CN101641440A - 用于调节靶rna活性的寡核苷酸 - Google Patents

Abstract

本发明描述了在靶RNA(例如mRNA)中结合到微RNA靶位点上的寡核苷酸。本发明的寡核苷酸可以介导核糖核酸酶H对靶RNA的降解，介导靶RNA的RNA干扰或阻止靶RNA的微RNA调控。本发明的寡核苷酸是有用的，例如用于研究微RNA:mRNA互相作用的研究工具并且用于治疗的开发。本发明还描述了使用本发明的寡核苷酸来鉴别微RNA靶位点的方法、证实微RNA靶位点的方法、鉴别本发明的寡核苷酸的方法和调节靶RNA活性的方法。

Description

用于调节靶RNA活性的寡核苷酸

背景技术

本发明涉及能够用于影响靶RNA活性的寡核苷酸。

第一代的所述寡核苷酸是用来影响靶mRNA活性的反义寡核苷酸。对于这种寡核苷酸的感兴趣的原因之一是由于特定的碱基配对而达到的灵敏的且可预见的特异性的潜力。换而言之，设计出对给定的核酸(例如mRNA)具有高度特异性的寡核苷酸从理论上来说是非常简单的。

然而，结果发现不是所有的序列都可以用于反义靶定，并且可及性可能随着例如二级结构或蛋白结合的原因而有不同。

此外，发现了简单的碱基配对不足以实现对给定的靶mRNA的调控，即，互补于给定的靶mRNA寡核苷酸不会必然地影响该靶mRNA的活性。如果寡核苷酸靶定的是mRNA的开放阅读框(open reading frame)，可能会发生翻译器在翻译过程中轻易地替换了寡核苷酸。因此，所开发的方法可能提高寡核苷酸调控活性。

例如，开发了能够活化核糖核酸酶H对靶mRNA的进行切割的寡核苷酸。这种寡核苷酸的一种潜在的劣势是它们可能介导对目标靶mRNA以外的其他RNA的切割，即，导致脱靶效应。而且，通过核糖核酸酶H切割而发生作用的寡核苷酸在临床实验中用于治疗各种疾病。

目前，已有研究表明，真核细胞(包括哺乳动物细胞)含有使用RNA作为特异性决定因子复杂的基因调控系统(在此也称为RNA干扰机器(RNAimachinery))。该系统可以由能被引入到目标细胞中以调控靶mRNA活性的被称为siRNA触发。目前，对使用siRNA触发RNA干扰机器做出了大量的努力以对靶RNA，特别是靶mRNA进行特异性调控。普遍认为这种方法极大的促进了新型治疗的开发。正如将要在下文中指出的，这种方法的一个主要的优势在于siRNA的特异性依赖于siRNA的引导链和靶RNA之间的互补程度，即，可以控制靶特异性。然而，发现siRNA的特异性可以比最开始设想的要低。最开始，认为只有含有与siRNA的引导链完全互补的段的靶RNA会受到影响，即，被RNA干扰机器靶定。新的研究表示，siRNA却是会产生显著的脱靶效应，即，非目标性的靶进行调控。现在认为这些脱靶是源自siRNA，更确切地说，源自起到微RNA(microRNA)作用的siRNA的引导链。

微RNA是最近发现的一类内源性RNA分子，并且它作为siRNA通过RNA干扰机器发挥作用。目前已经发现了约500种人类微RNA，并且这个数目还在飞快地增加。现在认为全部人类基因中有超过1/3的可以由微RNA进行调控。因此，这些微RNA本身可以被用于调控靶RNA的活性，并因而例如所可以用作治疗剂。

然而，如在下文中还要提到的，微RNA通常在多于一个的靶RNA上作用，即，是混杂的。因此，将微RNA引入细胞或调控微RNA的水平将影响到不止一个靶RNA的活性并因此可能导致不期望的脱靶效应。

最近已经进行的研究中，靶RNA的活性是通过抑制微RNA的活性来进行调控的。可以使用互补的被称为反义微RNA(antimirs)和拮抗微RNA(antagomirs)的寡核苷酸来抑制微RNA。由于微RNA本身是混杂的，因此反义微RNA或拮抗微RNA也是混杂的并会影响不止一种靶RNA的活性。

详细说明书

在先申请中(11月23日在丹麦递交的PA 2006 01543和PA 2006 01544，以及2007年4月2日在美国递交的US 60/888,094和US 60/888,095)，当提及发明所述的寡核苷酸时使用了术语Xmir。在本申请中，使用本发明的寡核苷酸术语优于术语Xmir。然而，当使用术语Xmir时，参照本发明的寡核苷酸。

因此，本文中的术语Xmir表示的是本发明的寡核苷酸，这将在随后的实施方式和权利要求书中进行进一步的说明。

本文中提及的所有参考文献此处通过参考并入本文中。

应该理解的是，本发明某一方面所描述的特征能等同的适用于其它方面。

定义

“能够调控靶RNA活性的寡核苷酸”指的是具有特定活性的寡核苷酸。这种寡核苷酸还被称为活性寡核苷酸。

术语“调控(regulate)”和“调节(modulate)”在本文中可互换使用。

“潜在地能够调控靶mRNA活性的寡核苷酸”指的是活性还没有通过实验确认的寡核苷酸。这种寡核苷酸也被称为候选调节物(candidate regulator)。

当引用了寡核苷酸而没有进行进一步的说明时，该寡核苷酸可以是“能够调控mRNA活性的寡核苷酸”或“潜在地能够调控靶mRNA活性的寡核苷酸”或者这两者均是。

当提及“靶RNA”时，表示的是本发明的寡核苷酸的靶。通常地，本发明的寡核苷酸能够以碱基配对的方式与靶RNA相互作用。

所述靶RNA可以为任何的RNA。优选地，所述靶RNA为mRNA或病毒RNA，例如基因组病毒RNA(genomic viral RNA)。

当提到“靶mRNA活性”的时候，通常表示的是靶mRNA的表达，即，向蛋白质或肽的翻译。因此，对靶mRNA活性的调控可以包括mRNA的降解和/或翻译调控。调控还可以包括影响mRNA在细胞内的运输。在本发明的一种优选实施方式中，寡核苷酸能够调控靶mRNA的表达。在另一种优选实施方式中，所述寡核苷酸可以介导靶mRNA的降解(反过来这也会调控靶mRNA的表达)。该活性还可以指复制过程。

当靶RNA为病毒RNA时，本发明的寡核苷酸可以影响病毒的复制或干扰病毒的增殖。

本文中的调控可以是正的或者是负的。即，调节物(例如，寡核苷酸或微RNA)可以增加靶(例如，靶mRNA)的活性或者也可以降低靶的活性。

当提到“RNA的靶序列”时，表示的是参与微RNA调控或者微RNA调控所必需的RNA区。术语“靶区”或者“靶序列”在本文中可互换使用。

不受到理论所限制地，认为所述的区包括在靶RNA的微RNA调控过程中直接与微RNA互相作用的碱基。在一种优选的实施方式中，靶序列为进行微RNA调控的所必需的靶RNA区。可以使用报告系统(reporter system)来对该区进行鉴别，其中，测试靶RNA的系统性地缺失的活性以鉴别靶序列。在靶区内评估引入点突变的效果对于鉴别靶区也是很有价值的。

从本说明书中可以清楚地知道，本发明的寡核苷酸也可以用来鉴别用于微RNA调控所必需的靶RNA区。优选地，靶序列包括反义种子序列(antiseedsequence)，它与微RNA的种子序列(seed sequence)互补并且还与本发明的寡核苷酸的引导序列互补。在种子序列中引入突变通常将影响微RNA的调控并因此可能被用来证实给定的位置参与了微RNA调控。

本文中使用的术语微RNA具有本领域通常的意思。即，术语微RNA指的是通常为18-22个核苷酸的未被翻译的小分子RNA，它能调控靶mRNA的活性。微RNA通常由原微RNA(pri-microRNA)处理得到短的茎环结构(被称为前微RNA(pre-microRNA))，最后得到成熟的微RNA。前微RNA的茎的两条链都可以被处理成成熟的微RNA。

微RNA库(miRBase(http://microrna.sanger.ac.uk/sequences/))是对已知微RNA的汇编。在该网站上也可以找到预测的和已知的对这些微RNA的靶。

本文中使用的术语siRNA(短干扰RNA)具有与本领域通常理解相同的意思。即，术语siRNA指的是双链RNA复合物，其中链的长度通常为18-22个核苷酸。经常地，该复合物具有3’-突出端(3’-overhang)。

当本文中提到RNA干扰机器时，表示的是必要于siRNA和微RNA活性或者必要于RNA干扰途径的细胞组成，RNA干扰机器中的主要成分是RNA诱导的沉默复合物(RISC复合物)。

当在本文中提及时，RNA单元是构成RNA聚合物的单体之一。因此，RNA单元也表示RNA单体或RNA核苷酸。类似地，DNA单元是构成DNA聚合物的一个单体，并且DNA单元也可以表示DNA单体或DNA核苷酸。

当提到碱基时，表示的是核苷酸的碱基。所述碱基可以为DNA、RNA、INA、LNA(锁核酸)或任何其他的核酸或能够进行特定的碱基配对的核酸的部分。所述碱基还可以为PNA(肽核酸)的部分。在一些实施方式中，所述碱基可以为通用碱基(universal base)。

当提到序列长度时，可以参考单元的数量或碱基的数量。

当提到互补序列时，G与C配对，A与T和U配对，反之亦然。在一种优选实施方式中，G也与U配对并且反之亦然，从而形成所谓的摆动碱基对(wobble base pair)。在另一种优选的实施方式中，碱基肌苷(I)可以含包含在微RNA中或本发明的寡核苷酸中。I与A、C和U进行碱基配对。在另一种优选实施方式中，可以使用通用碱基。通用碱基通常能够与G、C、A、U和T进行碱基配对。通常，通用碱基不会与另一条链上相对的碱基形成氢键。在另一种优选实施方式中，互补序列指的是沃森-克里克(Watson-Crick)碱基对专有的连续序列。

发明简述

第一方面，本发明提供了能有效地调节靶RNA活性的寡核苷酸。在优选的实施方式中，所述寡核苷酸以靶RNA的微RNA靶区为靶。本发明的另一方面是一种用来调节靶RNA活性的方法。在另一方面涉及提供本发明的寡核苷酸，该寡核苷酸鉴别靶RNA的微RNA靶区、测定靶RNA的微RNA靶区并鉴别给定靶RNA的微RNA调节物。

发明公开

本发明提供了以靶RNA的微RNA靶区为靶的寡核苷酸。在一种实施方式中，寡核苷酸引起了对靶RNA的微RNA靶区的可及性的利用。本发明的寡核苷酸可以使RNA干扰机器募集到靶RNA上以介导靶RNA的翻译抑制或切割。本发明的寡核苷酸还可以使核糖核酸酶H募集以介导靶RNA的切割。此外，本发明的寡核苷酸可以通过阻止微RNA对靶RNA的调控来调节靶RNA的活性。本发明还提供了使用本发明的寡核苷酸为靶RNA提供微RNA的方法、用于证实靶RNA的微RNA靶区的方法和调节靶RNA活性的方法。

第一方面——生物活性寡核苷酸

第一方面，本发明提供了一种含有反义序列的寡核苷酸，所述反义序列包括相应于微RNA的种子序列的引导序列，条件是所述寡核苷酸不是微RNA或者不含有与微RNA完整序列相对应的序列。

由于能用于靶定靶RNA的靶区，因此这种寡核苷酸是期望的，所述靶区参与了靶RNA的微RNA调控。不受到理论所限制地，认为所述靶区比靶RNA的其他区将要更易于发生互相作用(与微RNA、寡核苷酸或其他核酸)，这是由于所述靶区被设计成用于与微RNA互相作用，或者由于内源性RNA选择了更可及的靶区。

对以上观点的支持来自于本专利申请的优先权日之后出版的作品。一个出版物针对靶的二级结构对由微RNA引起的抑制效应的效果进行了调查(LongD，2007)。结果显示了靶结构对由微RNA进行的靶识别具有重大影响，至少对于秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)和果蝇(Drosophila melanogaster)的微RNA调控来说是这样的。作者提出，靶的二级结构可能对大多数以微RNA为靶的互相作用的可及性做出了贡献。

另一研究全面地调查了在微RNA靶识别中靶位点可及性的作用(克尔提斯M(Kertesz M)，2007)。作者证明了削弱了靶的可及性的突变极大地降低了微RNA介导的翻译抑制。此外，作者对蚊子、蠕虫、鼠和人类的全部3’UTR的靶的可及性进行了全基因组分析。发现在上述4类有机体中的微RNA种子序列表现出了对高度可及区的显著优选，且作者如习惯于靶的可及性是微RNA功能的关键因素。

我们认为靶的可及性将很可能是由靶的二级结构和由其他因子(例如RNA结合蛋白)引起的阻塞的组合所决定的。

因此，在本发明的一种实施方式中，靶区可以由例如诱导寡核苷酸或siRNA的核糖核酸酶H进行靶定。所述寡核苷酸可以是诱导核糖核酸酶H切割靶RNA的10个单体单元(10-mer)。所述寡核苷酸还可以防止微RNA对靶RNA发挥作用。这些不同的实施方式将在下文中列出。

“相应(corresponding)”用于(本发明的寡核苷酸的)引导序列和(微RNA的)种子序列的上下文中时，表示的是种子序列和引导序列的能够与同一序列进行碱基配对的能力。即，所述引导序列和种子序列不是必须要相同的，但是它们能够与同一序列进行碱基配对，例如，靶RNA的反义种子序列。

短语“与微RNA序列的完整序列相对应的序列”倾向于包括例如微RNA前体或编码所述微RNA的DNA分子。所述DNA分子可以为例如PCR(聚合酶链式反应)产物，该PCR产物用于T7 RNA聚合酶对微RNA的转录。该分子不包括在本发明的范围内，天然产生的微RNA也不属于本发明的范围。

来源

待用于本发明的方法的靶RNA优选为动物来源或植物来源。更优选地，靶RNA为哺乳动物来源。最优选为人类来源。所述靶RNA也可以为病毒来源，优选为会感染人类的病毒。在优选的实施方式中，术语人类靶RNA还包括会感染人类的病毒的病毒靶RNA。

待用于本发明的方法的微RNA也优选为动物来源或植物来源。更优选为哺乳动物来源。最优选为人类来源。待用于本发明的方法的微RNA还可以为病毒来源，优选为会感染人类的病毒，例如HSV-1(单纯疱疹病毒-1)的mir-LAT。在优选的实施方式中，术语人类微RNA还包括会感染人类的病毒的微RNA。

最优选地，本发明的寡核苷酸含有相应于人类微RNA或者来源于会感染人类的病毒微RNA的种子序列的引导序列。

在一种优选的实施方式中，本发明的寡核苷酸含有选自能与从以下序列组中选出的序列的互补序列进行碱基配对的序列所组成的组中的序列：任意SEQID NO：1-723中的位置1-20、位置1-19、位置1-18、位置1-17、位置1-16、位置1-15、位置1-14、位置1-13、位置1-12、位置1-11、位置1-10、位置1-9、位置1-8、位置1-7、位置1-6、位置2-20、位置2-19、位置2-18、位置2-17、位置2-16、位置2-15、位置2-14、位置2-13、位置2-12、位置2-11、位置2-10、位置2-9、位置2-8、位置2-7、位置2-6、位置3-20、位置3-19、位置3-18、位置3-17、位置3-16、位置3-15、位置3-14、位置3-13、位置3-12、位置3-11、位置3-10和位置3-9所组成的组。

在一种优选的实施方式中，本发明的寡核苷酸含有选自能与从以下序列组中选出的序列的互补序列进行碱基配对的序列所组成的组中的序列，并且该序列不能与前述位置的两侧相邻的核苷酸形成连续的碱基对：任意SEQ ID NO：1-723中的位置1-20、位置1-19、位置1-18、位置1-17、位置1-16、位置1-15、位置1-14、位置1-13、位置1-12、位置1-11、位置1-10、位置1-9、位置1-8、位置1-7、位置1-6、位置2-20、位置2-19、位置2-18、位置2-17、位置2-16、位置2-15、位置2-14、位置2-13、位置2-12、位置2-11、位置2-10、位置2-9、位置2-8、位置2-7、位置2-6、位置3-20、位置3-19、位置3-18、位置3-17、位置3-16、位置3-15、位置3-14、位置3-13、位置3-12、位置3-11、位置3-10和位置3-9所组成的组。

术语互补序列已经在上文进行了定义。短语“能够进行碱基配对”指的是术语互补序列。即，第一序列能够与第二序列进行碱基配对，所述第二序列与所述第一序列互补。

在另一种优选的实施方式中，本发明的寡核苷酸含有反义序列，该反义序列选自由能与以下序列组中选出的序列的互补序列进行碱基配对的序列所组成的组中的序列：任意SEQ ID NO：1-723中的位置1-20、位置1-19、位置1-18、位置1-17、位置1-16、位置1-15、位置1-14、位置1-13、位置1-12、位置1-11、位置1-10、位置1-9、位置1-8、位置1-7、位置1-6、位置2-20、位置2-19、位置2-18、位置2-17、位置2-16、位置2-15、位置2-14、位置2-13、位置2-12、位置2-11、位置2-10、位置2-9、位置2-8、位置2-7、位置2-6、位置3-20、位置3-19、位置3-18、位置3-17、位置3-16、位置3-15、位置3-14、位置3-13、位置3-12、位置3-11、位置3-10和位置3-9所组成的组。

本发明的寡核苷酸还可以通过碱基配对规则进行限定。因此，在另一种优选的实施方式中，本发明的寡核苷酸的反义序列包括选自由任意SEQ ID NO：1-723中的位置1-20、位置1-19、位置1-18、位置1-17、位置1-16、位置1-15、位置1-14、位置1-13、位置1-12、位置1-11、位置1-10、位置1-9、位置1-8、位置1-7、位置1-6、位置2-20、位置2-19、位置2-18、位置2-17、位置2-16、位置2-15、位置2-14、位置2-13、位置2-12、位置2-11、位置2-10、位置2-9、位置2-8、位置2-7、位置2-6、位置3-20、位置3-19、位置3-18、位置3-17、位置3-16、位置3-15、位置3-14、位置3-13、位置3-12、位置3-11、位置3-10和位置3-9所组成的组中的序列，其中

a.A仅可以与G、C、U、T或I互换

b.G仅可以与A或I互换

c.C仅可以与A、U或T互换

d.U仅可以与C、A、T或I互换

并且3个附加位置可以与任意碱基互换。

互换的规则基于以下考虑：

微RNA中的A可以与靶RNA中的U或I进行碱基配对。靶RNA中的U和I可以与A、G、I、C、U或T进行碱基配对。同样地适用于其他碱基。

此外，在微RNA中A对I的编辑表现出对微RNA靶沉默重定向(川原丽奈Y(Kawahara Y)，2007)。因此，微RNA中的A可以在一些实施方式中被I取代。

而且，靶RNA可以含有被由A编辑的I。

此外，G：U的碱基对在一些实施方式中(但不是全部)可以被微RNA-靶RNA互相作用接受。

结果示于表1：

可以与任意的碱基互换的附加位置(additional position)解释了单核苷酸多态性(SNPs)和其他的突变。此外，与微RNA互相作用的靶序列可以不与互相作用的微RNA完美地互补。即，在微RNA的种子序列和靶RNA的反义种子序列之间形成的复合物中可以发生错配。

因此，在另一种优选实施方式中，

a.A仅可以与G、C、U、T或I互换

b.G仅可以与A或I互换

c.C仅可以与A或U互换

d.U仅可以与C、A、T或I互换

并且3个附加位置可以与任意碱基互换。

在另一种优选实施方式中，

a.A仅可以与C、U、T或I互换

b.G仅可以与I互换

c.C仅可以与A、U或T互换

d.U仅可以与C、A、T或I互换

并且3个附加位置可以与任意碱基互换。

在另一种优选实施方式中，

a.A仅可以与C、U或I互换

b.G仅可以与I互换

c.C仅可以与A或U互换

d.U仅可以与C、A、T或I互换

并且3个附加位置可以与任意碱基互换。

在另一种优选实施方式中，

a.A仅可以与G或I互换

b.G仅可以与I或A互换

c.C仅可以与A、U或T互换

d.U仅可以与C或T互换

并且3个附加位置可以与任意碱基互换。

在另一种优选实施方式中，

a.A仅可以与G互换

b.G仅可以与A或G互换

c.C仅可以与T或U互换

d.U仅可以与C或T互换

并且3个附加位置可以与任意碱基互换。

在另一种优选实施方式中，U仅可以与T互换，

并且3个附加位置可以与任意碱基互换。

在另一种优选实施方式中，2个附加位置可以与任意碱基互换。

在另一种优选实施方式中，1个附加位置可以与任意碱基互换。

在另一种优选实施方式中，没有附加位置可以与任意碱基互换。

在一种优选的实施方式中，寡核苷酸还可以含有1个或2个附加(additions)或缺失(deletions)。更优选为1个附加/取代，并且最优选为没有附加/缺失。当微RNA和靶RNA之间的复合物含有凸起(bulges)时，附加和缺失是相互关联的。如果在微RNA上的核苷酸发生凸起(bulge)，这会导致本发明的寡核苷酸的缺失。如果在靶RNA上的核苷酸发生凸起，这会导致本发明的寡核苷酸的附加。

更优选地，本发明的核苷酸含有反义序列，该反义序列含有选自由任意SEQ ID NO：1-723中的位置1-10、位置1-9、位置1-8、位置1-7、位置1-6、位置2-10、位置2-9、位置2-8、位置2-7、位置2-6、位置3-10和位置3-9所组成的组中的引导序列，其中，应该理解的是，以上所列举的互换规则也适用于该组，即，适用于各种实施方式中。

最优选地，本发明的寡核苷酸含有反义序列，刚反义序列含有选自由任意SEQ ID NO：1-723中的位置1-8、位置1-7、位置2-8和位置2-7所组成的组中的引导序列，其中，应该理解的是，以上所列举的互换规则也适用于该组，即，适用于各种实施方式中。

在一种实施方式中，所述寡核苷酸不含有任意SEQ ID NO：1-723的上述位置两侧相邻的核苷酸。即，任意SEQ ID NO 1-723的上述任意位置相邻的位置与本发明的核苷酸相应的相邻的位置不同。

在另一种优选实施方式中，本发明的寡核苷酸含有反义序列，该反义序列含有选自由任意SEQ ID NO：1-723中的位置1-8、位置1-7、位置2-8和位置2-7所组成的组的引导序列，其中，应该理解的是，以上所列举的互换规则也适用于该组，即，适用于各种实施方式中。

第二序列

在另一种优选的实施方式中，本发明的寡核苷酸的反义序列还含有第二序列，该第二序列选自由任意SEQ ID NO：1-723中的位置12-17、位置12-16、位置13-17和位置13-16所组成的组，其中，引导序列和第二序列来自相同的SEQ ID NO，并且其中，应该理解的是，以上所列举的互换规则也适用于该组，即，适用于各种实施方式中。

连续的碱基段(contiguous stretch of bases)

优选本发明的寡核苷酸含有包括连续的碱基段的反义序列，该反义序列与选自由包括少于60个碱基、少于50个碱基、少于40个碱基、少于39个碱基、少于38个碱基、少于37个碱基、少于36个碱基、少于35个碱基、少于34个碱基、少于33个碱基、少于32个碱基、少于31个碱基、少于30个碱基、少于29个碱基、少于28个碱基、少于27个碱基、少于26个碱基、少于25个碱基、少于24个碱基、少于23个碱基、少于22个碱基、少于21个碱基、少于20个碱基、少于19个碱基、少于18个碱基、少于17个碱基、少于16个碱基、少于15个碱基、少于14个碱基、少于13个碱基、少于12个碱基、少于11个碱基、少于10个碱基、少于9个碱基、少于8个碱基、少于7个碱基、多于60个碱基、多于50个碱基、多于40个碱基、多于39个碱基、多于38个碱基、多于37个碱基、多于36个碱基、多于35个碱基、多于34个碱基、多于33个碱基、多于32个碱基、多于31个碱基、多于30个碱基、多于29个碱基、多于28个碱基、多于27个碱基、多于26个碱基、多于25个碱基、多于24个碱基、多于23个碱基、多于22个碱基、多于21个碱基、多于20个碱基、多于19个碱基、多于18个碱基、多于17个碱基、多于16个碱基、多于15个碱基、多于14个碱基、多于13个碱基、多于12个碱基、多于11个碱基、多于10个碱基、多于9个碱基、多于8个碱基、多于7个碱基、多于6个碱基和多于5个碱基所组成的组中的靶RNA的微RNA互补。

连续的碱基段表示的是在本发明的寡核苷酸和靶RNA之间形成的全部配合成双链形式的未中断的碱基序列。及，优选在所述双链中没有凸起，并优选该序列是互补的(参见以上互补序列的定义)。最优选为在本发明的寡核苷酸和靶RNA的靶区之间的理想沃森-克里克(Watson-Crick)双链。

术语邻接(contigous)和连续(continuous)在本文中可互换使用。

在另一种实施方式中，本发明的寡核苷酸含有反义序列，该反义序列包括与靶RNA的微RNA靶序列互补的连续的碱基段，所述连续的碱基段选自由10-14个碱基、12-16个碱基、14-18个碱基、16-20个碱基、10-25个碱基、12-24个碱基、14-22个碱基、15-22个碱基和15-20个碱基所组成的组中。

更优选为8-25个碱基的连续的碱基段。

最优选为10-20个碱基的连续的碱基段。

优选地，所述寡核苷酸能作为微RNA与靶RNA的相同的区互相作用。这种寡核苷酸的优势之一在于它以靶RNA暴露的区为靶(参见以上的讨论)。该核苷酸的另一个优势在于它能用于掩蔽微RNA靶，从而保护以靶RNA为靶的(内源性)微RNA不与靶RNA互相作用，并因此对靶RNA发挥其作用。

本发明的寡核苷酸可以与其相应的微RNA具有一定程度的同一性，该同一性的程度选自由少于99％、少于95％、少于90％、少于85％、少于80％、少于75％、少于70％、少于65％、少于60％、少于55％、少于50％、少于45％、少于40％、少于35％、少于30％和少于25％所组成的组中。当提到同一性的程度时，程度是对微RNA和本发明的寡核苷酸中长度最短的分子计算得到的。本发明的寡核苷酸的引导序列和微RNA的种子序列用于校准。因此，如果微RNA为20个碱基而寡核苷酸为14个碱基，且相同的位置数为12个，同一性的程度为12/14＝86％。如果微RNA为20个碱基，寡核苷酸为20个碱基，且相同的位置数为10个，则同一性的程度为10/20＝50％。

优选地，本发明的寡核苷酸内的引导序列的位置选自由位置1、位置2、位置3、位置4、位置5、位置6、位置7、位置8、位置9、位置10、位置11、位置12、位置13、位置14、位置15、位置16、位置17、位置18和位置19所组成的组，其中，该位置是从所述引导序列的第一个碱基和所述寡核苷酸的第一个碱基开始以5’到3’的方向计数的。

更优选地，所述位置选自由位置1、位置2、位置3、位置4和位置5所组成的组中。

如在较前的内容中所提到的，引导序列与微RNA的种子序列相对应，这在本说明中进行了定义。

可以出于各种目的对本发明的寡核苷酸的长度进行调整。可以通过增加所述寡核苷酸的长度来实现与靶RNA更强的互相作用，这也可以通过与靶RNA的微RNA靶序列互补的碱基的延伸来实现。另一方面，可以减少长度以获得更好的递送性(delivery)和生物利用度。长度的降低可能导致寡核苷酸的tm值(解链温度)降低。然而，可以通过寡核苷酸浓度的增加来抵消该效果。而且，可以使用增加亲和性的核苷酸和增加亲和性的修饰(modification)。

在优选的实施方式中，所述寡核苷酸的长度选自由少于60个碱基、少于50个碱基、少于40个碱基、少于39个碱基、少于38个碱基、少于37个碱基、少于36个碱基、少于35个碱基、少于34个碱基、少于33个碱基、少于32个碱基、少于31个碱基、少于30个碱基、少于29个碱基、少于28个碱基、少于27个碱基、少于26个碱基、少于25个碱基、少于24个碱基、少于23个碱基、少于22个碱基、少于21个碱基、少于20个碱基、少于19个碱基、少于18个碱基、少于17个碱基、少于16个碱基、少于15个碱基、少于14个碱基、少于13个碱基、少于12个碱基、少于11个碱基、少于10个碱基、少于9个碱基、少于8个碱基、少于7个碱基、多于60个碱基、多于50个碱基、多于40个碱基、多于39个碱基、多于38个碱基、多于37个碱基、多于36个碱基、多于35个碱基、多于34个碱基、多于33个碱基、多于32个碱基、多于31个碱基、多于30个碱基、多于29个碱基、多于28个碱基、多于27个碱基、多于26个碱基、多于25个碱基、多于24个碱基、多于23个碱基、多于22个碱基、多于21个碱基、多于20个碱基、多于19个碱基、多于18个碱基、多于17个碱基、多于16个碱基、多于15个碱基、多于14个碱基、多于13个碱基、多于12个碱基、多于11个碱基、多于10个碱基、多于9个碱基、多于8个碱基、多于7个碱基、多于6个碱基和多于5个碱基所组成的组中。

在另一种优选的实施方式中，所述寡核苷酸的长度选自由10-14个碱基、12-16个碱基、14-18个碱基、16-20个碱基、10-25个碱基、12-24个碱基、14-22个碱基、15-22个碱基和15-20个碱基所组成的组。

更优选为8-25个碱基的长度。

最优选为10-20个碱基的长度。

在本发明的一种优选实施方式中，微RNA具有选自由SEQ NO：1-723所组成的组中的序列。

还将优选的微RNA列于表2。请注意在较早的在先申请中所提到的序列的顺序被重新编号，并加入了新的序列。

表2.人类微RNA列表。序列按从5’到3’的方向示出。

MicroRNA	序列	SEQ IDNO
			hsa-let-7a	UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU	1
hsa-let-7a*	CUAUACAAUCUACUGUCUUUC	2
			hsa-let-7b	UGAGGUAGUAGGUUGUGUGGUU	3
hsa-let-7b*	CUAUACAACCUACUGCCUUCCC	4
			hsa-let-7c	UGAGGUAGUAGGUUGUAUGGUU	5
hsa-let-7c*	UAGAGUUACACCCUGGGAGUUA	6
			hsa-let-7d	AGAGGUAGUAGGUUGCAUAGUU	7
hsa-let-7d*	CUAUACGACCUGCUGCCUUUCU	8
			hsa-let-7e	UGAGGUAGGAGGUUGUAUAGUU	9
hsa-let-7e*	CUAUACGGCCUCCUAGCUUUCC	10
			hsa-let-7f	UGAGGUAGUAGAUUGUAUAGUU	11
hsa-let-7f-1*	CUAUACAAUCUAUUGCCUUCCC	12
			hsa-let-7f-2*	CUAUACAGUCUACUGUCUUUCC	13
hsa-let-7g	UGAGGUAGUAGUUUGUACAGUU	14
			hsa-let-7g*	CUGUACAGGCCACUGCCUUGC	15
hsa-let-7i	UGAGGUAGUAGUUUGUGCUGUU	16
			hsa-let-7i*	CUGCGCAAGCUACUGCCUUGCU	17
hsa-miR-1	UGGAAUGUAAAGAAGUAUGUAU	18

hsa-miR-100	AACCCGUAGAUCCGAACUUGUG	19
			hsa-miR-100*	CAAGCUUGUAUCUAUAGGUAUG	20
hsa-miR-101	UACAGUACUGUGAUAACUGAA	21
			hsa-miR-101*	CAGUUAUCACAGUGCUGAUGCU	22
hsa-miR-103	AGCAGCAUUGUACAGGGCUAUGA	23
			hsa-miR-105	UCAAAUGCUCAGACUCCUGUGGU	24
hsa-miR-105*	ACGGAUGUUUGAGCAUGUGCUA	25
			hsa-miR-106a	AAAAGUGCUUACAGUGCAGGUAG	26
hsa-miR-106a*	CUGCAAUGUAAGCACUUCUUAC	27
			hsa-miR-106b	UAAAGUGCUGACAGUGCAGAU	28
hsa-miR-106b*	CCGCACUGUGGGUACUUGCUGC	29
			hsa-miR-107	AGCAGCAUUGUACAGGGCUAUCA	30
hsa-miR-10a	UACCCUGUAGAUCCGAAUUUGUG	31
			hsa-miR-10a*	CAAAUUCGUAUCUAGGGGAAUA	32
hsa-miR-10b	UACCCUGUAGAACCGAAUUUGUG	33
			hsa-miR-10b*	ACAGAUUCGAUUCUAGGGGAAU	34
hsa-miR-122	UGGAGUGUGACAAUGGUGUUUG	35
			hsa-miR-122*	AACGCCAUUAUCACACUAAAUA	36
hsa-miR-124	UAAGGCACGCGGUGAAUGCC	37
			hsa-miR-124*	CGUGUUCACAGCGGACCUUGAU	38
hsa-miR-125a-3p	ACAGGUGAGGUUCUUGGGAGCC	39
			hsa-miR-125a-5p	UCCCUGAGACCCUUUAACCUGUGA	40
hsa-miR-125b	UCCCUGAGACCCUAACUUGUGA	41
			hsa-miR-125b-1*	ACGGGUUAGGCUCUUGGGAGCU	42
hsa-miR-125b-2*	UCACAAGUCAGGCUCUUGGGAC	43
			hsa-miR-126	UCGUACCGUGAGUAAUAAUGCG	44
hsa-miR-126*	CAUUAUUACUUUUGGUACGCG	45
			hsa-miR-127-3p	UCGGAUCCGUCUGAGCUUGGCU	46
hsa-miR-127-5p	CUGAAGCUCAGAGGGCUCUGAU	47
			hsa-miR-128a	UCACAGUGAACCGGUCUCUUU	48
hsa-miR-128b	UCACAGUGAACCGGUCUCUUU	49
			hsa-miR-129*	AAGCCCUUACCCCAAAAAGUAU	50
hsa-miR-129-3p	AAGCCCUUACCCCAAAAAGCAU	51
			hsa-miR-129-5p	CUUUUUGCGGUCUGGGCUUGC	52
hsa-miR-130a	CAGUGCAAUGUUAAAAGGGCAU	53
			hsa-miR-130a*	UUCACAUUGUGCUACUGUCUGC	54
hsa-miR-130b	CAGUGCAAUGAUGAAAGGGCAU	55
			hsa-miR-130b*	ACUCUUUCCCUGUUGCACUAC	56
hsa-miR-132	UAACAGUCUACAGCCAUGGUCG	57
			hsa-miR-132*	ACCGUGGCUUUCGAUUGUUACU	58
hsa-miR-133a	UUUGGUCCCCUUCAACCAGCUG	59
			hsa-miR-133b	UUUGGUCCCCUUCAACCAGCUA	60
hsa-miR-134	UGUGACUGGUUGACCAGAGGGG	61

hsa-miR-135a	UAUGGCUUUUUAUUCCUAUGUGA	62
			hsa-miR-135a*	UAUAGGGAUUGGAGCCGUGGCG	63
hsa-miR-135b	UAUGGCUUUUCAUUCCUAUGUGA	64
			hsa-miR-135b*	AUGUAGGGCUAAAAGCCAUGGG	65
hsa-miR-136	ACUCCAUUUGUUUUGAUGAUGGA	66
			hsa-miR-136*	CAUCAUCGUCUCAAAUGAGUCU	67
hsa-miR-137	UUAUUGCUUAAGAAUACGCGUAG	68
			hsa-miR-138	AGCUGGUGUUGUGAAUCAGGCCG	69
hsa-miR-138-1*	GCUACUUCACAACACCAGGGCC	70
			hsa-miR-138-2*	GCUAUUUCACGACACCAGGGUU	71
hsa-miR-139-3p	GGAGACGCGGCCCUGUUGGAGU	72
			hsa-miR-139-5p	UCUACAGUGCACGUGUCUCCAG	73
hsa-miR-140-3p	UACCACAGGGUAGAACCACGG	74
			hsa-miR-140-5p	CAGUGGUUUUACCCUAUGGUAG	75
hsa-miR-141	UAACACUGUCUGGUAAAGAUGG	76
			hsa-miR-141*	CAUCUUCCAGUACAGUGUUGGA	77
hsa-miR-142-3p	UGUAGUGUUUCCUACUUUAUGGA	78
			hsa-miR-142-5p	CAUAAAGUAGAAAGCACUACU	79
hsa-miR-143	UGAGAUGAAGCACUGUAGCUC	80
			hsa-miR-143*	GGUGCAGUGCUGCAUCUCUGGU	81
hsa-miR-144	UACAGUAUAGAUGAUGUACU	82
			hsa-miR-144*	GGAUAUCAUCAUAUACUGUAAG	83
hsa-miR-145	GUCCAGUUUUCCCAGGAAUCCCU	84
			hsa-miR-145*	GGAUUCCUGGAAAUACUGUUCU	85
hsa-miR-146a	UGAGAACUGAAUUCCAUGGGUU	86
			hsa-miR-146a*	CCUCUGAAAUUCAGUUCUUCAG	87
hsa-miR-146b-3p	UGCCCUGUGGACUCAGUUCUGG	88
			hsa-miR-146b-5p	UGAGAACUGAAUUCCAUAGGCU	89
hsa-miR-147	GUGUGUGGAAAUGCUUCUGC	90
			hsa-miR-147b	GUGUGCGGAAAUGCUUCUGCUA	91
hsa-miR-148a	UCAGUGCACUACAGAACUUUGU	92
			hsa-miR-148a*	AAAGUUCUGAGACACUCCGACU	93
hsa-miR-148b	UCAGUGCAUCACAGAACUUUGU	94
			hsa-miR-148b*	AAGUUCUGUUAUACACUCAGGC	95
hsa-miR-149	UCUGGCUCCGUGUCUUCACUCCC	96
			hsa-miR-149*	AGGGAGGGACGGGGGCUGUGC	97
hsa-miR-150	UCUCCCAACCCUUGUACCAGUG	98
			hsa-miR-150*	CUGGUACAGGCCUGGGGGACAG	99
hsa-miR-151-3p	CUAGACUGAAGCUCCUUGAGG	100
			hsa-miR-151-5p	UCGAGGAGCUCACAGUCUAGU	101
hsa-miR-152	UCAGUGCAUGACAGAACUUGG	102
			hsa-miR-153	UUGCAUAGUCACAAAAGUGAUC	103
hsa-miR-154	UAGGUUAUCCGUGUUGCCUUCG	104

hsa-miR-154*	AAUCAUACACGGUUGACCUAUU	105
			hsa-miR-155	UUAAUGCUAAUCGUGAUAGGGGU	106
hsa-miR-155*	CUCCUACAUAUUAGCAUUAACA	107
			hsa-miR-15a	UAGCAGCACAUAAUGGUUUGUG	108
hsa-miR-15a*	CAGGCCAUAUUGUGCUGCCUCA	109
			hsa-miR-15b	UAGCAGCACAUCAUGGUUUACA	110
hsa-miR-15b*	CGAAUCAUUAUUUGCUGCUCUA	111
			hsa-miR-16	UAGCAGCACGUAAAUAUUGGCG	112
hsa-miR-16-1*	CCAGUAUUAACUGUGCUGCUGA	113
			hsa-miR-16-2*	CCAAUAUUACUGUGCUGCUUUA	114
hsa-miR-17	CAAAGUGCUUACAGUGCAGGUAG	115
			hsa-miR-17*	ACUGCAGUGAAGGCACUUGUAG	116
hsa-miR-181a	AACAUUCAACGCUGUCGGUGAGU	117
			hsa-miR-181a*	ACCAUCGACCGUUGAUUGUACC	118
hsa-miR-181a-2*	ACCACUGACCGUUGACUGUACC	119
			hsa-miR-181b	AACAUUCAUUGCUGUCGGUGGGU	120
hsa-miR-181c	AACAUUCAACCUGUCGGUGAGU	121
			hsa-miR-181c*	AACCAUCGACCGUUGAGUGGAC	122
hsa-miR-181d	AACAUUCAUUGUUGUCGGUGGGU	123
			hsa-miR-182	UUUGGCAAUGGUAGAACUCACACU	124
hsa-miR-182*	UGGUUCUAGACUUGCCAACUA	125
			hsa-miR-183	UAUGGCACUGGUAGAAUUCACU	126
hsa-miR-183*	GUGAAUUACCGAAGGGCCAUAA	127
			hsa-miR-184	UGGACGGAGAACUGAUAAGGGU	128
hsa-miR-185	UGGAGAGAAAGGCAGUUCCUGA	129
			hsa-miR-185*	AGGGGCUGGCUUUCCUCUGGUC	130
hsa-miR-186	CAAAGAAUUCUCCUUUUGGGCU	131
			hsa-miR-186*	GCCCAAAGGUGAAUUUUUUGGG	132
hsa-miR-187	UCGUGUCUUGUGUUGCAGCCGG	133
			hsa-miR-187*	GGCUACAACACAGGACCCGGGC	134
hsa-miR-188-3p	CUCCCACAUGCAGGGUUUGCA	135
			hsa-miR-188-5p	CAUCCCUUGCAUGGUGGAGGG	136
hsa-miR-18a	UAAGGUGCAUCUAGUGCAGAUAG	137
			hsa-miR-18a*	ACUGCCCUAAGUGCUCCUUCUGG	138
hsa-miR-18b	UAAGGUGCAUCUAGUGCAGUUAG	139
			hsa-miR-18b*	UGCCCUAAAUGCCCCUUCUGGC	140
hsa-miR-190	UGAUAUGUUUGAUAUAUUAGGU	141
			hsa-miR-190b	UGAUAUGUUUGAUAUUGGGUU	142
hsa-miR-191	CAACGGAAUCCCAAAAGCAGCUG	143
			hsa-miR-191*	GCUGCGCUUGGAUUUCGUCCCC	144
hsa-miR-192	CUGACCUAUGAAUUGACAGCC	145
			hsa-miR-192*	CUGCCAAUUCCAUAGGUCACAG	146
hsa-miR-193a-3p	AACUGGCCUACAAAGUCCCAGU	147

hsa-miR-193a-5p	UGGGUCUUUGCGGGCGAGAUGA	148
			hsa-miR-193b	AACUGGCCCUCAAAGUCCCGCU	149
hsa-miR-193b*	CGGGGUUUUGAGGGCGAGAUGA	150
			hsa-miR-194	UGUAACAGCAACUCCAUGUGGA	151
hsa-miR-194*	CCAGUgGGGCUGCUGUUAUCUG	152
			hsa-miR-195	UAGCAGCACAGAAAUAUUGGC	153
hsa-miR-195*	CCAAUAUUGGCUGUGCUGCUCC	154
			hsa-miR-196a	UAGGUAGUUUCAUGUUGUUGGG	155
hsa-miR-196a*	CGGCAACAAGAAACUGCCUGAG	156
			hsa-miR-196b	UAGGUAGUUUCCUGUUGUUGGG	157
hsa-miR-197	UUCACCACCUUCUCCACCCAGC	158
			hsa-miR-198	GGUCCAGAGGGGAGAUAGGUUC	159
hsa-miR-199a-3p	ACAGUAGUCUGCACAUUGGUUA	160
			hsa-miR-199a-5p	CCCAGUGUUCAGACUACCUGUUC	161
hsa-miR-199b-3p	ACAGUAGUCUGCACAUUGGUUA	162
			hsa-miR-199b-5p	CCCAGUGUUUAGACUAUCUGUUC	163
hsa-miR-19a	UGUGCAAAUCUAUGCAAAACUGA	164
			hsa-miR-19a*	AGUUUUGCAUAGUUGCACUACA	165
hsa-miR-19b	UGUGCAAAUCCAUGCAAAACUGA	166
			hsa-miR-19b-1*	AGUUUUGCAGGUUUGCAUCCAGC	167
hsa-miR-19b-2*	AGUUUUGCAGGUUUGCAUUUCA	168
			hsa-miR-200a	UAACACUGUCUGGUAACGAUGU	169
hsa-miR-200a*	CAUCUUACCGGACAGUGCUGGA	170
			hsa-miR-200b	UAAUACUGCCUGGUAAUGAUGA	171
hsa-m iR-200b*	CAUCUUACUGGGCAGCAUUGGA	172
			hsa-miR-200c	UAAUACUGCCGGGUAAUGAUGGA	173
hsa-miR-200c*	CGUCUUACCCAGCAGUGUUUGG	174
			hsa-miR-202	AGAGGUAUAGGGCAUGGGAA	175
hsa-miR-202*	UUCCUAUGCAUAUACUUCUUUG	176
			hsa-miR-203	GUGAAAUGUUUAGGACCACUAG	177
hsa-miR-204	UUCCCUUUGUCAUCCUAUGCCU	178
			hsa-miR-205	UCCUUCAUUCCACCGGAGUCUG	179
hsa-miR-206	UGGAAUGUAAGGAAGUGUGUGG	180
			hsa-miR-208	AUAAGACGAGCAAAAAGCUUGU	181
hsa-miR-208b	AUAAGACGAACAAAAGGUUUGU	182
			hsa-miR-20a	UAAAGUGCUUAUAGUGCAGGUAG	183
hsa-miR-20a*	ACUGCAUUAUGAGCACUUAAAG	184
			hsa-miR-20b	CAAAGUGCUCAUAGUGCAGGUAG	185
hsa-miR-20b*	ACUGUAGUAUGGGCACUUCCAG	186
			hsa-miR-21	UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA	187
hsa-miR-21*	CAACACCAGUCGAUGGGCUGU	188
			hsa-miR-210	CUGUGCGUGUGACAGCGGCUGA	189
hsa-miR-211	UUCCCUUUGUCAUCCUUCGCCU	190

hsa-miR-212	UAACAGUCUCCAGUCACGGCC	191
			hsa-miR-214	ACAGCAGGCACAGACAGGCAGU	192
hsa-miR-214*	UGCCUGUCUACACUUGCUGUGC	193
			hsa-miR-215	AUGACCUAUGAAUUGACAGAC	194
hsa-miR-216a	UAAUCUCAGCUGGCAACUGUGA	195
			hsa-miR-216b	AAAUCUCUGCAGGCAAAUGUGA	196
hsa-miR-217	UACUGCAUCAGGAACUGAUUGGA	197
			hsa-miR-218	UUGUGCUUGAUCUAACCAUGU	198
hsa-miR-218-1*	AUGGUUCCGUCAAGCACCAUGG	199
			hsa-miR-218-2*	CAUGGUUCUGUCAAGCACCGCG	200
hsa-miR-219-1-3p	AGAGUUGAGUCUGGACGUCCCG	201
			hsa-miR-219-2-3p	AGAAUUGUGGCUGGACAUCUGU	202
hsa-miR-219-5p	UGAUUGUCCAAACGCAAUUCU	203
			hsa-miR-22	AAGCUGCCAGUUGAAGAACUGU	204
hsa-miR-22*	AGUUCUUCAGUGGCAAGCUUUA	205
			hsa-miR-220	CCACACCGUAUCUGACACUUU	206
hsa-miR-220b	CCACCACCGUGUCUGACACUU	207
			hsa-miR-220c	ACACAGGGCUGUUGUGAAGACU	208
hsa-miR-221	AGCUACAUUGUCUGCUGGGUUUC	209
			hsa-miR-221*	ACCUGGCAUACAAUGUAGAUUU	210
hsa-miR-222	AGCUACAUCUGGCUACUGGGU	211
			hsa-miR-222*	CUCAGUAGCCAGUGUAGAUCCU	212
hsa-miR-223	UGUCAGUUUGUCAAAUACCCCA	213
			hsa-miR-223*	CGUGUAUUUGACAAGCUGAGUU	214
hsa-miR-224	CAAGUCACUAGUGGUUCCGUU	215
			hsa-miR-23a	AUCACAUUGCCAGGGAUUUCC	216
hsa-miR-23a*	GGGGUUCCUGGGGAUGGGAUUU	217
			hsa-miR-23b	AUCACAUUGCCAGGGAUUACC	218
hsa-miR-23b*	UGGGUUCCUGGCAUGCUGAUUU	219
			hsa-miR-24	UGGCUCAGUUCAGCAGGAACAG	220
hsa-miR-24-1*	UGCCUACUGAGCUGAUAUCAGU	221
			hsa-miR-24-2*	UGCCUACUGAGCUGAAACACAG	222
hsa-miR-25	CAUUGCACUUGUCUCGGUCUGA	223
			hsa-miR-25*	AGGCGGAGACUUGGGCAAUUG	224
hsa-miR-26a	UUCAAGUAAUCCAGGAUAGGCU	225
			hsa-miR-26a-1*	CCUAUUCUUGGUUACUUGCACG	226
hsa-miR-26a-2*	CCUAUUCUUGAUUACUUGUUUC	227
			hsa-miR-26b	UUCAAGUAAUUCAGGAUAGGU	228
hsa-miR-26b*	CCUGUUCUCCAUUACUUGGCUC	229
			hsa-miR-27a	UUCACAGUGGCUAAGUUCCGC	230
hsa-miR-27a*	AGGGCUUAGCUGCUUGUGAGCA	231
			hsa-miR-27b	UUCACAGUGGCUAAGUUCUGC	232
hsa-miR-27b*	AGAGCUUAGCUGAUUGGUGAAC	233

hsa-miR-28-3p	CACUAGAUUGUGAGCUCCUGGA	234
			hsa-miR-28-5p	AAGGAGCUCACAGUCUAUUGAG	235
hsa-miR-296-3p	GAGGGUUGGGUGGAGGCUCUCC	236
			hsa-miR-296-5p	AGGGCCCCCCCUCAAUCCUGU	237
hsa-miR-297	AUGUAUGUGUGCAUGUGCAUG	238
			hsa-miR-298	AGCAGAAGCAGGGAGGUUCUCCCA	239
hsa-miR-299-3p	UAUGUGGGAUGGUAAACCGCUU	240
			hsa-miR-299-5p	UGGUUUACCGUCCCACAUACAU	241
hsa-miR-29a	UAGCACCAUCUGAAAUCGGUUA	242
			hsa-miR-29a*	ACUGAUUUCUUUUGGUGUUCAG	243
hsa-miR-29b	UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU	244
			hsa-miR-29b-1*	GCUGGUUUCAUAUGGUGGUUUAGA	245
hsa-miR-29b-2*	CUGGUUUCACAUGGUGGCUUAG	246
			hsa-miR-29c	UAGCACCAUUUGAAAUCGGUUA	247
hsa-miR-29c*	UGACCGAUUUCUCCUGGUGUUC	248
			hsa-miR-300	UAUACAAGGGCAGACUCUCUCU	249
hsa-miR-301a	CAGUGCAAUAGUAUUGUCAAAGC	250
			hsa-miR-301b	CAGUGCAAUGAUAUUGUCAAAGC	251
hsa-miR-302a	UAAGUGCUUCCAUGUUUUGGUGA	252
			hsa-miR-302a*	ACUUAAACGUGGAUGUACUUGCU	253
hsa-miR-302b	UAAGUGCUUCCAUGUUUUAGUAG	254
			hsa-miR-302b*	ACUUUAACAUGGAAGUGCUUUC	255
hsa-miR-302c	UAAGUGCUUCCAUGUUUCAGUGG	256
			hsa-m iR-302c*	UUUAACAUGGGGGUACCUGCUG	257
hsa-miR-302d	UAAGUGCUUCCAUGUUUGAGUGU	258
			hsa-miR-302d*	ACUUUAACAUGGAGGCACUUGC	259
hsa-miR-30a	UGUAAACAUCCUCGACUGGAAG	260
			hsa-miR-30a*	CUUUCAGUCGGAUGUUUGCAGC	261
hsa-miR-30b	UGUAAACAUCCUACACUCAGCU	262
			hsa-miR-30b*	CUGGGAGGUGGAUGUUUACUUC	263
hsa-miR-30c	UGUAAACAUCCUACACUCUCAGC	264
			hsa-miR-30c-1*	CUGGGAGAGGGUUGUUUACUCC	265
hsa-miR-30c-2*	CUGGGAGAAGGCUGUUUACUCU	266
			hsa-miR-30d	UGUAAACAUCCCCGACUGGAAG	267
hsa-miR-30d*	CUUUCAGUCAGAUGUUUGCUGC	268
			hsa-miR-30e	UGUAAACAUCCUUGACUGGAAG	269
hsa-miR-30e*	CUUUCAGUCGGAUGUUUACAGC	270
			hsa-miR-31	AGGCAAGAUGCUGGCAUAGCU	271
hsa-miR-31*	UGCUAUGCCAACAUAUUGCCAU	272
			hsa-miR-32	UAUUGCACAUUACUAAGUUGCA	273
hsa-miR-32*	CAAUUUAGUGUGUGUGAUAUUU	274
			hsa-miR-320	AAAAGCUGGGUUGAGAGGGCGA	275
hsa-miR-323-3p	CACAUUACACGGUCGACCUCU	276

hsa-miR-323-5p	AGGUGGUCCGUGGCGCGUUCGC	277
			hsa-miR-324-3p	ACUGCCCCAGGUGCUGCUGG	278
hsa-miR-324-5p	CGCAUCCCCUAGGGCAUUGGUGU	279
			hsa-miR-325	CCUAGUAGGUGUCCAGUAAGUGU	280
hsa-miR-326	CCUCUGGGCCCUUCCUCCAG	281
			hsa-miR-328	CUGGCCCUCUCUGCCCUUCCGU	282
hsa-miR-329	AACACACCUGGUUAACCUCUUU	283
			hsa-miR-330-3p	GCAAAGCACACGGCCUGCAGAGA	284
hsa-miR-330-5p	UCUCUGGGCCUGUGUCUUAGGC	285
			hsa-miR-331-3p	GCCCCUGGGCCUAUCCUAGAA	286
hsa-miR-331-5p	CUAGGUAUGGUCCCAGGGAUCC	287
			hsa-miR-335	UCAAGAGCAAUAACGAAAAAUGU	288
hsa-miR-335*	UUUUUCAUUAUUGCUCCUGACC	289
			hsa-miR-337-3p	CUCCUAUAUGAUGCCUUUCUUC	290
hsa-miR-337-5p	GAACGGCUUCAUACAGGAGUU	291
			hsa-miR-338-3p	UCCAGCAUCAGUGAUUUUGUUG	292
hsa-miR-338-5p	AACAAUAUCCUGGUGCUGAGUG	293
			hsa-miR-339-3p	UGAGCGCCUCGACGACAGAGCCG	294
hsa-miR-339-5p	UCCCUGUCCUCCAGGAGCUCACG	295
			hsa-miR-33a	GUGCAUUGUAGUUGCAUUGCA	296
hsa-miR-33a*	CAAUGUUUCCACAGUGCAUCAC	297
			hsa-miR-33b	GUGCAUUGCUGUUGCAUUGC	298
hsa-miR-33b*	CAGUGCCUCGGCAGUGCAGCCC	299
			hsa-miR-340	UUAUAAAGCAAUGAGACUGAUU	300
hsa-miR-340*	UCCGUCUCAGUUACUUUAUAGC	301
			hsa-miR-342-3p	UCUCACACAGAAAUCGCACCCGU	302
hsa-miR-342-5p	AGGGGUGCUAUCUGUGAUUGA	303
			hsa-miR-345	GCUGACUCCUAGUCCAGGGCUC	304
hsa-miR-346	UGUCUGCCCGCAUGCCUGCCUCU	305
			hsa-miR-34a	UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU	306
hsa-miR-34a*	CAAUCAGCAAGUAUACUGCCCU	307
			hsa-miR-34b	CAAUCACUAACUCCACUGCCAU	308
hsa-miR-34b*	UAGGCAGUGUCAUUAGCUGAUUG	309
			hsa-miR-34c-3p	AAUCACUAACCACACGGCCAGG	310
hsa-miR-34c-5p	AGGCAGUGUAGUUAGCUGAUUGC	311
			hsa-miR-361-3p	UCCCCCAGGUGUGAUUCUGAUUU	312
hsa-miR-361-5p	UUAUCAGAAUCUCCAGGGGUAC	313
			hsa-miR-362-3p	AACACACCUAUUCAAGGAUUCA	314
hsa-miR-362-5p	AAUCCUUGGAACCUAGGUGUGAGU	315
			hsa-miR-363	AAUUGCACGGUAUCCAUCUGUA	316
hsa-miR-363*	CGGGUGGAUCACGAUGCAAUUU	317
			hsa-miR-365	UAAUGCCCCUAAAAAUCCUUAU	318
hsa-miR-367	AAUUGCACUUUAGCAAUGGUGA	319

hsa-miR-367*	ACUGUUGCUAAUAUGCAACUCU	320
			hsa-miR-369-3p	AAUAAUACAUGGUUGAUCUUU	321
hsa-miR-369-5p	AGAUCGACCGUGUUAUAUUCGC	322
			hsa-miR-370	GCCUGCUGGGGUGGAACCUGGU	323
hsa-miR-371-3p	AAGUGCCGCCAUCUUUUGAGUGU	324
			hsa-miR-371-5p	ACUCAAACUGUGGGGGCACU	325
hsa-miR-372	AAAGUGCUGCGACAUUUGAGCGU	326
			hsa-miR-373	GAAGUGCUUCGAUUUUGGGGUGU	327
hsa-miR-373*	ACUCAAAAUGGGGGCGCUUUCC	328
			hsa-miR-374a	UUAUAAUACAACCUGAUAAGUG	329
hsa-miR-374a*	CUUAUCAGAUUGUAUUGUAAUU	330
			hsa-miR-374b	AUAUAAUACAACCUGCUAAGUG	331
hsa-miR-374b*	CUUAGCAGGUUGUAUUAUCAUU	332
			hsa-miR-375	UUUGUUCGUUCGGCUCGCGUGA	333
hsa-miR-376a	AUCAUAGAGGAAAAUCCACGU	334
			hsa-miR-376a*	GUAGAUUCUCCUUCUAUGAGUA	335
hsa-miR-376b	AUCAUAGAGGAAAAUCCAUGUU	336
			hsa-miR-376c	AACAUAGAGGAAAUUCCACGU	337
hsa-miR-377	AUCACACAAAGGCAACUUUUGU	338
			hsa-miR-377*	AGAGGUUGCCCUUGGUGAAUUC	339
hsa-miR-378	ACUGGACUUGGAGUCAGAAGG	340
			hsa-miR-378*	CUCCUGACUCCAGGUCCUGUGU	341
hsa-miR-379	UGGUAGACUAUGGAACGUAGG	342
			hsa-miR-379*	UAUGUAACAUGGUCCACUAACU	343
hsa-miR-380	UAUGUAAUAUGGUCCACAUCUU	344
			hsa-miR-380*	UGGUUGACCAUAGAACAUGCGC	345
hsa-miR-381	UAUACAAGGGCAAGCUCUCUGU	346
			hsa-miR-382	GAAGUUGUUCGUGGUGGAUUCG	347
hsa-miR-383	AGAUCAGAAGGUGAUUGUGGCU	348
			hsa-miR-384	AUUCCUAGAAAUUGUUCAUA	349
hsa-miR-409-3p	GAAUGUUGCUCGGUGAACCCCU	350
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hsa-miR-410	AAUAUAACACAGAUGGCCUGU	352
			hsa-miR-411	UAGUAGACCGUAUAGCGUACG	353
hsa-miR-411*	UAUGUAACACGGUCCACUAACC	354
			hsa-miR-412	ACUUCACCUGGUCCACUAGCCGU	355
hsa-miR-421	AUCAACAGACAUUAAUUGGGCGC	356
			hsa-miR-422a	ACUGGACUUAGGGUCAGAAGGC	357
hsa-miR-423-3p	AGCUCGGUCUGAGGCCCCUCAGU	358
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hsa-miR-424	CAGCAGCAAUUCAUGUUUUGAA	360
			hsa-miR-424*	CAAAACGUGAGGCGCUGCUAU	361
hsa-miR-425	AAUGACACGAUCACUCCCGUUGA	362

hsa-miR-425*	AUCGGGAAUGUCGUGUCCGCCC	363
			hsa-miR-429	UAAUACUGUCUGGUAAAACCGU	364
hsa-miR-431	UGUCUUGCAGGCCGUCAUGCA	365
			hsa-miR-431*	CAGGUCGUCUUGCAGGGCUUCU	366
hsa-miR-432	UCUUGGAGUAGGUCAUUGGGUGG	367
			hsa-miR-432*	CUGGAUGGCUCCUCCAUGUCU	368
hsa-miR-433	AUCAUGAUGGGCUCCUCGGUGU	369
			hsa-miR-448	UUGCAUAUGUAGGAUGUCCCAU	370
hsa-miR-449a	UGGCAGUGUAUUGUUAGCUGGU	371
			hsa-miR-449b	AGGCAGUGUAUUGUUAGCUGGC	372
hsa-miR-450a	UUUUGCGAUGUGUUCCUAAUAU	373
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hsa-miR-452	AACUGUUUGCAGAGGAAACUGA	377
			hsa-miR-452*	CUCAUCUGCAAAGAAGUAAGUG	378
hsa-miR-453	AGGUUGUCCGUGGUGAGUUCGCA	379
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hsa-miR-454*	ACCCUAUCAAUAUUGUCUCUGC	381
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hsa-miR-455-5p	UAUGUGCCUUUGGACUACAUCG	383
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hsa-miR-487a	AAUCAUACAGGGACAUCCAGUU	391
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hsa-miR-488	UUGAAAGGCUAUUUCUUGGUC	393
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hsa-miR-489	GUGACAUCACAUAUACGGCAGC	395
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hsa-miR-490-5p	CCAUGGAUCUCCAGGUGGGU	397
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hsa-miR-493	UGAAGGUCUACUGUGUGCCAGG	401
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hsa-miR-496	UGAGUAUUACAUGGCCAAUCUC	405

hsa-miR-497	CAGCAGCACACUGUGGUUUGU	406
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hsa-miR-498	UUUCAAGCCAGGGGGCGUUUUUC	408
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hsa-miR-499-5p	UUAAGACUUGCAGUGAUGUUU	410
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hsa-miR-500*	AUGCACCUGGGCAAGGAUUCUG	412
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hsa-miR-504	AGACCCUGGUCUGCACUCUAUC	418
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hsa-miR-505*	GGGAGCCAGGAAGUAUUGAUGU	420
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hsa-miR-507	UUUUGCACCUUUUGGAGUGAA	422
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hsa-miR-509-3p	UGAUUGGUACGUCUGUGGGUAG	426
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hsa-miR-510	UACUCAGGAGAGUGGCAAUCAC	428
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hsa-miR-512-3p	AAGUGCUGUCAUAGCUGAGGUC	430
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hsa-miR-514	AUUGACACUUCUGUGAGUAGA	434
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hsa-miR-515-5p	UUCUCCAAAAGAAAGCACUUUCUG	436
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hsa-miR-516a-5p	UUCUCGAGGAAAGAAGCACUUUC	438
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hsa-miR-516b*	UGCUUCCUUUCAGAGGGU	440
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hsa-miR-517a	AUCGUGCAUCCCUUUAGAGUGU	442
			hsa-miR-517b	UCGUGCAUCCCUUUAGAGUGUU	443
hsa-miR-517c	AUCGUGCAUCCUUUUAGAGUGU	444
			hsa-miR-518a-3p	GAAAGCGCUUCCCUUUGCUGGA	445
hsa-miR-518a-5p	CUGCAAAGGGAAGCCCUUUC	446
			hsa-miR-518b	CAAAGCGCUCCCCUUUAGAGGU	447
hsa-miR-518C	CAAAGCGCUUCUCUUUAGAGUGU	448

hsa-miR-518c*	UCUCUGGAGGGAAGCACUUUCUG	449
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			hsa-miR-518e	AAAGCGCUUCCCUUCAGAGUG	452
hsa-miR-518e*	CUCUAGAGGGAAGCGCUUUCUG	453
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hsa-miR-518f*	CUCUAGAGGGAAGCACUUUCUC	455
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hsa-miR-519a*	CUCUAGAGGGAAGCGCUUUCUG	457
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hsa-miR-520a-3p	AAAGUGCUUCCCUUUGGACUGU	465
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hsa-miR-520b	AAAGUGCUUCCUUUUAGAGGG	467
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hsa-miR-520c-5p	CUCUAGAGGGAAGCACUUUCUG	469
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hsa-miR-520f	AAGUGCUUCCUUUUAGAGGGUU	473
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hsa-miR-520h	ACAAAGUGCUUCCCUUUAGAGU	475
			hsa-miR-521	AACGCACUUCCCUUUAGAGUGU	476
hsa-miR-522	AAAAUGGUUCCCUUUAGAGUGU	477
			hsa-miR-522*	CUCUAGAGGGAAGCGCUUUCUG	478
hsa-miR-523	GAACGCGCUUCCCUAUAGAGGGU	479
			hsa-miR-523*	CUCUAGAGGGAAGCGCUUUCUG	480
hsa-miR-524-3p	GAAGGCGCUUCCCUUUGGAGU	481
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hsa-miR-526a	CUCUAGAGGGAAGCACUUUCUG	485
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hsa-miR-526b*	GAAAGUGCUUCCUUUUAGAGGC	487
			hsa-miR-527	CUGCAAAGGGAAGCCCUUUC	488
hsa-miR-532-3p	CCUCCCACACCCAAGGCUUGCA	489
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hsa-miR-539	GGAGAAAUUAUCCUUGGUGUGU	491

hsa-miR-541	UGGUGGGCACAGAAUCUGGACU	492
			hsa-miR-541*	AAAGGAUUCUGCUGUCGGUCCCACU	493
hsa-miR-542-3p	UGUGACAGAUUGAUAACUGAAA	494
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hsa-miR-543	AAACAUUCGCGGUGCACUUCUU	496
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hsa-miR-545	UCAGCAAACAUUUAUUGUGUGC	498
			hsa-miR-545*	UCAGUAAAUGUUUAUUAGAUGA	499
hsa-miR-548a-3p	CAAAACUGGCAAUUACUUUUGC	500
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hsa-miR-548d-3p	CAAAAACCACAGUUUCUUUUGC	506
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hsa-miR-549	UGACAACUAUGGAUGAGCUCU	508
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hsa-miR-550*	UGUCUUACUCCCUCAGGCACAU	510
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hsa-miR-551b	GCGACCCAUACUUGGUUUCAG	512
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hsa-miR-552	AACAGGUGACUGGUUAGACAA	514
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hsa-miR-554	GCUAGUCCUGACUCAGCCAGU	516
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hsa-miR-557	GUUUGCACGGGUGGGCCUUGUCU	520
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hsa-miR-572	GUCCGCUCGGCGGUGGCCCA	535
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hsa-miR-591	AGACCAUGGGUUCUCAUUGU	559
			hsa-miR-592	UUGUGUCAAUAUGCGAUGAUGU	560
hsa-miR-593	UGUCUCUGCUGGGGUUUCU	561
			hsa-miR-593*	AGGCACCAGCCAGGCAUUGCUCAGC	562
hsa-miR-595	GAAGUGUGCCGUGGUGUGUCU	563
			hsa-miR-596	AAGCCUGCCCGGCUCCUCGGG	564
hsa-miR-597	UGUGUCACUCGAUGACCACUGU	565
			hsa-miR-598	UACGUCAUCGUUGUCAUCGUCA	566
hsa-miR-599	GUUGUGUCAGUUUAUCAAAC	567
			hsa-miR-600	ACUUACAGACAAGAGCCUUGCUC	568
hsa-miR-601	UGGUCUAGGAUUGUUGGAGGAG	569
			hsa-miR-602	GACACGGGCGACAGCUGCGGCCC	570
hsa-miR-603	CACACACUGCAAUUACUUUUGC	571
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hsa-miR-605	UAAAUCCCAUGGUGCCUUCUCCU	573
			hsa-miR-606	AAACUACUGAAAAUCAAAGAU	574
hsa-miR-607	GUUCAAAUCCAGAUCUAUAAC	575
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hsa-miR-609	AGGGUGUUUCUCUCAUCUCU	577

hsa-miR-610	UGAGCUAAAUGUGUGCUGGGA	578
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hsa-miR-612	GCUGGGCAGGGCUUCUGAGCUCCUU	580
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hsa-miR-624	CACAAGGUAUUGGUAUUACCU	594
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hsa-miR-625	AGGGGGAAAGUUCUAUAGUCC	596
			hsa-miR-625*	GACUAUAGAACUUUCCCCCUCA	597
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hsa-miR-628-3p	UCUAGUAAGAGUGGCAGUCGA	600
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hsa-miR-629	UGGGUUUACGUUGGGAGAACU	602
			hsa-miR-629*	GUUCUCCCAACGUAAGCCCAGC	603
hsa-miR-630	AGUAUUCUGUACCAGGGAAGGU	604
			hsa-miR-631	AGACCUGGCCCAGACCUCAGC	605
hsa-miR-632	GUGUCUGCUUCCUGUGGGA	606
			hsa-miR-633	CUAAUAGUAUCUACCACAAUAAA	607
hsa-miR-634	AACCAGCACCCCAACUUUGGAC	608
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hsa-miR-636	UGUGCUUGCUCGUCCCGCCCGCA	610
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hsa-miR-638	AGGGAUCGCGGGCGGGUGGCGGCCU	612
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hsa-miR-640	AUGAUCCAGGAACCUGCCUCU	614
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hsa-miR-642	GUCCCUCUCCAAAUGUGUCUUG	616
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hsa-miR-644	AGUGUGGCUUUCUUAGAGC	618
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hsa-miR-646	AAGCAGCUGCCUCUGAGGC	620

hsa-miR-647	GUGGCUGCACUCACUUCCUUC	621
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hsa-miR-649	AAACCUGUGUUGUUCAAGAGUC	623
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hsa-miR-651	UUUAGGAUAAGCUUGACUUUUG	625
			hsa-miR-652	AAUGGCGCCACUAGGGUUGUG	626
hsa-miR-653	GUGUUGAAACAAUCUCUACUG	627
			hsa-miR-654-3p	UAUGUCUGCUGACCAUCACCUU	628
hsa-miR-654-5p	UGGUGGGCCGCAGAACAUGUGC	629
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hsa-miR-656	AAUAUUAUACAGUCAACCUCU	631
			hsa-miR-657	GGCAGGUUCUCACCCUCUCUAGG	632
hsa-miR-658	GGCGGAGGGAAGUAGGUCCGUUGGU	633
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hsa-miR-660	UACCCAUUGCAUAUCGGAGUUG	635
			hsa-miR-661	UGCCUGGGUCUCUGGCCUGCGCGU	636
hsa-miR-662	UCCCACGUUGUGGCCCAGCAG	637
			hsa-miR-663	AGGCGGGGCGCCGCGGGACCGC	638
hsa-miR-665	ACCAGGAGGCUGAGGCCCCU	639
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hsa-miR-671-3p	UCCGGUUCUCAGGGCUCCACC	641
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hsa-miR-672	UGAGGUUGGUGUACUGUGUGUGA	643
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hsa-miR-675	UGGUGCGGAGAGGGCCCACAGUG	645
			hsa-miR-7	UGGAAGACUAGUGAUUUUGUUGU	646
hsa-miR-708	AAGGAGCUUACAAUCUAGCUGGG	647
			hsa-miR-708*	CAACUAGACUGUGAGCUUCUAG	648
hsa-miR-7-1*	CAACAAAUCACAGUCUGCCAUA	649
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hsa-miR-744	UGCGGGGCUAGGGCUAACAGCA	651
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hsa-miR-758	UUUGUGACCUGGUCCACUAACC	653
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hsa-miR-765	UGGAGGAGAAGGAAGGUGAUG	655
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hsa-miR-767-3p	UCUGCUCAUACCCCAUGGUUUCU	657
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hsa-miR-768-3p	UCACAAUGCUGACACUCAAACUGCUGAC	659
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hsa-miR-770-5p	UCCAGUACCACGUGUCAGGGCCA	663

hsa-miR-801	GAUUGCUCUGCGUGCGGAAUCGAC	664
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hsa-miR-877	GUAGAGGAGAUGGCGCAGGG	674
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hsa-miR-886-3p	CGCGGGUGCUUACUGACCCUU	678
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hsa-miR-887	GUGAACGGGCGCCAUCCCGAGG	680
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hsa-miR-888*	GACUGACACCUCUUUGGGUGAA	682
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hsa-miR-891b	UGCAACUUACCUGAGUCAUUGA	686
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hsa-miR-9*	AUAAAGCUAGAUAACCGAAAGU	690
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hsa-miR-921	CUAGUGAGGGACAGAACCAGGAUUC	692
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hsa-miR-936	ACAGUAGAGGGAGGAAUCGCAG	706

hsa-miR-937	AUCCGCGCUCUGACUCUCUGCC	707
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hsa-miR-939	UGGGGAGCUGAGGCUCUGGGGGUG	709
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hsa-miR-941	CACCCGGCUGUGUGCACAUGUGC	711
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hsa-miR-96*	AAUCAUGUGCAGUGCCAAUAUG	717
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hsa-miR-99a	AACCCGUAGAUCCGAUCUUGUG	719
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hsa-miR-99b	CACCCGUAGAACCGACCUUGCG	721
			hsa-miR-99b*	CAAGCUCGUGUCUGUGGGUCCG	722
hsv-1miR-LAT	UGGCGGCCCGGCCCGGGGCC	723

在另一种实施方式中，所述微RNA的种子序列选自由任意SEQ ID NO：1-723中的位置1-20、位置1-19、位置1-18、位置1-17、位置1-16、位置1-15、位置1-14、位置1-13、位置1-12、位置1-11、位置1-10、位置1-9、位置1-8、位置1-7、位置1-6、位置2-20、位置2-19、位置2-18、位置2-17、位置2-16、位置2-15、位置2-14、位置2-13、位置2-12、位置2-11、位置2-10、位置2-9、位置2-8、位置2-7、位置2-6、位置3-20、位置3-19、位置3-18、位置3-17、位置3-16、位置3-15、位置3-14、位置3-13、位置3-12、位置3-11、位置3-10和位置3-9所组成的组中。

在一种更优选的实施方式中，所述微RNA的种子序列选自由任意SEQ IDNO：1-723中的位置1-10、位置1-9、位置1-8、位置1-7、位置1-6、位置2-10、位置2-9、位置2-8、位置2-7、位置2-6、位置3-10和位置3-9所组成的组中。

在一种最优选的实施方式中，所述微RNA的种子序列选自由任意SEQ IDNO：1-723中的位置1-8、位置1-7、位置2-8和位置2-7所组成的组。

本发明的寡核苷酸的活性

如将要说明的是，本发明的寡核苷酸具有各种实用性和优势。核糖核酸酶H的切割(cleavage)

在一种实施方式中，寡核苷酸引起了对靶RNA的靶区的可及性的利用。在该实施方式中，所述寡核苷酸可以激活核糖核酸酶H对靶的切割。由于提高了靶的可及性，即使当所述寡核苷酸较短时，例如，约为10个碱基或者仅为引导序列时，所述寡核苷酸还是将优先地影响靶RNA的活性。即，由于可及性较低，其它的互补区可能不会被靶定。它们可能被掩埋在RNA二级结构中或由于它们参与了蛋白质结合而变得不具有可及性。

核糖核酸酶H将切割RNA-DNA双链的RNA部分。对于核糖体核酸酶H活化的结构要求是本领与技术人员公知的。该机理被普遍地用于实现传统的反义调控，例如通过使用所谓的“缺口产生物(gapmer)”。缺口产生物是含有具有脱氧糖(缺口)和被修饰的侧翼(flank)的反义核苷酸。缺口产生物通常含有硫代磷酸核苷酸间键合(phosphorothioate internucleotide linkage)以提高生物稳定性，并且所述侧翼包括也提高了生物稳定性的例如2-O-修饰，即，对溶核酸攻击的耐受性。所述侧翼还可以包括提高了与互补核酸配对的缺口产生物碱基的解链温度。本文还描述了头部产生结构(headmer structure)和尾部产生结构(endmer structure)。

在另一种优选的实施方式中，所述寡核苷酸不能诱导核糖核酸酶H对靶RNA的切割。本领与技术人员可以知道对核糖核酸酶H的切割要求，并且将能够设计激活或不激活核糖核酸酶H的寡核苷酸。

因此，在一种优选的实施方式中，所述寡核苷酸不含有长度超过选自由3个碱基、4个碱基、5个碱基、6个碱基、7个碱基、8个碱基、9个碱基、10个碱基和11个碱基所组成的组中的未被修饰的DNA的段。最优选地，所述未被修饰DNA的段不超过3个碱基。

在另一种优选实施方式中，所述寡核苷酸不含有任何的DNA单体。

RNA干扰机器的募集

RNA干扰机器是一种由RNA引导的复杂的基因调控系统。因此，微RNA引导RNA干扰机器以mRNA为靶从而影响靶mRNA的活性。RNA干扰机器可以直接影响mRNA的翻译，或者RNA干扰机器可以影响靶mRNA的稳定性，即，介导靶mRNA的直接降解。不受到理论所限制地，认为微RNA和靶mRNA之间的互补能力是靶mRNA是否受到了翻译调控或降解的关键因素。

内源性微RNA由前体茎环处理得到，并且被结合到被称为RNA诱导的沉默复合物(RISC复合物)中。目前仍然缺乏对该过程的具体的了解。

细胞RNA干扰机器通过向细胞内引入合成的双链RNA复合物(被称为siRNA)被广泛地用于影响细胞mRNA的活性。如以上所描述地，siRNA是含有过客链(passenger strand)和互补的引导链的短双链RNA复合物。当RISC复合物能对含有与所述引导链互补的序列的mRNA的活性产生影响时，siRNA的引导链结合到RISC复合物内。因此，认为siRNA是能够有效并特异性地靶定任意的mRNA的新型化合物，从而认为siRNA具有作为新型治疗剂的潜力。

siRNA和微RNA共有的特征是它们使细胞RNA干扰复合物募集以影响靶RNA活性。

在一种实施方式中，本发明的寡核苷酸能够募集RNA干扰机器并因此将该RNA干扰机器引导到靶RNA上。这可能导致靶RNA的切割或靶RNA的翻译抑制。在该实施方式中，所述寡核苷酸可以为siRNA。即，所述寡核苷酸与互补的寡核苷酸杂交，通常超过20-22个碱基的长度，并且经常具有1-3个碱基的3’悬臂结构。如其名称所暗示地，siRNA必要地含有RNA单体，即使是被修饰的(例如，在一些位置上可以接受2’-O-修饰)。

寡核苷酸还可以用作为微RNA而不需要与天然产生的微RNA相同。当所述寡核苷酸用作为微RNA时，它必要地含有RNA单体，即使在一些位置上可以接受修饰。所述寡核苷酸可以具有类似于成熟的内源性微RNA或者类似于前体微RNA(在茎中具有凸起的茎环)的结构，该前体微RNA将被切块酶(dicer)加工为成熟的微RNA。

本发明的寡核苷酸在天然产生的微RNA通常对许多靶RNA进行调控的地方用作可能被设计为仅调控少数靶RNA或仅调控一种靶RNA的微RNA。可以通过设计使寡核苷酸仅靶定一种或少数靶来调整寡核苷酸的混杂性。通过使用通用碱基，也可以在寡核苷酸内设计大量的混杂性。将在下文对通用碱基进行更详细的讨论。还可以通过减少寡核苷酸的长度来引入混杂性。

重要的是，当本发明的寡核苷酸能募集RNA干扰机器时，它们仍然引起对靶RNA的靶区的可及性的利用。

阻断微RNA(blockmir)

在另一种实施方式中，寡核苷酸不能使RNA干扰机器募集。在该实施方式中，优选本发明的寡核苷酸能够阻断特定靶RNA上的RNA干扰机器活性。如以上所描述地，所述寡核苷酸可以通过掩蔽靶RNA的靶序列来达到上述目的，使RNA干扰机器与所述寡核苷酸进行碱基配对而不会识别靶序列。具有这种活性的本发明的寡核苷酸也可以被称为阻断微RNA。

在一种优选的实施方式中，所述寡核苷酸能够阻断特定靶RNA上的微RNA的调控活性。优选地，所述微RNA为内源性微RNA.

在本申请的优先权日期之后，有两组公开了能够在给定的mRNA阻断微RNA的调控活性的寡核苷酸的例子。

在第一组公开中(肖J(Xiao J)，2007)，被称为微RNA掩蔽反义ODN(寡脱氧核苷酸)的寡核苷酸被用来干扰微RNA-1(mir-1)在HCN2和HCN4上的调控活性和微RNA-133(mir-133)在HCN2上的调控活性。当过通过使用培养的新生大鼠心室肌细胞的免疫印迹法和使用HEK293人胚肾细胞系的荧光素酶分析测定时，观察到微RNA掩蔽的反义以基因特异性的方式增加了HCN2和HCN4的蛋白质水平。即，验证了阻断微RNA的作用机理。换而言之，证实了在mRNA的3’UTR处结合到微RNA的靶位点的寡核苷酸能够预防哺乳动物(大鼠和人类)细胞内的mRNA的微RNA调控。

然而，在肖(Xiao)等人的工作中所设计的阻断微RNA还留有一些问题没有解决。微RNA掩蔽的反义ODN含有具有在两端具有5个LNA单体的脱氧核苷酸。因此，寡核苷酸的中心部分显然含有12个未被修饰的同样核苷酸的段。通常认为这种结构活化了核糖核酸酶H并因此介导靶RNA的降解。

在第二组公开中(崔WY(Choi WY)，2007)阻断微RNA(被称为靶保护剂)被用来防止特定mRNA在斑马鱼(zebrafish)内的微RNA调控。更具体地说，作者使用了25个与斑马鱼中的斜视(squint)mRNA和左侧mRNA中的mir-430靶位点完全互补的单元的吗啉代寡核苷酸，以防止靶mRNA的mir-430调控(斜视和左侧)。因此，作者用与肖等人不同的有机体来验证了阻断微RNA的途径，并且他们还验证了可以使用不同的化学性质。

我们认为阻断微RNA活性的本质是与微RNA的靶位点有关，并且这能够使用各种化学性质并在各种有机体中实现。

在本申请的优先权日之后公开的报告中研究了通过人类RISC对用于靶RNA鉴别和切割的分子基础进行了研究(阿米尔斯SL(Ameres SL)，2007)。作者们发现靶的可及性决定了RISC介导的在体外和体内的切割。其中，他们使用与siRNA靶位点互补的寡核苷酸来阻断了靶的可及性，即，所述寡核苷酸可以被视为作用与本发明的阻断微RNA功能相似的物质，不同的是，它们所靶定的siRNA靶位点是由完全互补的siRNA调控的。有意思的是，作者发现在对退火到siRNA的3’部分的区域内的21个核苷酸靶序列的3个或6个核苷酸的阻断对调控没有效果(通过使用亲和纯化的人RISC的切割速率可以看出)。相反，对退火到siRNA的5’部分的区域内的靶位点的5个核苷酸的阻断极大的影响了调控(通过切割可以发现)，并且甚至仅阻断2个核苷酸即可影响调控。

再回到本发明的阻断微RNA，如果所述微RNA是靶RNA的正的调节物，则寡核苷酸将是靶RNA的负调节物。

更通常地，微RNA是靶RNA的负调节物。因此，在另一种实施方式中，寡核苷酸是靶RNA的正的调节物。这与传统的通常作用为负的调节物的反义寡核苷酸、微RNA和siRNA相反。

在一种优选的实施方式中，本发明的阻断微RNA为DNA，这是由于这些不会被RNA干扰机器鉴别并以此起到既不是微RNA也不是siRNA的作用。优选地，DNA单元被修饰从而防止核糖核酸酶H的活化。可选择地，存在的连续的DNA单元少于5个，例如少于4个连续的DNA单元和少于3个连续的DNA单元。

在另一种实施方式中，所述阻断微RNA不含有任何DNA单元。

在另一种实施方式中，所述阻断微RNA不含有任何RNA单元。

在另一种实施方式中，所述阻断微RNA不含有不超过长度超过选自由5个单元、6个单元、7个单元、8个单元、9个单元、10个单元、11个单元、12个单元、13个单元、14个单元、15个单元、16个单元、17个单元、18个单元、19个单元、20个单元、21个单元和22个单元所组成的组中的RNA单元的段。

在一种实施方式中，所述寡核苷酸被化学修饰，例如不能使RNA干扰机器募集。优选的修饰包括2’-O-修饰，例如2’-甲基和2’-O-F。共轭的RNA也是优选地。例如，与胆固醇部分共轭的RNA，其中所述胆固醇可以在防止寡核苷酸募集RNA干扰机器的同时改进该寡核苷酸的生物利用度。所述胆固醇部分可以与寡核苷酸的引导链内的单体共轭，或者在寡核苷酸的3’端或5’端进行共轭。更多的修饰将在下文中进行描述。

在另一种实施方式中，所述阻断微RNA可以含有混合的DNA单元和RNA单元从而防止寡核苷酸活化核糖核酸酶H并同时防止所述寡核苷酸募集RNA干扰机器。例如，DNA单元后可以跟着RNA单元，该RNA单元之后由可以再跟有DNA单元，等等。此外，在优选的实施方式中，硫代磷酸核苷酸间键合可以连接这些单元以提高寡核苷酸的生物稳定性。DNA单元和RNA单元均能被修饰。优选地，RNA单元在2’-O-位置(2’-O-甲基、LNA等)被修饰。

在另一种实施方式中，所述寡核苷酸(阻断微RNA)含有混合的DNA单元和RNA单元以防止所述寡核苷酸活化核糖核酸酶H并同时防止所述寡核苷酸募集RNA干扰机器，其中，所述DNA单元和RNA单元为阻断物。所述阻断物可以具有2个单元、3个单元、4个单元、5个单元或6个单元的长度，并且不同长度可以含有相同的寡核苷酸。DNA单元和RNA单元均被修饰，优选地，RNA单元在在2’-O-位置(2’-O-甲基、LNA等)被修饰。

在一种优选的实施方式中，所述寡核苷酸内还含有选自LNA单元、INA单元和吗啉代单元的组的单元。在另一种优选的实施方式中，所述寡核苷酸含有混合的LNA单元和具有2’-O-甲基的RNA单元。这种混合物被用作1型人类免疫缺陷病毒Tat依赖方式激活的和HIV-I感染的空间阻断抑制剂。

在另一种实施方式中，所述阻断微RNA全部由选自2’-O-修饰的单元、LNA单元、PNA单元、INA单元和吗啉代单元所组成的组的单元组成。在一种实施方式中，所述单元是混合的，而在另一种实施方式中，所述阻断微RNA仅含有这些单元中的一种。

在另一种实施方式中，所述阻断微RNA被设计成能够结合多于一个靶RNA。可以使用通用碱基在阻断微RNA内设计产生杂乱性。减少阻断微RNA的长度也能增加杂乱性。因此，在一种实施方式中，所述阻断微RNA可以仅含有与微RNA的种子序列相对应的引导序列。在该实施方式中，优选使用增加亲和性的修饰并且所述寡核苷酸可以在2’-O-位置被完全修饰，例如2’-O-甲基、2’-O-氟、2’-O-(2-甲氧基乙基)或该核苷酸可以为被锁定的(LNA)。

脱靶效应

在大多数实施方式中，阻断微RNA的脱靶结合将具有很少或者不产生效果。这与反义微RNA相反，由siRNA和微RNA介导了RNA干扰，并且核糖核酸酶H介导了反义调控，这可能导致脱靶效应的发生。只有在阻断微RNA结合到微RNA靶区上才会产生效果并因而阻止靶RNA的微RNA调控。

因此，在一种优选的实施方式中，与使用反义微RNA来调控靶RNA活性相比，阻断微RNA将具有减少的脱靶效应。

本说明书上下文中使用的反义微RNA指的是能够与未RNA碱基配对并从而抑制该微RNA活性的寡核苷酸。由于许多微RNA是杂乱无章的，即，它们调控多于一个的靶，对特定的微RNA的调控将影响到不止一个靶mRNA的活性。因此，当期望仅调控一种特定的靶mRNA的活性时，可以将对其他的靶mRNA的调控称为反义微RNA的脱靶效应。

使用(外源)混杂的微RNA(promiscuous microRNA)来影响或调控靶mRNA的活性，相反，反义微RNA也可能显著地含有脱靶效应。

此外，给定的微RNA的靶的所有组成成分可以在不同的细胞中不同，为此，反义微RNA可以在不同的细胞内具有不同的脱靶效应。与使用混杂的微RNA进行调控相同。阻断微RNA可以仅对特定细胞产生效果，其中靶RNA由微RNA调控。因此，阻断微RNA使得能够以细胞特异性微RNA：mRNA互相作用为靶。如果阻断微RNA进入不具有特定的微RNA：mRNA互相作用的细胞，该阻断微RNA将具有很少或者不产生效果。

siRNA为含有过客链和介导靶mRNA降解的引导链的双链RNA复合物，所述靶mRNA与所述RNA复合物的引导链互补。已经认识到siRNA通常具有脱靶效应，由于用作引导链的链还可以用作微RNA，即，siRNA可以介导靶mRNA的调控作用，所述靶mRNA与所述siRNA的引导链不完全互补。

因此，在一种实施方式中，与引导到相同的靶mRNA上的siRNA相比，本发明的阻断微RNA将具有减少的脱靶效应。

在另一种优选的实施方式中，与使用传统的用来调控靶mRNA的反义寡核苷酸相比，阻断微RNA还将具有减少的脱靶效应。

传统的反义寡核苷酸通常被设计为介导它们的靶RNA的核糖核酸酶H的切割。核糖核酸酶H对RNA和DNA的双链进行切割。

因此，如果这种寡核苷酸与非目标性的mRNA进行碱基配对时，该mRNA将被核糖核酸酶H失活，并因此产生脱靶效应。

总而言之，本发明的阻断微RNA的特征在于他们通过防止靶RNA的微RNA调控来影响RNA活性。因此，与传统的反义寡核苷酸、反义微RNA以及使用了微RNA和siRNA的RNA干扰介导的调控相比，本发明的阻断RNA将具有减少的脱靶效应。

当设计短阻断微RNA时，显然需要考虑转录组(transcriptome)可以含有多于一个与阻断微RNA完全互补的位置。然而，如以上所述地，如果靶序列还是用于微RNA调控的靶序列，则该阻断微RNA将仅影响靶RNA。因此，即使是非常短的阻断微RNA的脱靶效应和非常小。因此，阻断微RNA可以被有意地涉设计为以许多位置为靶。由于更具有可及性，阻断微RNA将优先地结合到微RNA靶位点上，并且仅在所述阻断微RNA防止微RNA结合到靶位点上时才产生效果。

化学性质

在本发明的寡核苷酸的优选实施方式中，所述寡核苷酸含有增加了其对互补序列的亲和性的核苷酸单体或者含有亲和性增加的修饰。这对于短寡核苷酸是特别相关的，并可以允许产生非常短的活化寡核苷酸，例如，长度为10-15个碱基或甚至少于10个碱基，例如仅为相应于微RNA的种子序列的引导序列。

增加了对互补序列的亲和性的核苷酸单元可以为例如LNA(锁核酸)单元、PNA(肽核酸)单元或INA(嵌入性核酸)单元。在2-O-位置(例如，2’-O-(2-甲氧基乙基)、2’-O-甲基RNA、2’-O-氟-RNA)被修饰的RNA单元也增加了对互补序列的亲和性。同时，由于变成了对细胞核酸酶的较劣的底物，这种修饰通常还提高了寡核苷酸的生物稳定性。

寡核苷酸还可以含有增加其生物稳定性和/或生物利用度的修饰，例如硫代磷酸酯键(phosphorothioate)合。所述寡核苷酸可以被全部地硫代磷酸化，或者仅部分地被硫代磷酸化。

在一种优选的实施方式中，所述寡核苷酸含有一个或多个LNA单元的重复模式，并且一个或多个单元在T位置被取代。OMe/LNA混合物(mixmer)表现用作由蛋白质-RNA互相作用调控的基因表达的空间阻断抑制剂的有力试剂。因此，当本发明的寡核苷酸用于在靶RNA上阻断微RNA活性，可以使用OMe/LNA混合物构造。还可以使用缺口产生物(gapmer)结构，然而，如果所述寡核苷酸目的在于起到阻断微RNA的作用，则优选不能诱导核糖核酸酶H。

在一种实施方式中，本发明的寡核苷酸不含有任何RNA单元。使用少量的或不使用RNA单元来防止寡核苷酸募集RNA干扰机器。化学的修饰也可以同样地实现该目的。

在另一种实施方式中，本发明的寡核苷酸不含有任何DNA单元。

在另一种实施方式中，本发明的寡核苷酸不含有任意的吗啉代单元和/或LNA单元。

在另一种实施方式中，所述寡核苷酸含有增加其生物稳定性的修饰。该修饰可以为上述用来增加对互补序列的亲和性的核苷酸单元。

在一种优选的实施方式中，所述寡核苷酸含有增加对互补序列的亲和性的核苷酸单元的数量为选自由1个单元、2个单元、3个单元、4个单元、5个单元、6个单元、7个单元、8个单元、9个单元、10个单元、11个单元、12个单元、13个单元、14个单元、15个单元、16个单元、17个单元、18个单元、19个单元、20个单元、21个单元、和22个单元所组成的组中。

在一种优选的实施方式中，增加了对互补序列的亲和性的核苷酸单元位于所述寡核苷酸的两侧。例如，如果所述寡核苷酸含有例如10个LNA单元，可能有5个位于5’端而其他的5个单元可以位于3’端。

在另一种实施方式中，所述寡核苷酸含有增加其生物利用度的修饰。提高了细胞运输的修饰是特别优选的。混杂性(promiscuity)和特异性

在另一种实施方式中，本发明的寡核苷酸可以含有杂交不特定的核苷酸。这种核苷酸含有所谓的通用碱基。其特征在于他们相对于任意的碱基地配合到沃森-克里克螺旋中。因此，它们可以用来为本发明的寡核苷酸赋予一定的杂乱性。如果所述寡核苷酸想要靶定两种特定的mRNA则可以使用该结构。

在一种优选的实施方式中，希望靶定特定的微RNA的大部分或全部的靶。在该情况下，所述寡核苷酸可以含有相应于所述微RNA的种子序列的引导序列，和一个或两个天然碱基(natural bases)的模块。可以调整所述天然碱基的模块的大小因而实现对靶序列的合适的亲和性。

在另一种实施方式中，本发明的寡核苷酸含有选自由3-硝基吡咯(nitropyrrole)、5-硝基吲哚、3-甲基异喹诺酮(3-methyl isocarbostyril)或5-甲基异喹诺酮所组成的组中的通用碱基。

在一种实施方式中，本发明的寡核苷酸可以含在侧端的3’侧、5’侧或这两侧连接的有通用碱基的引导序列。可以使用这种寡核苷酸来模拟微RNA的混杂特异性，并以此在微RNA的多个靶RNA或甚至全部的靶RNA上阻断微RNA活性。也可以用通用碱基和例如肌苷的结合来设计仅以微RNA的靶RNA的子集为靶的寡核苷酸。

在一种实施方式中，在引导序列和第二序列之间的碱基为通用碱基。

在另一种实施方式中，任何不是引导序列和第二序列的部分的碱基为通用碱基。

通用碱基会降低寡核苷酸的解链温度，因此，优选通过结合增加亲和性的修饰或单元(例如LNA单元或2’-O-甲基)来抵消这种降低。

单链对双链

在一些实施方式中，本法明的寡核苷酸优选不与互补的寡核苷酸进行碱基配对或者不倾向于与互补的寡核苷酸进行碱基配对而使用，即，它应该为单链的以促进与靶RNA的互相作用，并且在一些实施方式中，还能防止对RNA干扰机器的募集。

在另一种实施方式中，所述寡核苷酸与互补的寡核苷酸进行碱基配对。在一些情况中，希望所述寡核苷酸与互补寡核苷酸进行碱基配对以促进运输到细胞中和/或细胞间的运输。在有机体内的运输也得到了促进。此外，生物稳定性也受到了积极的影响。

当寡核苷酸用作为siRNA时，也可以使用与互补寡核苷酸的碱基配对。当寡核苷酸用作为外源性微RNA时，它可以形成茎环结构。

在另一种实施方式中，当寡核苷酸进入其靶细胞时，所述寡核苷酸与由核糖核酸酶H降解的RNA分子进行碱基配对。以此方式，所述寡核苷酸被就地释放。在一种优选的实施方式中，互补的寡核苷酸与本发明的寡核苷酸不是同一类型。例如，如果所述寡核苷酸为RNA，则互补寡核苷酸将不是RNA。

递送

用来递送寡核苷酸的各种方法是本领域技术人员已知的。因此，寡核苷酸可以被配制为微粒和纳米颗粒。脂质体通常用作为递送载体，并且存在各种脂质体递送系统。它们可以例如含有阳离子脂质或中性脂质。它们的大小可个根据不同的目的而不懂，并且可以在该脂质体内或脂质体的表面含有其它的成分。壳聚糖纳米颗粒被用于在主要细胞之间向各种细胞递送质粒和siRNA。因此，还可以使用壳聚糖纳米颗粒递送本发明的寡核苷酸。其它的用于递送的聚合物为聚乙烯亚胺(PEI)、环糊精、去端胶原(atelocollagen)、聚酰胺胺(PAMAM)和聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)。此外，本发明的寡核苷酸可以与阳离子肽共轭，所述阳离子肽已经表示出促进向细胞内的运输。

第二方面-调节靶RNA活性的方法

本发明的第二方面是调节靶RNA活性的方法，该方法包括以下步骤：

a.提供含有靶RNA的系统

b.提供含有与所述靶RNA的靶区互补的反义序列的寡核苷酸

c.将所述步骤b的寡核苷酸引入所述步骤a的系统中

d.从而调节所述靶RNA活性。

优选地，所述寡核苷酸为如在本发明的第一方面的各种实施方式中所描述的本发明的寡核苷酸。

并且优选地，所述靶RNA含有反义的种子序列，该反义的种子序列与所述寡核苷酸的引导序列互补。

在一种优选的实施方式中，所述寡核苷酸橘子了微RNA在靶RNA的活性并因此调节了所述靶RNA的活性。即，所述寡核苷酸为在第一方面所描述的阻断微RNA。

在另一种实施方式中，所述寡核苷酸诱导核糖核酸酶H对靶RNA的切割并因此调控所述靶RNA活性。

在另一种实施方式中，所述寡核苷酸使RNA干扰机器募集以靶定RNA。RNA干扰机器的募集可以导致靶RNA的翻译抑制或所述靶RNA的降解。

优选地，所述系统可以为细胞抽提物或细胞。该方法可以在体内、离体或体外进行。

在一种实施方式中，该方法为用于验证寡核苷酸活性的方法，即，证实所述寡核苷酸是否能够确实地调节靶RNA活性，并且调节到什么程度。当为了证实寡核苷酸具有最佳活性时可以使用该方法，例如，用于治疗的开发。在这种测试中，通常会寡核苷酸的不同长度和化学性质进行测试。

在另一种实施方式中，该方法为证实或验证靶RNA的微RNA靶的方法。通常地，假设微RNA调控给定的靶RNA，并且在这种情况下，第二方面的方法是证实所述靶RNA是否确实由微RNA调控的方法。因此，该方法可以还包括确认调控所述靶RNA的微RNA。由于所述靶RNA应该含有与所述微RNA的种子序列互补的翻译种子序列，因此这是可能的。

第三方面-提供具有生物活性的寡核苷酸

本发明的第三方面的方法包括以下步骤：

a.提供由微RNA调控的(预定的)靶RNA的靶序列，所述靶序列为参与微RNA调控的靶RNA的序列

b.设计寡核苷酸序列，该寡核苷酸序列含有与所述靶序列互补的至少6个碱基的连续的碱基段(反义序列)

c.合成所述步骤b的寡核苷酸序列，所述寡核苷酸为靶RNA活性的候选调节物。

在一种优选的实施方式中，该方法为提供具有生物活性的寡核苷酸。

优选地，连续的碱基段含有相应于调控所述靶RNA的微RNA的种子序列的引导序列。

优选地，该方法还包括以下步骤

a.提供用于所述靶RNA活性的报告系统

b.在所述候选调节物存在时测定所述靶RNA的活性

c.在所述候选调节物不存在时测定所述靶RNA的活性

d.比较所述b和c中的活性水平，并因此证实所述寡核苷酸是否确实能够调控RNA活性和/或RNA的潜在靶序列是否确实是靶序列。

在另一种优选的实施方式中，该方法还包括在存在阴性对照的情况下测定靶RNA活性，所述阴性对照为不与靶RNA中的任何区域互补的寡核苷酸。在另一种相关的实施方式中，所述阴性对照为与其用作对照的寡核苷酸互补的寡核苷酸。在另一种实施方式中，所述阴性对照与布什所述靶RNA的靶区的部分的区域互补。优选地，所述寡核苷酸及其阴性对照属于相同的类型，即，RNA，混合的RNA和DNA，并含有相同的修饰和类似于例如LNA或INA的核苷酸。

优选地，所述靶RNA的活性为表达，并且所述靶RNA为mRNA。

因此，当使用报告系统测试了这些寡核苷酸的活性(例如，证实这些寡核苷酸是否确实具有期望的活性，即，能够调控所述靶RNA活性)之后时，首先确认了潜在地能调控靶RNA活性的寡核苷酸(候选调节物)。

优选地，本发明的第三方面提供的寡核苷酸为本发明的寡核苷酸。

所述靶RNA的活性优选为基因表达活性，并且所述靶RNA优选为mRNA。所述靶RNA还可以为病毒基因组RNA，并且所述活性为例如复制活性。

所述预定的靶序列可以为检索自学术出版物或被证实的微RNA靶的数据库。

报告系统

用于表达的报告系统可以为能够读出指示性的靶RNA活性。它可以是例如含有基因构建体的细胞，其中所述靶RNA被融合到另一种报告基因中。

在一种优选的实施方式中，所述靶RNA的靶序列在mRNA的3’-非翻译的区域中。在这种情况下，3’UTR可以融合到报告基因中而不必须含有余下的靶RNA。

所述报告基因可以为例如荧光素酶基因或绿色荧光蛋白(GFP)基因。这种报告系统为本领域技术人员所公知的。

所述报告系统还可以为含有内源性靶mRNA的细胞。在这种实施方式中，靶mRNA的活性(表达)可以通过使用抗体靶定的多肽或由所述mRNA编码的蛋白质的免疫印迹法测定。也可以使用二维凝胶分析(2D-gel analysis)或蛋白芯片来测定靶mRNA的活性。

可以使用微阵列、RNA印迹法(Northern blots)和实时PCR(也被称为定量PCR)来测定mRNA水平的任何效果。这些报告系统也是本领域技术人员所公知的。

使用种子序列和反义种子序列

在一种优选的实施方式中，第三方面的方法还包括提供调控靶RNA的微RNA的序列并且使用该微RNA的种子序列以测定靶序列的反义种子序列。

调控靶RNA的微RNA的序列可以为例如，检索自学术论文或来自数据库。收集微RNA序列的这种数据库之一被称为miRBase(http://microrna.sanger.ac.uk/sequences/)。在一种优选的实施方式中，微RNA的序列检索自描述了由微RNA调控靶mRNA的学术论文。在另一种实施方式中，在从数据库中检索了微RNA序列之后，调控靶mRNA的微RNA的鉴别检索自学术出版物。该信息通常是第三方面的方法的起点。

微RNA的种子序列通常位于该微RNA的5’端。种子序列是引人关注的原因是认为种子序列是被特定微RNA调控的靶mRNA的重要的预报因子。即，认为它们与靶mRNA上的互补区碱基配对。这种靶mRNA上的互补区在本文中也被称为反义种子区或反义种子序列。遗憾的是，种子序列通常过短而不能对靶mRNA进行预测，即在细胞的转录组中有太多的反义种子序列。因此，由给定的微RNA调控的靶mRNA的鉴别依然存在极大的挑战，并且目前转向于实验证明而不是理论预测。

虽然如此，在测定mRNA由微RNA调控方面正在不断地做出努力，并且本发明的一个目的在于使用这种知识来进行第三方面的方法并且设计和提供本发明的寡核苷酸。

在一种优选的实施方式中，靶mRNA的靶区包含在3’UTR内并且含有与选自由任意SEQ ID NO：1-723的位置1-20、位置1-19、位置1-18、位置1-17、位置1-16、位置1-15、位置1-14、位置1-13、位置1-12、位置1-11、位置1-10、位置1-9、位置1-8、位置1-7、位置1-6、位置2-20、位置2-19、位置2-18、位置2-17、位置2-16、位置2-15、位置2-14、位置2-13、位置2-12、位置2-11、位置2-10、位置2-9、位置2-8、位置2-7、位置2-6、位置3-20、位置3-19、位置3-18、位置3-17、位置3-16、位置3-15、位置3-14、位置3-13、位置3-12、位置3-11、位置3-10和位置3-9所组成的组中的序列互补的序列。

在更优选的实施方式中，靶mRNA的靶区包含在3’UTR内，并含有与选自由任意SEQ ID NO：1-723的位置1-10、位置1-9、位置1-8、位置1-7、位置1-6、位置2-10、位置2-9、位置2-8、位置2-7、位置2-6、位置3-10和位置3-9所组成的组中的序列互补的序列。

在最优选的实施方式中，靶mRNA的靶区包含在3’UTR内，并含有与选自由任意SEQ ID NO：1-723的位置1-8、位置1-7、位置2-8和位置2-7所组成的组中的序列互补的序列。

第四方面-鉴别靶区、其微RNA调节物和本发明的寡核苷酸

本发明第四方面提供的方法包括以下步骤：

a.提供用于靶RNA活性的报告系统

b.提供与所述靶RNA的部分互补的寡核苷酸

c.在所述步骤b的所述寡核苷酸存在时测定所述靶RNA活性

d.在所述步骤b的所述寡核苷酸不存在时测定所述靶RNA活性

e.比较所述c和d中的活性水平，并从而证实所述寡核苷酸是否影响了所述RNA活性

f.从而证实活性寡核苷酸能够调控靶RNA活性和/或鉴别RNA的微RNA靶区

所述报告系统已在前述方面中进行了描述。

本发明的寡核苷酸的一个目的在于它们应该阻止微RNA接近特定微RNA的至少一种靶mRNA。因此，根据寡核苷酸与靶mRNA互相作用的强度，所述寡核苷酸将防止微RNA与靶序列进行碱基配对。换而言之，微RNA不再能够向靶mRNA引导RNA干扰机器并在靶mRNA上发挥其作用。

在一种优选的实施方式中，所述靶RNA的靶区为mRNA的3’UTR(3’非翻译区)。

在另一种优选实施方式中，所述靶RNA的靶区包含在3’UTR中。

在另一种实施方式中，该方法为鉴别RNA的微RNA靶序列的方法。即，给定mRNA的微RNA靶可能通过使用第四方面的方法而被鉴别。

在另一种实施方式中，该方法为鉴别能调控RNA活性的寡核苷酸的方法。

该方法还包括提供一系列的寡核苷酸，该寡核苷酸中的每一个与所述靶RNA的部分互补并且其中所述一系列的寡核苷酸对靶RNA的特定靶区具有超过50％的整体覆盖，并且其中对各个寡核苷酸活性进行测试(在调控靶RNA活性方面)。

优选地，使用活性寡核苷酸的序列来限定靶区的核苷酸敏感区。此外，优选使用寡核苷酸敏感区的序列来设计一种或多种具有优化序列(即，优化活性)的寡核苷酸。

在另一种实施方式中，缩短活性寡核苷酸的序列并再次测试其活性从而限定将起到mRNA调节物作用的寡核苷酸的最小长度。

本文中使用的寡核苷酸敏感区是RNA的一段区域，其中当碱基与寡核苷酸配对时，该区影响所述RNA活性。通常地，与寡核苷酸敏感区碱基配对的寡核苷酸将防止微RNA调控RNA活性。

在一种优选的实施方式中，使用寡核苷酸敏感区的序列来鉴别潜在地调控靶RNA的候选微RNA。因此，该方法为证实是哪个微RNA对给定的靶RNA进行调控的方法。

出于各种原因，对调控特定mRNA的微RNA的鉴别是令人感兴趣的。首先，它将对RNA干扰机器如何募集到特定mRNA靶上提供解释并且该信息将被用来将RNA干扰机器引导到一个或多个治疗靶上，例如编码疾病所涉及的蛋白质的mRNA。其次，反义微RNA寡核苷酸可以靶定特定mRNA以进行调控，所述寡核苷酸抑制了调控mRNA活性的微RNA活性。如果不错的话，对是哪个mRNA被特定的微RNA调控，或者哪个微RNA调控特定mRNA的测定目前是关于RNA干扰、微RNA和siRNA的最重要的问题之一。

本发明的一个目的是提供在微RNA和mRNA之间提供这种调控关系。

对候选微RNA的鉴别优选包括以下步骤：

a.提供寡核苷酸敏感区序列

b.寻找寡核苷酸敏感区的序列以与微RNA互补从而鉴别潜在地调控靶RNA的候选微RNA。

种子序列在寻找互补时尤其重要，并且所述寡核苷酸敏感区优选被首选找用作反义种子序列。

在一种优选的实施方式中，在二次测试(secondary test)中证实所鉴别的潜在地调控靶RNA的候选微RNA的活性，从而证实确实调控靶RNA活性的微RNA。

优选地，所述二次测试包括以下步骤：

a.提供用于靶RNA活性的报告系统

b.提供含有与微RNA互补并能够抑制所述候选微RNA活性的反义微RNA-寡核苷酸

c.在所述步骤b的反义微RNA-寡核苷酸存在时测定所述靶RNA活性

d.在所述步骤b的反义微RNA-寡核苷酸不存在时测定所述靶RNA活性

e.比较所述步骤c和d的活性水平并从而证实所鉴别的候选微RNA调节物是否确实是所述靶RNA的活性微RNA调节物。

在一种优选的实施方式中，所述二次测试还包括在存在阴性对照时证实靶mRNA的表达的步骤，其中所述阴性对照为不含有与所述微RNA互补的寡核苷酸。

优选地，该方法还包括以下步骤：

a.在存在引入到靶RNA的寡核苷酸时测定所述靶RNA活性

b.在反义微RNA-寡核苷酸存在时用所述步骤a的寡核苷酸刺激下测定所述靶RNA活性

c.从而证实在寡核苷酸敏感区所述寡核苷酸是否起到阻断微RNA活性的作用。

因此，如果在反义微RNA存在时，寡核苷酸对靶RNA活性具有降低的或甚至没有效果，这说明寡核苷酸通过阻断在寡核苷酸敏感区的微RNA活性而起到作用。

在一种优选的实施方式中，所述覆盖率选自由高于55％、高于60％、高于65％、高于70％、高于75％、高于80％、高于85％、高于90％、高于95％、高于99％和100％所组成的组中。

当提到覆盖率时，这表示能够被一系列的潜在寡核苷酸覆盖的靶区片段。换而言之，如果所述一系列的潜在寡核苷酸在杂交的条件下加入到靶区，则该靶区片段将参与碱基配对。

在另一种优选实施方式中，所述覆盖率为100％并且所述寡核苷酸在序列上具有重叠。

在另一种优选实施方式中，特定寡核苷酸从其5’端与寡核苷酸具有50％的重叠并且从其3’端具有50％的重叠。因此，靶区的任何给定序列将被至少两种寡核苷酸覆盖。该步骤在限定寡核苷酸敏感区中是有利的。

优选地，所述靶RNA为mRNA或病毒RNA。当所述靶RNA为mRNA时，靶mRNA活性优选为基因表达。

如果所述靶RNA为靶mRNA，靶区优选为该靶mRNA的3’UTR。

在第四方面的优选实施方式中的寡核苷酸为在本发明第一方面中描述的寡核苷酸。

药用组合物和治疗

本发明的第五方面是含有本发明的寡核苷酸的药用组合物。本领域技术人员将从以上的描述了解到，所述寡核苷酸将以与siRNA、微RNA和翻译寡核苷酸相同的方式用于治疗，这是由于它们能用来特异性地影响特定基因的表达。

本发明的第六方面为治疗方法，该方法包括向需要人群给药有效量的本发明的寡核苷酸或含有本发明的寡核苷酸的药用组合物。

本发明的第七方面为用作药物的本发明的寡核苷酸。

本发明的第八方面为使用本发明的寡核苷酸在制备用于癌症、病毒感染、心血管疾病或免疫疾病治疗的药物中的应用。

所述癌症可以为胶质母细胞瘤、乳腺癌、大肠癌和肝癌。

所述病毒感染可以为HIV感染、丙型肝炎感染、乙型肝炎感染、CMV(巨细胞病毒)感染和HSV(单纯疱疹病毒)感染。

所述免疫疾病可以为牛皮癣或湿疹。

所述心血管疾病可以通过降低高血胆固醇来进行治疗。

本发明的第九方面是本发明的寡核苷酸用作调节靶RNA活性。

传输方法

本发明的第十方面的方法包括将描述本发明的寡核苷酸、本发明提供的寡核苷酸敏感区的信息或者描述由本发明提供的靶RNA的微RNA靶区的信息进行传输。所述信息可以描述潜在地能够调控靶mRNA活性的寡核苷酸或者能够调控靶mRNA活性的寡核苷酸。

在第十方面的优选实施方式中，所述传输为电子传输。

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实施例

实施例1

用于治疗糖尿病的阻断微RNA

已经证实mir-375为胰岛分泌胰岛素的调节物，和重组胰岛素样生长因子-1(Myotrophin(Mtpn))为mir-375调控的靶(Poy MN，2004)。此外，siRNA对Mtpn的抑制模拟了miR-375对葡萄糖刺激的胰岛素分泌和胞吐作用的效果。因此，作者得出的结论是miR-375是胰岛素分泌的调节物并且可以藉此构成用于治疗糖尿病的新型的药理学靶。

这里，我们提供了能够通过抑制在Mtpn mRNA的3’UTR的Mtpn活性的mir-375调控来对Mtpn表达进行调控的阻断微RNA。

靶mRNA的相关部分为：

5′GUGUUUUAAGUUUUGUGUUGCAAAUGGAAUAAACUUGAAU

反义种子序列以粗体示出。靶RNA的靶区能够例如通过寻找用作反义种子序列的靶RNA而被鉴别。或者可以使用因特网上可用的合适的数据库(www.pictar.com，靶扫描(target-scan))来找到该靶区。显然地，该信息也可以来自于试验或来自于学术出版物(例如，Poy等人)。

所述mir-375的序列为

5′UUUGUUCGUUCGGCUCGCGUGA

种子序列与反义种子序列的配对产生了例如以下的互相作用。

5′...AGUUUUGUGUUGC---AAGAACAAAU..

            |:|  ||     |||||||

      3′AGUGCGC-UCGGCUUGCUUGUUU

可以发现完全的互补是很罕见的。

阻断微RNA：

能够通过抑制mir-375调控来对Mtpn表达进行调控的阻断微RNA将不得不使靶区的反义种子序列隔离，即，在碱基配对中隐藏反义种子序列。

因此，Mtpn的阻断微RNA(在3’-5’方向上的下侧链)例举于此，其与靶序列进行碱基配对(在5’-3’方向的上侧链)：

5′GUGUUUUAAGUUUUGUGUUGCAA

AUGGAAUAAACUUGAAU

         ||||||||||||||||||||||||||||||||||

         GUUCAAAACACAACGUUCUUGUUUACCUUAUUUG

5′GUGUUUUAAGUUUUGUGUUGCAAAUGGAAUAAACUUGAAU

         |||||||||||||||||||||||||||||

         GUUCAAAACACAACGUUCUUGUUUACCUU

5′GUGUUUUAAGUUUUGUGUUGCAA

AUGGAAUAAACUUGAAU

         ||||||||||||||||||||||||

         GUUCAAAACACAACGUUCUUGUUU

5′GUGUUUUAAGUUUUGUGUUGCAA

AUGGAAUAAACUUGAAU

            ||||||||||||||||||||||||

            CAAAACACAACGUUCUUGUUUGCC

5′GUGUUUUAAGUUUUGUGUUGCAA

AUGGAAUAAACUUGAAU

                 |||||||||||||||||||

                 CACAACGUUCUUGUUUACC

5′GUGUUUUAAGUUUUGUGUUGCAA

AUGGAAUAAACUUGAAU

                   |||||||||||||||||

                   CAACGUUCUUGUUUACC

5′GUGUUUUAAGUUUUGUGUUGCAA

AUGGAAUAAACUUGAAU

                      ||||||||||||||

                      CGUUCUUGUUUACC

5′GUGUUUUAAGUUUUGUGUUGCAAAUGGAAUAAACUUGAAU

                       |||||||||||||

                       GUUCUUGUUUACC

5′GUGUUUUAAGUUUUGUGUUGCAA

AUGGAAUAAACUUGAAU

                       ||||||||||||

                       GUUCUUGUUUAC

5′GUGUUUUAAGUUUUGUGUUGCAA

AUGGAAUAAACUUGAAU

                       |||||||||||

                       GUUCUUGUUUA

5′GUGUUUUAAGUUUUGUGUUGCAA

AUGGAAUAAACUUGAAU

                          ||||||||

                          CUUGUUUA

以上设计的阻断微RNA可以使用本领域公知的方法合成。如本说明书中说描述地，它们可以被合成为DNA、RNA、LNA、INA或具有混合的单体。

显然地，U单体可以与T单体互换而仍然可以允许进行碱基配对。同样，G-C碱基对可以被G-U摆动碱基对取代。

用于合成上述设计的以Mtpn的mRNA为靶的阻断微RNA的各种实施方式是寡核苷酸合成领域中的技术人员公知的。特别优选的实施方式在本发明的详细说明书中进行了描述。

阻断微RNA与例如胆固醇的共轭也属于本领域技术人员的常识。

实施例2

用于治疗单纯疱疹病毒感染的阻断微RNA

最近证实了单纯疱疹病毒-1编码的微RNA能使病毒发展为潜在性感染(Gupta A，2006)。发现被称为mir-LAT的微RNA对TGF-β和SMAD3进行调控，从而影响细胞将要经历凋亡的能力，通过通常的方法使感染的细胞自我毁灭以防止病毒子代的产生。因此，能够在TGF-β和SMAD3表达中阻断mir-LAT调控活性是引人关注的。

TGF-β的mRNA的靶区的序列为：

5′AGGTCCCGCCCCGCCCCGCCCCGCCCCGGCAGGCCCGCC

mir-LAT的序列为：

5′

CCCGGCCCGGGGCC

因此，可以形成下列复合物：

5′CGCCCCGGCAGGCCCG

    |||||||   ||| |||| |||

3′CCGGGGCC---CGGCCCGGCGGU

可以根据在前述实施例中所完成的设计一系列的阻断微RNA。该阻断微RNA的下侧链按在3’-5’方向示出，且上侧链是TGF-β的mRNA的靶区：

5′AGGUCCCGCCCCGCCCCGCCCCGCCCCGGCAGGCCCG

CC

   |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

   UCCAGGGCGGGGCGGGGCGGGGCGGGGCCGUCCGGGCCGGGGUGG

5′AGGUCCCGCCCCGCCCCGCCCCGCCCCGGCAGGCCCG

CC

                ||||||||||||||||||||||||||||||||

                GGGGCGGGGCGGGGCCGUCCGGGCCGGGGUGG

5′AGGUCCCGCCCCGCCCCGCCCCGCCCCGGCAGGCCCG

CC

                        ||||||||||||||||||||||||

                        GCGGGGCCGUCCGGGCCGGGGUGG

5′AGGUCCCGCCCCGCCCCGCCCCGCCCCGGCAGGCCCG

CC

                              ||||||||||||||||||

                              CCGUCCGGGCCGGGGUGG

5′AGGUCCCGCCCCGCCCCGCCCCGCCCCGGCAGGCCCG

CC

                                   |||||||||||||

                                   CGGGCCGGGGUGG

5′AGGUCCCGCCCCGCCCCGCCCCGCCCCGGCAGGCCCG

CC

                                    ||||||||||||

                                     GGCCGGGGUGG

5′AGGUCCCGCCCCGCCCCGCCCCGCCCCGGCAGGCCCG

CC

                                       |||||||||

                                       CCGGGGUGG

5′AGGUCCCGCCCCGCCCCGCCCCGCCCCGGCAGGCCCG

CC

                                        ||||||||

                                        CCGGGGUG

合成所述序列的各种实施方式是本领域技术人员公知的。特别优选的实施方式在本发明的详细说明书中进行了描述。

实施例3

鉴别对Mtpn表达进行调控的寡核苷酸

以下为该方法将怎样进行的非限制性示例。实际上没有进行湿法实验(wetexperiment)。

以下的序列为估计的Mtpn的mRNA的靶区的部分：

5′UUUGACGCAGUUGGGUUUCUCAUAAGUAUCCUAGUUCAUGUACAUCCGAAUGCUAAAU

AAUACUGUGUUUUAAGUUUUGUGUUGCAA

GGAAUAAACUUGAAUUGUGCUAC

涉及用于该区域的具有50％重叠的一系列的潜在的阻断微RNA。潜在的阻断微RNA以斜体示出，并且展示了Mtpn的mRNA的参考序列和互补链以进行比较：

5′UUUGACGCAGUUGGGUUUCUCAUAAGUAUCCUAGUUCAUGUACAUCCGAAUGCUAAAUAAU-

   |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

3′AAACUGCGUCAACCCAAAGAGUAUUCAUAGGAUCAAGUACAUGUAGGCUUACGAUUUAUUA-

      

            

                   

                            

                                       

-

5′-ACUGUGUUUUAAGUUUUGUGUUGCAAUGGAAUAAACUUGAAUUGUGCUAC

    |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

3′-UGACACAAAAUUCAAAACACAACGUUCUUGUUUACCUUAUUUGAACUUAACACGAUG

-

 

       

               

                          

                                    

因此设计了11个阻断微RNA。随后将它们合成为具有硫代磷酸酯键的例如2-O-修饰的寡核苷酸。用于合成上述设计的阻断微RNA靶定的Mtpn的mRNA的各种实施方式是寡核苷酸合成领域中的技术人员公知的。特别优选的实施方式在本发明的详细说明书中进行了描述。

阻断微RNA与例如胆固醇的共轭也属于本领域技术人员的常识。

随后将靶序列融合到表达能够被检测到的报告基因中。在该实施例中，所述报告基因为eGFP。随后将所设计的11个阻断微RNA中的每一个进行转染后监测到eGFP的表达之后，将所述报告基因转染到Hela细胞中。

结果：

只有从阻断微RNA互补开始计数到与靶区的5’端的阻断微RNA7-9影响了eGFP的表达。阻断微RNA7导致了稍微增加的eGFP表达，而阻断微RNA8和9具有更显著的效果。

因此，能够影响Mtpn的mRNA的表达的寡核苷酸得到鉴别。

该结果说明了由阻断微RNA7-9覆盖的区域是用于微RNA调控的靶。此外，该结果说明了由阻断微RNA8和9覆盖的区域对于微RNA调控最重要。由寡核苷酸8和9两者覆盖的区域可以含有与微RNA的种子序列互相作用的区域或者部分地含有与微RNA的种子序列互相作用的区域。

随后寻找由阻断微RNA8和阻断微RNA9所覆盖的区域(AAGTTTTGTGTTGCAA

TGGAATA)与微RNA的互补。

更具体地，该区域与微RNA的种子序列的互补。该研究鉴别了人类mir-375.

可以通过用反义微RNA抑制mir-375活性来证实该微RNA是否确实调控了Mtpn的mRNA活性。

mir-375的序列为：

5′UUUGUUCGUUCGGCUCGCGUGA

因此合成了具有互补序列的抑制性的反义微RNA。

mir-375-反义微RNA：

5′TCACGCGAGCCGAACGAACAAA

还产生了截短版本的反义微RNA：

5′ACGCGAGCCGAACGAACAAA

5′GCGAGCCGAACGAACAAA

5′GAGCCGAACGAACAAA

5′GCCGAACGAACAAA

5′CGAACGAACAAA

合成了反义微RNA，例如具有硫代磷酸酯键的2-修饰的寡核苷酸。随后使用报告系统测试这些反义微RNA是否能阻止mir-375调控Mtpn的mRNA。结果表示mir-375确实调控Mtpn的mRNA的表达。

Claims (93)

1.一种寡核苷酸，其含有反义序列，该反义序列含有与微RNA的种子序列相对应的引导序列，条件是该寡核苷酸不是微RNA或者不含有与微RNA的完整序列相对应的序列。

2.根据权利要求1所述的寡核苷酸，其中，所述微RNA为人类微RNA。

3.根据前述任意一项权利要求所述的寡核苷酸，该寡核苷酸含有选自能与从以下序列组中选出的序列的互补序列进行碱基配对的序列所组成的组中的序列：

任意的SEQ ID NO：1-723中的位置1-20、位置1-19、位置1-18、位置1-17、位置1-16、位置1-15、位置1-14、位置1-13、位置1-12、位置1-11、位置1-10、位置1-9、位置1-8、位置1-7、位置1-6、位置2-20、位置2-19、位置2-18、位置2-17、位置2-16、位置2-15、位置2-14、位置2-13、位置2-12、位置2-11、位置2-10、位置2-9、位置2-8、位置2-7、位置2-6、位置3-20、位置3-19、位置3-18、位置3-17、位置3-16、位置3-15、位置3-14、位置3-13、位置3-12、位置3-11、位置3-10和位置3-9所组成的组。

4.根据权利要求1或2所述的寡核苷酸，其中，所述反义序列含有选自由任意的SEQ ID NO：1-723中的位置1-20、位置1-19、位置1-18、位置1-17、位置1-16、位置1-15、位置1-14、位置1-13、位置1-12、位置1-11、位置1-10、位置1-9、位置1-8、位置1-7、位置1-6、位置2-20、位置2-19、位置2-18、位置2-17、位置2-16、位置2-15、位置2-14、位置2-13、位置2-12、位置2-11、位置2-10、位置2-9、位置2-8、位置2-7、位置2-6、位置3-20、位置3-19、位置3-18、位置3-17、位置3-16、位置3-15、位置3-14、位置3-13、位置3-12、位置3-11、位置3-10和位置3-9所组成的组中的序列，其中，

a.A仅能与G、C、U、T或I互换

b.G仅能与A或I互换

c.C仅能与A、U或T互换

d.U仅能与C、A、T或I互换

并且其中，3个附加位置能与任意碱基互换。

5.根据权利要求3所述的寡核苷酸，其中，

a.A仅能与G、C、U、T或I互换

b.G仅能与A或I互换

c.C仅能与A或U互换

d.U仅能与C、A、T或I互换

并且其中，3个附加位置能与任意碱基互换。

6.根据权利要求3所述的寡核苷酸，其中，

a.A仅能与C、U、T或I互换

b.G仅能与I互换

c.C仅能与A、U或T互换

d.U仅能与C、A、T或I互换

并且其中，3个附加位置能与任意碱基互换。

7.根据权利要求3所述的寡核苷酸，其中，

a.A仅能与C、U或I互换

b.G仅能与I互换

c.C仅能与A或U互换

d.U仅能与C、A、T或I互换

并且其中，3个附加位置能与任意碱基互换。

8.根据权利要求3所述的寡核苷酸，其中，

a.A仅能与G或I互换

b.G仅能与I或A互换

c.C仅能与A、U或T互换

d.U仅能与C或T互换

并且其中，3个附加位置能与任意碱基互换。

9.根据权利要求3所述的寡核苷酸，其中，

a.A仅能与G互换

b.G仅能与A或G互换

c.C仅能与T或U互换

d.U仅能与C或T互换

并且其中，3个附加位置能与任意碱基互换。

10.根据权利要求3所述的寡核苷酸，其中，U仅能与T互换，

并且其中，3个附加位置能与任意碱基互换。

11.根据前述任意一项权利要求所述的寡核苷酸，其中，2个附加位置能与任意碱基互换。

12.根据前述任意一项权利要求所述的寡核苷酸，其中，1个附加位置能与任意碱基互换。

13.根据前述任意一项权利要求所述的寡核苷酸，其中，没有附加位置能与任意碱基互换。

14.根据前述任意一项权利要求所述的寡核苷酸，其中，所述反义序列含有选自由任意的SEQ ID NO：1-723中的位置1-10、位置1-9、位置1-8、位置1-7、位置1-6、位置2-10、位置2-9、位置2-8、位置2-7、位置2-6、位置3-10和位置3-9所组成的组中的序列。

15.根据前述任意一项权利要求所述的寡核苷酸，其中，所述反义序列含有选自由任意的SEQ ID NO：1-723中的位置1-8、位置1-7、位置2-8和位置2-7所组成的组中的序列。

16.根据前述任意一项权利要求所述的寡核苷酸，其中，所述反义序列还含有第二序列，该第二序列选自由任意的SEQ ID NO：1-723中的位置12-17、位置12-16、位置13-17和位置13-16所组成的组，其中，所述引导序列和第二序列来自相同的SEQ ID NO。

17.根据前述任意一项权利要求所述的寡核苷酸，其中，所述反义序列含有与靶RNA的微RNA靶序列互补的选自由少于60个碱基、少于50个碱基、少于40个碱基、少于39个碱基、少于38个碱基、少于37个碱基、少于36个碱基、少于35个碱基、少于34个碱基、少于33个碱基、少于32个碱基、少于31个碱基、少于30个碱基、少于29个碱基、少于28个碱基、少于27个碱基、少于26个碱基、少于25个碱基、少于24个碱基、少于23个碱基、少于22个碱基、少于21个碱基、少于20个碱基、少于19个碱基、少于18个碱基、少于17个碱基、少于16个碱基、少于15个碱基、少于14个碱基、少于13个碱基、少于12个碱基、少于11个碱基、少于10个碱基、少于9个碱基、少于8个碱基、少于7个碱基、多于60个碱基、多于50个碱基、多于40个碱基、多于39个碱基、多于38个碱基、多于37个碱基、多于36个碱基、多于35个碱基、多于34个碱基、多于33个碱基、多于32个碱基、多于31个碱基、多于30个碱基、多于29个碱基、多于28个碱基、多于27个碱基、多于26个碱基、多于25个碱基、多于24个碱基、多于23个碱基、多于22个碱基、多于21个碱基、多于20个碱基、多于19个碱基、多于18个碱基、多于17个碱基、多于16个碱基、多于15个碱基、多于14个碱基、多于13个碱基、多于12个碱基、多于11个碱基、多于10个碱基、多于9个碱基、多于8个碱基、多于7个碱基、多于6个碱基和多于5个碱基所组成的组中的连续的碱基段。

18.根据前述任意一项权利要求所述的寡核苷酸，其中，所述反义序列含有与靶RNA的微RNA靶序列互补的连续的碱基段，所述连续的碱基段选自由10-25个碱基、12-24个碱基、14-22个碱基、15-22个碱基和15-20个碱基所组成的组中。

19.根据前述任意一项权利要求所述的寡核苷酸，其中，所述寡核苷酸与相对应的微RNA的同一性百分数选自由少于99％、少于95％、少于90％、少于85％、少于80％、少于75％、少于70％、少于65％、少于60％、少于55％、少于50％、少于45％、少于40％、少于35％、少于30％和少于25％所组成的组中。

20.根据前述任意一项权利要求所述的寡核苷酸，其中，所述寡核苷酸内的引导序列的位置选自由位置1、位置2、位置3、位置4、位置5、位置6、位置7、位置8、位置9、位置10、位置11、位置12、位置13、位置14、位置15、位置16、位置17、位置18和位置19所组成的组中，其中，所述位置按5’-3’方向从所述引导序列的第一碱基和所述寡核苷酸的第一碱基开始计数。

21.根据前述任意一项权利要求所述的寡核苷酸，其中，所述寡核苷酸的长度选自由少于60个碱基、少于50个碱基、少于40个碱基、少于39个碱基、少于38个碱基、少于37个碱基、少于36个碱基、少于35个碱基、少于34个碱基、少于33个碱基、少于32个碱基、少于31个碱基、少于30个碱基、少于29个碱基、少于28个碱基、少于27个碱基、少于26个碱基、少于25个碱基、少于24个碱基、少于23个碱基、少于22个碱基、少于21个碱基、少于20个碱基、少于19个碱基、少于18个碱基、少于17个碱基、少于16个碱基、少于15个碱基、少于14个碱基、少于13个碱基、少于12个碱基、少于11个碱基、少于10个碱基、少于9个碱基、少于8个碱基、少于7个碱基、多于60个碱基、多于50个碱基、多于40个碱基、多于39个碱基、多于38个碱基、多于37个碱基、多于36个碱基、多于35个碱基、多于34个碱基、多于33个碱基、多于32个碱基、多于31个碱基、多于30个碱基、多于29个碱基、多于28个碱基、多于27个碱基、多于26个碱基、多于25个碱基、多于24个碱基、多于23个碱基、多于22个碱基、多于21个碱基、多于20个碱基、多于19个碱基、多于18个碱基、多于17个碱基、多于16个碱基、多于15个碱基、多于14个碱基、多于13个碱基、多于12个碱基、多于11个碱基、多于10个碱基、多于9个碱基、多于8个碱基、多于7个碱基、多于6个碱基和多于5个碱基所组成的组中。

22.根据前述任意一项权利要求所述的寡核苷酸，其中，所述寡核苷酸的长度选自由10-25个碱基、12-24个碱基、14-22个碱基、15-22个碱基和15-20个碱基所组成的组中。

23.根据前述任意一项权利要求所述的寡核苷酸，其中，所述寡核苷酸能诱导核糖核酸酶H切割靶RNA。

24.根据前述任意一项权利要求所述的寡核苷酸，其中，所述寡核苷酸为缺口产生物、尾端产生物或头部产生物。

25.根据权利要求1-22中任意一项所述的寡核苷酸，其中，所述寡核苷酸不能诱导核糖核酸酶H切割靶RNA。

26.根据前述任意一项权利要求所述的寡核苷酸，其中，所述寡核苷酸不含有长度超过了选自由3个碱基、4个碱基、5个碱基、6个碱基、7个碱基、8个碱基、9个碱基、10个碱基和11个碱基所组成的组中的未被修饰的DNA的段。

27.根据前述任意一项权利要求所述的寡核苷酸，其中，所述寡核苷酸能够使RNA干扰机器募集。

28.根据前述任意一项权利要求所述的寡核苷酸，其中，所述寡核苷酸不能够使RNA干扰机器募集。

29.根据前述任意一项权利要求所述的寡核苷酸，其中，所述寡核苷酸能在特定靶RNA上阻断RNA干扰机器活性。

30.根据前述任意一项权利要求所述的寡核苷酸，其中，所述寡核苷酸能在特定靶RNA上阻断微RNA的调控活性。

31.根据前述任意一项权利要求所述的寡核苷酸，其中，所述寡核苷酸是靶RNA的正调节物。

32.根据前述任意一项权利要求所述的寡核苷酸，其中，所述寡核苷酸是靶RNA的负调节物。

33.根据前述任意一项权利要求所述的寡核苷酸，其中，所述寡核苷酸含有增加了其对互补序列的亲和性的核苷酸单体或增加亲和性的修饰。

34.根据前述任意一项权利要求所述的寡核苷酸，其中，所述寡核苷酸含有增加其生物稳定性和/或生物利用度的修饰，例如硫代磷酸酯键。

35.根据前述任意一项权利要求所述的寡核苷酸，其中，所述寡核苷酸含有INA单元、PNA单元、LNA单元、在2’-位置上被取代的单元或任意其它的能够进行特异性地碱基配对的核苷酸单元。

36.根据前述任意一项权利要求所述的寡核苷酸，其中，所述寡核苷酸含有在2’-位置上被取代的核苷酸单元和/或主链修饰。

37.一种寡核苷酸，该寡核苷酸含有重复模式的一个或多个LNA单元和一个或多个在2’-位置被取代的单元。

38.根据前述任意一项权利要求所述的寡核苷酸，其中，所述寡核苷酸不含有任何的RNA单元。

39.根据前述任意一项权利要求所述的寡核苷酸，其中，所述寡核苷酸不含有任何的DNA单元。

40.根据前述任意一项权利要求所述的寡核苷酸，其中，所述寡核苷酸不含有任何的吗啉代单元和/或LNA单元。

41.根据前述任意一项权利要求所述的寡核苷酸，其中，所述寡核苷酸含有通用碱基。

42.根据前述任意一项权利要求所述的寡核苷酸，其中，所述引导序列通过通用碱基侧接于3’侧、5’侧或同时侧接于这两侧。

43.根据前述任意一项权利要求所述的寡核苷酸，其中，引导序列和第二序列之间的碱基为通用碱基。

44.根据前述任意一项权利要求所述的寡核苷酸，其中，任意的不是引导序列和第二序列部分的碱基为通用碱基。

45.根据前述任意一项权利要求所述的寡核苷酸，其中，所述寡核苷酸不与互补的寡核苷酸进行碱基配对或者不倾向用于与互补的寡核苷酸进行碱基配对。

46.根据前述任意一项权利要求所述的寡核苷酸，其中，所述寡核苷酸与互补寡核苷酸进行碱基配对。

47.根据前述任意一项权利要求所述的寡核苷酸，其中，所述微RNA的序列选自由SEQ ID NO：1-723所组成的组中。

48.根据前述任意一项权利要求所述的寡核苷酸，其中，所述靶RNA为靶mRNA或靶病毒RNA。

49.一种调节靶RNA活性的方法，该方法包括以下步骤：

a.提供含有靶RNA的系统

b.将所述靶RNA的根据权利要求1-xx中任意一项所述的寡核苷酸引

入所述系统中

c.从而调节所述靶RNA活性。

50.根据权利要求49所述的方法，其中，所述寡核苷酸阻止了微RNA在靶RNA处的活性，从而调控所述靶RNA的活性。

51.根据权利要求49-50中任意一项所述的方法，其中，所述寡核苷酸诱导核糖核酸酶H切割所述靶RNA，从而调控所述靶RNA的活性。

52.根据权利要求49-51中任意一项所述的方法，其中，所述系统为细胞抽提物或者为细胞。

53.根据权利要求49-52中任意一项所述的方法，其中，该方法在体内、离体或在体外进行。

54.根据权利要求49-53中任意一项所述的方法，其中，该方法为用于证实寡核苷酸调节物或鉴别寡核苷酸调节物的方法。

55.根据权利要求49-54中任意一项所述的方法，其中，该方法为用于证实靶RNA的微RNA靶的方法。

56.根据权利要求49-54中任意一项所述的方法，其中，所述靶RNA为mRNA或病毒RNA。

57.一种方法，该方法包括以下步骤：

a.提供由微RNA调控的靶RNA的靶序列，所述靶序列为参与微RNA调控的靶RNA的序列

b.设计寡核苷酸序列，该寡核苷酸序列含有与所述靶序列互补的至少6个碱基的碱基段

c.合成所述步骤b的寡核苷酸序列，从而提供所述步骤b的寡核苷酸，所述寡核苷酸为所述靶RNA活性的候选调节物。

58.根据权利要求57所述的方法，该方法还包括以下测试步骤：

a.提供用于所述靶RNA活性的报告系统

b.在权利要求57所述步骤c的寡核苷酸存在时测定所述靶RNA的活性

c.在权利要求57所述步骤c的寡核苷酸不存在时测定所述靶RNA的活性

d.比较所述b和c中的活性水平，并因此证实所述寡核苷酸是否确实能够调控RNA活性和/或RNA的潜在靶序列是否确实是靶序列。

59.根据权利要求57和58中任意一项所述的方法，其中，所述活性是基因表达。

60.根据权利要求57-59中任意一项所述的方法，其中，所述靶RNA的靶序列含有与微RNA的种子序列互补的序列。

61.根据权利要求57-60中任意一项所述的方法，其中，所述靶RNA的靶序列含有选自能与从以下序列组中选出的序列进行碱基配对的序列所组成的组中的序列：

选自由任意的SEQ ID NO：1-723中的位置1-20、位置1-19、位置1-18、位置1-17、位置1-16、位置1-15、位置1-14、位置1-13、位置1-12、位置1-11、位置1-10、位置1-9、位置1-8、位置1-7、位置1-6、位置2-20、位置2-19、位置2-18、位置2-17、位置2-16、位置2-15、位置2-14、位置2-13、位置2-12、位置2-11、位置2-10、位置2-9、位置2-8、位置2-7、位置2-6、位置3-20、位置3-19、位置3-18、位置3-17、位置3-16、位置3-15、位置3-14、位置3-13、位置3-12、位置3-11、位置3-10和位置3-9所组成的组。

62.根据权利要求57-61中任意一项所述的方法，其中，所述RNA的靶序列含有选自由能够与以下序列组中选出的序列进行碱基配对的序列所组成的组中的序列：

任意的SEQ ID NO：1-723中的位置1-10、位置1-9、位置1-8、位置1-7、位置1-6、位置2-10、位置2-9、位置2-8、位置2-7、位置2-6、位置3-10和位置3-9所组成的组。

63.根据权利要求57-62中任意一项所述的方法，其中，所述RNA的靶序列含有选自能够与从以下序列组中选出的序列进行碱基配对的序列所组成的组中的序列：

任意的SEQ ID NO：1-723中的位置1-8、位置1-7、位置2-8和位置2-7所组成的组。

64.根据权利要求57-62中任意一项所述的方法，其中，所述RNA的靶序列还含有第二序列，该第二序列选自能够与从以下序列组中选出的序列进行碱基配对的序列所组成的组中：任意的SEQ ID NO：1-723中的位置12-17、位置12-16、位置13-17和位置13-16所组成的组，其中，所述引导序列和所述第二序列来自相同的SEQ ID NO。

65.根据权利要求57-64中任意一项所述的方法，其中，所述RNA的靶序列是未得到证实，并且该方法为证实所述靶序列的方法。

66.根据权利要求57-65中任意一项所述的方法，其中，所述RNA的靶序列得到证实，并且该方法为提供能够调控所述RNA活性的寡核苷酸的方法。

67.根据权利要求57-66中任意一项所述的方法，该方法还包括提供调控所述RNA的微RNA的序列，并使用所述微RNA的种子序列来测定所述靶序列的反义种子序列和所述寡核苷酸的引导序列。

68.根据权利要求57-67中任意一项所述的方法，其中，所述微RNA的种子序列选自以下所组成的组中：从所述微RNA的5’端开始计数的任意SEQID NO：1-723中的微RNA的位置1-10、微RNA的位置1-9、微RNA的位置1-8、微RNA的位置1-7、微RNA的位置1-6、微RNA的位置1-5、微RNA的位置1-4、微RNA的位置2-10、微RNA的位置2-9、微RNA的位置2-8、微RNA的位置2-7、微RNA的位置2-6和位置2-5。

69.根据权利要求57-68中任意一项所述的方法，其中，所述微RNA的种子序列选自由任意的SEQ ID NO：1-723中的位置1-8、位置1-7、位置2-8和位置2-7所组成的组中。

70.根据权利要求57-69中任意一项所述的方法，其中，所述靶RNA为靶mRNA或靶病毒RNA。

71.根据权利要求57-70中任意一项所述的方法，其中，所述寡核苷酸为权利要求1-48中任意一项所述的寡核苷酸。

72.一种方法，该方法包括以下步骤：

a.提供用于靶mRNA表达的报告系统

b.提供与所述靶RNA的部分互补的寡核苷酸

c.在所述步骤b的所述寡核苷酸存在时测定所述靶mRNA表达

d.在所述步骤b的所述寡核苷酸不存在时测定所述靶mRNA表达

e.比较所述c和d中的表达水平，并从而证实所述寡核苷酸是否影响所述mRNA的表达。

73.根据权利要求72所述的方法，其中，该方法为鉴别所述mRNA的微RNA靶序列的方法。

74.根据权利要求72所述的方法，其中，该方法为鉴别能够调控所述mRNA活性的寡核苷酸的方法。

75.根据权利要求72-74中任意一项所述的方法，其中，提供了每一个与所述靶mRNA的部分互补的一系列的寡核苷酸，并且其中所述一系列的寡核苷酸对于所述靶mRNA的特定靶区具有超过50％的整体覆盖率，并且其中测试该系列中的每一个寡核苷酸的活性。

76.根据权利要求72-75中任意一项所述的方法，其中，所述靶RNA的靶区为mRNA的3’非翻译区。

77.根据权利要求72-76中任意一项所述的方法，其中，使用所述活性寡核苷酸的序列来限定靶区的寡核苷酸敏感区。

78.根据权利要求72-77中任意一项所述的方法，其中，使用所述寡核苷酸敏感区的序列来设计一个或多个具有优化序列的寡核苷酸。

79.根据权利要求72-78中任意一项所述的方法，其中，使用所述寡核苷酸敏感区的序列来鉴别潜在地调控靶RNA的候选微RNA。

80.根据权利要求72-79中任意一项所述的方法，其中，该方法还包括以下的步骤：

c.提供寡核苷酸敏感区的序列

d.寻找用于与微RNA互补的所述寡核苷酸敏感区的序列以鉴别潜在地调控靶RNA的候选微RNA。

81.根据权利要求80所述的方法，其中，在二次测试中证实了所鉴别的潜在地调控靶mRNA的候选微RNA的活性，从而鉴别确实调控所述靶RNA活性的微RNA。

82.根据权利要求81所述的方法，其中，所述二次测试包括以下步骤：

a.提供用于靶RNA活性的报告系统

b.提供含有与微RNA互补的并且能够抑制候选微RNA活性的反义微RNA-寡核苷酸

c.在所述步骤b的反义微RNA-寡核苷酸存在时测定所述靶RNA活性

d.在所述步骤b的反义微RNA-寡核苷酸不存在时测定所述靶RNA活性

e.比较所述步骤c和d中的活性水平，并从而证实所鉴别的候选微RNA调节物是否确实是靶RNA的活性微RNA调节物。

83.根据权利要求82所述的方法，该方法还包括以下步骤：

a.在被引导到靶RNA的寡核苷酸存在时测定所述靶RNA活性

b.在反义微RNA-寡核苷酸存在时在所述步骤a的寡核苷酸刺激存在下测定所述靶RNA活性

c.从而证实所述寡核苷酸是否在寡核苷酸敏感区通过阻断微RNA活性而发挥作用。

84.根据权利要求72-83中任意一项所述的方法，其中，所述覆盖率选自由高于55％、高于60％、高于65％、高于70％、高于75％、高于80％、高于85％、高于90％、高于95％、高于99％和100％所组成的组中。

85.根据权利要求72-84中任意一项所述的方法，其中，所述覆盖率为100％并且所述寡核苷酸在序列中有重叠。

86.根据权利要求85所述的方法，其中，特定寡核苷酸从其5’端与寡核苷酸具有50％的重叠并且从其3’端与寡核苷酸具有50％的重叠。

87.根据权利要求72-86中任意一项所述的方法，其中，所述寡核苷酸为根据权利要求1-48中任意一项所述的寡核苷酸。

88.一种药用组合物，该药用组合物含有根据权利要求1-48中任意一项所述的寡核苷酸。

89.一种治疗方法，该方法包括给药权利要求1-48中任意一项所述的寡核苷酸或者权利要求88所述的药物组合物至需要它们的人。

90.用作药物的权利要求1-48中任意一项所述的寡核苷酸。

91.权利要求1-48中任意一项所述的寡核苷酸在制备用于治疗癌症、病毒感染、免疫疾病或心血管疾病的药物中的应用。

92.一种方法，该方法包括传输描述前述任意一项权利要求所述的寡核苷酸的信息。

93.根据权利要求92所述的方法，其中，所述传输为电子传输。