JP5637533B2 - マイクロ−ｒｎａスキャホールドおよび非天然存在型マイクロ−ｒｎａ - Google Patents

Description

本願は、米国特許仮出願番号第６０/９３９，７８５（出願日：２００７年５月２３日）に基づいて優先権を主張するものであり、前記出願のすべての記載をここに引用するものである。

本発明はＲＮＡｉの分野に係り、特に、遺伝子ノックダウンを効果的に媒介する非天然存在型ｍｉＲＮＡ類を形成するためにターゲット配列類を統合できるｍｉＲＮＡ系スキャホールド類に係る。

ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、転写後の遺伝子修飾に必要な、ほぼ偏在的な経路である。ＲＮＡｉの鍵となる重要な分子は、マイクロＲＮＡ（以後、ｍｉＲＮＡまたはｍｉＲと呼ぶ）である。これら小さな、非コードＲＮＡ類は、プライマリーｍｉＲＮＡ類（以後、ｐｒｉ−ＲＮＡと呼ぶ）として転写され、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ類と呼ばれる短いヘアピン構造を形成するために、Ｄｒｏｓｈａ（タイプＩＩＩ リボヌクレアーゼ）により核内で処理される（図１参照）。こうして得られた分子は、チトプラズムに運搬され、ＲＮＡ誘発サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に組み込まれる前に第２のヌクレアーゼ（Ｄｉｃｅｒ）によって処理される。成熟ｍｉＲＮＡ−ＲＩＳＣ複合体とメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）との干渉、特に、ｍｉＲＮＡガイド鎖のシード領域（ヌクレオチド２位−７位）とｍＲＮＡの３’ＵＴＲ領域との干渉は、転写切断および／または翻訳能減衰により遺伝子ノックダウンを引き起こす。

近年、固有の基質（ｍｉＲＮＡ）への研究がかなりの興味を集めてきた一方で、ＲＮＡｉ経路も強力な研究手段として認識されてきた。合成化学または酵素的方法により生成した小さな２本鎖ＲＮＡ類（以後、小さな干渉ＲＮＡまたはｓｉＲＮＡと呼ぶ）を、脂質媒介型トランスフェクションやエレクトロポレーションなどの様々な手段により細胞内に導入し、分解させるために、特定の遺伝子転写を標的にすることができる。このように、ＲＮＡｉ経路は、遺伝子機能、経路分析、および医薬品の発見を研究する上で重要な手段として役立つものであり、さらに、将来は治療薬としての適用も考えられている。

米国特許出願第１０／９４０８２号明細書（２００４年９月１４日出願）

Ｇｒｉｍｍ，Ｄ，（２００６）、Ｎａｔｕｒｅ Ｌｅｔｔｅｒｓ ４４１：５３７−５４１）

合成ｓｉＲＮＡの利用は、ほとんどの遺伝子ノックダウン実験が必要とすることに役立つにもかかわらず、合成分子が適当ではない事例もある。少数の細胞タイプには、通常用いるトランスフェクション法および／または試薬類が効かないタイプや、または、非常に鋭敏過ぎるタイプがある。さらに別の例では、実験系の必要性から、合成分子が供給される期間（典型的には４−１０日間）よりも長い期間をかけて遺伝子ノックダウンが達成されることが求められる。

サイレンシング試薬のベクター系による輸送は、レンチウイルスなどによる輸送および単純なヘパリンやｍｉＲＮＡ系スキャホールド構造体を用いることで過去成し遂げられてきた。（非特許文献１参照）。

本発明は、第１の内在性ｍｉＲＮＡから誘導されるスキャホールド、第２の内在性ｍｉＲＮＡから誘導される成熟鎖、この成熟鎖配列に少なくとも一部分が相補的なスター鎖配列を有する幹−ループ構造をもつ非天然存在型ｍｉＲＮＡを提供する。

また、本発明は、幹−ループ構造の幹が成熟鎖−スター鎖２本鎖を組み込んだ幹−ループ構造をもつ核酸からなる非天然存在型ｍｉＲ−１９６ａ−２ｍｉＲＮＡを提供する。成熟鎖の配列は、成熟内在性ｍｉＲＮＡから誘導されるが、しかし、ｍｉＲ−１９６ａ−２の内在性成熟鎖の配列とは全く異なる。スター鎖は、成熟鎖に少なくとも一部分が相補的である。いくつかの実施形態では、成熟鎖は、１９ヌクレオチド長から２５ヌクレオチド長の間の長さをもつ。また、ある実施形態では、成熟鎖の１位にあるヌクレオチドはＵである。また、ある実施形態では、成熟鎖の１２位にあるヌクレオチドは、スター鎖上の相対する位置にあるヌクレオチドと塩基対を生成しない。

また、本発明は、幹−ループ構造の幹が成熟鎖−スター鎖２本鎖を組み込んだ幹−ループ構造をもつ核酸からなる非天然存在型ｍｉＲ−２０４−ｍｉＲＮＡを提供する。成熟鎖の配列は成熟内在性ｍｉＲＮＡから誘導されるが、しかし、ｍｉＲ−２０４の内在性成熟鎖の配列とは全く異なる。スター鎖は、成熟鎖に少なくとも一部分が相補的である。

また、本発明は、細胞内で処理される成熟内在性ｍｉＲＮＡとほぼ同等な成熟ｍｉＲＮＡを生成可能な、非天然存在型ｍｉＲ−１９６ａ−２ｍｉＲＮＡを提供する。なお、前記成熟内在性ｍｉＲＮＡの配列は、内在性ｍｉＲ−１９６ａ−２成熟ｍｉＲＮＡの配列とは異なる。

また、本発明は、細胞内で処理される成熟内在性ｍｉＲＮＡとほぼ同等な成熟ｍｉＲＮＡを生成可能な、非天然存在型ｍｉＲ−２０４ｍｉＲＮＡを提供する。なお、前記成熟内在性ｍｉＲＮＡの配列は、内在性ｍｉＲ−２０４成熟ｍｉＲＮＡの配列とは異なる。

また、本発明は、内在性ｍｉＲＮＡ（例えば、ｍｉＲ−１９６ａ−２またはｍｉＲ−２０４）から誘導されるスキャホールド、標的ＲＮＡに少なくとも一部分が相補的（例えば、成熟鎖の２位−７位が標的ＲＮＡと相補的であるような）ではあるが内在性ｍｉＲＮＡ成熟鎖とは異なる成熟鎖、および、前記成熟鎖配列と少なくとも一部分が相補的であるスター鎖配列とを有する幹−ループ構造をもつ非天然存在型ｍｉＲＮＡを提供する。

また、本発明は、非天然存在型ｍｉＲＮＡ類、例えば、非天然存在型ｍｉＲ−１９６ａ−２ ｍｉＲＮＡまたは非天然存在型ｍｉＲ−２０４ ｍｉＲＮＡを有する細胞を提供する。

また、本発明は、細胞内の標的ＲＮＡの機能を低下させる方法を提供する。この方法には、非天然存在型ｍｉＲＮＡ（例えば、非天然存在型ｍｉＲ−１９６ａ−２ ｍｉＲＮＡまたは非天然存在型ｍｉＲ−２０４ ｍｉＲＮＡ）を発現可能なベクターに、細胞を接触させる工程が含まれる。前記非天然存在型ｍｉＲＮＡは、細胞内で処理され、内在性ｍｉＲＮＡにほぼ同等なｍｉＲＮＡを生成する。

また、本発明は、非天然存在型ｍｉＲＮＡ（例えば、非天然存在型ｍｉＲ−１９６ａ−２ ｍｉＲＮＡまたは非天然存在型ｍｉＲ−２０４ ｍｉＲＮＡ）をコードするヌクレオチド類配列を有するリコンビナント発現ベクター類を提供する。

本発明は、非天然存在型ｍｉＲＮＡ（例えば、非天然存在型ｍｉＲ−１９６ａ−２ ｍｉＲＮＡまたは非天然存在型ｍｉＲ−２０４ ｍｉＲＮＡ）を有し、さらに、少なくとも一つの薬学的に許容なキャリアを有する薬学的組成物を提供する。

さらに、本発明は、ある遺伝子が不適当に発現するのを特徴とする疾患を治療する医薬品の製造に、非天然存在型ｍｉＲＮＡ（例えば、非天然存在型ｍｉＲ−１９６ａ−２ ｍｉＲＮＡまたは非天然存在型ｍｉＲ−２０４ ｍｉＲＮＡ）を使用する方法を開示する。ここで、前記遺伝子は、前記非天然存在型ｍｉＲＮＡによって標的にされる。

本発明の他の態様も本明細書中に開示する。

ＲＮＡｉ経路を示す模式図である。図は、１）ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ → ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ→成熟ｍｉＲＮＡのプロセス、および２）ｓｉＲＮＡがこの経路に入る位置を示す。 標的配列（ｍＲＮＡ）とその逆相補配列について、スキャホールド内で標的にする配列の相対配置を示す模式図である。 ２次構造および非ワトソン−クリック塩基対を含むｍｉＲ−１９６ａ−２スキャホールドにおける重要な位置を示す模式図である。成熟鎖（標的とする鎖）およびスター鎖の両方の鎖での位置を示す。 本研究で使用する、配列、制限領域、人工イントロンの重要特性（例えば、５’および３’スプライスサイト、分岐点、ポリピリミジン領域など）を示す。 ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）中の人工イントロンの位置を図示する。ＳＤ＝スプライスドナー、ＳＡ＝スプライスアクセプター。 ｍｉＲ−１９６ａ−２に関する標的配列類とフランキング配列類を示す。配列は５→３’方向におけるものである。配列中下線で示した部分は、図６で詳細を示す。 ｍｉＲ−２６ｂに関する標的配列類とフランキング配列類を示す。配列は５→３’方向におけるものである。配列中下線で示した部分は、図６で詳細を示す。 ｍｉＲ−２０４に関する標的配列類とフランキング配列類を示す。配列は５→３’方向におけるものである。配列中下線で示した部分は、図６で詳細を示す。 ２重ルシフェラーゼレポーター構築体の図を示す。切断レポータープラスミド類を構築するために使用したｐｓｉＣＨＥＣＫ−２ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）の模式図を示す。ベクターはホタル（ｈｌｕｃ）およびウミシイタケ（ｈＲｌｕｃ）ルシフェラーゼ遺伝子類を含む。標的配列はｈＲｌｕｃの３’ＵＴＲに挿入される。 １０種の異なるｍｉＲＮＡスキャホールド類のスクリーニング結果を示す。レポーターアッセイで高活性を示した３種のｍｉＲＮＡ類（ｍｉＲ−２０４、ｍｉＲ−２６ｂ、およびｍｉＲ−１９６ａ−２）を同定した２重ルシフェラーゼレポ−ターを用いた、多数のｍｉＲＮＡスキャホールド類のスクリーニング結果を示す。水平な線は８０％ノックダウンを表す。 ｍｉＲＮＡスキャホールド類の中にある修飾部位の図を示す。●印は、ゆらぎ塩基対を示す。ｍｉＲ−２６ｂ構築例を示す。図の上部：四角で囲まれた部分は、成熟鎖配列の位置を示す。ここでは内在性成熟鎖配列として示される。このフォーマットのヌクレオチド類は、ＢｌｐＩおよびＳａｃＩ制限領域を導入する置換体である。図の下部：棒グラフは成熟鎖およびスター鎖機能に対して制限領域を導入した効果を示す。 ｍｉＲ−２０４構築例を示す。図の上部：四角で囲まれた部分は、成熟鎖配列の位置を示す。ここでは内在性成熟鎖配列として示される。このフォーマットのヌクレオチド類は、ＢｌｐＩおよびＳａｃＩ制限領域を導入する置換体である。図の下部：棒グラフは成熟鎖およびスター鎖機能に対して制限領域を導入した効果を示す。 ｍｉＲ−１９６ａ−２構築例を示す。図の上部：四角で囲まれた部分は、成熟鎖配列の位置を示す。ここでは２１ヌクレオチド成熟鎖配列として示される。しかし、ｍｉＲ−１９６ａ−２の内在性成熟鎖配列は、実際には２２ヌクレオチド長であってもよく、四角で囲まれた部分で示した配列よりも３’位においてさらに１ヌクレオチド（＊印で示したｇヌクレオチド）だけ長くてもよい。よって、＊印で示したｇヌクレオチドは、Ｄｒｏｓｈａおよび／またはＤｉｃｅｒによってスキャホールドが処置された方法に依存して成熟鎖の一部であってよく、また、スキャホールドの一部であってもよい（および、相対するヌクレオチドｃは、スター鎖の一部または、スキャホールドの一部であってよい）。ＢｌｐＩ領域は、このスキャホールドの天然構成部分である。このフォーマットのヌクレオチドは、ＸｂａＩ、ＳｃａＩおよびＳａｃＩ制限領域を導入する置換体である。 棒グラフは成熟鎖およびスター鎖機能に対して制限領域を導入した効果を示す。ＳｃａＩ＝スキャホールド構造中のミスマッチ部分、ＳｃａＩ＋。ミスマッチを除くために塩基対変換を導入した。ＸｂａＩ：構造中にミスマッチを導入する。ＸｂａＩ＋＝ミスマッチを除くために塩基対変換を導入した。修飾した構築体の活性を試験した全ての実験は、２重ルシフェラーゼレポ−ターを用いて行った。 ｍｉＲ−１９６ａ−２およびｍｉＲ−２０４スキャホールドの幹−ループ領域の例を示す。Ｍ＝成熟鎖。Ｓ＝スター鎖。なお、ｍｉＲ−１９６ａ−２の例中、＊印で示されたｇは、成熟鎖配列の一部とみなしてもよい。 ｍｉＲ−２０４スキャホールドの例を示す。成熟鎖およびスター鎖の挿入位置を図示する。内在性ｍｉＲ−２０４についてのヌクレオチド置換体をこのフォーマットを用いて示した。 ｍｉＲ−１９６ａ−２スキャホールドの例を示す。成熟鎖およびスター鎖の挿入位置を図示する。内在性ｍｉＲ−１９６ａ−２についてのヌクレオチド置換体をこのフォーマットを用いて示した。なお、＊印で示されたヌクレオチドｇは、成熟鎖配列の一部とみなしてもよく、よって、相対位置にあるｃもまたスター鎖配列の一部とみなしてよい。 ＧＡＤＰＨウオークに用いる配列類の模式図である。ＧＡＤＰＨウオークに用いる配列は、ＧＡＰＤＨ遺伝子の決められた領域を標的にし、標的領域を通って連続した２ｎｔステップを表す。各標的位置を示す配列類を全て合成し、ｍｉＲ−２６ｂ、−２０４、および −１９６ａ−２にクローニングした。天然構築対を複製した２次構造は、可能な場合、設計中に取り入れた。 様々な配列類の機能を調べるためにｈＲｌｕｃリポーターの３’ＵＴＲに挿入したＧＡＰＤＨ標的配列を示す。これらの文字列は実際の標的配列を表す。 ｓｉＲＮＡとして配列類が輸送されたときの、ＧＡＰＤＨウオークのサイレンシング効率を示す。 各配列がｍｉＲ−２６ｂスキャホールド内に輸送されたときの、ＧＡＰＤＨウオーク中の各配列のサイレンシング効率を示す。 各配列がｍｉＲ−２０４スキャホールド内に輸送されたときの、ＧＡＰＤＨウオーク中の各配列のサイレンシング効率を示す。 各配列がｍｉＲ−１９６ａ−２スキャホールド内に輸送されたときの、ＧＡＰＤＨウオーク中の各配列のサイレンシング効率を示す。 各配列がｍｉＲ−１９６ａ−２スキャホールド内に輸送されたときの、ＧＡＰＤＨウオーク中の各配列のサイレンシング効率を示す。２次構造は保持されなかった。 棒グラフは、各バックボーンにおいて各レベルでノックダウンを誘発した配列類の数を示す。ここで、ｍｉＲ−１９６ａ−２ｈｐは保持された２次構造をもたなかった配列類を表す。 機能性標的配列類についての望ましい特性を示す。機能性配列類のそれぞれの位置にあるヌクレオチドの特徴を分析して、ｍｉＲ−１９６ａ−２アルゴリズムに組み込み可能なヌクレオチドの傾向を同定した。Ｙ軸はヌクレオチド類の差異の傾向を示す。Ｘ軸は、それぞれのヌクレオチドの位置を示す。 ｍｉＲ−１９６ａ−２ウオーク中にある全ての配列の機能性に対して、全ての標的配列ＧＣ含有量をプロットした図を示す。この結果は、標的配列中に１０個以下のＧおよびＣを有する配列類は、それ以上のＧＣ数を有する配列類よりも高い機能性を示す傾向が強いことを示す。 ｓｉＲＮＡ合理的設計アルゴリズム（特許文献１参照）によって選ばれた標的配列類と、ｍｉＲ−１９６ａ−２合理的設計アルゴリズムによって選ばれた標的配列類との差異を示す。ＣＤＣ２遺伝子用の配列は、ｓｉＲＮＡ設計アルゴリズムおよびｍｉＲ−１９６ａ−２スキャホールドアルゴリズムにより設計した。図に示すように、２つのアルゴリズムは全く異なる標的配列類を選んでいる。このことは、この２つの技術は関連性をもたないという性質を強く示すものである。 ２重ルシフェラーゼレポーターに挿入したＭＡＰＫ１およびＥＧＦＲについての標的配列を示す。 ２重ルシフェラーゼレポーターに挿入したＭＡＰＫ１およびＥＧＦＲについての標的配列を示す。 ｓｉＲＮＡアルゴリズム（ｓｉＲＤ）によって設計したＥＧＦＲおよびＭＡＰＫ１を標的にする配列類の機能性を、ｍｉＲ−１９６ａ−２アルゴリズム（ｓｈＲＤ）によって設計した配列類の機能性と比較した図を示す。両セットの配列類を、人工的ｍｉＲ−１９６ａ−２バックボーンにクローニングし、２重ルシフェラーゼアッセイにより標的遺伝子（ｈＲｌｕｃ）のノックダウン能を試験した。また、合理的に設計したｓｉＲＮＡ配列類を、１）ｓｈＲＮＡ類に変換し、２）ｍｉＲ−１９６ａ−２バックボーンにクローニングし、比較用に用いた。ここで、天然ｍｉＲ−１９６ａ−２の２次構造にマッチする２次構造を、ｓｉＲＮＡ−ｓｈＲＮＡ設計に取り入れた。２重ルシフェラーゼアッセイを用いて機能性を測定した。 ＣＤＣ２、ＣＤ２８、ＣＤ６９、およびＬＡＴを含むその他の遺伝子を標的にする新規ｍｉＲ−１９６ａ−２アルゴリズムの機能を示す。 ２重ルシフェラーゼアッセイ用に、３’ＵＴＲ ｈＲｌｕｃ多重クローニングサイトに挿入したＺａｐ７０標的配列の配列を示す。 成熟鎖のシード領域にあるＧＣの位置を同定した、Ｚａｐ７０遺伝子を標的にする４つの非機能性挿入体の配列類を示す。破線の部分は成熟鎖配列（５’→３’）を表し、太い下線部分は成熟鎖配列の位置を示し、実線で囲まれた部分は各配列のＧＣ部分を示す。 ｍｉＲ−１９６ａ−２ウオークから採取した機能性配列の収集物について行った最近傍分析法から、機能性が高い配列類では、成熟鎖シード領域内にＧＣ含有量が少ないことが示される。Ｘ軸は成熟鎖における位置を表し、Ｙ軸は機能性配列についての自由エネルギー傾向の差異を表す。 図の棒グラフは、ｍｉＲ−１９６ａ−２ ｓｈＭＩＭＩＣを形成するようにｍｉＲ−１９６ａ−２スキャホールド中に挿入したときの、多数の内在性ｍｉＲＮＡ配列類の機能性を示す。内在性ｍｉＲ−１９６ａ−２マイクロＲＮＡに関わる２次構造およびいくつかの配列傾向を保持しながら、ｍｉＲ−１９６ａ−２スキャホールドに天然型配列類をクローニングした。構築体は全て７０％以上のサイレンシングを示した。 ｍｉＲ−１９６ａ−２ｓｈＭＩＭＩＣについての設計戦略全体を示す。内在性２２ヌクレオチド成熟鎖およびスター鎖配列類を示す。図６ａ−図６ｇの説明および以下に示したように、２２位塩基（図６ａ−図６ｇ中＊印で示された塩基に相当する）を含まない２１ヌクレオチド成熟鎖を、ｍｉＲ−１９６ａ−２がもつという証拠もある。内在性成熟鎖配列は、例えば、別の内在性ｍｉＲから得られる１８−２３ヌクレオチド配列によって置き換えられる。また、内在性スター鎖配列は、その大部分が新しい成熟鎖の逆相補鎖であるが、内在性ｍｉＲ−１９６ａ−２の２次構造を複製するようにいくつかの局所的な配列修飾を有する配列によって置き換えられる。これらの修飾には、成熟鎖１２位のヌクレオチドとスター鎖の相対する位置にあるヌクレオチドとのミスマッチを導入することや、成熟鎖の５位、１８位、１９位（もし在れば）および２１位（もし在れば）のヌクレオチド類とスター鎖の相対する位置にあるヌクレオチド類とのミスマッチを導入することが含まれる。ここで、２３ヌクレオチド成熟鎖（または、それより長い成熟鎖）は、２２位（例えば、３’）より後の位置にヌクレオチドを加えて提供してもよく、合わせて、スター鎖の相対する位置に好ましくはワトソンークリック塩基対が形成されるようにヌクレオチドを追加して提供してもよい。

「人工イントロン」という用語は、イントロンとして作用するように設計された特定の配列を意味する。

「合理的設計」という用語は、高い機能性レベルで遺伝子サイレンシングを提供する配列が同定される可能性を増す条件一式を使用する設計方法を意味する。

「レポーター」または「レポーター遺伝子」という用語は、発現を観察できる遺伝子を意味する。例えば、レポーターの発現レベルは、ＲＮＡｉ経路の基質によって遺伝子サイレンシングが成功したかどうか調べるために評価することが可能である。

「ＲＮＡ誘発サイレンシング複合体」およびその頭字語「ＲＩＳＣ」という用語は、切断、翻訳減衰、メチル化、および／または他の変形を行うためにｍＲＮＡなどの核酸分子類を標的にするため、成熟ｍｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡなどの単鎖ポリヌクレオチドと複合体を作るタンパク質一式を意味する。ＲＩＳＣの、既に知られた限定されない構成要素には、ｓｉＲＮＡ類やｍｉＲＮＡ類とともに、Ｄｉｃｅｒ、Ｒ２Ｄ２、およびＡｒｕｇｏｎａｕｔｅタンパク質ファミリーが含まれる。

「ＲＮＡ干渉」および「ＲＮＡｉ」という用語は同義語であり、ポリリボヌクレオチド単位を少なくとも１つ含むポリヌクレオチド（ｍｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ）が、生物学的プロセスに影響を及ぼすプロセスを意味する。このプロセスは、補助タンパク質を用いたＤＮＡのメチル化とともに、ｍＲＮＡ分解、翻訳減衰、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、およびゲノムＤＮＡとの相互作用による遺伝子サイレンシングを含むが、これらに限定されるものではない。

「遺伝子サイレンシング」という用語は、特定の遺伝子産物の発現がＲＮＡ干渉により減少するまたは減衰するプロセスを意味する。遺伝子サイレンシングレベル（ときには、「ノックダウン」の程度とも称されるが）は、様々な手段により測定できるが、その手段としては、ノーザンブロット分析法による転写レベルの測定、Ｂ−ＤＮＡ技術、転写感受性レポ−ター、発現プロファイリング（例えば、ＤＮＡチップ）、ｑＲＴ−ＰＣＲ、および関連技術が含まれるが、これらに限定されるものではない。他方、サイレンシングレベルは、特定遺伝子によってコードされるタンパク質のレベルを調べることで測定できる。この方法は、ウエスタン分析法、蛍光タンパク質（ＧＦＰなど）をもつレポータータンパク質の発現レベルの測定、または酵素活性（例えば、アルカリホスファターゼ）、またはその他の方法を含む、数多くの研究を行うことで実施できる。

「マイクロＲＮＡ」、「ｍｉＲＮＡ」、または「ｍｉＲ」という用語は全て、ＲＮＡｉ経路に入ることが可能であり、遺伝子発現を調節できる非コードＲＮＡ類を意味するが、これらのＲＮＡ類をコードするＤＮＡ配列類をも意味する。「プライマリーｍｉＲＮＡ」または「ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ」は、Ｄｒｏｓｈａプロセス前の非コード転写を表し、フランキング５’配列および３’配列とともに、幹−ループ配列を含む。「プレカーサーｍｉＲＮＡ」または「ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ」は、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡのＤｒｏｓｈａプロセス後の非コード転写を表す。「成熟ｍｉＲＮＡ」という用語は、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡのＤｉｃｅｒプロセスによって得られる２本鎖産物を意味するか、または、Ｄｉｃｅｒプロセスに続きＲＩＳＫに導入される単鎖産物を意味する。ある場合には、ｍｉＲＮＡの単鎖だけがＲＮＡｉ経路に入る。また、別の場合には、ｍｉＲＮＡの２本鎖がＲＮＡｉ経路に入ることができる。

「成熟鎖」という用語は、内在性ｍｉＲＮＡ中の配列を意味するか、または、標的ＲＮＡと完全にまたは一部分が逆相補的（ＲＣ）である非天然存在型ｍｉＲＮＡを意味する。「成熟配列」、「標的鎖」、「標的配列」、および「ガイド鎖」の用語は、「成熟鎖」という用語と同義であり、しばしば交換可能に用いられる。

「スター鎖」という用語は、ｍｉＲＮＡ中の成熟鎖に完全にまたは一部分が相補的である鎖を意味する。「パッセンジャー鎖」および「スター鎖」という用語は、交換可能である。

「標的配列」という用語は、成熟鎖と一部または完全に相補的である、標的ＲＮＡ中またはＤＮＡ中の配列を意味する。標的配列は、ＤＮＡの４つの塩基（Ａ、Ｔ、Ｇ、およびＣ）、またはＲＮＡの４つの塩基（Ａ、Ｕ、Ｇ、およびＣ）、を用いて記載することができる。ある場合には、標的配列は内在性ｍｉＲＮＡ成熟鎖により認識される配列である。別の場合には、標的配列はランダムに決定される。またある場合には、標的配列は、１つ以上の所望の特徴に基づいて好ましい標的配列類を同定するアルゴリズムによって同定することができる。

「標的ＲＮＡ」という用語は、ＲＮＡの機能活性を減少させるＲＮＡｉ経路によって標的となる特定のＲＮＡを意味する。ある場合には、ＲＮＡ標的は、翻訳能がその機能であるｍＲＮＡである。また、ある場合には、ＲＮＡｉ経路により、翻訳減衰または切断を通してｍＲＮＡの機能活性が減少する。本発明では、標的ＲＮＡ類は非天然存在型ｍｉＲＮＡ類により標的にされる。「標的」という用語は、ＤＮＡも意味する。

「内在性ｍｉＲＮＡ」という用語は、生物のゲノム内に本来存在する配列の転写により、その生物内で生産されるｍｉＲＮＡを意味する。内在性ｍｉＲＮＡは、例えば、イントロン、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、５’または３’非翻訳領域（ＵＴＲ）、または、遺伝子間領域の中に局在可能である。内在性ｍｉＲＮＡを生産する生物は、ヒト（または他の霊長類）、マウス、ラット、ハエ、虫類、魚類、または完全なＲＮＡｉ経路をもつ他の生物であってよいが、これらに限定されるものではない。

「相補的」という用語は、ポリヌクレオチドがもつ互いに塩基対を形成する性質を意味する。非平行なポリヌクレオチド鎖の中にあるヌクレオチド単位どうしの間に、一般に水素結合により塩基対が形成される。相補的ポリヌクレオチド鎖は、ワトソン−クリック様式（例えば、Ａ対Ｔ、Ａ対Ｕ、Ｃ対Ｇ）で塩基対を形成できる。または、ＵとＧの間に形成されるゆらぎ塩基対を含む、２本鎖を形成可能ないかなる様式でも塩基対を形成できる。当業者が知るように、ＤＮＡに対してＲＮＡを用いる場合、チミンよりもウラシルの方がアデノシンに相補的な塩基と考えられる。本発明の中でＵが示された場合、他に説明がない限りＴを置換できることを意味する。

完全相補性、または１００％相補性という用語は、１つのポリヌクレオチド鎖の各ヌクレオチド単位が、第２のポリヌクレオチド鎖のヌクレオチド単位と水素結合できる状態を意味する。部分相補性とは、２本の鎖の、全部ではないがいくつかのヌクレオチド単位が、互いに水素結合できる状態を意味する。例えば、少なくとも６塩基対−７塩基対が約１９−２５ヌクレオチド長に対して形成されるとき、２本の鎖は少なくとも部分相補的である。また、各配列が他の配列に対して（部分または完全）逆相補的（ＲＣ）であるとき、配列類は互いに「相補的」であると称される。例えば、配列５’ＧＡＴＣ３’は、その逆相補的配列３’ＣＴＡＧ５’に対して完全相補的である。また、配列類はゆらぎ塩基対をもつこともできる。

「２本鎖」という用語は、互いに塩基対を形成する、２本の相補的またはほぼ相補的ポリヌクレオチドにより形成される２本鎖構造を意味する。ワトソン−クリック塩基対やＵ−Ｇゆらぎ塩基対が含まれ、少なくとも部分相補的であるポリヌクレオチド鎖間の２本鎖構造を安定化する。２本鎖である鎖は、２本鎖を形成するために必ずしも完全相補的である必要はない。例えば、１つ以上のミスマッチを２本鎖は有してもよい。

単ポリヌクレオチド分子は、分子内塩基対をもつ２本鎖を形成しうる反平行で相補的なポリヌクレオチド鎖を有することができる。このようなポリヌクレオチド類は、しばしば幹−ループ構造を有する。幹−ループ構造では、幹の鎖類は主に単鎖であるループ配列によって分離され、完全に反平行な向きをとることができる。幹−ループ構造は、この技術分野においてよく知られている。Ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ類およびＰｒｉ−ｍｉＲＮＡ類は、しばしば、幹が成熟鎖−スター鎖２本鎖を有する１つ以上の幹−ループ構造をもつ。

「ヌクレオチド」という用語は、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドまたは、それらを修飾した形を意味するとともに、その誘導体を意味する。ヌクレオチドは、アデニン、ハイポキサンチン、グアニン、およびその誘導体や類縁体などのプリン類、チトシン、ウラシシル、チミン、およびその誘導体や類縁体などのピリミジン類からなる構成要素を有する。ヌクレオチド類縁体には、塩基、糖および／またはホスフェートの化学構造を修飾したヌクレオチドを含む。これらの修飾には、５位ピリミジン修飾、８位プリン修飾、チトシン エキソサイクリックアミン修飾、５−ブロモウラシルを含むが、これに限定されるものではない。さらに、２’位糖の修飾も含まれるが、２’−ＯＨが、Ｈ、ＯＲ、Ｒ，ハロゲン、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲ２またはＣＮなどの基で置換され、Ｒがアルキル基である、糖修飾リボヌクレオチドも含まれるが、これらに限定されるものではない。また、ヌクレオチド類縁体は、イノシン、クエウオシン、キサンチンなどの塩基類、２’メチルリボースなどの糖類、イネチルホスホネート、ホスホチオエートおよびペプチドなどの非天然型ホスホジエステル結合部類をもつヌクレオチド類を含むことも意味する。

修飾塩基という用語は、アデニン、グアニン、チトシン、チミン、ウラシル、キサンチン、イノシン、およびクエウオシンなどの塩基が、１つ以上の原子または基で置換または付加して修飾されているヌクレオチド塩基を意味する。塩基部分が修飾されているヌクレオチドを含む修飾例としては、アルキル化、ハロゲン化、チオール化、アニノ化、アミド化、アセチル化で修飾された塩基類が挙げられるが、単独またはこれらの組み合わせでもよい。さらに具体的な例としては、５−プロピニルウリジン、５−プロピニルシチジン、６−メチルアデニン、６−メチルグアニン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアデニン、２−プロピルアデニン、２−プロピルグアニン、２−アミノアデニン、１−メチルイノシン、３−メチルウリジン、５−メチルシチジン、５−メチルウリジン、および５位が修飾されたその他のヌクレオチド類、５−（２−アミノ）プロピル ウリジン、５−ハロシチジン、５−ハロウリジン、４−アセチルシチジン、１−メチルアデノシン、２−メチルアデノシン、３−メチルシチジン、６−メチルウリジン、２−メチルグアノシン、７−メチルグアノシン、２，２−ジメチルグアノシン、５−メチルアミノエチルウリジン、５−メチルオキシウリジン、７−デアザ−アデノシン、６−アゾウリジン、６−アゾシチジン、６−アゾチミジン、５−メチル−２−チオウリジン、などのデアザヌクレオチド類、２−チオウリジン、４−チオウリジン、２−チオシチジン、ジヒドロウリジン、シュードウリジン、クエウオシン、アルカエオシンなどのその他のチオ塩基類、ナフチルおよび置換ナフチル基、Ｎ６−メチルアデノシン、５−メチルカルボニルメチルウリジン、ウリジン５−オキシ酢酸、ピリジン−４−オン、ピリジン−２−オンなどのＯ−およびＮ−アルキル化プリン類およびピリミジン類、アミノフェノールまたは２，４，６−トリメトキシベンゼンなどのフェニルおよび修飾フェニル基、Ｇ−クランプヌクレオチドとして働く修飾チトシン類、８−置換アデニン類およびグアニン類、５−置換ウラシル類およびチミン類、アザピリミジン類、カルボキシヒドロキシアルキル ヌクレオチド類、カルボキシアルキルアミノヌクレオチド類、およびアルキルカルボニルアルキル化ヌクレオチド類が挙げられる。また、修飾ヌクレオチドには、糖部分が修飾されたヌクレオチドも含まれるとともに、リボースではない糖または糖類縁体をもつヌクレオチドも含まれる。例えば、この糖部分は、マンノース、アラビノース、グルコピラノース、ガラクトピラノース、４’−チオリボース、およびその他の糖類、複素環または炭素環であってよい。

ヌクレオチドという用語は、本技術分野で一般的に知られた塩基も含むことも意味する。例えば、３−ニトロピロール、５−ニトロインドール、またはネブラリンなどの一般的塩基を含むが、これに限定されるものではない。また、「ヌクレオチド」という用語は、リボシル３’酸素をアミノ基で置換した、Ｎ３’−Ｐ５’ホスホラミダイトを含む。さらに、「ヌクレオチド」という用語には、ヌクレオチドに放射活性、蛍光またはマスラベルなどの検出可能な標識をもつものも含まれる。

「ポリヌクレオチド」という用語は、２つ以上のヌクレオチドからなるポリマー類を意味し、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを含むが、これらに限定されるものではない。ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドは、デオキシリボシル部分およびリボシル部分を規則的および／または不規則に変換したポリヌクレオチド鎖を有する。これらの変換されたヌクレオチド単位類は、糖部分の２’位に、−ＯＨ、続いて−Ｈ、続いて−ＯＨ、続いて−Ｈなどをもつ。さらに、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドは、任意の位置のヌクレオチド単位類に様々な部分構造を取り付けた、この種のポリヌクレオチド類を修飾したものも含むが、これらに限定されるものではない。

「リボヌクレオチド」および「リボ核酸（ＲＮＡ）」という用語は、少なくとも１つのリボヌクレオチド単位をもつ、修飾または無修飾のヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを意味する。リボヌクレオチド単位は、リボシル部分１’位のＮ−グリコシド結合部に結合した窒素含有塩基をもつリボシル部分２’位に結合した水酸基を有し、別のヌクレオチドに結合できるかまたは結合を不可能にする部分構造を有する。

一態様として、本発明は、標的ＲＮＡの機能を低下できる非天然存在型ｍｉＲＮＡ（人工ｍｉＲＮＡとも称する）を提供する。「非天然存在型ｍｉＲＮＡ」（ここでは、特定の内在性ｍｉＲＮＡを意味する）は、特定の内在性ｍｉＲＮＡから誘導される幹−ループ構造を有するｐｒｅ−ｍｉＲＮＡまたはｐｒｉ−ｍｉＲＮＡを意味する。この特定の内在性ｍｉＲＮＡ中の幹−ループ構造の幹は成熟鎖−スター鎖２本鎖を導入している。ここで、この２本鎖中の成熟鎖配列は特定の内在性ｍｉＲＮＡの内在性成熟鎖配列とは異なるものである。また、本発明の非天然存在型ｍｉＲＮＡのスター鎖配列も、特定の内在性ｍｉＲＮＡの内在性成熟鎖配列とは異なるものである。

成熟鎖−スター鎖２本鎖の外部にある非天然存在型ｍｉＲＮＡの配列類（例えば、以下に詳述するようにフランキング配列を含んでもよい成熟鎖−スター鎖２本鎖のどちらか一方にあるループおよび幹領域）を、ここでは「ｍｉＲＮＡスキャホールド」、「スキャホールドタンパク」または単に「スキャホールド」と称する。従って、別の実施形態では、本発明は非天然存在型ｍｉＲＮＡを生産するのに有用なｍｉＲＮＡスキャホールドを提供する。本発明の非天然存在型ｍｉＲＮＡは、特定の内在性ｍｉＲＮＡから誘導される（例えば、少なくとも６０％一致から１００％一致を含む）ｍｉＲＮＡスキャホール）を有し、さらに、前記特定の内在性ｍｉＲＮＡからは得られない成熟鎖−スター鎖２本鎖を有する。本発明の、単一ｍｉＲＮＡスキャホールドは、ほぼ限りない数の異なる非天然存在型ｍｉＲＮＡ類を提供することに利用できる。それぞれの非天然存在型ｍｉＲＮＡは、同じｍｉＲＮＡ配列を有するが、異なる成熟鎖およびスター鎖配列を有する。

ここで、「非天然存在型ｍｉＲＮＡ」という用語は、ＲＮＡ分子だけではなく、ある文脈ではこのＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ分子を含むことを、当業者は認めるであろう。

本発明のｍｉＲＮＡスキャホールド配列が誘導される内在性ｍｉＲＮＡ類としては、ヒト由来のｍｉＲ−２６ｂ、ｍｉＲ−１９６ａ−２、およびｍｉＲ−２０４（ｍｉＲＮＡ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＭＩＭＡＴ０００００８３，ＭＩＭＡＴ００００２２６，ＭＩＭＡＴ００００２６５。それぞれ、
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より入手可能）、および、他の種由来のｍｉＲ−２６ｂ、ｍｉＲ−１９６ａ−２、およびｍｉＲ−２０４が含まれるが、これらに限定されるものではない。この説明の中では、２つのｍｉＲＮＡは、各配列の成熟鎖が一致またはほぼ一致する場合に、同等であると判定する。従って、「非天然存在型ｍｉＲ−１９６ａ−２ｍｉＲＮＡ」という用語は、（例えば、ｍｉＲ−１９６ａ−２または同等の配列から誘導されるｍｉＲＮＡスキャホールドなどの）ｍｉＲ−１９６ａ−２ｍｉＲＮＡを有し、さらに、内在性ｍｉＲ−１９６ａ−２の内在性成熟鎖およびスター鎖とは異なる内在性成熟鎖およびスター鎖を有する、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡまたはｐｒｉ−ｍｉＲＮＡを意味する。従って、非天然存在型ｍｉＲ−１９６ａ−２ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−１９６ａ−２（任意の種）から誘導される幹−ループ構造を有する。このｍｉＲ−１９６ａ−２では、幹−ループ構造の幹は、成熟鎖配列がｍｉＲ−１９６ａ−２の内在性成熟鎖配列とは異なる、成熟鎖−スター鎖２本鎖を組み込んでいる。同様に、「非天然存在型ｍｉＲ−２０４ ｍｉＲＮＡ」という用語は、ｍｉＲ−２０４スキャホールド（例えば、ｍｉＲ−２０４から誘導されるｍｉＲＮＡスキャホールド）およびｍｉＲ−２０４から誘導されない成熟鎖−スター鎖配列を有する、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡまたはｐｒｉ−ｍｉＲＮＡを意味する。非天然存在型ｍｉＲ−２０４ ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−２０４（任意の種）から誘導される幹−ループ構造を有する。このｍｉＲ−２０４では、幹−ループ構造の幹は、成熟鎖配列がｍｉＲ−２０４の内在性成熟鎖配列とは異なる、成熟鎖−スター鎖２本鎖を組み込んでいる。

ｍｉＲＮＡスキャホールド配列は、具体的に述べた内在性ｍｉＲＮＡ（例えば、ｍｉＲ−１９６ａ−２またはｍｉＲ−２０４）と同じものであってよい。また、ｍｉＲＮＡスキャホールド配列は、内在性ｍｉＲＮＡ配列について１つ以上のヌクレオチドを付加、置換、または除去するという点で、具体的に述べた内在性ｍｉＲＮＡとは異なっていてもよい。このような修飾、例えば、制限領域を導入することによって、ｍｉＲＮＡスキャホールドの機能を高めることができる。制限領域は、ｍｉＲＮＡスキャホールドに成熟鎖−スター鎖配列を導入することで、さらに、細胞内で発現するように非天然存在型ｍｉＲＮＡをベクターに導入することで、クローニング戦略を助長することができる。また、成熟鎖およびスター鎖の長さを最小にするために、および、効率的かつ特定遺伝子サイレンシング能を生み出すために、ヌクレオチド変換をｍｉＲＮＡスキャホールド内で行うことができる。また、ＲＩＳＣと相互作用して、得られた非天然存在型ｍｉＲＮＡ内のスター鎖機能を最小にするために、ｍｉＲＮＡスキャホールドに対して配列修飾を行うことができる。また別の例では、ｍｉＲＮＡスキャホールドのループに存在するヌクレオチドの数を、製造効率を改善するために減らすことができる。

ｍｉＲＮＡスキャホールドは、さらに５’および／または３’フランキング配列を有してもよい（例えば、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡを生産するためにＤｒｏｓｈａで先ず処置したｐｒｉ−ｍｉＲＮＡとして、非天然存在型ｍｉＲＮＡを提供することが望ましい場合）。このようなフランキング配列類は、幹ループの５’および／または３’末端を側面に置き、約５ヌクレオチド長から約６００ヌクレオチド長、好ましくは、約５ヌクレオチド長から約１５０ヌクレオチド長の長さで並べられる。フランキング配列は、内在性ｍｉＲＮＡの幹−ループ構造の５’および／または３’末端を側面に置く。ｍｉＲＮＡスキャホールドはこの内在性ｍｉＲＮＡから誘導されるか、または、１つ以上の塩基対が付加、除去または置換されて異なっていてもよい。たとえば、ｍｉＲ−１９６ａ−２ｍｉＲＮＡスキャホールド（および成熟鎖配列およびスター鎖配列をクローニングすることにより得られる、非天然存在型ｍｉＲ−１９６ａ−２ｍｉＲＮＡ）は、内在性ｍｉＲ−１９６ａ−２ｍｉＲＮＡの幹−ループ構造の５’および／または３’末端を側面に置く内在性配列類と同じ、５’および／または３’フランキング配列を有してもよい。

５’および／または３’フランキング配列類は、具体的に述べたｍｉＲＮＡ以外の、内在性ｍｉＲＮＡの幹−ループ構造の５’および／または３’末端を側面に置く内在性配列類から得ることができる。例えば、いくつかの実施形態では、ｍｉＲ−１９６ａ−２ｍｉＲＮＡスキャホールドは、ｍｉＲ−２０４などの別のｍｉＲＮＡの幹−ループ構造の５’および／または３’末端を側面に置く内在性配列類から誘導される、５’および／または３’フランキング配列類を有する。また、別の例では、５’および／または３’フランキング配列類は、ｍｉＲＮＡの折りたたみ、処理過程、または機能に最小の影響しか及ぼさないように設計または証明された人工的な配列類であてよい。また、別の例では、５’および／または３’フランキング配列類は、Ｄｒｏｓｈａ、Ｄｉｃｅｒ、またはＲＮＡｉ経路の他の構成要素によって、非天然存在型ｍｉＲＮＡの折りたたみまたは処理過程を促進する、またはそれを妨げることのない天然配列類である。また、成熟ｍｉＲＮＡを生産するために、非天然存在型ｍｉＲＮＡの処理過程を促進する１つ以上のヌクレオチドモチーフおよび／または２次構造をもつように、フランキング配列類を設計または選択することができる。従って、例えば、非天然存在型ｍｉＲＮＡが発現目的のためにイントロン内に埋め込まれる場合、発現遺伝子から非天然存在型ｍｉＲＮＡの切り出しを増強する切断ドナーまたはアクセプターサイトを有するように、ｍｉＲＮＡスキャホールド内のフランキング配列類を修飾可能である。一方、特有な配列または配列類によってｍｉＲＮＡ処理過程を促進する場合には、このような配列類を５’および／または３’フランキング配列内に挿入することが可能である。こうした配列類は、ＡＵに富んだ配列類、およびＲＮＡｉマシナリーの１つ以上の構成要素と親和性をもつ配列類、およびＲＮＡｉマシナリーによって処理過程を促進する２次構造を形成させる配列類を有してもよい。ある実施形態では、フランキング配列は、図４に示されるように人工イントロンを有する。

また、別の実施形態では、ｍｉＲＮＡスキャホールド内にある５’および／または３’フランキング配列類を、ｍｉＲＮＡスキャホールドの他の部分の種とは異なる種から得てもよい。例えば、ｍｉＲ−１９６ａ−２ ｍｉＲＮＡスキャホールド内にある５’および／または３’フランキング配列類を、ラットｍｉＲ−１９６ａ−２フランキング領域（または、他のラットｍｉＲＮＡのフランキング領域）から得てもよい。しかし一方では、ｍｉＲ−１９６ａ−２ ｍｉＲＮＡスキャホールドの残りの部分は、ヒトｍｉＲ−１９６ａ−２から得られる。

本発明のｍｉＲＮＡスキャホールド類は、１）明確な幹およびループ構造をもち、２）最小の２次構造をもち、３）クローニングを促進するように修飾可能であり、４）非天然存在型ｍｉＲＮＡがＰｏｌ ＩＩまたはＰｏｌ ＩＩＩプロモーターから発現されるようにさせ、５）ループの大きさと配列を変換可能であり、６）非天然存在型ｍｉＲＮＡがプラスミドとしてエピジェネティクス的に保持されるとき、またはホストゲノムに挿入されるときに、非天然存在型ｍｉＲＮＡを機能するようにさせ、７）非天然存在型ｍｉＲＮＡを生産するために、内在性成熟ｍｉＲＮＡ配列の位置に、外部配列類を挿入または置換することが可能である。前記スキャホールドが、ＧＦＰなどのレポ−ター遺伝子またはプロマイシンなどの選択可能な標識遺伝子、またはその両者に結合している場合は、好適なｍｉＲＮＡスキャホールド類は、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、イントロン配列または前記遺伝子のＯＲＦに挿入されるされないにかかわらず、機能することができる。好適な例では、ＧＦＰをコードする遺伝子を有する融合構築体は、２つのコード配列および前記融合構築体の３’ＵＴＲ内に挿入した人工ｍｉＲＮＡ−１９６ａ−２を機能的に分離する、Ｐｅｐｔｉｄｅ ２Ａをコードする配列をプロマイシンにコードする遺伝子に対し、機能的に融合される。図６ｆおよび図６ｇは、ｍｉＲ−２０４およびｍｉＲ−１９６ａ−２スキャホールドの非限定的例をそれぞれ示す。成熟鎖およびスター鎖を挿入するサイトが図示される。内在性ｍｉＲ−２０４およびｍｉＲ−１９６ａ−２のヌクレオチド類の置換は、ここにあるフォーマットを用いて示される。このような置換では、クローニングを促進するために限定領域を導入する。

上記で記載したように、本発明の非天然存在型ｍｉＲＮＡは、特定内在性ｍｉＲＮＡから得られるｍｉＲＮＡスキャホールドを有し、さらに前記特定内在性ｍｉＲＮＡからは得られない成熟鎖−スター鎖２本鎖を有する。本発明の非天然存在型ｍｉＲＮＡの成熟鎖は、前記スキャホールドが得られる内在性ｍｉＲＮＡと同じ長さにすることができるが、長くも短くもすることができる。また、本発明の非天然存在型ｍｉＲＮＡの成熟鎖の長さは、得られた非天然存在型ｍｉＲＮＡがＤｒｏｓｈａおよび／またはＤｉｃｅｒにより加工することができれば、その長さは重要ではない。

本発明の非天然存在型ｍｉＲＮＡの成熟鎖のヌクレオチド配列は、１）他の内在性ｍｉＲＮＡと同じものであるか、または他の内在性ｍｉＲＮＡから得ることが可能であり、２）標的ｍＲＮＡ配列に基づいて選択する、または、３）標的ｍＲＮＡ配列に基づいて合理的に選択することができる。以下に、成熟鎖のこれら３種の原料について説明する。

＜別の内在性ｍｉＲＮＡ（ｓｈＭＩＭＩＣＳ）から成熟鎖を得る実施形態＞
最初の一連の実施形態では、非天然存在型ｍｉＲＮＡのｍｉＲＮＡスキャホールド部分が誘導されるｍｉＲＮＡとは全く異なる、別の内在性ｍｉＲＮＡの成熟鎖配列（例えば、少なくとも６０％同等から１００％同等な配列）に、非天然存在型ｍｉＲＮＡの配列が誘導されるものである。このような非天然存在型ｍｉＲＮＡを「ｓｈＭＩＭＩＣ」と称することとする。このようなｓｈＭＩＭＩＣ類は、第１の内在性ｍｉＲＮＡから得られるスキャホールド、第２の内在性ｍｉＲＮＡから得られる成熟鎖、および前記成熟鎖配列に少なくとも部分的に相補的であるスター鎖をもつ、幹−ループ構造を有する。

例えば、ｍｉＲＮＡ−１９６ａ−２ ｓｈＭＩＭＩＣは、ｍｉＲＮＡ−１９６ａ−２から誘導されるｍｉＲＮＡスキャホールド構造をもつが、ｍｉＲＮＡ−１９６ａ−２以外の内在性ｍｉＲＮＡの成熟鎖から誘導される成熟鎖も有する。好ましくは、ｍｉＲＮＡ−１９６ａ−２ ｓｈＭＩＭＩＣの成熟鎖配列は、約１８から約２３個の長さのヌクレオチド類、例えば、１８、１９、２０、２１、２２、２３個の長さのヌクレオチド類である。しかし、成熟鎖配列の長さは、ｓｈＭＩＭＩＣがＤｒｏｓｈａやＤｉｃｅｒにより認識され処理される限り、重要ではない。従って、１８ヌクレオチド長より短い成熟鎖配列、および２３ヌクレオチド長よりも長い成熟鎖配列を、ｍｉＲ−１９６ａ−２スキャホールド内に収めてもよい。ｍｉＲ−１９６ａ−２スキャホールドに基づいた、ｓｈＭＩＭＩＣ類の一般的な設計概念を、図１１に示す。

ある一連の実施形態では、ｍｉＲＮＡ−１９６ａ−２ ｓｈＭＩＭＩＣは、ホモサピエンス（ｈｓａ）由来の、以下に示す任意のｍｉＲＮＡ類の成熟鎖配列から誘導される成熟鎖配列を有する。hsa-let-7a-l, hsa-let-7a-2, hsa-let-7a-3, hsa-let-7b, hsa-let-7c, hsa-let-7d, hsa-let-7e, hsa-let-7f-l, hsa-let-7f-2, hsa-let-7g, hsa-let-7i, hsa-mir-1-1, hsa-mir-1-2, hsa-mir-7-1, has-mir-7-2, hsa-mir-7-3, hsa-mir-9-1, hsa-mir-9-2, hsa-mir-9-3, hsa-mir-10a, hsa-mir-10b, hsa-mir-15a, hsa-mir-15b, hsa-mir-16-1, hsa-mir-16-2, hsa-mir-17, hsa-mir-18a, hsa-mir-18b, hsa-mir-19a, hsa-mir-19b-l, hsa-mir-19b-2, hsa-mir-20a, hsa-mir-20b, hsa-mir-21, hsa-mir-22, hsa-mir-23a, hsa-mir-23b, hsa-mir-24-1, hsa-mir-24-2, hsa-mir-25, hsa-mir-26a-l, hsa-mir-26a-2, hsa-mir-26b, hsa-mir-27a, hsa-mir-27b, hsa-mir-28, hsa-mir-29a, hsa-mir-29b-l, hsa-mir-29b-2, hsa-mir-29c, hsa-mir-30a, hsa-mir-30b, hsa-mir-30c-l, hsa-mir-30c-2, hsa-mir-30d, hsa-mir-30e, hsa-mir-31, hsa-mir-32, hsa-mir-33a, hsa-mir-33b, hsa-mir-34a, hsa-mir-34b, hsa-mir-34c, hsa-mir-92a-l, hsa-mir-92a-2, hsa-mir-92b, hsa-mir-93, hsa-mir-95, hsa-mir-96, hsa-mir-98, hsa-mir-99a, hsa-mir-99b, hsa-mir-100, hsa-mir-101-1, hsa-mir-101-2, hsa-mir-103-1, hsa-mir-103-2, hsa-mir-105-1, hsa-mir-105-2, hsa-mir-106a, hsa-mir-106b, hsa-mir-107, hsa-mir-122, hsa-mir-124-1, hsa-mir-124-2, hsa-mir-124-3, hsa-mir-125a, hsa-mir-125b-l, hsa-mir-125b-2, hsa-mir-126, hsa-mir-127, hsa-mir-128-1, hsa-mir-128-2, hsa-mir-129-1, hsa-mir-129-2, hsa-mir-130a, hsa-mir-130b, hsa-mir-132, hsa-mir-133a- 1, hsa-mir-133a-2, hsa-mir-133b, hsa-mir-134, hsa-mir-135a-l, hsa-mir-135a-2, hsa-mir-135b, hsa-mir-136, hsa-mir-137, hsa-mir-138-1, hsa-mir-138-2, hsa-mir-139, hsa-mir-140, hsa-mir-141, hsa-mir-142, hsa-mir-143, hsa-mir-144, hsa-mir-145, hsa-mir-146a, hsa-mir-146b, hsa-mir-147, hsa-mir-147b, hsa-mir-148a, hsa-mir-148b, hsa-mir-149, hsa-mir-150, hsa-mir-151, hsa-mir-152, hsa-mir-153-1, hsa-mir-153-2, hsa-mir-154, hsa-mir-155, hsa-mir-181a-l, hsa-mir-181a-2, hsa-mir-181b-1, hsa-mir-181b-2, hsa-mir-181c, hsa-mir-181d, hsa-mir-182, hsa-mir-183, hsa-mir-184, hsa-mir-185, hsa-mir-186, hsa-mir-187, hsa-mir-188, hsa-mir-190, hsa-mir-190b, hsa-mir-191, hsa-mir-192, hsa-mir-193a, hsa-mir-193b, hsa-mir-194-1, hsa-mir-194-2, hsa-mir-195, hsa-mir-196a-1, hsa-mir-196b, hsa-mir-197, hsa-mir-198, hsa-mir-199a-1, hsa-mir-199a-2, hsa-mir-199b, hsa-mir-200a, hsa-mir-200b, hsa-mir-200c, hsa-mir-202, hsa-mir-203, hsa-mir-204, hsa-mir-205, hsa-mir-206, hsa-mir-208a, hsa-mir-208b, hsa-mir-210, hsa-mir-211, hsa-mir-212, hsa-mir-214, hsa-mir-215, hsa-mir-216a, hsa-mir-216b, hsa-mir-217, hsa-mir-218-1, hsa-mir-218-2, hsa-mir-219-1, hsa-mir-219-2, hsa-mir-220a, hsa-mir-220b, hsa-mir-220c, hsa-mir-221, hsa-mir-222, hsa-mir-223, hsa-mir-224, hsa-mir-296, hsa-mir-297, hsa-mir-298, hsa-mir-299, hsa-mir-300, hsa-mir-301a, hsa-mir-301b, hsa-mir-302a, hsa-mir-302b, hsa-mir-302c, hsa-mir-302d, hsa-mir-302e, hsa-mir-302f, hsa-mir-320a, hsa-mir-320b-1, hsa-mir-320b-2, hsa-mir-320c-l, hsa-mir-320c-2, hsa-mir-320d-l, hsa-mir-320d-2, hsa-mir-323, hsa-mir-324, hsa-mir-325, hsa-mir-326, hsa-mir-328, hsa-mir-329-1, hsa-mir-329-2, hsa-mir-330, hsa-mir-331, hsa-mir-335, hsa-mir-337, hsa-mir-338, hsa-mir-339, hsa-mir-340, hsa-mir-342, hsa-mir-345, hsa-mir-346, hsa-mir-361, hsa-mir-362, hsa-mir-363, hsa-mir-365-1, hsa-mir-365-2, hsa-mir-367, hsa-mir-369, hsa-mir-370, hsa-mir-371, hsa-mir-372, hsa-mir-373, hsa-mir-374a, hsa-mir-374b, hsa-mir-375, hsa-mir-376a-l, hsa-mir-376a-2, hsa-mir-376b, hsa-mir-376c, hsa-mir-377, hsa-mir-378, hsa-mir-379, hsa-mir-380, hsa-mir-381, hsa-mir-382, hsa-mir-383, hsa-mir-384, hsa-mir-409, hsa-mir-410, hsa-mir-411, hsa-mir-412, hsa-mir-421, hsa-mir-422a, hsa-mir-423, hsa-mir-424, hsa-mir-425, hsa-mir-429, hsa-mir-431, hsa-mir-432, hsa-mir-433, hsa-mir-448, hsa-mir-449a, hsa-mir-449b, hsa-mir-450a-l, hsa-mir-450a-2, hsa-mir-450b, hsa-mir-451, hsa-mir-452, hsa-mir-453, hsa-mir-454, hsa-mir-455, hsa-mir-483, hsa-mir-484, hsa-mir-485, hsa-mir-486, hsa-mir-487a, hsa-mir-487b, hsa-mir-488, hsa-mir-489, hsa-mir-490, hsa-mir-491, hsa-mir-492, hsa-mir-493, hsa-mir-494, hsa-mir-495, hsa-mir-496, hsa-mir-497, hsa-mir-498, hsa-mir-499, hsa-mir-500, hsa-mir-501, hsa-mir-502, hsa-mir-503, hsa-mir-504, hsa-mir-505, hsa-mir-506, hsa-mir-507, hsa-mir-508, hsa-mir-509-1, hsa-mir-509-2, hsa-mir-509-3, hsa-mir-510, hsa-mir-511-1, hsa-mir-511-2, hsa-mir-512-1, hsa-mir-512-2, hsa-mir-513a-l, hsa-mir-513a-2, hsa-mir-513b, hsa-mir-513c, hsa-mir-514-1, hsa-mir-514-2, hsa-mir-514-3, hsa-mir-515-1, hsa-mir-515-2, hsa-mir-516a-1, hsa-mir-516a-2, hsa-mir-516b-1, hsa-mir-516b-2, hsa-mir-517a, hsa-mir-517b, hsa-mir-517c, hsa-mir-518a-1, hsa-mir-518a-2, hsa-mir-518b, hsa-mir-518c, hsa-mir-518d, hsa-mir-518e, hsa-mir-518f, hsa-mir-519a-1, hsa-mir-519a-2, hsa-mir-519b, hsa-mir-519c, hsa-mir-519d, hsa-mir-519e, hsa-mir-520a, hsa-mir-520b, hsa-mir-520c, hsa-mir-520d, hsa-mir-520e, hsa-mir-520f, hsa-mir-520g, hsa-mir-520h, hsa-mir-521-1, hsa-mir-521-2, hsa-mir-522, hsa-mir-523, hsa-mir-524, hsa-mir-525, hsa-mir-526a-l, hsa-mir-526a-2, hsa-mir-526b, hsa-mir-527, hsa-mir-532, hsa-mir-539, hsa-mir-541, hsa-mir-542, hsa-mir-543, hsa-mir-544, hsa-mir-545, hsa-mir-548a-l, hsa-mir-548a-2, hsa-mir-548a-3, hsa-mir-548b, hsa-mir-548c, hsa-mir-548d-l, hsa-mir-548d-2, hsa-mir-548e, hsa-mir-548f-l, hsa-mir-548f-2, hsa-mir-548f-3, hsa-mir-548f-4, hsa-mir-548f-5, hsa-mir-548g, hsa-mir-548h-l, hsa-mir-548h-2, hsa-mir-548h-3, hsa-mir-548h-4, hsa-mir-548i-l, hsa-mir-548i-2, hsa-mir-548i-3, hsa-mir-548i-4, hsa-mir-548j, hsa-mir-548k, hsa-mir-5481, hsa-mir-548m, hsa-mir-548n, hsa-mir-548o, hsa-mir-548p, hsa-mir-549, hsa-mir-550-1, hsa-rair-550-2, hsa-mir-551a, hsa-mir-551b, hsa-mir-552, hsa-mir-553, hsa-mir-554, hsa-mir-555, hsa-mir-556, hsa-mir-557, hsa-mir-558, hsa-mir-559, hsa-mir-561, hsa-mir-562, hsa-mir-563, hsa-mir-564, hsa-mir-566, hsa-mir-567, hsa-mir-568, hsa-mir-569, hsa-mir-570, hsa-mir-571, hsa-mir-572, hsa-mir-573, hsa-mir-574, hsa-mir-575, hsa-mir-576, hsa-mir-577, hsa-mir-578, hsa-mir-579, hsa-mir-580, hsa-mir-581, hsa-mir-582, hsa-mir-583, hsa-mir-584, hsa-mir-585, hsa-mir-586, hsa-mir-587, hsa-mir-588, hsa-mir-589, hsa-mir-590, hsa-mir-591, hsa-mir-592, hsa-mir-593, hsa-mir-595, hsa-mir-596, hsa-mir-597, hsa-mir-598, hsa-mir-599, hsa-mir-600, hsa-mir-601, hsa-mir-602, hsa-mir-603, hsa-mir-604, hsa-mir-605, hsa-mir-606, hsa-mir-607, hsa-mir-608, hsa-mir-609, hsa-mir-610, hsa-mir-611, hsa-mir-612, hsa-mir-613, hsa-mir-614, hsa-mir-615, hsa-mir-616, hsa-mir-617, hsa-mir-618, hsa-mir-619, hsa-mir-620, hsa-mir-621 , hsa-mir-622, hsa-mir-623 , hsa-mir-624, hsa-mir-625, hsa-mir-626, hsa-mir-627, hsa-mir-628, hsa-mir-629, hsa-mir-630, hsa-mir-631, hsa-mir-632, hsa-mir-633, hsa-mir-634, hsa-mir-635, hsa-mir-636, hsa-mir-637, hsa-mir-638, hsa-mir-639, hsa-mir-640, hsa-mir-641, hsa-mir-642, hsa-mir-643, hsa-mir-644, hsa-mir-645, hsa-mir-646, hsa-mir-647, hsa-mir-648, hsa-mir-649, hsa-mir-650, hsa-mir-651, hsa-mir-652, hsa-mir-653, hsa-mir-654, hsa-mir-655, hsa-mir-656, hsa-mir-657, hsa-mir-658, hsa-mir-659, hsa-mir-660, hsa-mir-661, hsa-mir-662, hsa-mir-663, hsa-mir-663b, hsa-mir-664, hsa-mir-665, hsa-mir-668, hsa-mir-671, hsa-mir-675, hsa-mir-708, hsa-mir-720, hsa-mir-744, hsa-mir-758, hsa-mir-760, hsa-mir-765, hsa-mir-766, hsa-mir-767, hsa-mir-768, hsa-mir-769, hsa-mir-770, hsa-mir-802, hsa-mir-873, hsa-mir-874, hsa-mir-875, hsa-mir-876, hsa-mir-877, hsa-mir-885, hsa-mir-886, hsa-mir-887, hsa-mir-888, hsa-mir-889, hsa-mir-890, hsa-mir-891a, hsa-mir-891b, hsa-mir-892a, hsa-mir-892b, hsa-mir-920, hsa-mir-921, hsa-mir-922, hsa-mir-923, hsa-mir-924, hsa-mir-933, hsa-mir-934, hsa-mir-935, hsa-mir-936, hsa-mir-937, hsa-mir-938, hsa-mir-939, hsa-mir-940, hsa-mir-941-1, hsa-mir-941-2, hsa-mir-941-3, hsa-mir-941-4, hsa-mir-942, hsa-mir-943, hsa-mir-944, hsa-mir-1178, hsa-mir-1179, hsa-mir-1180, hsa-mir-1181, hsa-mir-1182, hsa-mir-1183, hsa-mir-1184, hsa-mir-1185-1, hsa-mir-1185-2, hsa-mir-1197, hsa-mir-1200, hsa-mir-1201, hsa-mir-1202, hsa-mir-1203, hsa-mir-1204, hsa-mir-1205, hsa-mir-1206, hsa-mir-1207, hsa-mir-1208, hsa-mir-1224, hsa-mir-1225, hsa-mir-1226, hsa-mir-1227, hsa-mir-1228, hsa-mir-1229, hsa-mir-1231, hsa-mir-1233, hsa-mir-1234, hsa-mir-1236, hsa-mir-1237, hsa-mir-1238, hsa-mir-1243, hsa-mir-1244, hsa-mir-1245, hsa-mir-1246, hsa-mir-1247, hsa-mir-1248, hsa-mir-1249, hsa-mir-1250, hsa-mir-1251, hsa-mir-1252, hsa-mir-1253, hsa-mir-1254, hsa-mir-1255a, hsa-mir-1255b-l, hsa-mir-1255b-2, hsa-mir-1256, hsa-mir-1257, hsa-mir-1258, hsa-mir-1259, hsa-mir-1260, hsa-mir-1261, hsa-mir-1262, hsa-mir-1263, hsa-mir-1264, hsa-mir-1265, hsa-mir-1266, hsa-mir-1267, hsa-mir-1268, hsa-mir-1269, hsa-mir-1270, hsa-mir-1271, hsa-mir-1272, hsa-mir-1273, hsa-mir-1274a, hsa-mir-1274b, hsa-mir-1275, hsa-mir-1276, hsa-mir-1277, hsa-mir-1278, hsa-mir-1279, hsa-mir-1280, hsa-mir-1281, hsa-mir-1282, hsa-mir-1283-1, has-mir-1283-2, hsa-mir-1284, hsa-mir-1285-1, hsa-mir-1285-2, hsa-mir-1286, hsa-mir-1287, hsa-mir-1288, hsa-mir-1289-1, hsa-mir-1289-2, hsa-mir-1290, hsa-mir-1291, hsa-mir-1292, hsa-mir-1293, hsa-mir-1294, hsa-mir-1295, hsa-mir-1296, hsa-mir-1297, hsa-mir-1298, hsa-mir-1299, hsa-mir-1300, hsa-mir-1301, hsa-mir-1302-1, hsa-mir-1302-2, hsa-mir-1302-3, hsa-mir-1302-4, hsa-mir-1302-5, hsa-mir-1302-6, hsa-mir-1302-7, hsa-mir-1302-8, hsa-mir-1303, hsa-mir-1304, hsa-mir-1305, hsa-mir-1306, hsa-mir-1307, hsa-mir-1308, hsa-mir-1321, hsa-mir-1322, hsa-mir-1323, hsa-mir-1324, hsa-mir-1825, hsa-mir-1826, または、hsa-mir-1827。

同様に、ｍｉＲＮＡ−２０４ ｓｈＭＩＭＩＣは、ｍｉＲＮＡ−２０４から誘導されるｍｉＲＮＡスキャホールド構造をもつが、ｍｉＲＮＡ−２０４以外（ｍｉＲＮＡ−１９６ａ−２および前段落に記載した任意のｍｉＲ類を含む）の内在性ｍｉＲＮＡの成熟鎖から誘導される成熟鎖も有する。

ｓｈＭＩＭＩＣの成熟鎖配列は、内在性配列と同じでよい。または、特定のｍｉＲＮＡスキャホールド内の成熟鎖の機能活性を最適にするために、ｓｈＭＩＭＩＣの成熟鎖配列を内在性配列に関して修飾してもよい。例えば、ｍｉＲＮＡ−１９６ａ−２スキャホールドを用いて効率的に標的化を行うために、成熟鎖１位にはＵが好ましいことを本発明者は見出した。ｍｉＲＮＡ−１９６ａ−２スキャホールドに挿入する成熟鎖が、１位にＵ以外のヌクレオチドを有する場合、Ｕが第１位に存在するようにこの配列を変換することが好適である。理論や作用機構に拘らず、成熟鎖類は、２位から７位にかけて標的ｍｉＲＮＡを分離すると思われる。この理由から、ｓｈＭＩＭＩＣ内にある特定のｍｉＲＮＡの成熟鎖１位を変換しても、ｍｉＲＮＡの標的特異性が変わる可能性はない。

ｓｈＭＩＭＩＣのスター鎖は、ほとんどの部分で成熟鎖の逆相補鎖であるが、スキャホールドが誘導されるｍｉＲＮＡの内在性成熟鎖−スター鎖２本鎖構造を複製するように局所構造を変換することが好ましい。ｍｉＲＮＡ−１９６ａ−２ ｓｈＭＩＭＩＣ用のスター鎖の特徴には、図３に示し、以下に詳細を述べるように、次にあげる特徴が１つ以上含まれることが好ましい。
１．成熟鎖１位がＵであるとき（上で説明したように、好適であるが必須条件ではない）、スター鎖の相対する位置は、ゆらぎ塩基対となるようにＧが好適である。
２．成熟鎖５位がＧまたはＴ（Ｕ）の場合、スター鎖の相対する位置は、ゆらぎ塩基対となるようにＴ（Ｕ）またはＧにそれぞれ変換することが好適である。
３．成熟鎖が５位にＧまたはＴ以外の塩基をもつ場合、スター鎖の相対する位置は、標準的なワトソン−クリック塩基対をなすように設計することが好適である。
４．成熟鎖１２位とスター鎖の相対する位置との間には、ミスマッチが形成されることが好適である。ミスマッチ形成は、スター鎖の相対する位置が成熟鎖１２位と同じ塩基をもつことで達成される。
５．成熟鎖の長さが１８ヌクレオチド長またはそれ以上の場合、成熟鎖５位およびスター鎖の相対する位置に適用される条件と同じ条件が、成熟１８位およびスター鎖の相対する位置に同様に適用される。特に、成熟鎖１８位がＧまたはＴ（Ｕ）の場合、スター鎖の相対する位置は、ゆらぎ塩基対となるようにＴ（Ｕ）またはＧにそれぞれ変換される。成熟鎖が１８位にＧまたはＴ（Ｕ）以外の塩基をもつ場合は、スター鎖の相対する位置は、標準的なワトソン−クリック塩基対を形成するように設計する。
６．成熟鎖の長さが１９ヌクレオチド長またはそれ以上の場合、成熟鎖５位およびスター鎖の相対する位置に適用される条件と同じ条件が、成熟１９位およびスター鎖の相対する位置に、同様に適用される。特に、成熟鎖１９位がＧまたはＴ（Ｕ）の場合、スター鎖の相対する位置は、ゆらぎ塩基対となるようにＴ（Ｕ）またはＧにそれぞれ変換される。成熟鎖が１９位にＧまたはＴ（Ｕ）以外の塩基をもつ場合は、スター鎖は、標準的なワトソン−クリック塩基対を形成するように設計する。
７．成熟鎖の長さが２１ヌクレオチド長またはそれ以上の場合、成熟鎖５位およびスター鎖の相対する位置に適用される条件と同じ条件が、成熟２１位およびスター鎖の相対する位置に、同様に適用される。特に、成熟鎖２１位がＧまたはＴ（Ｕ）の場合、スター鎖の相対する位置は、ゆらぎ塩基対となるようにＴ（Ｕ）またはＧにそれぞれ変換される。成熟鎖が２１位にＧまたはＴ（Ｕ）以外の塩基をもつ場合は、スター鎖は、標準的なワトソン−クリック塩基対を形成するように設計する。

本発明のｓｈＭＩＭＩＣ類は、異なる成熟鎖の発現および活性レベルを標準化するのにとくに有用である。もし複数のｓｈＭＩＭＩＣ類が全て同じスキャホールド配列を共有し、成熟鎖（およびスター鎖）配列だけが異なる場合、各ｓｈＭＩＭＩＣはＤｉｃｅｒおよびＲＩＳＣによって同程度に発現および処理されると考えられる。従って、細胞内で異なる内在性成熟鎖を発現する効果を、並べて比較することができる。もし各成熟鎖に相当する内在性ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ類を細胞内で発現した場合、各ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡはＤｉｃｅｒおよびＲＩＳＣによって程度が異なって処理されるので、このような比較は困難であろう。さらに、スター鎖は、内在性ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡそれぞれに対して機能性レベルを変化させる。もし内在性スキャホールド内にある成熟鎖の機能を観察する場合、スター鎖と成熟鎖を区別することは不可能である。非内在性スキャホールド（例えば、ｓｈＭＩＭＩＣ）からｍｉＲＮＡを発現する場合、前記スキャホールドの２次構造を維持するために、スター鎖を修飾するが、それにより、スター鎖配列は内在性スター鎖配列と同じではなくなる。従って、観察される機能は成熟鎖に関するものだけであり、ｓｈＭＩＭＩＣのスター鎖の機能は含まれない。

＜成熟鎖を合理的に選択する実施形態＞
また、別の一連の実施形態では、本発明のｍｉＲＮＡスキャホールド類に挿入する成熟鎖配列類を合理的に設計する。ｍｉＲＮＡの設計は、標的とする遺伝子内にある好ましい標的サイトを同定すること、および発現した分子内で構造要素が保持されるように選択した配列の周囲にあるスキャホールドを最適化することの２工程よりなる。標的サイトの同定は、いくつかの方法で行うことができる。一実施形態によれば、本発明は、１）スキャホールド中に埋め込んだ標的配列の機能にとって重要な特徴、および／または２）その機能にとって有害である特徴、を同定する方法を提供する。この方法は、（ａ）遺伝子を標的にするランダムに選択した配列セット（例えば、標的ＲＮＡに少なくとも部分的に相補的である成熟鎖配列類）を選択し、（ｂ）これらの配列類を選択したスキャホールド内に組み込み、（ｃ）スキャホールド内にある各配列の相対機能を測定し、（ｄ）少なくとも１つの変換が機能に及ぼす影響があるかないかを測定し、および（ｅ）工程（ｄ）で得られた情報を用いて機能性配列類を選択するアルゴリズムを開発する、工程よりなる。

配列類によって標的ノックダウン（工程（ｃ））の効率を測定する方法には、標的遺伝子ｍＲＮＡおよび／またはタンパクレベルを定量する方法が含まれる。ｍＲＮＡについては、ＰＣＲ法、ノーザンブロット法、および分岐ＤＮＡ法を含む標準的技術が適用できる。タンパク質の定量には、ＥＬＩＳＡ法、ウエスタンブロット法などの方法が配列類の機能評価に使用できる。好ましいタンパク質検出方法としては、各配列の機能測定に使用できる各標的配列用の短い標的配列類を含む、２重ルシフェラーゼリポーターベクターシステム（例えば、ｐｓｉＣｈｅｃｋ、Ｐｒｏｍｅｇａ）などのリポーターシステムがある。

機能性および非機能性配列類を並べて分析することにより、特定のヌクレオチド類、熱力学的性質、２次構造などが機能を促進する、または機能に否定的に影響を及ぼす位置または領域を同定できる。こうしたプラスおよびマイナス要素を重み付けして合わせることで、選択アルゴリズムを構築することができる。

一実施例では、本発明はｍｉＲ−１９６ａ−２スキャホールドに対する機能性標的サイトを同定する方法を提供する。この方法には、約１８−２３個の塩基対（これより長いまたは短い配列類も具体的に考慮されるが）を有する潜在的配列類に対して選択基準（機能性および非機能性配列類をバイオインフォマティック分析することで決定される）を適用することが含まれる。ここで、選択基準は標的特有の基準ではなく独立したものである。好適な選択基準には、１）特定の位置にあるヌクレオチド類、２）特定の位置における位置特異的な熱力学的特性、３）標的配列内の可能な２次構造を削除または組み込むこと、およびその他の要因に関連してプラスおよびマイナスに重み付けした要素が含まれる。こうした選択基準を１つ以上適用することにより、ｍｉＲ−１９６ａ−２スキャホールドに挿入する配列類を合理的に設計することが可能になる。

また、ある実施形態では、前記選択基準は式によって具体化される。例えば、高機能をもつ非天然存在型ｍｉＲ−１９６ａ−２遺伝子標的配列類の成熟鎖（１９ヌクレオチド長から、例えば、２５ヌクレオチド長の成熟鎖でよい）の１−１９番目までのヌクレオチドを決めるために、以下に示した式１を使用してよい。

式１：標的配列の逆相補鎖の１−１９番目までのヌクレオチドを表わす。

（式１）
ここで、「Ａ」はアデニンを表し、「Ｇ」はグアニンを表し、「Ｔ」はチミンを表し、および「Ｃ」はチトシンを表す。さたに、各塩基記号に付いている番号は（例えば、Ａ１）、標的配列の逆相補鎖におけるその塩基の位置を表す。このように、このアルゴリズムにおける逆相補鎖（ＲＣ）ヌクレオチド１は、標的ＲＮＡ内のヌクレオチド１９と相補的になる（図２参照）。また、ｍｉＲＮＡスキャホールドに挿入した成熟鎖ヌクレオチド１に対し、ヌクレオチド１９は標的ｍＲＮＡ塩基対またはゆらぎ塩基対を形成する。以下の表１に、整列させたヌクレオチド類の位置を示す。ここで、Ｍ_１−Ｍ_１９は成熟鎖のヌクレオチド１−ヌクレオチド１９であり、Ｒ_１−Ｒ_１９は標的ＲＮＡのヌクレオチド１−ヌクレオチド１９であり、ヌクレオチドＳ_１−Ｓ_１９はスター鎖のヌクレオチド１−ヌクレオチド１９である。
表１

機能性および非機能性配列類を詳細に検討することにより、非天然存在型ｍｉＲ−１９６ａ−２ｍｉＲＮＡ類の成熟鎖１位にはＵが好適であると同定した。従って、成熟鎖１位におけるＵは非常に好適である。このことを考慮すると、標的の逆相補鎖の１位の「Ａ」または「Ｇ」は、かなりマイナスに重み付けされる（−５００）。たとえ重み付けの程度が比較的小さくても、１位に「Ｃ」もまた選択される。その理由は、１位の［Ｃ］によって、成熟−標的２本鎖中にＧＵゆらぎ塩基対が形成されるようにできるからである。一方、標的のＲＣ１位における「Ｔ」は非常に好適である（＋４３．８）。ここで、「Ｕ」はＲＮＡ分子内にあるヌクレオチドを意味し、「Ｔ」はＲＮＡ分子のｃＤＮＡ内にあるヌクレオチドを意味する。

ここで、ｍｉＲ−１９６ａ−２に対して、２１ヌクレオチド内在性成熟鎖配列（３’末端がＧＧである）および２２ヌクレオチド内在性成熟鎖配列（３’末端がＧＧＧである）をともに支持する証拠がある。もし、非天然存在型ｍｉＲ−１９６ａ−２の成熟鎖が、３’端にヌクレオチド類を追加して１９ヌクレオチド長よりも長い場合、スター鎖もまた、スター鎖および成熟鎖が同じ長さになるように、５’端に追加ヌクレオチドを有する。例えば、もし成熟鎖が２１ヌクレオチド長である場合、スター鎖もまた上記配列にＳ_１５位の２塩基類を追加すると、２１ヌクレオチド長になる。式１のアルゴリズムを用いる実施形態および、成熟鎖が２１ヌクレオチド配列である実施形態では、成熟鎖（成熟鎖のヌクレオチド１はＵが好適である）の塩基２ないし塩基１９の塩基類は、式１のアルゴリズムによって決定され、塩基２０と塩基２１は、内在性ｍｉＲ−１９６ａ−２成熟鎖配列を複製するようにＧであってよいが、必ずしもＧでなくてもよい。もし、成熟鎖の塩基２０と塩基２１がＧＧである場合、スター鎖の相対する位置にある塩基を、内在性成熟鎖−スター鎖２本鎖内と同じくＣＣ、ＵＵ、ＵＣに、またはワトソン−クリックまたはゆらぎ塩基対を形成するＣＵにすることができる。あるいは、２０位及び２１位をＧＧにして、スター鎖内の相対する位置にあるヌクレオチドにミスマッチ（例えば、Ｇ−ＧミスマッチまたはＧ−Ａミスマッチ）させることができる。あるいは、２０位及び２１位を、標的ＲＮＡと塩基対を形成する配列類で構成することができる。この場合、相対するスター鎖にあるヌクレオチド類は、ワトソン−クリック塩基対、ゆらぎ塩基対、またはミスマッチを形成することが可能である。

上で述べたように、ｍｉＲ−１９６ａ−２に対して、２１ヌクレオチド内在性成熟鎖および２２ヌクレオチド内在性成熟鎖がともに存在することを支持する証拠がある。従って、同様に成熟鎖が２２ヌクレオチド長である場合、スター鎖も上記配列においてＳ１の５’位に３つの塩基類を追加すると２２ヌクレオチド長となる。式１のアルゴリズムを用い、成熟鎖が２２ヌクレオチド配列である実施形態の場合、成熟鎖の塩基２ないし塩基１９の塩基類は式１のアルゴリズムによって決定される。２０、２１および２２番目の塩基類は、好適にはヌクレオチド１がＵである内在性ｍｉＲ−１９６ａ−２成熟鎖を複製するためにＧであってもよいが、必ずＧである必要はない。前記成熟鎖の２０−２２番目の塩基類がＧＧＧである場合、スター鎖の相対する位置にある塩基類はワトソン−クリック塩基対またはゆらぎ塩基対を形成することができる。例えば、前記成熟鎖の２０−２２番目の塩基類がＧＧＧである場合、この配列に相対するスター鎖配列は、この位置で内在性成熟鎖―スター鎖２本鎖を複製するＣＵＣでよい。または、２０、２１、および２２位にはＧＧＧが可能であり、これらのヌクレオチド類はスター鎖中、相対する位置にあるヌクレオチド類と、例えば、Ｇ−ＧミスマッチまたはＧ−Ａミスマッチのように、ミスマッチすることが可能である。あるいは、２０−２２位は、標的ＲＮＡと塩基対を形成する配列類からなることが可能である。この場合、相対するスター鎖上にあるヌクレオチド類は、ワトソン−クリック塩基対、ゆらぎ塩基対、またはミスマッチを形成することができる。

式１は、標的ヌクレオチドの位置傾向をもつ逆相補配列を示す。このように、式１は、例えば、（１）標的ＲＮＡの逆相補配列を決定し、（２）この配列にアルゴリズムを適用して所望のスコア（例えば、最も高いスコア、または最も高い複数のスコアのうちの１スコア）をもつ１９ヌクレオチド部分配列を決定することに用いられる。こうして決定した配列類は、続いて、非天然存在型ｍｉＲＮＡ−１９６ａ−２類を生成するためにｍｉＲＮＡ−１９６ａ−２スキャホールド内に導入される。

式１は、各条件が標的配列のＲＣの塩基についてランク順を示すように、一連の条件によって表すことも可能である。
条件１：標的配列のＲＣの１位には、ＣよりもＴが好ましく、ＧおよびＡはともに好ましくない。
条件２：標的配列のＲＣの５位には、Ｇ、ＣおよびＡの各々よりもＴが好ましい。
条件３：標的配列のＲＣの６位には、ＧおよびＣの各々よりもＡが好ましく、さらに、ＴよりＧおよびＣの各々が好ましい。
条件４：標的配列のＲＣの７位には、ＣおよびＴの各々よりもＡが好ましく、さらに、ＧよりＣおよびＴの各々が好ましい。
条件５：標的配列のＲＣの８位には、ＡおよびＧの各々よりもＴが好ましく、さらに、ＣよりＡおよびＧの各々が好ましい。
条件６：標的配列のＲＣの１２位には、ＡおよびＣの各々よりもＴが好ましく、さらに、ＧよりＡおよびＣの各々が好ましい。
条件７：標的配列のＲＣの１３位には、ＡおよびＧの各々よりもＴが好ましく、さらに、ＣよりＡおよびＧの各々が好ましい。
条件８：標的配列のＲＣの１５位には、ＡおよびＣの各々よりもＴが好ましく、さらに、ＧよりＡおよびＣの各々が好ましい。
条件９：標的配列のＲＣの１６位には、ＧよりＡ、Ｃ、およびＴの各々が好ましい。
条件１０：標的配列のＲＣの１７位には、ＧよりＡ、Ｃ、およびＴの各々が好ましい。
条件１１：標的配列のＲＣの１８位には、ＡおよびＣの各々よりもＴが好ましく、さらに、ＧよりＡおよびＣの各々が好ましい。
条件１２：標的配列のＲＣの１９位には、ＴよりもＣが好ましく、ＡよりもＴが好ましく、さらに、ＧよりもＡが好ましい。

また、ある実施形態では、前記条件の１以上の条件または全ての条件が、成熟鎖配列類を決定するために適用される。例えば、前記条件は、（１）標的ＲＮＡの逆相補配列を決定し、（２）１９ヌクレオチド部分配列（類）を決定するために前記条件から１つ以上の条件を適用することに用いられる。こうして決定した配列類は、続いて、非天然存在型ｍｉＲＮＡ−１９６ａ−２ ｍｉＲＮＡ類を生成するためにｍｉＲＮＡ−１９６ａ−２ ｍｉＲＮＡスキャホールド内に導入される。好適な実施形態としては、成熟鎖１位はＴ／Ｕである。

また、標的ＲＮＡヌクレオチドの傾向（表１のＲ_１−Ｒ_１９参照）を直接示すように、式１を同じ意味で表すことも可能であることを、当業者は理解しよう。 このことは、式１の各ヌクレオチドの傾向を標的ＲＮＡ（表１参照）の相対する相補ヌクレオチドで置き換えることによって、実施される。所望の標的ＲＮＡ配列が決まり次第、その逆相補配列（好適には、１位がＴ／Ｕ）を、成熟鎖を形成するｍｉＲＮＡ−１９６ａ−２ ｍｉＲＮＡスキャホールド内に導入する。従って、元々の式１が、Ｍ_２が「Ｇ」であることを示したとすれば、それを発展させた式ではＲ_１８が「Ｃ」であることを示す。

同様にして、式１が標的サイトを記述するために用いられる場合、各条件が標的ＲＮＡの塩基（例えば、表のＲ_１−Ｒ_１９塩基類参照）についてランク順位を表すように、一連の条件として示すことも可能である。
条件１：Ｒ_１では、ＡよりもＧが好ましく、ＵよりもＡが好ましく、ＣよりもＵが好ましい。
条件２：Ｒ_２では、ＵおよびＧの各々よりもＡが好ましく、ＣよりＵおよびＧの各々が好ましい。
条件３：Ｒ_３にでは、ＣよりＵ、ＧおよびＡの各々が好ましい。
条件４：Ｒ_４では、ＣよりＵ、ＧおよびＡの各々が好ましい。
条件５：Ｒ_５では、ＵおよびＧの各々よりＡが好ましく、さらに、ＣよりＵおよびＧの各々が好ましい。
条件６：Ｒ_７では、ＵおよびＣの各々よりＡが好ましく、さらに、ＧよりＵおよびＣの各々が好ましい。
条件７：Ｒ_８では、ＵおよびＧの各々よりＡが好ましく、さらに、ＣよりＵおよびＧの各々が好ましい。
条件８：Ｒ_１２はで、ＵおよびＣの各々よりＡが好ましく、さらに、ＧよりＵおよびＣの各々が好ましい。
条件９：Ｒ_１３では、ＧおよびＡの各々よりＵが好ましく、さらに、ＣよりＧおよびＡの各々が好ましい。
条件１０：Ｒ_１４では、ＣおよびＧの各々よりＵが好ましく、さらに、ＡよりＣおよびＧの各々が好ましい。
条件１１：Ｒ_１５では、Ｃ、ＧおよびＵの各々よりＡが好ましい。
条件１２：Ｒ_１９では、ＧよりもＡが好ましく、ＣおよびＵの各々は好ましくない。

前記条件の１つ以上の条件または全ての条件が、所望の標的ＲＮＡ配列を決定するために適用してよい。例えば、前記条件の１つ以上の条件は、１９ヌクレオチド部分配列（類）を決定するために所望の標的ＲＮＡ配列に適用される。こうして決定した部分配列（好適には１位にＴを有する）の逆相補配列は、続いて、非天然存在型ｍｉＲＮＡ−１９６ａ−２ ｍｉＲＮＡを生成するために、成熟鎖としてｍｉＲＮＡ−１９６ａ−２ ｍｉＲＮＡスキャホールド内に導入する。好適な実施形態としては、Ｒ_１９がＡとなるように条件１２を選ぶ。

また、別の実施形態では、本発明は、高機能性非天然存在型ｍｉＲＮＡ−１９６ａ−２ ｍｉＲＮＡの成熟鎖（２１−２５ヌクレオチド成熟鎖であってよい）の１−２１番目の塩基類（５’から３’方向に付番される）を決定するために別のアルゴリズムを提供する。下記の式２参照。
式２： 標的配列の逆相補配列の１−２１ヌクレオチド類に関する。

（式２）
ここで、「Ａ」はアデニンを表し、「Ｇ」はグアニンを表し、「Ｔ」はチミンを表し、「Ｃ」はシトシンを表す。また、各塩基の記号に付く数字は（例えば、Ａ１）標的ｍＲＮＡの逆相補配列中の塩基の位置を表す。このように、前記アルゴリズムによる逆相補ヌクレオチド１は、標的ｍＲＮＡのヌクレオチド２１の相補配列である（図２参照）。下記の表２に、配列したヌクレオチドの位置を示す。ここで、Ｍ_１−Ｍ_２１は、成熟鎖の１−２１番目のヌクレオチド類であり、Ｒ_１−Ｒ_２１は標的ＲＮＡの１−２１番目のヌクレオチド類であり、ヌクレオチド類Ｓ_１−Ｓ_２１はスター鎖の１−２１番目のヌクレオチド類である。
表２

また、成熟鎖が２１ヌクレオチド長よりも長い場合（例えば、２２または２３ヌクレオチド長）、スター鎖もまた、スター鎖および成熟鎖が同じ長さになるように、５’端に追加ヌクレオチドを有する。例えば、成熟鎖が２２ヌクレオチド長（内在性ｍｉＲ−１９６ａ−２成熟鎖の長さである）である場合、スター鎖もまた上記配列にＳ_１５位の追加２塩基を加えて、２２ヌクレオチド長になる。式２のアルゴリズムが用いられる実施形態および、成熟鎖が２２ヌクレオチド配列である実施形態では、成熟鎖（成熟鎖のヌクレオチド１はＵが好適である）の２−２１番目の塩基類は、式２のアルゴリズムによって決定され、２２番目の塩基は、ｍｉＲ−１９６ａ−２の内在性２２ヌクレオチド成熟鎖中の同じヌクレオチドである、例えば、Ｇであってよい。もし、成熟鎖の２２番目の塩基がＧである場合、スター鎖の相対する位置にある塩基を、内在性ｍｉＲ−１９６ａ−２にある塩基と同じＣに、または、ワトソン−クリック塩基対またはゆらぎ塩基対を形成するようにＵとすることができる。あるいは、２２位をＧにして、スター鎖内の相対する位置にあるヌクレオチドにミスマッチ（例えば、Ｇ−ＧミスマッチまたはＧ−Ａミスマッチ）させることができる。あるいは、２２位を、標的ＲＮＡと塩基対を形成するヌクレオチドにすることができる。この場合、相対するスター鎖にあるヌクレオチドは、ワトソン−クリック塩基対、ゆらぎ塩基対、またはミスマッチを形成することが可能である。

式１と同様に、式２は、標的配列ヌクレオチドの位置傾向を有する逆相補配列を示す。このように、式２は、例えば、（１）標的ＲＮＡの逆相補配列を決定し、（２）この配列にアルゴリズムを適用して所望のスコア（例えば、最も高いスコア、または最も高い複数のスコアのうちの１スコア）をもつ２１ヌクレオチド部分配列を決定することに用いられる。こうして決定した配列類は、続いて、非天然存在型ｍｉＲＮＡ−１９６ａ−２類を生成するためにｍｉＲＮＡ−１９６ａ−２スキャホールド内に導入される。

各条件が標的配列の逆相補配列の塩基についてランク順を示すように、式２を一連の条件によって表すことも可能である。
条件１：標的配列の逆相補配列１位は、Ｔ＞Ｃであり、ＡおよびＧの各々は好ましくない。
条件２：標的配列の逆相補配列３位は、Ａ，Ｔ，Ｇ＞Ｃ。
条件３：標的配列の逆相補配列５位は、Ｔ＞Ｇ＞Ａ＞Ｃ。
条件４：標的配列の逆相補配列６位は、Ａ＞Ｇ，Ｃ，Ｔ。
条件５：標的配列の逆相補配列７位は、Ｔ＞Ａ＞Ｃ＞Ｇ。
条件６：標的配列の逆相補配列８位は、Ｔ＞Ａ，Ｇ＞Ｃ。
条件７：標的配列の逆相補配列１２位は、Ｔ＞Ａ，Ｃ＞Ｇ。
条件８：標的配列の逆相補配列１３位は、Ｔ＞Ａ，Ｇ＞Ｃ。
条件９：標的配列の逆相補配列１４位は、Ａ，Ｇ，Ｔ＞Ｃ。
条件１０：標的配列の逆相補配列１５位は、Ｔ＞Ａ，Ｃ＞Ｇ。
条件１１：標的配列の逆相補配列１６位は、Ａ，Ｔ＞Ｇ＞Ｃ。
条件１２：標的配列の逆相補配列１７位は、Ｔ＞，Ｃ＞Ｇ。
条件１３：標的配列の逆相補配列１８位は、Ｔ＞Ａ，Ｃ＞Ｇ。
条件１４：標的配列の逆相補配列１９位は、Ｃ＞Ｔ＞Ａ＞Ｇ。
条件１５：標的配列の逆相補配列２０位は、Ａ，Ｇ，Ｔ＞Ｃ。
条件１６：標的配列の逆相補配列２１位は、Ｔ＞Ａ，Ｇ，Ｃ。
ここで、＞は他の塩基よりある塩基が好ましいことを示す。例えば、Ｗ＞Ｘ、Ｙ＞ＺはＸおよびＹの各よりもＷが好ましく、ＺよりもＸおよびＹの各々が好ましいことを示す。ある実施形態では、前記条件の１つ以上の条件または全ての条件が、成熟鎖配列類を決定するために適用される。例えば、前記条件は、（１）標的ＲＮＡの逆相補配列を決定し、（２）２１ヌクレオチド部分配列（類）を決定するために前記条件から１つ以上の条件を適用することに用いられる。こうして決定した配列類は、続いて、非天然存在型ｍｉＲＮＡ−１９６ａ−２ ｍｉＲＮＡ類を生成するためにｍｉＲＮＡ−１９６ａ−２ ｍｉＲＮＡスキャホールド内に導入される。好適な実施形態としては、成熟鎖１位は「Ｔ」である。

また、式１と同様に、標的ＲＮＡヌクレオチドの傾向（表２のＲ_１−Ｒ_２１参照）を直接示すように、式１を同じ意味で表すことも可能である。 このことは、式２の各ヌクレオチドの傾向を標的ＲＮＡ（表２参照）の相対する相補ヌクレオチドで置き換えることによって、実施される。

同様にして、各条件が標的ＲＮＡの塩基（例えば、表２のＲ_１−Ｒ_２１塩基類参照）についてランク順位を表すように、式２を一連の条件として示すことも可能である。
条件１：Ｒ_１では、Ｕ、Ｃ、およびＧの各々よりもＡが好ましい。
条件２：Ｒ_２では、ＧよりもＵ、ＣおよびＡの各々が好ましい。
条件３：Ｒ_３では、ＡよりもＣが好ましく、ＵよりもＡが好ましく、ＣよりもＵが好ま しい。
条件４：Ｒ_４では、ＵおよびＧの各々よりもＡが好ましく、さらに、ＣよりもＵおよびＧの各々が好ましい。
条件５：Ｒ_５では、ＵおよびＧの各々よりもＡが好ましく、さらに、ＣよりもＵおよびＧの各々が好ましい。
条件６：Ｒ_６では、ＣよりもＵおよびＡの各々が好ましく、さらに、ＧよりもＣが好ましい。
条件７：Ｒ_７では、ＵおよびＧの各々よりもＡが好ましく、さらに、ＣよりもＵおよびＧの各々が好ましい。
条件８：Ｒ_８では、ＧよりもＵ、ＣおよびＡの各々が好ましい。
条件９：Ｒ_９では、ＵおよびＣの各々よりもＡが好ましく、さらに、ＧよりもＵおよびＣの各々が好ましい。
条件１０：Ｒ_１０では、ＵおよびＧの各々よりもＡが好ましく、さらに、ＣよりもＵおよびＧの各々が好ましい。
条件１１：Ｒ_１４では、ＵおよびＣの各々よりもＡが好ましく、さらに、ＧよりもＵおよびＣの各々が好ましい。
条件１２：Ｒ_１５では、ＵよりもＡが好ましく、ＧよりもＵが好ましく、ＣよりもＧが好ましい。
条件１３：Ｒ_１６では、Ｃ、Ｇ、およびＡの各々よりもＵが好ましい。
条件１４：Ｒ_１７では、ＣよりもＡが好ましく、ＵよりもＣが好ましく、ＧよりもＵが好ましい。
条件１５：Ｒ_１９では、ＧよりもＵ、ＡおよびＣの各々が好ましい。
条件１６：Ｒ_２１では、ＧよりもＡが好ましく、ＵおよびＣの各々は好ましくない。

前記条件の１つ以上の条件または全ての条件を、所望の標的ＲＮＡ配列を決定するために適用してよい。例えば、前記条件の１つ以上の条件を、ヌクレオチド部分配列（類）を決定するために所望の標的ＲＮＡ配列に適用することにより、前記条件は用いられる。こうして決定した部分配列（好適には１位にＴ／Ｕを有する）の逆相補配列は、続いて、非天然存在型ｍｉＲＮＡ−１９６ａ−２ ｍｉＲＮＡを生成するために、成熟鎖としてｍｉＲＮＡ−１９６ａ−２ ｍｉＲＮＡスキャホールド内に導入される。好適な実施形態としては、成熟鎖の１位は「Ｔ／Ｕ」である。

位置特異的要因、特に、全体のＧＣ含有量、シード領域内のＧＣ含有量、およびテトラヌクレオチドの存在に焦点をあてた追加の重み付け要素類を、式１、式２、またはその誘導体の機能性をさらに促進するために加えることも可能である。例えば、成熟鎖中の以下に述べるどの要素もそれら要素類に含まれる。
ａ．−３^＊（＃ＧＣ）
ｂ．少なくとも「ＡＡＡＡ」が１個ある場合は−１００
ｃ．少なくとも「ＴＴＴＴ」が１個ある場合は−１００
ｄ．少なくとも「ＧＧＧＧ」が１個ある場合は−１００
ｅ．少なくとも「ＣＣＣＣ」が１個ある場合は−１００
ｆ．２−８位中＞ＧＣの場合は−１００
ｇ．＞１０ＧＣの場合は−１００
ここで、「＃ＧＣの＃」は標的の逆相補配列中の（または、式１または式２が標的ＲＮＡの傾向として表わされる場合には標的ＲＮＡ中の）ＧおよびＣヌクレオチド類の数を表す。
「ＡＡＡＡ」は標的の逆相補配列中の全てのＡを含有するテトラヌクレオチドを表す。ここで、式１または式２が標的ＲＮＡの傾向として表わされる場合には標的ＲＮＡ中の「ＵＵＵＵ」と同じ意味を表す。
「ＴＴＴＴ」は標的の逆相補配列中の全てのＴを含有するテトラヌクレオチドを表す。ここで、式１または式２が標的ＲＮＡの傾向として表わされる場合には標的ＲＮＡ中の「ＡＡＡＡ」と同じ意味を表す。
「ＧＧＧＧ」は標的の逆相補配列中の全てのＴを含有するテトラヌクレオチドを表す。ここで、式１または式２が標的ＲＮＡの傾向として表わされる場合には標的ＲＮＡ中の「ＣＣＣＣ」と同じ意味を表す。
「ＣＣＣＣ」は標的の逆相補配列中の全てのＴを含有するテトラヌクレオチドを表す。ここで、式１または式２が標的ＲＮＡの傾向として表わされる場合には標的ＲＮＡ中の「ＧＧＧＧ」と同じ意味を表す。
「２−８位中＞４ＧＣ」は、成熟鎖（例えば、シード領域））の２位―８位にある５個以上のＧおよび／またはＣヌクレオチドを表す。ここで、式２が標的ＲＮＡの傾向として表わされる場合にはＲ_１４−Ｒ_２０位にある、または、式１が標的ＲＮＡの傾向として表わされる場合にはＲ_１２−Ｒ_１８位にある、５個以上のＧ、ＣまたはＧおよびＣヌクレオチドと同じ意味を表す。
「＞１０ＧＣ」は、標的配列の逆相補配列中にある１１個以上のＧ、ＣまたはＧおよびＣヌクレオチドを表す。ここで、式１または式２が標的ＲＮＡの傾向として表わされる場合には標的ＲＮＡ中にある１１個以上のＧ、ＣまたはＧおよびＣヌクレオチドと同じ意味を表す。

同様にして、式１および式２が上で述べたように一連の条件として表わされる場合、追加される重み付け要素を別の追加条件として表わしてもよい。例えば、式１および式２が一連の条件として表わされる場合、追加される重み付け要素を以下の条件として表わしてもよい。ここで、条件の１つ以上のまたは全ての条件は所望の配列類を選択するために用いてもよい。
Ａ） 標的配列の逆相補配列は、ＡＡＡA、ＵＵＵＵ、ＧＧＧＧ、およびＣＣＣＣ
からなる群より選ばれるテトラヌクレオチド配列を含まない。または、同じ意味で、標的ＲＮＡ配列は、ＡＡＡA、ＵＵＵＵ、ＧＧＧＧ、またはＣＣＣＣを含まない。
Ｂ） 標的配列の逆相補配列は、全体で１０個以下のＧ＋Ｃ含有量をもつ。または、同じ意味で、標的ＲＮＡ配列類は、全体で１１個以上のＧ＋Ｃ含有量をもたない。
Ｃ） 成熟鎖は、シード領域に４個以下のＧ＋Ｃ含有量をもつ。または、同じ意味で、前記成熟鎖のシード領域に相対する標的ＲＮＡ配列の塩基類は、４個以下のＧ＋Ｃ含有量をもつ。

ここで、成熟鎖を記載する場合、標的ＲＮＡ配列を記載するためにヌクレオチドＵを用いることが可能である。または、前記ＲＮＡのｃＤＮＡを記載するために、ヌクレオチドＴを用いることが可能である。

また、（例えば、ヘアピン構造などの２次構造をもつことができる標的配列を除外することに焦点をあてた追加の重み付け要素を、選択アルゴリズムに加えることも可能である。

また、配列類を選択する方法はどれも、細胞ストレスをもつモチーフを含有する配列類を選択する工程をさらに有することができる。このようなモチーフとしては、例えば、毒性モチーフ（米国特許出願第２００５／０２０３０４３号明細書（２００５年９月１５日）参照）が含まれる。上で述べたアルゴリズムは、標的の配列を入力すると自動的に最適化された標的配列を出力するコンピュータプログラムとともに使用してもよく、またはコンピュータプログラムを用いることなく使用してもよい。前記コンピュータプログラムは、例えば、局所端末またはパーソナルコンピュータから内部ネットワークまたはインターネットを通してアクセス可能である。

また、配列類を選択する方法はどれも、特定のシード領域（成熟鎖２−７位または２−８位）配列類をもつ標的配列類を選択する工程をさらに有することができる。限定的でない例としては、内在性に発現した１つ以上のマイクロＲＮＡ類のシード類の１つと完全一致するシード類をもつ標的配列類を除外することが可能である。また別の例では、中程度または高い頻度でシード相補配列が現れるシード類を除外することが可能である。米国特許出願第１１/７２４，３４６号明細書（２００７年３月１５日出願）に、中程度または高い頻度でシード相補配列が現れるシード類の重要性が記載される。

最適な成熟鎖配列類が得られると、上で述べたように、これらの配列類はｍｉＲ−１９６ａ−２スキャホールド類に導入される。スター鎖は、そのほとんどが成熟鎖の逆相補配列であるが、内在性ｍｉＲ−１９６ａ−２の内在性成熟鎖−スター鎖の構造を複製する局所構造をもつように変換部分をもつことが好ましい。例えば、スター鎖の特性は、図３に示し以下に詳しく記載する１つ以上の特性を有していてよい。
１．成熟鎖の１位がＵである場合（上記のように、これは好適ではあるが必須条件ではない）、スター鎖の相対する位置は、常にゆらぎ塩基対が形成されるようにＧが好ましい。
２．成熟鎖の５位がＧまたはＴ（Ｕ）である場合、スター鎖の相対する位置は、ゆらぎ塩基対が形成されるように、それぞれＴ（Ｕ）またはＧに変換されることが好ましい。
３．成熟鎖が５位にＧまたはＴ以外の基をもつ場合、スター鎖の相対する位置は、標準的ワトソン−クリック塩基対が形成されるように設計される。
４．成熟鎖の１２位とスター鎖の相対する位置との間に、ミスマッチが形成されることが好ましい。これは、スター鎖の相対する位置に、成熟鎖の１２位と同じ塩基をもつようにすることで達成できる。
５．成熟鎖が１８ヌクレオチド長またはそれよりも長い場合、成熟鎖の５位およびスター鎖の相対する位置に適用される条件と同じ条件が、成熟鎖の１８位およびスター鎖の相対する位置に対して同じように適用される。具体的には、成熟鎖の１８位がＧまたはＴ（Ｕ）である場合、ゆらぎ塩基対が形成されるように、スター鎖の相対する位置は、それぞれＴ（Ｕ）またはＧに変換される。成熟鎖が１８位にＧまたはＴ以外の基をもつ場合、スター鎖のこの位置に相対する位置は、標準的ワトソン−クリック塩基対が形成されるように設計される。
６．成熟鎖が１９ヌクレオチド長またはそれよりも長い場合、成熟鎖の５位およびスター鎖の相対する位置に適用される条件と同じ条件が、成熟鎖の１９位およびスター鎖の相対する位置に対して同じように適用される。具体的には、成熟鎖の１９位がＧまたはＴ（Ｕ）である場合、ゆらぎ塩基対が形成されるように、スター鎖の相対する位置は、それぞれＴ（Ｕ）またはＧに変換される。成熟鎖が１９位にＧまたはＴ（Ｕ）以外の基をもつ場合、スター鎖は、標準的ワトソン−クリック塩基対が形成されるように設計される。
７．成熟鎖が２１ヌクレオチド長またはそれよりも長い場合、成熟鎖の５位およびスター鎖の相対する位置に適用される条件と同じ条件が、成熟鎖の２１位およびスター鎖の相対する位置に対して同じように適用される。具体的には、成熟鎖の２１位がＧまたはＴ（Ｕ）である場合、ゆらぎ塩基対が形成されるように、スター鎖の相対する位置は、それぞれＴ（Ｕ）またはＧに変換される。成熟鎖が２１位にＧまたはＴ（Ｕ）以外の基をもつ場合、スター鎖は、標準的ワトソン−クリック塩基対が形成されるように設計される。

参照する熟成鎖の位置に相対するスター鎖の位置は、上記表１および表２に示される。例えば、ｍｉＲＮＡ−１９６ａ−２などのスキャホールドに挿入される標的配列の機能を高めるために、上記した追加条件の１つ以上の条件を式１または式２と組み合わせることができる。

ここで、多くの場合において、上記した工程が行われる順番は決定的なものではない。従って、例えば配列類をアルゴリズムによってスコア化し、その後、所望しない性質をもつシード類を除外するために高スコアの配列類をスクリーンすることができる。または、可能性のある配列類のリストを作成し、所望しない性質をもつシード類を除外するためにスクリーンし、続いて機能性標的配列を決めるために、残った配列類を前記アルゴリズムで評価することができる。

各々の式によって、様々な範囲にある可能性のある生のスコアを算出する。また、異なる式から算出されるスコアを、さらに比較可能で容易に評価できようにするために、数学的方法を用いて各々の式から求めた生スコアを標準化することが可能である。それぞれの式には、異なる標準化方程式が存在する。標準化方程式は、全てのまたはほとんど全ての設計配列類について０−１００の範囲でスコアを出すように選ぶことが好ましい。遺伝子サイレンシングを行うことを計画する場合、式によって算出された生スコアを比較することで、または、全ての式の間で、標準化したスコアを比較することで配列類を選択するべきである。

＜アルゴリズムを使用しないで標的ＲＮＡの標的配列を選択する実施形態＞
すぐ上で述べた実施形態では、例えば、特定のｍｉＲＮＡスキャホールドに特有の様々な条件に合う配列について標的ＲＮＡをスキャンするためのアルゴリズムを用いている。このアルゴリズムによって決定した配列に完全に逆相補的な成熟鎖は、続いて、スキャホールドに導入される。従って、このアルゴリズムは、特定のスキャホールド内にある最も機能的と思われる配列類を選択する。一方、別の実施形態では、このようなアルゴリズムを使用することなしに標的ＲＮＡ配列が選択される。このような実施形態では、選択した標的ＲＮＡ配列に完全逆相補的となる成熟鎖が設計される。続いて、この成熟鎖を非天然存在型ｍｉＲＮＡを形成するようにｍｉＲＮＡスキャホールドに挿入する。標的ＲＮＡ配列の完全逆相補配列となる成熟鎖の発現によって、標的ＲＮＡがＲＩＳＣで切断されると、理論または作用機構に限定されることなく思われる。

また、別の実施形態では、選択された標的ＲＮＡ配列に一部だけが逆相補的となる成熟鎖が設計される。続いて、この成熟鎖は非天然存在型ｍｉＲＮＡを形成するようにｍｉＲＮＡスキャホールドに挿入される。このような成熟鎖のシード領域（２位−７位）は、標的ＲＮＡ配列（類）の１つ以上の領域に完全に相補的であることが好ましいが、しかし、成熟鎖の残りの部分には、標的ＲＮＡ配列に相補的ではない１つ以上の塩基類が含まれることが好ましい。このような成熟鎖が標的ＲＮＡに発現された場合、切断よりもむしろ翻訳減衰が起きると、理論または作用機構に限定されることなく思われる。

以前の研究から、翻訳減衰の経路によって遺伝子発現を効果的に調整するために、成熟鎖のシード領域と標的ＲＮＡ（類）の領域（好ましくは、３’ＵＴＲ）とが相補的なことが望ましいことが示された。さらに考慮してもよい１つ以上の追加パラメータには、１）特定の短配列（６ヌクレオチドなど）が、好ましくは、約１０−５０ヌクレオチド離れて標的ＲＮＡの３’ＵＴＲ内で２回以上繰り返される標的ＲＮＡ配列類を選択することが含まれる。このことにより、標的ＲＮＡに２つ以上の相補性をもつシード領域（２位−７位）を有する成熟鎖配列を設計できる。例えば、１つの成熟鎖が１つの３‘’ＵＴＲの２つ以上の領域を標的にできる。さらに、２）ＲＮＡｉ媒介翻訳減衰（例えば、ＡＵに富む配列類）により遺伝子調節を促進するさらなるサイトと任意に結合する標的遺伝子内にある標的配列類を選択することを可能とし、３）成熟鎖の１位でＡＵ塩基対を形成し、成熟鎖の位ではワトソン−クリック塩基対を形成することができる標的遺伝子配列を選択することを可能とする。このような考慮または他の設計を考慮することで、翻訳減衰メカニズムにより遺伝子調節を大きく促進することができる。

＜非天然存在型ｍｉＲＮＡ類の発現および利用＞
本発明の非天然存在型ｍｉＲＮＡ類は、プラスミド、および外在的配列あるいはホストゲノムに挿入する配列を保持するウイルスベクターを含む様々なベクター構築系において発現することが可能である。ここで、前記非天然存在型ｍｉＲＮＡ類には、式１または式２によって成熟鎖が合理的に設計されるｍｉＲＮＡ、式１または式２を用いて成熟鎖が選択されないｍｉＲＮＡ、およびｓｈＭＩＭＩＣが含まれる。例えば、（Ａ）塩基２−塩基１９が式１により決められる、またはｍｉＲＮＡ−１９６ａ−２以外のｍｉＲ成熟鎖から誘導される、および、（Ｂ）塩基２０−塩基２１が各々、ｍｉＲＮＡ−１９６ａ−２の２１ヌクレオチド成熟鎖の内在性配列であるＧである、２１ヌクレオチド成熟鎖があるとする。この２１ヌクレオチド成熟鎖を、次の配列をもつベクターインサートを生成するように、２１ヌクレオチド スター鎖（ＴＣ−Ｓ_１−Ｓ_１９）と並べて、ｍｉＲＮＡ−１９６ａ−２スキャホールドに導入してもよい。
5' TGATCTGTGGCT +[ M ₁ -M ₁₉ -GG] + GATTGAGTTTTGAAC+ [TC-S ₁ -S ₁₉ ] +AGTTACATCAGTCGGTTTTCG 3 ' 。 SEQ ID NO：24
この配列の逆相補配列は、適当なベクターにアニールおよびクローニング可能で、所望の遺伝子を長期にサイレンシングさせるなど標的ＲＮＡの機能性を低下させるために発現させることができる。ここで、２１ヌクレオチドおよび２２ヌクレオチド内在性ｍｉＲＮＡ−１９６ａ−２熟成鎖の両方が存在することを支持する証拠がある。従って、上記配列は、細胞内で発現する場合、２１ヌクレオチド成熟鎖（Ｍ_１−Ｍ_１９−ＧＧ）および／または２１ヌクレオチド成熟鎖（Ｍ_１−Ｍ_１９−ＧＧＧ）を生成するように処理される。よって、上記配列において下線で示したＧは、ｍｉＲＮＡ−１９６ａ−２スキャホールドの一部であるか、または、成熟鎖の一部であってよい。

好適なウイルスベクターには、レンチウイルス（ＨＩＶ、ＦＩＶなど） ベクター、レトロウイルス ベクター、アデノウイルス ベクター、アデノ関連 ベクター、およびラビエス ベクターなどがあるがこれに限定されるものではない。これらのベクター全てにおいて、非天然存在型ｍｉＲＮＡは、非コードＲＮＡ類（ポリメラーゼＩＩＩプロモーターなど）として転写されるか、または、ポリメラーゼＩＩプロモーターにより転写されるメッセンジャーＲＮＡと結合することができる。
ある実施形態では、プロモーターは組織特異的なプロモーターである。また、別の実施形態では、プロモーターはｔｅｔプロモーターまたがＲｅｏｓｗｉｔｃｈ^ＴＭなどの調節可能なプロモーターである。プロモーター配列は、標的にするホストから誘導されるか、または、別の生物のゲノムから採取できる。従って、例えば、プロモーターはＣＭＶ、ＨＩＶ、ＦＩＶ、またはＲＳＶプロモーター配列（ＬＴＲ（Ｌｏｎｇ Ｔｅｒｍｉｎａｌ Ｒｅｐｅａｔ）プロモーターなど）などのウイルスプロモーターが可能である。非天然存在型ｍｉＲＮＡをコードする配列類を、ベクター系と関連する他の要素を考慮して様々な位置に置くことができる。例えば、非天然存在型ｍｉＲＮＡをコードする配列類を、ポリメラーゼＩＩプロモーターから発現され遺伝子の５’および／または３’ＵＴＲ、または、遺伝子の１つ以上のイントロンに挿入される遺伝子に関連させることができる。好適な実施形態では、非天然存在型ｍｉＲＮＡをコードする配列類は、蛍光レポーター（ＧＦＰ、ＹＦＰ、ＲＦＰ、およびＢＦＰなど）、酵素的レポ−ター（ルシフェラーゼなど）、または、薬物耐性マーカー（プロマイシンなど）、または、その発現が細胞の生理学的性質を著しくは変化させない他の遺伝子類を含む、マーカーおよび／または遺伝子と関連する。また、別の例では、非天然存在型ｍｉＲＮＡの発現を、ポリメラーゼＩＩプロモーターから非コード配列として転写された遺伝子の発現に関連させないようにすることが可能である。また、ある例では、前記調節により、組織特異的調節可能な発現系を生成するために、調節可能なプロモーター（例えば、Ｐ_ＴＥＴ）を組織特異的プロモーターと組み合わせるなど、上記複数の要素を組み入れることができる。

また、特定のベクター構築体に結合した非天然存在型ｍｉＲＮＡ類の数も変えることができる。ある実施形態では、１つの非天然存在型ｍｉＲＮＡは１つのベクターから発現する。また、別の実施形態では、２つ以上の非天然存在型ｍｉＲＮＡ類（プールなど）が１つの１つのベクターから発現する。２つ以上の非天然存在型ｍｉＲＮＡ類が発現する場合、これら非天然存在型ｍｉＲＮＡ類は互いに関連する必要はなく、単一の転写（例えば、同じ３’ＵＴＲにある２つの非天然存在型ｍｉＲＮＡ類）に結合させることができる。または、２つの別々の転写に結合させることができる（例えば、２つの非天然存在型ｍｉＲＮＡ類が、２つの関連しない転写と結合して発現することができる）。１つのベクターから複数の非天然存在型ｍｉＲＮＡ類が発現する場合、非天然存在型ｍｉＲＮＡ類は同じもの（例えば、非天然存在型ｍｉＲ−１９６ａ−２ ｍｉＲＮＡ類の２コピー）であるか、または、異なるものであることが可能である。異なるものである場合の例としては、非天然存在型ｍｉＲ−１９６ａ−２ ｍｉＲＮＡの１コピーと非天然存在型ｍｉＲ−２０４ ｍｉＲＮＡの１コピー、または、同じ成熟鎖だが異なるスキャホールドをもつ２つのｓｈＭＩＭＩＣＳ、または、ｓｈＭＩＭＩＣとランダムに選ばれた成熟鎖か合理的に設計された成熟鎖のどちらか１つをもつ非天然存在型ｍｉＲＮＡ、などが含まれる。さらに、非天然存在型 ｍｉＲＮＡ類は、１つの遺伝子産物を標的にする配列類のプールを効果的にもつ、単一の標的ＲＮＡを標的にできる。または、非天然存在型 ｍｉＲＮＡ類は複数の遺伝子を標的にすることが可能である（複数遺伝子標的）。プーリングおよび複数遺伝子標的の両者ともに、本発明の非天然存在型 ｍｉＲＮＡ類を用いて別の手段により達成することができる。具体的には、１つ以上の標的遺伝子を標的にする複数の非天然存在型 ｍｉＲＮＡ類を、複数のベクター類に挿入し、その後、組み合わせ（混合して）、所望の細胞内に、１）トランスフェクション、または、２）トランスデュースすることができる。

非天然存在型ｍｉＲＮＡ類をコードするベクター構築体類は、公知のまたは本発明の記載から当業者が本発明との関連で有用とするどの方法を用いて細胞に導入してもよい。これらの方法には、任意の方法によるトランスフェクション、例えば、ＤＥＡＥ−Ｄｅｘｔｒａｎ、リン酸カルシウム、カチオン性脂質／リポソーム、ミセル、圧力法、マイクロインジェクション、電気泳動、イムノポレーション、ウイルスベクターの使用、コスミド、バクレリオファージ、細胞融合、および特定のコンジュゲードまたはリガンドとの結合などを用いる方法があるが、これらに限定されるものではない。

非天然存在型ｍｉＲＮＡ類がウイルスを用いて細胞に輸送される場合、ベクター構築体はチトプラズムで保存できる。または、レンチウイルスなどのホストゲノムに統合されて発現できる。こうしたベクターは、先のウイルスをパッキングするのに必要な配列類を頻繁に含むが、しかし、伝染性粒子の生成を防ぐために「ヘルパー」プラスミドによってもたらされる機能を欠く。また、ウイルス系が用いられる場合、構築体を発現させるプロモーターを変えることによって、つまり、構築体の発現レベルを変えることによって、構築体の発現レベルを操作することができる。または、伝染の多様性（ＭＯＩ）を調節することで、効果的には、各々の細胞に置かれた発現カセットのコピーの数を変えることによって、発現レベルを変えることができる。

別の実施形態では、本発明は、少なくとも１つの非天然存在型ｍｉＲＮＡ類からなるキットを提供する。

また、別の実施形態では、本発明は、非天然存在型ｍｉＲＮＡ類をコードする少なくとも１つのベクター構築体からなるキットを提供する。

また、別の実施形態では、本発明は、少なくとも１つのｍｉＲＮＡスキャホールドからなるキットを提供する。前記ｍｉＲＮＡスキャホールドは、ｍｉＲＮＡスキャホールドに成熟鎖およびスター鎖配列をクローニングし、続いて得られた非天然存在型ｍｉＲＮＡ類を細胞内で発現させることで、ｓｈＭＩＭＩＣＳを含む複数の異なる非天然存在型ｍｉＲＮＡ類を生成させるために用いることができる。

本発明のｍｉＲＮＡスキャホールド類、非天然存在型ｍｉＲＮＡ類、および方法は、基礎研究に限定されない、医薬品の発見と開発、診断、および治療を含む様々な用途に用いてよい。それぞれの場合において、ｍｉＲＮＡスキャホールドに成熟鎖配列を導入することにより生成される非天然存在型ｍｉＲＮＡは、所望の遺伝子により生成したｍＲＮＡなどの標的ＲＮＡの機能性を低下させるために用いられる。また、研究を準備するにあたり、遺伝子産物が医薬品の発見または開発の標的であるかどうかを確認するために、本発明の構成物および方法を用いてもよい。

ＲＮＡｉ経路で機能するように、本発明の非天然存在型ｍｉＲＮＡ内に配置された成熟鎖配列類の機能は、特定の遺伝子によって生成したｍＲＮＡなどの標的ＲＮＡの配列に依存し、標的ＲＮＡが導入される種には依存しないので、本発明の構成物および方法は、広範囲の種にわたる標的遺伝子に用いてよい。このような種としては、ヒト、イヌ、ウマ、ネコ、ウシ、マウス、ハムスター、チンパンジー、およびゴリラなどの全ての哺乳類の種、および、他の種やバクテリア、ウイルス、昆虫、植物、虫類などの生物が含まれるが、これらに限定されるものではない。

また、本発明の構成物および方法は、広範囲の遺伝子類をサイレンシングするために用いることができる。このような遺伝子類には、ヒトゲノムの約４５，０００の遺伝子が含まれるが、これらに限定されるものではない。先に述べた生物のゲノム中にある全ての遺伝子類とともに、ヒトゲノム遺伝子類が、糖尿病、アルツハイマー、癌などの疾患に関わるケースに特に係る。

また、別の適用としては、特定のファミリーの遺伝子類（キナーゼなど）、特定の経路（細胞サイクルの調節など）に関わる遺伝子類、または完全なゲノム類（例えば、ヒト、ラット、マウス、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ，Ｄｒｏｓｏｐｈｉａゲノムなど）に向けられた、非天然存在型ｍｉＲＮＡ類を提供する。遺伝子類のＲＮＡ産物に少なくとも一部分が相補的な成熟鎖配列類を有する非天然存在型ｍｉＲＮＡ類を用いて、集めた遺伝子の各々をノックダウンすることで、遺伝子ファミリーの各メンバー、経路の各メンバー、または、ゲノムの各遺伝子が特定の生物学的機能に寄与する程度を、研究者は直ちに評価することが可能となる。

また、本発明の構成物および方法を、所定の病気または疾患の原因または要因と思われる所望の標的ＲＮＡの活性を弱めることにより、病気または疾患状態を一時的または長い期間、生物に誘発するのに必要であるＲＮＡ干渉法に適用してもよい。所望の標的ＲＮＡの活性を増強することで、所定の病気または疾患を悪化させることもあれば、病気または疾患を改善したり治癒させる場合もある。同様に、所望の標的核酸の活性を弱めることにより、実際には、所定の病気または疾患を悪化させることもあれば、病気または疾患を改善したり治癒させる場合もある。所望の標的ＲＮＡは、ゲノムまたはクロモソ−ムの核酸類、または、ウイルスの核酸類などのクロモソーム外の核酸類を有する。

また、本発明の構成物および方法を、予防薬および治療薬など、ＲＮＡ干渉法の応用に用いてもよいこのような応用としては、所望の特定の標的ＲＮＡを操作することで、調節可能な病気または疾患をもつと疑われる生物を、好適なスキャホールドを発現させる系に配置された標的配列類を服用することによって治療する。この治療結果は、特定の病気または疾患を、改善、緩和、予防、および／または、診断するものであってよい。標的配列類は、薬学的に許容されるキャリア、希釈剤、または輸送システム（例えば、ウイルス）を用いて薬学的に許容される方法で服用することが好ましい。

また、本発明の成熟非天然存在型ｍｉＲＮＡ類は、静脈、筋肉、皮膚、皮下、鼻、経口、直腸などを経由する輸送経路により、または点眼により、または所望の標的核酸がある臓器、組織または細胞などの有効な部位に薬剤を放出する装置を組織移植することによって、服用することが可能である。

また、本発明は、非天然存在型ｍｉＲＮＡによって標的にされる遺伝子が不適当に発現されることを特徴とする病気を治療する医薬品を製造することに、非天然存在型ｍｉＲＮＡを利用することを開示する。

本発明の好適な実施形態を、実施形態を変えるまたは別の実施形態を示しながら、図で説明し、詳細に述べる。本発明が示し、記載し、図示する内容により、形態や詳細における同じような変換を、本発明の精神および範囲から離れることなしに行われてもよく、本発明の範囲が、先行技術によって除かれる内容を別にすれば、請求項にのみ限定されるものであることが、当業者によって理解されるべきである。さらに、ここに記載されるような本発明が、ここに開示される特定の要素がなくとも、好適に実施されるものである。

本出願に引用される全ての引用文献は、ここに記載される内容に合致して本明細書中にその全体を引用するものである。

次に記載する実施例は、本発明を例示する目的にのみ用いられるものであり、本発明の範囲を限定する目的に用いるものではない。

次に記載する専門用語は、ｓｉＲＮＡサイレンシング機能を比較および報告するために用いた。例えば、「Ｆ」に続く数字は、最小ノックダウンの程度を示した。例えば、Ｆ５０は、少なくとも５０％ノックダウンであることを意味し、Ｆ８０は、少なくとも８０％ノックダウンであることを示す。本研究では、Ｆ５０ ＲＮＡ以下の全ての値は、非機能性であると見なした。

＜一般的技術＞
全体のゲノムＤＮＡ抽出：全ＨｅＬａゲノムＤＮＡはＤＮｅａｓｙ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ単離キットを用いて抽出した。ＤＮＡの全体の完全性は、エチジウムブロミドを用いて着色した０．８％アガロースゲルで確認した。

＜ゲノムＤＮＡから誘導されるｍｉＲＮＡ類のＰＣＲ増幅＞
ＰＣＲは、２重ルシフェラーゼ系での試験用に様々なｍｉＲＮＡを増幅するために使用した。Ｑｕｉａｇｅｎ Ｔａｇ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（カタログ番号２０１４４３）を用いた１０−１００ｎｇ ＨｅＬａゲノムＤＮＡおよび各プライマー１０μＭから、天然ｍｉＲＮＡ類を増幅した。ＰＣＲパラメーター：最初の変性を９４℃で４分間、９４℃で１５秒間、５０−６０℃で３０秒間、３０サイクルを７２℃で４５秒間、最終伸長を７２℃で２分間。以下の表３に増幅に用いた配列類を示した。

表３
ＳｐｅＩおよびＢｇＩＩＩは、プライマー配列に組み込んだ制限領域を表す。「Ｆｏｒ」＝順方向プライマー、「Ｒｅｖ」＝逆方向プライマー。全ての配列は５’→３’方向に生成した。

プライマーセットのうち２つのプライマー（ｍｉＲ３３８とｍｉＲ１３５ａ−２）でそれぞれのサイトの増殖ができなかった。残りのスキャホールド類については、ＰＣＲ産物は、ゲル精製、ＳｐｅＩ／ＢｇＩＩＩ（ＮＥＢ）で処理、人工イントロンを含むＧＦＰで高修飾したｐＣＭＶ−Ｔａｇ４のＭＣＳにクロ−ニングした。クローニングの成功をシークエンシングで確認した。このような方法を用いた結果、ＧＦＰのＡＴＧ開始サイトの人工イントロン下流内に、ｍｉＲＮＡ類が局所に限定して配置された。図４参照。

＜ｐｓｉ Ｃｈｅｃｋ ２重ルシフェラーゼ レポーター 構築体＞
自身のプロモーターおよびポリ（Ａ）追加サイトをもつ、ヒト化ホタルルシフェラーゼ遺伝子（ｈｌｕｃ）およびヒト化ウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子（ｈＲｌｕｃ）を有する、２重ルシフェラーゼプラスミド（ｐｓｉＣＨＥＣＫ^ＴＭ−２ベクター）はＰｒｏｍｅｇａ（カタログ番号Ｃ８０２１）から得た。逆相補標的配列類は、ｈＲｌｕｃ遺伝子３’ＵＴＲのクローニングサイトにあるＸｈｏｌ−ＮｏｔＩ制限領域の間に挿入した。挿入した配列類は、制限領域に即して挿入されるようにＯｐｅｒｏｎから並べられた。Ｄｕａｌ−Ｇｌｏ^ＴＭルシフェラーゼアッセイシステム（Ｐｒｏｇｍａ、カタログ番号Ｅ２９８０）を用い、手引書の手順を少し変えて、ホタルおよびウミシイタケルシフェラーゼ活性を測定した。細胞を分解するとき、５０μＬのホタルルシフェラーゼおよび５０μＬのウミシタケルシフェラーゼを加える前に培地を細胞からアスピレーションした。

細胞生育力は、ａｌａｍａｒＢｌｕｅ^Ｒアッセイ（ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ Ｉｎｔｌ，Ｉｎｃ）を用いて２重プレート上で測定した。コントロールおよび実験で処理した細胞の細胞生育力は、１５％以内であった。

ｍＲＮＡ定量測定が必要な実験については、１Ｘ分解混合物中細胞を分解し、分岐ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）アッセイ（ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ^Ｒスクリーニングキット、カタログ番号ＱＧ−０００−０５０、Ｐｒｏｍｅｇａ）によってｍＲＮＡ定量を行った。標的遺伝子類の分岐ＤＮＡプローブはＰａｎｏｍｉｃｓおよび社内で設計した。

ルシフェラーゼ、ａｌａｍａｒＢｌｕｅおよびｂＤＮＡアッセイは、業者推薦プログラムを用い、Ｗａｌｌａｃ Ｖｉｃｔｏｒ １４２０多重カウンター（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）により測定した。

＜細胞培養およびトランスフェクション＞
トランスフェクションを行う１日前、ＨｅＬａ細胞を、無抗体の１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を加えたＤｕｌｂｅｃｃｏ修飾Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ）中で、１ウエルあたり約１０，０００細胞の細胞密度で９６穴プレートにプレーティングした。トランスフェクション当日、適当な標的配列類を含むｐｓｉＣｈｅｃｋ２重ルシフェラーゼプラスミド、スキャホールド構築体を発現するコントロールおよび実験用プラスミド、標的配列を標的するｓｉＲＮＡ類（１００ｎＭ）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００などの脂質輸送試薬類の混合物を調製した。これら混合物を、当業者によく知られたトランスフェクション条件を用いて、細胞内に導入した。

＜実験設計およびデータ分析＞
実験は全てトリプリケートで行った。レセプタープラスミドに対する非特異的影響を評価するために、実験結果は全て標準化比（Ｒｌｕｃ／Ｆｌｕｃ）_標準化として表わした。この比は、ｍｉＲＮＡリポータープラスミド（Ｒｌｕｃ／Ｆｌｕｃ）_{ｍｉＲＮＡ}を、リポータープラスミドと共移入させた非標的配列ので割って算出した、ホタツルシフェラーゼ発現に対するウミシタケルシフェラーゼ発現の比である。このレポータープラスミドから得られた最大値は配列によって変化する。１周辺の値はｍｉＲＮＡ機能が低いことを示すが、一方、０に近い値は低ｍｉＲＮＡ機能が高いことを示す。データは３つのウエルの平均値として報告し、誤差バーは、標準化ファクターでスケール化された、実験から得た３つの比（Ｒｌｕｃ／Ｆｌｕｃ）_{コントロール}の標準偏差を示す。これらの比は標準的分布に従わないが、標準偏差値はデータの良い変化値を示すものと考える。

＜高性能ｍｉＲＮＡスキャホールド類の同定＞

高機能性ｍｉＲＮＡスキャホールド類を同定するために、１０個の異なるｍｉＲＮＡをゲノムＤＮＡ（ｍｉＲ−１２６、２０４、１９６ａ−２、−３０ｃ−１、−２６ｂ、−３０ａ、−３７４、−１９６ａ−１、−５２６、および−４８６を含む）からＰＣＲ増幅し、ＧＦＰの人工イントロンのＳｐｅＩ／ＢｇＩＩＩサイトにクロ−ニングした（図４Ａ−図Ｅ参照）。並行して、ｈＲｌｕｃの３’ＵＴＲにある標的サイト（逆相補的）を含む２重ルシフェラーゼリポーターを構築した（図４Ｆおよび表４参照）。人口ｍｉＲＮＡ発現ベクトルおよび２重ルシフェラーゼレポーターベクターをコードするプラスミドは、標準的な鎖方向トランスフェクション技術によるＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， ０．２μｌ／ウエル）を用いて、ＨｅＬａ細胞（９６穴プレートの１ウエル中１０Ｋ細胞）中に共移入した。さらに４８時間後、ルシフェラーゼレポーターのノックダウンレベルを測定するために評価した。

図５に本研究結果を示すが、いくつかのｍｉＲＮＡスキャホールドは他のスキャホールドよりも機能性か高いことを示す。構築体の半数は、レポーター構築体を有意にサイレンスすることができないため、その後の研究から除外した。ｍｉＲ−３０ａ、−３７４、−１９６ａ１、−５２６、および−４８６は、全て８０％以下のレポーター構築体サイレンシングであった。また、ｍｉＲ−１２６の研究から、５’および３’鎖としてそれぞれ示される成熟鎖およびスター鎖の両者、およびヘパリンが機能性であることを見出した。成熟鎖およびスター鎖の両者が活性をもつことは、ある応用には好適かもしれないが、しかし、この構築体の実験はその後行わなかった。残りの３つのｍｉＲスキャホールド（−２０４、−２６ｂ、および−１９６ａ）は、２重ルシフェラーゼ構築体を８０％以上サイレンシングし、高機能性であると同定された。興味深いことに、ｍｉＲ−１９６ａ−２と同じ成熟鎖をもつｍｉＲ−１９６ａ−１が、最も最適化されていないスキャホールドであることが同定された。このことは、成熟ｍｉＲ配列を囲む配列がＤｒｏｓｈａ／Ｄｉｃｅｒプロセスで重要な役割を果たし、こうした効果がｍｉＲＮＡに大きな影響を与えているかもしれないことを示唆している。

＜外部配列クロ−ニングを可能にするｍｉＲＮＡスキャホールド配列類の修飾＞
配列類を輸送および標的化するｍｉＲＮＡスキャホールドの重要な特性は、スキャホールド内にクロ−ン配列を導入して機能性を保持する能力である。このことを実現するために、標準的な分子生物学的技術を用い、構築体の中に制限領域を組み込むために、実施例１で同定した３つの高機能性スキャホールド（ｍｉＲ−２６ｂ、１９６ａ２、および−２０４）を修飾した。その後、この修飾が成熟鎖の活性またはスター鎖活性を変化させたかどうかを測定するために、成熟標的鎖に逆相補的な配列を含む２重ルシフェラーゼレポーターを用いて、各構築体を試験した。また、ｍｉＲ−２６ｂおよびｍｉＲ−２０４について、ＢｌｐＩおよびＳａｃＩ制限領域を構築体に導入するために、ヌクレオチド修飾を行った（図６ａ、図６ｂ上部参照）。ｍｉＲ−１９６ａ−２については、天然ＢｌｐＩ領域が既に構築体内にあるので、第２制限領域（ＳａｃＩ、ＳｃａＬ、およびＸｂａＩ）を合わせて試験した（図６ｃ上部および下部参照）。

ｍｉＲ−２６ｂについては、ＳａｃＩ領域の導入は、成熟鎖の機能性全体にほとんどまたは全く影響を与えなかった（図６（ａ）、下部参照、約８５−９０％機能性を示す）。また、追加したＢｌｐＩ領域の修飾（ＢｌｐＩ／ＳａｃＩ）は、機能性全体に少し影響を与え、成熟鎖によるサイレンシングを約８０％に減らした。また、ＢｌｐＩ／ＳａｃＩを組み合わせた修飾は、スター鎖活性をさらに制限した。以上の研究結果から、ｍｉＲ−２６ｂスキャホールドに外部配列類をクローニングするのに使用可能な、制限領域の相補的な１組（ＢｌｐＩ／ＳａｃＩ）を同定した。

ｍｉＲ−２０４については、ＳａｃＩまたはＳａｃＩ／ＢｌｐＩどちらの領域の導入も、成熟鎖活性に影響を与えなかった（図６ｂ、下部参照）。ｍｉＲ−２６ｂ構築体で見られたように、２つの制限領域に導入するスキャホールドの修飾は、スター鎖の機能性を抑制した（約６０％サイレンシング→約４０％サイレンシング）。従って、以上の研究結果から、２つの目的が達成された。第１に、ｍｉＲ−２０４ スキャホールドに外部配列類をクローニングするのに使用可能な、制限領域の相補的１組を同定した。第２に、ｍｉＲ−２０４スター鎖の機能性をさらに制限する修飾を見出した。

ｍｉＲ−１９６ａ−２スキャホールドに合う制限領域の組み合わせは、問題があることを見出した（図６ｃ参照）。図６ｄに示すように、ＳｃａＩ領域（または、ＳａｃＩとＳｃａＩ領域との組み合わせ）を加えた場合、成熟鎖活性を著しく低下させた。ＳｃａＩ＋およびＳｃａＩ＋／ＳａｃＩ＋の両構築体は、スター鎖活性を高めることを示した。スター鎖活性の促進は好ましくないので、この制限領域の組み合わせは行わないことにした。

幸い、ＳａｃＩ領域の導入だけが成熟鎖活性に影響をほとんど与えずに、さらにスター鎖の機能性を抑制した（図６ｄ、４０％サイレンシング→２０％サイレンシング）。そこで、ｍｉＲ−２０４の場合と同様に、２つの別々の目標が達成された。第１に、ｍｉＲ−１９６ａ−２スキャホールドに外部配列類をクローニングするのに使用可能な、制限領域の相補的１組を同定した。第２に、ｍｉＲ−１９６ａ−２スター鎖の機能性をさらに制限する修飾を見出した。

＜外部配列類を許容するｍｉＲＮＡスキャホールドの同定＞
３つの好適なｍｉＲＮＡスキャホールドの中で、どのスキャホールドが最も外部配列類を許容するのかを測定するために、本研究で「ウオーク」ＧＡＤＰＨ標的配列類を各スキャホールド内に埋め込み、ＧＦＰの人工イントロン内にクローニングした。ここで、ウオークは、２ｂｐだけシフトした各配列に５’末端をもち、長さが２１ｂｐである配列類より構成される（図７ａ参照）。３つのベクターすべての場合において、各内在性スキャホールド類に存在する天然の２位構造（例えば、ブルジやミスマッチ構造）を保持するように、挿入を設計した。また、単純なヘパリン構造などの２次構造をもたないｍｉＲ−１９６ａ−２スキャホールドに埋め込んだ各配列によって構成される第４のウオークを、機能性における２次構造の重要性を理解するために試験した。３つのスキャホールドから得られた結果を、細胞内に等価な合成ｓｉＲＮＡをトランスフェクションしたときに得られた結果と比較した。また、ｐｓｉＣｈｅｃｋ（２重ルシフェラーゼ）レポーターに埋め込んだＧＡＰＤＨ標的配列を、図７ｂに示す。

図７ｃは合成１９ｂｐ ｓｉＲＮＡとして細胞内に導入されたときのウオーク中の各配列の機能性を示す。先に見られたように、標的ｓｉＲＮＡの位置のわずかな変化が、機能性に非常に大きな影響を与えることができるこれと同じ配列類が、ｍｉＲ−２６ｂ、ｍｉＲ−２０４、およびｍｉＲ−１９６ａ−２に導入されて発現構築体として輸送されたとき、ｍｉＲ−２０４およびｍｉＲ−１９６ａ−２の２つのスキャホールドは、ｍｉＲ−２６ｂスキャホールドよりも高い機能性レベルを示す（図７ｄ，図７ｅ，図７ｆ参照）。興味深いことに、ｍｉＲ−１９６ａ−２構造に導入した配列類から２次構造を全て削除した場合、機能性が大きく抑制されることを見出した（図７ｇ参照）。並べて比較すると、ｍｉＲ−１９６ａ−２およびｍｉＲ−２０４スキャホールドはｍｉＲ−２６ｂスキャホールドよりもより多くの配列で機能性をもつことが示された（図７ｈ参照）。また、これらの発見から、外部配列を輸送するのに３つのスキャホールド全てが有用であることが示され（最も好適なものとしてはｍｉＲ−１９６ａ−２およびｍｉＲ−２０４スキャホールド）、２次構造を保持することは最適の機能性のために好ましいことが示された。

＜好適な標的配列類の分析＞
ｍｉＲ−１９６ａ−２ＧＡＰＤＨウオークからの高機能性（＞７０％）配列類を、位置特異的傾向を同定するために評価した。この評価を行ったとき、直ちに、成熟鎖１位の「Ｕ」（この位置をコードするＤＮＡでは「Ｔ」）が、外部遺伝子類を標的にする高機能性配列類に特徴的であることが明らかになった。この理由から、この条件が最適な機能性をもつのに好ましいと、先ず同定された。５位および６位には、ＴおよびＡがそれぞれ好適であった。７位には、この位置にＧをもつ配列類はほとんどなかった（図８ａ参照）。内在性ｍｉＲ−１９６ａ−２内でミスマッチする位置である１２位には、「Ａ」が少々、「Ｔ」がかなり存在した。１３位にも「Ｔ」が多くあることが機能性配列類で観察された。このように、特定のヌクレオトド類について位置特異的な傾向が同定された。

続いて、各２次構造の重要性を同定する研究をさらに行った。１位に見られたＧＵゆらぎ塩基対のミスマッチを置換すると、全体の機能性に有害であることが観察された。同様に、１２位に見られたミスマッチのサイズを１２位および１３位に伸ばすと、やはり有害であることを見出した。

機能性および非機能性配列類の分析から、機能性とＧＣ含有量との間に強い相関があることを見出した。ｍｉＲ−１９６ａ−２ＧＡＰＤＨウオークで試験した配列類から得られた、全体のＧＣ含有量と機能性との比較から、一般的に、最も高機能的な配列類は、ＧＣ含有量が少ないことが示された。図８ｂに示すように、１０Ｇまたは１０Ｃヌクレオチド以下のＧＣをもつ２５個の配列類のなかで、１８個の配列類（７７％）が５０％以上のサイレンシングを示す。この結果は、ｍｉＲ−１９６ａ−２スキャホールド内に挿入する外部配列類を設計する場合、全体のＧＣ含有量を考慮するべきであることを示唆している。

＜ｓｉＲＮＡアルゴリズムとｓｈＲＮＡアルゴリズムとの比較＞
ｍｉＲ−１９６ａ−２スキャホールドに挿入する外部配列類を用いて効果的に標的化できる標的サイトを同定できるアルゴリズムを開発するために、先の実施例で得られた結果を使用した（式１、式２および関連する記載内容参照）。ｍｉＲ−１９６ａ−２アルゴリズムおよびｓｉＲＮＡを設計するのに用いられたアルゴリズムを用いて（米項特許出願第２００５／０２５５４８７号明細書参照（出願番号１０／９４０８９２、２００４年９月１４日出願）、ＣＤＣ２遺伝子内に同定された標的サイトを並べて比較した結果、ほとんど重なり合わない異なる配列類をこれら２つのアルゴリズムが同定することが分かった（図９ａ参照）。

この検討後、ｍｉＲ−１９６ａ−２アルゴリズムおよびｓｉＲＮＡアルゴリズムを、ＭＡＰＫ１およびＥＧＦＲの２つの遺伝子に適用した（図９ｂ−図９ｃ参照）。続いて、標的配列類を、先に記載した制限領域を用いてｍｉＲ−１９６ａ−２スキャホールドにクローニングし、好適な２重ルシフェラーゼレポーター構築体並べてＨｅＬａ細胞に共移入した（標的配列類については図９ｂ、図９ｃ参照）。図９ｄにその結果を示す。ＥＧＦＲについては、選択した５つのクロ−ンの中で、２つだけが８０％を超える遺伝子ノックダウンを示した。対照的に、新しいｍｉＲ−１９６ａ−２アルゴリズムにより選択した５つのクロ−ンの中で、４つのクロ−ンが＞８０％の遺伝子ノックダウンを示した。ＭＡＰＫ１については、ｓｉＲＮＡアルゴリズムにより選択した４つの配列類の中で、３つの配列類が＞８０％の遺伝子ノックダウンを示した。対照的に、新しいｍｉＲ−１９６ａ−２アルゴリズムにより選択した５つのクロ−ン全てが、＞８０％の遺伝子ノックダウンを示した。

ｍｉＲ−１９６ａ−２設計アルゴリズムの有効性をさらに試験した結果、ＣＤＣ２（ＮＭ＿００１７８６）、ＣＤ２８（ＮＭ＿０６１３９）、ＣＤ６９（ＮＭ＿００１７８１）、およびＬＡＴ（ＮＭ＿０１４３８７）に対する標的配列類を設計し、ｍｉＲ−１９６ａ−２スキャホールドにクローニングして、その後、２重ルシフェラーゼアッセイを用いて標的遺伝子をノックダウンする能力を試験した。これらの研究結果を、図９（ｅ）に示す。ｍｉＲ−１９６ａ−２アルゴリズムを用いて設計した２５個の配列類の中で、２２個の配列類（８８％）が７５％を超えるサイレンシングを示した。

標的を十分にノックダウンできなかった構築体（例えば、＜５０％、Ｚａｐ７０、図９ｆに標的配列を示す）を詳細に研究した結果、ここで開示したアルゴリズムを用いて選択した数多くの配列類は、特に成熟鎖のシード領域内に一連のＧおよびＣを含むことが明らかになった（図９ｇ参照）。続いて行った機能性標的配列類の分析から、成熟鎖シード領域内では不安定さが低くなる傾向があることが示された（図９ｈ）。この理由から、この領域内にあるＧＣ含有量を制限するために、ｍｉＲ−１９６ａ−２アルゴリズムに追加条件を組み込んだ。

下記の表４に実施例１−３で使用した配列類を示す（全て５’→３’方向）。
表４

（表４の続葉１）

（表４の続葉２）

内在性ｍｉＲＮＡ類とｍｉＲ−１９６ａ−２スキャホールドとの適合性

ｍｉＲ−１９６ａ−２スキャホールドを内在性ｍｉＲＮＡ類発現用の輸送プラットホームとして使用可能かどうかを決めるために、１１個の別々の内在性成熟鎖配列類（ｍｉＲ−４９９−５ｐ、ｍｉＲ−４９９−３ｐ、−２０８ａ、−９、−３４ａ、−３０−３ｐ、−１３２、−２６ｂ、−１２４、−２０８ｂ、および１２２ａ）を、ｐＧ１９ＳＭ６発現プラスミド内にあるｍｉＲ−１９６ａ−２スキャホールドにクローニングした。得られた構築体類は、第１のｍｉＲＮＡから誘導されるスキャホールドおよび第２のｍｉＲＮＡから誘導される成熟鎖を含むようなｓｈＭＩＭＩＣの例となる。この構築体類は次にあげる特徴をもつ。１）組み込まれた配列の長さは、１９−２３ヌクレオチド長であった。２）１２位のミスマッチは保存された。３）成熟鎖１位のヌクレオチドは、常にＵであった。もし、内在性ｍｉＲＮＡの成熟鎖１位のヌクレオチドがＵでない場合には、ｓｈＭＩＭＩＣではそのヌクレオチドをＵに変換した。また、スキャホールドの２次構造を維持できる場合には、スター鎖上の５位、１８位、１９位、および２１位にＧ：Ｕゆらぎ塩基対を形成させた。ｐＧ１９ＳＭ６発現プラスミドにクローニングした配列類のリストを、表５に示す。ここで、成熟鎖１位が発現成熟鎖でＵになるように修飾した位置を、下部にあるヌクレオチド類は示す。先に記載したように、発現ベクターに配列類をクローニングした。
表５．ｍｉＲ−１９６ａ−２スキャホールドにクローニングした成熟ｍｉＲＮＡ配列類のリスト

ｍｉＲ−１９６ａ−２スキャホールドで機能する各ｍｉＲＮＡの有効性を試験するために、特有の内在性ｍｉＲＮＡ配列を含む個々のｍｉＲ−１９６ａ−２発現カセットを、ヒト化Ｒｌｕｃ遺伝子３’ＵＴＲに挿入したｍｉＲを含有する２重ルシフェラーゼ構築体と並べて、先の実施例で記載した条件で細胞内に共移入した。細胞を培養してＦｌｕｃに対するＲｌｕｃの比を測定した。

以上の研究結果から、細胞に内在性ｍｉＲＮＡ配列類を効率的に輸送するために、ｍｉＲ−１９６ａ−２スキャホールドを使用できることが明らかになった。図１０に示すように、試験した構築体全てが、２重ルシフェラーゼレポーター構築体を７０％以上サイレンシングした。これらの結果は、内在性ｍｉＲＮＡ輸送システムとしてｍｉＲ−１９６ａ−２スキャホールドが使用できることを示している。

また、挿入したｍｉＲＮＡの長さを１９個の塩基対で試験した実験も行った。例えば、２２ｎｔ成熟鎖を３’末端で１９ｎｔに切り縮めてスキャホールドにクローニングした。表５に、クロ−ニングしたｍｉＲ−１０６ｂおよびｍｉＲ−１配列類を示す。全ての場合で、１９ｎｔに配列を切り縮めても各々のレポーター構築体をサイレンシングする能力に影響は無かった。従って、この結果から、ｍｉＲ−１９６ａ−２スキャホールドを、長さ１９−２３ｎｔの外部ｍｉＲＮＡ配列類に適用できることが示される。また、ｍｉＲ−１９６ａ−２スキャホールドが１１個の特有のｍｉＲＮＡ配列類を効果的に輸送できることから、ヒト、マウス、ラット、および、ｃ．ｅｌｅｇａｎｓを含む任意の種に由来するｍｉＲＮＡ類全てに、ｍｉＲ−１９６ａ−２スキャホールドを全般的に適用できることが示された。ｍｉＲ−１９６ａ−２スキャホールドに導入可能な成熟ｍｉＲＮＡ配列鎖類は、ｍｉＲＢａｓｅ（http/microrna.sanger.ac.uk/sequences/）で見出すことができる。図１１に、ｍｉＲ−１９６ａ−２スキャホールドに基づくｓｈＭＩＭＩＣ用の一般的な設計思想を示す。

Claims (19)

1. 幹−ループ構造をもつ核酸からなる非天然存在型ｍｉＲ−１９６ａ−２ ｍｉＲＮＡであって、
   前記幹−ループ構造の幹は成熟鎖−スター鎖２本鎖を組み込み、
   前記成熟鎖の配列は、１９から２５個の塩基を有し、ｍｉＲ−１９６ａ−２の内在性成熟鎖の配列とは異なる配列であり、前記成熟鎖の２位から７位までは、標的ＲＮＡの一部に対し相補的であり、
   前記成熟鎖の１位はＵヌクレオチドであり、前記スター鎖は前記成熟鎖の１位に相対するヌクレオチドの位置にＧヌクレオチドを有し、
   前記２本鎖は、前記成熟鎖の１２位にミスマッチを含むとともに（ｉ）他にはミスマッチを含まない構成か、あるいは（ｉｉ）前記２本鎖の成熟鎖の５位、１８位および１９位の１以上の位置、及び２０位から２２位までの任意または全ての位置にミスマッチまたはゆらぎ塩基対を含む構成かのいずれかを有し、
   前記２本鎖中その他の位置にはミスマッチまたはゆらぎ塩基対を含まない構成を有し、
   前記成熟鎖の配列は５’位末端から符番されることを特徴とする非天然存在型ｍｉＲ−１９６ａ−２ ｍｉＲＮＡ。
2. 請求項１に記載の非天然存在型ｍｉＲ−１９６ａ−２ ｍｉＲＮＡであって、
   内在性ｍｉＲ−１９６ａ−２の幹の配列からヌクレオチド１個を削除した配列、
   内在性ｍｉＲ−１９６ａ−２の幹の配列にヌクレオチド１個を付加した配列、
   内在性ｍｉＲ−１９６ａ−２の幹の配列でヌクレオチド１個を置換した配列、
   内在性ｍｉＲ−１９６ａ−２のループの配列からヌクレオチド１個を削除した配列、
   内在性ｍｉＲ−１９６ａ−２のループの配列にヌクレオチド１個を付加した配列、
   内在性ｍｉＲ−１９６ａ−２のループの配列でヌクレオチド１個を置換した配列、
   長さにおいて５個乃至１５０個の間のヌクレオチドをもつ５’フランキングヌクレオチド配列、および
   長さにおいて５個乃至１５０個の間のヌクレオチドをもつ３’フランキングヌクレオチド配列の、少なくとも１つの配列を有する非天然存在型ｍｉＲ−１９６ａ−２ ｍｉＲＮＡ。
3. 式（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）で表される配列
   

   

   式（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）
   [式中、Ｍは前記成熟鎖であり、Ｓは前記スター鎖である]
   を有することを特徴とする請求項１に記載の非天然存在型ｍｉＲ−１９６ａ−２ ｍｉＲＮＡ。
4. 前記成熟鎖が、長さにおいて１９個から２３個の間のヌクレオチドからなることを特徴とする請求項１から請求項３のいずれか１項に記載の非天然存在型ｍｉＲ−１９６ａ−２ ｍｉＲＮＡ。
5. 前記成熟鎖が、長さにおいて１９個のヌクレオチドであることを特徴とする請求項１から請求項４のいずれか１項に記載の非天然存在型ｍｉＲ−１９６ａ−２ ｍｉＲＮＡ。
6. 前記成熟鎖の配列がいかなる内在性ｍｉＲＮＡ成熟鎖とも異なることを特徴とする請求項１から請求項５のいずれか１項に記載の非天然存在型ｍｉＲ−１９６ａ−２ ｍｉＲＮＡ。
7. 前記成熟鎖の配列がｍｉＲ−１９６ａ−２の内在性成熟鎖以外の内在性成熟ｍｉＲＮＡから誘導されることを特徴とする請求項１から請求項５のいずれか１項に記載の非天然存在型ｍｉＲ−１９６ａ−２ ｍｉＲＮＡ。
8. 請求項７に記載の非天然存在型ｍｉＲ−１９６ａ−２ ｍｉＲＮＡであって、前記成熟鎖は、
   hsa-let-7a-l, hsa-let-7a-2, hsa-let-7a-3, hsa-let-7b, hsa-let-7c, hsa-let-7d, hsa-let-7e, hsa-let-7f-l, hsa-let-7f-2, hsa-let-7g, hsa-let-7i, hsa-mir-1-1, hsa-mir-1-2, hsa-mir-7-1, hsa-mir-7-2, hsa-mir-7-3, hsa-mir-9-1, hsa-mir-9-2, hsa-mir-9-3, hsa-mir-10a, hsa-mir-10b, hsa-mir-15a, hsa-mir-15b, hsa-mir-16-1, hsa-mir-16-2, hsa-mir-17, hsa-mir-18a, hsa-mir-18b, hsa-mir-19a, hsa-mir-19b-l, hsa-mir-19b-2, hsa-mir-20a, hsa-mir-20b, hsa-mir-21, hsa-mir-22, hsa-mir-23a, hsa-mir-23b, hsa-mir-24-1, hsa-mir-24-2, hsa-mir-25, hsa-mir-26a-l, hsa-mir-26a-2, hsa-mir-26b, hsa-mir-27a, hsa-mir-27b, hsa-mir-28, hsa-mir-29a, hsa-mir-29b-l, hsa-mir-29b-2, hsa-mir-29c, hsa-mir-30a, hsa-mir-30b, hsa-mir-30c-l, hsa-mir-30c-2, hsa-mir-30d, hsa-mir-30e, hsa-mir-31, hsa-mir-32, hsa-mir-33a, hsa-mir-33b, hsa-mir-34a, hsa-mir-34b, hsa-mir-34c, hsa-mir-92a-l, hsa-mir-92a-2, hsa-mir-92-b, hsa-mir-93, hsa-mir-95, hsa-mir-96, hsa-mir-98, hsa-mir-99a, hsa-mir-99b, hsa-mir-100, hsa-mir-101-1, hsa-mir-101-2, hsa-mir-103-1, hsa-mir-103-2, hsa-mir-105-1, hsa-mir-105-2, hsa-mir-106a, hsa-mir-106b, hsa-mir-107, hsa-mir-122, hsa-mir-124-1, hsa-mir-124-2, hsa-mir-124-3, hsa-mir-125a, hsa-mir-125b-1, hsa-mir-125b-2, hsa-mir-126, hsa-mir-127, hsa-mir-128-1, hsa-mir-128-2, hsa-mir-129-1, hsa-mir-129-2, hsa-mir-130a, hsa-mir-130b, hsa-mir-132, hsa-mir-133a-l, hsa-mir-133a-2, hsa-mir-133b, hsa-mir-134, hsa-mir-135a-l, hsa-mir-135a-2, hsa-mir-135b, hsa-mir-136, hsa-mir-137, hsa-mir-138-1, hsa-mir-138-2, hsa-mir-139, hsa-mir-140, hsa-mir-141, hsa-mir-142, hsa-mir-143, hsa-mir-144, hsa-mir-145, hsa-mir-146a, hsa-mir-146b, hsa-mir-147, hsa-mir-147b, hsa-mir-148a, hsa-mir-148b, hsa-mir-149, hsa-mir-150, hsa-mir-151, hsa-mir-152, hsa-mir-153-1, hsa-mir-153-2, hsa-mir-154, hsa-mir-155, hsa-mir-181a-l, hsa-mir-181a-2, hsa-mir-181b-l, hsa-mir-18lb-2, hsa-mir-181c, hsa-mir-181d, hsa-mir-182, hsa-mir-183, hsa-mir-184, hsa-mir-185, hsa-mir-186, hsa-mir-187, hsa-mir-188, hsa-mir-190, hsa-mir-190b, hsa-mir-191, 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hsa-mir-1299, hsa-mir-1300, hsa-mir-1301, hsa-mir-1302-1, hsa-mir-1302-2, hsa-mir-1302-3, hsa-mir-1302-4, hsa-mir-1302-5, hsa-mir-1302-6, hsa-mir-1302-7, hsa-mir-1302-8, hsa-mir-1303, hsa-mir-1304, hsa-mir-1305, hsa-mir-1306, hsa-mir-1307, hsa-mir-1308, hsa-mir-1321, hsa-mir-1322, hsa-mir-1323, hsa-mir-1324, hsa-mir-1825, hsa-mir-1826, hsa-mir-1827
   から構成される群から選択されるｍｉＲＮＡの内在性成熟鎖配列から誘導されることを特徴とする非天然存在型ｍｉＲ−１９６ａ−２ ｍｉＲＮＡ。
9. 請求項１から請求項８のいずれか１項に記載の非天然存在型ｍｉＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を有するリコンビナント発現ベクター。
10. 前記ベクターは人工イントロンを有するレポーター遺伝子と操作によって結合しているプロモーターを有し、および前記人工イントロン内部に前記非天然存在型ｍｉＲＮＡが位置することを特徴とする請求項９に記載のリコンビナント発現ベクター。
11. 前記ベクターは３’非翻訳領域（ＵＴＲ）をもつレポーター遺伝子と操作によって結合しているプロモーターを有し、および前記３’ＵＴＲ内部に前記非天然存在型ｍｉＲＮＡが位置することを特徴とする請求項９に記載のリコンビナント発現ベクター。
12. 前記ベクターはレンチウイルスベクターであることを特徴とする請求項９から請求項１１のいずれか１項に記載のリコンビナント発現ベクター。
13. 請求項１から請求項８のいずれか１項に記載の非天然存在型ｍｉＲＮＡまたは請求項９から請求項１２のいずれか１項に記載のリコンビナント発現ベクターを有し、さらに薬学的に許容されるキャリアーを少なくとも１つ有する医薬品組成物。
14. 遺伝子が不適当に発現することを特徴とする病気を治療する医薬品の製造に、請求項１から請求項８のいずれか１項に記載の非天然存在型ｍｉＲＮＡまたは請求項９から請求項１２のいずれか１項に記載のリコンビナント発現ベクターを使用する方法であって、前記遺伝子が前記非天然存在型ｍｉＲＮＡによって標的にされることを特徴とする、医薬品の製造に使用する方法。
15. 請求項１から請求項８のいずれか１項に記載の非天然存在型ｍｉＲＮＡまたは請求項９から請求項１２のいずれか１項に記載のリコンビナント発現ベクターを有する細胞。
16. インビトロの細胞内標的ＲＮＡの機能を低下させる方法であって、前記方法は、
    前記細胞を、請求項１から請求項８のいずれか１項に記載の非天然存在型ｍｉＲＮＡまたは請求項９から請求項１２のいずれか１項に記載のリコンビナント発現ベクターに接触させる工程を有し、前記非天然存在型ｍｉＲＮＡは前記細胞内で処理されて前記成熟鎖の配列をもつ成熟ｍｉＲＮＡを生成することを特徴とする、細胞内標的ＲＮＡの機能を低下させる方法。
17. 前記標的ＲＮＡが、ｍＲＮＡであることを特徴とする請求項１から請求項８のいずれか１項に記載の非天然存在型ｍｉＲ−１９６ａ−２ ｍｉＲＮＡ。
18. 前記成熟鎖が、前記標的ＲＮＡの領域と１００％相補的であることを特徴とする請求項１から請求項８、および請求項１７のいずれか１項に記載の非天然存在型ｍｉＲ−１９６ａ−２ ｍｉＲＮＡ。
19. 標的ＲＮＡ領域の標的ＲＮＡゆらぎ塩基対は、前記成熟鎖内のヌクレオチド１に対して相補的であることを特徴とする請求項１から請求項８、および請求項１７のいずれか１項に記載の非天然存在型ｍｉＲ−１９６ａ−２ ｍｉＲＮＡ。

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