CN106068324B - 控制基因表达的人工匹配型miRNA及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种使用miRNA的新的人工匹配型miRNA。所述人工匹配型miRNA为包括X区域和Y区域的单链核酸，并配置如下：X区域的3’末端和Y区域的5’末端经具有非核苷酸结构的连接子区域相连；所述X区域包括成熟miRNA引导链序列；和所述Y区域为包括与所述X区域完全互补的序列的单链核酸。该人工匹配型miRNA使得可抑制靶基因的表达。
Description
技术领域
本发明涉及抑制基因表达的人工匹配型miRNA及其用途。
背景技术
微小RNA(miRNA)已知为抑制基因表达的核酸分子并已被报道了经由例如下列生成过程抑制由基因编码的蛋白质的翻译。即，在细胞核中生成5’末端具有帽结构和3’末端具有多聚腺苷(poly(A))的miRNA转录产物(Pri-miRNA)。前述Pri-miRNA被Rnase(Drosha)切断而生成miRNA前体(Pre-miRNA)。前述Pre-miRNA形成具有环区和茎区的发夹结构。Pre-miRNA移动出细胞核并在细胞质中被RNase(Dicer)降解。切出3’末端具有1-4个碱基的突出端(overhang)的双链miRNA(成熟miRNA)。双链miRNA的一条链称为引导链，另一条链称为随从链(passenger strand)，前述引导链键合至类似于RNA诱导的沉默复合体(RNA-inducedsilencing complex,RISC)的复合体。该miRNA/RISC复合体键合至特定mRNA的3’非翻译区(3’UTR)来抑制由前述mRNA翻译蛋白质。
已阐明的是miRNA深入参与了如分化、细胞增殖和凋亡等生命现象和如病毒感染和癌症等多种疾病(专利文献1、非专利文献1、非专利文献2)。由此，已期望其特别是在医学领域中的应用。
文献列表
专利文献
专利文献1：WO 2010/056737 A2
非专利文献
非专利文献1：Deiters,2009,The AAPS Journal,12,51-60
非专利文献2：Takeshita etal.,2010,Mol.Ther.,18,181-187
发明内容
发明要解决的问题
对于前述miRNA的应用，例如，包括使用双链成熟miRNA等的方法是可用的。然而，该方法要求在应用前使两条单链核酸分子退火，这导致由识别双链的TLR3等发生自身免疫的可能性。
因此，本发明的目的是利用miRNA提供新的人工匹配型miRNA。
用于解决问题的方案
为了实现前述目的，本发明的人工匹配型miRNA为包括X区域和Y区域的单链核酸，其特征在于，
前述X区域的3’末端和前述Y区域的5’末端经非核苷酸结构的连接子区域连接，
前述X区域包括成熟miRNA的引导链序列，和
前述Y区域包括与所述X区域完全互补的序列。
本发明的组合物为一种用于抑制靶基因表达的组合物，并且其特征在于包括上述人工匹配型miRNA。
本发明的组合物为药学组合物，其特征在于包括上述人工匹配型miRNA。
本发明的表达抑制方法为抑制靶基因表达的方法，其特征在于使用上述人工匹配型miRNA。
本发明的疾病的治疗方法包括将上述本发明的人工匹配型miRNA投与至患者的步骤，其中在上述人工匹配型miRNA中的前述引导链序列为抑制参与前述疾病的基因表达的成熟miRNA的引导链序列。
发明的效果
本发明的人工匹配型miRNA可以以低成本容易地合成，并且可抑制由前述基因编码的蛋白质的翻译。
附图说明
图1为示出本发明的人工匹配型miRNA的一个实施方案的示意图。
图2为示出本发明实施例1中每孔的细胞数的图。
图3为示出本发明实施例1中细胞增殖的相对值的图。
图4为示出本发明实施例1中凋亡比例的图。
图5为示出本发明实施例1中AXL mRNA量和MET mRNA量的相对值的图。
图6为示出本发明实施例2中AXL mRNA量的相对值的图。
图7为示出本发明实施例2中MET mRNA量的相对值的图。
图8为示出本发明实施例3中AXL mRNA量的相对值的图。
图9为示出本发明实施例3中MET mRNA量的相对值的图。
图10为示出本发明实施例4中HMGA2 mRNA量的相对值的图。
图11为示出本发明实施例5中COLA1 mRNA量的相对值的图。
具体实施方式
除非另有说明，本说明书中所使用的术语意指它们在本领域中的一般含义。
(1)人工匹配型miRNA
本发明的人工匹配型miRNA为如上所述的包括X区域和Y区域的单链核酸，其特征在于，
前述X区域的3’末端和前述Y区域的5’末端经非核苷酸结构的连接子区域连接，
前述X区域包括成熟miRNA的引导链序列，和
前述Y区域包括与所述X区域完全互补的序列。
本发明的人工匹配型miRNA可抑制例如靶基因的表达。表达手段的抑制，例如前述靶基因的翻译的抑制，即，由前述靶基因编码的蛋白质的翻译的抑制，更特别地，由前述靶基因的mRNA的前述蛋白质的翻译的抑制。前述靶基因的表达抑制可通过例如源自靶基因的转录产物的生成量的减少；前述转录产物的活性的减少；由前述靶基因的翻译产物的生成量的减少；或前述翻译产物的活性的减少等来证实。前述蛋白质可为例如成熟蛋白质、进行加工或翻译后修饰之前的前体蛋白质。
由于本发明的人工匹配型miRNA是单链核酸分子，不像成熟miRNA似的，没有必要使两条单链的退火，并且可以以低成本生产。此外，由于本发明的人工匹配型miRNA是单链核酸分子，例如，其可避免被参与自身免疫的TLR3、RIG-I和MDA5等识别。
本发明的人工匹配型miRNA中前述X区域和前述Y区域之间的结构关系的概要示于图1。图1示出概要，例如不限制各个区域的长度和形状等。如图1所示，本发明的人工匹配型miRNA在5’侧具有前述X区域，在3’侧具有前述Y区域，前述X区域的3’末端和前述Y区域的5’末端经非核苷酸结构的连接子区域(图中由“P”示出)连接。
在本发明的人工匹配型miRNA中，由于前述Y区域包含与前述X区域完全互补的序列，将前述X区域和前述Y区域例如分子间退火。分子间退火也称作例如自身退火。本发明的人工匹配型miRNA还可以说在前述分子间-退火区域中形成双链。
本发明的人工匹配型miRNA还可称作线性单链核酸分子，其中，其5’末端和其3’末端未键合。为了保持两末端的未结合，本发明人工匹配型miRNA的5’末端优选例如是非磷酸基。
在本发明的人工匹配型miRNA中，前述X区域包含如上所述的成熟miRNA的引导链序列。成熟miRNA的引导链序列例如记录在各种数据库中(例如，http://www.mirbase.org/etc.)。因此，前述X区域可基于例如已知的成熟miRNA的信息来设定。前述成熟miRNA的引导链是带入RNA诱导的沉默复合体(RISC)的Argonaute(Ago)蛋白质并结合至靶标的mRNA的链。
前述X区域可仅由例如前述引导链序列组成，或者可进一步具有附加序列。在后一种情况中，前述X区域由例如前述引导链序列和前述附加序列组成，前述附加序列键合至例如前述引导链序列的3’末端。
在本发明的人工匹配型miRNA中，当前述X区域和前述Y区域比对时，前述Y区域具有与前述X区域完全互补的序列。前述Y区域可仅由例如与前述X区域互补的序列组成，或者除了前述互补序列以外还具有突出端。即，在本发明的人工匹配型miRNA中，当例前述Y区域和前述X区域比对时，前述Y区域可在3’末端具有突出端。如本文所使用的，Y区域中的前述突出端为例如当前述Y区域和前述X区域比对时前述Y区域所具有的超过前述X区域的末端碱基。突出端的长度(O)为例如如下式所示。
突出端的长度(O)＝[Y区域的全长碱基数(Y)]-[X区域的全长碱基数(X)]
在本发明的人工匹配型miRNA中，各区域的长度不特别限定。在下述条件的示例中，本发明的人工匹配型miRNA不限于如此的记载。本发明中，碱基数的数值范围公开了落入该范围内的所有正整数，并且例如“1-4个碱基”意指全部“1、2、3、4个碱基”(下文同)。
在前述X区域中，前述引导链序列的长度不特别限定并可为例如所报道的成熟miRNA的引导链序列的长度。其具体实例包括下限19个碱基长、20个碱基长，和上限25个碱基长、24个碱基长，以及范围19-25个碱基长、20-24个碱基长。
前述X区域的前述附加序列的长度不特别限定，下限为例如0个碱基长、1个碱基长、2个碱基长，上限为例如5个碱基长、4个碱基长、3个碱基长，且范围为例如0-5个碱基长、1-5个碱基长、1-4个碱基长、2-3个碱基长、3-5个碱基长。
前述X区域的长度不特别限定，下限为例如19个碱基长、21个碱基长、23个碱基长，上限为例如30个碱基长、28个碱基长、26个碱基长，范围为例如19-30个碱基长、21-28个碱基长、23-26个碱基长。
前述Y区域中前述突出端的长度不特别限定，下限为例如0个碱基长、1个碱基长，上限为例如4个碱基长、3个碱基长，范围为例如0-4个碱基长、1-3个碱基长、2个碱基长。
前述突出端的序列不特别限定，并自3’侧为例如UU、CU、GC、UA、AA、CC、UG、CG、AU和TT等。前述突出端可为例如TT而被赋予对核糖核酸酶的耐性。
前述Y区域的长度不特别限定，并且下限为例如19个碱基长、21个碱基长、23个碱基长，上限为例如32个碱基长、30个碱基长、28个碱基长，范围为例如19-32个碱基长、21-30个碱基长、23-28个碱基长。
本发明的人工匹配型miRNA的全长(T)不特别限定，下限为例如38个碱基长、42个碱基长、46个碱基长，上限为例如62个碱基长、58个碱基长、54个碱基长，范围为例如38-62个碱基长、42-58个碱基长、46-54个碱基长。
本发明的人工匹配型miRNA中，前述成熟miRNA的种类不特别限定，并且可适当地根据靶基因的种类来选择。
前述成熟miRNA的实例包括成熟miRNA，例如hsa-miR-34a(SEQ ID NO:1)、hsa-let-7a(SEQ ID NO:2)、hsa-let-7f(SEQ ID NO:3)、hsa-miR-150(SEQ ID NO:4)和hsa-miR-29b(SEQ ID NO:5)等。
hsa-miR-34a(SEQ ID NO:1)
UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU
hsa-let-7a(SEQ ID NO:2)
UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU
hsa-let-7f(SEQ ID NO:3)
UGAGGUAGUAGAUUGUAUAGUU
hsa-miR-150(SEQ ID NO:4)
UCUCCCAACCCUUGUACCAGUG
hsa-miR-29b(SEQ ID NO:5)
UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU
各SEQ ID NO中示出的核苷酸序列为引导链序列。
miR-34a的引导链靶向例如AXL、MET、CDK4、CDK6、SIRT1、CCND1、SIRT1和BCL-2等，且这些靶基因的表达抑制可预防或治疗疾病如肺癌、结直肠癌、胃癌、肝癌和乳腺癌等。
let-7a的引导链靶向例如HMGA2(高迁移率组AT-hook 2)、KRAS、NRAS、HRAS、MYC和TLR4等，且这些靶基因的表达抑制可预防或治疗疾病如肺癌、结直肠癌、胃癌、肝癌和乳腺癌等。
let-7f的引导链靶向例如HMGA2(高迁移率组AT-hook 2)、KRAS、NRAS、HRAS、MYC和TLR4等，且这些靶基因的表达抑制可预防或治疗疾病如肺癌、结直肠癌、胃癌、肝癌和乳腺癌等。
miR-150的引导链靶向例如COL1A1、COL4A4、SMAD2和SP1等，且这些靶基因的表达抑制可预防或治疗疾病如肺纤维化和肝纤维化等。
miR-29b的引导链靶向例如COL1A1、MCL1、DNMT3A、DNMT3B、TCL1A和TGFb3等，且这些靶基因的表达抑制可预防或治疗疾病如肺癌、结直肠癌、胃癌、肝癌、乳腺癌、肺纤维化和肝纤维化等。
本发明的人工匹配型miRNA的构成单元不特别限定。其实例包括核苷酸残基。前述核苷酸残基的实例包括核糖核苷酸残基和脱氧核糖核苷酸残基。在本发明的人工匹配型miRNA中，前述核苷酸残基优选为例如核糖核苷酸残基。前述核苷酸残基可为例如未经修饰的(未修饰的核苷酸残基)或已经修饰的(修饰的核苷酸残基)。通过构建本发明的人工匹配型miRNA来包括前述修饰的核苷酸残基，例如，可改进人工匹配型miRNA对核酸酶的耐性，从而使人工匹配型miRNA的稳定性得到改进。此外，本发明的人工匹配型miRNA除前述核苷酸残基以外还可包括例如非核苷酸残基。
当人工匹配型miRNA除前述未修饰的核糖核苷酸残基以外还包括例如前述修饰的核糖核苷酸残基，前述修饰的核糖核苷酸残基的个数不特别限定，并且为例如“1至几个”，具体地，例如1至5个，优选1至4个，更优选1至3个，更优选1或2个。前述修饰的核糖核苷酸残基与前述未修饰的核糖核苷酸残基形成对比，可为例如通过用脱氧核糖残基代替核糖残基而得到的前述脱氧核糖核苷酸残基。当本发明的人工匹配型miRNA除前述未修饰的核糖核苷酸残基以外还包括例如前述脱氧核糖核苷酸残基，前述脱氧核糖核苷酸残基的个数不特别限定，并且为例如“1至几个”，具体地，例如1至5个，优选1至4个，更优选1至3个，更优选1或2个。
前述核苷酸残基包括，例如糖、碱基和磷酸作为其组分。前述核糖核苷酸残基具有例如核糖残基作为糖；和腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、或尿嘧啶(U)作为碱基。前述脱氧核糖残基具有例如脱氧核糖残基作为糖；腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、或胸腺嘧啶(T)作为碱基。
前述未修饰的核苷酸残基的前述组分与天然存在的核苷酸残基相同或基本相同。具体地，例如组分与人体中天然存在的核苷酸残基相同或基本相同。
例如，前述修饰的核苷酸残基可为前述未修饰的核苷酸残基的任意组分被修饰的。前述修饰的核苷酸残基的实例包括天然存在的核苷酸残基和人工修饰的核苷酸残基。
前述修饰的核苷酸残基可为例如前述核苷酸的代替物的残基。前述代替物的实例包括人工核酸单体残基。其具体实例包括PNA(肽核酸)、LNA(锁核酸)、和ENA(2’-O,4’-C-亚乙基桥接核酸(Ethylenebridged Nucleic Acids))。
在前述核苷酸残基中，前述碱基不特别限定。前述碱基可为例如天然碱基或非天然碱基。前述碱基可为例如天然衍生的碱基或合成碱基。作为前述碱基，可使用例如一般的碱基和其修饰类似物等。
在本发明的人工匹配型miRNA中，前述非核苷酸结构的连接子区域优选含有选自由氨基酸残基、多胺残基和多元羧酸残基组成的组的至少之一。前述连接子区域可包含或可不包含除氨基酸残基、多胺残基和多元羧酸残基以外的残基。例如，前述连接子区域可含有任意的多元羧酸残基、对苯二甲酸残基和氨基酸残基。
本发明中，“多胺”意指包含多个(两个、三个或更多)氨基的任意化合物。前述“氨基”不限于-NH2基团，还包括亚氨基(-NH-)。本发明中，前述多胺不特别限定，其实例包括1,4-苯二胺、1,3-苯二胺和1,2-苯二胺等。此外，在本发明中，“多元羧酸”意指包含多个(两个、三个或更多)羧基的任意化合物。本发明中，前述多元羧酸不特别限定，其实例包括1,4-二羧基苯(对苯二甲酸)、1,3-二羧基苯(间苯二甲酸)和1,2-二羧基苯(邻苯二甲酸)等。另外，本发明中，“氨基酸”意指如下所述分子中包含一个以上的氨基和一个以上的羧基的任意有机化合物。前述“氨基”不限于-NH2基团，还包括亚氨基(-NH-)。
在本发明的人工匹配型miRNA中，前述氨基酸残基可由多个互连的氨基酸残基组成。本发明中，为多个互连的氨基酸残基的氨基酸残基为例如包含肽结构的残基。更具体地，为多个互连的氨基酸残基的前述氨基酸残基为例如下述化学式(I)的氨基酸残基，其中下述化学式(Ia)为肽(例如，甘氨酸二聚体或甘氨酸三聚体等)。
在本发明的人工匹配型miRNA中，前述氨基酸残基可为甘氨酸残基、对苯二甲酰胺残基、脯氨酸残基或赖氨酸残基。前述氨基酸残基可为修饰的氨基酸残基或氨基酸衍生物。
在本发明的人工匹配型miRNA中，前述连接子区域由例如下列化学式(I-0)表示。
在前述化学式(I-0)中，
Q11和Q12各自独立地为单键、CH2(亚甲基)、NH(亚氨基)、C＝O(羰基)、C＝S(硫代羰基)、C＝NH(亚氨基亚甲基)、O、或S，
Q1和Q2各自独立地为单键、CH2(亚甲基)、NH(亚氨基)、C＝O(羰基)、C＝S(硫代羰基)、C＝NH(亚氨基亚甲基)、O、或S，
Y1和Y2各自独立地为单键、CH2、NH、O或S；
L1为具有n个碳原子的亚烷基链，和亚烷基碳原子上的氢原子可被或可不被OH、ORa、NH2、NHRa、NRaRb、SH或SRa取代，或
L1为通过用氧原子取代前述亚烷基链上的至少一个碳原子获得的聚醚链，
条件是：当Y1为NH、O或S时，L1中键合至Y1的原子为碳，L1中键合至OR1的原子为碳，且氧原子彼此不相邻；
L2为具有m个碳原子的亚烷基链，和亚烷基碳原子上的氢原子可被或可不被OH、ORc、NH2、NHRc、NRcRd、SH或SRc取代，或
L2为通过用氧原子取代前述亚烷基链上的至少一个碳原子获得的聚醚链，
条件是：当Y2为NH、O或S时，L2中键合至Y2的原子为碳，L2中键合至OR2的原子为碳，且氧原子彼此不相邻；
Ra、Rb、Rc和Rd各自独立地为取代基或保护基；
m为0至30范围内的整数；
n为0至30范围内的整数；
前述X区域和前述Y区域经-OR1-或-OR2-键合至前述连接子残基，
其中R1和R2可存在或可不存在，且当它们存在时，R1和R2各自独立地为核苷酸残基或前述结构(I-0)；和
A为任意原子团。
前述X区域和Y区域与-OR1-和-OR2-的结合的组合不特别限定，并且可为例如以下任意条件。
条件(1)：
前述X区域和前述Y区域分别经-OR2-和-OR1-连接至前述式(I)的结构。
条件(2)：
前述X区域和前述Y区域分别经-OR1-和-OR2-连接至前述式(I)的结构。
在前述化学式(I-0)中，例如，Q11可为C＝O(羰基)，Q1可为NH(亚氨基)。另外，例如，Q11可为NH(亚氨基)，Q1可为C＝O(羰基)。另外，例如，Q12可为C＝O(羰基)，Q2可为NH(亚氨基)。此外，例如，Q12可为NH(亚氨基)，Q2可为C＝O(羰基)。
在前述化学式(I-0)中，Q11和Q12各自可为例如羰基。在该情况下，Q1和Q2各自优选亚氨基。另外，在该情况下，下列化学式(Iα)的结构更优选由下列化学式(Iα2)表示。
在前述化学式(Iα2)中，
R100为任意取代基，其可存在或可不存在。当其存在时，其可单独或多个存在。当其多个存在时，它们可彼此相同或不同。前述针对R100的任意取代基包括下述示例为Ra、Rb、Rc和Rd的取代基。其更具体的实例包括卤素、羟基、烷氧基、氨基、羧基、磺基、硝基、氨基甲酰基、氨磺酰基、烷基、烯基、炔基、卤烷基、芳基、芳烷基、烷芳基、环烷基、环烯基、环烷基烷基、环基烷基、羟烷基、烷氧基烷基、氨基烷基、甲硅烷基、甲硅烷氧基烷基、吡咯基和咪唑基等。前述化学式(Iα2)的结构更优选由下列化学式(Iα3)表示。
当Q11和Q12为羰基时，Q1和Q2为亚氨基，前述化学式(I-0)的连接子残基可为羧酸酰胺残基或羧酸残基。例如，下述实例中的“TPA”结构可为由前述化学式(Iα3)表示的对苯二甲酰胺残基或对苯二甲酸残基。
在前述化学式(I-0)中，各Q11和Q12可为亚氨基。在该情况中，各Q1和Q2优选羰基。在该情况中，下述化学式(Iβ)的结构更优选由下述化学式(Iβ2)表示。
在前述化学式(Iβ2)中，
R100为任意取代基，其可存在或可不存在。当其存在时，其可单独或多个存在。当其多个存在时，它们可彼此相同或不同。具体地，例如，与前述化学式(Iα2)中的R100相同。另外，前述化学式(Iβ2)的结构更优选由下列化学式(Iβ3)表示。
在本发明的人工匹配型miRNA中，当前述连接子残基为氨基酸残基时，前述氨基酸残基由例如下列化学式(I)表示。下列化学式(I)的结构为由前述化学式(I-0)表示的结构的一个实例。
在前述化学式(I)中，例如，X1、X2、Y1、Y2、L1和L2如上所定义。
与前述微小RNA的序列互补的序列经-OR1-或-OR2-各自键合至前述氨基酸残基，
其中R1和R2可存在或可不存在，且当它们存在时，R1和R2各自独立地为核苷酸残基或前述结构(I)；和
A为任意原子团，条件是下列化学式(Ia)为氨基酸或肽。
前述式(I)、(Iα)或(Ia)中的原子团A可包含或可不包含例如选自由链式原子团、脂环式原子团、芳族性原子团、杂芳族性原子团和杂脂环式原子团组成的组的至少之一。当前述链式原子团不特别限定时，例如可提及烷基、烯基、炔基、卤烷基、羟烷基、烷氧基烷基、氨烷基、甲硅烷基和甲硅烷氧基烷基等。在当前述脂环式原子团不特别限定时，例如可提及环烷基、环烯基、环烷基烷基和环基烷基等。当前述芳族性原子团不特别限定时，例如可提及芳基、芳烷基、烷芳基、稠环芳基、稠环芳烷基和稠环烷芳基等。前述杂芳族性原子团不特别限定，其实例包括杂芳基、杂芳烷基、烷基杂芳基、稠环杂芳基、稠环杂芳烷基和稠环烷基杂芳基等。在前述化学式(I)、(Iα)或(Ia)中的原子团A中，各前述原子团可进一步具有或可不进一步具有取代基或保护基。当前述取代基或保护基是多个时，它们可相同或不同。前述取代基为例如前述Ra、Rb、Rc和Rd所列举的那些，更具体地，例如卤素、羟基、烷氧基、氨基、羧基、磺基、硝基、氨基甲酰基、氨磺酰基、烷基、烯基、炔基、卤烷基、芳基、芳烷基、烷芳基、环烷基、环烯基、环烷基烷基、环基烷基、羟烷基、烷氧基烷基、氨烷基、甲硅烷基、甲硅烷氧基烷基、吡咯基和咪唑基等。前述保护基例如与前述Ra、Rb、Rc和Rd所列举的那些相同。
在本发明中，“氨基酸”是指如上所述分子中含有至少一个氨基和至少一个羧基的任意有机化合物。前述“氨基”不限定为-NH2基团，还包括亚氨基(-NH-)。例如，脯氨酸和羟脯氨酸等的分子中不含有-NH2基团，但含有亚氨基(-NH-)，并包括在本发明的“氨基酸”的定义中。本发明中，前述“氨基酸”可为如下所述的天然氨基酸或人工氨基酸。例如，由下述化学式(Ia2)或(Ia3)表示的化合物分子中也包含氨基和羧基，因此，其包括在本发明的“氨基酸”的定义中。因此，例如，其中原子团A为由下述化学式(A2)或化学式(A2a)示出的结构的前述化学式(I)，包括在本发明的“氨基酸残基”的定义中。另外，例如，下述实例中的“TPA”结构也包括在本发明的“氨基酸残基”的定义中。此外，本发明中，“肽”是指具有其中不小于2分子的氨基酸经肽键键合的结构的有机化合物。前述肽键可为酰胺结构或酰亚胺结构。当多个氨基存在于由前述化学式(Ia)表示的氨基酸或肽分子中时，清楚示于前述化学式(Ia)中的氨基可为任意氨基。另外，当多个羧基存在于由前述化学式(Ia)表示的氨基酸或肽分子中时，清楚示于前述化学式(Ia)中的羧基可为任意羧基。
在本发明人工匹配型miRNA的前述氨基酸残基中，前述氨基酸可为例如如上所述的天然氨基酸或人工氨基酸。本发明中，“天然氨基酸”是指具有天然存在的结构或其光学异构体的氨基酸。前述天然氨基酸的制造方法不特别限定，例如其可从天然产物中提取，或可合成。此外，在本发明中，“人工氨基酸”是指具有不天然存在的结构的氨基酸。即，前述人工氨基酸为氨基酸，即含有氨基的羧酸衍生物(分子中含有至少一个氨基和至少一个羧基的有机化合物)且具有不天然存在的结构。前述人工氨基酸优选不含有例如杂环。前述氨基酸可为构成例如蛋白质的氨基酸。前述氨基酸可为例如选自由甘氨酸、α-丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、羟赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、缬氨酸、脯氨酸、4-羟脯氨酸、色氨酸、β-丙氨酸、1-氨基-2-羧基环戊烷、氨基苯甲酸、氨基吡啶羧酸和由下列化学式(Ia2)表示的氨基酸组成的组的氨基酸的至少一种，并可进一步具有或可不进一步具有取代基或保护基。前述取代基的实例包括前述Ra、Rb、Rc和Rd所列举的取代基。更具体地，例如，可提及卤素、羟基、烷氧基、氨基、羧基、磺基、硝基、氨基甲酰基、氨磺酰基、烷基、烯基、炔基、卤烷基、芳基、芳烷基、烷芳基、环烷基、环烯基、环烷基烷基、环基烷基、羟烷基、烷氧基烷基、氨烷基、甲硅烷基、甲硅烷氧基烷基、吡咯基和咪唑基等。前述保护基与例如前述Ra、Rb、Rc和Rd所列举的保护基相同。当前述化学式(Ia)的氨基酸(其不是肽)含有异构体如光学异构体、几何异构体和立体异构体等时，可使用任何异构体。
在前述化学式(Ia2)中，R100为任意取代基，其可存在或可不存在。当其存在时，其可单独或多个存在。当其多个存在时，它们可彼此相同或不同。前述针对R100的任意取代基的实例包括示例为前述Ra、Rb、Rc或Rd的那些，更具体地例如卤素、羟基、烷氧基、氨基、羧基、磺基、硝基、氨基甲酰基、氨磺酰基、烷基、烯基、炔基、卤烷基、芳基、芳烷基、烷芳基、环烷基、环烯基、环烷基烷基、环基烷基、羟烷基、烷氧基烷基、氨基烷基、甲硅烷基、甲硅烷氧基烷基、吡咯基和咪唑基等。另外，前述化学式(Ia2)的结构可为例如下列化学式(Ia3)。
当前述化学式(Ia)的结构为前述化学式(Ia2)时，前述化学式(I)中的原子团A的结构由下列化学式(A2)表示。下列化学式(A2)中的R100与前述化学式(Ia2)中的R100相同。另外，当前述化学式(Ia)的结构为前述化学式(Ia3)时，前述化学式(I)中的原子团A的结构由下列化学式(A2a)表示。
前述化学式(I)的结构的实例为例如下列化学式(I-1)至(I-7)，其中，n和m与前述化学式(I)中的相同。
在前述化学式(I-1)至(I-7)中，n和m不特别限定，且为如上所述的。其具体实例包括前述化学式(I-1)中n＝11和m＝12、或n＝5和m＝4，前述化学式(I-4)中n＝5和m＝4，前述化学式(I-6)中n＝4和m＝4，前述化学式(I-7)中n＝5和m＝4。结构由下列化学式(I-1a)、(I-1b)、(I-4a)、(I-6a)和(I-7a)表示。
在本发明的人工匹配型miRNA中，前述连接子区域例如由下式(II)表示：
在前述化学式(II)中，
X1和X2各自独立地为H2、O、S或NH；
Y1和Y2各自独立地为单键、CH2、NH、O或S；
R3为键合至环A上的C-3、C-4、C-5或C-6的氢原子或取代基；
L1为具有n个原子的亚烷基链，和亚烷基碳原子上的氢原子可被或可不被OH、ORa、NH2、NHRa、NRaRb、SH或SRa取代，或
L1为通过用氧原子取代前述亚烷基链上的至少一个碳原子获得的聚醚链，
条件是：当Y1为NH、O或S时，L1中键合至Y1的原子为碳，L1中键合至OR1的原子为碳，且氧原子彼此不相邻；
L2为具有m个原子的亚烷基链，和亚烷基碳原子上的氢原子可被或可不被OH、ORc、NH2、NHRc、NRcRd、SH或SRc取代，或
L2为通过用氧原子取代前述亚烷基链上的至少一个碳原子获得的聚醚链，
条件是：当Y2为NH、O或S时，L2中键合至Y2的原子为碳，L2中键合至OR2的原子为碳，且氧原子彼此不相邻；
Ra、Rb、Rc和Rd各自独立地为取代基或保护基；
l为1或2；
m为0至30范围内的整数；
n为0至30范围内的整数；和
环A中，前述环A上的C-2以外的一个碳原子可被氮、氧或硫取代，
前述环A中可含有碳-碳双键或碳-氮双键，
前述X区域和Y区域经-OR1-或-OR2-各自键合至前述非核苷酸结构，
其中R1和R2可存在或可不存在，且当它们存在时，R1和R2各自独立地为核苷酸残基或所述结构(II)。
前述式(II)中，例如X1和X2各自独立地为H2、O、S或NH。前述式(II)中，“X1为H2”意指X1与同X1结合的碳原子一起形成CH2(亚甲基)。X2同样适用。
前述式(II)中，Y1和Y2各自独立地为单键、CH2、NH、O或S。
前述式(II)中，环A中的l为1或2。当l＝1时，环A为5元环，例如前述吡咯烷骨架。前述吡咯烷骨架为例如脯氨酸骨架或脯氨醇骨架等，并且以其二价结构示出。当l＝2时，环A为6元环，例如前述哌啶骨架。环A中，环A上除C-2以外的一个碳原子可被氮、氧或硫取代。环A中，环A可包含碳-碳双键或碳-氮双键。环A为例如L型或D型。
前述式(II)中，R3为键合至环A上的C-3、C-4、C-5或C-6的氢原子或取代基。当R3为前述取代基时，取代基R3可为一种过多种，或者可不存在。当R3存在多个时，它们可相同或不同。
取代基R3为例如卤素、OH、OR4、NH2、NHR4、NR4R5、SH、SR4和氧代基(＝O)等。
R4和R5例如各自独立地为取代基或保护基，并且可相同或不同。前述取代基的实例包括卤素、烷基、烯基、炔基、卤代烷基、芳基、杂芳基、芳烷基、环烷基、环烯基、、环烷基烷基、环基烷基、羟烷基、烷氧基烷基、氨基烷基、杂环基烯基、杂环基烷基、杂芳烷基、甲硅烷基和甲硅烷氧基烷基等。下文同样适用。取代基R3可选自上述取代基。
前述保护基为使例如高反应性官能团失活的官能团。保护基的实例包括已知的保护基等。关于前述保护基，例如，文献中的记载(J.F.W.McOmie,"Protecting groups inOrganic Chemistry",Plenum Press,London和New York,1973)可包括于此。前述保护基不特别限定，并且其实例包括叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)、双(2-乙酰氧基乙氧基)甲基(ACE)、三异丙基甲硅烷氧基甲基(TOM)、1-(2-氰基乙氧基)乙基(CEE)、2-氰基乙氧基甲基(CEM)、甲苯基磺酰基乙氧基甲基(TEM)和二甲氧基三苯甲基(DMTr)等。当R3为OR4时，前述保护基不特别限定，并且其实例包括TBDMS基团、ACE基团、TOM基团、CEE基团、CEM基团和TEM基团等。保护基的其他实例包括含甲硅烷基的基团。下文同样适用。
前述式(II)中，L1为具有n个原子的亚烷基链。前述亚烷基的一个或多个碳原子上的一个或多个氢原子可被或可不被例如OH、ORa、NH2、NHRa、NRaRb、SH或SRa取代。可选地，L1可为通过用氧原子取代前述亚烷基链上的至少一个碳原子获得的聚醚链。前述聚醚链为例如聚乙二醇。当Y1为NH、O或S时，L1中键合至Y1的原子为碳，L1中键合至OR1的原子为碳，且氧原子彼此不相邻。即，例如当Y1为O时，该氧原子和L1中的氧原子彼此不相邻，OR1中的氧原子和L1中的氧原子彼此不相邻。
前述式(II)中，L2为具有m个原子的亚烷基链。前述亚烷基的一个或多个碳原子上的一个或多个氢原子可被或可不被例如OH、ORc、NH2、NHRc、NRcRd、SH或SRc取代。可选地，L2可为通过用氧原子取代前述亚烷基链上的至少一个碳原子获得的聚醚链。当Y2为NH、O或S时，L2中键合至Y2的原子为碳，L2中键合至OR1的原子为碳，且氧原子彼此不相邻。即，例如当Y2为O时，该氧原子和L2中的氧原子彼此不相邻，OR2中的氧原子和L2中的氧原子彼此不相邻。
L1的n和L2的m不特别限定，例如它们各自的下限可为0，并且其上限不特别限定。例如，n和m可根据前述非核苷酸结构的期望长度而适当设定。例如，从制造成本和产率等观点，n和m各自优选为0至30，更优选0至20，仍更优选0至15。n和m可相同(n＝m)或不同。n+m为例如0至30，优选0至20，更优选0至15。
例如，Ra、Rb、Rc和Rd各自独立地为取代基或保护基。前述取代基和前述保护基的实例与上述相同。
前述式(II)中，氢原子各自独立地可被例如Cl、Br、F和I等卤素取代
前述X区域和前述Y区域经例如-OR1-或-OR2-各自键合至前述非核苷酸结构。这里，R1和R2可存在或可不存在。当R1和R2存在时，R1和R2各自独立地为核苷酸残基或前述式(II)表示的结构。当R1和/或R2为前述核苷酸残基时，前述非核苷酸结构由例如具有前述式(II)的结构的不包括核苷酸残基R1和/或R2的前述非核苷酸残基、和一个或多个前述核苷酸残基形成。当R1和/或R2为由前述式(II)表示的结构时，前述非核苷酸结构为例如两个以上的具有前述式(II)的结构的前述非核苷酸残基相互连接这样的结构。前述式(II)的结构数可为例如1、2、3或4。当前述结构包括多个前述结构时，前述式(II)的结构可例如直接或经前述一个或多个核苷酸残基连接。另一方面，当R1和R2不存在时，前述非核苷酸结构仅由例如具有前述式(II)的结构的前述非核苷酸残基组成。
前述X区域和前述Y区域与-OR1-和-OR2-的结合的组合不特别限定，并且可为例如以下任意条件。
条件(1)：
前述X区域和前述Y区域分别经-OR2-和-OR1-连接至前述式(II)的结构。
条件(2)：
前述X区域和前述Y区域分别经-OR1-和-OR2-连接至前述式(II)的结构。
前述式(II)的结构的实例包括下列式(II-1)至(II-9)的结构。下式中，n和m与前述式(II)中的相同。下式中，q为0-10的整数。
前述式(II-1)至(II-9)中，n、m和q不特别限定，且为如上所述。其具体实例为前述式(II-1)其中n＝8，前述(II-2)其中n＝3，前述式(II-3)其中n＝4或8，前述(II-4)其中n＝7或8，前述式(II-5)其中n＝3和m＝4，前述(II-6)其中n＝8和m＝4，前述式(II-7)其中n＝8和m＝4，前述(II-8)其中n＝5和m＝4，前述式(II-9)其中q＝1和m＝4。前述式(II-4)的一个实施方案(n＝8)示于下式(II-4a)，前述式(II-8)的一个实施方案(n＝5,m＝4)示于下式(II-8a)。
本发明中，术语“烷基”包括例如直链和支化的烷基。前述烷基的碳原子数不特别限定，并为例如1至30，优选1至6，更优选1至4。前述烷基的实例包括：甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、新戊基、正己基、异己基、正庚基、正辛基、正壬基和正癸基等。其中，例如优选甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、新戊基、正己基和异己基等。
本发明中，术语“烯基”包括例如直链或支化的烯基。前述烯基为例如具有一个或多个双键的前述烷基等。前述烯基的碳原子数不特别限定，并例如与前述烷基的碳原子数相同，优选2-8。前述烯基的实例包括乙烯基、1-丙烯基、2-丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、3-丁烯基、1,3-丁二烯基和3-甲基-2-丁烯基等。
本发明中，术语“炔基”包括例如直链或支化的炔基。前述炔基的实例为例如具有一个以上的三键的前述烷基等。前述炔基的碳原子数不特别限定，并例如与前述烷基的碳原子数相同，优选2-8。前述炔基的实例包括乙炔基、丙炔基和丁炔基。前述炔基可进一步包括例如一个以上的双键。
本发明中，术语“芳基”包括例如单环芳族烃基和多环芳族烃基。前述单环芳族烃基的实例包括苯基等。前述多环芳族烃基的实例包括1-萘基、2-萘基、1-蒽基、2-蒽基、9-蒽基、1-菲基、2-菲基、3-菲基、4-菲基和9-菲基等。其中优选，例如苯基，和萘基如1-萘基和2-萘基，等等。
本发明中，术语“杂芳基”包括例如单环芳族杂环基和稠合芳族杂环基。前述杂芳基的实例包括呋喃基(如2-呋喃基、3-呋喃基)、噻吩基(如2-噻吩基、3-噻吩基)、吡咯基(如1-吡咯基、2-吡咯基、3-吡咯基)、咪唑基(如1-咪唑基、2-咪唑基、4-咪唑基)、吡唑基(如1-吡唑基、3-吡唑基、4-吡唑基)、三唑基(如1,2,4-三唑-1-基、1,2,4-三唑-3-基、1,2,4-三唑-4-基)、四唑基(如1-四唑基、2-四唑基、5-四唑基)、噁唑基(如2-噁唑基、4-噁唑基、5-噁唑基)、异噁唑基(如3-异噁唑基、4-异噁唑基、5-异噁唑基)、噻唑基(如2-噻唑基、4-噻唑基、5-噻唑基)、噻二唑基、异噻唑基(如3-异噻唑基、4-异噻唑基、5-异噻唑基)、吡啶基(如2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基)、哒嗪基(如3-哒嗪基、4-哒嗪基)、嘧啶基(如2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-嘧啶基)、呋咕基(furazanyl)(如3-呋咕基)、吡嗪基(如2-吡嗪基)、噁二唑基(如1,3,4-噁二唑-2-基)、苯并呋喃基(如2-苯并[b]呋喃基、3-苯并[b]呋喃基、4-苯并[b]呋喃基、5-苯并[b]呋喃基、6-苯并[b]呋喃基、7-苯并[b]呋喃基)、苯并噻吩基(如2-苯并[b]噻吩基、3-苯并[b]噻吩基、4-苯并[b]噻吩基、5-苯并[b]噻吩基、6-苯并[b]噻吩基、7-苯并[b]噻吩基)、苯并咪唑基(如1-苯并咪唑基、2-苯并咪唑基、4-苯并咪唑基、5-苯并咪唑基)、二苯并呋喃基、苯并噁唑基、苯并噻唑基、喹喔啉基(如2-喹喔啉基、5-喹喔啉基、6-喹喔啉基)、噌啉基(如3-噌啉基、4-噌啉基、5-噌啉基、6-噌啉基、7-噌啉基、8-噌啉基)、喹唑啉基(如2-喹唑啉基、4-喹唑啉基、5-喹唑啉基、6-喹唑啉基、7-喹唑啉基、8-喹唑啉基)、喹啉基(如2-喹啉基、3-喹啉基、4-喹啉基、5-喹啉基、6-喹啉基、7-喹啉基、8-喹啉基)、酞嗪基(如1-酞嗪基、5-酞嗪基、6-酞嗪基)、异喹啉基(如1-异喹啉基、3-异喹啉基、4-异喹啉基、5-异喹啉基、6-异喹啉基、7-异喹啉基、8-异喹啉基)、嘌呤基、蝶啶基(如2-蝶啶基、4-蝶啶基、6-蝶啶基、7-蝶啶基)、咔唑基、菲啶基、吖啶基(如1-吖啶基、2-吖啶基、3-吖啶基、4-吖啶基、9-吖啶基)、吲哚基(如1-吲哚基、2-吲哚基、3-吲哚基、4-吲哚基、5-吲哚基、6-吲哚基、7-吲哚基)、异吲哚基、吩嗪基(如1-吩嗪基、2-吩嗪基)和吩噻嗪基(如1-吩噻嗪基、2-吩噻嗪基、3-吩噻嗪基、4-吩噻嗪基)等。
本发明中，例如术语“环烷基”为例如环状饱和烃基，且环烷基中的碳原子数为例如3-15，前述环烷基的实例包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基、桥接环烃基和螺烃基等。其中，优选环丙基、环丁基、环戊基、环己基和桥接环烃基等。
本发明中，“桥接环烃基”的实例包括二环[2.1.0]戊基、二环[2.2.1]庚基、二环[2.2.2]辛基和二环[3.2.1]辛基、三环[2.2.1.0]庚基、二环[3.3.1]壬烷、1-金刚烷基和2-金刚烷基等。
本发明中，“螺烃基”的实例包括螺[3.4]辛基等。
本发明中，术语“环烯基”包括例如环状不饱和脂族烃基，碳原子数为例如3-7。前述环烯基的实例包括环丙烯基、环丁烯基、环戊烯基、环己烯基和环庚烯基等。其中，优选环丙烯基、环丁烯基、环戊烯基和环己烯基等。前述术语“环烯基”包括例如在环中具有不饱和键的桥接环烃基和螺烃基。
本发明中，“芳烷基”包括苯甲基、2-苯乙基和萘甲基等。“环烷基烷基”和“环基烷基”的实例包括环己基甲基和金刚烷基甲基等。“羟烷基”包括羟甲基和2-羟乙基等。
本发明中，“烷氧基”包括例如任何前述烷基和氧组成的基团(烷基-O-基团)，并且其实例包括甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基和正丁氧基等。“烷氧基烷基”的实例包括甲氧基甲基等。“氨烷基”的实例包括2-氨基乙基等。
本发明中，“杂环基”的实例包括1-吡咯啉基、2-吡咯啉基、3-吡咯啉基、1-吡咯烷基、2-吡咯烷基、3-吡咯烷基、吡咯烷酮、1-咪唑啉基、2-咪唑啉基、4-咪唑啉基、1-咪唑烷基、2-咪唑烷基、4-咪唑烷基、咪唑烷酮、1-吡唑啉基、3-吡唑啉基、4-吡唑啉基、1-吡唑烷基、3-吡唑烷基、4-吡唑烷基、哌啶酮、哌啶子基(piperidino)、2-哌啶基、3-哌啶基、4-哌啶基、1-哌嗪基、2-哌嗪基、哌嗪酮、2-吗啉基、3-吗啉基、吗啉代、四氢吡喃基和四氢呋喃基等。
本发明中，“杂环基烷基”的实例包括哌啶基甲基和哌嗪基甲基等。“杂环基烯基”的实例包括2-哌啶基乙烯基等。“杂芳烷基”的实例包括吡啶基甲基和喹啉-3-基甲基等。
本发明中，术语“甲硅烷基”包括由化学式R3Si-表示的基团，其中R可独立地选自前述烷基、芳基和环烷基。甲硅烷基的实例包括三甲基甲硅烷基和叔丁基二甲基甲硅烷基等。“甲硅烷氧基”的实例包括三甲基甲硅烷氧基等。“甲硅烷氧基烷基”的实例包括三甲基甲硅烷氧基甲基等。
本发明中，“亚烷基”的实例包括亚甲基、亚乙基和亚丙基等。
本发明中，上述各种基团可被取代。前述取代基的实例包括羟基、羧基、磺基、卤素、卤化烷基(卤代烷基，如CF3、CH2CF3、CH2CCl3)、硝基、亚硝基、氰基、烷基(如甲基、乙基、异丙基、叔丁基)、烯基(如乙烯基)、炔基(如乙炔基)、环烷基(如环丙基、金刚烷基)、环烷基烷基(如环己基甲基、金刚烷基甲基)、环烯基(如环丙烯基)、环基烷基、羟烷基(如羟甲基、羟乙基)、烷氧基烷基(如甲氧基甲基、乙氧基甲基、乙氧基乙基)、芳基(如苯基、萘基)、芳烷基(如苯甲基、苯乙基)、烷芳基(如对甲苯基)、杂芳基(如吡啶基、呋喃基)、杂芳烷基(如吡啶基甲基)、杂环基(如哌啶基)、杂环基烯基、杂环基烷基(如吗啉基甲基)、烷氧基(如甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基)、卤化烷氧基(如OCF3)、烯氧基(如乙烯基氧基、烯丙基氧基)、芳氧基(如苯氧基)、烷氧基羰基(如甲氧基羰基、乙氧基羰基、叔丁氧基羰基)、芳烷氧基(如苯甲基氧基)、氨基[烷基氨基(如甲基氨基、乙基氨基、二甲基氨基)、酰基氨基(如乙酰基氨基、苯甲酰基氨基)、芳烷基氨基(如苯甲基氨基、三苯甲基氨基)、羟基氨基]、氨烷基(如氨基甲基)、烷基氨烷基(如二乙基氨基甲基)、氨基甲酰基、氨磺酰基、氧代基、甲硅烷基和甲硅烷氧基烷基等。
本发明的人工匹配型miRNA可包括例如标记物质，并可由前述标记物质标记。前述标记物质不特别限定，并可为例如荧光物质、染料或同位素等。前述标记物质的实例包括：荧光团如芘、TAMRA、荧光素、Cy3染料和Cy5染料等。前述染料的实例包括Alexa染料如Alexa488等。前述同位素的实例包括稳定同位素和放射性同位素。其中，优选稳定同位素。此外，例如前述稳定同位素不改变由其标记的化合物的物理性质并且因而具有作为示踪物的优良性质。前述稳定同位素不特别限定，其实例包括2H、13C、15N、17O、18O、33S、34S和36S。
如上所述，本发明的人工匹配型miRNA可抑制前述的靶基因表达。因此，本发明的人工匹配型miRNA可用作例如治疗由基因引起的疾病的治疗剂。当本发明的人工匹配型miRNA具有抑制引起前述疾病的基因的表达的成熟miRNA的引导链序列时，例如可通过抑制前述靶基因的表达来治疗前述疾病。本发明中，术语“治疗”包括例如前述疾病的预防；疾病的改善；和预后的改善，并且其可意指其中的任何一种。前述疾病不特别限定，例如抑制表达的前述序列可根据目的疾病而适当设定。前述疾病的实例包括癌症如乳腺癌、肺癌、结直肠癌、肝癌、胰腺癌、食管癌、前列腺癌、胆囊癌、子宫体癌、子宫颈癌、卵巢癌、骨肉瘤和白血病等，以及疾病如肺纤维化和肝纤维化等。
使用本发明人工匹配型miRNA的方法不特别限定。例如，前述人工匹配型miRNA可投与至具有前述靶基因的对象。
前述对象的实例包括细胞、组织和器官。前述对象的实例还包括人，非人动物如除人以外的非人哺乳动物。前述投与可例如在体内或体外进行。前述细胞不特别限定，且其实例包括：各种培养细胞如HeLa细胞、293细胞、NIH3T3细胞和COS细胞等；干细胞如ES细胞和造血干细胞等；和从生物体分离的细胞如原代培养细胞等。
本发明中，表达将被抑制的前述靶基因不特别限定，且可将任何期望的基因设为靶基因。如上所述，前述成熟miRNA可根据前述靶基因的种类而选择。
关于本发明的人工匹配型miRNA的使用，可参考下面关于后述根据本发明的组合物、表达抑制方法和治疗方法等的记载。
由于本发明的人工匹配型miRNA可如上所述抑制靶基因的表达，例如其作为药用产品，诊断剂，农药，和进行对农药、医学、生命科学等的研究的工具。
本发明的人工匹配型miRNA的合成方法不特别限定，并可采用常规已知的核酸生产方法。前述合成方法的实例包括根据基因工程方法的合成法和化学合成法等。基因工程方法的实例包括：利用体外转录的合成法；使用载体的方法；使用PCR盒进行的方法等。前述载体不特别限定，其实例包括如质粒等非病毒载体、以及病毒载体等。前述化学合成法不特别限定，其实例包括亚磷酰胺法和H-膦酸酯法等。前述化学合成法可例如使用商购可得的自动核酸合成仪来进行。在前述化学合成法中，通常使用使用亚酰胺(amidite)。前述亚酰胺不特别限定。商购可得的亚酰胺的实例包括RNA亚磷酰胺(2’-O-TBDMSi，商品名，Samchully Pharm Co.,Ltd.)、ACE亚酰胺、TOM亚酰胺、CEE亚酰胺、CEM亚酰胺和TEM亚酰胺等。
(2)组合物
根据本发明的表达抑制组合物如上所述为抑制靶基因表达的组合物，其典型地包含前述本发明的人工匹配型miRNA。本发明的组合物的特征在于包含前述本发明的人工匹配型miRNA，并且决不限制其他构成。本发明的表达抑制用组合物还称作例如表达抑制用试剂。
根据本发明，例如通过投与至其中存在前述靶基因的对象，可抑制前述靶基因的表达。
此外，如上所述，根据本发明的药学组合物典型地包含前述本发明的人工匹配型miRNA。本发明的组合物的特征在于包含前述本发明的人工匹配型miRNA，并且决不限制其他构成。本发明的药学组合物还称作例如医药品。
根据本发明，例如向患有由基因引起的疾病的患者的投与可抑制前述基因的表达，从而治疗前述疾病。本发明中，术语“治疗”包括如上所述的例如前述疾病的预防；疾病的改善；和预后的改善，并可意指其中的任何一种。
本发明中，要治疗的疾病不特别限定，且其实例包括由基因表达引起的疾病。根据前述疾病的种类，引起疾病的基因可设定为前述靶基因，另外，根据前述靶基因，可选择前述成熟miRNA的前述引导链序列。
使用根据本发明的表达抑制用组合物和药学组合物的方法(下文中，两种组合物简称为“组合物”)不特别限定，且其实例包括将前述人工匹配型miRNA投与至具有前述靶基因的对象。
前述对象的实例包括细胞、组织和器官。前述对象的实例还包括人，非人动物如除人以外的非人哺乳动物。前述投与可例如在体内或体外进行。前述细胞不特别限定，且其实例包括：各种培养细胞如HeLa细胞、293细胞、NIH3T3细胞和COS细胞等；干细胞如ES细胞和造血干细胞等；和从生物体分离的细胞如原代培养细胞等。
前述投与方法不特别限定，并且可例如根据对象适当确定。当前述对象为培养细胞时，投与方法可为例如使用转染试剂或电穿孔等的方法。
例如，本发明各组合物可仅包含本发明的人工匹配型miRNA或另外可包含除人工匹配型miRNA以外的添加剂。前述添加剂不特别限定，且优选例如药学可接受添加剂。前述添加剂的种类不特别限定，且可根据例如对象种类而适当选择。
本发明的组合物中，例如前述人工匹配型miRNA可与前述添加剂形成复合体。前述添加剂还可称作例如复合化剂。前述复合体形成使得例如前述人工匹配型miRNA被有效递送。
前述复合化剂不特别限定，且其实例包括聚合物、环糊精和金刚烷胺(adamantine)等。前述环糊精的实例包括线性环糊精共聚物和线性氧化环糊精共聚物等。
前述添加剂的其它实例包括载体、与靶细胞结合的结合物质、缩合剂、融合剂和赋形剂等。
(3)表达抑制方法
根据本发明的表达抑制方法如上所述为抑制靶基因表达的方法，其中典型地使用了前述本发明的人工匹配型miRNA。本发明的表达抑制方法的特征在于其中使用前述本发明的人工匹配型miRNA，并且决不限制其它步骤和条件。
本发明的表达抑制方法中，前述基因表达受到抑制的机理不特别限定，其实例包括通过成熟miRNA的表达抑制。
本发明的表达抑制方法包括例如将前述人工匹配型miRNA投与至其中存在前述靶基因的对象的步骤。通过前述投与步骤，例如将前述人工匹配型miRNA与前述对象相接触。前述对象的实例包括细胞、组织和器官。前述对象的实例还包括人，非人动物如除人以外的非人哺乳动物。前述投与可例如在体内或体外进行。
在本发明的表达抑制方法中，例如可单独投与前述人工匹配型miRNA，或可投与包含前述人工匹配型miRNA的前述本发明的组合物。前述投与方法不特别限定，例如可根据对象的种类而适当选择。
(4)治疗方法
如上所述，根据本发明的疾病的治疗方法包括将前述本发明的人工匹配型miRNA投与至患者的步骤，其特征在于前述人工匹配型miRNA的前述引导链序列为抑制引起前述疾病的基因表达的成熟miRNA的引导链序列。本发明的治疗方法的特征在于使用前述本发明的人工匹配型miRNA，并且决不限制其它步骤和条件。
前述本发明的表达抑制方法还适用于例如本发明的治疗方法。前述投与方法不特别限定，并可为例如任何经口投与和肠胃外投与。
(5)人工匹配型miRNA的使用
根据本发明的使用是前述本发明的人工匹配型miRNA用于前述靶基因的表达抑制的使用。
根据本发明的单链核酸为用于疾病治疗的单链核酸。前述单链核酸为前述本发明的人工匹配型miRNA，且其特征在于前述人工匹配型miRNA中的前述引导链序列为抑制引起前述疾病的基因表达的成熟miRNA的引导链序列。
下文中，将参考实施例等详细描述本发明，然而要注意的是本发明绝对不限于此。
实施例
(实施例1)
本发明的人工匹配型miRNA基于成熟miR-34a的引导链来合成，并且确认H1299细胞的生长抑制。
(1)miRNA的合成
作为阳性对照的miRNA，合成由下示引导链(SEQ ID NO:1)和随从链(SEQ ID NO:6)组成的人成熟miR-34a。作为阴性对照，合成由乱序(scramble)的引导链(SEQ ID NO:7)(其中打乱了前述引导链的碱基组成)和相应的随从链(SEQ ID NO:8)组成的乱序的成熟miR-34a。
作为本实施例的人工匹配型miRNA，合成匹配型miR-34a，其中由前述引导链(SEQID NO:1)和附加序列组成的X区域、和由于前述X区域完全互补的序列和突出端组成的Y区域经下式的脯氨酸衍生物的非核苷酸结构(序列中由[P]表示)连接。下记序列中，下划线部分对应于前述引导链。前述匹配型miRNA中的前述非核苷酸结构由下式示出并在前述匹配型miRNA的合成中使用L-脯氨酰二酰胺亚酰胺(L-prolinediamideamidite)(参见WO2012/017919)导入。另外，作为人工匹配型miRNA的阴性对照，合成由前述引导链(打乱了引导链的碱基组成)和与之对应的随从链组成的乱序的匹配型miR-34a。
以下示出这些miRNA的序列和结构。下文中，由下划线部分示出的序列对应于引导链。
成熟miR-34a
引导链(SEQ ID NO:1)
5’-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU-3’
随从链(SEQ ID NO:6)
5’-CAAUCAGCAAGUAUACUGCCCU-3’
乱序的成熟miR-34a
引导链(SEQ ID NO:7)
5’-UGUAUCGUUAUCGGGUCGGUUG-3’
随从链(SEQ ID NO:8)
5’-CAACCGACCCGAUAACGAUACA-3’
匹配型miR-34a(SEQ ID NO:9)
5’-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGUUCC-[P]-GGAACAACCAGCUAAGACACUGCCAUA-3’
乱序的匹配型miR-34a(SEQ ID NO:10)
5’-UGUAUCGUUAUCGGGUCGGUUGUCC-[P]-GGACAACCGACCCGAUAACGAUACAUA-3’
成熟miR-34a
匹配型miR-34a
(2)人工匹配型miRNA对肺癌来源的细胞的影响
将前述人工匹配型miRNA引入人非小细胞性肺癌细胞系(NCI-H1299)并确认对前述细胞的影响。
(2-1)转染
将前述miRNA溶解在注射用蒸馏水(Otsuka Pharmaceutical Co.,Ltd.，下文相同)中来制备100μmol/L的miRNA溶液。作为培养基，使用含10％FBS的RPMI-培养基1640(Invitrogen)。培养条件设为37℃，5％CO2。
首先，将细胞在前述培养基中培养，并将培养液分配至24孔板以使各孔含有500μL培养液来实现1×104个细胞/孔的密度。细胞在前述孔中培养24小时。用前述miRNA使用转染试剂RNAi MAX转染试剂(商品名，Life Technologies)根据所附步骤转染细胞。通过如下设定每孔的组成来进行转染。在下述组成中，(B)为Opti-MEM(商品名，LifeTechnologies)，(C)为前述RNA溶液，其总计添加了49μL。前述孔中前述miRNA的终浓度设为100nmol/L。转染后，培养前述孔中的细胞3天。前述培养3天后，如下所示确认培养细胞。
表1
(每孔的组成：μL)
(2-2)细胞数的计数
培养细胞的每孔细胞数在培养后计数。结果示于图2。图2为示出每孔细胞数的图。图2中，“正常”表示未处理细胞的结果，“空白对照(mock)”表示单独引入转染试剂的细胞，“乱序”表示乱序的miR-34a作为阴性对照，“miR-34a”表示成熟miR-34a作为阳性对照，“乱序匹配”表示乱序的匹配型miR-34a作为阴性对照，和“miR-34a匹配”表示实施例的匹配型miR-34a(下文相同)。如图2所示，实施例的匹配型miR-34a能够将细胞数降低到与阳性对照成熟miR-34a相同的水平。
(2-3)MTT试验
培养后，培养细胞通过商购可得的试剂盒(商品名Cell Count Reagent SF,Nacalai Tesque)进行MTT试验，并评价细胞增殖。细胞增殖的评价基于为1的正常(无处理)的结果以相对值示出。结果示于图3。图3为示出细胞增殖的相对值的图。如图3所示，实施例的匹配型miR-34a能够将细胞数降低到与阳性对照成熟miR-34a相同的水平。
(2-4)凋亡
培养后，培养细胞通过使用商购可得的试剂盒(商品名Annexin V:PE ApoptosisDetection Kit,BD Biosciences)进行凋亡检测。结果示于图4。图4为示出早期凋亡(％)和后期凋亡(％)的图。如图4所示，实施例的匹配型miR-34a能够促进凋亡至与阳性对照成熟miR-34a相同的水平。
(2-5)mRNA的表达抑制
通过使用ISOGEN试剂(商品名NIPPON GENE)根据所附步骤从培养后的培养细胞回收RNA。
接着，根据所附步骤使用逆转录酶(商品名M-MLV逆转录酶，Invitrogen)由前述RNA合成cDNA。使用前述合成的cDNA作为模板进行定量PCR，测量AXL cDNA和MET cDNA的量。其cDNA量还使用GAPDH cDNA作为内部对照来测量。
在前述定量PCR中，FastStart Universal SYBR Green Master(商品名，Roche)用作试剂，MX3000P(商品名，Stratagene)用作热循环仪，MxPro(商品名，Stratagene)用作分析仪器(下文相同)。对于前述AXL cDNA、前述MET cDNA和前述GAPDH cDNA的扩增，使用下述引物对。反应混合物的总量为25μL，测量每个进行3次。
AXL引物对
5’-CTCAACCAGGACGACTCCAT-3’(SEQ ID NO:11)
5’-AGACCGCTTCACTCAGGAAA-3’(SEQ ID NO:12)
MET引物对
5’-CAGGCAGTGCAGCATGTAGT-3’(SEQ ID NO:13)
5’-TGTCCAACAAAGTCCCATGA-3’(SEQ ID NO:14)
GAPDH引物对
5’-ATGGGGAAGGTGAAGGTCG-3’(SEQ ID NO:15)
5’-GGGTCATTGATGGCAACAATATC-3’(SEQ ID NO:16)
当miRNA未添加的对照中AXL mRNA或MET mRNA为1时，计算各转染细胞中AXL mRNA和MET mRNA的相对值。其结果示于图5。图5(A)示出AXL mRNA的结果，图5(B)示出MET mRNA的结果。
如图5所示，实施例的匹配型miR-34a将AXL mRNA的量和MET mRNA的量降低到与阳性对照成熟miR-34a相同的水平。因此，可以说由AXL mRNA和MET mRNA编码的蛋白质的翻译受到前述人工匹配型miRNA的抑制。
从这些结果发现，实施例的匹配型miR-34a可抑制AXL mRNA和MET mRNA等的表达，并且能够抑制H1299细胞的生长并促进凋亡。
不同于双链成熟miR-34a，由于前述人工匹配型miRNA为单链核酸分子，因此其在使用时不需要各单链的退火并可避免被参与天然免疫的TLR3等识别。
(实施例2)
在实施例1的匹配型miR-34a中，缩短X区域的附加序列和Y区域的突出端。
(1)miRNA的合成
如下所示，匹配型miR-34a具有在X区域3’侧的以矩形包围的3碱基长的附加序列(J)，和在Y区域5’侧的以矩形包围的2碱基长的突出端(O)。因此，合成其中前述附加序列从3’侧删除1碱基且与之对应的在Y区域侧的序列从5’侧删除1碱基的分子；其中突出端从3’侧删除1碱基的分子；和其中前述附加序列和突出端删除1碱基的分子，并以与前述实施例1相同的方式确认AXL mRNA和MET mRNA的表达抑制。下列序列中，[P]的5’侧区域为X区域；前述X区域中，下划线部分为前述引导链序列，余下为前述附加序列，[P]的3’侧为Y区域；前述Y区域中，以矩形包围的区域为突出端。
匹配型miR-34a
匹配型miR-34a
○2J3(SEQ ID NO：9)
5’-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGUUCC-[P]-GGAACAACCAGCUAAGACACUGCCA
-3’
○2J2(SEQ ID NO：17)
5’-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGUUC-[P]-GAACAACCAGCUAAGACACUGCCA
-3’
○2J1(SEQ ID NO：18)
5’-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGUU-[P]-AACAACCAGCUAAGACACUGCCA
-3’
○2JO(SEQ ID NO：19)
5’-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU-[P]-ACAACCAGCUAAGACACUGCCA
-3’
○1J3(SEQ ID NO：20)
5’-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGUUCC-[P]-GGAACAACCAGCUAAGACACUGCCA
-3’
○1J2(SEQ ID NO：21)
5’-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGUUC-[P]-GAACAACCAGCUAAGACACUGCCA
-3’
○1J1(SEQ ID NO：22)
5’-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGUU-[P]-AACAACCAGCUAAGACACUGCCA
-3’
○1JO(SEQ ID NO：23)
5’-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU-[P]-ACAACCAGCUAAGACACUGCCA
-3’
○OJ3(SEQ ID NO：24)
5’-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGUUCC-[P]-GGAACAACCAGCUAAGACACUGCCA-3’
○OJ2(SEQ ID NO：25)
5’-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGUUC-[P]-GAACAACCAGCUAAGACACUGCCA-3’
○OJ1(SEQ ID NO：26)
5’-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGUU-[P]-AACAACCAGCUAAGACACUGCCA-3’
○OJO(SEQ ID NO：27)
5’-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU-[P]-ACAACCAGCUAAGACACUGCCA-3’
结果示于图6和图7。图6示出AXL mRNA的结果，图7示出MET mRNA的结果。如图6和图7所示，表达抑制效果即使在前述X区域的附加序列和前述Y区域的突出端缩短时也得以维持。
(实施例3)
在匹配型miR-34a中，改变连接子的非核苷酸结构、并增加或减少X区域的附加序列，并检测对AXL mRNA和MET RNA的表达的抑制效果。
(1)miRNA的合成
如下所示，合成匹配型miR-34a(PH-0039)，其中从实施例1的匹配型miR-34a改变突出端区域的碱基序列。此外，合成其中PH-0039的附加序列和与之对应在Y区域侧的序列被删除的分子(PH-0037)，和其中附加序列和与之对应的在Y区域侧的序列延长至5碱基长的分子(PH-0093)。
另外，合成其中PH-0037、PH-0039和PH-0093的连接子区域被下式的对苯二甲酸衍生物中的非核苷酸结构(序列中由[TP]表示)取代的分子(分别为XH-0016、XH-0025和XH-0027)。非核苷酸结构通过使用对苯二甲酸亚酰胺导入(参见WO 2013/133221)。
合成其中PH-0037和PH-0039的连接子区域被下式的甘氨酸衍生物中的非核苷酸结构(序列中由[Gly]表示)取代的分子(分别为XH-0012和XH-0028)，
合成其中PH-0037和PH-0039的连接子区域被下式的甘氨酰甘氨酸(glycylglycine)衍生物中的非核苷酸结构(序列中由[GlyGly]表示)取代的分子(分别为XH-0014和XH-0029)，
前述化学式(G2)中的GlyGly为由下列化学式(GlyGly)表示的原子团，其中末端羰基碳键合至上述化学式(G2)中的N原子，且下列化学式(GlyGly)中的末端氮原子键合至上述化学式(G2)中的羰基碳。
(GlyGly)
-HN-CH2-CO-HN-CH2-CO-
另外，合成其中PH-0037和PH-0039的连接子区域被下式的赖氨酸衍生物中的非核苷酸结构(序列中由[K]表示)取代的分子(分别为KH-0007和KH-0011)。
前述甘氨酸衍生物的非核苷酸结构通过使用甘氨酸酰胺亚酰胺(参见WO 2013/103146)导入，前述甘氨酰甘氨酸衍生物的非核苷酸结构通过使用甘氨酰甘氨酸酰胺亚酰胺(参见WO 2013/133221)导入，赖氨酸衍生物的非核苷酸结构通过使用L-赖氨酸酰胺亚酰胺(参见WO 2013/103146)导入。
以下序列中，各连接子的5’侧区域为X区域；前述X区域中，下划线部分为前述引导链序列，余下为前述附加序列，各连接子的3’侧区域为Y区域。PH-0037(SEQ ID NO:28)
5’-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU-[P]-ACAACCAGCUAAGACACUGCCACU-3’
PH-0039(SEQ ID NO:29)
5’-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGUUCC-[P]-GGAACAACCAGCUAAGACACUGCCACU-3’
PH-0093(SEQ ID NO:30)
5’-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGUUCCGG-[P]-CCGGAACAACCAGCUAAGACACUGCCACU-3’
XH-0016(SEQ ID NO:28)
5’-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU-[TP]-ACAACCAGCUAAGACACUGCCACU-3’
XH-0025(SEQ ID NO:29)
5’-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGUUCC-[TP]-GGAACAACCAGCUAAGACACUGCCACU-3’
XH-0027(SEQ ID NO:30)
5’-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGUUCCGG-[TP]-CCGGAACAACCAGCUAAGACACUGCCACU-3’
XH-0012(SEQ ID NO:28)
5’-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU-[Gly]-ACAACCAGCUAAGACACUGCCACU-3’
XH-0028(SEQ ID NO:29)
5’-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGUUCC-[Gly]-GGAACAACCAGCUAAGACACUGCCACU-3’
XH-0014(SEQ ID NO:28)
5’-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU-[GlyGly]-ACAACCAGCUAAGACACUGCCACU-3’
XH-0029(SEQ ID NO:29)
5’-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGUUCC-[GlyGly]-GGAACAACCAGCUAAGACACUGCCACU-3’
KH-0007(SEQ ID NO:28)
5’-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU-[K]-ACAACCAGCUAAGACACUGCCACU-3’
KH-0011(SEQ ID NO:29)
5’-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGUUCC-[K]-GGAACAACCAGCUAAGACACUGCCACU-3’
作为阴性对照，合成匹配型miRNA(PH-0000)，其包括由与核酸数据库中记录的所有序列均无互补性的序列组成的引导链和与之对应的随从链。PH-0000(SEQ ID NO:31)
5’-UACUAUUCGACACGCGAAGUUCC-[P]-GGAACUUCGCGUGUCGAAUAGUAUU-3’
作为阳性对照，合成其中成熟miR-34a的引导链和随从链经天然型miRNA前体(pre-miRNA)的环部分连接的分子(NM-0004)，和其中成熟miRNA的引导链和与之完全互补的序列退火的双链匹配型RNA(NI-0209)。
NM-0004(64mer)
NI-0209(22/22mer)
NM-0004(SEQ ID NO:32)
5’-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGUUGUGAGCAAUAGUAAGGAAGCAAUCAGCAAGUAUACUGCCCU-3’
NI-0209
引导链(SEQ ID NO:1)/随从链(SEQ ID NO:33)
5’-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU-3’/5’-AACCAGCUAAGACACUGCCACU-3’
(2)AXL基因的表达水平的测量
前述RNA各自以4μmol/L溶解在注射用蒸馏水(Otsuka Pharmaceutical Co.,Ltd.)中，从而制备RNA溶液。
H1299细胞(ATCC)用作细胞。作为培养基，使用含10％FBS的RPMI培养基1640(LifeTechnologies)。培养条件设为37℃，5％CO2。
首先，将细胞在前述培养基中培养，并将培养液分配至24孔板以使各孔含有400μL培养液来实现4×104个细胞/孔的密度。用前述miRNA使用转染试剂脂质体(Lipofectamine)RNAi MAX(商品名，Life Technologies)根据前述转染试剂所附步骤转染细胞。具体地，通过如下设定每孔的组成来进行转染。在下述组成中，(B)为Opti-MEM(LifeTechnologies)，(C)为前述4μmol/L的RNA溶液，其总计添加了98.5μL。前述孔中前述miRNA的终浓度设为2nmol/L。
表2
(每孔的组成：μL)
转染后，细胞在前述孔中培养24小时，接着使用RNeasy迷你试剂盒(Qiagen,Netherlands)根据其中所附步骤收集RNA。随后，通过使用转录子第一链cDNA合成试剂盒(Roche)根据其中所附步骤由前述RNA合成cDNA。接着，如下所示，使用前述合成的cDNA作为模板进行PCR，并测量AXL和MET基因的表达水平以及作为内标的GAPDH基因的表达水平。前述AXL和MET基因的表达水平参考上述GAPDH基因的表达水平来标准化。
使用LightCycler 480 SYBR Green I Master(商品名，Roche)作为试剂和LightCycler 480Instrument II(商品名，Roche)作为仪器进行前述PCR(下文相同)。前述AXL、MET和GAPDH基因分别使用下列引物对扩增。
AXL基因用PCR引物对
(SEQ ID NO:11)5’-CTCAACCAGGACGACTCCAT-3’
(SEQ ID NO:12)5’-AGACCGCTTCACTCAGGAAA-3’
MET基因用PCR引物对
(SEQ ID NO:13)5’-CAGGCAGTGCAGCATGTAGT-3’
(SEQ ID NO:14)5’-TGTCCAACAAAGTCCCATGA-3’
GAPDH基因用引物对
(SEQ ID NO:15)5’-ATGGGGAAGGTGAAGGTCG-3’
(SEQ ID NO:16)5’-GGGTCATTGATGGCAACAATATC-3’
作为对照1，关于100μL的前述溶液(B)单独添加至前述培养液的细胞，也测量基因的表达水平(-)。此外，作为对照2，关于进行与上述相同的转染步骤但不添加前述RNA溶液且添加前述(B)和1.5μL前述(A)以使(A)和(B)的总量将为100μL的细胞，也测量基因的表达水平(空白对照)。
对于标准化的AXL和MET基因的表达水平，基于对照(空白对照)的细胞中的表达水平为1来确定导入有各RNA的细胞中表达水平的相对值。
(3)结果
如图8和9所示，AXL mRNA和MET RNA的表达抑制效果即使在连接子区域的非核苷酸结构改变、或X区域的附加序列删除或延长时也得以维持。
(实施例4)
基于成熟let-7a的引导链合成本发明的各种人工匹配型miRNA，并检测对靶基因HMGA2 mRNA的表达的抑制效果。
(1)miRNA的合成
作为阳性对照，合成其中成熟let-7a的引导链(SEQ ID NO:2)和随从链(SEQ IDNO:34)经天然型pre-let-7a的环部分连接的分子(NM-0003)，以及其中成熟let-7a的引导链和与之完全互补的序列退火的双链匹配型RNA(NI-0207)。
NM-0003(72mer)
NI-0207(22/22mer)
在以下序列中，下划线部分表示前述引导链序列。
NM-0003(SEQ ID NO:35)
5’-UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUUUUAGGGUCACACCCACCACUGGGAGAUAACUAUACAAUCUACUGUCUUUC-3’
NI-0207
引导链(SEQ ID NO:2)/随从链(SEQ ID NO:34)
5’-UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU-3’/5’-CUAUACAACCUACUACCUCAUC-3’
如下所示，合成各种人工匹配型let-7a，其中与实施例3同样的，将脯氨酸衍生物([P])、对苯二甲酸衍生物([TP])、甘氨酸衍生物([Gly])、甘氨酰甘氨酸衍生物([GlyGly])和赖氨酸衍生物([K])的连接子引入到3’侧包括成熟let-7a的引导链序列和附加序列(0、3或5个碱基长)的X区域、和与X区域完全互补并在5’侧具有2碱基长的突出端的Y区域之间。
在以下序列中，各连接子的5’侧区域为X区域；前述X区域中，下划线部分为前述引导链序列，余下为前述附加序列，各连接子的3’侧区域为Y区域。
PH-0013(SEQ ID NO:36)
5’-UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU-[P]-AACUAUACAACCUACUACCUCAUC-3’
PH-0015(SEQ ID NO:37)
5’-UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUUUCC-[P]-GGAAACUAUACAACCUACUACCUCAUC-3’
PH-0094(SEQ ID NO:38)
5’-UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUUUCCGG-[P]-CCGGAAACUAUACAACCUACUACCUCAUC-3’
XH-0010(SEQ ID NO:36)
5’-UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU-[TP]-AACUAUACAACCUACUACCUCAUC-3’
XH-0030(SEQ ID NO:37)
5’-UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUUUCC-[TP]-GGAAACUAUACAACCUACUACCUCAUC-3’
XH-0031(SEQ ID NO:38)
5’-UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUUUCCGG-[TP]-CCGGAAACUAUACAACCUACUACCUCAUC-3’
XH-0008(SEQ ID NO:36)
5’-UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU-[Gly]-AACUAUACAACCUACUACCUCAUC-3’
XH-0032(SEQ ID NO:37)
5’-UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUUUCC-[Gly]-GGAAACUAUACAACCUACUACCUCAUC-3’
XH-0009(SEQ ID NO:36)
5’-UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU-[GlyGly]-AACUAUACAACCUACUACCUCAUC-3’
XH-0033(SEQ ID NO:37)
5’-UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUUUCC-[GlyGly]-GGAAACUAUACAACCUACUACCUCAUC-3’
KH-0005(SEQ ID NO:36)
5’-UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU-[K]-AACUAUACAACCUACUACCUCAUC-3’
KH-0012(SEQ ID NO:37)
5’-UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUUUCC-[K]-GGAAACUAUACAACCUACUACCUCAUC-3’
作为阴性对照，使用实施例3中合成的PH-0000。
(2)HMGA2基因的表达水平的测量
前述RNA各自以0.4μmol/L溶解在注射用蒸馏水(Otsuka Pharmaceutical Co.,Ltd.)中，从而制备RNA溶液。
A549细胞(DS Pharma Biomedical Co.,Ltd.)用作细胞。使用含10％FBS的DMEM(Life Technologies)作为培养基。培养条件设为37℃，5％CO2。
首先，将细胞在前述培养基中培养，并将培养液分配至24孔板以使各孔含有400μL培养液来实现4×104个细胞/孔的密度。用前述miRNA使用转染试剂脂质体RNAi MAX(商品名，Life Technologies)根据前述转染试剂所附步骤转染细胞。具体地，通过如下设定每孔的组成来进行转染。在下述组成中，(B)为Opti-MEM(Life Technologies)，(C)为0.4μmol/L的前述RNA溶液，其总计添加了98.5μL。前述孔中前述miRNA的终浓度设为0.2nmol/L。
表3
(每孔的组成：μL)
转染后，细胞在前述孔中培养24小时，接着使用RNeasy迷你试剂盒(Qiagen,Netherlands)根据其中所附步骤收集RNA。随后，通过使用转录子第一链cDNA合成试剂盒(Roche)根据其中所附步骤由前述RNA合成cDNA。接着，如下所示，使用前述合成的cDNA作为模板进行PCR，并测量HMGA2基因的表达水平以及作为内标的GAPDH基因的表达水平。前述HMGA2基因的表达水平参考上述GAPDH基因的表达水平来标准化。
使用LightCycler 480 SYBR Green I Master(商品名，Roche)作为试剂和LightCycler 480 Instrument II(商品名，Roche)作为仪器进行前述PCR(下文相同)。前述HMGA2和GAPDH基因分别使用下列引物对扩增。
HMGA2基因用PCR引物对
(SEQ ID NO:39)5’-GAAGCCACTGGAGAAAAACG-3’
(SEQ ID NO:40)5’-CTTCGGCAGACTCTTGTGAG-3’
GAPDH基因用引物对
(SEQ ID NO:15)5’-ATGGGGAAGGTGAAGGTCG-3’
(SEQ ID NO:16)5’-GGGTCATTGATGGCAACAATATC-3’
作为对照1，关于100μL的前述溶液(B)已单独添加至前述培养液的细胞，也测量基因的表达水平(-)。此外，作为对照2，关于进行与上述相同的转染步骤但不添加前述RNA溶液且添加前述(B)和1.5μL前述(A)以使(A)和(B)的总量将为100μL的细胞，也测量基因的表达水平(空白对照)。
对于标准化的HMGA2基因的表达水平，基于对照(空白对照)的细胞中的表达水平为1来确定导入有各RNA的细胞中表达水平的相对值。
(3)结果
如图10所示，实施例的匹配型let-7a以与阳性对照成熟let-7a和双链匹配型let-7a相同或不低于的水平抑制了HMGA2 mRNA的表达。另外，HMGA2 mRNA的表达抑制效果即使在连接子区域的非核苷酸结构或X区域的附加序列的碱基长改变时也得以维持。
(实施例5)
基于成熟miR-29b的引导链合成本发明的各种人工匹配型miRNA，并检测对靶基因COLA1 mRNA的表达抑制效果。
(1)miRNA的合成
作为阳性对照，合成其中成熟miR-29b的引导链(SEQ ID NO:5)和随从链(SEQ IDNO:41)经天然型pre-miR-29b的环部分连接的分子(NM-0005)，以及其中成熟miR-29b的引导链和与之完全互补的序列退火的双链匹配型RNA(NI-0211)。
NM-0005(64mer)
NI-0211(23/23mer)
在以下序列中，下划线部分表示前述引导链序列。
NM-0005(SEQ ID NO:42)
5’-GCUGGUUUCAUAUGGUGGUUUAGAUUUAAAUAGUGAUUGUCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3’
NI-0211
随从链(SEQ ID NO:41)/引导链(SEQ ID NO:5)
5’-CACUGAUUUCAAAUGGUGCUAGA-3’/5’-UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3’
如下所示，合成各种人工匹配型miR-29b，其中与实施例3同样的，将脯氨酸衍生物([P])、对苯二甲酸衍生物([TP])、甘氨酸衍生物([Gly])、甘氨酰甘氨酸衍生物([GlyGly])和赖氨酸衍生物([K])的连接子引入到3’侧包括成熟miR-29b的引导链序列和附加序列(0、3或5个碱基长)的X区域、和与X区域完全互补并在5’侧具有2碱基长的突出端的Y区域之间。
在以下序列中，各连接子的5’侧区域为X区域；前述X区域中，下划线部分为前述引导链序列，余下为前述附加序列，各连接子的3’侧区域为Y区域。
PH-0071(SEQ ID NO:43)
5’-UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-[P]-AACACUGAUUUCAAAUGGUGCUAGA-3’
PH-0073(SEQ ID NO:44)
5’-UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUUUCC-[P]-GGAAACACUGAUUUCAAAUGGUGCUAGA-3’
PH-0095(SEQ ID NO:45)
5’-UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUUUCCGG-[P]-CCGGAAACACUGAUUUCAAAUGGUGCUAGA-3’
XH-0034(SEQ ID NO:43)
5’-UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-[TP]-AACACUGAUUUCAAAUGGUGCUAGA-3’
XH-0035(SEQ ID NO:44)
5’-UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUUUCC-[TP]-GGAAACACUGAUUUCAAAUGGUGCUAGA-3’
XH-0036(SEQ ID NO:45)
5’-UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUUUCCGG-[TP]-CCGGAAACACUGAUUUCAAAUGGUGCUAGA-3’
XH-0037(SEQ ID NO:43)
5’-UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-[Gly]-AACACUGAUUUCAAAUGGUGCUAGA-3’
XH-0038(SEQ ID NO:44)
5’-UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUUUCC-[Gly]-GGAAACACUGAUUUCAAAUGGUGCUAGA-3’
XH-0039(SEQ ID NO:43)
5’-UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-[GlyGly]-AACACUGAUUUCAAAUGGUGCUAGA-3’
XH-0040(SEQ ID NO:44)
5’-UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUUUCC-[GlyGly]-GGAAACACUGAUUUCAAAUGGUGCUAGA-3’
KH-0013(SEQ ID NO:43)
5’-UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-[K]-AACACUGAUUUCAAAUGGUGCUAGA-3’
KH-0014(SEQ ID NO:44)
5’-UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUUUCC-[K]-GGAAACACUGAUUUCAAAUGGUGCUAGA-3’
作为阴性对照，使用实施例3中合成的PH-0000。
(2)COL1A1基因的表达水平的测量
前述RNA各自以1μmol/L溶解在注射用蒸馏水(Otsuka Pharmaceutical Co.,Ltd.)中，从而制备RNA溶液。
A549细胞(DS Pharma Biomedical Co.,Ltd.)用作细胞。作为培养基，使用含10％FBS的DMEM(Life Technologies)。培养条件设为37℃，5％CO2。
首先，将细胞在前述培养基中培养，并将培养液分配至24孔板以使各孔含有400μL培养液来实现4×104个细胞/孔的密度。用前述miRNA使用转染试剂脂质体RNAi MAX(商品名，Life Technologies)根据前述转染试剂所附步骤转染细胞。具体地，通过如下设定每孔的组成来进行转染。在下述组成中，(B)为Opti-MEM(Life Technologies)，(C)为前述1μmol/L的RNA溶液，其总计添加了98.5μL。前述孔中前述miRNA的终浓度设为0.5nmol/L。
[表4]
(每孔的组成：μL)
转染后，细胞在前述孔中培养24小时，接着使用RNeasy迷你试剂盒(Qiagen,Netherlands)根据其中所附步骤收集RNA。随后，通过使用转录子第一链cDNA合成试剂盒(Roche)根据其中所附步骤由前述RNA合成cDNA。接着，如下所示，使用前述合成的cDNA作为模板进行PCR，并测量COL1A1基因的表达水平以及作为内标的GAPDH基因的表达水平。前述COL1A1基因的表达水平参考上述GAPDH基因的表达水平来标准化。
使用LightCycler 480SYBR Green I Master(商品名，Roche)作为试剂和LightCycler 480Instrument II(商品名，Roche)作为仪器进行前述PCR(下文相同)。前述COL1A1和GAPDH基因分别使用下列引物对扩增。
COL1A1基因用PCR引物对
(SEQ ID NO:46)5’-CCCAAGGACAAGAGGCATGT-3’
(SEQ ID NO:47)5’-CCGCCATACTCGAACTGGAA-3’
GAPDH基因用引物对
(SEQ ID NO:15)5’-ATGGGGAAGGTGAAGGTCG-3’
(SEQ ID NO:16)5’-GGGTCATTGATGGCAACAATATC-3’
作为对照1，关于100μL的前述溶液(B)已单独添加至前述培养液的细胞，也测量基因的表达水平(-)。此外，作为对照2，关于进行与上述相同的转染步骤但不添加前述RNA溶液且添加前述(B)和1.5μL前述(A)以使(A)和(B)的总量将为100μL的细胞，也测量基因的表达水平(空白对照)。
对于标准化的COL1A1基因的表达水平，基于对照(空白对照)的细胞中的表达水平为1来确定导入有各RNA的细胞中表达水平的相对值。
(3)结果
如图11所示，实施例的匹配型miR-29b以与阳性对照成熟miR-29b和双链匹配型miR-29b相同或不低于的水平抑制了COLA1 mRNA的表达。另外，COLA1 mRNA的表达抑制效果即使在连接子区域的非核苷酸结构或X区域的附加序列的碱基长改变时也得以维持。
虽然已在上文参考示例性实施方案描述了本发明，但本发明决不限于此。在不超出本发明的范围内，可对本发明的构成和细节作出对于本领域技术人员而言容易理解的各种变更。另外，本文所引用的包括专利和专利申请在内的任何出版物的内容以其全部内容引入以作参考，引用到它们在本文公开的程度。
本申请基于日本提交的专利申请No.2013-273033(提交日：2013年12月27日)，再次将其全部内容引入于此。
产业上的可利用性
由于本发明的人工匹配型miRNA能够以低成本容易地合成，并且能够抑制由前述基因编码的蛋白质的翻译。因此，本发明的人工匹配型miRNA作为例如医药品、诊断剂、农药、以及进行农学、医学、生命科学等研究的工具是有用的。
Claims (24)
1.一种人工匹配型miRNA，其为包括X区域和Y区域的单链核酸，
其中所述X区域的3’末端和所述Y区域的5’末端经非核苷酸结构的连接子区域连接，
所述X区域包括成熟miRNA的引导链序列和附加序列，所述附加序列连接至所述引导链序列的3’末端，所述Y区域包括与所述X区域完全互补的序列，其中所述成熟miRNA选自由hsa-miR-34a、hsa-miR-29b和hsa-let-7a组成的组，
所述附加序列的长度为1-5个碱基长，和
所述连接子区域的结构为下列化学式(I-1)、(I-4)、(I-6)、(I-7)或(II-8)，和在下列化学式(I-1)、(I-4)、(I-6)、(I-7)或(II-8)中，n为0至30的整数，且m为0至30的整数：
2.根据权利要求1所述的人工匹配型miRNA，其中当将所述Y区域和所述X区域比对时，所述Y区域在3’末端具有突出端。
3.根据权利要求2所述的人工匹配型miRNA，其中所述突出端具有0-4个碱基长。
4.根据权利要求1至3任一项所述的人工匹配型miRNA，其中所述X区域的长度为19-33个碱基。
5.根据权利要求1至4任一项所述的人工匹配型miRNA，其中所述Y区域的长度为21-35个碱基。
6.根据权利要求1至5任一项所述的人工匹配型miRNA，其中全长为40- 68个碱基长。
7.根据权利要求1至6任一项所述的人工匹配型miRNA，其中在所述氨基酸残基中的所述氨基酸为天然氨基酸和人工氨基酸的至少之一。
8.根据权利要求7所述的人工匹配型miRNA，其中所述天然氨基酸为构成蛋白质的氨基酸。
9.根据权利要求1至8任一项所述的人工匹配型miRNA，其中在所述化学式(I-1)中，n＝11且m＝12，或n＝5且m＝4。
10.根据权利要求1至8任一项所述的人工匹配型miRNA，其中在所述化学式(I-4)中，n＝5且m＝4。
11.根据权利要求1至8任一项所述的人工匹配型miRNA，其中在所述化学式(I-6)中，n＝4且m＝4。
12.根据权利要求1至8任一项所述的人工匹配型miRNA，其中在所述化学式(I-7)中，n＝5且m＝4。
13.根据权利要求1至8任一项所述的人工匹配型miRNA，其中在所述化学式(II-8)中，n＝5且m＝4。
14.根据权利要求1所述的人工匹配型miRNA，其中所述核苷酸序列为选自由SEQ IDNO:9和17-28组成的组的核苷酸序列。
15.根据权利要求1所述的人工匹配型miRNA，其中所述核苷酸序列为选自由SEQ IDNO:36-38组成的组的核苷酸序列。
16.根据权利要求1所述的人工匹配型miRNA，其中所述核苷酸序列为选自由SEQ IDNO:43-45组成的组的核苷酸序列。
17.一种用于抑制靶基因表达的组合物，其包括根据权利要求1至16任一项所述的人工匹配型miRNA。
18.一种药学组合物，其包括根据权利要求1至16任一项所述的人工匹配型miRNA。
19.一种非治疗目的的抑制靶基因表达的方法，其包括使用根据权利要求1至16任一项所述的人工匹配型miRNA。
20.根据权利要求19所述的方法，其包括将所述人工匹配型miRNA投予 至细胞、组织或器官。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述人工匹配型miRNA在体内或体外投予 。
22.根据权利要求19或20所述的方法，其中将所述人工匹配型miRNA投予 至非人动物。
23.一种人工匹配型miRNA在制备通过以下方法治疗疾病的试剂中的用途，所述方法包括将根据权利要求1至16任一项所述的人工匹配型miRNA投予 至患者的步骤，其中所述人工匹配型miRNA的所述引导链序列为抑制参与所述疾病的基因表达的成熟miRNA的引导链序列。
24.一种用于疾病的治疗的单链核酸，所述单链核酸为根据权利要求1至16任一项所述的人工匹配型miRNA，其中所述人工匹配型miRNA的所述引导链序列为抑制参与所述疾病的基因表达的成熟miRNA的引导链序列。
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