CN101845071B

CN101845071B - 一种2’或3’偶联氨基酸的核苷衍生物、其制备方法及应用

Info

Publication number: CN101845071B
Application number: CN2010101334779A
Authority: CN
Inventors: 高源�; 刘迎春
Original assignee: BEIJING OKEANOS TECH Co Ltd
Current assignee: Hefei Ouchuang Gene Biotechnology Co., Ltd.
Priority date: 2010-03-25
Filing date: 2010-03-25
Publication date: 2012-02-01
Anticipated expiration: 2030-03-25
Also published as: CN101845071A

Abstract

本发明提供了一种偶联氨基酸的核苷衍生物，其结构如式1或式2所示：

式1 式2其中，B为带有氨基保护基的核苷碱基；n为1-6的整数；Linker为C₂-C₁₀的直链烷烃；R₁为H或甲基；R₂为碳碳双键、碳碳三键或叠氮基。本发明还提供了所述2’或3’偶联氨基酸的核苷衍生物的制备方法及其在提高siRNA稳定性中的应用。采用本发明提供的2’或3’偶联氨基酸的核苷衍生物固定的siRNA双链，具有良好的亲脂性和膜透性，在机体内可以耐受各种酶的水解，对生理环境的氧化、还原、取代、消除、加成等反应及广泛的pH环境均可耐受，其化学稳定性和血液容留时间得到明显的改善。

Description

一种2’或3’偶联氨基酸的核苷衍生物、其制备方法及应用

技术领域

本发明涉及一种2’或3’偶联氨基酸的核苷衍生物、其制备方法及其在siRNA领域中的应用。

背景技术

RNA干扰(RNA interference，RNAi)现象是一种进化上保守的抵御转基因或外来病毒侵犯的防御机制。将与靶基因的转录产物mRNA存在同源互补序列的双链RNA(double strand RNA，dsRNA)导入细胞后，能特异性地降解该mRNA，从而产生相应的功能表型缺失，这一过程属于转录后基因沉默机制(posttranscriptional gene siliencing，PTGS)范畴。RNAi广泛存在于生物界，从低等原核生物到植物、真菌、无脊椎动物、甚至近来在哺乳动物中也发现了此种现象，只是机制也更为复杂。

现已初步阐明RNAi的作用机制：RNAi的第一步是dsRNA在内切核酸酶(一种具有RNaseIII样活性的核酸酶，称为Dicer)作用下加工裂解形成21-25nt的由正义链和反义链组成的干扰性小dsRNA，即siRNA。RNAi的第二步是由siRNA中的反义链指导形成一种核蛋白体，该核蛋白体称为RNA诱导的沉默复合体(RNA induced silencingcomplex，RISC)，由RISC介导切割靶mRNA分子中与siRNA反义链互补的区域，从而达到干扰基因表达作用。RISC由多种蛋白成分组成，包括内切核酸酶、外切核酸酶、解旋酶和同源RNA链搜索活性等。

RNAi是一种高效的特异性强的基因阻断技术，近年来发展迅速，已经成为功能基因组研究的有力工具。最近在人类体细胞里已经成功地对近20种基因功能进行了敲除，尤其是因此而了解了人类空泡蛋白Tsg101对HIV在人体内增殖的作用，进一步深化了对HIV的研究。

siRNA的化学稳定性差不是由于其在双链形式下被降解，而是由于在双链-单链的杂交-解旋平衡中，其单链形式被RNase酶降解造成的。根据以上原理，用非核酸分子将两条siRNA链各自的一端连接起来，将siRNA链锁定，siRNA链就不易解旋降解，从而可以改善siRNA的化学稳定性和血液容留时间。在细胞内，利用细胞内存在的Dicer酶释放被锁定的siRNA，对靶基因的表达进行抑制。

但是，已有的修饰和连接方法对siRNA的稳定性的改进十分有限；而且，在所修饰的结构中不易引入功能性分子，如荧光标记分子。

从化学活性角度看，烷烃链和杂环结构是非常稳定的化学结构。尤其在机体内它们可以耐受蛋白酶、肽酶、核酸酶的水解，对生理环境的氧化、还原、取代、消除、加成等反应及广泛的pH环境均可耐受，因此设计合成烷烃或杂环结构固定的siRNA是提高siRNA稳定性和活性的理想途径。

发明内容

本发明的目的是提供一种2’或3’偶联氨基酸的核苷衍生物。

本发明的另一目的是提供上述核苷衍生物的制备方法。

本发明的进一步目的是提供上述核苷衍生物在提高siRNA稳定性中的应用。

为了实现本发明目的，本发明的一种偶联氨基酸的核苷衍生物，其结构如式1或式2所示：

式1 式2

其中，B为带有氨基保护基的核苷碱基，所述核苷碱基优选为胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶、鸟嘌呤或腺嘌呤；n为1-6的整数；Linker为C₂-C₁₀的直链烷烃；R₁为H或甲基；R₂为碳碳双键、碳碳三键或叠氮基；2’-OH和3’-OH可以为R构型或S构型。

前述的核苷衍生物，其中所述的氨基保护基为苯甲酰基、异丙酰基或乙酰基。

上述2’或3’偶联氨基酸的核苷衍生物的制备方法，其包括步骤：

1)将核苷溶于水溶性有机溶剂中，在碱的作用下与带氨基的linker偶联得到中间体A，柱层析分离2’偶联产物或3’偶联产物；

2)将步骤1)的偶联产物和氨基酸溶于水溶性有机溶剂中，在脱水剂的作用下发生脱水反应，得产物B。

前述的方法，其中步骤1)和步骤2)中所述的水溶性有机溶剂包括DMF、DMSO、THF、1，4-二氧六环、吡啶、乙腈。

前述的方法，其中步骤1)中所述的碱包括氢化钠、碳酸钾、叔丁醇钾、DMAP、二乙胺。

前述的方法，其中步骤1)中所述的带氨基的linker包括：

其中，n1＝0-8。

前述的方法，其中步骤2)中所述的氨基酸，其侧链末端带有碳碳双键、碳碳三键或叠氮基。

前述的方法，其中步骤2)中所述的氨基酸可以是R构型或S构型，其包括：

其中，n2为1-6的整数。

前述的方法，其中步骤2)中所述的脱水剂包括DCC、DIC、EDCI。

前述的方法，具体步骤如下：

1)将真空干燥的核苷溶于预先干燥的水溶性有机溶剂中，控制温度在0-10℃之间，加入相当于1-3倍核苷物质的量的碱，搅拌10-30min，缓慢滴加相当于0.5-1.5倍核苷物质的量的带氨基的linker，5-30min内滴加完毕，室温搅拌8-24h；向体系中加入少量水(约为2-6倍核苷物质的量)，淬灭反应，旋干溶剂，柱层析分离2’偶联产物和3’偶联产物；

2)将步骤1)的偶联产物和氨基酸按1∶1-3物质的量比溶于预先干燥的水溶性有机溶剂中，搅拌均匀，向体系中加入相当于2-5倍核苷物质的量的脱水剂，室温下搅拌6-12h；向体系中加入少量水(约为4-10倍核苷物质的量)，淬灭反应，滤除生成的固体，将滤液旋干，柱层析分离得到目标产物。

上述2’或3’偶联氨基酸的核苷衍生物在提高siRNA稳定性中的应用。

将式1或式2所示的2’-或3’-位偶联氨基酸的核苷单体通过固相合成，连接到两条siRNA链的3’端和5`端。2`-或3`-位的若是末端双键，在Grubbs催化剂的作用下发生烯烃复分解反应，将两条siRNA链锁定；或者利用Click化学原理使2’-或3’-位的末端的碳碳三键和叠氮基偶联成三氮唑，从而将两条siRNA链锁定。被固定两端的siRNA不仅化学稳定性和血液容留时间得到明显的改善，而且容易透过细胞膜。被锁定的siRNA进入细胞后，经细胞内存在的Dicer酶的剪切和加工后释放被锁定的siRNA，从而对靶基因的表达进行抑制。此外，利用上述方法固定的双链siRNA两端还有裸露的氨基，可以根据需要偶联任何功能基团，包括荧光基团、靶向识别分子或可增加细胞膜通透性的脂类分子等。

本发明所述在Grubbs催化剂的作用下的锁定siRNA的方法，包括如下步骤：

1)选择靶基因，确定siRNA的正义链和反义链的序列；

2)通过常规的固相合成方法，合成需要被锁定的siRNA，并在合成过程中将2’-或3’-位含末端双键的核苷衍生物连接到两条siRNA链的3’端和5’端；

3)在Grubbs催化剂的作用下发生烯烃复分解反应，将两条siRNA链锁定；

4)被锁定的siRNA进入细胞后，经细胞内Dicer酶的剪切和加工后释放被锁定的siRNA，从而对靶基因的表达进行抑制。

本发明所述的利用Click化学原理锁定siRNA的方法，包括如下步骤：

1)选择靶基因，确定siRNA的正义链和反义链的序列；

2)通过常规的固相合成方法，合成需要被锁定的siRNA，并在合成过程中将2’-或3’-位含末端三键和叠氮基的核苷衍生物连接到两条siRNA链的3’端和5’端；

3)在CuI的催化下，将两条siRNA链锁定；

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

1)本发明提供的2’或3’偶联氨基酸的核苷衍生物为全新化合物，制备方法简单，无需苛刻的反应条件和复杂的化学反应过程；

2)本发明将侧链末端带有双键、三键或叠氮基的氨基酸偶联到核苷的2’或3’位，不仅可以用于固定siRNA双链，而且在其裸露的氨基上还可以根据需要偶联任何功能基团，如荧光基团等；

3)采用本发明2’或3’偶联氨基酸的核苷衍生物固定的siRNA双链，具有良好的亲脂性和膜透性，在机体内可以耐受各种酶的水解，对生理环境的氧化、还原、取代、消除、加成等反应及广泛的pH环境均可耐受，其化学稳定性和血液容留时间得到明显的改善；

4)本发明利用Grubbs催化剂或Click化学原理进行偶联固定，反应简单易行。

附图说明

图1表示本发明2’或3’偶联氨基酸的核苷衍生物的制备路线；

图2为本发明利用Grubbs催化剂固定siRNA的方法示意图；

图3为本发明利用Click化学原理固定siRNA的方法示意图；

图4为本发明实施例1的2’或3’偶联氨基酸的核苷衍生物的制备路线示意图；

图5为本发明实施例2的2’或3’偶联氨基酸的核苷衍生物的制备路线示意图；

图6为本发明实施例3的2’或3’偶联氨基酸的核苷衍生物的制备路线示意图；

图7为本发明实施例4的在Grubbs催化剂的作用下锁定两条siRNA链的示意图；

图8为本发明实施例5的利用Click化学原理锁定两条siRNA链的示意图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1

(1)将真空干燥的尿苷(4.88g，20mmol)溶于预先干燥的50ml的DMF中，控制温度在0℃，加入氢化钠(0.48g，20mmol)，搅拌30min。缓慢滴加2-溴乙胺(1.35g，22mmol)，5min内滴加完毕，室温搅拌8h；向体系中加入5ml水，淬灭反应，旋干溶剂，柱层析分离2’偶联产物A2-1(产率为32％)和3’偶联产物A3-1(产率为17％)，如图4所示。

(2)将A2-1(0.29g，1mmol)和(S)-2-氨基-4-戊烯酸(0.23g，2mmol)溶于预先干燥的10ml乙腈中，搅拌均匀，向体系中加入DCC(5mmol)，室温下搅拌8h；向体系中加入1ml水，淬灭反应，滤除生成的固体，将滤液旋干，柱层析分离得到目标产物B2-1(产率为72％)。

¹H NMR：1.33(m，2H)；1.79(m，2H)；1.96(m，2H)；3.30(t，2H)；3.38(m，1H)；3.54(d，1H)；3.51(d，3`-OH)；3.63(t，2H)；3.79(d，1H)；3.82(t，5`-OH)；3.90(m，1H)；4.40(m，1H)；4.75(m，1H)；5.02(m，1H)；5.07(m，1H)；5.76(m，1H)；5.82(d，1H)；6.17(m，1H)；9.62(d，1H)；MS：[M+1]⁺：413。

(3)将A3-1(0.29g，1mmol)和(S)-2-氨基-4-戊烯酸(0.23g，2mmol)溶于预先干燥的10ml乙腈中，搅拌均匀，向体系中加入DCC(5mmol)，室温下搅拌8h；向体系中加入1ml水，淬灭反应，滤除生成的固体，将滤液旋干，柱层析分离得到目标产物B3-1(产率为70％)。

¹H NMR：1.33(m，2H)；1.79(m，2H)；1.96(m，2H)；3.30(t，2H)；3.38(m，1H)；3.54(d，1H)；3.58(d，2`-OH)；3.63(t，2H)；3.79(d，1H)；3.88(t，5`-OH)；3.90(m，1H)；4.52(m，1H)；4.75(m，1H)；5.02(m，1H)；5.07(m，1H)；5.76(d，1H)；5.82(m，1H)；5.93(m，1H)；9.62(d，1H)；MS：[M+1]⁺：413。

实施例2

(1)将真空干燥的5-甲基尿苷(4.88g，20mmol)溶于预先干燥的50ml的DMF中，控制温度在0℃，加入氢化钠(0.48g，20mmol)，搅拌30min。缓慢滴加2-溴乙胺(1.35g，22mmol)，5min内滴加完毕，室温搅拌8h；向体系中加入5ml水，淬灭反应，旋干溶剂，柱层析分离2’偶联产物A2-1(产率为32％)和3’偶联产物A3-1(产率为17％)，如图5所示。

¹H NMR：1.26(m，6H)；1.42(m，8H)；1.56(s，3H)；1.75(t，2H)；2.43(s，3H)；2.46(t，2H)；2.83(s，1H)；3.20(t，2H)；3.37(t，2H)；3.54(m，1H)；3.58(d，3`-OH)；3.65(t，5`-OH)；3.79(m，1H)；3.90(m，1H)；4.40(m，1H)；4.75(m，1H)；5.11(s，1H)；6.17(m，1H)；7.57(d，1H)；MS：[M+1]⁺：523。

¹H NMR：1.26(m，6H)；1.42(m，8H)；1.56(s，3H)；1.75(t，2H)；2.43(s，3H)；2.46(t，2H)；2.83(s，1H)；3.20(t，2H)；3.27(m，1H)；3.37(t，2H)；3.54(m，1H)；3.62(d，2`-OH)；3.65(t，5`-OH)；3.79(m，1H)；4.53(m，1H)；4.64(m，1H)；5.11(s，1H)；5.93(m，1H)；7.57(d，1H)；MS：[M+1]⁺：523。

实施例3

(1)将真空干燥的5-甲基尿苷(4.88g，20mmol)溶于预先干燥的50ml的DMF中，控制温度在0℃，加入氢化钠(0.48g，20mmol)，搅拌30min。缓慢滴加2-溴乙胺(1.35g，22mmol)，5min内滴加完毕，室温搅拌8h；向体系中加入5ml水，淬灭反应，旋干溶剂，柱层析分离2’偶联产物A2-1(产率为32％)和3’偶联产物A3-1(产率为17％)，如图6所示。

¹H NMR：1.29(m，6H)；1.46(m，6H)；1.72(m，1H)；2.03(m，1H)；3.30(m，5H)；3.54(m，1H)；3.58(d，3`-OH)；3.63(m，1H)；3.69(t，5`-OH)；3.79(m，1H)；3.90(m，1H)；4.40(m，1H)；4.75(m，1H)；6.40(m，1H)；7.32(m，3H)；8.03(m，2H)；8.16(s，1H)；8.35(s，1H)；9.15(s，1H，NH)；MS：[M+1]⁺：611。

¹H NMR：1.29(m，6H)；1.46(m，6H)；1.72(m，1H)；2.03(m，1H)；3.30(m，5H)；3.46(d，2`-OH)；3.54(m，1H)；3.63(m，1H)；3.69(t，5`-OH)；3.79(m，1H)；3.90(m，1H)；4.64(m，1H)；4.99(m，1H)；6.16(m，1H)；7.32(m，3H)；8.03(m，2H)；8.16(s，1H)；8.35(s，1H)；9.15(s，1H，NH)；MS：[M+1]⁺：611。

实施例4 2’或3’偶联氨基酸的核苷衍生物固定siRNA(在Grubbs催化剂的作用下)

(1)选择靶基因，确定siRNA的正义链和反义链的序列

选择GAPDH(Genbank登记号为NC_000012)为靶基因，设计siRNA，其对应于NC_000012的位置为2700-2718bp。

正义链：5’-GUAUGACAACAGCCUCAAGTT-3’

反义链：5’-CUUGAGGCUGUUGUCAUACTT-3’

(2)固相合成siRNA

其中，2’或3’偶联氨基酸的核苷衍生物的合成方法参考实施例1。

(3)在Grubbs催化剂的作用下发生烯烃复分解反应，将两条siRNA链锁定，如图7所示。

实施例5 2’或3’偶联氨基酸的核苷衍生物固定siRNA(利用Click化学原理)

(1)选择靶基因，确定siRNA的正义链和反义链的序列

正义链：5’-GUAUGACAACAGCCUCAAGTT-3’

反义链：5’-CUUGAGGCUGUUGUCAUACTT-3’

(2)固相合成siRNA

其中，2’或3’偶联氨基酸的核苷衍生物的合成方法参考实施例2和3。

(3)在CuI催化剂的作用，利用Click化学原理，将两条siRNA链锁定，如图8所示。

实施例6锁定的siRNA稳定性检测

将未锁定的siRNA和实施例4与实施例5制得的siRNA和10％的血清分别孵育1min、30min、1.5h、3h、6h、12h、24h后进行20％PAGE电泳，以观察锁定的siRNA在血清中的稳定性。

结果表明：未锁定的siRNA在血清中孵育30min就明显降解，6h时完全降解，而实施例4和实施例5中锁定的siRNA在24h内未观察到明显降解。进一步实验表明，72h内实施例4和实施例5中的siRNA始终未观察到明显降解。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110>北京欧凯纳斯科技有限公司

<120>一种2’或3’偶联氨基酸的核苷衍生物、其制备方法及应用

<130>KHP10112242.3

<160>4

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(20)..(21)

<223>n为t

<400>1

guaugacaac agccucaagn n 21

<210>2

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(20)..(21)

<223>n为t

<400>2

cuugaggcug uugucauacn n 21

<210>3

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(20)..(21)

<223>n为t

<400>3

guaugacaac agccucaagn n 21

<210>4

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(20)..(21)

<223>n为t

<400>4

cuugaggcug uugucauacn n 21

Claims

1.一种偶联氨基酸的核苷衍生物，其结构如式1或式2所示：

式1 式2

其中，B为带有氨基保护基的核苷碱基；

n为1-6的整数；

Linker为C₂-C₁₀的直链烷烃基；

R₁为H或甲基；

R₂为碳碳双键、碳碳三键或叠氮基；

其中所述的氨基保护基为苯甲酰基、异丙酰基或乙酰基。

2.制备权利要求1所述的核苷衍生物的方法，其包括步骤：

1)将核苷溶于水溶性有机溶剂中，在碱的作用下与带氨基的linker偶联得到中间体，柱层析分离2’或3’偶联产物；

2)将步骤1)的偶联产物和氨基酸溶于水溶性有机溶剂中，在脱水剂的作用下发生脱水反应，即得；

其中，步骤1)和步骤2)中所述的水溶性有机溶剂为DMF、DMSO、THF、1，4-二氧六环、吡啶或乙腈；步骤1)中所述的碱为氢化钠、碳酸钾、叔丁醇钾、DMAP或二乙胺；步骤2)中所述的氨基酸，其侧链末端带有碳碳双键、碳碳三键或叠氮基；步骤2)中所述的脱水剂为DCC、DIC或EDCI；

其中步骤1)中所述的带氨基的linker为：

其中，n1＝0-8；

其中步骤2)中所述的氨基酸为：

其中，n2为大于1小于等于6的整数。

3.根据权利要求2所述的方法，具体步骤如下：

1)将真空干燥的核苷溶于预先干燥的水溶性有机溶剂中，控制温度在0-10℃之间，加入相当于1-3倍核苷物质的量的碱，搅拌10-30min，缓慢滴加相当于0.5-1.5倍核苷物质的量的带氨基的linker，5-30min内滴加完毕，室温搅拌8-24h；向体系中加入相当于2-6倍核苷物质的量的水，淬灭反应，旋干溶剂，柱层析分离2’偶联产物和3’偶联产物；

2)将步骤1)的偶联产物和氨基酸按1∶1-3物质的量比溶于预先干燥的水溶性有机溶剂中，搅拌均匀，向体系中加入相当于2-5倍核苷物质的量的脱水剂，室温下搅拌6-12h；向体系中加入相当于4-10倍核苷物质的量的水，淬灭反应，滤除生成的固体，将滤液旋干，柱层析分离得到目标产物。