KR20240027158A - 표면-결합 올리고뉴클레오타이드의 화학적 절단 및 탈보호를 위한 조성물 및 방법 - Google Patents
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Abstract
본 개시내용의 실시형태는 폴리뉴클레오타이드 서열분석을 위한 주형의 제조 방법에 관한 것이다. 특히, 본 개시내용은 고체 지지체 상에 고정된 이중-가닥 폴리뉴클레오타이드 중 하나 이상의 제1 가닥을 전이 금속 착물, 예를 들어, 팔라듐 착물 또는 니켈 착물에 의해 절단하는 것에 의한, 서열분석용 제제에서의 클러스터링된 폴리뉴클레오타이드의 선형화에 관한 것이다. 추가로, 본 개시내용은 아조벤젠 링커를 포함하는 고체 지지체 상에 고정된 이중-가닥 폴리뉴클레오타이드 중 하나 이상의 제2 가닥을 Na2S2O4에 의해 절단하는 것에 의한, 클러스터링된 폴리뉴클레오타이드의 선형화에 관한 것이다. 3' 인산염 모이어티 차단기를 포함하는 뉴클레오타이드 및 올리고뉴클레오타이드, 및 플루오린화물 시약을 이용하여 이를 제거하는 방법이 또한 개시된다.
Description
우선 출원에 대한 참고에 의한 편입
본 출원은 2018년 5월 15일자로 출원된 미국 가출원 특허 제62/671,816호 및 2019년 1월 3일자로 출원된 미국 가출원 특허 제62/788,045호에 대한 우선권의 유익을 주장하며, 이들 기초출원의 각각은 본 명세서에 그들의 전문이 참고로 원용된다.
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기술분야
본 개시내용의 실시형태는 폴리뉴클레오타이드 서열분석(sequencing)을 위한 주형의 제조 방법에 관한 것이다. 특히, 본 개시내용은 고체 지지체 상에 고정된 이중-가닥 폴리뉴클레오타이드 중 하나 이상의 제1 가닥의, 일부 경우에 전이 금속 착물, 예컨대 팔라듐 착물 또는 니켈 착물의 존재 하의 반응에 의한 화학적 절단에 의한 서열분석용 제제에서의 클러스터링된 폴리뉴클레오타이드의 선형화에 관한 것이다. 추가로, 본 개시내용은 고체 지지체 상의 변형된 프라이머의 화학적으로-매개된 탈보호에 관한 것이다.
다양한 핵산 서열분석 방법이 당업계에 공지되어 있다. 미국 특허 제5,302,509호는 DNA 중합효소 또는 DNA 리가제를 이용하여 다중 연장 반응을 수행하여 주형 가닥에 상보성인 표지된 폴리뉴클레오타이드를 연속적으로 혼입시키는 것을 수반하는, 폴리뉴클레오타이드 주형을 서열분석하는 방법을 기재한다. 이러한 "합성에 의한 서열분석"(sequencing by synthesis: SBS) 반응에서, 주형 가닥에 짝지어진 새로운 폴리뉴클레오타이드 가닥 염기는 주형 가닥에 상보성인 개개 뉴클레오타이드의 연속적 혼입에 의해 5'에서 3' 방향으로 구성된다. 서열분석 반응에서 사용되는 기질 뉴클레오사이드 3인산은 3' 위치에서 상이한 3' 표지로 표지되어, 연속적 뉴클레오타이드가 첨가됨에 따라 혼입된 뉴클레오타이드 정체의 결정을 허용한다.
핵산 서열분석 반응의 처리율을 최대화하기 위해, 다중 주형 분자를 병행하여 서열 분석하는 것이 유리하다. 다중 주형의 병행 처리는 핵산 어레이 기술의 사용에 의해 달성될 수 있다. 이들 어레이는 전형적으로 고체 지지체 물질에 고정된 폴리뉴클레오타이드의 고밀도 기질로 이루어진다.
고정된 핵산 어레이의 어레이 제작을 위한 다양한 방법은 당업계에 기재되어 있다. WO 98/44151과 WO 00/18957은 둘 다 고체 지지체 상에 고정될 증폭 산물이 복수의 동일한 고정된 폴리뉴클레오타이드 가닥 및 복수의 동일한 고정된 상보성 가닥으로부터 형성된 클러스터 또는 "콜로니"를 포함하는 어레이를 형성하도록 허용하는 핵산 증폭 방법을 기재한다. 이 유형의 어레이는 본 명세서에서 "클러스터링된 어레이"로서 지칭된다. 이들 방법에 따라 제조된 클러스터링된 어레이 상의 DNA 콜로니에 존재하는 핵산 분자는, 예를 들어 WO 98/44152에 기재되어 있는 서열분석 반응을 위한 주형을 제공할 수 있다. 고체상 증폭 반응 산물, 예컨대 WO 98/44151 및 WO 00/18957에 기재되어 있는 것은 고정된 폴리뉴클레오타이드 가닥 및 고정된 상보성 가닥의 쌍을 어닐링함으로써 형성된 소위 "브리지된" 구조이며, 이들 가닥 둘 다 5' 말단이 고체 지지체에 부착된다. 핵산 서열분석을 위한 더 적합한 주형을 제공하기 위해, 적어도 부분적으로 단일-가닥인 주형을 생성하기 위해 "브리지"된 구조에서 고정된 가닥 중 하나의 실질적으로 모두 또는 적어도 일부를 제거하는 것이 바람직하다. 따라서 단일-가닥인 주형의 일부는 서열분석 프라이머에 대한 혼성화를 위해 이용 가능할 것이다. "브리지된" 이중 가닥 핵산 구조에서 하나의 고정된 가닥의 모두 또는 일부를 제거하는 과정은 "선형화"로서 지칭된다. 효소 절단, 광-화학적 절단 또는 화학적 절단을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는, 선형화를 위한 다양한 방법이 있다. 선형화 방법의 비제한적 예는 국제 특허 출원 WO 2007/010251 및 미국 특허 공개 제2009/0088327호, 및 미국 특허 공개 제2009/0118128호에 개시되어 있으며, 이들은 전문이 참고로 편입된다.
이중가닥 DNA 클러스터를 선형화하기 위해 그리고 표면-결합 프라이머를 탈보호하기 위해 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드의 효율적인 부위-특이적 절단을 용이하게 하는 효소 방법이 공지되어 있다. 현재, 다양한 서열분석 적용분야의 이들 반응 유형 둘 다에서 효소가 광범위하게 사용되고 있다. 그러나, 효소 안정성, 효소 생산 비용, 구체적 저장 및 조작 요건, 효소 활성의 변화 및 서열분석 판독에서의 높은 배경 강도를 비롯한, 효소 접근에 의한 소정의 문제가 있다. 따라서, 효과적인 DNA 서열분석을 위한 대안의 선형화 및 탈보호 방법을 개발할 필요가 존재한다. 그러나, 이와 관련하여 선형화 단계에 적용될 수 있는 반응 유형에 대한 다수의 제한이 있는데, 시약, 조건 및 부산물이 (a) 올리고뉴클레오타이드 혼성화 및 탈혼성화, 프라이머 PCR 연장, 및 DNA 합성을 비롯한, 상류 및 하류 반응에 적합하여야 하고, (b) 산성, 염기성 및 산화 조건 하에 양호한 안정성을 나타내어야 하며, (c) 빠르고 깨끗한 화학 반응을 달성하여야 하고, 그리고 (d) 뉴클레오타이드 검출 방법을 방해하지 않아야 하기 때문이다. 본 개시내용은 상기 기재한 제한을 충족하는 효과적인 대안인 화학적 절단 및 탈보호 단계를 기재한다.
본 개시내용의 일부 실시형태는 하기 단계들을 포함하는, 복수의 고정된 이중-가닥 폴리뉴클레오타이드를 선형화하는 방법에 관한 것이다: 이중-가닥 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 고체 지지체를 제공하는 단계로서, 각각의 이중-가닥 폴리뉴클레오타이드는 제1 가닥 및 제2 가닥을 포함하되, 상기 제1 가닥 및 상기 제2 가닥은 그들의 5' 말단에서 상기 고체 지지체에 각각 고정되고, 각각의 제1 가닥은 전이 금속 착물의 존재 하에 화학적 절단을 겪을 수 있는 제1 절단 부위를 포함하며, 상기 전이 금속 착물은 팔라듐 착물 또는 니켈 착물인, 상기 고체 지지체를 제공하는 단계; 상기 이중-가닥 폴리뉴클레오타이드를 상기 전이 금속 착물의 수용액과 접촉시킴으로써, 상기 제1 절단 부위에서 하나 이상의 제1 가닥을 절단하고, 하나 이상의 절단된 제1 핵산 및 절단 고정된 제1 가닥을 생성하는 단계; 및 상기 절단된 제1 핵산을 상기 고체 지지체로부터 제거하는 단계. 이러한 방법에서, 고정된 제2 가닥은 고체 지지체로부터 절단된 제1 핵산의 제거 후에 고체 지지체 상에 남아있고, 절단 고정된 제1 가닥에 혼성화된 채로 남아있다. 일부 실시형태에서, 팔라듐(Pd) 착물은 Pd(0) 착물이다. 일부 실시형태에서, 니켈(Ni) 착물은 Ni(0) 착물이다. 일부 실시형태에서, 제1 절단 부위는 알릴 작용기를 포함한다. 일부 추가적인 실시형태에서, 제1 절단 부위는 인산염 모이어티를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 절단 부위는 알릴 인산염 모이어티를 포함하는 변형된 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드이다.
본 개시내용은 또한 복수의 올리고뉴클레오타이드가 고정된 고체 지지체를 제공하는 단계로서, 상기 올리고뉴클레오타이드는 각각 3' 하이드록실 상에 보호기, 예컨대 화학적 탈보호를 겪을 수 있는 인산염기를 함유하는 변형된 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오사이드, 또는 변형된 3' 말단의 인산염 모이어티를 포함하는, 상기 고체 지지체를 제공하는 단계, 및 올리고뉴클레오타이드를 탈보호 시약과 반응시킴으로써, 보호기(예컨대 변형된 3' 말단 인산염 모이어티)를 절단하여 유리 3' 하이드록실기를 갖는 고정된 올리고뉴클레오타이드를 생성하는 단계를 포함하는, 고체 지지체 상의 올리고뉴클레오타이드의 화학적 탈보호 방법에 관한 것이다. 일부 양상에서, 보호기는 하기 화학식 (I)의 구조를 갖는 3' 말단의 인산염 모이어티이다:
식 중, 인산염 모이어티는 고정된 올리고뉴클레오타이드의 3' 말단에서의 인산염이고;
R1은 -NH2, -OH, -NHC(O)ORa 또는 -OCH2OSi(Rb)3이고;
Ra는 C1-4알킬, tert-뷰틸, 알릴, 벤질 또는 9-플루오렌일메틸이며; 그리고
각각의 Rb는 C1-4알킬 및 페닐로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고; 그리고
R2는 H, C1-4 알킬, 선택적으로 치환된 테트라하이드로퓨란 또는 뉴클레오타이드이다.
화학식 (I)의 일부 양상에서, R1은 -NHC(O)ORa이다. 일부 양상에서, Ra는 9-플루오렌일메틸, 벤질 또는 알릴이다. 일부 양상에서, R1은 -OCH2OSi(Rb)3이다. 일부 양상에서, 각각의 Rb는 아이소프로필이다. 일부 양상에서, 각각의 Rb는 독립적으로 메틸, 에틸, tert-뷰틸 또는 페닐이다.
일부 양상에서, 탈보호 시약은 플루오린화 이온(예를 들어, TBAF, HF 또는 CsF) 또는 약염기(예를 들어, 수산화나트륨)이다. 일부 양상에서, 고정된 올리고뉴클레오타이드는 본 명세서에 기재된 바와 같은 제1 가닥의 화학적 절단에 의해 생성된 절단 고정된 제1 가닥이다. 따라서, 일부 양상에서, 제1 가닥은 절단된 제1 핵산을 고체 지지체로부터 절단 및 제거한 후에 절단 고정된 제1 가닥에 존재하는 변형된 뉴클레오타이드를 포함한다. 본 명세서에 기재된 방법은 판독 1의 완료 후에 절단 고정된 제1 가닥의 3' 하이드록실 보호기를 제거하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 절단 고정된 제1 가닥은 말단의 인산염기를 포함한다. 다른 양상에서, 상기 방법은 절단된 제1 핵산을 고체 지지체로부터 절단 및 제거한 후에 절단 고정된 제1 가닥의 3' 말단의 인산염을 차단시키는 단계를 포함한다. 일부 양상에서, 차단시키는 단계는 고정된 제2 가닥을 서열분석하기 전에 3' 말단의 인산염을 차단기와 반응시키는 것, 및 본 명세서에 기재된 화학적 절단 방법에 따라 3' 하이드록실기를 생성하기 위해 판독 1의 완료 후에 차단기를 제거하는 것에 의한다. 제2 가닥의 3' 말단은 탈보호 반응 동안 그리고 반응 후에 고정 절단된 제1 가닥으로 혼성화된 채로 남아있다.
다른 양상에서, 3' 하이드록실 보호기는 제1 절단 후에 절단 고정된 제1 가닥에 존재하는 인산염기 또는 모이어티이고, 상기 방법은 탈인산화 효소, 예컨대 T4PNK의 존재 하에 인산염기 또는 모이어티를 제거하는 단계를 포함한다. 제2 가닥의 3' 말단은 효소적 탈보호 반응 동안에 그리고 반응 후에 고정 절단된 제1 가닥에 혼성화된 채로 남아있다.
일부 실시형태에서, 상기 방법은 고체 지지체로부터 절단된 제1 핵산의 제거 후에 고정된 제2 가닥을 서열분석하는 단계를 더 포함한다. 일부 양상에서, 서열분석은 고정된 제2 가닥에 상보성인 표지된 뉴클레오타이드를 연속적으로 혼입시키는 단계 및 각각의 연속적 혼입 후에 표지된 뉴클레오타이드를 검출하는 단계를 포함한다. 짝지은 말단(paired-end) 서열분석에서, 이중-가닥 핵산의 가닥은 둘 다 궁극적으로 서열분석되고, 이러한 경우에, 고정된 제2 가닥의 서열분석은 본 명세서에서 "판독 1"로서 지칭된다.
다른 실시형태에서, 각각의 고정된 제2 가닥은 화학적 절단을 겪을 수 있는 제2 절단 부위를 포함한다. 일부 양상에서, 제2 가닥을 서열분석하고(판독 1), 그리고 3' 하이드록실 보호기를 고정 절단된 제1 가닥으로부터 제거한 후에, 상기 방법은 고정된 제2 가닥에 대한 상보체를 합성하여 파생적 이중-가닥 폴리뉴클레오타이드를 생성하는 단계를 더 포함하되, 각각의 파생적 이중-가닥 폴리뉴클레오타이드는 제2 가닥 및 파생적(derivative) 제1 가닥을 포함하고, 상기 파생적 제1 가닥 및 제2 가닥은 각각 그들의 5' 말단이 고체 지지체에 고정된다. 본 개시내용의 방법은 제2 절단 부위에서 하나 이상의 제2 가닥을 절단함으로써, 하나 이상의 절단된 제2 핵산 및 절단 고정된 제2 가닥을 생성하는 단계, 및 절단된 제2 핵산을 고체 지지체로부터 제거하는 단계를 포함한다. 이러한 방법에서, 고정된 파생적 제1 가닥은 절단된 제2 핵산의 고체 지지체로부터의 제거 후에 고체 지지체 상에 남아있고, 절단 고정된 제2 가닥에 혼성화된 채로 남아있다.
일부 이러한 실시형태에서, 제2 가닥의 제2 절단 부위는 화학적 절단을 겪을 수 있고, 제2 가닥는 화학 반응에 의해 절단된다. 예를 들어, 제2 절단 부위는 하나 이상의 인접한 다이올 결합(산화, 예컨대 과아이오딘산염 시약에 의한 처리에 의해 절단될 수 있음), 이황화 결합(예를 들어, DTT와 같은 환원 조건 하에, 또는 포스핀의 존재 하에, 절단 가능함), 오쏘-나이트로벤질기(예를 들어, 광분해에 의해 절단 가능함), 아조벤젠 결합(예를 들어, Na2S2O4의 존재 하에 절단 가능함), 알킬-셀레늄 결합(예를 들어, 과산화수소와 같은 산화에 의해 절단 가능함), 실릴 에터 결합(예를 들어, 플루오린화 이온, 산 또는 염기에 의해 절단 가능함), 또는 알릴 카바메이트 결합(예를 들어, 팔라듐 착물의 존재 하에 절단 가능함)을 포함한다. 일부 양상에서, 제2 절단이 하이드록실 모이어티를 방출하도록 결합이 선택된다. 일부 양상에서, 절단은 링커 반응 부위를 제거한다(예를 들어, 인접한 다이올의 산화는 2종의 별개의 카보닐 화합물을 남기고, 다이올은 더 이상 존재하지 않는다). 일부 양상에서, 제2 절단 부위는 제2 가닥을 따라서 임의의 위치에 있지만, 바람직하게는 제2 가닥의 5' 말단 근처의(예를 들어, 고체 지지체의 부착 근처의) 골격 상에 부착된다. 일부 실시형태에서, 제1 가닥 및 제2 가닥을 절단하기 위한 화학적 절단 조건은 상이하고, 제1 가닥 및 제2 가닥은 동일한 절단 조건에 의해 절단될 수 없다(예를 들어, 절단 부위는 직교성이다). 일부 양상에서, 절단 단계는 둘 다 화학적 절단 단계를 필요로 하지 않는다. 예를 들어, 제1 가닥은 효소 반응에 의해 절단될 수 있는 반면, 제2 가닥은 화학 반응에 의해 절단되거나, 또는 제1 가닥은 화학 반응에 의해 절단될 수 있는 반면, 제2 가닥은 효소 반응에 의해 절단된다.
본 개시내용의 일부 추가적인 실시형태는 하기 단계들을 포함하는 복수의 고정된 이중-가닥 폴리뉴클레오타이드의 선형화 방법에 관한 것이다: 이중-가닥 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 고체 지지체를 제공하는 단계로서, 각각의 이중-가닥 폴리뉴클레오타이드는 제1 가닥 및 제2 가닥을 포함하되, 제1 가닥 및 제2 가닥은 그들의 5' 말단이 고체 지지체에 고정되고, 각각의 제1 가닥은 제1 절단 부위를 포함하며, 각각의 제2 가닥은 아조벤젠 링커를 포함하는 제2 절단 부위를 포함하는, 상기 고체 지지체를 제공하는 단계; 제1 절단 부위에서 하나 이상의 제1 가닥을 절단하고, 하나 이상의 절단된 제1 핵산 및 절단 고정된 제1 가닥을 생성하는 단계; 절단된 제1 핵산을 고체 지지체로부터 제거하는 단계; 고정된 제2 가닥을 서열분석하는 단계; 제2 가닥에 상보성인 파생적 제1 가닥을 재합성하는 단계; 및 제2 절단 부위에서 하나 이상의 제2 가닥을 절단하고, 하나 이상의 절단된 제2 핵산 및 절단 고정된 제2 가닥을 생성하는 단계. 이러한 방법의 일부 양상에서, 고정된 파생적 제1 가닥은 절단된 제2 핵산의 고체 지지체로부터의 제거 후에 고체 지지체 상에 남아있고, 절단 고정된 제2 가닥에 혼성화된 채로 남아있다.
일부 양상에서, 상기 방법은 절단된 제2 핵산의 고체 지지체로부터의 제거 후에 고정된 파생적 제1 가닥을 서열분석하는 단계를 더 포함한다. 일부 양상에서, 서열분석은 고정된 파생적 제1 가닥에 상보성인 표지된 뉴클레오타이드를 연속적으로 혼입시키는 단계 및 각각의 연속적 혼입 후에 표지된 뉴클레오타이드를 검출하는 단계를 포함한다. 짝지은 말단 서열분석에서, 이중-가닥 핵산의 가닥은 둘 다 궁극적으로 서열분석되고, 이러한 경우에, 고정된 파생적 제1 가닥의 서열분석은 본 명세서에서 "판독 2"로서 지칭된다.
본 개시내용의 일부 실시형태는 짝지은 말단 서열분석 방법에서 화학 반응에 의해 제거될 수 있는 3' 차단 모이어티의 제조 방법에 관한 것이다(전문이 참고로 편입된 미국 특허 공개 제2009/0088327호에 기재됨). 상기 방법은 하기 단계들을 포함한다: 이중-가닥 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 고체 지지체를 제공하는 단계로서, 각각의 이중-가닥 폴리뉴클레오타이드는 제1 가닥 및 제2 가닥을 포함하되, 상기 제1 가닥 및 제2 가닥은 그들의 5' 말단이 고체 지지체에 고정되고, 각각의 제1 가닥은 제1 절단 부위를 포함하는, 상기 고체 지지체를 제공하는 단계; 제1 절단 부위에서 하나 이상의 제1 가닥을 절단하여 하나 이상의 절단된 제1 핵산 및 절단 고정된 제1 가닥을 생성하는 단계; 및 3' 차단 모이어티를 절단 고정된 제1 가닥의 3' 말단에 도입하는 단계로서, 상기 3' 차단 모이어티는 화학 반응에 의해 제거될 수 있는, 상기 도입하는 단계. 일부 다른 실시형태에서, 3' 차단 모이어티를 절단 고정된 제1 가닥의 3' 말단에 도입하는 대신에, 3' 차단 모이어티는 상기 절단 단계 후에 제1 절단 부위로부터 생성된다. 일부 실시형태에서, 3' 차단 모이어티는 인산염 모이어티를 함유하는 변형된 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드를 포함한다. 하나의 이러한 실시형태에서, 3' 차단 모이어티는 변형된 뉴클레오사이드를 포함하고, 변형된 뉴클레오사이드는 뉴클레오사이드의 5'에서 추가의 -CH2OH 또는 보호된 -CH2OH를 함유한다. 다른 이러한 실시형태에서, 3' 차단 모이어티는 변형된 뉴클레오사이드를 포함하고, 변형된 뉴클레오사이드는 뉴클레오사이드의 5'에서 추가의 -CH2NH2 또는 보호된 -CH2NH2를 함유한다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 화학 반응에서, 예를 들어, 플루오린화제 또는 염기를 포함하는 수용액에서 3' 차단 모이어티를 제거하는 단계를 더 포함한다.
본 개시내용의 일부 실시형태는 복수의 제1 가닥 폴리뉴클레오타이드가 고정된 고체 지지체에 관한 것이며, 각각의 제1 가닥 폴리뉴클레오타이드는 팔라듐 착물 또는 니켈 착물에 의한 화학적 절단을 겪을 수 있는 제1 절단 부위를 포함하되, 복수의 제1 가닥 폴리뉴클레오타이드는 그들의 5'이 고체 지지체에 고정된다. 일부 실시형태에서, 고체 지지체는 그에 고정된 복수의 제2 가닥 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함하며, 각각의 제2 가닥 폴리뉴클레오타이드는 제2 절단 부위를 포함하되, 복수의 제2 가닥 폴리뉴클레오타이드는 그들의 5' 말단이 고체 지지체에 고정된다. 일부 실시형태에서, 팔라듐 착물은 팔라듐(0) 착물이다. 일부 실시형태에서, 제1 절단 부위는 알릴 작용기를 포함한다. 일 실시형태에서, 제1 절단 부위는 알릴dT를 포함한다. 일부 추가적인 실시형태에서, 제1 절단 부위는 인산염 모이어티를 추가로 포함하는데, 이는 화학적 절단 후에 절단 고정된 제1 가닥 상에 남아있다. 일 실시형태에서, 인산염 모이어티는 화학식 (I)의 구조를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제2 절단 부위는 화학적 절단, 광 절단, 효소 절단 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 방법에 의해 절단될 수 있다. 일 실시형태에서, 제2 절단 부위는 화학적 절단 반응에 의해 절단된다. 일부 이러한 실시형태에서, 제2 절단 부위는 이하에 기재하는 바와 같이 화학식 (VIII) 또는 (VIIIa)의 다이올 링커, 또는 화학식 (X)의 아조벤젠 링커를 포함할 수 있다.
본 개시내용은 또한 변형된 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드 및 올리고뉴클레오타이드 및 이러한 화합물의 제조 방법에 관한 것이다. 일 양상에서, 변형된 뉴클레오사이드 또는 변형된 뉴클레오타이드는 화학식 (II)의 구조를 포함한다:
식 중, R은 H, OH 또는 OPG이고; R1은 H 또는 PG이며; R2는 H, PG이거나 또는 -OR2는 인산염기이고; PG는 하이드록실 보호기이며; 염기는 아데닌, 구아닌, 사이토신, 티민, 또는 유라실, 또는 이들의 유도체이다. 일부 실시형태에서, 인산염기는 음으로 하전될 수 있다(예를 들어, -PO4 -). 일 양상에서, 변형된 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드는 하기 화학식 (IIa)의 구조를 가진다:
.
일 양상은, 화학식 (II)의 변형된 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드가 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드에 혼입될 때, 하기 화학식 (II')의 구조를 포함하는 변형된 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드이며, 알릴 변형된 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드의 3' 산소는 다른 뉴클레오타이드의 5' 말단에 공유 부착된다(도시하지 않음):
. 일부 실시형태에서, 인산염 기는 음으로 하전될 수 있다(예를 들어, -PO4 -).
다른 양상은 알릴 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드이며, 올리고뉴클레오타이드는 하기 화학식 (III)의 화합물이다:
식 중 각각의 염기는 독립적으로 아데닌, 구아닌, 사이토신, 티민, 또는 유라실, 또는 이들의 유도체이고; 올리고뉴클레오타이드는 고체 지지체에 선택적으로 결합된다. 일부 실시형태에서, 인산염 기는 음으로 하전될 수 있다(예를 들어, -PO4 -).
일부 양상에서, 올리고뉴클레오타이드의 5' 말단(별표)은 고체 지지체에 결합된다.
추가적인 개시내용은 알릴 뉴클레오타이드를 폴리뉴클레오타이드에 혼입시키기 위한 화학적 시약에 관한 것이되, 화학적 시약은 하기 화학식 (IV)의 화합물이다:
식 중, PG는 H 또는 하이드록실 보호기이고; 염기는 아데닌, 구아닌, 사이토신, 티민, 또는 유라실 또는 이들의 유도체이다.
일부 양상에서, PG는 약산성 조건 하에 절단 가능한 보호기이다. 일부 양상에서, PG는 트라이틸 또는 다이메톡시트라이틸(DMT)이다.
일부 양상은 하기 단계들을 포함하는 화학식 (IV)의 화합물의 제조 방법이다: 하기 화학식 A의 화합물을 비닐 그리나드 시약(예컨대 비닐MgCl 또는 비닐MgBr)과, 선택적으로 실온에서 반응시켜, 하기 화학식 B의 화합물을 형성하는 단계:
.
일부 양상에서, 상기 방법은 화학식 C의 화합물을 (선택적으로 피츠너-모파트(Pfitzner-Moffatt) 산화를 통해, 또는 1-에틸-3-(3-다이메틸아미노프로필)카보다이이미드(EDC) 또는 N,N'-다이사이클로헥실카보다이이미드(DCC), 다이클로로아세트산(DCA) 및 DMSO를 이용하여) 산화시켜:
화학식 A의 화합물을 형성하는 단계.
일부 양상에서, 상기 방법은 화학식 D의 화합물을:
비스-보호된 중간체를 단리시키는 일 없이 염기(예컨대 이미다졸)의 존재 하에 TBDPSCl(tert-뷰틸다이페닐실릴 클로라이드) 다음에 약산, 예컨대 PTSA(p-톨루엔설폰산)과 원-포트 절차로 반응시켜, 화학식 C의 화합물을 형성하는 단계를 포함한다.
다른 양상은 하기 화학식 (I) 구조의 3' 차단 모이어티를 포함하는 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드이다:
식 중, R1은 -NH2, -OH, -NHC(O)ORa 또는 -OCH2OSi(Rb)3이고; Ra는 C1-4 알킬, tert-뷰틸, 알릴, 벤질 또는 9-플루오렌일메틸이며; 각각의 Rb는 C1-4 알킬 및 페닐로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고; 그리고 R2는 H, C1-4 알킬 및 선택적으로 치환된 테트라하이드로퓨란 또는 뉴클레오타이드이다. 일부 실시형태에서, 인산염 기는 음으로 하전될 수 있다(예를 들어, PO4 -).
다른 양상은 화학식 (V)의 구조를 포함하는 3' 인산염 변형된 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드이다:
식 중, R1은 -NH2, -OH, -NHC(O)ORa 또는 -OCH2OSi(Rb)3이고;
Ra는 C1-4 알킬, tert-뷰틸, 알릴, 벤질 또는 9-플루오렌일메틸이며;
각각의 Rb는 C1-4 알킬 및 페닐로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고; 그리고
염기는 선택적으로 보호된 아데닌, 구아닌, 사이토신, 티민, 또는 유라실, 또는 이들의 유도체이다. 일부 실시형태에서, 인산염 기는 음으로 하전될 수 있다(예를 들어, PO4 -). 일부 실시형태에서, 화학식 (V)의 화합물은 화학식 (V')의 화합물로부터 제조될 수 있다:
식 중, X는 O 또는 NH이고; R1'은 보호된 OH(즉, -O-TOM, -O-트라이틸, -O-DMT, -OTMS, -O-TBDMS, -O-TIPS, -OBz) 또는 보호된 NH2(즉, -NH-Boc, -NH-Fmoc, -NH-CBz, -NH-Alloc)이고; 그리고 R1은 NH2 또는 OH이다.
다른 양상은 화학식 (V)의 3' 인산염 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드이며, 여기서 올리고뉴클레오타이드는 화학식 (VI)의 화합물이다:
식 중, R1은 -NH2, -OH, -NHC(O)ORa 또는 -OCH2OSi(Rb)3이고;
Ra는 C1-4 알킬, tert-뷰틸, 알릴, 벤질 또는 9-플루오렌일메틸이며;
각각의 Rb는 C1-4알킬 및 페닐로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고;
각각의 염기는 독립적으로 선택적으로 보호된 아데닌, 구아닌, 사이토신, 티민, 또는 유라실, 또는 이들의 유도체이다. 일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드는 고체 지지체에 선택적으로 결합된다. 일부 실시형태에서, 인산염 기는 음으로 하전될 수 있다(예를 들어, PO4 -). 일부 실시형태에서, 화학식 (VI)의 화합물은 화학식 (VI')의 화합물로부터 제조될 수 있다:
식 중, X는 O 또는 NH이고; R1'은 보호된 OH(즉, -O-TOM, -O-트라이틸, -O-DMT, -OTMS, -O-TBDMS, -O-TIPS, -OBz,) 또는 보호된 NH2(즉, -NH-Boc, -NH-Fmoc, -NH-CBz, -NH-Alloc)이고; 그리고 R1은 NH2 또는 OH이다.
화학식 (V) 또는 (VI)의 일부 양상에서, R1은 -NHC(O)ORa이다. 일부 양상에서, Ra는 9-플루오렌일메틸, 벤질 또는 알릴이다. 일부 양상에서, R1은 -OCH2OSi(Rb)3이다. 일부 양상에서, 각각의 Rb는 아이소프로필이다. 일부 양상에서, 각각의 Rb는 독립적으로 메틸, 에틸, tert-뷰틸 또는 페닐이다.
본 개시내용은 또한 3' 인산염 변형된 뉴클레오타이드를 폴리뉴클레오타이드에 혼입시키기 위한 화학적 시약에 관한 것이다, 화학적 시약은 화학식 (VII)의 화합물이다:
식 중, R1은 상기 명시한 바와 같고; PG는 H 또는 하이드록실 보호기이며; 그리고 염기는 선택적으로 보호된 아데닌, 구아닌, 사이토신, 티민, 또는 유라실, 또는 이들의 유도체이다.
화학식 (VII)의 일부 양상에서, R1은 -NHC(O)ORa이다. 일부 양상에서, Ra는 9-플루오렌일메틸, 벤질 또는 알릴이다. 일부 양상에서, R1은 -OCH2OSi(Rb)3이다. 일부 양상에서, 각각의 Rb는 아이소프로필이다. 일부 양상에서, 각각의 Rb는 독립적으로 메틸, 에틸, tert-뷰틸 또는 페닐이다.
본 개시내용은 또한 폴리뉴클레오타이드 내로 혼입시키기 위한 다이올 링커의 제조 방법에 관한 것이다. 일부 양상에서, 다이올 링커는 미국 특허 제8,715,966호에 기재된 바와 같은 다이올 링커이다. 일부 양상에서, 다이올 링커는 하기 화학식 (VIII)의 구조를 가진다:
식 중, r은 2, 3, 4, 5 또는 6이고;
s는 2, 3, 4, 5 또는 6이며;
"a" 산소는 제1 뉴클레오타이드의 3' 하이드록실 산소이고; 그리고
"b" 산소는 제2 뉴클레오타이드의 5' 하이드록실 산소이다.
일부 양상에서, 다이올 링커는 화학식 (VIIIa)의 구조를 가진다:
식 중, "a" 및 "b"는 상기 명시한 바와 같다.
본 개시내용은 화학식 (VIII) 또는 (VIIIa)의 링커를 폴리뉴클레오타이드 내로 혼입시키기 위한 화학적 시약의 제조 방법에 관한 것이되, 화학적 시약은 화학식 (IX)의 화합물이다:
식 중, r은 2, 3, 4, 5 또는 6이고(일부 양상에서, r은 5임);
s는 2, 3, 4, 5 또는 6이며(일부 양상에서, s는 3임); 그리고
PG는 약산성 조건 하에 제거 가능한 보호기(예를 들어, 트라이틸 또는 다이메톡시트라이틸)이다.
도 1은 일루미나의 합성에 의한 서열분석(SBS) 화학의 작업 흐름의 실시형태를 도시한 도면.
도 2a는 Pd(0) 착물로 처리 전에 그리고 후에 비패턴화된 고프라이머 밀도 유동 셀(flow cell) 표면의 타이푼(Typhoon) 영상으로서, 유동 셀 표면에 알릴 변형된 프라이머가 접합된, 도면.
도 2b는 알릴 작용기가 없는 대조군 프라이머가 접합된 유동 셀 표면에 비교되는, 도 2a에 기재한 Pd(0) 처리 후 프라이머 밀도 변화를 보여주는 막대 그래프를 도시한 도면.
도 3a는 표준 P5/P7 프라이머(통로 5 내지 8)가 접합된 유동 셀에 비교되는, 알릴 변형된 P5 프라이머 및 표준 P7 프라이머(통로 1 내지 4)가 접합된 비패턴화된 고프라이머 밀도 유동 셀로부터의 TET 염료 표면 형광 QC 검정(TET-QC)을 보여주는 막대 차트를 도시한 도면.
도 3b는 도 3a에 기재한 TET-QC 후에 유동 셀 표면의 타이푼 이미지를 도시한 도면.
도 4는 표준 유동 셀 및 새로운 유형의 유동 셀을 이용하는 Miseq(등록상표) 2-통로 기기 상의 서열분석 데이터의 오류율(%)을 도시한 도면.
도 5a는 (Pd(C3H5)Cl)2(6mM), THP(60mM) 및 아스코브산나트륨(6mM)의 제형(N = 2)에 비해 1 내지 10 당량의 THP(10㎎/㎖, 각각의 조건에 대해 N = 4) 존재 하에 Pd(C3H5)Cl)2로부터 단리된 제형의 P15 절단 활성을 도시한 도면.
도 5b는 (Pd(C3H5)Cl)2 (6mM), THP(60mM) 및 아스코브산나트륨(6mM)(N = 2)의 제형에 비교되는, [Pd(C3H5) (THP)2]Cl 및 1 이상의 당량의 THP(12mM Pd, 각각의 조건에 대해 N = 2)를 함유하는 제형의 P15 절단 활성을 도시한 도면.
도 6a는 인시추로 생성된 Pd(0) 시약에 비교되는, 10mM Pd(THM)4에 대한 NovaSeq(상표명) 평균 판독 1 강도를 도시한 도면.
도 6b는 인시추로 생성된 Pd(0) 시약에 비교되는 10mM Pd(THM)4에 대한 NovaSeq(상표명) 평균 PhiX 오류율을 도시한 도면.
도 7은 (Pd(C3H5)Cl)2 (6mM), THP (60mM) 및 아스코브산나트륨(6mM)의 제형에 비교되는 Pd(THP)2-4 (10㎎/㎖)의 P15 절단 활성을 도시한 도면.
도 8은 Pd-THP 또는 Ni-THP에 의한 처리 후 P15/P7 프라이머가 접합된 유동 셀의 형광 강도의 막대 차트를 도시한 도면.
도 2a는 Pd(0) 착물로 처리 전에 그리고 후에 비패턴화된 고프라이머 밀도 유동 셀(flow cell) 표면의 타이푼(Typhoon) 영상으로서, 유동 셀 표면에 알릴 변형된 프라이머가 접합된, 도면.
도 2b는 알릴 작용기가 없는 대조군 프라이머가 접합된 유동 셀 표면에 비교되는, 도 2a에 기재한 Pd(0) 처리 후 프라이머 밀도 변화를 보여주는 막대 그래프를 도시한 도면.
도 3a는 표준 P5/P7 프라이머(통로 5 내지 8)가 접합된 유동 셀에 비교되는, 알릴 변형된 P5 프라이머 및 표준 P7 프라이머(통로 1 내지 4)가 접합된 비패턴화된 고프라이머 밀도 유동 셀로부터의 TET 염료 표면 형광 QC 검정(TET-QC)을 보여주는 막대 차트를 도시한 도면.
도 3b는 도 3a에 기재한 TET-QC 후에 유동 셀 표면의 타이푼 이미지를 도시한 도면.
도 4는 표준 유동 셀 및 새로운 유형의 유동 셀을 이용하는 Miseq(등록상표) 2-통로 기기 상의 서열분석 데이터의 오류율(%)을 도시한 도면.
도 5a는 (Pd(C3H5)Cl)2(6mM), THP(60mM) 및 아스코브산나트륨(6mM)의 제형(N = 2)에 비해 1 내지 10 당량의 THP(10㎎/㎖, 각각의 조건에 대해 N = 4) 존재 하에 Pd(C3H5)Cl)2로부터 단리된 제형의 P15 절단 활성을 도시한 도면.
도 5b는 (Pd(C3H5)Cl)2 (6mM), THP(60mM) 및 아스코브산나트륨(6mM)(N = 2)의 제형에 비교되는, [Pd(C3H5) (THP)2]Cl 및 1 이상의 당량의 THP(12mM Pd, 각각의 조건에 대해 N = 2)를 함유하는 제형의 P15 절단 활성을 도시한 도면.
도 6a는 인시추로 생성된 Pd(0) 시약에 비교되는, 10mM Pd(THM)4에 대한 NovaSeq(상표명) 평균 판독 1 강도를 도시한 도면.
도 6b는 인시추로 생성된 Pd(0) 시약에 비교되는 10mM Pd(THM)4에 대한 NovaSeq(상표명) 평균 PhiX 오류율을 도시한 도면.
도 7은 (Pd(C3H5)Cl)2 (6mM), THP (60mM) 및 아스코브산나트륨(6mM)의 제형에 비교되는 Pd(THP)2-4 (10㎎/㎖)의 P15 절단 활성을 도시한 도면.
도 8은 Pd-THP 또는 Ni-THP에 의한 처리 후 P15/P7 프라이머가 접합된 유동 셀의 형광 강도의 막대 차트를 도시한 도면.
비효소적인 화학적 선형화 전략은 각각의 서열분석 판독보다 앞서 브리지된 이중-가닥 폴리뉴클레오타이드 구조를 절단하기 위한 매력적인 대안이다. 특히, 화학물질은 종종 실온에서 장기간 동안 저장될 수 있고, 효소에 비해 상대적으로 저렴하다. 본 출원은 서열분석을 위한 주형을 생성하기 위해 고체 지지체 상에 고정된 이중-가닥 폴리뉴클레오타이드 클러스터의 화학적 선형화 방법에 관한 것이다. 각각의 이중-가닥 폴리뉴클레오타이드는 제1 가닥 및 제2 가닥을 포함한다. 제1 가닥은 고체 지지체에 고정된 제1 연장 프라이머를 연장시킴으로써 생성되고, 제2 가닥은 고체 지지체에 고정된 제2 연장 프라이머를 연장시킴으로써 생성된다. 제1 가닥 및 제2 가닥 각각은 절단 부위를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 가닥은 팔라듐 착물 또는 니켈 착물, 예를 들어, Pd(0) 착물 또는 Ni(0) 착물에 의해 절단될 수 있는 절단 부위를 포함한다. 특정 실시형태에서, 절단 부위는 제1 가닥의 제1 연장 프라이머 부분에 위치된다. 추가 실시형태에서, 절단 부위는 알릴 작용기를 갖는 티민 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드 유사체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제2 가닥은 화학적 시약, 예를 들어, Na2S2O4에 의해 절단될 수 있는 아조벤젠 링커를 포함하는 절단 부위를 포함한다. 대안적으로, 제2 가닥은 과아이오딘산염, 예를 들어, NaIO4에 의해 절단될 수 있는 다이올 링커를 포함하는 절단 부위를 포함한다. 본 명세서에 기재된 방법은 일루미나(Illumina)(캘리포니아주 샌디에이고에 소재)로부터의 HiSeq(등록상표), MiSeq(등록상표) 또는 NextSeq(등록상표) 시스템과 같은 시스템 상의 합성에 의한 서열분석(SBS) 반응의 부분으로서 사용될 수 있다.
도 1은 일루미나 SBS 화학의 표준 작업 흐름의 실시형태를 기재한다. 첫째로, 고체 지지체 표면 상에 고정된 복수의 P5/P7 프라이머를 포함하는 고체 지지체가 제공된다. P5 및 P7 프라이머 각각은 서열 내에 절단 부위를 가진다. 일 실시형태에서, P5 프라이머 상의 절단 부위는 데옥시유리딘(U)이다. 일 실시형태에서, P7 프라이머 상의 절단 부위는 8-옥소-구아닌 뉴클레오타이드(옥소-G)이다. 서열분석될 표적 DNA 분자의 세트는 고정된 P5/P7 프라이머에 혼성화된다. 혼성화 후에, 본래의 표적 DNA 분자가 제거되어, P5/P7 프라이머를 함유하는 연장된 폴리뉴클레오타이드의 상보성 복제물만을 남긴다. 이 단계는 또한 "파종(seeding)" 단계로서 알려져 있다. 이어서, 연장된 P5/P7 폴리뉴클레오타이드는 "브리지 증폭"으로 불리는 공정을 통해 증폭되어, 이중-가닥 클러스터를 형성하는데, 이는 가닥이 둘 다의 5' 말단이 고체 지지체에 부착되어 있다. "클러스터링" 단계 후에, 제1 선형화는 P5 프라이머를 함유하는 연장된 폴리뉴클레오타이드의 일부를 제거하도록 수행된다. 일 실시형태에서, 이러한 제거는 P5 프라이머 상의 U 위치를 절단하기 위해 효소 USER을 이용하여 효소 절단 반응에 의해 용이하게 된다. SBS의 제1 라운드 후에(판독 1), 이중-가닥 폴리뉴클레오타이드를 다시 형성하기 위한 재합성이 수행된다. 이어서, 제2 선형화가 수행되어 P7 프라이머를 함유하는 연장된 폴리뉴클레오타이드의 일부를 제거한다. 일 실시형태에서, 이러한 제거는 P7 프라이머의 옥소-G 위치를 절단하기 위해 효소 FPG를 이용하는 효소 절단 반응에 의해 용이하게 된다. 이어서, 표적 DNA를 서열분석하기 위한 SBS의 제2 라운드가 수행된다(판독 2).
P5 및 P7 프라이머는 HiSeq(등록상표), MiSeq(등록상표), NextSeq(등록상표) 및 게놈 어날라이저(Genome Analyzer)(등록상표) 플랫폼 상의 서열분석을 위해 일루미나 인코포레이티드(Illumina, Inc.)에 의해 시판되는 상업적 유동 셀의 표면 상에서 사용된다. 프라이머 서열은 본 명세서에 전문이 참고로 편입된 미국 특허 공개 제 2011/0059865 A1에 기재되어 있다.
짝지은 말단 서열분석을 위한 표준 P5 및 P7 프라이머 서열은 다음을 포함한다:
P5: 짝지은 말단 5'→3'
AATGATACGGCGACCACCGAGAUCTACAC (서열번호 1)
P7: 짝지은 말단 5'→3'
CAAGCAGAAGACGGCATACGAG*AT (서열번호 2)
여기서, G*은 8-옥소-구아닌이다.
선택적으로, P5 및 P7 프라이머 중 하나 또는 둘 다는 폴리 T 꼬리를 포함할 수 있다. 폴리 T 꼬리는 일반적으로 상기 서열의 5' 말단에 위치되지만, 일부 경우에, 3' 말단에 위치될 수 있다. 폴리 T 서열은 다수의 T 뉴클레오타이드, 예를 들어, 2 내지 20개를 포함할 수 있다.
폴리-T 스페이서를 갖는 PAZAM 코팅된 유동 셀 상에 사용되는 표준 P5 및 P7 프라이머 서열은 하기를 포함한다:
폴리-T 스페이서를 갖는 P5 프라이머:
5'-알킨-TTTTTTTTTTAATGATACGGCGACCACCGAGAUCTACAC (서열번호 3)
폴리-T 스페이서를 갖는 P7 프라이머:
5'-알킨-TTTTTTTTTTCAAGCAGAAGACGGCATACGAG*AT (서열번호 4)
여기서, G*은 8-옥소-구아닌이다.
추가적인 프라이머 서열은 단일 판독 SBS에 대해 P5 및 P7 프라이머 세트를 포함한다:
P5: 단일 판독: 5'→ 3'
AATGATACGGCGACCACCGA (서열번호 7)
P7: 단일 판독: 5'→ 3'
CAAGCAGAAGACGGCATACGA (서열번호 8)
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 표준 P5/P7 프라이머 또는 올리고가, 예를 들어, Pd 착물 또는 Ni 착물에 의한 화학적 절단을 겪을 수 있는 제1 절단 부위 또는 제2 절단 부위를 혼입시키도록 변형될 때, P5/P7 프라이머의 변형은 P5/P7 서열 내 존재하는 뉴클레오타이드(또는 뉴클레오사이드)의 상이한 화학적 독립체, 예를 들어, 부위-특이적 화학적 절단을 가능하게 하는 특정 작용기를 갖는 변형된 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오사이드 유사체로의 대체 또는 치환을 지칭할 수 있다. 변형은 또한 존재하는 P5/P7 서열 내로 새로운 화학적 독립체의 삽입을 지칭할 수 있으며, 여기서, 새로운 화학적 독립체는 부위 특이적 화학적 절단을 겪을 수 있다. 일부 실시형태에서, 변형된 P5/P7 프라이머는 각각 P15/P17 프라이머로서 지칭되며, 하기를 포함한다:
P15 프라이머 5'→3'
5'-알킨-TTTTTTAATGATACGGCGACCACCGAGAXCTACAC (서열번호 5)
여기서, X = 반응식 1에 나타낸 바와 같은 알릴 T 뉴클레오사이드.
P17 프라이머 5'→3'
5'-알킨-TTTTTTYYYCAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT (서열번호 6)
여기서, Y는 화학적 절단, 예를 들어, 전문이 참고로 편입된 미국 특허 공개 제2012/0309634호에 개시된 바와 같은, 과아이오딘산염과 같은 시약에 의한 산화에 의해 화학적 절단이 실시되는 다이올 링커이다. 일부 실시형태에서, 다이올 링커는 본 명세서에 기재된 바와 같은 화학식 (VIII) 또는 (VIIIa)를 포함한다.
정의
본 명세서에서 사용되는 부문 표제는 단지 조직적 목적을 위한 것이며, 기재된 대상을 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 용어 "포함하는(including)"뿐만 아니라 다른 형태, 예컨대 "포함하다(include)", "포함하다(includes)" 및 "포함된(included)"은 제한적이지 않다. 용어 "갖는"뿐만 아니라 다른 형태, 예컨대 "가지다(have)", "가지다(has)" 및 "가졌다(had)"의 사용은 제한적이지 않다. 연결구에서이든 또는 청구범위의 본문에서이든 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "포함하다(comprise(s))" 및 "포함하는(comprising)"은 제약이 없는 의미를 갖는 것으로 해석되어야 한다. 즉, 상기 용어는 어구 "적어도 갖는" 또는 "적어도 포함하는"과 동의어로 해석되어야 한다. 예를 들어, 공정과 관련하여 사용될 때, 용어 "포함하는(comprising)"은 상기 과정이 적어도 열거된 단계들을 포함하지만, 추가적인 단계들을 포함할 수도 있다는 것을 의미한다. 화합물, 조성물 또는 장치와 관련하여 사용될 때, 용어 "포함하는(comprising)"은 화합물, 조성물 또는 장치가 적어도 인용된 특징 또는 성분을 포함하지만, 또한 추가적인 특징들 또는 성분들을 포함할 수도 있다는 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는, 통상적인 유기 약어를 이하에 정의한다:
Ac
아세틸
Ac2O
아세트산 무수물
Alloc
알릴옥시카보닐
aq.
수성
BOC 또는 Boc
tert-부톡시카보닐
Bz
벤질
℃
섭씨 온도
Cbz
벤질옥시카보닐
CVD
화학 기상 증착법
dATP
데옥시아데노신 3인산
dCTP
데옥시사이티딘 3인산
dGTP
데옥시구아노신 3인산
dTTP
데옥시티미딘 3인산
ddNTP(s)
다이데옥시뉴클레오타이드(들)
DCM
염화메틸렌
DMF
다이메틸폼아마이드
DMT 또는 DMTr
다이메톡시트라이틸
EtOAc
에틸 아세테이트
FC
유동 셀
Fmoc
플루오렌일메틸옥시카보닐
g
그램(들)
h 또는 hr
시간(들)
IPA
아이소프로필 알코올
LCMS
액체 크로마토그래피-질량분석법
㎖
밀리리터(들)
Ni
니켈
PE
석유 에터
PAZAM
임의의 아크릴아마이드의 폴리(N-(5-아지도아세트아미딜펜틸) 아크릴아마이드-코-아크릴아마이드) 대 아자파 비
Pd
팔라듐
rt
실온
SBS
합성에 의한 서열분석
TBAF
테트라-n-뷰틸암모늄 플루오라이드
TBDMS
트라이뷰틸다이메틸실릴
TEA
트라이에틸아민
TFA
트라이플루오로아세트산
Tert, t
3차
THF
테트라하이드로퓨란
THM
트리스(하이드록시메틸)포스핀
THP
트리스(하이드록시프로필)포스핀
TIPS
트라이아가소프로필실릴
TLC
박층 크로마토그래피
TMS
트라이메틸실릴
TOM
트라이아가소프로필실릴옥시메틸
트라이틸
트라이페닐메틸
㎕
마이크로리터(들)
본 명세서에서 사용되는 용어 "공유 부착된" 또는 "공유 결합된"은 원자 사이의 전자 쌍의 공유를 특징으로 하는 화학 결합의 형성을 지칭한다. 예를 들어, 공유 부착된 중합체 코팅은 다른 수단을 통한 표면 부착, 예를 들어, 접착 또는 정전기적 상호작용에 비해, 기질의 작용기화된 표면과 화학 결합을 형성하는 중합체 코팅을 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "연장 프라이머"는 고체 지지체 상에 고정된 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드를 지칭하며, 여기서, 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드는 표적 단일 가닥 핵산 분자의 서열에 특이적으로 결합할 수 있다. 혼성화 과정 후에, 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드는 표적 핵산 분자에 상보성인 서열을 포함하도록 연장된다. 일부 예에서, 용어 "연장 프라이머"는 "증폭 프라이머"와 상호 호환적으로 사용된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "핵산" 및 "뉴클레오타이드"는 당업계에서의 그들의 용도와 일치되며 천연 유래 종 또는 이들의 기능성 유사체를 포함하는 것으로 의도된다. 핵산의 특히 유용한 작용 유사체는 서열 특이적 방식으로 핵산에 혼성화할 수 있거나 또는 특정 뉴클레오타이드 서열의 복제를 위한 주형으로서 사용될 수 있다. 천연 유래 핵산은 일반적으로 포스포다이에스터 결합을 함유하는 골격을 가진다. 유사체 구조는 임의의 다양한 당업계에 공지된 것을 포함하는 교번의 골격 결합을 가질 수 있다. 천연 유래 핵산은 일반적으로 데옥시리보스 당(예를 들어, 데옥시리보핵산(DNA)에서 발견됨) 또는 리보스 당(예를 들어, 리보핵산(RNA)에서 발견됨)을 가진다. 핵산은 당업계에 공지된 이들 당 모이어티의 임의의 다양한 유사체를 갖는 뉴클레오타이드를 함유할 수 있다. 핵산은 천연 또는 비천연 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 이와 관련하여, 천연 데옥시리보핵산은 아데닌, 티민, 사이토신 또는 구아닌으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 염기를 가질 수 있고, 리보핵산은 유라실, 아데닌, 사이토신 또는 구아닌으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 염기를 가질 수 있다. 핵산 또는 뉴클레오타이드에 포함될 수 있는 유용한 비천연 염기는 당업계에 공지되어 있다. 용어 "프로브" 또는 "표적"은 핵산에 관해 사용될 때, 본 명세서에 제시된 방법 또는 조성물과 관련하여 핵산에 대한 의미론적 식별자로서 의도되고, 달리 명확하게 표시되는 것 이상으로 핵산의 구조 또는 기능을 반드시 제한하지는 않는다. 용어 "프로브" 및 "표적"은 다른 분석물, 예컨대 단백질, 소분자, 세포 등에 유사하게 적용될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "폴리뉴클레오타이드"는 일반적으로 DNA(예를 들어, 게놈 DNA cDNA), RNA(예를 들어, mRNA), 합성 올리고뉴클레오타이드 및 합성 핵산 유사체를 비롯한 핵산을 지칭한다. 폴리뉴클레오타이드는 천연 또는 비천연 염기, 또는 이들의 조합 및 천연 또는 비천연 골격 결합, 예를 들어, 포스포로티오에이트, PNA 또는 2'-O-메틸-RNA, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 일부 예에서, 용어 "폴리뉴클레오타이드", "올리고뉴클레오타이드" 또는 "올리고"는 상호 호환적으로 사용된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "절단 부위"는 폴리뉴클레오타이드의 일부가 절단 반응에 의해 제거될 수 있는 폴리뉴클레오타이드 서열 상의 위치를 지칭한다. 절단 부위의 위치는 바람직하게는 사전결정되어 있는데, 이는 절단 반응이 일어나는 위치가 미리 알려지지 않은 위치인 무작위 부위에서의 절단과 대조적으로 미리 결정된다는 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "고체 지지체"는 수성 액체 중에서 불용성인 강성 기재를 지칭한다. 상기 기재는 비다공성 또는 다공성일 수 있다. 기재는 선택적으로 액체(예를 들어, 다공성에 기인)를 취할 수 있지만, 액체를 취할 때 기재가 실질적으로 팽창하지 않고 액체가 건조에 의해 제거될 때 실질적으로 줄어들지 않도록 전형적으로 충분히 강성일 것이다. 비다공성 고체 지지체는 일반적으로 액체 또는 기체에 대해 불침투성이다. 예시적인 고체 지지체는 유리 및 개질된 또는 작용기화된 유리, 플라스틱(예를 들어, 아크릴, 폴리스타이렌 및 스타이렌과 다른 물질의 공중합체, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 폴리뷰틸렌, 폴리우레탄, 테플론(Teflon)(상표명), 환식 올레핀, 폴리이미드 등), 나일론, 세라믹, 수지, 제오노르(Zeonor), 실리카 또는 실리카계 물질(실리콘 및 개질 실리콘을 포함), 탄소, 금속, 무기 유리, 광섬유 다발, 및 중합체를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 일부 실시형태에 특히 유용한 고체 지지체는 유동 셀의 성분이거나 또는 유동 셀 장치 내에 위치된다. 고체 지지체는 평면, 예를 들어, 유동 셀, 또는 비평면, 예를 들어, 비드를 가질 수 있다.
치환체가 2-라디칼로서 도시되는 경우에(즉, 분자의 나머지에 대해 2개의 부착 지점을 갖는 경우에), 달리 표시되지 않는 한, 치환체는 임의의 방향적 구성으로 부착될 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 따라서, 예를 들어, -AE- 또는 로서 도시되는 치환체는 A가 분자의 가장 왼쪽 부착 지점에 부착되도록 배향되는 치환체뿐만 아니라 A가 분자의 가장 오른쪽 부착 지점에 부착되는 경우를 포함한다.
팔라듐(Pd) 또는 니켈(Ni) 보조된 제1 화학적 선형화 방법
본 개시내용의 일부 실시형태는 하기 단계들을 포함하는, 복수의 고정된 이중-가닥 폴리뉴클레오타이드의 선형화 방법에 관한 것이다: 이중-가닥 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 고체 지지체를 제공하는 단계로서, 각각의 이중-가닥 폴리뉴클레오타이드는 제1 가닥 및 제2 가닥을 포함하고, 제1 가닥 및 제2 가닥은 그들의 5' 말단이 고체 지지체에 각각 고정되며, 각각의 제1 가닥은 절단 시약의 존재 하에 화학적 절단을 겪을 수 있는 제1 절단 부위를 포함하는, 상기 고체 지지체를 제공하는 단계; 이중-가닥 폴리뉴클레오타이드를 절단 시약과 접촉시킴으로써, 제1 절단 부위에서 하나 이상의 제1 가닥을 절단시키고, 하나 이상의 절단된 제1 핵산 및 절단 고정된 제1 가닥을 생성하는 단계; 및 절단된 제1 핵산을 고체 지지체로부터 제거하는 단계. 일부 양상에서, 절단 부위는 Pd 착물 또는 Ni 착물의 존재 하에 절단을 겪을 수 있다. 일부 양상에서, 절단 시약은 Pd 착물 또는 Ni 착물의 수용액이다. 일부 양상에서, 절단 시약은 인시추로 제조된다.
본 명세서에 기재된 Pd/Ni 선형화 방법의 일부 실시형태에서, 각각의 제1 가닥은 고체 지지체에 고정된 제1 연장 프라이머로부터 연장된다. 일부 이러한 실시형태에서, 제1 연장 프라이머는 본 명세서에 개시된 바와 같은 P5 또는 P7 서열, 또는 P5 또는 P7에 상보성인 서열인 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, 제1 연장 프라이머는 P5 뉴클레오타이드 서열(서열번호 1)을 포함한다. 추가 실시형태에서, 제1 연장 프라이머는 폴리-T 스페이서 P5 뉴클레오타이드 서열(서열번호 3)을 포함한다. 일 실시형태에서, 제1 연장 프라이머는 P5 프라이머이다. 추가 실시형태에서, 제1 연장 프라이머는 폴리-T 스페이서 P5 프라이머이다. 추가 실시형태에서, 제1 연장 프라이머는 본 명세서에 개시된 바와 같은 P5 또는 P7 서열, 또는 P5 또는 P7에 상보성인 서열인 뉴클레오타이드 서열을 포함하되, 서열의 하나의 뉴클레오타이드는 팔라듐 착물의 존재 하에 절단되기 쉬운 변형된 뉴클레오타이드에 의해 대체된다. 일부 양상에서, 제1 연장 프라이머는 본 명세서에 기재된 바와 같은 P15의 뉴클레오타이드 서열(서열번호 5)을 포함한다.
본 명세서에 기재된 Pd/Ni 선형화 방법의 일부 실시형태에서, 제1 연장 프라이머는 제1 절단 부위를 포함한다. 일부 추가적인 실시형태에서, 제1 절단 부위는 화학적 절단, 예를 들어 팔라듐 착물에 의해 화학적 절단을 겪을 수 있는 변형된 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오사이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 변형된 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드는 하기 화학식 (II)의 구조를 가진다:
식 중, R은 H, OH 또는 OPG이고; R1은 H 또는 PG이며; R2는 H, PG이거나, 또는 -OR2는 인산염 기이며; PG는 하이드록실 보호기이고; 염기는 아데닌, 구아닌, 사이토신, 티민, 또는 유라실, 또는 이들의 유도체이다. 일부 실시형태에서, 인산염 기는 음으로 하전될 수 있다(예를 들어, -PO4 -). 일 양상에서, 변형된 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드는 하기 화학식 (IIa)의 구조를 가진다:
.
일부 실시형태에서, 변형된 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드 모이어티를 혼입시키는 제1 절단 부위는 화학식 (II')의 구조를 포함하며, 여기서 알릴 변형된 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드의 3' 산소는 다른 뉴클레오타이드의 5' 말단에 공유 부착된다(구조는 나타내지 않음):
. 일부 실시형태에서, 인산염 기는 음으로 하전될 수 있다(예를 들어, -PO4 -).
일부 추가적인 실시형태에서, 변형된 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오사이드는 추가로 검출 가능한 표지, 예를 들어, 형광 표지로 표지될 수 있다. 일부 실시형태에서, 변형된 뉴클레오타이드는 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오사이드의 5' 탄소에서 비닐 치환체를 포함하며, 따라서 5' 하이드록실기에 대해 알릴 모이어티를 형성한다. 일부 실시형태에서, 5' 하이드록실기는 다이뉴클레오타이드 단위가 알릴 인산염 모이어티를 갖는 절단 부위를 포함하도록, 제2 뉴클레오타이드의 3' 인산염에 연결된다. 일부 실시형태에서, 변형된 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오사이드는 티민 (T) 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드 유사체이다. 일부 추가적인 실시형태에서, 3' 하이드록실 보호(또는 차단)기, 예를 들어, 인산염 모이어티(화학식 (II)에서와 같음)는 제1 가닥의 화학적 절단 후에 절단 고정된 제1 가닥 상에 남아있다. 하나의 이러한 실시형태에서, 제2 뉴클레오타이드의 3' 인산염 모이어티는 변형된 뉴클레오사이드 유사체의 5'-탄소 위치에 공유결합된다(즉, 인산염 기는 변형된 뉴클레오타이드의 5' 하이드록실을 포함한다). 일부 실시형태에서, 절단 부위는 제1 연장 프라이머의 3' 말단 근처에, 예를 들어, 제1 연장 프라이머의 3' 말단으로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 뉴클레오타이드 거리 내에 위치된다. 일부 다른 실시형태에서, 절단 부위는 제1 연장 프라이머의 5' 말단 근처에, 예를 들어, 제1 연장 프라이머의 5' 말단으로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 뉴클레오타이드 거리 내에 위치된다. 일부 경우에, DNA 재합성을 보장하기 위해, 절단 부위는 바람직하게는 제1 프라이머의 3' 말단을 향해, 예를 들어, 2 내지 8, 또는 3 내지 7, 또는 4 내지 6개의 뉴클레오타이드 거리 내에 위치된다. 일 실시형태에서, 제1 연장 프라이머는 P5 프라이머이고, 제1 절단 부위는 P5 프라이머 서열 내에 위치된다(예를 들어, 변형된 뉴클레오타이드는 대체하는 하나의 뉴클레오타이드를 첨가함으로써, P5 프라이머 서열에 혼입된다). 따라서, 본 명세서에 개시된 P5 서열(서열번호 1 또는 서열번호 3)은 Pd/Ni 착물에 의해 화학적 절단을 겪을 수 있는 제1 절단 부위를 포함하도록 변형되고, 따라서, 변형된 P5 프라이머를 형성한다. 하나의 실시형태에서, 변형된 P5 프라이머는 본 명세서에 개시된 P15 프라이머를 포함한다(서열번호 5).
팔라듐 시약
본 명세서에 기재된 Pd 선형화 방법의 일부 실시형태에서, 화학적 선형화 방법에서 사용되는 Pd 착물은 수용성이다. 일부 이러한 실시형태에서, Pd 착물은 Pd(0) 착물이다. 일부 예에서, Pd(0) 착물은 알켄, 알코올, 아민, 포스핀 또는 금속 수화물과 같은 시약에 의한 Pd(II) 착물의 환원으로부터 인시추로 생성될 수 있다. 적합한 팔라듐 공급원은 Na2PdCl4, (PdCl(C3H5))2, [Pd(C3H5)(THP)]Cl, [Pd(C3H5)(THP)2]Cl, Pd(OAc)2, Pd(Ph3)4, Pd(dba)2 및 Pd(TFA)2를 포함한다. 하나의 이러한 실시형태에서, Pd(0) 착물은 Na2PdCl4로부터 인시추로 생성된다. 다른 실시형태에서, 팔라듐 공급원은 염화 알릴 팔라듐(II) 이량체[(PdCl(C3H5))2]이다. 일부 실시형태에서, Pd(0) 착물은 Pd(II) 착물을 포스핀과 혼합함으로써 수용액 중에서 생성된다. 적합한 포스핀은 수용성 포스핀, 예컨대 트리스(하이드록시프로필)포스핀(THP), 트리스(하이드록시메틸)포스핀(THM), 1,3,5-트라이아자-7-포스파아다만탄(PTA), 비스(p-설포네이토페닐)페닐포스핀 2수화물 칼륨염, 트리스(카복시에틸)포스핀(TCEP) 및 트라이페닐포스핀-3,3',3''-트라이설폰산 3나트륨 염을 포함한다.
일부 실시형태에서, Pd(0)는 인시추로 Pd(II) 착물 [(PdCl(C3H5))2]을 THP와 혼합함으로써 제조된다. Pd(II) 착물과 THP의 몰비는 약 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9 또는 1:10일 수 있다. 일부 추가적인 실시형태에서, 1종 이상의 환원제, 예컨대 아스코브산 또는 이의 염(예를 들어, 아스코브산나트륨)이 첨가될 수 있다.
일부 실시형태에서, Pd(0)는 Pd(II) 전-촉매, 예컨대 [Pd(C3H5)(THP)]Cl, [Pd(C3H5)(THP)2]Cl을 추가적인 THP와 혼합함으로써 제조된다. [Pd(C3H5)(THP)]Cl 및 [Pd(C3H5)(THP)2]Cl은 (PdCl(C3H5))2를 1 내지 5당량의 THP와 반응시킴으로써 제조될 수 있고, 그들은 화학적 선형화 반응에서 사용 전에 단리될 수 있다.
일부 다른 실시형태에서, Pd(0) 착물은 Pd(THM)4, Pd(THP)2, Pd(THP)3 또는 PD(THP)4, 또는 이들의 조합물이다.
니켈 시약
본 명세서에 기재된 Ni 선형화 방법의 일부 실시형태에서, 화학적 선형화 방법에서 사용되는 Ni 착물은 수용성이다. 일부 이러한 실시형태에서, Ni 착물은 Ni(0) 착물이다. 일부 예에서, Ni 착물은 알켄, 알코올, 아민, 포스핀 또는 금속 수화물과 같은 시약에 의해 Ni(II) 화합물의 환원으로부터 인시추로 생성될 수 있다. 일부 실시형태에서, Ni(II) 화합물은 NiCl2이다. 적합한 포스핀은 수용성 포스핀, 예컨대 트리스(하이드록시프로필)포스핀(THP), 트리스(하이드록시메틸)포스핀(THM), 1,3,5-트라이아자-7-포스파아다만탄(PTA), 비스(p-설포네이토페닐)페닐포스핀 2수화물 칼륨 염, 트리스(카복시에틸)포스핀(TCEP), 및 트라이페닐포스핀-3,3',3''-트라이설폰산 3나트륨 염을 포함한다. 일 실시형태에서, Ni 착물은 NiCl2를 1 내지 10 당량의 THP와 혼합함으로써 제조된다.
본 개시내용의 일부 실시형태는 하기 단계들을 포함하는, 복수의 고정된 이중-가닥 폴리뉴클레오타이드의 선형화 방법에 관한 것이다: 이중-가닥 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 고체 지지체를 제공하는 단계로서, 각각의 이중-가닥 폴리뉴클레오타이드는 제1 가닥 및 제2 가닥을 포함하되, 각각의 제1 가닥은 고체 지지체에 고정된 변형된 P5 프라이머로부터 연장되고, 각각의 제2 가닥은 고체 지지체에 고정된 P7 프라이머로부터 연장되며, 제1 가닥과 제2 가닥은 둘 다 그들의 5'이 고체 지지체에 고정되고, 각각의 변형된 P5 프라이머는 Pd(0) 착물에 의해 화학적 절단을 겪을 수 있는 제1 절단 부위를 포함하는, 상기 고체 지지체를 제공하는 단계; 이중-가닥 폴리뉴클레오타이드를 Pd(0) 착물의 수용액과 접촉시킴으로써, 제1 절단 부위에서 하나 이상의 제1 가닥을 절단하고, 하나 이상의 절단된 제1 핵산 및 절단 고정된 제1 가닥을 생성하는 단계; 및 절단된 제1 핵산을 고체 지지체로부터 제거하는 단계. 일부 실시형태에서, 제1 절단 부위는 알릴 작용기를 갖는 변형된 T 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드를 포함한다. 절단 부위는 절단 고정된 제1 가닥의 3'-OH를 차단시키는 Pd 절단 반응 후에 제1 가닥 상에 남아있는, 3'-차단 모이어티, 예를 들어, 인산염 모이어티를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 3' 차단 모이어티는 화학 반응에 의해 또는 효소 반응에 의해 탈보호될 수 있는 인산염 기를 함유하는 변형된 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드를 포함한다. 일 실시형태에서, 변형된 P5 프라이머는 P15를 포함하거나, 또는 P15이다.
3'-탈보호
본 개시내용의 일부 실시형태는 하기 단계들을 포함하는 올리고뉴클레오타이드로부터 3' 말단 보호기를 제거하는 방법에 관한 것이다: 5' 말단이 고정된, 복수의 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 고체 지지체를 제공하는 단계로서, 상기 올리고뉴클레오타이드는 각각 본 명세서에 기재된 바와 같은 화학식 (I)의 구조를 갖는 3' 말단 보호기를 포함하는, 상기 고체 지지체를 제공하는 단계; 및 올리고뉴클레오타이드를 탈보호 시약과 접촉시킴으로써, 3' 말단 보호기를 절단하여 각각 유리 3' 말단 하이드록실기를 갖는 올리고뉴클레오타이드를 생성하는 단계. 하기 화학식 (I)의 구조를 갖는 3' 말단 변형된 인산염 모이어티:
식 중, R1은 -NH2, -OH, -NHC(O)ORa 또는 -OCH2OSi(Rb)3이고; Ra는 C1-4 알킬, tert-뷰틸, 알릴, 벤질 또는 9-플루오렌일메틸이며; 각각의 Rb는 독립적으로 C1-4알킬 및 페닐로 이루어진 군으로부터 선택되고; 그리고 R2는 H, C1-4 알킬, 선택적으로 치환된 테트라하이드로퓨란, 또는 뉴클레오타이드이다.
일부 추가적인 실시형태에서, 보호기는 하기 화학식 (V)의 구조를 포함한다:
식 중, 염기는 선택적으로 보호된 아데닌, 구아닌, 사이토신, 티민, 또는 유라실, 또는 이들의 유도체이다. 일부 실시형태에서, 화학식 (I) 또는 (V)에서 하나 이상의 인산염기는 음으로 하전될 수 있다(예를 들어, PO4 -).
화학식 (I) 또는 (V)의 일부 실시형태에서, R1은 -NHC(O)ORa이다. 일부 실시형태에서, Ra는 9-플루오렌일메틸, 벤질 또는 알릴이다. 일부 실시형태에서, R1은 -OCH2OSi(Rb)3이다. 일부 실시형태에서, 각각의 Rb는 아이소프로필이다. 일부 실시형태에서, 각각의 Rb는 독립적으로 메틸, 에틸, tert-뷰틸 또는 페닐이다.
일부 실시형태에서, 화학식 (I) 또는 (V)의 변형된 인산염 기는 화학적 탈보호 시약, 예컨대 플루오린화물 함유 시약 또는 염기에 의해 제거될 수 있다. 비제한적 예는 테트라-n-뷰틸암모늄 플루오라이드(TBAF), HF, NH4F, CsF, NaOH 및 KOH, 및 이들의 조합물을 포함한다.
본 명세서에 기재된 Pd/Ni 선형화 방법의 일부 실시형태에서, 제1 선형화 후에, 고정된 제1 가닥의 남아있는 부분은 탈보호된 3' 말단 하이드록실기를 갖고, 상기 방법은 Pd/Ni 절단 반응 후에 절단 고정된 제1 가닥의 남아있는 부분의 3' 말단을 차단하는 단계를 추가로 포함한다. 하나의 이러한 실시형태에서, 차단은 3' 하이드록실 보호기로서 절단 고정된 제1 가닥의 3' 말단을 인산화시키는 단계를 포함한다. 일부 다른 실시형태에서, 각각 절단 고정된 제1 가닥의 3' 말단은 보호기를 포함한다. 일부 이러한 실시형태에서, 차단 효과는 절단 반응 후에 절단 고정된 제1 가닥 상에 남아있는 인산염 모이어티 또는 변형된 인산염 모이어티에 의해 달성될 수 있는데, 이는 절단 고정된 제1 가닥의 3'-OH에 대한 차단기로서 작용한다. 일부 실시형태에서, 변형된 인산염 모이어티는 본 명세서에 기재된 바와 같은 화학식 (I) 또는 (V)의 구조를 포함한다.
인산염 기 또는 변형된 인산염 기는 고정된 제2 가닥에 상보성인 파생적 제1 가닥을 생성하기 위해 DNA 재합성 전에 제거된다. 일부 실시형태에서, 3' 말단 보호기는 인산염 기인데, 이는 T4PNK와 같은 포스파타제에 의해 제거될 수 있다. 일부 다른 실시형태에서, 3' 말단 보호기는 화학식 (I) 또는 (V)의 변형된 인산염기이며, 이는 플루오린화물 함유 시약 또는 염기, 예컨대 테트라-n-뷰틸암모늄 플루오라이드(TBAF), HF, NH4F, CsF, NaOH 또는 KOH, 또는 이들의 조합물에 의해 제거될 수 있다.
제2 선형화 방법
본 명세서에 기재된 Pd/Ni 선형화 방법의 일부 실시형태에서, 각각의 제2 가닥은 고체 지지체에 고정된 제2 연장 프라이머로부터 연장되고, 각각의 제2 가닥은 제2 절단 부위를 포함한다. 일부 이러한 실시형태에서, 제2 연장 프라이머는 본 명세서에 개시된 바와 같은 P5 또는 P7 서열, 또는 P5 또는 P7에 상보성인 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, 제2 연장 프라이머는 P7 뉴클레오타이드 서열(서열번호 2)을 포함한다. 추가 실시형태에서, 제2 연장 프라이머는 폴리-T 스페이서 P7 뉴클레오타이드 서열(서열번호 4)을 포함한다. 일부 양상에서, 제2 연장 프라이머는 변형된 뉴클레오타이드가 혼입된(서열 내 염기에 첨가하거나 또는 이를 3' 하이드록실 보호기를 갖는 염기로 대체함) P5 또는 P7인 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 추가 실시형태에서, 제2 연장 프라이머는 P17 프라이머를 포함한다(서열번호 6). 일 실시형태에서, 제2 연장 프라이머는 P7 프라이머이다. 추가 실시형태에서, 제2 연장 프라이머는 폴리-T 스페이서 P7 프라이머이다. 다른 실시형태에서, 제2 연장 프라이머는 P17 프라이머이다.
본 명세서에 기재된 Pd/Ni 선형화 방법의 일부 실시형태에서, 제2 연장 프라이머는 제2 절단 부위를 포함한다. 일부 이러한 실시형태에서, 제2 절단 부위는 팔라듐 착물 또는 니켈 착물에 의한 화학적 절단을 겪을 수 없다. 일부 양상에서, 제2 절단 부위는 화학적 절단, 광 절단, 효소 절단 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 방법에 의해 절단될 수 있다. 일 실시형태에서, 제2 절단 부위는 효소 절단 반응에 의해 절단될 수 있다. 일 실시형태에서, 제2 연장 프라이머는 본 명세서에 개시된 P7 프라이머(서열번호 2 또는 서열번호 4)이고, 제2 절단 부위는 옥소-G이다. 일부 이러한 실시형태에서, 절단 반응을 위해 사용되는 효소는 FPG이다.
일부 다른 실시형태에서, 제2 절단 부위는 화학적 절단 반응에 의해 절단될 수 있다. 하나의 이러한 실시형태에서, 제2 연장 프라이머는 본 명세서에 기재된 방식에 따른 화학적 절단에 민감한 변형된 뉴클레오타이드를 포함하도록 변형된 P7 프라이머를 포함하거나 또는 이러한 P7 프라이머이다. 일부 실시형태에서, 제2 연장 프라이머는 본 명세서에 개시된 P17 프라이머(서열번호 6)를 포함하거나 또는 이러한 P17 프라이머이고, 제2 절단 부위는 과아이오딘산염, 예를 들어, 과아이오딘산나트륨에 의한 처리에 의해 절단될 수 있는 하나 이상의 다이올 결합을 포함한다. 일부 이러한 실시형태에서, 다이올 링커는 화학식 (VIII)의 구조를 포함한다:
식 중, r은 2, 3, 4, 5 또는 6이고;
s는 2, 3, 4, 5 또는 6이며;
"a" 산소는 제1 뉴클레오타이드의 3' 하이드록실 산소이고; 그리고
"b" 산소는 제2 뉴클레오타이드의 5' 하이드록실 산소이다.
일부 실시형태에서, 다이올 링커는 화학식 (VIIIa)의 구조를 가진다:
식 중, "a" 및 "b"는 상기 정의한 바와 같다.
일부 다른 실시형태에서, 제2 절단 부위는 화학적 절단 시약, 예를 들어, Na2S2O4에 의해 절단될 수 있는 아조벤젠 링커를 포함한다. 일부 이러한 실시형태에서, 아조벤젠 링커는 화학식 (X)의 구조를 포함한다:
식 중, R1은 H, 하이드록실, 또는 보호된 하이드록실이고; R2는 H, C1-6 알킬, 또는 C1-6 알콕시이며; 각각의 R3 및 R4는 독립적으로 H, 할로, -C(O)OR5 또는 -C(O)NHR6이고; 각각의 R5 및 R6은 독립적으로 H, C1-6 알킬, 또는 C6-10 아릴이며; X는 -C(O)-, -CH2- 또는 -C(O)NH-이고; 각각의 m1, m2 및 m3은 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5 또는 6이다. 일부 양상에서, R1은 하이드록실이다. 일부 다른 양상에서, R1은 보호된 하이드록실, 예컨대 -OBz이다. 일부 양상에서, R3은 -C(O)OR5이다. 일부 양상에서, R3은 -C(O)NHR6이다. 일부 이러한 양상에서, R5 및 R6은 독립적으로 C1-6 알킬, 예컨대 메틸, 에틸, 아이소프로필 또는 t-뷰틸이다. 일부 다른 양상에서, R3은 H이다. 일부 양상에서, R2는 H이다. 일부 양상에서, R4는 H이다. 일부 양상에서, X는 -CH2-이다. 일부 다른 양상에서, X는 -C(O)NH-이다. 일부 양상에서, m1은 2, 3 또는 4이다. 일부 양상에서, m2는 1, 2 또는 3이다. 일부 양상에서, m3은 1, 2 또는 3이다.
화학식 (X)의 아조벤젠 링커의 일부 실시형태에서, 하나의 말단 산소 원자는 인산염 기, 예를 들어, 하기 화학식 (Xa) 또는 화학식 (Xb)의 구조에 의해 인산염 기에 추가로 연결된다:
일부 양상에서, "a" 산소는 제1 뉴클레오타이드의 3' 하이드록실 산소이다. 일부 양상에서, "b" 산소는 제2 뉴클레오타이드의 5' 하이드록실 산소이다. 일부 다른 양상에서, "b" 산소는 제1 뉴클레오타이드의 3' 하이드록실 산소이다. 일부 다른 양상에서, "a" 산소는 제2 뉴클레오타이드의 5' 하이드록실 산소이다.
화학식 (Xa) 또는 (Xb)의 아조벤젠 링커는 화학적 시약에 의해 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 내로 혼입될 수 있으며, 화학적 시약은 화학식 (XIa) 또는 (XIb)의 포스포르아미다이트 화합물이다:
식 중, R1-R4, X, m1, m2 및 m3은 (X)에 명시되어 있고; 그리고
PG는 약산성 조건 하에 제거 가능한 보호기(예를 들어, 트라이틸 또는 다이메톡시트라이틸)이다.
본 발명의 일부 추가적인 실시형태는 하기 단계들을 포함하는 복수의 고정된 이중-가닥 폴리뉴클레오타이드의 선형화 방법에 관한 것이다: 이중-가닥 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 고체 지지체를 제공하는 단계로서, 각각의 이중-가닥 폴리뉴클레오타이드는 제1 가닥 및 제2 가닥을 포함하되, 제1 가닥 및 제2 가닥은 그들의 5' 말단이 고체 지지체에 고정되고, 각각의 제1 가닥은 제1 절단 부위를 포함하며, 각각의 제2 가닥은 아조벤젠 링커를 포함하는 제2 절단 부위를 포함하는, 상기 고체 지지체를 제공하는 단계; 제1 절단 부위에서 하나 이상의 제1 가닥을 절단하고, 하나 이상의 절단된 제1 핵산 및 절단 고정된 제1 가닥을 생성하는 단계; 절단된 제1 핵산을 고체 지지체로부터 제거하는 단계; 고정된 제2 가닥을 서열분석하는 단계; 제2 가닥에 상보성인 파생적 제1 가닥을 재합성하는 단계; 및 제2 절단 부위에서 하나 이상의 제2 가닥을 절단하고, 하나 이상의 절단된 제2 핵산 및 절단 고정된 제2 가닥을 생성하는 단계. 이러한 방법의 일부 실시형태에서, 각각의 제1 가닥은 고체 지지체에 고정된 제1 연장 프라이머로부터 연장되고, 제1 연장 프라이머는 제1 절단 부위를 포함한다. 이러한 방법의 일부 실시형태에서, 제1 절단 부위는 화학적 절단, 광 절단, 효소 절단 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 방법에 의해 절단될 수 있고, 예를 들어, 제1 절단 부위는 본 명세서에 기재된 Pd/Ni 방법 또는 효소 방법(예를 들어, UDG)에 의해 절단될 수 있다. 일부 이러한 실시형태에서, 제1 연장 프라이머는 P5, 변형된 P5 또는 P15를 포함한다. 일부 실시형태에서, 각각의 제2 가닥은 고체 지지체에 고정된 제2 연장 프라이머로부터 연장되고, 제2 연장 프라이머는 제2 절단 부위를 포함한다. 일부 이러한 실시형태에서, 아조벤젠 링커는 본 명세서에 기재된 화학식 (X), (Xa) 또는 (Xb)의 구조를 포함한다. 일부 실시형태에서, 아조벤젠 링커는 Na2S2O4에 의해 절단된다. 일부 실시형태에서, 고정된 제2 가닥의 서열분석은 고정된 제2 가닥에 상보성인 표지된 뉴클레오타이드를 연속적으로 혼입시키는 것 및 표지된 뉴클레오타이드를 검출하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 각각 절단 고정된 제1 가닥의 3' 말단은 본 명세서에 기재된 바와 같은 화학식 (I) 또는 (V)의 구조를 포함하는 보호기, 예를 들어, 인산염 기 또는 변형된 인산염 모이어티를 포함한다. 보호기는 효소 반응(예를 들어, 효소 T4PNK) 또는 화학적 탈보호, 예를 들어, 화학식 (I) 또는 (V)의 구조를 포함하는 변형된 인산염 모이어티의 탈보호를 위한 본 명세서에 기재된 바와 같은 플루오린화물 함유 시약 또는 염기에 의해 제거될 수 있다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 절단된 제2 핵산을 고체 지지체로부터 제거하는 단계, 및 파생적 제1 가닥을 서열분석하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 고정된 파생적 제1 가닥은 고체 지지체로부터의 절단된 제2 핵산의 제거 후에 고체 지지체 상에 남아있으며, 절단 고정된 제2 가닥에 혼성화된 채로 남아있다.
본 명세서에 기재된 제1 선형화 방법 및 제2 선형화 방법의 일부 실시형태에서, 이중-가닥 폴리뉴클레오타이드는 공유 결합을 통해 고체 지지체에 고정된다. 일 실시형태에서, 이중-가닥 폴리뉴클레오타이드는 고체 지지체 상에서 하이드로겔 또는 중합체에 공유 결합된다. 일 실시형태에서, 하이드로겔 또는 중합체 코팅은 PAZAM을 포함한다. 일부 실시형태에서, 하이드로겔 또는 중합체 코팅은 또한 고체 지지체의 표면에, 예를 들어, 표면에 침착된 작용기화된 실란과의 반응을 통해 공유 부착된다. 일 실시형태에서, 작용기화된 실란은 노르보넨 유도 실란이다. 실란화된 고체 지지체 상의 하이드로겔 또는 중합체 코팅의 비제한적 예, 및 하이드로겔 또는 중합체 코팅된 고체 지지체에 폴리뉴클레오타이드 또는 프라이머를 접합시키는 방법은 미국 특허 공개 제2014/0079923호 및 제2015/0005447호에 개시되어 있으며, 이들은 그들의 전문이 참고로 편입되어 있다.
Pd 선형화를 위한 접합된 고체 지지체
본 개시내용의 일부 실시형태는 고체 지지체 상에 고정된 복수의 제1 가닥 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 고제 지지체에 관한 것이며, 각각의 제1 가닥 폴리뉴클레오타이드는 (예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 팔라듐 착물 또는 니켈 착물에 의한) 화학적 절단을 겪을 수 있는 제1 절단 부위를 포함하되, 복수의 제1 가닥 폴리뉴클레오타이드는 그들의 5' 말단이 고체 지지체에 고정된다.
본 명세서에 기재된 고체 지지체의 일부 실시형태에서, 각각의 제1 가닥은 고체 지지체에 고정된 제1 연장 프라이머를 포함하거나 또는 이로부터 연장된다. 일부 이러한 실시형태에서, 제1 연장 프라이머는 본 명세서에 개시된 바와 같은 P5 또는 P7 서열 또는 P5 또는 P7에 상보성인 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, 제1 연장 프라이머는 P5 뉴클레오타이드 서열(서열번호 1)을 포함한다. 추가 실시형태에서, 제1 연장 프라이머는 폴리-T 스페이서 P5 뉴클레오타이드 서열(서열번호 3)을 포함한다. 일 실시형태에서, 제1 연장 프라이머는 P5 프라이머이다. 추가 실시형태에서, 제1 연장 프라이머는 폴리-T 스페이서 P5 프라이머이다. 일부 실시형태에서, P5 또는 P7 서열은 절단 부위의 적어도 일부를 형성하는 변형된 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드를 포함하도록 변형된다.
본 명세서에 기재된 고체 지지체의 일부 실시형태에서, 제1 연장 프라이머는 제1 절단 부위를 포함한다. 일부 추가적인 실시형태에서, 제1 절단 부위는, 예를 들어 팔라듐 착물 또는 니켈 착물에 의한 화학적 절단을 겪을 수 있는 변형된 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오사이드를 포함한다. 일부 이러한 실시형태에서, 변형된 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오사이드는 T 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드 유사체이다. 하나의 이러한 실시형태에서, 절단 부위는 알릴 작용기, 예를 들어, T 뉴클레오사이드 유사체의 5'-탄소 위치에서 비닐 치환을 포함하는 T 뉴클레오사이드 유사체를 포함하고, 따라서 5' 하이드록실기에 대해 알릴 모이어티를 형성한다. 일부 이러한 실시형태에서, 변형된 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드는 본 명세서에 기재된 바와 같은 화학식 (II)의 구조를 포함한다. 일부 실시형태에서, 다이뉴클레오타이드 단위가 알릴 인산염 모이어티를 갖는 절단 부위를 포함하도록, 5' 하이드록실기는 제2 뉴클레오타이드의 3' 인산염에 연결된다. 일부 이러한 실시형태에서, 변형된 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드는 본 명세서에 기재된 바와 같은 화학식 (II')의 구조를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 연장 프라이머는 P15 프라이머를 포함하거나 또는 P15 프라이머이다. 일부 추가적인 실시형태에서, 절단 부위는 또한 제2 뉴클레오타이드 상에 3' 보호(또는 차단) 모이어티, 예를 들어, 인산염 모이어티를 포함한다. 차단 모이어티는 제1 가닥의 화학적 절단 후에 절단 고정된 제1 가닥 상에 남아있다. 일 실시형태에서, 제2 뉴클레오타이드의 3' 인산염 모이어티는 변형된 뉴클레오사이드 유사체의 5'-탄소 위치에 공유 부착된다(즉, 인산염 기는 변형된 뉴클레오타이드의 5' 하이드록실을 포함한다). 일부 실시형태에서, 절단 고정된 제1 가닥 상에 남아있는 차단기는 화학적 탈보호 시약, 예컨대 플루오린화물 함유 화합물 또는 염기에서 제거될 수 있는 본 명세서에 기재된 바와 같은 (V)의 화학식 (I)의 구조를 포함한다. 일부 실시형태에서, 절단 고정된 제1 가닥 상에 남아있는 차단기는 포스파타제(예를 들어, T4PNK)에 의해 제거될 수 있는 인산염 기이다. 일부 실시형태에서, 절단 부위는 제1 연장 프라이머의 3' 말단 근처에, 예를 들어, 제1 연장 프라이머의 3' 말단으로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 뉴클레오타이드 거리 내에 위치된다. 일부 다른 실시형태에서, 절단 부위는 제1 연장 프라이머의 5' 말단 근처에, 예를 들어, 제1 연장 프라이머의 5' 말단으로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 뉴클레오타이드 거리 내에 위치된다. 일부 경우에, DNA 재합성을 보장하기 위해, 절단 부위는 바람직하게는, 예를 들어, 2 내지 8, 또는 3 내지 7, 또는 4 내지 6 뉴클레오타이드 거리 내의 제1 프라이머의 3' 말단을 향해 위치된다. 일 실시형태에서, 제1 연장 프라이머는 P5 프라이머이고, 제1 절단 부위는 P5 프라이머 서열에 위치된다(예를 들어, 변형된 뉴클레오타이드는 대체하는 하나의 뉴클레오타이드를 첨가함으로써 P5 프라이머 서열에 혼입된다). 따라서, 본 명세서에 개시된 P5 서열(서열번호 1 또는 서열번호 3)은 Pd/Ni 복합체에 의한 화학적 절단을 겪을 수 있는 제1 절단 부위를 포함하도록 변형되고, 따라서 변형된 P5 프라이머를 형성한다. 일 실시형태에서, 변형된 P5 프라이머는 본 명세서에 개시된 P15 프라이머를 포함하거나 또는 P15이다(서열번호 5). 일부 추가적인 실시형태에서, 변형된 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오사이드는 추가로 검출 가능한 표지, 예를 들어, 형광 표지로 표지될 수 있다. 검출 가능한 표지는 완료 직후에 접합 반응의 직접 정량화를 가능하게 한다.
본 명세서에 기재된 고체 지지체의 일부 실시형태에서, 화학적 선형화 방법에서 사용되는 Pd 착물은 수용성이다. 일부 이러한 실시형태에서, Pd 착물은 Pd(0) 착물이다. 일부 예에서, Pd(0) 착물은 알켄, 알코올, 아민, 포스핀 또는 금속 수화물과 같은 시약에 의한 Pd(II) 착물의 환원으로부터 인시추로 생성될 수 있다. 적합한 팔라듐 공급원은 Na2PdCl4, (PdCl(C3H5))2, [Pd(C3H5)(THP)]Cl, [Pd(C3H5)(THP)2]Cl, Pd(Ph3)4, Pd(OAc)2, Pd(dba)2 및 Pd(TFA)2를 포함한다. 하나의 이러한 실시형태에서, Pd(0) 착물은 Na2PdCl4로부터 인시추로 생성된다. 다른 실시형태에서, 팔라듐 공급원은 염화알릴 팔라듐(II) 이량체[(PdCl(C3H5))2]이다. 일부 실시형태에서, Pd(0) 착물은 Pd(II) 착물을 포스핀과 혼합함으로써 수용액 중에서 생성된다. 적합한 포스핀은 수용성 포스핀, 예컨대 트리스(하이드록시프로필)포스핀(THP), 트리스(하이드록시메틸)포스핀(THM), 1,3,5-트라이아자-7-포스파아다만탄(PTA), 비스(p-설포네이토페닐)페닐포스핀 2수화물 칼륨 염, 트리스(카복시에틸)포스핀(TCEP) 및 트라이페닐포스핀-3,3',3''-트라이설폰산 3나트륨염을 포함한다. 일부 실시형태에서, Pd(0)는 [(PdCl(C3H5))2], [Pd(C3H5)(THP)]Cl 또는 [Pd(C3H5)(THP)2]Cl을 THP와 인시추로 혼합함으로써 생성될 수 있다. 1종 이상의 환원제, 예컨대 아스코르브산 또는 이의 염(예를 들어, 아스코브산나트륨)이 첨가될 수 있다. 일부 실시형태에서, Pd(0) 착물은 Pd(THM)4, Pd(THP)2, Pd(THP)3 또는 PD(THP)4, 또는 이들의 조합물이다.
본 명세서에 기재된 고체 지지체의 일부 실시형태에서, 화학적 선형화에서 사용되는 Ni 착물은 수용성이다. 일부 이러한 실시형태에서, Ni 착물은 Ni(0) 착물이다. 일부 예에서, Ni 착물은 본 명세서에 기재된 바와 같은 Pd(II)의 Pd(0)로의 환원에서 사용되는 것과 유사한 시약에 의해 Ni(II) 화합물(예컨대 NiCl2)의 환원으로부터 인시추로 생성될 수 있다. 일 실시형태에서, Ni 착물은 NiCl2를 1 내지 10 당량의 THP와 혼합함으로써 제조된다.
본 명세서에 기재된 고체 지지체의 일부 실시형태에서, 고체 지지체는 그 위에 고정된 복수의 제2 가닥 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함하고, 각각의 제2 가닥 폴리뉴클레오타이드는 제2 절단 부위를 포함하되, 복수의 제2 가닥 폴리뉴클레오타이드는 5' 말단이 고체 지지체에 고정된다. 일부 이러한 실시형태에서, 각각의 제2 가닥 폴리뉴클레오타이드는 고체 지지체에 고정된 제2 연장 프라이머를 포함하거나 이로부터 연장된다. 일부 이러한 실시형태에서, 제2 연장 프라이머는 본 명세서에 개시된 바와 같은 P5 또는 P7 서열 또는 P5 또는 P7에 상보성인 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, 제2 연장 프라이머는 P7 뉴클레오타이드 서열(서열번호 2)을 포함한다. 추가 실시형태에서, 제2 연장 프라이머는 폴리-T 스페이서 P7 뉴클레오타이드 서열(서열번호 4)을 포함한다. 다른 실시형태에서, 제2 연장 프라이머는 P15 서열(서열번호 6)을 포함한다. 일 실시형태에서, 제2 연장 프라이머는 P7 프라이머이다. 추가 실시형태에서, 제2 연장 프라이머는 폴리-T 스페이서 P7 프라이머이다. 일부 실시형태에서, P7 프라이머 또는 폴리-T 스페이서 P7 프라이머는 8-옥소-구아닌를 제거하도록 그리고 화학적으로 절단 가능한 링커, 예를 들어, 하나 이상의 다이올 단위를 삽입하도록 변형된다. 또 다른 실시형태에서, 제2 연장 프라이머는 P17 프라이머이다. 일부 실시형태에서, 제2 연장 프라이머는 제2 절단 부위를 포함한다. 일부 이러한 실시형태에서, P5, P7 또는 P17 서열은 절단 가능한 링커를 갖는 변형된 뉴클레오타이드를 포함하도록 변형된다. 일부 추가적인 실시형태에서, 제2 절단 부위는 제1 화학적 선형화 반응에서 사용되는 팔라듐 착물 또는 니켈 착물의 의해 화학적 절단을 겪을 수 없다. 제2 절단 부위는 화학적 절단, 광화학적 절단, 효소 절단 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 방법에 의해 절단될 수 있다. 일 실시형태에서, 제2 절단 부위는 효소 절단 반응에 의해 절단될 수 있다. 하나의 이러한 실시형태에서, 제2 연장 프라이머는 본 명세서에 개시된 P7 프라이머(서열번호 2 또는 서열번호 4)이고, 제2 절단 부위는 옥소-G이다. 다른 실시형태에서, 제2 절단 부위는 화학적 절단 반응에 의해 절단될 수 있다. 예를 들어, 제2 절단 부위는 하나 이상의 인접한 다이올 결합(과아이오딘산염 시약에 의한 처리와 같은 산화에 의해 절단 될 수 있음), 이황화 결합(예를 들어, DTT와 같은 환원 조건 하에, 또는 포스핀의 존재 하에 절단 가능), 오쏘-나이트로벤질기(예를 들어, 광분해에 의해 절단 가능), 아조벤젠 결합(예를 들어, Na2S2O4의 존재 하에 절단 가능), 알킬-셀레늄 결합(예를 들어, 과산화수소와 같은 산화에 의해 절단 가능), 실릴 에터 결합(예를 들어, 플루오린화 이온, 산 또는 염기에 의해 절단 가능), 또는 알릴 카바메이트 결합(예를 들어, 팔라듐 착물의 존재 하에 절단 가능)을 포함할 수 있다. 이들 결합은 화학적 절단 후에 적어도 하나의 유리 하이드록실기를 생성할 수 있다. 하나의 이러한 실시형태에서, 제2 연장 프라이머는 본 명세서에 개시된 P17 프라이머(서열번호 6)를 포함하거나 또는 P17 프라이머이고, 제2 절단 부위는 산화에 의해, 예를 들어, 과아이오딘산나트륨에 의한 처리에 의해 절단될 수 있는 하나 이상의 다이올 결합을 포함한다. 일부 실시형태에서, 다이올 링커는 본 명세서에 기재된 바와 같은 화학식 (VIII) 또는 (VIIIa)의 구조를 포함한다. 일부 실시형태에서, 아조벤젠 링커는 본 명세서에 기재된 바와 같은 화학식 (X), (Xa) 또는 (Xb)의 구조를 포함한다.
본 개시내용의 일부 실시형태는 고체 지지체 상에 고정된 복수의 제1 가닥 폴리뉴클레오타이드 및 복수의 제2 가닥 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 고체 지지체에 관한 것이며, 각각의 제1 가닥 폴리뉴클레오타이드는 고체 지지체에 고정된 변형된 P5 프라이머로부터 연장되고, 상기 변형된 P5 프라이머는 제1 절단 부위를 포함하며; 각각의 제2 가닥 폴리뉴클레오타이드는 고체 지지체에 고정된 P7 프라이머로부터 연장되고, P5 프라이머는 제2 절단 부위를 포함하되; 상기 제1 가닥 폴리뉴클레오타이드와 상기 제2 가닥 폴리뉴클레오타이드는 둘 다 그들의 5' 말단이 고체 지지체에 고정되어 있고, 제1 절단 부위는 Pd 착물 또는 Ni 착물, 예컨대 Pd(0) 착물 또는 Ni(0) 착물에 의해 화학적 절단을 겪을 수 있다. 일부 실시형태에서, 제1 절단 부위는 본 명세서에 기재된 바와 같은 알릴 작용기를 갖는 변형된 T 뉴클레오사이드를 포함한다. 절단 부위는 절단 고정된 제1 가닥 폴리뉴클레오타이드의 3'-OH를 차단하기 위한 Pd/Ni 절단 반응 후에 제1 가닥 폴리뉴클레오타이드 상에 남아있는 3' 말단 차단 모이어티, 예를 들어, 인산염 또는 변형된 인산염 모이어티로서 작용할 수 있는 모이어티를 추가로 포함할 수 있다.
본 명세서에 기재된 고체 지지체의 일부 실시형태에서, 상기 제1 가닥 폴리뉴클레오타이드 및 상기 제2 가닥 폴리뉴클레오타이드는 고체 지지체의 표면 상에서 중합체 또는 하이드로겔 코팅에 의한 공유 결합을 통해 고체 지지체에 고정된다. 일 실시형태에서, 하이드로겔 또는 중합체 코팅은 PAZAM을 포함한다. 일부 실시형태에서, 하이드로겔 또는 중합체 코팅은 또한 고체 지지체의 표면에, 예를 들어, 표면 상에 침착된 작용기화된 실란과의 반응을 통해 공유 부착된다. 일 실시형태에서, 작용기화된 실란은 노보넨 유도 실란이다. 일 실시형태에서, 고체 지지체는 유동 셀을 포함하거나 또는 유동 셀이다.
고체 지지체 표면
일부 실시형태에서, 프라이머 접합 전에 고체 지지체 표면은 작용기화된 분자로 코팅된 영역과 코팅이 없는 비활성 영역을 둘 다 포함한다. 일부 이러한 실시형태에서, 작용기화된 분자 코팅은 하이드로겔 또는 중합체 코팅이다. 코팅된 영역은 반응 부위를 포함할 수 있고, 따라서, 화학적 결합 또는 다른 분자 상호작용, 예컨대 혼성화 또는 공유 반응을 통해 분자를 부착하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 코팅된 영역(예를 들어, 반응성 특징, 통로, 패드, 비드 또는 웰) 및 비활성 영역(사이질 영역으로서 지칭됨)은 패턴 또는 그리드를 형성하기 위해 번갈아 생길 수 있다. 이러한 패턴은 1 또는 2개의 치수일 수 있다. 일부 실시형태에서, 비활성 영역은 유리 영역, 금속 영역, 마스크 영역 또는 사이질 영역 또는 이들의 조합으로부터 선택될 수 있다. 대안적으로 이들 물질은 반응성 영역을 형성할 수 있다. 비활성 또는 반응성은 기재 상에 사용되는 화학물질 및 과정에 따를 것이다. 일 실시형태에서, 고체 지지체의 표면은 유리 영역을 포함한다. 다른 실시형태에서, 표면은 금속 영역을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 고체 지지체는 유동 셀의 적어도 일부를 형성하거나 또는 유동 셀에 위치된다. 일부 이러한 실시형태에서, 유동 셀은 작용기화된 분자 코팅, 예를 들어, 중합체 또는 하이드로겔 코팅을 통해 고체 지지체의 표면에 부착되는 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 폴리뉴클레오타이드 클러스터로 유동 셀에 존재하되, 폴리뉴클레오타이드 클러스터의 폴리뉴클레오타이드는 하이드로겔 또는 중합체 코팅를 통해 유동 셀의 표면에 부착된다. 이러한 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드가 부착되는 유동 셀 몸체의 표면은 고체 지지체로 고려된다. 다른 실시형태에서, 하이드로겔 또는 중합체 코팅면을 갖는 별개의 고체 지지체는 유동 셀의 몸체에 삽입된다. 바람직한 실시형태에서, 유동 셀은 복수의 레인 또는 복수의 섹터로 나누어지는 유동 챔버이되, 복수의 레인 또는 복수의 섹터 중 하나 이상은 본 명세서에 기재된 공유 부착된 하이드로겔 또는 중합체 코팅으로 코팅된 표면을 포함한다. 본 명세서에 기재된 유동 셀의 일부 실시형태에서, 단일 폴리뉴클레오타이드 클러스터 내에서 부착된 폴리뉴클레오타이드는 동일 또는 유사한 뉴클레오타이드 서열을 가진다. 본 명세서에 기재된 유동 셀의 일부 실시형태에서, 상이한 폴리뉴클레오타이드 클러스터의 부착된 폴리뉴클레오타이드는 상이한 또는 비유사한 뉴클레오타이드 서열을 가진다. 본 명세서에 제시된 방법 또는 조성물에서 사용될 수 있는 유동 셀의 제조를 위한 예시적인 유동 셀 및 기재는 일루미나 인코포레이티드(Illumina, Inc.)(캘리포니아주 샌디에이고에 소재)로부터 상업적으로 입수 가능하거나 또는 미국 특허 공개 제2010/0111768 A1호 및 제2012/0270305호에 기재되어 있는 것을 포함하지만, 이들로 제한되지 않으며, 이들 각각은 본 명세서에 참고로 편입되어 있다.
PAZAM
고체 지지체 표면의 하이드로겔 또는 중합체 코팅의 일 실시형태는 PAZAM을 포함하고, 폴리아크릴아마이드 공중합체는 다음의 두 반복 단위를 포함한다:
일부 실시형태에서, PAZAM은 선형 중합체이다. 일부 다른 실시형태에서, PAZAM은 약하게 교차결합된 중합체이다. PAZAM은 본 명세서에 제시된 조성물 또는 방법에서 사용하도록 작용기화되거나 또는 변형될 수 있다. PAZAM 및 이의 유사체의 제조는 본 명세서에 전문이 참고로 편입된 미국 특허 제9,012,022호에 개시되어 있다.
3' 차단기
SBS 주기 동안, 단일 혼입만이 일어나는 것을 보장하기 위해, 점점 늘어나는 쇄에 추가되는 각각의 표지된 뉴클레오타이드에 구조적 변형("보호기")에 추가되어 하나의 뉴클레오타이드만이 혼입되는 것을 보장한다. 보호기를 갖는 뉴클레오타이드가 첨가된 후에, 보호기는 서열 분석 중인 DNA의 완전성을 방해하지 않는 반응 조건 하에 제거된다. 이어서, 서열분석 주기는 다음의 보호, 표지된 뉴클레오타이드의 혼입을 계속할 수 있다.
DNA 서열분석에서 유용하게 되도록, 일단 뉴클레오타이드 상의 염기가 첨가되면, 폴리뉴클레오타이드 쇄 내로 혼입을 위해 사용되는 중합효소가 계속해서 복제하는 것을 방지하기 위해 뉴클레오타이드, 더 통상적으로는 뉴클레오타이드 3인산은 일반적으로 3'-하이드록시 보호기를 필요로 한다. 뉴클레오타이드 상에 첨가될 수 있고 여전히 적합한 유형의 기에 대한 다수의 제한이 있다. 보호기는 추가적인 뉴클레오타이드 분자가 폴리뉴클레오타이드 쇄에 첨가되는 것을 방지하여야 하는 한편, 동시에 폴리뉴클레오타이드 쇄에 대한 손상을 야기하는 일 없이 당 모이어티로부터 용이하게 제거 가능하다. 더 나아가, 변형된 뉴클레오타이드는 폴리뉴클레오타이드 쇄 내로 혼입하기 위해 사용되는 중합효소 또는 다른 적절한 효소에 의해 용인될 필요가 있다. 따라서 이상적인 보호기는 장기간 안정성을 나타내고, 중합효소에 의해 효율적으로 혼입되며, 2차 또는 추가적인 뉴클레오타이드 혼입의 차단을 야기하고, 바람직하게는 수성 조건 하에 폴리뉴클레오타이드 구조에 대한 손상을 야기하지 않는 약한 조건 하에 제거되는 능력을 가진다.
가역적 보호기는 앞서 보고되었다. 예를 들어, 문헌[Metzker et al., (Nucleic Acids Research, 22 (20): 4259-4267, 1994)]은 8개의 3'-변형된 2-데옥시리보뉴클레오사이드 5'-삼인산(3'-변형된 dNTP)의 합성 및 사용, 및 혼입 활성에 대한 2개의 DNA 주형 검정에서의 시험을 개시한다. WO 2002/029003은 중합효소 반응에서 DNA의 점점 늘어나는 가닥 상의 3'-OH 기를 캡핑하기 위한 알릴 보호기의 사용을 포함할 수 있는 서열분석 방법을 기재한다. 다른 가역적 보호기 및 DNA 적합 조건 하에 그들을 탈보호하는 방법은 아지도메틸 또는 변형된 아지도메틸기를 포함하며, 이는 국제 특허 출원 공개 WO 2004/018497 및 WO 2014/139596에 개시되어 있고, 이들의 전문은 본 명세서에 참고로 편입된다.
본 명세서에 기재된 3'-OH 차단기의 일 실시형태는 포스파타제에 의해 제거될 수 있는 인산염 기이다.
검출 가능한 표지
본 명세서에 기재된 일부 실시형태는 검출 가능한 표지의 사용에 관한 것이다. 검출은 형광 분석법을 비롯한 임의의 적합한 방법에 의해 또는 다른 광학적 수단에 의해 수행될 수 있다. 바람직한 표지는 에너지의 흡수 후에, 정해진 파장에서 방사선을 방출하는 형광단이다. 다수의 적합한 형광 표지가 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Welch et al. (Chem. Eur. J. 5(3):951-960, 1999)]은 본 발명에서 사용될 수 있는 단실-작용기화된 형광 모이어티를 개시한다. 문헌[Zhu et al. (Cytometry 28:206-211, 1997)]은 또한 본 발명에서 사용될 수 있는 형광 표지 Cy3 및 Cy5의 사용을 기재한다. 사용에 적합한 표지는 또한 문헌[Prober et al. (Science 238:336-341, 1987); Connell et al. (BioTechniques 5(4):342-384, 1987), Ansorge et al. (Nucl. Acids Res. 15(11):4593-4602, 1987) 및 Smith et al. (Nature 321:674, 1986)]에 개시되어 있다. 다른 상업적으로 입수 가능한 형광 표지는 플루오레세인, 로다민(예를 들어, TMR, 텍사스 레드 및 Rox), 알렉사, 보디피, 아크리딘, 쿠마린, 파이렌, 벤잔트라센 및 사이아닌을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
일부 실시형태에서, 검출 가능한 표지는 본 명세서에 기재된 방법 및 고체 지지체에서 Pd 절단을 겪을 수 있는 폴리뉴클레오타이드의 제1 절단 부위에서 사용될 수 있다. 특히, 제1 절단 부위는 표지된 변형된 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오사이드를 포함할 수 있다. 이 접근은 현재 일루미나 제조 작업 흐름을 추가로 간소화할 수 있다. 일 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 알릴 변형된 P5 프라이머는 반응이 완료된 직후에 접합 반응의 직접 정량화를 가능하게 하는 형광 태그를 포함하도록 변형되어, 이러한 정량화 단계를 수행하기 위한 별개의 혼성화 검정의 필요를 제거할 수 있다.
검출 가능한 표지에 대한 링커
본 명세서에 기재된 일부 실시형태에서, 변형된 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오사이드의 핵염기는 상기 기재한 바와 같은 검출 가능한 표지에 연결될 수 있다. 일부 이러한 실시형태에서, 사용되는 링커는 절단 가능하다. 절단 가능한 링커의 사용은 표지가, 필요하다면 검출 후에 제거되어, 순차적으로 혼입된 임의의 표지된 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오사이드에 의한 임의의 간섭 신호를 피할 수 있다는 것을 보장한다.
일부 다른 실시형태에서, 사용되는 링커는 비-절단성이다. 본 발명의 표지된 뉴클레오타이드가 혼입된 각각의 예에서, 뉴클레오타이드는 후속적으로 혼입될 필요가 없고, 따라서 표지는 뉴클레오타이드로부터 제거될 필요가 없다.
절단 가능한 링커는 당업계에 공지되어 있으며, 뉴클레오타이드 염기 및 표지에 링커를 부착시키기 위해 통상적인 화학이 적용될 수 있다. 링커는 산, 염기, 친핵체, 친전자체, 라디칼, 금속, 환원제 또는 산화제, 광, 온도, 효소 등에 대한 노출을 포함하는 임의의 적합한 방법에 의해 절단될 수 있다. 본 명세서에 논의된 바와 같은 링커는 또한 3'-O-보호기 결합을 절단하기 위해 사용되는 동일한 촉매로 절단될 수 있다. 적합한 링커는 문헌[Greene & Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley & Sons]에 개시된 바와 같은 표준 화학적 보호기로부터 적합하게 될 수 있다. 고체상 합성에서 사용되는 추가적인 적합한 절단 가능한 링커는 문헌[Guillier et al. (Chem. Rev. 100:2092-2157, 2000)]에 개시되어 있다.
용어 "절단 가능한 링커"의 사용은 전체 링커가, 예를 들어, 뉴클레오타이드 염기로부터 제거되는 데 필요하다는 것을 나타내는 것을 의미하지는 않는다. 검출 가능한 표지가 염기에 부착되는 경우에, 뉴클레오사이드 절단 부위는, 링커 부분이 절단 후에 뉴클레오타이드에 부착된 채로 남아있는 것을 보장하는 링커 상의 위치에 위치될 수 있다.
검출 가능한 표지가 염기에 부착되는 경우에, 링커는 뉴클레오타이드 염기 상의 임의의 위치에 부착될 수 있으며, 단, 왓슨-크릭 염기 짝짓기가 여전히 수행될 수 있다. 퓨린 염기와 관련하여, 링커는 퓨린 또는 바람직한 데아제퓨린 유사체의 7-위치를 통해, 8-변형된 퓨린을 통해, N-6 변형된 아데노신 또는 N-2 변형된 구아닌을 통해 부착되는 경우에 바람직하다. 피리미딘에 대해, 부착은 바람직하게는 사이토신, 티미딘 또는 유라실 상의 5-위치 및 사이토신 상의 N-4 위치를 통한다.
일부 실시형태에서, 링커는 3'-OH 보호기와 유사한 작용기로 이루어질 수 있다. 표지와 보호기를 둘 다 제거하는 데 단일 처리만이 필요하기 때문에, 이는 탈보호 및 탈보호 과정을 더 효율적으로 만들 것이다. 특히 바람직한 링커는 포스핀-절단 가능한 아자이드 함유 링커이다.
절단 방법
선형화 단계에서, 예를 들어 본 명세서에 기재된 제2 가닥 폴리뉴클레오타이드의 절단을 위해 이중-가닥 핵산 분자 가닥 중 하나 또는 둘 다를 절단하기 위해 다양한 절단 방법이 사용될 수 있다. 적합한 절단 방법의 바람직하지만, 비제한적 실시형태는 이하에 추가로 상세하게 논의된다.
A) 화학적 절단
용어 "화학적 절단"은 이중-가닥 핵산 분자 가닥 중 하나 또는 둘 다의 절단을 촉진시키고/달성하기 위해 비핵산 및 비효소 화학적 시약을 이용하는 임의의 방법을 포함한다. 필요하다면, 이중-가닥 핵산 분자 가닥 중 하나 또는 둘 다는 특정 절단 부위, 바람직하게는 사전 결정된 절단 부위에서 화학적 절단 반응을 허용하기 위해 하나 이상의 비-뉴클레오타이드 화학적 모이어티 및/또는 비천연 뉴클레오타이드 및/또는 비천연 골격 결합을 포함할 수 있다. 하나의 비제한적 실시형태에서, 이중-가닥 핵산 분자의 하나의 가닥은 과아이오딘산염(예를 들어, 과아이오딘산나트륨)으로 처리에 의한 절단을 허용하는 다이올 결합을 포함할 수 있다. 다이올 결합은 절단 부위에 위치될 수 있는데, 이의 정확한 위치는 사용자에 의해 선택될 수 있다. 한 가지 초과의 다이올이 절단 부위에 포함될 수 있다는 것이 인식될 것이다.
폴리뉴클레오타이드 쇄에 대한 혼입에 적합한 포스포르아미다이트 화학에 기반한 다이올 링커 단위는 피델리티 시스템즈 인코포레이티드(Fidelity Systems, Inc.)(미국 메릴랜드주 게이더스버그에 소재)로부터 상업적으로 입수 가능하다. 자동화된 화학적 DNA 합성을 위한 표준 방법을 이용하여 하나 이상의 다이올 단위가 폴리뉴클레오타이드에 혼입될 수 있다. 고체 지지체로부터의 최적의 거리에 다이올 링커를 위치시키기 위해, 다이올 링커와 고체 지지체에 대한 부착 부위 사이에 하나 이상의 스페이서 분자가 포함될 수 있다. 스페이서 분자는 비-뉴클레오타이드 화학적 모이어티일 수 있다. 다이올 링커와 함께 사용하기 위한 포스포르아미다이트 화학에 기반한 적합한 스페이서 단위는 또한 피델리티 시스템즈 인코포레이티드에 의해 공급된다. 다이올 링커는 "절단제"에 의한 처리에 의해 절단되는데, 이는 다이올의 절단을 촉진시키는 임의의 물질일 수 있다. 바람직한 절단제는 과아이오딘산염, 바람직하게는 수성 과아이오딘산나트륨(NaIO4)이다. 다이올을 절단하기 위해 절단제(예를 들어, 과아이오딘산염)로 처리 후에, 절단된 생성물은 절단 반응에서 생성된 반응종을 중화시키기 위해 "캡핑제"로 처리될 수 있다. 이 목적을 위한 적합한 캡핑제는 에탄올아민과 같은 아민을 포함한다. 유리하게는, 반응종이 형성되지마자 캡핑되도록 캡핑제(예를 들어, 에탄올아민)는 절단제(예를 들어, 과아이오딘산염)와 혼합물로 포함될 수 있다.
이중-가닥 핵산 분자의 한 개 가닥의 절단을 달성하기 위해 다이올 결합과 절단제(예를 들어, 과아이오딘산염)의 조합이 고체 지지된 폴리아크릴아마이드 하이드로겔 상의 핵산 분자 선형화에 바람직한데, 과아이오딘산염에 의한 처리가 핵산 완전성에 그리고 하이드로겔 표면의 화학에 적합하기 때문이다. 그러나, 작용기화된 실란으로 코팅된 지지체를 비롯한 다른 표면 상에 고정된 핵산의 선형화를 위해 다이올 방법이 또한 사용될 수 있다.
추가 실시형태에서, 절단될 가닥(또는 고체상 증폭에 의해 제조되는 경우에 이 가닥으로부터 유도된 증폭 프라이머)은 화학적 환원제, 예를 들어, 트리스(2-카복시에틸)-포스페이트 하이드로클로라이드(TCEP)에 의한 절단을 허용하는 이황화물 기를 포함할 수 있다.
B) 이중-가닥 분자 내 비염기성 부위의 절단
"비염기성 부위"는 염기 성분이 제거된 폴리뉴클레오타이드 쇄 내 뉴클레오사이드 위치로서 정의된다. 비염기성 부위는 뉴클레오사이드 잔기의 가수분해에 의해 생리적 조건 하에 DNA에서 자연적으로 발생될 수 있지만, 또한 인공 조건 하에 화학적으로 또는 효소 작용에 의해 형성될 수 있다. 일단 형성되면, 비염기성 부위는 절단되어(예를 들어, 엔도뉴클레아제 또는 다른 단일-가닥 절단 효소에 의한 처리, 열 또는 알칼리에 대한 노출에 의해) 폴리뉴클레오타이드 가닥의 부위-특이적 절단을 위한 수단을 제공한다.
비제한적 실시형태에서, 비염기성 부위는 이중-가닥 폴리뉴클레오타이드의 한 개 가닥 상의 사전 결정된 위치에서 생성되고, 이어서, 이중-가닥 핵산 분자 내 사전 결정된 절단 부위에서 데옥시유리딘(U)을 처음 혼입시킴으로써 절단될 수 있다. 이는, 예를 들어, 고체상 PCR 증폭에 의한 이중-가닥 핵산 분자의 제조를 위해 사용되는 프라이머 중 하나에 U을 포함함으로써 달성될 수 있다. 이어서, 효소 유라실 DNA 글리코실라제(UDG)는 유라실 염기를 제거하는 데 사용되어, 하나의 가닥 상에서 비염기성 부위를 생성할 수 있다. 이어서, 비염기성 부위를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 가닥은 엔도뉴클레아제(예를 들어, EndoIV 엔도뉴클레아제, AP 리아제, FPG 글리코실라제/AP 리아제, EndoVIII 글리코실라제/AP 리아제), 열 또는 알칼리에 의한 처리에 의해 비염기성 부위에서 절단될 수 있다.
비염기성 부위는 서열분석 프라이머로서 작용하는 유리 3'-하이드록실 모이어티를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 증폭 프라이머가 둘 다 순차적으로 절단되도록 변형된다면, 제2 절단은 표면으로부터 제1 가닥을 절단하는 데 사용될 수 있다. 제1(또는 제2) 프라이머는 하나의 효소(UDG)에 의해 절단될 수 있는 유라실 염기를 함유할 수 있으며, 제2(또는 제1) 프라이머는 제2의 직교성 효소, FPG 글리코실라제에 의해 절단될 수 있는 8-옥소-구아닌 염기를 함유할 수 있었다. 서열분석의 제1 주기로서 G 염기가 혼입되거나, 또는 절단된 이중가닥이 용액에서 서열분석 프라이머의 혼성화를 허용하도록 변성될 수 있도록, 표면에 부착된 서열분석 프라이머를 남기는 데 제2 비염기성 부위 절단이 사용될 수 있었다.
C) 리보뉴클레오타이드의 절단
데옥시리보뉴클레오타이드(추가적인 비-뉴클레오타이드 화학적 모이어티, 비-천연 염기 또는 비-천연 골격 결합이 있거나 또는 없음)를 달리 포함하는 폴리뉴클레오타이드 가닥 내로 하나 이상의 리보뉴클레오타이드의 혼입은 데옥시리보뉴클레오타이드와 리보뉴클레오타이드 사이의 포스포다이에스터 결합을 선택적으로 절단할 수 있는 화학적 제제를 이용하거나 또는 리보뉴클레아제(RNAse)를 이용하여 절단을 위한 부위를 제공할 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 이러한 화학적 절단 제제 또는 RNase를 이용하여 하나 이상이 연속적 리보뉴클레오타이드를 함유하는 부위에서 (이중-가닥 핵산 분자의) 하나의 핵산의 절단에 의해 서열분석 주형의 생성을 포함한다. 바람직하게는 절단될 가닥은 화학적 절단을 위한 사전결정 부위를 제공하기 위해 단일 리보뉴클레오타이드를 함유한다.
데옥시리보뉴클레오타이드와 리보뉴클레오타이드 사이의 포스포다이에스터 결합을 선택적으로 절단할 수 있는 적합한 화학적 절단제는 금속 이온, 예를 들어 희토 금속 이온(특히, La3+, 특히 Tm3+, Yb3+ 또는 Lu3+(Chen et al., Biotechniques, 2002, 32: 518-520; Komiyama et al. Chem. Commun. 1999, 1443- 1451)), Fe(3) 또는 Cu(3), 또는 상승된 pH에 대한 노출, 예를 들어, 수산화나트륨과 같은 염기에 의한 처리를 포함한다. "데옥시리보뉴클레오타이드와 리보뉴클레오타이드 사이의 포스포다이에스터 결합의 선택적 절단"은 화학적 절단제가 동일한 조건 하에 두 데옥시리보뉴클레오타이드 사이의 포스포다이에스터 결합을 절단할 수 없다는 것을 의미한다. 리보뉴클레오타이드(들)의 염기 조성물은 일반적으로 물질이 아니지만, 화학적(또는 효소적) 절단을 최적화하기 위해 선택될 수 있다. 예로서, rUMP 또는 rCMP는 일반적으로 절단이 금속 이온, 특히 희토 금속 이온에 대한 노출에 의해 수행된다면, 바람직하다.
리보뉴클레오타이드(들)는 전형적으로 이중-가닥 핵산 분자의 하나의 가닥에 혼입될 것이며, 이중-가닥 분자의 두 상보성 가닥이 어닐링될 때(즉, 5' 돌출부에서) 단일-가닥인 이의 영역 내에 위치될 수 있다. 특히, 정방향 및 역방향 증폭 프라이머(이 중 하나는 적어도 하나의 리보뉴클레오타이드임)를 이용하는 고체상 PCR 증폭에 의해 이중-가닥 핵산 분자가 제조된다면, PCR 증폭을 위해 사용되는 표준 DNA 중합효소는 리보뉴클레오타이드 주형을 복제할 수 없다. 따라서, 고체상 PCR 반응의 산물은 리보뉴클레오타이드(들)를 포함하는 돌출된 5' 영역 및 리보뉴클레오타이드(들) 상류의 증폭 프라이머의 임의의 나머지를 함유할 것이다.
리보뉴클레오타이드와 데옥시리보뉴클레오타이드 사이, 또는 두 리보뉴클레오타이드 사이의 포스포다이에스터 결합은 또한 RNase에 의해 절단될 수 있다. 적절한 기질 특이성의 임의의 식균 작용 리보뉴클레아제가 이 목적을 위해 사용될 수 있다. 리보뉴클레오타이드(들)가 이중-가닥 분자의 두 상보성 가닥이 어닐링될 때(즉, 5' 돌출부에서) 단일 가닥인 영역에 존재한다면, RNase는 리보뉴클레오타이드를 함유하는 단일 가닥에 대해 특이성을 갖는 엔도뉴클레아제일 것이다. 리보뉴클레아제에 의한 절단을 위해, 2개 이상의 연속적 리보뉴클레오타이드, 바람직하게는 2 내지 10 또는 5 내지 10개의 연속적 리보뉴클레오타이드를 포함하는 것이 바람직하다. 특정 RNases가 특정 잔기 다음의 절단에 대해 특이성을 가진다는 것을 제외하고, 리보뉴클레오타이드의 정확한 서열은 일반적으로 물질이 아니다. 적합한 RNase는, 예를 들어, C 및 U 잔기 다음에 절단되는 RNaseA를 포함한다. 따라서, RNaseA로 절단할 때, 절단 부위는 C 또는 U인 적어도 하나의 리보뉴클레오타이드를 포함하여야 한다.
하나 이상의 리보뉴클레오타이드를 혼입시키는 폴리뉴클레오타이드는 적절한 리보뉴클레오타이드 전구체를 이용하는 올리고뉴클레오타이드 화학적 합성을 위한 표준 기법을 이용하여 용이하게 합성될 수 있다. 이중-가닥 핵산 분자가 고체상 핵산 증폭에 의해 제조된다면, 증폭 반응을 위해 사용될 프라이머 중 하나에 하나 이상의 리보뉴클레오타이드를 혼입시키는 것이 편리하다.
D) 광화학적 절단
용어 "광 절단" 또는 "광화학적 절단"은 이중-가닥 핵산 분자 가닥 중 하나 또는 둘 다의 절단을 달성하기 위해 광 에너지를 이용하는 임의의 방법을 포함한다. 광화학적 절단을 위해 사전결정된 부위는 이중-가닥 분자의 가닥 중 하나에서 비뉴클레오타이드 화학적 스페이서 단위에 의해 제공될 수 있다. 적합한 광화학적 절단 가능한 스페이서는 미국 버지니아주 스털링에 소재한 글렌 리서치(Glen Research)에 의해 공급되는 PC 스페이서 포스포르아미다이트(4-(4,4'-다이메톡시트라이틸옥시) 뷰티르아미도메틸)-1-(2-나이트로페닐)-에틸]-2-사이아노에틸-(N,N-다이아이소프로필)-포스포르아미다이트)를 포함한다. 스페이서 단위는 UV 광원에 대한 노출에 의해 절단될 수 있다. 이 스페이서 단위는 올리고뉴클레오타이드의 화학적 합성을 위한 표준 기법을 이용하여, 고체 표면에 대한 부착을 허용하는 티오인산염기와 함께 폴리뉴클레오타이드의 5' 말단에 부착될 수 있다. 편리하게는, 이 스페이서 단위는 고체상 증폭에 의해 광절단 가능 이중-가닥 핵산 분자의 합성을 위해 사용될 정방향 또는 역방향 증폭 프라이머에 혼입될 수 있다.
E) PCR 정지제
다른 실시형태에서, 이중-가닥 핵산은 정방향 및 역방향 프라이머를 이용하여 고체상 증폭에 의해 제조될 수 있는데, 정방향 및 역방향 프라이머 중 하나는 "PCR 정지제"를 함유한다. "PCR 정지제"는 해당 지점을 지나서 복제할 수 없게 되는, 증폭을 위해 사용되는 중합효소의 리드-쓰루(read-through)를 방지하는 임의의 모이어티이다. 상기 결과는 PCR 정지제를 함유하는 프라이머의 연장에 의해 유도된 증폭된 가닥이 5' 돌출 부분을 함유하는 것이다. 이 5' 돌출부(PCR 정지제 그 자체가 아님)는 우세하게 천연 골격 결합을 갖는 천연 유래 데옥시리보뉴클레오타이드로 구성될 수 있으며, 즉, 단순하게 단일-가닥 DNA의 신장일 수 있다. 이어서, 분자는 단일-가닥 DNA의 절단에 민감하지만, 이중가닥 DNA는 아닌 절단 시약(예를 들어, 효소), 예를 들어 녹두 뉴클레아제의 사용에 의해 5' 돌출 영역에서 절단될 수 있다.
PCR 정지제는 본질적으로, 증폭 반응을 위해 사용될 중합효소의 리드-쓰루를 방지하는 임의의 모이어티일 수 있다. 적합한 PCR 정지제는 헥사에틸렌 글리콜(HEG), 비염기성 부위, 및 임의의 비-천연 또는 변형된 뉴클레오타이드(DNA 유사체, 예컨대 펩타이드 핵산(PNA)을 비롯한 중합효소의 리드-쓰루를 방지하는 것)를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
안정한 비염기성 부위는 안정한 비염기성 부위를 함유하는 적절한 스페이서 단위를 이용하는 화학적 올리고뉴클레오타이드 합성 동안에 도입될 수 있다. 예로서, 미국 버지니아주 스털링에 소재한 글렌 리서치로부터 상업적으로 입수 가능한 비염기성 퓨란(5'-O-다이메톡시트라이틸-1',2'-다이데옥시리보스-3'-[(2-사이아노에틸)-(N,N-다이아이소프로필)]-포스포르아미다이트) 스페이서는 비염기성 부위를 도입하기 위해 화학적 올리고뉴클레오타이드 합성 동안에 혼입될 수 있다. 따라서 이러한 부위는 고체상 증폭에서 사용될 올리고뉴클레오타이드 프라이머 내로 용이하게 도입될 수 있다. 비염기성 부위가 정방향 또는 역방향 증폭 프라이머 중 하나에 혼입된다면, 얻어진 증폭 산물은 (단일-가닥 형태로) 비염기성 부위를 포함하는 하나의 가닥 상에 5' 돌출부를 가질 것이다. 이어서, 단일-가닥 비염기성 부위는 적합한 화학적 제제의 작용(예를 들어, 알칼리에 대한 노출) 또는 효소(예를 들어, AP-엔도뉴클레아제 VI, 문헌[Shida el al., Nucleic Acids Research, 1996, Vol.24, 4572-4576])에 의해 절단될 수 있다.
F) 펩타이드 링커의 절단
절단 부위는 또한 펩타이드 분자가 핵산 분자의 하나의 가닥에 연결되는 접합체 구조를 제조함으로써 이중-가닥 핵산 분자의 하나의 가닥에 혼입될 수 있다. 펩타이드 분자는 후속적으로 적절한 특이성의 펩티다제 효소, 또는 비효소적 화학적 또는 광화학적 절단의 임의의 다른 적합한 수단에 의해 절단될 수 있다. 전형적으로, 펩타이드와 핵산 사이의 접합체는 이중-가닥 핵산 분자의 하나의 가닥에만 펩타이드를 공유 결합함으로써 형성될 것이며, 상기 펩타이드 부분은 고체 표면에 대한 부착 지점에 인접한 이 가닥의 5' 말단에 접합된다. 이중-가닥 핵산이 고체상 증폭에 의해 제조된다면, 펩타이드 접합체는 증폭 프라이머 중 하나의 5' 말단에서 혼입될 수 있다. 분명하게는, 이 프라이머의 펩타이드 성분은 PCR 증폭 동안 복제되지 않을 것이며; 따라서 "브리지된" 증폭 산물은 하나의 가닥 상에 절단 가능한 5' 펩타이드 "돌출부"를 포함할 것이다.
펩타이드가 핵산의 5' 말단에 접합된 펩타이드와 핵산 사이의 접합체는 당업계에 일반적으로 공지된 기법을 이용하여 제조될 수 있다. 하나의 이러한 기법에서, 목적하는 아미노산 및 뉴클레오타이드 서열의 펩타이드 및 핵산 성분은, 예를 들어, 표준 자동 화학 합성 기법에 의해 별개로 합성될 수 있고, 이어서, 수성/유기 용액 중에서 접합된다. 예로서, 글렌 리서치로부터 상업적으로 입수 가능한 OPeC(상표명) 시스템은 5'-시스테인일 올리고뉴클레오타이드에 대한 N-말단의 티오에스터-작용기화된 펩타이드의 "천연 결찰"에 기반한다. 표준 Fmoc-기반 고체상 펩타이드 조립체에서의 최종 결합 단계에서 펜타플루오로페닐 S-벤질티오석시네이트가 사용된다. 트라이플루오로아세트산에 의한 탈보호는 N-말단의 S-벤질티오석신일기로 치환된 펩타이드를 생성한다. O-트랜스-4-(N-a-Fmoc-S-tert-뷰틸설펜일-1-시스테인일) 아미노사이클로헥실 O-2-사이아노에틸-N,N-다이아이소프로필포스포르아미다이트는 표준 포스포르아미다이트 고체상 올리고뉴클레오타이드 조립체에서의 최종 결합 단계에서 사용된다. 수성 암모니아 용액에 의한 탈보호는 용액에서 5'-S-tert-뷰틸설펜일-L-시스테인일 작용기화된 올리고뉴클레오타이드를 생성한다. 변형된 펩타이드의 티오벤질 말단은 티오페닐의 사용에 의해 티오페닐 유사체로 전환되는 반면, 변형된 올리고뉴클레오타이드는 트리스(카복시에틸)포스핀을 이용하여 환원된다. 이들 두 중간체의 결합 다음에 "천연 결찰" 단계는 올리고뉴클레오타이드-펩타이드 접합체의 형성을 야기한다.
펩타이드 및 핵산을 함유하는 접합된 가닥은 선택된 표면에 적합한 당업계에 공지된 임의의 적합한 공유 결합을 이용하여 고체 지지체에 공유 부착될 수 있다. 예를 들어, 고체 지지된 폴리아크릴아마이드 하이드로겔 표면에 대한 공유 부착은 펩타이드 성분의 "유리" 말단(즉, 핵산에 접합되지 않은 말단) 상의 티오인산염 기의 포함에 의해 달성될 수 있다. 펩타이드/핵산 접합체 구조가 고체상 PCR 증폭을 위새 사용될 증폭 프라이머라면, 고체 지지체에 대한 부착은 핵산 성분이 없는 3' 말단을 이탈해야만 한다.
펩타이드 성분은 임의의 선택된 펩티다제 효소에 의해 절단 가능하게 되도록 설계될 수 있으며, 이 중 다수는 당업계에 공지되어 있다. 펩티다제의 특성은 특히 제한되지 않으며, 펩티다제만이 펩티다제 성분 어디에서나 절단하는 것이 필수적이다. 유사하게, 펩타이드 성분의 길이 및 아미노산 서열은 선택된 펩티다제에 의해 "절단 가능"하게 될 필요를 제외하고 특히 제한되지 않는다.
핵산 성분의 길이 및 정확한 서열은 또한 특히 제한되지 않으며, 임의의 목적하는 서열을 가질 수 있다. 핵산 성분이 고체상 PCR에서 프라이머로서 작용하는 것이라면, 그의 길이 및 뉴클레오타이드 서열은 증폭될 주형에 대한 어닐링을 가능하게 하도록 선택될 것이다.
변성
절단을 위해 사용되는 방법의 임의의 실시형태에서, 절단 반응 생성물은 고체 지지체에 부착되지 않는 절단 가닥(들)의 일부(들)를 제거하기 위해 변성 조건이 실시될 수 있다. 적합한 변성 조건은 표준 분자 생물학 프로토몰에 대해 당업자에게 명백할 것이다(Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3rd Ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY; Current Protocols, eds., Ausubel et al.). 변성(및 절단된 가닥의 후속적 재어닐링)은 부분적으로 또는 실질적으로 단일-가닥인 서열분석 주형의 생성을 초래한다. 이어서, 서열분석 반응은 주형의 단일-가닥 부분에 대한 서열분석 프라이머의 혼성화에 의해 개시될 수 있다.
다른 실시형태에서, 서열분석은 절단 가닥(들)의 일부를 제거하기 위한 변헝에 대한 필요 없이 절단 단계 후에 직접적으로 개시될 수 있다. 절단 단계가 상보성 가닥에 대해 여전히 혼성화된 하나의 절단된 가닥 상에서 유리 3' 하이드록실기를 생성한다면, 서열분석은 초기 변성 단계에 대한 필요 없이 가닥-변위 중합효소를 이용하여 이 지점으로부터 진행될 수 있다. 특히, 가닥 변위 서열분석은 틈내기 엔도뉴클레아제에 의한 절단에 의해 또는 엔도뉴클레아제, 열 또는 알칼리 처리에 의한 비염기성 부위의 가수분해에 의해 주형 생성과 함께 사용될 수 있다.
서열분석 방법
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 고체 지지체 및 방법은 폴리뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열을 결정하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 실시형태에서, 상기 방법은 (a) 폴리뉴클레오타이드 중합효소를 기재의 표면에 (예를 들어, 본 명세서에 기재된 중합체 또는 겔 코팅 중 어느 하나를 통해) 부착된 비선형화된 폴리뉴클레오타이드 클러스터와 접촉시키는 단계; (b) 하나 이상의 뉴클레오타이드가 폴리뉴클레오타이드 중합효소에 의해 이용될 때 검출 가능한 신호가 생성되도록 기재 표면에 뉴클레오타이드를 제공하는 단계; (c) 하나 이상의 부착된 폴리뉴클레오타이드(또는 부착된 폴리뉴클레오타이드로부터 생성된 하나 이상의 클러스터)에서 신호를 검출하는 단계; 및 (d) 단계 (b)와 (c)를 반복하여, 기재-부착된 폴리뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열을 결정하는 단계를 포함한다.
핵산 서열분석은 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 폴리뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열을 결정하는 데 사용될 수 있다. 바람직한 방법에서, 합성에 의한 서열분석(SBS)은 기재 표면에 (예를 들어, 본 명세서에 기재된 중합체 코팅 중 어느 하나를 통해) 부착된 폴리뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열을 결정하는 데 이용된다. 이러한 과정에서, 하나 이상의 뉴클레오타이드가 폴리뉴클레오타이드 중합효소와 결합된 주형 폴리뉴클레오타이드에 제공된다. 폴리뉴클레오타이드 중합효소는 폴리뉴클레오타이드 주형에 상보성인 새로 합성된 핵산 가닥에 하나 이상의 뉴클레오타이드를 혼입한다. 합성은 주형 폴리뉴클레오타이드의 일부에 또는 주형 폴리뉴클레오타이드의 하나의 말단에 공유 결합된 보편적 또는 비가변 핵산의 일부에 상보성인 올리고뉴클레오타이드 프라이머로부터 개시된다. 뉴클레오타이드는 주형 폴리뉴클레오타이드에 대해 혼입되기 때문에, 서열분석 과정의 각각의 단계 동안 뉴클레오타이드가 혼입되는 결정을 가능하게 하는 검출 가능한 신호가 생성된다. 이런 방법으로, 주형 폴리뉴클레오타이드의 적어도 일부에 상보성인 핵산 서열이 생성되어, 주형 폴리뉴클레오타이드의 적어도 일부의 뉴클레오타이드 서열의 결정을 허용한다.
유동 셀은 본 개시내용의 방법에 의해 생성되고 합성에 의한 서열분석(SBS) 또는 주기에서 시약의 반복 전달을 수반하는 다른 검출 기법이 실시되는 어레이의 하우징을 위한 편리한 형식을 제공한다. 예를 들어, 제1 SBS 주기를 개시하기 위해, 하나 이상의 표지된 뉴클레오타이드, DNA 중합효소 등은 본 명세서에 제시된 방법에 의해 제조된 핵산 어레이를 하우징하는 유동 셀로/유동 셀을 통해 유동될 수 있다. 프라이머 연장이 표지된 뉴클레오타이드가 혼입되도록 야기하는 어레이의 해당 부위가 검출될 수 있다. 선택적으로, 일단 뉴클레오타이드가 프라이머에 첨가되면, 뉴클레오타이드가 추가적인 프라이머 연장을 종결시키는 가역적 종결 특성을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 탈차단제가 전달되어 모이어티를 제거할 때까지 후속적 연장이 일어날 수 없도록 가역적 종결자 모이어티를 갖는 뉴클레오타이드 유사체가 프라이머에 첨가될 수 있다. 따라서, 가역적 종결을 사용하는 실시형태에 대해, 탈차단 시약이 (검출이 일어나기 전에 또는 후에) 유동 셀에 전달될 수 있다. 다양한 전달 단계 사이에 세척이 수행될 수 있다. 이어서, 뉴클레오타이드에 의해 프라이머를 연장시키기 위해 주기는 n회 반복되어 길이 n의 서열을 검출할 수 있다. 본 개시내용의 방법에 의해 생성되는 어레이와 함께 사용하기에 용이하게 적합할 수 있는 예시적인 SBS 절차, 유동 시스템 및 검출 플랫폼은, 예를 들어, 문헌[Bentley et al., Nature 456:53-59 (2008)], WO 04/018497; 미국 특허 제7,057,026; WO 91/06678; WO 07/123744; 미국 특허 제 7,329,492호; 미국 특허 제7,211,414호; 미국 특허 제7,315,019호; 미국 특허 제7,405,281호 및 미국 특허 제2008/0108082호에 기재되어 있으며, 이들 각각은 본 명세서에 전문이 참고로 편입된다.
유동 셀을 사용하는 상기 기재한 방법의 일부 실시형태에서, 단일 유형의 뉴클레오타이드만이 단일 유동 단계 동안 유동 셀에 존재한다. 이러한 실시형태에서, 뉴클레오타이드는 dATP, dCTP, dGTP, dTTP 및 이들의 유사체로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 유동 셀을 사용하는 상기 기재한 방법의 다른 실시형태에서, 복수의 상이한 유형의 뉴클레오타이드가 단일 유동 단계 동안 유동 셀에 존재한다. 이러한 방법에서, 뉴클레오타이드는 dATP, dCTP, dGTP, dTTP 및 이들의 유사체로부터 선택될 수 있다.
유동 셀에 존재하는 기재 표면 상의 중합체 코팅에 부착된 폴리뉴클레오타이드 중 하나 이상에 대한 각각의 유동 단계 동안 혼입된 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드의 결정은 폴리뉴클레오타이드 주형에서 또는 근처에서 생성된 신호를 검출함으로써 달성된다. 상기 기재한 방법의 일부 실시형태에서, 검출 가능한 신호는 광학 신호를 포함한다. 다른 실시형태에서, 검출 가능한 신호는 비광학 신호를 포함한다. 이러한 실시형태에서, 비광학 신호는 폴리뉴클레오타이드 주형 중 하나 이상에서 또는 근처에서 pH의 변화를 포함한다.
본 개시내용의 기재의 적용분야 및 용도는 핵산에 관해 본 명세서에 예시되었다. 그러나, 다른 분석물이 본 명세서에 제시되고 분석된 기재에 부착될 수 있다는 것이 이해될 것이다. 본 개시내용의 기재에 또는 기재 상에 하나 이상의 분석물이 존재할 수 있다. 본 개시내용의 기재는 분석물의 검출에, 또는 분석물과의 합성 반응을 수행하는 데 특히 유용하다. 따라서, 검출, 특성규명, 변형, 합성 등이 되는 임의의 다양한 분석물이 본 명세서에 제시된 기재에 또는 기재 상에 존재할 수 있다. 예시적인 분석물은 핵산(예를 들어, DNA, RNA 또는 이들의 유사체), 단백질, 당류, 세포, 항체, 에피토프, 수용체, 리간드, 효소(예를 들어, 키나제, 포스파타제 또는 중합효소), 소분자 약물 후보 등을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 기재는 분석물의 라이브러리로부터 다중의 상이한 종을 포함할 수 있다. 예를 들어, 종은 항체 라이브러리로부터의 상이한 항체, 핵산 라이브러리로부터의 상이한 서열을 갖는 핵산, 단백질 라이브러리로부터 상이한 구조 및/또는 기능을 갖는 단백질, 소분자의 조합 라이브러리로부터의 약물 후보 등일 수 있다.
일부 실시형태에서, 분석물이 개개로 분해 가능하도록 그들은 기재 상의 특징에 대해 분포될 수 있다. 예를 들어, 각각의 분석물의 단일 분자는 각각의 특징에 존재할 수 있다. 대안적으로, 개개 분자가 반드시 분해되지는 않도록 분석물은 콜로니 또는 집단으로서 존재할 수 있다. 콜로니 또는 집단은 (다중 복제물일지라도) 단일 종의 분석물만을 함유하는 것에 대해 동종일 수 있다. 예로서 핵산을 취한다면, 기재 상의 각각의 특징은 핵산의 콜로니 또는 집단을 포함할 수 있고, 콜로니 또는 집단의 모든 핵산은 동일한 뉴클레오타이드 서열(단일 가닥 또는 이중 가닥)을 가질 수 있다. 이러한 콜로니는 본 명세서에서 앞서 제시된 바와 같은 클러스터 증폭 또는 브리지 증폭에 의해 생성될 수 있다. 표적 서열의 다중 복제물은 단일 핵산 분자, 예컨대 구름원(rolling circle) 증폭 절차를 이용하여 생성된 콘카테머(concatemer)에 존재할 수 있다. 따라서, 기재 상의 특징은 단일 종의 분석물의 다중 복제물을 함유할 수 있다. 대안적으로, 특징에 있는 분석물의 콜로니 또는 집단은 2 이상의 상이한 종을 포함할 수 있다. 예를 들어, 기재 상의 하나 이상의 웰은 각각 둘 이상의 상이한 핵산 종(즉, 상이한 서열을 갖는 핵산 분자)을 갖는 혼합된 콜로니를 함유할 수 있다. 혼합된 콜로니에서 둘 이상의 핵산 종은 무시할 수 없는 양으로 존재하여, 예를 들어, 혼합된 콜로니에서 하나 초과의 핵산이 검출될 수 있게 할 수 있다.
실시예
추가적인 실시형태를 다음의 실시예에서 추가로 상세하게 개시하며, 이는 어떠한 방법으로 청구범위의 범주를 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
일반적 표면 제조 프로토콜
세정된 HiSeq(등록상표) 유동 셀의 실란처리
YES(수율 공학처리 시스템(Yield Engineering Systems)) 실란처리 챔버 또는 데시케이터 중 하나를 이용하는 화학 기상 증착법(CVD)을 통해 노보넨-작용기화된 유동 셀을 생산한다. CVD 공정을 전형적으로 60℃애소 1 내지 24시간의 기간 동안 수행한다.
PAZAM 결합
이어서, 실란처리한 유동 셀을 코팅하고 다중 툴링 옵션(multiple tooling option)을 이용하여 접합시킬 수 있다. 예를 들어, 일루미나 서열분석(일루미나로부터 상업적으로 입수 가능)을 위한 cBot 완전 자동화된 클론 클러스터 생성 시스템을 사용하여 이들 작업을 수행할 수 있다. 전형적인 절차에서, 유동 셀을 처음에 IPA/H2O(1:1; 100㎕/분, 2분)로 씻어 낸다. 다음에, 통로를 통해 탈이온수(DI water)로 씻어 낸다(100㎕/분, 2분). 0.5 중량% PAZAM(aq.) 용액의 분취액을 제조한다(8개의 통로에 충분). 중합체를 통로로 유동시킨다(100㎕/분, 2분). PAZAM 결합 단계를 60℃에서 1시간에 걸쳐 완료하였다. 이 단계의 완료 후에, 통로를 물로 씻어 내어 다음의 접합 단계를 위해 준비를 한다. 중합체 코팅 단계를 완료한 후에, 유동 셀을 4℃로 완충제(예를 들어, 식염수-시트르산나트륨(SSC) 완충제)에서 저장할 수 있다. 대안적으로, PAZAM 코팅 직후에 접합 단계가 완료될 수 있다.
PAZAM 코팅된 유동 셀 및 QC의 접합
본 프로토콜은 cBot 시스템(ILMN)을 이용하여 HiSeq(등록상표) 유동 셀을 접합시키기 위한 절차를 기재한다. 접합 절차는 알릴-변형된 P5 서열 올리고 프라이머 및 다이올-변형된 P7 서열 프라이머가 대략 1:1 비로 PAZAM 표면에 공유부착되는 유동 셀 표면을 제공한다. 표준 일루미나 절차 후에 전형적인 접합 혼합물을 제조하고, 사용할 프라이머 농도에 의존한다. 사용하는 전형적인 프라이머 농도는 대략 1 내지 20μM이며, 20 내지 250000 단위(형광 계수)의 프라이머 밀도를 표적화한다. cBot 시스템을 이용하는 표준 일루미나 절차 후에 QC 단계를 수행한 후, 타이푼(Typhoon)(형광 플랫베드 스캐너(fluorescence flatbed scanner)) 상에서 영상화하였다.
QC 후에, 유동 셀의 통로를 5x SSC(60㎕/분, 총 용적 = 300㎕/유동 세포)로 씻어 내어 수산화나트륨(탈혼성화 단계를 수행하기 위해 사용함)을 제거하였다.
이어서, 접합된 유동 셀을 4℃에서 저장한 후에 하류의 생화학 과정(클러스터링, 서열분석)에서 사용하였다.
실시예 1
본 실시예에서, 이중가닥 짝짓기 특성 및 PCR 연장 특성을 방해하는 일 없이 생물학적 조건 하에 화학적 시약에 의해 효율적으로 절단될 특정 부위로서 변형된 티민 뉴클레오사이드 유사체를 포함하는 변형된 올리고뉴클레오타이드를 사용하였다.
특히, 올리고뉴클레오타이드는 5'-C 위치 상에 부착된 비닐 기를 갖는 단일 변형 T-뉴클레오사이드를 함유한다. 수성 완충제 중의 Na2PdCl4 또는 (Pd알릴Cl)2 및 THP 용액으로 처리할 때(인시추로 팔라듐(0) 착물을 생성), 3'-말단에서 인산염 기를 함유하는 더 짧은 올리고가 얻어진 변형된 T 위치에서 올리고뉴클레오타이드를 절단하였다. 이 반응을 이하의 반응식 1에 도시하되, Nu는 친핵체를 나타낸다.
변형된 T 뉴클레오사이드 포스포르아미다이트의 합성을 반응식 2에 기재한다. 출발 물질은 상업적으로 입수 가능하다. 대다수의 반응 단계들은 70% 초과의 수율을 제공하였다. 변형된 T 뉴클레오사이드를 포함하는 최종 DNA 올리고뉴클레오타이드의 우수한 수율을 또한 보고하였다.
5'- O -다이메톡시트라이틸-티미딘-3'-O-TBDPS (2). 5'-O-다이메톡시트라이틸-티미딘 (1)(15g, 1eq, 27.54m㏖)을 고진공 하에 1시간 동안 건조시켰다. DCM 무수물(300㎖)을 N2 하에 첨가하였다. 이 용액에 제1 이미다졸(4.69g, 2.5eq, 69m㏖)을 고체로서 첨가하였고, 이어서, t-뷰틸 다이페닐실릴클로라이드(9.1㎖, 1.3eq, 35.8m㏖)를 고체로서 첨가하였다. 반응 혼합물을 N2 하에 실온에서 1시간 동안 교반시켰다. 반응의 완료를 TLC에 의해 확인하였다. 포화 NaHCO3 용액(100㎖)을 이용하여 반응을 중지시키고, 5분 동안 교반시켰다. DCM(100㎖)을 반응 혼합물에 첨가하고 나서, 수층을 DCM으로 2회 추출하였다. 유기상을 포화 NaHCO3(200㎖) 다음에 염수(200㎖)로 세척하였다. 합한 유기물을 MgSO4로 건조시킨 후에, 용매를 진공 하에 제거하고 나서, 진공 하에 매우 잘 건조시켜 2를 백색/연한 황색 거품으로서 제공하였다. 화합물 2를 조질의 물질로 다음 단계에서 사용하였다. LC-MS (ES 및 CI): (-ve) m/z 782 (M-H+), (-ve) m/z 817 (M+Cl-). 1 H NMR (CDCl3) δ 0.99 (s, 9H, tBu), 1.27 (s, 3H, Me), 1.96-2.06 (m, 1H, H-2'), 2.25 - 2.35 (m, 1H, H-2'), 2.80 (dd, J = 4, 12Hz, 1H, H-5'), 3.15 (dd, J = 4, 12Hz, 1H, H-5'), 3.71 (s, 6H, OMe), 3.96 - 4.01 (m, 1H, H-4'), 4.45-4.50 (m, 1H, H-3'), 6.42 (dd, J = 8, 12Hz, 1H, H-1'), 6.79-6.72 (m, 4H, 방향족), 7.68 - 7.00 (m, 24H, 방향족+CH), 8.01 (s, 1H, NH).
3'- O -TBDPS-티미딘 (3). 조질의 5'-O-다이메톡시트라이틸-티미딘-3'-O-TBDPS (2)(최대값으로서 27.54m㏖)를 N2 하에 무수 MeOH(300㎖)에서 용해시켰다. TFA(10용적%, 30㎖)를 첨가하고 나서, 반응물을 실온에서 2시간 30분 동안 N2 하에 교반시켰다. 반응의 완료는 TLC에 따랐다. 반응을 포화 NaHCO3(200㎖)로 조심스럽게 중지시키고, 실온에서 10분 동안 교반시켰다. MeOH를 진공 하에 제거하였다. 잔여 혼합물을 DCM(300㎖)으로 희석시키고 나서, 포화 NaHCO3로 분배시켰다. 수성상을 DCM으로 2회 추출하고, 이어서, 유기상을 포화 NaHCO3로 세척하였고, MgSO4로 건조시키고 나서, 진공 하에 농축시켰다. 조질의 물질을 칼럼(바이오티지(Biotage), 100g Ultra-Si, PE/EtOAc)에 의해 정제하여 백색 거품으로서 화합물 3(13.15g, 99%)을 제공하였다. LC-MS (ES 및 CI): (-ve) m/z 479 (M-H+), (+ve) m/z 481 (M+H+). 1 H NMR (d 6 DMSO) δ 1.46 (s, 9H, tBu), 2.15 (s, 3H, Me), 2.35-2.53 (m, 2H, H2'), 3.57-3.67 (m, 1H, H5'), 3.77-3.87 (m, 1H, H5'), 4.30-4.36 (m, 1H, H4'), 4.80-4.86 (m, 1H, H3'), 5.41 (t, J = 5.2Hz, 1H), 6.72 (dd, J = 8.7, 5.7Hz, 1H), 7.82-7.94 (m, 6H, 방향족+CH), 8.00-8.05 (m, 5H, 방향족), 11.73 (s, 1H, NH).
화합물 ( 3 )의 대안의 합성. 5'-O-다이메톡시트라이틸-티미딘(1, 40g, 73.4m㏖)을 DCM(0.127M)에서 2시간 동안 실온에서 TBDPSCl(1.3 eq.) 및 이미다졸(2.5 eq.)로 처리한 후에, 메탄올(0.097M)에서 1시간 동안 PTSA (3 eq.)로 처리하여 화합물 (3)을 원-포트(one-pot) 제조에서 100% 수율로 제공하였다. 실릴화 단계 후에 워크업은 필요하지 않았고, 용매 증발 및 밤샘 건조 단계를 제거하고 나서, 공기에 노출시키면서 반응을 수행하였다. 티미딘 뉴클레오사이드의 리보스의 TFA 환원 산-촉매된 재배열 대신 PTSA를 사용한다.
3'- O -TBDPS-5'알데하이드-티미딘(4). 3'-O-TBDPS-티미딘(3)(5.16g, 1eq, 10.75m㏖)을 4A MS와 함께 고진공 레인 하에 밤새 건조시켰다. 이어서, 무수 DCM(250㎖)을 N2 하에 화합물 3 및 4A MS에 첨가하고, 이어서, 빙욕을 이용하여 4℃로 냉각시켰다. 데스 마틴 페리오단(Dess Martin Periodane)을 N2 하에 일부분(3×1.823g, 1.2eq, 12.9m㏖) 첨가하고 나서, 반응물을 4℃에서 N2 하에 1시간 30분 동안 교반시켰다. 반응을 LCMS에 의해 확인하였다. 반응물을 실온으로 가온시키고, 반응물을 N2 하에 4시간 동안, 또는 반응의 완료시까지 교반시켰다. 일단 완료되면 Na2SO3 용액을 반응물(100㎖)에 첨가하였고, 실온에서 10분 동안 교반시켰다. 2개의 상을 분리시키고 나서, 수성상을 DCM으로 2회 추출하였다. 이어서, 유기상을 Na2CO3 및 포화 NaHCO3로 세척하고 나서, MgSO4로 건조시키고, 진공 하에 농축시켰다. 조질의 물질을 고진공 하에 밤새 건조시켜 다음 단계를 위한 준비를 한다. 건조가 개선되도록 톨루엔과 공동 증발을 행하였다. LC-MS (ES 및 CI): (-ve) m/z 477 (M-H+), (-ve) m/z 513 (M+Cl-), (+ve) m/z 479 (M+H+), (+ve) m/z 501 (M+Na+); (-ve) m/z 495 (수화물-H+), (+ve) m/z 519 (수화물+Na+).
알데하이드의 대안의 합성 (4) . 화합물(3, 0.5g)을 DMSO에서 6시간 동안 실온에서 EDC(3 eq.) 및 DCA(0.5 eq.)로 처리하여 카복실산으로 과산화 없이 피츠너-모파트 산화를 통해 화합물(4)을 제공하였고, 이를 데스-마틴(Dess-Martin) 페리오디난 방법으로 관찰하였다(그리고 카복실산 오염물질의 퀀칭을 위해 후속 단계에서 매우 과량의 그리나드(Grignard) 시약의 첨가를 필요로 하였다).
3'-O-TBDPS-5'비닐-티미딘(5). 3'-O-TBDPS-5'알데하이드-티미딘(4)(5.16g, 1eq, 10.75m㏖)을 4Å MS와 함께 고진공 레인 하에 밤새 건조시켰다. 이어서, 무수 THF(150㎖)를 화합물 3 및 4Å MS에 N2 하에 첨가하였다. THF 중의 1M 비닐 브로민화마그네슘 용액(21.5㎖, 2eq, 21.5m㏖)을 매우 서서히 실온에서 30분에 걸쳐 첨가하였다. 반응물을 실온에서 N2 하에 2시간 동안 교반시키고 나서, LCMS로 확인하였다. 필요하다면, 일부 여분의 비닐 브로민화마그네슘을 적가할 수 있고(0.3eq, 3.22㎖), 반응물을 추가 1시간 동안 교반시켰다. 일단 완료되면, 수 중의 1M AcOH 용액(60㎖, pH=6)을 반응물에 첨가하여, 실온에서 10분 동안 교반시켰다. 반응물을 DCM으로 희석시키고, 2상을 분리시켰다. 수성상을 DCM으로 2회 추출하였다. 이어서, 유기상을 포화 NaHCO3로 2회 세척하고 나서, MgSO4로 건조시키고, 진공 하에 농축시켰다. 잔사를 칼럼(바이오티지(Biotage), 100g kpSi, PE/EtOAc)에 의해 정제하여 크림색 거품으로서 화합물 5(2.01g, 2단계에 걸쳐 37%)를 제공하였다. LC-MS (ES 및 CI): (-ve) m/z 505 (M-H+), (-ve) m\z 541 (M+Cl-), (+ve) m/z 507 (M+H+). 1 H NMR (400 MHz, 클로로폼- d ) δ 1.01 (d, J = 10.1 Hz, 9H, tBu), 1.80 (s, 3H, Me), 2.02 - 2.22 (m, 2H, H2'), 3.48-3.54 (m, 0.6H, H5'), 3.81 (t, J = 2.2 Hz, 0.6H, H4'), 3.97 - 4.02 (m, 0.4H, H4'), 4.13 - 4.22 (m, 0.4H, H5'), 4.33 - 4.50 (dm, 1H, H3'), 4.82 - 5.17 (m, 2H, CH2=CH-), 5.24 - 5.43 (m, 0.4H, CH2=CH-), 5.52 - 5.75 (m, 0.6H, CH2=CH-), 6.04 - 6.29 (ddd, J = 21.2, 8.3, 6.0 Hz, 1H, H1'), 7.26 - 7.46 (m, 7H, Arom + CH), 7.50 - 7.66 (m, 4H, Arom), 8.23 (s, 1H, NH).
알릴 알코올의 대안의 합성 (5) . 알데하이드(4)를 THF 중의 비닐 염화마그네슘(2.5 eq.)으로 실온에서 처리하여 화합물(5)을 제공하였다. 브로민화물 대신 염화물 시약의 사용은 목적하는 생성물의 염화물 변이체 도입 없이 목적하는 생성물(상기 방법에서 14%)의 브로민화된 유사체의 생성을 감소시켰다.
3'-O-TBDPS-5'비닐-5'DMT-티미딘(6). 3'-O-TBDPS-5'비닐-티미딘(5)(2.01g, 1eq, 3.97m㏖)을 고진곤 레인 하에 밤새 건조시켰다. AgNO3을 첨가하고 나서, 고체를 고진공 하에 다른 30분 동안 건조시켰다. 무수 DCM을 N2 하에 반응물에 첨가하고, 이어서 콜리딘(1.05㎖, 2eq, 7.94m㏖) 및 최종적으로 고체로서 DMT-Cl(2.02g, 1.5eq, 5.96m㏖)에 첨가하였다. 반응물을 실온에서 N2 하에 3시간 동안 교반시켰고; TLC에 의해 완료를 확인하였다(PE/EtOAc, 6:4 +1% NEt3). 이어서, 반응물을 DCM으로 희석시키고 나서, 셀라이트 상에 여과시키고, 고체를 더 많은 DCM으로 세척하였다. 이어서, 용액을 1% H2SO4(60㎖)로 분배시키고 나서, DCM으로 추출하였다. 유기상을 포화 NaHCO3로 2× 세척하고 나서, MgSO4로 건조시키고, 진공 하에 농축시켜 조질의 6을 거품으로서 제공하였다. 이를 추가 정제 없이 다음 단계에서 사용할 것이다. LC-MS (ES 및 CI): (-ve) m/z 807 (M-H+), (+ve) m/z 809 (M+H+).
대안의 절차: 무수 DCM 중의 화합물(5, 6.7g, 13.2m㏖)과 2,3,5-콜리딘 용액을 30분 동안 분자체(molecular sieve) 상에서 건조시켰다. 이어서, 얻어진 용액을 4,4'-다이메톡시트라이페닐메틸 클로라이드(6.7g) 및 분자체를 함유하는 플라스크에 첨가하였다. AgNO3을 첨가하고 나서, 반응물을 1시간 동안 교반시켰다. 얻어진 혼합물을 DCM(40㎖)으로 희석시키고 나서, 규조토를 통해 여과시키고, DCM(3×40㎖)으로 린스하였다. MeOH(240㎖)를 여과액에 첨가하고 나서, 혼합물을 10분 동안 교반시키고, 이어서, 분별 깔때기에 옮기고 나서, 포화 수성 NaHCO3(2×400㎖)로 세척하고, 건조시키고 나서(Na2SO4), 진공 하에 농축시켜 황색 거품으로서 조질의 생성물을 제공하였다.
5'비닐-5'DMT-티미딘(7). 3'-O-TBDPS-5'알릴-5'DMT-티미딘(6)(1eq, 이전 단계로부터 3.97m㏖)을 고진공 레인 하에 건조시켰다. 무수 THF(12㎖)를 N2 하에 첨가하고 나서, 4℃로 냉각시켰다. THF(4.37㎖, 1.1eq, 4.37m㏖) 중의 1M TBAF 용액을 4℃에서 적가하였다. 4℃에서 5분 후에, 반응물을 실온으로 가온시키고, N2 하에 3시간 동안 교반시켰다. 반응의 완료는 TLC(PE/EtOAc, 3:7 + 1% NEt3)에 따랐다. 반응물을 EtOAc로 희석시키고 나서, 포화 NaHCO3로 분배시켰다. 수성상을 EtOAc로 추출하고, 이어서, 유기상을 포화 NaHCO3 다음에 염수로 세척하고 나서, MgSO4로 건조시키고, 진공 하에 농축시켰다. 잔사를 칼럼(바이오티지, 25g KpSi, PE/EtOAc + 1% NEt3)으로 정제하여 백색 거품으로서 화합물 7(1.81g, 2단계에 걸쳐 80%)을 제공하였다. LC-MS (ES 및 CI): (-ve) m/z 569(M-H+), (+ve) m/z 571(M+H+). 1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 1.46 (s, 1H, Me), 1.65 (s, 2H, Me), 1.97 - 2.13 (m, 2H, H2'), 3.64 (m, 1H, H4'), 3.85 ( dd, J = 8.0, 4 Hz, 0.4H, H5'), 3.92 (dd, J = 8.0, 4 Hz, 0.6H, H5'), 4.31 - 4.45 (m, 1H, H3'), 4.55 - 4.86 (m, 2H, CH=CH2-), 5.27 (dd, J = 7.4, 4.8 Hz, 1H, OH), 5.52 - 5.71 (m, 1H, CH=CH2-), 6.11 (dt, J = 8.1, 5.8 Hz, 1H, H1'), 6.86 (dd, J = 8, 4 Hz, 4H, Arom.), 7.13 - 7.35 (m, 7H, Arom. + CH), 7.40-7.50 (m, 3H, Arom.), 11.35 (s, 1H).
5'비닐-5'DMT-티미딘-포스포르아미다이트(8). 5'비닐-5'DMT-티미딘(800㎎, 1.4m㏖)을 고진공 레인 하에 건조시켰다. 무수 DCM(7㎖)을 N2 하에 첨가하고 나서, 10분 동안 실온에서 분자체와 함께 교반시켰다. 용액에, 휴니그 염기(Hunig's base)(0.74㎖, 4.2m㏖)를 첨가한 후에 2-사이아노에틸 N,N-다이아이소프로필클로로포스포르아미다이트(407㎕, 0.52m㏖)를 첨가하였다. 반응물을 실온에서 N2 하에 3시간 동안 교반시켰다. 반응의 완료는 TLC(PE/EtOAc, 4:6)에 따랐다. 반응물을 진공 하에 농축시켰다. 잔사를 칼럼(바이오티지, 25g KpSi, PE/EtOAc + 1% NEt3)에 의해 정제하여 백색 거품으로서 화합물 8(930㎎)을 제공하였다. LC-MS (ES 및 CI): (-ve) m/z 770(M-H+), (+ve) m/z 771(M+H+). 1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 0.96 - 1.27 (m, 21H), 1.50 (d, J = 5.9 Hz, 1H), 1.66 (s, 3H), 2.02 - 2.37 (m, 3H), 2.58 - 2.74 (m, 2H), 2.78 (td, J = 5.8, 3.9 Hz, 1H), 3.46 - 3.69 (m, 6H), 3.76 - 3.93 (m, 2H), 3.96 - 4.10 (m, 2H), 4.61 (ddd, J = 17.5, 14.2, 8.6 Hz, 2H), 4.68 - 4.98 (m, 3H), 5.43 - 5.79 (m, 1H), 6.04 (dt, J = 9.6, 5.1 Hz, 1H), 6.13 (dt, J = 10.7, 6.9 Hz, 0H), 6.85 (ddt, J = 8.2, 5.2, 2.4 Hz, 6H), 7.09 - 7.34 (m, 11H), 7.34 - 7.50 (m, 4H), 11.37 (d, J = 6.1 Hz, 1H). 31P NMR (162 MHz, DMSO) δ 147.94, 147.16, 147.03.
절단 효율 분석
고 프라이머 밀도 PAZAM 표면(40-60k)에 대한 절단 효율을 평가하였다. 본 명세서에 기재된 표준 절차에 따라 (비패턴화된) HiSeq(등록상표) 유동 셀을 제조하였다. CVD 방법을 이용하여 노보넨 유도 실란을 기재면 상에 침착한 후에 중합체(PAZAM)의 기재면에 대한 클릭 결합 다음에 알릴 T 뉴클레오사이드 유사체(5'-알킨-TTTTTTTTTXCAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT, 여기서 X는 상기 기재한 변형된 T 뉴클레오사이드가 혼입된 부위를 나타냄)를 함유하는 변형된 P7 올리고를 갖는 중합체 표면에 접합을 위한 제2 클릭 결합 절차를 행하였다.
표준 P7 올리고와 유사한 밀도를 갖는 PAZAM 유동 셀 상에 변형된 P7 올리고를 접합시켰다. 변형된 P7 올리고에 대한 접합 효율은 또한 표준 5'-작용기화된 P5 및 P7 올리고와 유사하였다. 유동 셀 표면을 1x EA 혼입 혼합물(50mM 에탄올 아민-HCl(pH 9.9), 50mM NaCl 및 0.05% 챕스(Chaps)를 함유)에서 10분 동안 60℃에서 1mM Na2PdCl4, 10mM THP로 처리하였다. 인시추로 생성된 Pd(0) 착물로 처리 후에 표면으로부터 알릴 T 변형된 P5 올리고의 성공적인 절단을 입증하기 위해 TET-QC 검정을 사용하였다.
도 2a는 Pd(0) 처리 전에 그리고 처리 후에 유동 셀 표면의 타이푼 영상을 도시한다. 도 2b는 Pd(0) 처리 전 그리고 처리 후 프라이머 밀도의 변화를 나타내며, 변형된 P5 올리고로 처리한 유동 셀 표면을 표준 대조군과 비교한다. 저 프라이머 밀도와 고 프라이머 밀도 범위 둘 다에서, 변형된 P5 올리고와 접합된 Pd(0) 처리된 유동 셀 표면은 형광 강도의 실질적 변화를 나타내었다. 결과는 이 방법을 이용하는 매우 효율적인 절단(대략 95%, 형광 검정)을 시사하였다. 비교하면, 표준 P5 올리고 접합된 유동 셀 표면은 형광 강도의 큰 변화를 나타내지 않았는데, 이는 표준 P5 올리고가 Pd(0) 착물에 의해 절단되지 않았다는 것을 나타낸다.
서열분석 실행 결과 분석
짧은 서열분석 실행을 수행함으로써 효과적인 절단을 겪는 상기 기재한 변형된 알릴 T 뉴클레오사이드의 능력을 추가로 분석하였다. 이 실험에서, 상기 기재한 것과 유사한 방법에 따라 유동 셀을 제작하였다. 따라서, 알릴-T 변형된 P5 알킨 올리고 및 표준 P7 알킨 올리고를 다양한 표면 프라이머 밀도로 PAZAM 코팅 유동 셀 상에 접합시켰다. 효율적인 재합성을 보장하기 위해, 알릴 변형의 위치를 변형된 P5 올리고의 3' 말단쪽으로 추가로 이동시켰다. SBS 유동 셀 제작을 위해 사용한 접합 프라이머의 서열을 다음과 같이 기재한다:
P5: 5'-알킨-TTTTTTTTTTAATGATACGGCGACCACCGAGAXCTACAC(서열번호 5)
P7: 5'-알킨-TTTTTTTTTTCAAGCAGAAGACGGCATACGA(8-옥소 G)AT(서열번호 4)
X = 반응식 1에 기재한 바와 같은 알릴 변형.
전형적인 절단 조건은 60℃에서 10분 동안 알릴-P5 접합면을 Na2PdCl4/THP 용액과 함께 인큐베이션시키는 것을 수반한다. Pd(0) 처리된 PAZAM 표면은 이들 조건에서 안정하였고, 수백회 주기의 서열분석을 계속해서 뒷받침할 수 있다. 추가로, 다른 부수적 반응이 검출되지 않았고, PET 재합성에 의해 간접적으로 결정하여, P7 올리고의 후속적 절단은 영향받지 않고 남아 있어서, 알릴 접근의 직교성 및 특이성을 확인하였다.
도 3a는 비-패턴화된 고 프라이머 밀도 유동 셀로부터의 TET 염료 표면 형광 QC 검정(TET-QC) 결과를 입증하는 막대 차트이다. 통로 1 내지 4에서, 표면은 알릴 변형된 P5 올리고 및 표준 P7 올리고와 접합되었다. 통로 5 내지 8에서, 표면은 표준 P5/P7 올리고와 접합되었다. 결과는 변형된 올리고와 표준 P5 올리고 간에 비슷하였다. 도 3b는 도 3a에 기재한 TET-QC 후에 유동 셀 표면의 타이푼 영상을 도시한다. 또한, 통로 사이의 시각적 차이는 확인되지 않았는데, 둘 다 남아있는 검출 가능한 신호를 나타내지 않았기 때문이다. 예비 데이터는 클러스터 밀도에 관해 변형된 P5 올리고와 표준 P5 올리고 간에 특정 차이가 없다는 것을 시사하였다.
또한 며칠 동안 실온에서 저장할 때, Na2PdCl4/THP를 함유하는 절단 용액은 안정하였고, 알릴-변형된 P5 올리고를 절단하기 위해 숙성된 혼합물이 여전히 사용될 수 있다는 것을 관찰하였다.
실시예 2
본 실시예에서, P15/P17 프라이머와 접합된 새로운 유형의 유동 셀에 대해 본 명세서에 기재된 Pd(0) 선형화 방법 및 다이올 절단 방법을 시험하였고, MiSeq(등록상표)(2-통로 기기로서 구성)에 대한 서열분석 데이터를 수집하고, P5/P7 프라이머와 접합된 표준 유동 셀과 비교하고 나서, 도 1에 기재된 효소 선형화를 사용하였다. 새로운 유동 셀과 표준 유동 셀을 둘 다 PAZAM 중합체로 코팅하였고, 표면 상의 프라이머 밀도는 프라이머 유형 둘 다에 대해 약 200K가 되는 것을 목표로 하였다.
NovaSeq(상표명) 혼입 혼합물을 갖는 유동 셀 둘 다에 대해 서열분석을 수행하고 나서, 20℃에서 영상화를 수행하였다. 각각의 선형화 단계(판독 1 및 판독 2) 전에, 임의의 과량의 사용하지 않은 표면 프라이머를 제거하기 위해 유동 셀을 외부 처리하였다. 표준 표면 프라이머(P5/P7)에 대해, 38℃에서 20분 동안 USER 효소(LMX1)와 함께 인큐베이션하는 판독 1에서 그리고 40℃에서 20분 동안 FpG 효소와 함께 인큐베이션하는 판독 2에서 선형화를 행하였다. 새로운 P15/P17 표면 프라이머에 대해, 60℃에서 2분 동안 THP 및 아스코브산나트륨(6mM/60mM/6mM)을 함유하는 팔라듐 혼합물과 함께 인큐베이션하는 판독 1에서 그리고 20℃에서 10분 동안 과아이오딘산나트륨 혼합물로 씻어 낸 판독 2에서 선형화를 행하였다. 해당 데이터에 제시한 서열분석 라이브러리는 PhiX이고, 실행은 2×151 주기였다. 서열분석 결과를 이하의 표에 요약한다.
서열분석 데이터는 Pd(0)가 서열분석에서 잘 작업된 화학적 선형화를 보조하였고, 1차 기질은 표준에 비교하여 매우 유사하다는 것을 제시한다. 클러스터 패싱 필터(Cluster passing filter)(PF%), 단계화(phasing)/전단계화(prephasing), 배열%는 P5/P7과 P15/P17 표면 프라이머 둘 다와 동등하였다. 오류%은 P15/P17 접합 유동 셀에 대해 판독 1에서 약간 더 높았지만, 여전히 상당히 양호하였고(도 4에 나타냄) 유동 셀에서 유동 셀로의 변형이 마찬가지로 일어날 수 있다. 판독 2에서 오류율%는 비슷하다. 더 나아가, 선형화에 필요한 시간은 새로운 유형의 유동셀을 이용할 때 판독 2에 대해 2배만큼 그리고 판독 1에 대해 10배만큼 감소된다.
실시예 3
본 실시예에서, 실시예 1에 기재한 알릴 T 뉴클레오사이드는 현재의 일루미나 제조 작업 흐름을 추가로 간소화하기 위해 검출 가능한 표지(즉, 형광 표지)로 추가로 태그할 수 있다. 일단 염료 표지된 알릴 T 뉴클레오사이드가 P5 올리고에 혼입된다면, 이는 완료 직후에 접합 반응의 직접 정량화를 가능하게 한다. 본 과정에서, 이 단계는 별개의 혼성화 검정으로서 수행한다.
앞의 실시예에 기재한 것과 유사한 합성 방법을 이용하여, 염료 표지된 변형된 T 뉴클레오타이드를 이용하는 Pd(0) 절단 반응을 반응식 3에 도시한다.
실시예 4
본 실시예에서, 다이올 링커 시약을 반응식 4에 나타낸 바와 같이 제조하였다. 상기 방법은 미국 특허 제8,715,966호에 기재한 합성에 대해 개선된다.
다이올-1. 본 방법은 다이올-1의 합성에서 용매로서 DMF를 제거한다. DMF는 에멀션의 형성 및 생성물의 수성상으로의 바람직하지 않은 분배 때문에, 수성 추출을 복잡하게 만들며, 사전-보고 과정에서, 워크업 전 그의 제거는 시간 소모적이다. 이전의 DMF/DCM 혼합물을 EtOAc로 대체하였고, 이는 진행 시간을 3일로부터 1 내지 2일(크로마토그래피를 포함)로 감소시켰다. 추가로, 비스-트라이틸화된 부산물의 형성은 이전의 방법에서 수율을 감소시켰다. 헥산다이올/DIPEA의 혼합물에 대한 고체 DMTr-Cl의 소량 첨가로부터 헥산다이올/DMTr-Cl의 혼합물에 대한 액체 DIPEA의 적가까지 시약의 첨가 순서 변화는 목적하는 생성물에 대한 반응의 선택성을 약 10%만큼 개선시켰다. 일부 실시형태에서, 이 반응의 생성물은 크로마토그래피 없이 조질을 사용하여 DMTr-OH 및 비스-트라이틸화된 부산물을 사용할 수 있다.
다이올-3. TPAP/촉매 NMO를 이용하는 사전 산화 방법은 대응하는 카복실산에 대한 과산화를 야기하였고, 3 내지 4일이 필요하였다. 본 명세서에서, DCM과 수성 NaHCO3의 2상 혼합물에서 TPAP/NMO를 TEMPO/표백제로 대체하였다. 표백제를 남아있는 시약의 혼합물에 적가하고 나서, 일단 표백제 첨가가 행해지면, 반응을 완료하였다. 수성 추출에 의해 생성물을 단리시켰고, 과산화를 최소로 하며 수율은 66 내지 92%이고, 전반적 과정은 더 빨랐다(1.5일). 다른 실시형태에서, 다이올-3 및 다이올-4의 합성을 단축시켜 중간 크로마토그래피 단계를 제거할 수 있다. 출발 물질에서 임의의 카복실산 물질을 중화시키는 데 과량의 tBuOK가 필요할 수 있다.
다이올-2. 다이올-2의 합성을 위한 사전 방법은 36시간에 일부 조작과 함께 48시간 환류를 포함하여 완전한 반응을 보장하였다. 반응 농도의 증가는 환류 시간이 48시간으로부터 12 내지 24시간으로 감소되게 하였다. 이전의 프로토콜에서, 조질의 다이올-2를 물에 추출하였다. 물의 제거가 필요하였는데(후속 단계가 수분-민감성이기 때문), 이는 규모가 시간-소모적이었다. DCM에 다이올-2의 추출 및 수성 NaHCO3으로 세척에 의해 단계를 개선시켜 임의의 아세트산을 제거하고 용매 제거 시간을 최소화하였다. 전체 과정 시간은 3일로부터 2일로 감소되었다. 생성물을 DCM에서 저장액으로서 저장하였다. 용액을 3A 분자체에 대해 밤새 저장한 후에 다이올-4와 반응시켰다.
대안적으로, 다이올-2는 정제를 단순화시키기 위해 대응하는 알코올로 가수분해될 수 있다. 이어서, 알코올은 후속 단계에서 사용되어 다이올-4를 직접 제공한다.
다이올-5. 크로마토그래피 정제 단계를 제거하여 공정 시간에서 1일을 절약하였다. 추가로, DMF를 DCM으로 전환시켜 수성 워크업 동안 용매/세척 용액 용적의 감소를 가능하게 함으로써 공정 효율을 개선시킬 수 있다.
다이올-6. 크로마토그래피 정제 단계가 제거될 수 있다.
다이올-7. 다이올-7의 합성은 두 단축 공정, 에스터화 및 TBAF를 이용하는 탈실릴화를 수반한다. 이전에 보고된 공정에서, TBAF에 의한 탈실릴화 동안에 상당한 1,4-아세틸 이동이 관찰되었는데, 이는 상당량의 바람직하지 않은 부산물인 다이올-7M의 형성을 야기한다:
.
이 물질은 다이올-7의 전반적인 수율 및 순도를 감소시켰다. 추가로, 후속 단계에 대한 다이올-7M의 극복은 1차 알코올보다는 2차 알코올에 대한 포스포르아미다이트에 의해 다이올-8M을 생성하였다. 프라이머 내로의 혼입은 비절단 가능 링커를 초래할 것이다. 본 방법에서, TBAF 단계는 상업적 TBAF 배취로부터 목적하지 않는 NaOH를 제거하기 위해 AcOH로 완충되었다. 너무 많은 AcOH는 DMTr 보호기의 상실을 야기한다. 1.75 eq. AcOH로 반응을 실행하고, TBAF와 AcOH의 사전 혼합 후에 출발 물질에 노출시켰다. 추가로, 사전 방법은 워크업 전에 THF의 증발을 포함하였고; 본 방법은 해당 증발 단계를 제거하였으며, 수성상의 pH 7로의 조심스러운 중화를 포함하여 생성물의 염기-유도 분해를 감소시켰다. 최종적으로, 에스터화 단계 후에 크로마토그래피 정제를 제거하였다.
대안적으로, 다이올-5의 다이올-7로의 합성 절차는 단축되어 추가적인 크로마토그래피 단계들을 제거할 수 있다. 종합하면, 상기 공정은 6개보다는 3개의 크로마토그래피 단계를 포함하여 실행될 수 있으며, 조질의 물질은 다이올-4, 다이올-7 및 다이올-8 단계에서 정제될 것이다.
실시예 5
본 실시예는 하이드록실 보호기로서 작용하는 A-TOM 단량체인 변형된 3' 인산염 모이어티의 합성을 기재한다. (TOM = 트라이-아이소프로필실릴옥시메틸)
단계 1. DMT 아데노신(A-OBz)의 벤조일화.
N6-벤조일-2'-데옥시-5'-ODMT-D-아데노신(11.2g, 17m㏖) 및 용매(1:3 비로 피리딘/DCM 혼합물, 11㎖ 피리딘, 33㎖ DCM)를 실온에서 혼합하여 용액을 제공하였다. 반응 플라스크를 0℃로 냉각시키고, 그것에 DMAP(0.41g, 3.41m㏖) 및 염화벤조일(3.9g(3.2㎖), 34.1m㏖)을 첨가하였다. 밤새 교반시키는 한편 실온으로 가온시켜(반응 진행의 TLC 모니터링) 일부 백색 고체 침전물이 있는 매운 연한 오렌지색 혼합물을 초래하였다. 40℃ 미만의 온도에서 진공 하에 용매를 제거하였다. 잔사를 AcOEt(대략 500㎖)로 희석시키고 나서, 포화 수성 중탄산나트륨(2×250㎖), 물(250㎖)로 2회 세척하고, MgSO4로 건조시켰다. 용매의 증발 및 톨루엔과 공동증발 후에, 백색 거품이 얻어졌고, 일정한 중량까지 진공에서 건조시켰다. 정제 없이 다음 단계에서 물질을 사용하였다.
단계 2. 탈트라이틸화(A-OH).
A-OBz(13.69g, 비정제, 17m㏖)를 다이클로로메탄/메탄올 혼합물(1:1, 300㎖) 중에 용해시키고 나서, 0℃로 질소 하에 냉각시켰다. 트라이플루오로아세트산(2.75㎖, 36m㏖)을 주사기를 통해 첨가하였다. 반응물을 교반시킨 한편 1시간 동안 실온으로 가온시켰다. 모니터링한 반응은 TLC에 의해 진행시킨다. 고체 NaHCO3(3g, 36m㏖)의 첨가에 의해 반응을 0℃에서 중지시켰다. 진공 하에 40℃ 미만의 온도에서 용매를 제거하고 나서, 잔사를 AcOEt(대략 800㎖)로 희석시키고, 물(5×250㎖)로 5회 세척하였다. 유기층을 MgSO4로 건조시키고 나서, 여과 후 진공에서 건조시켜 백색 거품을 수득하였다. 칼럼 크로마토그래피에 의한 정제(1:1 석유 에터/에틸 아세테이트 대 에틸 아세테이트로 구배 용리)로 백색 분말로서 표적 생성물을 얻었다. (5.0g, 60% 수율(2 단계), 100% 에틸 아세테이트에서 Rf = 0.35) 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 11.25 (s, 1H), 8.78 (s, 1H), 8.75 (s, 1H), 8.07 (ddt, J = 10.1, 7.0, 1.4 Hz, 4H), 7.75 - 7.68 (m, 1H), 7.68 - 7.62 (m, 1H), 7.62 - 7.51 (m, 4H), 6.64 (dd, J = 8.6, 5.9 Hz, 1H), 5.68 (dt, J = 6.1, 1.9 Hz, 1H), 5.28 (t, J = 5.7 Hz, 1H), 4.31 (td, J = 4.4, 1.8 Hz, 1H), 3.72 (tdd, J = 11.8, 6.4, 4.7 Hz, 2H), 3.19 (ddd, J = 14.4, 8.7, 6.1 Hz, 1H), 2.75 (ddd, J = 14.1, 5.9, 1.8 Hz, 1H).
단계 3. 산화.
다이클로로메탄(50㎖) 함유 분자체(4Å)에서 A-OH(1.0g, 2.18m㏖)의 용액을 질소 기체 하에 0℃로 냉각시켰다. 별개의 플라스크에서, 데스-마틴 페리오디난(1.11g, 2.61m㏖)을 분자체에 대해 다이클로로메탄(10㎖)에서 용해시켰다. 데스-마틴 용액을 A-OH에 첨가하였고, 실온으로 가온시켰다. 반응을 LCMS에 의해 모니터링하였고, 1시간 후에 반응을 포화 중탄산나트륨 용액으로 중지시켰다. 퀀칭 혼합물을 다이클로로메탄(~250㎖)으로 희석시키고, 중탄산나트륨 용액(100㎖) 및 물(2× 100㎖)로 세척하였다. 유기층을 MgSO4로 건조시키고 나서, 여과 후 진공에서 건조시켜 백색 거품을 수득하였고, 이를 추가 정제 없이 다음 단계에서 사용하였다.
단계 4. 비티히 반응(Wittig Reaction)(A-CH=CH
2
).
메틸트라이페닐포스포늄 브로민화물(5.83g, 16m㏖)을 교반 막대, 분자체 및 질소 라인(nitrogen line)을 함유하는 오븐-건조시킨 2구 둥근 바닥 플라스크에서 건조 THF(40㎖)와 혼합하였다. 플라스크의 하나의 입구는 고체 첨가관 내 칼륨 tert-뷰톡사이드를 보유하였다. 용액을 0℃로 냉각시켰다. 연결 부위 내 첨가관을 돌림으로써 칼륨 tert-뷰톡사이드를 첨가하여, 공기에 대한 노출 또는 시스템 개방 없이 교반 용액 내로 고체가 떨어지지 못하게 하였다. 용액은 혼탁한 백색으로부터 황색으로 바뀐다. 0℃에서 1시간 동안 교반시켰다. 주의: 이 단계를 위한 모든 고체 시약을 고진공 하에 밤새 오산화인의 존재 하에 건조시켰다. 주사기, 바늘, 교반 막대, 활성화된 분자체를 또한 동일한 탱크에서 건조시켰다.
황색 고체를 0℃에서 넓은-게이지 바늘 및 주사기를 통해 THF(15㎖) 중의 A-CHO(2.5g, 5.44m㏖) 용액에 첨가하였다. 색은 황색으로부터 오렌지색으로 변하였다. 0℃에서 3시간 동안 교반시키고, LCMS에 의해 모니터링하였다.
1ℓ 비커 내 0℃에서 물(300㎖) 및 AcOEt(300㎖)를 함유하는 플라스크에 반응 혼합물을 부어서 반응을 워크업시켰다. 10분 동안 교반시킨 후에 분별 깔때기에 옮겼다. 유기층을 포화 중탄산나트륨 용액(3×100㎖) 및 염수(100㎖)로 세척하였다. 유기층을 MgSO4로 건조시키고, 여과 후 진공에서 건조시켜 황갈색 거품을 수득하였다. 칼럼 크로마토그래피(다이클로로메탄 내지 5% 메탄올/DCM에 의한 구배 용리)에 의한 정제로 크림같은 황색 거품으로서 표적 생성물을 얻었다. (2.59g, 5% MeOH/DCM에서 Rf = 0.53) 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 11.21 (s, 1H), 8.77 (s, 1H), 8.66 (s, 1H), 8.05 (d, J = 7.2 Hz, 2H), 7.65 (t, J = 7.4 Hz, 1H), 7.57 (q, J = 7.9, 7.3 Hz, 3H), 6.50 (t, J = 6.7 Hz, 1H), 6.06 (ddd, J = 17.2, 10.4, 6.7 Hz, 1H), 5.55 (d, J = 4.4 Hz, 1H), 5.29 - 5.10 (m, 2H), 4.42 (p, J = 4.2 Hz, 1H), 4.30 (dd, J = 6.7, 3.6 Hz, 1H), 2.94 (dt, J = 13.1, 6.4 Hz, 1H), 2.40 (ddd, J = 13.3, 6.5, 4.3 Hz, 1H).
단계 5. 다이올 산화(A-OHOH).
교반 막대를 구비한 플라스크에 질소 하에 THF(7㎖) 중의 A-CH2CH2(0.68g, 1.49m㏖)의 용액을 넣었다. 4-메틸모폴린 N-옥사이드(0.262g, 2.235m㏖)를 고체로서 칭량하고 반응 플라스크에 첨가하였다. 또한 물(7㎖)을 첨가하였다. 사산화오스뮴(수 중 4% 용액, 285㎕, 0.045m㏖)을 반응 플라스크에 첨가하였다. 반응물을 40℃에서 밤새 가열하였다. 반응의 TLC 및 LCMS 모니터링을 진행한다. 고체로서 황산티오나트륨을 첨가함으로써 반응을 퀀칭시킨다. 혼합물을 30분 동안 교반시킨 후에 에틸 아세테이트(150㎖) 및 중탄산나트륨 용액에서 워크업시켰다. 유기층을 포화 중탄산나트륨 용액(3×100㎖)으로 3회 세척하였다. 유기층을 MgSO4로 건조시키고, 여과 후 진공에서 건조시켜 회백색의 서서히 결정화되는 고체를 수득하였다. 칼럼 크로마토그래피(다이클로로메탄 내지 10% 메탄올/DCM에 의한 구배 용리)에 의한 정제로 표적 생성물을 무색 오일로서 얻었다. (0.13g, 19% 수율, MeOH/DCM에서 Rf = 5% 0.28) 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 11.25 (s, 1H), 8.78 (s, 1H), 8.73 (s, 1H), 8.07 (ddt, J = 9.6, 7.2, 1.4 Hz, 4H), 7.74 - 7.68 (m, 1H), 7.68 - 7.62 (m, 1H), 7.62 - 7.47 (m, 5H), 6.62 (dd, J = 8.9, 5.8 Hz, 1H), 5.82 (dt, J = 5.8, 1.5 Hz, 1H), 5.48 (d, J = 5.1 Hz, 1H), 4.69 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 4.31 (dd, J = 5.0, 1.5 Hz, 1H), 3.81 (p, J = 5.3 Hz, 1H), 3.48 (dh, J = 22.3, 5.5 Hz, 2H), 3.18 (ddd, J = 14.4, 9.0, 5.9 Hz, 1H), 2.70 (ddd, J = 14.4, 6.0, 1.5 Hz, 1H).
단계 6. 실릴화(A-OHTOM).
DCM 중의 A-OHOH(0.128g, 0.262m㏖) 용액을 교반 막대 및 질소 선을 함유하는 플라스크 내 DCM(1.5㎖)에 용해시켰다. 다이-tert-뷰틸주석 다이클로라이드(80㎎, 0.262m㏖)와 N,N-다이아이소프로필에틸아민(182㎕, 1.05m㏖)을 실온에서 30분 동안 첨가하였다. 트라이-아이소-프로필실릴옥시메틸 클로라이드(TOM-Cl, 79㎕, 0.341m㏖)를 마이크로피펫을 통해 첨가하였다. 반응의 TLC 및 LCMS 모니터링을 진행한다. 반응물을 밤새 실온에 두었다. 에틸 아세테이트(200㎖)에서 반응 워크업을 수행하였다. 포화 중탄산나트륨 용액(3×100㎖)으로 세척하였다. 유기층을 MgSO4로 건조시키고, 여과 후 진공에서 건조시켜 황/갈색 오일을 수득하였다. 칼럼 크로마토그래피(다이클로로메탄 내지 8% 메탄올/DCM으로 구배 용리)에 의한 정제로 황백색 거품으로서 표적 생성물을 얻었다(0.14g, 79% 수율, 5% MeOH/DCM에서 Rf= 0.5) 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 11.25 (s, 1H), 8.76 (s, 1H), 8.73 - 8.65 (m, 1H), 8.06 (tt, J = 7.5, 1.4 Hz, 4H), 7.76 - 7.62 (m, 2H), 7.62 - 7.46 (m, 4H), 6.61 (dd, J = 8.9, 5.7 Hz, 1H), 5.82 (d, J = 5.7 Hz, 1H), 5.65 (d, J = 5.3 Hz, 1H), 4.84 (s, 2H), 4.27 (dd, J = 5.4, 1.5 Hz, 1H), 4.06 - 3.93 (m, 1H), 3.62 (ddd, J = 42.1, 10.3, 5.2 Hz, 2H), 3.22 (ddd, J = 14.7, 9.1, 5.8 Hz, 1H), 2.74 - 2.65 (m, 1H), 0.94 (m, 21H, TOM).
단계 7. 트라이틸화(A-TOM-DMT).
건조 A-OHTOM(0.14g, 0.207m㏖), (4,4'-다이메톡시트라이페닐메틸 클로라이드(DMT-Cl, 0.105g, 0.311m㏖) 및 질산은(53㎎, 0.311m㏖)을 건조 DCM(1.5㎖) 및 콜리딘(2,4,6-트라이메틸피리딘)(55㎕, 0.414m㏖)이 있는 플라스크에 넣었다. 반응물을 3시간 동안 실온에서 교반시켰다. 반응의 TLC 및 LCMS 모니터링을 진행한다. DCM(100㎖)으로 반응 혼합물을 희석시키고 나서, 소결 유리 깔때기를 통해 여과시켰다. DCM 용액을 포화 중탄산나트륨 용액(5×100㎖)으로 세척하였다. MgSO4로 DCM 층을 건조시키고, 여과 후 진공에서 건조시켜 황색/갈색 오일을 수득하였다. 칼럼 크로마토그래피(다이클로로메탄 대 10% 메탄올/DCM으로 구배 용리)에 의한 정제로 점성 황색 오일로서 표적 생성물을 얻었다(0.17g, 85% 수율, 5% MeOH/DCM에서 Rf=0.46).
단계 8. (A-3'OH).
메탄올과 THF의 혼합물(4:5, 총 0.9㎖)에서 A-TOM-DMT (56㎎, 56μ㏖)의 용액을 0℃로 냉각시켰다. 수산화나트륨(4M, 0.1㎖, 과량)을 첨가하고 나서, 0℃에서 15분 동안 교반시켰다. TLC 및 LCMS에 의해 반응을 모니터링하였다. 아세트산(1M, 0.5㎖)을 이용하여 반응을 퀀칭시켜, pH가 pH 8 미만이 되지 않게 보장하였다. 반응 혼합물을 에틸 아세테이트(EA, 100㎖)로 희석시키고, 용액을 포화 중탄산나트륨 용액(3×50㎖)으로 세척하였다. MgSO4로 EA층을 건조시키고, 여과 후 진공에서 건조시켜. 잔사를 칼럼 크로마토그래피(EA/석유 에터(25%) 대 100% EA로 구배 용리)에 의해 정제하여 백색 거품(0.02g, 40% 수율, 100% EA에서 Rf=0.38)을 제공하였다.
단계 9. 포스포르아미다이트 형성(ATOM 단량체).
A-3'OH(92㎎, 105μ㏖)를 분자체 및 자기 교반 막대를 함유하는 플라스크에 넣은 후에 THF(건조, 0.2㎖)를 질소 기체 하에 실온에서 첨가하였다. N,N-다이아이소프로필에틸아민(110㎕, 630μ㏖)을 THF 용액에 첨가하였다. 최종적으로, 2-사이아노에틸 N,N-다이아이소프로필클로로포스포르아미다이트(38㎕, 169μ㏖)를 마이크로피펫을 통해 첨가하였다. 반응물을 질소 하에 실온에서 교반시켰다. 반응을 TLC에 의해 모니터링하였다. 반응이 완료되었을 때, 용매를 진공에서 제거하였다. 잔사를 석유 에터(3×20㎖)로 실온에서 세척하였다. 이어서, 잔사를 DCM 중에 용해시키고 나서, 여과시켜 분자체를 제거하였다. 진공에서 다시 건조시킨 후에 칼럼 크로마토그래피(EA/석유 에터(20%) 대 75% EA에 의한 구배 용리)에 의해 정제하여 점성의 무색 오일(80㎎, 70% 수율)을 제공하였다 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 11.17 (s, 1H), 8.57 (s, 1H), 8.39 (s, 1H), 8.06 - 7.99 (m, 2H), 7.64 (td, J = 7.1, 1.2 Hz, 1H), 7.58 - 7.46 (m, 4H), 7.36 (ddd, J = 15.4, 9.0, 2.8 Hz, 4H), 7.29 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 7.27 - 7.17 (m, 1H), 6.92 - 6.83 (m, 4H), 6.34 (dd, J = 9.0, 5.9 Hz, 1H), 4.78 - 4.71 (m, 1H), 4.68 (q, J = 6.6, 4.6 Hz, 1H), 4.52 (dd, J = 8.5, 4.9 Hz, 1H), 4.27 (d, J = 7.1 Hz, 1H), 3.85 - 3.69 (m, 8H), 3.62 (dp, J = 10.4, 6.7 Hz, 1H), 3.34 - 3.22 (m, 1H), 2.78 (td, J = 5.8, 1.9 Hz, 2H), 2.64 (td, J = 8.8, 4.7 Hz, 1H), 2.26 - 2.16 (m, 1H), 2.08 (d, J = 0.7 Hz, 6H), 1.21 (dd, J = 15.4, 5.6 Hz, 9H), 1.12 (d, J = 6.7 Hz, 6H), 0.99 - 0.88 (m, 2H), 0.83 (dd, J = 6.3, 4.5 Hz, 18H).
실시예 6
모델 다이뉴클레오타이드(C-Tom-A)의 합성.
C-아미다이트(125㎎, 0.15m㏖)와 A-OH-Tom(64㎎, 0.1m㏖)의 화합물을 진공하에 밤새 P2O5로 건조시키고 나서, 무수 아세토나이트릴(1㎖)에 용해시켰다. N2 하에서, 에틸티오테트라졸(ETT, 32.5㎎, 0.25m㏖)을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 15분 동안 교반시켰다. TLC 및 LC-MS는 출발 물질 A-OH-Tom의 완전한 소모를 나타내었다. 데칸(5M, 0.1㎖)과 DCM(1㎖) 중의 t-BuOOH 용액을 반응 혼합물에 첨가하고 나서, 15분 동안 실온에서 교반시켰다. 반응 혼합물을 수성 NaHCO3에 붓고 나서, 수성상을 EtOAc로 추출하였다. 합한 유기상을 증발시키고 NaOH(0.1M, H2O/THF/MeOH=1/4/5 v/v 중의 1㎖)로 실온에서 1시간 동안 처리하였다. 이어서, 혼합물을 THF/MeOH(5㎖/4㎖) 중의 HCl(1M)로 0.5시간 동안 처리하였다. 반응 혼합물을 농축시키고 나서, H2O와 EtOAc에 분배시켰다. 수성상으로부터 목적하는 생성물을 회수하고 나서, 추가로 RP HPLC(TEAB 0.1M/CH3CN)로 정제하였다.
모델 화합물 C-TOM-A에 대한 절단 연구.
C-TOM-A의 저장액을 탈보호 조건 하에 처리하였다. RP HPLC에 의해 반응 진행을 모니터링하였다. 중간체 C-A는 TOM 기가 C-TOM-A로부터 제거되었지만, 인산염 결합은 절단되지 않은 화합물이다. 이하의 표 1은 다양한 반응 조건 및 탈보호 시약 하의 탈보호 결과를 요약한다.
| 조건 | 결과 |
| 0.5mM C-TOM-A, 0.5M TBAF, 1:1 THF/H2O, pH ~ 7 | 60% 중간체 C-A/2.5 h |
| 0.5mM C-TOM-A, 0.5M Et3N-3HF, Et3N, pH ~ 7 | 100% 중간체 C-A/2.5 h |
| 0.5mM C-TOM-A, 0.25M NH4F, pH ~ 7 | 80% 중간체 C-A/2.5 h |
| 0.5mM C-TOM-A, 0.25M CsF, 트리스-HCl, pH 7.4 | 70% 중간체 C-A/2.5 h |
| 0.5mM C-TOM-A, 0.25M CsF, 트리스-HCl, pH 9 | 70% 중간체 C-A/2.5 h |
| 0.5mM C-TOM-A, 0.5M Et3N-3HF, pH ~ 1 | 80% 중간체 C-A + 20% 생성물/1 h |
| 0.33mM C-TOM-A, 0.17M NH4F, 0.33M NaOH, pH ~ 14 | 50% 중간체 C-A + 50% 생성물/1 h |
| 0.33mM C-TOM-A, 0.33M CsF, 0.33M NaOH, pH ~ 14 | 1시간에 완료 |
| 0.5mM C-TOM-A, 1M NaOH, pH 14 | 20분에 완료 |
실시예 7본 실시예에서, Pd(0) 착물을 생성하기 위한 대안의 방법을 기재하고, 그들의 화학적 절단 활성을 실시예 1에 기재된 바와 같은 알릴 팔라듐(II) 클로라이드 이량체 (Pd(C3H5)Cl)2 및 THP로부터 인시추로 생성된 Pd(0) 착물과 비교하였다. 인시추로 생성된 Pd(0) 착물과 대조적으로, 일부 팔라듐(II) 전-촉매를 제조하고 나서, 화학적 선형화 반응, 예를 들어, P15 프라이머의 화학적 절단에서 사용 전에 단리시켰다. 이들 Pd(II) 전-촉매는 단리 형태에서는 비활성이지만, THP의 존재 하에 편리하게 인시추로 활성 Pd(0)로 환원시킬 수 있다. 이들 대안의 Pd 전-촉매는 생성물 안정성을 개선시키고, 보관 수명을 연장시킬 수 있다.
제조 방법
(Pd(C3H5)Cl)2를 질소 하에 건조, 탈기 테트라하이드로퓨란에 용해시키고 나서, 테트라하이드로퓨란 용액으로서 첨가한 1 내지 10당량의 THP로 처리하였다. 오일 유출이 관찰되었고, 상청액을 디캔팅시킴으로써 오일을 단리시켰다. 물질을 진공 하에 건조시켜 황색 내지 갈색 또는 오렌지색 점성 오일을 얻었다. 이들 물질은 수 중에서 고도로 가용성이었다. 1 내지 2 당량의 THP를 첨가하였을 때, [Pd(C3H5)(THP)]Cl과 [Pd(C3H5)(THP)2]Cl의 혼합물을 단리시켰고, 이들 둘 다 Pd(II) 착물이었다. 5당량의 THP를 첨가하였을 때, [Pd(C3H5)(THP)2]Cl의 깨끗한 샘플을 얻었다. 이들 두 Pd(II) 착물을 단리시키고 나서, 특성규명하였다. 10 당량의 THP를 첨가하였을 때, P15 선형화에 활성인 Pd(0) 물질을 얻었다.
[Pd(C3H5)(THP)]Cl: 31P NMR (162 MHz, D2O): d 14 (s) ppm. 13C NMR (101 MHz, D2O): d 118.7 (d, J = 5.0 Hz), 81.7 (d, J = 29 Hz), 62.1 (d, J = 15 Hz), 26.5 (s), 20.5 (d, J = 25.0 Hz) ppm. LC-MS: [알릴Pd(THP)]+; 예상치: 355 Da, 실측치: 355 Da.
[Pd(C3H5)(THP)2]Cl: 31P NMR (162 MHz, D2O): d 10 (s) ppm. 13C NMR (101 MHz, D2O): d 122.7 (t, J = 5.3 Hz), 71.2 (t, J = 14 Hz), 61.8 (t, J = 7.6 Hz), 26.7 (s), 22.1 (t, J = 13 Hz) ppm. LC-MS: [알릴Pd(THP)2]+; 예상치: 563 Da, 실측치: 563 Da.
P15 절단을 위한 사용
1, 2, 5 및 10 당량의 THP에 의한 (Pd(C3H5)Cl)2의 처리로부터 단리시킨 물질을 10㎎/㎖로 수성 완충제에서 제형화하였다. HPLC-기반 검정을 이용하여 P15 절단에 대한 이들 제형의 활성을 평가하였다. 이 검정에서, P15 프라이머(10μM) 용액을 10% v/v의 각각의 제형으로 처리하였고, 10분 동안 38℃에서 인큐베이션시키고, 이어서, 희석 및 교반 칼럼 처리에 의해 퀀칭시키고 나서, HPLC에 의해 분석하였다. P15와 절단 상물 피크 면적비로부터 절단 백분율을 계산한다.
[Pd(C3H5)(THP)]Cl 및 [Pd(C3H5)(THP)2]Cl((Pd(C3H5)Cl)2를 1 내지 5 당량의 THP와 혼합하는 것으로부터 얻음)의 수성 제형은 다른 첨가제의 부재 하에 P15 절단에 대해 비활성이었다. 그러나, (Pd(C3H5)Cl)2와 10 당량의 THP와의 혼합으로부터 단리시킨 물질의 수성 제형은 (Pd(C3H5)Cl)2(6mM), THP(60mM) 및 아스코브산나트륨(6mM)으로부터 인시추로 제조한 Pd 혼합물과 비슷한 P15 절단 활성을 제공하였다. 결과를 도 5a에 나타낸다. Pd(II) 전-촉매 [Pd(C3H5)(THP)]Cl 및 [Pd(C3H5)(THP)2]Cl이 추가적인 수성 THP 용액에 의한 처리에 의해 제조 동안 또는 그들의 사용 시점에 인시추로 편리하게 활성화되었다는 것을 관찰하였다. [Pd(C3H5)(THP)2]Cl은 수용액(12mM Pd)으로 제형화할 때에 1 당량 이상의 THP로 처리할 때 활성이 된다는 것을 입증하였다. P15 절단 성능은 (Pd(C3H5)Cl)2(6mM), THP(60mM) 및 아스코브산나트륨(6mM)의 혼합물로부터 인시추로 제조되는 Pd(0) 혼합물의 기준 샘플 지점을 초과하였다(도 5b).
실시예 8
본 실시예에서, 대안의 단리 가능한 Pd(0) 착물 Pd(THM)4를 포스핀 리간드 트리스(하이드록시메틸)포스핀(THM)을 이용함으로써 제조하였다. 그의 절단 활성을 실시예 1에 기재한 바와 같은 알릴 팔라듐(II) 클로라이드 이량체 (Pd(C3H5)Cl)2와 THP의 인시추로 생성된 Pd(0) 착물에 비교하였다.
제조: Pd(THM)4를 제조하고 나서, 문헌[Ellis, et al., Inorg. Chem., 1992, 31, 14]에 기재된 프로토콜을 이용하여 단리시켰다. 수용액을 10mM 농도에서 제형화하고 나서, 그의 성능을 (Pd(C3H5)Cl)2(10mM)와 THP(100mM)를 이용하여 인시추로 생성된 Pd(0)에 대해 평가하였다.
Pd(0)-유도된 선형화를 입증하기 위해, P15/P7 표면 프라이머(이중 지수 순환(indexing cycle)으로 2×151)와 접합된 S4 유동 셀을 이용하는 NovaSeq(상표명) 기기 상에서 서열분석을 수행하였다. 나노(레인 1 및 3) 및 무 PCR(레인 2 및 4) 라이브러리(450 bp 삽입물)를 이용하여 Xp 작업 흐름을 사용하였다. 판독 1 SBS 화학 전에, (Pd(C3H5)Cl)2 (10mM), THP(100mM) 및 아스코브산나트륨(10mM)으로 구성된 Pd 혼합물[레인 1 내지 2에서]; 또는 Pd(THM)4(10mM)의 수용액[레인 3 내지 4에서] 중 하나를 이용하여 선형화를 수행하였다. FpG 효소를 함유하는 시약을 이용하여 판독 2 선형화를 수행하였다. 서열분석 기질은 일반적으로 Pd 선형화 방법 둘 다와 유사하다는 것을 관찰하였다. Pd(THM)4에 의한 높은 판독 1 강도 및 재합성 백분율은 성공적인 선형화가 달성되었다는 것을 나타내었다(도 6a). 인간 및 PhiX 오류율은 방법 둘 다와 비슷하였다(도 6b). 서열분석 결과를 이하의 표에 요약한다(표 2).
| 기질 |
(PdCl(C
3
H
5
))
2
/THP
/아스코브산나트륨 |
Pd(THM) 4 | ||||
| 평균 | ± | 표준 편차 | 평균 | ± | 표준 편차 | |
| 클러스터 PF(%) | 74.6925 | ± | 8.13 | 74.23 | ± | 8.90 |
| R1 오류율(%) | 0.4725 | ± | 0.12 | 0.52 | ± | 0.11 |
| R2 오류율(%) | 0.43 | ± | 0.08 | 0.475 | ± | 0.08 |
| R1 강도 주기 1 | 1249.25 | ± | 179.06 | 1404.5 | ± | 119.50 |
| R2 강도 주기 1 | 1328.25 | ± | 195.68 | 1496 | ± | 140.01 |
| R3 강도 주기 1 | 1194.75 | ± | 160.90 | 1339 | ± | 101.82 |
| R4 강도 주기 1 | 1123 | ± | 125.10 | 1208 | ± | 86.27 |
| 미스매치 판독 1 (%) | 0.4525 | ± | 0.08 | 0.475 | ± | 0.09 |
| 미스매치 판독 2 (%) | 0.5975 | ± | 0.10 | 0.615 | ± | 0.11 |
| 재합성(%) | 89.8939 | 86.009 | ||||
실시예 9
본 실시예에서, 활성 Pd(0) 착물의 제조를 위한 대안의 경로를 기재한다. Pd(THP)2-4를 제조하고 나서, 리간드 교환 반응에서 Pd(PPh3)4를 THP와 반응시킴으로써 단리시켰다. 그의 절단 활성을 실시예 1에 기재한 바와 같이 알릴 팔라듐(II) 클로라이드 이량체 (Pd(C3H5)Cl)2 및 THP로부터의 인시추로 생성된 Pd(0) 착물과 비교하였다.
제조 방법
질소 하에서, Pd(PPh3)4를 건조, 탈기된 다이클로로메탄 중에 용해시켜 황색 용액을 제공하였다. 수성 THP 용액(4.1당량)을 첨가하여 2상 혼합물을 얻었고, 이를 2.5시간 동안 교반시켰다. 황색은 유기층으로부터 수층으로 전달되었다. 유기층을 빨아들임으로써 반응을 워크업하고, 추가 DCM으로 수성상을 린스하였다. 수성상을 감압 하에 건조시키고, 테트라하이드로퓨란과 공동증발시키고 나서, 얻어진 오렌지색 오일을 고진공 하에 건조시켰다. 수율은 거의 정량적이었다. 생성물 LC-MS 분석은 Pd(THP)2의 존재를 나타내었다[Pd(THP)2+ H+; 예상치: 523 Da, 실측치: 523 Da].
P15 선형화를 위한 사용
Pd(THP)2-4를 수성 완충제에서 10㎎/㎖로 제형화하고 나서, 플레이트-기반 검정을 이용하여 그의 P15 절단 활성을 평가하였다. 이 검정은 P15/P17 표면 프라이머와 접합된 96-웰 플레이트를 이용한다. 개재 형광 염료를 사용하여 판독 1 선형화 전에 그리고 후에 존재하는 이중-가닥 DNA를 정량화하였고; 남아있는 이중-가닥 DNA의 양으로부터 절단 백분율을 계산할 수 있다. Pd(THP)2-4의 제형에 대해, P15 절단 활성은 (Pd(C3H5)Cl)2(6mM), THP(60mM) 및 아스코브산나트륨(6mM)으로부터 인시추로 제조한 Pd 혼합물과 비슷하였다(도 7). 두 방법은 비슷한 절단 성능을 가진다는 것이 관찰되었다.
실시예 10
본 실시예에서, 대안의 니켈계 화학적 절단 시약을 제조하고 나서, DNA 가닥을 함유하는 알릴 dT 뉴클레오타이드의 절단에서 시험하였다.
처음에, THP와 THM 포스핀 리간드를 둘 다 다양한 당량으로 사용하여 니켈 착물의 제조에서 NiCl2와 반응시켰다. Ni-THP(1:4 또는 1:10 비)는 실시예 1에 기재한 시약을 함유하는 팔라듐과 동일한 절단 생성물을 수득하였다. 흥미롭게도, 포스핀 리간드가 더 짧은 알킬쇄(따라서 더 작은 원추각)를 갖는 Ni-THM은 니켈과 착물을 형성할 때 동일한 절단 활성을 입증하지 못 하였다.
표면 상에서 Ni-THP의 절단 활성을 시험하였고, Pd-THP의 절단 활성과 비교하였다. P15/P7 프라이머 및 추적자 올리고와 접합된 HiSeq(상표명) 유동 셀에서 실험을 수행하였다. 추적자 올리고는 서열 및 3' 형광 표지에서 4개의 알릴dT를 가진다. Ni-THP 또는 Pd-THP 착물에 의한 알릴dT의 절단 시, 유동셀로부터의 형광 신호를 제거할 것이다. 유동 셀을 1.1μM P15/P7 및 추가적인 5% 내지 40% 추적자 올리고와 접합시키고, 이어서, 타이푼 상에서 스캐닝하여 접합의 성공을 확인하였다. 60℃에서 10분 동안 화학적 선형화를 수행하였다. 레인 1 내지 4를 대조군으로서 Pd-THP 착물((Pd(C3H5)Cl)2(10mM), THP(100mM) 및 아스코브산나트륨(10mM)으로부터 인시추로 생성)로 처리하고, 레인 5 내지 8을 10mM Ni-THP(1:10) 착물로 처리하였다. 이어서, 타이푼 상에서 형광 강도를 얻어서, 화학적 선형화 정도를 평가하였다. 레인 레이아웃: 5% 추적자= 55nM(레인 1, 5); 10% 추적자 = 110nM(레인 2, 6); 20% 추적자= 220nM(레인 3, 7); 40% 추적자= 440nM (레인 4, 8). 도 8은 절단 전에 그리고 후에 정규화된 중위 형광 강도를 나타내고, Ni-THP는 Pd-THP와 비슷한 효율적인 절단 활성을 입증하였다.
실시예 11
본 실시예에서, 수성 다이티온산나트륨(Na2S2O4) 용액에 의한 화학적 선형화를 위한 생물직교성 절단 가능한 링커로서 대안의 아조-아렌 기반 링커를 기재한다.
반응 5 및 6은 각각 아조-포스포르아미다이트 1 및 2의 제조를 도시한다.
화합물 5. N2 하에, DMF(20㎖) 중의 메틸 2-아미노-5-아이오도벤조에이트 (4)(2.77g, 10m㏖), Pd(PPh3)4(1.159㎎, 1m㏖), CuI(381㎎, 2m㏖), Et3N(4.2㎖, 30m㏖)과 프로파길 알코올(1.75㎖, 30m㏖)의 현탁액을 실온에서 15시간 동안 교반시켰다. TLC 분석(석유 에터:에틸 아세테이트 1:1)은 출발 물질의 완전한 소모를 나타내었다. 200㎖의 포화 NaCl 용액으로 반응을 중지시켰다. 에틸 아세테이트:석유 에터 1:1(200㎖)을 혼합물에 첨가하고 나서, 수층을 에틸 아세테이트:석유 에터 1:1로 3회 추출하였다. 합한 유기물을 MgSO4로 건조시킨 후에, 용액을 농축시키고 나서, 실리카겔 크로마토그래피(석유 에터:에틸 아세테이트 80:20 대 에틸 아세테이트)에 의해 정제하여, 화합물 5를 황색 오일(1.88g, 92%)로서 제공하였다. 1H NMR (CDCl3) d 3.78 (s, 3H), 4.25 (s, 2H, *CCH2), 7.27-7.36 (m, 2H, 방향족 H), 7.58-7.65 (m, 1H, 방향족 H).
화합물 6. N2 하에, 건조 DMF(25㎖) 중의 화합물 5(1.88㎎, 9.2m㏖)와 이미다졸(1.83g, 27.6m㏖)의 용액에 t-뷰틸다이페닐실릴클로라이드(1.06g, 12m㏖)를 첨가하였다. 반응은 TLC에 따랐고, 1시간 동안 실온에서 교반시킨 후에 완료되었다. 포화 NaHCO3 용액으로 반응을 퀀칭시키고 나서, 에틸 아세테이트:석유 에터 1:1(2×)로 추출하였다. 합한 유기물을 MgSO4로 건조시킨 후에, 용매를 진공 하에 제거하였다. 이어서, 조질의 혼합물을 EtOH 중에 용해시키고 나서, EtSiH 및 Pd-C(10%)로 처리하였다. 반응 혼합물을 N2 하에 16시간 동안 환류시켰다. TLC 분석(석유 에터:에틸 아세테이트 8:2)은 출발 물질의 완전한 소모를 나타내었다. 반응 혼합물을 여과시키고, 농축 후, 실리카겔 크로마토그래피(석유 에터 대 석유 에터:에틸 아세테이트 1:1)에 의해 정제하여, 황색 오일로서 화합물 6(3.37g, 82%)을 제공하였다. 1H NMR (CDCl3) d 1.04 (s, 9H, 3xCH3), 1.70-1.77 (m, 2H, CH2), 2.56 (t, 2H, CH2), 3.58 (t, 2H, OCH2), 3.60 (s, 3H, OCH3), 6.62-6.65 (m, 1H, 방향족 H), 7.03-7.06 (m, 1 H, 방향족), 7.27-7.63 (m, 11H, 방향족 H).
화합물 8. DMF(40㎖) 중의 레조르시놀(2.2g, 20m㏖) 및 K2CO3(2.76g, 20m㏖)의 현탁액에 tert-뷰틸 4-브로모부타노에이트(2.2g, 10m㏖)를 N2 하에 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 15시간 동안 교반시켰다. TLC 분석(석유 에터:에틸 아세테이트 7:3)은 출발 물질 레조르시놀의 90% 소모를 나타내었다. 300㎖ 포화 NaCl 용액으로 반응을 중지시켰다. 에틸 아세테이트:석유 에터 1:1(300㎖)을 반응 혼합물에 첨가하고 나서, 수층을 에틸 아세테이트:석유 에터 1:1로 3회 추출하였다. 합한 유기물을 MgSO4로 건조시킨 후에, 용액을 농축시키고 나서, 실리카겔 크로마토그래피(석유 에터 대 석유 에터:에틸 아세테이트 50:50)에 의해 정제하여, 황색 오일로서 화합물 8(2.2g, 88%)을 제공하였다. 1H NMR (CDCl3) d 1.27 (s, 9H), 1.91-1.98 (m, 2H, CH2), 2.22 (t, 2H, CH2), 3.27 (t, 2H, OCH2), 6.36-6.46 (m, 3 방향족 H), 7.09 (t, 1 방향족 H)
화합물 9. 화합물 5(450㎎, 1m㏖)를 아세톤/물(1:1)(2.5㎖)의 용액 중에 용해시켰다. 혼합물을 0℃로 냉각시키고 나서, 진한 HCl(0.5㎖)을 첨가하였다. 5분 후에, 물(1㎖)에 아질산나트륨(93㎎, 1.2m㏖)을 적가하고 나서, 혼합물을 1시간 동안 0℃에서 교반시켰다. 동시에, 아세톤/물(1:1)(3㎖) 용액에서 화합물 8(252㎎, 1m㏖), Na2CO3(210㎎, 2m㏖) 및 NaOH(160㎎, 4m㏖)를 가용화시켰다. 제1 용액을 0℃에서 두 번째로 적가하였다. 첨가를 완료한 후에, 혼합물을 실온으로 가온시키고 추가 1시간 동안 교반시켰다. 반응 혼합물을 1M HCl로 중화시키고, 이어서, DCM(3×50㎖)으로 추출하였다. 유기상을 MgSO4로 건조시키고 나서, 농축 후, 실리카겔 크로마토그래피(석유 에터 대 석유 에터:에틸 아세테이트 1:1)에 의해 정제하였다. 화합물 9를 오렌지색/적색 오일(400㎎, 56%)로서 얻었다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 1.02 (s, 9H, 3xCH3), 1.27 (s, 9H), d 1.69-1.76 (m, CH2), 1.91-1.97 (m, 2H, CH2), 2.20 (t, 2H, CH2), 2.53 (t, 2H, CH2), 3.34 (t, 2H, OCH2), 3.54 (t, 2H, OCH2), 3.62 (s, 3H, OCH3), 6.36-6.46 (m, 4 방향족 H), 7.00-7.06 (m, 1 H, 방향족 H), 7.09 (t, 1 방향족 H), 7.27-7.63 (m, 11H, 방향족 H).
화합물 11. 화합물 9(3.55g, 5m㏖)를 DCM(50㎖) 중에 용해시켰다. 용액을 TFA(10㎖)로 실온에서 처리하고 나서, 밤새 교반시켰다. 이어서, TFA를 감압 하에 제거하고 나서, 톨루엔과 공동증발시켰다. 잔사를 NaCl과 DCM 간에 분배시켰다. 수층을 DCM으로 3회 추출하였다. 합한 유기층을 MgSO4로 건조시키고 나서, 농축시켰다. 조질의 생성물을 THF(15㎖) 중에 용해시키고 나서, TBAF(1M, 5㎖)로 처리하였다. 반응을 TLC(DCM/MeOH 90:10)에 의해 모니터링하였다. 용매를 감압 하에 제거하고 나서, 잔사를 NaCl과 DCM(+10% MeOH) 간에 분배시켰다. 수층을 DCM(+10% MeOH)으로 3회 추출하였다. 합한 유기층을 MgSO4로 건조시키고 나서, 농축시켰다. 잔사를 피리딘과 3× 공동증발시켰다. 잔사를 Py/CH3CN(10/10㎖) 및 휴니그 염기(3.7㎖, 15m㏖)에 용해시키고 나서, DMT-Cl(5.07g, 15m㏖)을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반시켰다. TCL(DCM: MeOH 95:5)은 반응의 완료를 나타내었다. 혼합물을 농축시키고 나서, DCM에 용해시키고, Na2CO3로 세척하였다. 합한 유기층을 MgSO4로 건조시키고 나서, 농축 후, 실리카겔 크로마토그래피(석유 에터:에틸 아세테이트 8:2 대 에틸 아세테이트 + 1% NEt3)로 정제하였다. 화합물 11을 오렌지색/적색 오일(2.37g, 66%)로서 얻었다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 1.70-1.79 (m, 2H, CH2), 1.90-1.97 (m, 2H, CH2), 2.24 (t, 2H, CH2), 2.54 (t, 2H, CH2), 3.26 (t, 2H, OCH2), 3.58 (t, 2H, OCH2), 3.63 (s, 3H, OCH3), 3.71 (s, 6H, OMe), 6.79-6.89 (m, 4H, 방향족), 7.03-7.06 (m, 1 H, 방향족 H), 7.10 (t, 1 방향족 H), 7.13-7.63 (m, 13H, 방향족 H).
화합물 12. 화합물 11(1.05g, 1.46m㏖) 및 DMAP(18㎎, 0.15m㏖)를 N2 하에서 7㎖의 무수 피리딘에 용해시켰다. 이어서, 반응 혼합물을 0℃로 냉각시키고, 염화벤조일(0.5㎖, 4.4m㏖)를 적가하였다. 반응 혼합물을 서서히 실온으로 가온시키고, 용액이 혼탁하게 바뀌는 시간 동안인 1시간 동안 교반시켰다. TLC 분석은 출발 물질의 완전한 소모를 나타내었다. 포화 NaHCO3 용액으로 반응을 중지시켰다. 수층을 DCM로 3회 추출하였다. 합한 유기층을 MgSO4로 건조시키고 나서, 농축 후, 실리카겔 크로마토그래피(석유 에터:에틸 아세테이트 8:2 대 에틸 아세테이트 + 1% NEt3)에 의해 정제하여 황색 고체로서 화합물 12(930㎎, 78%)를 제공하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 1.69-1.76 (m, 2H, CH2), 1.91-1.97 (m, 2H, CH2), 2.20 (t, 2H, CH2), 2.53 (t, 2H, CH2), 3.24 (t, 2H, OCH2), 3.54 (t, 2H, OCH2), 3.62 (s, 3H, OCH3), 3.71 (s, 6H, OMe), 6.79-6.86 (m, 4H, 방향족), 7.01 (t, 1 방향족 H), 7.04-7.11 (m, 3 H, 방향족 H), 7.13-7.63 (m, 13H, 방향족 H), 7.94-8.36 (m, 3H, 방향족 H).
화합물 13. 화합물 12(340㎎, 0.5m㏖)를 3㎖의 무수 DMF에 N2 하에 용해시키고 나서, 휴니그 염기(0.26㎖, 1.5m㏖)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 TSTU(196㎎, 0.65m㏖)로 처리하고 나서, 실온에서 유지시켰다. 30분 후에, TLC 분석(EtOAc)은 반응이 완료되었음을 나타내었다. 이어서, 3-아미노프로판올(38㎕, 0.5 ㏖)을 반응 혼합물에 첨가하고 나서, 실온에서 4시간 동안 교반시켰다. TLC 분석은 출발 물질의 완전한 소모를 나타내었다. 포화 NaHCO3 용액으로 반응을 쿠너칭시켰다. 수층을 DCM으로 3회 추출하였다. 합한 유기층을 MgSO4로 건조시키고 나서, 농축 후, 자일렌(3×)과 공동증발시키고 나서, 실리카겔 크로마토그래피(석유 에터:에틸 아세테이트 8:2 대 에틸 아세테이트 + 1% NEt3)에 의해 정제하여 화합물 13을 오렌지색 오일(320㎎, 73%)로서 제공하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 1.67-1.79 (m, 4H, CH2), 1.91-1.97 (m, 2H, CH2), 2.20 (t, 2H, CH2), 2.53 (t, 2H, CH2), 3.24 (t, 2H, OCH2), 3.45 (t, 2H, OCH2), 3.51 (t, 2H, NCH2), 3.54 (t, 2H, OCH2), 3.69 (s, 3H, OCH3), 3.71 (s, 6H, OMe), 6.79-6.86 (m, 4H, 방향족), 7.01 (t, 1 방향족 H), 7.04-7.11 (m, 3 H, 방향족 H), 7.13-7.69 (m, 13H, 방향족 H), 7.94-8.40 (m, 3H, 방향족 H).
화합물 1. 화합물 13(320㎎, 0.36m㏖) 고진공 레인 하에 건조시켰다. 무수 DCM(2㎖)을 N2 하에 첨가하고 나서, 분자체와 함께 10분 동안 실온에서 교반시켰다. 용액에, 휴니그 염기(0.19㎖, 1.1m㏖)를 첨가한 후에 2-사이아노에틸 N,N-다이아이소프로필클로로포스포르아미다이트(102㎎, 0.43m㏖)를 첨가하였다. 반응물을 실온에서 N2 하에 3시간 동안 교반시켰다. 반응은 TLC(PE/EtOAc, 8:2)에 따랐다. 반응을 진공 하에 시럽으로 농축시켰다. 잔사를 칼럼(석유 에터:에틸 아세테이트 8:2 대 에틸 아세테이트, PE/EtOAc + 1% NEt3)에 의해 정제하여 화합물 1을 오렌지색 오일(190㎎, 50%)로서 제공하였다. 생성물은 칼럼 상에서 부분적으로 분해되었다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 0.96 - 1.27 (m, 12H), 1.68-1.79 (m, 4H, CH2), 1.91-1.97 (m, 2H, CH2), 2.20 (t, 2H, CH2), 2.53 (t, 2H, CH2), 2.58 - 2.74 (m, 2H, CH2CN), 3.24 (t, 2H, OCH2), 2.93 (m, 2H, NCH), 3.44 (t, 2H, NCH2), 3.42-3.54 (m, 4H, OCH2), 3.69 (s, 3H, OCH3), 3.71 (s, 6H, OMe), 6.79-7.01 (m, 5H, 방향족), 7.04-7.11 (m, 3 H, 방향족 H), 7.13-7.69 (m, 13H, 방향족 H), 7.94-8.40 (m, 3H, 방향족 H).
화합물 15. N2 하에, 건조 DMF(25㎖) 중의 화합물 14 (3.6g, 20m㏖) 및 이미다졸(3.72g, 60m㏖) 용액에 t-뷰틸다이페닐실릴클로라이드(2.3g, 26m㏖)를 첨가하였다. 반응은 TLC에 따랐고, 1시간 동안 실온에서 교반시킨 후에 완료되었다. 반응을 포화 NaHCO3 용액으로 퀀칭시키고 나서, 에틸 아세테이트:석유 에터 1:1(2×)로 추출하였다. 합한 유기층을 MgSO4로 건조시킨 후에, 반응 혼합물을 여과시키고, 농축 후에, 실리카겔 크로마토그래피(석유 에터 대 석유 에터:에틸 아세테이트 1:1)에 의해 정제하여, 어두운 황색 오일로서 화합물 15(7.19g, 86%)를 제공하였다. 1H NMR (DMSO-d6) d 0.99 (s, 9H, 3xCH3), 3.38-3.46 (m, 2H, NCH2), 3.92 (t, 2H, OCH2), 5.59 (s, 2H, NH2), 6.50-6.54 (d, 2 H, 방향족 H), 7.37-7.66 (m, 13H, 방향족 H), 8.05 (d, 1H, NH).
화합물 16. N2 하에, 건조 DCM(10㎖) 중의 화합물 15(840㎎, 2m㏖) 용액에 0℃에서 나이트로실 테트라플루오로보레이트(234㎎, 2m㏖)를 첨가하였다. 반응은 TLC에 따랐고, 1시간 동안 0℃에서 교반시킨 후에 출발 물질은 사라졌다. 이어서, 화합물 8(756㎎, 3m㏖)을 반응 혼합물에 첨가하였다. 반응 혼합물을 서서히 실온으로 가온시키고 4시간 동안 교반시켰다. 반응은 TLC에 따랐다. 완료 시, 포화 NaHCO3 용액으로 반응을 퀀칭시키고 나서, DCM(2×)으로 추출하였다. 합한 유기층을 MgSO4로 건조시킨 후에, 반응 혼합물을 여과시키고 나서, 농축 후, 실리카겔 크로마토그래피(석유 에터 대 석유 에터:에틸 아세테이트 1:1)에 의해 정제하여, 오렌지색 오일로서 화합물 16(1.12g, 82%)을 제공하였다. 1H NMR (DMSO-d6) d 0.99 (s, 9H, 3xCH3), 1.27 (s, 9H, 3× CH3), 1.91-1.98 (m, 2H, CH2), 2.22 (t, 2H, CH2), 3.27 (t, 2H, OCH2), 3.38-3.46 (m, 2H, NCH2), 3.92 (t, 2H, OCH2), 6.36-6.46 (m, 3 방향족 H), 6.50-6.56 (d, 2 H, 방향족 H), 7.10 (t, 1 방향족 H), 7.37-7.66 (m, 13H, 방향족 H), 8.06 (d, 1H, NH).
화합물 17. 화합물 16(1.1g, 1.64m㏖) 및 DMAP(20㎎, 0.16m㏖)를 N2 하에 8㎖의 무수 피리딘에 용해시켰다. 이어서, 반응 혼합물을 0℃로 냉각시키고, 염화벤조일(0.17㎖, 1.5m㏖)을 적가하였다. 반응 혼합물을 서서히 실온으로 가온시키고 나서, 용액이 혼탁하게 되는 시간 동안인 1시간 동안 교반시켰다. TLC 분석은 출발 물질의 완전한 소모를 나타내었다. 반응을 포화 NaHCO3 용액으로 중지시켰다. 수층을 DCM 3x로 추출하였다. 합한 유기층을 H2SO4로 세척하고 나서, MgSO4로 건조시키고, 농축시켰다. 얻어진 조질의 혼합물을 DCM(14㎖) 중에 용해시켰다. 용액을 실온에서 TFA(1.4㎖)로 처리하였고, 밤새 교반시켰다. 반응을 TLC(석유 에터:에틸 아세테이트 1:1)에 의해 모니터링하였다. TFA를 감압 하에 제거하였고, 톨루엔과 공동증발시켰다. 잔사를 NaCl과 DCM 간에 분배시켰다. 수층을 DCM으로 3회 추출하였다. 합한 유기층을 MgSO4로 건조시키고 나서, 농축시켰다. 조질의 생성물을 THF(8㎖) 중에 용해시키고 나서, TBAF(1M, 1.6㎖)로 처리하였다. 반응은 TLC(DCM/MeOH 9:11)에 의해 모니터링하였다. 용매를 감압 하에 제거하고 나서, 잔사를 NaCl과 DCM(+10% MeOH) 간에 분배시켰다. 수층을 DCM(+10% MeOH)으로 3회 추출하였다. 합한 유기층을 MgSO4로 건조시키고 나서, 농축 후 실리카겔 크로마토그래피(DCM 대 DCM:MeOH 9:1)에 의해 정제하였다. 화합물 17을 오렌지색/적색 오일(515g, 64%)로서 얻었다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 1.56-1.64 (m, 2H, CH2), 2.01 (t, 2H, CH2), 3.24 (t, 2H, NCH2), 3.52 (t, 2H, OCH2), 4.25 (t, 2H, OCH2), 6.79-6.89 (m, 1H, 방향족 H), 7.03-7.06 (m, 1 H, 방향족 H), 7.13-7.63 (m, 10H, 방향족 H), 8.56 (t, 1H, NH).
화합물 18. 화합물 17(500㎎, 1m㏖)을 py/CH3CN(5/5㎖) 및 휴니그 염기(0.87㎖, 5m㏖)에 용해시키고 나서, DMT-Cl(1g, 3m㏖)을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반시켰다. TCL(DCM:MeOH 95:5)은 반응의 완료를 나타내었다. 혼합물을 농축시키고 나서, DCM 중에 용해시키고, Na2CO3으로 세척하였다. 합한 유기층을 MgSO4로 건조시키고 나서, 농축 후 실리카겔 크로마토그래피(석유 에터:에틸 아세테이트 8:2 대 에틸 아세테이트 + 1% NEt3)에 의해 정제하였다. 화합물 18을 오렌지색/적색 오일(653㎎, 83%)로서 얻었다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 1.16-1.24 (m, 2H, CH2), 2.01 (t, 2H, CH2), 3.24 (t, 2H, NCH2), 3.52 (t, 2H, OCH2), 3.69 (s, 6H, OMe), 4.25 (t, 2H, OCH2), 6.76-6.89 (m, 4H, 방향족 H), 7.03-8.23 (m, 21H, 방향족 H), 8.86 (t, 1H, NH).
화합물 19. 화합물 18(350㎎, 0.5m㏖)을 3㎖의 무수 DMF에서 N2 하에 용해시키고 나서, 휴니그 염기(0.26㎖, 1.5m㏖)을 첨가하였다. 이어서, 반응 혼합물을 TSTU(196㎎, 0.65m㏖)로 처리하고, 실온에서 유지시켰다. 30분 후에, TLC 분석(석유 에터: EtOAc 2:8)은 반응이 완료되었음을 나타내었다. 이어서, 3-아미노프로판올(38㎕, 0.5㏖)을 반응 혼합물에 첨가하고 나서, 실온에서 4시간 동안 교반시켰다. TLC 분석은 출발 물질의 완전한 소모를 나타내었다. 반응을 포화 NaHCO3 용액으로 중지시켰다. 수층을 DCM(3×)로 추출하였다. 합한 유기층을 MgSO4로 건조시키고 나서, 농축 후, 자일렌(3×)과 공동 증발시키고, 실리카겔 크로마토그래피(석유 에터:에틸 아세테이트 8:2 대 에틸 아세테이트 + 1% NEt3)에 의해 정제하여 오렌지색 오일로서 화합물 19(223㎎, 52%)를 제공하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 1.67-1.79 (m, 4H, CH2), 1.91-1.97 (m, 2H, CH2), 2.05 (t, 2H, CH2), 2.53 (t, 2H, CH2), 3.24 (t, 2H, OCH2), 3.45 (t, 2H, OCH2), 3.51 (t, 2H, NCH2), 3.57 (t, 2H, OCH2), 3.71 (s, 6H, OMe), 6.79-6.86 (m, 4H, 방향족), 7.01 (t, 1 방향족 H), 7.04-7.11 (m, 3 H, 방향족 H), 7.13-7.69 (m, 13H, 방향족 H), 7.74-8.40 (m, 4H, 방향족 H), 8.76 (t, 1H, NH).
화합물 2. 화합물 19(223㎎, 0.26m㏖)를 고진공 레인 하에 건조시켰다. 무수 DCM(1.5㎖)을 N2 하에 첨가하고 나서, 분자체와 함께 10분 동안 실온에서 교반시켰다. 용액에, 휴니그 염기(0.14㎖, 0.78m㏖)를 첨가한 후에 2-사이아노에틸 N,N-다이아이소프로필클로로포스포르아미다이트(76㎕, 0.34m㏖)를 첨가하였다. 반응물을 실온에서 N2 하에 3시간 동안 교반시켰다. 반응은 TLC(PE/EtOAc, 2:8)에 따랐다. 반응을 진공 하에 시럽으로 농축시켰다. 잔사를 칼럼(석유 에터:에틸 아세테이트 8:2 대 에틸 아세테이트 + 1% NEt3)에 의해 정제하여 오렌지색 오일로서 화합물 2(152㎎, 56%)를 제공하였다. 생성물은 칼럼 상에서 부분적으로 분해되었다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 0.96 - 1.27 (m, 12H), 1.68-1.79 (m, 4H, CH2), 1.91-1.97 (m, 2H, CH2), 2.19-2.22 (m, 2H, CH2), 2.51-2.54 (m, 2H, CH2), 2.58 - 2.74 (m, 2H, CH2CN), 3.22-3.26 (m, 2H, OCH2), 2.93 (m, 2H, NCH), 3.44 (t, 2H, NCH2), 3.42-3.54 (m, 4H, OCH2), 3.71 (s, 6H, OMe), 6.79-7.01 (m, 5H, 방향족), 7.04-7.11 (m, 3 H, 방향족 H), 7.13-7.69 (m, 13H, 방향족 H), 7.94-8.40 (m, 3H, 방향족 H), 8.76 (t, 1H, NH).
이어서, 두 아조-포스포르아미다이트 화합물 1 및 2를 각각 혼입하는 두 짧은 올리고(올리고 아조-1 및 올리고 아조-2)를 합성하여 절단 효율을 평가하였다. 올리고 아조-1는 450㎚에서의 흡수되며, 오렌지색이었다. 절단 후에, 아조 결합은 파괴되고, 오렌지색의 상실을 초래한다. 실온에서 0.1M Na2S2O4 용액을 첨가한 후에 실온에서, 올리고 용액의 오렌지색은 즉시 사라졌는데, 이는 아조 결합의 매우 효율적인 절단을 나타낸다. 올리고 아조-1 및 절단 산물의 HPLC 분석은 또한 동일한 결과를 확인하였다. 올리고 아조-2 절단 검사의 HPLC 분석은 실온에서 0.1M Na2S2O4 용액에 의해 처리된 아조 결합의 분명하고 즉각적인 파괴를 나타내었다.
더 나아가, 올리고 아조-1의 SBS 서열분석 시약과의 적합성을 또한 시험하였다. 처음에, 10μM의 올리고 아조-1(10㎕)을 60℃에서 60분 동안 90㎕의 혼입 혼합물(IMX), 절단 혼합물(CMS) 및 스캔 혼합물(USM)에서 인큐베이션시켰다. HPLC 분석은 올리고 아조-1이 IMX에서 완전히 안정하며, 90% 올리고 아조-1이 CMS에서 분해되었고, 50% 올리고 아조-1이 USM에 남아있다는 것을 나타내었다. 올리고 아조-2에 대해 작은 개선이 관찰되었다. 올리고를 둘 다 CMS 용액(10㎕)에서 60분 동안 60℃에서 인큐베이션시켰을 때의 올리고 아조-1에 대한 66% 분해에 비해 올리고 아조-2에 대한 분해는 44%로 감소되었다.
SEQUENCE LISTING
<110> Illumina, Inc.; Illumina Cambridge Limited
<120> COMPOSITIONS AND METHODS FOR CHEMICAL CLEAVAGE AND DEPROTECTION
OF SURFACE-BOUND OLIGONUCLEOTIDES
<130> WO/2019/222264
<140> PCT/US2019/032287
<141> 2019-05-14
<150> US 62/788,045
<151> 2019-01-03
<150> US 62/671,816
<151> 2018-05-15
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic; P5: paired end
<220>
<221> misc_feature
<222> (23)..(23)
<223> n = u
<400> 1
aatgatacgg cgaccaccga ganctacac 29
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic; P7: paired end
<220>
<221> misc_feature
<222> (22)..(22)
<223> n = 8-oxo-guanine
<400> 2
caagcagaag acggcatacg anat 24
<210> 3
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic; P5 primer with poly-T spacer
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 5'-alkyne
<220>
<221> misc_feature
<222> (33)..(33)
<223> n = u
<400> 3
tttttttttt aatgatacgg cgaccaccga ganctacac 39
<210> 4
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic; P7 primer with poly-T spacer
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 5'-alkyne
<220>
<221> misc_feature
<222> (32)..(32)
<223> n = 8-oxo-guanine
<400> 4
tttttttttt caagcagaag acggcatacg anat 34
<210> 5
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic; P15 primer
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 5'-alkyne
<220>
<221> misc_feature
<222> (29)..(29)
<223> n = allyl t nucleoside
<400> 5
ttttttaatg atacggcgac caccgaganc tacac 35
<210> 6
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic; P17 primer
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 5'-alkyne
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> diol linker
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> diol linker
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> diol linker
<400> 6
ttttttnnnc aagcagaaga cggcatacga gat 33
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic; P5: single read
<400> 7
aatgatacgg cgaccaccga 20
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic; P7: single read
<400> 8
caagcagaag acggcatacg a 21
Claims (29)
- 다음을 포함하는 복수의 고정된 이중 가닥 폴리뉴클레오타이드를 선형화하는 방법:
각각의 이중 가닥 폴리뉴클레오타이드가 제1 가닥 및 제2 가닥을 포함하는 이중 가닥 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 고체 지지체를 제공하는 단계로서, 여기서 제1 가닥과 두 번째 가닥은 이들의 5' 말단에서 고체 지지체에 고정되고, 각각의 제1 가닥은 팔라듐 착물 또는 니켈 착물인 전이금속 착물에 의해 화학적 절단을 겪을 수 있는 제1 절단 부위를 포함하는, 상기 단계;
상기 이중 가닥 폴리뉴클레오타이드를 상기 전이금속 착물의 수용액과 접촉시킴으로써, 상기 제1 절단 부위에서 하나 이상의 제1 가닥을 절단하고, 하나 이상의 절단된 제1 핵산 및 절단되고 고정된 제1 가닥을 생성하는 단계; 및
상기 고체 지지체로부터 상기 절단된 제1 핵산을 제거하는 단계. - 제1항에 있어서, 각각의 제1 가닥이 상기 고체 지지체에 고정된 제1 연장 프라이머로부터 연장되는, 방법.
- 제2항에 있어서, 상기 제1 연장 프라이머가 상기 제1 절단 부위를 포함하는, 방법.
- 제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 제1 연장 프라이머가 P5 서열 또는 변형된 P5 서열을 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 절단 부위가 전이 금속 착물에 의해 화학적 절단을 겪을 수 있는 변형된 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드 모이어티를 포함하는, 방법.
- 제5항에 있어서, 상기 변형된 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드 모이어티가 알릴기를 포함하는, 방법.
- 제5항 또는 제6항에 있어서, 상기 제1 절단 부위가 하기 화학식 (II')의 구조를 갖는 변형된 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드 모이어티를 포함하는, 방법:
여기서, 염기는 아데닌, 구아닌, 시토신, 티민 또는 우라실, 또는 이들의 유도체인, 방법. - 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형된 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드 모이어티는 티민 염기를 가지는, 방법.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전이금속 착물은 팔라듐(0) 착물인, 방법.
- 제9항에 있어서, 상기 팔라듐(0) 착물은 Pd(THP)2, Pd(THP)4, Pd(THM)4 또는 이들의 조합인, 방법.
- 제9항에 있어서, 상기 팔라듐(0) 착물은 현장에서(in situ) 생성되는, 방법.
- 제11항에 있어서, 상기 상기 팔라듐(0) 착물은 하나 이상의 팔라듐(II) 화합물을 THP(tris(hydroxypropyl)phosphine)과 혼합함으로써 생성되며, 상기 팔라듐(II) 화합물은 Na2PdCl4, (Pd알릴Cl)2, [Pd알릴(THP)]Cl 및 [Pd알릴(THP)2]Cl로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
- 제11항에 있어서, 상기 팔라듐(0) 착물은 Pd(PPh3)4와 트리스(하이드록시프로필)포스핀을 혼합함으로써 생성되는, 방법.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전이금속 착물은 니켈(0) 착물인, 방법.
- 제14항에 있어서, 상기 니켈(0) 착물은 니켈(II) 화합물로부터 현장에서(in situ) 생성되는, 방법.
- 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 절단되고 고정된 제1 가닥의 3' 말단은 보호기를 포함하는, 방법.
- 제16항에 있어서, 상기 보호기는 하기 화학식 (I)의 구조를 갖는 3' 말단 포스페이트 모이어티인, 방법:
여기서,
R1은 -NH2, -OH, -NHC(O)ORa 또는 -OCH2OSi(Rb)3이고;
Ra는 C1-4알킬, tert-부틸, 알릴, 벤질 또는 9-플루오렌일메틸이며,
각각의 Rb는 C1-4알킬 및 페닐로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고; 그리고 R2는 H, C1-4 알킬, 선택적으로 치환된 테트라하이드로퓨란 또는 뉴클레오타이드인, 방법. - 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 제2 가닥이 상기 고체 지지체에 고정된 제2 연장 프라이머로부터 연장되고, 각각의 제2 가닥은 제2 절단 부위를 포함하는, 방법.
- 제18항에 있어서, 상기 제2 연장 프라이머는 제2 절단 부위를 포함하는, 방법.
- 제18항 또는 제19항에 있어서, 상기 제2 절단 부위는 팔라듐 착물 또는 니켈에 의해 화학적 절단을 겪을 수 없는, 방법.
- 제18항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 연장 프라이머는 P7 뉴클레오타이드 서열 또는 변형된 P7 뉴클레오타이드 서열 또는 P17 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 방법.
- 제18항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 절단 부위는 화학적절단, 광 절단, 효소 절단 및 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택된 방법에 의해 절단되는, 방법.
- 제22항에 있어서, 상기 제2 절단 부위가 화학적 절단에 의해 절단되고, 상기 제2 절단 부위가 디올 링커 또는 아조벤젠 링커를 포함하는, 방법.
- 제23항에 있어서, 상기 디올 링커가 하기 화학식 (VIII)의 구조를 포함하는, 방법:
여기서, r은, 2, 3, 4, 5, 또는 6이고;
s는 2, 3, 4, 5, 또는 6임. - 제24항에 있어서, 상기 디올 링커가 과요오드염(periodate salt)에 의해 절단될 수 있는, 방법.
- 제23항에 있어서, 상기 아조벤젠 링커가 하기 화학식 (X)의 구조를 포함하는, 방법:
여기서, R1은 H, 하이드록실, 또는 보호된 하이드록실이고;
R2는 H, C1-6 알킬, 또는 C1-6 알콕시이며;
각각의 R3 및 R4는 독립적으로 H, 할로, -C(O)OR5 또는 -C(O)NHR6이고;
각각의 R5 및 R6은 독립적으로 H, C1-6 알킬, 또는 C6-10 아릴이며;
X는 -C(O)-, -CH2- 또는 -C(O)NH-이고;
각각의 m1, m2 및 m3은 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5 또는 6임. - 제26항에 있어서, 상기 아조벤젠 링커가 Na2S2O4에 의해 절단될 수 있는, 방법.
- 제22항에 있어서, 상기 제2 절단 부위가 효소적 절단에 의해 절단되는, 방법.
- 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이중 가닥 폴리뉴클레오타이드가 공유 결합을 통해 상기 고체 지지체에 고정되는, 방법.
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