JP2023067467A

JP2023067467A - ３’－エキソヌクレアーゼを用いた長鎖核酸の精製法

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Publication number: JP2023067467A
Application number: JP2021178735A
Authority: JP
Inventors: 章寛大窪; Akihiro Okubo; 優伊藤; Masaru Ito; 紗彩赤澤; Saaya Akazawa
Original assignee: Tokyo Institute of Technology NUC
Current assignee: Tokyo Institute of Technology NUC
Priority date: 2021-11-01
Filing date: 2021-11-01
Publication date: 2023-05-16

Abstract

【課題】本発明は、核酸の化学合成において生じる不純物を選択的に除去する方法を提供することを目的とする。【解決手段】本発明によれば、化学合成した核酸断片を、３’－エキソヌクレアーゼを用いて精製する方法であって、核酸合成過程において３’－エキソヌクレアーゼによる酵素分解に耐性である化学修飾基を該核酸断片の３’末端の核酸に導入又は誘導し、３’－エキソヌクレアーゼにより処理する工程を含む方法が提供される。【選択図】なし

Description

本発明は、核酸合成の分野に関し、より具体的には、ＤＮＡ断片の化学合成において、合成過程で出現する不純物のみを酵素により選択的に分解及び除去（精製）し、高純度のＤＮＡを合成する方法を提供する。

ＰＣＲ、アンチセンス技術、核酸構造解析、及びＲＮＡｉ研究を含む広範な用途にオリゴヌクレオチド（＜１０^２ｍｅｒ）が広く用いられている。オリゴヌクレオチドの化学合成技術は、最初にＫｈｏｒａｎａらのリン酸ジエステル法（非特許文献１）が開発され、その後、リン酸トリエステル法（非特許文献２、３）、ホスファイト法（非特許文献４）、ホスファイト法の改良法でありホスホロアミダイト化したより安定なヌクレオシド誘導体を用いるＣａｒｕｔｈｅｒｓらのホスホロアミダイト法（非特許文献５、６）、さらにＨ－ホスホネート法（非特許文献７）等が開発された。ホスホロアミダイト法の改良法としてＫｏｓｔｅｒらによって開発されたβ－シアノエチルホスホロアミダイト法（非特許文献６）は、ＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成装置において広く利用されている。

これらのオリゴヌクレオチド合成技術に関しては、それぞれの反応に適した試薬や反応条件の検討、改良が詳細になされてきており、例えば１回のオリゴヌクレオチド鎖伸長反応（縮合反応）の収率として、β－シアノエチルホスホロアミダイト法等を含むホスファイト法ではおよそ９８～９９％を達成している。

これらのオリゴヌクレオチド合成法は、化学反応としては、ほぼ完成された方法とみなされているが、１回の縮合反応の収率が９９％であっても微量な副反応によって変異が導入されたり、又は所望の鎖長に満たないオリゴヌクレオチドが生じることが多い。特に５０ｍｅｒを超えるような長鎖オリゴヌクレオチドの合成を行う場合、これらの変異有するオリゴヌクレオチドや短鎖オリゴヌクレオチドをＨＰＬＣ等で除去することは容易ではないという問題がある。

Ｐ．Ｔ．Ｇｉｌｈａｍ，Ｈ．Ｇ．Ｋｈｏｒａｎａ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８０，６２１２（１９５８）Ｒ．Ｌ．Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ，Ｋ．Ｋ．Ｏｇｉｌｖｉｅ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８９，４８０１（１９６７）Ｈ．Ｉｔｏｅｔａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，１０，１７５５（１９８２）Ｒ．Ｌ．Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ，Ｗ．Ｂ．Ｌｕｎｄｓｆｏｒｄ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，９８，３６５５（１９７６）Ｍ．Ｄ．Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ，Ｍ．Ｈ．Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１０３，３１８５（１９８１）Ｎ．Ｄ．Ｓｉｎｈａ，Ｊ．ＢｉｅｒｎａｔａｎｄＨ．Ｋｏｓｔｅｒ，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，１２，４５３９（１９８４）Ｂ．Ｃ．Ｆｒｏｅｈｌｅｒｅｔａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，１４，５３９９（１９８６）

本発明は、目的とする鎖長を有する合成核酸の収率を向上させるために、化学合成において生じる短鎖の合成核酸（不純物）を除去することを課題とする。

本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、核酸断片（オリゴヌクレオチド、オリゴＤＮＡ、オリゴＤＮＡプール）の合成において、固相担体上で５’から３’方向に化学合成をする場合に、３’末端の核酸に３’－エキソヌクレアーゼに耐性な化学修飾を施すことにより、核酸合成過程において生じる不純物を除去できることを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は以下を包含する。
［１］化学合成した核酸断片を、３’－エキソヌクレアーゼを用いて精製する方法であって、核酸合成過程において３’－エキソヌクレアーゼによる酵素分解に耐性である化学修飾基を該核酸断片の３’末端の核酸に導入し、３’－エキソヌクレアーゼにより処理する工程を含む、上記方法。
［２］精製が、目的とする鎖長より短い核酸断片を３’－エキソヌクレアーゼにより選択的に分解及び除去するものである、［１］に記載の方法。
［３］３’－エキソヌクレアーゼによる酵素分解に耐性である、導入される化学修飾基が、ホスホロチオエート結合、ジメトキシトリチル基、リン酸基及びチオリン酸基からなる群から選択される、［１］又は［２］に記載の方法。
［４］ホスホロアミダイト法に基づく核酸の化学合成において、［１］～［３］のいずれかに定義される方法を用いることを含む、高純度の核酸配列を合成する方法。
［５］核酸配列の合成において不純物の発生率を１０分の１又はそれ以下に低減させることを特徴とする、［４］に記載の方法。
［６］（ａ）固相担体に結合させたヌクレオシドの３’水酸基を酸処理により除去する工程；
（ｂ）ヌクレオシド－Ｏ－ホスホロアミダイト誘導体を酸触媒で活性化し、縮合反応により、直接又はユニバーサルリンカーを介して、固相担体上のヌクレオシドの５’水酸基と三価リン酸結合により連結させる工程；
（ｃ）未反応の該５’又は３’水酸基をキャッピングする工程；
（ｄ）該三価リン酸結合を酸化する工程；
（ｅ）上記工程を反復する工程；
（ｆ）反復する工程の最終において、工程（ｃ）の後に３’末端の核酸に化学修飾基を導入又は誘導する工程；
（ｇ）化学合成された核酸を固相担体から遊離させる工程；及び
（ｈ）３’－エキソヌクレアーゼで処理する工程
を含む、［４］又は［５］に記載の方法。
［７］ヌクレオシド－Ｏ－ホスホロアミダイト誘導体が、下記式（Ｉ）：

〔式中、
Ｂは、核酸塩基又は保護基で保護された核酸塩基であり；
Ｒ_１は、水素原子、水酸基、又は保護基で保護された水酸基であり；
Ｒ_２は、水素原子又は水酸基の保護基であり；
Ｒ_３は、２－シアノエチル基、２－トリメチルシリルエチル基、ニトロフェニルエチル基、又は２－ニトロエチル基であり；
Ｒ_４は、－Ｎ（Ｒ_５）_２（式中、Ｒ_５は、独立して、Ｃ_１～６アルキル、または窒素、硫黄及び酸素からなる群から選択される３個までのヘテロ原子を有する４～７員環のへテロシクロアルキル若しくはヘテロシクロアルケニルである）、モルホリノ基、又はジアルキルアミノ基である〕
で表される、［６］に記載の方法。
［８］ＰＣＡ法に基づく核酸の化学合成において、［４］～［７］のいずれかに記載の方法によって得られた核酸配列を用いることを含む、高純度の二本鎖長鎖核酸を合成する方法。
［９］核酸がＤＮＡである、［１］～［８］のいずれかに記載の方法。

本発明によれば、３’－エキソヌクレアーゼを利用した核酸合成法を提供することにより、高純度に核酸配列又は長鎖核酸を精製することができる。

未修飾ＯＤＮ（ＯＤＮ１及び６）の分解評価を行った結果である。ＯＤＮ２及びＯＤＮ３の分解評価を行った結果である。ＯＤＮ４及びＯＤＮ５の分解評価を行った結果である。ＯＤＮ５及びＯＤＮ７の分解評価を行った結果である。ＰＣＡ法における３’－エキソヌクレアーゼによる精製の効果を示す。

本発明は、核酸合成過程において、３’－エキソヌクレアーゼに耐性な化学修飾基を、核酸配列の３’末端の核酸の３’位に導入することにより、３’－エキソヌクレアーゼによって、所望より短い核酸断片を分解及び除去することを特徴とし、ホスホロアミダイト法による核酸合成法、ＰＣＡ法による遺伝子合成等において、高純度の核酸断片（例えば、オリゴＤＮＡプール）を提供することができる。本発明において「核酸」、「核酸配列」及び「核酸断片」はともに、「ヌクレオチド」又は「ヌクレオチド配列」と同義に使用され、２塩基長（２ｍｅｒ又は２ｂｐ）以上のヌクレオチドを指し、オリゴヌクレオチド（＜１０^２ｂｐ）、遺伝子（１０^２～１０^３ｂｐ）、遺伝子クラスター（１０^３～１０^４ｂｐ）、ゲノム（＞１０^５ｂｐ）が含まれ得る。本発明では、核酸は、ＤＮＡ（オリゴデオキシリボヌクレオチド）及びＲＮＡ（オリゴリボヌクレオチド）であり得る。

本発明の精製法は、最終のカップリング（縮合）工程において、３’末端の核酸に３’－エキソヌクレアーゼに耐性な化学修飾基を導入又は誘導することにより、該核酸がカップリングされていない核酸断片と比較して、不純物を１０分の１又はそれ以下に低減させることができる。したがって、本発明の精製法を用いることにより、オリゴ核酸（例えば、＜１０^２ｍｅｒ程度のＤＮＡ）の合成に限らず、約１０^４ｂｐの遺伝子クラスターや１０^５ｂｐ以上のゲノム合成もより正確かつ高純度に生成させることができる。本発明によれば、長鎖核酸合成に用いるオリゴヌクレオチドのとりわけ好適な例としては、３０～２００ｍｅｒの核酸、好ましくは５０～１００ｍｅｒの核酸である。なお、本明細書で使用する場合、用語「不純物」とは、核酸合成において、所望の長さに満たない短い配列を有する核酸を指す。したがって、１塩基でも短い配列を有する核酸は、不純物に含まれる。

本発明によれば、概して、当該技術分野において当業者に公知である、例えば、ＰＣＡ法による遺伝子合成、ＧｉｂｓｏｎＡｓｓｅｍｂｌｙ法による遺伝子クラスター合成に適用することができる。本発明は、公知のＣａｒｕｔｈｅｒｓらのホスホロアミダイト法、その改良法であるＫｏｓｔｅｒらのβ－シアノエチルホスホロアミダイト法又はそれらの改良法の原理に基づく核酸の化学合成に適用することができる。これらの公知の方法は、縮合反応に用いるヌクレオシド－３’－Ｏ－ホスホロアミダイト誘導体を、酸触媒を用いてそのＮ－Ｎ－ジイソプロピルアミノ基に対しプロトンを供与して活性化し、それにより固相担体上に固定された核酸（ヌクレオシド又はポリヌクレオチド）の５’－末端のヌクレオシドの５’－水酸基（５’－末端水酸基）との間で縮合反応を起こさせ、それらを三価リン酸結合により結合させること、及びその三価リン酸結合を酸化して安定な五価リン酸結合にすることに基づくものである。

なお、本発明の精製法は、上記される不純物を３’－エキソヌクレアーゼにより分解及び除去するため、通常の固相担体上で行っている３’から５’方向に核酸を伸長する方法とは異なり、５’から３’方向に化学合成を行い、３’－エキソヌクレアーゼに耐性な化学修飾基が導入された核酸を３’末端に有さない、所望の長さ未満の核酸配列（核酸断片）は３’－エキソヌクレアーゼにより分解及び除去される。

１．定義
本発明で使用される用語は、特段記載がない限り、当業者が一般的に理解する技術用語及び科学用語の意味を有する。本明細書において、本発明で使用される用語のうち、特に重要な用語については、少なくとも下記に定義される意味を有するものとする。

本明細書で使用される場合、用語「核酸」とは、ヌクレオチドがホスホジエステル結合により連結された鎖状の化合物（オリゴヌクレオチド）を意味し、ＤＮＡ及びＲＮＡ等が含まれる。核酸は、１本鎖、２本鎖のいずれであってもよいが、核酸合成機による効率的な合成が可能であることから、好ましくは１本鎖である。一実施形態では、合成後に固相担体から遊離した核酸断片をまとめ、オリゴ核酸（例えば、ＤＮＡ）プールとして提供することができる。また、「核酸」には、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）等のプリン塩基及びチミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、ウラシル（Ｕ）等のピリミジン塩基を含有するオリゴヌクレオチドのみでなく、修飾されたその他の複素環型塩基を含有する修飾オリゴヌクレオチドも含まれる。

本発明で使用される場合、用語「３’－エキソヌクレアーゼ」は、ヌクレオチド間の結合、好ましくは、リン酸ジエステル結合を核酸配列（オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドなど）の末端から１つずつ切断する酵素であって、核酸配列の３’末端からの切断に特異的な活性を有する酵素を指す。また、３’－エキソヌクレアーゼは、その種類により、一本鎖の核酸配列のみを切断するタイプ、二本鎖の核酸配列のみを切断するタイプ、又は一本鎖及び二本鎖の核酸配列を切断するタイプに分けられる。本発明の方法では、いずれのタイプの３’－エキソヌクレアーゼを使用してもよい。

さらに、本発明の方法に使用される３’－エキソヌクレアーゼは、３’末端の核酸に導入された化学修飾基を明確に区別して、核酸を選択的に切断することができるか又は切断することができない。核酸に導入される「化学修飾基」の例としては、限定されないが、ホスホロチオエート結合、ジメトキシトリチル基（ＤＭＴｒ）、リン酸基、リン酸ベンジルエステル、チオリン酸基、ホスホロジチオエート結合、ホスホロアミデート結合、ボラノホスフェート結合などが挙げられる。このうち、３’－エキソヌクレアーゼが核酸配列を切断することができない（すなわち、３’－エキソヌクレアーゼに対して耐性のある）化学修飾基の例としては、限定されないが、ホスホロチオエート結合、ＤＭＴｒ、ホスホロジチオエート結合、及びホスホロアミデート結合が挙げられる。一方、３’－エキソヌクレアーゼが核酸配列を切断することができる（すなわち、３’－エキソヌクレアーゼに対して耐性のない）化学修飾基の例としては、限定されないが、リン酸基及びリン酸ベンジルエステルなどが挙げられる。

本発明で使用される「固相合成」とは、多孔質担体、ポリマービーズ、ゼラチン様樹脂、反応容器の側壁、底面その他の固相担体（後述）の表面上で核酸合成を行う反応を指す。本発明によれば、固相合成のための核酸合成手法としては、限定されないが、一般的に、ホスホロアミダイト法に基づく核酸の化学合成が採用され得る。ホスホロアミダイト法は、固相担体上で（１）脱保護→（２）縮合（カップリング）→（３）キャッピング→（４）酸化の４工程を連続的に行うものであるが、１塩基分の鎖伸長反応を完了する過程を１サイクルとし、それを目的の鎖長に達するまで繰り返し行うことにより、目的の核酸配列を得ることができる。

２．本発明による精製法
本発明は、核酸合成過程において、３’－エキソヌクレアーゼに耐性な化学修飾基を、核酸配列の３’末端の核酸の３’位に導入又は誘導することにより、３’－エキソヌクレアーゼによって、目的とする核酸配列よりも短い核酸断片を分解及び除去する方法に関する。本発明者らは、ある種の３’－エキソヌクレアーゼが、核酸配列の３’末端の核酸に導入又は誘導された化学修飾基の違いにより、核酸配列を切断し得る場合とそうでない場合があることを見出した。これを利用することにより、所望の鎖長を有する核酸配列の３’末端の核酸には３’－エキソヌクレアーゼに耐性である化学修飾を施すことによって、このような化学修飾が施されていない若しくは未修飾であるか又は耐性のない化学修飾が施されている短い核酸配列を不純物として除去することができる。

本発明によれば、固相合成において生じる不純物の分解及び除去は、合成した核酸断片が固相担体に結合した状態で行われるプロセスであってもよく、又は合成した核酸断片を固相担体から切り出した液相中で行われるプロセスであってもよい。一般的には、酵素とその基質との反応効率を低下させないため、液相中で行われることが好ましい。３’－エキソヌクレアーゼの添加量及び作用時間は、当業者であれば、使用する３’－エキソヌクレアーゼの種類及びその酵素活性を考慮して、適宜調整することができる。なお、固相担体から核酸断片を切り出す方法は、限定されないが、固相担体と第１の核酸における結合を切断（加水分解）する試薬、又は固相担体と第１の核酸との間にスペーサーが存在する場合は、そのスペーサーを切断（加水分解）する試薬を使用することでよい。このような試薬の例としては、アンモニア水（ＮＨ_４ＯＨ）、メチルアミン溶液などが挙げられる。

上記の通り、本発明の方法は、核酸合成において生じる不純物を３’－エキソヌクレアーゼにより分解及び除去することにより、高純度の所望の核酸配列を得ることができる。「高純度」とは、合成した全核酸断片の数のうち、不純物の発生率を１０分の１又はそれ以下に低減させることを指し、例えば、１０分の１、１１分の１、１２分の１、１３分の１、１４分の１、１５分の１、１６分の１、１７分の１、１８分の１、１９分の１、２０分の１、又はそれ以下（若しくはそれ未満）に低減させることができる。あるいは、上記発生率が、１０％又はそれ以下であることを指し、例えば、９％以下、８％以下、７％以下、６％以下、５％以下、４％以下、３％以下、２％以下、１％以下であり得る。

３．本発明による高純度の核酸配列を合成する方法
本発明の高純度の核酸配列を合成する方法は、本質的には、ホスホロアミダイト法に基づく核酸の化学合成に基づく。上述したように、ホスホロアミダイト法は、固相担体上で（１）脱保護→（２）縮合（ホスホロアミダイト誘導体のカップリング）→（３）キャッピング→（４）酸化の４工程を連続的に行い、これを１サイクルとして繰り返すことにより、目的の核酸配列を得る核酸合成法である。本発明の精製法では、最終サイクルの工程（２）の後、３’末端の核酸に化学修飾基を導入又は誘導することを特徴とする。

具体的な実施形態では、本発明の高純度の核酸配列を合成する方法は、以下：
（ａ）固相担体に結合させたヌクレオシドの３’水酸基を酸処理により除去する工程；
（ｂ）ヌクレオシド－Ｏ－ホスホロアミダイト誘導体を酸触媒で活性化し、縮合反応により、直接又はユニバーサルリンカーを介して、固相担体上のヌクレオシドの５’水酸基と三価リン酸結合により連結させる工程；
（ｃ）未反応の該５’又は３’水酸基をキャッピングする工程；
（ｄ）該三価リン酸結合を酸化する工程；
（ｅ）上記工程を反復する工程；
（ｆ）反復する工程の最終において、工程（ｃ）の後に３’末端の核酸に化学修飾基を導入又は誘導する工程；
（ｇ）化学合成された核酸を固相担体から遊離させる工程；及び
（ｈ）３’－エキソヌクレアーゼで処理する工程
を含む。

上記ヌクレオシド－Ｏ－ホスホロアミダイト誘導体としては、下記の一般式（Ｉ）：

で表されることが好ましい。上記式中、Ｂは、核酸塩基又は保護基で保護された核酸塩基であり；
Ｒ_１は、水素原子、水酸基、又は保護基で保護された水酸基であり；
Ｒ_２は、水素原子又は水酸基の保護基であり；
Ｒ_３は、２－シアノエチル基、２－トリメチルシリルエチル基、ニトロフェニルエチル基、又は２－ニトロエチル基であり；
Ｒ_４は、－Ｎ（Ｒ_５）_２（式中、Ｒ_５は、独立して、Ｃ_１～６アルキル、または窒素、硫黄及び酸素からなる群から選択される３個までのヘテロ原子を有する４～７員環のへテロシクロアルキル若しくはヘテロシクロアルケニルである）、モルホリノ基、又はジアルキルアミノ基であり得る。

本明細書で使用される場合、用語「アルキル基」とは、直鎖、分枝鎖又は環状の１価の脂肪族飽和炭化水素基を指し、好ましくは炭素原子数１～６のアルキル基、より好ましは炭疽原子数１～３のアルキル基である。「アルキル基」としては、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基等が挙げられる。用語「アラルキル基」とは、１又は２個以上のアリール基で置換されたアルキル基を指し、炭素原子数７～１５のアラルキル基が好ましく、炭素原子数７～１１のアラルキル基がより好ましい。「アラルキル基」としては、例えば、ベンジル基、フェネチル基、２－ナフチルメチル基等が挙げられる。「アルケニル基」とは、少なくとも１つの炭素－炭素二重結合を有する直鎖、分枝鎖又は環状の１価の不飽和炭化水素基を指し、炭素原子数２～６のアルケニル基が好ましく、炭素原子数２又は３のアルケニル基がより好ましい。「アルケニル基」としては、例えば、ビニル基、１－プロペニル基、２－プロペニル基、２－メチル－１－プロペニル基、１－ブテニル基、２－ブテニル基、３－ブテニル基、３－メチル－２－ブテニル基、１－ペンテニル基、２－ペンテニル基、３－ペンテニル基、４－ペンテニル基、４－メチル－３－ペンテニル基、１－ヘキセニル基、３－ヘキセニル基、５－ヘキセニル基、２－シクロヘキセニル基等が挙げられる。「アルキニル基」とは、少なくとも１つの炭素－炭素三重結合を有する直鎖、分枝鎖又は環状の１価の不飽和炭化水素基を指し、炭素原子数２～６のアルケニル基が好ましく、炭素原子数２又は３のアルケニル基がより好ましい。「アルキニル基」としては、例えば、エチニル基、１－プロピニル基、プロパルギル、２－ブチニル基、３－ブチニル基、１－メチル－２－プロピニル基、２－ペンチニル基、３－ペンチニル、５－へキシニル基、ヘプチニル基、オクチニル基、ノニニル基、デシニル基、ドデシニル基、およびウンデシニル基等が挙げられる。用語「ハロゲン」としては、例えば、フッ素原子、塩素原子、臭素原子等が挙げられる。用語「アリール基」とは、１価の芳香族炭化水素基を指し、炭素原子数６～１４のアリール基が好ましく、炭素原子数６～１０のアリール基がより好ましい。「アリール基」としては、例えば、フェニル基、１－ナフチル基、２－ナフチル基等が挙げられる。

Ｒ_１は、水素原子、水酸基、又は保護基で保護された水酸基であり得る。

Ｒ_２は、水素原子又は水酸基の保護基である。水酸基の保護基としては、典型的には、ジメトキシトリチル基（ＤＭＴｒ）を使用しているが、例えば、光制御により核酸をフロー合成する場合には、水酸基の保護基として、光分解性保護基を使用してもよい。「光分解性保護基」とは、カップリング反応において、ホスホロアミダイトの糖部分の３’位の水酸基を保護し、さらに、光照射により脱離する、すなわち、末端官能基を露出させる任意の基を指す。「光分解性保護基」としては、限定されないが、ニトロベンジル基、ニトロフェニルエチルエステル基（ＮＰＥ）、ジメトキシニトロベンジルエステル基（ＤＭＮＢ）、ブロモヒドロキシクマリン（Ｂｈｃ）基、ジメトキシベンゾイン基、２－ニトロピペロニルオキシカルボニル（ＮＰＯＣ）基、２－ニトロベラトリルオキシカルボニル（ＮＶＯＣ）基、５’－（α－メチル－２－ニトロピペロニル）オキシカルボニル（ＭｅＮＰＯＣ）基、２－（２－ニトロ－４－エチル－５－チオフェニルフェニル）プロピルオキシカルボニル（ＳＰｈＮＰＰＯＣＯ）基、α－メチル－２－ニトロベラトリルオキシカルボニル（ＭｅＮＶＯＣ）基、２，６－ジニトロベンジルオキシカルボニル（ＤＮＢＯＣ）基、α－メチル－２，６－ジニトロベンジルオキシカルボニル（ＭｅＤＮＢＯＣ）基、１－（２－ニトロフェニル）エチルオキシカルボニル（ＮＰＥＯＣ）基、１－メチル－１－（２－ニトロフェニル）エチルオキシカルボニル（ＭｅＮＰＥＯＣ）基、９－アントラセニルメチルオキシカルボニル（ＡＮＭＯＣ）基、１－ピレニルメチルオキシカルボニル（ＰＹＭＯＣ）基、３’－メトキシベンゾイニルオキシカルボニル（ＭＢＯＣ）基、３’，５’－ジメトキシベンゾイルオキシカルボニル（ＤＭＢＯＣ）基、７－ニトロインドリニルオキシカルボニル（ＮＩＯＣ）基、５，７－ジニトロインドリニルオキシカルボニル（ＤＮＩＯＣ）基、２－アントラキノニルメチルオキシカルボニル（ＡＱＭＯＣ）基、α，α－ジメチル－３，５－ジメトキシベンジルオキシカルボニル基、５－ブロモ－７－ニトロインドリニルオシキカルボニル（ＢＮＩＯＣ）基等を挙げることができる。

Ｒ_３は、リン酸基の保護基であり、例えば、２－シアノエチル基、２－トリメチルシリルエチル基、ニトロフェニルエチル基、又は２－ニトロエチル基であり得る。本発明では、保護基の脱離容易性の点から、酸性条件下では脱離しないが塩基性条件下で容易に脱離する保護基が好ましく、２－シアノエチル基がより好ましい。

Ｒ_４は、窒素原子上に炭素数１～６個の同一又は異なるアルキル基が２個結合したジアルキルアミノ基であり得る。典型的には、ジイソプロピルアミノ基、ジエチルアミノ基、エチルメチルアミノ基、又はモルホリノ基などのアミン類を含むアミン誘導体が挙げられる。

上記のいずれの置換基においてアミノ基を有する場合、反応においてアミノ基が保護されていることが好ましく、「アミノ基の保護基」の例としては、限定されないが、ＰＲＯＴＥＣＴＩＶＥＧＲＯＵＰＳＩＮＯＲＧＡＮＩＣＳＹＮＴＨＥＳＩＳ、第３版、ＪＯＨＮＷＩＬＬＹ＆ＳＯＮＳ出版（１９９９年）等に記載されている保護基であってもよい。「アミノ基の保護基」の具体例としては、例えば、ピバロイル基、ピバロイロキシメチル基、トリフルオロアセチル基、フェノキシアセチル基、４－イソプロピルフェノキシアセチル基、４－ｔｅｒｔ－ブチルフェノキシアセチル基、アセチル基、ベンゾイル基、イソブチリル基、ジメチルホルムアミジニル基、９－フルオレニルメチルオキシカルボニル基等を挙げることができる。これらの中でも、フェノキシアセチル基、４－イソプロピルフェノキシアセチル基、アセチル基、ベンゾイル基、イソブチリル基およびジメチルホルムアミジニル基が好ましい。

また、本発明によれば、カルボニル基が保護されていてもよく、例えば、フェノール、２，５－ジクロロフェノール、３－クロロフェノール、３，５－ジクロロフェノール、２－ホルミルフェノール、２－ナフトール、４－メトキシフェノール、４－クロロフェノール、２－ニトロフェノール、４－ニトロフェノール、４－アセチルアミノフェノール、ペンタフルオロフェノール、４－ピバロイロキシベンジルアルコール、４－ニトロフェネチルアルコール、２－（メチルスルフォニル）エタノール、２－（フェニルスルフォニル）エタノール、２－シアノエタノール、２－（トリメチルシリル）エタノール、ジメチルカルバミン酸クロライド、ジエチルカルバミン酸クロライド、エチルフェニルカルバミン酸クロライド、１－ピロリジンカルボン酸クロライド、４－モルフォリンカルボン酸クロライド、ジフェニルカルバミン酸クロライド等を反応させて、カルボニル基を保護することができる。ここで、カルボニル基の保護基については、特に導入しなくてもよい場合がある。

最終のカップリング工程において、３’末端の核酸に化学修飾基を導入又は誘導する方法は限定されず、当業者であれば、化学修飾基の種類及び性質に応じて、適宜、公知の方法を選択することができる。例えば、化学修飾基としてチオエート結合の誘導では、末端のリン酸ジエステル結合からチオエート結合への変換によって達成することができ、限定されないが、硫化剤（例えば、３－（（ジメチルアミノ－メチリデン）アミノ）－３Ｈ－１，２，４－ジチアゾール－３－チオンなど）を使用する方法が挙げられる。別の例では、化学修飾基としてＤＭＴｒの導入では、上述した式（Ｉ）で表される化合物において、Ｒ_２において保護基として導入されたＤＭＴｒを３’末端において脱保護しないことによって達成される。さらに別の例では、化学修飾基としてリン酸基の導入では、限定されないが、リン酸化試薬（例えば、２－［２－（４，４’－ジメトキシトリチルオキシ）エチルスルホニル］エチル－（２－シアノエチル）－（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル）－ホスホルアミダイト）を使用する方法が挙げられる。さらに、リン酸基からチオリン酸基の導入は、硫化剤の使用によって達成される。

当業者に理解されるように、核酸配列の固相合成に使用される固相担体として、種々の形態及び組成を有することができ、天然に存在する材料（天然材料）、合成により修飾された天然材料、又は合成材料から得ることができる。例えば、シリコン；ガラス（例えば、微小多孔質ガラス、多孔質ガラス（例えば、コントロールポアドガラス（ＣＰＧ）など）；金属（例えば、金、プラチナなど）；フェライトを芯にグリシンメタクリレートで表面を覆った磁性ビーズ；プラスチック（例えば、ポリエチレングリコール樹脂、シリカゲル樹脂、ポリテトラフルオロエチレン樹脂、ポリエステル樹脂、ポリエチレン樹脂、ポリプロピレン樹脂、ポリスチレン樹脂、アクリロニトリルブタジエンスチレン樹脂、ナイロン、アクリル樹脂、フッ素樹脂、ポリカーボネート樹脂、ポリウレタン樹脂、メチルペンテン樹脂、フェノール樹脂、メラミン樹脂、エポキシ樹脂、塩化ビニル樹脂）；多糖（例えば、アガロース、デキストラン、ニトロセルロースなど）；ポリアクリルアミド；ポリビニルアルコール；ヒドロキシエチルメタクリレートとメチルメタクリレートとのコポリマーなどが挙げられる。固相担体の形状としては、板状（基板状）、ビーズ状、糸状、球状、多角形状、粉末状など、任意の形状のものであってもよい。また、固相担体は、任意の形態で用いることができるが、ＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成装置等では、カラム等の容器に充填した形態で用いることが好ましい。また、上記と関連して、使用される固相担体として、従来よりＤＮＡチップ及び遺伝子検出用マイクロアレイを製造するために用いられているものを特に制限なく用いることができる。

以下、前述の５’から３’方向に核酸合成するためのホスホロアミダイト法の反応工程を、典型例を用いて簡単に説明する。
（１）脱保護工程
固相担体上に固定された核酸（オリゴヌクレオチド又はヌクレオシド）を酸処理することにより、その核酸の３’－末端のヌクレオシドの３’－水酸基（以下、単に「３’－水酸基」とも呼ぶ）の保護基を酸性条件下で脱離（脱保護）させ、この３’－水酸基を遊離状態とする。３’－水酸基の保護基は、限定されないが、一般的にはジメトキシトリチル基（ＤＭＴｒ）である。３’－水酸基からのジメトキシトリチル基の脱離は、限定されはないが、好ましくは、３％トリクロロ酢酸－ジクロロメタン溶液又は３％ジクロロ酢酸－ジクロロメタン溶液を用いることができる。

（２）縮合工程（カップリング工程）
上記脱保護工程で脱保護された３’－水酸基を有する固相担体上の核酸に、次に該核酸に連結させるべきヌクレオシド－３’－Ｏ－ホスホロアミダイト誘導体と、活性化剤である酸触媒とを添加する。この結果、ヌクレオシド－３’－Ｏ－ホスホロアミダイト誘導体は、酸触媒により活性化され、それに固相担体上の核酸の遊離３’－水酸基が反応して、両者は縮合反応により連結されることになる。この縮合反応により生じる結合は、三価のリン酸結合である。

酸触媒としては、限定されないが、１Ｈ－テトラゾール、５’－エチルチオ－１Ｈ－テトラゾール、ベンチルチオ－１Ｈ－テトラゾール、ジシアノイミダゾール、サッカリン／１－メチルイミダゾールなどの公知の酸触媒（活性化剤）を使用することができる。酸触媒は、アセトニトリル等の溶媒に溶解させた溶液として添加することが好ましく、その酸触媒溶液は０．１Ｍ～０．４５Ｍ、好ましくは０．２５Ｍ～０．４５Ｍで調製したものを用いることができるが、この濃度に限定されるものではなく、当業者が適宜調節可能である。

（３）キャッピング工程
上記縮合工程後、固相担体上のヌクレオシドの未反応の３’－水酸基を、脱保護工程で脱保護するものとは別の保護基で保護することにより、不活性化（すなわち、キャッピング）することができる。

ホスホロアミダイト法はこれまでに開発されたリン酸エステル縮合反応の中では最も活性があり、９８～９９％の５’－水酸基と反応する。その結果、固相担体上にはわずかに未反応の５’－水酸基を有するヌクレオシドが残存することになるが、これは次の鎖長伸長反応サイクルで伸長反応を生じると分離し難い不純物となるため、未反応の遊離な状態の５’－水酸基を有する未反応のヌクレオシド又はヌクレオチドを次のサイクルに持ち越さないようにする、キャッピングにより未反応の５’－水酸基を不活性化して伸長反応を停止させることが好ましい。

キャッピングは、公知の方法で行うことができるが、一般的には、その未反応の３’－水酸基をアセチル化することにより行うことが好ましい。未反応の３’－水酸基のアセチル化は、限定されないが、無水酢酸又は無水フェノキシ酢酸によるアセチル化を利用することができる。また、未反応の３’－水酸基のキャッピングには、非塩基不安定性試薬（例えば、ＵｎｉＣａｐ）を使用して達成され、脱保護後、ヌクレオチド配列上に遊離水酸基ではなくリン酸基を残すことができる。

上記の例において、未反応の３’－水酸基のキャッピングのためには、例えば、無水酢酸を含む溶液を、反応時に生じる酢酸と塩形成させるための塩基性触媒と共に固相担体に添加することが好ましい。無水酢酸を含む溶液と、塩基性触媒である１－メチルイミダゾール等を含む溶液は、別々に調製してキャッピング工程の際に用時調製することが好ましい。無水酢酸とともに添加される塩基性触媒としては、限定されないが、１－メチルイミダゾール、ピリジン、２，６－ルチジンなどが挙げられる。無水酢酸及び塩基性触媒は、各々、適切な溶媒（例えば、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、アセトニトリル等）に溶解した溶液として添加すればよい。

（４）酸化工程
上記縮合工程で鎖伸長されたヌクレオチドの三価のリン酸結合を、酸化試薬を固相担体に添加することにより酸化し、安定な五価の正リン酸結合に変換する。三価のリン酸結合（三価リン酸トリエステル結合）は加水分解されやすく不安定なためである。酸化試薬としては、公知の酸化試薬を用いることができるが、例えば、ヨウ素を含む水性溶液又は過酸化物などを好適に使用することができる。具体例としては、０．０２Ｍヨウ素－ピリジン溶液を水性溶媒又は有機溶媒に溶解した溶液、例えば、ヨウ素－ピリジン－水－テトラヒドロフラン溶液、（１Ｓ）－（＋）－（１０－カンファースルホニル）オキサジリジン、ｔ－ブチルハイドロパーオキシド－メチレンクロリドなどの過酸化物を用いることができるが、これに限定されない。

（５）反復工程
核酸塩基の種類を変更して、上記工程（１）～（４）を繰り返すことにより、核酸配列を伸長させ得る。

（６）化学修飾工程
伸長させた核酸配列の３’末端の核酸に化学修飾基を導入又は誘導させる。上記（２）の縮合工程において、酸化工程に進めることなく、例えば、硫化剤により、末端のリン酸ジエステル結合をチオエート結合に誘導することができ、又は脱保護しないことによりＤＭＴｒを残存させることができ、又はリン酸化試薬によりリン酸基の導入、さらには硫化剤によりチオリン酸基を導入することができる。

４．本発明による高純度の長鎖核酸を合成する方法
本発明によれば、上記で得られた核酸配列を固相担体から遊離させ、得られた核酸プール（例えば、オリゴＤＮＡプール）を用いて長鎖核酸（～１０^３ｂｐ）を得ることができる。より長い核酸を得る方法としては、当該技術文献において周知であるＰＣＡ（Polymerase Cycling Assembly)法を利用することができる。ＰＣＡ法は、一般的に、化学合成した一本鎖オリゴＤＮＡ（＜１０^２ｍｅｒ）から遺伝子レベル（１０^２～１０^３ｂｐ）の二本鎖ＤＮＡを作製する方法として知られている。ＰＣＡ法では、オーバーラップ配列（典型的には、１５～２５ｂｐ）を有する２つのオリゴＤＮＡ（典型的には、６０～８０ｍｅｒ）同士をアニーリングし、一本鎖部分のギャップ（例えば、数十ｂｐ）を耐熱性ＤＮＡポリメラーゼで埋めて（合成して）、二本鎖ＤＮＡを調製することができる。熱変性による一本鎖化→アニーリング→ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成のサイクルを繰り返すことにより、現在では、最大で約５０の核酸断片からなる一本鎖オリゴＤＮＡから目的とする遺伝子レベルの二本鎖ＤＮＡを１ポッド反応で連結することができる。

オリゴＤＮＡプールを出発材料とした場合、ＰＣＡの反応液中には連結が完結していない短鎖のＤＮＡ断片が残留するため、最後に目的配列の両端をプライミングサイトとしたＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）を行い、所望の長鎖ＤＮＡだけを指数的に増幅させる。ＰＣＲにより増幅可能なＤＮＡの長さは最大で数千ｂｐであるため、したがって、ＰＣＡ法が適用できるのは数千ｂｐが限界となる。なお、このＰＣＡ法は、ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＣｈａｉｎＡｓｓｅｍｂｌｙ法やＡｓｓｅｍｂｌｙＰＣＲ法と呼ばれることがある。

後述する実施例２に記載されるように、上記ホスホロアミダイト法によって得られた、化学修飾基が導入された核酸配列（核酸断片）をＰＣＡ法によりアセンブリし、増幅させて長鎖（５５２ｂｐ）ＤＮＡについても、３’－エキソヌクレアーゼに耐性のない化学修飾基（リン酸基）が導入された長鎖ＤＮＡは、３’－エキソヌクレアーゼにより分解され、一方、耐性のある化学修飾基（ホスホロチオエート結合）が導入された長鎖ＤＮＡは分解されないことが実証された。また、両方の長鎖ＤＮＡにおける連結効率には相違はなく、核酸増幅効率に影響はないことも示された。なお、本発明の核酸合成法では、上記の通り、化学修飾基の使用により核酸配列中に導入されるが、合成した核酸配列を鋳型として増幅する回数の増加により、実質的に化学修飾基を含む核酸配列は存在しないものとみなすことができる。

以下、本発明を実施例に基づいて、より具体的に説明する。なお、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容易に本発明に修飾・変更を加えることができ、それらは本発明の技術的範囲に含まれる。

本実施例で使用した合成試薬及び有機溶媒等は、特に言及がない限り、東京化成工業、和光純薬工業、関東化学、シグマアルドリッチで購入したものを使用した。

実施例１：エキソヌクレアーゼＩ及びエキソヌクレアーゼＩＩＩを用いた酵素分解反応評価
エキソヌクレアーゼＩ（ＥＸＯ－１、５Ｕ／μＬ）７５０Ｕ２６５０Ａ、及びエキソヌクレアーゼＩＩＩ（ＥＸＯ－３、２００Ｕ／μＬ）５０００Ｕ２１７０Ａは、タカラバイオ株式会社から購入した。４０ｗ／ｖ％アクリルアミド／ビス混合液（２９：１）は富士フィルム和光製薬株式会社から購入した。ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｏｌｄは、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入した。核酸自動合成機に使用する試薬は、富士フィルム、和光純薬株式会社及びＧｌｅｎＲｅｓｅａｒｃｈ社から購入した。なお、エキソヌクレアーゼＩは、ＤＮＡのリン酸化エステル結合の加水分解を触媒することにより、一本鎖ＤＮＡの３’－ＯＨ末端から５’－モノヌクレオチドを遊離させる３’→５’エキソヌクレアーゼである。また、エキソヌクレアーゼＩＩＩは、二本鎖ＤＮＡの３’－ＯＨ末端から５’－モノヌクレオチドを遊離させる３’→５エキソヌクレアーゼある。

ＨＰＬＣ
陰イオン交換クロマトグラフィーＨＰＬＣは、島津製作所社製ＳｈｉｍａｄｚｕＬＣ－１０Ａｖｐを用いた。カラムは、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製ＤＮＡＰａｃ（商標）ｓｅｍｉ－ｐｒｅｐＰＡ１００９×２５０ｍｍを用いた。測定は５０℃定温、溶媒Ｂ：０％（０分）から溶媒Ｂ：６０％（６０分）の直線勾配により実施した。
溶媒Ａ：２５ｍＭリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ６．０）＋１０ｖｏｌ％のＣＨ_３ＣＮ
溶媒Ｂ：２５ｍＭリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ６．０）＋１ＭのＮａＣｌ＋１０ｖｏｌ％のＣＨ_３ＣＮ

ＥＳＩ－ＴＯＦ－ＭＡＳＳ
ＥＳＩ－ＴＯＦ－ＭＡＳＳには、ＢｒｕｋｅｒＤａｌｔｏｎｉｃｓ社製ｍｉｃｒｏＴＯＦＩＩを用いた。

オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）
ＯＤＮ１（Ｔ－２０）：5’-T^*TTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3’（^＊＝ホスホロチオエート）（配列番号１）
ＯＤＮ２（Ｔ２０－Ｐ）：5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-P-3’（P＝リン酸基）（配列番号２）
ＯＤＮ３（Ｔ－２０－ＰＳ）：5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTT^*T-3’（^＊＝ホスホロチオエート）（配列番号３）
ＯＤＮ４（Ｔ２０－ＤＭＴｒ）：5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-DMTr-3’（配列番号４）
ＯＤＮ５（Ｔ２０－Ｐ（Ｏ）（ＯＢｎ）ＯＨ）：5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-P(O)(OBn)OH-3’（配列番号５）
ＯＤＮ６（Ａ２０）：5’-A^*AAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3’（^＊＝ホスホロチオエート）（配列番号６）
ＯＤＮ７（Ａ２０－ＰＳ）：5’-AAAAAAAAAAAAAAAAAAA^*A-3’（^＊＝ホスホロチオエート）（配列番号７）
なお、ＯＤＮ１～３及びＯＤＮ６～７は、ＩｎｔｅｇｒａｔｅｄＤＮＡＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社から購入し、ＯＤＮ４～５は、以下のプロトコールにより合成した。

オリゴ合成
ＯＤＮ４～５は、３’－Ｏ－（ジメトキシトリチル）チミジンの５’－水酸基をスクシニルリンカーを介して導入したコントロールポアドガラス（ＣＰＧ）担体上で核酸自動合成機ｎＳ－８ＩＩを用いて１μｍｏｌスケールで合成した。合成サイクルは以下の通りである。
（１）脱トリチル化：ＣＨ２Ｃｌ_２中の３％トリクロロ酢酸、２４秒；
（２）カップリング：ＡＣＮ中の０．１Ｍの３’－Ｏ－（４，４’－ジメトキトリチル）－チミジン－５’－ＣＥＤホスホロアミダイト、ＣＨ_３ＣＮ－ＮＭＰ（１０：１、ｖ／ｖ）中の０．１Ｍの６－ニトロ－ＨＯＢｔ／０．２ＭのＢＩＴ、５秒；
（３）キャッピング：ＴＮＦ中の１０ｖｏｌ％Ａｃ_２Ｏ、ＴＨＦ－１－メチルイミダゾール－ピリジン（８：１：１、ｖ／ｖ／ｖ）、３０秒；
（４）酸化：ＴＨＦ－ピリジン－Ｈ_２Ｏ（９０：２：８、ｖ／ｖ／ｖ）中の０．０２ＭのＩ_２、２０秒
を１９サイクル繰り返し、ＯＤＮ４（Ｔ２０－ＤＭＴｒ）を合成した。ＯＤＮ５（Ｔ２０－Ｐ（Ｏ）ＯＢｎＯＨ）については、アミダイト試薬を０．２５Ｍジベンジル－Ｎ，Ｎ，ジイソプロピルアミダイトに変更し、上記合成サイクルをもう一度繰り返した。合成終了後、２８％ＮＨ_３水溶液で室温２時間処理することにより、固相担体から切り出し、続いて、遠心エバポレータを用いて減圧留去し、Ｓｅｐ－Ｐａｋ（登録商標）を用いて簡易精製した。その後、陰イオン交換クロマトグラフィーを用いて分取精製した後、Ｓｅｐ－Ｐａｋ（登録商標）を用いて脱塩をし、ＥＳＩ－ＴＯＦ－ＭＡＳＳを用いて目的物であることを確認した。
ＯＤＮ４（Ｔ２０－ＤＭＴｒ）：ＥＳＩ－ＴＯＦ－ＭＡＳＳ［Ｍ＋Ｈ］^＋計算値６３２４．３０、実測値６３１９．９６；
ＯＤＮ５（Ｔ２０－Ｐ（Ｏ）ＯＢｎＯＨ）：ＥＳＩ－ＴＯＦ－ＭＡＳＳ［Ｍ＋Ｈ］^＋計算値６１９２．０４、実測値６１８９．６９。

酵素分解評価
各ＯＤＮは、３０μＭ、ＥＸＯ－３は２０Ｕ／μＬ、ＥＸＯ－１は０．５Ｕ／μＬになるように５０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５ｍＭＭｇＣｌ_２、１ｍＭＤＴＴ溶液に溶解し、３７℃でインキュベートした後、９０℃で５～１５分間、失活させた。その後、反応溶液５μＬとゲルローディング・ダイ・パープル（６×）１μＬを加え、７Ｍ尿素を含む２０％変性ＰＡＧＥ電気泳動を用いて酵素による分解評価を行なった。電気泳動後、ＴＢＥ緩衝液４０ｍＬにＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｏｌｄ４μＬを加え、調製した染色液にゲルサンプルを抽出した。

未修飾ＯＤＮ（ＯＤＮ１及び６）の分解評価を行った結果を図１に示す。（左から）レーン４は、ＯＤＮ１とＯＮＤＮ６の二本鎖ＤＮＡがＥＸＯ３によって切断されるが、一方、レーン５に見られるようにＥＸＯ１では切断されないことが示された。また、レーン８では、ＯＤＮ１（一本鎖）がＥＸＯ１により切断されることを示すが、ＥＸＯ３は、同じ一本鎖の核酸配列を切断することが示された。これは、今回使用したＥＸＯ３は、二本鎖ＤＮＡを切断する活性に加えて、一本鎖ＤＮＡも切断する活性を併せ持つことが示された。上記の結果は、各エキソヌクレアーゼによるオリゴ核酸の切断（分解）が特異的であることが示された。

次に、３’末端が化学修飾されたオリゴＤＮＡを用いて、３’－エキソヌクレアーゼによる分解評価を行った（図２）。図２左は、オリゴＤＮＡとしてＯＤＮ２（３’末端にリン酸基が導入されたもの）を使用し、図２右は、ＯＤＮ３（３’末端にホスホロチオテートが導入されたもの）を使用し、３’－エキソヌクレアーゼ（ＥＸＯ１）による分解評価を行った結果である。一本鎖ＤＮＡを切断するＥＸＯ１により、ＯＤＮ２は、経時的に穏やかに分解されていくことが観察されたが、一方、ＯＤＮ３は一本鎖であるにもかかわらず、分解されなかった。これは、ＥＸＯ１によるオリゴＤＮＡ核酸の分解には、３’末端の化学修飾基の相違が大きく作用することが示唆された。

同様に、ＯＤＮ４（３’末端にジメトキトリチル（ＤＭＴｒ）基が導入されたもの）及びＯＤＮ５（３’末端にリン酸ベンジルエステルが導入されたもの）について分解評価を行った（図３）。図３左は、ＯＤＮ４（３’末端にＤＭＴｒが導入されたもの）を使用し、図３右は、ＯＤＮ５（３’末端にリン酸ベンジルエステルが導入されたもの）を使用し、３’－エキソヌクレアーゼ（ＥＸＯ１）による分解評価を行った結果である。ＥＸＯ１は、化学修飾を選択的に認識し、リン酸ベンジルエステルが導入された核酸を分解したが、ＤＭＴｒが導入された核酸は分解しなかった。

さらに、各鎖における化学修飾基が相違する二本鎖核酸についても同様に分解評価を行った（図４）。ＯＤＮ５（前述）とＯＤＮ７（３’末端にホスホロチオエート結合が導入されたもの）の組み合わせでは、二本鎖核酸を分解するＥｘｏ３であっても、核酸配列に３’末端にホスホロチオエート結合が導入されたことにより、ＯＤＮ５とＯＤＮ７の二本鎖核酸は分解されなかった。

実施例２：エキソヌクレアーゼＩＩＩを用いたＰＣＡ－ＰＣＲ増幅連結反応
エキソヌクレアーゼＩＩＩ（ＥＸＯ－３、２００Ｕ／μＬ）５０００Ｕ２１７０Ａは、タカラバイオ株式会社から購入した。Ｑ５Ｈｉｇｈ－ＦｉｄｅｌｉｔｙＤＮＡポリメラーゼ、１０ｍＭｄＮＴＰｓ、５×Ｑ５反応緩衝液は、ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓＪａｐａｎから購入した。

以下の使用したＯＤＮ８～１７およびＰｒｉｍｅｒ１～２はＩｎｔｅｇｒａｔｅｄＤＮＡＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）社から購入した。

（Ａ）３’末端が化学修飾されていない配列
ＯＤＮ８（１０６ｍｅｒ）
TGATCCGTATGCGGGTGTTCTGGATCGTGTTAATTATGATCAGATGAGCGTTTATGTTGGTCGTGGTGTTGGTGGTGGTAGCCTGGTTAATGGTGGTATGGCAGTT（配列番号８）
ＯＤＮ９（１２０ｍｅｒ）
GTAGCCTGGTTAATGGTGGTATGGCAGTTGCACCGAAACGTAGCTATTTTGAAGAAGTTCTGCCTCGCGTTGATAGCGCAGCAATGTATGATCGTTATTTTCCGCGTGCAAATAGCATGC（配列番号９）
ＯＤＮ１０（１２０ｍｅｒ）
TCGTTATTTTCCGCGTGCAAATAGCATGCTGCGTGTGAATCATATTGATAACGGTTGGTTTGAAGGCACCGATTGGTATAAATTCGCACGTGTTAGCCGTGATCAGGCCCAGAAAGCAGG（配列番号１０）
ＯＤＮ１１（１２０ｍｅｒ）
ACTTCGGCTGCCAGTGCGCTTTTCGGAACTTCACCATTGGCTTCACGACGCATGTAATCGAAATCATAAACATTCGGAACATGAACGGTGCCCAGACCTGCTTTCTGGGCCTGATCACGG（配列番号１１）
ＯＤＮ１２（１２０ｍｅｒ）
GCCTGATGCAGGGTTTCAATGGTAACTTTACCGGTGCCTAATGCTGCTGCCAGATAGGTTTTGTCCAGGCTCTGTTTACCATGATTATTACCATAAATAACTTCGGCTGCCAGTGCGCTT（配列番号１２）
ＯＤＮ１３（９８ｍｅｒ）
CGACCATCTGCGTCTTTCTGTTCAACGGTCAGCAGATATGTGCCATCTTTCTGCTGACGAATGGTACGTGCCTGATGCAGGGTTTCAATGGTAACTTT（配列番号１３）

（Ｂ）３’末端がホスホロチオエート結合で化学修飾された配列（^：ホスホロチオエート結合）
ＯＤＮ１４（１０６ｍｅｒ）
TGATCCGTATGCGGGTGTTCTGGATCGTGTTAATTATGATCAGATGAGCGTTTATGTTGGTCGTGGTGTTGGTGGTGGTAGCCTGGTTAATGGTGGTATGGCAGT^T（配列番号１４）
ＯＤＮ１５（１２０ｍｅｒ）
GTAGCCTGGTTAATGGTGGTATGGCAGTTGCACCGAAACGTAGCTATTTTGAAGAAGTTCTGCCTCGCGTTGATAGCGCAGCAATGTATGATCGTTATTTTCCGCGTGCAAATAGCATG^C（配列番号１５）
ＯＤＮ１６（１２０ｍｅｒ）
TCGTTATTTTCCGCGTGCAAATAGCATGCTGCGTGTGAATCATATTGATAACGGTTGGTTTGAAGGCACCGATTGGTATAAATTCGCACGTGTTAGCCGTGATCAGGCCCAGAAAGCAG^G（配列番号１６）
ＯＤＮ１７（１２０ｍｅｒ）
ACTTCGGCTGCCAGTGCGCTTTTCGGAACTTCACCATTGGCTTCACGACGCATGTAATCGAAATCATAAACATTCGGAACATGAACGGTGCCCAGACCTGCTTTCTGGGCCTGATCACG^G（配列番号１７）
ＯＤＮ１８（１２０ｍｅｒ）
GCCTGATGCAGGGTTTCAATGGTAACTTTACCGGTGCCTAATGCTGCTGCCAGATAGGTTTTGTCCAGGCTCTGTTTACCATGATTATTACCATAAATAACTTCGGCTGCCAGTGCGCT^T（配列番号１８）
ＯＤＮ１９（９８ｍｅｒ）
CGACCATCTGCGTCTTTCTGTTCAACGGTCAGCAGATATGTGCCATCTTTCTGCTGACGAATGGTACGTGCCTGATGCAGGGTTTCAATGGTAACTT^T（配列番号１９）
Ｐｒｉｍｅｒ１（２７ｍｅｒ）
TGATCCGTATGCGGGTGTTCTGGATCG（配列番号２０）
Ｐｒｉｍｅｒ２（３０ｍｅｒ）
CGACCATCTGCGTCTTTCTGTTCAACGGTC（配列番号２１）

１．エキソヌクレアーゼＩＩＩ（Ｅｘｏ－３）による反応
ＯＤＮ８～１３又はＯＤＮ１４～１９は各５０ｐＭ、Ｅｘｏ－３は１０Ｕ／μｌになるように、５０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝溶液（ｐＨ８．０、５ｍＭＭｇＣｌ_２、１ｍＭＤＴＴ）に溶解した。この溶液を３７℃で３０分間インキュベートした後、９０℃で１５分処理した。

２．ＰＣＡ反応
５μｌのＥｘｏ－３の反応溶液をＰＣＲ用８連チューブに分注し、２Ｕ／μｌのＱ５Ｈｉｇｈ－ＦｉｄｅｌｉｔｙＤＮＡポリメラーゼを０．２５μｌ、１０ｍＭのｄＮＴＰを０．５μｌ、５×Ｑ５反応緩衝液（１２５ｍＭＴＡＰＳ－ＨＣｌ、２５０ｍＭＫＣｌ、１０ｍＭＭｇＣｌ_２、５ｍＭ β－メルカプトエタノール）を５μｌ、及びＭＱを加え、２５μｌにした。その後、Ｂｉｏｒａｄ社のＭＪＭｉｎｉ（商標）ＰｅｒｓｏｎａｌＴｈｅｒｍａｌＣｙｃｌｅｒを用いて以下のプロトコールでＰＣＡ反応を行なった。

３．ＰＣＲ反応
ＰＣＡ反応溶液に、Ｐｒｉｍｅｒ１を２７ｐｍｏｌ、Ｐｒｉｍｅｒ２を２７ｐｍｏｌ、２０００Ｕ／ｍｌのＱ５Ｈｉｇｈ－ＦｉｄｅｌｉｔｙＤＮＡポリメラーゼを０．２５μｌ、１０ｍＭのｄＮＴＰを０．５μｌ、５×Ｑ５反応緩衝液（１２５ｍＭＴＡＰＳ－ＨＣｌ、２５０ｍＭＫＣｌ、１０ｍＭＭｇＣｌ_２、５ｍＭ β－メルカプトエタノール）を５μｌ、及びＭＱを加え、全量を５０μｌにした。その後、Ｂｉｏｒａｄ社のＭＪＭｉｎｉ（商標）ＰｅｒｓｏｎａｌＴｈｅｒｍａｌＣｙｃｌｅｒを用いて以下のプロトコールでＰＣＡ反応を行なった。

得られた反応液を島津社製マイクロチップ電気泳動装置ＭｕｌｔｉＮＡを用いて定量分析を行なった。３’末端が化学修飾されていない６配列（ＯＤＮ８～１３）をＰＣＡにより断片を組み合わせ、ＰＣＲに増幅した二本鎖核酸配列を「ＰＯ」と称し、一方、３’末端がホスホロチオエート結合で化学修飾された６配列（ＯＤＮ１４～１９）をＰＣＡにより断片を組み合わせ、ＰＣＲに増幅した二本鎖核酸配列を「ＰＳ」と称する（図５上）。いずれの配列も５５２ｂｐのＤＮＡであった。

Ｅｘｏ３の非添加系において各断片から核酸配列を連結させた場合、ＰＯ及びＰＳのいずれもそう対比が１．０（又はその近傍）であったことから、化学修飾の有無による連結効率に違いがないことが判明した（図５下）。次に、Ｅｘｏ３の添加系において同様に連結させた場合、ＰＯは、Ｅｘｏ３により分解されたのに対して、ＰＳは分解されず、非添加系と比較しても同等の増幅効率であって。このように、核酸断片からＰＣＡ法により長鎖核酸を得る場合において、３’－エキソヌクレアーゼの使用と適切な化学修飾基の導入により、ＰＯなどの不純物を選択的かつ高効率で除去することができる。

本発明に係る核酸配列の３’末端に導入した化学修飾、及び３’－エキソヌクレアーゼの使用した核酸断片の化学合成法により、核酸合成の過程で生じる不純物のみを選択的に分解及び除去することができ、高純度の核酸断片及び長鎖核酸を提供することができる。

本明細書に引用する全ての刊行物及び特許文献は、参考により全体として本明細書中に援用される。なお、例示の目的として、本発明の特定の実施形態を本明細書において説明したが、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、種々の改変が行われる場合があることは、当業者に容易に理解されるであろう。

Claims

化学合成した核酸断片を、３’－エキソヌクレアーゼを用いて精製する方法であって、核酸合成過程において３’－エキソヌクレアーゼによる酵素分解に耐性である化学修飾基を該核酸断片の３’末端の核酸に導入し、３’－エキソヌクレアーゼにより処理する工程を含む、上記方法。
精製が、目的とする鎖長より短い核酸断片を３’－エキソヌクレアーゼにより選択的に分解及び除去するものである、請求項１に記載の方法。
３’－エキソヌクレアーゼによる酵素分解に耐性である、導入される化学修飾基が、ホスホロチオエート結合、ジメトキシトリチル基、リン酸基及びチオリン酸基からなる群から選択される、請求項１又は２に記載の方法。
ホスホロアミダイト法に基づく核酸の化学合成において、請求項１～３のいずれか１項に定義される方法を用いることを含む、高純度の核酸配列を合成する方法。
核酸配列の合成において不純物の発生率を１０分の１又はそれ以下に低減させることを特徴とする、請求項４に記載の方法。
（ａ）固相担体に結合させたヌクレオシドの３’水酸基を酸処理により除去する工程；
（ｂ）ヌクレオシド－Ｏ－ホスホロアミダイト誘導体を酸触媒で活性化し、縮合反応により、直接又はユニバーサルリンカーを介して、固相担体上のヌクレオシドの５’水酸基と三価リン酸結合により連結させる工程；
（ｃ）未反応の該５’又は３’水酸基をキャッピングする工程；
（ｄ）該三価リン酸結合を酸化する工程；
（ｅ）上記工程を反復する工程；
（ｆ）反復する工程の最終において、工程（ｃ）の後に３’末端の核酸に化学修飾基を導入又は誘導する工程；
（ｇ）化学合成された核酸を固相担体から遊離させる工程；及び
（ｈ）３’－エキソヌクレアーゼで処理する工程
を含む、請求項４又は５に記載の方法。
ヌクレオシド－Ｏ－ホスホロアミダイト誘導体が、下記式（Ｉ）：

〔式中、
Ｂは、核酸塩基又は保護基で保護された核酸塩基であり；
Ｒ_１は、水素原子、水酸基、又は保護基で保護された水酸基であり；
Ｒ_２は、水素原子又は水酸基の保護基であり；
Ｒ_３は、２－シアノエチル基、２－トリメチルシリルエチル基、ニトロフェニルエチル基、又は２－ニトロエチル基であり；
Ｒ_４は、－Ｎ（Ｒ_５）_２（式中、Ｒ_５は、独立して、Ｃ_１～６アルキル、または窒素、硫黄及び酸素からなる群から選択される３個までのヘテロ原子を有する４～７員環のへテロシクロアルキル若しくはヘテロシクロアルケニルである）、モルホリノ基、又はジアルキルアミノ基である〕
で表される、請求項６に記載の方法。
ＰＣＡ法に基づく核酸の化学合成において、請求項４～７のいずれか１項に記載の方法によって得られた核酸配列を用いることを含む、高純度の二本鎖長鎖核酸を合成する方法。
核酸がＤＮＡである、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。