JP7100069B2 - 表面結合オリゴヌクレオチドを化学開裂および脱保護するための組成物および方法 - Google Patents
表面結合オリゴヌクレオチドを化学開裂および脱保護するための組成物および方法 Download PDFInfo
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Description
本出願は、2018年5月15日出願の米国仮出願62/671,816および2019年1月3日出願の米国仮出願62/788,045に基づく優先権の利益を主張し、この各々は、引用により全体として本明細書に包含させる。
本出願は、EFS-Webにより提出したASCIIテキストファイルの電子配列表と共に出願された。電子配列表はILLINC363WOSEQLIST.txtなるファイル名の電子配列表として提供され、2019年5月10日に作成され、最終的に保存され、2,806バイトサイズである。電子配列表の情報は、引用により全体として本明細書に包含させる。
分野
本発明の実施態様は、ポリヌクレオチド配列決定のための鋳型を製造する方法に関する。特に、本発明は、固体支持体上に固定された二本鎖ポリヌクレオチドの1以上の第一鎖の化学開裂による、ある場合、パラジウム錯体またはニッケル錯体などの遷移金属錯体存在下での反応による配列決定に備えたクラスター化ポリヌクレオチドの線形化に関する。さらに、本発明は、固体支持体上の修飾プライマーの化学的脱保護に関する。
本発明のある実施態様は、複数の固定化二本鎖ポリヌクレオチドを線形化する方法であって、二本鎖ポリヌクレオチドを含む固体支持体を用意し、ここで、各二本鎖ポリヌクレオチドは第一鎖および第二鎖を含むものであり、ここで、第一鎖および第二鎖は、各々その5’末端で固体支持体に固定化されており、そして、各第一鎖は遷移金属錯体存在下で化学開裂を受けることができる第一開裂部位を含み、ここで、遷移金属錯体はパラジウム錯体またはニッケル錯体であり;二本鎖ポリヌクレオチドと遷移金属錯体の水溶液を接触させ、それにより第一開裂部位で1以上の第一鎖を開裂し、1以上の開裂第一核酸および開裂固定化第一鎖を産生し;そして固体支持体から開裂第一核酸を除去することを含む、方法に関する。このような方法において、固定化第二鎖は、固体支持体から開裂第一核酸を除去後固体支持体上に残り、開裂固定化第一鎖とハイブリダイズしたままである。ある実施態様において、パラジウム(Pd)錯体はPd(0)錯体である。ある実施態様において、ニッケル(Ni)錯体はNi(0)錯体である。ある実施態様において、第一開裂部位はアリル官能基を含む。あるさらなる実施態様において、第一開裂部位はさらにホスフェート部分を含む。ある実施態様において、第一開裂部位はアリルホスフェート部分を含む修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドである。
R1は-NH2、-OH、-NHC(O)ORaまたは-OCH2OSi(Rb)3であり;
ここで、RaはC1-4アルキル、tert-ブチル、アリル、ベンジルまたは9-フルオレニルメチルであり;そして
各Rbは独立してC1-4アルキルおよびフェニルからなる群から選択され;そして
R2はH、C1-4アルキル、場合により置換されているテトラヒドロフランまたはヌクレオチドである。〕
の構造を有する3’末端ホスフェート部分である。
の構造を含む。ある実施態様において、ホスフェート基は負に荷電していてよい(例えば、-PO4 -)。ある態様において、修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドは式(IIa):
の化合物であり;そしてオリゴヌクレオチドは所望により固体支持体に結合している。ある実施態様において、ホスフェート基は負に荷電していてよい(例えば、-PO4 -)。
の化合物である。
の構造の3’遮断部分を含む。ある実施態様において、ホスフェート基は負に荷電していてよい(例えば、PO4 -)。
RaはC1-4アルキル、tert-ブチル、アリル、ベンジルまたは9-フルオレニルメチルであり;
各Rbは独立してC1-4アルキルおよびフェニルからなる群から選択され;そして
塩基は所望により保護されているアデニン、グアニン、シトシン、チミンまたはウラシルまたはその誘導体である。〕
の構造を含む。ある実施態様において、ホスフェート基は負に荷電していてよい(例えば、PO4 -)。ある実施態様において、式(V)の化合物は、式(V’)の化合物から産生され得る。
RaはC1-4アルキル、tert-ブチル、アリル、ベンジルまたは9-フルオレニルメチルであり;
各Rbは独立してC1-4アルキルおよびフェニルからなる群から選択され;
各塩基は独立して所望により保護されているアデニン、グアニン、シトシン、チミンまたはウラシルまたはその誘導体である。〕
の化合物である。ある実施態様において、オリゴヌクレオチドは所望により固体支持体に結合している。ある実施態様において、ホスフェート基は負に荷電していてよい(例えば、PO4 -)。ある実施態様において、式(VI)の化合物は式(VI’)の化合物から製造され得る。
の化合物である。
sは2、3、4、5または6であり;
「a」酸素は第一ヌクレオチドの3’ヒドロキシル酸素であり;そして
「b」酸素は第二ヌクレオチドの5’ヒドロキシル酸素である。〕
の構造を有する。
非酵素化学線形化ストラテジーは、各配列解読に先立ち架橋二本鎖ポリヌクレオチド構造を開裂するための魅力的な代替手段である。特に、化学物質は長期室温で保存でき、酵素と比較して比較的安価である。本発明は、配列決定用鋳型の産生のために固体支持体に固定化された二本鎖ポリヌクレオチドのクラスターを化学的に線形化する方法に関する。各二本鎖ポリヌクレオチドは第一鎖および第二鎖を含む。第一鎖は、固体支持体に固定化された第一伸長プライマーの伸長により産生され、第二鎖は、固体支持体に固定化された第二伸長プライマーの伸長により産生される。第一および第二鎖の各々は開裂部位を含む。ある実施態様において、第一鎖は、パラジウム錯体またはニッケル錯体、例えば、Pd(0)錯体またはNi(0)錯体により開裂され得る開裂部位を含む。特定の実施態様において、開裂部位は第一鎖の第一伸長プライマー部分に位置する。さらなる実施態様において、開裂部位は、アリル官能基を有するチミンヌクレオシドまたはヌクレオチドアナログを含む。ある実施態様において、第二鎖は、化学反応剤、例えば、Na2S2O4により開裂され得るアゾベンゼンリンカーを含む開裂部位を含む。あるいは、第二鎖は、過ヨウ素酸、例えば、NaIO4により開裂され得る開裂部位を含む。ここに記載する方法を、Illumina(San Diego, CA)のHiSeq(登録商標)、MiSeq(登録商標)またはNextSeq(登録商標)システムなどのシステムで合成による配列決定(SBS)反応の一部として使用し得る。
P5:ペアエンド 5’→3’
AATGATACGGCGACCACCGAGAUCTACAC(配列番号1)
P7:ペアエンド 5’→3’
CAAGCAGAAGACGGCATACGAG*AT(配列番号2)
ここで、G*は8-オキソ-グアニンである。
ポリTスペーサーを伴うP5プライマー:
5’-アルキン-TTTTTTTTTTAATGATACGGCGACCACCGAGAUCTACAC(配列番号3)
ポリTスペーサーを伴うP7プライマー:
5’-アルキン-TTTTTTTTTTCAAGCAGAAGACGGCATACGAG*AT(配列番号4)
ここで、G*は8-オキソ-グアニンである。
さらなるプライマー配列は、シングルリードSBSのための一組のP5およびP7プライマーを含む。
P5:シングルリード:5’→3’
AATGATACGGCGACCACCGA(配列番号7)
P7:シングルリード5’→3’
CAAGCAGAAGACGGCATACGA(配列番号8)
P15プライマー5’→3’
5’-アルキン-TTTTTTAATGATACGGCGACCACCGAGAXCTACAC(配列番号5)
ここで、スキーム1に示すとおりX=アリルTヌクレオシド。
P17プライマー5’→3’
5’-アルキン-TTTTTTYYYCAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT(配列番号6)
ここで、Yは、例えば、引用により全体として本明細書に明示的に包含させる米国公開2012/0309634に開示の過ヨウ素酸のような反応剤での酸化により、化学開裂に付されるジオールリンカーである。ある実施態様において、ジオールリンカーは、ここに記載する式(VIII)または(VIIIa)を含む。
ここで使用する見出しは構成目的のためのみであり、記載する主題を限定すると解釈してはならない。
本発明のある実施態様は、複数の固定化二本鎖ポリヌクレオチドを線形化する方法であって、二本鎖ポリヌクレオチドを含む固体支持体を用意し、ここで、各二本鎖ポリヌクレオチドは第一鎖および第二鎖を含むものであり、ここで、第一鎖および第二鎖は、各々その5’末端で固体支持体に固定化されており、そして、各第一鎖は開裂反応剤の存在下で化学開裂を受けることができる第一開裂部位を含み;二本鎖ポリヌクレオチドと開裂反応剤を接触させ、それにより第一開裂部位で1以上の第一鎖を開裂し、1以上の開裂第一核酸および開裂固定化第一鎖を産生し;そして固体支持体から開裂第一核酸を除去することを含む、方法に関する。ある態様において、開裂部位はPd錯体またはNi錯体存在下、開裂を受け得る。ある態様において、開裂反応剤はPd錯体またはNi錯体の水溶液である。ある態様において、開裂反応剤はin situで調製される。
の構造を有する。ある実施態様において、ホスフェート基は負に荷電していてよい(例えば、-PO4 -)。ある態様において、修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドは式(IIa):
ここに記載するPd線形化方法のある実施態様において、化学線形化方法に使用するPd錯体は水可溶性である.このような実施態様のある場合において、Pd錯体はPd(0)錯体である。幾つかの例において、Pd(0)錯体を、アルケン、アルコール、アミン、ホスフィンまたは金属ハイドライドのような反応剤によるPd(II)錯体の還元によりin situ産生し得る。適当なパラジウム源は、Na2PdCl4、(PdCl(C3H5))2、[Pd(C3H5)(THP)]Cl、[Pd(C3H5)(THP)2]Cl、Pd(OAc)2、Pd(Ph3)4、Pd(dba)2およびPd(TFA)2を含む。このような実施態様のある場合において、Pd(0)錯体は、Na2PdCl4からin situで産生される。他の実施態様において、パラジウム源はアリルパラジウム(II)クロライド二量体[(PdCl(C3H5))2]である。ある実施態様において、Pd(0)錯体は、Pd(II)錯体とホスフィンの混合により水溶液中で産生される。適当なホスフィンは、水可溶性ホスフィン、例えばトリス(ヒドロキシプロピル)ホスフィン(THP)、トリス(ヒドロキシメチル)ホスフィン(THM)、1,3,5-トリアザ-7-ホスファアダマンタン(PTA)、ビス(p-スルホナトフェニル)フェニルホスフィン二水和物カリウム塩、トリス(カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)およびトリフェニルホスフィン-3,3’,3’’-トリスルホン酸三ナトリウム塩を含む。
ここに記載するNi線形化方法のある実施態様において、化学線形化方法において使用するNi錯体は水可溶性である。このような実施態様のある場合において、Ni錯体はNi(0)錯体である。幾つかの例において、Ni錯体は、Ni(II)化合物のアルケン、アルコール、アミン、ホスフィンまたは金属ハイドライドのような反応剤での還元によりin situで産生され得る。ある実施態様において、Ni(II)化合物はNiCl2である。適当なホスフィンは、トリス(ヒドロキシプロピル)ホスフィン(THP)、トリス(ヒドロキシメチル)ホスフィン(THM)、1,3,5-トリアザ-7-ホスファアダマンタン(PTA)、ビス(p-スルホナトフェニル)フェニルホスフィン二水和物カリウム塩、トリス(カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)およびトリフェニルホスフィン-3,3’,3’’-トリスルホン酸三ナトリウム塩などの水可溶性ホスフィンを含む。ある実施態様において、Ni錯体は、NiCl2と1~10当量のTHPの混合により製造される。
本発明のある実施態様は、オリゴヌクレオチドから3’末端保護基を除去する方法であって、5’末端で固定化された複数のオリゴヌクレオチドを含む固体支持体を用意し、ここで、オリゴヌクレオチドは各々ここに記載する式(I)の構造を有する3’末端保護基を含み;そして、オリゴヌクレオチドと脱保護剤を接触させ、それにより、3’末端保護基を開裂して、各々遊離3’末端ヒドロキシル基を有するオリゴヌクレオチドを産生することを含む、方法に関する。3’末端修飾ホスフェート部分は、式(I):
の構造を有する。
の構造を含む。ある実施態様において、式(I)または(V)における1以上のホスフェート基は負に荷電していてよい(例えば、PO4 -)。
ここに記載するPd/Ni線形化方法のある実施態様において、各第二鎖は固体支持体に固定化された第二伸長プライマーから伸長され、各第二鎖は第二開裂部位を含む。このような実施態様のある場合において、第二伸長プライマーは、ここに記載するP5もしくはP7配列またはP5もしくはP7に相補的である配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む。ある実施態様において、第二伸長プライマーはP7ヌクレオチド配列(配列番号2)を含む。さらなる実施態様において、第二伸長プライマーはポリTスペーサーP7ヌクレオチド配列(配列番号4)を含む。ある態様において、第二伸長プライマーは、修飾ヌクレオチドが取り込まれた(配列に3’ヒドロキシル保護基を有する塩基を付加するか配列における塩基を置き換える)P5またはP7であるヌクレオチド配列を含む。さらなる実施態様において、第二伸長プライマーはP17プライマー(配列番号6)を含む。ある実施態様において、第二伸長プライマーはP7プライマーである。さらなる実施態様において、第二伸長プライマーはポリTスペーサーP7プライマーである。他の実施態様において、第二伸長プライマーはP17プライマーである。
sは2、3、4、5または6であり;
「a」酸素は第一ヌクレオチドの3’ヒドロキシル酸素であり;そして
「b」酸素は第二ヌクレオチドの5’ヒドロキシル酸素である。〕
の構造を含む。
の構造を含む。ある態様において、R1はヒドロキシルである。ある他の態様において、R1は-OBzなどの保護ヒドロキシルである。ある態様において、R3は-C(O)OR5である。ある態様において、R3は-C(O)NHR6である。このような態様において、R5およびR6は、独立してメチル、エチル、イソプロピルまたはt-ブチルなどのC1-6アルキルである。ある他の態様において、R3はHである。ある態様において、R2はHである。ある態様において、R4はHである。ある態様において、Xは-CH2-である。ある他の態様において、Xは-C(O)NH-である。ある態様において、m1は2、3または4である。ある態様において、m2は1、2または3である。ある態様において、m3は1、2または3である。
ある態様において、「a」酸素は第一ヌクレオチドの3’ヒドロキシル酸素である。ある態様において、「b」酸素は第二ヌクレオチドの5’ヒドロキシル酸素である。ある他の態様において、「b」酸素は第一ヌクレオチドの3’ヒドロキシル酸素である。ある他の態様において、「a」酸素は第二ヌクレオチドの5’ヒドロキシル酸素である。
PGは弱酸性条件下で除去可能な保護基(例えば、トリチルまたはジメトキシトリチル)である。〕
のホスホロアミダイト化合物である。
本発明のある実施態様は、固定化された複数の第一鎖ポリヌクレオチドを含む固体支持体に関し、各第一鎖ポリヌクレオチドは化学開裂(例えば、ここに記載するパラジウム錯体またはニッケル錯体により)を受け得る第一開裂部位を含み、ここで、複数の第一鎖ポリヌクレオチドは5’末端で固体支持体に固定化される。
ある実施態様において、プライマー移植前の固体支持体表面は、官能化分子で被覆された領域およびコーティングがない不活性領域の両者を含む。このような実施態様のある場合において、官能化分子コーティングはヒドロゲルまたはポリマーコーティングである。被覆領域は反応部位を含むことができ、それ故に、化学結合またはハイブリダイゼーションもしくは共有結合性反応などの他の分子相互作用を介する分子の結合に使用できる。ある実施態様において、被覆領域(例えば、反応性特性、チャネル、パッド、ビーズまたはウェル)および不活性領域(間隙領域と称する)は、パターンまたは格子を形成するために交互であり得る。このようなパターンは一次元的または二次元的であり得る。ある実施態様において、不活性領域はガラス領域、金属領域、マスク領域または間隙領域またはこれらの組み合わせから選択され得る。あるいは。これらの材料は反応性領域を形成し得る。不活性または反応性は、基質で使用する化学および手順による。ある実施態様において、固体支持体表面はガラス領域を含む。他の実施態様において、表面は金属領域を含む。
SBSサイクル中、一つの取り込みしか生じないことを確実にするために、構造的修飾(「保護基」)が、1ヌクレオチドしか取り込まれないことを確実にするために、成長中の鎖に付加される各標識ヌクレオチドに付加される。保護基を有するヌクレオチドが付加された後、次いで、保護基を、配列決定されるDNAの完全性を妨害しない反応条件下、除去される。次いで、配列決定サイクルを、次の保護、標識ヌクレオチドの取り込みで継続し得る。
ここに記載するある実施態様は、検出可能標識の使用に関する。検出は、蛍光スペクトロスコピーまたは他の光学手段を含む任意の適当な方法により実施され得る。好ましい標識はフルオロフォアであり、これは、エネルギー吸収後、既定の波長で放射線を放出する。多くの適当な蛍光標識が知られる。例えば、Welch et al.(Chem. Eur. J. 5(3):951-960, 1999)は、本発明で使用できるダンシル官能化蛍光部分を開示する。Zhu et al.(Cytometry 28:206-211, 1997)は、蛍光標識Cy3およびCy5の使用を記載し、これはまた本発明でも使用され得る。試用に適する標識は、Prober et al.(Science 238:336-341, 1987); Connell et al.(BioTechniques 5(4):342-384, 1987)、Ansorge et al.(Nucl. Acids Res. 15(11):4593-4602, 1987)およびSmith et al.(Nature 321:674, 1986)にも記載される。他の市販の蛍光標識は、フルオレセイン、ローダミン(TMR、テキサスレッドおよびRoxを含む)、alexa、ボディピー、アクリジン、クマリン、ピレン、ベンズアントラセンおよびシアニンを含むが、これらに限定されない。
ここに記載するある実施態様において、修飾ヌクレオチドまたはヌクレオシドの核酸塩基を、上記のとおり検出可能標識に結合し得る。このような実施態様のある場合において、使用するリンカーは開裂可能である。開裂可能リンカーの使用は、必要であれば、標識が検出後除去され、その後取り込まれる何らかの標識ヌクレオチドまたはヌクレオシドとの何らかの干渉シグナルを回避し得ることを確実とし。
種々の開裂方法を、線形化工程における二本鎖核酸分子の一方または両方の鎖の開裂、例えばここに記載する第二鎖ポリヌクレオチドの開裂のために使用し得る。適当な開裂方法の好ましいが、限定的ではない実施態様を、下にさらに詳述する。
用語「化学開裂」は、二本鎖核酸分子の一方または両方の鎖の開裂を促進/達成するために非核酸および非酵素化学反応剤を利用する、あらゆる方法を包含する。必要であれば、二本鎖核酸分子の一方または両方の鎖は、特定の開裂部位、好ましくは予め決定され開裂部位での化学開裂反応を可能とするために、1以上の非ヌクレオチド化学部分および/または非天然ヌクレオチドおよび/または非天然主鎖結合を含み得る。一つの非限定的実施態様において、二本鎖核酸分子の一鎖は、過ヨウ素酸(例えば、過ヨウ素酸ナトリウム)での処理による開裂を可能とするジオール結合を含み得る。ジオール結合は、開裂部位に配置でき、その正確な位置は使用者により選択され得る。1を超えるジオールが開裂部位に挿入され得ることが理解される。
「非塩基部位」は、塩基成分が除かれている、ポリヌクレオチド鎖におけるヌクレオシド位置として定義される。非塩基部位は、ヌクレオシド残基の加水分解により生理的条件下でDNAに自然に生じ得るが、人工的条件下化学的にまたは酵素の作用により形成させることもできる。形成されたら、非塩基部位は開裂(例えば、エンドヌクレアーゼまたは他の一本鎖開裂酵素での処理、熱またはアルカリへの暴露)により、ポリヌクレオチド鎖の部位特異的開裂のための手段となり得る。
1以上のリボヌクレオチドの、そうしなければデオキシリボヌクレオチド(さらなる非ヌクレオチド化学部分、非天然塩基または非天然主鎖結合を伴うまたは伴わない)を含むポリヌクレオチド鎖への取り込みは、デオキシリボヌクレオチドとリボヌクレオチドの間のホスホジエステル結合の選択的開裂を可能とする化学剤を使用するまたはリボヌクレアーゼ(RNAse)開裂のための部位を提供し得る。それ故に、本発明はまた、このような化学開裂剤またはRNaseを使用する、1以上の連続リボヌクレオチドを含む部位での(二本鎖核酸分子の)一鎖の開裂による、配列決定鋳型の産生も包含する。好ましくは開裂すべき鎖は、化学開裂のための予め決定された部位を提供するための、単一リボヌクレオチドを含む。
用語「光開裂」または「光化学開裂」は、二本鎖核酸分子の一方または両方の鎖の開裂を達成するために光エネルギーを利用するあらゆる方法をいう。光化学開裂のための予め決定された部位は、二本鎖分子の鎖の一方における非ヌクレオチド化学スペーサー単位により提供され得る。適当な光化学開裂可能スペーサーは、Glen Research, Sterling, Virginia, USAにより供給される、PCスペーサーホスホロアミダイト(4-(4,4’-ジメトキシトリチルオキシ)ブチラミドメチル)-1-(2-ニトロフェニル)-エチル]-2-シアノエチル-(N,N-ジイソプロピル)-ホスホロアミダイト)を含む。スペーサー単位は、UV光源への暴露により開裂され得る。このスペーサー単位は、オリゴヌクレオチドの化学合成の標準技法を使用して、固体表面への結合を可能とするチオホスフェート基と共に、ポリヌクレオチドの5’末端に結合され得る。便利には、このスペーサー単位は、固相増幅による光開裂可能二本鎖核酸分子の合成に使用される順方向または逆方向増幅プライマーに取り込まれ得る。
他の実施態様において、二本鎖核酸を、順方向および逆方向プライマーを使用する固相増幅により合成でき、その一方は、「PCRストッパー」を含む。「PCRストッパー」は、その点を超えて複製され得ないように、増幅に使用されるポリメラーゼのリードスルー(read-through)を阻止する任意の部分(ヌクレオチドまたは非ヌクレオチド)である。その結果、PCRストッパー含有プライマーの伸長に由来する増幅鎖が、5’オーバーハング部分を含むこととなる。この5’オーバーハング(PCRストッパー自体以外)は、主に天然主鎖結合を有する天然に存在するデオキシリボヌクレオチドから構成でき、すなわち単に一本鎖DNAのストレッチであり得る。次いで、分子を一本鎖DNAの開裂に選択的であるが、二本鎖DNAはしない開裂剤(例えば、酵素)、例えばマングビーンヌクレアーゼの使用により5’オーバーハング領域で開裂され得る。
開裂部位を、ペプチド分子が核酸分子の一鎖に結合した、接合体構造の製造により、二本鎖核分子の一鎖に導入することもできる。続いてペプチド分子は、適切な特異性のペプチダーゼ酵素または非酵素化学または光化学開裂の任意の他の適当な手段により開裂され得る。一般に、ペプチドと核酸の接合体は、二本鎖核酸分子の一鎖のみへのペプチドの共有結合により形成され、ペプチド部分はこの鎖の5’末端で、固体表面への結合点に隣接して、接合される。二本鎖核酸が固相増幅により製造されるならば、ペプチド接合体は、増幅プライマーの一方の5’末端に取り込まれ得る。明らかに、このプライマーのペプチド成分はPCR増幅中に複製されず、故に、「架橋」増幅産物は、一鎖に開裂可能5’ペプチド「オーバーハング」を含む。
開裂に使用する方法の任意の実施態様において、開裂反応の産物は、固体支持体に結合していない開裂鎖の部分を除去するために、変性条件に付され得る。適当な変性条件は、標準分子生物学プロトコールを参照して、当業者である読者に明らかである(Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3rd Ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY; Current Protocols, eds., Ausubel et al.)。変性(および続く開裂鎖の再アニーリング)は、部分的にまたは実質的に一本鎖である配列決定鋳型の産生をもたらす。次いで、配列決定反応を、配列決定プライマーと鋳型の一本鎖部分のハイブリダイゼーションにより開始し得る。
ある実施態様において、ここに記載する固体支持体および方法を、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列の決定に使用し得る。このような実施態様のある場合において、方法は、(a)ポリヌクレオチドポリメラーゼと基質表面に(例えば、ここに記載するポリマーまたはゲルコーティングの何れかにより)結合した非線形化ポリヌクレオチドクラスターを接触させ;(b)1以上のヌクレオチドがポリヌクレオチドポリメラーゼにより利用されたとき、検出可能シグナルが生じるように基質の表面にヌクレオチドを提供し;(c)1以上の結合ポリヌクレオチド(または結合ポリヌクレオチドから産生された1以上のクラスター)でシグナルを検出し;そして(d)工程(b)および(c)を繰り返し、それにより基質結合ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定する工程を含み得る。
浄化HiSeq(登録商標)フローセルのシラン化
ノルボルネン官能化フローセルを、YES(Yield Engineering Systems)シラン化チャンバーまたはデシケーターを使用する化学蒸着(CVD)方法により製造する。CVD操作は、一般に60℃で1~24時間行う。
次いで、シラン化フローセルを、複数のツーリングオプションを使用して被覆および移植し得る。例えば、イルミナ配列決定のためのcBot完全自動化クローンクラスター産生システム(Illuminaから入手可能)を、これらのオプションの実施に使用し得る。典型的方法において、フローセルに先ずIPA/H2O(1:1;100μL/分、2分)を流す。次に、DI水をチャネルを通して流す(100μL/分、2分)。一定量の0.5wt%PAZAM(水性)溶液を調製する(8チャネルに十分)。ポリマーをチャネルに流す(100μL/分、2分)。PAZAMカップリング工程は、60℃で、1時間かけて完了する。この工程の完了後、次の移植工程の準備で、チャネルに水で流す。ポリマーコーティング工程完了後、フローセルは、4℃で緩衝液(例えば、食塩水-クエン酸ナトリウム(SSC)緩衝液)中保存できる。あるいは、移植工程は、PAZAMコーティング直後に完了させ得る。
このプロトコールは、cBotシステム(ILMN)を使用するHiSeq(登録商標)フローセルの移植の方法を記載する。移植方法は、アリル修飾P5配列オリゴプライマーおよびジオール修飾P7配列プライマーが約1:1比でPAZAM表面に共有結合するフローセル表面を提供する。典型的移植混合物を標準イルミナ方法に従い調製し、使用するプライマー濃度に依存する。用いる典型的プライマー濃度は約1~20μMであり、ターゲティングプライマー密度20~250000単位(蛍光カウント)である。QC工程を、cBotシステムを使用して標準イルミナ方法に従い実施し、その後Typhoon(蛍光フラットベッドスキャナー)で画像処理する。
この実施例で、修飾チミンヌクレオシドアナログを含む修飾オリゴヌクレオチドを、二本鎖対形成性質およびPCR伸長性質を妨害することなく、生物学的条件下で化学反応剤により効率的に開裂される特定の部位として使用した。
開裂効率を、高プライマー密度PAZAM表面(40~60k)で評価した。(非パターン化)HiSeq(登録商標)フローセルを、ここに記載する標準法に従い調製した。ノルボルネン由来シランを、CVD方法、続いて基質表面へのポリマー(PAZAM)のクリックカップリング、続いてポリマー表面にアリルTヌクレオシドアナログ(5’-アルキン-TTTTTTTTTXCAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT、ここで、Xは上記修飾Tヌクレオシドが取り込まれた位置を示す)を含む修飾P7オリゴを移植するための第二クリックカップリング法を使用して、基質表面に沈着させた。
上記修飾アリルTヌクレオシドが効果的開裂を受ける能力を、短配列決定ランの実施によりさらに分析した。この実験において、フローセルを、上記に準じて製造した。それ故に、アリル-T修飾P5アルキンオリゴおよび標準P7アルキンオリゴを、種々の表面プライマー密度でPAZAM被覆フローセルに移植した。効率的再合成を確実にするために、アリル修飾の位置を、修飾P5オリゴの3’末端に向けてさらにシフトさせた。SBSフローセル製作に使用した移植プライマーの配列は、次のとおり記載される。
P5:5’-アルキン-TTTTTTTTTTAATGATACGGCGACCACCGAGAXCTACAC
P7:5’-アルキン-TTTTTTTTTTCAAGCAGAAGACGGCATACGA(8-オキソG)AT
X=スキーム1に記載のとおりアリル修飾。
この実施例で、ここに記載するPd(0)線形化方法およびジオール開裂方法を、P15/P17プライマーを移植した新規タイプのフローセルで試験し、MiSeq(登録商標)(2チャネル装置として設定)で配列決定データを集め、P5/P7プライマーを移植した標準フローセルと比較し、図1に記載する酵素線形化に使用した。新規フローセルおよび標準フローセル両者ともPAZAMポリマーで被覆し、表面のプライマー密度は両タイプのプライマーで約200Kを目指した。
この実施例で、実施例1に記載したアリルTヌクレオシドを、現在のイルミナの製造ワークフローをさらに合理化するために、検出可能標識(すなわち、蛍光標識)でさらにタグ付けし得る。色素標識アリルTヌクレオシドがP5オリゴに取り込まれたら、それは、完了直後、移植反応の直接定量化を可能とする。現在の手順において、この工程は別のハイブリダイゼーションアッセイとして実施される。
モデルジヌクレオチド(C-Tom-A)の合成
この実施例で、Pd(0)錯体を製造する別法が記載され、その化学開裂活性を実施例1に記載したアリルパラジウム(II)クロライド二量体(Pd(C3H5)Cl)2およびTHPからin situで産生されたPd(0)錯体と比較した。in situで産生されたPd(0)錯体と対照的に、一部パラジウム(II)前触媒は、化学線形化反応、例えば、P15プライマーの化学開裂への使用前に製造および単離された。これらのPd(II)前触媒は単離形態では不活性であるが、便利にはTHP存在下でin situで活性Pd(0)に還元される。これらの代替Pd前触媒は生成物安定性を改善し、貯蔵寿命を延長し得る。
(Pd(C3H5)Cl)2を、窒素下、乾燥、脱気テトラヒドロフランに溶解し、テトラヒドロフラン溶液として添加した1~10当量のTHPで処理した。油状物の分離が観察され、油分を上清の傾捨により分離した。この油状物質を減圧下乾燥させて、黄色~褐色または橙色粘性油状物を得た。これらの物質は水に高度に可溶性であった。1~2当量のTHPを加えたとき、[Pd(C3H5)(THP)]Clと[Pd(C3H5)(THP)2]Clの混合物が単離され、その両者ともPd(II)錯体であった。5当量THPを加えたとき、[Pd(C3H5)(THP)2]Clのクリーンサンプルが得られた。これらの二つのPd(II)錯体を単離し、特徴づけした。10当量THPを加えたとき、P15線形化のために活性なPd(0)物質が得られた。
(Pd(C3H5)Cl)2の1当量、2当量、5当量および10当量処理で単離したTHP物質を、水性緩衝液中、10mg/mLで製剤した。P15開裂に対するこれらの製剤の活性を、HPLCベースのアッセイを使用して評価した。このアッセイにおいて、P15プライマー(10μM)溶液を、10%v/vの各製剤で処理し、10分間、38℃でインキュベートし、次いで希釈およびスピンカラム処理により反応停止させ、HPLCにより分析した。パーセンテージ開裂を、P15と開裂産物のピーク面積の比から計算する。
この実施例で、別の単離可能Pd(0)錯体Pd(THM)4を、ホスフィンリガンドトリス(ヒドロキシメチル)ホスフィン(THM)を使用して調製した。その開裂活性を、実施例1に記載したアリルパラジウム(II)クロライド二量体(Pd(C3H5)Cl)2およびTHPからin situで産生したPd(0)錯体と比較した。
この実施例で、活性Pd(0)錯体調製のための別経路を記載する。Pd(THP)2-4を、Pd(PPh3)4とTHPをリガンド交換反応により調製し、単離した。その開裂活性を、実施例1に記載したアリルパラジウム(II)クロライド二量体(Pd(C3H5)Cl)2およびTHPからin situで産生したPd(0)錯体と比較した。
窒素下、Pd(PPh3)4を乾燥、脱気ジクロロメタンに溶解して、黄色溶液を得た。THP水溶液(4.1当量)を加えて二相混合物とし、をれを2.5時間撹拌した。黄色が有機層から水層に移った。反応物を有機層を取り除き、水相をさらなるDCMで洗浄して後処理した。水相を減圧下乾燥させ、テトラヒドロフランと共蒸発させ、得られた橙色油状物を高真空下乾燥させた。収率はほぼ定量的であった。生成物LC-MS分析は、Pd(THP)2の存在を示した。[Pd(THP)2+H+;予測:523 Da, 実測:523 Da]。
Pd(THP)2-4を、水性緩衝液中、10mg/mLで製剤し、そのP15開裂活性をプレートベースのアッセイを使用して評価した。このアッセイは、P15/P17表面プライマーを移植した96ウェルプレートを使用した。挿入蛍光色素を、リード1線形化前後に存在する二本鎖DNAの定量化に使用し、パーセンテージ開裂を、残存二本鎖DNAの量から計算し得る。Pd(THP)2-4の製剤について、P15開裂活性は(Pd(C3H5)Cl)2(6mM)、THP(60mM)およびアスコルビン酸ナトリウム(6mM)からin situで調製したPd混合物と同等であった(図7)。この2つの方法は、同等な開裂性能を有したことが観察された。
この実施例で、別のニッケルベースの化学開裂剤を調製し、アリルdTヌクレオチド含有DNA鎖の開裂において試験した。
この実施例で、亜ジチオン酸ナトリウム(Na2S2O4)水溶液による化学線形化のための生体直交型開裂可能リンカーとしての、別のアゾ-アレーンベースのリンカーを記載する。
さらに、本発明は次の態様を包含する。
1. 複数の固定化二本鎖ポリヌクレオチドを線形化する方法であって、
二本鎖ポリヌクレオチドを含む固体支持体を用意し、各二本鎖ポリヌクレオチドは第一鎖および第二鎖を含むものであり、ここで、第一鎖および第二鎖はその5’末端で固体支持体に固定化され、ここで、各第一鎖は遷移金属錯体による化学開裂を受けることができる第一開裂部位を含み、ここで、遷移金属錯体はパラジウム錯体またはニッケル錯体であり;
二本鎖ポリヌクレオチドと遷移金属錯体の水溶液を接触させ、それにより第一開裂部位で1以上の第一鎖を開裂し、1以上の開裂第一核酸および開裂固定化第一鎖を産生し;そして
固体支持体から開裂第一核酸を除去する
ことを含む、方法。
2. 各第一鎖が固体支持体に固定化された第一伸長プライマーから伸長する、項1に記載の方法。
3. 第一伸長プライマーが第一開裂部位を含む、項2に記載の方法。
4. 第一伸長プライマーがP5配列または修飾P5配列を含む、項2または3に記載の方法。
5. 第一開裂部位が遷移金属錯体により化学開裂を受けることができる修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチド部分を含む、項1~4の何れかに記載の方法。
6. 修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチド部分がアリル基を含む、項5に記載の方法。
7. 第一開裂部位が式(II’):
の構造を有する修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチド部分を含む、項5または6に記載の方法。
8. 修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチド部分がチミン塩基を有する、項5~7の何れかに記載の方法。
9. 遷移金属錯体がパラジウム(0)錯体である、項1~8の何れかに記載の方法。
10. パラジウム(0)錯体がPd(THP) 2 、Pd(THP) 4 、Pd(THM) 4 またはこれらの組み合わせである、項9に記載の方法。
11. パラジウム(0)錯体がin situで産生される、項9に記載の方法。
12. パラジウム(0)錯体が、1以上のパラジウム(II)化合物をトリス(ヒドロキシプロピル)ホスフィン(THP)と混合することにより産生され、ここで、パラジウム(II)化合物がNa 2 PdCl 4 、(PdアリルCl) 2 、[Pdアリル(THP)]Clおよび[Pdアリル(THP) 2 ]Clからなる群から選択される、項11に記載の方法。
13. パラジウム(0)錯体が、Pd(PPh 3 ) 4 をトリス(ヒドロキシプロピル)ホスフィンと混合することにより産生される、項11に記載の方法。
14. 遷移金属錯体がニッケル(0)錯体である、項1~8の何れかに記載の方法。
15. ニッケル(0)錯体がニッケル(II)化合物からin situで産生される、項14に記載の方法。
16. 各開裂固定化第一鎖の3’末端が保護基を含む、項1~15の何れかに記載の方法。
17. 保護基が式(I):
R 1 が-NH 2 、-OH、-NHC(O)OR a または-OCH 2 OSi(R b ) 3 であり;
R a がC 1-4 アルキル、tert-ブチル、アリル、ベンジル基または9-フルオレニルメチルであり;
各R b が独立してC 1-4 アルキルおよびフェニルからなる群から選択され;そして
R 2 がH、C 1-4 アルキル、場合により置換されているテトラヒドロフランまたはヌクレオチドである。〕
の構造を有する3’末端ホスフェート部分である、項16に記載の方法。
18. 各第二鎖が固体支持体に固定化された第二伸長プライマーから伸長され、各第二鎖が第二開裂部位を含む、項1~17の何れかに記載の方法。
19. 第二伸長プライマーが第二開裂部位を含む、項18に記載の方法。
20. 第二開裂部位がパラジウム錯体またはニッケル錯体による化学開裂を受けることができない、項18または19に記載の方法。
21. 第二伸長プライマーがP7ヌクレオチド配列または修飾P7ヌクレオチド配列またはP17ヌクレオチド配列を含む、項18~20の何れかに記載の方法。
22. 第二開裂部位が化学開裂、光開裂、酵素開裂およびこれらの組み合わせからなる群から選択される方法により開裂される、項18~21の何れかに記載の方法。
23. 第二開裂部位が化学開裂により開裂され、ここで、第二開裂部位がジオールリンカーまたはアゾベンゼンリンカーを含む、項22に記載の方法。
24. ジオールリンカーが式(VIII):
rが2、3、4、5または6であり;そして
sが2、3、4、5または6である。〕
の構造を含む、項23に記載の方法。
25. ジオールリンカーが過ヨウ素酸塩により開裂され得る、項24に記載の方法。
26. アゾベンゼンリンカーが式(X):
R 1 がH、ヒドロキシルまたは保護ヒドロキシルであり;
R 2 がH、C 1-6 アルキルまたはC 1-6 アルコキシであり;
各R 3 およびR 4 が独立してH、ハロ、-C(O)OR 5 または-C(O)NHR 6 であり;
各R 5 およびR 6 が独立してH、C 1-6 アルキルまたはC 6-10 アリールであり;
Xが-C(O)-、-CH 2 -または-C(O)NH-であり;そして
各m1、m2およびm3が独立して1、2、3、4、5または6である。〕
の構造を含む、項23に記載の方法。
27. アゾベンゼンリンカーがNa 2 S 2 O 4 により開裂され得る、項26に記載の方法。
28. 第二開裂部位が酵素開裂により開裂される、項22に記載の方法。
29. 二本鎖ポリヌクレオチドが共有結合により固体支持体に固定化される、項1~28の何れかに記載の方法。
30. 複数の固定化二本鎖ポリヌクレオチドを線形化する方法であって、
二本鎖ポリヌクレオチドを含む固体支持体を用意し、各二本鎖ポリヌクレオチドが第一鎖および第二鎖を含み、ここで、第一鎖および第二鎖がその5’末端で固体支持体に固定化され、ここで、各第一鎖が第一開裂部位を含み、ここで、各第二鎖がアゾベンゼンリンカーを含む第二開裂部位を含み;
第一開裂部位で1以上の第一鎖を開裂し、1以上の開裂第一核酸および開裂固定化第一鎖を産生し;
固体支持体から開裂第一核酸を除去し;
固定化第二鎖を配列決定し;
第二鎖に相補的な誘導体第一鎖を再合成し;そして
第二開裂部位で1以上の第二鎖を開裂し、1以上の開裂第二核酸および開裂固定化第二鎖を産生する
ことを含む、方法。
31. 各第一鎖が固体支持体に固定化された第一伸長プライマーから伸長され、ここで、第一伸長プライマーが第一開裂部位を含む、項30に記載の方法。
32. 第一開裂部位が化学開裂、光開裂、酵素開裂およびこれらの組み合わせからなる群から選択される方法により開裂される、項30または31に記載の方法。
33. 各第二鎖が固体支持体に固定化された第二伸長プライマーから伸長され、ここで、第二伸長プライマーが第二開裂部位を含む、項30~32の何れかに記載の方法。
34. アゾベンゼンリンカーが式(X):
R 1 がH、ヒドロキシルまたは保護ヒドロキシルであり;
R 2 がH、C 1-6 アルキルまたはC 1-6 アルコキシであり;
各R 3 およびR 4 が独立してH、ハロ、-C(O)OR 5 または-C(O)NHR 6 であり;
各R 5 およびR 6 が独立してH、C 1-6 アルキルまたはC 6-10 アリールであり;
Xが-C(O)-、-CH 2 -または-C(O)NH-であり;そして
各m1、m2およびm3が独立して1、2、3、4、5または6である。〕
の構造を含む、項30~33の何れかに記載の方法。
35. アゾベンゼンリンカーをNa 2 S 2 O 4 により開裂する、項30~34の何れかに記載の方法。
36. 固定化第二鎖の配列決定が、固定化第二鎖に相補的な標識ヌクレオチドを連続的に取り込み、標識ヌクレオチドを検出することを含む、項30~35の何れかに記載の方法。
37. 各開裂固定化第一鎖の3’末端が保護基を含む、項30~36の何れかに記載の方法。
38. 3’末端開裂固定化第一鎖の保護基が誘導体第一鎖の再合成前に脱保護される、項37に記載の方法。
39. さらに固体支持体から開裂第二核酸を除去し、誘導体第一鎖を配列決定することを含む、項30~38の何れかに記載の方法。
40. オリゴヌクレオチドから3’末端保護基を除去する方法であって、
5’末端で固定化された複数のオリゴヌクレオチドを含む固体支持体を用意し、ここで、オリゴヌクレオチドは各式(I)
R 1 が-NH 2 、-OH、-NHC(O)OR a または-OCH 2 OSi(R b ) 3 であり;
R a がC 1-4 アルキル、tert-ブチル、アリル、ベンジル基または9-フルオレニルメチルであり;
各R b が独立してC 1-4 アルキルおよびフェニルからなる群から選択され;そして
R 2 がH、C 1-4 アルキル、場合により置換されているテトラヒドロフランまたはヌクレオチドである。〕
の構造を有する3’末端保護基を含み;そして
オリゴヌクレオチドと脱保護剤を接触させ、それにより、3’末端保護基を開裂して、各々遊離3’末端ヒドロキシル基を有するオリゴヌクレオチドを産生する
ことを含む、方法。
41. R 1 が-OCH 2 OSi(R b ) 3 である、項40に記載の方法。
42. 各R b がイソプロピルである、項41に記載の方法。
43. R 2 がヌクレオチドである、項40~42の何れかに記載の方法。
44. 脱保護剤がフッ化物イオンまたは塩基を含む、項40~43の何れかに記載の方法。
45. 脱保護剤がテトラ-n-ブチルアンモニウムフルオライド(TBAF)、HF、NH 4 F、CsF、NaOHおよびKOHおよびこれらの組み合わせからなる群から選択される、項44に記載の方法。
46. 固定化された複数の第一鎖ポリヌクレオチドを含む固体支持体であって、各第一鎖ポリヌクレオチドが遷移金属錯体による化学開裂を受けることができる第一開裂部位を含み;ここで、遷移金属錯体がパラジウム錯体またはニッケル錯体であり、ここで、複数の第一鎖ポリヌクレオチドがその5’末端で固体支持体に固定化されるものである、固体支持体。
47. 各第一鎖ポリヌクレオチドが固体支持体に固定化された第一伸長プライマーを含む、項46に記載の固体支持体。
48. 第一伸長プライマーが第一開裂部位を含む、項47に記載の固体支持体。
49. 第一伸長プライマーがP5配列または修飾P5配列を含む、項47または48に記載の固体支持体。
50. 第一開裂部位がパラジウム錯体またはニッケル錯体による化学開裂を受けることができる修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドを含む、項46~49の何れかに記載の固体支持体。
51. 修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドがアリル基を含む、項50に記載の固体支持体。
52. 第一開裂部位が式(II’):
の構造を有する修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドを含む、項51に記載の固体支持体。
53. 修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドがチミン塩基を含む、項50~52の何れかに記載の固体支持体。
54. 第一伸長プライマーがP15配列を含む、項50~53の何れかに記載の固体支持体。
55. パラジウム錯体がパラジウム(0)錯体である、項46~54の何れかに記載の固体支持体。
56. パラジウム錯体が1以上のパラジウム(II)化合物とトリス(ヒドロキシプロピル)ホスフィン(THP)の混合によりin situで産生され、ここで、パラジウム(II)化合物がNa 2 PdCl 4 、(PdアリルCl) 2 、[Pdアリル(THP)]Clおよび[Pdアリル(THP) 2 ]Clからなる群から選択される、項55に記載の固体支持体。
57. パラジウム(0)錯体がPd(PPh 3 ) 4 とトリス(ヒドロキシプロピル)ホスフィンの混合により産生される、項55に記載の固体支持体。
58. 遷移金属錯体がニッケル(0)錯体である、項46~54の何れかに記載の固体支持体。
59. ニッケル(0)錯体がニッケル(II)化合物からin situで産生される、項58に記載の固体支持体。
60. 第一開裂部位が化学開裂後3’遮断部分を産生する、項46~59の何れかに記載の固体支持体。
61. 3’遮断部分が式(I):
R 1 が-NH 2 、-OH、-NHC(O)OR a または-OCH 2 OSi(R b ) 3 であり;
R a がC 1-4 アルキル、tert-ブチル、アリル、ベンジル基または9-フルオレニルメチルであり;
各R b が独立してC 1-4 アルキルおよびフェニルからなる群から選択され;そして
R 2 がH、C 1-4 アルキル、場合により置換されているテトラヒドロフランまたはヌクレオチドである。〕
の構造を有するホスフェート部分を含む、項60に記載の固体支持体。
62. 式(I)の構造が式(V):
により表される、項61に記載の固体支持体。
63. R 1 が-OCH 2 OSi(R b ) 3 である、項61または62に記載の固体支持体。
64. R b がイソプロピルである、項63に記載の固体支持体。
65. 3’遮断部分が酵素反応または化学反応により除去され得る、項60~64の何れかに記載の固体支持体。
66. さらに固定化された複数の第二鎖ポリヌクレオチドを含み、各第二鎖ポリヌクレオチドが第二開裂部位を含み、ここで、複数の第二鎖ポリヌクレオチドがその5’末端で固体支持体に固定化される、項46~65の何れかに記載の固体支持体。
67. 各第二鎖ポリヌクレオチドが固体支持体に固定化された第二伸長プライマーを含む、項66に記載の固体支持体。
68. 第二伸長プライマーが第二開裂部位を含む、項67に記載の固体支持体。
69. 第二開裂部位がパラジウム錯体またはニッケル錯体による化学開裂を受けることができない、項66~68の何れかに記載の固体支持体。
70. 第二開裂部位が化学開裂、光開裂、酵素開裂およびこれらの組み合わせからなる群から選択される方法により開裂され得る、項66~69の何れかに記載の固体支持体。
71. 第二開裂部位が化学開裂により開裂され、ここで、第二開裂部位がジオールリンカーまたはアゾベンゼンリンカーを含む、項70に記載の固体支持体。
72. ジオールリンカーが式(VIII):
rが2、3、4、5または6であり;そして
sが2、3、4、5または6である。〕
の構造を含む、項71に記載の固体支持体。
73. アゾベンゼンリンカーが式(X):
R 1 がH、ヒドロキシルまたは保護ヒドロキシルであり;
R 2 がH、C 1-6 アルキルまたはC 1-6 アルコキシであり;
各R 3 およびR 4 が独立してH、ハロ、-C(O)OR 5 または-C(O)NHR 6 であり;
各R 5 およびR 6 が独立してH、C 1-6 アルキルまたはC 6-10 アリールであり;
Xが-C(O)-、-CH 2 -または-C(O)NH-であり;そして
各m1、m2およびm3が独立して1、2、3、4、5または6である。〕
の構造を含む、項71に記載の固体支持体。
74. 第二伸長プライマーがP7ヌクレオチド配列、修飾P7ヌクレオチド配列またはP17ヌクレオチド配列を含む、項67~70の何れかに記載の固体支持体。
75. 第一および第二鎖ポリヌクレオチドが固体支持体表面上のポリマーまたはヒドロゲルコーティングとの共有結合を経て固体支持体に固定化される、項66~74の何れかに記載の固体支持体。
76. ポリマーまたはヒドロゲルコーティングがPAZAMを含む、項75に記載の固体支持体。
77. 固体支持体がフローセルを含む、項46~76の何れかに記載の固体支持体。
78. 式(II):
RがH、OHまたはOPGであり;
R 1 がHまたはPGであり;
R 2 がH、PGであるかまたは-OR 2 がホスフェートであり;
PGがヒドロキシル保護基であり;そして
塩基がアデニン、グアニン、シトシン、チミンまたはウラシルまたはその誘導体である。〕
の構造を含む、修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチド。
79. 式(IIa):
80. 塩基がチミンである、項78または79に記載の修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチド。
81. 項79または80に記載の修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドを含む、オリゴヌクレオチド。
82. オリゴヌクレオチドが式(III):
83. オリゴヌクレオチドの5’末端(アスタリスクの位置)が固体支持体に結合している、項81または82に記載のオリゴヌクレオチド。
84. 式(I):
R 1 が-NH 2 、-OH、-NHC(O)OR a または-OCH 2 OSi(R b ) 3 であり;
R a がC 1-4 アルキル、tert-ブチル、アリル、ベンジル基または9-フルオレニルメチルであり;
各R b が独立してC 1-4 アルキルおよびフェニルからなる群から選択され;そして
R 2 がH、C1-4アルキル、場合により置換されているテトラヒドロフランまたはヌクレオチドである。〕
の構造の3’遮断部分を含む、ヌクレオシドまたはヌクレオチド。
85. 式(I)の構造が式(V):
によっても表される、項84に記載のヌクレオシドまたはヌクレオチド。
86. R 1 が-OCH 2 OSi(R b ) 3 である、項84または85に記載のヌクレオシドまたはヌクレオチド。
87. R b がイソプロピルである、項86に記載のヌクレオシドまたはヌクレオチド。
88. 項84~87の何れかに記載のヌクレオチドを含む、オリゴヌクレオチド。
89. 式(VI):
Claims (21)
- 各第一鎖が固体支持体に固定化された第一伸長プライマーを含む、請求項1に記載の固体支持体。
- 第一伸長プライマーが第一開裂部位を含む、請求項2に記載の固体支持体。
- 第一伸長プライマーが配列番号1または3に示す配列を有するP5配列を含む、請求項2または3に記載の固体支持体。
- 第一開裂部位がパラジウム錯体またはニッケル錯体により化学開裂を受けることができる修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドを含む、請求項1~4の何れかに記載の固体支持体。
- 修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドがアリル基を含む、請求項5に記載の固体支持体。
- 式(I):
R1が-NH2、-OH、-NHC(O)ORaまたは-OCH2OSi(Rb)3であり;
RaがC1-4アルキル、tert-ブチル、アリル、ベンジル基または9-フルオレニルメチルであり;
各Rbが独立してC1-4アルキルおよびフェニルからなる群から選択され;そして
R2がH、C1-4アルキル、テトラヒドロフランまたはヌクレオチドである。〕
または
式(V):
R1が-NH2、-OH、-NHC(O)ORaまたは-OCH2OSi(Rb)3であり;
RaがC1-4アルキル、tert-ブチル、アリル、ベンジル基または9-フルオレニルメチルであり;
各Rbが独立してC1-4アルキルおよびフェニルからなる群から選択され;そして
塩基がアデニン、グアニン、シトシン、チミンまたはウラシルまたはその誘導体である。〕
の構造を有するホスフェート部分を含む3’遮断部分を含む固体支持体であって、請求項1~6の何れかに記載の固体支持体の第一開裂部位の開裂により産生される、固体支持体。 - 式(I)におけるR2のテトラヒドロフランが置換されている、請求項7に記載の固体支持体。
- 式(V)における塩基が保護されている、請求項7に記載の固体支持体。
- 固体支持体に固定化された請求項1~9の何れかに記載の第二鎖を含み、各第二鎖が第二開裂部位を含む、請求項7~9の何れかに記載の固体支持体。
- 第二鎖が固体支持体に固定化された第二伸長プライマーを含む、請求項10に記載の固体支持体。
- 第二伸長プライマーが第二開裂部位を含む、請求項11に記載の固体支持体。
- 第二開裂部位がパラジウム錯体またはニッケル錯体による化学開裂を受けることができない、請求項10~12の何れかに記載の固体支持体。
- 第二開裂部位が化学開裂により開裂されているものである、請求項10~12の何れかに記載の固体支持体。
- 第二開裂部位がジオールリンカーまたはアゾベンゼンリンカーを含む、請求項10~12の何れかに記載の固体支持体。
- 固体支持体に固定化された複数の二本鎖ポリヌクレオチドを線形化する方法であって、
請求項1~6の何れかに記載の固体支持体を用意し;
二本鎖ポリヌクレオチドを遷移金属錯体の水溶液と接触させ、それにより第一開裂部位で1以上の第一鎖を開裂し、1以上の開裂第一核酸および開裂固定化第一鎖を産生し;そして
固体支持体から開裂第一核酸を除去する
ことを含む、方法。 - 遷移金属錯体がパラジウム(0)錯体またはニッケル(0)錯体である、請求項16に記載の方法。
- パラジウム(0)錯体がPd(THP)2、Pd(THP)4、Pd(THM)4またはこれらの組み合わせである、請求項17に記載の方法。
- パラジウム(0)錯体がin situで産生される、請求項17または18に記載の方法。
- ニッケル(0)錯体がニッケル(II)化合物からin situで産生される、請求項17に記載の方法。
- 第二開裂部位が化学開裂、光開裂、酵素開裂およびこれらの組み合わせからなる群から選択される方法により開裂される、請求項10~13および15の何れかに記載の固体支持体。
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