JPH08508513A

JPH08508513A - リン含有共有結合をつくる方法およびその中間体

Info

Publication number: JPH08508513A
Application number: JP7505881A
Authority: JP
Inventors: ラヴィクマール，ヴァスリンガ; マルヴェイ，デニス; コール，ダグラス・エル; クック，フィリップ・ダン
Original assignee: Isis Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Ionis Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1993-07-29
Filing date: 1994-07-20
Publication date: 1996-09-10
Anticipated expiration: 2013-06-04
Also published as: EP0711301A4; US6124450A; CA2167671A1; JP2761439B2; EP0711301A1; US5614621A; WO1995004065A1; US5847106A

Abstract

(57)【要約】置換シリルアルキルホスホルアミダイトがホスフェート、ホスホロチオエートおよび他のリン含有共有結合をつくるためのカップリング試薬として働く合成方法を提供する。また、そのような方法に有用な合成中間体を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】リン含有共有結合をつくる方法およびその中間体発明の分野本発明は、ホスフェート、ホスホロチオエートおよび他のリン含有共有結合をつくる新規な方法に関する。本発明はさらに、そのような方法に有用な新規な合成中間体に関する。発明の背景化学文献には、リン含有共有結合によりヌクレオシドをカップリングして、定められた配列のオリゴヌクレオチドを生成する多くの方法が記載されている。最も一般的な方法の１つはホスホルアミダイト法（例えば、Ｂｅａｕｃａｇｅ等、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ１９９２、４８、２２２３およびその引用文献を参照）であり、この方法では、遊離ヒドロキシル基を有するヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドを保護されたシアノエチルホスホルアミダイト単量体と弱酸の存在下で反応させて、ホスファイト結合構造を形成する。ホスファイト結合を酸化し、その後シアノエチル基を加水分解すると、所望のホスフェートまたはホスホロチオエートが生じる。しかしながら、ホスホルアミダイト法には欠点がないわけではない。例えば、シアノエチルホスホルアミダイト単量体はたいへん高価である。かなりの量の単量体は一般的なホスホルアミダイトカップリングにおいて未反応となり、未反応単量体を回収することができるとしても、それは非常に難しいことである。また、ホスフェート基上のシアノエトキシ基の脱保護の副生成物であるアクリロニトリルは発癌性物質であり、場合によってはミハエルアクセプターとして作用して不所望な副生成物を生成する。従って、当業界ではこれらの問題を解消する合成方法が望まれている。本発明の目的本発明の目的は、ホスフェート、ホスホロチオエートおよび他のリン含有共有結合をつくる方法を提供することである。本発明の別の目的は、自動制御に適応することができる方法を提供することである。さらに別の目的は、そのような方法において有用な出発物質および合成中間体を提供することである。また別の目的は、さらに使用するために回収および再循環が可能な出発物質および反応生成物を提供することである。さらにまた別の目的は、反応生成物に立体特異性をもたらす方法を提供することである。発明の概要これらおよび他の目的は、置換シリルアルキルホスホルアミダイトカップリング試薬を用いることによってリン含有共有結合をつくる方法を提供する本発明によって達成される。好ましい具体例では、非ラセミ生成物は、式Ｉの保護されたヌクレオシドを式［（Ｒ_N）₂Ｎ］₂ＰＯ（ＣＨ₂）xＳｉ（Ｒ_S）₃のカップリング試薬と、式IIのシリルアルキルホスホルアミダイト単量体を形成するのに有効な時間および反応条件下で接触させることを含む方法によって製造される：（式中、各Ｑは、独立して、Ｏ、Ｓ、ＣＨ₂、ＣＨＦまたはＣＦ₂であり；各Ｂ_Xは、独立して、ヌクレオシド塩基であり；各Ｘは、独立して、Ｈ、ＯＨ、アルキル、置換アルキル、アルカリールもしくはアラルキル、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ₃、ＯＣＦ₃、ＯＣＮ、Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキル、Ｎ−アルキル、Ｏ−アルケニル、Ｓ−アルケニル、Ｎ−アルケニル、ＳＯＣＨ₃、ＳＯ₂ＣＨ₃、ＯＮＯ₂、ＮＯ₂、Ｎ₃、ＮＨ₂、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリール、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノもしくは置換シリル、ＲＮＡ開裂基、オリゴヌクレオチドの薬物動力学的特性を改善するための基、またはオリゴヌクレオチドの薬力学的特性を改善するための基であり；Ｒ_HPはヒドロキシル保護基であり；各Ｒ_Nは、独立して、炭素原子数１−約１０のアルキルであり；各Ｒ_Sは、独立して、炭素原子数１−約１０のアルキルまたは炭素原子数６− 約１０のアリールであり；そしてｘは１−約７である）。そのような単量体をその後、式（III）（（Ｐ）＝固体支持体）の支持体結合ヌクレオシドと、式IVの支持体結合ホスファイト２量体を形成するのに有効な時間および反応条件下で接触させる。式IVの２量体を酸化剤と、式Ｖ（Ｚ＝ＯまたはＳ）の酸化生成物を形成するのに有効な時間および反応条件下で接触させ、これらを水性塩基と接触させて、溶液相シリル反応生成物を形成する。これらの反応生成物を弗化物イオンで処理して、式VIのホスフェートおよびホスホロチオエート２量体を生成する。発明の詳細な説明本発明は、リン含有共有結合をつくる新規で改良された方法およびそのような方法において有用な中間体を提供する。これらの方法および中間体を用いると、ホスフェートおよびホスホロチオエートオリゴヌクレオチドが多くのヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドサブユニットから製造される。ヌクレオシドサブユニットは「天然」部分でも「合成」部分でもよい。従って、本発明では、「オリゴヌクレオチド」という用語は第１に多数の結合ヌクレオシド単位から生成されたポリヌクレオチドを意味する。ヌクレオシドは天然由来の塩基およびペントフラノシル糖基から生成される。従って、「オリゴヌクレオチド」という用語には事実上、天然由来種および天然由来サブユニットから生成された合成種が含まれる。本発明によるオリゴヌクレオチドはまた修飾サブユニットを含んでいてもよい。代表的な修飾にはヌクレオシドの複素環式塩基部分またはヌクレオシドの糖部分の修飾が含まれる。修飾の例については次の米国特許出願に記載されている：ＲＮＡ活性を検出および調節する組成物および方法（ＣｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎＡｎｄＭｅｔｈｏｄＦｏｒＤｅｔｅｃｔｉｎｇＡｎｄＭｏｄｕｌａｔｉｎｇＲＮＡＡｃｔｉｖｉｔｙ）と題する１９９０年１月１１日付第４６３，３５８号；遺伝子発現を検出および調節する糖修飾オリゴヌクレオチド（ＳｕｇａｒＭｏｄｉｆｉｅｄＯｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓＴｈａｔＤｅｔｅｃｔＡｎｄＭｏｄｕｌａｔｅＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）と題する１９９０年８月１３日付第５６６，９７７号；新規なポリアミン共役オリゴヌクレオチド（ＮＯｖｅｌＰｏｌｙａｍｉｎｅＣｏｎｊｕｇａｔｅｄＯｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ）と題する１９９０年７月２７日付第５５８，６６３号；遺伝子発現を検出および調節するヌクレアーゼ抵抗性ピリミジン修飾オリゴヌクレオチド（ＮｕｃｌｅａｓｅＲｅｓｉｓｔａｎｔＰｙｒｉｍｉｄｉｎｅＭｏｄｉｆｉｅｄＯｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓＴｈａｔＤｅｔｅｃｔＡｎｄＭｏｄｕｌａｔｅＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）と題する１９９１年７月２７日付第５５８，８０６号；およびＲＮＡ活性を検出および調節する組成物および方法（ＣｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎＡｎｄＭｅｔｈｏｄＦｏｒＤｅｔｅｃｔｉｎｇＡｎｄＭｏｄｕｌａｔｉｎｇＲＮＡＡｃｔｉｖｉｔｙ）と題する１９９１年１月１１日付第ＰＣＴ／ＵＳ９１／００２４３号。これらの各特許出願は本発明の譲受人に譲渡されている。これらの記載は参照することによってここに記載されたものとする。従って、オリゴヌクレオチドという用語は、天然の塩基および天然の糖と同様な機能をする修飾糖部分または修飾塩基部分である修飾部分を含めた構造を意味する。代表的な修飾塩基には、天然プリンおよびピリミジン塩基の代わりに用いられるデアザまたはアザプリンおよびピリミジン；５または６位置に置換基を有するピリミジン；２、６または８位置に変更または交換された置換基を有するプリンが含まれる。代表的な修飾糖には炭素環式または非環式糖、２′位置に置換基を有する糖、および糖の１つ以上の水素原子の代わりに置換基を有する糖が含まれる。他の変更された塩基部分および変更された糖部分については米国特許第３，６８７，８０８号およびＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ８９／０２３２３号に記載がある。変更塩基部分または変更糖部分にはまた、本発明の精神と一致する他の修飾が含まれる。そのようなオリゴヌクレオチドは、天然由来のまたは野生型の合成オリゴヌクレオチドと構造的に区別できるが機能的に交換することができる部分として記載するのがもっともよい。そのようなオリゴヌクレオチドの全ては、所望のＲＮＡまたはＤＮＡ鎖構造をまねるのに効果的に作用する限りは本発明に包含される。アンチセンス方法論で用いる場合、本発明のオリゴヌクレオチドは約１０−約３０個のサブユニットを含むことが好ましい。そのようなオリゴヌクレオチドは約１５−約２５のサブユニットを含むことがさらに好ましい。明らかなように、サブユニットは、リン含有結合を介して隣接サブユニットに適当に結合した塩基と糖の組み合わせである。オリゴヌクレオチドの結合に「構成ブロック」として用いられるとき、さらに小さな集まりであるのが好ましい。本発明のオリゴヌクレオチドを用いて調節されるべきＲＮＡまたはＤＮＡ部分は、生成または活性が調節されるべきタンパク質をコードするＤＮＡまたはＲＮＡの部分を含むように予め選択することが好ましい。従って、用いる組成物の標的部分は、ＤＮＡまたはＲＮＡの予め選択した部分に相補的であるように、すなわちその部分に対してアンチセンスオリゴヌクレオチドであるように選択する。本発明の好ましい具体例では、本発明の化合物はｔａｔタンパク質をコードするＨＩＶｍＲＮＡに対してまたはＨＩＶｍＲＮＡのＴＡＲ領域にハイブリダイズする。別の好ましい具体例では、化合物はＨＩＶｍＲＮＡのＴＡＲ領域の二次構造をまね、そしてそのようにすることによってｔａｔタンパク質を結合する。他の好ましい化合物はヘルペス、乳頭腫および他のウイルスの配列に相補的である。本発明のオリゴヌクレオチドは、診断、治療に、そして研究試薬およびキットとして用いることができる。これらは適当な薬学的に許容される希釈剤または担体を含めることによって医薬組成物中において用いることができる。これらはさらに、タンパク質の不所望な生成を特徴とする疾患を有する生物の治療に用いることができる。生物を、不所望なタンパク質をコード化する核酸の鎖と特異的にハイブリダイズしうる配列を有するオリゴヌクレオチドと接触させなければならない。この種の治療は単細胞原核生物および真核生物から多細胞真核生物までの様々な生物に実施することができる。ＤＮＡ−ＲＮＡ転写またはＲＮＡ−タンパク翻訳をその遺伝、代謝または細胞コントロールの基本部分として用いるどのような生物も、本発明に従って治療および／または予防処置を行うことができる。バクテリア、イースト、原生動物、藻類、全ての植物、および温血動物を含む全ての高等動物のような見かけ上異なる生物を治療することができる。さらに、多細胞真核生物の各細胞は、ＤＮＡ−ＲＮＡ転写およびＲＮＡ−タンパク翻訳をそれらの細胞活性の不可欠な部分として含んでいるので、これらを治療することができる。さらに、真核生物細胞の多くの小器官（例えば、ミトコンドリアおよび葉緑体）も転写および翻訳機構を含む。従って、単細胞、細胞集団または小器官も、治療または診断用オリゴヌクレオチドで治療することができる生物の定義に含めることができる。ここで用いる治療は、生物を殺すことによって、あるいは一定しないもしくは有害な細胞の成長または発現を制御することによって、疾病状態をなくすことを包含する。１つの態様において、本発明は、式Ｉの保護されたヌクレオシドを、式［（Ｒ_N ）₂Ｎ］₂ＰＯ（ＣＨ₂）xＳｉ（Ｒ_S）₃のカップリング試薬と、式IIのシリルアルキルホスホルアミダイト単量体を形成するのに有効な時間および条件下で接触させる合成方法に関する。そのような接触は、１Ｈ−テトラゾール、５−（４−ニトロフェニル）−１Ｈ− テトラゾールまたはジイソプロピルアミノテトラゾリドのような弱酸の存在下、無水条件で行う。ＱはＳ、ＣＨ₂、ＣＨＦ、ＣＦ₂または好ましくはＯである。例えば、Ｓｅｃｒｉｓｔ等、アブストラクト２１、４′−チオヌクレオシドの合成および生物学的活性（ＳｙｎｔｈｅｓｉｓａｎｄＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＡｃｔｉｖｉｔｙｏｆ４′−Ｔｈｉｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ）、Ｐｒｏｇｒａｍ＆Ａｂｓｔｒａｃｔｓ，ＴｅｎｔｈＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＲｏｕｎｄｔａｂｌ e，ＮｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓａｎｄｔｈｅｉｒＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎs，ＰａｒｋＣｉｔy，Ｕｔａｈ，Ｓｅｐｔ．１６−２０，１９９２を参照。各Ｑは独立して選択され、従って、ある１つの化合物中の他のＱと同じものでも異なるものでもよい。Ｂ_Xはアデニン、グアニン、ウラシル、チミン、シトシン、２−アミノアデノシンまたは５−メチルシトシンから選択されるヌクレオシド塩基であるが、他の非天然由来の種を用いて、例えばＤＮＡと安定な二重鎖または三重鎖を形成してもよい。代表的な塩基は米国特許第３，６８７，８０８号（Ｍｅｒｉｇａｎ等）に記載されており、これらの記載は参照することによってここに記載されたものとする。ＸはＨ、ＯＨ、アルキル、置換アルキル、アルカリールまたはアラルキル、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ₃、ＯＣＦ₃、ＯＣＮ、Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキル、Ｎ−アルキル、Ｏ−アルケニル、Ｓ−アルケニル、Ｎ−アルケニル、ＳＯＣＨ₃ 、ＳＯ₂ＣＨ₃、ＯＮＯ₂、ＮＯ₂、Ｎ₃、ＮＨ₂、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリール、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノまたは置換シリル、ＲＮＡ開裂基、オリゴヌクレオチドの薬物動力学的特性を改善する基、またはオリゴヌクレオチドの薬力学的特性を改善する基である。「アルキル」という用語は、分枝鎖および直鎖炭化水素残基を意味し、１つ以上の³Ｈおよび／または¹⁴Ｃ原子を有するアルキル基を含む。ＸはＨまたはＯＨ、あるいは特にＱがＯである場合、Ｆ、Ｏ−アルキルまたはＯ−アルケニルであるのが好ましい。好ましいアルキルおよびアルケニル基の炭素原子数は１−約１０である。Ｒ_HPはどのようなヒドロキシル保護基でもよい。Ｒ_HPは塩基性条件下で安定であるが酸性条件下で除去しうることが好ましい。本発明の方法では広い範囲の保護基を用いることができる。一般に、保護基は化学官能性を特定の反応条件に対して不活性にし、分子の残りを実質的に損なうことなくそのような官能性に付加したり、それから除くことができる。代表的な保護基はＢｅａｕｃａｇｅ等、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ１９９２，４８，２２２３に記載されている。好ましい保護基は、例えばジメトキシトリチル（ＤＭＴｒ）、モノメトキシトリチル、９ −フェニルキサンテン−９−イル（Ｐｉｘｙｌ）および９−（ｐ−メトキシフェニル）キサンテン−９−イル（Ｍｏｘ）である。式［（Ｒ_N）₂Ｎ］₂ＰＯ（ＣＨ₂）xＳｉ（Ｒ_S）₃のカップリング試薬は、式ＨＯ（ＣＨ₂）xＳｉ（Ｒ_S）₃のアルコールを三塩化リンと反応させ、そして得られる生成物Ｃｌ₂ＰＯ（ＣＨ₂）xＳｉ（Ｒ_S）₃を少なくとも２当量の式（Ｒ_N）₂ＮＨのアミンと反応させることによって製造されるのが好ましい。Ｒ_N基は同じものでも異なるものでもよく、炭素原子数１−約１０、好ましくは１−６、さらに好ましくは３のアルキルである。イソプロピル基が特に好ましい。Ｒ_S基は同じものでも異なるものでもよく、炭素原子数１−約１０のアルキルまたは炭素原子数６−約１０のアリールである。好ましくは、Ｒ_Sはメチル、エチル、イソプロピル、プロペニル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチルおよびフェニル基から選択される。２つのＲ_Sはフェニル基であり、１つのＲ_Sはメチル基であるのが好ましい。変数ｘは１−約７、好ましくは１−約４、さらに好ましくは２である。多くの適したアルコールはＣｅｌｅｂｕｓｋｉの１９９２年１０月２７日発行米国特許第５，１５９，０９５号に記載されており、これらの記載は参照することによってここに記載されたものとする。好ましいカップリング剤の１つはジフェニルメチルシリルエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイトであり、これはジフェニルメチルシリルエチルアルコールからジフェニルメチルシリルエチルホスホジクロリダイトを経て誘導することができる。式IIのシリルアルキルホスホルアミダイト単量体は、式IIIの支持体結合ヌクレオシドと、（Ｐ）がＨ、ヒドロキシル保護基または固体支持体である式IVのホスファイト２量体を形成するのに有効な時間および条件下で接触させることができる。好ましい具体例では、そのような接触は１Ｈ−テトラゾール、５−（４−ニトロフェニル）−１Ｈ−テトラゾールまたはジイソプロピルアミノテトラゾリドのような活性化剤の存在下、無水条件の下で行う。本発明に従う固体支持体は、例えば制御孔ガラス（ＣＰＧ）、オキサリル制御孔ガラス（例えば、Ａｌｕｌ等、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｃｈ１９９１，１９，１５２７参照）、ＴｅｎｔａＧｅｌ支持体−−アミノポリエチレングリコール誘導支持体（例えば、Ｗｒｉｇｈｔ等，ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔｅｒｓ１９９３，３４，３３７３参照）またはＰｏｒｏｓ−−ポリスチレン／ジビニルベンゼンの共重合体である。式IVのホスファイト化合物を次に酸化して、例えば式Ｖの化合物を生成する。そのような酸化を順次行って、ホスフェート（Ｚ＝Ｏ）およびホスホロチオエート（Ｚ＝Ｓ）先駆体構造体を生成する。有用な硫化剤にはＢｅａｕｃａｇｅ試薬（Ｉｙｅｒ等，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９０，１１２，１２５３およびＩｙｅｒ等，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９９０，５５，４６９３参照）、テトラエチルチウラムジスルフィド（例えば、Ｖｕ等，ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔｅｒｓ１９９１，３２，３００５参照）、ジベンゾイルテトラスルフィド（Ｒａｏ等，ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔｅｒｓ１９９２，３３，４８３９参照）、ジ（フェニルアセチル）ジスルフィド（例えば、Ｋａｍｅｒ等，ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔｅｒｓ１９８９，３０，６７５７）、硫黄、トリアリールまたはトリアルキルまたはトリアラルキルまたはトリアルカリールホスフィンのような配位子と組み合わせた硫黄が含まれる。有用な酸化剤はヨウ素／テトラヒドロフラン／水／ピリジンまたは過酸化水素／水またはｔ−ブチルヒドロペルオキシドまたはｍ−クロロ過安息香酸のような過酸等である。硫化の場合、反応は空気、特に酸素を除去した無水条件下で行い、酸化の場合、反応は水性条件下で行う。特定の具体例では、式Ｖの化合物をヒドロキシル保護基Ｒ_HPを除くのに有効な反応条件にさらし、その後、得られる生成物を追加単量体IIとカップリングさせて、式Ｖａ（ｎ＝１）のホスファイトオリゴヌクレオチドを生成する。明らかなように、さらにｎが例えば２−２００である式Ｖａの化合物は、上述の酸化、脱保護およびカップリング工程をさらに繰り返すことによって製造することができる。（Ｐ）がヒドロキシル保護基または固体支持体である場合、例えば式Ｖの酸化生成物は保護基または支持体を切り離すのに有効な条件にさらしてもよい。得られる生成物を水酸化アンモニウムまたはいくつかの他の水性塩基または弗化物イオンと接触させてそのシリルアルキル部分を除去し、例えば式VIまたはVIａのホスフェート含有化合物およびホスホロチオエート含有化合物を生成する。制御孔ガラスのような固体支持体からの切り離しは、水酸化アンモニウムまたはいくつかの他の水性塩基を用いて行うのが好ましい。弗化物イオンとの接触はテトラヒドロフラン、アセトニトリル、ジメトキシエタンまたは水のような溶媒中で行うのが好ましい。弗化物イオンはテトラアルキルアンモニウム弗化物（例えば、弗化テトラブチルアンモニウム（ＴＢＡＦ））、弗化カリウムまたは弗化セシウムから選択される１種以上の塩の形で提供するのが好ましい。Ｒ_HP基を当業界で周知の方法により式VIおよびVIａの化合物から除去すると、Ｒ_HPがＨである式VIおよびVIａの化合物を生成することができる。例えば、ジメトキシトリチル保護基はプロトン性の酸、例えばギ酸、ジクロロ酢酸、トリクロロ酢酸、ｐ−トルエンスルホン酸もしくは他の酸によって、またはルイス酸、例えば臭化亜鉛もしくは他のルイス酸を用いて除去することができる。明らかなように、本発明の方法の工程は特定の回数または特定の順序で行う必要はない。また、本発明の化合物の固体支持体からの切り離しは、シリルアルキル基の除去前に行ってもまたは後に行ってもよい。本発明の別の目的、利点および新しい特徴は当業者であれば次の実施例から明らかになるであろう。これらの実施例は本発明を限定するものではない。実施例１ジフェニルメチルシリルエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイトの製造磁気撹拌機、ガラス栓およびアルゴン送入口を備えた５００ｍｌの三つ口フラスコをアルゴン雰囲気下で組み立てる。全てのガラス器具をオーブン中で１２０ ℃にて１時間乾燥する。反応フラスコに無水エーテル（１５０ｍｌ）および三塩化リン（９．２７ｇ；６７．５mmol）を入れる。ジフェニルメチルシリルエタノール（１２．１２ｇ；５０mmol）を含むエーテル（５０ｍｌ）を等圧にした滴加漏斗を使用して撹拌しながら０℃（氷冷）で反応フラスコにゆっくり加える。添加完了後、氷浴を除き、反応液を３時間撹拌する。次に、反応混合物を５００ｍｌのフラスコに移し、減圧下で濃縮する。この無色生成物を含む無水エーテル（２００ｍｌ）に、ジイソプロピルアミン（５７．７ｍｌ）をアルゴン下、０℃で加える。添加完了後、室温で１６時間（一晩）撹拌し続ける。反応混合物を濾過し、濃縮すると、無色で粘性の液体が得られる。この生成物の¹¹ＰＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）はδ１２３．４ｐｐｍで大きなピークを示す。実施例２保護されたシリルアルキルホスホルアミダイト単量体の製造Ａ．５′−Ｏ−（４，４′−ジメトキシトリチル）チミジン−３′−Ｏ−（２ −ジフェニルメチルシリルエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイト）磁気撹拌機、アルゴンガス用送入口および隔壁を備えた２５０ｍｌのニロフラスコをアルゴン雰囲気下で組み立てる。全てのガラス器具を１２０℃で１時間乾燥する。フラスコに５′−Ｏ−（４，４′−ジメトキシトリチル）チミジン（Ｃｈｅｍ−Ｉｍｐｅｘ；３．８１ｇ；７mmol）および５−（４−ニトロフェニル） −１Ｈ−テトラゾール（Ｃｈｅｍ−Ｉｍｐｅｘ；１．０７ｇ；５．６mmol））を入れる。無水アセトニトリル（５０ｍｌ）を加える。アルゴン下、室温のこの撹拌混合物にジフェニルメチルシリルエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイト（４．９６ｇ；１０．５mmol）を含むアセトニトリル（５０ｍｌ）の溶液を加える。２時間撹拌した後、ホワットマンシリカゲル６０ＡダイアモンドＫＧＦ上での薄層クロマトグラフィー（１００％酢酸エチル）から、出発ヌクレオシドが消えていることが分かる。反応混合物を濾過し、濾液を酢酸エチル（１００ｍｌ）で希釈し、冷飽和炭酸水素ナトリウム溶液、ブラインで１回洗浄し、乾燥する（ＭｇＳＯ₄）。乾燥溶液を減圧下で濃縮すると、粘性で泡立った液体が得られる。粗生成物をシリカゲルを用いてフラッシュクロマトグラフィーを行うことによって精製する。酢酸エチルおよびヘキサンからなる勾配溶媒系を用いる。精製の間ずっとトリエチルアミン（１％）を用いる。生成物に相当するフラクションを一緒にし、濃縮すると、淡黄色の粘性で泡立った液体（９．８７ｇ；７７％）が得られる。³¹ＰＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）は２つのジアステレオマー生成物に相当するδ１４５．４８３、１４６．１７６に２つの信号を示す。Ｂ．Ｎ²−イソブチリル−５′−Ｏ−（４，４′−ジメトキシトリチル）−２ ′−デオキシグアノシン−３′−Ｏ−（２−ジフェニルメチルシリルエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイト）磁気撹拌機、アルゴンガス用送入口および隔壁を備えた２５０ｍｌの二口フラスコをアルゴン雰囲気下で組み立てる。全てのガラス器具を１２０℃で１時間乾燥する。フラスコにＮ²−イソブチリル−５′−Ｏ−（４，４′−ジメトキシトリチル）−２′−デオキシグアノシン（Ｃｈｅｍ−Ｉｍｐｅｘ；３．１９５ｇ；５mmol）およびジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド（０．６８４ｇ；４mm ol）を入れる。無水アセトニトリル（５０ｍｌ）を加える。アルゴン下、室温のこの撹拌混合物にジフェニルメチルシリルエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイト（３．５４３ｇ；７．５mmol）を含むアセトニトリル（５０ｍｌ）の溶液を加える。２時間撹拌した後、ホワットマンシリカゲル６０ＡダイアモンドＫＧＦ上での薄層クロマトグラフィー（１００％酢酸エチル）から、出発ヌクレオシドが消えていることが分かる。反応混合物を濾過し、濾液を酢酸エチル（１００ｍｌ）で希釈し、冷飽和炭酸水素ナトリウム溶液、ブラインで１回洗浄し、乾燥する（ＭｇＳＯ₄）。乾燥溶液を減圧下で濃縮すると、粘性で泡立った液体が得られる。粗生成物をシリカゲルを用いてフラッシュクロマトグラフィーを行うことによって精製する。酢酸エチルおよびヘキサンからなる勾配溶媒系を用いる。精製の間ずっとトリエチルアミン（１％）を用いる。生成物に相当するフラクションを一緒にし、濃縮すると、淡黄色の粘性で泡立った液体（３．６ｇ；６５％）が得られる。³¹ＰＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）は２つのジアステレオマー生成物に相当するδ１４５．４８３、１４６．１７６に２つの信号を示す。Ｃ．Ｎ⁶−ベンゾイル−５′−Ｏ−（４，４′−ジメトキシトリチル）−２′ −デオキシアデノシン−３′−Ｏ−（２−ジフェニルメチルシリルエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイト）磁気撹拌機、アルゴンガス用送入口および隔壁を備えた２５０ｍｌの二口フラスコをアルゴン雰囲気下で組み立てる。全てのガラス器具を１２０℃で１時間乾燥する。フラスコにＮ⁶−ベンゾイル−５′−Ｏ−（４，４′−ジメトキシトリチル）−２′−デオキシアデノシン（Ｃｈｅｍ−Ｉｍｐｅｘ；３．２８５ｇ；５ mmol）およびジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド（０．６８４ｇ；４mmol ）を入れる。無水アセトニトリル（５０ｍｌ）を加える。アルゴン下、室温のこの撹拌混合物にジフェニルメチルシリルエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイト（２．８３５ｇ；６mmol）を含むアセトニトリル（５０ｍｌ）の溶液を加える。２時間撹拌した後、反応混合物を濾過し、濃縮すると、粘性で泡立った物質が得られる。粗生成物をシリカゲルを用いてフラッシュクロマトグラフィーを行うことによって精製する。酢酸エチルおよびヘキサンからなる勾配溶媒系を用いる。精製の間ずっとトリエチルアミン（１％）を用いる。生成物に相当するフラクションを一緒にし、濃縮すると、粘性で泡立った液体（３．８１ｇ；６８％）が得られる。³¹ＰＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）は２つのジアステレオマー生成物に相当するδ１４６．０９３、１４６．４７８に２つの信号を示す。Ｄ．Ｎ⁴−ベンゾイル−５′−Ｏ−（４，４′−ジメトキシトリチル）−２′ −デオキシシチジン−３′−Ｏ−（２−ジフェニルメチルシリルエチルＮ，Ｎ −ジイソプロピルホスホルアミダイト）磁気撹拌機、アルゴンガス用送入口および隔壁を備えた２５０ｍｌの二口フラスコをアルゴン雰囲気下で組み立てる。全てのガラス器具を１２０℃で１時間乾燥する。フラスコにＮ⁴−ベンゾイル−５′−Ｏ−（４，４′−ジメトキシトリチル）−２′−デオキシシチジン（Ｃｈｅｍ−Ｉｍｐｅｘ；３．１６９ｇ；５mm ol）およびジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド（０．６８４ｇ；４mmol）を入れる。無水アセトニトリル（５０ｍｌ）を加える。アルゴン下、室温のこの撹拌混合物にジフェニルメチルシリルエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイト（３．５４３ｇ；７．５mmol）を含むアセトニトリル（５０ｍｌ）の溶液を加える。２時間撹拌した後、ホワットマンシリカゲル６０ＡダイアモンドＫＧＦ上での薄層クロマトグラフィー（１００％酢酸エチル）から、出発ヌクレオシドが消えていることが分かる。反応混合物を濾過し、濾液を酢酸エチル（１００ｍｌ）で希釈し、冷飽和炭酸水素ナトリウム溶液、ブラインで１回洗浄し、乾燥する（ＭｇＳＯ₄）。乾燥溶液を減圧下で濃縮すると、粘性で泡立った液体が得られる。粗生成物をシリカゲルを用いてフラッシュクロマトグラフィーを行うことによって精製する。酢酸エチルおよびヘキサンからなる勾配溶媒系を用いる。精製の間ずっとトリエチルアミン（１％）を用いる。生成物に相当するフラクションを一緒にし、濃縮すると、粘性で泡立った液体（４．０９ｇ；７４％）が得られる。³¹ＰＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）は２つのジアステレオマー生成物に相当するδ１４６．２７７、１４６．６８２に２つの信号を示す。実施例３カップリング方法Ａ．Ｔ−Ｔホスホロチオエート２量体の合成エステル結合を介してＣＰＧ（制御孔ガラス）に結合された５′−Ｏ−ジメトキシトリチルチミジン（１００ｍｇ、４mmol）をガラス反応器に取り、２％ジクロロ酢酸（体積／体積）のジクロロメタン溶液を加えて、５′−ヒドロキシル基を脱保護する。生成物をジクロロメタンで、次いでアセトニトリルで洗浄する。その後、アセトニトリル中０．２Ｍ５′−Ｏ−（４，４′−ジメトキシトリチル）チミジン−３′−Ｏ−（２−ジフェニルメチルシリルエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイト）溶液およびアセトニトリル中０．４Ｍ１Ｈ− テトラゾール溶液を加え、室温で５分間反応させる。生成物をアセトニトリルで洗浄する。次に、アセトニトリル中０．０５ＭＢｅａｕｃａｇｅ試薬溶液を加え、室温で５分間反応させる。この硫化工程をもう１回、５分間繰り返す。支持体をアセトニトリルで、次いで無水酢酸／ルチジン／ＴＨＦ（１：１：８）の溶液で洗浄し、Ｎ−メチルイミダゾール／ＴＨＦを加えて、未反応５′−ヒドロキシル基をキャップする。生成物をアセトニトリルで洗浄する。化合物を含有する担体を３０％水性水酸化アンモニウムで９０分間処理する。水溶液を濾過し、減圧下で濃縮し、そして室温にてＴＨＦ中１．０Ｍ弗化テトラ−ｎ−ブチルアンモニウム溶液で処理して、Ｔ−Ｔのホスホロチオエート２量体を得る。Ｂ．Ｃ−Ｔホスホロチオエート２量体の合成エステル結合を介してＣＰＧ（制御孔ガラス）に結合された５′−Ｏ−ジメトキシトリチルチミジン（１００ｍｇ、４mmol）をガラス反応器に取り、２％ジクロロ酢酸（体積／体積）のジクロロメタン溶液を加えて、５′−ヒドロキシル基を脱保護する。生成物をアセトニトリルで洗浄する。その後、アセトニトリル中０．２ＭＮ⁴−ベンゾイル−５′−Ｏ−（４，４′−ジメトキシトリチル）− ２′−デオキシシチジン−３′−Ｏ−（２−ジフェニルメチルシリルエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイト）溶液およびアセトニトリル中０．４Ｍ１Ｈ−テトラゾール溶液を加え、室温で５分間反応させる。生成物をアセトニトリルで洗浄し、次に、アセトニトリル中０．０５ＭＢｅａｕｃａｇｅ試薬溶液を加え、室温で５分間反応させる。この硫化工程をもう１回、５分間繰り返す。支持体をアセトニトリルで、次いで無水酢酸／ルチジン／ＴＨＦ（１：１：８）の溶液で洗浄し、Ｎ−メチルイミダゾール／ＴＨＦを加えて、未反応５′− ヒドロキシル基をキャップする。生成物をアセトニトリルで洗浄する。化合物を含有する担体を３０％水性水酸化アンモニウム溶液で９０分間処理し、そして５５℃で１２時間インキュベートする。水溶液を濾過し、減圧下で濃縮して、ｄＣ−Ｔのホスホロチオエート２量体を得る。Ｃ．Ｔ−Ｔホスホジエステル２量体の合成エステル結合を介してＣＰＧ（制御孔ガラス）に結合された５′−Ｏ−ジメトキシトリチルチミジン（１００ｍｇ、４mmol）をガラス反応器に取り、２％ジクロロ酢酸（体積／体積）のジクロロメタン溶液を加えて、５′−ヒドロキシル基を脱保護する。生成物をジクロロメタンで、次いでアセトニトリルで洗浄する。その後、アセトニトリル中０．２Ｍ５′−Ｏ−（４，４′−ジメトキシトリチル）チミジン−３′−Ｏ−（２−ジフェニルメチルシリルエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイト）溶液およびアセトニトリル中０．４Ｍ１Ｈ− テトラゾール溶液を加え、室温で５分間反応させる。生成物をアセトニトリルで洗浄し、次いで水／ピリジン／ＴＨＦ（２／２０／８０）中の０．１Ｍヨウ素を加え、室温で５分間反応させる。支持体をアセトニトリルで、次いで無水酢酸／ルチジン／ＴＨＦ（１：１：８）の溶液で洗浄し、Ｎ−メチルイミダゾール／ＴＨＦを加えて、未反応５′−ヒドロキシル基をキャップする。生成物をアセトニトリルで洗浄する。化合物を含有する担体を３０％水性水酸化アンモニウムで９０分間室温で処理し、そして５５℃で１時間インキュベートする。水溶液を濾過し、減圧下で濃縮して、Ｔ−Ｔのホスホジエステル２量体を得る。Ｄ．５′−ＴＴＴＴＴＴＴ−３′ホスホロチオエート７量体の合成エステル結合を介してＣＰＧ（制御孔ガラス）に結合された５′−Ｏ−ジメトキシトリチルチミジン（５０ｍｇ、２mmol）をガラス反応器に取り、２％ジクロロ酢酸（体積／体積）のジクロロメタン溶液を加えて、５′−ヒドロキシル基を脱保護する。生成物をアセトニトリルで洗浄する。その後、アセトニトリル中０．２Ｍ５′−Ｏ−（４，４′−ジメトキシトリチル）チミジン−３′−Ｏ−（２−ジフェニルメチルシリルエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイト）溶液およびアセトニトリル中０．４Ｍ１Ｈ−テトラゾール溶液を加え、室温で５分間反応させる。生成物をアセトニトリルで洗浄し、次に、アセトニトリル中０．０５ＭＢｅａｕｃａｇｅ試薬溶液を加え、室温で５分間反応させる。この硫化工程をもう１回、５分間繰り返す。支持体をアセトニトリルで、次いで無水酢酸／ルチジン／ＴＨＦ（１：１：８）の溶液で洗浄し、Ｎ−メチルイミダゾール／ＴＨＦを加えて、未反応５′−ヒドロキシル基をキャップする。生成物をアセトニトリルで洗浄する。この全サイクルをさらに５回繰り返して、完全に保護されたチミジン７量体を得る。化合物を含有する担体を３０％水性水酸化アンモニウム溶液で９０分間室温で処理し、そして５５℃で１時間インキュベートする。水溶液を濾過し、減圧下で濃縮して、ＴＴＴＴＴＴＴのホスホロチオエート２量体を得る。Ｅ．５′−ｄ（ＧＡＣＴ）−３′ホスホロチオエート４量体の合成エステル結合を介してＣＰＧ（制御孔ガラス）に結合された５′−Ｏ−ジメトキシトリチルチミジン（５０ｍｇ、２mmol）をガラス反応器に取り、２％ジクロロ酢酸（体積／体積）のジクロロメタン溶液を加えて、５′−ヒドロキシル基を脱保護する。生成物をアセトニトリルで洗浄する。その後、アセトニトリル中０．２Ｍ５′−Ｏ−（４，４′−ジメトキシトリチル）チミジン−３′−Ｏ−（２−ジフェニルメチルシリルエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイト）溶液およびアセトニトリル中０．４Ｍ１Ｈ−テトラゾール溶液を加え、室温で５分間反応させる。生成物をアセトニトリルで洗浄し、次に、アセトニトリル中０．０５ＭＢｅａｕｃａｇｅ試薬溶液を加え、室温で５分間反応させる。この硫化工程をもう１回、５分間繰り返す。支持体をアセトニトリルで、次いで無水酢酸／ルチジン／ＴＨＦ（１：１：８）の溶液で洗浄し、Ｎ−メチルイミダゾール／ＴＨＦを加えて、未反応５′−ヒドロキシル基をキャップする。生成物をアセトニトリルで洗浄する。２％ジクロロ酢酸（体積／体積）のジクロロメタン溶液を加えて、５′−ヒドロキシル基を脱保護する。生成物をアセトニトリルで洗浄する。その後、アセトニトリル中０．２ＭＮ⁴−ベンゾイル−５′−Ｏ−（４，４′−ジメトキシトリチル）−２′−デオキシシチジン−３′−Ｏ−（２−ジフェニルメチルシリルエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイト）溶液およびアセトニトリル中０．４Ｍ１Ｈ−テトラゾール溶液を加え、室温で５分間反応させる。生成物をアセトニトリルで洗浄し、次に、アセトニトリル中０．０５ＭＢｅａｕｃａｇｅ試薬溶液を加え、室温で５分間反応させる。この硫化工程をさらに１回、５分間繰り返す。支持体をアセトニトリルで、次いで無水酢酸／ルチジン／ＴＨＦ（１：１：８）の溶液で洗浄し、Ｎ−メチルイミダゾール／ＴＨＦを加えて、未反応５′−ヒドロキシル基をキャップする。生成物をアセトニトリルで洗浄する。２％ジクロロ酢酸（体積／体積）のジクロロメタン溶液を加えて、５′−ヒドロキシル基を脱保護する。生成物をアセトニトリルで洗浄する。その後、無水アセトニトリル中０．２ＭＮ⁶−ベンゾイル−５′−Ｏ−（４，４′−ジメトキシトリチル）−２′−デオキシアデノシン−３′−Ｏ−（２−ジフェニルメチルシリルエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイト）溶液およびアセトニトリル中０．４Ｍ１Ｈ−テトラゾール溶液を加え、室温で５分間反応させる。生成物をアセトニトリルで洗浄し、次に、アセトニトリル中０．０５ＭＢｅａｕｃａｇｅ試薬溶液を加え、室温で５分間反応させる。この硫化工程をさらに１回、５分間繰り返す。支持体をアセトニトリルで、次いで無水酢酸／ルチジン／ＴＨＦ（１：１：８）の溶液で洗浄し、Ｎ−メチルイミダゾール／ＴＨＦを加えて、未反応５′−ヒドロキシル基をキャップする。生成物をアセトニトリルで洗浄する。２％ジクロロ酢酸（体積／体積）のジクロロメタン溶液を加えて、５′−ヒドロキシル基を脱保護する。生成物をアセトニトリルで洗浄する。その後、アセトニトリル中０．２ＭＮ²−イソブチリル−５′−Ｏ−（４，４′−ジメトキシトリチル）−２′−デオキシグアノシン−３′−Ｏ−（２−ジフェニルメチルシリルエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイト）溶液およびアセトニトリル中０．４Ｍ１Ｈ−テトラゾール溶液を加え、室温で５分間反応させる。生成物をアセトニトリルで洗浄し、次に、アセトニトリル中０．０５ＭＢｅａｕｃａｇｅ試薬溶液を加え、室温で５分間反応させる。この硫化工程をさらに１回、５分間繰り返す。支持体をアセトニトリルで、次いで無水酢酸／ルチジン／ＴＨＦ（１：１：８）の溶液で洗浄し、Ｎ−メチルイミダゾール／ＴＨＦを加えて、未反応５′−ヒドロキシル基をキャップする。生成物をアセトニトリルで洗浄する。化合物を含有する担体を３０％水性水酸化アンモニウム溶液で９０分間室温で処理し、そして５５℃で２４時間インキュベートする。水溶液を濾過し、減圧下で濃縮して、５′−ｄＧ−ｄＡ−ｄＣ−Ｔ−３′のホスホロチオエート４量体を得る。本発明の好ましい具体例に多くの変更を加えうること、およびそのような変更が本発明の精神に逸脱することなくなしうることは、当業者にとって明らかなことである。従って、請求の範囲は本発明の真の精神および範囲に入る全ての均等の変更を包含するものである。

【手続補正書】【提出日】１９９６年２月９日【補正内容】請求の範囲１．式IIの化合物を製造する方法であって、式Ｉの化合物を式：［（Ｒ_N）₂Ｎ］₂ＰＯ（ＣＨ₂）_xＳi（Ｒ_S）₃のカップリング試薬と、式IIの化合物を形成するのに有効な時間および反応条件下で接触させることを含む方法：［式中、各Ｑは、独立して、Ｏ、Ｓ、ＣＨ₂、ＣＨＦまたはＣＦ₂であり；各Ｂ_xは、独立して、ヌクレオシド塩基であり；各Ｘは、独立して、Ｈ、ＯＨ、アルキル、置換アルキル、アルカリールもしくはアラルキル、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ₃、ＯＣＦ₃、ＯＣＮ、Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキル、Ｎ−アルキル、Ｏ−アルケニル、Ｓ−アルケニル、Ｎ−アルケニル、ＳＯＣＨ₃、ＳＯ₂ＣＨ₃、ＯＮＯ₂、ＮＯ₂、Ｎ₃、ＮＨ₂、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリール、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノもしくは置換シリル、ＲＮＡ開裂基、オリゴヌクレオチドの薬物動力学的特性を改善するための基、またはオリゴヌクレオチドの薬力学的特性を改善するための基であり；Ｒ_HPはヒドロキシル保護基であり；各Ｒ_Nは、独立して、炭素原子数１−約１０のアルキルであり；各Ｒ_sは、独立して、炭素原子数１−約１０のアルキルまたは炭素原子数６− 約１０のアリールであり；そしてｘは１−約７である］。２．式IVの化合物を製造する方法であって、請求項１記載の方法により製造された式IIの化合物を式IIIの化合物と、式IVの化合物を形成するのに有効な時間および反応条件下で接触させることを含む方法：［式中、（Ｐ）はＨ、ヒドロキシル保護基または固体支持体であり、Ｑ、Ｂ_x、Ｘ、Ｒ_HP、Ｒ_s、およびｘは請求項１において定義したとおりである］。３．式Ｖの化合物を製造する方法であって、請求項２記載の方法により製造された式IVの化合物を酸化剤と、式Ｖの化合物を形成するのに有効な時間および反応条件下で接触させることを含む方法：［式中、ＺはＯまたはＳであり、Ｑ、Ｂ_x、Ｘ、Ｒ_HP、Ｒ_s、およびｘは請求項１において定義したとおりであり、（Ｐ）は請求項２において定義したとおりである］。４．（Ｐ）が固体支持体である上記式Ｖの化合物を水性塩基と接触させて、溶液相反応生成物を形成することをさらに含む、請求項３の方法。５．上記溶液相反応生成物を弗化物イオンと接触させて、式IVの化合物を生成することをさらに含む、請求項４の方法：［式中、ＺはＯまたはＳであり、Ｑ、Ｂ_x、ＸおよびＲ_HPは請求項１において定義したとおりである］。６．上記式IVの化合物を、上記Ｒ_HP基を除去するのに有効な条件にさらすことをさらに含む、請求項５の方法。７．上記式Ｖの化合物を弗化物イオンと接触させて、シリルアルキルホスフェート保護基を除去することをさらに含む、請求項３の方法。８．上記シリルアルキルホスフェート保護基を除去した上記化合物を水性塩基と接触させて、式IVの化合物を形成することをさらに含む、請求項７の方法：［式中、ＺはＯまたはＳであり、Ｑ、Ｂ_x、ＸおよびＲ_HPは請求項１において定義したとおりである］。９．上記式IVの化合物を、上記Ｒ_HP基を除去するのに有効な条件にさらすことをさらに含む、請求項８の方法。１０．式IVの化合物を製造する方法であって、式IIの化合物を式IIIの化合物と、式IVの化合物を形成するのに有効な時間および反応条件下で接触させることを含む方法：［式中、各Ｑは、独立して、Ｏ、Ｓ、ＣＨ₂、ＣＨＦまたはＣＦ₂であり；各Ｂ_xは、独立して、ヌクレオシド塩基であり；各Ｘは、独立して、Ｈ、ＯＨ、アルキル、置換アルキル、アルカリールもしくはアラルキル、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ₃、ＯＣＦ₃、ＯＣＮ、Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキル、Ｎ−アルキル、Ｏ−アルケニル、Ｓ−アルケニル、Ｎ−アルケニル、ＳＯＣＨ₃、ＳＯ₂ＣＨ₃、ＯＮＯ₂、ＮＯ₂、Ｎ₃、ＮＨ₂、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリール、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノもしくは置換シリル、ＲＮＡ開裂基、オリゴヌクレオシドの薬物動力学的特性を改善するための基、またはオリゴヌクレオシドの薬力学的特性を改善するための基であり；Ｒ_HPはヒドロキシル保護基であり；各Ｒ_Nは、独立して、炭素原子数１−約１０のアルキルであり；各Ｒ_sは、独立して、炭素原子数１−約１０のアルキルまたは炭素原子数６− 約１０のアリールであり；（Ｐ）はＨ、ヒドロキシル保護基または固体支持体であり；そしてｘは１−約７である］。１１．式Ｖの化合物を製造する方法であって、請求項１０記載の方法により製造された式IVの化合物を酸化剤と、式Ｖの化合物を形成するのに有効な時間および反応条件下で接触させることを含む方法：［式中、ＺはＯまたはＳであり、Ｑ、Ｂ_x、Ｘ、Ｒ_HP、Ｒ_s、（Ｐ）およびｘは請求項１０において定義したとおりである］。１２．上記式IVの化合物を追加の式IIの化合物と接触させ、各々のそのような追加接触工程の後、得られた生成物を酸化することをさらに含む、請求項１１の方法。１３．式IIの化合物：（式中、Ｑは、Ｏ、Ｓ、ＣＨ₂、ＣＨＦまたはＣＦ₂であり；Ｂ_xは、ヌクレオシド塩基であり；Ｘは、Ｈ、ＯＨ、アルキル、置換アルキル、アルカリールもしくはアラルキル、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ₃、ＯＣＦ₃、ＯＣＮ、Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキル、Ｎ−アルキル、Ｏ−アルケニル、Ｓ−アルケニル、Ｎ−アルケニル、ＳＯＣＨ₃、ＳＯ₂ＣＨ₃、ＯＮＯ₂、ＮＯ₂、Ｎ₃、ＮＨ₂、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリール、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノもしくは置換シリル、ＲＮＡ開裂基、オリゴヌクレオシドの薬物動力学的特性を改善するための基、またはオリゴヌクレオシドの薬力学的特性を改善するための基であり；Ｒ_HPはヒドロキシル保護基であり；各Ｒ_Nは、独立して、炭素原子数１−約１０のアルキルであり；各Ｒ_sは、独立して、炭素原子数１−約１０のアルキルまたは炭素原子数６− 約１０のアリールであり；そしてｘは１−約７である）。１４．式IVの化合物：（式中、各Ｑは、独立して、Ｏ、Ｓ、ＣＨ₂、ＣＨＦまたはＣＦ₂であり；各Ｂ_xは、独立して、ヌクレオシド塩基であり；各Ｘは、独立して、Ｈ、ＯＨ、アルキル、置換アルキル、アルカリールもしくはアラルキル、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ₃、ＯＣＦ₃、ＯＣＮ、Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキル、Ｎ−アルキル、Ｏ−アルケニル、Ｓ−アルケニル、Ｎ−アルケニル、ＳＯＣＨ₃、ＳＯ₂ＣＨ₃、ＯＮＯ₂、ＮＯ₂、Ｎ₃、ＮＨ₂、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリール、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノもしくは置換シリル、ＲＮＡ開裂基、オリゴヌクレオシドの薬物動力学的特性を改善するための基、またはオリゴヌクレオシドの薬力学的特性を改善するための基であり；Ｒ_HPはヒドロキシル保護基であり；各Ｒ_sは、独立して、炭素原子数１−約１０のアルキルまたは炭素原子数６− 約１０のアリールであり；（Ｐ）はＨ、ヒドロキシル保護基または固体支持体であり；そしてｘは１−約７である）。１５．式Ｖの化合物：（式中、各Ｑは、独立して、Ｏ、Ｓ、ＣＨ₂、ＣＨＦまたはＣＦ₂であり；各Ｂ_xは、独立して、ヌクレオシド塩基であり；各Ｘは、独立して、Ｈ、ＯＨ、アルキル、置換アルキル、アルカリールもしくはアラルキル、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ₃、ＯＣＦ₃、ＯＣＮ、Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキル、Ｎ−アルキル、Ｏ−アルケニル、Ｓ−アルケニル、Ｎ−アルケニル、ＳＯＣＨ₃、ＳＯ₂ＣＨ₃、ＯＮＯ₂、ＮＯ₂、Ｎ₃、ＮＨ₂、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリール、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノもしくは置換シリル、ＲＮＡ開裂基、オリゴヌクレオシドの薬物動力学的特性を改善するための基、またはオリゴヌクレオシドの薬力学的特性を改善するための基であり；Ｒ_HPはヒドロキシル保護基であり；各Ｒ_sは、独立して、炭素原子数１−約１０のアルキルまたは炭素原子数６− 約１０のアリールであり；（Ｐ）はＨ、ヒドロキシル保護基または固体支持体であり；ＺはＯまたはＳであり；そしてｘは１−約７である）。１６．式Ｃｌ₂ＰＯ（ＣＨ₂）_xＳｉ（Ｒ_s）₃の化合物：（式中、各Ｒ_sは、独立して、炭素原子数１−約１０のアルキルまたは炭素原子数６− 約１０のアリールであり；そしてｘは１−約７である）。１７．ジフェニルメチルシリルエチルホスホジクロリダイトである、請求項１６の化合物。１８．式：［（Ｒ_N）₂Ｎ］₂ＰＯ（ＣＨ₂）_xＳｉ（Ｒ₃）₃の化合物：（式中、各Ｒ_Nは、独立して、炭素原子数１−約１０のアルキルであり；各Ｒ_sは、独立して、炭素原子数１−約１０のアルキルまたは炭素原子数６− 約１０のアリールであり；そしてｘは１−約７である）。１９．ジフェニルメチルシリルエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイトである、請求項２０の化合物。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＡ６１Ｋ 31/70 ＡＤＹ 8314−4ＣＡ６１Ｋ 31/70 ＡＤＹ (72)発明者コール，ダグラス・エルアメリカ合衆国カリフォルニア州92130, サンディエゴ，スミス・キャニオン・コート 4992 (72)発明者クック，フィリップ・ダンアメリカ合衆国カリフォルニア州92069, サンマルコス，アヴィラー・コート 641

Claims

【特許請求の範囲】１．式Ｉの化合物を式［（Ｒ_N）₂Ｎ］₂ＰＯ（ＣＨ₂）_xＳｉ（Ｒ_s）₃のカップリング試薬と、式IIの化合物を形成するのに有効な時間および反応条件下で接触させることを含む合成方法：（式中、各Ｑは、独立して、Ｏ、Ｓ、ＣＨ₂、ＣＨＦまたはＣＦ₂であり；各Ｂ_xは、独立して、ヌクレオシド塩基であり；各Ｘは、独立して、Ｈ、ＯＨ、アルキル、置換アルキル、アルカリールもしくはアラルキル、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ₃、ＯＣＦ₃、ＯＣＮ、Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキル、Ｎ−アルキル、Ｏ−アルケニル、Ｓ−アルケニル、Ｎ−アルケニル、ＳＯＣＨ₃、ＳＯ₂ＣＨ₃、ＯＮＯ₂、ＮＯ₂、Ｎ₃、ＮＨ₂、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリール、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノもしくは置換シリル、ＲＮＡ開裂基、オリゴヌクレオチドの薬物動力学的特性を改善するための基、またはオリゴヌクレオチドの薬力学的特性を改善するための基であり；Ｒ_HPはヒドロキシル保護基であり；各Ｒ_Nは、独立して、炭素原子数１−約１０のアルキルであり；各Ｒ_Sは、独立して、炭素原子数１−約１０のアルキルまたは炭素原子数６− 約１０のアリールであり；そしてｘは１−約７である）。２．上記式IIの化合物を式IIIの化合物と、式IVの化合物を形成するのに有効な時間および反応条件下で接触させることをさらに含む、請求項１の方法：（式中、（Ｐ）はＨ、ヒドロキシル保護基または固体支持体である）。３．式IVの化合物を酸化剤と、式Ｖの化合物を形成するのに有効な時間および反応条件下で接触させることをさらに含む、請求項２の方法：（式中、ＺはＯまたはＳである）。４．（Ｐ）が固体支持体である上記式Ｖの化合物を水性塩基と接触させて、溶液相反応生成物を形成することをさらに含む、請求項３の方法。５．上記溶液相反応生成物を弗化物イオンと接触させて、式VIの化合物を生成することをさらに含む、請求項４の方法：６．上記式VIの化合物を、上記Ｒ_HP基を除去するのに有効な条件にさらすことをさらに含む、請求項５の方法。７．上記式Ｖの化合物を弗化物イオンと接触させて、シリルアルキルホスフェート保護基を除去することをさらに含む、請求項３の方法。８．上記シリルアルキルホスフェート保護基を除去した上記化合物を水性塩基と接触させて、式VIの化合物を形成することをさらに含む、請求項７の方法：９．上記式VIの化合物を、上記Ｒ_HP基を除去するのに有効な条件にさらすことをさらに含む、請求項８の方法。１０．式IIの化合物を式IIIの化合物と、式IVの化合物を形成するのに有効な時間および反応条件下で接触させることを含む合成方法：（式中、各Ｑは、独立して、Ｏ、Ｓ、ＣＨ₂、ＣＨＦまたはＣＦ₂であり；各Ｂ_xは、独立して、ヌクレオシド塩基であり；各Ｘは、独立して、Ｈ、ＯＨ、アルキル、置換アルキル、アルカリールもしくはアラルキル、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ₃、ＯＣＦ₃、ＯＣＮ、Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキル、Ｎ−アルキル、Ｏ−アルケニル、Ｓ−アルケニル、Ｎ−アルケニル、ＳＯＣＨ₃、ＳＯ₂ＣＨ₃、ＯＮＯ₂、ＮＯ₂、Ｎ₃、ＮＨ₂、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリール、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノもしくは置換シリル、ＲＮＡ開裂基、オリゴヌクレオシドの薬物動力学的特性を改善するための基、またはオリゴヌクレオシドの薬力学的特性を改善するための基であり；Ｒ_HPはヒドロキシル保護基であり；各Ｒ_Nは、独立して、炭素原子数１−約１０のアルキルであり；各Ｒ_sは、独立して、炭素原子数１−約１０のアルキルまたは炭素原子数６− 約１０のアリールであり；（Ｐ）はＨ、ヒドロキシル保護基または固体支持体であり；そしてｘは１− 約７である）。１１．上記式IVの化合物を酸化剤と、ＺがＯまたはＳである式Ｖの化合物を形成するのに有効な時間および反応条件下で接触させることをさらに含む、請求項１０の方法。１２．上記式IVの化合物を追加の式IIの化合物と接触させ、各々のそのような追加接触工程の後、得られた生成物を酸化することをさらに含む、請求項１１の方法。１３．式IIの化合物：（式中、Ｑは、Ｏ、Ｓ、ＣＨ₂、ＣＨＦまたはＣＦ₂であり；Ｂ_xは、ヌクレオシド塩基であり；Ｘは、Ｈ、ＯＨ、アルキル、置換アルキル、アルカリールもしくはアラルキル、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ₃、ＯＣＦ₃、ＯＣＮ、Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキル、Ｎ−アルキル、Ｏ−アルケニル、Ｓ−アルケニル、Ｎ−アルケニル、ＳＯＣＨ₃、ＳＯ₂ＣＨ₃、ＯＮＯ₂、ＮＯ₂、Ｎ₃、ＮＨ₂、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリール、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノもしくは置換シリル、ＲＮＡ開裂基、オリゴヌクレオシドの薬物動力学的特性を改善するための基、またはオリゴヌクレオシドの薬力学的特性を改善するための基であり；Ｒ_HPはヒドロキシル保護基であり；各Ｒ_Nは、独立して、炭素原子数１−約１０のアルキルであり；各Ｒ_sは、独立して、炭素原子数１−約１０のアルキルまたは炭素原子数６− 約１０のアリールであり；そしてｘは１−約７である）。１４．式IVの化合物：（式中、各Ｑは、独立して、Ｏ、Ｓ、ＣＨ₂、ＣＨＦまたはＣＦ₂であり；各Ｂ_xは、独立して、ヌクレオシド塩基であり；各Ｘは、独立して、Ｈ、ＯＨ、アルキル、置換アルキル、アルカリールもしくはアラルキル、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ₃、ＯＣＦ₃、ＯＣＮ、Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキル、Ｎ−アルキル、Ｏ−アルケニル、Ｓ−アルケニル、Ｎ−アルケニル、ＳＯＣＨ₃、ＳＯ₂ＣＨ₃、ＯＮＯ₂、ＮＯ₂、Ｎ₃、ＮＨ₂、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリール、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノもしくは置換シリル、ＲＮＡ開裂基、オリゴヌクレオシドの薬物動力学的特性を改善するための基、またはオリゴヌクレオシドの薬力学的特性を改善するための基であり；Ｒ_HPはヒドロキシル保護基であり；各Ｒ_sは、独立して、炭素原子数１−約１０のアルキルまたは炭素原子数６− 約１０のアリールであり；（Ｐ）はＨ、ヒドロキシル保護基または固体支持体であり；そしてｘは１− 約７である）。１５．式Ｖの化合物：（式中、各Ｑは、独立して、Ｏ、Ｓ、ＣＨ₂、ＣＨＦまたはＣＦ₂であり；各Ｂ_xは、独立して、ヌクレオシド塩基であり；各Ｘは、独立して、Ｈ、ＯＨ、アルキル、置換アルキル、アルカリールもしくはアラルキル、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ₃、ＯＣＦ₃、ＯＣＮ、Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキル、Ｎ−アルキル、Ｏ−アルケニル、Ｓ−アルケニル、Ｎ−アルケニル、ＳＯＣＨ₃、ＳＯ₂ＣＨ₃、ＯＮＯ₂、ＮＯ₂、Ｎ₃、ＮＨ₂、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリール、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノもしくは置換シリル、ＲＮＡ開裂基、オリゴヌクレオシドの薬物動力学的特性を改善するための基、またはオリゴヌクレオシドの薬力学的特性を改善するための基であり；Ｒ_HPはヒドロキシル保護基であり；各R_sは、独立して、炭素原子数１−約１０のアルキルまたは炭素原子数６−約１０のアリールであり；（Ｐ）はＨ、ヒドロキシル保護基または固体支持体であり；ＺはＯまたはＳであり；そしてｘは１−約７である）。１６．式Ｃｌ₂ＰＯ（ＣＨ₂）xＳｉ（Ｒ_s）₃の化合物：（式中、各Ｒ_Sは、独立して、炭素原子数１−約１０のアルキルまたは炭素原子数６− 約１０のアリールであり；そしてｘは１−約７である）。１７．ジフェニルメチルシリルエチルホスホジクロリダイトである、請求項１６の化合物。１８．式［（Ｒ_N）₂Ｎ］₂ＰＯ（ＣＨ₂）xＳｉ（Ｒ_S）₃の化合物：（式中、各Ｒ_Nは、独立して、炭素原子数１−約１０のアルキルであり；各Ｒ_Sは、独立して、炭素原子数１−約１０のアルキルまたは炭素原子数６− 約１０のアリールであり；そしてｘは１−約７である）。１９．ジフェニルメチルシリルエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイトである、請求項２０の化合物。