JP5213723B2

JP5213723B2 - マイクロｒｎａの調節に使用するためのオリゴマー化合物及び組成物

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Publication number: JP5213723B2
Application number: JP2008552606A
Authority: JP
Inventors: エサウ、クリスティン; スウェイジ、エリック、イー．; バット、バークリシェン; キンバーガー、ガース、エー．
Original assignee: Ionis Pharmaceuticals Inc; Isis Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Ionis Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2006-01-27
Filing date: 2007-01-27
Publication date: 2013-06-19
Anticipated expiration: 2027-01-27
Also published as: US20090221685A1; CA2640058C; EP1984499A2; AU2007211082B2; US8129515B2; CA2640058A1; EP2388327A1; EP2388328A1; JP2009524696A; US9598693B2; US9127272B2; EP1984499B1; US20120115228A1; WO2007090073A3; WO2007090073A2; US20150322436A1; AU2007211082A1

Description

関連文献の相互参照
本明細書は、２００６年１月２７日に出願された米国仮出願第６０／７６２，７２１号、及び２００６年１月１９日に出願された米国仮出願第６０／８０５，２０４号に対して優先権を主張するものであり、それぞれはこの参照によってその全体が本明細書に組み込まれるものである。

技術分野
本発明は、マイクロＲＮＡを含む、短い非コード（ｎｏｎ−ｃｏｄｉｎｇ）ＲＮＡを調節するための組成物及び方法を提供するものである。特に、本発明は、オリゴマー化合物、特に化学的に修飾されたオリゴヌクレオチドに関連しており、これはいくつかの実施形態において、マイクロＲＮＡを含む短い非コードＲＮＡ標的を有する或いはコード化している核酸分子とハイブリダイズする、或いは立体的に干渉するものである。

「成熟」ｍｉＲＮＡとしても知られているマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡｓ）は、植物及び動物のゲノム内にコード化された短い（約２１〜２４ヌクレオチド長）非コードＲＮＡである。これら高度に保存され内因的に発現したＲＮＡは、特異的ｍＲＮＡの３'?非翻訳領域（３'?ＵＴＲ）へ結合することによって遺伝子の発現を調節している。５００以上の異なるｍｉＲＮＡは、植物及び動物において同定されていた。成熟ｍｉＲＮＡｓは、しばしば数千長のヌクレオチドである、長い内因性前駆体ｍｉＲＮＡ転写産物（ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡｓ、ｐｒｉ−ｍｉｒｓ、ｐｒｉ−ｍｉＲｓ、或いはｐｒｉ−ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡｓとしても知られている）から派生すると見られている（Ｌｅｅ，ｅｔａｌ．，ＥＭＢＯＪ．，２００２，２１（１７），４６６３−４６７０））。

ｍｉＲＮＡｓの機能解析によって、これら短い非コードＲＮＡは、発生タイミング、器官形成、分化、パターン形成、胚形成、増殖調節及びプログラム細胞死を含む、動物における異なる生理学的過程に貢献していることが明らかになった。ｍｉＲＮＡｓが関与する特定の過程の例としては、幹細胞分化、神経発生、血管新生、造血発生、及びエキソサイトーシスを含む（Ａｌｖａｒｅｚ−ＧａｒｃｉａａｎｄＭｉｓｋａ，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，２００５，１３２，４６５３−４６６２を参照のこと）。

ｍｉＲＮＡファミリー及びクラスターを含むｍｉＲＮＡと、ヒト疾患との間の関連も同定されてきた。多くのｍｉＲＮＡは原発性ヒト腫瘍において調節解除される（Ｃａｌｉｎｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，２００２，９９，１５５２４−１５５２９；Ｃａｌｉｎｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，２００４，１０１，１１７５５−１１７６０；Ｈｅｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２００５，４３５，８２８−８３３；Ｌｕｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２００５，４３５，８３４）。さらに、多くのヒトｍｉＲＮＡは癌に関連したゲノム領域に位置している（Ｃａｌｉｎｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，２００４，１０１，２９９９−３００４；ＭｃＭａｎｕｓ，２００３，Ｓｅｍｉｎ．ＣａｎｃｅｒＢｉｏｌ，１３，２５２−２５８；Ｈｅｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２００５，４３５，８２８−８３３）。ポリシストロニックｍｉＲＮＡ由来であるＭｉｒ−１５ａ及びｍｉＲ−１６−１は、染色体１３ｑ１４の３０ｋｂ領域内に位置しており、これは半分以上のＢ細胞慢性リンパ性白血病（Ｂ−ＣＬＬ）において欠損する領域である。ｍｉＲ−１５ａ及びｍｉＲ−１６−１の両者は、ほとんどのＣＬＬケースにおいて欠損している或いはダウンレギュレーション（ｄｏｗｎ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）されている（Ｃａｌｉｎｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，２００２，９９，１５５２４−１５５２９）。

ｍｉＲＮＡｓのファミリーは、シード配列として知られる領域である、ｍｉＲＮＡの２〜８位でのヌクレオチド同定によって特徴付けされ得る。Ｌｅｗｉｓらは、いくつかのｍｉＲＮＡファミリー、さらには関連シード配列で特徴付けされているｍｉＲＮＡスーパーファミリーを記載している（Ｌｅｗｉｓｅｔａｌ．２００５）。

ｍｉＲＮＡは、ほとんどの真核生物において転写後調節を行うと考えられており、植物、動物さらには特定のウイルスにおいて検出されていた。多くのｍｉＲＮＡｓはいくつかの種から同定されており（例えばＰＣＲ公開公報第ＷＯ０３／０２９４５９号及び公開米国特許第２００５０２２２３９９号、第２００５０２２７９３４号、第２００５００５９００５号、及び第２００５０２２１２９３号を参照のこと、それぞれはこの参照によってその全体が本明細書に組み込まれるものである）、より多くはバイオインフォマティクス的に予測されていた。これらｍｉＲＮＡの多くは種を超えて保存されているが、種特異的ｍｉＲＮＡも同定されていた（Ｐｉｌｌａｉ，ＲＮＡ，２００５，１１，１７５３−１７６１）。

短い非コードＲＮＡによって仲介されるメカニズムを介して遺伝子発現を調節する薬剤に対するニーズが存在する。

本発明はとりわけ、アンチセンス及び非アンチセンスメカニズムに依存するものを含む、ｍｉＲＮＡのレベル、活性或いは機能を修飾するのに有用な化学的に修飾されたオリゴマー化合物及び方法を提供するものである。

本発明はとりわけ、短い非コードＲＮＡを有する或いはコード化する核酸を標的とし、短い非コードＲＮＡのレベルを修飾する或いはそれらの機能を干渉するように作用する、オリゴマー化合物、特に核酸及び核酸様オリゴマー化合物を提供する。

本発明はさらに、ｍｉＲＮＡを標的とし、ｍｉＲＮＡのレベルを修飾する或いはそれらのプロセシング或いは機能を干渉するように作用する、オリゴマー化合物、好ましくは核酸及び核酸様オリゴマー化合物も提供する。

本発明は、ヌクレオシド間（ｉｎｔｅｒｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ）結合基によって結合した約１７〜約２９個のヌクレオシドの連続配列を有するオリゴマー化合物を提供し、前記相列は２つの外部領域間に位置した内部領域を有し、各外部領域は独立して１〜約３個のヌクレオシドを有し、各外部領域は安定化ヌクレオシドを有し、前記内部領域は少なくとも１０個のβ−Ｄ−２'−デオキシ−２'−フルオロリボフラノシルヌクレオシドを有し、前記安定化ヌクレオシドのそれぞれはβ−Ｄ−２'−デオキシ−２'−フルオロリボフラノシルヌクレオシドに関連した増強されたヌクレアーゼ安定性を提供するものである。

本発明はさらに、ヌクレオシド間結合基によって結合した約１７〜約２９個のヌクレオシドの連続配列を有するオリゴマー化合物を提供し、前記相列は２つの外部領域間に位置した内部領域を有し、各外部領域は独立して１〜約３個のヌクレオシドを有し、各外部領域は安定化ヌクレオシドを有し、及び前記内部領域は少なくとも１０個のβ−Ｄ−２'−デオキシ−２'−フルオロリボフラノシルヌクレオシドを有するものである。

特定の実施形態において、前記オリゴマー化合物は、前記内部領域にβ−Ｄ−２'−デオキシ−２'−フルオロリボフラノシルヌクレオシドのみを有するギャップオリゴマー化合物を定義する、結合ヌクレオシドの連続配列を有する。別の実施形態において、前記オリゴマー化合物は、前記内部領域に２〜６個の安定化ヌクレオシドを有する部分的に修飾されたヌクレオシド化合物も定義できる、結合ヌクレオシドの連続配列を有する。

いくつかの実施形態において、前記安定化修飾は、安定化ヌクレオシド、安定化ヌクレオシド間結合基、或いはそれらの組み合わせを有する。更なる実施形態において、各安定化ヌクレオシドは、β−Ｄ−２'−デオキシ−２'−フルオロリボフラノシルヌクレオシドに関連した増強されたヌクレアーゼ安定性を提供するものである。

いくつかの実施形態において、前記内部領域における各ヌクレオシドは、独立して、安定化ヌクレオシド或いはβ−Ｄ−２'−デオキシ−２'−フルオロリボフラノシルヌクレオシドであり、ここにおいて少なくとも一つのβ−Ｄ−２'−デオキシ−２'−フルオロリボフラノシルヌクレオシドは前記内部領域における各安定化ヌクレオシドを各外部領域から分離するものである。

特定の実施形態において、各安定化ヌクレオシドは、独立して、２'?修飾ヌクレオシドである。

１実施形態において、前記２'?修飾ヌクレオシドは、二環性糖修飾ヌクレオシドである。別の実施形態において、各二環性糖修飾ヌクレオシドは独立して、アルファ或いはβ立体配置におけるＤ或いはＬ糖を有する。

いくつかの実施形態において、前記２'?修飾ヌクレオシドのそれぞれは独立して、Ｏ−Ｃ_１−Ｃ_１２アルキル、置換Ｏ−Ｃ_１−Ｃ_１２アルキル、Ｏ−Ｃ_２−Ｃ１２アルケニル、置換Ｏ−Ｃ_２−Ｃ_１２アルケニル、Ｏ−Ｃ_２−Ｃ_１２アルキニル、置換Ｏ−Ｃ_２−Ｃ_１２アルキニル、アミノ、置換アミノ、アミド、置換アミド、アラルキル、置換アラルキル、Ｏ−アラルキル、置換Ｏ−アラルキル、Ｎ_３、ＳＨ、ＣＮ、ＯＣＮ、ＣＦ_３、ＯＣＦ_３、ＳＯＣＨ_３、−ＳＯ_２ＣＨ_３、複素環?アルキル、複素環アルカリル、アミノ?アルキルアミノ及びポリアルキルアミノから選択された２'?置換基を有し；各置換基は独立して、ハロゲン、Ｃ_１−Ｃ_１２アルキル、置換Ｃ_１−Ｃ_１２アルキル、Ｃ_２−Ｃ_１２アルケニル、置換Ｃ_２−Ｃ_１２アルケニル、Ｃ_２−Ｃ_１２アルキニル、置換Ｃ_２−Ｃ_１２アルキニル、Ｏ−Ｃ_１−Ｃ_１２アルキル、置換Ｏ−Ｃ_１−Ｃ_１２アルキル、Ｓ−Ｃ_１−Ｃ_１２アルキル、置換Ｓ−Ｃ_１−Ｃ_１２アルキル、アシル（Ｃ（＝Ｏ）−Ｈ）、置換アシル、アミノ、置換アミノ、アミド、置換アミド、Ｃ_１−Ｃ_１２アルキルアミノ、置換Ｃ_１−Ｃ_１２アルキルアミノ、Ｃ_１−Ｃ_１２アミノアルコキシ、置換Ｃ_１−Ｃ_１２アミノアルコキシ、Ｃ_１−Ｃ_１２アルキルアミノオキシ、置換Ｃ_１−Ｃ_１２アルキルアミノオキシ、グアニジニル、置換グアニジニル、或いは保護基である。

別の実施形態において、前記２'?修飾ヌクレオシドは独立して、Ｏ（ＣＨ_２）_０−２ＣＨ_３、Ｏ（ＣＨ_２）_２ＯＣＨ_３、Ｏ（ＣＨ_２）_２ＳＣＨ_３、ＯＣＨ_２Ｃ（Ｈ）ＣＨ_２、Ｏ（ＣＨ_２）_２ＯＮ（ＣＨ_３）_２及びＯＣＨ_２Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｈ）ＣＨ_３から選択される２'?置換基を有する。

特定の実施形態において、前記ニ環性糖修飾ヌクレオシドのそれぞれは独立して、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ（Ｒ_１）−、−Ｃ（Ｒ_１）（Ｒ_２）−、−Ｃ（Ｒ_１）＝Ｃ（Ｒ_１）−、−Ｃ（Ｒ_１）＝Ｎ−、−Ｃ（＝ＮＲ_１）−、−Ｓｉ（Ｒ_１）（Ｒ_２）−、−Ｓ（＝Ｏ）_２−、−Ｓ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）−及び−Ｃ（＝Ｓ）−から独立して選択される１〜８結合バイラジカル基を有する２'及び４'−炭素原子の間の架橋基を有するものであり；各Ｒ_１及びＲ_２は独立して、Ｈ、ヒドロキシル、Ｃ_１−Ｃ_１２アルキル、置換Ｃ_１−Ｃ_１２アルキル、Ｃ_２−Ｃ_１２アルケニル、置換Ｃ_２−Ｃ_１２アルケニル、Ｃ_２−Ｃ_１２アルキニル、置換Ｃ_２−Ｃ_１２アルキニル、Ｃ_５−Ｃ_２０アリール、置換Ｃ_５−Ｃ_２０アリール、複素環ラジカル（遊離基）、置換複素環ラジカル、ヘテロアリール、置換へテロアリール、Ｃ_５−Ｃ_７脂環ラジカル、置換Ｃ_５−Ｃ_７脂環ラジカル、ハロゲン、置換オキシ（−Ｏ−）、アミノ、置換アミノ、アジド、カルボキシル、置換カルボキシル、アシル、置換アシル、ＣＮ、チオール、置換チオール、スルホニル（Ｓ（＝Ｏ）_２−Ｈ）、置換スルホニル、スルホキシル（Ｓ（＝Ｏ）−Ｈ）或いは置換スルホキシルであり；ここにおいて、各置換基は独立して、ハロゲン、Ｃ_１−Ｃ_１２アルキル、置換Ｃ_１−Ｃ_１２アルキル、Ｃ_２−Ｃ_１２アルケニル、置換Ｃ_２−Ｃ_１２アルケニル、Ｃ_２−Ｃ_１２アルキニル、置換Ｃ_２−Ｃ_１２アルキニル、アミノ、置換アミノ、アシル、置換アシル、Ｃ_１−Ｃ_１２アミノアルキル、Ｃ_１−Ｃ_１２アミノアルコキシ、置換Ｃ_１−Ｃ_１２アミノアルキル、置換Ｃ_１−Ｃ_１２アミノアルコキシ或いは保護基である。

いくつかの実施形態において、各安定化ヌクレオシド間結合基は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合基である。

本発明は、結合ヌクレオシドの連続配列を持つ、及び以下の化学式：
５'−Ｔ_１−（Ｎｕ_１−Ｌ_１）_ｎ１−（Ｎｕ_２−Ｌ_２）_ｎ２−Ｎｕ_２−（Ｌ_３−Ｎｕ_３）_ｎ３−Ｔ_２−３'
であって、ここにおいて：
各Ｎｕ_１及びＮｕ_３は独立して、安定化ヌクレオシドであり；
少なくとも１０個のＮｕ_２は、β−Ｄ−２'−デオキシ−２'−フルオロリボフラノシルヌクレオシドであり；
各Ｌ_１、Ｌ_２及びＬ_３は独立して、ヌクレオシド間結合基であり；
各Ｔ_１及びＴ_２は独立して、Ｈ、ヒドロキシル保護基、任意に結合した共役基或いはキャップ（ｃａｐｐｉｎｇ）基であり；
ｎ_１は０〜約３であり；
ｎ_２は約１４〜約２２であり；
ｎ_３は０〜約３であり；
ｎ_１が０である場合Ｔ_１はＨ或いはヒドロキシル保護基ではなく、ｎ_３が０の場合Ｔ_２はＨ或いはヒドロキシル保護基ではないという条件である；
を持つオリゴマー化合物を提供するものである。

いくつかの実施形態において、各安定化ヌクレオシドは、β−Ｄ−２'−デオキシ−２'−フルオロリボフラノシルヌクレオシドに関連した増強されたヌクレアーゼ安定性を提供するものである。

別の実施形態において、各Ｎｕ_２は、β−Ｄ−２'−デオキシ−２'−フルオロリボフラノシルヌクレオシドである。

特定の実施形態において、各Ｎｕ_２は独立して、安定化ヌクレオシド或いはβ−Ｄ−２'−デオキシ−２'−フルオロリボフラノシルヌクレオシドである。

更なる実施形態において、３'Ｎｕ_１安定化ヌクレオシドへ結合した前記Ｎｕ_２ヌクレオシド、及び５'Ｎｕ_３安定化ヌクレオシドへ結合した前記Ｎｕ_２ヌクレオシドはそれぞれ独立して、β−Ｄ−２'−デオキシ−２'−フルオロリボフラノシルヌクレオシドである。

他の実施形態において、安定化ヌクレオシドは独立して、２'?修飾ヌクレオシドである。更なる実施形態において、前記２'?修飾ヌクレオシドは二環性糖修飾ヌクレオシドである。付加的な実施形態において、各二環性糖修飾ヌクレオシドは独立して、アルファ或いはベータ立体配置におけるＤ或いはＬ糖を有する。

特定の実施形態において、各安定化ヌクレオシドは、β−Ｄ−リボフラノシルヌクレオシド
に関連したオリゴマー化合物の結合親和性を増加するものである。

更なる実施形態において、各２'?置換基は独立して、Ｏ−Ｃ_１−Ｃ_１２アルキル、Ｏ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＮＨ_２、Ｏ−（ＣＨ_２）_２−Ｏ−Ｎ（Ｒ_６）_２、Ｏ−ＣＨ_２Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｒ_６）_２、Ｏ−（ＣＨ_２）_２−Ｏ−（ＣＨ_２）_２−Ｎ（Ｒ_６）_２、Ｏ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＮＨＲ_６、Ｎ_３、Ｏ−ＣＨ_２−ＣＨ＝ＣＨ_２、ＮＨＣＯＲ_６或いはＯ−ＣＨ_２−Ｎ（Ｈ）−Ｃ（＝ＮＲ_６）［Ｎ（Ｒ_６）_２］から選択され；ここにおいて各Ｒ_６は独立して、Ｈ、Ｃ_１−Ｃ_１２アルキル、置換Ｃ_１−Ｃ_１２アルキル、Ｃ_２−Ｃ_１２アルケニル、置換Ｃ_２−Ｃ_１２アルケニル、Ｃ_２−Ｃ_１２アルキニル、置換Ｃ_２−Ｃ_１２アルキニル、或いは保護基であり、ここにおいて前記置換基は、ハロゲン、ヒドロキシル、アミノ、アジド、シアノ、ハロアルキル、アルケニル、アルコキシ、チオアルコキシ、ハロアルコキシ、或いはアリールである。

１実施形態において、各２'?置換基は独立して、Ｏ（ＣＨ_２）_０−２ＣＨ_３、Ｏ（ＣＨ_２）_２?ＯＣＨ_３、Ｏ（ＣＨ_２）_２ＳＣＨ_３、ＯＣＨ_２Ｃ（Ｈ）ＣＨ_２、Ｏ（ＣＨ_２）_２ＯＮ（ＣＨ_３）_２或いはＯＣＨ_２Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｈ）ＣＨ_３である。別の実施形態において、各２'?置換基は独立して、ＯＣＨ_３或いはＯ?（ＣＨ_２）_２?ＯＣＨ_３である。更なる実施形態において、各２'?置換基はＯ?（ＣＨ_２）_２?ＯＣＨ_３である。

１実施形態において、各二環性糖修飾ヌクレオシドは独立して、１〜５個の結合バイラジカル基を有する。別の実施形態において、各二環性糖修飾ヌクレオシドは独立して、２或いは３個の結合バイラジカル基を有する。別の実施形態において、各二環性糖修飾ヌクレオシドは２個の結合バイラジカルを有する。

１実施形態において、二環性糖修飾ヌクレオシドの各架橋基は独立して、?ＣＨ_２−、−（ＣＨ_２）_２−、−ＣＨ_２−Ｏ−、−（ＣＨ_２）_２−Ｏ−或いは−ＣＨ_２−Ｎ（Ｒ_３）−Ｏ−であり、ここにおいてＲ_３はＨ或いはＣ_１−Ｃ_１２アルキルである。別の実施形態において、各架橋基は独立して、−ＣＨ_２−Ｏ−或いは−（ＣＨ_２）_２−Ｏ−である。

１実施形態において、各二環性糖修飾ヌクレオシドの糖立体配置は独立して、ベータ?Ｄ或いはアルファ?Ｌである。

特定の実施形態において、前記安定化ヌクレオシドのそれぞれは独立して、以下の化学式：

を有し、ここにおいて：
Ｂｘは複素環塩基部位であり；
Ｅは、Ｈ、Ｃ_１−Ｃ_６アルキル、Ｃ_２−Ｃ_６アルケニル、Ｃ_２−Ｃ_６アルキニル、置換Ｃ_１−Ｃ_６アルキル、置換Ｃ_２−Ｃ_６アルケニル或いは置換Ｃ_２−Ｃ_６アルキニルであり；
ＹはＨであり、ＸはＯ−Ｃ_１−Ｃ_１０アルキル、Ｏ−Ｃ_２−Ｃ_１０アルケニル、Ｏ−Ｃ_２−Ｃ_１０アルキニル、置換Ｏ−Ｃ_１−Ｃ_１０アルキル、置換Ｏ−Ｃ_２−Ｃ_１０アルケニル、置換Ｏ−Ｃ_２−Ｃ_１０アルキニル、アミノ、置換アミノ或いはアジドである、或いは
ＸはＨであり、ＹはＣ_１−Ｃ_１０アルキル、置換Ｃ_１−Ｃ_１０アルキル、アミノ、或いは置換アミノである；若しくは、
Ｙ及びＸは共に、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ（Ｒ_４）−、−Ｃ（Ｒ_４）（Ｒ_５）−、−Ｃ（Ｒ_４）＝Ｃ（Ｒ_４）−、−Ｃ（Ｒ_４）＝Ｎ−、−Ｃ（＝ＮＲ_４）−、−Ｓｉ（Ｒ_４）_２−、−Ｓ（＝Ｏ）_２−、−ＳＯ−、−Ｃ（＝Ｏ）−及び−Ｃ（＝Ｓ）−から独立して選択された１〜８個の結合バイラジカル基を有する架橋基を有し；
各Ｒ_４及びＲ_５は独立して、Ｈ、ヒドロキシル、Ｃ_１−Ｃ_１２アルキル、置換Ｃ_１−Ｃ_１２アルキル、Ｃ_２−Ｃ_１２アルケニル、置換Ｃ_２−Ｃ_１２アルケニル、Ｃ_２−Ｃ_１２アルキニル、置換Ｃ_２−Ｃ_１２アルキニル、Ｃ_５−Ｃ_２０アリール、置換Ｃ_５−Ｃ_２０アリール、複素環ラジカル、置換複素環ラジカル、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、Ｃ_５−Ｃ_７脂環ラジカル、置換Ｃ_５−Ｃ_７脂環ラジカル、ハロゲン、置換オキシ（−Ｏ−）、アミノ、置換アミノ、アジド、カルボキシル、置換カルボキシル、アシル、置換アシル、ＣＮ、チオール、置換チオール、スルホニル（Ｓ（＝Ｏ）_２−Ｈ）、置換スルホニル、スルホキシル（Ｓ（＝Ｏ）−Ｈ）或いは置換スルホキシルであり；
各置換基は独立して、ハロゲン、Ｃ_１−Ｃ_１２アルキル、置換Ｃ_１−Ｃ_１２アルキル、Ｃ_２−Ｃ_１２アルケニル、置換Ｃ_２−Ｃ_１２アルケニル、Ｃ_２−Ｃ_１２アルキニル、置換Ｃ_２−Ｃ_１２アルキニル、アミノ、置換アミノ、アシル、置換アシル、Ｃ_１−Ｃ_１２アミノアルキル、Ｃ_１−Ｃ_１２アミノアルコキシ、置換Ｃ_１−Ｃ_１２アミノアルキル、置換Ｃ_１−Ｃ_１２アミノアルコキシ、或いは保護基である。

１実施形態において、ｎ_１及びｎ_３はそれぞれ独立して、１〜約３である。別の実施形態において、ｎ_１及びｎ_３はそれぞれ独立して２〜約３である。更なる実施形態において、ｎ_１は１或いは２であり、ｎ_３は２若しくは３である。別の実施形態において、ｎ_１及びｎ_３はそれぞれ２である。

１実施形態において、ｎ_１及びｎ_３の少なくとも一つはゼロより大きい。別の実施形態において、ｎ_１及びｎ_３はそれぞれゼロより大きい。他の実施形態において、ｎ_１及びｎ_３の一つはゼロより大きい。更なる実施形態において、ｎ_１及びｎ_３の一つは１より大きい。

１実施形態において、ｎ_２は１６〜２０である。別の実施形態において、ｎ_２は１７〜１９である。

１実施形態において、前記Ｎｕ_２ヌクレオシドの約２〜約８個は安定化ヌクレオシドである。別の実施形態において、前記Ｎｕ_２ヌクレオシドの約２〜約６個は安定化ヌクレオシドである。更なる実施形態において、前記Ｎｕ_２ヌクレオシドの約３〜約４個は安定化ヌクレオシドである。更なる実施形態において、前記Ｎｕ_２ヌクレオシドの３個は安定化ヌクレオシドである。

１実施形態において、前記Ｎｕ_２ヌクレオシドのそれぞれは、２〜約８個のβ−Ｄ−２'−デオキシ−２'−フルオロリボフラノシルヌクレオシドによって、前記Ｎｕ_３安定化ヌクレオシドとは分離されている。他の実施形態において、前記Ｎｕ_２ヌクレオシドのそれぞれは、３〜約８個のβ−Ｄ−２'−デオキシ−２'−フルオロリボフラノシルヌクレオシドによって、前記Ｎｕ_３安定化ヌクレオシドとは分離されている。更なる実施形態において、前記Ｎｕ_２ヌクレオシドのそれぞれは、５〜約８個のβ−Ｄ−２'−デオキシ−２'−フルオロリボフラノシルヌクレオシドによって、前記Ｎｕ_３安定化ヌクレオシドとは分離されている。

１実施形態において、オリゴマー化合物は２〜約６個のＮｕ_２安定化ヌクレオシドから成る。別の実施形態において、オリゴマー化合物は３個のＮｕ_２安定化ヌクレオシドから成る。

１実施形態において、前記Ｎｕ_２安定化ヌクレオシドのそれぞれは、１つの連続配列において結合している。別の実施形態において、少なくとも２個の前記Ｎｕ_２安定化ヌクレオシドは、少なくとも１個の前記β−Ｄ−２'−デオキシ−２'−フルオロリボフラノシルヌクレオシドによって分離されている。更なる実施形態において、前記Ｎｕ_２安定化ヌクレオシドのそれぞれは、少なくとも１個の前記β−Ｄ−２'−デオキシ−２'−フルオロリボフラノシルヌクレオシドによって分離されている。

１実施形態において、前記Ｎｕ_２β−Ｄ−２'−デオキシ−２'−フルオロリボフラノシルヌクレオシドの少なくとも２つの連続配列は、少なくとも１個の前記安定化ヌクレオシドによって分離されており、ここにおいて、前記連続配列のそれぞれは同数のβ−Ｄ−２'−デオキシ−２'−フルオロリボフラノシルヌクレオシドを有するものである。

１実施形態において、前記オリゴマー化合物は、約１８〜約２６個長のヌクレオシドを有するものである。別の実施形態において、前記オリゴマー化合物は、約１９〜約２４個長のヌクレオシドを有するものである。

１実施形態において、Ｔ_１及びＴ_２はそれぞれ独立して、Ｈ或いはヒドロキシル保護基である。別の実施形態において、少なくとも１つのＴ_１及びＴ_２は４，４'?ジメトキシトリチルである。更なる実施形態において、少なくとも１つのＴ_１及びＴ_２は共役基と任意に結合するものである。付加的な実施形態において、少なくとも１つのＴ_１及びＴ_２はキャップ基である。更なる実施形態において、前記キャップ基は逆位デオキシ脱塩基基である。

１実施形態において、各Ｌ_１、Ｌ_２及びＬ_３は独立して、ホスホジエステル或いはホスホロチオエートヌクレオシド間結合基である。別の実施形態において、各Ｌ_１、Ｌ_２及びＬ_３は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合基である。更なる実施形態において、各Ｌ_１、Ｌ_２及びＬ_３の少なくとも１つは、ホスホジエステルヌクレオシド間結合基によって提供される安定性と比較して、ヌクレアーゼ分解に対して増強された安定性を提供する安定化ヌクレオシド間結合基である。更なる実施形態において、各各Ｌ_１、Ｌ_２及びＬ_３は、安定化ヌクレオシド間結合基である。付加的な実施形態において、前記安定化ヌクレオシド間結合基のそれぞれは、リン含有ヌクレオシド間結合基である。別の実施形態において、前記安定化ヌクレオシド間結合基のそれぞれは独立して、リン含有ヌクレオシド間結合基、或いは非リン含有ヌクレオシド間結合基である。

本発明は、ヌクレオシドの連続配列を有し、及び以下の化学式Ｉ：
Ｔ_１−（Ｎｕ_１）_ｎ１−（Ｎｕ_２）_ｎ２−（Ｎｕ_３）_ｎ３−（Ｎｕ_４）_ｎ４−（Ｎｕ_５）_ｎ５−Ｔ_２であって、ここにおいて：
Ｎｕ_１及びＮｕ_５は独立して、２'安定化ヌクレオシドであり；
Ｎｕ_２及びＮｕ_４はβ−Ｄ−２'−デオキシ−２'−フルオロリボフラノシルヌクレオシドであり；
Ｎｕ_３は２'?修飾ヌクレオシドであり；
ｎ_１及びｎ_５のそれぞれは独立して、０〜３であり；
ｎ_２＋ｎ_４の合計は１０〜２５の間であり；
ｎ_３は０〜５であり；
Ｔ_１及びＴ_２のそれぞれは独立して、Ｈ、ヒドロキシル保護基、任意に結合した共役基、或いはキャップ基である、
を有するオリゴマー化合物を提供するものである。

１実施形態において、ｎ_２及びｎ_４の合計は１６或いは１７である。別の実施形態において、ｎ_１は２であり；ｎ_３は２であり；ｎ_５は２である。

特定の実施形態において、化合式Ｉは以下から選択されるものである。
ａ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝１９，ｎ３＝０，ｎ４＝０，ｎ５＝２、
ｂ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝２，ｎ３＝３，ｎ４＝１４，ｎ５＝２、
ｃ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝５，ｎ３＝３，ｎ４＝１１，ｎ５＝２、
ｄ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝８，ｎ３＝３，ｎ４＝８，ｎ５＝２、
ｅ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝１１，ｎ３＝３，ｎ４＝５，ｎ５＝２、
ｆ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝１４，ｎ３＝３，ｎ４＝２，ｎ５＝２、
ｇ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝９，ｎ３＝３，ｎ４＝７，ｎ５＝２、
ｈ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝１０，ｎ３＝３，ｎ４＝６，ｎ５＝２、
ｉ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝１２，ｎ３＝３，ｎ４＝４，ｎ５＝２、
ｊ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝３，ｎ３＝３，ｎ４＝１３，ｎ５＝２、
ｋ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝４，ｎ３＝３，ｎ４＝１２，ｎ５＝２、
ｌ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝６，ｎ３＝３，ｎ４＝１０，ｎ５＝２、
ｍ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝７，ｎ３＝３，ｎ４＝９，ｎ５＝２、
ｎ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝１３，ｎ３＝３，ｎ４＝３，ｎ５＝２、
ｏ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝８，ｎ３＝６，ｎ４＝５，ｎ５＝２、
ｐ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝２，ｎ３＝２，ｎ４＝１５，ｎ５＝２、
ｑ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝３，ｎ３＝２，ｎ４＝１４，ｎ５＝２、
ｒ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝４，ｎ３＝２，ｎ４＝１３，ｎ５＝２、
ｓ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝５，ｎ３＝２，ｎ４＝１２，ｎ５＝２、
ｔ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝６，ｎ３＝２，ｎ４＝１１，ｎ５＝２、
ｕ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝７，ｎ３＝２，ｎ４＝１０，ｎ５＝２、
ｖ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝８，ｎ３＝２，ｎ４＝９，ｎ５＝２、
ｗ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝９，ｎ３＝２，ｎ４＝８，ｎ５＝２、
ｘ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝１０，ｎ３＝２，ｎ４＝７，ｎ５＝２、
ｙ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝１１，ｎ３＝２，ｎ４＝６，ｎ５＝２、
ｚ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝１２，ｎ３＝２，ｎ４＝５，ｎ５＝２、
ａａ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝１３，ｎ３＝２，ｎ４＝４，ｎ５＝２、
ｂｂ）化学式Ｉ：ｎ５＝２，ｎ２＝１４，ｎ３＝２，ｎ４＝３，ｎ５＝２、又は
ｃｃ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝１５，ｎ３＝２，ｎ４＝２，ｎ５＝２

いくつかの実施形態において、Ｎｕ_１及びＮｕ_５は独立して、２'?修飾ヌクレオシドである。

１実施形態において、Ｎｕ_１はＯ−（ＣＨ_２）_２−ＯＣＨ_３であり、Ｎｕ_３はＯ−（ＣＨ_２）_２−ＯＣＨ_３であり、Ｎｕ_５はＯ−（ＣＨ_２）_２−ＯＣＨ_３であり、Ｔ_１はＨであり、Ｔ_２はＨであり、化学式Ｉは以下から選択されるものである。
ａ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝１９，ｎ３＝０，ｎ４＝０，ｎ５＝２、
ｂ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝２，ｎ３＝３，ｎ４＝１４，ｎ５＝２、
ｃ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝５，ｎ３＝３，ｎ４＝１１，ｎ５＝２、
ｄ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝８，ｎ３＝３，ｎ４＝８，ｎ５＝２、
ｅ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝１１，ｎ３＝３，ｎ４＝５，ｎ５＝２、
ｆ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝１４，ｎ３＝３，ｎ４＝２，ｎ５＝２、
ｇ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝９，ｎ３＝３，ｎ４＝７，ｎ５＝２、
ｈ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝１０，ｎ３＝３，ｎ４＝６，ｎ５＝２、
ｉ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝１２，ｎ３＝３，ｎ４＝４，ｎ５＝２、
ｊ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝３，ｎ３＝３，ｎ４＝１３，ｎ５＝２、
ｋ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝４，ｎ３＝３，ｎ４＝１２，ｎ５＝２、
ｌ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝６，ｎ３＝３，ｎ４＝１０，ｎ５＝２、
ｍ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝７，ｎ３＝３，ｎ４＝９，ｎ５＝２、
ｎ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝１３，ｎ３＝３，ｎ４＝３，ｎ５＝２、
ｏ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝８，ｎ３＝６，ｎ４＝５，ｎ５＝２、
ｐ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝２，ｎ３＝２，ｎ４＝１５，ｎ５＝２、
ｑ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝３，ｎ３＝２，ｎ４＝１４，ｎ５＝２、
ｒ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝４，ｎ３＝２，ｎ４＝１３，ｎ５＝２、
ｓ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝５，ｎ３＝２，ｎ４＝１２，ｎ５＝２、
ｔ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝６，ｎ３＝２，ｎ４＝１１，ｎ５＝２、
ｕ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝７，ｎ３＝２，ｎ４＝１０，ｎ５＝２、
ｖ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝８，ｎ３＝２，ｎ４＝９，ｎ５＝２、
ｗ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝９，ｎ３＝２，ｎ４＝８，ｎ５＝２、
ｘ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝１０，ｎ３＝２，ｎ４＝７，ｎ５＝２、
ｙ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝１１，ｎ３＝２，ｎ４＝６，ｎ５＝２、
ｚ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝１２，ｎ３＝２，ｎ４＝５，ｎ５＝２、
ａａ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝１３，ｎ３＝２，ｎ４＝４，ｎ５＝２、
ｂｂ）化学式Ｉ：ｎ５＝２，ｎ２＝１４，ｎ３＝２，ｎ４＝３，ｎ５＝２、又は
ｃｃ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝１５，ｎ３＝２，ｎ４＝２，ｎ５＝２。

１実施形態において、前記オリゴマー化合物は、少なくとも１つのホスホロチオエートヌクレオシド間結合を有するものである。別の実施形態において、各ヌクレオシド間結合はホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。

１実施形態において、Ｔ_１はＨでありＴ_２はＨである。

本発明は、ｍｉＲＮＡ活性を阻害する方法を提供し、この方法は、ヌクレオシド間結合基によって結合された約１７〜約２９個のヌクレオシドの連続配列を有するオリゴマー化合物を細胞と接触させる工程であって、前記配列は２つの外部領域間に位置した内部領域を有し、各外部領域は独立して１〜約３個のヌクレオシドを有し、各外部領域は安定化ヌクレオシドを有し、前記内部領域は少なくともの１０個のβ−Ｄ−２'−デオキシ−２'−フルオロリボフラノシルヌクレオシドを有し、前記安定化ヌクレオシドのそれぞれは、β−Ｄ−２'−デオキシ−２'−フルオロリボフラノシルヌクレオシドに関連した増強されたヌクレアーゼ安定性を提供するものである、工程を有し、ここにおいて前記オリゴマー化合物は、ｍｉＲＮＡに対して実質的に相補的な配列を有するものである。

本発明はさらに、ｍｉＲＮＡ活性を阻害する方法を提供し、この方法は、ｍｉＲＮＡに対して実質的に相補的な配列を有し、ヌクレオシド間結合基によって結合した約１７〜約２９個のヌクレオシドの連続配列を有するオリゴマー化合物を細胞へ接触させる工程を有し、前記配列は２つの外部領域の間に位置した内部領域を有し、各外部領域は独立して１〜約３個のヌクレオシドを有し、各外部領域は安定化修飾を有し、前記内部領域は少なくとも１０個のβ−Ｄ−２'−デオキシ−２'−フルオロリボフラノシルヌクレオシドを有するものである。

本発明は付加的に、ｍｉＲＮＡ活性を阻害する方法を提供し、この方法は、ｍｉＲＮＡに対して実質的に相補的な配列を有し、以下の化学式：
５'−Ｔ_１−（Ｎｕ_１−Ｌ_１）_ｎ１−（Ｎｕ_２−Ｌ_２）_ｎ２−Ｎｕ_２−（Ｌ_３−Ｎｕ_３）_ｎ３−Ｔ_２−３'
であって、ここにおいて：
各Ｎｕ_１及びＮｕ_３は独立して、安定化ヌクレオシドであり；
少なくとも１０個のＮｕ_２は、β−Ｄ−２'−デオキシ−２'−フルオロリボフラノシルヌクレオシドであり；
各Ｌ_１、Ｌ_２及びＬ_３は独立して、ヌクレオシド間結合基であり；
各Ｔ_１及びＴ_２は独立して、Ｈ、ヒドロキシル保護基、任意に結合した共役基、或いはキャップ基であり；
ｎ_１は０〜約３であり；
ｎ_２は約１４〜約２２であり；
ｎ_３は０〜約３であり；
ｎ_１が０である場合Ｔ_１はＨ或いはヒドロキシル保護基ではなく、ｎ_３が０の場合Ｔ_２はＨ或いはヒドロキシル保護基ではないという条件である；
を持つ、オリゴマー化合物を細胞へ接触させる工程を有するものである。

本発明はさらに、ｍｉＲＮＡ活性を阻害する方法も提供し、この方法は、ｍｉＲＮＡに対して実質的に相補的な配列を有し、以下の化学式：
Ｔ_１−（Ｎｕ_１）_ｎ１−（Ｎｕ_２）_ｎ２−（Ｎｕ_３）_ｎ３−（Ｎｕ_４）_ｎ４−（Ｎｕ_５）_ｎ５−Ｔ_２
であって、ここにおいて：
Ｎｕ_１及びＮｕ_５は独立して、２'安定化ヌクレオシドであり；
Ｎｕ_２及びＮｕ_４は、β−Ｄ−２'−デオキシ−２'−フルオロリボフラノシルヌクレオシドであり；
Ｎｕ_３は、２'−修飾ヌクレオシドであり；
ｎ_１及びｎ_５はそれぞれ独立して０〜３であり；
ｎ_２＋ｎ_４の合計は１０〜２５の間であり；
ｎ_３は０〜５であり；
Ｔ_１及びＴ_２のそれぞれは独立して、Ｈ、ヒドロキシル保護基、任意に連結した共役基、或いはキャップ基である；
を持つオリゴマー化合物を細胞へ接触させる工程を有するものである。

１実施形態において、前記オリゴマー化合物は、ｍｉＲＮＡに対して完全に相補的である。他の実施形態において、前記オリゴマー化合物は、配列ＩＤ番号１〜４７０から選択された配列を有するものである。

１実施形態において、前記細胞はインビトロである。別の実施形態において、前記細胞はインビボである。他の実施形態において、前記細胞へ接触させる工程は、動物へ投与する工程を有する。

１実施形態において、前記方法は、本発明のオリゴマー化合物を動物へ接触させることによるインビボでのｍｉＲＮＡ活性の阻害を有するものである。

本発明は、インビボでのｍｉＲ−１２２活性を阻害する方法を提供し、この方法は、配列ＩＤ番号：１９の核酸塩基を有し、化学式Ｔ_１−（Ｎｕ_１）_ｎ１−（Ｎｕ_２）_ｎ２−（Ｎｕ_３）_ｎ３−（Ｎｕ_４）_ｎ４−（Ｎｕ_５）_ｎ５−Ｔ_２であって、ここにおいてＮｕ_１はＯ−（ＣＨ_２）_２−ＯＣＨ_３であり、Ｎｕ_３はＯ−（ＣＨ_２）_２−ＯＣＨ_３であり、Ｎｕ_５はＯ−（ＣＨ_２）_２−ＯＣＨ_３であり、Ｔ_１はＨであり、Ｔ_２はＨであり、ここにおいて化学式Ｉは以下から選択されるものである。
ａ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝１９，ｎ３＝０，ｎ４＝０，ｎ５＝２、
ｂ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝２，ｎ３＝３，ｎ４＝１４，ｎ５＝２、
ｃ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝５，ｎ３＝３，ｎ４＝１１，ｎ５＝２、
ｄ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝８，ｎ３＝３，ｎ４＝８，ｎ５＝２、
ｅ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝１１，ｎ３＝３，ｎ４＝５，ｎ５＝２、
ｆ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝１４，ｎ３＝３，ｎ４＝２，ｎ５＝２、
ｇ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝９，ｎ３＝３，ｎ４＝７，ｎ５＝２、
ｈ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝１０，ｎ３＝３，ｎ４＝６，ｎ５＝２、
ｉ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝１２，ｎ３＝３，ｎ４＝４，ｎ５＝２、
ｊ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝３，ｎ３＝３，ｎ４＝１３，ｎ５＝２、
ｋ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝４，ｎ３＝３，ｎ４＝１２，ｎ５＝２、
ｌ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝６，ｎ３＝３，ｎ４＝１０，ｎ５＝２、
ｍ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝７，ｎ３＝３，ｎ４＝９，ｎ５＝２、
ｎ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝１３，ｎ３＝３，ｎ４＝３，ｎ５＝２、
ｏ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝８，ｎ３＝６，ｎ４＝５，ｎ５＝２、
ｐ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝２，ｎ３＝２，ｎ４＝１５，ｎ５＝２、
ｑ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝３，ｎ３＝２，ｎ４＝１４，ｎ５＝２、
ｒ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝４，ｎ３＝２，ｎ４＝１３，ｎ５＝２、
ｓ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝５，ｎ３＝２，ｎ４＝１２，ｎ５＝２、
ｔ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝６，ｎ３＝２，ｎ４＝１１，ｎ５＝２、
ｕ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝７，ｎ３＝２，ｎ４＝１０，ｎ５＝２、
ｖ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝８，ｎ３＝２，ｎ４＝９，ｎ５＝２、
ｗ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝９，ｎ３＝２，ｎ４＝８，ｎ５＝２、
ｘ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝１０，ｎ３＝２，ｎ４＝７，ｎ５＝２、
ｙ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝１１，ｎ３＝２，ｎ４＝６，ｎ５＝２、
ｚ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝１２，ｎ３＝２，ｎ４＝５，ｎ５＝２、
ａａ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝１３，ｎ３＝２，ｎ４＝４，ｎ５＝２、
ｂｂ）化学式Ｉ：ｎ５＝２，ｎ２＝１４，ｎ３＝２，ｎ４＝３，ｎ５＝２、又は
ｃｃ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝１５，ｎ３＝２，ｎ４＝２，ｎ５＝２。

化学式を持つオリゴマー化合物で動物を接触させる工程を有するものである。

１実施形態において、インビボでｍｉＲ−１２２活性を阻害する前記方法はさらに、肝臓ＡＬＤＯＡｍＲＮＡレベルを増加させる工程を有するものである。別の実施形態において、インビボでｍｉＲ−１２２活性を阻害する前記方法はさらに、血漿総コレステロールレベルを減少させる工程を有するものである。

１実施形態において、オリゴマー化合物は２０〜２４個の結合ヌクレオシドを有するものである。別の実施形態において、オリゴマー化合物は２１個の結合ヌクレオシドを有するものである。更なる実施形態において、オリゴマー化合物は２２個の結合ヌクレオシドを有するものである。付加的な実施形態において、オリゴマー化合物は２３個の結合ヌクレオシドを有するものである。

ｍｉＲＮＡは病的状態において異常に発現することが見出されている。例えば、健康な細胞又は組織と比較すると、特定のｍｉＲＮＡは病的細胞又は組織においてより高いもしくは低いレベルで存在する。本発明は特に、病的状態に付随するものを含むｍｉＲＮＡ活性を調整する組成及び方法を提供するものである。本発明に係る特定の組成物は強力な活性及び／または改善された治療インデックスを有するため、インビボの方法に使用するのに特に適している。

オリゴマー化合物中の化学的に合成されたヌクレオチドの使用は、ｍｉＲＮＡのようなスモールノンコーディングＲＮＡに結合／調整するオリゴマーの能力に影響を与えるということが知られている。さらにオリゴマー化合物中に化学的に修飾されたヌクレオチドを配置すると、オリゴマー化合物の治療インデックスが影響を受けることが見出されている。本発明は特に、ｍｉＲＮＡのようなスモールノンコーディングＲＮＡの調整に使用する、強い活性及び改善された治療インデックスを有するオリゴマー化合物を提供する。

二つの２'−ＭＯＥ安定化ヌクレオシドによって５'及び３'各末端の側方に配置された１９β−Ｄ−２'−デオキシ−２'−フルオロリボフラノシルヌクレオシドを有するオリゴマー化合物のインビボ試験において、前記オリゴマー化合物は、２'−均一（ｕｎｉｆｏｒｍ）ＭＯＥオリゴマー化合物のＴｍと同じＴｍを有するが、インビボでｍｉＲＮＡを抑制する大幅に増強された能力を示していた。したがって、本発明は、とりわけ、各々がヌクレオシド間結合基によって結合したヌクレオシドの近接した配列を含む、化学的に合成されたオリゴマー化合物を提供する。各オリゴマー化合物は約１０のβ−Ｄ−２'−デオキシ−２'−フルオロリボフラノシルヌクレオシドを含み、さらに、安定化ヌクレオシドを含む１もしくはそれ以上の外部領域を含む。一つの態様では、オリゴマー化合物の各ヌクレオシドはβ−Ｄ−２'−デオキシ−２'−フルオロリボフラノシルヌクレオシドであり、３'及び５'末端ヌクレオシドの一方または両方が抱合基またはキャッピング基に結合している。さらなる態様では、前記オリゴマー化合物の少なくとも１０のヌクレオシドがβ−Ｄ−２'−デオキシ−２'−フルオロリボフラノシルヌクレオシドであり、１もしくはそれ以上の付加的な安定化ヌクレオシドが３'及び５'末端の一方または両方に結合している。

さらなる試験によって、前記オリゴマー化合物の治療係数はオリゴマー化合物の内部領域にあるヌクレオチドまたはヌクレオシドを取り入れることによって改善されうるということが証明された。２'−ＭＯＥ安定化ヌクレオシドによって５'及び３'各末端の側方に配置されたβ−Ｄ−２'−デオキシ−２'−フルオロリボフラノシルヌクレオシドの内部領域を含み、さらに内部領域に２'−ＭＯＥヌクレオシドを含むオリゴマー化合物が、内部２'ＭＯＥヌクレオシドなしのオリゴマー化合物に比べて、減少した免疫刺激活性を有することが示された。したがって、本発明はとりわけ、オリゴマー化合物であって、このオリゴマー化合物の少なくとも１０のヌクレオシドがβ−Ｄ−２'−デオキシ−２'−フルオロリボフラノシルヌクレオシドであって、１もしくはそれ以上の付加的な安定化ヌクレオシドが３'及び５'末端の一方または両方に結合しており、更に２'ＭＯＥヌクレオシドが前記オリゴマー化合物の一もしくはそれ以上の内部の位置に含まれているオリゴマー化合物を提供する。特定の実施形態においては、前記オリゴマー化合物の少なくとも１０のヌクレオシドがβ−Ｄ−２'−デオキシ−２'−フルオロリボフラノシルヌクレオシドであり、１もしくはそれ以上の付加的な安定化ヌクレオシドが３'及び５'末端の一方または両方に結合しており、更に２'−修飾ヌクレオシドがオリゴマー化合物の１もしくはそれ以上の内部の位置に含まれる。他の実施形態においては、前記オリゴマー化合物の少なくとも１０のヌクレオシドがβ−Ｄ−２'−デオキシ−２'−フルオロリボフラノシルヌクレオシドであり、１もしくはそれ以上の付加的な安定化修飾が３'及び５'末端の一方または両方に結合しており、安定化ヌクレオシドが前記オリゴマー化合物の１もしくはそれ以上の内部位置に含まれる。一般的に、前記３'及び５'末端における安定化修飾はβ−Ｄ−２'−デオキシ−２'−フルオロリボフラノシルヌクレオシドだけを有するオリゴマー化合物に比較して、増強した安定性を提供する。特定の実施形態においては、安定化修飾は安定化ヌクレオシド及び／または安定化ヌクレオシド間結合基である。

強い活性と改善された治療係数を有するオリゴマー化合物は以下の化学式で説明することが可能であり、Ｔ_１−（Ｎｕ_１）_ｎ１−（Ｎｕ_２）_ｎ２−（Ｎｕ_３）_ｎ３−（Ｎｕ_４）_ｎ４−（Ｎｕ_５）_ｎ５−Ｔ_２、式中、Ｎｕ_１及びＮｕ_５は独立して２'安定化ヌクレオシドであり、Ｎｕ_２及びＮｕ_４はβ−Ｄ−２'−デオキシ−２'−フルオロリボフラノシルヌクレオシドであり、，Ｎｕ_３は２'−修飾ヌクレオシドであり、ｎ１及びｎ５の各々は独立して０〜３であり、ｎ２及びｎ４の和は１０〜２５の間であり、ｎ３は０〜５であり、Ｔ_１はＴ_２の各々は独立してＨ、ヒドロキシル保護基、任意に結合した抱合基またはキャッピング基である。

一つの実施形態において、オリゴマー化合物は、次のように、ｎ１、ｎ２、ｎ３、ｎ４、及びｎ５の構造を有するものであることがさらに説明される。

ｎ１＝２，ｎ２＝１９，ｎ３＝０，ｎ４＝０，ｎ５＝２（立体構造Ａ）、
ｎ１＝２，ｎ２＝２，ｎ３＝３，ｎ４＝１４，ｎ５＝２（立体構造Ｂ）、
ｎ１＝２，ｎ２＝５，ｎ３＝３，ｎ４＝１１，ｎ５＝２（立体構造Ｃ）、
ｎ１＝２，ｎ２＝８，ｎ３＝３，ｎ４＝８，ｎ５＝２（立体構造Ｄ）、
ｎ１＝２，ｎ２＝１１，ｎ３＝３，ｎ４＝５，ｎ５＝２（立体構造Ｅ）、
ｎ１＝２，ｎ２＝１４，ｎ３＝３，ｎ４＝２，ｎ５＝２（立体構造Ｆ）、
ｎ１＝２，ｎ２＝９，ｎ３＝３，ｎ４＝７，ｎ５＝２（立体構造Ｇ）、
ｎ１＝２，ｎ２＝１０，ｎ３＝３，ｎ４＝６，ｎ５＝２（立体構造Ｈ）、
ｎ１＝２，ｎ２＝１２，ｎ３＝３，ｎ４＝４，ｎ５＝２（立体構造Ｉ）、
ｎ１＝２，ｎ２＝３，ｎ３＝３，ｎ４＝１３，ｎ５＝２（立体構造Ｊ）、
ｎ１＝２，ｎ２＝４，ｎ３＝３，ｎ４＝１２，ｎ５＝２（立体構造Ｋ）、
ｎ１＝２，ｎ２＝６，ｎ３＝３，ｎ４＝１０，ｎ５＝２（立体構造Ｌ）、
ｎ１＝２，ｎ２＝７，ｎ３＝３，ｎ４＝９，ｎ５＝２（立体構造Ｍ）、
ｎ１＝２，ｎ２＝１３，ｎ３＝３，ｎ４＝３，ｎ５＝２（立体構造Ｎ）、
ｎ１＝２，ｎ２＝８，ｎ３＝６，ｎ４＝５，ｎ５＝２（立体構造Ｏ）、
ｎ１＝２，ｎ２＝２，ｎ３＝２，ｎ４＝１５，ｎ５＝２（立体構造Ｐ）、
ｎ１＝２，ｎ２＝３，ｎ３＝２，ｎ４＝１４，ｎ５＝２（立体構造Ｑ）、
ｎ１＝２，ｎ２＝４，ｎ３＝２，ｎ４＝１３，ｎ５＝２（立体構造Ｒ）、
ｎ１＝２，ｎ２＝５，ｎ３＝２，ｎ４＝１２，ｎ５＝２（立体構造Ｓ）、
ｎ１＝２，ｎ２＝６，ｎ３＝２，ｎ４＝１１，ｎ５＝２（立体構造Ｔ）、
ｎ１＝２，ｎ２＝７，ｎ３＝２，ｎ４＝１０，ｎ５＝２（立体構造Ｕ）、
ｎ１＝２，ｎ２＝８，ｎ３＝２，ｎ４＝９，ｎ５＝２（立体構造Ｖ）、
ｎ１＝２，ｎ２＝９，ｎ３＝２，ｎ４＝８，ｎ５＝２（立体構造Ｗ）、
ｎ１＝２，ｎ２＝１０，ｎ３＝２，ｎ４＝７，ｎ５＝２（立体構造Ｘ）、
ｎ１＝２，ｎ２＝１１，ｎ３＝２，ｎ４＝６，ｎ５＝２（立体構造Ｙ）、
ｎ１＝２，ｎ２＝１２，ｎ３＝２，ｎ４＝５，ｎ５＝２（立体構造Ｚ）、
ｎ１＝２，ｎ２＝１３，ｎ３＝２，ｎ４＝４，ｎ５＝２（立体構造ＡＡ）、
ｎ５＝２，ｎ２＝１４，ｎ３＝２，ｎ４＝３，ｎ５＝２（立体構造ＢＢ）、又は
ｎ１＝２，ｎ２＝１５，ｎ３＝２，ｎ４＝２，ｎ５＝２（立体構造ＣＣ）。

特定の実施形態おいては、表１で示されているように、オリゴマー化合物はヌクレオチド配列及び化学式Ｉの次のような組み合わせを有することが可能であり、各々のヌクレオシドはホスホロチオエートヌクレオシド間結合基によって結合している。他の実施形態において、表１で示されている化学式Ｉの例は、２３個の結合ヌクレオシドを含むあらゆるオリゴマー化合物に適用される。

特定の実施形態において、表２で示されているように、オリゴマー化合物はヌクレオチド配列と化学式Ｉの次のような組み合わせを有することが可能であり、各々のヌクレオシドはホスホロチオエートヌクレオシド間結合基によって結合している。他の実施形態において、表２で示されている化学式Ｉの例は２２個の結合ヌクレオシドを含むあらゆるオリゴマー化合物に適用される。

特定の実施形態において、表３で示されているように、オリゴマー化合物はヌクレオチド配列と化学式Ｉの次のような組み合わせを有することが可能であり、各々のヌクレオシドはホスホロチオエートヌクレオシド間結合基によって結合している。他の実施形態において、表３で示されている化学式Ｉの例は２１個の結合ヌクレオシドを含むあらゆるオリゴマー化合物に適用される。

特定の実施形態において、表４で示されているように、オリゴマー化合物はヌクレオチド配列と化学式Ｉの次のような組み合わせを有することが可能であり、各々のヌクレオシドはホスホロチオエートヌクレオシド間結合基によって結合している。他の態様において、表４で示されている化学式Ｉの例は２０個の結合ヌクレオシドを含むあらゆるオリゴマー化合物に適用される。

特定の実施形態において、表５で示されているように、オリゴマー化合物はヌクレオチド配列と化学式Ｉの次のような組み合わせを有することが可能であり、各々のヌクレオシドはホスホロチオエートヌクレオシド間結合基によって結合している。他の態様において、表５で示されている化学式Ｉの例は２４個の結合ヌクレオシドを含むあらゆるオリゴマー化合物に適用される。

さらなる実施形態において、上述した構造を有することに加えて、前記オリゴマー化合物は安定化ヌクレオチドとしてＮｕ_１、Ｎｕ_３、及びＮｕ_５の各々を有するように記載される。特定の実施形態において、オリゴマー化合物は上述したモチーフを有することが可能であり、Ｎｕ_１、Ｎｕ_３、及びＮｕ_５の各々は２'−ＭＯＥである。さらなる実施形態において、各ヌクレオシド間結合はホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。

本発明のオリゴマー化合物は結合ヌクレオシドの連続配列を有し、以下の化学式によっても記載することが可能であり、
５'−Ｔ_１−（Ｎｕ_１−Ｌ_１）_ｎ１−（Ｎｕ_２−Ｌ_２）_ｎ２−Ｎｕ_２−（Ｌ_３−Ｎｕ_３）_ｎ３−Ｔ_２−３'、
式中、
各Ｎｕ_１及びＮｕ_３は独立して安定化ヌクレオシドであり、
少なくとも１０個のＮｕ_２はβ−Ｄ−２'−デオキシ−２'−フルオロリボフラノシルヌクレオシドであり、
各Ｌ_１、Ｌ_２及びＬ_３は独立してヌクレオシド間結合基であり、
各Ｔ_１及びＴ_２は独立してＨ、ヒドロキシ保護基、選択的に結合した抱合基またはキャッピング基であり、
ｎ_１は０〜約３であり、
ｎ_２は１４〜約２２であり、
ｎ_３は０〜約３であり、及び
但し、ｎ_１が０でない場合は、Ｔ_１はＨまたはヒドロキシ保護基でなく、ｎ_３が０の場合、Ｔ_２はＨまたはヒドロキシ保護基ではないものである。
オリゴマー化合物は、配列ＩＤ番号１〜４７０から選択された近接ヌクレオチド配列に適用される本願明細書に記載された化学式を有するものであっても良い。

「安定化修飾」は、ヌクレアーゼの存在下において、ホスホジエステルヌクレオシド間結合によって結合した２'−デオキシヌクレオシドによって提供されるものと比較して、増強した安定性を提供することを意味する。このように、そのような修飾がオリゴマー化合物に「増強したヌクレアーゼ安定性」を提供する。安定化修飾は少なくとも安定化ヌクレオシド及び安定化ヌクレオシド間結合基を含む。

「安定性増強ヌクレオシド」又は「安定化ヌクレオシド」という用語は、オリゴマー化合物の増強したヌクレアーゼの安定性を提供するための、当業者に周知のヌクレオシドの全ての様式を含むことを意味する。一つの実施形態において、安定化ヌクレオシドは２'−修飾ヌクレオシドであっても良い。そのような安定性を増強する２'−修飾ヌクレオシドの例は、２'−ＯＣＨ３、２'−メトキシエトキシ（２'−Ｏ−ＣＨ_２ＣＨ_２ＯＣＨ_３，Ｍａｒｔｉｎｅｔａｌ．，Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，１９９５，７８，４８６−５０４）、２環糖修飾ヌクレオシド、２'−ジメチルアミノオキシエトキシ（Ｏ（ＣＨ_２）_２ＯＮ（ＣＨ_３）_２、２'−ジメチルアミノエトキシエトキシ（２'−Ｏ−ＣＨ_２−Ｏ−ＣＨ_２−Ｎ（ＣＨ_３）_２）、メトキシ（−Ｏ−ＣＨ_３）、アミノプロポキシ（−ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＮＨ_２）、アリル（−ＣＨ_２−ＣＨ＝ＣＨ_２）、−Ｏ−アリル（−Ｏ−ＣＨ_２−ＣＨ＝ＣＨ_２）、及び２'−アセトアミド（２'−Ｏ−ＣＨ_２Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ１Ｒ１であって、各Ｒ１は独立して，Ｈ又はＣ１−Ｃ１アルキルであるものを含むが、これらに限定されるない。

そのような２'−修飾ヌクレオシドの調製を教示する代表する米国特許は米国特許第４，第９８１，９５７号、第５，１１８，８００号、第５，３１９，０８０号、第５，３５９，０４４号、第５，３９３，８７８号、第５，４４６，１３７号、第５，４６６，７８６；５，第５１４，７８５号、第５，５１９，１３４号、第５，５６７，８１１号、第５，５７６，４２７号、第５，５９１，７２２号、第５，５９７，９０９号、第５，６１０，３００、第５，６２７，０５３号、第５，６３９，８７３号、第５，６４６，２６５号、第５，６５８，８７３号、第５，６７０，６３３号、第５，７９２，７４７号、及び第５，７００，９２０号明細書を含むが、これらに限定されるものではなく、それらのうちのあるものは本出願と共に所有されており、その各々は本参照により本願明細書に組みこまれるものである。

一つの態様において、本発明は少なくとも一つの安定性増強ヌクレオシド間結合を有するオリゴマー化合物を提供する。「安定性増強ヌクレオシド間結合」又は「安定化ヌクレオシド間結合基」という用語は、ホスホジエステルヌクレオシド間結合によって提供されるものと比較して、オリゴマー化合物に増強したヌクレアーゼの安定性を提供する、ヌクレオシド間結合基の全ての様式を含むことを意味する。このように安定性増強ヌクレオシド間結合はホスホジエステルヌクレオシド間結合以外の結合である。そのような安定化増強ヌクレオシド間結合の例はホスホチオエートヌクレオシド間結合を含むが、これらに限定されるものではない。

安定性増強ヌクレオシド間結合の調製を教示する代表する米国特許は米国特許第３，６８７，８０８号、第５，２８６，７１７号、第５，５８７，３６１号、第５，６７２，６９７号、第５，４８９，６７７号、第５，６６３，３１２号、第５，６４６，２６９号、及び第５，６７７，４３９号明細書を含むが、これらに限定されるものではなく、その各々は本参照により本願明細書に組み込まれる。

本願明細書において提供されるオリゴマー化合物の例は、スモールノンコーディングＲＮＡに対して１００％の相補性を含む、実質的に相補的である核酸塩基配列を含む。そのようなオリゴマー化合物例はスモールノンコーディングＲＮＡにハイブリダイズでき、更に活性を調節することが可能である。一つの実施形態において、オリゴマー化合物がハイブリダイズするスモールノンコーディングＲＮＡはｍｉＲＮＡである。

さらに、スモールノンコーディングＲＮＡのレベル、発現、処理、又は機能を調節するための方法が提供されている。本発明のオリゴマー化合物は、スモールノンコーディングＲＮＡ核酸標的物を含む又はコードした核酸にハイブリダイズすることによって、スモールノンコーディングＲＮＡのレベル、発現、機能を調節し、その結果正常機能を変化させることができる。一つの実施形態において、正常機能の変化は、切断を通して、隔離によって、または立体的に閉塞させることによって、スモールノンコーディングＲＮＡの破壊を促進するオリゴマー化合物の能力による。他の実施形態において、前記オリゴマー化合物はスモールノンコーディングＲＮＡに安定してハイブリダイズし、スモールノンコーディングＲＮＡが正常細胞標的にハイブリダイズすること、及び正常細胞標的の活性を制御することを抑制する。一つの実施形態において、前記調節はｍｉＲＮＡの機能を抑制することを含む。

本願明細書において提供される方法は、動物においてｍｉＲＮＡ活性を抑制する方法を含み、この方法は、強い活性及び改善された治療係数を有するオリゴマー化合物を動物に接触させる工程を含む。一部の実施形態において、前記オリゴマー化合物は配列ＩＤ番号１〜４７０から選択される配列の、少なくとも１８の近接ヌクレオチドを含む。他の実施形態において、オリゴマー化合物は配列ＩＤ番号１〜４７０から選択される配列の、少なくとも２０の近接ヌクレオチドを含む。他の実施形態において、オリゴマー化合物は配列ＩＤ番号１〜４７０から選択される配列から成る。

本願明細書において提供される実施形態は、動物でコレステロールを減少させる方法を含み、この方法は、動物、特にヒトで強い活性及び改善された治療係数を有するオリゴマー化合物を投与する工程を含む。一つの実施形態において、ｍｉＲ−１２２ａは本発明のオリゴマー化合物で標的化されている。

本願明細書において、オリゴマー化合物及びオリゴマー化合物を含む組成物が提供され、前記オリゴマー化合物は、分解又は切断メカニズムによってスモールノンコーディングＲＮＡのレベル、発現、または機能の調節をサポートすることができる化合物になる１もしくはそれ以上の修飾を含む。

更に、本願明細書は、オリゴマー化合物及びオリゴマー化合物を含む組成物が提供され、前記オリゴマー化合物は立体的な閉鎖によって、１もしくはそれ以上のスモールノンコーディングＲＮＡのレベル、発現、または機能を阻害する又は妨げることができる化合物になる１もしくはそれ以上の修飾を含む。

「治療係数」は所望の効果を引き起こす用量に対する望ましくない効果をもたらすオリゴマー化合物の用量の比を意味する。本開示の本脈において、オリゴマー化合物は、活性は保持されているが、望ましくない効果が減少又はない場合、「改善した治療係数」を示す。例えば、改善された治療係数を有するオリゴマー化合物は、免疫刺激活性のような望ましくない効果をもたらすことなく、又は少なくとも化合物の投与を禁止させる程度の望ましくない効果をもたらすことなく、ｍｉＲＮＡ活性を抑制する能力を保持する。

本願明細書で使用される「スモールノンコーディングＲＮＡ」という用語は、これらに限定されることはないが、長さが１７から２９ヌクレオチドの範囲のポリヌクレオチドを包含するために使用される。一つの実施形態では、スモールノンコーディングＲＮＡはｍｉＲＮＡである（ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ、Ｍｉｒｓ、ｍｉＲｓ、ｍｉｒｓ、及び成熟したｍｉＲＮＡｓとしても知られている。

本願明細書で使用される「ｍｉＲＮＡ前駆物質」という用語は、ｍｉＲＮＡに由来とされ、尚且つ、これらに限定されないが、一次ＲＮＡ転写産物（ｐｒｉｍａｒｙＲＮＡｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ）、一次ｍｉＲＮＡ転写産物（ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡｓ）、及びｍｉＲＮＡ前駆体（ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡｓ）を含む任意のより長い核酸配列を包含するために使用される。

本願明細書で使用される「ｍｉＲＮＡファミリー」という用語は、ヌクレオチド配列によって関連している複数のｍｉＲＮＡを指す。このように、ｍｉＲＮＡファミリーのメンバーは本願明細書において「関連ｍｉＲＮＡ（ｒｅｌａｔｅｄｍｉＲＮＡ）」と名づけられている。ｍｉＲＮＡファミリーの各メンバーは同一のシード配列（ｓｅｅｄｓｅｑｕｅｎｃｅ）を共有している。本願明細書で使用される「シード配列（ｓｅｅｄｓｅｑｕｅｎｃｅ）」という用語は成熟したｍｉＲＮＡ配列の５'末端からの２〜６又は２〜７ヌクレオチドを指す。ｍｉＲＮＡファミリーの例は従来技術において周知であり、ｌｅｔ−７ファミリー（９個のｍｉＲＮＡｓを有する）、ｍｉＲ−１５ファミリー（ｍｉＲ−１５ａ、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−１６−１、及びｍｉＲ−１９５を含む）、及びｍｉＲ−１８１ファミリー（ｍｉＲ−１８１ａ、ｍｉＲ−１８１ｂ、及びｍｉＲ−１８１ｃ）を含むが、これらに限定されない。

本願明細書で使用されている「標的核酸」、「標的ＲＮＡ」、「標的ＲＮＡ転写産物」、又は「核酸標的物」という用語は、これらに限定されないが、ＲＮＡを含む標的にされ得るあらゆる核酸を包含するために使用される。一実施形態において、前記標的核酸は、これらに限定されないが、ｍｉＲＮＡ及びｍｉＲＮＡ前駆物質を含む非コード配列である。好ましい実施形態では、前記標的核酸はｍｉＲＮＡであり、これはまたｍｉＲＮＡ標的物を指す場合もある。オリゴマー化合物は、オリゴマー化合物が実質的にｍｉＲＮＡと１００％相補性を含む配列を含む場合、「ｍｉＲＮＡ標的」である。

本開示の文脈において、「機能調節」はスモールノンコーディングＲＮＡの機能又は活性の変化、又はスモールノンコーディングＲＮＡが関連し、又は下流の効果がもたらされるあらゆる細胞内成分の機能の変化を意味する。一つの実施形態において、機能調節はスモールノンコーディングＲＮＡの活性の抑制である。

本願明細書において使用される「調節」及び「発現の調節」は、スモールノンコーディングＲＮＡ、核酸標的物、ＲＮＡ又はスモールノンコーディングＲＮＡに関連したタンパク質、又はスモールノンコーディングＲＮＡの下流標的物（例えば、スモールノンコーディングＲＮＡによって制御されたタンパク質をコードした核酸を表しているｍＲＮＡ）の量又はレベルの増強（刺激）又は減少（抑制）のいずれかを意味する。抑制は調節の適切な形態であり、スモールノンコーディングＲＮＡは適切な核酸標的物である。レベルが調節されたスモールノンコーディングＲＮＡは、ｍｉＲＮＡ及びｍｉＲＮＡ前駆物質を含む。

オリゴマー化合物
本発明の文脈において「オリゴマー化合物」という用語は、少なくとも核酸標的物の領域にハイブリダイズすることができるポリマー構造を指す。一実施形態において、核酸標的物はｍｉＲＮＡである。「オリゴマー化合物」という用語は、オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシド、オリゴヌクレオチド類似体、オリゴヌクレオチド摸倣体、及びそれらの組み合わせを含む化合物を含むが、これらに限定されない。オリゴマー化合物はまたアンチセンスオリゴマー化合物、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、選択的スプライサー、プライマー、プローブ、及び標的核酸の少なくとも一部分をハイブリダイズする他の化合物を含むが、これらに限定されない。オリゴマー化合物又はオリゴヌクレオチドは、５'から３'方向に読み込まれたその核酸塩基配列が標的核酸の対応する領域の逆相補体を含む場合に、アンチセンスである。

一般的に、オリゴマー化合物は結合した単量体サブユニットの骨格を含み、ここで各々の結合した単量体サブユニットは直接又は間接的にヘテロ環塩基部分に結合している。単量体サブユニット、糖部分、又は糖代替物及びヘテロ環塩基部分に連結している結合は、独立して修飾することが可能であり、これらに限定されないが、均一物、ヘミマー、ギャップマー、位置的に修飾されたオリゴマー化合物を含む得られたオリゴマー化合物に対する複数のモチーフをもたらす。

例えば、修飾されたオリゴマー化合物は、増強した細胞内の取り込み、核酸標的物に対する増強した親和性、ヌクレアーゼ存在下において増加した安定性、及びスモールノンコーディングＲＮＡの機能を修飾する増強された能力どの所望の特性のために、しばしば天然型よりも好ましい。本願明細書で使用されている「修飾」という用語は、オリゴヌクレオチドなどの出発又は天然のオリゴマー化合物から、置換及び／又はあらゆる変化を含む。オリゴマー化合物の修飾は、例えば以下に記載した、ヌクレオチド間の結合、糖部分、塩基部分の置換または変化を包含する。

オリゴマー化合物は通常、直鎖状に調製されるが、つなぎ合わせるか又は環状に調製することも可能であり、及び分岐したものも含む。分離したオリゴマー化合物はハイブリダイズされ、一端または両端において、平滑末端或いは突出端を含む、二本鎖化合物を形成する。

本発明に従ったオリゴマー化合物は、約１２から約５０単量体サブユニットを含む（例えば、約１２から約５０の結合したヌクレオシド）。当業者であれば、本発明が、長さが１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、又は５０サブユニットのオリゴマー化合物を具体化しているものであることが予想される。

一実施形態において、本発明のオリゴマー化合物は上記に例示したように、長さが１５から３０の単量体サブユニットである。

一実施形態において、本発明のオリゴマー化合物は本願明細書において例示したように、長さが１７から２９の単量体サブユニットである。

一実施形態において、本発明のオリゴマー化合物は上記に例示したように、長さが１８から２６の単量体サブユニットである。

一実施形態において、本発明のオリゴマー化合物は、長さが１９、２０、２１、２２、２３、又は２４サブユニットであるか、又は代わりに本発明のオリゴマー化合物は長さが１９から２４のサブユニットの範囲である。

一実施形態において、本発明のオリゴマー化合物は、長さが２１、２２、２３、又は２４サブユニットであるか、又は代わりに当該発明のオリゴマー化合物は長さが２１から２４のサブユニットの範囲である。

本願明細書において使用される「約」という用語は、その後の変数の±５％の意味である。

ハイブリダイゼーション
本発明の文脈において「ハイブリダイゼーション」はオリゴマー化合物の相補鎖の対形成を意味する。本発明において、対形成のメカニズムは、オリゴマー化合物の鎖の相補的なヌクレオシド又はヌクレオチド基（核酸塩基）の間の、ワトソン−クリック、フーグスティーン、又は逆フーグスティーン水素結合である水素結合を含む。例えば、アデニンとチミンは、水素結合の形成を通して対形成する相補的な核酸塩基である。ハイブリダイゼーションは様々な状況下で生じる。

オリゴマー化合物は、例えば、インビボアッセイまたは治療的処置の場合において生理学的な条件下、及びインビトロアッセイの場合において標準的なアッセイ条件下など、特異的なハイブリダイゼーションが望まれている条件下で、オリゴマー化合物の非標的核酸配列に対する非特異的な結合を避けるのに十分な程度の相補性がある時、「特異的にハイブリダイズすることができる」ものである。核酸標的物に特異的にハイブリダイズするオリゴマー化合物は、核酸標的物の正常機能を妨げ、結果的に活性を変え、機能を破壊し、又は標的核酸のレベルを調節する。

「厳密なハイブリダイゼーションの条件」又は「厳密な条件」という表現は、本発明のオリゴマー化合物が特異的にその核酸標的物にハイブリダイズする条件を指す。厳密な条件は配列に依存しており、異なる環境で変化し、本文脈中では、オリゴマー化合物が核酸標的物にハイブリダイズする「厳密な条件」下は、オリゴマー化合物の性質及び組成、及びそれらを研究するアッセイによって決定される。当業者であれば実験的なプロトコールに変動性があることを理解し、最小の非特異的ハイブリダイゼーション現象のある厳密なハイブリダーゼーションに対して、条件が適切である時を決定できる。

本願明細書で使用される「相補性」は、１つの核酸塩基がもう１つと正しく対形成する能力を言う。例えば、オリゴマー化合物の特定の位置にある単量体サブユニットが、核酸標的物の特定の位置にある単量体サブユニットと水素結合が可能である場合、前記位置は相補的な位置であると考えられる。逆に、単量体サブユニットが水素結合できない場合、その位置は「非相補的」とみなされる。各分子における十分な数の相補的な位置が、互いに水素結合可能な単量体のサブユニットによって占められている場合、オリゴマー化合物及び標的核酸はお互いに「実質的に相補的である」ものである。従って、「実質的に相補的」という用語は、安定且つ特異的な結合がオリゴマー化合物と標的核酸との間で生じるように、単量体サブユニットの十分な数を上回る正しい対形成の十分な程度を示すのに使用される。「実質的に相補的」と「十分に相補的」という用語は、本願明細書においてほとんど同じ意味として使用されている。

オリゴマー化合物は、特異的にハイブリダイズできるように、その標的核酸に対して１００％相補的である必要はない。さらに、オリゴマー化合物は、介在する又は近接するセグメントがハイブリダイゼーションに関与しないように１もしくはそれ以上のセグメントにハイブリダイズすることが可能である（例えば、バルジ、ループ構造、ヘアピン構造）。「非相補性核酸塩基」は、標的核酸の中の対応する位置において、核酸塩基と正しい塩基の対を形成できないアンチセンスオリゴヌクレオチドの核酸塩基を意味する。一部の実施形態において、オリゴマー化合物が標的核酸に実質的に相補的であれば、オリゴマー化合物と標的核酸との間において「ミスマッチ（ｍｉｓｍａｔｃｈ）」としても知られている非相補的な位置があり、そのような非相補的な位置はオリゴマー化合物と標的核酸の間で耐容性であっても良い。本願明細書において使用される「非相補性」、及び「ミスマッチ」という用語はほとんど同じ意味として使用される。３つまでのミスマッチはしばしば、オリゴマー化合物が標的核酸の活性を調節する能力を有意に減少させることなく、そのオリゴマー化合物の中で耐容性を示す。一部の実施形態において、ミスマッチは標的ｍｉＲＮＡのシード配列に対して相補性のあるオリゴマー化合物の領域の外にあることが好ましい。好ましい実施形態において、前記オリゴマー化合物は標的ｍｉＲＮＡに対して、０、１、又は２個のミスマッチを含む。より好ましい実施形態では、オリゴマー化合物は、標的ｍｉＲＮＡに対して多くても１個のミスマッチを含む。

オリゴマー化合物の各核酸塩基が核酸標的物の対応する位置において対形成を行うことができる場合、オリゴマー化合物及び核酸標的物は互いに「十分相補性がある」ものである。本願明細書において使用される「十分相補性がある」という用語は、オリゴマー化合物が標的ｍｉＲＮＡと同じ長さのヌクレオシドの連続配列を含み、更に標的ｍｉＲＮＡに対して十分に相補性があるということを意味する（例えば、ｍｉＲＮＡの長さが２２ヌクレオチドある場合、全長相補性オリゴマー化合物を有するオリゴマー化合物長さもまた２２ヌクレオチドである）。一部の実施形態において、オリゴマー化合物が標的ｍｉＲＮＡに対して全長相補性を有する。

本願明細書において使用される「本質的に全長相補性がある」という用語は、二本鎖間の全長相補性を有し、さらにオリゴマー化合物と標的ｍｉＲＮＡとの間において３つまでのミスマッチを含み、前記オリゴマー化合物はそれでもなお標的ｍｉＲＮＡとハイブリダイスできるようになっており、更に前記オリゴマー化合物の機能は実質的に損なわれないとことを意図している。前記の用語はまた、標的ｍｉＲＮＡの長さに関して６ヌクレオチドまでの切断又は延長を有するオリゴマー化合物を含み、前記切断または延長はオリゴマー化合物の３'または５'末端のいずれか、又はオリゴマー化合物の３'及び５'両末端に対する欠失又は追加であることを意味している。特定の実施形態において、前記オリゴマー化合物は、標的ｍｉＲＮＡの長さに比べて、１又は２ヌクレオシドまで切断されている。限定されない例として、標的ｍｉＲＮＡが２２ヌクレオシドの長さであるならば、本質的に全長相補性のある当該オリゴマー化合物は長さが２０又は２１ヌクレオチドであっても良い。好ましい実施形態において、当該オリゴマー化合物は、オリゴマー化合物の３'または５'末端のいずれかにおいて、１ヌクレオシドまで切断されている。

一部の実施形態において、当該オリゴマー化合物は、標的核酸の中の標的領域に対して、少なくとも８５％、少なくとも９０％、或いは少なくとも９５％配列相補性を有する。別の実施形態において、当該オリゴマー化合物は核酸標的物に対して１００％相補性がある。

オリゴマー化合物またはその一部は、オリゴマー化合物に対する定義された割合の同一性を有するものであっても良い。この同一性はオリゴマー化合物の全長以上、或いはオリゴマー化合物の一部であっても良い（例えばオリゴヌクレオチドに対して、オリゴマー化合物の同一性の割合を決定するために、２７塩基長の１〜２０核酸塩基が２０塩基長と比較される）。オリゴマー化合物は、本願明細書において説明されているオリゴマー化合物と類似した機能をもたらすために、本願明細書において説明されているものと同一の配列を有する必要はない。本願明細書において教示されたオリゴヌクレオチドの短いバージョン（例えば欠失があるため同一ではない）、又は本願明細書において教示されたオリゴヌクレオチドと同一ではない変形体（例えば一つの塩基が別のもので置換されている）は本発明の範囲内である。同一性の割合は、比較しているオリゴマー化合物と同一の塩基数によって計算される。同一でない塩基はお互いに隣接しているか、当該オリゴヌクレオチドに分散しているか、又はその両方である。

「標的領域」は少なくとも一つの同定できる配列、構造、機能、または特徴を有する、標的核酸の部分として定義されている。「標的セグメント」は、標的核酸の中にある特異的な標的領域のより小型又は副次的な部分として定義される。本発明で使用される「部位」は、標的核酸の中の特異的な位置として定義される。「５'標的部位」はオリゴマー化合物に相補性のある一番５'側のヌクレオチドである。「３'標的部位」はオリゴマー化合物に相補性のある一番３'側のヌクレオチドである。一部の実施形態において、標的セグメントは全長ｍｉＲＮＡである。他の態様においては、標的セグメントは標的ｍｉＲＮＡのシード配列である。本願明細書において使用される「シード配列」という用語はｍｉＲＮＡの５'末端のヌクレオチド２から７として定義される。

本発明の化合物及び組成物がハイブリダイズする標的核酸の場所は、本願名所において「適切な標的セグメント」と呼ぶ。本願明細書で使用される「適切な標的セグメント」という用語は、オリゴマー化合物が標的とする標的領域の少なくとも６核酸塩基部分として定義される。一実施形態において、標的ｍｉＲＮＡの適切な標的セグメントはｍｉＲＮＡのシード配列である。

本発明のオリゴマー化合物は一本鎖、二本鎖、環状またはヘアピン状のオリゴマー化合物の形状であっても良く、内部又は末端のバルジ又はループのような構造的要素を含むものであっても良い。一旦システムに入ると、本発明のオリゴマー化合物は一つもしくはそれ以上の酵素、又はタンパク質の作用を誘発し、標的核酸のレベル、発現、機能の修飾に影響する場合がある。

そのようなタンパク質の限定されない例は、ＤｒｏｓｈａＲＮＡ分解酵素ＩＩＩである。Ｄｒｏｓｈａは長い一次ＲＮＡ転写物（ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ）を長さ約７０から４５０ヌクレオチドから、核から輸出されるｍｉＲＮＡ前駆体（長さ約５０から約８０ヌクレオチド）に処理する核内酵素であり、ヒトＤｉｃｅｒ酵素に接触し、ｍｉＲＮＡ前駆体をｍｉＲＮＡに処理する。

さらなる限定されない例は、ＲＩＳＣ複合体の酵素を含む。ＲＮＡ標的物の分解に影響を与えるＲＩＳＣ複合体の使用は、それによってオリゴヌクレオチドを介した遺伝子発現の抑制の効能を大幅に増強する。同様の役割が、例えばＲＮＡ分解酵素ＩＩＩ及び酵素のリボヌクレアーゼＬファミリーにおけるものなどのように、他のリボヌクレアーゼに対して想定されている。

オリゴマー化合物修飾
従来技術で周知のように、ヌクレオシドは塩基と糖の組み合わせである。ヌクレオシドの塩基（又は核酸塩基）部分は通常はヘテロ環塩基部分である。二つのもっとも一般的なそのようなヘテロ環塩基の種類は、プリンとピリミジンである。ヌクレオチドは、ヌクレオシドの糖部分に共有結合によって結合したリン酸基をさらに含むヌクレオシドである。これらのヌクレオシドがペントフラノシル糖を含むものであるため、リン酸基は前記糖の２'、３'又は５'ヒドロキシ基部分に結合することができる。オリゴヌクレオチドを形成する場合、前記リン酸基は隣接したヌクレオシドにお互いに共有結合によって結合し、直鎖ポリマー化合物を形成する。この直鎖ポリマー構造の各々の末端は結合し、ハイブリダイゼーションによって、又は共有結合の形成によって、環状構造を形成する。さらに、直鎖化合物は内部の核酸塩基相補性を有するものであっても良く、したがって、完全にな又は部分的に二本鎖構造を形成する方法で折りたたまれているものであっても良い。修飾されていないオリゴヌクレオチドの構造内で、リン酸基は通常オリゴヌクレオチドのヌクレオシド間結合を形成すると言われる。ＲＮＡ及びＤＮＡの修飾されていないヌクレオシド間結合は３'から５'へのホスホジエステル結合である。

本発明の文脈では、「修飾されていないオリゴヌクレオチド」という用語は一般的にリボ核酸（ＲＮＡ）又はデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）のオリゴマーまたはポリマーを指す。この用語は天然の核酸塩基、糖、共有ヌクレオシド間結合から構成されるオリゴヌクレオチドを含む。「オリゴヌクレオチド類似体」という用語はオリゴヌクレオチドに類似した方法で機能する１もしくはそれ以上の非天然部分を有するオリゴヌクレオチドを指す。そのような非天然オリゴヌクレオチドは、例えば、増強した細胞の取り込み、増強した他のオリゴヌクレオチドまたは核酸標的物に対する増強した親和性、ヌクレアーゼ存在下での増強した安定性などの望ましい特性のために、しばしば天然の形態よりも選択される。「オリゴヌクレオチド」という用語は、修飾されていないオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体を指すのに使用される。

本発明の文脈で、オリゴヌクレオシドという用語は、リン原子を持たないヌクレオシド間結合によって連結しているヌクレオシドを指す。この種類のヌクレオシド間結合はアルキル、シクロアルキル、混合したヘテロ原子アルキル、混合したヘテロ原子シクロアルキル短鎖、１もしくはそれ以上のへテロ原子の短鎖、及び１もしくはそれ以上のヘテロ環の短鎖を含む。ヌクレオシド間結合はシロキサン、スルフィド、スルホキシド、スルホン、アセチル、ホルムアセチル、チオホルムアセチル、メチレンホルムアセチル、チオホルムアセチル、アルケニル、スルファミン酸、メチレンイミノ、メチレンヒドラジン、スルホン酸、スルホンアミド、アミド及び混合したＮ、Ｏ、Ｓ、及びＣＨ_２組成部分を有する他のものを含むが、これらに限定されない。さらに上記修飾に加えて本発明のオリゴマー化合物のヌクレオシドは様々な他の修飾を有することが可能である。

修飾されたヌクレオシド間結合基
オリゴマー化合物の具体的例は、例えば、非天然ヌクレオシド間結合などの修飾を有するオリゴヌクレオチドを含む。そのような非天然ヌクレオシド間の結合は、例えば、増強した細胞の取り込み、他のオリゴヌクレオチドまたは核酸標的物に対する増強した親和性、及びヌクレアーゼ存在下での増強した安定性のような望ましい特性のために、しばしば天然形態より多く選択される。

本発明のオリゴマー化合物は１もしくはそれ以上の修飾されたヌクレオシド間の結合を有していても良い。本願明細書で定義されているように、修飾したヌクレオチド間結合を有するオリゴヌクレオチドは、リン原子を含むヌクレオシド間結合、及びリン原子を含まないヌクレオシド間結合を含む。本明細書の目的のため、及び従来技術で頻繁に参照されているように、修飾オリゴヌクレオチドは、そのヌクレオシド間骨格においてリン原子を有しておらず、またオリゴヌクレオシドとしてもみなされる場合がある。

１つの適切なリンを含む修飾ヌクレオシド間結合はホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。他の修飾されたオリゴヌクレオチド骨格の多くは（ヌクレオシド間結合）、従来技術で周知であり、本発明の文脈において有用である。

リンを含むヌクレオシド間結合の調製を教示する代表的な米国特許は、米国特許第３，６８７，８０８号、第４，４６９，８６３号、第４，４７６，３０１号、第５，０２３，２４３号、第５，１７７，１９６号、５，第１８８，８９７号、第５，２６４，４２３号、第５，２７６，０１９号、第５，２７８，３０２号、第５，２８６，７１７号、第５，３２１，１３１号、第５，３９９，６７６号、第５，４０５，９３９号、第５，４５３，４９６号、５，４５５，２３３号、５，４６６，６７７号、５，４７６，９２５号、５，５１９，１２６号、第５，５３６，８２１号、第５，５４１，３０６号、第５，５５０，１１１号、第５，５６３，２５３号、第５，５７１，７９９号、第５，５８７，３６１号、第５，１９４，５９９号、第５，５６５，５５５号、第５，５２７，８９９号、第５，７２１，２１８号、第５，６７２，６９７号、第５，６２５，０５０号、第５，４８９，６７７号及び第５，６０２，２４０号明細書を含むが、これらに限定されず、この各々はこの参照により本願明細書に組み込まれる。

ここでリン原子を含まない修飾されたオリゴヌクレオチドの骨格は（ヌクレオシド間結合）、短鎖アルキル、またはシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合したヘテロ原子及びアルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド間結合、または１もしくはそれ以上の短鎖ヘテロ原子または複素環ヌクレオシド間結合によって形成されるヌクレオシド間結合を有する。これらはアミド骨格を有するものを含み、更に混合したＮ、Ｏ、Ｓ、及びＣＨ_２組成部分を有する他のものを含む。

上記のリンを含まないオリゴヌクレオシドの調整を教示する代表的な米国特許は、米国特許第５，０３４，５０６号、第５，１６６，３１５号、第５，１８５，４４４号、第５，２１４，１３４号、第５，２１６，１４１号、第５，２３５，０３３号、第５，２６４，５６２号、第５，２６４，５６４号、第５，４０５，９３８号、第５，４３４，２５７号、第５，４６６，６７７号、第５，４７０，９６７号、第５，４８９，６７７号、第５，５４１，３０７号、第５，５６１，２２５号、第５，５９６，０８６号、第５，６０２，２４０号、第５，６１０，２８９号、第５，６０２，２４０号、第５，６０８，０４６号、第５，６１０，２８９号、第５，６１８，７０４号、第５，６２３，０７０号、第５，６６３，３１２号、第５，６３３，３６０号、第５，６７７，４３７号、第５，７９２，６０８号、第５，６４６，２６９号及び第５，６７７，４３９号明細書を含むが、これらに限定されず、この各々は本参照により本願明細書に組み込まれる。

オリゴマー化合物はまたオリゴヌクレオチド摸倣体を含むことも可能である。オリゴヌクレオチドに適用される摸倣体という用語は、オリゴマー化合物を含むことが意図されており、フラノース環又はフラノース環及びヌクレオシド間結合の両方が新規な基によって置換されているか、或いはフラノース環だけが例えばモルフォリノ環で置換されることが、糖の代替物として従来技術でもまた参照されている。ヘテロ環塩基又は修飾されたヘテロ環塩基部分は適切な標的核酸とのハイブリダイゼーションのために保持される。オリゴヌクレオチド模倣体がペプチド核酸（ｐｅｐｔｉｄｅｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄｓ：ＰＮＡ）及びシクロヘキセニル（ｃｙｃｌｏｈｅｘｅｎｙｌ）核酸（ＣｅＮＡとして知られる。Ｗａｎｇｅｔａｌ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２０００，１２２，８５９５−８６０２を参照）のようなオリゴマー化合物を含むことができる。オリゴヌクレオチド模倣体の調製を教示する代表的な米国特許は、米国特許第５，５３９，０８２号、第５，７１４，３３１号、及び第５，７１９，２６２号明細書を含むが、これらに限定されず、この各々は本参照により本願明細書に組み込まれる。オリゴヌクレオチド模倣体の別の種類はホスホノモノエステル核酸と呼ばれており、骨格にリン基を取り込む。オリゴヌクレオチド模倣体のこの種類は、核酸の検出のためのプローブとして、及び、分子生物学での使用のための補助として、遺伝子発現を抑制する領域（アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、センスオリゴヌクレオチド、及び三本鎖形成オリゴヌクレオチド）の有用な生理学的、生物学的、及び薬理学的特性を有するという報告がされている。フラノシル環がシクロブチル部分によって置き換えられている別のオリゴヌクレオチド摸倣体が報告されている。

修飾された糖鎖
本発明のオリゴマー化合物もまた、１もしくはそれ以上の修飾されたまたは置換された糖鎖を含むことが可能である。塩基部分は適切な核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションのために保持されている。糖修飾はオリゴマー化合物に対して、ヌクレアーゼ安定性、結合親和性、他の有益な生物学的特性を与えることができる。代表的な修飾された糖は炭素環又は非環式糖、２'、３'、または４'位の１もしくはそれ以上位置において置換基を有する糖、糖の１もしくはそれ以上の水素基の位置に置換物を有する糖、糖のいずれの２つの他の原子の結合間の結合を有する糖を含む。多くの糖修飾は従来技術で周知であり、２'位置に修飾された糖及び糖の任意の２原子の間に架橋を有する糖（糖が２環式となるように）は特に本発明で有用である。本発明で有用な糖の修飾の例は、これらに限定されないが、ＯＨ、Ｆ、Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキル、またはＮ−アルキル、或いはＯ−アルキル−Ｏ−アルキルから選択される糖置換基を含む化合物を含み、前記アルキル、アルケニル、及びアルキニルは置換または未置換Ｃ_１〜Ｃ_１０アルキルまたはＣ_２〜Ｃ_１０アルケニル及びアルキニルであっても良い。特に適切であるのは、２−メトキシエトキシ（２'−Ｏ−メトキシエチル、２'−ＭＯＥ、又は２'−ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＯＣＨ_３としても知られている）、２'−Ｏ−メチル（２'−Ｏ−ＣＨ_３）、２'−フルオロ（２'−Ｆ）、又は４'炭素原子から２'炭素原子に連結する架橋基を有する２環式糖修飾ヌクレオシドであり、架橋基の例は−ＣＨ_２−Ｏ−、−（ＣＨ_２）_２−Ｏ−、又は−ＣＨ_２−Ｎ（Ｒ_３）−Ｏ−を含み、Ｒ_３はＨ又はＣ_１〜Ｃ_１２アルキルである。

一実施形態において、オリゴマー化合物は２'位で置換基を有する１もしくはそれ以上のヌクレオシドを含む。本発明で有用な２'−糖置換基の例は、これらに限定されないが、ＯＨ、Ｆ、Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキル、又はＮ−アルキル、Ｏ−アルケニル、Ｓ−アルケニル、又はＮ−アルケニル、Ｏ−アルキニル、Ｓ−アルキニル又はＮ−アルキニル、或いはＯ−アルキニル−Ｏ−アルキニルを含み、前記アルキル、アルケニル、及びアルキニルは、置換又は未置換Ｃ_１〜Ｃ_１０アルキル又はＣ_２〜Ｃ_１０アルケニル及びアルキニルである。Ｏ［（ＣＨ_２）_ｎＯ］_ｍＣＨ_３、Ｏ（ＣＨ_２）_ｎＮＨ_２、Ｏ（ＣＨ_２）_ｎＣＨ_３、Ｏ（ＣＨ_２）_ｎＯＮＨ_２、ＯＣＨ_２Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｈ）ＣＨ_３、及びＯ（ＣＨ_２）_ｎＯＮ［（ＣＨ_２）_ｎＣＨ_３］_２は特に望ましく、式中、ｎ及びｍは１から約１０である。他の２'−糖置換基はＣ_１〜Ｃ_１０アルキル、置換されたアルキル、アルケニル、アルキニル、アルカリル、アラルキル、或いはＯ−アルカリル又はＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ_３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ_３、ＯＣＦ_３、ＳＯＣＨ_３、ＳＯ_２ＣＨ_３、ＯＮＯ_２、ＮＯ_２、Ｎ_３、ＮＨ_２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換されたシリル、ＲＮＡ分解基、レポーター基、インターカレーター、薬理学的特性を改善するための基、又はオリゴマー化合物の薬力学的特性を改善するための基、及び同様な特性を有する他の置換基を含む。

増加したヌクレーゼ抵抗性、及びヌクレオチドに対する非常に高い結合親和性を与える修飾の１つは２'−ＭＯＥ側鎖である（Ｂａｋｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９７，２７２，１１９４４−１２０００）。２'−ＭＯＥ置換の目下の利点の１つは、Ｏ−メチル、Ｏ−プロピル、及びＯ−アミノプロピルのような多くの類似した２'修飾よりも高い結合親和性に改善されている点である。２'−ＭＯＥ置換を有するオリゴヌクレオチドはまたインビボ使用における有望な特色を有する、遺伝子発現のアンチセンス抑制剤となることが示されている（Ｍａｒｔｉｎ，Ｐ．Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，１９９５、７８，４８６−５０４、Ａｌｔｍａｎｎｅｔａｌ．，Ｃｈｉｍｉａ，１９９６、５０、１６８−１７６、Ａｌｔｍａｎｎｅｔａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．，１９９６，２４，６３０−６３７及びＡｌｔｍａｎｎｅｔａｌ．，ＮｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓＮｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ、１９９７、１６、９１７−９２６）。

２'−糖置換基はアラビノ（ａｒａｂｉｎｏ、上向き）又はリボ（ｒｉｂｏ、下向き）の位置にあっても良い。２'−アラビノ修飾の１つは２'−Ｆである。同様の修飾がオリゴマー化合物の他の位置に作成することが可能であり、特に３'末端のヌクレオシド又は２'−５'に結合したオリゴヌクレオチド中での糖の３'位置、及び５'末端ヌクレオチド中の５'位置で作成可能である。オリゴマー化合物は、ペントフラノシル糖の代わりにシクロブチル部分のような糖摸倣部分を有していても良い。修飾した糖構造の調製を教示する代表的な米国特許は、米国特許第４，９８１，９５７号、第５，１１８，８００号、第５，３１９，０８０号、第５，３５９，０４４号、第５，３９３，８７８号、第５，４４６，１３７号、第５，４６６，７８６号、第５，５１４，７８５号、第５，５１９，１３４号、第５，５６７，８１１号、第５，５７６，４２７号、第５，５９１，７２２号、第５，５９７，９０９号、第５，６１０，３００号、第５，６２７，０５３号、第５，６３９，８７３号、第５，６４６，２６５号、第５，６５８，８７３号、第５，６７０，６３３号、第５，７９２，７４７号、及び第５，７００，９２０号明細書を含むが、これらに限定されず、この各々はこの参照により本願明細書で完全に組み込まれる。

代表的な糖置換基は「キャップされた２'−オキシエトキシオリゴヌクレオチド」という標題の米国特許第６，１７２，２０９号明細書に開示されており、本願明細書で完全に引用文献によって組み込まれている。

代表的な環状糖置換基は「立体構造的に前有機化されたＲＮＡを標的とした２'-オリゴマー化合物」という標題の米国特許第６，２７１，３５８号明細書に」開示されており、これはこの参照により本願明細書に組み込まれる。

代表的なグアニジノ置換基は「機能的なオリゴマー」という標題の米国特許第６，５９３，４６６号明細書で開示されており、これはこの参照により本願明細書に組み込まれる。

代表的なアセトアミド置換基は米国特許第６，１４７，２００号明細書で開示されており、これはこの参照により本願明細書に組み込まれる。

別の修飾基は２環式になっており、そのため糖の立体構造配置を固定している糖部分を有するヌクレオシドを含む。そのような修飾はヌクレーゼ安定性、結合親和性、又はある他の有益な生物学的特性をオリゴマー化合物に与える可能性がある。これらのヌクレオシドの中でもっとも研究されているものは４'−ＣＨ_２−Ｏ−２'架橋を有する２環式糖によって修飾されたヌクレオシドである。この架橋は糖の下についており、固定された３'−エンド（ｅｎｄｏ）立体構造配置の中へ糖環を押し込んでいるように示される。アルファ−Ｌヌクレオシドもまた報告されており、この結合は前記環よりも上で、複素環塩基はベータ立体構造というよりはアルファ立体構造である（米国特許出願第２００３／００８７２３０号参照）。キシロ類似体もまた調製されている（米国特許出願第２００３／００８２８０７号参照）。４'−ＣＨ_２−Ｏ−２'架橋されたヌクレオシドと類似した特性を有する別の２環式糖によって修飾されたヌクレオシドは４'−（ＣＨ_２）_２−Ｏ−２'架橋にメチレン基を追加したものを有する（Ｋａｎｅｋｏら、米国特許出願第２００２／０１４７３３２号、Ｓｉｎｇｈｅｔａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１９９８，４，４５５−４５６、米国特許第６，２６８，４９０号及び第６，６７０，４６１号明細書及び米国特許出願第２００３／０２０７８４１号参照）。これらの２環式糖によって修飾されたヌクレオシド（４'−（ＣＨ_２）_{１（ｏｒ２）}−Ｏ−２'）を取り込むオリゴマー化合物は、相補的なＤＮＡ及びＲＮＡ（Ｔｍ＝＋３〜＋１０Ｃ）との非常に高い二本鎖熱安定性、３'−エキソヌクレアーゼ分解に対する安定性、及び良好な溶解特性を示す。

オリゴマー化とともに２環式糖によって修飾された単量体アデニン、シトシン、グアニン、５−メチル−シトシン、チミン、及びウラシルの合成及び調製、並びに核酸認識特性が記載されている（Ｋｏｓｈｋｉｎｅｔａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、１９９８、５４、３６０７−３６３０、国際出願第ＷＯ９８／３９３５２号及び第ＷＯ９９／１４２２６号）。

４'−ＣＨ_２−Ｓ−２'類似体などの他の２環式糖によって修飾されたヌクレオシド類似体が調製されている（Ｋｕｍａｒｅｔａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ、１９９８、８、２２１９−２２２２）。核酸ポリメラーゼのための基質としてのオリゴデオキシリボヌクレオチド二本鎖を含む、他の２環式糖類似体の調製もまた記載されている（Ｗｅｎｇｅｌら、国際出願第ＷＯ９８−ＤＫ３９３第１９９８０９１４号）。

核酸修飾
本発明のオリゴマー化合物はまた１もしくはそれ以上の核酸塩基（しばしば従来技術では単に「塩基」と言われる）を含むことができ、それらの核酸塩基は天然発生又は合成非修飾核酸塩基から構造的に区別することができるが、機能的には交換可能である。そのような核酸塩基の修飾はオリゴマー化合物にヌクレーゼ安定性、結合親和性、又は他の有益な生物学的特性を与えることができる。本願明細書で使用される「非修飾」又は「天然」核酸塩基はプリン塩基であるアデニン（Ａ）及びグアニン（Ｇ）、及びピリミジン塩基であるチミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）及びウラシル（Ｕ）を含む。本願明細書において複素環塩基部分とも呼ばれている修飾核酸塩基はまた他の合成及び天然核酸塩基を含み、それらの多くの例は、特に、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、７−デアザグアニン及び７−デアザアデニン等である。

複素環塩基部分はまた例えば、７−デアザ−アデニン、７−デアザグアノシン、２−アミノピリジン及び２−ピリドンのような、他のヘテロ環と置換されるプリン又はピリミジン塩基を含む。一部の核酸塩基は米国特許第３，６８７，８０８号明細書、ＴｈｅＣｏｎｃｉｓｅＥｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａＯｆＰｏｌｙｍｅｒＳｃｉｅｎｃｅＡｎｄＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｐａｇｅｓ８５８−８５９，Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ，Ｊ．Ｉ．，ｅｄ．ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ&Ｓｏｎｓ，１９９０，Ｅｎｇｌｉｓｃｈｅｔａｌ．，ＡｎｇｅｗａｎｄｔｅＣｈｅｍｉｅ，ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＥｄｉｔｉｏｎ，１９９１，３０，６１３、及びＳａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．，Ｃｈａｐｔｅｒ１５，ＡｎｔｉｓｅｎｓｅＲｅｓｅａｒｃｈａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐａｇｅｓ２８９−３０２，Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．及びＬｅｂｌｅｕ，Ｂ．，ｅｄ．，ＣＲＣＰｒｅｓｓ，１９９３において開示されているものを含む。これらの核酸塩基の特定のものは本発明のオリゴマー化合物の結合親和性を増加させるのに特に有用である。これらは、２アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシル及び５−プロピニルシトシンを含む、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン及びＮ−２、Ｎ−６、及びＯ−６置換プリンを含む。

本発明の一つの態様において、オリゴマー化合物は１もしくはそれ以上の複素環塩基部分の代わりに、多環式複素環化合物を有するように調製される。多数の三環式複素環化合物がこれまでに報告されている。これらの化合物は、標的鎖への修飾鎖結合特性を増加させるために、アンチセンス用途において日常的に使用されている。もっともよく研究されている修飾はグアノシンを標的としており、したがってそれらはＧ−クランプ（Ｇ−ｃｌａｍｐｓ）又はシチジン類似体と称する。

第二鎖においてグアノシンと３個の水素結合を作る代表的なシトシン類似体は１，３−ジアザフェノキサジン−２−オン（Ｒ_１０＝Ｏ，Ｒ_１１〜Ｒ_１４＝Ｈ）（Ｋｕｒｃｈａｖｏｖｅｔａｌ，ＮｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓａｎｄＮｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１９９７，１６，１８３７−１８４６）１，３−ジアザフェノチアジン−２−オン（Ｒ_１０＝Ｓ，Ｒ_１１−Ｒ_１４＝Ｈ）（Ｌｉｎ，Ｋ．−Ｙ．；Ｊｏｎｅｓ，Ｒ．Ｊ．；Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ，Ｍ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９５，１１７，３８７３−３８７４）及び６，７，８，９−テトラフルオロ−１，３−ジアザフェノキサジン−２−オン（Ｒ_１０＝Ｏ，Ｒ_１１−Ｒ_１４＝Ｆ）（Ｗａｎｇ，Ｊ．；Ｌｉｎ，Ｋ．−Ｙ．，Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ，Ｍ．ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔ．１９９８，３９，８３８５−８３８８）を含む。オリゴヌクレオチドに組み込まれている場合、これらの塩基修飾は相補的なグアニンにハイブリダイズすることが示されており、グアニンはまたアデニンとハイブリダイズし、延長したスタッキング相互作用によってらせん状の熱安定性を増強することが示されている（米国特許出願第２００３０２０７８０４号及び米国特許出願第２００３０１７５９０６号、これらはいずれもこの参照により本願明細書に組み込まれる）。

シトシン類似体／置換が強固な１，３−ジアザフェノキサジン−２−オン骨格（Ｒ_１０＝Ｏ，Ｒ_１１＝−Ｏ−（ＣＨ_２）_２−ＮＨ_２，Ｒ_{１２−１４}＝Ｈ）に結合するアミノエトキシ部分を有する場合、らせん安定化特性が観察されている（Ｌｉｎ，Ｋ．−Ｙ．；Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ，Ｍ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９８，１２０，８５３１−８５３２）。結合研究によって、単一修飾によるもっとも高いことが知られている親和性を増強する５−メチルシトシン?ｄＣ５^ｍｅ?と比べて、単一取り込みが１８°までのＴ_ｍの増加とともに、その相補的な標的ＤＮＡ又はＲＮＡに対するモデルオリゴヌクレオチドの結合親和性を増強することが可能であることが示された。一方、前記らせん安定性の獲得によってオリゴヌクレオチドの特異性は損なわれない。Ｔ_ｍデータはｄＣ５^ｍｅと比較して完全にマッチしている配列とミスマッチ配列との間のより大きな差異を示す。繋ぎ止められたアミノ基は付加的な水素結合供与体として作用し、相補的なグアニンのフーグスティーン表面、すなわちＯ６と相互作用しそのため４つの水素結合を形成することが示唆された。これは、Ｇ−クランプの増強した親和性が延長した塩基のスタッキング及び付加的な特定の水素結合の組み合わせによって調製されているということを意味している。

本発明に従った三環式複素環化合物及びそれらを使用する方法は、米国特許第６，０２８，１８３号明細書及び米国特許第６，００７，９９２号明細書に開示されており、どちらの内容も本願明細書に完全に組み込まれる。

配列特異性とともに、フェノキサジン誘導体の結合親和性が増強すると、その誘導体はより強力なアンチセンスを基礎とした薬剤開発における価値のある核酸塩基類似体となる。単一置換基が２０塩基長２'−デオキシホスホロチオエートオリゴヌクレオチドのインビトロの作用強度を有意に改善することが示されているように、活性増強はＧ−クランプの場合により明確であった。（Ｆｌａｎａｇａｎ，Ｗ．Ｍ．；Ｗｏｌｆ，Ｊ．Ｊ．；Ｏｌｓｏｎ，Ｐ．；Ｇｒａｎｔ，Ｄ．；Ｌｉｎ，Ｋ．−Ｙ．；Ｗａｇｎｅｒ，Ｒ．Ｗ．；ＭａｔｔｅｕｃｃｉＭ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９９，９６，３５１３−３５１８）。

複素環基として有用である修飾多環式複素環化合物は、これらに限定されないが、上述の米国特許第３，６８７，８０８号、及び米国特許第４，８４５，２０５号、第５，１３０，３０２号、第５，１３４，０６６号、第５，１７５，２７３号、第５，３６７，０６６号、第５，４３２，２７２号、第５，４３４，２５７号、第５，４５７，１８７号、第５，４５９，２５５号、第５，４８４，９０８号、第５，５０２，１７７号、第５，５２５，７１１号、第５，５５２，５４０号、第５，５８７，４６９号、第５，５９４，１２１号、第５，５９６，０９１号、第５，６１４，６１７号、第５，６４５，９８５号、第５，６４６，２６９号、第５，７５０，６９２号、第５，８３０，６５３号、第５，７６３，５８８号、第６，００５，０９６号、及び第５，６８１，９４１号明細書及び米国特許出願第２００３０１５８４０３号で開示されており、これらはこの参照により本願明細書に完全に組み込まれる。

５−メチルシトシンの置換を含む特定の核酸塩基の置換は、本発明のオリゴヌクレオチドの結合親和性を増加させるのに特に有用である。例えば、５−メチルシトシン置換が０．６−１．２?Ｃまで核酸二本鎖安定性を増加させることが示されており（Ｓａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．，Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．ａｎｄＬｅｂｌｅｕ，Ｂ．，ｅｄｓ．，ＡｎｔｉｓｅｎｓｅＲｅｓｅａｒｃｈａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＣＲＣＰｒｅｓｓ，ＢｏｃａＲａｔｏｎ，１９９３，ｐｐ．２７６−２７８）、現時点においては塩基置換が好ましく、２'−Ｏ−メトキシエチル糖修飾と組み合わせた場合に特により好ましい。

抱合オリゴマー化合物
本発明のオリゴマー化合物に付与される置換基の１つは、得られるオリゴマー化合物の活性、細胞内分布、又は細胞内取り込みを増強する１もしくはそれ以上の部分又は抱合の結合を含む。一実施形態において、そのような修飾オリゴマー化合物は、ヒドロキシル基又はアミノ基のような官能基に、共有結合的に抱合基が結合することによって調製される。本発明の抱合基は、オリゴマーの薬力学的特性を増強し、薬物動態学的特性を増強する挿入物、レポーター分子、ポリアミン、ポリアミド、ポリエチレングリコール、ポリエーテル、オリゴマー基、及びオリゴマー基を含む。典型的な抱合基はコレステロール、炭水化物、脂質、リン脂質、ビオチン、フェナジン、葉酸、フェナントリジン、アントラキノン，アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリン及び色素を含む。本発明の文脈において、薬力学的特性を増強する基はオリゴマー取り込みを改善し、分解に対するオリゴマー抵抗性を増強し、及び／又はＲＮＡとのハイブリダイゼーションを強化する基を含む。本発明の文脈において、薬物動態学的な特長を増強する基はオリゴマー取り込み、分配、代謝、又は排出を改善する基を含む。代表的な抱合基は、１９９２年１０月２３日付出願の国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９２／０９１９６号で開示されている。その全体の開示はこの参照により本願明細書に組み込まれる。抱合部分はコレステロール部分及び従来技術で周知の様々な他の脂質部分を含むが、これらに限定されない。

さらに、本発明のオリゴマー化合物はオリゴマー化合物の能動又は受動輸送、局在、又はコンパートメント化を促進する、１もしくはそれ以上の部分、結合、又は抱合を有する。細胞内局在は核内、核小体内、または細胞質内局在を含むが、これらに限定されない。コンパートメント化は、核、核小体、ミトコンドリアを含む又は細胞膜内に包埋される細胞内分画への本発明のオリゴヌクレオチドのあらゆる方向性をもった動きを含むが、これらに限定されない。さらに、本発明のオリゴマー化合物は転写後修飾を促進する１もしくはそれ以上の抱合部分を含む。

抱合基は直接的に又は任意の結合基を介して、オリゴマー化合物の様々な位置に結合することが可能である。結合基という用語は、オリゴマー化合物に抱合基が結合するのを受け入れる全ての基を含むことを意図している。結合基は、例えばオリゴマー化合物のような親化合物の選択的な部位に、化学官能基、抱合基、レポーター基、および他の基が結合するのに有用である二価の基である。一般的に、２機能性結合部分は２つの官能基を有するハイドロカルボニル部分を含む。前記官能基の１つは親分子又は目的化合物に結合させるために選択され、あるいは他は化学官能基又は抱合基のようなあらゆる選択された基に実質的に結合するために選択される。一部の実施形態において、リンカーはエチレングリコール又はアミノ酸単位のような繰り返し単位の鎖構造又はオリゴマーを含む。２機能性結合性部分に日常的に使用される官能基の例は、求核試薬基に反応する求電子試薬、及び求電子試薬に反応するための求核試薬が含まれるが、これらに限定されない。一部の実施形態において、２機能性結合鎖はアミノ、ヒドロキシル、カルボン酸、チオール、不飽和（例えば、２重又は３重結合）及びその同類のものを含む。２機能性結合部分のいくつかの限定されない例は、８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸（８−ａｍｉｎｏ−３，６−ｄｉｏｘａｏｃｔａｎｏｉｃａｃｉｄ：ＡＤＯ）、サクシニミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ４−（Ｎ−ｍａｌｅｉｎｉｄｏｍｅｔｈｙｌ）ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ−１−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ：ＳＭＣＣ）及び６−アミノヘキサン酸（６−ａｍｉｎｏｈｅｘａｎｏｉｃａｃｉｄ：ＡＨＥＸ又はＡＨＡ）を含む。他の結合基は置換されたＣ１〜Ｃ１０アルキル、置換又は未置換Ｃ２〜Ｃ１０アルケニル、或いは置換又は未置換Ｃ２〜Ｃ１０アルキニルが含まれるが、これらに限定されず、望ましい置換基の限定されないリストはヒドロキシル、アミノ、アルコキシ、カルボキシ、ベンジル、フェニル、ニトロ、チオール、チオアルコキシ、ハロゲン、アルキル、アリル、アルケニル及びアルキニルを含む。さらなる代表的な結合基は国際出願第ＷＯ９４／０１５５０号及びＷＯ９４／０１５５０号の例で開示されている。

本発明の組成物において使用されるオリゴマー化合物は、一般的に例えばヌクレアーゼ安定性のような特性を増強するためにオリゴマー化合物の一端又は両端に結合し、１もしくはそれ以上の安定化基を有するように修飾されていても良い。キャップ構造は安定化基に含まれる。化学的修飾は、オリゴヌクレオチドのいずれかの末端に組み込まれた「キャップ構造又は末端キャップ鎖」を意味する（例えばＷｉｎｃｏｔｔら、国際出願第ＷＯ９７／２６２７０号を参照。これはこの参照により本願明細書組み込まれる）。これらの末端の修飾は、エキソヌクレアーゼ分解から末端の核酸分子を有するオリゴマー化合物を保護し、さらに細胞内の運搬及び／又は局在を助ける。前記キャップは５'末端（５'−ｃａｐ）又は３'−末端（３'−ｃａｐ）又は両端にあっても良い。２重鎖オリゴマー化合物において、キャップは各鎖にいずれかの鎖のいずれかの末端又は両端にあっても良い。限定されない例では、前記５'−キャップは、逆位塩基脱落残基（部分）、４'，５'−メチレンヌクレオチド、１−（ベータ−Ｄ−エリスロフラノシル）ヌクレオチド又は４'−チオヌクレオチド又は炭素環式ヌクレオチド、１，５−、Ｌ−ヌクレオチド、アルファ−ヌクレオチド、修飾された塩基のヌクレオチド、ホスホロジチオエート結合、トレオ−ペントフラノシルヌクレオチド、非環式３'，４'−セコヌクレオチド、非環式３，４−ジヒドロキシブチルヌクレオチド、非環式３，５−ジヒドロキシペンチルリウクレオチド、３'−３'−逆位ヌクレオチド鎖、３'−３'−逆位塩基脱落鎖、３'−２'−逆位ヌクレオチド鎖；３'−２'−逆位塩基脱落鎖、１，４−ブタンジオールリン酸、３'−ホスホロアミデート、ヘキシルリン酸、アミノヘキシルリン酸、３'−リン酸、３'−ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、又は架橋の又は非架橋のメチルリン酸部分（Ｗｉｎｃｏｔｔら、国際出願第ＷＯ９７／２６２７０号。これはこの参照により本願明細書に組み込まれる）。

本発明の特に好ましい３'−キャップ構造は、例えば４'，５'−メチレンヌクレオチド、１−（ベータ−Ｄ−エリスロフラノシル）ヌクレオチド、４'−チオ−ヌクレオチド、炭素環式ヌクレオチド、５'−アミノ−アルキル−リン酸、１，３−ジアミノ−２−プロピルリン酸、３−アミノプロピルリン酸、６−アミノヘキシルリン酸、１，２−アミノドデシルリン酸、ヒドロキシプロピルリン酸、１，５−無水へキシトールヌクレオチド、Ｌ−ヌクレオチド、アルファ−ヌクレオチド、修飾された塩基のヌクレオチド、ホスホロジチオエート、トレオ−ペントフラノシルヌクレオチド、非環式３'，４'−セコヌクレオチド、３，４−ジヒドロキシブチルヌクレオチド、３，５−ジヒドロキシペンチルヌクレオシド、５'−５'−逆位ヌクレオチド鎖、５'−５'−逆位塩基脱落鎖、５'−ホスホラミデート、５'−ホスホロチオエート、１，４−ブタンジオールリン酸、５'−アミノ、架橋の又は非架橋の５'−ホスホラミデート、ホスホロチオエート及び／又はホスホロジチオエート、架橋の又は非架橋のメチルリン酸及び５'−メルカプト部分を含む（詳細はＢｅａｕｃａｇｅａｎｄＴｙｅｒ，１９９３，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ４９，１９２５を参照。これはこの参照により本願明細書に組み込まれる）。

オリゴマー化合物の一端又は両端をキャップしてヌクレーゼ安定性を与えるために使用可能なさらなる３'及び５'−安定化基は、２００３年１月１６日付出願の国際出願第ＷＯ０３／００４６０２号で開示されたものを含む。

オリゴマー化合物化学的モチーフ
オリゴマー化合物はその長さに沿って特定の方向性で配置された化学修飾サブユニットを有することが可能である。「化学的なモチーフ」はオリゴマー化合物全体の化学修飾の配置として定義される。

特定の実施形態において、本発明のオリゴマー化合物は均一に修飾される。本願明細書において使用される「均一に修飾される」オリゴマー化合物における、糖、塩基、ヌクレオシド間結合、又はそれらの組み合わせの化学的修飾がオリゴマー化合物の各単位に適用される。一実施形態において、均一に修飾されたオリゴマー化合物の各糖部分が修飾される。他の実施形態では、均一に修飾されたオリゴマー化合物の各ヌクレオシド間結合が修飾される。さらなる実施形態において、均一に修飾されたオリゴマー化合物の各糖及び各ヌクレオシド間結合が修飾を有する。均一に修飾されたオリゴマー化合物の例は、均一な２'−ＭＯＥ糖鎖、均一な２'−ＭＯＥ及び均一なホスホロチオエート骨格、均一な２'−ＯＭｅ、均一な２'−ＯＭｅ及び均一なホスホロチオエート骨格、均一な２'−Ｆ、均一な２'−Ｆ及び均一なホスホロチオエート骨格、均一なホスホロチオエート骨格、均一なデオキシヌクレオチド、均一なリボヌクレオチド、均一なホスホロチオエート骨格、及びそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。

本願明細書において使用される「位置的に修飾されたモチーフ」という用語は、均一な糖修飾ヌクレオシド配列を含むことを意味し、前記配列は、１〜約８の糖修飾ヌクレオシドを含む２もしくはそれ以上の領域によって中断されており、内部領域は一般的に１から約６又は１から約４である。位置的に修飾されたモチーフは、糖修飾のヌクレオシドの内部領域を含み、一端又が両端を含まれていても良い。糖修飾ヌクレオシドの領域中の各々の特定の糖修飾は本質的に均一である。異なる糖修飾によって、ヌクレオチドの領域の区別が可能である。位置的に修飾されたモチーフは核酸塩基又はヌクレオシド間結合の位置又は種類によって決定されない。前記位置的に修飾されたオリゴマー化合物という用語は多くの異なる特異的な置換形態を含む。多数のこれらの置換形態を組成物中で調製して試験を行った。一実施形態において、位置的に修飾されたオリゴマー化合物は、ホスホジエステルヌクレオチド間結合、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合、又はホスホジエステル及びホスホロチオエートヌクレオチド間結合の組み合わせを含むものであっても良い。

一部の実施形態において、位置的に修飾されたオリゴマー化合物は、５'−ＭＭｍｍＭｍＭＭＭｍｍｍｍＭＭＭＭｍｍｍｍｍ−３'及び５'−ＭＭｍＭＭｍＭＭｍＭＭｍＭＭｍＭＭｍＭＭｍＭＭ−３'などの、第１の修飾に第２の修飾が散在したクラスターを有するオリゴマー化合物を含み、ここで「Ｍ」は第１の修飾、及び「ｍ」は第２の修飾を表す。一実施形態において、「Ｍ」は２'−ＭＯＥ及び「ｍ」は４'−（ＣＨ_２）_ｎ−Ｏ−２'を有する二環式糖修飾ヌクレオシドであり、ｎは１又は２である。別の実施形態において、「Ｍ」は２'−ＭＯＥ及び「ｍ」は２'−Ｆである。別の実施形態において「Ｍ」は２'−ＯＭｅ及び「ｍ」は２'−Ｆである。

一部の実施形態において、オリゴマー化合物はキメラオリゴマー化合物である。「キメラオリゴマー化合物」又は「キメラ」は、核酸を基礎としたオリゴマー化合物の場合、例えばヌクレオチド又はヌクレオシドなどの少なくとも一つの単量体の単位によって各々作製された少なくとも２つの化学的に異なる領域を有するオリゴマー化合物である。キメラオリゴヌクレオチド合成方法は当業者に周知である。

特定の実施形態において、キメラオリゴマー化合物はギャップマーオリゴマー化合物である。「ギャップマー」は、二つの外部領域（「ウィング（ｗｉｎｇ）」又は「ウィングセグメント（ｗｉｎｇｓｅｇｍｅｎｔ）」と呼ばれる）に隣接した、内部領域（「ギャップ（ｇａｐ）」又は「ギャップセグメント（ｇａｐｓｅｇｍｅｎｔ）」と呼ばれる）という３領域に分割されるヌクレオシドの連続配列を有するオリゴマー化合物を意味する。内部及び外部領域は糖部分、ヌクレオシド間結合、それらの組み合わせによって区別される。ギャップマーオリゴマー化合物の領域を区別するために使用される糖部分の種類は、２'−ＭＯＥ、２'−フルオロ、２'−Ｏ−ＣＨ_３、及び二環糖修飾ヌクレオシドを限定せずに含む、本願明細書に開示されるβ−Ｄ−リボヌクレオシド、β−Ｄ−デオキシリボヌクレオシド、又は２'−修飾ヌクレオシドを含む。一実施形態において、各領域は均一に修飾されている。別の一実施形態において、内部領域のヌクレオシドは外部領域の糖部分とは異なる糖部分を均一化する。一つの限定されない例において、ギャップは、第１の２'−修飾ヌクレオシドを均一に含み、各ウィングは第２の２'−修飾ヌクレオシドを均一に含む。

ギャップマーオリゴマー化合物は「対称性」又は「非対称性」のいずれかであることでさらに定義されている。各ウィングに同じ均一な糖修飾を有するギャップマーは「対称性ギャップマーオリゴマー化合物」と称する。各ウィングに異なる均一な修飾を有するギャップマーは「非対称性ギャップマーオリゴマー化合物」と称する。一実施形態において、このようなギャップマーオリゴマー化合物は、例えば、２'−ＭＯＥ修飾ヌクレオシド（対称性ギャップマー）を含むウィング、及びβ−Ｄ−リボヌクレオシド又はβ−Ｄ−デオキシヌクレオシドを含むギャップの両方を有することが可能である。別の実施形態において、対称性ギャップマーは、２'−ＭＯＥ修飾ヌクレオシドを含むウィング及び２'−ＭＯＥ修飾ヌクレオシドとは別の２'−修飾ヌクレオシドを含むギャップの両方を有することが可能である。非対称性ギャップマーオリゴマー化合物は例えば、β−Ｄ−リボヌクレオシド、β−Ｄ−デオキシリボヌクレオシド又は２'−ＭＯＥ又は２'−ＯＣＨ３修飾ヌクレオシドとは別の２'−修飾ヌクレオシドを含む内部領域（ギャップ）を有する２'−ＯＣＨ_３修飾ヌクレオシドを含む一つのウィング及び２'−ＭＯＥ修飾ヌクレオシドを含む他方のウィングを有することが可能である。これらのギャップマーオリゴヌクレオチド化合物はホスホジエステルヌクレオチド間結合、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合、又はホスホジエステル及びホスホロチオエートヌクレオチド間結合の組み合わせを含むものであっても良い。

一部の実施形態において、ギャップマーオリゴマー化合物の各ウィングは同じ数のサブユニットを含む。別の実施形態において、ギャップマーオリゴマー化合物の一つのウィングは、ギャップマーオリゴマー化合物の他方のウィングとは異なる数のサブユニットを含む。一実施形態では、ギャップマーオリゴマー化合物のウィングは、独立して、１から約３のヌクレオシドを有する。適切なウィングは２から約３のヌクレオシドを有する。一実施形態において、ウィングは２ヌクレオシドを含むことが可能である。別の実施形態において、５'−ウィングは１つ又は２つのヌクレオシドを含むことが可能であり、３'−ウィングは２つ又は３つのヌクレオシドを含むことが可能である。本発明はしたがって、ギャップオリゴマー化合物を含み、各ウィングは独立して、１、２、又は３つの糖修飾ヌクレオシドを含む。一実施形態において、内部又はギャップ領域は１５から２３ヌクレオシドを含み、それは、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２及び２３ヌクレオチドを含むと理解されている。さらなる実施形態において内部又はギャップ領域は１７から２１のヌクレオシドを含むことが理解され、それはつまり、１７、１８、１９、２０、又は２１のヌクレオシドを含むと理解される。別の実施形態において、内部又はギャップ領域は１８から２０ヌクレオシドを含むと理解され、それはつまり、１８、１９、又は２０ヌクレオシドを含むと理解されている。好ましい一実施形態において、ギャップ領域は１９ヌクレオシドを含む。一実施形態において、オリゴマー化合物はその標的ｍｉＲＮＡに全長相補性を有するギャップマーオリゴヌクレオチドである。さらなる実施形態では、ウィングは２'−ＭＯＥ修飾ヌクレオシドであり、ギャップは２'−フルオロ修飾ヌクレオシドを含む。一実施形態では、一つのウィングは長さが２ヌクレオシドであり、他のウィングは長さ３ヌクレオシドである。付加的な実施形態では、ウィングは長さが各２ヌクレオシドであり、ギャップ領域は長さが１９ヌクレオチドである。

キメラオリゴマー化合物の例は、第１の修飾を含む中心領域及び第２の修飾を含むウィング領域（５'ＭＭｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍＭＭ３'）を有する２３の核酸塩基をもつオリゴマー化合物、第１の修飾を含む中心領域及び第２の修飾を含むウィング領域（５'ＭＭｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍＭＭ３'）を有する２２の核酸塩基をもつオリゴマー化合物、及び第１の修飾を含む中心領域及び第２の修飾を含むウィング領域（５'ＭＭｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍＭＭ３'）を有する２１の核酸塩基をもつオリゴマー化合物を含むが、これらに限定されず、「Ｍ」は一番目の修飾を表し、「ｍ」は２番目の修飾を表す。一つの限定されない例において、「Ｍ」は２'−Ｏ−メトキシエチル、及び「ｍ」は２'−フルオロであっても良い。

一実施形態において、キメラオリゴマー化合物は「ヘミマーオリゴマー化合物」であり、糖部分及び／又はヌクレオシド結合の化学的修飾はオリゴマー化合物の５'末端のサブユニット領域を３'末端のサブユニット領域から区別する。

キメラオリゴマー化合物は一般的にはヌクレーゼ分解に対する増加した抵抗性、増加した細胞の取り込み、及び／又は標的核酸に対する増加した結合親和性を与えるために、少なくとも一つの修飾された領域を含む。オリゴマー化合物の付加領域は、例えば、異なる修飾を含むことができ、ある場合では、ＲＮＡ対ＤＮＡ又はＲＮＡ対ＲＮＡハイブリッド分解可能な酵素のための基質として働く可能性がある。例えば、オリゴマー化合物はＲＮａｓｅＨに対する基質として働く領域を含むように設計される。ＲＮａｓｅＨはＲＮＡ対ＤＮＡ二本鎖のＲＮＡ鎖を分解する細胞内エンドヌクレアーゼである。したがって、分解領域を有するオリゴマー化合物によってＲＮａｓｅＨの活性化されると、結果としてＲＮＡ標的物の分解が起こり、このため、オリゴマー化合物の効果が増強する。あるいは、他の領域に比べて増加した又は減少した親和性のいずれかを示す化学修飾ヌクレオシドの領域を含むオリゴマー化合物の長さによって、標的核酸に対するオリゴマー化合物の結合親和性が変化する。この結果、キメラ使用時、例えば同じ標的領域にハイブリダイズするホスホロチオエートデオキシオリゴヌクレオチドと比較し、基質領域を有するより短いオリゴマー化合物によって一致する結果がしばしば得られる可能性がある。

本発明のキメラのオリゴマー化合物は、上述したように、２もしくはそれ以上のオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド摸倣体、オリゴヌクレオチド類似体、オリゴヌクレオシド及び／又はオリゴヌクレオシド摸倣体の複合体構造として形成されることが可能である。そのオリゴマー化合物は、従来技術において、ハイブリッド、ヘミマー、ギャップマー、逆位ギャップマーと呼ばれる。そのハイブリッド構造の調製を教示する代表的米国特許は、米国特許第５，０１３，８３０号、第５，１４９，７９７号、第５，２２０，００７号、第５，２５６，７７５号、第５，３６６，８７８号、第５，４０３，７１１号、第５，４９１，１３３号、第５，５６５，３５０号、第５，６２３，０６５号、第５，６５２，３５５号、第５，６５２，３５６号、及び第５，７００，９２２号明細書を含むが、これらに限定されず、それらの各々はこの参照により本願明細書で完全に組み込まれる。

キメラオリゴマー化合物の別の態様において、「ギャップ無能化（ｇａｐ−ｄｉｓａｂｌｅｄ）」モチーフがある（ギャップ切断モチーフ（ｇａｐ−ａｂｌａｔｅｄｍｏｔｉｆ）としても呼ばれる）。ギャップ無能化モチーフにおいて、内部領域は内部領域の化学修飾とは異なる化学修飾によって中断されている。ウィング領域は、上述したように、均一な大きさであるか又は異なるサイズであることが可能である。ギャップ無能化モチーフは５'ＭＭＭＭＭＭｍｍｍＭＭＭｍｍｍｍＭＭＭＭ３'、５'ＭＭＭＭｍｍｍｍｍｍＭｍｍｍｍｍｍｍＭＭ３'、５'ＭＭｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍＭＭＭｍｍｍＭＭ３'であり、「ｍ」は１つの糖修飾を表し、及び「Ｍ」は異なる糖修飾を表す。

本発明で使用される「交互モチーフ（ａｌｔｅｒｎａｔｉｎｇｍｏｔｉｆ）」という用語は、オリゴマー化合物の本質的な全配列において交互になった２つの異なるヌクレオシドを含むヌクレオシドの連続配列を含むことを意味する。交互パターンは５'−Ａ（−Ｌ−Ｂ−Ｌ−Ａ）ｎ（−Ｌ−Ｂ）ｎｎ−３'という化学式で記載され、ここでＡ及びＢは少なくとも異なる糖基を有することによって区別されるヌクレオシドであり、各Ｌはヌクレオシド間基であり、ｎｎは０又は１及びｎは約７から１１である。これにより長さが約１７から約２４ヌクレオシドの交互オリゴヌクレオチドが可能となる。このような長さの範囲は、より長い又はより短いオリゴマー化合物もまた本発明に適しているので、限定することを意味するものではない。前記化学式はまた交互オリゴマー化合物の偶数または奇数の長さに対しても適用され、３'及び５'末端ヌクレオシドは同じ（奇数）又は異なる（偶数）。これらの交互オリゴマー化合物は、ホスホジエステルヌクレオシド間結合、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合、又はホスホジエステル及びホスホロチオエートヌクレオシド間結合の組み合わせを含むものであっても良い。

本発明の交互オリゴマー化合物を含む「Ａ」及び「Ｂ」ヌクレオシドは、少なくとも異なる糖部分を有することによってお互いに区別される。各々のＡ及びＢヌクレオシドは、β−Ｄ−リボヌクレオシド、β−Ｄ−デオキシリボヌクレオシド、２'−修飾ヌクレオシド（そのような２'−修飾ヌクレオシドは特に２'−ＭＯＥ、２'−フルオロ、及び２'−Ｏ−ＣＨ３を含むものであっても良い）及び２環式糖修飾ヌクレオシドから選択される修飾糖部分を有する。交互モチーフは核酸塩基配列及びヌクレオシド間結合から独立している。ヌクレオシド間結合は各位置又は特定の選択された位置において変化するか、又はオリゴマー化合物全体的に均一又は交互になったものであっても良い。

本発明で使用される「完全修飾モチーフ」という用語は糖修飾ヌクレオシドの連続配列を含むことを意味し、基本的に各ヌクレオシドは同じ修飾糖部分を有するように修飾されている。本発明の完全修飾鎖の適切な糖修飾ヌクレオシドは、２'−フルオロ（２'Ｆ）、２'−Ｏ（ＣＨ_２）_２ＯＣＨ_３（２'−ＭＯＥ）、２'−ＯＣＨ_３（２'−Ｏ−メチル）及び２環式糖修飾ヌクレオシドを含むが、これらに限定されない。一つの態様において、３'及び５'−末端ヌクレオシドは修飾されないままである。好ましい実施形態において、前記修飾ヌクレオチドは２'−ＭＯＥ、２'−Ｆ、２'−Ｏ−Ｍｅ又は２環式糖修飾ヌクレオシドのいずれかである。

本発明で使用される「ヘミマーモチーフ（ｈｅｍｉｍｅｒｍｏｔｉｆ）」という用語は、均一な糖鎖（同一の糖、修飾されている又は修飾されていない）を有するヌクレオシドの配列を含むことを意味し、５'−末端又は３'−末端の１つが、ヘミマー修飾オリゴマー化合物中の他のヌクレオシドとは異なる糖修飾ヌクレオシドの２〜１２ヌクレオシド配列を有する。一般的なヘミマーの例は、一方の末端に糖修飾ヌクレオシドの配列を有するβ−Ｄ−リボヌクレオシド又はβ−Ｄ−デオキシリボヌクレオシドを含むオリゴマー化合物である。ヘミマーモチーフの１つは、一方の末端に位置する２〜１２糖修飾ヌクレオシドを有する、β−Ｄ−リボヌクレオシド又はβ−Ｄ−デオキシヌクレオシドの配列を含む。別のヘミマーモチーフは、一方の末端に位置する２〜６糖修飾ヌクレオシドを有するβ−Ｄ−リボヌクレオシド又はβ−Ｄ−デオキシリボヌクレオシドの配列を含み、２〜４糖修飾ヌクレオシドが適切である。本発明の好ましい実施形態において、当該オリゴマー化合物は２'−ＭＯＥ修飾ヌクレオチドの領域、及びβ−Ｄ−デオキシリボヌクレオシドの領域を含む。一実施形態において、β−Ｄ−デオキシリボヌクレオシドはオリゴマー化合物中の１３以下の連続ヌクレオチドを含む。これらのヘミマーオリゴマー化合物はホスホジエステルヌクレオチド間結合、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合又はホスホジエステル及びホスホロチオエートヌクレオチド間結合の組み合わせを含むものであっても良い。

本発明において使用される「ブロックマーモチーフ（ｂｌｏｃｋｍｅｒｍｏｔｉｆ）」という用語は、均一に修飾された糖修飾ヌクレオシドのブロックによって内部で中断された均一な糖（修飾又は未修飾の同一な糖）を有するヌクレオシドの配列を含むことを意味し、前記修飾は他のヌクレオシドとは異なる。より一般的には、ブロックマーモチーフを有するオリゴマー化合物は、２から６又は２から４の糖修飾ヌクレオシドの１つの内部ブロックを有するβ−Ｄ−リボヌクレオシド又はβ−Ｄ−デオキシリボヌクレオシドの配列を含む。内部ブロック領域がヘミマーとなる末端の１つにない限り、内部ブロック領域はオリゴマー化合物中のいかなる位置にあっても良い。塩基配列及びヌクレオシド間結合はブロックマーモチーフ内のあらゆる位置で変化し得る。

天然及び修飾されたヌクレオチドはいずれも、それらのハイブリダイゼーション及び親和特性に影響する特定の立体的配置を有する。ホモ二本鎖核酸の立体的配置を記載するために使用される用語はＲＮＡに対しては「ＡＦｏｒｍ」及びＤＮＡに対しては「ＢＦｏｒｍ」である。ＲＮＡ及びＤＮＡ二本鎖に対する各立体配置は核酸繊維のＸ線回折分析から決定した（ＡｒｎｏｔｔａｎｄＨｕｋｉｎｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，１９７０，４７，１５０４．）。一般的にＲＮＡ対ＲＮＡ二本鎖はＤＮＡ対ＤＮＡ二本鎖より安定であり、より高い融解温度（Ｔｍ'ｓ）を有する（Ｓａｎｇｅｒｅｔａｌ，ＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓｏｆＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＳｔｒｕｃｔｕｒｅ，１９８４，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ；ＮｅｗＹｏｒｋ，ＮＹ．；Ｌｅｓｎｉｋｅｔａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９５，３４，１０８０７−１０８１５；Ｃｏｎｔｅｅｔａｌ，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，１９９７，２５，２６２７−２６３４）。ＲＮＡの増強された安定性は、幾つかの構造的特徴に起因しており、特にＡ−Ｆｏｒｍの配置から得られる改善された塩基のスタッキング相互作用からもたらされる（Ｓｅａｒｌｅｅｔａｌ，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，１９９３，２１，２０５１−２０５６）。ＲＮＡにおける２'水酸基の存在はノーザンパッカー（Ｎｏｒｔｈｅｒｎｐｕｃｋｅｒ）としても示されるＣ３'エンドパッカー（Ｃ３'ｅｎｄｏｐｕｃｋｅｒ）の方向へ糖を偏らさせ、Ａ−Ｆｏｒｍの配置を好む２本鎖もたらす。さらに、ＲＮＡの２'水酸基はＲＮＡ二本鎖を安定化させる、水が介在する水素結合のネットワークを形成することができる（Ｅｇｌｉｅｔａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９６，３５，８４８９−８４９４）。一方、デオキシ核酸は、サザンパッカー（Ｓｏｕｔｈｅｒｎｐｕｃｋｅｒ）としても知られるＣ２'エンド糖パッカー（Ｃ２' ｅｎｄｏｓｕｇａｒｐｕｃｋｅｒ）を好み、より不安定なＢ−ｆｏｒｍ配置を与えると考えられている（Ｓａｎｇｅｒ，Ｗ．（１９８４）ＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓｏｆＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＳｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，ＮｅｗＹｏｒｋ，ＮＹ）。本願明細書で使用されるＢ−ｆｏｒｍ配置は、Ｃ２'−エンドパッカー及びＯ４'−エンドパッカーの両方が含まれる。これは、Ｂ−ｆｏｒｍ２本鎖をもたらすフラノース（ｆｕｒａｎｏｓｅ）立体構造を考える上で、Ｏ４'−エンドパッカーの寄与も考慮に入れるべきであると指摘した、Ｂｅｒｇｅｒｅｔａｌ，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ，１９９８年，２６，２４７３−２４８０と一致する。

しかしながら、ＤＮＡ対ＲＮＡハイブリッド２本鎖は、通常、純粋なＲＮＡ対ＲＮＡ二本鎖よりも不安定であり、それらの配列に依存していることは、ＤＮＡ対ＤＮＡ二本鎖よりも多かれ少なかれ不安定である可能性がある（Ｓｅａｒｌｅｅｔａｌ，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，１９９３，２１，２０５１−２０５６）。ハイブリッド二本鎖構造は、、Ａ−及びＢ−ｆｏｒｍ配置の間の中間であり、その配置は弱いスタッキング相互作用をもたらす可能性がある（Ｌａｎｅｅｔａｌ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９３，２１５，２９７−３０６；Ｆｅｄｏｒｏｆｆら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９３，２３３，５０９−５２３；Ｇｏｎｚａｌｅｚｅｔａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９５，３４，４９６９−４９８２；Ｈｏｒｔｏｎｅｔａｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９６年，２６４，５２１−５３３）。標的ＲＮＡと合成配列の間に形成される２本鎖の安定性は、これらに限定されないが、ＲＮａｓｅＨ−介在及びＲＮＡ干渉メカニズムを含むアンチセンスメカニズムなどの治療の中心をなすものであり、これらのメカニズムはＲＮＡ標的鎖に対する合成配列鎖のハイブリダイゼーションに関連する。ＲＮａｓｅＨの場合、ｍＲＮＡを効果的に抑制するには、前記アンチセンス配列が少なくともハイブリダイゼーションの閾値に達することが必要である。

定常的に使用されている糖パッカリングを修飾する１つの方法は、糖の配置に影響を及ぼす置換基を用いて２'位置の糖を置換することである。環の立体構造に対する影響は２'位置の置換基の性質に依存している。多くの異なる置換基がそれらの糖パッカリング効果を測定するために研究されている。例えば、２'−ハロゲンは、２'-フルオロ誘導体がＣ３'−エンド形態のもっとも多い集団（６５％）を表し、２'−ヨウ素が最も少ない集団（７％）を表すことを示す研究がなされている。アデノシン（２'−ＯＨ）対デオキシアデノシン（２'−Ｈ）の集団は各々３６％及び１９％である。さらに、アデノシンダイマー（２'−デオキシ−２'−フルオロアデノシン−２'−デオキシ−２'−フルオロ−アデノシン）の２'−フルオロ基の効果は、積み重なった立体構造の安定性にも関連する。

予想されるように、相対的な二本鎖の安定性は２'−ＯＨ基を２'−Ｆ基に代え、このためＣ３'エンド集団が増加することによって増強されることが可能である。２'−Ｆ結合のより高極性の性質、並びにＣ３'−エンドパッカーリングを極端に優位させることは、Ａ−ｆｏｒｍ二本鎖での積み重なった立体構造を安定化させることが推測されている。ＵＶ淡色効果、環状２色性、及び^１ＨＮＭＲからのデータはまた、ハロ（ｈａｌｏ）置換の電気陰性が減少するにつれてスタッキングの程度が減少することを示している。さらに、糖部分の２'−位置の立体的な嵩高さは、Ｂ−ｆｏｒｍ二本鎖よりもＡ−ｆｏｒｍ二本鎖の方がより受け入れられるようになっている。従って、ジヌクレオシド一リン酸の３'末端における２'置換は、立体的な反発、フラノースパッカリング優位、静電気的反発、疎水的引力、水素結合能力などのスタッキング立体構造に対する多くの効果を越えると考えられている。このような置換効果は置換の分子サイズ、電気陰性、及び疎水性によって決定されると考えられている。相補性のある鎖の融解温度はまた、２'置換されたアデノシン二リン酸によって上昇する。置換の立体構造又は存在の３'エンド優位は増加した結合に関与しているかどうかは明らかではない。しかしながら、近傍の塩基のより大きな重なりは（スタッキング：ｓｔａｃｋｉｎｇ）、３'−エンド立体構造によって達成され得る。

ヌクレオシドの立体構造は、ペントフラノシル糖の２'、３'、又は４'位置の置換を含む様々な要素に影響される。立体障害置換基は一般にエクアトリアル位を好むが、電気陰性置換基は一般的にアキシャル位を好む（ＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓｏｆＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＳｔｒｕｃｔｕｒｅ，ＷｏｌｆｇａｎｇＳａｎｇｅｒ，１９８４，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ．）。３'エンド立体構造を好む２'位置の修飾は、認識要素（ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎｅｌｅｍｅｎｔ）として２'−ＯＨを保持しながら達成させることが可能である（Ｇａｌｌｏｅｔａｌ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ（２００１），５７，５７０７−５７１３、Ｈａｒｒｙ−Ｏ'ｋｕｒｕｅｔａｌ，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，（１９９７），６２（６），１７５４−１７５９、及びＴａｎｇｅｔａｌ，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．（１９９９），６４，７４７−７５４．）。或いは、３'エンド立体構造が優位となることは、電気陰性フッ素原子をアキシャル位に配置させた３'エンド立体構造に適応させた２'デオキシ−２'Ｆ−ヌクレオシドによって例示したように、２'−ＯＨの欠失によって達成することが可能である（Ｋａｗａｓａｋｉら，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．（１９９３年），３６，８３１−８４１）。リボース環の他の修飾、例えば、４'位を置換して４'Ｆ修飾ヌクレオシドを与えること（Ｇｕｉｌｌｅｒｍｅｔａｌ，ＢｉｏｏｒｇａｎｉｃａｎｄＭｅｄｉｃｉｎａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙＬｅｔｔｅｒｓ（１９９５），５，１４５５−１４６０及びＯｗｅｎら，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．（１９７６），４１，３０１０−３０１７）、或いは例えばメタノカルバヌクレオシド（ｍｅｔｈａｎｏｃａｒｂａｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ）類似体を得るための修飾（Ｊａｃｏｂｓｏｎら，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．（２０００），４３，２１９６−２２０３及びＬｅｅら，ＢｉｏｏｒｇａｎｉｃａｎｄＭｅｄｉｃｉｎａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙＬｅｔｔｅｒｓ（２００１），１１，１３３３−１３３７）は、３'エンド立体構造優位をもたらす。

本発明の１つの態様では、オリゴマー化合物は３'エンド糖立体構造を生じさせるために、合成的に修飾されたヌクレオシドを含む。ヌクレオシドは、ヘテロ環塩基、糖部分、或いはその両方の合成的な修飾を取入れることにより、所望の３'エンド糖立体構造を誘導する。これらの修飾されたヌクレオシドはＲＮＡ様ヌクレオシドを模倣するために使用され、オリゴマー化合物の特別な特性は、所望の３'エンド立体構造配置を維持したまま増強される得る。より安定な３'エンドヌクレオシドを用いることにより増強された特性は、タンパク質結合、タンパク質オフレート、吸収、クリアランスの修飾を通しての薬理動態学的特性の修飾、化学的安定性と同様にヌクレアーゼ安定性の修飾、結合親和性及びオリゴマーの特異性の修飾（酵素及び相補性配列に対する親和性及び特異性）、そしてＲＮＡ分解の増加した効果を含むが、これらに限定されない。

修飾ヌクレオシド及びそれらのオリゴマーの立体構造は、例えば分子的動態計算、核磁気共鳴スペクトロスコピー、及びＣＤ測定などの様々な方法で測定され得る。従って、ＲＮＡ様立体構造を誘導することが予想される修飾（オリゴマー化合物構造でのＡ−ｆｏｒｍ二本鎖配置）は本発明のオリゴマー化合物で有用である。本発明に受け入れられる修飾ヌクレオシドの合成は従来技術で周知である（例えばＣｈｅｍｉｓｔｒｙｏｆＮｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓａｎｄＮｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓＶｏｌ１−３，ｅｄ．ＬｅｒｏｙＢ．Ｔｏｗｎｓｅｎｄ，１９８８，ＰｌｅｎｕｍＰｒｅｓｓ．を参照）。

一つの態様において、本発明は、天然のＲＮＡ又はＤＮＡに比べて増強した特性を有するように設計されているオリゴマー化合物を対象としている。最適化された又は増強されたオリゴマー化合物を設計する１つの方法は、可能な増強修飾を詳しく調べて選択した配列の各ヌクレオシドを含む。１つの修飾は、１若しくはそれ以上のＲＮＡヌクレオシドを同じ３'エンド立体構造配置を有するヌクレオシドを置換することである。そのような修飾は天然ＲＮＡと比較して、化学的及びヌクレアーゼ安定性を増強することが可能であり、一方同時にオリゴヌクレオチドを合成及び／又はオリゴヌクレオチドに取り込むことがより安価且つ簡便である。前記配列は、キメラ立体構造の結果となる得る修飾を増強するため評価された、領域及び各領域のヌクレオシドにさらに分けることが可能である。５'及び３'末端は、１若しくはそれ以上の末端ヌクレオシドを作製するための有利な修飾に考慮される。本発明のオリゴマー化合物は、一本鎖または２本鎖配列の一方又は両方の少なくとも５'位置に少なくとも１つの５'修飾リン酸基を含む。考慮される他の修飾は、ヌクレオシド間結合、抱合基、置換糖または塩基、の１若しくはそれ以上のヌクレオシドをヌクレオシド摸倣体に置換すること、及びオリゴマー化合物の所望の特性を増強することが可能であるあらゆる他の修飾である。

本願明細書で使用される「アルキル」という用語は、２４個の炭素原子まで含む飽和した直鎖又は分岐鎖炭化水素ラジカル基を指す。アルキル基の例は、メチル、エチル、プロピル、ブチル、イソプロピル、ｎ−ヘキシル、オクチル、デシル、ドデシル及び同様のものを含むが、これらに限定されない。アルキル基は典型的には１から約２４個の炭素原子、より典型的には１から約１２個の炭素（Ｃ_１−Ｃ_１２アルキル）、より望ましくは１から約６個の炭素原子が含まれる。本願明細書で使用される「低級アルキル（ｌｏｗｅｒａｌｋｙｌ）」という用語は、１から約６個の炭素原子を含む。本願明細書で使用されるアルキル基は、選択的に１もしくはそれ以上置換基を含むものであっても良い（下記の置換基のリストを参照）。

本願明細書で使用される「アルケニル」という用語は、少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を有する２４個までの炭素原子を含む直鎖又は分岐鎖炭化水素鎖ラジカル基を指す。アルケニル基の例は、エテニル、プロペニル、ブテニル、１−メチル−２−ブテン−１−ｙｌ、１，３−ブタジエンのようなジエン、及び同様のものを含むが、これらに限定されない。アルケニル基は典型的には２から約２４個の炭素原子を含み、より典型的には２から約１２個の炭素原子、より望ましくは２から約６個の炭素原子を含む。本願明細書で使用されているアルケニルｌ基は選択的には一つか又はさらにより多くの置換基を含む可能性がある。

本願明細書で使用される「アルキニル」という用語は，２４個までの炭素原子を含み、及び少なくとも一つの炭素−炭素三重結合を有する、直鎖又は分岐鎖炭化水素ラジカル基を指す。アルケニル基の例は、エチニル、１−プロピニル、１−ブチニル及び同様のまのを含むが、これらに限定されない。アルキニル基は典型的には２から約２４個の炭素原子、より典型的には２から約１２個の炭素原子、より望ましくは、２から約６個の炭素原子を含む。本願明細書で使用されるアルキニル基は選択的に１もしくはそれ以上の置換基を含む可能性がある。

本願明細書で使用される「アミノアルキル」という用語は，アミノ置換アルキルラジカル基を指す。この用語はいずれの位置にアミノ基置換を有するＣ_１〜Ｃ_１２アルキル基を含むことを意味し、前記アルキル基は親分子にアミノアルキル基が結合している。アミノアルキル基の前記アルキル又はアミノ部分は置換基とともにさらに置換されることが可能である。

本願明細書で使用される「脂肪族の」という用語は、２４個までの炭素原子を含む、直線状または分岐した炭化水素のラジカル基を指し、任意２つの炭素原子の間の飽和は一重、二重、又は三重結合である。脂肪族基は望ましくは１から約２４個の炭素原子、より典型的には１から約１２個の炭素原子、より望ましくは１から約６個の炭素原子を含む。脂肪族基の直線状又は分岐した鎖は、窒素、酸素、硫素及びリンを含む、１もしくはそれ以上のヘテロ原子によって中断される可能性がある。ヘテロ原子によって中断された、そのような脂肪族基は、例えばポリアルキレングリコール、ポリアミン、及びポリイミンのような、ポリアルコキシを含むが、これらに限定されない。本願明細書で使用されている脂肪族基は選択的にさらなる置換基を含むものであっても良い。

「脂環」という用語は周期性の環システムを指し、環は脂肪族である。前記環システムは１もしくはそれ以上の環を含むものであっても良く、少なくとも１つの環が脂肪族である。脂環はあらゆる程度の飽和を有する環を含む。望ましい脂環は、環内に約５から約９個の炭素原子を有する環を含む。本願明細書で使用される脂環は選択的にさらなる置換基を有するものであっても良い。

本願明細書で使用される「アルコキシ」はアルキル基と酸素原子の間に形成されたラジカル基を呼び、酸素原子は親分子にアルコキシ基をつけるのに使用される。アルコキシ基の例は、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ−ブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、ｎ−ペントキシ、ネオペントキシ、ｎ−へキソキシ及び同様のものを含むが、これらに限定されない。本願明細書で使用されるアルコキシ基は選択的にさらなる置換基を含む可能性がある。

本願明細書で使用される「ハロ（ｈａｌｏ）」及び「ハロゲン（ｈａｌｏｇｅｎ）」という用語はフッ素、塩素、臭素及びヨウ素から選択される原子を言う。

本願明細書で使用される「アリール」及び「芳香族の」という用語は、１もしくはそれ以上の芳香族環を有する単環式の又は多環式の炭素環式の環システムラジカル基を指す。アリール基の例はフェニル、ナフチル、テトラヒドロナフチル、インダニル、イデニル及び同様のものを含むが、これらに限定されない。望ましいアリール環システムは、１もしくはそれ以上の環に、約５から２０個、又はさらに約６から１４個の炭素原子を有する。本願明細書で使用されているアリール基は、選択敵的にさらなる置換基を含むものであっても良い。

本願明細書で他に定義されていない限り、「アラルキル」及び「アリールアルキル」は、アルキル基及びアリール基の間に形成されるラジカル基を呼び、前記アルキル基は親分子にアラルキル基を結合させる場合に使用される。例は、ベンジル、フェネチル及び同様のものを含む。本願明細書で使用されているアラルキル基は選択的に、ラジカル基を形成するアルキル、アリール又は両方の基にさらなる置換基を含むものであっても良い。

本願明細書で使用されている「ヘテロ環（ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ）」又は「ヘテロ環のラジカル基」という用語は、少なくとも一つのヘテロ原子を含み、関連してヘテロアリール基を含んでいる、飽和されていない、一部飽和されている又は完全に飽和されている、ラジカル基の単環式の又は多環式の環システムを指す。ヘテロ環はまた融合した環システムを含むのを意味し、一もしくはそれ以上の融合した環システムはヘテロ原子を含まない。ヘテロ環基は典型的には硫素、窒素、又は酸素から選択される少なくとも１つの原子を含む。ヘテロ環基の例は、［１，３］ジオキソラン、ピロリジニル、ピラゾリニル、ピラゾリジニル、イミダゾリニル、イミダゾリジニルｌ、ピペリジニル、ピペラジニル、オキサゾリジニル、イソオキサゾリジニル、モルホリニル、チアゾリジニル、イソチアゾリジニル、キノキサリニル、ピリダジノニル、テトラヒドロフリル及び同様のものを含む。本願明細書で使用されるヘテロ環基は選択的にさらなる置換基を含むものであっても良い。ある態様では、ヘテロ環基は、例えば、約３から約５０個の炭素原子、望ましくは約４から１４個の炭素原子を有し、酸素、窒素、又は硫素から独立して選ばれる１から４個のヘテロ原子を有する。

本願明細書で使用される「ヘテロアリール」及び「ヘテロ芳香族の」は単環式のまたは多環式の芳香族環、環システム又は融合した環システムを含んでいるラジカル基を呼び、少なくとも一つの環は芳香族であり、及び一つ又はより多くのヘテロ原子を含む。ヘテロアリールはまた、一つ又はより多くの融合した環がヘテロ原子含んでいないシステムを含んでいる、融合環システムを含むのを意味する。ヘテロアリール基は典型的に、硫素、窒素、又は酸素から選ばれた一つの環原子を含む。ヘテロアリール基の例は、ピリジニル、ピラジニル、ピリミジニル、ピロリル、ピラゾリル、イミダゾリル、チアゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、チアジアゾリル、オキサジアゾリル、チオフェニル、フラニル、キノリニル、イソキノリニル、ベンゾイミダゾリル、ベンゾオキサゾリル、キノキサリニル、及び同様のものを含むが、これらに限定されない。ヘテロアリールラジカル基は直接又は脂肪族基又はヘテロ原子のような結合鎖を通して親分子につくことが可能である。本願明細書で使用されるヘテロアリール基は、選択的にさらなる置換基を含む可能性がある。ある態様では、ヘテロアリール基は例えば、約３から５０個の炭素原子望ましくは約４から１４個の炭素原子を有し、酸素、窒素、又は硫素から独立して選ばれる１から４個のヘテロ原子を有する。

本願明細書で使用される「ヘテロアリールアルキル」は、ａｌｋｙｌ基を介して親分子につく、以前に定義されたヘテロアリール基を指す。例はピリジニルメチル、ピリミジニルエチル及び同様のものを含むが、これらに限定されるものではない。本願明細書で使用されるヘテロアルキル基は選択的にさらなる置換基を含むものであっても良い。

本願明細書で使用される「アシル」は、有機酸から水酸基を除去することにより形成されるラジカル基を指し、一般式−Ｃ（Ｏ）−Ｘを有し、ここでＸは一般的に脂肪族、脂環又は芳香族である。例は、脂肪族カルボニル、芳香族カルボニル、脂肪族スルホニル、芳香族スルホニル、脂環スルホニル、芳香族リン酸、脂肪族リン酸及び同様のものを含む。本願明細書で使用されたアシル基は選択的にさらなる置換基を含ものであっても良い。

本願明細書において別に定義されていない限り、アミド（ａｍｉｄｅ）は−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ_２及び置換されたアミドは−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ_ａＲ_ｂであり、少なくともＲ_ａ及びＲ_ｂの１つはＨとは異なる別の置換基である。

本願明細書において別に定義されていない限り、アミノアルキルはアルキル基に結合したアミノ基を有するラジカル基を意味し、１または両方の基がさらに１若しくはそれ以上の置換基で置換されていても良い。前記ラジカル基はアルキルまたはアミノ基から親基に結合していても良い。

本願明細書において別に定義されていない限り、アミノアルコキシはオキシ（アミノアルキル−Ｏ−）にさらにつく、アルキル基につくアミノ基を有するラジカル基を意味し、アミノ及び／又はアルキル基はさらに１若しくはそれ以上の置換基で置換されていても良い。

本願明細書で使用される「保護基」という用語は、合成法の間で望ましくない反応に対して、これらに限定されないが、水酸基、アミノ基、及びチオール基を含む反応基を保護するための従来周知の不安定化学部分を指す。保護基は、一般的に、他の部位における反応の間、部位を選択的及び／又は直接的に保護するために使用され、その後除去されて更なる反応のため利用可能とするために保護されていないようにするものである。従来技術で知られている保護基は一般的にＧｒｅｅｎｅａｎｄＷｕｔｓ，ＰｒｏｔｅｃｔｉｖｅＧｒｏｕｐｓｉｎＯｒｇａｎｉｃＳｙｎｔｈｅｓｉｓ，３ｒｄｅｄｉｔｉｏｎ，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ&Ｓｏｎｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ（１９９９）で説明されている。

本願明明細書で説明されるオリゴマー化合物は、複数の不斉中心を含んでおり、したがって光学異性体、ジアステレオマー、及び他の立体異性体の形態をもたらし、それらは、フラノシル糖基に対して（Ｒ）−又は（Ｓ）−、（Ｄ）−又は（Ｌ）−のような絶対立体化学の観点から定義される。本発明は、そのような可能なすべての異性体、並びにラセミ体及び光学的に純粋な形態を含むことを意味する。光学異性体は、上述した方法によって、あるいはラセミ混合物を分割することによって、光学的に活性な各前駆体から調製される。前記分割は、分割剤の存在下、クロマトグラフィー、又は繰り返して行われる結晶化、又は当業者に周知のこれらの技術をいくつか組み合わせることによって実施可能である。前記分割に関するさらなる詳細は、Ｊａｃｑｕｅｓら，Ｅｎａｎｔｉｏｍｅｒｓ，Ｒａｃｅｍａｔｅｓ，ａｎｄＲｅｓｏｌｕｔｉｏｎｓ（ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ&Ｓｏｎｓ，１９８１）において見出される。本願明細書において説明される化合物がオルフィンの二重結合、他の不飽和、又は他の幾何学的非対称中心を含む場合、別に特定されていない限り、前記化合物はＥ及びＺ幾何学異性体両方、又はシス−及びトランス−異性体の両方を含むのを意図する。同様に、互変異性体もまた含まれることを意図する。本願明細書に見られる任意の炭素−炭素二重結合の立体配置は、利便性のために選択されているのみであり、文脈にそう述べられていない限りは特定の立体構造を示すことを意図しているものではなく、従って、トランスとして本願明細書で任意に示した炭素―炭素二重結合又は炭素−ヘテロ原子二重結合は、シス、トランス、又はあらゆる割合における２の混合であっても良い。

本願明細書で使用される置換基は、そこに結合する１もしくはそれ以上の置換基を有していても良い。本願明細書で使用される「置換の」及び「置換基」は、望ましい特性を増強する又は望まれた効果を与えるために、典型的に他の基又は親化合物に付け加えられた基を含むことを意味する。置換基は保護される又は保護されていなくても良く、親化合物利用可能な部位または多くの利用可能な部位に結合させることが可能である。置換基は、さらに他の置換基で置換されていても良く、親化合物に直接結合するか又はアルキル又はヒドロカルビル基などの結合基を通して結合していても良い。そのような基は、これらに限定されないが、ハロゲン、ハイドロキシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アシル（−Ｃ（Ｏ）Ｒ_ａ）、カルボキシル（−Ｃ（Ｏ）Ｏ−Ｒ_ａ）、脂肪族の、脂環、アルコキシ、置換されたオキソ（−Ｏ−Ｒ_ａ）、アリール、アラルキル、複素環、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、アミノ（−ＮＲ_ｂＲ_ｃ）、イミノ（＝ＮＲ_ｂ）、アミド（−Ｃ（Ｏ）ＮＲ_ｂＲ_ｃ又は−Ｎ（Ｒ_ｂ）Ｃ（Ｏ）Ｒ_ａ）、アジド（−Ｎ_３）、ニトロ（−ＮＯ_２）、シアノ（−ＣＮ）、カルバミド（-ＯＣ（Ｏ）ＮＲ_ｂＲ_ｃ又は−Ｎ（Ｒ_ｂ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ_ａ）、ウレイド（−Ｎ（Ｒ_ｂ）Ｃ（Ｏ）ＮＲ_ｂＲ_ｃ）、チオウレイド（−Ｎ（Ｒ_ｂ）Ｃ（Ｓ）ＮＲ_ｂＲ_ｃ）、グアニジニル（−Ｎ（Ｒ_ｂ）Ｃ（＝ＮＲ_ｂ）ＮＲ_ｂＲ_ｃ）、アミジニル（−Ｃ（＝ＮＲ_ｂ）ＮＲ_ｂＲ_ｃ又は-Ｎ（Ｒ_ｂ）Ｃ（ＮＲ_ｂ）Ｒ_ａ）、チオール（−ＳＲ_ｂ）、スルフィニル（−Ｓ（Ｏ）Ｒ_ｂ）、スルホニル（−Ｓ（Ｏ）_２Ｒ_ｂ）、スルホンアミジル（−Ｓ（Ｏ）_２ＮＲ_ｂＲ_ｃ又は-Ｎ（Ｒ_ｂ）Ｓ（Ｏ）_２Ｒ_ｂ）及び抱合基を含む。各Ｒ_ａ、Ｒ_ｂ及びＲ_ｃは、さらに、これらに限定されないが、アルキル、アルケニル、アルキニル、脂肪族、アルコキシ、アシル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、脂環式、複素環式、及びヘテロアリールアルキルを含む好ましい一覧のグループで置換される。

リン酸保護基は、米国特許第５，７６０，２０９号、第５，６１４，６２１号、第６，０５１，６９９号、第６，０２０，４７５号、第６，３２６，４７８号、第６，１６９，１７７号、第６，１２１，４３７号、第６，４６５，６２８号明細書に記載されているものを含み、これはこの参照により本願明細書で完全に組み込まれる。

オリゴマー化合物のスクリーニング
マイクロＲＮＡ等を含むスモールノンコーディングＲＮＡに対する有効なモジュレーターを同定するスクリーニング方法もまた、本発明に包含され、それらの方法は、スモールノンコーディングＲＮＡ又はその一部を、１若しくはそれ以上のモジュレーター候補物質と接触させる工程と、スモールノンコーディングＲＮＡの強度、発現量を減少または増加させる、又はその機能を変化させる１若しくはそれ以上の候補物質を選択する工程と、を有するものである。本願明細書に記すように、モジュレーター候補物質はマイクロＲＮＡ、またはその任意の一部を標的とするオリゴマー化合物である可能性がある。モジュレーターまたはその候補物質が、スモールノンコーディングＲＮＡの強度、発現量を調節すること（例えば減少または増加させるなどの形で）、またはその機能を変化させることが一旦示されれば、そのモジュレーターは、本発明に従って、さらなる研究用途に使用するほか、標的のバリデーション、試験研究、検査または治療での試薬、薬剤として用いることができる。一実施形態において、特定のマイクロＲＮＡの機能を調節する能力に対して、モジュレーター候補物質をスクリーニングする。

オリゴヌクレオチドの合成
オリゴマー化合物およびホスホアミダイトは、当業者にとって周知の方法で合成される。修飾型または天然型のヌクレオシドの低重合化は、ＤＮＡ様化合物の合成方法に関する文献（ＰｒｏｔｏｃｏｌｓｆｏｒＯｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓａｎｄＡｎａｌｏｇｓ，Ｅｄ．Ａｇｒａｗａｌ（１９９３），ＨｕｍａｎａＰｒｅｓｓ）、および／またはＲＮＡ様化合物の合成方法に関する文献（Ｓｃａｒｉｎｇｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ（２００１），２３，２０６〜２１７．Ｇａｉｔｅｔａｌ，ＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｏｆＣｈｅｍｉｃａｌｌｙｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄＲＮＡｉｎＲＮＡ：ＰｒｏｔｅｉｎＩｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ，Ｅｄ．Ｓｍｉｔｈ（１９９８），１〜３６．Ｇａｌｌｏｅｔａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ（２００１），５７，５７０７〜５７１３）に従って適切に行われる。あるいは、例えばＤｈａｒｍａｃｏｎＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｃ．（コロラド州Ｌａｆａｙｅｔｔｅ）などの様々なオリゴヌクレオチド合成会社からオリゴマーを購入することもできる。

どのプロトコルを用いるかに関わらず、本発明に従って使われるオリゴマー化合物は周知の固相合成法によって簡便かつ規定通りに生成することができる。そうした合成のための器具は、例えばＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（カリフォルニア州ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ）などのいくつかの供給メーカーによって販売されている。以上述べたような合成方法として、当該技術分野で既知である方法（液相合成法など）であれば他のどういったものであっても、追加的に、または代替的に用いることができる。

オリゴヌクレオチドの単離および分析の方法は当該技術分野において周知のものである。オリゴヌクレオチドの小規模な合成、単離そして分析には、９６穴プレートが特に便利である。

二重鎖オリゴマー化合物の設計およびスクリーニング
スクリーニングおよび標的のバリデーションの研究において、本発明のオリゴマー化合物は、そのそれぞれに対応する相補鎖のオリゴマー化合物と同時に用いて、安定した二本鎖（二重鎖）のオリゴヌクレオチドを形成させて使用することができる。本発明に従い、本発明のオリゴマー化合物およびその相補鎖を含む一連の二重鎖が、スモールノンコーディングＲＮＡを標的とするように設計することができる。前記二重鎖の末端は、１若しくはそれ以上の天然型、または修飾型核酸塩基の付加によって、オーバーハングを形成するように修飾することができる。そうすると、二重鎖ＲＮＡのセンス鎖はアンチセンス鎖に対して相補的に設計および合成され、いずれの末端にも修飾または付加を持つようにすることもまたできる。例えばいくつかの実施形態では上述のように、二重鎖のうちの両方の鎖は中央領域の核酸塩基が相補的であり、それぞれの鎖が一方または両方の末端にオーバーハングを有するようになるであろう。

一部の実施形態において、以下に示すように、ＣＧＡＧＡＧＧＣＧＧＡＣＧＧＧＡＣＣＧ（配列ＩＤ番号：１）という配列を有するアンチセンス鎖を含む二重鎖が（一本鎖のオーバーハングが無い）非突出末端を持つように調製することができる。

他の実施形態において、以下に示すように、ＣＧＡＧＡＧＧＣＧＧＡＣＧＧＧＡＣＣＧ（配列ＩＤ番号：１）という配列を有し、二塩基分のデオキシチミジン（ｄＴ）のオーバーハングを有するアンチセンス鎖および、それに対して相補的なセンス鎖とを含む二重鎖がオーバーハングを持つように調製することができる。

これらの配列はウラシル（Ｕ）を含むように図示されているが、当業者は、ウラシル（Ｕ）が、ＤＮＡ配列に見られるチミンによって置換できることを理解するであろう。二重鎖を構成するＲＮＡ鎖は本発明で開示されている方法によって合成することができ、またはＤｈａｒｍａｃｏｎＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｃ．（コロラド州Ｌａｆａｙｅｔｔｅ）から購入することもできる。

診断法、薬剤探索および治療法
本発明のオリゴマー化合物および組成物はさらに、試験研究、薬剤探索、キットおよび診断法、および治療法にも用いることができる。

試験研究での利用では、本発明のオリゴマー化合物は、核酸分子を標的として、その正常な機能に干渉するように用いられる。まず、本発明における１若しくはそれ以上のオリゴマー化合物または組成物によって処理された細胞または組織内での発現パターンを、化合物または組成物によって処理されていないコントロールの細胞または組織内のものと比較した。そして、その結果生成されたパターンは、例えば、試験の対象となる遺伝子の、疾患との関連性、シグナル伝達経路、細胞内局在、発現量、サイズ、構造、または機能などと関連する核酸の発現の差分的なレベルに対して分析される。これらの分析は、刺激を受けた、または受けていない細胞に対して、および発現パターンに影響する他の化合物の存在下、または非存在下で行うことができる。

薬剤探索での利用では、スモールノンコーディングＲＮＡ、遺伝子、またはタンパク質と、病状、表現型、または健康状態との間に存在する関連性を解明するために、本発明のオリゴマー化合物が用いられる。これらの方法は、標的の検出または調節を包含するものであり、以下の工程を含む。すなわち、サンプル、組織、細胞、または微生物の、本発明のオリゴマー化合物および組成物への接触の工程、標的の強度および／またはｍＲＮＡまたはそれがコードするタンパク質など下流の遺伝子産物の強度の計測の工程、処理後のある時点での表現型または化学的な反応の結果の測定の工程、および未処理のサンプル、ポジティブコントロール、またはネガティブコントロールとの計測値の選択的な比較の工程である。これらの方法は、標的のバリデーションの過程で未知の遺伝子の機能を解明するための他の実験と、または疾患の治療あるいは予防のための標的としての特定の遺伝子産物の有効性を解明するための他の実験と平行して、または組み合わせて行うことができる。

キットおよび診断法としての利用では、本発明のオリゴマー化合物および組成物は、単独で、または他の化合物あるいは治療法との組合せで用いて、差分解析および／またはコンビナトリアル解析のツールとして使用することができ、それによってタンパク質をコードしていない、またはコードしている核酸の一部または全体の相補物の、細胞および組織内での発現パターンを解明することができる。

当業者は治療目的において、化合物および組成物の特異性および感度を利用することができる。アンチセンスのオリゴマー化合物は、ヒトを含む動物の疾患の治療の助けとして用いられてきている。リボザイムを含むアンチセンスオリゴヌクレオチド薬剤は、ヒトに対して安全かつ効果的に投与されてきており、さらに、多数の臨床試験が現在も進行中である。従って、オリゴマー化合物が有効な治療法であることは確立されており、前記治療法を細胞、組織、および特にヒトをはじめとする動物の処理／治療のための処置において実用的であるように構成することができる。

治療法としての利用では、選択されたスモールノンコーディング核酸の発現を調節することで、治療、改善、または向上することができる症状を示す疾病または疾患を有すると疑われる動物、望ましくはヒトに対して、前記選択されたスモールノンコーディング核酸を標的とする化合物および組成物を投与する。本発明の化合物のうちの優れたものは強い活性と改善された治療指数を示し、従って、治療法への適用に適している。例えば、これに限定されるものではないが一実施形態では、治療方法は、疾病または疾患と関連付けられる症状を処理、改善、または向上させるために有効な量のモジュレーターを動物へ投与する、または接触させる工程を含むものである。本発明の化合物のうち優れたものは、標的のスモールノンコーディングＲＮＡの活性または機能を効果的に調節するか、または標的のスモールノンコーディングＲＮＡの発現または強度を抑制する。望ましい実施形態では、標的のスモールノンコーディングＲＮＡはマイクロＲＮＡ、プレマイクロＲＮＡ、またはポリシストロニックあるいはモノシストロニックプリマイクロＲＮＡである。さらに追加的な実施形態では、標的のスモールノンコーディングＲＮＡはマイクロＲＮＡファミリーの一構成員である。あるいは、マイクロＲＮＡファミリーのなかから２若しくはそれ以上の構成員が調節のために選択される。一実施形態では、動物内の標的の強度、活性、または発現量は約１０％抑制される。他の実施形態では、動物内の標的の強度、活性、または発現量は約３０％抑制される。さらには、動物内の標的の強度、活性、または発現量は５０％またはそれ以上、６０％またはそれ以上、７０％またはそれ以上、８０％またはそれ以上、９０％またはそれ以上、９５％またはそれ以上、抑制される。また他の実施形態では、マイクロＲＮＡｓおよびマイクロＲＮＡファミリーに関連付けられるありとあらゆる症状の治療に用いられる薬剤の製造における本発明の化合物の利用を、本発明は提供する。

動物において、血清、脂肪組織、肝臓、またはスモールノンコーディングＲＮＡあるいはその前駆体を含むことが知られている他のどのような体液、組織、または器官でも、標的強度の減少を測定することができる。さらには、分析される体液、組織、または器官に含まれている細胞は、標的となるスモールノンコーディングＲＮＡそれ自身のさらに下流の標的となる核酸分子を含む。

医薬品組成物を設計するための方法および組成物
本発明はまた、オリゴマー化合物、スモールノンコーディングＲＮＡ、および本発明の組成物を含む製剤設計および医薬品組成物を含む。医薬品組成物を設計するための方法および組成物は、例えば、これに限定されるものではないが、投与経路、病気の程度、または投与量を含む数々の基準に依存する。当業者は、そういった検討事項を良く理解している。

本発明のオリゴマー化合物および組成物は、有効な量の化合物または組成物を、適切で医薬品としての条件を満たした希釈剤または担体に添加することで、医薬品組成物において利用することができる。本発明のオリゴマー化合物および方法の使用は、疾病予防においてもまた有用である。

本発明のオリゴマー化合物および組成物は、医薬品としての条件を満たしたあらゆる塩、エステル、またはそうしたエステルの塩を包含し、また、ヒトを含む動物への投与によって（直接的に、あるいは間接的に）生物学的な活性代謝物、または残基を生じさせることができる他のあらゆる化合物を包含する。従って例えば、プロドラッグおよび本発明のオリゴマー化合物の塩として医薬品の条件を満たすもの、そのようなプロドラッグの塩で医薬品の条件を満たすもの、およびその他の生物学的な同等物もまた、この開示内容の範囲内である。

「プロドラッグ」という用語は、不活性な状態で準備されており、それが内在性の酵素または他の化学物質および／または条件の働きによって、生体内や細胞内で活性型（すなわち医薬品）に変換されるものを意味している。

「医薬品としての条件を満たした塩」という用語は、本発明の化合物および組成物の塩で、生理的におよび医薬品としての条件を満たした塩について言及している。すなわち、元の化合物に望まれる生物学的活性を保持し、さらに望ましくない毒性効果をもたらさないような塩を言う。適切な例としては、これに限定されるものではないが、ナトリウム塩やカリウム塩が挙げられる。

いくつかの実施形態では、オリゴマー化合物は被験体に対して経口投与することができる。被験体としてはマウス、ラット、イヌ、モルモットまたはヒト以外の霊長類などの哺乳類を用いることができる。またいくつかの実施形態では、ヒトまたはヒトの患者を被験体とすることができる。また、ある実施形態での被験体は、ここでさらに詳しく述べられる通り、１若しくはそれ以上のプリマイクロＲＮＡｓの強度または発現量を調節する必要に迫られている可能性がある。一部の実施形態において、被験対象に投与される組成物は、ここで述べられる通り、１若しくはそれ以上の箇所を修飾されたヌクレオチドを含むであろう。

細胞培養およびオリゴヌクレオチド処理
標的の核酸の発現または機能に対するオリゴマー化合物の効果は、標的の核酸が検出可能な強度で存在しさえすれば、いかなるタイプの細胞を用いて測定しても良い。使用する細胞の決定は、例えば、ノザンブロット法、リボヌクレアーゼプロテクションアッセイ法、またはリアルタイムＰＣＲ法など、当該技術分野で通常に使用されている方法によって容易に行うことができる。このような分析に用いられる様々な細胞は、民間の供給メーカー（例えば、ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，ヴァージニア州Ｍａｎａｓｓｕｓ；Ｚｅｎ−Ｂｉｏ，Ｉｎｃ，ノースカロライナ州ＲｅｓｅａｒｃｈＴｒｉａｎｇｌｅＰａｒｋ；ＣｌｏｎｅｔｉｃｓＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，メリーランド州Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ）から入手可能であり、市販の試薬（例えば、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄ）を用いて供給メーカーの指示に従って細胞を培養した。実例となる細胞の種類としては、これに限定されるものではないが：Ｔ−２４細胞、Ａ５４９細胞、正常なヒト乳腺上皮細胞（ｎｏｒｍａｌｈｕｍａｎｍａｍｍａｒｙｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｓ：ＨＭＥＣｓ）、ＭＣＦ７細胞、Ｔ４７Ｄ細胞、ＢＪ細胞、Ｂ１６−Ｆ１０細胞、正常ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣｓ）、正常ヒト皮膚繊維芽細胞（ｈｕｍａｎｎｅｏｎａｔａｌｄｅｒｍａｌｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ：ＮＨＤＦ）、ヒト表皮角化細胞（Ｈｈｕｍａｎｅｍｂｒｙｏｎｉｃｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ：ＨＥＫ）、２９３Ｔ細胞、ＨｅｐＧ２、ヒト前駆脂肪細胞、分化したヒト脂肪細胞（当該技術分野において既知の方法に従ってヒト前駆脂肪細胞を分化させたもの）、ＮＴ２細胞（ＮＴＥＲＡ−２ｃｌ．Ｄ１としても知られる）、およびＨｅｌａ細胞が挙げられる。

アンチセンスオリゴマー化合物による処理
本発明のオリゴマー化合物による細胞の処理は、細胞密度が約８０％に達した時点で行われる。オリゴマー化合物の細胞への導入には、カチオン性脂質トランスフェクション試薬ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄ）を用いる。オリゴマー化合物とＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）をＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄ）中で混合し、オリゴマー化合物とＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）とを望みの最終濃度に到達させる。細胞に添加する前に、オリゴマー化合物、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）、およびＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）１を完全に混合させ、約０．５時間インキュベートした。細胞培地をプレートから除去し、滅菌したガーゼ上でプレートを軽くたたく。９６穴プレートの各ウェルを、それぞれ１５０μＬのリン酸緩衝生理食塩水またはハンクス液で洗浄する。２４穴プレートの各ウェルを、それぞれ２５０μＬのリン酸緩衝生理食塩水またはハンクス液で洗浄する。各ウェル中の洗浄緩衝液を、９６穴プレートまたは２４穴プレートの場合、それぞれ１００μＬ、２５０μＬのオリゴマー化合物／ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）／ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）の混合液と置換する。未処理のコントロール細胞には、ＬＩＰＯＥＦＣＴＩＮ（登録商標）のみを与える。プレートは３７℃で４〜７時間ほどインキュベートした後、細胞培地を除去し、滅菌したガーゼ上でプレートを軽くたたく。９６穴プレートまたは２４穴プレートの各ウェルに、それぞれ１００μＬ、１ｍＬの成長培地をそのまま添加する。オリゴヌクレオチド処理から１６〜２４時間後に細胞を採取し、ＲＮＡを単離して標的量の減少をリアルタイムＰＣＲで計測するか、もしくは他の表現型のアッセイを行う。処理した細胞のデータ測定は３回繰り返して行い、３回の試行の平均値を結果とする。

あるいは、細胞のトランスフェクションはＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄ）を用いて行う。細胞密度が６５〜７５％に達してから、それをオリゴヌクレオチドで処理する。オリゴヌクレオチドとＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）を、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）１血清使用量低減培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄ）中で混合し、オリゴヌクレオチドの濃度が望ましい値になるように、そしてＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）の濃度がオリゴヌクレオチド１００ｎＭにつき２〜１２μｇ／ｍＬの間になるようにする。このトランスフェクション混合液を室温下で約０．５時間インキュベートする。９６穴プレートで培養した細胞の場合、各ウェルを１００μＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）で一回洗浄した後、１３０μＬのトランスフェクション混合液で処理する。２４穴プレート、またはその他の標準的な組織培養プレートで培養した細胞の場合も、適量の培地およびオリゴヌクレオチドを用いて同様に処理する。細胞の処理およびデータの取得は２回、または３回に渡って行う。３７℃で約４〜７時間処理した後、トランスフェクション混合液を含む培地を新鮮な培地で置換する。オリゴヌクレオチド処理を１６〜２４時間行った後、細胞を採取する。

一部の実施形態において、、本発明のオリゴマー化合物を一過性に発現するように、細胞にトランスフェクトした。また他の一部の実施形態において、細胞にトランスフェクションを受けた後、本発明のオリゴマー化合物を安定的に発現するように選別される。

オリゴヌクレオチドの濃度は使用する細胞株ごとに異なる。特定の細胞株に最適なオリゴヌクレオチド濃度を決定する方法は、当該技術分野において周知である。例えば、Ｈ−ｒａｓのような遺伝子を標的とするポジティブコントロールのヌクレオチドを用いて、一定範囲の様々な濃度でもって細胞を処理する。コントロールは非修飾、均一に修飾された、またはキメラのオリゴマー化合物である。例えば、コントロールの標的ＲＮＡを８０％抑制するポジティブコントロールのオリゴヌクレオチドの濃度が、その細胞株についてその後に行う実験での新規なオリゴヌクレオチドのスクリーニングのための濃度として用いられる。もし８０％の抑制が実現できなければ、標的の発現または機能を６０％抑制するのに必要なポジティブコントロールのオリゴヌクレオチドの最も低い濃度が、その細胞株についてその後に行う実験でのオリゴマー化合物のスクリーニングのための濃度として用いられる。ここで用いられるオリゴヌクレオチド濃度は１ｎＭから３００ｎＭまでの範囲で変化させてよい。

標的の強度または発現のヌクレオチドによる抑制の解析
標的の強度または発現の調節は、当該技術分野において既知である様々な方法で分析できる。例えば、標的の核酸の強度を定量化する方法としては、ノザンブロット法、競合ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、または定量的リアルタイムＰＣＲ法などがある。ＲＮＡの分析は、細胞のトータルＲＮＡ、またはｐｏｌｙ（Ａ）＋ｍＲＮＡで行うことができる。ＲＮＡ単離の方法は当該技術分野において周知である。ノザンブロット法もまた、当該技術分野において通常に用いられている。定量的リアルタイムＰＣＲ法は、市販のＡＢＩＰＲＩＳＭ（登録商標）７６００、７７００、または７９００配列検出システム（ＰＥ−ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，カリフォルニア州ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙより入手可能）を、メーカーの指示に従って用いることで簡便に行うことができる。

さらに、遺伝子発現解析の方法として当該技術分野において既知のものの例としては、ＤＮＡアレイ、またはマイクロアレイ（ＢｒａｚｍａａｎｄＶｉｌｏ，ＦＥＢＳＬｅｔｔ，２０００，４８０，１７〜２４；Ｃｅｌｉｓ，ｅｔａｌ．，ＦＥＢＳＬｅｔｔ，２０００，４８０，２〜１６），ＳＡＧＥ法（ｓｅｒｉａｌａｎａｌｙｓｉｓｏｆｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：ＳＡＧＥ）（Ｍａｄｄｅｎ，ｅｔａｌ．，ＤｒｕｇＤｉｓｃｏｖ．Ｔｏｄａｙ，２０００，５，４１５〜４２５），ＲＥＡＤＳ法（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｅｎｚｙｍｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｄｉｇｅｓｔｅｄｃＤＮＡｓ：ＲＥＡＤＳ）（ＰｒａｓｈａｒａｎｄＷｅｉｓｓｍａｎ，ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．，１９９９，３０３，２５８〜２７２），ＴＯＧＡ法（ｔｏｔａｌｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓ）（Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅ，ｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，２０００，９７，１９７６〜８１），タンパク質アレイ、およびプロテオミクス（Ｃｅｌｉｓ，ｅｔａｌ．，ＦＥＢＳＬｅｔｔ．，２０００，４８０，２〜１６；Ｊｕｎｇｂｌｕｔ，ｅｔａｌ．，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，１９９９，２０，２１００〜１０），ＥＳＴシーケンシング（ｅｘｐｒｅｓｓｅｄｓｅｑｕｅｎｃｅｔａｇ（：ＥＳＴ）ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）（Ｃｅｌｉｓ，ｅｔａｌ．，ＦＥＢＳＬｅｔｔ，２０００，４８０，２〜１６；Ｌａｒｓｓｏｎ，ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２０００，８０，１４３〜５７），サブトラクティヴＲＮＡフィンガープリント法（ｓｕｂｔｒａｃｔｉｖｅＲＮＡｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇ：ＳｕＲＦ）（Ｆｕｃｈｓ，ｅｔａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２０００，２８６，９１〜９８；Ｌａｒｓｏｎ，ｅｔａｌ．，Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，２０００，４１，２０３〜２０８），サブトラクション法（ｓｕｂｔｒａｃｔｉｖｅｃｌｏｎｉｎｇ）、ディファレンシャルディスプレイ法（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｄｉｓｐｌａｙ：ＤＤ）（ＪｕｒｅｃｉｃａｎｄＢｅｌｍｏｎｔ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２０００，３，３１６〜２１），比較ゲノムハイブリダイゼーション法（ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅｇｅｎｏｍｉｃｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）（Ｃａｒｕｌｌｉ，ｅｔａｌ．，Ｊ．ＣｅｌｌＢｉｏｃｈｅｍ．Ｓｕｐｐｌ．，１９９８，３１，２８６〜９６），蛍光ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション法（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｉｎｓｉｔｕｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：ＦＩＳＨ）（ＧｏｉｎｇａｎｄＧｕｓｔｅｒｓｏｎ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，１９９９，３５，１８９５〜９０４），およびマススペクトロメトリー法（ｍａｓｓｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙｍｅｔｈｏｄｓ）（Ｔｏ，Ｃｏｍｂ．Ｃｈｅｍ．ＨｉｇｈＴｈｒｏｕｇｈｐｕｔＳｃｒｅｅｎ，２０００，３，２３５〜４１）が挙げられる。

ＲＮＡの単離
Ｈｅｌａ、Ｔ−２４、およびＡ５４９などの細胞株からのＲＮＡ試料の調製は、当該技術分野において既知の方法、例えば、ＴＲＩＺＯＬ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄ）を用いてメーカーの推奨するプロトコルに従って行う。簡単に説明すると、細胞の単層を冷却ＰＢＳで２回洗浄した後、培養皿の表面積１０平方センチメートル当たり１ｍＬのＴＲＩＺＯＬ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄ）を用いて細胞を溶解し、ＴＲＩＺＯＬ（登録商標）のプロトコルに従ってトータルＲＮＡを調製する。

標的ＲＮＡ強度の定量的リアルタイムＰＣＲ分析
標的ＲＮＡ強度の計量は、ＡＢＩＰＲＩＳＭ（登録商標）７６００，７７００、または７９００配列検出システム（ＰＥ−ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，カリフォルニア州ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ）を用いた定量的リアルタイムＰＣＲ法を利用し、メーカーの指示に従って行う。定量的リアルタイムＰＣＲの方法は当該技術分野において周知のものである。

リアルタイムＰＣＲを行う前に、単離されたＲＮＡ試料を逆転写酵素（ｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ：ＲＴ）処理し、次のリアルタイムＰＣＲ増幅に用いる基質とする相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を作製する。ＲＴおよびリアルタイムＰＣＲ反応は、同じサンプルウェル中で続けて行う。ＲＴおよびリアルタイムＰＣＲ用の試薬はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄ）より入手できる。ＲＴおよびリアルタイムＰＣＲ反応は２０μＬのＰＣＲカクテル（２．５×ＰＣＲバッファ（不含ＭｇＣｌ_２）、６．６ｍＭのＭｇＣｌ_２、それぞれ３７５μＭのｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＣＴＰ，およびｄＧＴＰ、それぞれ３７５μＭのフォワードプライマーおよびリバースリバースプライマー、１２５μＭのプローブ、４ユニットのＲＮＡｓｅインヒビター、１．２５ユニットのＰＬＡＴＩＮＵＭ（登録商標）Ｔａｑ、５ユニットのＭｕＬＶリバーストランスクリプターゼ、および２．５×ＲＯＸダイ）を、３０μＬのトータルＲＮＡ溶液（２０〜２００ｎｇ）が入っている９６穴プレートに加えることで行う。ＲＴ反応は４８℃で３０分間インキュベートすることで行う。続いて、９５℃で１０分間インキュベートすることでＰＬＡＴＩＮＵＭ（登録商標）Ｔａｑを活性化し、２ステップのＰＣＲプロトコルを４０サイクル実行する。ＰＣＲプロトコルは：９５℃で１５秒間（解離）に続いて６０℃で１．５分間（アニーリング／伸長）である。

リアルタイムＰＣＲによって得られた標的遺伝子（またはＲＮＡ）の測定値の標準化は、たとえばＧＡＰＤＨなど発現が一定している遺伝子の発現強度を用いて、またはＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．オレゴン州Ｅｕｇｅｎｅ）を使用したトータルＲＮＡの計量によって行う。ＧＡＰＤＨの発現は、標的と同時に、平行して、または独立して実行するリアルタイムＰＣＲによって計量する。トータルＲＮＡはＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）ＲＮＡ計量試薬（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．オレゴン州Ｅｕｇｅｎｅ）を用いて計量する。ＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）によるＲＮＡの計量方法は、Ｊｏｎｅｓ，Ｌ．Ｊ．，ｅｔａｌ．，（ＡｎａｌｙｔｉｃａｌＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９８，２６５，３６８〜３７４）に詳しい。

このアッセイでは、１７０μＬのＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）のワーキング溶液（ＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）試薬を、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，１ｍＭＥＤＴＡ，ｐＨ７．５で１：３５０に希釈したもの）を、３０μＬの精製された細胞ＲＮＡの入った９６穴プレートにピペットで注入する。このプレートをＣＹＴＯＦＬＵＯＲ（登録商標）４０００（ＰＥＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、励起波長４８５ｎｍ、蛍光波長５３０ｎｍで読み取る。

プローブおよびプライマーは標的配列にハイブリダイズするよう設計する。リアルタイムＰＣＲのプローブおよびプライマーの設計方法は当該技術分野において周知であり、これにはＰＲＩＭＥＲＥＸＰＲＥＳＳ（登録商標）（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，カリフォルニア州ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ）のようなソフトウェアの利用も含まれる。そういったソフトウェアは、ＡＬＤＯＡおよびＧＹＳ１といったｍＲＮＡの検出に用いるプローブおよびプライマーの設計に用いることができる。

標的ＲＮＡの強度のノザンブロット法による解析
ノザンブロット法は当該技術分野においてルーティン的な手順に従って行われる。１５〜２０μｇのトータルＲＮＡを、ＴＢＥバッファシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いた１０％アクリルアミドゲル（含尿素）電気泳動で分画する。ＲＮＡは、ＸｃｅｌｌＳＵＲＥＬＯＣＫ（商標）ミニセル電気泳動槽（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄ）中で、ゲルからＨＹＢＯＮＤ（商標）−Ｎ＋ナイロン膜（ＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ，ニュージャージー州Ｐｉｃａｔａｗａｙ）へエレクトロブロットする。メンブレンはＳＴＲＡＴＡＬＩＮＫＥＲ（登録商標）ＵＶクロスリンカー２４００（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｉｎｃ，カリフォルニア州ＬａＪｏｌｌａ）を用いたＵＶ架橋を施し、その後ＲＡＰＩＤ−ＨＹＢ（商標）バッファ溶液（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて、メーカーがオリゴヌクレオチドプローブ向けに推奨している方法でプローブによる検出を行う。

標的特異的なＤＮＡオリゴヌクレオチドプローブが、目的のＲＮＡの検出に用いられる。マイクロＲＮＡｓの検出に用いるプローブは、ＩＤＴ（アイオワ州Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ）など民間業者が合成している。プローブの５'末端はＴ４ポリヌクレオチドキナーゼによって（γ−^３２Ｐ）ＡＴＰ（Ｐｒｏｍｅｇａ，ウィスコンシン州Ｍａｄｉｓｏｎ）で標識される。ローディングおよびブロッティングの効率のばらつきを標準化するために、メンブレンのストリッピングを行い、Ｕ６ＲＮＡに対するプローブで再度検出を行う。ハイブリダイゼーションを行ったメンブレンの映像化および定量化は、ＳＴＯＲＭ（登録商標）８６０ＰＨＯＳＰＨＯＲＩＭＡＧＥＲ（登録商標）システム、およびＩＭＡＧＥＱＵＡＮＴ（登録商標）ソフトウェアＶ３．３（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｙｎａｍｉｃｓ，カリフォルニア州Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ）で行うことができる。

タンパク質量の解析
スモールノンコーディングＲＮＡによって調節または制御されている下流の標的タンパク質量の評価または定量化は、当該技術分野において周知の様々な方法によって行うことができる。そのようなものとしては、免疫沈降法、ウェスタンブロット法（イミュノブロッティング）、ＥＬＩＳＡ法（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔａｓｓａｙ：ＥＬＩＳＡ）、定量的タンパク質解析、タンパク質活性解析（例えば、カスパーゼ活性アッセイなど）、免疫組織化学法、免疫細胞化学、またはＦＡＣＳ法（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄｃｅｌｌｓｏｒｔｉｎｇ：ＦＡＣＳ）が挙げられる。標的に対する抗体は様々な方法で同定、および入手できる。例えば、ＭＳＲＳ抗体カタログ（ＡｅｒｉｅＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ミシガン州Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ）、または当該技術分野において周知であるモノクローナル、またはポリクローナル抗体の標準的な作製方法によることもできる。

表現型の解析
ひとたびここに開示される方法によってモジュレーターが設計、または同定できたならば、そのオリゴマー化合物は１若しくはそれ以上のさらなる表現型解析に供することができ、その解析はそれぞれが特定の病状または症状に関連する生理条件の治療、改善、または向上においての有効性を予想させる、または示唆する重要な結果を有するであろう。

表現型の解析と、それに用いるキットおよび試薬は、当業者にとって周知であり、本発明においても健康および疾患の状態における標的の役割および／または関連性の調査に用いられている。表現型の解析として代表的なものとしては、細胞周期の解析、アポトーシスの解析、血管新生の解析（例えば、内皮管形成の解析、血管新生関連遺伝子の発現解析、マトリックスメタロプロテアーゼ活性の解析など）、脂肪細胞の解析（例えば、インスリンシグナルの解析、脂肪細胞の分化の解析など）、炎症の解析（サイトカインシグナリングの解析、樹状細胞によるサイトカイン生成の解析など）が挙げられる。こうした解析法の例は当該技術分野において容易に見つかる（例えばその結果、米国特許出願公表第２００５／０２６１２１８号は、そのすべてが参照として組み込まれる）。さらなる表現型の解析方法には、幹細胞の分化および脱分化、例えば成人幹細胞や胚性幹細胞を評価するものも含まれる。これらの解析方法のプロトコルもまた、当該技術分野において周知のものである（例えば、Ｔｕｒｋｓｅｎ，ＥｍｂｒｙｏｎｉｃＳｔｅｍＣｅｌｌｓ：ＭｅｔｈｏｄｓａｎｄＰｒｏｔｏｃｏｌｓ，２００１，ＨｕｍａｎａＰｒｅｓｓ；ニュージャージー州Ｔｏｔｏｗａ；Ｋｌｕｇ，ＨｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃＳｔｅｍＣｅｌｌＰｒｏｔｏｃｏｌｓ，２００１，ＨｕｍａｎａＰｒｅｓｓ，ニュージャージー州Ｔｏｔｏｗａ；Ｚｉｇｏｖａ，ＮｅｕｒａｌＳｔｅｍＣｅｌｌｓ：ＭｅｔｈｏｄｓａｎｄＰｒｏｔｏｃｏｌｓ，２００２，ＨｕｍａｎａＰｒｅｓｓ，ニュージャージー州Ｔｏｔｏｗａ）。

ルシフェラーゼレポーターアッセイ
マイクロＲＮＡｓを標的とするオリゴマー化合物の活性は、ＤＵＡＬ−ＬＵＣＩＦＥＲＡＳＥ（登録商標）レポーターアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ，ウィスコンシン州Ｍａｄｉｓｏｎ）で、ルシフェラーゼ活性が正常なマイクロＲＮＡ活性（すなわち、相補的な配列への結合）によって阻害されることを利用してインビトロで評価することができる。オリゴマー化合物は、標的とするマイクロＲＮＡがルシフェラーゼレポーター中の相補的な配列へ結合することを阻害し、それによってルシフェラーゼの活性が促進される。ルシフェラーゼレポーターは、目的のマイクロＲＮＡの配列を用いて作製できる。

マイクロＲＮＡルシフェラーゼセンサーコンストラクトは、目的のマイクロＲＮＡに対して相補的な配列を、ｐＧＬ３−Ｃｏｎｔｒｏｌ（Ｐｒｏｍｅｇａ，ウィスコンシン州Ｍａｄｉｓｏｎ）の３'−ＵＴＲに挿入することで作製できる。アッセイの１日目に、Ｈｅｌａ細胞（ＡＴＣＣ，ヴァージニア州Ｍａｎａｓｓｕｓより入手）をＴ−１７０フラスコ（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ニュージャージー州ＦｒａｎｋｌｉｎＬａｋｅｓ）に、３．５×１０^６細胞／フラスコとなるように播種する。Ｈｅｌａ細胞はＨｉｇｈＧｌｕｃｏｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄ）を入れたダルベッコＭＥＭ培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ'ｓＭｏｄｉｆｉｅｄＥａｇｌｅＭｅｄｉｕｍ）で培養する。２日目は、各フラスコ内のＨｅｌａ細胞にそれぞれ１０μｇのマイクロＲＮＡルシフェラーゼセンサーコンストラクトを導入する。各フラスコには同時に、ルシフェラーゼシグナルの標準化に用いるＲｅｎｉｌｌａを発現するｐｈＲＬｓｅｎｓｏｒｐｌａｓｍｉｄ（Ｐｒｏｍｅｇａ，ウィスコンシン州Ｍａｄｉｓｏｎ）をそれぞれ０．５μｇずつ導入する。Ｈｅｌａ細胞への遺伝子導入では、１フラスコあたり２０μＬのＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄ）２０００を用いる。４時間のトランスフェクションの後、細胞をＰＢＳで洗浄し、そしてトリプシン処理を施す。遺伝子導入したＨｅｌａ細胞は、各ウェル当たり４０，０００細胞となるよう、２４穴プレート（ＢＤＦａｌｃｏｎ）に再び播種してオーバーナイトで培養する。３日目には、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄ）を用いてオリゴマー化合物をＨｅｌａ細胞へ導入するが、この際には１ｍＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）１血清使用量低減培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄ）中で１００ｎＭのＡＳＯ当たりのＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）が２．５μＬとなるようにし、４時間処理する。ＡＳＯによるトランスフェクションの後、オリゴマー化合物を含む培地は、ＨｉｇｈＧｌｕｃｏｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄ）を入れたダルベッコＭＥＭ培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ'ｓＭｏｄｉｆｉｅｄＥａｇｌｅＭｅｄｉｕｍ）で置換する。４日目には、Ｈｅｌａ細胞を溶解して、ＤＵＡＬ−ＬＵＣＩＦＥＲＡＳＥ（登録商標）レポーターアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ，ウィスコンシン州Ｍａｄｉｓｏｎ）を用いてルシフェラーゼ活性を測定する。

インビボでの研究
実験動物モデルは、マイクロＲＮＡｓを標的とするオリゴマー化合物の効果、効能、および治療指数の評価に用いられる。

実験動物はＪａｃｋｓｏｎＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓなどの民間業者から入手できる。オリゴマー化合物は生理食塩水に溶解し、それを腹腔内へ投与する。実験の最後には、器官を詳細に観察し、様々な組織からＲＮＡを単離して定量的ＰＣＲによる解析を行い、血清または血液を採取して、例えばコレステロール、トリグリセリド、およびブドウ糖などの血清マーカー量を測定する。肝組織中グリセリドの量もまた測定する。

そうしたインビボ実験で行われるさらなる解析には、肝臓切片の組織学的な解析による形態変化の評価も含まれる。肝臓の組織学的な解析は、当該技術分野において既知であるルーティン的な方法を用いて行われる。簡単に説明すると、肝臓を１０％緩衝ホルマリンで固定し、パラフィン包埋する。４ｍｍの切片を作製してスライドガラス標本に載せる。脱水の後、切片をヘマトキシリンエオジン染色する。形態の解析には、ｏｉｌＲｅｄＯ染色を用いた肝臓脂肪症の評価も含まれ、その染色法もまた当該技術分野において既知のものである。

ここで開示されるものに加えて、本発明に対する様々な改良／変更等は、当業者にとってはここまでの記述からすると明らかなものである。そうした改良／変更等はまた、添付の請求項の範囲に含まれることが意図されたものである。本出願で引用されている各参考文献（これらに限定するものではないが、研究論文、米国および諸外国の特許、特許出願公表、国際特許出願公表、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）アクセッション番号、およびそれらに類するものを含む）は、それらのすべてが参照として本発明へ特に組み込まれるものである。ここで開示される本発明がより良く理解されるために、以下に実施例を提供する。それらの実施例を通して、分子クローニング反応およびその他の標準的なＤＮＡ組換え技術は、特に断りが無い限り、例えばＭａｎｉａｔｉｓｅｔａｌ．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ−ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，２ｎｄｅｄ．，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＰｒｅｓｓ（１９８９）にあるようなルーティン的な方法に従って、市販の試薬を用いて行われた。

これらの実施例は説明を目的とするためだけのものであって、いかなる方法によっても本発明を限定解釈するものではないということを理解されたい。当業者は、本発明の精神から逸脱することなく、様々な化合物を設計するために、本発明の根底にある原理をただちに採用することができる。
（実施例）

均一に修飾されたオリゴマー化合物のａｎｔｉ−ｍｉＲＮＡ活性
マイクロＲＮＡを標的とし、均一に修飾されたオリゴマー化合物が、ルシフェラーゼレポーターアッセイにおいて、マイクロＲＮＡの活性を調節する能力を検定した。均一に修飾された化合物は、糖による均一な修飾、ヌクレオシド間の結合部の均一な修飾、またはそれらの組合せを含む。培養細胞のオリゴマー化合物による処理に続いて、ルシフェラーゼ活性が測定される。ここで、ルシフェラーゼ活性の上昇は、オリゴマー化合物がマイクロＲＮＡの活性を阻害していることを示す。
ｍｉＲ−２１（ＴＡＧＣＴＴＡＴＣＡＧＡＣＴＧＡＴＧＴＴＧＡ；配列ＩＤ番号：１１３）に相補的な２２塩基のヌクレオチドを、ｐＧＬ３−Ｃｏｎｔｒｏｌ（Ｐｒｏｍｅｇａ）の３'−ＵＴＲへ挿入することで、ｍｉＲ−２１ルシフェラーゼセンサーコンストラクトを作製した。ここで記述している方法で、ＤＵＡＬ−ＬＵＣＩＦＥＲＡＳＥ（登録商標）レポーターアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ，ウィスコンシン州Ｍａｄｉｓｏｎ）を実行した。

Ｈｅｌａ細胞へａｎｔｉ−ｍｉＲ−２１オリゴマー化合物（以下の配列を有する：ＴＣＡＡＣＡＴＣＡＧＴＣＴＧＡＴＡＡＧＣＴＡ、配列ＩＤ番号：１１３）が導入された。前記オリゴマー化合物は以下のような均一な修飾モチーフを有する：均一な２'−ＭＯＥおよび均一なホスホロチオエート；均一な２'−ＭＯＥおよび均一なリン酸ジエステル；均一な２'−Ｏ−Ｍｅおよび均一なホスホロチオエート；均一な２'−ＯＭｅおよび均一なリン酸ジエステル；均一な２'−Ｆおよび均一なホスホロチオエート、である。ホスホロチオエートの骨格を持つオリゴマー化合物の中では、均一な２'−Ｆオリゴマー化合物が最も強いａｎｔｉ−ｍｉＲ−２１活性を有しており、それに次ぐのは均一な２'−ＭＯＥおよび２'−ＯＭｅオリゴマー化合物である。全体の中で最も強いａｎｔｉ−ｍｉＲ−２１活性を示すものは均一な２'−ＭＯＥおよびリン酸ジエステルを持つオリゴマー化合物である。

均一に修飾された化合物で、ｍｉＲ−２１に対してミスマッチを有するものもまた検定された。均一な２'−ＭＯＥ修飾、およびヌクレオシド間に均一なホスホロチオエート結合を含むａｎｔｉ−ｍｉＲ−２１オリゴマー化合物によってＨｅｌａ細胞を処理した。オリゴマー化合物には、合計１から６箇所のミスマッチを導入した。１箇所のミスマッチの導入によって、ｍｉＲ−２１に対するオリゴマー化合物の阻害活性は減少した。オリゴマー化合物の３'末端、つまりマイクロＲＮＡの５'末端のシード領域に対して相補的な場所へ１箇所のミスマッチを導入したものは、他の場所に１箇所のミスマッチを含むオリゴマー化合物と比較して、さらに大幅な阻害活性の減少を示す結果となった。２若しくはそれ以上のミスマッチは弱い活性をもたらし、３若しくはそれ以上のミスマッチはさらに活性を微弱なものとした。従って、オリゴマー化合物が標的のマイクロＲＮＡを調節する強度は、ミスマッチの導入によって制御することができる。

配列が一部欠失した場合のオリゴマー化合物の阻害活性への影響についてもまた実験を行った。均一な２'−ＭＯＥおよびヌクレオシド間に均一なホスホロチオエート結合を含み、５'末端または３'末端にサブユニットの欠失を導入したａｎｔｉ−ｍｉＲ−２１オリゴマー化合物でＨｅｌａ細胞を処理した。５'または３'末端のいずれか一方の１サブユニットをＡＳＯｓから欠失させても活性への悪影響はなかった。オリゴマー化合物の３'末端から１サブユニットを欠失させると、ａｎｔｉ−ｍｉＲ−２１オリゴマー化合物の阻害活性はわずかに改善した。２若しくはそれ以上のサブユニットの欠失は、ａｎｔｉ−ｍｉＲ−２１の活性を大きく減少させる結果となった。従って、オリゴマー化合物が標的のマイクロＲＮＡを調節する強度は、配列の一部欠失によって制御することができる。

均一に修飾されたオリゴマー化合物の活性の持続時間を評価した。以下の通りに修飾したａｎｔｉ−ｍｉＲ−２１オリゴマー化合物によってＨｅｌａ細胞を処理した：均一な２'−ＭＯＥおよび均一なリン酸ジエステル；均一な２'−ＭＯＥおよび均一なホスホロチオエート；均一な２'−ＯＭｅおよび均一なリン酸ジエステル：均一な２'−ＯＭｅおよび均一なホスホロチオエート、である。オリゴマー化合物によるトランスフェクションから、４，８，２４、および４８時間後のルシフェラーゼ活性を測定した。短い時間の時は、均一に修飾されたオリゴマー化合物は、どれもかなりの強さのａｎｔｉ−ｍｉＲ−２１活性を示した。しかし、２４および４８時間経過後では、リン酸ジエステルの骨格と均一な２'−ＭＯＥを持つオリゴマー化合物がこの実験中では最も強い活性を示し、ホスホロチオエートの骨格を有し、均一な２'−Ｆおよび均一な２'−ＭＯＥを持つオリゴマー化合物がそれに次いで強かった。

これらの結果は、均一に修飾された化合物がｍｉＲ−２１の活性を効果的に抑制することを示している。従って、一実施形態では均一に修飾されたオリゴマー化合物がマイクロＲＮＡｓを標的とする。さらなる実施形態では、マイクロＲＮＡの活性を阻害する方法は、マイクロＲＮＡｓを標的とするオリゴマー化合物と細胞との接触を含む。

キメラのオリゴマー化合物
キメラのオリゴマー化合物とは、化学的に修飾された領域を２若しくはそれ以上含むオリゴマー化合物である。キメラのオリゴマー化合物の一つの例は「ギャップマー」である。ギャップマーでは、オリゴマー化合物は中央領域と、それの両側に隣接する二つの「ウィング」と名付けられた領域を含むモチーフを有する。一態様では、中央領域のヌクレオチドは一種類の糖修飾を含み、一方でウィング領域のヌクレオチドは違う種類の糖修飾を含む。通常、２つのウィング領域の塩基数は同じであるが、しかし、ギャップマーについては、その条件は必ずしも必須ではない。

一つの例としては、キメラのオリゴマー化合物として適切なモチーフは以下のようである。

Ｔ_１−（Ｎｕ_１）_ｎ１−（Ｎｕ_２）_ｎ２−（Ｎｕ_３）_ｎ３−（Ｎｕ_４）_ｎ４−（Ｎｕ_５）_ｎ５−Ｔ_２，ここでＴ_１はＨ，Ｔ_２はＨ、Ｎｕ_１は２'−ＭＯＥ、Ｎｕ_２は２'−Ｆ、Ｎｕ_５は２'−ＭＯＥ、ｎ_１は２，ｎ_２は１９、ｎ_３は０、ｎ_４は０、そしてｎ_５は２である。オリゴマー化合物ＩＳＩＳ３９３２０６は、配列ＩＤ番号：１９にこのモチーフを適用したものである。換言すると、ＩＳＩＳ３９３２０６は、２'−ＭＯＥで修飾されたヌクレオチドをそれぞれ二つ有する外部領域と、それらに両側から挟まれて１９個の２'−Ｆで修飾されたヌクレオチドを含む内部領域を有する（２'−ＭＯＥ／２'−Ｆ／２'−ＭＯＥ）。ｍｉＲ−１２２を標的とするキメラのオリゴマー化合物がｍｉＲ−１２２の活性をインビボで阻害する能力を検定した。この例では、ｍｉＲ−１２２を標的とするオリゴマー化合物が説明されている。しかし、本発明のオリゴマー化合物における修飾は、ｍｉＲ−１２２を調節するそれらのオリゴマー化合物に限定されるものではない。

一定量の投与による実験
Ｃ５７ＢＬ／６の雄マウスを民間業者から入手した。マウスは以下の治療群に分類された：ＩＳＩＳ３２７８９５で処理；ＩＳＩＳ３９３２０６で処理；および生理食塩水で処理されたもの、である。それぞれのオリゴマー化合物は、５'―ＡＣＡＡＡＣＡＣＣＡＴＴＧＴＣＡＣＡＣＴＣＣＡ―３'（配列ＩＤ番号：１９）という塩基配列を有する。ＩＳＩＳ３２７８９５は、均一な２'−ＭＯＥ糖修飾、およびヌクレオシド間に均一にホスホロチオエート結合を含む。生理食塩水で処理されたマウスがコントロールとされた。２５ｍｇ／ｋｇの用量のオリゴマー化合物を週二回、三週間にわたってマウスへ腹腔内投与した。処理の終了段階において、マウスは健康で正常な様子であり、血漿中のＡＳＴおよびＡＬＴ量も正常の範囲内であった。

ｍｉＲ−１２２の標的であるＡＬＤＯＡｍＲＮＡの肝組織中の量をＴａｑｍａｎリアルタイムＰＣＲで測定し、生理食塩水処理した動物でのＡＬＤＯＡｍＲＮＡの量と比較した。その結果、ＩＳＩＳ３２７９８５およびＩＳＩＳ３９３２０６による処理では、ＡＬＤＯＡの量はそれぞれ約４倍および７倍の上昇が見られた。従って、キメラのオリゴマー化合物は、均一な２'−ＭＯＥ修飾を持つオリゴマー化合物と比較して、より強力なａｎｔｉ−ｍｉＲ活性を示すことがここに明らかとなった。２'−Ｆを含むオリゴマー化合物による処理では脾臓の重量増加が見られたが、これは免疫賦活作用を示唆している。均一な２'−ＭＯＥを持つオリゴマー化合物および２'−ＭＯＥ／２'−Ｆ／２'−ＭＯＥオリゴマー化合物は同等の融解温度を有することから、これら２つのオリゴマー化合物はＡＬＤＯＡｍＲＮＡ量の同程度の増加をもたらすことが期待されていた。従って、内部領域に１９個の２'−Ｆで修飾されたヌクレオチドを有し、外部領域に２'−ＭＯＥで修飾されたヌクレオチドを二つ持つオリゴマー化合物が、２'−ＭＯＥで均一に修飾されたオリゴマー化合物と比較して、著しく強いａｎｔｉ−ｍｉＲ活性を示したことは予想外であった。

血漿中の総コレステロール量もまた、当該技術分野において既知である方法（例えば、ＯｌｙｍｐｕｓＡＵ４００ｅａｕｔｏｍａｔｅｄｃｌｉｎｉｃａｌｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎａｌｙｚｅｒ，ニューヨーク州Ｍｅｌｖｉｌｌｅ）を用いて測定された。ＩＳＩＳ３２７９８５およびＩＳＩＳ３９３２０６で処理したマウスでは、生理食塩水処理した動物と比較して、総コレステロール量の減少が見られた。

作用発現の解析
均一に修飾された、またはキメラのオリゴマー化合物による処理後のｍｉＲ−１２２阻害活性の作用発現を比較するために、ＩＳＩＳ３２７８９５およびＩＳＩＳ３９３２０６を２５ｍｇ／ｋｇの用量で週二回、五週間までマウスへ投与した。そして、１，２，３，４，５，６，８、および１０回目の投与のそれぞれ２４時間後に、各治療グループから４匹ずつのマウスを検体とした。それぞれの時点でＡＬＤＯＡｍＲＮＡ量および血漿中コレステロールを測定したところ、２'−ＭＯＥ／２'−Ｆ／２'−ＭＯＥオリゴマー化合物が、より強いａｎｔｉ−ｍｉＲ−１２２活性、すなわちＡＬＤＯＡｍＲＮＡ量の上昇および血漿中コレステロール量の減少をもたらすことが示唆された。さらに、２'−ＭＯＥ／２'−Ｆ／２'−ＭＯＥオリゴマー化合物の方が、均一な２'−ＭＯＥオリゴマー化合物と比較して、より早い段階でＡＬＤＯＡの上昇および血漿中コレステロール量の減少が確認された。従って、２'−ＭＯＥ／２'−Ｆ／２'−ＭＯＥオリゴマー化合物は、均一な２'−ＭＯＥオリゴマー化合物と比較して、より強い効果およびより早い作用発現を示すことが明らかとなった。

用量反応試験
ａｎｔｉ−ｍｉＲＮＡオリゴマー化合物の用量依存性を評価するために、均一な２'−ＭＯＥおよび２'−ＭＯＥ／２'−Ｆ／２'−ＭＯＥオリゴマー化合物を、６．２５，１２．５，２５、または５０ｍｇ／ｋｇの用量で週二回、三週間までマウスへ投与した。２'−ＭＯＥ／２'−Ｆ／２'−ＭＯＥオリゴマー化合物を６．２５，１２．５，２５、および５０ｍｇ／ｋｇの用量で投与した結果、生理食塩水を投与した動物での測定値と比較してＡＬＤＯＡｍＲＮＡはそれぞれ約４，５，４．２５、および５倍増加した。均一な２'−ＭＯＥオリゴマー化合物の同量を投与した結果、生理食塩水を投与した動物での測定値と比較してＡＬＤＯＡｍＲＮＡはそれぞれ約０．２５，１．５，２および３倍増加した。血漿中コレステロール量もまた同様に、用量依存的に減少した。すなわち、２'−ＭＯＥ／２'−Ｆ／２'−ＭＯＥオリゴマー化合物を６．２５，１２．５，２５、および５０ｍｇ／ｋｇの用量で投与すると、生理食塩水を投与した動物での測定値と比較して血漿中コレステロール量はそれぞれ約４０％、４５％、４５％、および４８％減少した。２'−ＭＯＥオリゴマー化合物では、低いほうから三番目の用量までは血漿中コレステロール量を約５％減少させる結果となり、最高の用量では血漿中コレステロール量を少なくとも４０％減少させた。従って、２'−ＭＯＥ／２'−Ｆ／２'−ＭＯＥオリゴマー化合物は２'−ＭＯＥオリゴマー化合物と比較して、著しく優れた効果および効能を示すことが明らかとなった。

ここに提供されたキメラのオリゴマー化合物は、より強いａｎｔｉ−ｍｉＲＮＡ活性を示した。従って、ここに提供されるのはマイクロＲＮＡ活性を阻害する方法であり、その方法はここに記すように、改善されたａｎｔｉ−ｍｉＲＮＡ活性を有するオリゴマー化合物の動物への投与を含むものである。いくつかの実施形態では、オリゴマー化合物はキメラのオリゴマー化合物であり、それは内部領域に２'−Ｆ修飾ヌクレオチドを含み、そして外部領域に安定度を増加させる修飾を含む。一実施形態では、オリゴマー化合物はその内部領域に一種類の２'−修飾ヌクレオチドを含み、そして外部領域にはそれぞれ二種類目の２'−修飾ヌクレオチドを含む。さらなる実施形態では、ギャップ領域に２'−フルオロ修飾を含み、そしてウィング領域には２'−メトキシエチル修飾を含む。一実施形態では、オリゴマー化合物はＩＳＩＳ３９３２０６である。

強い活性を有するオリゴマー化合物
マイクロＲＮＡｓを標的とし、位置ごとに修飾されたモチーフを有するオリゴマー化合物が、インビボでマイクロＲＮＡ活性を阻害する能力を検定した。

１０から１２箇所の２'−Ｆ糖修飾および内部領域に付加的な修飾を含むオリゴマー化合物が検定された。付加的な修飾には、２'−ＯＭｅ、２'−ＭＯＥ、または４'−ＣＨ２−Ｏ−２'の形に架橋する糖修飾が含まれる。オリゴマー化合物は配列ＩＤ番号：１９の配列を含む。ＩＳＩＳ３９６６０８は、５'−ＭＭＬＦＦＬＦＦＬＦＦＬＦＦＬＦＦＬＦＦＬＭＭ−３'の形で位置ごとに修飾されたモチーフを有し、ここでＭは２'−ＭＯＥを、Ｌは４'−ＣＨ２−Ｏ−２'という架橋を有する二環式の核酸を意味する。ＩＳＩＳ３９７３０３は、５'−ＭＭＦＭＦＭＦＭＦＭＦＭＦＭＦＭＦＭＦＭＦＭＭ−３'の形で位置ごとに修飾されたモチーフを有し、ここでＭは２'−ＭＯＥを、Ｆは２'−Ｆを意味する。ＩＳＩＳ３９７４０４は５'−ＭＭＦＯＦＯＦＯＦＯＦＯＦＯＦＯＦＯＦＯＦＭＭ−３'の形で位置ごとに修飾されたモチーフを有し、ここでＭは２'−ＭＯＥを、Ｆは２'−Ｆを、そしてＯは２'−ＯＭｅを意味する。

オリゴマー化合物は２５ｍｇ／ｋｇの用量で、週二回、三週間マウスへ投与された。そして肝臓でのＡＬＤＯＡｍＲＮＡ量を測定した。２'−Ｆを持つ内部領域へ導入した２'−ＭＯＥまたは２'−ＯＭｅを有するオリゴマー化合物では、生理食塩水処理した動物と比較してＡＬＤＯＡｍＲＮＡが２〜２．５倍に上昇した。４'−ＣＨ２−Ｏ−２'の形に架橋する糖修飾を導入すると、生理食塩水処理した動物のＡＬＤＯＡｍＲＮＡ量の約３．５倍に増加し、そしてコレステロールも約４０％減少させる結果となった。２'−ＭＯＥ／２'−Ｆ／２'−ＭＯＥでは、ＡＬＤＯＡｍＲＮＡ量が最も大きく上昇し、そして血漿中総コレステロールの減少（約６０％）も最も優れており、また、脾臓の重量も最も大きな値となる結果をもたらした。

強い活性および改善された治療指数を有するオリゴマー化合物
マイクロＲＮＡを標的とするオリゴマー化合物への２'−ＭＯＥ／２'−Ｆ／２'−ＭＯＥモチーフの組み込みが、インビボでの高い効果および効能をもたらしたことから、このモチーフは様々な用途の中でも治療用途のためにａｎｔｉ−ｍｉＲオリゴマー化合物へ組み込むことが望ましい。このモチーフの治療指数をさらに改善するために、キメラのモチーフの中央領域へ、２'−Ｆ以外の２'−修飾を有するように、位置ごとに修飾されたオリゴマー化合物を設計した。後述するように検定を行ったオリゴマー化合物の集合の一部を表Ａに示した。付加的に検定された化合物はＩＳＩＳ４００１２９であり、これは以下のようにヌクレオシド間のホスホロチオエート結合によって結合された修飾ヌクレオシドを有するものである：以下のように配置されたものである：二つの２'−ＭＯＥ、三つの２'−Ｆ、一つの２'−ＭＯＥ、五つの２'−Ｆ、一つの２'−ＭＯＥ、五つの２'−Ｆ、一つの２'−ＭＯＥ、三つの２'−Ｆ、二つの２'−ＭＯＥである。

一定量の投与による実験
内部領域に少なくとも１６箇所の２'−Ｆ修飾ヌクレオチドを有する、位置ごとに修飾されたオリゴマー化合物を用いて、インビボでの実験を行った。オリゴマー化合物は配列ＩＤ番号：１９の配列を含む。検定されたオリゴマー化合物は、ＩＳＩＳ３９３２０６，ＩＳＩＳ４００１２４，４００１２５，４００１２６，４００１２７，４００１２８，４００１２９，および４００１３０を含む。オリゴマー化合物を、２５ｍｇ／ｋｇの用量で週２回、３週間に渡ってマウスに腹腔内投与した。ＩＳＩＳ３９３２０６も同様に投与した。オリゴマー化合物で処理したマウスの肝臓でのＡＬＤＯＡｍＲＮＡ量を定量的ＰＣＲで測定し、生理食塩水で処理したマウスの肝臓での測定値と比較した。ＩＳＩＳ３９３２０６では、ＡＬＤＯＡｍＲＮＡが約４倍に上昇し、コレステロールは約５０％減少した。ＩＳＩＳ４００１２４，４００１２５，４００１２６，４００１２７，４００１２８，４００１２９，および４００１３０オリゴマー化合物のそれぞれによる処理では、生理食塩水処理したマウスの肝臓での測定値の少なくとも２倍以上にＡＬＤＯＡｍＲＮＡが上昇する結果となった。血漿中総コレステロールの減少は２０％から４０％の間であった。特に、ＩＳＩＳ４００１２４，４００１２６，および４００１２７は、ＩＳＩＳ３９３２０６と同等の効率でＡＬＤＯＡｍＲＮＡ量を上昇させることができ、生理食塩水処理した場合の肝臓ＡＬＤＯＡ量と比較して約４倍となった。さらには、ＩＳＩＳ３９３２０６処理では脾臓重量の増加が見られたのに対して、これらのオリゴマー化合物では脾臓重量の著しい増加は見られなかった。ＩＳＩＳ４００１２５，４００１２９，および４００１２８では、ＡＬＤＯＡｍＲＮＡ量がそれぞれ約３倍、２．５倍、および２倍へ上昇し、脾臓重量の増加はなかった。一方、オリゴマー化合物の内部領域に２'−Ｆを含むＩＳＩＳ４００１３０では、ＡＬＤＯＡｍＲＮＡ量が約３倍に増加したものの、ＩＳＩＳ３９３２０６処理したマウスで見られたのと同程度の脾臓重量の増加ももたらす結果となった。

一回の投与による実験
ｍｉＲ−１２２を標的とするオリゴマー化合物を一回だけ投与した場合の効果を評価するための実験を行った。オリゴマー化合物は以下のモチーフを含む：均一に修飾した２'−ＭＯＥ；２'−ＭＯＥ／２'−Ｆ／２'−ＭＯＥ；および内部領域に少なくとも１６箇所の２'−Ｆを有する位置ごとに修飾されたもの、である。マウス（Ｂａｌｂ／ｃ雌、治療グループにつきｎ＝４）の腹腔内へ、１１，３３、または１００ｍｇ／ｋｇの用量を一回だけ投与し、４日後に検体とした。共にｍｉＲ−１２２のアンチセンスによる阻害によって上昇することが知られているＡＬＤＯＡｍＲＮＡ量およびＧＹＳ１ｍＲＮＡ量を肝臓で測定し、生理食塩水処理したマウスの肝臓中でのそれぞれのｍＲＮＡ量と比較した。表Ｂはこの実験のデータを要約したものである；ここでＡＬＤＯＡおよびＧＹＳ１ｍＲＮＡ量は、生理食塩水処理のコントロールに対するパーセンテージで示した；ＣＨＯＬはコレステロールの基準値（実験開始時の値）に対するパーセンテージである；ＳＤは標準偏差である。

ここに記したとおり、均一な２'−ＭＯＥ化合物は最高の用量ではＡＬＤＯＡｍＲＮＡ量を増加（約２倍）させ、検定された各用量でＧＹＳ１ｍＲＮＡを増加（約１．５から２倍）させた。ＩＳＩＳ３９３２０６，４００１２５，および４００１２６の１００ｍｇ／ｋｇ用量では、ＡＬＤＯＡｍＲＮＡ量を約４倍増加させた。特に、ＩＳＩＳ４００１２７では、１１および３３ｍｇ／ｋｇ（１００ｍｇ／ｋｇは技術的問題から検定されなかった）の両方でＡＬＤＯＡｍＲＮＡを約４倍に増加させ、これは他の化合物では最高の用量で見られた増加量と同等なものとなった。ＩＳＩＳ４００１２５および４００１２６はＡＬＤＯＡｍＲＮＡをかなり増加させる結果をもたらした。ＩＳＩＳ４００１２４もまたＡＬＤＯＡ量を増加させた。

一定量の投与による実験で見られたのと同様に、キメラのオリゴマー化合物の内部領域に、２'−Ｆ以外の２'−修飾を導入すると、脾臓重量の増加が起こらないことから分かるように、免疫賦活作用に関して改善が見られた。

これらのデータは、本発明のオリゴマー化合物が強い活性と改善された治療指数を示すことを立証している。このように、マイクロＲＮＡｓを標的とするオリゴマー化合物は、効果および効能を含めて治療用途に適した特性を有するものである。

Claims

以下の化学式Ｉを有する結合したヌクレオシドの連続配列を含むオリゴマー化合物：
Ｔ_１−（Ｎｕ_１）_ｎ１−（Ｎｕ_２）_ｎ２−（Ｎｕ_３）_ｎ３−（Ｎｕ_４）_ｎ４−（Ｎｕ_５）_ｎ５−Ｔ_２
式中、
Ｎｕ_１、Ｎｕ_３、及びＮｕ_５は、２'−修飾ヌクレオシドであり、該２'−修飾ヌクレオシドの各々は、２'−置換基Ｏ（ＣＨ_２）_２ＯＣＨ_３を含み、
Ｎｕ_２及びＮｕ_４は、β−Ｄ−２'−デオキシ−２'−フルオロリボフラノシルヌクレオシドであり、
ｎ１及びｎ５の各々は、２であり、
ｎ２＋ｎ４の合計は１０〜２５であり、
ｎ３は２または３であり、
各Ｔ_１及びＴ_２は_、独立して、Ｈ、ヒドロキシル保護基、任意に結合した抱合基、或いはキャッピング基である。
ｎ２＋ｎ４の合計が１６或いは１７である、請求項１記載のオリゴマー化合物。
前記化学式Ｉが、下記から選択される、請求項１記載のオリゴマー化合物：
ａ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝２，ｎ３＝３，ｎ４＝１４，ｎ５＝２、
ｂ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝５，ｎ３＝３，ｎ４＝１１，ｎ５＝２、
ｃ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝８，ｎ３＝３，ｎ４＝８，ｎ５＝２、
ｄ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝１１，ｎ３＝３，ｎ４＝５，ｎ５＝２、
ｅ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝１４，ｎ３＝３，ｎ４＝２，ｎ５＝２、
ｆ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝９，ｎ３＝３，ｎ４＝７，ｎ５＝２、
ｇ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝１０，ｎ３＝３，ｎ４＝６，ｎ５＝２、
ｈ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝１２，ｎ３＝３，ｎ４＝４，ｎ５＝２、
ｉ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝３，ｎ３＝３，ｎ４＝１３，ｎ５＝２、
ｊ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝４，ｎ３＝３，ｎ４＝１２，ｎ５＝２、
ｋ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝６，ｎ３＝３，ｎ４＝１０，ｎ５＝２、
ｌ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝７，ｎ３＝３，ｎ４＝９，ｎ５＝２、
ｍ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝１３，ｎ３＝３，ｎ４＝３，ｎ５＝２、
ｎ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝２，ｎ３＝２，ｎ４＝１５，ｎ５＝２、
ｏ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝３，ｎ３＝２，ｎ４＝１４，ｎ５＝２、
ｐ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝４，ｎ３＝２，ｎ４＝１３，ｎ５＝２、
ｑ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝５，ｎ３＝２，ｎ４＝１２，ｎ５＝２、
ｒ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝６，ｎ３＝２，ｎ４＝１１，ｎ５＝２、
ｓ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝７，ｎ３＝２，ｎ４＝１０，ｎ５＝２、
ｔ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝８，ｎ３＝２，ｎ４＝９，ｎ５＝２、
ｕ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝９，ｎ３＝２，ｎ４＝８，ｎ５＝２、
ｖ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝１０，ｎ３＝２，ｎ４＝７，ｎ５＝２、
ｗ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝１１，ｎ３＝２，ｎ４＝６，ｎ５＝２、
ｘ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝１２，ｎ３＝２，ｎ４＝５，ｎ５＝２、
ｙ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝１３，ｎ３＝２，ｎ４＝４，ｎ５＝２、
ｚ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝１４，ｎ３＝２，ｎ４＝３，ｎ５＝２、又は
ａａ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝１５，ｎ３＝２，ｎ４＝２，ｎ５＝２。
Ｎｕ_１、Ｎｕ_３、及びＮｕ_５は、２'−置換基Ｏ（ＣＨ_２）_２ＯＣＨ_３を有するヌクレオシドであり、Ｔ_１はＨであり、Ｔ_２はＨであり、化学式Ｉは、下記から選択される、請求項１記載のオリゴマー化合物：
ａ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝２，ｎ３＝３，ｎ４＝１４，ｎ５＝２、
ｂ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝５，ｎ３＝３，ｎ４＝１１，ｎ５＝２、
ｃ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝８，ｎ３＝３，ｎ４＝８，ｎ５＝２、
ｄ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝１１，ｎ３＝３，ｎ４＝５，ｎ５＝２、
ｅ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝１４，ｎ３＝３，ｎ４＝２，ｎ５＝２、
ｆ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝９，ｎ３＝３，ｎ４＝７，ｎ５＝２、
ｇ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝１０，ｎ３＝３，ｎ４＝６，ｎ５＝２、
ｈ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝１２，ｎ３＝３，ｎ４＝４，ｎ５＝２、
ｉ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝３，ｎ３＝３，ｎ４＝１３，ｎ５＝２、
ｊ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝４，ｎ３＝３，ｎ４＝１２，ｎ５＝２、
ｋ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝６，ｎ３＝３，ｎ４＝１０，ｎ５＝２、
ｌ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝７，ｎ３＝３，ｎ４＝９，ｎ５＝２、
ｍ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝１３，ｎ３＝３，ｎ４＝３，ｎ５＝２、
ｎ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝２，ｎ３＝２，ｎ４＝１５，ｎ５＝２、
ｏ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝３，ｎ３＝２，ｎ４＝１４，ｎ５＝２、
ｐ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝４，ｎ３＝２，ｎ４＝１３，ｎ５＝２、
ｑ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝５，ｎ３＝２，ｎ４＝１２，ｎ５＝２、
ｒ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝６，ｎ３＝２，ｎ４＝１１，ｎ５＝２、
ｓ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝７，ｎ３＝２，ｎ４＝１０，ｎ５＝２、
ｔ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝８，ｎ３＝２，ｎ４＝９，ｎ５＝２、
ｕ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝９，ｎ３＝２，ｎ４＝８，ｎ５＝２、
ｖ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝１０，ｎ３＝２，ｎ４＝７，ｎ５＝２、
ｗ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝１１，ｎ３＝２，ｎ４＝６，ｎ５＝２、
ｘ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝１２，ｎ３＝２，ｎ４＝５，ｎ５＝２、
ｙ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝１３，ｎ３＝２，ｎ４＝４，ｎ５＝２、
ｚ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝１４，ｎ３＝２，ｎ４＝３，ｎ５＝２、又は
ａａ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝１５，ｎ３＝２，ｎ４＝２，ｎ５＝２。
前記オリゴマー化合物は、少なくとも１つのホスホロチオエートヌクレオシド間結合を含む、請求項１〜４のいずれかに記載のオリゴマー化合物。
各ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合を含む、請求項１〜４のいずれかに記載のオリゴマー化合物。
Ｔ_１はＨであり、Ｔ_２はＨである、請求項１〜３、５或いは６のいずれかに記載のオリゴマー化合物。
配列ＩＤ番号１〜４７０から選択された核酸塩基配列を含む、請求項１〜７のいずれかに記載のオリゴマー化合物。
配列ＩＤ番号１１３の核酸塩基配列を含む、請求項１〜７のいずれかに記載のオリゴマー化合物。
Ｎｕ_１、Ｎｕ_３、及びＮｕ_５は、２'−置換基Ｏ（ＣＨ_２）_２ＯＣＨ_３を有するヌクレオシドであり、Ｔ_１はＨであり、Ｔ_２はＨであり、化学式Ｉは、下記から選択される、請求項９記載のオリゴマー化合物：
ａ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝２，ｎ３＝３，ｎ４＝１３，ｎ５＝２、
ｂ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝５，ｎ３＝３，ｎ４＝１０，ｎ５＝２、
ｃ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝８，ｎ３＝３，ｎ４＝７，ｎ５＝２、
ｄ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝１１，ｎ３＝３，ｎ４＝４，ｎ５＝２、
ｅ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝９，ｎ３＝３，ｎ４＝６，ｎ５＝２、
ｆ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝１０，ｎ３＝３，ｎ４＝５，ｎ５＝２、
ｇ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝１２，ｎ３＝３，ｎ４＝３，ｎ５＝２、
ｈ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝３，ｎ３＝３，ｎ４＝１２，ｎ５＝２、
ｉ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝４，ｎ３＝３，ｎ４＝１１，ｎ５＝２、
ｊ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝６，ｎ３＝３，ｎ４＝９，ｎ５＝２、
ｋ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝７，ｎ３＝３，ｎ４＝８，ｎ５＝２、
ｌ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝１３，ｎ３＝３，ｎ４＝２，ｎ５＝２、
ｍ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝２，ｎ３＝２，ｎ４＝１４，ｎ５＝２、
ｎ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝３，ｎ３＝２，ｎ４＝１３，ｎ５＝２、
ｏ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝４，ｎ３＝２，ｎ４＝１２，ｎ５＝２、
ｐ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝５，ｎ３＝２，ｎ４＝１１，ｎ５＝２、
ｑ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝６，ｎ３＝２，ｎ４＝１０，ｎ５＝２、
ｒ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝７，ｎ３＝２，ｎ４＝９，ｎ５＝２、
ｓ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝８，ｎ３＝２，ｎ４＝８，ｎ５＝２、
ｔ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝９，ｎ３＝２，ｎ４＝７，ｎ５＝２、
ｕ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝１０，ｎ３＝２，ｎ４＝６，ｎ５＝２、
ｖ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝１１，ｎ３＝２，ｎ４＝５，ｎ５＝２、
ｗ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝１２，ｎ３＝２，ｎ４＝４，ｎ５＝２、
ｘ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝１３，ｎ３＝２，ｎ４＝３，ｎ５＝２、又は
ｙ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝１４，ｎ３＝２，ｎ４＝２，ｎ５＝２。
配列ＩＤ番号１９の核酸塩基配列を含む、請求項１〜７のいずれかに記載のオリゴマー化合物。
Ｎｕ_１、Ｎｕ_３、及びＮｕ_５は、２'−置換基Ｏ（ＣＨ_２）_２ＯＣＨ_３を有するヌクレオシドであり、Ｔ_１はＨであり、Ｔ_２はＨであり、化学式Ｉは、下記から選択される、請求項１１記載のオリゴマー化合物：
ａ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝２，ｎ３＝３，ｎ４＝１４，ｎ５＝２、
ｂ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝５，ｎ３＝３，ｎ４＝１１，ｎ５＝２、
ｃ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝８，ｎ３＝３，ｎ４＝８，ｎ５＝２、
ｄ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝１１，ｎ３＝３，ｎ４＝５，ｎ５＝２、
ｅ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝１４，ｎ３＝３，ｎ４＝２，ｎ５＝２、
ｆ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝９，ｎ３＝３，ｎ４＝７，ｎ５＝２、
ｇ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝１０，ｎ３＝３，ｎ４＝６，ｎ５＝２、
ｈ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝１２，ｎ３＝３，ｎ４＝４，ｎ５＝２、
ｉ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝３，ｎ３＝３，ｎ４＝１３，ｎ５＝２、
ｊ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝４，ｎ３＝３，ｎ４＝１２，ｎ５＝２、
ｋ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝６，ｎ３＝３，ｎ４＝１０，ｎ５＝２、
ｌ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝７，ｎ３＝３，ｎ４＝９，ｎ５＝２、
ｍ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝１３，ｎ３＝３，ｎ４＝３，ｎ５＝２、
ｎ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝２，ｎ３＝２，ｎ４＝１５，ｎ５＝２、
ｏ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝３，ｎ３＝２，ｎ４＝１４，ｎ５＝２、
ｐ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝４，ｎ３＝２，ｎ４＝１３，ｎ５＝２、
ｑ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝５，ｎ３＝２，ｎ４＝１２，ｎ５＝２、
ｒ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝６，ｎ３＝２，ｎ４＝１１，ｎ５＝２、
ｓ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝７，ｎ３＝２，ｎ４＝１０，ｎ５＝２、
ｔ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝８，ｎ３＝２，ｎ４＝９，ｎ５＝２、
ｕ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝９，ｎ３＝２，ｎ４＝８，ｎ５＝２、
ｖ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝１０，ｎ３＝２，ｎ４＝７，ｎ５＝２、
ｗ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝１１，ｎ３＝２，ｎ４＝６，ｎ５＝２、
ｘ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝１２，ｎ３＝２，ｎ４＝５，ｎ５＝２、
ｙ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝１３，ｎ３＝２，ｎ４＝４，ｎ５＝２、
ｚ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝１４，ｎ３＝２，ｎ４＝３，ｎ５＝２、又は
ａａ）化学式Ｉ：ｎ１＝２，ｎ２＝１５，ｎ３＝２，ｎ４＝２，ｎ５＝２。
ｍｉＲＮＡ活性を阻害するための薬剤組成物であって、請求項１記載のオリゴマー化合物を含み、前記オリゴマー化合物が、ｍｉＲＮＡに対して実質的に相補的な核酸塩基配列を含む、薬剤組成物。
ｍｉＲＮＡ活性をインビボで阻害するための薬剤組成物であって、請求項１記載のオリゴマー化合物を含み、前記オリゴマー化合物が、配列ＩＤ番号１〜４７０から選択された核酸塩基配列を含む、薬剤組成物。
ｍｉＲ−１２２活性を阻害するための薬剤組成物であって、請求項１０〜１２のいずれかに記載のオリゴマー化合物を含む、薬剤組成物。
ＡＬＤＯＲｍＲＮＡレベルを増加させる、請求項１５記載の薬剤組成物。
コレステロールレベルを減少させる、請求項１５記載の薬剤組成物。