JP2012180358A

JP2012180358A - キメラギャップ化オリゴマー組成物

Info

Publication number: JP2012180358A
Application number: JP2012097083A
Authority: JP
Inventors: Balkrishen Bhat; バット、バルクリシェン; Eric Swayze; スウェイジ、エリック; Allerson Charles; アラーソン、チャールズ; Dande Prasad; ダンデ、プラサッド; P Prakash Thazha; プラカッシュ、ターザ、ピー．; Richard H Griffey; グリッフィー、リチャード、エイチ．
Original assignee: Isis Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Ionis Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2012-04-20
Filing date: 2012-04-20
Publication date: 2012-09-20

Abstract

【課題】遺伝子発現を調節する方法の提供。
【解決手段】第１の鎖は異なる３つの領域を有し、第２の鎖は天然ＲＮＡであり、各々の領域は、他の２つの領域のものとは異なる、天然の若しくは修飾されたリボフラノシル糖部分を有する二本鎖組成物。第１のオリゴマー化合物の少なくとも一部は、核酸標的と相補的でありハイブリダイズする。
【選択図】なし

Description

本発明は、核酸標的にハイブリダイズするのに十分な相補性を有するオリゴマー化合物、及びそれらを遺伝子発現の調節に使用する方法を提供する。一実施形態において、前記オリゴマー化合物は、核酸標的にハイブリダイズすることができる第１の鎖と、前記第１の鎖にハイブリダイズするのに十分な相補性を有する第２の鎖とを有する二本鎖コンストラクトを有する。好ましい実施形態において、前記オリゴマー化合物は、標的ＲＮＡの一部、若しくは標的ＲＮＡの転写又は翻訳に関与する関連核酸標的にハイブリダイズし、結果として前記標的ＲＮＡの活性を調節する。

多くの生物種において、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の導入は、強力且つ特異的な遺伝子サイレンシングを誘発する。この現象は、植物及び動物の両者で起き、ウイルス防御及びトランスポゾンサイレンシング機構の役割を有するものである。この現象は、もともとは、ペチュニア花を研究する研究者らによって１０年以上前に最初に報告されたものである。これらの花の紫色を濃くしようとして、Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎらは、強力なプロモーターの制御下で色素産生遺伝子を導入した。濃い紫色を期待していたが、多くの花は、色がまだらになったり白くなるものさえあった。これは前記導入遺伝子及び相同の内在性遺伝子の両方の発現が抑制されたためであることから、Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎは、観察された現象を"共抑制"と名付けた（Ｎａｐｏｌｉｅｔａｌ．，ＰｌａｎｔＣｅｌｌ，１９９０，２，２７９−２８９；Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎｅｔａｌ．，ＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９６，３１，９５７−９７３）。

その後、共抑制は植物、菌類の多くの生物種で起こることが発見されているが、特にアカパンカビにおいて特に顕著に見出すことができ、"クエリング（ｑｕｅｌｌｉｎｇ）"として知られている（ＣｏｇｏｎｉａｎｄＭａｃｉｎｏ，ＧｅｎｅｓＤｅｖ．２０００，１０，６３８−６４３；Ｇｕｒｕ，Ｎａｔｕｒｅ，２０００，４０４，８０４−８０８）。

ｄｓＲＮＡが動物の遺伝子サイレンシングを導くことができるという最初の証拠は、線形動物である線虫の研究によってもたらされた。１９９５年、研究者Ｇｕｏ及びＫｅｍｐｈｕｅｓは、その機能を見極めるために、ｐａｒ―１遺伝子の発現を停止するアンチセンスＲＮＡの使用を試みていた。予想されたように、前記アンチセンスＲＮＡの導入は、ｐａｒ―１の発現を妨げたが、奇妙にも、センス鎖コントロールの導入もまた発現を妨げた（ＧｕｏａｎｄＫｅｍｐｈｅｕｓ，Ｃｅｌｌ，１９９５，８１，６１１−６２０）。この結果は、Ｆｉｒｅらが線虫にｄｓＲＮＡ（センス鎖及びアンチセンス鎖両方の混合物）を導入するまで、謎であった。この導入は、前記センス鎖若しくはアンチセンス鎖のどちらか単独の導入よりも、非常に効率的なサイレンシングを結果としてもたらした。細胞につきわずか数分子のｄｓＲＮＡの導入は、相同遺伝子の発現を完全にサイレンシングするのに十分であった。さらに、前記虫の腸へのｄｓＲＮＡの導入は、前記虫全体だけでなく第１世代の子孫にも遺伝子サイレンシングをもたらした（Ｆｉｒｅｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９９８，３９１，８０６−８１１）。

この現象の効力がきっかけで、Ｔｉｍｍｏｎｓ及びＦｉｒｅは、線虫のｕｎｃ−２２遺伝子と相同なｄｓＲＮＡを発現するように改変されている線形動物細菌を餌として与えることによって、ｄｓＲＮＡ効果の限界を調査することとなった。驚くべきことに、これらの虫は、ｕｎｃ−２２のヌル様な表現型を明らかにした（ＴｉｍｍｏｎｓａｎｄＦｉｒｅ，Ｎａｔｕｒｅ１９９８，３９５，８５４；Ｔｉｍｍｏｎｓｅｔａｌ．，Ｇｅｎｅ，２００１，２６３，１０３−１１２）。更なる研究は、虫をｄｓＲＮＡに浸すこともまた、サイレンシングを導くことが可能であることを示した（Ｔａｂａｒａｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９８，２８２，４３０−４３１）。ＰＣＴ国際公開公報第ＷＯ０１／４８１８３号パンフレットは、線形動物虫の標的遺伝子の発現を阻害する方法を開示しており、これは、標的遺伝子の一部と実質的に同一なヌクレオチド配列を有する二本鎖ＲＮＡ構造を産生することができる食物生物を前記虫に与える工程に続き、前記線形動物が前記食物生物を摂取する工程、若しくは前記二本鎖ＲＮＡ構造を産生することができるＤＮＡを導入する工程を含む（Ｂｏｇａｅｒｔｅｔａｌ．，２００１）。

二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）暴露の結果として生じた、線虫で明示された転写後遺伝子サイレンシングは、その後、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）と呼ばれている。この用語は、内在性の標的ｍＲＮＡレベルの配列特異的な減少を導いているｄｓＲＮＡに関与する遺伝子サイレンシングの全ての様式を一般化するために用いられ、遺伝子組換えＤＮＡが導入遺伝子及び内在性の遺伝子の両方のサイレンシングを導く共抑制とは異なる。線虫への外来性二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の導入は、相同配列を含む遺伝子の活性を明確且つ強力に乱すことを示している。Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙらは、ｄｓＲＮＡの主要な干渉効果が転写後であることを示唆し、この結論は、ｄｓＤＮＡが媒介した干渉の後の主要ＤＮＡ配列の検討、即ち改変の証拠がないという発見後の、その下流遺伝子の活性には影響を及ぼさない上流オペロンの改変に関連する研究に由来する。これらの結果は、転写の開始若しくは伸長への影響と相反する。最終的に、彼らは、細胞質での転写産物の蓄積が事実上なくなる一方で、ｄｓＲＮＡに媒介された干渉が核内での新生転写産物の蓄積の完全ではないが実質的な減少をもたらすことをｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーションによって観察した。これらの結果は、内在性ｍＲＮＡが干渉の最初の標的であることを指し示し、翻訳前の標的ｍＲＮＡを分解する機構が起き得ることを示唆する。またこの機構が、異常なメッセージを標的化し破壊することに関与する線虫のｍＲＮＡ監視システムであるＳＭＧシステムに依存しないことも発見された。その著者らは更に、分解する相同ｍＲＮＡを標的とするために、ｄｓＲＮＡがどのように触媒機構として機能するかのモデルを提案した（Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９８，９５，１５５０２−１５５０７）。

最近、ＲＮＡｉの多くの特徴を繰り返す合胞体胞胚葉ショウジョウバエ胚からの無細胞系の進歩が報告された。この反応において観察される干渉は、配列特異的であり、ｄｓＲＮＡによって促進されるが一本鎖ＲＮＡでは促進されず、特定のｍＲＮＡ分解によって機能し、最小長ｄｓＲＮＡを必要とする。さらに、ｄｓＲＮＡのプレインキュベーションはその活性を増強し、ＲＮＡｉが溶解反応物中で配列特異的な過程によって媒介され得ることを証明している（Ｔｕｓｃｈｌｅｔａｌ．，ＧｅｎｅｓＤｅｖ．，１９９９，１３，３１９１−３１９７）。

その後の実験において、Ｔｕｓｃｈｌらは、ショウジョウバエのインビトロ系を使用し、２１ｎｔ及び２２ｎｔのＲＮＡ断片がＲＮＡｉの配列特異的な媒介物であることを証明した。彼らが低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）と呼んだこれらの断片は、リボヌクレアーゼＩＩＩ様なプロセシング反応によって長いｄｓＲＮＡから産生することが示された。彼らはまた、オーバーハング３’末端を有する化学的に合成されたｓｉＲＮＡ二本鎖が、ショウジョウバエ溶解液において、効率的な標的ＲＮＡの切断を媒介することと、前記切断部位が、ガイドｓｉＲＮＡによって計測された領域の中心近くに位置することとを示した。加えて彼らは、センス若しくはアンチセンスのどちらの標的ＲＮＡがｓｉＲＮＡ−タンパク質複合体によって切断され得るかを、ｄｓＲＮＡプロセシングの方向が決定するということを示唆している（Ｅｌｂａｓｈｉｒｅｔａｌ．，ＧｅｎｅｓＤｅｖ．，２００１，１５，１８８−２００）。２１〜２３個のヌクレオチドｓｉＲＮＡによって生じる内在性及び異種遺伝子の発現の抑制の更なる特徴は、ヒト胎児腎臓細胞（２９３）及びヒーラー細胞を含むいくつかの哺乳類細胞株において調査されている（Ｅｌｂａｓｈｉｒｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２００１，４１１，４９４−４９８）。

つい最近、Ｔｉｊｓｔｅｒｍａｎらはアンチセンス方向性の一本鎖ＲＮＡオリゴマーが遺伝子サイレンシングの強力な誘導因子であり得ることを実際に明らかにした。共抑制の場合のように、彼らは、アンチセンスＲＮＡは、ＲＮＡｉ遺伝子ｒｄｅ−１及びｒｄｅ−４とは独立に作用するが、変異誘発／ＲＮＡｉ遺伝子ｍｕｔ−７及び推定ＤＥＡＤｂｏｘＲＮＡヘリカーゼであるｍｕｔ−１４を必要とすることを示した。その著者らによれば、それらのデータは、鋳型としてｍＲＮＡを使用しているＲＮＡプライマー伸長によって遺伝子サイレンシングが遂行され、後に分解されるｄｓＲＮＡを導くという仮説を支持し、一重鎖ＲＮＡオリゴマーが最終的にＲＮＡｉ現象の原因となることを示唆している（Ｔｉｊｓｔｅｒｍａｎｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００２，２９５，６９４−６９７）。

最近のいくつかの公報には、ＲＮＡｉ活性に必要なｄｓＲＮＡトリガーの構造条件が記載されている。最近の報告は、理想的なｄｓＲＮＡの配列は２ｎｔの３’末端オーバーハングを含む２１ｎｔの長さであることを指し示している（Ｅｌｂａｓｈｉｒｅｔａｌ，ＥＭＢＯ，２００１，２０，６８７７−６８８７，ＳａｂｉｎｅＢｒａｎｔｌ，ＢｉｏｃｈｉｍｉｃａｅｔＢｉｏｐｈｙｓｉｃａＡｃｔａ，２００２，１５７５，１５−２５）。この系において、３’末端からの４つのヌクレオシドの２’−デオキシヌクレオシドとの置換は、活性に影響しないことが証明されている。一方、前記配列（センス若しくはアンチセンス）全体にわたる２’−デオキシヌクレオシド若しくは２’−ＯＣＨ_３−ヌクレオシドの置換は、ＲＮＡｉ活性に有害なことが示された。

線虫のＲＮＡサイレンシングのための構造条件の調査は、活性に干渉しないインターヌクレオチド連結（ホスホロチオエート）の修飾を証明している（Ｐａｒｒｉｓｈｅｔａｌ．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｅｌｌ，２０００，６，１０７７−１０８７）。また、２’−アミノ若しくは５’−ヨードウリジンのような化学修飾は、センス鎖においては良好な耐用性を示すが、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖では耐用性を示さないことがＰａｒｒｉｓｈらによって示され、これはＲＮＡｉにおいて２つの鎖に異なる役割があることを示唆している。グアニンからイノシン等の塩基修飾（１つの水素結合が消失する）は、前記修飾（センス若しくはアンチセンス）の位置と独立してＲＮＡｉ活性を減少させることが証明されている。同一の"位置独立"な活性の消失は、ｄｓＲＮＡトリガー中のミスマッチの導入に続いて観測されている。一部の修飾の型、例えば、５−ヨードＵ等の立体的な要求をしている塩基の導入は、アンチセンス鎖に位置するときはＲＮＡｉ活性に有害であることが示されているが、一方でセンス鎖に修飾位置があると、ＲＮＡｉ活性への有害の程度が小さいことが示された。２１ｎｔのｄｓＲＮＡ配列の場合のように、ＲＮＡ−ＤＮＡのヘテロ二本鎖はＲＮＡｉのトリガーとしての役目を果たさなかった。しかし、２’−２’−Ｆ修飾ヌクレオシドを含むｄｓＲＮＡは、２’−Ｆ修飾ヌクレオシドの位置（センス若しくはアンチセンス）と無関係なＲＮＡｉ反応の引き金を引く際に効率的であるように見えた。

１つの実験において、遺伝子発現の減少は、着床後のハツカネズミ胚にエレクトロポレーション処理されたｄｓＲＮＡ及び２５ｍｅｒのモルホリノを使用して研究された（Ｍｅｌｌｉｔｚｅｒｅｔａｌ．，ＭｅｈａｎｉｓｍｓｏｆＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，２００２，１１８，５７−６３）。前記モルホリノオリゴマーは活性を示したが、ｄｓＲＮＡほど有効ではなかった。

ＲＮＡｉ現象に関する多くの国際出願が最近公開されている。これらは、国際公開公報番号第ＷＯ００／４４８９５号、国際公開公報番号第ＷＯ００／４９０３５号、国際公開公報番号第ＷＯ００／６３３６４号、国際公開公報番号第ＷＯ０１／３６６４１号、国際公開公報番号第ＷＯ０１／３６６４６号、国際公開公報番号第ＷＯ９９／３２６１９号、国際公開公報番号第ＷＯ００／４４９１４号、国際公開公報番号第ＷＯ０１／２９０５８号、及び国際公開公報番号第ＷＯ０１／７５１６４号パンフレットを含む。

米国特許第５，８９８，０３１号及び６，１０７，０９４号（それぞれは、本出願に共通に所有され、この参照により本明細書に組み込まれるものである）には、ＲＮＡ様の特性を有する特定のオリゴヌクレオチドが報告されている。ＲＮＡとハイブリダイズするとき、これらのオリゴヌクレオチドは、ｄｓリボヌクレアーゼ酵素の基質として役立ち、結果として前記酵素による前記ＲＮＡの切断が起こる。

最近公開された他の論文（Ｍａｒｔｉｎｅｚｅｔａｌ．，Ｃｅｌｌ，２００２，１１０，５６３−５７４）において、一本鎖ｓｉＲＮＡと同様に二本鎖ｓｉＲＮＡは、ｅｌＦ２Ｃ１及びｅｌＦ２Ｃ２（ヒトＧＥＲｐ９５０アルゴノートタンパク質）と一緒にＲＮＡ誘導性サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）中に属することが示された。５’−リン酸化一本鎖ｓｉＲＮＡの活性は、研究された系において二本鎖ｓｉＲＮＡと同程度であった。関連する研究において、５’−リン酸塩部分の含有物は、インビボでショウジョウバエ胚中のｓｉＲＮＡの活性を増強することが示された（Ｂｏｕｔｌａ，ｅｔａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．，２００１，１１，１７７６−１７８０）。他の研究において、５’−リン酸塩は、ヒトヒーラー細胞中のｓｉＲＮＡ機能に必要であることが報告された（Ｓｃｈｗａｒｚｅｔａｌ．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｅｌｌ，２００２，１０，５３７−５４８）。

最近公開された１つの論文において、その著者は、ｓｉＲＮＡのセンス鎖、アンチセンス鎖、若しくはセンス鎖及びアンチセンス鎖の両方への２’−Ｏ−メチル基の包含は、大きな活性の減少を示したことを主張している（Ｃｈｉｕ，Ｙａ−ＬｉｎａｎｄＲａｎａ，Ｔａｒｉｑ，Ｍ．，ＲＮＡ，２００３，９，１０３４−１０４８）。

リボヌクレアーゼのＨ経路のように、遺伝子発現のアンチセンス調節のＲＮＡ干渉経路は、特定の遺伝子産物のレベルを調節するための有効手段であり、従って、遺伝子サイレンシングに関連する非常に有用な多くの治療、診断、及び研究の用途であると判明するかもしれない。従って、本発明は更に、遺伝子発現経路を調節するのに有効な組成物を提供し、それらが非アンチセンス機構と同様にＲＮＡ干渉及びｄｓＲＮＡ酵素等のアンチセンス作用機構に依存することを含む。この開示を身につけた当業者は、必要以上に実験することなく、これらの使用のための好ましい組成物を識別することが可能である。

特定の観点において、本発明は第１のオリゴマー化合物及と第２のオリゴマー化合物とを有する組成物に関連するものであり、各々は連結ヌクレオシド塩基を有している。前記第１のオリゴマーの少なくとも一部は、前記第２のオリゴマーの少なくとも一部とハイブリダイズすることができ、前記第１のオリゴマーの少なくとも一部は、選択された標的核酸と相補的であり、且つハイブリダイズすることができる。ここにおいて、前記第１のオリゴマー化合物は、インターヌクレオシド連結基によって連結される複数の連結ヌクレオシドを有するものであり、前記ヌクレオシドは更に３つの領域を有するものである。前記３つの領域の各々は、別個に修飾されたリボフラノシル糖部分、若しくはβ−Ｄ−リボフラノシル糖部分を有する１つの領域を有することによって、少なくとも１つの観点において、他の２つの領域の各々と区別され、前記他の２つの領域は、別個に修飾されたリボフラノシル糖部分を有することによって、少なくとも１つの観点において、互いに区別される。前記第２のオリゴマー化合物は、インターヌクレオシド連結基によって連結された複数の連結β−Ｄ−リボフラノシルヌクレオシドを有するものである。１つの観点において、前記第１及び第２のオリゴマー化合物は、選択的にリン酸基、３’−オーバーハング、若しくは結合基を有する。

１つの観点において、修飾リボフラノシル糖部分の各々の領域は、均一に修飾される。他の観点において、少なくとも１つの領域は、３つ全ての領域を有する３’−末端配座配置を有するヌクレオシドを有するものであって、前記３つ全ての領域は、３’−末端配座配置を有するヌクレオシドを有することが好ましい。

１つの観点において、少なくとも１つの領域は、２’−置換リボフラノシル部分を有するものであり、２’−置換基は、−Ｆ、−Ｏ−ＣＨ_２ＣＨ_２−Ｏ−ＣＨ_３、−ＯＣ_ｌ−Ｃ_ｌ２アルキル、−Ｏ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＮＨ_２、−Ｏ−（ＣＨ_２）_２−Ｏ−Ｎ（Ｒ_ｌ）_２、−Ｏ−ＣＨ_２Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｒ_ｌ）_２、−Ｏ−（ＣＨ_２）_２−Ｏ−（ＣＨ_２）_２−Ｎ（Ｒ_ｌ）_２、−Ｏ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＮＨＲ_ｌ、−Ｎ_３、−Ｏ−ＣＨ_２−ＣＨ＝ＣＨ_２、−ＮＨＣＯＲ_ｌ、−ＮＨ_２、−ＮＨＲ_１、−Ｎ（Ｒ_ｌ）_２、−ＳＨ、−ＳＲ_１、−Ｎ（Ｈ）ＯＨ、−Ｎ（Ｈ）ＯＲ_１、−Ｎ（Ｒ_１）ＯＨ、−Ｎ（Ｒ_１）ＯＲ_１、若しくは−Ｏ−ＣＨ_２−Ｎ（Ｈ）−Ｃ（＝ＮＲ_１）［Ｎ（Ｒ_ｌ）_２］であり、各々のＲ_１は、個別に、Ｈ、Ｃ_ｌ〜Ｃ_ｌ２アルキル、保護基、若しくは置換又は非置換Ｃ_ｌ〜Ｃ_ｌ２アルキル、Ｃ_２〜Ｃ_ｌ２アルケニル、若しくはＣ_２〜Ｃ_ｌ２アルキニルであり、前記置換基は、ハロゲン基、ヒドロキシル基、アミノ基、アジド基、シアノ基、ハロアルキル基、アルケニル基、アルコキシ基、チオアルコキシ基、ハロアルコキシ基、若しくはアリール基から選択されるものである。

２’−置換基のより好ましい基は、−Ｆ、−Ｏ−ＣＨ_３、−Ｏ−ＣＨ_２ＣＨ_２−Ｏ−ＣＨ_３、−Ｏ−ＣＨ_２−ＣＨ＝ＣＨ_２、Ｎ_３、ＮＨ_２、ＮＨＯＨ、−Ｏ−（ＣＨ_２）_２−Ｏ−Ｎ（Ｒ_ｌ）_２、−Ｏ−ＣＨ_２Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｒ_１）_２、−Ｏ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＮＨ_２、−Ｏ−（ＣＨ_２）_２−Ｏ−（ＣＨ_２）_２−Ｎ（Ｒ_１）_２、若しくは−Ｏ−ＣＨ_２−Ｎ（Ｈ）−Ｃ（＝ＮＲ_１）［Ｎ（Ｒ_ｌ）_２］を含むものであり、各々のＲ_１は、個別に、Ｈ、Ｃ_ｌ〜Ｃ_ｌ２アルキル、保護基、若しくは置換又は非置換Ｃ_ｌ〜Ｃ_ｌ２アルキル、Ｃ_２〜Ｃ_ｌ２アルケニル、若しくはＣ_２〜Ｃ_ｌ２アルキニルであり、前記置換基は、ハロゲン基、ヒドロキシル基、アミノ基、アジド基、シアノ基、ハロアルキル基、アルケニル基、アルコキシ基、チオアルコキシ基、ハロアルコキシ基、若しくはアリール基から選択されるものである。

２’−置換基のさらにより好ましい基は、−Ｆ、−Ｏ−ＣＨ_２ＣＨ_２−Ｏ−ＣＨ_３、−Ｏ−ＣＨ_３、−Ｏ−ＣＨ_２−ＣＨ＝ＣＨ_２、若しくは−Ｏ−ＣＨ_２−ＣＨ−ＣＨ_２−ＮＨ（Ｒ_ｊ）であり、Ｒ_ｊはＨ若しくはＣ_１〜Ｃ_１０アルキルである。さらにより好ましいのは、−Ｆ、−Ｏ−ＣＨ_３、若しくは−Ｏ−ＣＨ_２ＣＨ_２−Ｏ−ＣＨ_３であり、−Ｆ若しくは−Ｏ−ＣＨ_３は、さらにより好ましい。

前記第１のオリゴマー化合物の１つの領域のための好ましいリボフラノシル修飾は、４’−チオ修飾ヌクレオシドを含む。

一実施形態において、組成物は、β−Ｄ−リボフラノシル糖部分の１つの領域、及びリボフラノシル糖部分の２つの別個に修飾された領域を有する第１のオリゴマー化合物を含む。好ましい配向性は、別個に修飾されたリボフラノシル糖部分の２つの外側領域、及びβ−Ｄ−リボフラノシル糖部分の１つの内側領域を有することを含む。好ましいキメラ配向性は、２’−Ｆ修飾リボフラノシル糖部分、若しくは４’−チオ修飾リボフラノシル部分を有する５’−外側領域、β−Ｄ−リボフラノシル糖部分を有する内側領域、及び２’−ＯＣＨ_３修飾リボフラノシル糖部分、４’−チオ修飾リボフラノシル部分、修飾リボフラノシル部分を有する３’−外側領域を有するものであり、各々は、４’−ＣＨ_２−Ｏ−２’−架橋若しくはリボフラノシル部分を有するものであり、各々は、４’−（ＣＨ_２）_２−Ｏ−２’−架橋を有するものである。

一実施形態において、組成物は、リボフラノシル糖部分の別個に修飾された３つの領域を有する第１のオリゴマー化合物を含むものであり、各々の領域は、２’−Ｆ修飾リボフラノシル糖部分、２’−ＯＣＨ_３修飾リボフラノシル糖部分、４’−チオ修飾リボフラノシル部分、修飾リボフラノシル部分から選択された均一に修飾されたリボフラノシル部分を有するものであり、各々は、４’−ＣＨ_２−Ｏ−２’−架橋若しくはリボフラノシル部分を有するものであり、各々は、４’−（ＣＨ_２）_２−Ｏ−２’−架橋を有するものである。好ましい組成物は、２つの外側領域及び１つの内側領域を有する３つの領域を有することを含むものであり、５’−外側領域は、４’−チオ修飾リボフラノシル部分を有するものであり、前記内側領域は、２’−Ｆ修飾リボフラノシル糖部分を有するものであり、３’−外側領域は、２’−ＯＣＨ_３修飾リボフラノシル糖部分、修飾リボフラノシル部分を有するものであり、各々は、４’−ＣＨ_２−Ｏ−２’−架橋若しくはリボフラノシル部分を有するものであり、各々は、４’−（ＣＨ_２）_ｎｎ−Ｏ−２’−架橋を有するものである。

一実施形態において、前記組成物は、２つの外側領域及び１つの内側領域を有する第１のオリゴマー化合物を含むものであり、前記外側領域は、各々１〜６個のヌクレオシドを有し、前記内側領域は、６〜１４個のヌクレオシドを有するものである。好ましい範囲は、各々２〜５個のヌクレオシドを有する外側領域、及び８〜１３個のヌクレオシドを有する内側領域を含む。より好ましい範囲は、各々２〜５個のヌクレオシドを有する外側領域、及び８〜１３個のヌクレオシドを有する内側領域を含む。他の好ましい範囲は、各々２〜５個のヌクレオシドを有する外側領域、及び８〜１３個のヌクレオシドを有する内側領域を含む。特に好ましいキメラギャップマーは、各外側領域に２〜５個のヌクレオシド及び前記内側領域に１０〜１６個のヌクレオシドを有する２０ｍｅｒｓ（２〜５／１０〜１４／２〜５）、及び各外側領域に１〜３個のヌクレオシド及び前記内側領域に１３〜１７個のヌクレオシドを有する１９ｍｅｒｓ（１〜３／１３〜１７／１〜３）を含む。

一実施形態において、前記組成物は、少なくとも１つの５’−リン酸基を含む。他の実施形態において、前記組成物は、末端３’−ＯＨ基を含む。更なる実施形態において、前記組成物は、少なくとも１つの結合基を有する。

一実施形態において、前記第１及び前記第２のオリゴマー化合物の各々のヌクレオシドは、リン酸ジエステルインターヌクレオシド連結基によって連結される。他の実施形態において、前記第１及び前記第２のオリゴマー化合物の各々のヌクレオシドは、ホスホロチオエートインターヌクレオシド連結基によって連結される。更なる実施形態において、前記第１及び前記第２のオリゴマー化合物の１つのヌクレオシドは、ホスホロチオエートインターヌクレオシド連結基によって連結され、前記第１及び前記第２のオリゴマー化合物の他のヌクレオシドは、リン酸ジエステルインターヌクレオシド連結基によって連結される。他の実施形態において、前記第１のオリゴマー化合物のヌクレオシドは、ホスホロチオエートインターヌクレオシド連結基によって連結され、前記第２のオリゴマー化合物のヌクレオシドは、リン酸ジエステルインターヌクレオシド連結基によって連結される。更なる実施形態において、前記第１及び前記第２のオリゴマー化合物のヌクレオシドは、個別に、ホスホロチオエート若しくはリン酸ジエステルインターヌクレオシド連結基によって連結される。他の実施形態において、前記第１及び前記第２のオリゴマー化合物の少なくとも１つは、個別に、ホスホロチオエート及びリン酸ジエステルインターヌクレオシド連結基によって交互に連結される。

一実施形態において、前記第１及び前記第２のオリゴマー化合物の少なくとも１つは更に、３’−末端、５’−末端、若しくは３’−末端及び５’−末端の両方に結合された少なくとも１つの末端キャップ部分を有する。１つの好ましい末端キャップ部分は、反転デオキシ脱塩基部分である。好ましい実施形態において、組成物は、前記３’−末端及び前記５’−末端の一方若しくは両方に、末端キャップ部分を有する第２のオリゴマー化合物を含むものであり、反転デオキシ脱塩基部分は、好ましい末端キャップ部分である。一実施形態において、前記第１及び前記第２のオリゴマー化合物は、ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドの相補対である。一実施形態において、前記第１及び第２のオリゴマー化合物の各々は、約８〜約８０個の核酸塩基を有するものであり、より好ましい範囲は、約１０〜約５０個の核酸塩基である。更により好ましい範囲は、約１２〜約３０個の核酸塩基、約１２〜約２４個の核酸塩基、及び約１９〜約２３個の核酸塩基を含む。

一実施形態において、前記第１のオリゴマー化合物は、アンチセンスオリゴヌクレオチドであり、他の実施形態において、前記第２のオリゴマー化合物は、センスオリゴヌクレオチドである。

１つの観点において、前記組成物は、少なくとも１つのタンパク質を含み、前記タンパク質は、ＲＮＡ誘導性サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）の少なくとも一部を含むものである。

他の実施形態において、本発明は、１若しくはそれ以上の細胞、組織、若しくは動物を本発明の組成物と接触させる工程を有する遺伝子発現を阻害する方法を含む。他の実施形態において、方法は、１若しくはそれ以上の細胞、組織、若しくは動物を請求項１の第１若しくは第２のオリゴマー化合物に接触させる工程を有する遺伝子発現を阻害する工程を含む。

本発明は、オリゴマー化合物の組成物を提供するものであり、前記組成物の少なくとも一部は、二重鎖であり、前記組成物の更なる部分は、核酸標的と相補的であり、ハイブリダイズする。前記組成物は、自己相補的な領域を有する一本鎖を有することができ、従って、ループ構造を形成している。より好ましい組成物は、第１及び第２のオリゴマー化合物を有する二本鎖の組成物を含むものであり、前記第１のオリゴマー化合物は、前記第２のオリゴマー化合物とハイブリダイズし、更に標的核酸とハイブリダイズする相補的な領域を有する。この性質において、前記第１のオリゴマー化合物は、前記組成物のアンチセンス鎖であり、前記第２のオリゴマー化合物はセンス鎖である。

１つの観点において、核酸標的と相補的な前記第１のオリゴマー化合物の領域は、３’−末端糖配座配置を有するヌクレオシドを有する。前記相補的な領域は、好ましくは、キメラギャップオリゴマー化合物を有するものであり、内側領域は、他の２つの領域によって側面に位置され、全てのヌクレオシドは、３’−末端配座配置を有する。前記３つの領域は、各々の個々の領域と同一である異なるリボフラノシルサブユニットを有することによって少なくとも差別化される。前記３つの領域は、天然若しくは修飾インターヌクレオシド連結、及び天然若しくは修飾複素環塩基部分のいずれの組み合わせを有することができる。ここに記載され、当該分野に既知のように、前記オリゴマー化合物は、５’−リン酸基及び結合基等の修飾によって更に修飾され得る。

本発明の１つの観点において、前記第１のオリゴマー化合物は、３つの相異する領域に分割される連結したヌクレオシドの連続的な配列を有するものであり、各々の領域は、他の２つの領域と関連する少なくとも異なるリボフラノシル糖部分を有する。本発明の他の観点において、前記３つの領域の１つは、連結したβ−Ｄ−リボヌクレオシドヌクレオシドの連続的な配列であり、残りの領域は、それらのリボフラノシル糖部分を有することによって差別化される。未修飾ＲＮＡ（連結したβ−Ｄ−リボヌクレオシドヌクレオシド）を含まない領域は、好ましくは、本質的には各々の領域と同一であるが領域間では異なる、少なくとも均一に修飾されたリボフラノシル糖ユニットを含むヌクレオシドを有する。修飾リボフラノシル糖部分の好ましい修飾は、４’−チオリボヌクレオシド、２’−置換リボヌクレオシド、及び４’−ＣＨ_２−０−２’−架橋若しくは４’−（ＣＨ_２）_２−Ｏ−２‘−架橋を有するヌクレオシドを含む。より好ましい修飾は、修飾されたヌクレオシドに３’−末端糖配座配置を与える。

１つの観点において、前記第１のオリゴマー化合物は、３つの領域を有するものであり、１つの内側領域は、２つの外側領域によって側面に位置される。１つの観点において、前記外側領域は、各々約１〜約６個のヌクレオシドを有するものであり、前記内側領域は、約６〜約１４個のヌクレオシドを有する。他の観点において、前記外側領域は、各々約２〜約５個のヌクレオシドを有するものであり、前記内側領域は、約８〜約１３個のヌクレオシドを有する。更なる観点において、前記外側領域は、約２〜約３個のヌクレオシドを有するものであり、前記内側領域は、約１０〜約１３個のヌクレオシドを有する。

本発明の組成物は、遺伝子発現の調節に有益である。本発明の１つの観点において、標的細胞、細胞集団、組織、若しくは動物は、遺伝子発現を直接阻害することができるメッセージの減少を生じさせるために、本発明の組成物と接触される。他の実施形態において、メッセージの減少は、標的遺伝子を非標的遺伝子と関連づける経路を通して、非標的遺伝子を間接的に上方調節する。本発明のオリゴマー化合物を使用した遺伝子を調節する方法及びモデルは、実施例において例示される。

他の観点において、遺伝子発現を阻害する方法は、１若しくはそれ以上の細胞、組織、若しくは動物を本発明の組成物に接触する工程を有することを開示される。本発明の組成物を使用する方法の多数の手順は、実施例の欄において例示される。

本発明の組成物は、核酸標的にハイブリダイズすることによって遺伝子発現を調節し、結果として、その正常な機能が失われる。本明細書において使用される"標的核酸"若しくは"核酸標的"は、標的となり得るいずれの核酸を網羅する利便性のために使用され、核酸は、ＤＮＡ、そのようなＤＮＡから転写されたＲＮＡ（ｐｒｅ−ｍＲＮＡ及びｍＲＮＡ、若しくはその一部を含む）、及びそのようなＲＮＡ由来のｃＤＮＡを含むがこれに限られるものではない。本発明の好ましい実施例において、前記標的核酸は、メッセンジャーＲＮＡである。更なる好ましい実施形態において、前記標的メッセンジャーＲＮＡの分解は、本発明のオリゴマー化合物と共に形成されるＲＩＳＣ複合体によって促進される。他の好ましい実施形態において、前記標的メッセンジャーＲＮＡの分解は、リボヌクレアーゼＨ等のヌクレアーゼによって促進される。

その標的核酸を有する本発明のオリゴマー化合物のハイブリダイゼーションは、"アンチセンス"と一般に呼ばれるものである。従って、本発明の一部の好ましい実施形態の実行における好ましい機構は、本明細書において"アンチセンス阻害"と称される。そのようなアンチセンス阻害は、一般的に、少なくとも１つの鎖若しくは断片が、切断、分解、若しくは別の方法で機能不能にされるようなオリゴヌクレオチド鎖若しくは断片の水素結合に基づいたハイブリダイゼーションに基づく。この点において、そのようなアンチセンス阻害のための、特異的な核酸分子及びそれらの機能を標的とすることは、現在好ましい。

妨げられるＤＮＡの機能は、複製及び転写を含むことができる。複製及び転写は、例えば、内在性の細胞鋳型、ベクター、プラスミドコンストラクト、若しくは別のものからなることができる。妨げられるＲＮＡの機能は、タンパク質翻訳部位へのＲＮＡのトランスロケーション、ＲＮＡ合成部位から離れている細胞内の部位へのＲＮＡのトランスロケーション、ＲＮＡからのタンパク質の翻訳、１若しくはそれ以上のＲＮＡ種をもたらすＲＮＡのスプライシング、及びＲＮＡが携わっている若しくはＲＮＡによって促進される可能性がある、ＲＮＡに関連する触媒活性若しくは複合体形成等の機能を含むことができる。本発明の文脈において、"調節"及び"発現の調節"は、遺伝子、例えば、ＤＮＡ若しくはＲＮＡをコードする核酸分子の量若しくはレベルの増加（刺激）若しくは減少（阻害）のどちらかを意味する。阻害は多くの場合、発現の調節の好ましい形式であり、ｍＲＮＡは多くの場合、標的核酸が好ましい。

本発明の組成物及び方法はまた、ｓｍａｌｌｎｏｎ−ｃｏｄｉｎｇＲＮＡの研究、性質決定、検証、及び調節において有益である。それらは、これに限られるものではないが、マイクロＲＮＡ（ｍｉｃｒｏＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ）、核内低分子ＲＮＡ（ｓｍａｌｌｎｕｃｌｅａｒＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ）、核小体低分子ＲＮＡ（ｓｍａｌｌｎｕｃｌｅｏｌａｒＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ）、ｓｍａｌｌｔｅｍｐｏｒａｌＲＮＡ（ｓｔＲＮＡ）、及びｔｉｎｙｎｏｎ−ｃｏｄｉｎｇＲＮＡ（ｔｎｃＲＮＡ）、若しくはそれらの前駆物質、若しくはプロセシング済転写産物、若しくはそれらの他の細胞成分と関連するものを含む。

ｓｍａｌｌｎｏｎ−ｃｏｄｉｎｇＲＮＡは、植物、線虫、及び哺乳類を含む広範囲の生物における多様な発生及び制御経路において機能することが示されている。マイクロＲＮＡは、ｓｍａｌｌｎｏｎ−ｃｏｄｉｎｇＲＮＡであり、それは、酵素的切断によって、より大きな前駆物質からプロセシングされ、ｍＲＮＡの翻訳を阻害する。前駆物質からプロセシングされるが、ｍｉＲＮＡに酷似したｓｔＲＮＡは、発生のタイミングの制御に関与することが示されている。他のｎｏｎ−ｃｏｄｉｎｇｓｍａｌｌＲＮＡは、転写、翻訳、運搬、及び染色体構造の細胞のスプライシングと同じく多様に事象に関与している。

ｓｍａｌｌｎｏｎ−ｃｏｄｉｎｇＲＮＡのモジュレータが機能するとき、本発明の組成物は、スプライシングの調節、染色体のパッケージング又はメチル化、発生のタイミングの事象の制御、特定の生物学的経路への移送のタイミングに依存した標的ＲＮＡ発現レベルの増加又は減少、及び翻訳又は転写の制御等の細胞の機能若しくは作用の制御及び操作において実用性を見つける。加えて、本発明の組成物は、細胞原形質、細胞核、核小体、若しくはミトコンドリア等の特定の細胞区画におけるそれらの効果を最適化するために修飾され得る。

本発明の組成物は更に、スクリーニングアッセイ若しくは装置と同様にＲＮＡプロセシング若しくは代謝の調節経路の成分を同定するために使用され得る。

オリゴマー化合物
本発明の文脈において、用語"オリゴマー化合物"は、核酸分子の領域をハイブリダイズすることができるポリマー構造を指す。この用語は、オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシド、オリゴヌクレオチド類似体、オリゴヌクレオチド擬態、及びこれらのキメラ化合を含む。オリゴマー化合物は、通常線形に調製されるが、接続される若しくは別の方法で円形に調製されることができ、また枝分れを含むことができる。オリゴマー化合物は、例えば、二本鎖化合物を形成するために、ハイブリダイズした二本鎖等の二本鎖コンストラクトに含まれ得る。前記二本鎖オリゴマー化合物は、連結若しくは分離することができ、平滑末端、末端のオーバーハングを有することができ、若しくは平滑末端及びオーバーハングを有する末端を含む組み合わせを有することができる。更なる修飾は、前記末端の１つ、選択された核酸塩基位置、糖位置、若しくはインターヌクレオシド連結の１つに結合された結合基を含むことができる。一般に、オリゴマー化合物は、連結基が接続された単量体サブユニットの骨格を有するものであり、各々の連結された単量体サブユニットは、直接若しくは間接的に複素環塩基部分に結合される。オリゴマー化合物はまた、複素環塩基部分に連結されない単量体サブユニットを含む可能性があり、それによって脱塩基部位を提供する。オリゴマー化合物を作り上げている反復ユニットのいずれの１つは、修飾されることができ、ヘミマー、ギャップマー、及びキメラを含む様々なモチーフを生じさせている。

当該技術分野で既知のように、ヌクレオシドは複素環塩基部分に結合される糖部分を有する。このような複素環塩基の最も一般的な２つの種別は、プリン及びピリミジンである。ヌクレオチドは、ヌクレオシドの糖部分に共有結合しているリン酸基を更に含むヌクレオシドである。ペントフラノシル糖を含むそれらのヌクレオシドにとって、前記リン酸基は、より一般的な３’，５−インターヌクレオシド連結若しくはそれほど一般的でない２’，５’−インターヌクレオシド連結を与えている糖の２’，３’、若しくは５’ヒドロキシル部分のどちらかと連結され得る。オリゴヌクレオチドの形成において、前記リン酸基は、隣接したヌクレオシドの糖部分と共有結合する。それぞれの末端は、ハイブリダイゼーション若しくは共有結合の形成によって、円形構造を形成するために接続され得るが、オープンリニア（ｏｐｅｎｌｉｎｅａｒ）構造が一般的に好ましい。

本発明の文脈において、用語"オリゴヌクレオチド"は、リボ核酸（ＲＮＡ）若しくはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）のオリゴマー若しくはポリマーを指す。この用語は、自然発生の核酸塩基、糖、及び共有インターヌクレオシド連結から成るオリゴヌクレオチドを含む。用語"オリゴヌクレオチド類似体"は、オリゴヌクレオチドに類似した様式で機能する１若しくはそれ以上の非自然発生の部分を有するオリゴヌクレオチドを指す。このようなオリゴヌクレオチド類似体は、望ましい特性、例えば、増大された細胞の取込み、核酸標的のための増大された親和性、及び増大されたヌクレアーゼ安定性、が原因となった自然発生上の形態が多くの場合好ましい。本発明の文脈において、用語"オリゴヌクレオシド"は、リン原子を有さないインターヌクレオシド連結によって繋がれる一連のヌクレオシドを指す。この型のインターヌクレオシド連結は、短鎖アルキル、シクロアルキル、混合ヘテロ原子アルキル、混合ヘテロ原子シクロアルキル、１若しくはそれ以上の短鎖ヘテロ原子、及び１若しくはそれ以上の短鎖複素環を含む。これらのインターヌクレオシド連結は、シロキサン、硫化物、スルホキシド、スルホン、アセチル、ホルムアセチル、チオホルムアセチル、メチレンホルムアセチル、チオホルムアセチル、アルケニル、スルファミン酸塩、メチレンイミノ、メチレンヒドラジノ、スルホン酸塩、スルホンアミド、アミド、及び混合されたＮ、Ｏ、Ｓ、及びＣＨ_２構成要素を有するその他のものを含むが、これに限られるものではない。上記のオリゴヌクレオシドの調製を教示する代表的な米国特許は、米国特許第５，０３４，５０６号、５，１６６，３１５号、５，１８５，４４４号、５，２１４，１３４号、５，２１６，１４１号、５，２３５，０３３号、５，２６４，５６２号、５，２６４，５６４号、５，４０５，９３８号、５，４３４，２５７号、５，４６６，６７７号、５，４７０，９６７号、５，４８９，６７７号、５，５４１，３０７号、５，５６１，２２５号、５，５９６，０８６号、５，６０２，２４０号、５，６１０，２８９号、５，６０２，２４０号、５，６０８，０４６号、５，６１０，２８９号、５，６１８，７０４号、５，６２３，０７０号、５，６６３，３１２号、５，６３３，３６０号、５，６７７，４３７号、５，７９２，６０８号、５，６４６，２６９号、及び５，６７７，４３９号を含むが、これに限られるものではなく、これらの一部は本出願に共通に所有され、これらの各々はこの参照により本明細書に組み込まれるものである。

アンチセンスオリゴマー化合物、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、外側ガイド配列（ＥＧＳ）オリゴヌクレオチド、代替スプライサー、プライマー、プローブ、及び標的核酸の少なくとも一部にハイブリダイズするその他のオリゴマー化合物等のオリゴマー化合物は、本発明に更に含まれる。このように、これらのオリゴマー化合物は、一本鎖、二本鎖、環状、若しくはヘアピンのオリゴマー化合物の形態で導入されても良く、内部若しくは末端オーバーハング又はループ等の構造要素を含んでも良い。一旦、系に導入されると、本発明のオリゴマー化合物は、標的核酸の修飾をもたらすために、１若しくはそれ以上の酵素若しくは構造タンパク質の作用を引き出すことができる。

このような酵素の限られない１つの例は、細胞性エンドヌクレアーゼであるリボヌクレアーゼＨであり、これは、ＲＮＡ：ＤＮＡ二本鎖のＲＮＡ鎖、若しくはＲＮＡ：ＤＮＡ領域を有する二本差のＲＮＡ領域を切断し、望ましい特性を増大させるために他の化学的特性を有する可能性がある。"ＤＮＡのような"一本鎖アンチセンスオリゴマー化合物がリボヌクレアーゼＨを引き出すことは、当該技術分野において既知である。従って、リボヌクレアーゼＨの活性化は、ＲＮＡ標的の切断をもたらし、その結果、オリゴヌクレオチドが媒介した遺伝子発現の阻害の効率を大きく増大させる。同様な役割は、リボヌクレアーゼＩＩＩ及びリボヌクレアーゼＬファミリー等の他のリボヌクレアーゼに仮定される。

アンチセンスオリゴマー化合物の好ましい形態が、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドである間、多くの生物種において、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）等の二本鎖コンストラクトの導入は、遺伝子、若しくはその関連した遺伝子産物の、アンチセンスが媒介した機能の縮小を強力に及び特異的に誘導することを示した。この現象は、植物及び動物の両方で起こり、ウイルス防御及びトランスポゾンサイレンシングに、進化的な関係を有すると考えられる。

本発明に基づくオリゴマー化合物は、好ましくは、約８〜約８０個の核酸塩基（即ち、約８〜約８０個の連結されたヌクレオシド／単量体サブユニット）を有する。当業者は、本発明が長さ８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、若しくは８０個の核酸塩基のオリゴマー化合物を具体化すると理解する。

１つの好ましい実施形態において、本発明のオリゴマー化合物は、長さ１０〜５０個の核酸塩基である。当業者は、これが長さ１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、５６、４７、４８、４９、若しくは５０個の核酸塩基のオリゴマー化合物を具体化すると理解する。

他の好ましい実施形態において、本発明のオリゴマー化合物は、長さ１２〜３０個の核酸塩基である。当業者は、これが長さ１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、若しくは３０個の核酸塩基のオリゴマー化合物を具体化すると理解する。

更に好ましい実施形態において、本発明のオリゴマー化合物は、長さ１２〜２４個の核酸塩基である。当業者は、これが長さ１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、若しくは２４個の核酸塩基のオリゴマー化合物を具体化すると理解する。

更に好ましい実施形態において、本発明のオリゴマー化合物は、長さ１９〜２３個の核酸塩基である。当業者は、これが長さ１９、２０、２１、２２、若しくは２３個の核酸塩基のオリゴマー化合物を具体化すると理解する。

オリゴマー化合物の特に好ましい長さの１つは、約１２〜約３０個の核酸塩基である。他の特に好ましい長さは、約１２〜約２４個の核酸塩基である。更に特に好ましい長さは、約１９〜約２３個の核酸塩基である。

キメラオリゴマー化合物
オリゴマー化合物の全ての位置が均一に修飾される必要はなく、実際、上述した修飾のうちの１つ以上は、単一のオリゴマー化合物において、若しくはオリゴマー化合物中のヌクレオシド等の単一の単量体サブユニットにさえ組み込まれることができる。本発明はまた、キメラオリゴマー化合物であるオリゴマー化合物を含む。本発明の文脈中の"キメラ"オリゴマー化合物、若しくは"キメラ"は、２若しくはそれ以上の化学的に明瞭な領域を含んでいるオリゴマー化合物であり、各々は、少なくとも１つの単量体ユニット（即ち、核酸ベースのオリゴマーの場合、ヌクレオチド）から作り上げられる。

キメラオリゴマー化合物は、ヌクレアーゼ分解への増加した耐性、細胞の増加した取り込み、及び／若しくは標的核酸の増加した結合能を与えるために、一般的に少なくとも１つの修飾された領域を含む。オリゴマー化合物の付加的な領域は、ＲＮＡ：ＤＮＡ若しくはＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを切断することができる酵素の基質として役立つ可能性がある。一例として、リボヌクレアーゼＨは、ＲＮＡ：ＤＮＡ二本鎖のＲＮＡ鎖を切断する細胞性エンドヌクレアーゼである。従って、リボヌクレアーゼＨの活性化は、ＲＮＡ標的の切断をもたらし、その結果、遺伝子発現の阻害の効率を大きく増大させる。従って、例えば、同じ標的領域にハイブリダイズしているホスホロチオエートデオキシオリゴヌクレオチドと比較して、キメラが使用されるときに、類似の結果が、より短いオリゴマー化合物で多くの場合得られることができる。ＲＮＡ標的の切断は、通常、ゲル電気泳動、及び必要に応じて、当該技術分野において既知の核酸ハイブリダイゼーションと関連した技術によって検出され得る。

本発明のキメラオリゴマー化合物は、上記の通りに２若しくはそれ以上のオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド類似体、オリゴヌクレオシド、及び／若しくはオリゴヌクレオチド擬態の複合構造として形成され得る。通常使用されるキメラ化合物は、ハイブリッド、ヘミマー、ギャップマー、反転ギャップマー、及びブロックマーを含むが、これに限定されるものではなく、様々な点修飾及び／若しくは領域は、天然若しくは修飾ＤＮＡ及びＲＮＡ型ユニット、及び／若しくは例えば、ＬＮＡ、ＥＮＡ（商標）、ＰＮＡ、モルホリノ、及びその他のもの等の擬態型サブユニットから選択される。このようなハイブリッド構造の調製を教示する代表的な米国特許は、米国特許第５，０１３，８３０号、５，１４９，７９７号、５，２２０，００７号、５，２５６，７７５号、５，３６６，８７８号、５，４０３，７１１号、５，４９１，１３３号、５，５６５，３５０号、５，６２３，０６５号、５，６５２，３５５号、５，６５２，３５６号、及び５，７００，９２２号を含むがこれに限定されるものではなく、これらの一部は即時の出願に一般に所有され、それぞれはこの参照により本明細書に完全に組み込まれるものである。

オリゴマー擬態
本発明に受け入れられるオリゴマー化合物の好ましい他の基は、オリゴヌクレオチド擬態を含む。オリゴヌクレオチドに適用されるような擬態という用語は、オリゴマー化合物を含むことを意図され、ここにおいてフラノースリング、若しくはフラノースリング及びインターヌクレオチド連結は新規な基に置換され、フラノースリングだけの置換はまた、当該技術分野において糖代用物であるとして言及される。複素環塩基部分若しくは修飾された複素環塩基部分は、適切な標的核酸とのハイブリダイゼーションのために維持される。

１つのそのようなオリゴマー化合物、優れたハイブリダイゼーション特性を有することを示しているオリゴヌクレオチド擬態は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）と呼ばれる。ＰＮＡは良好なハイブリダイゼーション特性、高い生物学的安定性を有し、静電気的に中性分子である。最近の１つの研究において、ＰＮＡはトランスジェニックマウスモデルでの異常スプライシングを修正することに使用された（Ｓａｚａｎｉｅｔａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２００２，２０，１２２８−１２３３）。ＰＮＡオリゴマー化合物において、オリゴヌクレオチドの糖−主鎖は、主鎖、特にアミノエチルグリシン主鎖を含むアミドと置換される。前記核酸塩基は、直接若しくは間接的に（以下に示すように−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ_２−）前記主鎖のアミド部分のアザ窒素原子と結合される。ＰＮＡオリゴマー化合物の調製を教示する代表的な米国特許は、米国特許第５，５３９，０８２号、５，７１４，３３１号、及び５，７１９，２６２号を含むがこれに限定されるものではなく、それぞれはこの参照により本明細書に組み込まれるものである。ＰＮＡはＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（米国カリフォルニア州ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ）から市販で手に入れられる。

１９９１年に、Ｎｉｅｌｓｅｎ及びその同僚によって発表されてから（Ｎｉｅｌｓｅｎｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９１，２５４，１４９７−１５００）、多数の修飾が基本的なＰＮＡ主鎖に作られている。基本構造を下に示す：

ここにおいて、Ｂｘは複素環塩基部分であり、
Ｔ_４は、水素、アミノ保護基、−Ｃ（Ｏ）Ｒ_５、置換或いは非置換Ｃ_１〜Ｃ_１０アルキル、置換或いは非置換Ｃ_２〜Ｃ_１０アルケニル、置換或いは非置換Ｃ_２〜Ｃ_１０アルキニル、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、化学官能基、レポーター基、結合基、アミノ酸がアスパラギン酸或いはグルタミン酸のときにα−カルボキシル基を介して或いは選択的にω−カルボキシル基を通して連結されるＤ或いはＬα−アミノ酸、若しくはカルボキシル基を通して連結されるＤ、Ｌ、或いは混合Ｄ及びＬアミノ酸由来のペプチドであり、前記置換基は、ヒドロキシル、アミノ、アルコキシ、カルボキシ、ベンジル、フェニル、ニトロ、チオール、チオアルコキシ、ハロゲン、アルキル、アリール、アルケニル、及びアルキニルから選択され、
Ｔ_５は、−ＯＨ、−Ｎ（Ｚ_１）Ｚ_２、Ｒ_５、アミノ酸がリシン或いはオルニチンのときにα−アミノ基を介して或いは選択的にω−アミノ基を通して連結されるＤ或いはＬα−アミノ酸、若しくはアミノ基を通して連結されるＤ、Ｌ、或いは混合Ｄ及びＬアミノ酸由来のペプチド、化学官能基、レポーター基、若しくは結合基であり、
Ｚ_１は、水素、Ｃ_１〜Ｃ_６アルキル、若しくはアミノ保護基であり、
Ｚ_２は、水素、Ｃ_１〜Ｃ_６アルキル、アミノ保護基、−Ｃ（＝Ｏ）−（ＣＨ_２）_ｎ−Ｊ−Ｚ_３、アミノ酸がアスパラギン酸或いはグルタミン酸のときにα−カルボキシル基を介して或いは選択的にω−カルボキシル基を通して連結されるＤ或いはＬα−アミノ酸、若しくはカルボキシル基を通して連結されるＤ、Ｌ、或いは混合Ｄ及びＬアミノ酸由来のペプチドであり、
Ｚ_３は、水素、アミノ保護基、−Ｃ_１〜Ｃ_６アルキル、−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ_３、ベンジル、ベンゾイル、若しくは−（ＣＨ_２）_ｎ−Ｎ（Ｈ）Ｚ_１であり、
各々のＪは、Ｏ、Ｓ、若しくはＮＨであり、
Ｒ_５は、カルボニル保護基であり、
ｎは、２〜約５０である。

研究されている他の種類のオリゴヌクレオチド擬態は、モルホリノリングに結合される複素環塩基を有している連結モルホリノユニット（モルホリノ核酸）に基づいている。モルホリノ核酸中でモルホリノ単量体ユニットを連結する多くの連結基が報告されている。連結基の好ましい種類は、非イオン性オリゴマー化合物を与えるために選択されている。非イオン性モルホリノを基にしたオリゴマー化合物は、細胞のタンパク質との望まれていない相互作用を有する可能性が低い。モルホリノを基にしたオリゴマー化合物は、細胞のタンパク質との望まれていない相互作用を形成する可能性が低いオリゴヌクレオチドの非イオン性の擬態である（ＤｗａｉｎｅＡ．ＢｒａａｓｃｈａｎｄＤａｖｉｄＲ．Ｃｏｒｅｙ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００２，４１（１４），４５０３−４５１０）。モルホリノを基にしたオリゴマー化合物は、エブラフィッシュ（ｅｂｒａｆｉｓｈ）胚で研究されている（Ｇｅｎｅｓｉｓ，ｖｏｌｕｍｅ３０，ｉｓｓｕｅ３，２００１、及びＨｅａｓｍａｎ，Ｊ．，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，２００２，２４３，２０９−２１４を参照）。モルホリノを基にしたオリゴマー化合物の更なる研究もまた報告されている（Ｎａｓｅｖｉｃｉｕｓｅｔａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，２０００，２６，２１６−２２０、及びＬａｃｅｒｒａｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，２０００，９７，９５９１−９５９６を参照）。モルホリノを基にしたオリゴマー化合物は、１９９１年７月２３日に発行された米国特許第５，０３４，５０６号に開示される。オリゴマー化合物のモルホリノの種類は、単量体サブユニットを接合している様々な異なる連結基を有して調製されている。

モルホリノ核酸は、単量体サブユニットを接合している様々な異なる連結基（Ｌ_２）を有して調製されている。基本構造式を下に示す：

ここにおいて、
Ｔ_１は、水素、ヒドロキシル、保護ヒドロキシル、連結ヌクレオシド、若しくは連結オリゴマー化合物であり、
Ｔ_５は、水素或いはリン酸塩、リン酸塩誘導体、連結ヌクレオシド、若しくは連結オリゴマー化合物であり、
Ｌ_２は、キラルからアキラルまで荷電から中性まで変化され得る連結基であり（米国特許第５，１６６，３１５号は、−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）［Ｎ（ＣＨ_３）_２］−Ｏ−を含む連結を開示し、米国特許第５，０３４，５０６号は、例えば−Ｓ（＝Ｏ）−Ｘ−（ここでＸはＮＨ、ＮＣＨ_３、Ｏ、Ｓ、若しくはＣＨ_２である）、−Ｃ（＝Ｙ）−Ｏ−（ここでＹはＯ若しくはＳである）、−Ｓ（＝Ｏ）（ＯＨ）−ＣＨ_２−、−Ｓ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ｎ（Ｒ）−ＣＨ_２−（ここでＲはＨ若しくはＣＨ_３である）等のアキラルインターモルホリノ連結を開示し、米国特許第５，１８５，４４４号は、例えば−Ｐ（＝Ｏ）（−Ｘ）−Ｏ−（ここでＸはＦ、ＣＨ_２Ｒ、Ｓ−ＣＨ_２Ｒ、若しくはＮＲ_１Ｒ_２であり、Ｒ、Ｒ_１、及びＲ_２は各々Ｈ、ＣＨ_３、若しくは塩基特異的水素結合の形成を妨げない一部の他の部分である）等のキラルインターモルホリノ連結を含むリンを開示する）、
ｎは、２〜約５０である。

オリゴヌクレオチド擬態の更なる種類は、シクロヘキセニル核酸（ＣｅＮＡ）と呼ばれる。通常ＤＮＡ／ＲＮＡ分子中に存在するフラノースリングは、シクロヘニルリングによって置換される。ＣｅＮＡＤＭＴで保護されたホスホラミダイトモノマーは調製され、古典的なホスホラミダイト化学に附随するオリゴマー化合物合成のために使用されている。ＣｅＮＡで修飾された特定の位置を有する、充分に修飾されたＣｅＮＡオリゴマー化合物及びオリゴヌクレオチドは、調製され、研究されている（Ｗａｎｇｅｔａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２０００，１２２，８５９５−８６０２を参照）。一般的に、ＤＮＡ鎖へのＣｅＮＡモノマーの組み込みは、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドの安定性を増加させる。ＲＮＡ及びＤＮＡとの複合体を形成するＣｅＮＡオリゴアデニレートは、天然の複合体に同様の安定性を補完する。天然核酸構造へのＣｅＮＡ構造の組み込みの研究は、簡単な配座の順応を継続するためにＮＭＲ及び円偏光二色性によって示された。さらに、標的ＲＮＡの配列へのＣｅＮＡの組み込みは、血清に対して安定であり、大腸菌リボヌクレアーゼを活性化することができ、結果として標的ＲＮＡ鎖の切断をもたらす。

ＣｅＮＡの一般構造式を下に示す：

ここにおいて、
各々のＢｘは複素環塩基部分であり、
Ｌ_３は、例えばリン酸ジエステル等のインターシクロヘキセニル連結、若しくはホスホロチオエート連結であり、
Ｔ_１は、水素、ヒドロキシル、保護ヒドロキシル、連結ヌクレオシド、若しくは連結オリゴマー化合物であり、
Ｔ_２は、水素或いはリン酸塩、リン酸塩誘導体、連結ヌクレオシド、若しくは連結オリゴマー化合物である。

他の種類のオリゴヌクレオチド擬態（アンヒドロヘキシトール核酸）は、１若しくはそれ以上のアンヒドロヘキシトールヌクレオシドから調製されることができ（ＷｏｕｔｅｒｓａｎｄＨｅｒｄｅｗｉｊｎ，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，１９９９，９，１５６３−１５６６を参照）、一般構造式を有する：

各々のＢｘは複素環塩基部分であり、
Ｌは、例えばリン酸ジエステル等のインターアンヒドロヘキシトール連結、若しくはホスホロチオエート連結であり、
Ｔ_１は、水素、ヒドロキシル、保護ヒドロキシル、連結ヌクレオシド、若しくは連結オリゴマー化合物であり、
Ｔ_２は、水素或いはリン酸塩、リン酸塩誘導体、連結ヌクレオシド、若しくは連結オリゴマー化合物である。

更なる好ましい修飾は、二環式の糖部分を形成するためにリボシル糖環の２’−水酸基が前記糖環の４’炭素原子に連結され、それにより２’−Ｃ，４’−Ｃ−オキシメチレン連結を形成している"ＬｏｃｋｅｄＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ"（ＬＮＡ）等の二環式の糖部分を含む（Ｅｌａｙａｄｉｅｔａｌ．，Ｃｕｒｒ．ＯｐｉｎｉｏｎＩｎｖｅｎｓ．Ｄｒｕｇｓ，２００１，２，５５８−５６１；Ｂｒａａｓｃｈｅｔａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，２００１，８１−７；及びＯｒｕｍｅｔａｌ．，Ｃｕｒｒ．ＯｐｉｎｉｏｎＭｏｌ．Ｔｈｅｒ．，２００１，３，２３９−２４３に概説される。また米国特許第６，２６８，４９０号及び６，６７０，４６１号も参照）。前記連結は、好ましくは２’酸素原子及び４’炭素原子が架橋しているメチレン（−ＣＨ_２−）_ｎ基であり、ｎ＝１ではＬＮＡ（ｌｏｃｋｅｄｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄは、ここでは２’−Ｏ，４’−メチレン−架橋核酸として使用される）が使用され、ｎ＝２ではＥＮＡ（商標）（２’−Ｏ，４’−エチレン−架橋核酸）が使用される（Ｓｉｎｇｈｅｔａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１９９８，４，４５５−４５６；ＥＮＡ（商標）：Ｍｏｒｉｔａｅｔａｌ．，ＢｉｏｏｒｇａｎｉｃＭｅｄｉｃｉｎａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００３，１１，２２１１−２２２６）。ＬＮＡ及び他の二環式の糖類似体は、相補的ＤＮＡ及びＲＮＡ（Ｔｍ＝＋３〜＋１０Ｃ）を有する非常に高い二本鎖熱安定性、３’−エキソヌクレオリティック分解へ向かう安定性、及び良好な溶解特性を示す。ＬＮＡはＰｒｏＬｉｇｏ（仏国パリ及び米国コロラド州Ｂｏｕｌｄｅｒ）から市販されている。二環式の環システムを示しているＬＮＡの基本構造を下に示す。

ここにおいて各々のＴ_１及びＴ_２は、個別に、水素、ヒドロキシル保護基、連結ヌクレオシド、若しくは連結オリゴマー化合物であり、各々のＺ_１は、例えばリン酸ジエステル若しくはホスホロチオエート等のインターヌクレオシド連結基である。

また研究されているＬＮＡの異性体は、∀−Ｌ−ＬＮＡであり、３’−エキソヌクレアーゼに反して優れた安定性を有することを示している（Ｆｒｉｅｄｅｎｅｔａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ，２００３，２１，６３６５−６３７２）。前記∀−Ｌ−ＬＮＡは、強力なアンチセンス活性を示したアンチセンスギャップマー及びキメラに組み込まれた。∀−Ｌ−ＬＮＡの構造は下に示される。

調製及び研究されている他の類似した二環式の糖部分は、単一のメチレン基を介した３’−水酸基から前記糖環の４’炭素原子に渡る架橋を有し、従って３’−Ｃ，４’−Ｃ−オキシメチレン連結を形成している（米国特許第６，０４３，０６０号を参照）。２ＤＮＭＲ分光法によって決定されるＬＮＡの配座は、Ｎ型配座のより高い集団を取り入れるように一本鎖及び二本鎖両方のＬＮＡ核酸の固定された配向性がリン酸骨格を強制することを示した（Ｐｅｔｅｒｓｅｎｅｔａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．，２０００，１３，４４−５３）。これらの配座は、前記核酸塩基の改良されたスタッキングと関連する（Ｗｅｎｇｅｌｅｔａｌ．，ＮｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓＮｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１９９９，１８，１３６５−１３７０）。

ＬＮＡは、非常に安定したＬＮＡ：ＬＮＡ二本鎖を形成することを示している（Ｋｏｓｈｋｉｎｅｔａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９９８，１２０，１３２５２−１３２５３）。ＬＮＡ：ＬＮＡハイブリダイゼーションは、熱的に最も安定した核酸型二本鎖システムであることが示され、ＬＮＡのＲＮＡ様の特徴は二本鎖レベルで定められた。３つのＬＮＡモノマー（Ｔ若しくはＡ）の導入は、ＤＮＡ相補体の方へ著しく融点（Ｔｍ＝＋１５／＋１１）を増加させた。ＬＮＡによって媒介されるハイブリダイゼーションの一般性は、非常に安定したＬＮＡ：ＬＮＡ二本鎖の形成によって強調されている。前記ＲＮＡ様のＬＮＡは、モノマーのＮ型配座の制限、及びＬＮＡ：ＲＮＡ二本鎖の二次構造に関して反映された。

ＬＮＡはまた、高熱親和性を有する相補的ＤＮＡ、ＲＮＡ、若しくはＬＮＡと二本鎖を形成する。円偏光二色性（ＣＤ）スペクトルは、充分に修飾されたＬＮＡ（特にＬＮＡ：ＲＮＡ）を含む二本鎖がＡ−型ＲＮＡ：ＲＮＡ二本鎖と構造的に似ていることを示す。ＬＮＡ：ＤＮＡ二本鎖の核磁気共鳴（ＮＭＲ）試験は、ＬＮＡモノマーの３’−末端の配座を確かにした。二本鎖ＤＮＡの認識はまた、ＬＮＡによる鎖侵襲の示唆を証明されている。ミスマッチ配列の研究は、対応する未修飾な基準鎖と比較して一般に改良された選択性を有するワトソン−クリックの塩基対合規則にＬＮＡが従うことを示す。ルシフェラーゼｍＲＮＡの中の様々な領域（５’−非翻訳領域、開始コドン領域、若しくはコード領域）を標的としたときに、ＤＮＡ：ＬＮＡキメラは効率的に遺伝子発現を阻害することを示している（Ｂｒａａｓｃｈｅｔａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ，２００２，３０，５１６０−５１６７）。

ＬＮＡ−オリゴマー化合物の新規な型は、前記ＬＮＡと同様に広範囲にわたる診断及び治療の適用において有益である。それらの中には、アンチセンス適用、ＰＣＲ適用、鎖−置換オリゴマー、核酸ポリメラーゼ用及び一般にヌクレオチドを基にした薬物用の基質がある。

ＬＮＡを含む強力な及び非毒性のアンチセンスオリゴヌクレオチドが報告されている（Ｗａｈｌｅｓｔｅｄｔｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，２０００，９７，５６３３−５６３８）。著者らは、ＬＮＡがいくつかの所望の特性をアンチセンス剤に与えることを証明した。ＬＮＡ／ＤＮＡ共重合体は、血清及び細胞抽出物中で容易に分解されることはなかった。ＬＮＡ／ＤＮＡ共重合体は、生体ラット脳のＧタンパク質結合受容体シグナル及び大腸菌のレポーター遺伝子の検出と同じくらい異なるアッセイシステムにおいて、強力なアンチセンス活性を呈した。生体ヒト乳癌細胞への、リポフェクチンによって媒介されるＬＮＡの効率的な送達はまた遂行されている。ＬＮＡに関連するインビボのさらに成功した研究は、毒性なしにラットデルタオピオイド受容体のノックダウンを示し（Ｗａｈｌｅｓｔｅｄｔｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，２０００，９７，５６３３−５６３８）、及び他の研究においてはＲＮＡポリメラーゼＩＩの大サブユニットの翻訳の遮断を示している（Ｆｌｕｉｔｅｒｅｔａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，２００３，３１，９５３−９６２）。前記ＬＮＡモノマーのアデニン、シトシン、グアニン、５−メチル−シトシン、チミン、及びウラシルの合成及び調製は、それらのオリゴマー形成及び核酸認識特性と一緒に報告されている（Ｋｏｓｈｋｉｎｅｔａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，１９９８，５４，３６０７−３６３０）。ＬＮＡ及びその調製はまた、国際公開番号第ＷＯ９８／３９３５２号及び国際公開番号第ＷＯ９９／１４２２６号に記載されている。

ＬＮＡの最初の類自体（ホスホロチオエート−ＬＮＡ及び２’−チオ−ＬＮＡ）はまた調製されている（Ｋｕｍａｒｅｔａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，１９９８，８，２２１９−２２２２）。核酸ポリメラーゼ用の基質としてオリゴデオキシリボヌクレオチド二本鎖を含んでいる固定されたヌクレオシド類似体の調製はまた報告されている（Ｗｅｎｇｅｌｅｔａｌ．，国際出願番号第ＷＯ９８−ＤＫ３９３１９９８０９１４号パンフレット）。さらに、２’−アミノ−ＬＮＡの合成、柄を有する配座固定された新規な高親和性オリゴヌクレオチド類似体は、当該技術分野において報告されている（Ｓｉｎｇｈｅｔａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，１９９８，６３，１００３５−１００３９）。加えて、２’−アミノ−ＬＮＡ及び２’−メチルアミノ−ＬＮＡは調製され、相補的ＲＮＡ及びＤＮＡ鎖とのそれらの二本鎖の熱安定性は以前に報告されている。

調製及び研究されている、本発明に従う他のオリゴヌクレオチド擬態は、トレオース核酸である。このオリゴヌクレオチド擬態は、リボースヌクレオシドの代わりにトレオースヌクレオシドに基づいており、以下に示される一般構造を有する。

（３’，２’）−∀−Ｌ−トレオース核酸（ＴＮＡ）の初期の関心は、ＴＮＡをコピーするＤＮＡポリメラーゼが存在したかどうかという問題へ向いた。特定のＤＮＡポリメラーゼがＴＮＡ鋳型の限られた長さをコピーできたことが分かった（Ｃ&ＥＮ／Ｊａｎｕａｒｙ１３，２００３で報告）。

他の研究において、ＴＮＡは相補的ＤＮＡ、ＲＮＡ、及びＴＮＡオリゴヌクレオチドと逆平行のワトソン−クリック塩基対合ができると見つけ出された（Ｃｈａｐｕｔｅｔａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２００３，１２５，８５６−８５７）。

１つの研究において、（３’，２’）−∀−Ｌ−トレオース核酸は調製され、２’及び３’アミド化類似体と比較されている（Ｗｕｅｔａｌ．，ＯｒｇａｎｉｃＬｅｔｔｅｒｓ，２００２，４（８），１２７９−１２８２）。前記アミド化類似体は、ＲＮＡ／ＤＮＡと同程度の強度を有するＲＮＡ及びＤＮＡへの結合が示された。

更なるオリゴヌクレオチド擬態は、二環及び三環ヌクレオシド類似体を含むように調製され、構造式を有する（アミド化モノマーを示す）。

（Ｓｔｅｆｆｅｎｓｅｔａｌ．，Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，１９９７，８０，２４２６−２４３９、Ｓｔｅｆｆｅｎｓｅｔａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９９９，１２１，３２４９−３２５５、Ｒｅｎｎｅｂｅｒｇｅｔａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２００２，１２４，５９９３−６００２、及びＲｅｎｎｅｂｅｒｇｅｔａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄｓｒｅｓ．，２００２，３０，２７５１−２７５７を参照）。これらの修飾ヌクレオシド類似体はホスホラミダイト研究法を使用してオリゴマー形成され、結果として生じる、三環ヌクレオシド類似体を含むオリゴマー化合物は、ＤＮＡ、ＲＮＡ及びそれ自体にハイブリダイズされるときに、増加した熱安定性（Ｔｍ）を示している。二環ヌクレオシド類似体を含むオリゴマー化合物は、ＤＮＡ二本鎖の熱安定性に匹敵する熱安定性を示している。

オリゴヌクレオチド擬態の他の種類はホスホノモノエステル核酸と呼ばれ、それは主鎖中にリン基を組み込む。この種類のオリゴヌクレオチド擬態は、核酸の検出のためのプローブとして及び分子生物学で使用される補助物として、遺伝子発現（アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、センスオリゴヌクレオチド、及び三重鎖形成性オリゴヌクレオチド）を阻害する領域において、物理学的及び生物学的及び薬理学的な有益な特性を有すると報告されている。

一般構造式（Ｍａｒｋｕｓｈの定義の変数参照：米国特許第５，８７４，５５３号及び６，１２７，３４６号。この参照により本明細書に完全に組み込まれるものである）は以下に示される。

本発明に従う更なるオリゴヌクレオチド擬態は調整され、ここにおいてシクロブチルリングは天然フラノシルリングと置換する。

オリゴマー及びモノマー修飾
当該技術分野において既知であるように、ヌクレオシドは塩基−糖の組み合わせである。ヌクレオシドの塩基部分は、通常複素環塩基である。このような複素環塩基の２つの最も一般的な種類は、プリン及びピリミジンである。ヌクレオチドは更に、前記ヌクレオシドの糖部分に共有結合で連結されるリン酸基を含むヌクレオシドである。ペントフラノシル糖を含むこれらのヌクレオシドでは、前記リン酸基は前記糖の２’、３’、若しくは５’ヒドロキシル部分のいずれかと連結され得る。オリゴヌクレオチドの形成において、線形ポリマー化合物を形成するために、前記リン酸基は隣接したヌクレオシドと互いに共有結合的に連結する。次々に、この線形ポリマー化合物のそれぞれの末端は、円形化合物を形成するために更に接合され得るが、線形化合物が一般に好ましい。加えて、線形化合物は内部の核酸塩基の相補性を有する可能性があり、従って、完全に若しくは部分的な二重鎖化合物を産生することに関しては、いわば折り重なることができる。オリゴヌクレオチドの内部では、前記リン酸基は、一般に、前記インターヌクレオシド連結の形成、若しくは前記オリゴヌクレオチドの主鎖の糖環と併せて呼ばれる。ＲＮＡ及びＤＮＡの主鎖を作り上げる正常なインターヌクレオシド連結は、３’から５’へのホスホジエステル結合である。

修飾されたインターヌクレオシド連結
この本発明に有益な好ましいアンチセンスオリゴマー化合物の具体的な例は、修正を含むオリゴヌクレオチド、例えば非自然発生のインターヌクレオシド連結を含む。この明細書において定義したように、修飾インターヌクレオシド連結を有するオリゴヌクレオチドは、リン原子を保有するインターヌクレオシド連結及びリン原子を有しないインターヌクレオシド連結を含む。この明細書の目的にとって、当該技術分野において時々参照されるように、それらのインターヌクレオシド主鎖中のリン原子を有さない修飾オリゴヌクレオチドはまた、オリゴヌクレオシドであると考えられ得る。

線虫の系において、インターヌクレオチド連結（ホスホロチオエート）の修飾は、ＲＮＡｉ活性を著しくは妨げなかった。この観測に基づいて、本発明の特定の好ましいオリゴマー化合物はまた、１若しくはそれ以上の修飾インターヌクレオシド連結を有することができると示唆される。修飾インターヌクレオシド連結を含む好ましいリンは、ホスホロチオエートインターヌクレオシド連結である。

リン原子をその中に含む好ましい修飾オリゴヌクレオチド主鎖は、例えば、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、リン酸トリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、３’−アルキレンホスホン酸塩、５’−アルキレンホスホン酸塩、及びキラルホスホン酸塩を含むメチル及び他のアルキルホスホン酸塩、ホスフィナート、３’−アミノアミド亜リン酸エステル及びアミノアルキルアミド亜リン酸エステルを含むアミド亜リン酸エステル、チオアミド亜リン酸エステル、チオノアルキルホスホン酸塩、チオノアルキルホスホトリエステルを含む他のアルキルホスホン酸塩、ホスホノアセテート、及びチオホスホノアセテート（Ｓｈｅｅｈａｎｅｔａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ，２００３，３１（１４），４１０９−４１１８及びＤｅｌｌｉｎｇｅｒｅｔａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２００３，１２５，９４０−９５０）、正常の３’−５’連結を有するセレノリン酸塩及びボラノリン酸塩、これらの２’−５’連結類似体、及びこれらの反転した極性を有するものを含み、ここにおいて１若しくはそれ以上のインターヌクレオチド連結は、３’から３’、５’から５’、若しくは２’から２’の連結である。反転した極性を有する好ましいオリゴヌクレオチドは、３’−大部分のインターヌクレオチド連結、即ち、脱塩基（核酸塩基が失われている若しくはその場所に水酸基を有する）され得る単一の反転ヌクレオシド残基において、単一の３’から３’への連結を有する。様々な塩、混合塩、及び遊離酸形状もまた含まれる。

Ｎ３’−Ｐ５’アミド亜リン酸エステルは、相補的ＲＮＡ鎖への高親和性及びヌクレアーゼ耐性の両方を呈すると報告されている（Ｇｒｙａｚｎｏｖｅｔａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９９４，１１６，３１４３−３１４４）。Ｎ３’−Ｐ５’アミド亜リン酸エステルは、インビボで一部の成功（具体的にはｃ−ｍｙｃ遺伝子の発現を下方制御する）を有する研究がされている（Ｓｋｏｒｓｋｉｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９９７，９４，３９６６−３９７１；及びＦａｉｒａｅｔａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２００１，１９，４０−４４）。

上記のリン含有連結の調製を教示する代表的な米国特許は、米国特許第３，６８７，８０８号；４，４６９，８６３号；４，４７６，３０１号；５，０２３，２４３号；５，１７７，１９６号；５，１８８，８９７号；５，２６４，４２３号；５，２７６，０１９号；５，２７８，３０２号；５，２８６，７１７号；５，３２１，１３１号；５，３９９，６７６号；５，４０５，９３９号；５，４５３，４９６号；５，４５５，２３３号；５，４６６，６７７号；５，４７６，９２５号；５，５１９，１２６号；５，５３６，８２１号；５，５４１，３０６号；５，５５０，１１１号；５，５６３，２５３号；５，５７１，７９９号；５，５８７，３６１号；５，１９４，５９９号；５，５６５，５５５号；５，５２７，８９９号；５，７２１，２１８号；５，６７２，６９７号；及び５，６２５，０５０号を含むが、これに限定されるものではなく、これらの一部は本出願に共通に所有され、これらの各々はこの参照により本明細書に組み込まれるものである。

本発明のより好ましい実施形態において、オリゴマー化合物は、１若しくはそれ以上のホスホロチオエート及び／若しくはヘテロ原子インターヌクレオシド連結、特に−ＣＨ_２−ＮＨ−Ｏ−ＣＨ_２−、−ＣＨ_２−Ｎ（ＣＨ_３）−Ｏ−ＣＨ_２−［メチレン（メチルイミノ）若しくはＭＭＩ主鎖として既知である］、−ＣＨ_２−Ｏ−Ｎ（ＣＨ_３）−ＣＨ_２−、−ＣＨ_２−Ｎ（ＣＨ_３）−Ｎ（ＣＨ_３）−ＣＨ_２−、及び−Ｏ−Ｎ（ＣＨ_３）−ＣＨ_２−ＣＨ_２−［天然のリン酸ジエステルインターヌクレオチド連結は、−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−ＣＨ_２−として表される］を有する。ＭＭＩ型インターヌクレオシド連結は、上記参照された米国特許第５，４８９，６７７号において開示される。好ましいアミドインターヌクレオシド連結は、上記参照された米国特許第５，６０２，２４０号において開示される。

その中にリン原子を含まない好ましい修飾オリゴヌクレオチド主鎖は、短鎖アルキル或いはシクロアルキルインターヌクレオシド連結、ヘテロ原子及びアルキル或いはシクロアルキルインターヌクレオシドの混合物、若しくは１若しくはそれ以上の短鎖ヘテロ原子或いは複素環インターヌクレオシド連結によって形成される主鎖を有する。これらは、モルホリノ連結（ヌクレオシドの糖部分から一部分形成される）；シロキサン主鎖；スルフィド、スルホキシド、及びスルホン主鎖；ホルムアセチル及びチオホルムアセチル主鎖；メチレンホルムアセチル及びチオホルムアセチル主鎖；リボアセチル主鎖；主鎖を含むアルケン；スルファミン酸エステル主鎖；メチレンイミノ及びメチレンヒドラジノ主鎖；スルホン酸エステル及びスルホンアミド主鎖；及びＮ、Ｏ、Ｓ、及びＣＨ_２の構成要素を有する他のものを有する主鎖を含む。上記のオリゴヌクレオシドの調製を教示する代表的な米国特許は、米国特許第５，０３４，５０６号；５，１６６，３１５号；５，１８５，４４４号；５，２１４，１３４号；５，２１６，１４１号；５，２３５，０３３号；５，２６４，５６２号；５，２６４，５６４号；５，４０５，９３８号；５，４３４，２５７号；５，４６６，６７７号；５，４７０，９６７号；５，４８９，６７７号；５，５４１，３０７号；５，５６１，２２５号；５，５９６，０８６号；５，６０２，２４０号；５，６１０，２８９号；５，６０２，２４０号；５，６０８，０４６号；５，６１０，２８９号；５，６１８，７０４号；５，６２３，０７０号；５，６６３，３１２号；５，６３３，３６０号；５，６７７，４３７号；５，７９２，６０８号；５，６４６，２６９号；及び５，６７７，４３９号を含むが、これに限定されるものではなく、これらの一部は本出願に共通に所有され、これらの各々はこの参照により本明細書に組み込まれるものである。

修飾された糖
本発明のオリゴマー化合物はまた、１若しくはそれ以上の置換された若しくは別の修飾された糖部分を含んでも良い。リボシル及び関連する糖部分は、通常、連結に関係しないどの反応位置でも修飾される。従って、糖置換基のための好ましい位置は、天然の３’から５’へのインターヌクレオシド連結には通常使用されない２’の位置である。他の好ましい位置は３’及び５’末端である。３’−糖位置は、２つの隣接した糖単位の間が２’、５’連結のとき、修飾を受けやすい。好ましい糖置換基は、ＯＨ；Ｆ；Ｏ−、Ｓ−、或いはＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−、或いはＮ−アルケニル；Ｏ−、Ｓ−、或いはＮ−アルキニル；若しくはＯ−アルキル−Ｏ−アルキルを含み、アルキル、アルケニル、及びアルキニルは、Ｃ_１〜Ｃ_１０アルキル、若しくはＣ_２〜Ｃ_１０アルケニル及びアルキニルへ置換されても若しくは置換されなくても良い。Ｏ［（ＣＨ_２）_ｎＯ］_ｍＣＨ_３、Ｏ（ＣＨ_２）_ｎＯＣＨ_３、Ｏ（ＣＨ_２）_ｎＮＨ_２、Ｏ（ＣＨ_２）_ｎＣＨ_３、Ｏ（ＣＨ_２）_ｎＯＮＨ_２、及びＯ（ＣＨ_２）_ｎＯＮ［（ＣＨ_２）_ｎＣＨ_３］_２は特に好ましく、ｎ及びｍは１〜約１０である。他の好ましいオリゴヌクレオチドは、Ｃ_１〜Ｃ_１０の低アルキル、置換された低アルキル、アルケニル、アルキニル、アルカリル、アラルキル、Ｏ−アルカリル或いはＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ_３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ_３、ＯＣＦ_３、ＳＯＣＨ_３、ＳＯ_２ＣＨ_３、ＯＮＯ_２、ＮＯ_２、Ｎ_３、ＮＨ_２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換されたシリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、インターカレータ、オリゴヌクレオチドの薬物速度論的特性を改良するための基、若しくは薬力学的特性を改良するための基、及び同様の特性を有する他の置換基から選択された糖置換基を有する。好ましい修飾は、すなわち２’−メトキシエトキシ（２’−Ｏ−ＣＨ_２ＣＨ_２ＯＣＨ_３、また２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）或いは２’−ＭＯＥとしても既知）（Ｍａｒｔｉｎｅｔａｌ．，Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，１９９５，７８，４８６−５０４）、即ちアルコキシアルコキシ基を含む。更に好ましい修飾は、２’−ジメチルアミノオキシエトキシ、即ちＯ（ＣＨ_２）_２ＯＮ（ＣＨ_３）_２基（実施例において後述の通り２’−ＤＭＡＯＥとしても既知）、２’−ジメチルアミノエトキシエトキシ（また当該技術分野において２’−Ｏ−ジメチル−アミノ−エトキシ−エチル或いは２’−ＤＭＡＥＯＥとしても既知）、即ち２’−Ｏ−（ＣＨ_２）_２Ｏ−（ＣＨ_２）_２Ｎ（ＣＨ_３）_２、及びＮ−メチルアセトアミド（またＮＭＡ、２’−Ｏ−ＣＨ_２−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｈ）ＣＨ_３とも呼ぶ）を含む。

他の好ましい糖置換基は、メトキシ（−Ｏ−ＣＨ_３）、アミノプロポキシ（−ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＮＨ_２）、アリル（−ＣＨ_２−ＣＨ＝ＣＨ_２）、−Ｏ−アリル（−Ｏ−ＣＨ_２−ＣＨ＝ＣＨ_２）、及びフルオロ（Ｆ）を含む。２’−糖置換基は、アラビノ（上）位置若しくはリボ（下）位置であっても良い。好ましい２’−アラビノ修飾は、２’−Ｆである（Ｌｏｃｅｔａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００２，４１，３４５７−３４６７参照）。同様の修飾はまた、オリゴマー化合物の他の位置、特に３’末端ヌクレオシド若しくは２’−５’連結オリゴヌクレオチドの３’位置の糖、及び５’末端ヌクレオチドの５’位置の糖で作られ得る。オリゴマー化合物はまた、ペントフラノシル糖の代わりにシクロブチル部分等の糖擬態を有することができる。このような修飾された糖構造の調製を教示する代表的な米国特許は、米国特許第４，９８１，９５７号；５，１１８，８００号；５，３１９，０８０号；５，３５９，０４４号；５，３９３，８７８号；５，４４６，１３７号；５，４６６，７８６号；５，５１４，７８５号；５，５１９，１３４号；５，５６７，８１１号；５，５７６，４２７号；５，５９１，７２２号；５，５９７，９０９号；５，６１０，３００号；５，６２７，０５３号；５，６３９，８７３号；５，６４６，２６５号；５，６５８，８７３号；５，６７０，６３３号；５，７９２，７４７号；５，７００，９２０号；及び６，１４７，２００号明細書を含むが、これに限定されるものではなく、これらの一部は本出願に共通に所有され、これらの各々はこの参照により本明細書に完全に組み込まれるものである。

更なる代表的な糖置換基は、構造式Ｉａ若しくＩＩａの基を含み、

ここにおいて、
Ｒ_ｂはＯ、Ｓ、若しくはＮＨである；
Ｒ_ｄは単結合、Ｏ、Ｓ、若しくはＣ（＝Ｏ）である；
Ｒ_ｅはＣ_１〜Ｃ_１０アルキル、Ｎ（Ｒ_ｋ）（Ｒ_ｍ）、Ｎ（Ｒ_ｋ）（Ｒ_ｎ）、Ｎ＝Ｃ（Ｒ_ｐ）（Ｒ_ｑ）、Ｎ＝Ｃ（Ｒ_ｐ）（Ｒ_ｒ）、若しくは構造式ＩＩＩａを有する；

Ｒ_ｐ及びＲ_ｑは各々個別に水素若しくはＣ_１〜Ｃ_１０アルキルである；
Ｒ_ｒは−Ｒ_ｘ−Ｒ_ｙである；
各々のＲ_ｓ、Ｒ_ｔ、Ｒ_ｕ、及びＲ_ｖは個別に水素、Ｃ（Ｏ）Ｒ_ｗ、置換或いは非置換Ｃ_１〜Ｃ_１０アルキル、置換或いは非置換Ｃ_２〜Ｃ_１０アルケニル、置換或いは非置換Ｃ_２〜Ｃ_１０アルキニル、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、化学官能基、若しくは結合基であり、ここにおいて置換基はヒドロキシル、アミノ、アルコキシ、カルボキシ、ベンジル、フェニル、ニトロ、チオール、チオアルコキシ、ハロゲン、アルキル、アリール、アルケニル、及びアルキニルから選択される；
若しくは選択的に、Ｒ_ｕ及びＲ_ｖはそれらが結合されるための窒素原子と一緒にフタリミド部分を形成する；
各々のＲ_ｗは個別に置換或いは非置換Ｃ_１〜Ｃ_１０アルキル、トリフロロメチル、シアノエチルオキシ、メトキシ、エトキシ、ｔ−ブトキシ、アリルオキシ、９−フルオレニルメトキシ、２−（トリメチルシリル）−エトキシ、２，２，２−トリクロロエトキシ、ベンジルオキシ、ブチリル、イソブチリル、フェニルまたはアリールである；
Ｒ_ｋは水素、窒素保護基、若しくは−Ｒ_ｘ−Ｒ_ｙである；
Ｒ_ｘは結合若しくは連結部分である；
Ｒ_ｙは化学官能基、結合基、若しくは立体支持媒体である；
各々のＲ_ｍ及びＲ_ｎは、Ｈ、窒素保護基、置換或いは非置換Ｃ_１〜Ｃ_１０アルキル、置換或いは非置換Ｃ_２〜Ｃ_１０アルケニル、置換或いは非置換Ｃ_２〜Ｃ_１０アルキニルであり、ここにおいて置換基はヒドロキシル、アミノ、アルコキシ、カルボキシ、ベンジル、フェニル、ニトロ、チオール、チオアルコキシ、ハロゲン、アルキル、アリール、アルケニル、アルキニル、ＮＨ_３ ^＋、Ｎ（Ｒ_ｕ）（Ｒ_ｖ）、グアニジノ、及びアシルから選択され、前記アシルは、酸アミド若しくはエステルである；
若しくはＲ_ｋ及びＲ_ｍは共に、窒素保護基であるか、Ｎ及びＯから選択される追加のヘテロ原子を選択的に含む環構造に接合されるか、若しくは化学官能基である：
Ｒ_ｉは、ＯＲ_ｚ、ＳＲ_ｚ、若しくはＮ（Ｒ_ｚ）２である；
各々のＲ_ｚは個別に、Ｈ、Ｃ_１〜Ｃ_８アルキル、Ｃ_１〜Ｃ_８ハロアルキル、Ｃ（＝ＮＨ）Ｎ（Ｈ）Ｒ_ｕ、Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｈ）Ｒ_ｕ、若しくはＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（Ｈ）Ｒ_ｕである；
Ｒ_ｆ、Ｒ_ｇ、及びＲ_ｈは、約４〜約７個の炭素原子、若しくは約３〜約６個の炭素原子と１若しくは２個のヘテロ原子とを有する環構造を有するものであり、前記ヘテロ原子は酸素、窒素、及び硫黄から選択され、前記環構造は脂肪族化合物、不飽和脂肪族化合物、芳香族化合物、若しくは飽和或いは不飽和複素環化合物である；
Ｒ_ｊは、１〜約１０個の炭素原子を有するアルキル或いはハロアルキル、２〜約１０個の炭素原子を有するアルケニル、２〜約１０個の炭素原子を有するアルキニル、６〜約１４個の炭素原子を有するアリール、Ｎ（Ｒ_ｋ）（Ｒ_ｍ）ＯＲ_ｋ、ハロ、ＳＲ_ｋ、若しくはＣＮである；
ｍａは１〜約１０である；
各々のｍｂは個別に、０若しくは１である；
ｍｃは０若しくは１〜１０の整数である；
ｍｄは１〜１０の整数である；
ｍｅは０、１、若しくは２である；
ｍｃが０のとき、ｍｄは１より大きい。

構造式Ｉの代表的な置換基は、１９９８年８月７日出願の米国特許出願番号第０９／１３０，９７３号において開示され、表題"Ｃａｐｐｅｄ２’−ＯｘｙｅｔｈｏｘｙＯｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ"は、この参照により本明細書に完全に組み込まれるものである。

特に好ましい糖置換基は、Ｏ［（ＣＨ_２）_ｎＯ］_ｍＣＨ_３、Ｏ（ＣＨ_２）_ｎＯＣＨ_３、Ｏ（ＣＨ_２）_ｎＮＨ_２、Ｏ（ＣＨ_２）_ｎＣＨ_３、Ｏ（ＣＨ_２）_ｎＯＮＨ_２、及びＯ（ＣＨ_２）_ｎＯＮ［（ＣＨ_２）_ｎＣＨ_３］_２を含み、ｎ及びｍは１〜約１０である。

構造式ＩＩＩ及びＩＶに示される代表的なグアニジノ置換基は、共通に所有された米国特許出願０９／３４９０４０号（表題"ＦｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄＯｌｉｇｏｍｅｒｓ"、１９９９年７月７日出願）に開示され、これはこの参照により本明細書に完全に組み込まれるものである。

代表的なアセトアミド置換基は、米国特許第６，１４７，２００号明細書に開示され、この参照により本明細書に完全に組み込まれるものである。

代表的なジメチルアミノエチルオキシエチル置換基は、１９９９年８月６日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９９／１７８９５号（表題"２’−Ｏ−Ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｅｔｈｙｌｏｘｙｅｔｈｙｌ−Ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｃｃｏｍｐｏｕｎｄｓ"）において開示され、この参照により本明細書に完全に組み込まれるものである。

修飾された核酸塩基／天然核酸塩基
オリゴマー化合物はまた、核酸塩基（多くの場合、当該技術分野において単に"塩基"若しくは"複素環塩基部分"と言う）修飾若しくは置換を含んでも良い。本明細書において使用される"未修飾な"若しくは"天然の"核酸塩基は、プリン塩基（アデニン（Ａ）及びグアニン（Ｇ））、及びピリミジン塩基（チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、及びウラシル（Ｕ））を含む。修飾された核酸塩基はまた、本明細書において、複素環塩基部分が、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５‐ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニン及びグアニンの６−メチル及び他のアルキル派生物、アデニン及びグアニンの２−プロピル及び他のアルキル派生物、２−チオウラシル、２−チオチミン及び２−チオシトシン、５−ハロウラシル及びシトシン、ピリミジン塩基の５−プロピニル（−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ_３）ウラシル及びシトシン及び他のアルキニル派生物、６−アゾウラシル、シトシン及びチミン、５−ウラシル（偽ウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシル及び他の８−置換アデニン及びグアニン、５−ハロ特に、５−ブロモ、５−トリフロロメチル及び他の５−置換ウラシル及びシトシン、７−メチルグアニン及び７−メチルアデニン、２−Ｆ−アデニン、２−アミノ−アデニン、８−アザグアニン及び８−アザアデニン、７−デアザグアニン及び７−デアザアデニン及び３−デアザグアニン及び３−デアザアデニン等の他の合成及び天然核酸塩基を含むことを指す。

複素環塩基部分はまた、プリン若しくはピリミジン塩基が他のヘテロ環（例えば７−デアザ−アデニン、７−デアザグアノシン、２−アミノピリジン及び２−ピリドン）と置換されるものを含んでも良い。更なる核酸塩基は、米国特許第３，６８７，８０８号明細書において開示されたもの、ＴｈｅＣｏｎｃｉｓｅＥｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａＯｆＰｏｌｙｍｅｒＳｃｉｅｎｃｅＡｎｄＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｐａｇｅｓ８５８−８５９，Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ，Ｊ．Ｉ．，ｅｄ．ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ & Ｓｏｎｓ，１９９０において開示されたもの、Ｅｎｇｌｉｓｃｈｅｔａｌ．，ＡｎｇｅｗａｎｄｔｅＣｈｅｍｉｅ，ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＥｄｉｔｉｏｎ，１９９１，３０，６１３において開示されたもの、及びＳａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．，Ｃｈａｐｔｅｒ１５，ＡｎｔｉｓｅｎｓｅＲｅｓｅａｒｃｈａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐａｇｅｓ２８９−３０２，Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．ａｎｄＬｅｂｌｅｕ，Ｂ．，ｅｄ．，ＣＲＣＰｒｅｓｓ，１９９３において開示されたものを含む。これらの核酸塩基の一部は、本発明のオリゴマー化合物の結合能を増加するのに特に有益である。これらは５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン、及びＮ−２、Ｎ−６、及びＯ−６置換プリンを含み、２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシル及び５−プロピニルシトシンを含む。５メチルシトシン置換は、０．６〜１．２℃で核酸二本鎖の安定性を増加させることを示し（Ｓａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．，Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．ａｎｄＬｅｂｌｅｕ，Ｂ．，ｅｄｓ．，ＡｎｔｉｓｅｎｓｅＲｅｓｅａｒｃｈａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＣＲＣＰｒｅｓｓ，ＢｏｃａＲａｔｏｎ，１９９３，ｐｐ．２７６−２７８）、特に２’−Ｏ−メトキシエチル糖修飾と結合するときには更に塩基置換が現在のところ好ましい。

本発明のオリゴマー化合物はまた、１若しくはそれ以上の複素環塩基部分の代わりに多環の複素環化合物を含むことができる。多くの三環複素環式化合物は以前に報告されている。これらの化合物は、標的鎖への修飾鎖の結合特性を増加させるためにアンチセンス適用において一般的に使用される。最も熟慮された修飾はグアノシンを標的にしたときであり、従って、それらはＧ−クランプ若しくはシチジン類似体と呼ばれる。これらの多環の複素環化合物の多くは、一般構造式を有する：

第２鎖においてグアノシンと３つの水素結合を作る代表的なシトシン類似体は、１，３−ジアザフェノキサジン−２−ｏｎｅ（Ｒ_１０＝Ｏ，Ｒ_１１−Ｒ_１４＝Ｈ）［Ｋｕｒｃｈａｖｏｖ，ｅｔａｌ．，ＮｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓａｎｄＮｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１９９７，１６，１８３７−１８４６］、１，３−ジアザフェノチアジン−２−ｏｎｅ（Ｒ_１０＝Ｓ，Ｒ_１１−Ｒ_１４＝Ｈ），［Ｌｉｎ，Ｋ．−Ｙ．；Ｊｏｎｅｓ，Ｒ．Ｊ．；Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ，Ｍ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９５，１１７，３８７３−３８７４］、及び６，７，８，９−テトラフルオロ−１，３−ジアザフェノキサジン−２−ｏｎｅ（Ｒ_１０＝Ｏ，Ｒ_１１−Ｒ_１４＝Ｆ）［Ｗａｎｇ，Ｊ．；Ｌｉｎ，Ｋ．−Ｙ．，Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ，Ｍ．ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔ．１９９８，３９，８３８５−８３８８］を含む。オリゴヌクレオチドに組み入れられたこれらの塩基修飾は、相補的なグアニンとハイブリダイズすることが示され、最近ではまた、アデニンとハイブリダイズすること、及び拡張されたスタッキング相互作用によって螺旋の熱安定性を増強することが示されている（２００２年５月２４日出願の米国特許出願第１０／１５５，９２０号（表題"ＭｏｄｉｆｉｅｄＰｅｐｔｉｄｅＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ"）、及び２００２年５月２４日出願の米国特許出願第１０／０１３，２９５号（表題"ＮｕｃｌｅａｓｅＲｅｓｉｓｔａｎｔＣｈｉｍｅｒｉｃＯｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ"）を参照。これらの両方は本出願に共通に所有され、この参照により本明細書に完全に組み込まれるものである）。

シトシン類似体／置換が固定１，３−ジアザフェノキサジン−２−ｏｎｅ骨格に結合したアミノエトキシ部分を有するときに、更なる螺旋−安定化特性は観察されている（Ｒ_１０＝Ｏ，Ｒ_１１＝−Ｏ−（ＣＨ_２）_２−ＮＨ_２，Ｒ_{１２−１４}＝Ｈ）［Ｌｉｎ，Ｋ．−Ｙ．；Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ，Ｍ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９８，１２０，８５３１−８５３２］。結合の研究は、単一の取り込みが５−メチルシトシン（ｄＣ５^ｍｅ）と関連して、最大１８°までのΔＴｍを有する、その相補的な標的ＤＮＡ若しくはＲＮＡに対するモデルオリゴヌクレオチドの結合能を増強し得ることを証明し、しかしそれは単一の修飾のための、最も高い既知の親和性の増大である。一方、螺旋の安定性の利得は、オリゴヌクレオチドの特異性を危うくさせることはない。Ｔ_ｍデータは、完全に一致した配列と不一致の配列との間の、ｄＣ５^ｍｅと比較してさらに大きな区別を指し示す。鎖でつながれたアミノ基が相補的なグアニンのフーグスティーン面（即ち、Ｏ６）と相互作用するための追加の水素結合のドナーとして役立ち、従って４つの水素結合を形成していることが示唆された。これは、Ｇ−クランプの増加した親和性が、拡張した塩基スタッキング及び追加の特異的水素結合の組み合わせによって媒介されることを意味する。

更に、本発明に従う三環式の複素環化合物及びそれらを使用する方法は、２０００年５月２２日発行の米国特許出願番号第６，０２８，１８３号、及び１９９９年１２月２８日発行の米国特許出願番号第６，００７，９９２号に開示されており、両者の内容は本出願に共通に割り当てられ、本明細書に完全に組み込まれるものである。

強固な配列特異性と共にフェノキサジン派生物の増強された結合能は、それらをより強力なアンチセンスに基づく薬物の開発のための有益な核酸塩基類似体とする。実際、有望なデータは、フェノキサジン置換を含むヘプタヌクレオチドがＲＮａｓｅＨを活性化し、細胞の取込みを増強し、及び増加したアンチセンス活性を提示することができることを証明しているインビトロ実験に由来する［Ｌｉｎ，Ｋ−Ｙ；Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ，Ｍ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９８，１２０，８５３１−８５３２］。単一の置換がかなり２０ｍｅｒの２’デオキシホスホロチオエートオリゴヌクレオチドのインビトロでの有効性を大きく改善することを示したように、前記活性の増大は、Ｇ−クランプの場合にはさらに顕著であった［Ｆｌａｎａｇａｎ，Ｗ．Ｍ．；Ｗｏｌｆ，Ｊ．Ｊ．；Ｏｌｓｏｎ，Ｐ．；Ｇｒａｎｔ，Ｄ．；Ｌｉｎ，Ｋ．−Ｙ．；Ｗａｇｎｅｒ，Ｒ．Ｗ．；Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ，Ｍ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９９，９６，３５１３−３５１８］。それにもかかわらず、オリゴヌクレオチド設計を最適化し、生物活性上のこれらの複素環式修飾の効果をよりよく理解するために、オリゴマーのヌクレアーゼ安定性に対するそれらの影響を評価することは重要である。

更に、ヘテロ環塩基として有益な、修飾された多環の複素環化合物は、米国特許第４，８４５，２０５号；５，１３０，３０２号；５，１３４，０６６号；５，１７５，２７３号；５，３６７，０６６号；５，４３２，２７２号；５，４３４，２５７号；５，４５７，１８７号；５，４５９，２５５号；５，４８４，９０８号；５，５０２，１７７号；５，５２５，７１１号；５，５５２，５４０号；５，５８７，４６９号；５，５９４，１２１号；５，５９６，０９１号；５，６１４，６１７号；５，６４５，９８５号；５，６４６，２６９号；５，７５０，６９２号；５，８３０，６５３号；５，７６３，５８８号；６，００５，０９６号；及び５，６８１，９４１号明細書、及び２００１年１１月２８日出願の米国特許出願番号第０９／９９６，２９２号と同様に、上記で指摘した米国特許第３，６８７，８０８号に開示されるが、これに制限されるものではなく、これらの一部は本出願に共通に所有され、これらの各々はこの参照により本明細書に組み込まれるものである。

結合
本発明の組成物に使用されるオリゴマー化合物はまた、結果として生じるオリゴマー化合物の活性、細胞分布若しくは細胞の取込みを増強するための１若しくはそれ以上の部分若しくは結合を有するために修飾される。一実施形態において、このような修飾されたオリゴマー化合物は、ヒドロキシル若しくはアミノ基等の官能基に結合基を共有結合させることによって調製される。本発明の結合基は、インターカレータ、レポーター分子、ポリアミン、ポリアミド、ポリエチレングリコール、ポリエーテル、オリゴマーの薬力学的特性を増強する基、及びオリゴマーの薬物速度論的特性を増強する基を含む。典型的な結合基は、コレステロール、脂質、リン脂質、ビオチン、フェナジン、葉酸塩、フェナントリジン、アントラキノン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリン、及びＣｙ３及びＡｌｅｘａ等を含む色素を含む。本発明の前後関係において、薬力学的特性を増強する基は、オリゴマーの取込みを改善する、分解に対するオリゴマーの耐性を増強する、及び／若しくはＲＮＡとの配列−特異的なハイブリダイゼーションを強化する基を含む。本発明の前後関係において、薬物速度論的特性を増強する基は、オリゴマーの取込み、分配、代謝若しくは排出を改善する基を含む。代表的な結合基は、１９９２年１０月２３日出願の国際特許出願番号第ＰＣＴ／ＵＳ９２／０９１９６号に開示され、これらの全体の開示は、この参照によって本明細書に組み込まれるものである。

結合部分は、コレステロール部分等の脂質部分（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８９，８６，６５５３−６５５６）、コール酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎｅｔａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，１９９４，４，１０５３−１０６０）、チオエーテル（例えば、ヘキシル−Ｓ−トリチルチオール）（Ｍａｎｏｈａｒａｎｅｔａｌ．，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９９２，６６０，３０６−３０９；ｍａｎｏｈａｒａｎｅｔａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，１９９３，３，２７６５−２７７０）、チオコレステロール（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒｅｔａｌ．，Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．，１９９２，２０，５３３−５３８）、脂肪族鎖（例えば、ドデカンジオール或いはウンデシル残基）（Ｓａｉｓｏｎ−Ｂｅｈｍｏａｒａｓｅｔａｌ．，ＥＭＢＯＪ．，１９９１，１０，１１１１−１１１８；Ｋａｂａｎｏｖｅｔａｌ．，ＦＥＢＳＬｅｔｔ．，１９９０，２５９，３２７−３３０；Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋｅｔａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，１９９３，７５，４９−５４）、リン脂質（例えば、ジ−ヘキサデジル−ラック−グリセロール或いはトリエチルアンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデジル−ラック−グリセロ−３−Ｈ−ホスホネート）（Ｍａｎｏｈａｒａｎｅｔａｌ．，ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔ．，１９９５，３６，３６５１−３６５４；Ｓｈｅａｅｔａｌ．，Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．，１９９０，１８，３７７７−３７８３）、ポリアミン若しくはポリエチレングリコール鎖（Ｍａｎｏｈａｒａｎｅｔａｌ．，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ & Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１９９５，１４，９６９−９７３）、若しくはアダマンタン酢酸（ｍａｎｏｈａｒａｎｅｔａｌ．，ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔ．，１９９５，３６，３６５１−３６５４）、パルミチル部分（Ｍｉｓｈｒａｅｔａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１９９５，１２６４，２２９−２３７）、若しくはオクタデシルアミン或いはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール部分（Ｃｒｏｏｋｅｅｔａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，１９９６，２７７，９２３−９３７）を含むが、これに限定されるものではない。

本発明のオリゴマー化合物はまた、例えば、アスピリン、ワルファリン、フェニルブタゾン、イブプロフェン、スプロフェン、フェンブフェン、ケトプロフェン、（Ｓ）−（＋）−プラノプロフェン、カルプロフェン、ダンシルサルコシン、２，３，５−トリヨード安息香酸、フルフェナム酸、フォリン酸、ベンゾサイアジアザイド、クロロサイアザイド、ジアゼピン、インドメチシン、バルビツレート、セファロスポリン、サルファ剤、抗糖尿病薬、抗細菌性、若しくは抗生物質等の活性薬物材料と結合される可能性がある。オリゴヌクレオチド−薬物結合体及びそれらの調製は、米国特許出願第０９／３３４，１３０号明細書（１９９９年６月１５日出願）に開示されており、この参照により本明細書に完全に組み込まれるものである。

このようなオリゴヌクレオチドの結合の調製を教示する代表的な米国特許は、米国特許第４，８２８，９７９号；４，９４８，８８２号；５，２１８，１０５号；５，５２５，４６５号；５，５４１，３１３号；５，５４５，７３０号；５，５５２，５３８号；５，５７８，７１７号；５，５８０，７３１号；５，５８０，７３１号；５，５９１，５８４号；５，１０９，１２４号；５，１１８，８０２号；５，１３８，０４５号；５，４１４，０７７号；５，４８６，６０３号；５，５１２，４３９号；５，５７８，７１８号；５，６０８，０４６号；４，５８７，０４４号；４，６０５，７３５号；４，６６７，０２５号；４，７６２，７７９号；４，７８９，７３７号；４，８２４，９４１号；４，８３５，２６３号；４，８７６，３３５号；４，９０４，５８２号；４，９５８，０１３号；５，０８２，８３０号；５，１１２，９６３号；５，２１４，１３６号；５，０８２，８３０号；５，１１２，９６３号；５，２１４，１３６号；５，２４５，０２２号；５，２５４，４６９号；５，２５８，５０６号；５，２６２，５３６号；５，２７２，２５０号；５，２９２，８７３号；５，３１７，０９８号；５，３７１，２４１号；５，３９１，７２３号；５，４１６，２０３号；５，４５１，４６３号；５，５１０，４７５号；５，５１２，６６７号；５，５１４，７８５号；５，５６５，５５２号；５，５６７，８１０号；５，５７４，１４２号；５，５８５，４８１号；５，５８７，３７１号；５，５９５，７２６号；５，５９７，６９６号；５，５９９，９２３号；５，５９９，９２８号；及び５，６８８，９４１号明細書を含むが、これらに限定されるものではなく、これらの一部は本出願に共通に所有され、これらの各々はこの参照により本明細書に組み込まれるものである。

本発明の組成物に使用されるオリゴマー化合物はまた、ヌクレアーゼ安定性のような特性を増強するために、一般に、オリゴマー化合物の一方若しくは両方の末端に結合される１若しくはそれ以上の安定化基を有するように修飾され得る。キャップ構造は、安定化基に含まれる。"キャップ構造若しくは末端のキャップ部分"は、オリゴヌクレオチドのいずれの末端にも結合されている化学修飾を意味している（例えば、Ｗｉｎｃｏｔｔらによる国際公開第ＷＯ９７／２６２７０号パンフレット参照。この開示はこの参照により本明細書に組み込まれるものである）。これらの末端の修飾は、エキソヌクレアーゼ分解から、末端の核酸分子を有するオリゴマー化合物を保護し、細胞内での送達及び／若しくは局在に役に立つことができる。前記キャップは、５’−末端（５’−キャップ）若しくは３’−末端（３’−キャップ）で存在されることができ、若しくは両末端で存在されることができる。制限されない例において、前記５’−キャップは、反転脱塩基残基（部分）、４’，５’−メチレンヌクレオチド；１−（ベータ−Ｄ−エリトロフラノシル）ヌクレオチド、４’−チオヌクレオチド、炭素環ヌクレオチド；１，５−無水ヘキシトールヌクレオチド；Ｌ−ヌクレオチド；アルファ−ヌクレオチド；修飾された塩基ヌクレオチド；ジチオリン酸連結；スレオ−ペントフラノシルヌクレオチド；非環式３’，４’−セコヌクレオチド；非環式３，４−ジヒドロキシブチルヌクレオチド；非環式３，５−ジヒドロキシペンチルヌクレオチド、３’−３’−反転ヌクレオチド部分；３’−３’−反転脱塩基部分；３’−２’−反転ヌクレオチド部分；３’−２’−反転脱塩基部分；１，４−ブタンジオールリン酸塩；３’−アミド亜リン酸エステル；ヘキシルリン酸塩；アミノヘキシルリン酸塩；３’−リン酸塩；３’−ホスホロチオエート；ホスホロジチオエート；若しくは架橋或いは非架橋のメチルホスホン酸塩部分を含む（詳細は、Ｗｉｎｃｏｔｔｅｔａｌ．，国際公開公報第ＷＯ９７／２６２７０号パンフレットを参照。この参照により本明細書に組み込まれるものである）。

本発明の特に好ましい３’−キャップ構造は、例えば、４’，５’−メチレンヌクレオチド；１−（ベータ−Ｄ−エリトロフラノシル）ヌクレオチド；４’−チオヌクレオチド、炭素環ヌクレオチド；５’−アミノ−有機リン酸化合物；１，３−ジアミノ−２−プロピルリン酸塩、３−アミノプロピルリン酸塩；６−アミノヘキシルリン酸塩；１，２−アミノドデシルリン酸塩；ヒドロキシプロピルリン酸塩；１，５−無水ヘキシトールヌクレオチド；Ｌ−ヌクレオチド；アルファ−ヌクレオチド；修飾された塩基ヌクレオチド；ジチオリン酸；スレオ−ペントフラノシルヌクレオチド；非環式３’，４’−セコヌクレオチド；３，４−ジヒドロキシブチルヌクレオチド；３，５−ジヒドロキシペンチルヌクレオチド、５’−５’−反転ヌクレオチド部分；５’−５’−反転脱塩基部分；５’−アミド亜リン酸エステル；５’−ホスホロチオエート；１，４−ブタンジオールリン酸塩；５’−アミノ；架橋及び／若しくは非架橋の５’−ホスホロアミデート、ホスホロチオエート、及び／若しくはジチオリン酸、架橋或いは非架橋のメチルホスホン酸塩、及び５’−メルカプト部分を含む（詳細は、ＢｅａｕｃａｇｅａｎｄＴｙｅｒ，１９９３，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ４９，１９２５を参照。この参照により本明細書に組み込まれるものである）。

更に、ヌクレアーゼ安定性を与えるために、オリゴマー化合物の一方若しくは両方の末端のキャップに使用され得る３’及び５’−安定化基は、２００３年１月１６日に公開された国際公開番号第ＷＯ０３／００４６０２号パンフレットに開示されるものを含む。

３’−末端修飾
本発明の１つの観点において、オリゴマー化合物は、３’−末端の糖立体構造を生じさせるように合成的に修飾されたヌクレオシドを含む。ヌクレオシドは、所望の３’−末端の糖立体構造を生じさせるために、複素環塩基、糖部分、若しくは両者の合成修飾を結合することができる。望ましい３’−末端の立体構造配置を維持すると共に、オリゴマー化合物の特定の特性が増強され得るために、これらの修飾されたヌクレオシドはヌクレオシドのような擬態ＲＮＡに使用される。線虫の系において、２’−デオキシ−２’−Ｆ−ヌクレオシドで構成された二本鎖がＲＮＡｉ反応の引き金を引く際に効率的に見えるという事実によって一部支持されるＲＮＡ干渉の要件（例えば、引き金）として、ＲＮＡ型二本鎖（形状螺旋、主に３’−末端）にとって明らかな好ましさがある。より安定した３’−末端ヌクレオシドを使用することによって増強される特性は、化学的安定性；オリゴマーの結合能及び特異性の調節（相補配列と同様に酵素のための親和性及び特異性）；及びＲＮＡ切断の効果の増加と同様に、タンパク質結合の修飾を介した薬物速度論的特性の調節、タンパク質ｏｆｆ−ｒａｔｅ（オフ−レート）、吸収、及びクリアランス；ヌクレアーゼ安定性の調節を含むが、これらに限定されるものではない。本発明は、Ｃ３’−末端型立体構造を支持するような方法で修飾された１若しくはそれ以上のヌクレオシドを有するＲＮＡｉのオリゴマーの引き金を提供する。

ヌクレオシド立体構造は、２’、３’、若しくは４’−位置のペントフラノシル糖での置換を含む様々な因子によって影響される。電気的陰性物質置換基は、一般にアキシアル位を好み、その一方で、立体的に要求されている置換基は、一般にエクアトリアル位を好む（ＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓｏｆＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＳｔｒｕｃｔｕｒｅ，ＷｏｌｆｇａｎｇＳａｎｇｅｒ，１９８４，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ）。下の図２にて図示したように、認識要素として２’−ＯＨを保持すると共に、３’−末端の立体構造を支持する２’位置の修飾は達成され得る（Ｇａｌｌｏｅｔａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ（２００１），５７，５７０７−５７１３．Ｈａｒｒｙ−Ｏ‘ｋｕｒｕｅｔａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，（１９９７），６２（６），１７５４−１７５９ａｎｄＴａｎｇｅｔａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．（１９９９），６４，７４７−７５４）。或いは、アキシアル位の電気陰性フッ素原子の位置を決める３’−末端の立体構造をとる２’デオキシ−２‘Ｆ−ヌクレオシドによって例証されるように、３’−末端の立体構造に対する好みは２’−ＯＨの欠失によって達成され得る（Ｋａｗａｓａｋｉｅｔａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．（１９９３），３６，８３１−８４１）。リボース環の他の修飾、例えば、４’−Ｆ修飾ヌクレオシドを与えるための４’−位置での置換（Ｇｕｉｌｌｅｒｍｅｔａｌ．，ＢｉｏｏｒｇａｎｉｃａｎｄＭｅｄｉｃｉｎａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙＬｅｔｔｅｒｓ（１９９５），５，１４５５−１４６０、及びＯｗｅｎｅｔａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．（１９７６），４１，３０１０−３０１７）、若しくは、例えば、メタノカルバヌクレオシド類似体を生じさせるための修飾（Ｊａｃｏｂｓｏｎｅｔａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．（２０００），４３，２１９６−２２０３、及びＬｅｅｅｔａｌ．，ＢｉｏｏｒｇａｎｉｃａｎｄＭｅｄｉｃｉｎａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙＬｅｔｔｅｒｓ（２００１），１１，１３３３−１３３７）１１、１３３３−１３３７）はまた、３’−末端の立体構造に対する好みをも生じさせる。同じように、ＲＮＡｉ反応のオリゴマーの引き金は、立体構造がＣ３’−末端型立体構造、即ち、ＬｏｃｋｅｄＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ（ＬＮＡ、Ｓｉｎｇｈｅｔａｌ，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．（１９９８），４，４５５−４５６）、及びｅｔｈｙｌｅｎｅｂｒｉｄｇｅｄＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ（ＥＮＡ（商標）、Ｍｏｒｉｔａｅｔａｌ，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ & ＭｅｄｉｃｉｎａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙＬｅｔｔｅｒｓ（２００２），１２，７３−７６）に固定されるというような方法で修飾された１若しくはそれ以上のヌクレオシドから成るかもしれない。

修飾されたヌクレオシド及びそれらのオリゴマーの好ましい立体構造は、分子動力学計算、核磁気共鳴分光法、及びＣＤ計測等の様々な方法によって推定され得る。従って、ＲＮＡに似た立体構造（オリゴマーとの関連においてＡ−型二本鎖配置）を生じさせると予測される修飾は、本発明の修飾されたオリゴヌクレオチドに使用されるために選択される。本発明に従う多数の修飾ヌクレオシドの合成は、当該技術分野において既知である（例えば、ＣｈｅｍｉｓｔｒｙｏｆＮｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓａｎｄＮｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓＶｏｌ．１−３，ｅｄ．ＬｅｒｏｙＢ．Ｔｏｗｎｓｅｎｄ，１９８８，Ｐｌｅｎｕｍｐｒｅｓｓ．，及び下記の実施例を参照）。

１つの観点において、本発明は、核酸標的に対する、天然ＲＮＡと比較して増強された特性を有するように調製されるオリゴマーを対象としている。標的は識別され、オリゴマーは、効果的な長さ及び標的配列の一部と相補的である配列を有するように選択される。選択された配列の各々のヌクレオシドは、可能な増強修飾のために精査される。好ましい修飾は、同一の３’−末端の立体構造配置を有するヌクレオシドを有する１若しくはそれ以上のＲＮＡヌクレオシドの置換である。このような修飾は、天然ＲＮＡと関連して化学的及びヌクレアーゼ安定性を増強することができ、一方で同時に、オリゴヌクレオチドに合成する及び／若しくは組み入れるために、非常に安価且つ容易である。選択された配列は、更にいくつかの領域に分割されることができ、各々の領域のヌクレオシドは、キメラ配位の結果である修飾を増強するかが評価された。また、１若しくはそれ以上の末端ヌクレオシドに対してなされる多くの場合有利な修飾が５’及び３’−末端に与えられると考察された。本発明のオリゴマー化合物は、一本鎖の若しくは二本鎖配列或いは複数の配列の少なくとも１つの５’−位置の、少なくとも１つの５’−修飾リン酸基を含む。更なる修飾はまた、インターヌクレオシド連結、結合基、置換糖或いは塩基、ヌクレオシド擬態を有する１若しくはそれ以上のヌクレオシドの置換、及びその標的のために選択された配列を増強し得る他のいかなる修飾等をも考慮されている。

ホモ二本鎖核酸の立体構造配置を記載するために使用された用語は、ＲＮＡ用の"Ａ型"及びＤＮＡ用の"Ｂ型"である。ＲＮＡ及びＤＮＡ二本鎖のためのそれぞれの立体構造の配置は、核酸性質のＸ線回折分析から決定された（ＡｒｎｏｔｔａｎｄＨｕｋｉｎｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，１９７０，４７，１５０４）。一般に、ＲＮＡ：ＲＮＡ二本鎖はより安定していて、ＤＮＡ：ＤＮＡ二本鎖より高い融解温度（Ｔｍ’ｓ）を有する（Ｓａｎｇｅｒｅｔａｌ．，ＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓｏｆＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＳｔｒｕｃｔｕｒｅ，１９８４，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ；ＮｅｗＹｏｒｋ，ＮＹ．；Ｌｅｓｎｉｋｅｔａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９５，３４，１０８０７−１０８１５；Ｃｏｎｔｅｅｔａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，１９９７，２５，２６２７−２６３４）。ＲＮＡの増加した安定性は、構造上のいくつかの特徴、最も特にＡ−型配置から生じる改良された塩基スタッキング相互作用に起因すると考えられている（Ｓｅａｒｌｅｅｔａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，１９９３，２１，２０５１−２０５６）。ＲＮＡ中の２’ヒドロキシルの存在が、Ａ−型配置を支持するための二本鎖をもたらすＣ３’末端パッカー、言い換えればノーザンパッカーの方へ糖にバイアスをかける。加えて、ＲＮＡの２’水酸基は、ＲＮＡ二本鎖を安定させるのを助ける、水に媒介された水素結合のネットワークを形成することができる（Ｅｇｌｉｅｔａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９６，３５，８４８９−８４９４）。一方、デオキシ核酸は、安定性の低いＢ−型配置を与えると考えられるＣ２’末端の糖パッカー、言い換えればサザンパッカーを好む（Ｓａｎｇｅｒ，Ｗ．（１９８４）ＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓｏｆＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＳｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，ニューヨーク州ＮｅｗＹｏｒｋ）。本明細書において使用されるＢ型配置は、Ｃ２’−末端パッカー及びＯ４’−末端パッカーの両者を含んでいる。これは、Ｂｅｒｇｅｒ，ｅｔ．ａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ，１９９８，２６，２４７３−２４８０と矛盾せず、ＢｅｒｇｅｒはＢ−型二本鎖の起源を与える、フラノースの立体構造を考察する際に、考察はＯ４’−末端パッカーに寄与するであろうと指摘した。

しかし、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッド二本鎖は、純粋のＲＮＡ：ＲＮＡ二本鎖より通常安定せず、それらの配列への依存はＤＮＡ：ＤＮＡ二本鎖より安定していてもしていなくても良い（Ｓｅａｒｌｅｅｔａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，１９９３，２１，２０５１−２０５６）。ハイブリッド二本鎖の構造は、Ａ−型及びＢ−型配置の間の中間体であり、それは結果として貧弱なスタッキング相互作用になる可能性がある（Ｌａｎｅｅｔａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９３，２１５，２９７−３０６；Ｆｅｄｏｒｏｆｆｅｔａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９３，２３３，５０９−５２３；Ｇｏｎｚａｌｅｚｅｔａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９５，３４，４９６９−４９８２；Ｈｏｒｔｏｎｅｔａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９６，２６４，５２１−５３３）。これらの機構が合成オリゴマー鎖のＲＮＡ標的鎖への結合を必要とするときに、標的ＲＮＡ及び合成配列の間で形成される二本鎖の安定性は、アンチセンス及びＲＮＡ干渉等の治療が中心となるが、これに限定されるものではない。アンチセンスの場合、ｍＲＮＡの効果的な阻害は、アンチセンスＤＮＡがｍＲＮＡと非常に高い結合能を有することを必要とする。一方、合成オリゴマー鎖及び標的ｍＲＮＡ鎖間の所望の相互作用はまれに生じ、結果として効果を減少させる。

糖のパッキングを修正する１つの通常使用される方法は、糖配置に影響する置換基と２’−位置の糖との置換である。環立体構造への影響は、２’位置の置換基の性質に依存する。多くの異なる置換基は、それらの糖パッキングを決定するために研究されている。例えば、２’−ハロゲンは研究されて、２’フルオロ派生物がＣ３’末端型の最大の集団（６５％）を呈し、２’ヨードは最小さい集団（７％）を呈すということを示している。アデノシン（２’ＯＨ）対デオキシアデノシン（２’Ｈ）の集団は、それぞれ３６％及び１９％である。更に、アデノシンダイマー（２’−デオキシ−２’−フルオロアデノシン−２’−デオキシ−２’−フルオロ−アデノシン）の２’−フルオロ基の効果は、積み重ねられた立体構造の安定化と更に相関している。

予想通り、相対的な二本鎖の安定性は、２’−Ｆ基と２’−ＯＨ基との置換によって増強されることができ、その結果Ｃ３’−末端の集団を増加させている。高極性の２’Ｆ結合及び極端にＣ３’末端パッキングを好むことは、Ａ−型二本鎖中の積み重ねられた立体構造を安定させる可能性があると推測されている。ＵＶ淡色効果、円偏光二色性、及び１ＨのＮＭＲのデータはまた、スタッキングの程度がハロ置換基の電気陰性度が減少するにつれて減少することを指し示す。更に、糖成分の２’位置の立体の大部分は、Ｂ−型二本鎖よりもＡ−型二本鎖中に適応する。従って、ジヌクレオシド一リン酸の３’末端の２’置換基は、スタッキング立体構造に多くの効果を与えると考えられる：立体反発、フラノースパッキング選好、静電反発力、疎水性引力、及び水素結合形成能力。これらの置換基効果は、分子の大きさ、電気陰性度、及び置換基の疎水性によって決定されると考えられる。相補鎖の融解温度はまた、２’が置換したアデノシン二リン酸とともに増加される。立体構造の３’末端選好若しくは置換基の存在は、増加した結合に関与する。しかし、隣接した塩基（スタッキング）の、より大きな重なりは、３’末端立体構造によって達成され得る。

増加したヌクレアーゼ耐性及びヌクレオチドへの非常に高い結合能を与える１つの合成２’−修飾は、２−メトキシエトキシ（２’−ＭＯＥ（２’−ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３））側鎖である（Ｂａｋｅｒｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９７，２７２，１１９４４−１２０００）。２’−ＭＯＥ置換の即効性の利点のうちの１つは、Ｏ−メチル、Ｏ−プロピル、及びＯ−アミノプロピル等の多くの同様の２’修飾より大きい結合能の改善である。２’−Ｏ−メトキシエチル置換基を有するオリゴマーはまた、インビボでの使用に有望な特徴を有する遺伝子発現のアンチセンスインヒビダーであることが示されている（Ｍａｒｔｉｎ，Ｐ．，Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，１９９５，７８，４８６−５０４；Ａｌｔｍａｎｎｅｔａｌ．，Ｃｈｉｍｉａ，１９９６，５０，１６８−１７６；Ａｌｔｍａｎｎｅｔａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．，１９９６，２４，６３０−６３７；及びＡｌｔｍａｎｎｅｔａｌ．，ＮｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓＮｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１９９７，１６，９１７−９２６）。ＤＮＡと比較して、２’−ＭＯＥ修飾を有するオリゴマーは、改善されたＲＮＡ親和性及びより高いヌクレアーゼ耐性を示した。ウイングヌクレオシドの２’−ＭＯＥ置換基及びデオキシ−ホスホロチオエートヌクレオチドの内部領域（また、ギャップオリゴマー若しくはギャップマーとも呼ばれる）を有するキメラオリゴマーは、低薬量で、動物モデルの腫瘍の成長の効果的な減少を示した。２’−ＭＯＥ置換されたオリゴマーはまた、いくつかの疾病状態においてアンチセンス薬剤としての顕著な見込みを示している。そのようなＭＯＥ置換されたオリゴマーの１つは、ＣＭＶ網膜炎の治療のための臨床試験において、現在調査されている。

２’−Ｏ−メトキシエチルのより高いＲＮＡ親和性をより理解するため、及び２’−Ｏ−メトキシエチル置換基の立体構造の特性を調べるために、２つの十二量体オリゴヌクレオチドは、配列ＩＤ番号１（ＣＧＣＧＡＡＵＵＣＧＣＧ）及び配列ＩＤ番号２（ＧＣＧＣＵＵＡＡＧＣＧＣ）を有するように合成された。これらの自己相補性鎖は、２’−Ｏ−メトキシエチルによって修飾される全ての２’−位置を有する。二本鎖は１．７オングストロームの分解能で結晶化され、結晶構造は決定された。結晶化に使用された条件は、２ｍＭのオリゴヌクレオチド、５０ｍＭのＮａＨｅｐｅｓｐＨ６．２〜７．５、１０．５０ｍＭのＭｇＣｌ_２、１５％のＰＥＧ４００であった。結晶データは、空間群Ｃ２、セル定数ａ＝４１．２Å、ｂ＝３４．４Å、ｃ＝４６．６Å、＝９２．４°を示した。分解能は、−１７０℃で１．７Åであった。電流Ｒ＝因子は、２０％（Ｒ_ｆｒｅｅ２６％）であった。

この結晶構造は、十分に修飾されたＲＮＡオリゴヌクレオチド類似体の最初の結晶構造であると信じられている。二本鎖は、全Ａ−型立体構造及びＣ３’−末端パッカーを示す全ての修飾された糖をとる。下記の構造式ＩＩにて図示するように、エチレングリコールリンカーの大部分の２’−Ｏ−置換基、Ａ’−Ｂ’結合の周囲のねじれ角は、ゴーシュ配座を有する。２’−ＭＯＥでは、下記の構造式ＩＩのＡ’及びＢ’はＭＯＥのエチル部位のメチレン部分であり、Ｒ’はメトキシ部位である。

結晶において、結晶学上の２層の回転軸が分子の２折層の回転軸と一致しないように、２’−ＭＯＥＲＮＡ二本鎖は一般的な配向性をとる。二本鎖は予想されるＡ−型配置をとり、２４の２’−ＭＯＥ置換基の全ては十分な分解能での電子密度図で見られた。置換基原子の温度要因と同様に電子密度図は、一部の例において２’−ＭＯＥ置換基の屈曲性を指し示す。

大部分の２’−ＭＯＥ置換基は、エチルリンカーのＣ−Ｃ結合の周りでゴーシュ配座を示す。しかし、２つの例において、Ｃ−Ｃ結合の周りのトランス立体構造が観察される。結晶の格子相互作用は、それらの副溝を互いに介して二本鎖のパッキングを含む。従って、一部の残基では、２’−Ｏ−置換基の立体構造は、隣接した二本鎖に接触することによって影響を受ける。一般に、置換基の立体構造の変化（例えば、Ｃ−Ｃ結合の周りのｇ^＋若しくはｇ⁻）は、両方の鎖間で、副溝を交差して、及び鎖内での相互作用の範囲を作り出す。１つの位置では、２つの残基からの置換基の原子は、副溝を横切ったファン・デル・ワールス接触においてある。同様に、密接な接触は、２つの隣接した鎖内残基からの置換基の原子の間で起こる。

Ａ−ＤＮＡ二本鎖の以前に決定された結晶構造は、単離された２’−Ｏ−メチルＴ残基を結合した構造のためにあった。２’−ＭＯＥ置換基のための上記の結晶構造において、保存された水和の傾向は、２’−ＭＯＥ残基で観察されている。単一の水分子は、Ｏ２’、Ｏ３’、及びメトキシ酸素原子の間に位置することが観察され、３つ全てが２．９及び３．４Åの間の接触を形成している。加えて、置換基の酸素原子は、他のいくつかの水素結合接触に関係している。例えば、特定の２’−Ｏ−置換基のメトキシ酸素原子は、架橋水分子を介した逆鎖からのアデノシンのＮ３への水素結合を形成する。

いくつかの場合において、水分子は、修飾されたヌクレオシドの酸素原子Ｏ２’、Ｏ３’、及びＯＣ’の間で捕捉される。エチレングリコールリンカーのＣ−Ｃ結合の周りのトランス配座を有する２’−ＭＯＥ置換基は、ＯＣ’と逆鎖からのグアノシンのＮ２との間の近い接触、及びＯＣ’とＮ３（Ｇ）との間の水媒介に関連される。２’−ＭＯＥの修飾された鎖を含んでいる二本鎖に利用できる熱力学データを組み合わせると、この結晶構造は、他の修飾のさらに詳細な構造−安定性の分析を可能にする。

結晶学上の構造研究を拡張する際に、分子モデリング実験は、２’−Ｏ−修飾を有するオリゴヌクレオチドの更に増強された結合能を研究するために実行された。コンピュータシミュレーションは、オリゴヌクレオチドの各々のヌクレオシドに位置する２’−Ｏ−修飾を有する上記配列ＩＤ番号１の化合物で実施された。シミュレーションは、ＡＭＢＥＲ力場法を使用して水溶液中のオリゴヌクレオチドで実行された（Ｃｏｒｎｅｌｌｅｔａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９９５，１１７，５１７９−５１９７）（ｍｏｄｅｌｉｎｇｓｏｆｔｗａｒｅｐａｃｋａｇｅｆｒｏｍＵＣＳＦ，カリフォルニア州ＳａｎＦｒａｎｃｉｓｃｏ）。計算は、Ｉｎｄｉｇｏ２ＳＧＩ機で実行された（ＳｉｌｉｃｏｎＧｒａｐｈｉｃｓ，カリフォルニア州ＭｏｕｎｔａｉｎＶｉｅｗ）。

更に、３’−末端糖作用を有する２’−Ｏ−修飾は、構造式ＩＩのＡ’及びＢ’原子に対応する２つの原子部分を組み入れる環構造を有する修飾を含む。環構造は、オリゴヌクレオチドに組み込まれる１若しくはそれ以上のヌクレオシドの糖部分の２’位置に結合される。ヌクレオシドの２’−酸素は、構造式ＩＩのＡ’原子に対応する炭素原子に連結する。これらの環構造は、脂肪族、不飽和脂肪族、芳香族、若しくは複素環式であることができる。環の更なる原子（構造式ＩＩのＢ’原子に対応する原子）は、更なる酸素原子若しくは硫黄或いは窒素原子を持つ。この酸素、硫黄若しくは窒素原子は、１若しくはそれ以上の水素原子、アルキル部分或いはハロアルキル部分に結合され、若しくはウレイド、カルバミン酸塩、アミド或いはアミジン部分等の更なる化学的部分の一部である。前記環構造の残部は、これらの２つの環原子を接合する結合についての回転を制限する。更なる原子のような"更なる酸素、硫黄若しくは窒素原子"（上記のＲ位置の部分）に位置する際のこの補助は、前記ヌクレオシドの３’−酸素原子（Ｏ３’）に近接近して位置され得る。

３’−末端糖の配座配置を与える好ましい他の２’−糖置換基は、２’−ＯＭｅ基である。２’−ＯＭｅ基を有するグアノシン、シチジン、及びウリジンジヌクレオシドリン酸の２’−置換は、前記糖がＣ３’−末端配座をとるという結論を導く対応する天然（２’−ＯＨ）種に関して、増強されたスタッキング効果を示した。この場合、メチル基の疎水性の引力がその立体の大部分の不安定化効果を打開する傾向があると信じられている。

それらの相補的な標的鎖に結合するオリゴヌクレオチドの能力は、前記オリゴヌクレオチド及びその相補的な鎖のハイブリダイゼーション複合体の融解温度（Ｔｍ）を決定することによって比較される。二重螺旋の特徴的な物理的性特性である前記融解温度（Ｔｍ）は、５０％の螺旋（ハイブリダイズされている）対コイル（ハイブリダイズされていない）の形状が存在する温度（摂氏度）を示す。Ｔｍは、ハイブリダイゼーション複合体の形成及び分解（融解）を決定するＵＶスペクトルを使用することによって測定される。ハイブリダイゼーションの間に起こる塩基スタッキングは、ＵＶ吸収（淡色効果）の減少に附随して起こる。従って、ＵＶ吸収の減少は、より高いＴｍを指し示す。より高いＴｍは、鎖間の結合のより強い強度を指し示す。

ＦｒｅｉｅｒａｎｄＡｌｔｍａｎｎ，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ，（１９９７）２５：４４２９−４４４３は、以前に有する標的ＲＮＡとのそれらの二本鎖の安定性上のオリゴヌクレオチドの構造修飾の作用の研究を以前に公開している。この研究において、著者は、合成され、及びそれらのハイブリダイゼーションの親和性及びＴｍを査定された２００以上の異なる修飾を含む一連のオリゴヌクレオチドを再調査した。研究された糖修飾は、前記糖の２’−位置の置換、３’−置換、４’−酸素の置換、二環式糖の使用、四員環置換を含んだ。いくつかの核酸塩基修飾はまた、チミンの５若しくは６位置の置換、ピリミジンヘテロ環の修飾、及びプリンヘテロ環の修飾を含んで研究されている。修飾インターヌクレオシド連結はまた、インターヌクレオシド連結を含む中性、リン、及び非リンを含んで研究された。

ＲＮＡ標的鎖に標的される修飾されたオリゴヌクレオチド中のＣ３’−末端糖の割合を増加することは、ＲＮＡに結合するこの鎖を事前に組織化しなければならない。文献において報告及び研究されているいくつかの糖修飾のうち、２’−フルオロ若しくは２’−アルコキシ等の電気陰性置換基の組み入れは、３’末端（ノーザン）パッカー配座の方向に糖配座を移動させる。Ａ−型の配座配置を有するために、これは、このような修飾を組み入れるオリゴヌクレオチドを事前に組織化する。このＡ−型配座は、標的ＲＮＡ鎖への、オリゴヌクレオチドの増加した結合能を結果としてもたらしている。

分子のモデリング実験は、２’−Ｏ−修飾を有するオリゴヌクレオチドの更に増強された結合能を研究するために行われた。コンピュータシミュレーションは、オリゴヌクレオチドの各々のヌクレオシドに位置する本発明の２’−Ｏ−修飾を有している配列ＩＤ番号１、ｒ（ＣＧＣＧＡＡＵＵＣＧＣＧ）を有する化合物で行われた。前記シミュレーションは、ＡＭＢＥＲ力場法を使用して、水溶液中のオリゴヌクレオチドで実行された（Ｃｏｒｎｅｌｌｅｔａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９９５，１１７，５１７９−５１９７）（ｍｏｄｅｌｉｎｇｓｏｆｔｗａｒｅｐａｃｋａｇｅｆｒｏｍＵＣＳＦ，カリフォルニア州ＳａｎＦｒａｎｃｉｓｃｏ）。計算は、Ｉｎｄｉｇｏ２ＳＧＩ機で実行された（ＳｉｌｉｃｏｎＧｒａｐｈｉｃｓ，カリフォルニア州ＭｏｕｎｔａｉｎＶｉｅｗ）。

加えて、エチレングリコールモチーフを含んでいる２’−置換基では、側鎖のＯ−Ｃ−Ｃ−Ｏねじれの周りの酸素原子間のゴーシュ相互作用は、二本鎖への安定化効果を有する可能性がある（Ｆｒｅｉｅｒ同上）。このようなゴーシュ相互作用は、何年もの間、実験的に観察されている（Ｗｏｌｆｅｅｔａｌ．，Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．，１９７２，５，１０２；Ａｂｅｅｔａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９７６，９８，４６８）。このゴーシュ効果は、二本鎖形成に好都合である側鎖の配位に結果としてなる可能性がある。この安定化配位の正確な性質は、まだ説明されていない。我々が理論によって結ばれたくないと共に、アルキル側鎖で見られる、よりランダムな分布よりも、単一のゴーシュ配位中でＯ−Ｃ−Ｃ−Ｏねじれを保つことは、二本鎖形成にエントロピー効果を提供する。

結果として生じる二本鎖にＡ−型配座の特性（３’−末端）を与える本発明に従う代表的な２’−置換基は、２’−Ｏ−アルキル、２’−Ｏ−置換アルキル、及び２’−フルオロ置換基を含む。好ましい置換基は、様々なアルキル及びアリールエーテル及びチオエーテル、アミン、及びモノアルキル、及びジアルキル置換アミンである。複数の修飾が、１若しくはそれ以上の単量体サブユニット（ヌクレオシドは、好ましい）の複数の部位での本発明の１若しくはそれ以上のオリゴマー化合物、及び若しくはこれに限られるものではないが、選択された適用における活性等の特性を増強するためのインターヌクレオシド連結に作られ得ることを更に意図している。表ＩからＶＩＩは、ＲＮＡ相補体にハイブリダイズされたＤＮＡ鎖に、修飾／置換が作られたときの修飾につき、正数の∈Ｔｍを与えることを示しているヌクレオシド及びインターヌクレオチド連結修飾／置換を一覧にしている。

表Ｉ
ＲＮＡ相補体に対してＴｍの全体的な増加を与える２’−置換基を有する修飾されたＤＮＡ鎖：

※これらの修飾は、オリゴヌクレオチドのＴｍを増加させることができるだけでなく、また位置及び数（モチーフ依存）に依存してＴｍを減少させることができる。

表ＩＩ
ＲＮＡ相補体に対してＴｍの全体的な増加を与える修飾された糖環（構造ｘを参照）を有する修飾されたＤＮＡ鎖：

注釈：一般に、硫黄若しくはメチレンとの環酸素置換は、特異的なモチーフのためのＴｍに対する軽微な影響だけが研究されている。前記二本鎖を安定させることを示す基との２’−位置での置換は、ＣＨ_２が環Ｏを置換したときに不安定されている。これは、特定の２’−置換基（例えば、−Ｏ−ＣＨ_３及び−（Ｏ−ＣＨ_２ＣＨ_２）_３−Ｏ−ＣＨ_３）を有する環Ｏの間の必要なゴーシュ相互作用によると考えられる。

表ＩＩＩ
ＲＮＡ相補体に対してＴｍの全体的な増加を与える修飾された糖環を有する修飾されたＤＮＡ鎖：

表ＩＶ
糖修飾がＲＮＡ相補体に対してＴｍの全体的な増加を与える二環式の置換糖修飾を有する修飾されたＤＮＡ鎖：

表Ｖ
ＲＮＡ相補体に対してＴｍの全体的な増加を与える修飾された複素環塩基部分を有する修飾されたＤＮＡ鎖：

Ｒ_１での置換は安定化されることができ、Ｒ_２での置換は一般に非常に不安定化され（アンチコンホーメーションを形成することができない）、安定化５及び２’−置換基を有するモチーフは、一般に追加物、例えば安定増加である。

２’−Ｏ−メチルウリジンのＯ４及びＯ２位置の置換は、これらの修飾が期待される結果となる水素結合部位を除去するときに、非常に不安定な二本鎖である。６−アザＴはまた、この置換がｐＫａを減少させ、エノール互変異性体の方へヌクレオシドを移すときに、極度の不安定さを示し、結果として水素結合を削減している。

表ＶＩ
インターヌクレオシド連結を含む少なくとも１つの修飾されたリン、及びＲＮＡ相補体に対するＴｍへの影響を有するＤＮＡ鎖：

表ＶＩＩ
インターヌクレオシド連結を含む少なくとも１つの非リン、及びＲＮＡ相補体に対するＴｍへの影響を有するＤＮＡ鎖：

注釈：一般に、炭素連鎖インターヌクレオチド連結は、二本鎖形成を不安定にしていた。二重及び三重結合が使用されるとき、この不安定化は重度ではなかった。グリコール及び柔軟性エーテル連結の使用はまた、不安定にしていた。

２’−Ｏ修飾を包含する本発明の好ましい環構造は、シクロヘキシル、シクロペンチル、及びフェニル環と類似した空間の痕跡を有する複素環式環と同様に、シクロヘキシル、シクロペンチル、及びフェニル環を含む。本発明の特に好ましい２’−Ｏ−置換基は、２’−Ｏ−（トランス２−メトキシシクロヘキシル）、２’−Ｏ−（トランス２−メトキシシクロペンチル）、２’−Ｏ−（トランス２−ウレイドシクロヘキシル）、及び２’−Ｏ−（トランス２−メトキシフェニル）を含むが、これに限定されるものではない。

３’−末端糖配座を有すると予想される修飾された一部のヌクレオシドの実施例は、下記の表Ｉに示されている。これらの実施例は、代表的なものであり、包括的なものではない。

ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドの全体的な安定性が、配列−依存性及びＤＮＡ若しくはＲＮＡ鎖のプリン含量を含むいくつかの要因に依存するにもかかわらず、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドは、通常ＲＮＡ：ＲＮＡ二本鎖より安定してなく、場合によっては、ＤＮＡ：ＤＮＡ二本鎖より安定していることさえない。利用可能な実験データは、ＤＮＡ：ＤＮＡ（Ｂ−ファミリー）及びＲＮＡ：ＲＮＡ（Ａ−ファミリー）二本鎖の間の、主に、その中間体の配座の性質に対するＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドの比較的低下された安定性に起因すると考えられている。核酸二本鎖の全体的な熱力学的安定性は、主鎖、塩基対合、及びスタッキング相互作用の配座を含むいくつかの要因から生じる可能性がある。前記二本鎖の全体的な安定化に対する個々の熱力学的貢献を確認することは困難ではあるが、ハイブリッド二本鎖の増加した安定性を促進する主要な要因が、水和にとって、より良いスタッキング相互作用（静電−相互作用）、及びより有益な溝特質であると論じることは妥当である。Ｃ２’−Ｓメチル置換は、ハイブリッド二本鎖を不安定にすることを示している。３つのハイブリッドの間での上昇値の顕著な相違は、一部の説明を提供する可能性がある。２’−Ｓ−メチル基は、高い上昇値（〜３．２Å）による塩基−スタッキングを減少させることに対して強い影響を有するが、一方で２’−Ｏ−メチル基は、Ａ−型二本鎖の上昇値（〜２．６Å）に等しい上昇値によって、よりコンパクトな全体構造を作る。その全体的にＡのような構造の特徴にもかかわらず、ＳＭｅ＿ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッド構造は、Ｂ−ファミリー二本鎖の平均上昇値に極めて近い、平均上昇値３．２Åを所有する。実際、一部の局所塩基−ステップ（ＣＧステップ）は、異常に高い上昇値（４．５Åと同程度に高い）を有することが観察される可能性がある。従って、２’−Ｓ−メチルによって置換されたＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドの、より大きな不安定さは、貧弱なスタッキング相互作用に起因すると一部考えられるかもしれない。

化学定義
本明細書において他に定義されない限り、アルキル基は、Ｃ_１〜Ｃ_１２、好ましくはＣ_１〜Ｃ_８、さらに好ましくはＣ_１〜Ｃ_６の直鎖又は（可能であれば）分枝鎖の脂肪族ヒドロカルビル基を意味する。

本明細書において他に定義されない限り、ヘテロアルキル基は、Ｃ_１〜Ｃ_１２、好ましくはＣ_１〜Ｃ_８、さらに好ましくはＣ_１〜Ｃ_６の直鎖又は（可能であれば）分枝鎖の脂肪族ヒドロカルビル基を意味し、少なくとも１つ、好ましくは約１〜約３個のヘテロ原子をこの鎖に含み、末端部分を鎖に含む。好ましいヘテロ原子は、Ｎ、Ｏ、及びＳを含む。

本明細書において他に定義されない限り、シクロアルキル基は、Ｃ_３〜Ｃ_１２、好ましくはＣ_３〜Ｃ_８、さらに好ましくはＣ_３〜Ｃ_６の脂肪族ヒドロカルビル環を意味する。

本明細書において他に定義されない限り、アルケニル基は、Ｃ_２〜Ｃ_１２、好ましくはＣ_２〜Ｃ_８、さらに好ましくはＣ_２〜Ｃ_６のアルケニルを意味し、それは直鎖又は（可能であれば）分枝鎖のヒドロカルビル部分で良く、少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を含む。

本明細書において他に定義されない限り、アルキニル基は、Ｃ_２〜Ｃ_１２、好ましくはＣ_２〜Ｃ_８、さらに好ましくＣ_２〜Ｃ_６のアルキニルを意味し、それは直鎖又は（可能であれば）分枝鎖のヒドロカルビル部分であっても良く、少なくとも１つの炭素−炭素三重結合を含む。

本明細書において他に定義されない限り、ヘテロシクロアルキル基は、少なくとも３つの環員を含む環構造のものを意味し、その少なくとも１つは炭素であり、その１、２、又は３つの環員は炭素以外である。前記炭素原子数は１〜約１２までの範囲が好ましく、好ましくは１〜約６であり、環員の総数は３〜約１５まで変わり、約３〜約８までが好ましい。環の好ましいヘテロ原子は、Ｎ、Ｏ、及びＳである。好ましいヘテロシクロアルキル基は、モルホリノ、チオモルホリノ、ピペリジニル、ピペラジニル、ホモピペリジニル、ホモピペラジニル、ホモモルホリノ、ホモチオモルホリノ、ピローロジニル（ｐｙｒｒｏｌｏｄｉｎｙｌ）、テトラヒドロオキサゾリル、テトラヒドロイミダゾリル、テトラヒドロチアゾリル、テトラヒドロイソオキサゾリル、テトラヒドロピラゾリルを含む。

本明細書において他に定義されない限り、アリール基は、少なくとも１つのアリール環を含む任意の炭化水素環構造を意味する。好ましいアリール環は、約６〜約２０の環炭素を含む。特に好ましいアリール環は、フェニル、ナフチニル、アントラセニル、及びフェナントレニルを含む。

本明細書において他に定義されない限り、ヘテロアリール基は、少なくとも１つの不飽和環を含む環状成分であり、その環は、前記が炭素原子と非炭素原子とから成る。前記環システムは約１〜約４つの環を含む。炭素原子数は、１〜約１２までの範囲が好ましく、好ましくは１〜約６であり、環員の総数は、３〜約１５まで変わり、約３〜約８までが好ましい。環の好ましいヘテロ原子は、Ｎ、Ｏ、及びＳである。好ましいヘテロアリール基部分は、ピラゾリル、チオフェニル、ピリジル、イミダゾリル、テトラゾリル、ピリジル、ピリミジニル、プリニル、キナゾリニル、キノキサリニル、ベンジミダゾリル、ベンゾチオフェニル等を含む。

本明細書において他に定義されない限り、ある部分が、例えばヘテロアリールアルキル（ヘテロアリール及びアルキル）、アラルキル（アリール及びアルキル）等のようにある部分が化合物部分として定義される場合、それぞれのサブ部分（ｓｕｂ−ｍｏｉｅｔｉｅｓ）は本明細書において定義されたものである。

本明細書において他に定義されない限り、電子求引基は、シアノ基又はイソシアナト基等の、電荷を結合する炭素原子から引き離す基である。注目すべき他の電子求引性基は、電気陰性度が炭素の電気陰性度より大きいもの、例えば、ハロゲン基、ニトロ基、又は１若しくはそれ以上のシアノ基、イソチオシアナト基、ニトロ基、若しくはハロゲン基でオルト位又はパラ位置換されたフェニル基を含む。

本明細書において他に定義されない限り、ハロゲン及びハロという用語は、それらの通常の意味を有する。好ましいハロ（ハロゲン）置換基は、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩである。

前述の選択的置換基は、本明細書において他に定義されない限り、望ましい特性に依存した適切な置換基である。ハロゲン（Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ）、アルキル、アルケニル、及アルキニル部分、ＮＯ_２、ＮＨ_３（置換された又は未置換の）、酸成分（例えば−ＣＯ_２Ｈ、−ＯＳＯ_３Ｈ_２等）、ヘテロシクロアルキル部分、ヘテロアリール部分、アリール部分等が含まれる。

前述したすべての化学式における波線（〜）は、５’−リン酸塩の酸素又は硫黄への結合を示唆する。リン酸塩保護基は、米国特許第５、７６０、２０９号明細書、米国特許第５、６１４、６２１号明細書、米国特許第６、０５１、６９９号明細書、米国特許第６、０２０、４７５号明細書、米国特許第６、３２６、４７８号明細書、米国特許第６、１６９、１７７号明細書、米国特許第６、１２１、４３７号明細書、米国特許第６、４６５、６２８号明細書に記載されたものを含み、これらの開示はそれぞれ本明細書に全体として組み込まれるものである。

オリゴマー合成
修飾された及び非修飾のヌクレオシドのオリゴマー化は、ＤＮＡの文献上の方法（ＰｒｏｔｏｃｏｌｓｆｏｒＯｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓａｎｄＡｎａｌｏｇｓ、Ｅｄ．Ａｇｒａｗａｌ（１９９３），ＨｕｍａｎａＰｒｅｓｓ）及び／又は必要に応じてＲＮＡ合成（Ｓｃａｒｉｎｇｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ（２００１），２３、２０６−２１７，Ｇａｉｔｅｔａｌ．，ＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｏｆＣｈｅｍｉｃａｌｌｙｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄＲＮＡｉｎＲＮＡ：ＰｒｏｔｅｉｎＩｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ，Ｅｄ．Ｓｍｉｔｈ（１９９８），１−３６．Ｇａｌｌｏｅｔａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ（２００１），５７，５７０７−５７１３）に従って成される。さらに本発明のオリゴマー化合物を合成するためのの特別な手順が下記の実施例に図示されている。

本発明に従って使用されるオリゴマー化合物は、固相合成の既知技術により簡便且つ規定どおりに生成され得る。そのような合成装置は、例えば、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ、カリフォルニア州）などの複数の製造元から販売されている。当業者に既知である、そのような合成に対する任意の他の方法が、追加的に又は代替的に使用される。ホスホロチオエート及びアルキル化誘導体等のオリゴヌクレオチドを調整する同様の技術の使用方法については既知である。

本発明はまた、少なくとも１つの２’−Ｏ−保護ヌクレオシドを取り込みオリゴマー化合物の調整にも有用である。取り込み更に適切な脱保護を行った後、２’−Ｏ−保護ヌクレオシドは、取り込み位置でリボヌクレオシドに変換される。最終オリゴマー化合物の２−リボヌクレオシド単位の数及び位置は、任意の位置で１から変わりえるものであるか、或いはこの方法は、完全な２’−ＯＨ修飾オリゴマー化合物となるまで調整するために使用され得る。オリゴマー化合物の合成に従った全ての２’−Ｏ−保護基が本発明において含まれる。一般に保護されたヌクレオシドは、例えばコハク酸塩のリンカーにより固体担持に結合される。その後このオリゴヌクレオチドは、５’−末端ヒドロキシル基の脱保護化、さらなるヌクレオシド単位のカップリング、キャッピング、及び酸化（代替的に硫化）の繰り返しサイクルにより延長される。より頻繁に使用される合成方法において、完成されたオリゴヌクレオチドは、アンモニア溶液を用いた処理によるリン酸塩保護基及び環外アミノ保護基の除去により、固体担持から切断される。その後さらなる脱保護処理が２’−ヒドロキシ基を保護するために使用されるより特定化された保護基を除去するのに通常必要とされ、それにより完全に脱保護化されたオリゴヌクレオチドが得られる。

多数の２’−Ｏ−保護基は、オリゴリボヌクレオチドの合成に使用されてきたが、効果的な基が発見するまでには何年もかかった。効果的な２’−Ｏ−保護基の要点は、２’−Ｏ位置に選択的に導入され得ること及び合成後望ましくない副生成物形成を伴わず簡単に除去され得ることにある。前記保護基はまた、オリゴヌクレオチド合成に必要な通常の脱保護、カップリング、及びキャッピング処理に非反応性であることを要する。当初、オリゴリボヌクレオチド合成に使用された保護基のいくつかは、テトラヒドロピラン−１−イル及び４−メトキシテトラヒドロピラン−４−イルを含んでいた。これらの２つの保護基は、５’−Ｏ−保護基の全てと競合しない為、修飾された保護基は、例えば１−（２−フルオロフェニル）−４−メトキシピペリジン−４−イル（Ｆｐｍｐ）等の５’−ＤＭＴ基と共に使用されていた。Ｒｅｅｓｅは、多くのピペリジン誘導体（Ｆｐｍｐ類似物）を特定し、それらは、１−［（クロロ−４−メチル）フェニル］−４’−メトキシピペリジン−４−イルを含むオリゴリボヌクレオチドの合成に有益であることを確認した（Ｒｅｅｓｅｅｔａｌ．、ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔ．、１９８６、（２７）、２２９１）。別の手法は、標準５’−ＤＭＴ（ジメトキシトリチル）基を例えばレブリニル基及び９−フルオレニルメトキシカルボニル等の非酸性条件下で除去される保護基で置換することであった。そのような保護基によって、オリゴリボヌクレオチド合成における酸性不安定性２’−保護基の使用が可能になる。より広範囲で使用され、当初、オリゴリボヌクレオチドの合成に使用された保護基は、ｔ−ブチルジメチルシリル基であった（Ｏｇｉｌｖｉｅｅｔａｌ．，ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔ．，１９７４，２８６１；Ｈａｋｉｍｅｌａｈｉｅｔａｌ．，ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔ．，１９８１，（２２），２５４３、及びＪｏｎｅｓｅｔａｌ．，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．ＰｅｒｋｉｎＩ．，２７６２）。前記２’−Ｏ−保護基は、その除去に特殊な試薬を要するものであり、例えば、ｔ−ブチルジメチルシリル基は、通常、他の切断／脱保護化処理全ての後で、オリゴマー化合物をフッ化テトラブチルアンモニウム（ＴＢＡＦ）で処理することにより除去される。

あるの研究者のグループは、多数の２’−Ｏ−保護基について試験した（Ｐｉｔｓｃｈ、Ｓ．、Ｃｈｉｍｉａ、２００１、（５５）、３２０−３２４）。このグループは、フッ化物不安定性及び光解離性保護基が穏やかな条件下で除去されることを見出した。試験された１つの光解離性保護基は、［２−（ニトロベンジル）オキシ］メチル（ｎｂｍ）保護基であった（Ｓｃｈｗａｒｔｚｅｔａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，１９９２、（２），１０１９）。分析された他の保護基は、構造的に関連したホルムアルデヒドアセタール誘導体の多数の２’−Ｏ−保護基を含んでいた。また２’−Ｏ−［（トリイソプロピルシリル）オキシ］メチル（２’−Ｏ−ＣＨ_２−Ｏ−Ｓｉ（ｉＰｒ）_３、ＴＯＭ）を含む２’−Ｏ−アルキル化ヌクレオシドホスホルアミダイトを調整するための多数の関連保護基が調整された。ＴＯＭ基に対して直角に使用されるために調整したある２’−Ｏ−保護基は、２’−Ｏ−［（Ｒ）−１−（２−ニトロフェニル）エチルオキシ）メチル］（（Ｒ）−ｍｎｂｍ））であった。

フッ化物不安定性５’−Ｏ−保護基（酸性不安定性ではない）及び酸性不安定性２’−Ｏ−保護基を使用するための別の手法が報告されている（Ｓｃａｒｉｎｇｅ、ＳｔｅｐｈｅｎＡ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ、２００１、（２３）２０６−２１７）。多数の可能なシリルエーテルが５’−Ｏ−保護基のために試験され、多数のアセタール及びオルトエステルが２’−Ｏ−保護基のために試験された。保護計画で最良の結果をもたらしたものは、５’−Ｏ−シリルエーテル−２’−ＡＣＥ（５’−Ｏ−ビス（トリメチルシロキシ）シクロドデシルオキシシリルエーテル（ＤＯＤ）−２’−Ｏ−ビス（２−アセトキシエトキシ）メチル）（ＡＣＥ）であった。この手法は、ＲＮＡ／ＤＮＡ合成に通常使用されない異なる試薬を必要とする修飾ホスホアミダイトの合成方法を使用する。

多くの研究がオリゴリボヌクレオチドの合成に注目してきたが、現在商業的に使用されている主要なＲＮＡ合成手法は、５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）、５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｏ−［１（２−フルオロフェニル）−４−メトキシピペリジン−４−イル］（ＦＰＭＰ）、２’−Ｏ−［（トリイソプロピルシリル）オキシ］メチル（２’−Ｏ−ＣＨ_２−Ｏ−Ｓｉ（ｉＰｒ）_３）（ＴＯＭ）、５’−Ｏ−シリルエーテル−２’ＡＣＥ（５’−Ｏ−ビス（トリメチルシルオキシ）シクロドデシロキシシリルエーテル（ＤＯＤ）−２’−Ｏ−ビス（２−アセトキシエトキシ）メチル（ＡＣＥ）を含む。ＲＮＡ製品を現在販売している主要な会社の一部のリストは、ＰｉｅｒｃｅＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＤｈａｒｍａｃｏｎＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｃ．、ＡｍｅｒｉＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓＩｎｃ．、及びＩｎｔｅｇｒａｔｅｄＤＮＡＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ．を含む。その中の一社であるＰｒｉｎｃｅｔｏｎＳｅｐａｒａｔｉｏｎｓは、特にＴＯＭ及びＴＢＤＭＳの親和力によりカップリング回数を減少させると宣伝しているＲＮＡ合成活性化剤を製造している。そのような活性化剤は、本発明に従ったものである。

商業的なＲＮＡ合成に使用されている主要な基は、
ＴＢＤＭＳ＝５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリル、
ＴＯＭ＝２’−Ｏ−［（トリイソプロピルシリル）オキシ］メチル、
ＤＯＤ／ＡＣＥ＝５’−Ｏ−ビス（トリメチルシルオキシ）シクロドデシロキシシリ
ルエーテル−２’−Ｏ−ビス（２−アセトキシエトキシ）メチル
ＦＰＭＰ＝５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｏ−［１（２−フルオロフェニル）−４
−メトキシピペリジン−４−イル］
である。

上述の全ＲＮＡ合成手法は、本発明に従ったものである。例えばある手法から５’−保護基を用い、また別の手法から２’−Ｏ−保護基を用いるなど、上述の複合型手法もまた、本発明に従ったものである。

リボヌクレオチド、及び少なくとも１つの組み込まれたリボヌクレオシドを有するオリゴマー化合物の調整及びこれら二つの両極端の間で定まる可能な立体配置は、本発明により包含される。相当するオリゴマー化合物は、相補的領域を有するオリゴリボヌクレオチドを含むさらなるオリゴマー化合物とハイブリダイズされ、二重鎖（複製）オリゴマー化合物を形成する。そのような二重鎖オリゴヌクレオチド部分は、標的の発現を調節し、翻訳及びアンチセンス機構を通じたＲＮＡプロセシングを制御することが当業者において示されている。さらに、二重鎖部分は、化学修飾を受けやすい可能性がある（Ｆｉｒｅｅｔａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ、１９９８、３９１、８０６−８１１；ＴｉｍｍｏｎｓａｎｄＦｉｒｅ、Ｎａｔｕｒｅ１９９８、３９５、８５４；Ｔｉｍｍｏｎｓｅｔａｌ．、Ｇｅｎｅ、２００１、２６３、１０３−１１２；Ｔａｂａｒａｅｔａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９０、２８２、４３０−４３１；Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙｅｔａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９８、９５、１５５０２−１５５０７；Ｔｕｓｃｈｌｅｔａｌ．、ＧｅｎｅｓＤｅｖ．、１９９９、１、３１９１−３１９７；Ｅｌｂａｓｈｉｒｅｔａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ、２００１、４１１、４９４−４９８；Ｅｌｂａｓｈｉｒｅｔａｌ．、ＧｅｎｅｓＤｅｖ．、２００１、１５、１８８−２００）。例えば、そのような二重鎖部分は、標的に対する複製のアンチセンス鎖の古典的ハイブリダイゼーションにより標的を阻害し、それにより標的の酵素性崩壊を誘発することが示されている（Ｔｉｊｓｔｅｒｍａｎｅｔａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００２、２９５、６４９−６９７）。

本発明のオリゴマー化合物の調整方法はまた、創薬及び標的妥当性確認（ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ）の領域で使用され得る。本発明は、タンパク質と病状、表現型、又は疾病と間に存在する関係を解明するための創薬の取り組みにおいて、本明細書において同定されたオリゴマー化合物及び好ましい標的を含む。これらの方法は、標的ペプチドの検出又は調節を含み、試料、組織、細胞、又は器官を本発明のオリゴマー化合物と接触させる工程、処理後ある時点において標的及び／又は関連した表現型の核酸又はタンパク質レベル又は化学指標を測定する工程、及び選択的に測定値を未処理の対照試料又は本発明のさらなるオリゴマー化合物で処理した試料と比較する工程を含む。これらの方法はまた、標的の妥当性を確認する方法に対して未知の遺伝子の機能を決定するため、又は特定の病気、病状、又は表現型を治療又は阻害するために標的としての特定遺伝子生成物の妥当性を決定するために、他の実験と並行して又は組み合わせて行わうことが可能である。

ＲＮＡｉ活性に対するヌクレオシド修飾の効果は、既存の文献（Ｅｌｂａｓｈｉｒｅｔａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ（２００１）、４１１、４９４−４９８；Ｎｉｓｈｉｋｕｒａｅｔａｌ．、Ｃｅｌｌ（２００１）、１０７、４１５−４１６；及びＢａｓｓｅｔａｌ．、Ｃｅｌｌ（２０００）、１０１、２３５−２３８）に従い評価される。

本発明の標的
アンチセンスオリゴマー化合物を特定の核酸分子に対して"標的化すること"は、本発明の文脈において多段階処理方法であり得る。この方法は、通常標的核酸でその機能が調節される核酸の特定に始まる。この標的核酸は、例えば、細胞遺伝子（又はその遺伝子から転写されるｍＲＮＡ）であり、その表現型が特定の疾患又は病理性状態、又は感染剤からの核酸分子と結合する。

標的化方法はまた、アンチセンス相互作用する標的核酸内の少なくとも１つの標的領域、断片、又は部位の決定を通常含み、その相互作用では、望ましい効果、例えば発現の調節が得られる。本発明の範囲内において、"領域"という用語は、少なくとも１つの同定可能な構造、機能、特性を有する標的核酸の部位として定義される。標的核酸の領域内に断片がある。"断片"は、標的核酸内の領域の小さな部位又下位部位として定義される。本発明において使用される"部位"は、核酸内の位置として定義される。領域、断片、及び部位という用語はまた、本発明のオリゴマー化合物、例えば３つの分離した断片を持つギャップトオリゴマー化合物を記載するのに使用される。

翻訳開始コドンは、典型的に５’−ＡＵＧ（転写されたｍＲＮＡ分子において；対応するＤＮＡ分子の５’−ＡＵＧ）であり、翻訳開始コドンはまた、"ＡＵＧコドン""開始コドン""ＡＵＧ開始コドン"として言及される。少数の遺伝子は、５’−ＧＵＧ、５’−ＵＵＧ、又は５’−ＣＵＧを有する翻訳開始コドンを持ち、５’−ＡＵＡ、５’−ＡＣＧ、及び５’−ＣＵＧは生体内で機能することが示されている。このように、"翻訳開始コドン"及び"開始コドン"は、多くのコドン配列を含み、各場合において開始剤のアミノ酸は、典型的にメチオニン（真核生物）又はホルミルメチオニン（原核生物）である。当業者に既知の真核及び原核生物の遺伝子は２つ若しくはそれ以上の代替開始コドンを持つ可能性があり、特定の細胞タイプ又は組織、又は一連の特定条件下における翻訳開始に利用されることは当業者に既知のことである。本発明の文脈において、"開始コドン"及び "翻訳開始コドン"は、生体内で使用され、コドン配列とは無関係に核酸標的をエンコードする遺伝子から転写されたｍＲＮＡの翻訳を開始するコドン又は複数のコドンである。遺伝子の翻訳終止コドン（又は"停止コドン"）は３つの配列の内の１つ、つまり、５’−ＵＡＡ、５’−ＵＡＧ、５’−ＵＧＡ（対応するＤＮＡ配列は、それぞれ５’−ＴＡＡ、５’−ＴＡＧ、及び５’−ＴＧＡである）を持つ可能性があることも当業者に既知である。

"開始コドン領域"及び"翻訳開始コドン領域"という用語は、ｍＲＮＡ又は翻訳開始コドンから５’又は３’方向のいずれかに連続する約２５〜約５０のヌクレオチドを含む遺伝子の部位のことである。同様に、"停止コドン領域"及び"翻訳終止コドン領域"という用語は、ｍＲＮＡ又は翻訳終止コドンから５’又は３’方向のいずれかに連続する約２５〜約５０のヌクレオチドを含む遺伝子の部位のことである。結果的に、"開始コドン領域"（又は"翻訳開始コドン領域"）及び"停止コドン領域"（又は"翻訳終止コドン領域"）は、本発明のアンチセンスオリゴマー化合物で効果的に標的化された全領域である。

オープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）又は"コード領域"は、翻訳開始コドンと翻訳終止コドンとの間の領域に関することであることは当業者に既知であり、また効果的に標的化された領域である。本発明の文脈の範囲内において、好ましい領域は、遺伝子内の領域で遺伝子のオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）の翻訳開始又は翻訳終止コドンを含む。

他の標的領域は、５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）及び３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）を含み、前記５’非翻訳領域は、翻訳開始コドンから５’方向のｍＲＮＡの部位として称されることは当業者に既知であり、従ってｍＲＮＡの５’キャップ部位と翻訳開始コドン（又は遺伝子上の対応するヌクレオチド）との間のヌクレオチドを含むものであり、前記３’非翻訳領域は、翻訳終止コドンから５’方向のｍＲＮＡの部位として称されることは当業者に既知であり、従ってｍＲＮＡの翻訳終止コドンと３’末端（又は遺伝子上の対応するヌクレオチド）との間のヌクレオチドを含むものである。前記ｍＲＮＡの５’キャップ部位は、５’−５’トリホスフェート結合を通してｍＲＮＡの５’大部分の残基に結合したＮ７ーメチル化グアノシン残基を含む。前記ｍＲＮＡの５’キャップ領域は、５’キャップ構造それ自体をこのキャップ部位に隣接する最初の５０のヌクレオチドと同様に含むと考えられている。５’キャップ領域を標的化することがまた好まれる。

真核生物のｍＲＮＡ転写の中には、直接翻訳されるものもあるが、多くは１つ若しくはそれ以上の"イントロン"として知られる転写物から翻訳前に切断される領域を含む。"エクソン"として知られる残りの領域（従って翻訳される）は、スプライスされ連続したｍＲＮＡ配列を形成する。スプライス部位、すなわち、イントロン−エクソン接合又はエクソン−イントロン接合を標的化することはまた、異常スプライシングが病気の原因である状況又は特定のスプライス生成物の過剰生産が病気の原因である状況において、特に有益である。再配列又は欠損を原因とする異常融合接合はまた、好まれる標的部位である。異なる遺伝子源から２つ（若しくはそれ以上）のｍＲＮＡのスプライシング過程を通して生成されたｍＲＮＡ転写物は、"融合転写物"として知られる。イントロンは、例えばＤＮＡ又はｍＲＮＡ前駆体に対し標的化したアンチセンスオリゴマー化合物を使用することにより効果的に標的化され得ることもまた知られる。

別のＲＮＡ転写物がＤＮＡの同一ゲノム領域から生産され得ることも当業者に既知である。この異種の転写物は、通常"変異体"として知られる。より具体的には、"ｍＲＮＡ前駆体変異体"は、同一ゲノムＤＮＡから生産され、同一ゲノムＤＮＡから生産される他の転写物と開始又は停止位置において異なり、イントロン領域及びエクソン領域の両方を含む転写物である。１若しくはそれ以上のエクソン又はイントロン領域、それら一部の切断において、ｍＲＮＡ前駆体変異体は、小型ｍＲＮＡを生成する。結果として、ｍＲＮＡ変異体は、加工されたｍＲＮＡ前駆体であり、特異的ｍＲＮＡ前駆体変異体各々は、スプライシングの結果として特異的ｍＲＮＡ変異体を常に生成しなければならない。これらのｍＲＮＡ変異体はまた、"スプライス変異体代替物"として知られる。ｍＲＮＡ変異体のスプライシングが行われない場合、ｍＲＮＡ前駆体変異体は、ｍＲＮＡ前駆体と同一である。

翻訳を開始又は終止するために他のシグナルを使用して変異体が生成され得ること、及びｍＲＮＡ前駆体及びｍＲＮＡが２以上の開始コドン又は終止コドンを持ち得ることは当業者に既知である。他の開始コドンを使用するｍＲＮＡ前駆体又はｍＲＮＡ由来の変異体は、ｍＲＮＡ前駆体又はｍＲＮＡの"開始変異体代替物"として知られる。他の終止コドンを使用するそれらの転写物は、ｍＲＮＡ前駆体又はｍＲＮＡの"終止変異体代替物"として知られる。他の終止変異体の１つの具体的なタイプは、"ポリＡ変異体"であり、そこにおいて生成される複数の転写物は、転写機構によって"ポリＡ終止シグナル"の１つを代替的に選択することによりもたらされ、従って固有のポリＡ部位において終わる転写物を生成する。本発明の範囲内である本明細書において記載された変異体のタイプはまた、好ましい核酸標的である。

好ましいアンチセンスオリゴマー化合物がハイブリダイズする標的核酸上の位置は、本明細書の下記に"好まれる標的断片"として言及される。本明細書において使用される"好ましい標的断片"という用語は、活性アンチセンスオリゴマー化合物の標的部位の少なくとも８−核酸塩基部位として定義される。理論に縛られることなく、これらの標的断片はハイブリダイゼーションのために標的核酸の接近可能な部位であると現在信じられている。

好ましいアンチセンスオリゴマー化合物の例は、例えば細胞遺伝子又は細胞遺伝子から転写されたｍＲＮＡなどの標的核酸の５’末端から少なくとも８つ連続する核酸塩基を含むオリゴマー化合物を含む（残りの核酸塩基は、同一のオリゴヌクレオチドの連続鎖で、特異的に標的核酸にハイブリダイズするアンチセンス化合物の５’末端の上流から直接始まり、このオリゴヌクレオチドが約８〜約８０のヌクレオチドを含むまで続く）。同様に好ましいアンチセンスオリゴマー化合物は、オリゴヌクレオチド配列により表され、その配列は、図示した好ましいアンチセンス化合物の中の１つの３’末端から少なくとも８つの連続する核酸塩基を含むものである（残りの核酸塩基は、同一のオリゴヌクレオチドの連続的鎖で、特異的に標的核酸にハイブリダイズするアンチセンス化合物の３’末端の下流から直接始まり、このオリゴヌクレオチドが約８〜約８０のヌクレオチドを含むまで続く）。本明細書において図示した好ましいアンチセンス化合物分野の当業者であれば、さらに好まれるアンチセンス化合物を特定できるであろう。

一旦１若しくはそれ以上の標的領域、断片、又は部位が特定されると、アンチセンスオリゴマー化合物は、選択され、この化合物は、標的に対し十分相補的で、すなわち、十分にハイブリダイズする且つ十分な特異性を持ち、望ましい効果を与える。

本発明の１実施形態に従うと、一連の好まれる核酸の組成物は、本発明のアンチセンスオリゴマー化合物を含み、二本鎖を形成し、それらの相補体は、特異的標的又は標的に合わせ設計され得る。鎖の末端は、１つ若しくはそれ以上の天然又は修飾された核酸を加え突出を形成する。二本鎖のセンス鎖は、アンチセンス鎖の相補鎖としてその後設計され、合成され、また末端の一方への修飾又は付加を含む。例えば、１つの実施例において、二本鎖の両方の鎖は、中心核酸塩基に対して相補的で、各々の鎖は片側の端又は両端において突出を持つ。

例えば、ＣＧＡＧＡＧＧＣＧＧＡＣＧＧＧＡＣＣＧ配列を融資、２つの核酸塩基突出デオキシチミジン（ｄＴ）を有するアンチセンスオリゴマー化合物を含む二本鎖は、以下の構造を持つ。

二本鎖のＲＮＡ鎖は、本明細書において開示された方法により合成されるか、又は例えばＤｈａｒｍａｃｏｎＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｃ．（Ｌａｆａｙｅｔｔｅ、コロラド州）等の種々のＲＮＡ合成会社から入手可能である。一旦合成されると、相補鎖がアニーリングされる。一本鎖が一定量に分割され、５０μＭ濃度に希釈される。一旦希釈されると、３０μＬの各鎖が１５μＬのアニーリング用緩衝液の５Ｘ溶液と混合される。緩衝液の最終濃度は、１００ｍＭ酢酸カリウム、３０ｍＭＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、ｐＨ７．４、及び２ｍＭ酢酸マグネシウムである。最終容量は、７５μＬである。この溶液は、９０℃で１分間インキュベートされ、その後１５秒間遠心分離機にかけられる。チューブは、１時間３７℃放置し、この時点でｄｓＲＮＡ二本鎖が実験で使用される。ｄｓＲＮＡ化合物の最終濃度は２０μＭである。この溶液は、（−２０℃で）凍結保存され、５回まで凍結融解され得る。

調整された時点において、所望の合成二本鎖の標的発現調節能を評価する。細胞が８０％飽和状態に達した場合、それらは、本発明の少なくとも１つのオリゴマー化合物を含む合成された二本鎖と共に処理する。９６ウェルのプレート中の細胞成長に関しては、ウェルを２００μＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭ−１血清使用量低減培地（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）で洗浄し、その後１３０μＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭ−１で１２μｇ／ｍＬのＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）を含むもので処理し、所望のｄｓＲＮＡ化合物が最終濃度２００ｎＭで得られる。５時間の処理後、培地を新しい培地に交換する。細胞は、処理後１６時間後に回収し、その時点でＲＮＡを単離し、標的の減少をＲＴ−ＰＣＲにより測定した。

さらなる実施形態において、本明細書において特定される"好まれる標的断片"は、標的発現を調節する更なるオリゴマー化合物のスクリーンにおいて使用される。"モジュレータ"は、好ましい標的断片に相補的な少なくとも８−核酸塩基部位において含まれる標的をエンコードする核酸分子の発現を減少又は増加させるオリゴマー化合物である。スクリーニング方法は、標的をエンコードする核酸分子の好ましい標的断片を１若しくはそれ以上のモジュレータ候補と接触させる工程と、標的をエンコードする核酸分子の発現を増減させる１つ若しくはそれ以上のモジュレータ候補を選択する工程とを含む。一旦モジュレータ候補又はモジュレータが標的をエンコードする核酸分子発現を調節できることが示されると（例えば減少させるか又は増加させるかのどちらか）、前記モジュレータは、その後、標的機能をさらに調査的研究するために使用されるか、若しくは本発明に従って、研究、診断、又は治療基剤として使用される。

本発明の好ましい標的断片はまた、本発明の各相補的アンチセンスオリゴマー化合物と混合することが可能であり、安定したオリゴヌクレオチド（二本鎖）が形成される。

ハイブリダイゼーション
本発明の文中における"ハイブリダイゼーション"は、２つの配列が十分な塩基相補性である場合に生じ、二本鎖領域を形成する。この２つの配列源は、合成的なもの又は天然的なものであっても良く、一本鎖においてその鎖が自己相補的な領域を有する場合に生じる可能性がある。本発明において、対合の好ましいメカニズムは、ワトソン・クリック型、フーグスティーン型、又は逆フーグスティーン型の水素結合であって、相補的なヌクレオシド間又はオリゴマー化合物の鎖のヌクレオチド塩基間（核酸塩基）、又はオリゴマー化合物と標的核酸との間の水素結合が関与する。例えば、アデニン及びチミンは、水素結合の形成を通して対合する相補的核酸塩基である。ハイブリダイゼーションは、様々な条件で起こり得る。

アンチセンスオリゴマー化合物は、この化合物の標的核酸に対する結合が標的核酸の通常の機能に干渉する場合に特にハイブリダイズ可能であり、活性喪失を引き起こし、十分な相補性があり、アンチセンスオリゴマー化合物の非標的核酸配列への非特異的結合で特異的結合が望まれる条件下、すなわち生体内アッセイ又は治療の場合における生理学的な条件下及びアッセイが生体内アッセイでなされる条件下での非特異的結合を回避する。

本発明において、"厳密なハイブリダイゼーション条件"又は"厳密な条件"という語句は、本発明のオリゴマー化合物がその標的配列（しかしの最小数の他の配列）にハイブリダイズする条件のことである。厳密な条件は、配列依存性であり、異なる条件で変わり、本発明の文中における"厳密条件"は、オリゴマー化合物が標的配列にハイブリダイズする条件であり、オリゴマー化合物の性質及び組成によって決定され、アッセイにより調査される。

本明細書において使用される"相補的"は、２つの核酸塩基の正確な対合能力に言及するものであり、この２つの核酸塩基の位置には無関係である。例えば、オリゴマー化合物のある特定位置にある核酸が標的核酸の特定位置にある核酸と水素結合できる場合、標的核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はオリゴヌクレオチド分子であり、つまりオリゴヌクレオチドと標的核酸との間水素結合の位置は、相補的な位置だと考えられる。オリゴマー化合物及びさらなるＤＮＡ、ＲＮＡ、又はオリゴヌクレオチド分子は、各分子における十分な数の相補的位置が互いに水素結合可能な核酸に占められる場合、互いに相補的である。このように、"特異的にハイブリダイズ可能な"及び"相補的"という用語は、十分な程度の正確な対合又は十分な数の核酸塩基に対する相補性があり安定で特異的結合がオリゴヌクレオチドと標的核酸との間に起こることを示唆するために使用される。

アンチセンスオリゴマー化合物配列がその標的核酸配列に対し特異的にハイブリダイズするためには１００％相補的である必要はないということは、当業者に理解される。さらに、オリゴヌクレオチドは、１つ若しくはそれ以上の断片に対してハイブリダイズし、介在又は隣接断片は、ハイブリダイゼーション時に関与しない（例えば、ループ構造又はヘアピン構造）。本発明のアンチセンスオリゴマー化合物は標的核酸内の標的領域に対して少なくとも７０％の配列相補性を含むことが好ましく、９０％の配列相補性がより好ましく、標的とされる標的核酸配列内の標的領域に対する９５％の配列相補性がさらに好まれる。例えば、アンチセンスオリゴマー化合物であってそのアンチセンスオリゴマー化合物の２０個の核酸塩基中１８個が標的領域に対して相補的であるアンチセンスオリゴマー化合物は、従って特異的にハイブリダイズし、９０％の相補性を示す。本実施例において、残りの非相補的核酸塩基は、クラスター化されるているか、又は相補的核酸塩基と共に散在化し、お互いに又は相補的核酸塩基と隣接する必要はない。このように、アンチセンスオリゴマー化合物であって、標的核酸に対し完全に相補的な２つの領域が横にある４つの非相補的核酸塩基を有しする全長１８個の核酸塩基を有するアンチセンスオリゴマー化合物は、標的核酸に対し全体的に７７．８％の相補性があり、このように本発明の範囲内におさまるものである。アンチセンスオリゴマー化合物の標的核酸領域との相補性の百分率は、当業者に既知のＢＬＡＳＴプログラム（基礎的局所配列検索ツール）及びＰｏｗｅｒＢＬＡＳＴプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌｅｔａｌ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９９０、２１５、４０３−４１０；ＺｈａｎｇａｎｄＭａｄｄｅｎ、ＧｅｎｏｍｅＲｅｓ．、１９９７、７、６４９−６５６）を用いて簡易的に決定され得る。

スクリーニング及び標的保持
さらなる実施形態において、"好ましい標的断片"は、選択されたタンパク質の発現を調節するオリゴマー化合物追加のスクリーンにおいて使用される。"モジュレータ"は、標的断片に相補的な少なくとも８−核酸塩基部位において含まれるタンパク質をエンコードする核酸分子の発現を減少又は増加させるオリゴマー化合物である。スクリーニング方法は、タンパク質をエンコードする核酸分子の好まれる標的断片を１つ若しくはそれ以上のモジュレータ候補と接触させる工程と、タンパク質をエンコードする核酸分子の発現を増減させる１つ若しくはそれ以上のモジュレータ候補を選択する工程とを有する。一旦モジュレータ候補又はモジュレータがペプチドをエンコードする核酸分子発現を調節できること示されると（例えば減少させるか又は増加させるかのどちらか）、前記モジュレータは、その後ペプチドの機能のさらなる調査的研究において使用されるか若しくは本発明と共に研究、診断、又は治療基剤として使用される。

本発明の好ましい標的断片はまた、本発明の相補的なアンチセンスオリゴマーのそれぞれと結合し、安定した二本鎖オリゴヌクレオチドが形成される。そのような二本鎖オリゴヌクレオチド基は、アンチセンスメカニズムを通してＲＮＡプロセッシングと共に標的発現を調節し翻訳を規制することが当業者に示されている。さらに、二本鎖部分は、化学修飾を受けやすい可能性がある（Ｆｉｒｅｅｔａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ、１９９８、３９１、８０６−８１１；ＴｉｍｍｏｎｓａｎｄＦｉｒｅ、Ｎａｔｕｒｅ１９９８、３９５、８５４；Ｔｉｍｍｏｎｓｅｔａｌ．、Ｇｅｎｅ、２００１、２６３、１０３−１１２；Ｔａｂａｒａｅｔａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９８、２８２、）４３０−４３１；Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙｅｔａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９８９５、１５５０２−１５５０７；Ｔｕｓｃｈｌｅｔａｌ．、ＧｅｎｅｓＤｅｖ．、１９９９、１３、３１９１−３１９７；Ｅｌｂａｓｈｉｒｅｔａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ、２００１、４１１、４９４−４９８；Ｅｌｂａｓｈｉｒｅｔａｌ．、ＧｅｎｅｓＤｅｖ．２００１、１５、１８８−２００）。例えば、そのような二本鎖部分は、標的に対する二本鎖アンチセンス鎖の古典的ハイブリダイゼーションにより標的を阻害し、従って標的の酵素性分解を引き起こすことが示されている（Ｔｉｊｓｔｅｒｍａｎｅｔａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００２、２９５、６９４−６９７）。

本発明のオリゴマー化合物を含む組成物はまた、創薬及び標的保持の分野において使用され得る。本発明は、創薬の試みにおいて本明細書で特定されるオリゴマー化合物及び好ましい標的の使用方法を含み、タンパク質と病状、表現型、又は条件との間に存在する関係を解明するものである。これらの方法は、標的ペプチドの検出又は調節する工程を含み、試料、組織、細胞、又は器官を本発明のオリゴマー化合物と接触させる工程と、処理後の標的及び／又は関連した表現型の核酸又はタンパク質レベル又は化学指標の測定をする工程と、選択的に測定値を未処理の対照試料又は本発明のさらなるオリゴマー化合物で処理された試料と比較する工程とを含む。これらの方法はまた、他の実験と並行して又は組み合わせて行うことが可能であり、未知の遺伝子の機能を決定するか、又は特定の遺伝子生成物の治療又は特定の病気、条件、又は表現型の阻害対象としての有効性を決定するものである。

ＲＮＡｉ活性に対するヌクレオシドの修飾効果は、文献（Ｅｌｂａｓｈｉｒｅｔａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ（２００１）、４１１、４９４−４９８；Ｎｉｓｈｉｋｕｒａｅｔａｌ．、Ｃｅｌｌ（２００１）、１０７、４１５−４１６；及びＢａｓｓｅｔａｌ．、Ｃｅｌｌ（２０００）、１０１、２３５−２３８）によって評価される。

キット、研究、試薬、診断、及び治療
本発明のオリゴマー化合物の組成物は、診断、治療、及び予防用に並びに研究試薬及びキットとして利用され得る。さらに、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、強力な特異性で遺伝子発現を阻害することが可能であり、特定の機能を解明又は数々の生物学的経路の機能を見分けるために、しばしば当業者において使用されるものである。

キット及び診断における使用に関し、本発明の組成物は、単独、又は他のオリゴマー化合物又は治療剤との組み合わせにより微分解析及び／又は組み合わせ解析のツールとして使用されることが可能であり、ある部位の発現パターン、又は細胞及び組織内で発現される遺伝子の全相補体の解明をするものである。１つの限定されない例として、１つ若しくはそれ以上のアンチセンスオリゴマー化合物で処理した細胞又は組織内での発現パターンは、処理のなされていない対照細胞又は組織と比較され、生成されたパターンは、例えば、調べられる遺伝子の疾病関連性、情報伝達系、細胞局在、発現レベル、サイズ、構造、又は機能に関連するため遺伝子発現の微小差異レベルの分析がなされる。これらの分析は、刺激された又は刺激されない細胞に対して行われ得、発現パターンに影響する他の化合物及び／又はオリゴマー化合物の存在下又は非存在下で行われ得る。

当業者に既知の遺伝子発現分析方法の例は、ＤＮＡアレイ又はミクロアレイを含む（ＢｒａｚｍａａｎｄＶｉｌｏ、ＦＥＢＳＬｅｔｔ．、２０００、４８０、１７−２４；Ｃｅｌｉｓ、ｅｔａｌ．、ＦＥＢＳＬｅｔｔ．、２０００、４８０、２−１６）、ＳＡＧＥ（ｓｅｒｉａｌａｎａｌｙｓｉｓｏｆｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）（Ｍａｄｄｅｎ、ｅｔａｌ．、ＤｒｕｇＤｉｓｃｏｖ．Ｔｏｄａｙ、２０００、５、４１５−４２５）、ＲＥＡＤＳ（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｅｎｚｙｍｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｄｉｇｅｓｔｅｄｃＤＮＡｓ）（ＰｒａｓｈａｒａｎｄＷｅｉｓｓｍａｎ、ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．、１９９９、３０３、２５８−７２）、ＴＯＧＡ（ｔｏｔａｌｇｅｎｅｅｚｐｒｅｓｓｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓ）（Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅ、ｅｔａｌ．、ＦＥＢＳＬｅｔｔ．、２０００、４８０、２−１６；Ｊｕｎｇｂｌｕｔ、ｅｔａｌ．、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ、１９９９、２０、２１００−１０）、発現配列タグ（ＥＳＴ）配列（Ｃｅｌｉｓ、ｅｔａｌ．、ＦＥＢＳＬｅｔｔ．、２０００、４８０、２−１６；Ｌａｒｓｓｏｎ、ｅｔａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｔｈｅｃｈｎｏｌ．、２０００、８０、１４３−５７）、減法ＲＮＡフィンガープリント法（ＳｕＲＦ）（Ｆｕｃｈｓ、ｅｔａｌ．、Ｊ．ＣｅｌｌＢｉｏｃｈｅｍ．Ｓｕｐｐｌ．、１９９８、３１、２８６、９１−９８；Ｌａｒｓｏｎ、ｅｔｌ．、Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ、２０００、４１、２０３−２０８）、減法クローニング、ディファレンシャル・ディスプレイ（ＪｕｒｅｃｉｃａｎｄＢｅｌｍｏｎｔ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、２０００、３、３１６−２１）、比較ゲノムハイブリダイゼーション（Ｃａｒｕｌｌｉ、ｅｔａｌ．、Ｊ．ＣｅｌｌＢｉｏｃｈｅｍ．Ｓｕｐｐｌ．、１９９８、３１、２８６−９６）、ＦＩＳＨ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｉｎｓｉｔｕｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）テクニック（ＧｏｉｎｇａｎｄＧｕｓｔｅｒｓｏｎ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、１９９９、３５、１８９５−９０４）、及び質量分析法（Ｔｏ、Ｃｈｅｍ．ＨｉｇｈＴｈｒｏｕｇｈｐｕｔＳｃｒｅｅｎ、２０００、３、２３５−４１）。

本発明の組成物は、組成物中のオリゴマー化合物がタンパク質をエンコードする核酸にハイブリダイズするため、ある意味においては研究及び診断に有益である。例えば、有効なタンパク質阻害剤として本明細書において開示される有効性及び条件下でハイブリダイズすることが示されたオリゴヌクレオチドはまた、遺伝子増幅又は検出それぞれのための条件下で有効なプライマー又はプローブである。これらのプライマー及びプローブは、タンパク質をエンコードする核酸分子の特異的検出方法及び検出のため又はさらなる研究での使用のための核酸分子の増幅又において有益である。本発明の核酸を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド、特にプライマー及びプローブのハイブリダイゼーションは、当業者に既知の手段により検出され得る。そのような手段は、酵素のオリゴヌクレオチドへの結合、オリゴヌクレオチドの放射標識、又は任意の他の検出手段を含む。そのような検出手段で試料中の選択されたタンパク質レベルを検出する手段を使用するキットもまた、準備される。

アンチセンス方法の特異性及び選択性はまた、治療的使用のために当業者により利用される。アンチセンスオリゴマー化合物は、ヒトを含む動物の病状の治療における治療成分として使用されている。リボザイムを含むアンチセンスオリゴヌクレオチド薬は、安全に且つ効果的にヒトに投与され、数多くの臨床試験が現在行われている。アンチセンスオリゴマー化合物が有益な治療用モダリティで細胞、組織、及び動物、特にヒトの治療型（レジメ）において利用されるように構成されている有用な治療的モダリティーであるように確立されている。

治療に関し、疾病又は疾患があると疑われる動物、好ましくはヒトは、その疾病又は疾患が選択されたタンパク質の発現を調節することにより治療され得る場合、本発明と共に本発明の組成物を投与することにより治療される。例えば、非限定的な１実施例において、この方法は、治療的有効量のタンパク質阻害剤を治療の必要に応じて動物に投与する処置を含む。本発明のタンパク質阻害剤は、タンパク質の活性を阻害する或いはタンパク質の発現を効果的に阻害する。一実施形態において、動物におけるタンパク質の活性又は発現は、約１０％阻害される。動物におけるタンパク質の活性又は発現は、約３０％阻害されるのが好ましい。動物におけるタンパク質の活性又は発現は、約５０％若しくはそれ以上阻害されるのがさらに好ましい。

例えば、タンパク質の発現減少は、動物の血清、脂肪組織、又は肝臓若しくは任意の体液、組織、又は器官において測定される。分析中の体液、組織、又は器官内に含まれる細胞は、タンパク質をエンコードする核酸分子及び／又はタンパク質それ自体を含む。

本発明の組成物は、適切な薬学的に許容可能な希釈剤又は担体に有効量を加えることにより薬学的組成物において利用され得る。本発明の組成物及び方法の使用は、また予防的に有益である。

製剤
本発明の組成物はまた、混合され、カプセル化され、結合されるか、或いは他の分子、分子構造、又は、例えば、リポソーム、受容体標的化分子、経口性、直腸性、局所性、又は他の製剤などの化合物の混合物と結合され、摂取、分配、及び／又は吸収を助ける。代表的な米国特許でそのような摂取、分配、及び／又は吸収補助製剤の調製を教示しており、それらは、これらに限定されないが、米国特許第５，１０８，９２１号、第５，３５４，８４４号、第５，４１６，０１６号、第５，４５９，１２７号、第５，５２１，２９１号、第５，５４３，１５８号、第５，５４７，９３２号、第５，５８３，０２０号、第５，５９１，７２１号、第４，４２６，３３０号、第４，５３４，８９９号、第５，０１３，５５６号、第５，１０８，９２１号、第５，２１３，８０４号、第５，２２７，１７０号、第５，２６４，２２１号、第５，３５６，６３３号、第５，３９５，６１９号、第５，４１６，０１６号、第５，４１７，９７８号、第５，４６２，８５４号、第５，４６９，８５４号、第５，５１２，２９５号、第５，５２７，５２８号、第５，５３４，２５９号、第５，５４３，１５２号、第５，５５６，９４８号、第５，５８０，５７５号、及び第５，５９５，７５６号明細書を含み、これらの各々はこの参照により本明細書に組み込まれる。

本発明の組成物は、任意の薬学的に許容な塩、エステル、そのようなエステルの塩、任意の他の化合物の塩をヒトを含む動物に投与することを含み、生物学的に活性な代謝産物またはその残渣を提供することが（直接又は間接的に）可能である。従って、例えば、この開示はまた、本発明の組成物のプロドラッグ及び薬学的に許容可能な塩、そのようなプロドラッグの薬学的に許容な塩、並びに他の生物学的同等物に関する。"プロドラッグ"という用語は、非活性な形態に調整され、体内又はその細胞内において内因性酵素又は他の化学薬品、及び／又は条件の作用により活性な形態（すなわち薬物）に変換される治療剤を示すものである。特に、本発明のオリゴヌクレオチドのプロドッグバージョンは、Ｇｏｓｓｅｌｉｎらによる１９９３年１２月９日出願国際公報第９３／２４５１０号明細書、又はＩｍｂａｃｈらによる国際公報第９４／２６７６４号明細書及び米国特許第５、７７０、７１３号明細書において開示された方法に従って、ＳＡＴＥ［（Ｓ−アセチル−２−チオエチル）リン酸塩］誘導体として調整される。

"薬学的に許容な塩"という用語は、本発明のオリゴマー化合物の生理学的及び薬学的に許容な塩に言及するものであり、すなわち、親化合物の所望の生物活性を維持し、望ましくない毒物効果を与えない塩に言及する。オリゴヌクレオチドに関し、薬学的に許容な塩及びその使用方法の好まれる実施例は、さらに米国特許第６，２８７，８６０号明細書に記載され、この開示は本明細書に完全に組み込まれるものである。

本発明はまた、本発明の組成物を含む薬学的組成物及び製剤を含む。本発明の薬学的組成物は、数多くの方法により投与され、局所治療又は全身治療が望まれるのかどうか及び治療部位に依存する。投与は、局所的であっても良く（眼性、及び膣性及び直腸性送達を含む粘膜を含む）、肺性（例えば、粉末又はエアロゾールの吸入又は吹送になされるもの、噴霧器によるのを含む）、気管内、鼻腔内、表皮性、及び経皮性、経口性又は非経口性であっても良い。非経口投与は、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内、又は筋肉内注射若しくは注入を含み、或いは例えば髄腔内又は脳室内などの頭蓋内投与を含む。少なくとも１つの２’−Ｏ−メトキシエチル修飾を有するオリゴヌクレオチドは、経口投与に特に有益であると考えられる。局所投与用の薬学的組成物及び製剤は、経皮パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、ドロップ、坐薬、スプレー、液体、及び粉末を含む。従来の薬学的担体、水性、粉末及び油性基剤、増粘剤、及び同類のものは、必要であるか、あるいは望ましい。被覆コンドーム、グローブ等もまた有益であっても良い。

本発明の薬学的製剤は、簡便に投与単位形態で表されるものであり、医薬品工業において既知の従来技術に従って調整される。そのような技術は、有効成分を薬学的担体又は賦形剤と結合させる工程を含む。一般的に、前記製剤は、有効成分を液体担体又は粉砕された固体担体若しくはその両方と均質且つ密接に結合させることにより調整され、その後必要であれば、製品の成形を行う。

本発明の組成物はこれらに限定されないが、タブレット、カプセル、ゲルカプセル、液体シロップ、ソフトゲル、坐薬、及び浣腸等の任意の可能な多数投与形態に成型される。本発明の組成物はまた、水性、非水性、又は混合媒体中において懸濁物として成型される。懸濁水溶液は、さらに、その物質は例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール及び／又はデキストランを含む懸濁液の粘性を増大させる物質を含む。懸濁物はまた、安定剤を含むものであっても良い。

本発明の薬学的組成物は、これらに限定されるものではないが、溶液、エマルジョン、発泡体、及びリポソームを含有する製剤を含む。本発明の薬学的組成物及び製剤は、１つ以上の浸透促進剤、担体、賦形剤又は他の有効成分か非有効成分を含む。エマルジョンは、通常直径０．１μｍを超える液滴状で他方の液体に分散した液体の典型的異相系である。エマルジョンは、分散相及び有効医薬品に加え、追加成分を含むこともあり、水相又は油相の一方における溶液若しくはそれ自体で分離した相として存在する。ミクロエマルジョンは、本発明の実施形態として含まれる。エマルジョン及びその使用方法は当業者に既知であり、更に米国特許第６、２８７、８６０号明細書に記載されており、この開示は本明細書に完全に組み込まれる。

本発明の製剤は、リポソーム製剤を含む。本発明において使用される"リポソーム"という用語は、両親媒性脂質から成る小胞であり、その脂質は球状二重膜又は複数の二重膜に配列される。リポソームは、単層又は多重層小胞であり、そこにおいて親油性物質又は組成物が送達される水性内部から膜が形成される。カチオン性リポソームは、正電荷を持ったリポソームであり、負電荷を持ったＤＮＡ分子と相互作用し安定な錯体を形成すると考えられる。ＰＨ感知性又は負電荷を持ったリポソームは、ＤＮＡと錯体を形成するよりもＤＮＡをトラップしやすいと考えられる。カチオン性及び非カチオン性リポソーム両者は、細胞にＤＮＡを送達するために使用されている。

リポソームはまた、"立体的に安定化された"リポソームを含み、本明細書において使用されるその用語は、１若しくはそれ以上の特化された脂質を含むリポソームに言及し、その脂質がリポソームに取り込まれる際、そのような特別な脂質がないリポソームと比較して循環存続期間が長くなる。立体的に安定化されたリポソームの例は、リポソームの小胞を形成する脂質部位の部分が１若しくはそれ以上の糖脂質を含むか、或いは１若しくはそれ以上の例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分などの親水性ポリマーと共に誘導化されるものである。リポソーム及びその使用方法は、更に、米国特許第６，２８７，８６０号明細書に記載されており、この開示は本明細書に完全に組み込まれるものである。

本発明の薬学的製剤及び組成物はまた、界面活性剤を含むものであっても良い。医療品、製剤、及びエマルジョンにおける界面活性剤の用途は、当業者に既知である。界面活性剤及びその使用は、更に米国特許第６，２８７，８６０号明細書に記載されており、この開示は本明細書に完全に組み込まれるものである。

一実施形態において、本発明はさまざまな浸透促進剤を使用しており、核酸、特にオリゴヌクレオチドの効率的な送達に影響を与える。細胞膜全体の非親油性医薬品の拡散を促進することに加え、浸透促進剤も親油性医薬品の透過性を強化する。浸透促進剤は、５つの広範なカテゴリ、すなわち界面活性剤、脂肪酸、胆汁酸塩、キレート剤、及び非キレート性非界面活性剤のうちの１つに帰属するものとして分類される。浸透促進剤及びそれらの使用は更に米国特許第６，２８７，８６０号明細書に記載されており、この開示は本明細書に完全に組み込まれるものである。

当業者であれば、製剤がその意図された使用方法、すなわち投与経路に従い型通りに設計されることが認識されるであろう。

局所投与の好まれる製剤は、本発明のオリゴヌクレオチドが例えば脂質、リポソーム、脂肪酸、脂肪酸エステル、ステロイド、キレート剤及び界面活性剤などの局所的送達剤との混合物中に含まれるものを含む。好ましい脂質及びリポソームは、中性（例えばジオレオイルフォスフォチジルＤＯＰＥ、エタノールアミン、ジミリストイルフォスファチジルコリンＤＭＰＣ、ジステアロイルフォスファチジルコリン）、アニオン性（例えばジミリストイルフォスファチジルグリセリンＤＭＰＧ）、及びカチオン性（例えばジオレイルテトラメチルアミノプロピルＤＯＴＡＰ及びジオレオイルフォスフォチジルエタノールアミンＤＯＴＭＡ）のものを含む。

局所又は他の投与に関し、本発明のオリゴヌクレオチドは、リポソーム内でカプセル化されても良く、或いはそれに対し、特にカチオン性リポソームと錯体を形成しても良い。或いは、オリゴヌクレオチドは、脂質、特にカチオン性脂質と錯体を形成する。好ましい脂肪酸及びエステル及び薬学的に許容されるその塩の使用方法は、更に、米国特許第６，２８７，８６０号明細書に記載されており、この開示は本明細書に完全に組み込まれるものである。局所製剤は、１９９９年５月２０日に出願された米国特許第０９／３１５２９８号明細書に詳述されており、この開示はこの参照により本明細書に完全に組み込まれるものである。

経口投与のための組成物及び製剤は、粉末、顆粒、微粒子、ナノ粒子、懸濁液、又は水溶液又は非水性媒体、カプセル、ゲルカプセル、匂い袋、錠剤、又は小型錠剤を含む。増粘剤、香料、希釈剤、乳化剤、分散補助剤、又は結合剤が望ましい。好ましい経口製剤において、本発明のオリゴヌクレオチドは、１若しくはそれ以上の浸透促進剤界面活性剤及びキレート剤と共に投与される。好ましい界面活性剤は、脂肪酸及び／又はエステル若しくはその塩、胆汁酸及び／又はそれの塩を含む。好ましい胆汁酸／塩及び脂肪酸及びその使用方法は、更に、米国特許第６，２８７，８６０号明細書に記載されており、その開示は本明細書に完全に組み込まれるものである。また、浸透促進剤の組み合わせは、例えば、胆汁酸／塩と組み合わされた脂肪酸／塩が好ましい。特に好ましい組み合わせは、ラウリン酸、カプリン酸及びＵＤＣＡのナトリウム塩である。更なる浸透促進剤は、ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−２０−セチルエーテルを含む。本発明のオリゴヌクレオチドは、スプレー乾燥された粒子を含む顆粒形態で経口的に送達されるか、或いは錯体化して微粒子又はナノ粒子を形成する。オリゴヌクレオチド錯化剤及びその使用は、更に、米国特許第６、２８７、８６０号明細書に記載されており、その開示は本明細書に完全に組み込まれる。オリゴヌクレオチドの経口用製剤及びその調整法は、米国特許出願第０９／１０８、６７３号明細書（１９９８年７月１日出願）、米国特許出願第０９／３１５２９８号明細書（１９９９年５月２０日出願）、及び２００２年２月８日に出願された米国特許出願第１０／０７１、８２２号明細書に詳細に記載されており、これらの開示は各々この参照により本明細書に完全に組み込まれるものである。

非経口、鞘内、又は心室内投与のための組成物及び製剤は、滅菌水溶液を含むものであっても良く、緩衝液、希釈剤、及び他の適切な添加物を含んでいても良く、例えばこれらに限定されないが、浸透促進剤、担体化合物、及び他の薬学的に許容な担体若しくは賦形剤もまた含むものである。

本発明のいくつかの実施形態は、薬学的組成物を提供するものであり、１若しくはそれ以上の本発明の組成物、及び非アンチセンス機構によって機能する１若しくはそれ以上の他の化学療法薬を含む。そのような化学療法薬の例は、これらに限定されるものではないが、ダウノルビシン、ダウノマイシン、ダクチノマイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、エソルビシン（ｅｓｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ブレオマイシン、マフォスファミド（ｍａｆｏｓｆａｍｉｄｅ）、イホスファミド、シトシンアラビノシド、ビス−クロロエチルニトロスレア（ｃｈｌｏｒｏｅｔｈｙｌｎｉｔｒｏｓｕｒｅａ）、ブスルファン、マイトマイシンＣ、アクチノマイシンＤ、ミトラマイシン、プレドニソン、ヒドロキシプロゲステロン、テストステロン、タモキシフェン、ダカルバジン、プロカルバジン、ヘキサメチルメラミン、ペンタメチルメラミン、ミトキサントロ）、アムサクリン、クロラムブシル、メチルシクロヘキシルニトロスレア（ｍｅｔｈｙｌｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌｎｉｔｒｏｓｕｒｅａ）、ナイトロジェンマスタード、メルファラン、シクロホスファミド、６‐メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−アザシチジン、ヒドロキシ尿素、デオキシコホルマイシン、４−ヒドロキシペルオキシシクロホスホラミド、５−フルオロウラシル（５ＦＵ）、５‐フルオロデオキシウリジン（５−ＦＵｄＲ）、ＭＴＸ（ＭＴＸ）、コルヒチン、タキソール、ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド（ＶＰ−１６）、トリメトレキサート、イリノテカン、トポテカン（ｔｏｐｏｔｅｃａｎ）、ゲミシタビン（ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）、テニポシド、シスプラチン、及びジエチルスチルベストロール（ＤＥＳ）等の癌化学療法薬を含む。本発明の組成物と共に使用される際、そのような化学療法薬は、個別に（例えば５−ＦＵ及びオリゴヌクレオチド）、連続的に（例えば５−ＦＵ及びオリゴヌクレオチドに引き続きＭＴＸ及びオリゴヌクレオチド）、或いは１若しくはそれ以上のそのような化学療法薬と共に（例えば５−ＦＵ、ＭＴＸ、及びオリゴヌクレオチド又は５−ＦＵ、放射線療法、及びオリゴヌクレオチド）使用されても良い。抗炎症薬はまた、これらに限定されないが、非ステロイド性抗炎症薬及びコルチコステロイド、及び抗ウイルス薬を含み、これらに限らないがリビビリン、ビダラビン、アシクロビル、及びガンシクロビルが本発明の組成物と混合され得る。本発明の組成物と他の非アンチセンス薬との組み合わせは、また、本発明の範囲内である。本発明の１若しくはそれ以上の組成物は、他の治療薬との組み合わせて使用されることが可能であり、現在特定のウイルス感染対策であるカクテル療法を具現化するものである。

関連する別の実施例において、治療として効果的な併用療法は、本発明の２若しくはそれ以上の組成物の使用方法を含み、複数の組成物が単一又は複数の核酸標的に対して標的化される。アンチセンスオリゴマー化合物の多くの例が当業者に既知である。２若しくはそれ以上の結合された化合物を一緒に又は連続的に使用され得る。

投薬
治療用組成物の製剤及びその連続的投与（投薬）は、当業者の技術の範囲内であると考えられる。投薬は、治療される疾病状態の深刻さ及び反応性に依存し、治療コースは数日〜数ヶ月又は治癒する或いは疾病状態の改善が達成されるまで続く。最適投薬スケジュールは、患者の体内医薬品蓄積測定値から算出され得る。当業者は、最適投与量、投与方法、及び反復率を容易に決定することが可能である。最適投与量は、各オリゴヌクレオチドの相対的効力に従い変化し、ｉｎｖｉｔｒｏ及びｉｎｖｉｖｏ動物モデルにおいて効果的であると見出されたＥＣ_５０に基づいて、一般に推定され得る。一般に、投与量は、体重１ｋｇにつき０．０１ｕｇ〜１００ｇまでであり、毎日、毎週、毎月、又は毎年あたり１回若しくはそれ以上であるか、或いはさらに２〜２０年毎に一回投与される。当業者は、及び身体の流体または組織の医薬品の濃縮のための測定された滞留時間及び体液若しくは組織内の医薬品濃度に基づく投薬反復率を容易に推定し得る。以下の成功した治療において、患者は、疾病状態の再発を防ぐために維持療法を受けることが望ましく、オリゴヌクレオチドは維持投与において、体重１ｋｇにつき０．０１ｕｇ〜１００ｇまでの範囲で、毎日１回〜２０年毎に１回投与される。

本発明が好まれる実施例のいくつかと共に特異性に関して記載されているが、以下の実施例は、本発明を図示することのみに有益で、同一性を限定するものではない。

ｓｉＲＮＡコンストラクト調製、及びｅＩＦ４Ｅ並びに存続標的に対する試験
選択したｓｉＲＮＡコンストラクトを調整し、ＲＴ−ＰＣＲにより測定される標的ＲＮＡを低下させる能力を試験した。各コンストラクトのＩＣ_５０を決定した。

小文字のｆは、前述ヌクレオシドが２’−Ｆヌクレオシド（Ｃｆ＝２’−Ｆシチジン）であることを示す。小文字のｍは、前述のヌクレオシドが２’−ＯＣＨ_３ヌクレオシドであることを示す。小文字のｓは、前述のヌクレオシドが４’−チオヌクレオシドであることを示す。全てのヌクレオシド間結合は、Ｐ＝Ｏである。

実施例１０で示すような標準アッセイを用いて、ヒーラ細胞、ＭＨ−Ｓ細胞、またはＵ−８７のＭｇ細胞において上記コンストラクトを試験した。ＩＣ_５０のものは、以下に示すように計算した。

ヌクレオシドホスホラミダイトの合成
アミダイト及びその中間体を含む以下の化合物を、米国特許第６、４２６、２２０号明細書及び開示された国際公開公報第０２／３６７４３号パンフレットに記載されるように調整した；５−メチルｄＣアミダイト、５−メチル−ｄＣアミダイトに対する５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−デオキシ−５−メチルシチジン中間体、５−メチルｄＣアミダイトに対する最後から二番目の中間体である５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−デオキシ−Ｎ４−ベンゾイル−５−メチルシチジン、［５’−Ｏ−（４、４’−ジメトキシトリフェニルメチル）−２’−デオキシ−Ｎ^４−ベンゾイル−５−メチルシチジン−３’−Ｏ−イル］−２−シアノエチル−Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルホスホラミダイト（５−メチルｄＣアミダイト）、２’−フルオロデオキシアデノシン、２’−フルオロデオキシグアノシン、２’−フルオロウリジン、２’−フルオロデオキシシチジン、２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）修飾アミダイト、２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）−５−メチルウリジン中間、最後から二番目の中間体である５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）−５−メチルウリジン、［５’−Ｏ−（４、４’−ジメトキシトリフェニルメチル）−２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）−５−メチルウリジン−３’−Ｏ−イル］−２−シアノエチル−Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルホスホラミダイト（ＭＯＥＴアミダイト）、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）−５−メチルシチジン中間、最後から二番目の中間体である５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）−Ｎ^４−ベンゾイル−５−メチル−Ｃ、［５’−Ｏ−（４、４’−ジメトキシトリフェニルメチル）−２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）−Ｎ^４−ベンゾイル５−メチルシチジン−３’−Ｏ−イル］−２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホラミダイト（ＭＯＥ５−Ｍｅ−Ｃアミダイト）、［５’−Ｏ−（４、４’−ジメトキシトリフェニルメチル）−２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）−Ｎ^６−ベンゾイルアデノシン−３’−Ｏ−イル］−２−シアノエチル−Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルホスホラミダイト（ＭＯＥＡアミダイト）、［５’−Ｏ−（４、４’−ジメトキシトリフェニルメチル）−２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）−Ｎ^４−イソブチリルグアノシン−３’−Ｏ−イル］−２−シアノエチル−Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルホスホラミダイト（ＭＯＥＧアミダイト）、２’−Ｏ−（アミノオキシエチル）ヌクレオシドアミダイト、及び２’−Ｏ−（ジメチルアミノオキシエチル）ヌクレオシドアミダイト、２’−（ジメチルアミノオキシエトキシ）ヌクレオシドアミダイト）、５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−Ｏ^２−２’−アンヒドロ−５−メチルウリジン、５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−２’−Ｏ−（２−ヒドロキシエチル）−５−メチルウリジン、２’−Ｏ−（［２−フタルイミドキシ）エチル］−５’−ｔ−ブチルジフェニルシリル−５−メチルウリジン、５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−２’−Ｏ−［（２−ホルムアドキシミノオキシ）エチル］−５−メチルウリジン、５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−２’−Ｏ−［Ｎ、Ｎジメチルアミノオキシエチル］−５−メチルウリジン、２’−Ｏ−（ジメチルアミノオキシエチル）ジメチル−５−メチルウリジン、５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｏ−（ジメチルアミノオキシエチル）−５−メチルウリジン、５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｏ−（２−Ｎ、Ｎ−ジメチルアミノオキシエチル）−５−メチルウリジン−３’−［（２−シアノエチル）−Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルホスホラミダイト］、２’−（アミノオキシエトキシ）ヌクレオシドアミダイト、Ｎ２−イソブチリル−６−Ｏ−ジフェニルカルバモイル−２’−Ｏ−（２−エチルアセチル）−５’−Ｏ−（４、４’−ジメトキシトリチル）グアノシン−３’−［（２−シアノエチル）−Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルホスホラミダイト］、２’−ジメチルアミノエトキシエトキシ（２’−ＤＭＡＥＯＥ）ヌクレオシドアミダイト、２’−Ｏ−［２（２−Ｎ、Ｎ−ジメチルアミノエトキシ）エチル］−５−メチルウリジン、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−［２（２−Ｎ、Ｎ−ジメチルアミノエトキシ）−エチル）］−５−メチルウリジン、及び５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−［２（２−Ｎ、Ｎ−ジメチルアミノエトキシ）−エチル）］−５−メチルウリジン−３’−Ｏ−（シアノエチル−Ｎ、Ｎ−ジイソプロピル）ホスホラミダイト。

オリゴヌクレオチド及びオリゴヌクレオシド合成
本発明に従って使用されるオリゴマー化合物を、既知の固相合成技術を通じて簡便且つ規定通りに作った。そのような合成装置は、例えばＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ、カリフォルニア州）を含む数箇所の販売元により販売されている。当業者に既知のそのような合成のために、任意の他の手段をさらに又は代替的に使用しても良い。ホスホロチオアート及びアルキル化誘導体などのオリゴヌクレオチドを調整するために類似の技術を使用することは周知である。

オリゴヌクレオチド：非置換の及び置換されたリン酸ジエステル（Ｐ＝Ｏ）オリゴヌクレオチドを、ヨウ素酸化を用いた標準的なホスホラミダイト化学を用いて自動ＤＮＡ合成装置（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓｍｏｄｅｌ３９４）で合成する。

以下の例外を除き、ホスホロチオアート（Ｐ＝Ｓ）をリン酸ジエステルオリゴヌクレオチドと同様に合成する：亜リン酸エステル結合を酸化するために、アセトニトリル中、３，Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン１，１−二酸化物の１０％ｗ／ｖ溶液を利用することにより、硫化をする。前記硫化反応工程時間は１８０秒まで増加し、正常なキャッピング工程より先に行った。ＣＰＧカラムから解離、及び５５℃（１２〜１６の時間）において濃縮水酸化アンモニウム中で非ブロック化した後、前記オリゴヌクレオチドを、３倍より多い体積のエタノールを用いて１ＭのＮＨ_４ＯＡｃ溶液から沈殿させて回収した。オリゴヌクレオチドのホスフィン酸塩を、米国特許第５，５０８，２７０号明細書において記載されるように調整し、この開示はこの参照により本明細書において組み込まれる。

アルキルホスホン酸塩オリゴヌクレオチドを、米国特許第４，４６９，８６３号明細書において記載されているように調整し、この開示はこの参照により本明細書に組み込まれる。

３’−デオキシ−３’−メチレンホスホン酸塩オリゴヌクレオチドを、米国特許第５、６１０、２８９号明細書又は第５，６２５，０５０号明細書において記載されているように調整し、この開示はこの参照により本明細書に組み込まれる。

ホスホラミダイトオリゴヌクレオチドを、米国特許第５，２５６，７７５号明細書又は米国特許第５，３６６，８７８号明細書において記載されているように調整し、この開示はこの参照により本明細書に組み込まれる。

アルキルホスホノチオアートオリゴヌクレオチドを、開示されている国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ９４／００９０２号及び国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ９３／０６９７６号（国際公開公報第９４／１７０９３号及び国際公開公報第９４／０２４９９号として開示）において記載されているように調整し、この開示はこの参照により本明細書に組み込まれる。

３’−デオキシ−３’−アミノホスホラミドオリゴヌクレオチドを、米国特許第５，４７６，９２５号明細書において記載されているように調整し、この開示はこの参照により本明細書に組み込まれる。

リン酸トリエステルオリゴヌクレオチドを、米国特許第５，０２３，２４３号明細書において記載されているように調製し、この開示はこの参照により本明細書に組み込まれる。

ボラノリン酸塩オリゴヌクレオチドを、米国特許第５，１３０，３０２号明細書及び第５，１７７，１９８号明細書において記載されているように調整し、この開示は両方ともこの参照により本明細書に組み込まれる。

オリゴヌクレオシド：ＭＭＩが結合したオリゴヌクレオシドとしても同定されているメチレンメチルイミノが結合したオリゴヌクレオシド、ＭＤＨが結合したオリゴヌクレオシドとしても同定されているメチレンジメチルヒドラゾが結合したオリゴヌクレオシド、アミド−３結合したオリゴヌクレオシドとしても同定されているメチレンカルボニルアミノが結合したオリゴヌクレオシド、更にアミド−４結合したオリゴヌクレオシドとしても同定されているメチレンアミノカルボニルが結合したオリゴヌクレオシド、及びＭＭＩとＰ＝Ｏ又はＰ＝Ｓ結合とを換えたものを有する混合した骨格のオリゴマー化合物を、米国特許第５，３７８，８２５号明細書、第５，３８６，０２３号明細書、第５，４８９，６７７号明細書、第５，６０２，２４０号明細書、及び第５，６１０，２８９号明細書において記載されているように調整し、この開示はこの参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

ホルムアセタール及びチオホルムアセタールが結合したオリゴヌクレオシドを、米国特許第５，２６４，５６２号明細書及び第５，２６４，５６４号明細書において記載されているように調整し、この開示はこの参照により本明細書に組み込まれる。

エチレンオキサイドが結合したオリゴヌクレオシドを、米国特許第５，２２３，６１８号明細書において記載されているように調整し、この開示はこの参照により本明細書に組み込まれる。

ＲＮＡ合成
一般に、ＲＮＡ合成化学は、戦略的中間反応における様々な保護基の選択的導入に基づく。当業者であれば有機合成における保護基の使用については理解するが、有用な保護基類は、シリルエーテルを含む。２’−水酸基上に酸不安定性オルトエステル保護基と組み合わせて５’−水酸基を保護するために、特に大きな（ｂｕｌｋｙ）シリルエーテルを使用する。その後保護基のこのセットを、標準的な固相合成工学を用いて使用する。他のすべての合成工程の後に、最後に前記酸不安定性オルトエステル保護基を除去することが重要である。さらに、合成中の早い段階でシリル保護基を使用すると、望ましくない２’水酸基の脱保護をすることなく、目的とする簡易な除去を確実にする。

以下の方法は、異なる方法で除去され、更に異なる化学的不安定性を有する保護基によって２’−水酸基を保護することと組み合わせて、５’−水酸基を順次保護する‘ものであり、ＲＮＡオリゴヌクレオチドを合成した。

ＲＮＡオリゴヌクレオチドを段階的方法により合成する。各ヌクレオチドを、固体担体に結合したオリゴヌクレオチドに連続的に（３’−から５’−の方向に）添加する。鎖の３’−末端の第１のヌクレオシドを、固体担体に共有結合的に結合させる。ヌクレオチド前駆体、リボヌクレオシドホスホラミダイト、及び活性化剤を添加し、それらを第１のヌクレオシドの５’−末端の上で第２の塩基とカップリングさせる。固体担体を洗浄し、すべての未反応５’−水酸基を無水酢酸でキャップ化することにより、５’−アセチル部分が得られる。その後この結合を酸化し、より安定で最終的に望まれるＰ（Ｖ）結合にする。ヌクレオチド添加サイクルの終わりに、フッ化物によって５’−シリル基を切断する。このサイクルを、各追随ヌクレオチドに対して繰り返す。

以下の合成は、リン酸塩上のメチル保護基を、ＤＭＦ中の１Ｍの二ナトリウム−２−カルバモイル−２−シアノエチレン−１、１−ジチオレート三水和物（Ｓ_２Ｎａ_２）を使用し３０分で切断する。前記脱保護溶液を、蒸留水を使用して固体担体に結合したオリゴヌクレオチドから洗浄する。その後この固体担体を５５℃で１０分間４０％メチルアミン水溶液で処理する。これにより、溶液にＲＮＡオリゴヌクレオチドを遊離させ、環外アミンを脱保護化し、２’−基を修飾する。オリゴヌクレオチドは、この段階において、陰イオン交換ＨＰＬＣによって分析可能である。

２’−オルトエステル基は、除去される最後の保護基である。ＤｈａｒｍａｃｏｎＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｉｎｃ．（コロラド州Ｌａｆａｙｅｔｔｅ）によって開発されたエチレングリコールモノアセテートオルトエステル保護基は、有益なオルトエステル保護基の一例であり、以下の重要な特性を有する。前記保護基は、ヌクレオシドホスホラミダイト合成及びオリゴヌクレオチド合成の条件に対し安定である。しかしながら、オリゴヌクレオチド合成の後、オリゴヌクレオチドをメチルアミンにより処理すると、固体担体からオリゴヌクレオチドを切断するが、オルトエステルからアセチル基も除去される。オルトエステル上において結果として得られる２−エチル−水酸基置換基は、アセチル化された前駆体より電子求引性である。その結果、前記修飾されたオルトエステルは、酸触媒性加水分解に対してより不安定になる。具体的には、アセチル基が除去された後の開裂速度は、ほぼ１０倍速い。従って、このオルトエステルは、オリゴヌクレオチド合成と競合しても充分な安定性を持ち、さらに引き続き修飾する際、ＲＮＡオリゴヌクレオチド最終産物と共存して比較的温和な水溶液条件下で脱保護が行われる。

さらに、ＲＮＡ合成の方法は当業者に既知である（Ｓｃａｒｉｎｇｅ，Ｓ．Ａ．Ｐｈ．Ｄ．Ｔｈｅｓｉｓ，ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＣｏｌｏｒａｄｏ，１９９６；Ｓｃａｒｉｎｇｅ，Ｓ．Ａ．，ｅｔａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９９８，１２０，１１８２０−１１８２１；Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ，Ｍ．Ｄ．ａｎｄＣａｒｕｔｈｅｒｓ，Ｍ．Ｈ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９８１，１０３，３１８５−３１９１；Ｂｅａｕｃａｇｅ，Ｓ．Ｌ．ａｎｄＣａｒｕｔｈｅｒｓ，Ｍ．Ｈ．ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔ．，１９８１，２２，１８５９−１８６２；Ｄａｈｌ，Ｂ．Ｊ．，ｅｔａｌ．，ＡｃｔａＣｈｅｍ．Ｓｃａｎｄ，．１９９０，４４，６３９−６４１；Ｒｅｄｄｙ，Ｍ．Ｐ．，ｅｔａｌ．，ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｍＬｅｔｔ．，１９９４，２５，４３１１−４３１４；Ｗｉｎｃｏｔｔ，Ｆ．ｅｔａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，１９９５，２３，２６７７−２６８４；Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｂ．Ｅ．，ｅｔａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，１９６７，２３，２３０１−２３１３；Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｂ．Ｅ．，ｅｔａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，１９６７，２３，２３１５−２３３１）。

本発明のＲＮＡアンチセンスオリゴマー化合物（ＲＮＡオリゴヌクレオチド）は、本明細書における方法によって合成するか、或いはＤｈａｒｍａｃｏｎＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｉｎｃ（コロラド州Ｌａｆａｙｅｔｔｅ）から購入することが可能である。合成された時点において、その後相補的ＲＮＡアンチセンスオリゴマー化合物は、当業者に既知の従来技術法によってアニール化することが可能であり、二本鎖（二本鎖）アンチセンオリゴマー化合物が形成される。例えば、二本鎖は、３０μｌのＲＮＡオリゴヌクレオチド（５０ｕＭのＲＮＡオリゴヌクレオチド溶液）の各相補鎖と、１５μｌの５Ｘアニーリング緩衝液の（１００ｍＭの酢酸カリウム、ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ３０ｍＭでｐＨ７．４のもの、２ｍＭの酢酸マグネシウム）とを混合した後、９０℃で１分間、その後３７℃で１時間での加熱により形成することが可能である。結果として得られる二本鎖アンチセンスオリゴマー化合物は、標的核酸の役割を調べるキット、アッセイ、スクリーン、又は他の方法において使用可能である。

キメラオリゴヌクレオチドの合成
本発明のキメラオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシド、又は混合オリゴヌクレオチド／オリゴヌクレオチドは、幾つかの異なる種類がある。これらは、結合ヌクレオシドの"ギャップ"断片が結合ヌクレオシドの５’と３’"ウィング"断片との間に位置する第１のタイプと、 "ギャップ"断片がオリゴマー化合物の３’又は５’末端の一方に位置する第二の"オープエンド"タイプとを含む。前記第１のタイプのオリゴヌクレオチドはまた、"ギャップマー"又はギャップ化されたオリゴヌクレオチドとして当業者に周知である。前記第２のタイプのオリゴヌクレオチドはまた、"ヘミマー"又は"ウィングマー"として当業者に周知である。

［２’−Ｏ−Ｍｅ］−−［２’−デオキシ］−−［２’−Ｏ−Ｍｅ］キメラホスホロチオアートオリゴヌクレオチド
２’−Ｏ−アルキルホスホロチオアート及び２’−デオキシホスホロチオアートオリゴヌクレオチド断片を有するキメラオリゴヌクレオチドを、上述のＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓの自動化ＤＮＡ合成装置Ｍｏｄｅｌ３９４を使用することにより合成する。オリゴヌクレオチドを、自動化合成装置、及びＤＮＡ部のための２’−デオキシ−５’−ジメトキシトリチル−３’−Ｏ−ホスホラミダイト並びに５’及び３’ウィングのための５’−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−メチル−３’−Ｏ−ホスホラミダイトを使用して合成する。標準の合成サイクルを、５’−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−メチル−３’−Ｏ−ホスホラミダイトのための増加された反応時間を有するカップリング工程を組み込むことにより修飾する。完全に保護されたオリゴヌクレオチドを、固体担体から切断し、１２〜１６時間５５℃で濃縮されたアンモニア（ＮＨ４ＯＨ）において脱保護化する。脱保護化されたオリゴを、その後適切な方法（沈降、カラムクロマトグラフィ、真空中で減少された体積、分光度分析された収率、且つキャピラリ電気泳動及び質量分析により分析された純度）により回収する。

［２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）］−−［２’−デオキシ］−−［２’−Ｏ−（メトキシエチル）］キメラホスホロチオアートオリゴヌクレオチド
［２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）］−−［２’−デオキシ］−−［−２’−Ｏ−（メトキシエチル）］キメラホスホロチオアートオリゴヌクレオチドを、２’−Ｏ−メチルアミダイトから２’−Ｏ−（メトキシエチル）アミダイトへの置換を有する２’−Ｏ−メチルキメラオリゴヌクレオチドの上述手順につき調整した。

［２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）ホスホジエステル］−［２’−デオキシホスホロチオアート］−［２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）リン酸ジエステル］キメラオリゴヌクレオチド
［２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）リン酸ジエステル］−−［２’−デオキシホスホロチオアート］−−［２’−Ｏ−（メトキシエチル）リン酸ジエステル］キメラオリゴヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチルアミダイトに対して２’−Ｏ−（メトキシエチル）アミダイト置換基を有する２’−Ｏ−メチルキメラオリゴヌクレオチドのための上述方法のように調整し、ヨウ素による酸化によりキメラ構造のウィング部分の範囲内にリン酸ジエステルヌクレオチド間結合を生成し、更に３，Ｈ−１，２ベンゾジチオール−３−オン１，１ジオキサイド（Ｂｅａｕｃａｇｅ試薬）を使用した硫化により中心ギャップのホスホロチオアートヌクレオチド間結合を生成する。

他のキメラオリゴヌクレオチド、キメラオリゴヌクレオシド、及び混合されたキメラオリゴヌクレオチド／オリゴヌクレオシドを、米国特許第５，６２３，０６５号明細書に従って合成し、この開示はこの参照により本明細書に組み込まれる。

選択標的を対象とした二本鎖アンチセンスのオリゴマー化合物の設計及びスクリーニング
本発明に従って、本発明のアンチセンスオリゴマー化合物及びその相補体を含む一連の核酸二本鎖は、標的を標的化するために設計することが可能である。鎖の末端を１若しくはそれ以上の天然又は修飾された核酸塩基の添加によって修飾し、オーバーハングを形成する。その後ｄｓＲＮＡのセンス鎖を、アンチセンス鎖の相補体として設計し、合成するが、その鎖いずれかの末端に対して修飾又は付加を含んでも良い。例えば、一実施形態において、前記ｄｓＲＮＡ二重鎖の両鎖は、中心的核酸に対して相補的であり、各鎖は、片方又は両方の末端において突出する。

例えば、配列ＣＧＡＧＡＧＧＣＧＧＡＣＧＧＧＡＣＣＧを有するアンチセンス鎖を有し、デオキシチミジン（ｄＴ）の２−核酸塩基オーバーハングを有する二本鎖は、以下の構造を有する。

二本鎖のＲＮＡ鎖を、本明細書において開示される方法により合成可能であり、或いはＤｈａｒｍａｃｏｎＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｃ．（コロラド州Ｌａｆａｙｅｔｔｅ）より購入可能である。合成された時点において、相補鎖をアニーリングする。一本鎖を、等分し、５０ｕＭの濃度に希釈する。一旦希釈し、各鎖の３０ｕＬを、アニーリング緩衝液の５Ｘ溶液の１５ｕＬと混合する。前記緩衝液の最終的な濃度は、酢酸カリウム１００ｍＭ、ｐＨ７．４のＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ３０ｍＭ、及び酢酸マグネシウム２ｍＭである。最終的な体積は７５ｕＬである。この溶液を、９０℃で１分間インキュベートし、その後１５秒間遠心分離機にかけた。チューブを１時間３７℃で静置し、ｄｓＲＮＡ二本鎖を実験で使用する。ｄｓＲＮＡ二本鎖の最終濃度は２０ｕＭである。この溶液は冷凍保存し（−２０℃）、５回まで凍結融解することが可能である。

調整した時点で、二本鎖アンチセンスオリゴマー化合物の標的発現の調節能を評価する。

細胞が８０％の密度に達する際、それを、本発明の二本鎖アンチセンスオリゴマー化合物で処理する。９６ウェルプレートにおいて増殖する細胞に関し、ウェルを２００μＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭ血清使用量低減培地（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）で一度洗浄し、その後１２μｇ／ｍＬのＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）及び望まれる二本鎖アンチセンスオリゴマー化合物で終濃度２００ｎＭを含むＯＰＴＩ−ＭＥＭ−１（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）１３０μＬで処理する。５時間の処理後、培地を新しい培地と取り替える。、１６時間後に細胞を回収し、その際ＲＮＡを単離し、標的の減少をＲＴ−ＰＣＲで測定した。

類似の手順において、二本鎖オリゴマー化合物は、ヒーラー細胞中（ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、バージニア州Ｍａｎａｓｓａｓ）で評価する。ヒーラー細胞に対して使用される培養方法は、ＡＴＣＣから入手可能であり、例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ．において見出される。９６ウェルプレートにおいて細胞を増殖させるために、２００μＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭ血清使用量低減培地（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）で一度ウェルを洗浄し、その後１２μｇ／ｍＬのＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）及び所望濃度のｄｓＲＮＡを含むＯＰＴＩ−ＭＥＭ−１（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）１３０μＬで処理する。５時間の処理後、培地を新しい培地と取り替える。ｄｓＲＮＡ処理１６時間後に細胞を回収し、その際ＲＮＡを単離し、標的の減少を実施例ａｒｄＳｏｕｒｃｅＩＤ：ＮＴ００００８８８２において記載されるようにＲＴ−ＰＣＲで測定した。

オリゴヌクレオチド単離
制御された細孔ガラス固体担体からの開裂し、濃縮水酸化アンモニウム中で５５℃で１２〜１６時間非ブロック化した後、>３倍体積のエタノールを含む１ＭのＮＨ_４ＯＡｃからの沈殿によりオリゴヌクレオシド又はオリゴヌクレオチドを回収する。合成されたオリゴヌクレオチドを、エレクトロスプレー質量分析（分子量決定）及びキャピラリゲル電気泳動により分析し、少なくとも７０％の完全長物質であると判断した。ホスホロチオアートの相対量及び合成において得られたホスホジエステル結合を、−１６ａｍｕ（＋／−３２の＋／−４８）と比較して正確な分子量比により決定した。いくつかの研究のため、ＣｈｉａｎｇらによるＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９１、２６６、１８１６２−１８１７１の記載のように、オリゴヌクレオチドをＨＰＬＣにより精製した、。ＨＰＬＣで精製した物質によって得られる結果は、非ＨＰＬＣで精製した物質から得られる結果と同様であった。

オリゴヌクレオチド合成−９６ウェルプレートフォーマット
オリゴヌクレオチドを、同時に９６の配列を９６ウェルフォーマットに集めることでことが可能な自動化合成機で固相Ｐ（ＩＩＩ）ホスホラミダイト化学を経て合成した。リン酸ジエステルヌクレオチド間結合を、ヨウ素水溶液での酸化反応により提供した。ホスホロチオアートヌクレオチド間結合を、無水アセトニトリルの３，Ｈ−１，２ベンゾジチオール−３−オン１、１ジオキサイド（Ｂｅａｕｃａｇｅ試薬）を使用する硫化により生成した。標準の塩基保護したβ−シアノエチルジイソプロピルホスホラミダイトを、商業的販売元（例えばＰＥ−ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ又はＰｈａｒｍａｃｉａ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ニュージャージー州Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ）から購入した。非標準ヌクレオシドは、標準的方法又は特許製法により合成される。それらを、塩基保護されたβ−シアノエチルジイソプロピルホスホラミダイトとして利用する。

オリゴヌクレオチドを、固体担体から切断し、濃縮ＮＨ_４ＯＨにより１２〜１６時間高温で（５５〜６０℃）で脱保護化し、遊離した生成物をその後真空中で乾燥した。その後乾燥した生成物を滅菌溶液に再懸濁し、マスタープレートを得て、それより全ての分析及び検査プレートサンプルをその後自動分注器を使用して希釈する。

９６ウェルプレートフォーマットを使用するオリゴヌクレオチド解析
各ウェルのオリゴヌクレオチド濃度を、サンプルの希釈及びＵＶ吸収分光法により決定した。各生成物の完全長の完全性を、９６ウェルフォーマット（ＢｅｃｋｍａｎＰ／ＡＣＥ（商標）ＭＤＱ）又は個別に調整したサンプルの一方で商業的ＣＥ装置上で（例えば、ＢｅｃｋｍａｎＰ／ＡＣＥ（商標）５０００、ＡＢＩ２７０）キャピラリ電気泳動（ＣＥ）により評価した。エレクトロスプレー質量分析を利用するオリゴマー化合物の質量分析によって塩基及び骨格組成物を確認した。全アッセイ検査プレートを、単一及び多チャネル自動化分注器を使用しマスタープレートから希釈した。プレート上のオリゴマー化合物の少なくとも８５％が少なくとも８５％の完全長である場合許容されると判断した。

細胞培養及びオリゴヌクレオチド処理
標的核酸発現におけるオリゴマー化合物の効果は、任意の様々な細胞タイプにおいて試験することができ、測定可能なレベルで存在標的核酸がを提供する。これは、例えば、ＰＣＲまたはノーザンブロット解析を使用して型通りに測定することができる。以下の細胞タイプは図示する目的のために提供するが、他の細胞タイプを型通りに使用することができ、前記選択された細胞タイプにおいて発現する標的が提供する。これは、当業者の通常の方法（例えばノーザンブロット解析、ＲＮＡ分解酵素保護アッセイ、又はＲＴ−ＰＣＲ）により容易に測定可能である。

Ｔ−２４細胞：
ヒトの移行細胞膀胱癌の細胞系Ｔ−２４をｔｈｅＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）（バージニア州Ｍａｎａｓｓａｓ）から得た。Ｔ−２４細胞は、１０％のウシ胎仔血清（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄ）、１ｍＬあたりｌ００ユニットのペニシリン、及び１ｍＬあたり１００マイクログラムのストレプトマイシン（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄ）を補足した完全ＭｃＣｏｙ’ｓ５Ａ基本培地中で型通りに培養した。細胞が９０％の密度に達した際にトリプシン処理し、希釈により型通りに継代培養した。ＲＴ−ＰＣＲ解析ために９６ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ−Ｐｒｉｍａｒｉａ＃３５３８７２）に、細胞を、７０００細胞／ウェルの密度で播種した。

ノーザンブロッティング解析又は他の解析のために、細胞を１００ｍｍプレート又は他の標準の組織培養プレートに播種し、培地及びオリゴヌクレオチドの適当な容量を使用し同様に処理する。

Ａ５４９細胞：
ヒトの肺癌の細胞系Ａ５４９を、ｔｈｅＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）（バージニア州Ｍａｎａｓｓａｓ）から得た。Ａ５４９細胞を、１０％のウシ胎仔血清（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄ）、１ｍＬあたりｌ００ユニットのペニシリン、及び１ｍＬあたり１００マイクログラムのストレプトマイシンを補足したＤＭＥＭ基本培地（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄ）で型通りに培養した。細胞を９０％の密度に達した際にトリプシン処理及び希釈により型通りに継代培養した。

ＮＨＤＦ細胞：
ヒトの新生児の皮膚の繊維芽細胞（ＮＨＤＦ）を、ｔｈｅＣｌｏｎｅｔｉｃｓＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（メリーランド州Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ）から得た。ＮＨＤＦｓを、供給元の推奨通りに補足した繊維芽細胞増殖培養液（ＣｌｏｎｅｔｉｃｓＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、メリーランド州Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ）において、型通りに維持した。細胞を供給元の推奨通りに最高１０代継代まで維持した。

ＨＥＫ細胞：
ヒトの胎生期ケラチン合成細胞（ＨＥＫ）を、ｔｈｅＣｌｏｎｅｔｉｃｓＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（メリーランド州Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ）から得た。
ＨＥＫｓを、供給元の推奨通りに補充される繊維芽細胞増殖培養液（ＣｌｏｎｅｔｉｃｓＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、メリーランド州Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ）において、型通りに維持した。細胞は、供給元の推奨通りに最高１０代継代まで維持した。

オリゴマー化合物での処理：
細胞を、６５〜７５％の密度に達した際に、オリゴヌクレオチドで処理した。９６ウェルプレートにおいて増殖する細胞に関し、ウェルを、１００ＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭ血清使用量低減培地（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄ）で一度洗浄し、その後３．７５ｇ／ｍＬのＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（商標）（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄ）及び望まれる濃度のオリゴヌクレオチドを含む１３０ＬのＯＰＴＩ−ＥＭ−１で処理する。細胞を処理し、データを三組得る。３７℃での処理４〜７時間後、培地を、新しい培地と取り替えた。細胞を、オリゴヌクレオチド処理の１６〜２４時間後回収した。

使用するオリゴヌクレオチドの濃度を、細胞系によって変化させる。特定の細胞系の最適なオリゴヌクレオチド濃度を測定するために、ある濃度範囲において正制御因子のオリゴヌクレオチドで細胞を処理する。ヒトの細胞に関し、正制御因子のオリゴヌクレオチドを、ＩＳＩＳ１３９２０（ＴＣＣＧＴＣＡＴＣＧＣＴＣＣＴＣＡＧＧＧ、配列番号：３）でヒトのＨ−ラス癌遺伝子に対して標的化されるもの又はＩＳＩＳ１８０７８（ＧＴＧＣＧＣＧＣＧＡＧＣＣＣＧＡＡＡＴＣ、配列番号：４）でヒトのＪｕｎ−Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌｋｉｎａｓｅ−２（ＪＮＫ２）に標的化されるものの一方から選択する。両方の制御因子は、ホスホロチオアート骨格を有する２’−Ｏ−メトキシエチルギャップマー（ボールド体で示される２’−Ｏ−メトキシエチル）である。マウス又はラット細胞に関し、正制御するオリゴヌクレオチドは、ＩＳＩＳ１５７７０、ＡＴＧＣＡＴＴＣＴＧＣＣＣＣＣＡＡＧＧＡ、配列番号：５、両方のマウスに対して標的化されるホスホロチオアート骨格を有する２’−Ｏ−メトキシエチルギャップマー（ボールド体で示される２’−Ｏ−メトキシエチル）、及びラットのｃ−ｒａｆである。ｃ−Ｈラス癌遺伝子（ＩＳＩＳ１３９２０）、ＪＮＫ２（ＩＳＩＳ１８０７８）、又はｃ−ｒａｆ（ＩＳＩＳ１８０７８）ｍＲＮＡの８０％阻害をもたらす正制御因子のオリゴヌクレオチド濃度を、その後、その細胞系に関する次の実験における新しいオリゴヌクレオチドのスクリーニング濃度として利用する。８０％の阻害が達成されない場合、ｃ−Ｈラス癌遺伝子、ＪＮＫ２、又はｃ−ｒａｆｍＲＮＡの６０％阻害をもたらす正の制御オリゴヌクレオチドの最も低い濃度を、その後その細胞系の次の実験においてオリゴヌクレオチドスクリーニング濃縮として利用する。６０％の阻害が達成されない場合、その特定の細胞系はオリゴヌクレオチドトランスフェクション実験に不適当であると思われる。本明細書において使用されるアンチセンスオリゴヌクレオチド濃度は、５０ｎＭ〜３００ｎＭまでである。

オリゴヌクレオチドの標的発現阻害の分析
アンチセンスの標的発現調節を、当業者に既知の様々な方法で分析し得る。
例えば、標的のｍＲＮＡレベルを、例えば、ノーザンブロット分析、競合ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、又はリアルタイムＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）によって定量化し得る。定量リアルタイム−ＰＣＲは、現在好まれる。ＲＮＡ分析を、全細胞ＲＮＡ又はｐｏｌｙ（Ａ）＋ｍＲＮＡに対して行い得る。本発明のＲＮＡ分析の好まれる方法は、本明細書における他の実施例において記載される全細胞ＲＮＡの使用である。ＲＮＡ単離方法は、当業者に既知である。ノーザンブロット解析をまた、当業者にルーチンである。定量的リアルタイムＰＣＲは、商業的に入手可能なＡＢＩＰＲＩＳＭ（商標）７６００、７７００、又は７９００ＳｅｑｕｅｎｃｅＤｅｔｅｃｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍをＰＥ−ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙから入手し使用してし得、製造元の規定に従って使用し得る。

標的のタンパク質レベルを、当業者に既知の様々な方法、例えば免疫沈降、ウエスタンブロット解析（イムノブロッティング）、酵素結合抗体免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、又は蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣ））で定量化し得る。標的の方向に向けられた抗体を、同定し得、種々の供与源、例えば抗体のＭＳＲＳカタログ（ＡｅｒｉｅＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ミシガン州Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ）から得られる或いは従来のモノクローナル又はポリクローナル抗体生成方法を通して調整することが可能である。

表現型アッセイ及び標的阻害剤の使用のためのインビボ研究の設計
表現型アッセイ
標的阻害剤を本明細書において開示される方法により同定し、オリゴマー化合物を、１つ若しくはそれ以上の表現型アッセイにおいて更に調査し、各アッセイは、特定の疾病状
態又は条件の治療における有効性を示すと考えられ測定できるエンドポイントがある。

表現型アッセイ、キット及びそれらの使用のための試薬は、当業者に既知で本明細書において正常状態及び病気状態における標的の役割及び／又は関連性を調査するために使用される。代表的な表現型アッセイは、数箇所の商業的販売元の任意の１つから購入し得るが、細胞生育性、細胞毒性、増殖、若しくは細胞生存力を決定するもの（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ、オレゴン州Ｅｕｇｅｎｅ；ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｂｏｓｔｏｎ、マサチューセッツ州）、酵素アッセイを含むタンパク質に基づくアッセイ（Ｐａｎｖｅｒａ、ＬＬＣ、ウィスコンシン州Ｍａｄｉｓｏｎ；ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ニュージャージー州ＦｒａｎｋｌｉｎＬａｋｅｓ；ＯｎｃｏｇｅｎｅＲｅｓｅａｒｃｈＰｒｏｄｕｃｔｓ、カリフォルニア州ＳａｎＤｉｅｇｏ）、細胞調節、情報伝達、燃焼、酸化過程、並びにアポトーシス（ＡｓｓａｙＤｅｓｉｇｎｓＩｎｃ．ミシガン州ＡｎｎＡｒｂｏｒ）、トリグリセライド蓄積（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ミズーリ州Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）は、血管アッセイ、菅形成アッセイ、サイトカイン並びにホルモンアッセイ、及び代謝アッセイ（ＣｈｅｍｉｃｏｎＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＩｎｃ．、カリフォルニア州Ｔｅｍｅｃｕｌａ；ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ニュージャージー州Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ）を含む。

限定されない一実施例において、上述の方法により測定した最適濃度における制御化合物と同様に、特定の表現型アッセイに適切であると測定された細胞を（すなわち、乳癌の研究のために選出されたＭＣＦ−７細胞；肥満症研究のための脂肪細胞）ｉｎｖｉｔｒｏ研究から同定される標的阻害剤で処理する。処理期間の終点において、処理済み及び未処理の細胞を、表現型の結果及び終点を決定するアッセイに固有な１若しくはそれ以上の方法によって、分析する。表現型の終点は、細胞成分、例えばタンパク、脂質、核酸、ホルモン、サッカライド、又は金属レベルの変化と共に細胞形態における時間変化又は処理投与量の変化を含む。ｐＨ、細胞周期における期、又は細胞による生物学的指標の摂取若しくは排出を含む細胞状態の測定もまた、目的のエンドポイントである。

処理後の細胞遺伝子型の解析もまた（１つ若しくはそれ以上の細胞の遺伝子の発現測定）、標的阻害剤の有効性又は効力の指標として使用する。ホールマーク遺伝子、又は特異的疾病状態、条件、又は表現型と関連すると思われる遺伝子を、処理済み又は非処理の細胞において測定する。

ｉｎｖｉｖｏ研究
本明細書において記載されるｉｎｖｉｖｏ研究の個々の対象は、ヒトを含む温血脊椎動物である。臨床試験は、各個人が不必要にリスクを負わされず、研究における自分たちの役割を十分に知らされることを確実にするために厳密なコントロールに従う。

治療による心理的な効果を説明するために志願者に、偽薬又は標的阻害剤を無作為に与える。さらに、医者が治療を偏らないように、彼らが投与している薬品が標的阻害剤又は偽薬かどうかを知らせないようにする。この無作為化方法を使用する故、各志願者は、新治療薬又は偽薬のどちらかを与えられる同一の可能性を有する。

志願者は、８週間標的阻害剤又は偽薬の一方を受け取り、初め（任意治療前のベースライン測定）、終わり（最終治療の後）、及び研究期間内定期的に測定され示唆された疾病状態又は条件に関連する生物学的パラメータを伴う。そのような測定は、治療前のレベルと比較した標的をコードする核酸分子レベル又は体液、組織、又は器官における標的タンパク質レベルを含む。他の測定は、これに限定されるものではないが、ＡＤＭＥ（生体吸収、分配、新陳代謝、及び排出）測定と共に治療中の病気状態若しくは条件、体重、血圧、疾病若しくは毒性の薬理学的指標の血清力価指標を含む。各患者の記録情報は、年齢（歳）、性別、身長（ｃｍ）、家系の疾病状態若しくは条件（肯定／否定）、動機づけ評価（いくらか／普通／非常に）、及び示唆される疾病過去の治療法の数並びにタイプを含む。

本研究に参加している志願者は、健康な成人（１８〜６５歳）であり、ほぼ同人数の男女が研究に参加している。ある特徴を有する志願者を、偽薬及び標的阻害剤治療に等しく振り分ける。一般に、偽薬治療される志願者は、治療にほとんど又は全く反応を示さない、その一方標的阻害剤で治療される志願者は、本研究の結末において彼らの疾病状態又は条件指標において好ましい傾向を示す。

ＲＮＡ単離
Ｐｏｌｙ（Ａ）＋ｍＲＮＡ単離
Ｐｏｌｙ（Ａ）＋ｍＲＮＡを、Ｍｉｕｒａら（Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．、１９９６、４２、１７５８−１７６４）に従って単離した。他のｐｏｌｙ（Ａ）＋ｍＲＮＡ単離方法は、当業者には決まりきった手順である。簡潔に言えば、９６ウェルプレートで増殖する細胞に対し、細胞増殖培養液を細胞から除去し、各ウェルを２００Ｌの冷却ＰＢＳで洗浄した。６０μＬの細胞溶解緩衝液（１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．６、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．５ＭのＮａＣｌ、０．５％のＮＰ−４０、２０ｍＭのバナジル−リボヌクレオシド錯体）を各ウェルに加え、プレートを穏やかに攪拌した後、５分間室温でインキュベートした。５５μＬの溶菌液をオリゴヌクレオチドｄ（Ｔ）で被覆された９６ウェルプレート（ＡＧＣＴＩｎｃ．、Ｉｒｖｉｎｅ、カリフォルニア州）に注入した。プレートを、室温で６０分間インキュベートし、２００μＬの洗浄緩衝液（１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．６、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．３ＭのＮａＣｌ）で３回洗浄した。最終洗浄後、プレートをペーパータオルで吸い取り過剰な洗浄緩衝液を除去した後、５分間空気乾燥した。７０℃まで予熱した６０μＬの溶出緩衝液（５ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．６）を各ウェルに加え、プレートを９０℃で５分間ホットプレートでインキュベートし、その後溶出液を新しい９６ウェルプレートに移した。

１００ｍｍ又は他の標準プレートで増殖する細胞を、全溶液の適当な体積を使用し同様に処理する。

全ＲＮＡの単離
全ＲＮＡを、ＱｉａｇｅｎＩｎｃ．（カリフォルニア州Ｖａｌｅｎｃｉａ）より購入しＲＮＥＡＳＹ９６（商標）キットを製造元の推奨する手順に従い使用して単離した。簡潔に述べると、９６ウェルウェルプレートで増殖する細胞に対し、細胞増殖培養液を細胞から除去し、各ウェルを２００μＬの冷却ＰＢＳで洗浄した。１５０μＬの緩衝液ＲＬＴを２０秒間激しく攪拌し、各プレートに加えた。その後、前記検体を廃棄物収集トレイを備えたＱＩＡＶＡＣ（登録商標）連結管に連結したＲＮＥＡＳＹ９６（商標）ウェルプレートに移し、真空源に装着した。前記真空は１分間適用した。５００μＬの緩衝液ＲＷ１を、ＲＮＥＡＳＹ９６（商標）プレートの各ウェルに加え、１５分間インキュベートし、再び１分間真空にした。さらに５００μＬの緩衝液ＲＷ１をＲＮＥＡＳＹ９６（商標）プレートの各ウェルに加え、２分間真空にした。その後１ｍＬの緩衝液ＲＰＥを、ＲＮＥＡＳＹ９６（商標）プレートの各ウェルに加え、、９０秒間真空にした。その後緩衝液ＲＰＥの洗浄を繰り返し、さらに３分間真空にした。その後、プレート、ＱＩＡＶＡＣ（商標）連結管から除去し、ペーパータオルで吸い取り乾燥した。その後、プレートを１．２ｍＬの回収チューブを含む回収チューブラック付のＱＩＡＶＡＣ（商標）連結管に再び装着した。その後ＲＮＡは、１４０Ｌのリボヌクレアーゼのない水を各ウェルにピペットで移し、１分間インキュベートし、その後３分間減圧することにより抽出した。

反復ピペッティング及び吸い取り工程を、ＱＩＡＧＥＮＢｉｏ−Ｒｏｂｏｔ９６０４（Ｑｉａｇｅｎ、Ｉｎｃ．カリフォルニア州Ｖａｌｅｎｃｉａ）を使用し自動化することができる。重要なことは、培養プレート上の細胞を溶解させた後に、プレートをロボットデッキに移動し、ピペッティングし、デオキシリボヌクレアーゼ処理、及び溶出工程を行う。

標的ｍＲＮＡレベルの定量的リアルタイムＰＣＲ分析
標的ｍＲＮＡレベルの定量を、定量的リアルタイムＰＣＲでＡＢＩＰＲＩＳＭ（商標）７６００、７７００、又は７９００ＳｅｑｕｅｎｃｅＤｅｔｅｃｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍ（ＰＥ−ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、、カリフォルニア州ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ）を使用して取扱説明書に従って行った。これは、閉じたチューブでゲルに基づかない、蛍光検出システムであり、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）生成物のハイスループット定量を可能にする。ＰＣＲが完了した後増幅生成物が定量化される標準ＰＣＲに対して定量的リアルタイムＰＣＲの生成物は、蓄積しながら定量化される。ＰＣＲ反応におけるオリゴヌクレオチドプローブでＰＣＲのフォアードプライマーとリバースプライマーとの間に特異的アニーニングし、２つの蛍光色素を含むものを含むことにより達成される。リポータ色素（例えば、ＰＥ−ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ、ＯｐｅｒｏｎＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓＩｎｃ．、カリフォルニア州Ａｌａｍｅｄａ、又はＩｎｔｅｇｒａｔｅｄＤＮＡＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓＩｎｃ．、アイオワ州Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、のいずれかから購入可能なＦＡＭ又はＪＯＥ）がプローブの５’端に結合し、消光剤色素３’端に結合される。プローブ及び色素が正常である際、リポータ色素の発光は、近接する３’消光色素により消される。増幅の間、標的配列に対するプローブのアニーリングは、基質でポリメラーゼの５’−エキソヌクレアーゼ活性により切断され得るものを作り出す。ＰＣＲ増幅のサイクルの伸長期の間、Ｔａｑポリメラーゼによるプローブの切断は、プローブの残りから（従って消光剤成分から）リポータ色素を遊離させ、配列−特異的蛍光シグナルが作られる。各サイクルに関し、さらにリポータ色素分子は、そのそれぞれのプローブから切断され、蛍光強度は、ＡＢＩＰＲＩＳＭ（商標）配列検出システムに組み込まれるレーザー光学によりモニターされる。各アッセイにおいて、非処理の対照サンプルからのｍＲＮＡの段階的希釈液を含む一連の併発反応は、標準曲線を生成し、その曲線はアンチセンスオリゴヌクレオチド処理後阻害の割合を定量するのに使用される。

定量的ＰＣＲ分析の前に、測定中の標的遺伝子に特異的なプライマ−プローブセットを、ＧＡＰＤＨ増幅反応と共に"多重化"される力で評価する。多重化する際に、標的遺伝子及び内部標準遺伝子ＧＡＰＤＨを、単一のサンプルとして共に増幅する。この分析において、非処理の細胞から単離されるｍＲＮＡを、段階的に希釈する。各希釈液を、ＧＡＰＤＨのみ、標的遺伝子のみ（"単一化"）、又は両方（多重化）に特異的プライマ−プローブセットの存在下で増幅する。以下のＰＣＲ増幅、ＧＡＰＤＨの標準曲線、及び希釈関数としての標的ｍＲＮＡシグナルは、単一化及び多重化サンプルの両者から発生する。多重化サンプルから発生するＧＡＰＤＨ及び標的シグナルの傾き並びに相関係数が単一化サンプルから発生するそれらの対応値の１０％以内になる場合、その標的に特異的なプライマ−プローブは多重化可能であるとみなされる。他のＰＣＲ方法はまた、当業者において既知である。

ＰＣＲ試薬を、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄ）から得た。ＲＴ−ＰＣＲ反応を、２０μＬのＰＣＲカクテル（ＭｇＣｌ_２無しの２．５ｘのＰＣＲ緩衝液、６．６ｍＭのＭｇＣｌ_２、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＣＴＰ、並びにｄＧＴＰ各３７５ｎＭ、フォアードプライマー並びにリバースプライマー各３７５ｎＭ、１２５ｎＭのプローブ、４ユニットのリボヌクレアーゼ阻害剤、１．２５ユニットのＰＬＡＴＩＮＵＭ（登録商標）Ｔａｑ、５ユニットＭｕＬＶ逆転写酵素、及び２．５ｘのＲＯＸ色素）を３０μＬの全ＲＮＡ溶液（２０−２００ｎｇ）を含む９６ウェルプレートに加えることにより行った。ＲＴ反応を、３０分間４８℃のインキュベーションにより実行した。ＰＬＡＴＩＮＵＭ（登録商標）Ｔａｑを活性化するための１０分間９５℃でのインキュベーションに引き続き、２つの工程のＰＣＲプロトコルの４０サイクルを実行した：１５秒間９５℃（変性）に引き続く１．５分間６０℃（アニーリング／伸長）。

リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって得られた標的遺伝子の定量を、ＧＡＰＤＨの発現レベル若しくは発現量が一定の遺伝子の一方を使用し、或いはＲｉｂｏＧｒｅｅｎ（商標）（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ、Ｉｎｃ．、オレゴン州Ｅｕｇｅｎｅ）を使用して全ＲＮＡを定量することにより規準化する。ＧＡＰＤＨ発現を、標的と多重化とを同時に又は別々に作動させることにより、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより定量化する。全ＲＮＡ量を、ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ（商標）ＲＮＡ定量化試薬（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ、Ｉｎｃ．、オレゴン州Ｅｕｇｅｎｅ）を使用し定量化する。
ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ（商標）によるＲＮＡ定量化方法は、Ｊｏｎｅｓ、Ｌ．Ｊ．ら（ＡｎａｌｙｔｉｃａｌＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９８、２６５、３６８−３７４）において教示される。

このアッセイにおいて、１７０μＬのＲｉｂｏＧｒｅｅｎ（商標）が機能する試薬（ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ（商標）試薬で１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ：１ｍＭのＥＤＴＡを１：３５０、ｐＨ７．５で希釈されたもの）を、３０μＬの精製された細胞性ＲＮＡを含む９６ウェルプレートにピペットで移す。プレートを、ＣｙｔｏＦｌｕｏｒ４０００（ＰＥＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）において４８５ｎｍで励起し及び５３０ｎｍで放出し読み込む。

プローブを、公開されている配列情報を使用してヒトの標的配列に対してハイブリダイズするように設計する。

標的ｍＲＮＡレベルのノーザンブロット解析
アンチセンス処理１８時間後、細胞単層を、冷たいＰＢＳで２回洗浄し、１ｍＬのＲＮＡＺＯＬ（商標）（ＴＥＬ−ＴＥＳＴ"Ｂ"Ｉｎｃ．、テキサス州Ｆｒｉｅｎｄｓｗｏｏｄ）中で溶解させた。全ＲＮＡ量を、以下の製造元の推奨規定に従って調整した。全ＲＮＡ量の２０マイクログラムは、ＭＯＰＳ緩衝液システム（ＡＭＲＥＳＣＯ、Ｉｎｃ．、オハイオ州Ｓｏｌｏｎ）を使用する１．１％のホルムアルデヒドを含む１．２％のアガロースゲルによる電気泳動により分別した。ＲＮＡを、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ／ＳｏｕｔｈｅｒｎＴｒａｎｓｆｅｒ緩衝液システムを使用する一晩の毛管移動によりゲルからＨＹＢＯＮＤ（商標）−Ｎ＋ナイロンメンブラン（ＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ、ニュージャージー州Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ）に移した。ＲＮＡ移動を、ＵＶ視覚化により確認した。メンブランを、ＳＴＲＡＴＡＬＩＮＫＥＲＵＶＣｒｏｓｓｌｉｎｋｅｒ（商標）２４００（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｉｎｃ、カリフォルニア州ＬａＪｏｌｌａ）を使用するＵＶ架橋性により固定し、その後ＱＵＩＣＫＨＹＢ（商標）ハイブリダイゼーション溶液（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カリフォルニア州ＬａＪｏｌｌａ）を厳密な条件に関する製造元の推奨規定を使用しプローブした。

ヒトの標的を検出するために、ヒトの標的特異的プライマープローブセットを、ＰＣＲにより調整し、ローディングの際の変動を正規化し、移動効率性メンブランが取り除かれ、ヒトのグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）ＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、カリフォルニア州ＰａｌｏＡｌｔｏ）に関しプローブした。

ハイブリダイズされたメンブランを、ＰＨＯＳＰＨＯＲＩＭＡＧＥＲ（商標）とＩＭＡＧＥＱＵＡＮＴ（商標）ＳｏｆｔｗａｒｅＶ３．３（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｙｎａｍｉｃｓ、カリフォルニア州Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ）を用いて視覚化し定量化した。データを、非処理の対照のＧＡＰＤＨレベルに標準化した。

オリゴマー化合物によるヒトの標的発現阻害
本発明に従い、一連のオリゴマー化合物を、ヒトの標的ＲＮＡの異なる領域を標的化するように設計する。オリゴマー化合物を、定量的リアルタイムＰＣＲによりヒトの標的ｍＲＮＡレベル上でのその効果が分析し、本明細書における他の実施例において記載される。データは、３つの実験からの平均である。これらの好まれる配列に相補的な標的領域は、本明細書において"好まれる標的断片"であり、従って本発明のオリゴマー化合物による標的化に好まれる。配列は、好まれるオリゴマー化合物の逆の相補体を表す。

"好まれる標的断片"が本発明のオリゴマー化合物のハイブリダイゼーションに開かれた或いはアクセス可能な実験により見出されている故、当業者は、単なるルーチン実験のみをし、本発明のさらなる実施形態を理解する或いは確認でき、この実施形態は、これら好まれる標的断片に特異的にハイブリダイズし、その結果標的発現を阻害する他のオリゴマー化合物を含む。

本発明によると、オリゴマー化合物は、アンチセンスオリゴマー化合物、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、外部のガイド配列（ＥＧＳ）オリゴヌクレオチド、替わりのスプライサー、プライマー、プローブ、及び他の短いオリゴマー化合物で標的核酸の部位に少なくともハイブリダイズする化合物を含む。

標的タンパク質レベルのウエスタンブロット解析
ウエスタンブロット分析（免疫ブロット分析）を、標準的な分析法を使用し実行する。細胞を、オリゴヌクレオチド処理の１６〜２０時間後回収し、ＰＢＳで１回洗浄し、Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液中（１００ｕｌ／ウェル）で懸濁し、５分間沸騰し、１６％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにロードする。ゲルを、１５０Ｖで１．５時間流し、ウエスタンブロッティングのメンブランへ移す。標的方向に向けられた適切な一次抗体を、一次抗体種に向けられた放射標識された又は蛍光標識された主要な二次抗体と共に使用した。バンドを、ＰＨＯＳＰＨＯＲＩＭＡＧＥＲ（商標）（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｙｎａｍｉｃｓ、カリフォルニア州Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ）を用いて視覚化する。

代表的な細胞系
ＭＣＦ−７細胞
ヒトの乳癌細胞系ＭＣＦ−７を、ｔｈｅＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（バージニア州Ｍａｎａｓｓａｓ）から得る。これらの細胞は、野性型ｐ５３遺伝子を含む。ＭＣＦ−７細胞を、型通りに１０％のウシ胎仔血清（Ｇｉｂｃｏ／ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、メリーランド州Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）で懸濁されたＤＭＥＭ低グルコース（Ｇｉｂｃｏ／ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、メリーランド州Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）中で培養する。細胞を、９０％の密度に達した歳、型通りにトリプシン処理及び希釈により継代培養する。細胞を、本発明のオリゴマー化合物での処理のために７０００細胞／ウェルの密度で９６ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ−Ｐｒｉｍａｒｉａ＃３８７２）に入れる。

ＨｅｐＢ３細胞
ヒトの肝癌細胞系ＨｅｐＢ３（Ｈｅｐ３Ｂ２．１−７）を、ｔｈｅＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ−ＡＴＣＣＣａｔａｌｏｇ＃ＨＢ−８０６４）（バージニア州Ｍａｎａｓｓａｓ）から得る。この細胞系は、もともと８才の黒人男性の肝細胞癌腫に由来した。細胞は、形態において上皮性で及びヌードマウスにおいて腫瘍形成性である。ＨｅｐＢ３細胞を、型通りにアールの均衡塩類溶液、２ｍＭのＬ−グルタミン、１．５ｇ／Ｌ重炭酸ナトリウム、０．１ｍＭの可欠アミノ酸、１．０ｍＭのナトリウム・ピルベート（ＡＴＣＣ＃２０−２００３、バージニア州Ｍａｎａｓｓａｓ）を及び熱で非活性化された１０％のウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ／ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、メリーランド州Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）を有する最小必須培地（ＭＥＭ）で培養する。細胞を、９０％の密度に達した歳、型通りにトリプシン処理及び希釈により継代培養する。

Ｔ−２４細胞
移行性細胞膀胱癌細胞系Ｔ−２４を、ｔｈｅＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（バージニア州Ｍａｎａｓｓａｓ）から得る。Ｔ−２４の細胞を、型通りに１０％のウシ胎仔血清（Ｇｉｂｃｏ／ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、メリーランド州Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）１ｍＬにつき１００のユニットのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ／ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、メリーランド州Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）で補充される完全なＭｃＣｏｙ’ｓ５Ａ基本培地（Ｇｉｂｃｏ／ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、メリーランド州Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）で培養する。細胞を、９０％の密度に達した歳、型通りにトリプシン処理及び希釈により継代培養する。細胞を、本発明のオリゴマー化合物での処理のために７０００細胞／ウェルの密度で９６ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ−Ｐｒｉｍａｒｉａ＃３８７２）に入れる。

Ａ５４９細胞
ヒトの肺癌細胞系Ａ５４９を、ｔｈｅＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（バージニア州Ｍａｎａｓｓａｓ）から得る。Ａ５４９細胞は、型通りに１０％のウシ胎仔血清（Ｇｉｂｃｏ／ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、メリーランド州Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）１ｍＬにつき１００のユニットのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ／ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、メリーランド州Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）で補充される完全なＤＭＥＭ基本培地（Ｇｉｂｃｏ／ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、メリーランド州Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）で培養する。細胞を、９０％の密度に達した歳、型通りにトリプシン処理及び希釈により継代培養する。細胞を、本発明のオリゴマー化合物での処理のために７０００細胞／ウェルの密度で９６ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ−Ｐｒｉｍａｒｉａ＃３８７２）に入れる。

主要なマウス肝細胞
主要なマウス肝細胞を、ＣｈａｒｌｅｓＲｉｖｅｒＬａｂｓから購入されるＣＤ−１マウスから調整する。主要なマウス肝細胞を、型通りに１０％のウシ胎仔血清（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄ）、２５０ｎＭデキサメタゾン（Ｓｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ミズーリ州Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）、１０ｎＭウシインスリン（Ｓｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ミズーリ州Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）で補充される肝細胞接着培地（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄ）で培養する。細胞を、本発明のオリゴマー化合物での処理のために４０００〜６０００細胞／ウェルの密度で９６ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ−Ｐｒｉｍａｒｉａ＃３５３８７２、ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、マサチューセッツ州Ｂｅｄｆｏｒｄ）に入れる。

本発明のオリゴマー化合物でのリポソームにより媒介される処理
細胞が望まれる密度に達した際、リポソームにより媒介されるトランスフェクションにより本発明のオリゴマー化合物で処理し得る。９６ウェルプレートにおいて増殖された細胞に関し、ウェルを、２００μＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭ（商標）−１血清使用量低減培地（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）で１回洗浄し、その後２．５μｇ／ｍＬのＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（商標）（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）を含む１００μＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭ（商標）−１及び望まれる終濃度での本発明のオリゴマー化合物で処理する。処理の４時間後、培地を新しい培地と取り替える。細胞を、リアルタイムＰＣＲによる標的ｍＲＮＡの発現解析のために本発明のオリゴマー化合物で処理した１６時間後に回収する。

本発明のオリゴマー化合物でのエレクトロポレーションにより媒介される処理
細胞が望まれる密度に達した際、エレクトロポレーションによる本発明のオリゴマー化合物で処理し得る。細胞を、１ｍｍのキュベットにおける望まれる濃度の本発明のオリゴマー化合物の存在下１×１０^７細胞／ｍＬの密度、７５Ｖの電圧及び６ｍｓのパルス長でエレクトロポレーションする。電気パルスの送達に引き続き、細胞を１６〜２４時間で取り替える。細胞を、その後リアルタイムＰＣＲにより標的ｍＲＮＡの発現解析のために回収する。

アポトーシスアッセイ
カスパーゼ−３の活性を、蛍光分析によるＨＴＳカスパーゼ−３アッセイ（ＯｎｃｏｇｅｎｅＲｅｓｅａｒｃｈＰｒｏｄｕｃｔｓ、カリフォルニア州ＳａｎＤｉｅｇｏ）でペプチド配列（ＤＥＶＤ）におけるアスパルテート残基後の切断を検出するものにより評価する。ＤＥＶＤ基質を蛍光分子により標識し、切断の際に蛍光の青から緑への変化を示す。処理された細胞における活性カスパーゼ−３を、製造元の規定に従いこのアッセイにより測定する。本発明のオリゴマー化合物での処理に引き続き、５０μＬのアッセイ緩衝液を各ウェルに加え、２０μＬのカスパーゼ−３蛍光基質結合物を添加する。データを３組得る。ウェルの蛍光を、蛍光性プレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭＡＸＧｅｍｉｎｉＸＳ、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ、カリフォルニア州Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ）を使用し（励起／発光４００／５０５ナノメートル）直ちに検出される。プレートは、カバーされ、さらに３時間３７℃でインキュベートされ、その後蛍光が再び蛍光（励起／発光４００／５０５ナノメートル）が測定される。時間ゼロでの値は、３時間で得られた測定値から減じられる。非処理の対照細胞から得られる測定値は、１００％活性として表される。

細胞増殖及び生存率測定
細胞生育性及び増殖は、ＣｙＱｕａｎｔＧＲ緑色蛍光色素で細胞性核酸に結合する際強い蛍光増進を呈するＣｙＱｕａｎｔ細胞増殖アッセイキット（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ、オレゴン州Ｅｕｇｅｎｅ）を使用して測定される。アッセイは、製造元の規定に従いなされる。本発明の１つ若しくはそれ以上のオリゴマー化合物での処理後、ミクロプレートは、ウェルから培地を除去するためにそっと裏返され、２００μＬのリン酸塩緩衝食塩水で１回洗浄される。プレートは−７０℃で凍結し、その後融解される。ＣｙＱＵＡＮＴＧＲ色素／細胞−細胞溶解緩衝液の２００μＬの体積は、各ウェルに加えられる。ミクロプレートは、５分間室温で、光に当たらない状況で培養される。データは、三組得られる。ウェルの蛍光を、蛍光性プレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭＡＸＧｅｍｉｎｉＸＳ、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ、カリフォルニア州Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ）を使用し（励起／発光４８０／５２０ナノメートル）直ちに検出する。非処理の対照細胞から得られる測定値を、１００％活性として表す。

レプチン欠損マウス：肥満症及び糖尿病（ｏｂ／ｏｂマウス）のモデル
レプチンは、食欲を制御する脂肪によって生産されるホルモンである。ヒト及びヒト以外の動物両者におけるこのホルモンの欠失は、肥満症に至る。ｏｂ／ｏｂマウスは、肥満症及び高血糖をもたらすレプチン遺伝子の突然変異を有する。このように、肥満症並びに糖尿病の調査及びこれらの条件を処理するように設計される処理にマウスは有益なモデルである。ｏｂ／ｏｂマウスは、インシュリンのより高い循環レベルを有し、ｄｂ／ｄｂマウスより高血糖性ではなく、レプチン受容体における突然変異を隠す。本発明に従い、本発明のオリゴマー化合物を、肥満症及び糖尿病のｏｂ／ｏｂモデルにおいて試験する。

７週間目の雄Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊ−Ｌｅｐｒｏｂ／ｏｂマウス（ＪａｃｋｓｏｎＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、メイン州ＢａｒＨａｒｂｏｒ）に、１０〜１５％の脂肪量を有する食餌を与え、４週間週に２回２５ｍｇ／ｋｇの投与量で皮下に本発明のオリゴマー化合物又は対照化合物を注射する。整理食塩水注射された動物、レプチン野生型腹子（すなわち、やせた腹子）、及び標準の齧歯動物食餌を入れられたｏｂ／ｏｂマウスは、対照として役立つ。処理期間以後、マウスを、犠牲にし、標的レベルは肝臓、褐色脂肪組織（ＢＡＴ）、及び白色脂肪組織（ＷＡＴ）において評価する。ＲＮＡ単離及び標的ｍＲＮＡ発現レベル定量を、本明細書において記載される他の実施例により行う。

標的ｍＲＮＡの阻害から生じる生理作用を査定するために、ｏｂ／ｏｂマウスは、血清脂質、血清のない脂肪酸、血清コレステロール（ＣＨＯＬ）、肝臓トリグリセライド、脂肪組織トリグリセライド、及び肝臓酵素レベルに関し処理期間の終わりに、更に評価する。肝性脂肪症又は肝臓から脂質を除去することを、肝臓トリグリセライド含量を測定することにより査定する。肝性脂肪症を、油性赤Ｏ色素で染色される凍結肝臓組織切片の定型的組織学分析により査定し、脂質沈澱物を視覚化するために共通して使用し及び核並びに細胞原形質を視覚化するためにヘマトキシリン及びエオジンそれぞれで対比染色した。

グルコース及びインシュリン新陳代謝の際の標的阻害の効果を、本発明のオリゴマー化合物で処理されるｏｂ／ｏｂマウスにおいて評価する。プラズマグルコースは、処理の開始時及び処置後２週並びに４週間で測定する。プラズマインシュリンは、同様に処理の初めに測定し処理の２週及び４週後も続く。グルコース及びインシュリン耐性試験でまた、餌を与えられた及び断食されたマウスにおいて投与する。マウスに、インシュリン又はグルコースの一方の腹こう内注射をし、血液中のグルコース及びインシュリンレベルを、グルコース注射前に又は３時間までの１５分、２０分、又は３０分間隔で測定する。本発明のオリゴマー化合物で処理されるｏｂ／ｏｂマウスの代謝速度を査定するために、マウスの呼吸商及び酸素消費をまた、測定する。

処理を受けたｏｂ／ｏｂマウスを、脂質代謝、コレステロール生合成、脂肪酸酸化、脂肪酸貯蔵、グルコネオゲネシス、及びグルコース新陳代謝に関係する発現遺伝子に対する標的阻害効果に関して処理期間の終わりに、更に評価する。これらの遺伝子は、これに限定されるものではないが、ＨＭＧ−コエンザイムＡレダクターゼ、アセチルコエンザイムＡカルボキシラーゼ１、及びアセチルコエンザイムＡカルボキシラーゼ２、カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼＩ、グリコーゲンホスホリラーゼ、グルコース−６−ホスファターゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ１、リポタンパク質リパーゼ、ホルモンセンサティブリパーゼを含む。肝臓及び白色並びに茶色脂肪組織のｍＲＮＡレベルを、本明細書において、他の実施例において記載するようにリアルタイムＰＣＲにより定量化し、注目する各遺伝子の公開された配列を使用し作られたプライマ−プローブセットを使用する。

レプチン受容体欠損マウス：肥満症及び糖尿病（ｄｂ／ｄｂマウス）のモデル
レプチンは、食欲を制御する脂肪によって生産されるホルモンである。ヒト及びヒト以外の動物両者におけるこのホルモンの欠失は、肥満症に至る。ｄｂ／ｄｂマウスは、肥満症及び高血糖をもたらすレプチン遺伝子の突然変異を有する。このように、肥満症並びに糖尿病の調査及びこれらの条件を処理するように設計される処理にマウスは有益なモデルである。ｄｂ／ｄｂマウスは、インシュリンのより低い循環レベルを有し、ｏｂ／ｏｂマウスより高血糖性であり、レプチン遺伝子における突然変異を隠し、タイプ２の糖尿病齧歯動物モデルとして使用する。本発明に従い、本発明のオリゴマー化合物を、肥満症及び糖尿病のｄｂ／ｄｂモデルにおいて試験する。

７週間目の雄Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊ−Ｌｅｐｒｄｂ／ｄｂマウス（ＪａｃｋｓｏｎＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、メイン州ＢａｒＨａｒｂｏｒ）に、１０〜１５％の脂肪量を有する食餌を与え、４週間週に２回２５ｍｇ／ｋｇの投与量で皮下に本発明のオリゴマー化合物又は対照化合物を注射する。整理食塩水注射された動物、レプチン野生型腹子（すなわち、やせた腹子）、及び標準の齧歯動物食餌を入れられたｄｂ／ｄｂマウスは、対照として役立つ。処理期間以後、マウスを、犠牲にし、標的レベルを肝臓、褐色脂肪組織（ＢＡＴ）、及び白色脂肪組織（ＷＡＴ）において評価する。ＲＮＡ単離及び標的ｍＲＮＡ発現レベル定量を、本明細書において記載される他の実施例により行う。

処理期間以後、マウスを犠牲にし、標的レベルを肝臓、褐色脂肪組織（ＢＡＴ）、及び白色脂肪組織（ＷＡＴ）において評価する。ＲＮＡ単離及び標的ｍＲＮＡ発現レベル定量を、本明細書において記載される他の実施例により行う。

標的ｍＲＮＡの阻害から生じる生理作用を査定するために、ｄｂ／ｄｂマウスを、血清脂質、血清のない脂肪酸、血清コレステロール（ＣＨＯＬ）、肝臓トリグリセライド、脂肪組織トリグリセライド及び肝臓酵素レベルに関し処理期間の終わりに、更に評価する。肝性脂肪症又は肝臓から脂質を除去することを、肝臓トリグリセライド含量を測定することにより査定する。肝性脂肪症を、油性赤Ｏ色素で染色される凍結肝臓組織切片の定型的組織学分析により査定し、脂質沈澱物を視覚化するために共通して使用し、核並びに細胞原形質を視覚化するためにヘマトキシリン並びにエオジンそれぞれで対比染色した。

グルコース及びインシュリン新陳代謝の際の標的阻害の効果を、本発明のオリゴマー化合物で処理されるｄｂ／ｄｂマウスにおいて評価する。プラズマグルコースを、処理の開始時及び処置後２週並びに４週間で測定する。プラズマインシュリンを、同様に処理の初めに測定し、処理の２週及び４週後も続ける。グルコース及びインシュリン耐性試験でまた、餌を与えられた及び断食されたマウスにおいて投与する。マウスに、インシュリン又はグルコースの一方の腹こう内注射をし、血液中のグルコース及びインシュリンレベルを、グルコース注射前に又は注射後１５分、３０分、６０分、９０分、及び１２０分間隔で測定する。本発明のオリゴマー化合物で処理するｄｂ／ｄｂマウスの代謝速度を査定するために、マウスの呼吸商及び酸素消費をまた、測定する。

処理を受けたｄｂ／ｄｂマウスを、脂質代謝、コレステロール生合成、脂肪酸酸化、脂肪酸貯蔵、グルコネオゲネシス、及びグルコース新陳代謝に関係する発現遺伝子に対する標的阻害効果に関して処理期間の終わりに、更に評価する。これらの遺伝子は、これに限定されるものではないが、ＨＭＧ−コエンザイムＡレダクターゼ、アセチルコエンザイムＡカルボキシラーゼ１、及びアセチルコエンザイムＡカルボキシラーゼ２、カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼＩ、グリコーゲンホスホリラーゼ、グルコース−６−ホスファターゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ１、リポタンパク質リパーゼ、ホルモンセンサティブリパーゼを含む。肝臓及び白色並びに茶色脂肪組織のｍＲＮＡレベルを、本明細書において、他の実施例において記載するようにリアルタイムＰＣＲにより定量化し、注目する各遺伝子の公開された配列を使用し作られたプライマ−プローブセットを使用する。

標準の齧歯動物食餌に関するやせたマウス
Ｃ５７Ｂｌ／６マウスを標準の齧歯動物食餌で維持し、対照の（やせた）動物として使用する。本発明の更なる実施形態において、本発明のオリゴマー化合物を、正常なやせた動物において試験する。７週間目の雄Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに、４％の脂肪量を有する食餌を与え、４週間週に２回２５ｍｇ／ｋｇの投与量で皮下に本発明のオリゴマー化合物又は対照化合物を注射する。整理食塩水注射した動物は、対照として役立つ。処理期間以後、マウスを、犠牲にし、標的レベルを、肝臓、褐色脂肪組織（ＢＡＴ）、及び白色脂肪組織（ＷＡＴ）において評価する。ＲＮＡ単離及び標的ｍＲＮＡ発現レベル定量を、本明細書において記載する他の実施例により行う。

処理期間以後、マウスを、犠牲にし、標的レベルを、肝臓、褐色脂肪組織（ＢＡＴ）、及び白色脂肪組織（ＷＡＴ）において評価する。ＲＮＡ単離及び標的ｍＲＮＡ発現レベル定量を、本明細書において記載する他の実施例により行う。

標的ｍＲＮＡの阻害から生じる生理作用を査定するために、やせたマウスを、血清脂質、血清のない脂肪酸、血清コレステロール（ＣＨＯＬ）、肝臓トリグリセライド、脂肪組織トリグリセライド、及び肝臓酵素レベルに関し処理期間の終わりに、更に評価する。肝性脂肪症又は肝臓から脂質を除去することを、肝臓トリグリセライド含量を測定することにより査定する。肝性脂肪症を、油性赤Ｏ色素で染色される凍結肝臓組織切片の定型的組織学分析により査定し、脂質沈澱物を視覚化するために共通して使用し、核並びに細胞原形質を視覚化するためにヘマトキシリン並びにエオジンそれぞれで対比染色された。

グルコース及びインシュリン新陳代謝の際の標的阻害の効果を、本発明のオリゴマー化合物で処理されるやせたマウスにおいても評価する。プラズマグルコースを、処理の開始時及び処置後２週並びに４週間で測定する。プラズマインシュリンを、同様に処理の初めに測定し、処理の２週及び４週後も続ける。グルコース及びインシュリン耐性試験でまた、餌を与えられた及び断食されたマウスにおいて投与する。マウスに、インシュリン又はグルコースの一方の腹こう内注射をし、血液中のグルコース及びインシュリンレベルを、グルコース注射前に又は注射後１５分、３０分、６０分、９０分、及び１２０分間隔で測定する。本発明のオリゴマー化合物で処理するやせたマウスの代謝速度を査定するために、マウスの呼吸商及び酸素消費はまた、測定する。

処理を受けた傾きマウスを、脂質代謝、コレステロール生合成、脂肪酸酸化、脂肪酸貯蔵、グルコネオゲネシス、及びグルコース新陳代謝に関係する発現遺伝子に対する標的阻害効果に関して処理期間の終わりに、更に評価する。これらの遺伝子は、これに限定されるものではないが、ＨＭＧ−コエンザイムＡレダクターゼ、アセチルコエンザイムＡカルボキシラーゼ１、及びアセチルコエンザイムＡカルボキシラーゼ２、カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼＩ、グリコーゲンホスホリラーゼ、グルコース−６−ホスファターゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ１、リポタンパク質リパーゼ、ホルモンセンサティブリパーゼを含む。肝臓及び白色並びに茶色脂肪組織のｍＲＮＡレベルを、本明細書において、他の実施例において記載するようにリアルタイムＰＣＲにより定量化し、注目する各遺伝子の公開された配列を使用し作られたプライマ−プローブセットを使用する。

本出願において参照された各刊行物は、これに限定されないが、本、参考文献、特許、及び特許出願を含み、本明細書においてそれらの全体が組み込まれることが意図される。

Claims

第１のオリゴマー化合物と第２のオリゴマー化合物とを有する組成物であって、
前記第１のオリゴマー化合物の少なくとも一部は、前記第２のオリゴマー化合物の少なくとも一部とハイブリダイズすることができ、
前記第１のオリゴマー化合物の少なくとも一部は、選択された標的核酸と相補的であり、且つハイブリダイズすることができ、
前記第１のオリゴマー化合物は、インターヌクレオシド連結基によって連結された複数の連結ヌクレオシドを有し、前記ヌクレオシドは、３つの領域を有するものであり、
ここで、前記３つの領域の各々は、少なくとも１つの観点において、別個に修飾されたリボフラノシル糖部分を有することによって他の２つの領域の各々と区別されており、若しくは、１つの領域は、β−Ｄ−リボフラノシル糖部分を有するものであり、他の２つの領域は、少なくとも１つの観点において、別個に修飾されたリボフラノシル糖部分を有することによって他の２つの領域の各々と区別されており、
前記第２のオリゴマー化合物は、インターヌクレオシド連結基によって連結された複数の連結ヌクレオシドを有し、
前記第１及び第２のオリゴマー化合物の各々は、選択的にリン酸基、３’−オーバーハング、若しくは結合基を有するものである、組成物。
請求項１記載の組成物において、修飾されたリボフラノシル糖部分の前記領域の各々は、均一に修飾されるものである、組成物。
請求項１記載の組成物において、少なくとも１つの領域は、３’−末端配座配置を有するヌクレオシドを有するものである、組成物。
請求項３記載の組成物において、前記３つの領域の各々は、３’−末端配座配置を有するヌクレオシドを有するものである、組成物。
請求項１記載の組成物において、少なくとも１つの領域は、２’−置換リボフラノシル部分を有するものであり、前記２’−置換基は、−Ｆ、−Ｏ−ＣＨ_２ＣＨ_２−Ｏ−ＣＨ_３、−ＯＣ_１−Ｃ_１２アルキル、−Ｏ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＮＨ_２、−Ｏ−（ＣＨ_２）_２−Ｏ−Ｎ（Ｒ_１）_２、−Ｏ−ＣＨ_２Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｒ_１）_２、−Ｏ−（ＣＨ_２）_２−Ｏ−（ＣＨ_２）_２−Ｎ（Ｒ_１）_２、−Ｏ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＮＨＲ_１、−Ｎ_３、−Ｏ−ＣＨ_２−ＣＨ＝ＣＨ_２、−ＮＨＣＯＲ_１、−ＮＨ_２、−ＮＨＲ_１、−Ｎ（Ｒ_１）_２、−ＳＨ、−ＳＲ_１、−Ｎ（Ｈ）ＯＨ、−Ｎ（Ｈ）ＯＲ_１、−Ｎ（Ｒ_１）ＯＨ、−Ｎ（Ｒ_１）ＯＲ_１、若しくは−Ｏ−ＣＨ_２−Ｎ（Ｈ）−Ｃ（＝ＮＲ_１）［Ｎ（Ｒ_１）_２］であり、
各々のＲ_１は、個別に、Ｈ、Ｃ_１〜Ｃ_１２アルキル、保護基又は置換或いは非置換Ｃ_１〜Ｃ_１２アルキル、Ｃ_２〜Ｃ_１２アルケニル、若しくはＣ_２〜Ｃ_１２アルキニルであり、前記置換基は、ハロゲン、ヒドロキシル、アミノ、アジド、シアノ、ハロアルキル、アルケニル、アルコキシ、チオアルコキシ、ハロアルコキシ、若しくはアリールから選択されるものである、組成物。
請求項５記載の組成物において、前記２’−置換基の各々は、個別に、−Ｆ、−Ｏ−ＣＨ_３、−Ｏ−ＣＨ_２ＣＨ_２−Ｏ−ＣＨ_３、−Ｏ−ＣＨ_２−ＣＨ＝ＣＨ_２、Ｎ_３、ＮＨ_２、ＮＨＯＨ、−Ｏ−（ＣＨ_２）_２−Ｏ−Ｎ（Ｒ_１）_２、−Ｏ−ＣＨ_２Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｒ_１）_２、−Ｏ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＮＨ_２、−Ｏ−（ＣＨ_２）_２−Ｏ−（ＣＨ_２）_２−Ｎ（Ｒ_１）_２、若しくは−Ｏ−ＣＨ_２−Ｎ（Ｈ）−Ｃ（＝ＮＲ_１）［Ｎ（Ｒ_１）_２］であり、
各々のＲ_１は、個別に、Ｈ、Ｃ_１〜Ｃ_１２アルキル、保護基又は置換或いは非置換Ｃ_１〜Ｃ_１２アルキル、Ｃ_２〜Ｃ_１２アルケニル、若しくはＣ_２〜Ｃ_１２アルキニルであり、前記置換基は、ハロゲン、ヒドロキシル、アミノ、アジド、シアノ、ハロアルキル、アルケニル、アルコキシ、チオアルコキシ、ハロアルコキシ、若しくはアリールから選択されるものである、組成物。
請求項６記載の組成物において、前記２’−置換基の各々は、個別に、−Ｆ、−Ｏ−ＣＨ_２ＣＨ_２−Ｏ−ＣＨ_３、−Ｏ−ＣＨ_３、−Ｏ−ＣＨ_２−ＣＨ＝ＣＨ_２、若しくは−Ｏ−ＣＨ_２−ＣＨ−ＣＨ_２−ＮＨ（Ｒ_ｊ）であり、Ｒ_ｊはＨ若しくはＣ_１〜Ｃ_１０アルキルである、組成物。
請求項７記載の組成物において、前記２’−置換基の各々は、個別に、−Ｆ、−Ｏ−ＣＨ_３、若しくは−Ｏ−ＣＨ_２ＣＨ_２−Ｏ−ＣＨ_３である、組成物。
請求項８記載の組成物において、前記２’−置換基の各々は、個別に、−Ｆ若しくは−Ｏ−ＣＨ_３である、組成物。
請求項１記載の組成物において、前記領域の１つは、４’−チオ修飾ヌクレオシドを有するものである、組成物。
請求項１記載の組成物において、前記第１のオリゴマー化合物は、β−Ｄ−リボフラノシル糖部分の１つの領域と、リボフラノシル糖部分の別個に修飾された２つの領域とを有するものである、組成物。
請求項１１記載の組成物において、前記３つの領域は、２つの外側領域及び１つの内側領域を有するものであり、前記内側領域は、β−Ｄ−リボフラノシル糖部分を有するものである、組成物。
請求項１２記載の組成物において、５’−外側領域は、２’−Ｆ修飾リボフラノシル糖部分若しくは４’−チオ修飾リボフラノシル部分を有するものであり、前記内側領域は、β−Ｄ−リボフラノシル糖部分を有するものであり、また３’−外側領域は、２’−ＯＣＨ_３修飾リボフラノシル糖部分、４’−チオ修飾リボフラノシル部分、４’−ＣＨ_２−Ｏ−２’−架橋を各々有する修飾リボフラノシル部分、若しくは４’−（ＣＨ_２）_２−Ｏ−２’−架橋を各々有するリボフラノシル部分を有するものである、組成物。
請求項１記載の組成物において、前記第１のオリゴマー化合物は、リボフラノシル糖部分の前記３つの別個に修飾された領域を有するものであり、各々の領域は、２’−Ｆ修飾リボフラノシル糖部分、２’−ＯＣＨ_３修飾リボフラノシル糖部分、４’−チオ修飾リボフラノシル部分、４’−ＣＨ_２−Ｏ−２’−架橋を各々有する修飾リボフラノシル部分、若しくは４’−（ＣＨ_２）_２−Ｏ−２’−架橋を各々有するリボフラノシル部分から選択される、均一に修飾されたリボフラノシル部分を有するものである、組成物。
請求項１４記載の組成物において、前記３つの領域は、２つの外側領域及び１つの内側領域を有するものであり、前記５’−外側領域は、４’−チオ修飾リボフラノシル部分を有するものであり、前記内側領域は、２’−Ｆ修飾リボフラノシル糖部分を有するものであり、また前記３’−外側領域は、２’−ＯＣＨ_３修飾リボフラノシル糖部分、４’−ＣＨ_２−Ｏ−２’−架橋を各々有する修飾リボフラノシル部分、若しくは４’−（ＣＨ_２）_ｎｎ−Ｏ−２’−架橋を各々有するリボフラノシル部分を有するものである、組成物。
請求項１記載の組成物において、前記第１のオリゴマー化合物は、２つの外側領域及び１つの内側領域を有するものであり、前記外側領域は、各々１〜６個のヌクレオシドを有するものであり、前記内側領域は、６〜１４個のヌクレオシドを有するものである、組成物。
請求項１記載の組成物において、前記第１のオリゴマー化合物は、２つの外側領域及び１つの内側領域を有するものであり、前記外側領域は、各々２〜５個のヌクレオシドを有するものであり、前記内側領域は、８〜１３個のヌクレオシドを有するものである、組成物。
請求項１記載の組成物において、前記第１のオリゴマー化合物は、２つの外側領域及び１つの内側領域を有するものであり、前記外側領域は、各々２〜３個のヌクレオシドを有するものであり、前記内側領域は、１０〜１３個のヌクレオシドを有するものである、組成物。
請求項１記載の組成物において、前記第１のオリゴマー化合物は、２つの外側領域及び１つの内側領域を有するものであり、前記外側領域は、各々１〜３個のヌクレオシドを有するものであり、前記内側領域は、１３〜１７個のヌクレオシドを有するものであり、前記第１のオリゴマー化合物は、１９個のヌクレオシドを有するものである、組成物。
請求項１記載の組成物において、前記第１のオリゴマー化合物は、２つの外側領域及び１つの内側領域を有するものであり、前記外側領域は、各々２〜５個のヌクレオシドを有するものであり、前記内側領域は、１０〜１４個のヌクレオシドを有するものであり、前記第１のオリゴマー化合物は、２０個のヌクレオシドを有するものである、組成物。
請求項１記載の組成物において、この組成物は更に、少なくとも１つの５’−リン酸基を有するものである、組成物。
請求項１記載の組成物において、この組成物は更に、末端３’−ＯＨ基を有するものである、組成物。
請求項１記載の組成物において、この組成物は更に、少なくとも１つの結合基を有するものである、組成物。
請求項１記載の組成物において、前記第１及び前記第２のオリゴマー化合物の各々のヌクレオシドは、リン酸ジエステルインターヌクレオシド連結基によって連結されるものである、組成物。
請求項１記載の組成物において、前記第１及び前記第２のオリゴマー化合物の各々のヌクレオシドは、ホスホロチオエートインターヌクレオシド連結基によって連結されるものである、組成物。
請求項１記載の組成物において、前記第１及び前記第２のオリゴマー化合物の１つのヌクレオシドは、ホスホロチオエートインターヌクレオシド連結基によって連結されるものであり、また前記第１及び第２のオリゴマー化合物の他のヌクレオシドは、リン酸ジエステルインターヌクレオシド連結基によって連結されるものである、組成物。
請求項１記載の組成物において、前記第１のオリゴマー化合物のヌクレオシドは、ホスホロチオエートインターヌクレオシド連結基によって連結されるものであり、また前記第２のオリゴマー化合物のヌクレオシドは、リン酸ジエステルインターヌクレオシド連結基によって連結されるものである、組成物。
請求項１記載の組成物において、前記第１及び前記第２のオリゴマー化合物の各々のヌクレオシドは、個別に、ホスホロチオエート若しくはリン酸ジエステルインターヌクレオシド連結基によって連結されるものである、組成物。
請求項２８記載の組成物において、前記第１及び前記第２のオリゴマー化合物の少なくとも１つは、個別に、ホスホロチオエート及びリン酸ジエステルインターヌクレオシド連結基によって交互に連結されるものである、組成物。
請求項１記載の組成物において、前記第１及び前記第２のオリゴマー化合物の少なくとも１つは更に、３’−末端、５’−末端、若しくは３’−末端及び５’−末端の両方に結合された少なくとも１つの末端キャップ部分を有するものである、組成物。
請求項３０記載の組成物において、前記末端キャップ部分は、反転デオキシ脱塩基部分である、組成物。
請求項３１記載の組成物において、前記第２のオリゴマー化合物は、前記３’−末端及び前記５’−末端の一方若しくは両方に末端キャップ部分を有するものである、組成物。
請求項３２記載の組成物において、前記末端キャップ部分は、反転デオキシ脱塩基部分である、組成物。
請求項１記載の組成物において、前記第１及び前記第２のオリゴマー化合物は、ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドの相補対である、組成物。
請求項１記載の組成物において、前記第１及び前記第２のオリゴマー化合物の各々は、約８〜約８０個の核酸塩基を有するものである、組成物。
請求項１記載の組成物において、前記第１及び前記第２のオリゴマー化合物の各々は、約１０〜約５０個の核酸塩基を有するものである、組成物。
請求項１記載の組成物において、前記第１及び前記第２のオリゴマー化合物の各々は、約１２〜約３０個の核酸塩基を有するものである、組成物。
請求項１記載の組成物において、前記第１及び前記第２のオリゴマー化合物の各々は、約１２〜約２４個の核酸塩基を有するものである、組成物。
請求項１記載の組成物において、前記第１及び前記第２のオリゴマー化合物の各々は、約１９〜約２３個の核酸塩基を有するものである、組成物。
請求項１記載の組成物において、前記第１のオリゴマー化合物は、アンチセンスオリゴヌクレオチドである、組成物。
請求項１記載の組成物において、前記第２のオリゴマー化合物は、センスオリゴヌクレオチドである、組成物。
請求項１の組成物と少なくとも１つのタンパク質とを有する組成物であって、前記タンパク質は、ＲＮＡ−誘導性サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）の少なくとも一部を有するものである、組成物。
遺伝子発現を阻害する方法であって、１若しくはそれ以上の細胞、組織、若しくは動物に請求項１の組成物を接触させる工程を有する、方法。
遺伝子発現を阻害する方法であって、１若しくはそれ以上の細胞、組織、若しくは動物に請求項１のオリゴマー化合物を接触させる工程を有する、方法。