JP3100166B2 - 光開裂性環状オリゴヌクレオチド - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は、光開裂性基により環状化されたオリゴヌク
レオチドに関する。

背景技術 オリゴヌクレオチドは、核酸の検出において特異的配
列を認識し検出するためのプローブとして、また遺伝子
工学の重要な手法であるPCR法のためのプライマーとし
て、更には近年の遺伝子治療の分野で活発に研究開発さ
れているアンチセンス法におけるアンチセンスオリゴヌ
クレオチドとして、生物および医療の分野で非常に重要
で有用な物質であることが知られている。

上記のオリゴヌクレオチドがそれぞれの機能を発揮す
るためには、いずれもオリゴヌクレオチドの有する塩基
配列部の相補配列へのいわゆるハイブリダイゼーション
能力を必要としている。

さらに、上記のアンチセンスオリゴヌクレオチドにつ
いては、ハイブリダイゼーション能力のみならず、その
生体内での安定性も要求される。例えばアンチセンスオ
リゴヌクレオチドを用いた遺伝情報の制御についての試
みがいくつかなされてきているが（例えば、Zamecnick,
Stephenson等、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,75,280−284
（ヌクレアーゼに対しては極めて低い耐性しかもたいな
ものが多く、生体内で望ましくない分解反応を受けるこ
とが問題となる。従って、実際これらの欠点を補うよう
な種々の修飾オリゴヌクレオチドが開発されている。

例えば、ホスホロチオエート（phosphorothioate）結
合を有するオリゴヌクレオチドであり、Ｓ−オリゴ（Ｓ
−Oligo）（DeClercq等、Science 165,1137−1139（196
9））と呼ばれているものであって、DNA自動合成機で容
易に合成され得るものであり、比較的ヌクレアーゼ耐性
がある（Wickstrom等、J.Biol.Biophys.Meth.,13 97−1
02（1986））ことが知られている。また、メチルホスホ
ネート（methylphosphonate）結合を有するオリゴヌク
レオチドであり、MP−オリゴ（MP−Oligo）（Miller
等、Biochemistry,18,5134−5142（1979））と呼ばれて
いるものであって、天然型のDNAのリン酸結合の酸素の
うちの１つをメチル基に置き換えることにより、ヌクレ
アーゼ耐性を有すると共に、リン酸部の電荷が無くなり
膜透過性が比較的良くなるものである。

しかし、上記Ｓ−オリゴは、リン酸結合部にキラル中
心を持つ多くの異性体をもつラセミ混合物であり、RNA
またはDNAとの親和性が低いという欠点があり（Cosstic
k等、Biochemistry 24,3630−3638（1985））、さらに
十分な生体内での安定性（すなわち、対ヌクレアーゼ耐
性）も有していないという欠点がある。

また、MP−オリゴも、Ｓ−オリゴ同様のラセミ混合物
であり、RNAまたはDNAとの親和性が低いという欠点があ
り、さらにリン酸部の電荷が無いことから水への溶解性
が低いという欠点がある。

さらには、従来知られているアンセンチスオリゴヌク
レオチドは、一度生体内に導入された後は、全くその活
性発現（例えば濃度、及び場所、時間）に関しては制御
不可能であるという欠点がある。

図面の簡単な説明 図１は本発明に係る光開裂性環状オリゴヌクレオチド
の１例を示すものであり、黒四角は、光開裂基を、塩基
配列Ａは、ターゲットの塩基配列Ｔとハイブリダイズ可
能な塩基配列を示す。

図２は図１に示す本発明に係る光開裂性環状オリゴヌ
クレオチド（小さな○で示す）が、細胞内に導入され、
拡散した後、細胞の一部を光照射されることで光開裂性
基が開裂し、直鎖状オリゴヌクレオチドに変換され、タ
ーゲットDNAとハイブリダイズしてアンチセンス活性を
発現することを示す図である。

図３は本発明に係る光開裂性環状オリゴヌクレオチド
の１例を示すものであり、黒四角は、光開裂基を、塩基
配列Ａはターゲットの塩基配列Ｔとハイブリダイズ可能
な塩基配列を、塩基配列Ｂはターゲットの塩基配列Ｓと
相互作用可能な塩基配列を示す。

図４は図３に示す本発明に係る光開裂性環状オリゴヌ
クレオチド（小さな○で示す）が、細胞内に導入され、
拡散した後、ターゲット核酸と相互作用して、複合体を
形成し、さらに細胞の一部を光照射されることで光開裂
性基が開裂し、直鎖状オリゴヌクレオチドに変換され、
ターゲットDNAとハイブリダイズしてアンチセンス活性
を発現することを示す図である。

図５はニトロベンジル型光開裂性基により、２種類の
オリゴヌクレオチドがリン酸エステル基で結合されてお
り、その結合が、光照射によりリン酸基と、ニトロソフ
ェニル誘導体になることを示す図である。

図６はニトロベンジル型光開裂性基により、２種類の
オリゴヌクレオチドがリン酸エステル基で結合されてお
り、その結合が、光照射によりリン酸基と、ニトロソフ
ェニル誘導体になることを示す図である。

図７は本発明に係る、ホスホアミダイト試薬の合成例
を示す図である。

図８は本発明に係る、他のホスホアミダイト試薬の合
成例を示す図である。

図９は本発明に係る光開裂性環状オリゴヌクレオチド
の調製法の一例を示すものであり、光開裂性基を導入し
たオリゴヌクレオチドの５′末端をリン酸化したもの
を、ビオチンが結合したテンプレートオリゴヌクレオチ
ドとハイブリダイズさせ、DNAリガーゼ反応により環状
化することを示す図である。

図10は本発明に係る環状または直鎖状オリゴヌクレオ
チドについてのヌクレアーゼ耐性試験を示す図である。

図11は本発明に係る環状または直鎖状オリゴヌクレオ
チドについての光開裂反応のポリアクリルアミドゲル電
気泳動の結果を示す写真であり、レーン1:直鎖状40mer
（２）、2:直鎖状40mer（２）を光照射したもの、3:合
成30mer（５）、4:環状40mer（２′）、5:環状40mer
（２′）を光照射したもの、6:合成40mer（６）を示
す。

図12は本発明に係る環状または直鎖状オリゴヌクレオ
チドについての光開裂反応のポリアクリルアミドゲル電
気泳動の結果を示す写真であり、レーン1:直鎖状40mer
（８）、2:直鎖状40mer（８）を光照射したもの、3:合
成30mer（５）、4:環状40mer（８′）、5:環状40mer
（８′）を光照射したもの、6:合成40mer（６）を示
す。

図13は直鎖状オリゴヌクレオチド（２）の光照射前の
HPLC分析結果を示す図である。

図14は直鎖状オリゴヌクレオチド（２）の光照射後の
HPLC分析結果を示す図である。

図15は直鎖状オリゴヌクレオチド（２）の光照射によ
る光開裂を示す図である。

図16は直鎖状オリゴヌクレオチド（８）の光照射によ
る光開裂を示す図である。

図17は本発明に係る環状オリゴヌクレオチドとターゲ
ット核酸の相互作用により形成される複合体を示すHPLC
の結果である。

図18は本発明に係る直鎖状オリゴヌクレオチドとター
ゲット核酸の相互作用により形成されるハイブリダイズ
体を示すHPLCの結果である。

発明の開示 本発明者は、上記説明した従来の修飾アンチセンスオ
リゴヌクレオチドの有する欠点に鑑みなされたもので、
これら欠点を解消し、RNAまたはDANとの親和性が十分高
く、しかも生体内で十分なヌクレアーゼ耐性を兼備する
新規構造を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを見
出し本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明に係る光開裂性環状オリゴヌクレオ
チドは、ターゲットたるDNAまたはRNAに対してハイブリ
ダイズするオリゴヌクレオチドであって、さらに、光開
裂性基により環状化されている構造を有するものであ
る。ここで上記光開裂性基とは、従来より光ケイジド試
薬として知られている基を有するものであり、特定の光
照射により、特定の結合が切断されるものである。

従って、本発明に係る光開裂性環状オリゴヌクレオチ
ドは、生体内に導入された後、その環状構造のため、ヌ
クレアーゼ分解反応を受けることなく、生体内の所定の
位置へ十分な時間をかけて拡散することが可能となるも
のである。さらに、所定の時間後に、適当な光を照射す
ることにより、上記光開裂性基が光分解し、特定の結合
が切断され、環状構造であったオリゴヌクレオチドが直
鎖状オリゴヌクレオチドとなり、ターゲットたるRNAま
たはDNAとハイブリダイズ可能となるものである。

さらには、ターゲットDNAまたはRNAの存在する領域に
拡散した後、ターゲットDNA、またはRNAの一部の塩基配
列と相互作用することにより複合体を形成し、光照射に
より光分解して直鎖状となりアンチセンスオリゴヌクレ
オチドとしての活性を効果的に発揮し得るものである。

より詳しくは、本発明は、分子中に少なくとも１つの
光開裂性基で結合された環状オリゴヌクレオチドであっ
て、該光開裂性基がニトロベンジル基であり、かつ該光
開裂性基とオリゴヌクレオチドがリン酸エステル結合を
介して結合されていることを特徴とする環状オリゴヌク
レオチドを提供するものである。

また、本発明は、前記光開裂性基が、次式に示す構造
を有することを特徴とする前記記載の環状オリゴヌクレ
オチドを提供するものである。

さらに、本発明は、前記光開裂性基が、次式に示す構
造を有することを特徴とする前記記載の環状オリゴヌク
レオチドを提供するものである。

また、本発明は、前記環状オリゴヌクレオチドが10〜
200個の塩基からなることを特徴とする前記記載の環状
オリゴヌクレオチドを提供するものである。

また、本発明は、前記環状オリゴヌクレオチドが30〜
100個の塩基からなることを特徴とする前記記載の環状
オリゴヌクレオチドを提供するものである。

さらに、本発明は、前記環状オリゴヌクレオチドが、
前記光開裂性基の開裂により、ターゲット核酸の塩基配
列の少なくとも一部の塩基配列とハイブリダイズ可能な
塩基配列を有することを特徴とする前記記載の環状オリ
ゴヌクレオチドを提供するものである。

また、本発明は、前記環状オリゴヌクレオチドが、前
記光開裂性基の開裂によりターゲット核酸の塩基配列の
少なくとも一部の塩基配列とハイブリダイズ可能な第１
の塩基配列と、前記環状オリゴヌクレオチドが、ターゲ
ット核酸と複合体を形成する第２の塩基配列を有するこ
とを特徴とする前記記載の環状オリゴヌクレオチドを提
供するものである。

発明を実施するための最良の形態 本発明に係る光開裂性環状オリゴヌクレオチドは、少
なくとも１つの光開裂性基により環状化構造を有するオ
リゴヌクレオチドである。さらに、本発明に係る光開裂
性環状オリゴヌクレオチドの塩基配列は、ターゲットた
る核酸（DNA、RNA等）に相捕的にハイブリダイズ可能な
塩基配列をその一部に有するものである。さらに、本発
明に係る光開裂性環状オリゴヌクレオチドは、ターゲッ
トたる核酸と複合体を形成可能な塩基配列をその一部に
有するものである。

本発明に係る光開裂性環状オリゴヌクレオチドの好ま
しい例の１つとしては、図１に模式的に示されるような
構造を有するものであり、光開裂性基で環状化された特
定の塩基配列（光開裂後に直鎖状となり、ターゲット核
酸へアンチセンスオリゴヌクレオチドとしてハイブリダ
イズ可能な塩基配列、図１では塩基配列Ａで表されてい
る）を有するオリゴヌクレオチドである。図２に示され
るように、係る光開裂性環状オリゴヌクレオチドがター
ゲット核酸の存在する部分へ導入された際、その環状構
造のために種々のヌクレアーゼに対して耐性を有し、加
水分解を受けることなく十分ターゲット核酸の近傍へ拡
散することが可能となる。さらに、望ましい位置及び時
間に、また望ましい強度の光を照射することにより本発
明に係る光開裂性環状オリゴヌクレオチドの光開裂性基
が開裂し、直鎖状のオリゴヌクレオチドとなる。係る直
鎖状オリゴヌクレオチドは、近傍に存在するターゲット
核酸の特定の塩基配列にハイブリダイズすることが可能
となり、アンチセンスオリゴヌクレオチドの作用を発揮
し得るものである。この際、ターゲット核酸とハイブリ
ダイズしない該直鎖状オリゴヌクレオチドは速やかに近
傍に存在するヌクレアーゼにより加水分解される。

本発明に係る光開裂性環状オリゴヌクレオチドの好ま
しい構造の他の例はさらに、図３に模式的に示されるよ
うに、光開裂性基で環状化された特定の塩基配列（光開
裂後に直鎖状となりターゲット核酸へアンチセンスオリ
ゴヌクレオチドとしてハイブリダイズ可能な塩基配列、
図３においては塩基配列Ａと表されている）と、環状状
態でターゲット核酸と相互作用可能な塩基配列（図３で
は塩基配列Ｂと表されている）を有するオリゴヌクレオ
チドである。図４に示されるように、係る光開裂性環状
オリゴヌクレオチドは、ターゲット核酸の存在する部分
へ導入された際、その環状構造のために種々のヌクレア
ーゼに対して耐性を有し、加水分解を受けることなく十
分ターゲット核酸の近傍へ拡散し、さらにターゲット核
酸の一部（図３では塩基配列Ｓと表されている）へ相互
作用して複合体を形成することが可能となる。この場
合、望ましい位置及び時間に、また望ましい強度の光を
照射することにより本発明に係る光開裂性環状オリゴヌ
クレオチドの光開裂性基が開裂し、直鎖状のオリゴヌク
レオチドとなる。係る直鎖状オリゴヌクレオチドは、前
記複合体形成のため極めて近傍に存在するターゲット核
酸の特定の塩基配列に効果的にハイブリダイズすること
が可能となり、アンチセンスオリゴヌクレオチドの作用
を効果的に発揮し得るものである。上記相互作用可能な
塩基配列Ｂの種類及び塩基数は特に制限はないが、塩基
配列Ａよりも長い塩基数を有することがより好ましい。

以下本発明に係る光開裂性環状オリゴヌクレオチドの
構造上の特徴を説明する。

（光開裂性基） 本発明に係る光開裂性環状オリゴヌクレオチドは、そ
の分子内に光照射により光開裂する基を有するものであ
る。係る光開裂性基は光照射により光開裂し、その結果
環状構造が直鎖状となりアンチセンスオリゴヌクレオチ
ドとしての活性が現われるものである（図１、３参
照）。

従って、係る光開裂性基は、アンチセンスオリゴヌク
レオチドとして作用するべき塩基配列を含む１本の直鎖
状オリゴヌクレオチドの５′及び３′末端を結合し、環
状構造を形成するものであり、該結合の少なくとも１つ
が、光照射により開裂するものである。従って、本発明
において、その目的に使用可能な構造は特に限定される
ことなく、上記性質を有する官能基であればよい。例え
ば、従来より、光ケイジド試薬として知られている官能
基は好ましく使用可能なものの１種類である。本発明に
おいては、さらに、当該官能基がリン酸エステル結合を
形成するものが好ましい。

さらには、該官能基を有する光開裂性基が、通常のオ
リゴヌクレオチド自動合成機（例えばアミダイト法に基
づく）により分子内に取り込まれるための官能基を有す
ることが必要である。上記の２つの機能を有する光開裂
性基としては、例えば、以下のような構造を有するニト
ロベンジル型のものが好適に使用される。

図５、及び図６に示されるように、この構造は、適当
な光の照射を受けて選択的にリン酸エステルの１つが切
断され、リン酸部分と、ニトロソフェニル誘導体を有す
る部分とに分れることが知られている。

従って、図５、６に示されるニトロベンジル型の光開
裂性基を、アミダイト法を用いてオリゴヌクレオチドの
任意の位置に導入するためには、例えば以下の構造を有
するホスホアミダイト試薬が使用可能である。

この試薬はそれぞれ、例えば、図７、８に示される合
成方法で調製することが可能である。すなわち、３−ク
ロロ−N,N−ジイソプロピルアミノ−（２−シアノエト
キシ）ホスフィン（３−chloro−N,N−diisopropylamin
o−（２−cyanoethoxy）phosphine）（1a）及び、１−
Ｏ−ジメトキシトリチル−２−（ｏ−ニトロフェニル）
−1,2−エタンジオール（１−Ｏ−dimethoxytrityl−２
−（ｏ−nitrophenyl）−1,2−ethanediol）（1b）の反
応により、該ホスホアミダイト試薬［１−（ｏ−ニトロ
フェニル）−２−ジメトキシトリチルオキシ］エトキシ
−N,N−ジイソプロピルアミノ−２−シアノエトキシホ
スフィン（［１−（ｏ−nitrophenyl）−２−dimethoxy
trityloxy］ethoxy−N,N−diisopropylamino−２−cyan
oethoxyphosphine）（１）が合成され得る。同様の方法
で実施例に示された方法により（１′）が合成可能であ
る。

得られるホスホアミダイト試薬はそのまま、アミダイ
ト法による自動合成機の試薬として使用され得るもので
ある。

（環状オリゴヌクレオチド） 本発明に係る環状オリゴヌクレオチドの塩基配列につ
いては限定されない。しかし、この環状オリゴヌクレオ
チド中に導入される光開裂性基の部分で分子が光開裂
し、直鎖状のオリゴヌクレオチドを与えることになるが
この開裂した後の塩基配列が、ターゲットたるRNAまた
はDNA（ターゲット核酸）にハイブリダイズし、アンチ
センスオリゴヌクレオチドとして作用し得るように塩基
配列を任意に選択することが出来るものである。

さらに、環状構造を保持したまま、ターゲット核酸と
相互作用し、複合体を形成し得る塩基配列を含むもので
ある。係る塩基配列はターゲットの一部の塩基配列と相
補的な塩基配列であり、相互作用（例えば、ハイブリダ
イゼーション）可能な塩基数であればよい。係る塩基の
種類と数は適時選択可能であるが、好ましくは10〜200
塩基数、より好ましくは30〜100塩基数のものである。
係る範囲の塩基数の場合は、通常アンチセンス核酸とし
て使用される15〜30塩基数のオリゴヌクレオチド部分を
含み、かつ必要ならば、ターゲット核酸に相互作用可能
な塩基部分を有する環状光開裂オリゴヌクレオチドを合
成することが可能となる。

さらに、本発明においては、上記得られる直鎖状（光
開裂性基を含むもの、含まないもの）オリゴヌクレオチ
ドを、環状化するためには、特に制限はされないが、リ
ガーゼによる結合が好ましく使用される。このために
は、５′末端をリン酸化し、さらに、適当なテンプレー
トを用いて、通常のリガーゼ反応をおこなうことで可能
となる。この際リガーゼ反応のためのテンプレートとし
てのオリゴヌクレオチドの調製もまた、通常の自動合成
機等を用いて容易に得ることができる。

また、該リガーゼ反応についても特に制限はないが、
例えば、テンプレートオリゴヌクレオチドにビチオンを
結合して使用することは、後処理が容易となる。

図９においては、本発明に係る環状オリゴヌクレオチ
ドの調製の一例を示した。

また、短い環状オリゴヌクレオチドの合成には、他の
方法、例えば、５′末端をリン酸化したオリゴヌクレオ
チドと、テンプレートを用意し、三重鎖を形成させ、そ
れをBrCN−イミダゾールで環状化を行うことで可能であ
る（Prakash,Gand Kool,E.T.,J.Chem.Soc.,Chem.Commu
n.,（1991）1161−1163）。

さらに、固相合成法により環状オリゴヌクレオチドを
合成することも可能である（Napoli,L.D.,Montesarchi
o,D.,Piccialli,G.,Santacroce,C.,Mayol,L.,Galeone,
A.,Messere,A.,Gazetta Chimica Italiana121（1991）5
05−508）。

（光開裂反応） 本発明に係る光開裂性基を有する環状オリゴヌクレオ
チドの光開裂反応については、特に制限はない。例えば
ニトロベンジル型の官能基については、照射光の波長、
強度等の条件はよく知られており、その条件をそのまま
使用可能である。

さらに、照射光は試料全体に照射しても、一部にしぼ
って照射してよい。試料の一部の特定の位置にしぼって
光照射する際には、図２、又は４にも示されているが、
特定の位置でのみアンチセンス活性が発現することとな
る。

実施例 以下実施例に基づき本発明を具体的に説明するが、本
発明はその要旨を超えない限り以下の実施例に限定され
るものではない。

３−クロロ−N,N−ジイソプロピルアミノ−（２−シア
ノエトキシ）ホスフィン（３−chloro−N,N−diisoprop
ylamino−（２−cyanoethoxy）phosphine）（1a）の合
成。

窒素ガス導入用管、磁気攪拌器、滴下ロートを備えた
反応装置中で、窒素ガス雰囲気下、３−ジクロロ−（２
−シアノエトキシ）ホスフィン（３−dichloro−（２−
cyanoethoxy）phosphine）27.0gを無水ジエチルエーテ
ル80mlに溶解し、これを−15℃に冷却した。十分に攪拌
しつつ無水ジエチルエーテル30mlに溶解したジイソプロ
ピルアミン31gをゆっくりと滴下した。そのまま18時間
攪拌後、析出したジイソプロピルアミン塩酸塩を濾過分
別した 溶媒を減圧で留去した後、粗生成物を淡黄色透明油状
物として得た。これを減圧蒸留（108−115℃/0.1mmHg）
により分離精製した（22g、ガスクロマトグラフによる
純度は95％以上）。¹HNMR（JEOL JNM−PMX60、重クロ
ロホルム）による構造解析：δ3.6−4.2（4H、ｍ、ジア
ノエトキシ基のエチレン）、2.9（2H、ｔ、イソプロピ
ル基のメチン）、1.3（12H、ｄ、イソプロピル基のメチ
ル）。

ｏ−ニトロフェニル−1,2−エタンジオール（ｏ−nitro
phenyl−1,2−ethanediol）のジメトキシトリチル（dim
ethoxytrityl）化。

100mlフラスコに、磁気攪拌器及び滴下ロートを備え
た反応装置に、ｏ−ニトロフェニル−1,2−エタンジオ
ール2.5gと、無水ピリジン50mlを加え、５℃に冷却しつ
つ、ジメトキシトリチルクロリド4.6gを加えた。18時間
攪拌して反応させた後、大部分のピリジンを減圧留去
し、残留物に酢酸エチル100ml及び、飽和食塩水100mlを
加えた。有機溶剤層を飽和重曹水、飽和食塩水で洗浄
し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧で留去し
赤色油状物6.7gを得た。得られた粗生成物をシリカゲル
カラムクロマトグラフ（0.5％トリエチルアミン含有ク
ロロホルム溶出液）により精製し、6.0gの目的物、１−
Ｏ−ジメトキシトリチル−２−（ｏ−ニトロフェニル）
−1,2−エタンジオール（１−０−dimethoxytrityl−２
−（ｏ−nitrophenyl）−1,2−ethanediol）（1b）を得
た。¹HNMR（JEOL JNM−PMX60、重クロロホルム）によ
る構造解析：δ6.9−8.1（17H,m,ジメトキシトリチル基
のフェニル、ニトロフェニル基のフェニル）、4.0（6
H、ｓ、ジメトキシフェニル基メトキシ）、3.8（1H、
ｔ、メチン基）、3.4（2H、ｄ、メチレン）。

［１−（ｏ−ニトロフェニル）−２−ジメトキシトリチ
ルオキシ］エトキシ−N,N−ジイソプロピルアミノ−２
−シアノエトキシホスフィン（［１−（ｏ−nitropheny
l）−２−dimethoxytrityloxy］ethoxy−N,N−diisopro
pylamino−２−cyanoethoxyphosphine）（１）の合成。

上記得られた１−Ｏ−ジメトキシトリチル−２−（ｏ
−ニトロフェニル）−1,2−エタンジオール6.0gと、ト
リエチルアミン3.1gを無水塩化メチレン50mlに溶解し、
５℃に、冷却しつつ、無水塩化メチレン10mlに溶解した
３−クロロ−N,N−ジイソプロピルアミノ−（２−シア
ノエトキシ）ホスフィン3.6gを滴下した。１時間反応さ
せた後、反応液に酢酸エチル150mlを加え、飽和食塩水
で３回洗浄した。後、溶媒を留去して得られた粗生成物
を、シリカゲルカラムクロマトグラフ（ヘキサン／酢酸
エチル2:1（0.5％トリエチルアミン含有）溶出液）によ
り精製し、8.9gの目的物（逆相によるHPLCによる純度98
％）を得た。¹HNMR（JEO LJNM−PMX60、重クロロホル
ム）による構造解析：δ6.8−8.1（17H、ｍ、ジメトキ
シトリチル基フェニル、ニトロフェニル基フェニル）、
4.0（1H,t,メチン基）、3.7（6H,s,ジメトキシフェニル
基のメチル基）、3.3−3.6（6H,m,シアノエトキシ基の
メチレン、ニトロフェニルエタンジオールのメチレン
基）、2.3（2H、ｔ、イソプロピル基のメチン）、1.2
（12H、ｄ、イソプロピル基のメチル）。分子量（TOF−
MS、669.30）（計算値669.76）。

ｏ−ニトロフェニル−1,2−エタンジオール（ｏ−nitro
phenyl−1,2−ethanediol）のtert−ブチルジメチルシ
リル（tert−butyldimethylsilyl）化 暗室中で窒素雰囲気下、攪拌装置を備えた反応容器に
ジクロロメタン100ml、トリエチルアミン10ml、ジメチ
ルアミノピリジン5mg、及びｏ−ニトロフェニル−1,2−
エタンジオール10.0gを加えて混合し、得られた溶液を
５℃に冷却した。さらに、この溶液に、tert−ブチルジ
メチルシリルクロライド9.8gを数回に分けて添加し、約
３時間攪拌した。反応の終了はTLCにより追跡し、原料
の消失を認めて反応終了とした。TLC上で反応生成物の
純度を確認し、さらに精製することなく次のステップに
使用した。

１−Ｏ−tert−ブチルメチルシリル−２−（ｏ−ニトロ
フェニル）−1,2−エタンジオール（１−Ｏ−tert−but
yldimethylsilyl−２−（ｏ−nitrophenyl）−1,2−eth
anediol）のジメトキシトリチル（dimethoxytrityl化） 上記反応液にそのままトリエチルアミン10mlを加え、
さらに室温でジメトキシトリチルクロライド18.6gを数
回に分けて添加した。そのまま一夜攪拌反応を続け、TL
Cにより反応の終了を確認した。溶液を減圧で留去し、
得られた残渣に酢酸エチル200mlを加え、さらに水、飽
和食塩水で十分洗浄して乾燥し、溶媒を減圧で除き21g
の油状物を得た。得られた残渣をクロロホルムを溶出液
とするシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製
し、22.0gの油状物を得た。¹HNMR（JEOLJNM−PMX60、重
クロロホルム中、δ（ppm））による構造解析結果:6.6
−7.8（17H,m,ジメトキシトリチル基フェニル、ニトロ
フェニル基フェニル）、5.5（1H、ｔ、メチン基）、3.9
（2H,d,メチレン基）、3.8（6H,s,ジメトキシメチル基
のメチル基）、1.0（9H,s,tert−ブチルジメチルシリル
基tert−ブチル基）、0.1（6H,s,tert−ブチルジメチル
シリル基メチル基）。

１−Ｏ−tert−ブチルジメチルシリル−２−０−ジメト
キシトリチル−２−（ｏ−ニトロフェニル）−1,2−エ
タンジオール（１−０−tert−butyldimethylsilyl−２
−０−dimethoxytrityl−２−（ｏ−nitrophenyl）−1,
2−ethanediol）の脱tert−ブチルジメチルシリル（ter
t−butyldimethylsilyl）化 常温で、磁気攪拌装置を備えた反応装置に１−０−te
rt−ブチルジメチルシリル−２−ジメトキシトリチル−
２−（ｏ−ニトロフェニル）−1,2−エタンジオール21.
0g及びテトラヒドロフラン100mlをとり、激しく攪拌し
ながらテトラブチルアンモニウムフルオリド2.6gを数回
に分けて添加した。そのまま、約１時間攪拌を続け、反
応終了をTLCにより確認した後、反応液を濃縮して反応
を終了した。残留物に酢酸エチルを加え、水及び飽和食
塩水により洗浄し、乾燥後溶媒を減圧下除き油状残渣18
gを得た。これにクロロホルムを溶出液としたシリカゲ
ルカラムクロマトグラフィーにより精製し、油状生成物
16.0gを得た。

［２−ジメトキシトリチルオキシ−２−（ｏ−ニトロフ
ェニル）］エトキシ−N,N−ジイソプロピルアミノ−２
−シアノエトキシホスフィン［２−dimethoxytrityloxy
−２−（ｏ−nitrophenyl）］ethoxy−N,N−diisopropy
lamino−２−cyanoethoxy phosphine）（１′） 暗室条件下、攪拌装置を備えた反応装置にジクロロメ
タン100ml、トリエチルアミン7.0g、及び１−ジメトキ
シトリチル−１−（ｏ−ニトロフェニル）−1,2−エタ
ンジオール16.0gを、室温で３−クロロ−N,N−ジイソプ
ロピルアミノ−２−シアノエトキシホスフィン8.5gのジ
クロロメタン溶液を滴下した。反応は速やかに進行し、
約30分で完了した。溶媒を減圧で除き、残渣を酢酸エチ
ルに溶解し、水及び飽和食塩水で洗浄して、後乾燥し
た。溶媒を減圧で除き、粗生成物19gを得た。ヘキサン
・酢酸エチル（2:1）を溶出液としたシリカゲルカラム
フラッシュクロマトグラフィーにより精製し、生成物
（１′）11gを得た。¹HNMR（JEOLJNM−PMX60、重クロロ
ホルム中、δ（ppm））による構造解析結果:6.6−7.9
（17H,m,ジメトキシトリチル基フェニル、ニトロフェニ
ル基フェニル）、5.4（1H、t,メチン基）、3.9（2H,d,
メチレン基）、3.7（6H,s,ジメトキシトリチル基のメチ
ル基）、3.3−3.6（4H,m,シアノエトキシ基のメチレ
ン）、2.3（2H,t,イソプロピル基メチン）、1.3（12H,
d,イソプロピル基のメチル。質量分析（島津/KRATOS KO
MPACT MALDI IV）、669.51（計算値669.76） 直鎖状オリゴヌクレオチドの合成。

５′−pCGCAAGCTTC−Ｘ−GCCAAGCGCGCAATTAACCCCTCAA
ACCGC−３′（２）、５′−pCGCAAGCTTCGCCAA GCGCGCAA
TTAACCCCTCAAACCGC−３′（３）、５′−ビオチン−GAA
GCTTGCGGCGGTTTGAG−３′（４）、５′−pGCC AAGCGCGC
AATTAACCCCTCAAACCGC−３′（５）、５′−pGCCAAGCGCG
CAATTAACCCCTCAAACCGCCGCAAGCTTC−３′（６）、５′−
pCGCAAGCTTCp−３′（７）、５′−pCGCAAGCTTC−Ｙ−G
CCAAGCGCGCAATTAACCCCTCAAACCGC−３′（８）の合成に
は、アプライドバイオシステム社製モデル394（Applied
Biosystems,Mode1394）により、（２）については上で
合成した試薬（１）を用いて（式中、Ｘとして記載され
ている基）、（８）については上で合成した試薬
（１′）を用いて（式中、Ｙとして記載されている基）
通常のアミダイト法により合成した。

オリゴヌクレオチド（２）、（３）、（５）、
（６）、（７）についてはさらにDNA自動合成機でアミ
ダイト法により５′末端にリン酸基を付加し、（４）に
ついてはさらに、DNA自動合成機でアミダイト法により
５′末端にビチオンを付加した。

得られたオリゴヌクレオチドは、アンモニア処理（30
％NH₄OH、室温１時間、55℃８時間）により脱保護基等
の後処理を行い、さらに、Oligo−PakSP（ミリポア社
製）により粗精製した後、（（４）のみ）ファルマシア
社製NAP−25カラムによる脱塩後、遠心濃縮した。

それぞれのオリゴヌクレオチドの精製はイオン交換あ
るいは逆相によるHPLC（島津製作所製,LC−10A）を用い
たHPLCで行った。

同様に、上記光開裂基Ｘを含む70merオリゴヌクレオ
チド５′−pCGCAAGCTTCGCCCGCACCGATCGC−Ｘ−GCCAAGCG
CGCAATTAACCCCCTTCCCAACAGTTGCTCAAACCGC−３′を同じ
方法でDNA自動合成機により合成し、精製した。

環状オリゴヌクレオチドの調製。

上記得られた直鎖状オリゴヌクレオチド（２）、
（３）、または（８）を10μｌ（100pmol/μｌ）、環状
化用テンプレートとして（４）を10μｌ（100pmol/μ
ｌ）、超純水8930μｌ、T4DNAリガーゼ緩衝液（宝酒
造）1mlを混合し、27℃で30分遮光放置し、続いて16℃
で遮光数分放置してから、T4 DNA Ligase50μｌ（宝酒
造、350Unit/μｌ）を加え、そのまま４時間放置した。
遠心濃縮後、NAP−25カラムによる脱塩操作の後、ふた
たび遠心濃縮し、アビジンをコートした磁気ビーズ（DY
NAL製、DYNABEADS M280 Streptavidine）により環状化
用テンプレートを除去した。精製は、HPLCによる分取を
行い、目的とするフラクションを集め脱塩した。使用し
たHPLC条件は、以下の通りである。得られた環状オリゴ
ヌクレオチドをそれぞれ（２′）、（３′）、及び
（８′）とする。

カラム、TOSOH TSKgel DNA−NPR4.6mmφx7.5mm 流量、1.0ml/min カラムオーブン温度、37℃ 緩衝液Ａ、20mM Tris−HClpH9 緩衝液Ｂ、緩衝液Ａ中に1.0M NaCl グラジエント、A/B（％）60/40から40/60まで30分 得られた環状オリゴヌクレオチドについて、20％ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動（以下PAGEと略する）で分
析すると、直鎖状40merのオリゴヌクレオチドと環状40m
erのオリゴヌクレオチドの移動度がそれぞれ異なった。
環状オリゴヌクレオチドの方が直鎖状に比べて少し移動
度が大きいことが確認された。

同様に、上記合成した70mer直鎖状オリゴヌクレオチ
ドも、同様の操作によりリガーゼ反応により環状化し、
環状化オリゴヌクレオチドを得た。PAGEによる分析にお
いて、直鎖状70merと、環状70merオリゴヌクレオチドの
移動度が異なることが確認された。

環状オリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性実験 光開裂性基を含まない、HPLCで精製した直鎖状オリゴ
ヌクレオチド（２）と、環状オリゴヌクレオチド
（２′）を用い、ヌクレアーゼ耐性試験を行った（以
後、直鎖状オリゴヌクレオチドをLinear,環状オリゴヌ
クレオチドをCircularとする）。

使用したヌクレアーゼは、エキソヌクレアーゼとし
て、Exonuclease III,Exonuclease V,Exonuclease VII,
λExonucleaseの４種類、エンドヌクレアーゼとし
て、S1 Nuclease,Mung Bean Nuclease,BAL31Nucleaseの
３種類であった。

実験は以下の手順で行った（図10参照）。

エキソヌクレアーゼ耐性試験： まず、オリゴヌクレオチド（Linear,Circular）を15
μｌのエキソヌクレアーゼ反応液（Exonuclease III,50
mM Tris−HCl（pH8.0）,5mM MgC12,10mM 2−メルカプト
エタノール;Exonuclease V,66.7mMグリシン−NaOH（pH
9.4）,30mM MgCl2,8.3mM 2−メルカプトエタノール,0.5
mM ATP;Exonuclease VII,50mM Tris−HCl（pH7.9）,50m
Mリン酸カリウム（pH7.6）,8.3mM EDTA,10mM 2−メルカ
プトエタノール；λExonuclease,67mMグリシン−KOH（p
H9.4）,2.5mM MgCl2,0.05％ BSA）に各15pmol程度加
え、酵素（Exonuclease III,90U;Exonuclease V,3.8U;E
xonuclease VII,5U;λExonuclease,2.5U）を添加した。
それぞれの反応液を37℃の恒温層で30分間インキュベー
トした後、20％PAGE（20mA,40分，染色エチジウムプロ
ミド（EtBr）30分）にかけ、LinearとCircularの分解の
度合いを調べた。

エンドヌクレアーゼ耐性試験： まず、オリゴヌクレオチド（直鎖状;Linera,環状;Cir
cular）を150μｌのエンドヌクレアーゼ反応液（S1 Nuc
lease,30mM酢酸ナトリウム（pH4.6）,280M NaCl,1mM Zn
SO₄;Mung Bean Nuclease,30mM酢酸ナトリウム（pH5.
0）,100mM NaCl,5％グリセロール;BAL31Nuclease,20mM
Tris−HCl（pH8.0）,600mM NaCl,12mM MgCl₂,1mM EDT
A）に各150pmol程度加え、酵素（S1 Nuclease,0.5U;Mun
g Bean Nuclease,1U;BAL31Nuclease,0.2U）を添加し
た。反応液は37℃（S1,Mung Bean）あるいは30℃（BAL3
1）でインキュベートして反応させた。反応開始後、0,
2,5分後に反応液を50μｌずつ分取し、５μｌの0.5M ED
TAが入った新しいチューブに移し変え、酵素反応を完全
に停止させた。

反応終了後の反応液を、HPLC（TOSOH TSKgel DNA−NP
R,溶媒A:20mM Tris−HCl（pH9.0），溶媒B:A中に1M NaC
lをグラジエントA/B＝100/0から40/60まで60分間）で分
析し、LinearとCircularの分解の程度を調べ、HPLC分析
から得られた変化を表１にまとめた。

以上の結果をまとめると以下の様な一般的な傾向を認
めることができる。

すなわち、エキソヌクレアーゼ耐性を試験した酵素で
は、環状オリゴヌクレオチドは分解されなかった。すな
わち、PAGEにおいてバンドに変化は見られず、環状オリ
ゴヌクレオチドには、これらのエキソヌクレアーゼに対
する耐性があることが明らかである。

また、エンドヌクレアーゼ耐性を試験したすべてのエ
ンドヌクレアーゼで、LinearとCircularで分解の程度に
差が見られた。従って、オリゴヌクレオチドを環状化す
ることにより、エンドヌクレアーゼに対する耐性が得ら
れることは明らかである。

光開裂性基を含む直鎖状及び環状オリゴヌクレオチドの
光照射 以下のオリゴヌクレオチドについて光照射実験を実施
した。

・光開裂性基Ｘを有する直鎖状40merオリゴヌクレオチ
ド（２） ・（２）が光照射を受ける際に生成する５′末端リン酸
化30merのオリゴヌクレオチド（５） ・光開裂性基Ｘを有する環状40merオリゴヌクレオチド
（２′） ・（２′）が光照射を受けたときに生成する、５′末端
リン酸化40merオリゴヌクレオチド（６） ここで、（２）は10merオリゴヌクレオチドと30merオ
リゴヌクレオチドを光開裂性基Ｘで結合しているため、
光照射により10merと30merに分れることになる。また、
光開裂された部分では、10mer生成物の３′末端にニト
ロソフェニル基、30mer生成物の５′末端にリン酸基が
残ることになる。

さらに、環状オリゴヌクレオチド（２′）は、光照射
を受けると光開裂された部分で切断され、１本の直鎖状
40merオリゴヌクレオチドが生成することとなるが、こ
の１本の鎖直鎖状オリゴヌクレオチドの５′末端にはニ
トロソフェニル基が結合していることとなる。（２），
（２′）を50pmol/10μｌの濃度でTE緩衝液に溶解し、
キセノンランプ（USHIO,300W,フィルターなし、室温）
に30分照射した後、20％PAGEにて分析した。

この結果（図11）、（２）（レーン１）の光照射後の
生成物（レーン２）は、（５）（レーン３）とほぼ同じ
位置にくることがわかり、（２′）（レーン４）の光照
射後の生成物（レーン５）は（６）（レーン６）とほぼ
同じ位置にくることがわかった。

さらに以下のオリゴヌクレオチドについて光照射実験
を実施した。

・光開裂性基Ｙを有する直鎖状40merオリゴヌクレオチ
ド（８） ・（２）が光照射を受ける際に生成する５′末端リン酸
化30merのオリゴヌクレオチド（５） ・光開裂性基Ｘを有する環状40merオリゴヌクレオチド
（８′） ・（８′）が光照射を受けたときに生成する、５′末端
リン酸化40merオリゴヌクレオチド（６） ここで、（８）は10merオリゴヌクレオチドと30merオ
リゴヌクレオチドを光開裂性基Ｙで結合しているため、
光照射により10merと30merに分れることになる。また、
光開裂された部分では、10mer生成物の５′末端にニト
ロソフェニル基、30mer生成物の３′末端にリン酸基が
残ることになる。

さらに、環状オリゴヌクレオチド（８′）は、光照射
を受けると光開裂された部分で切断され、１本の直鎖状
40merオリゴヌクレオチドが生成することとなるが、こ
の１本鎖直鎖状オリゴヌクレオチドの５′末端にはニト
ロソフェニル基が結合していることとなる。（８），
（８′）を50pmol/10μｌの濃度でTE緩衝液に溶解し、
キセノンランプ（USHIO,300W,フィルターなし、室温）
に30分照射した後、20％PAGEにて分析した。

この結果（図12）、（８）（レーン１）の光照射後の
生成物（レーン２）は、（５）（レーン３）とほぼ同じ
位置にくることがわかり、（８′）（レーン４）の光照
射後の生成物（レーン５）は（６）（レーン６）とほぼ
同じ位置にくることがわかった。

従って、光照射により直鎖状及び環状のオリゴヌクレ
オチドがそれぞれ光開裂性基の部分で切断されたことが
明かである。（図11及び図12）。

直鎖状オリゴヌクレオチド（２）の光照射前及び後の
HPLC分析結果（カラム:TOSOH TSKgel DNA−NPR4.6mmφx
7.5cm、カラム温度:37℃、流速:0.75ml/min、緩衝液A:2
0mM Tris−HCl pH9.0、緩衝液B:Aに1.0M NaClO₄添加、
グラジエント:A/B＝95/5から65/35まで45分、検出:260n
mUV）を図13及び14に示した。これより、（２）自体は2
5.621分の保持時間で単一ピークあったが、光照射後
に、14.744分及び、24.427分の保持時間を有する２つの
ピークになった。24.427分のピークはオリゴヌクレオチ
ド（５）によるピーク（24.382分）と一致する。従っ
て、以上の結果から、オリゴヌクレオチド（２）は図15
及び16に示すように光開裂したことが示された。同様に
オリゴヌクレオチド（８）は図16に示すように光開裂し
た。

なお、本発明において合成されたオリゴヌクレオチド
は、１つは、配列の長さ:41、配列の型：核酸、鎖の数:
1本鎖、トポロジー；直鎖状、配列の種類:DNA、配列:pC
GCAAGCTTC XGCCAAGCGC GCAATTAACC CCTCAAACCG C（ここ
でpCは、５′末端をリン酸化したシトシンを、またＸは
不特定のヌクレオチドを示す）であり、また、配列の長
さ:40、配列の型：核酸、鎖の数:1本鎖、トポロジー：
直鎖状、配列の種類:DNA、配列:pCGCAAGCTTC GCCAAGCGC
G CAATTAACCC CTCAAACCGCであり、また、配列の長さ:4
0、配列の型：核酸、鎖の数:1本鎖、トポロジー：サイ
クリック、配列の種類:DNA、配列:CGCAAGCTTC GCCAAGCG
CG CAATTAACCC CTCAAACCGCであって環状構造を有してい
るもの、配列の長さ:20、配列の型：核酸、鎖の数:1本
鎖、トポロジー：直鎖状、配列の種類:DNA、配列:Bioti
nGAAGCTTGCG GCGGTTTGAG（BiotinGはビチオン化したグ
アニンを示す）であり、配列の長さ:30、配列の型：核
酸、鎖の数:1本鎖、トポロジー：直鎖状、配列の種類:D
NA、配列:pGCCAAGCGCG CAATTAACCC CTCAAACCGC（ここで
pGは５′末端をリン酸化したグアニンを示す）であり、
配列の長さ:40、配列の型：核酸、鎖の数:1本鎖、トポ
ロジー：直鎖状、配列の種類:DNA、配列:pGCCAAGCGCG C
AATTAACCC CTCAAACCGC CGCAAGCTTC（ここでpGは５′末
端をリン酸化したグアニンを示す）であり、配列の長
さ:10、配列の型：核酸、鎖の数:1本鎖、トポロジー：
直鎖状、配列の種類:DNA、配列:pCGCAAGCTTCp（ここでp
Cは、５′末端をリン酸化したシトシンを、Cpは３′末
端をリン酸化したシトシンを示す）である。さらに、配
列の長さ:71、配列の型：核酸、鎖の数:1本鎖、トポロ
ジー：直鎖状、配列の種類:DNA、配列の特徴、存在位
置:1特徴を決定した方法:E他の情報:5′末端をリン酸化
配列:CGCAAGCTTC GCCCGCACCG ATCGCXGCCA AGCGCGCAAT T
AACCCCCTT CCCAACAGTT GCTCAAACCG C（ここでＸは不特
定のヌクレオチドを示す）。さらに、配列の長さ:71、
配列の型：核酸、鎖の数:1本鎖、トポロジー：サイクリ
ック、配列の種類:DNA、配列の特徴、配列:CGCAAGCTTC
GCCCGCACCG ATCGCXGCCA AGCGCGCAAT TAACCCCCTT CCCAAC
AGTT GCTCAAACCG Cである（ここでＸは不特定のヌクレ
オチドを示す）。

環状オリゴヌクレオチドと１本鎖核酸との相互作用 相補的配列を有する１本鎖40merオリゴヌクレオチド
（ターゲット）として、５′−GCGGTTTGAGGGGTTAATTGCG
CGCTTGGCGAAGCTTGCG−３′を使用し、係る塩基配列を環
状にした環状40merオリゴヌクレオチドを調製した。

上記ターゲット（100μΜ）を36μｌと、上記環状オ
リゴヌクレオチド（100μＭ）を30μｌとを、10xBuffer
（0.1M NaCl,10mMリン酸緩衝液、pH7.0）12μｌ、ホル
ムアミド30μｌ、超純水36μｌ（合計150μｌ）中で混
合したものを以下の条件でアニーリング（95℃で５分間
後、50℃で20分保持した後室温）した。

得られた溶液の260nmでの吸光度変化を、温度変化（3
0℃／時間で、30℃から85℃へ昇温）に対し測定した。

比較として、上記ターゲットと相補的な塩基配列を有
する40merの１本鎖オリゴヌクレオチドを用いて同様の
測定を行った。

上記の条件下で、環状オリゴヌクレオチドも、１本鎖
オリゴヌクレオチドも、ターゲットと混合することによ
り温度−吸光度変化が観測された。ここでは、通常用い
られている核酸の融点（ある条件下で２本鎖から１本鎖
になる温度）の測定方法に準じて、温度−吸光度変化曲
線の変曲点を融点とした。得られた融点は、環状オリゴ
ヌクレオチドの場合は、61℃であり、比較としての１本
鎖オリゴヌクレオチドの場合は67℃であった。

この結果は、上記40merの環状オリゴヌクレオチド
が、１本鎖オリゴヌクレオチドと同様に、ターゲットと
強く相互作用し、その生成物は、通常の２本鎖形成と近
似した構造を有するものであることを示唆している。

上記40merの環状オリゴヌクレオチドと１本鎖オリゴ
ヌクレオチドとの相互作用に基づく安定な複合体の生成
物を、陰イオン交換HPLCにより分離確認した。

HPLC分析条件：陰イオン交換HPLC カラム 東ソーTSKgel DNA−NPR4.6mmφx7.5cm カラム温度 37℃ バッファーＡ＝20mM Tris−HCl、pH9.0 バッファーＢ＝バッファーＡ中で1.0M NaCl グラジエントA/B（％）80/20から20/80まで10分。

流速 0.8ml/min 検出波長 260nm 図17には、ターゲットのみ（24.5分）、環状オリゴヌ
クレオチドのみ（24.3分）とは異なる位置にターゲット
と環状オリゴヌクレオチドとの複合体によるピーク（30
分）の存在が明確に示されている。さらに、図18には、
ターゲットのみ（24.5分）、１本鎖オリゴヌクレオチド
のみ（24.1分）とは異なる位置にターゲットと環状オリ
ゴヌクレオチドとのハイブリッド体によるピーク（25.3
分）が示されている。保持時間の差は、ターゲットと環
状オリゴヌクレオチドとの複合体の溶液中の構造に基づ
くイオン性が、ターゲットと環状オリゴヌクレオチドと
のハイブリッド体（完全２本鎖形成）の構造に基づくイ
オン性と異なるものであることを示唆している。

産業上の利用可能性 本発明に係る光開裂性環状オリゴヌクレオチドは、生
体内に導入された後、その環状構造のため、生体内での
ヌクレアーゼ分解反応を受けることが少なく、生体内の
所定の位置へ十分な時間をかけて拡散することが可能と
なる。さらに、所定の時間後に、適当な光を照射するこ
とにより、上記光開裂性基が光開裂し、特定の結合が切
断される。これにより環状構造であったオリゴヌクレオ
チドが直鎖状オリゴヌクレオチドとなり、ターゲットた
るDNAまたはRNAとハイブリダイズ可能となるものであ
る。

従って、本発明に係る構造を有する光開裂性環状オリ
ゴヌクレオチドを生体内に導入し、任意の場所（例え
ば、１つの特定の細胞やある特定の位置）へ拡散するの
に十分な時間後、特定の位置へ光照射を行い、該光が照
射された時および場所にのみアンチセンスオリゴヌクレ
オチドが発現し、遺伝子制御可能とするものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C07H 21/00 - 21/04 C12N 15/00 - 15/90 ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (7)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】分子中に少なくとも１つの光開裂性基で結
   合された環状オリゴヌクレオチドであって、該光開裂性
   基がニトロベンジル基であり、かつ該ニトロベンジル基
   とオリゴヌクレオチドがリン酸エステル結合を介して結
   合されていることを特徴とする環状オリゴヌクレオチ
   ド。
2. 【請求項２】前記光開裂性基が、次式に示す構造を有す
   ることを特徴とする請求項１に記載の環状オリゴヌクレ
   オチド。
3. 【請求項３】前記開裂性基が、次式に示す構造を有する
   ことを特徴とする請求項１に記載の環状オリゴヌクレオ
   チド。
4. 【請求項４】前記環状オリゴヌクレオチドが10〜200個
   の塩基からなることを特徴とする請求項１に記載の環状
   オリゴヌクレオチド。
5. 【請求項５】前記環状オリゴヌクレオチドが30〜100個
   の塩基からなることを特徴とする請求項１に記載の環状
   オリゴヌクレオチド。
6. 【請求項６】前記環状オリゴヌクレオチドが、前記光開
   裂性基の開裂により、ターゲット核酸の塩基配列の少な
   くとも一部の塩基配列とハイブリダイズ可能な塩基配列
   を有することを特徴とする請求項１に記載の環状オリゴ
   ヌクレオチド。
7. 【請求項７】前記環状オリゴヌクレオチドが、前記光開
   裂性基の開裂によりターゲット核酸の塩基配列の少なく
   とも一部の塩基配列とハイブリダイズ可能な第１の塩基
   配列と、前記環状オリゴヌクレオチドが、ターゲット核
   酸と複合体を形成する第２の塩基配列を有することを特
   徴とする請求項１に記載の環状オリゴヌクレオチド。