JP2787774B2 - オリゴヌクレオチド合成時のホスフィチル化による化学的キャッピング - Google Patents

オリゴヌクレオチド合成時のホスフィチル化による化学的キャッピング

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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は一般的にオリゴヌクレオチド類の合成方法に
関し、より詳細にはDNA或いはDNA合成のいづれかにおけ
る欠乏配列を化学的にキャップするホスファイトモノエ
ステル類の使用に関する。
遺伝子及び遺伝子制御領域は現在分子レベルで日常的
に特性化され、研究されている。これは、DNA及びRNAの
分析、修飾及び合成に伴う技術における最近の進歩によ
って可能にされたものである。特に重要であるのは支持
体−結合一本鎖DNAの自動化合成のための機械の開発で
ある。例えば、Matteucci及びCarutheres,J.Amer.Chem.
Soc.,Vol.103,3185−3191頁（1981），及びGait編Oligo
nucleotide Synthesis;A Practical Approach（IRL Pre
ss,Washington,D.C.,1984）。
自動化DNA合成を行うために選ばれる方法は、ホスホ
ルアミダイト、及び、水素−ホスホネート化学である。
例えば、Beaucage及びCaruthers,Tetrahedron Letters,
Vol.22,1859−1862頁（1981）;McBride及びCaruthers,T
etrahedron Letters,245−248頁（1983）;Froehler及び
Matteucci,Tetrahedron Letters,Vol.27,469−472頁（1
986）;Garegg等、Tetrahedron Letters,Vol.27,4051−4
054頁（DNA合成）、及び4055−4058頁（RNA合成）；及
びFroehler等Nucleic Acids Research,Vol.14,5399−54
07（1986）。合成サイクルはコンピュータ制御下に繰返
され、一度に１個のヌクレオシドモノマー単位を添加し
てオリゴヌクレオチドを規定する所望の配列及び長さを
達成する。例えば、ホスホルアミダイド或いはホスファ
イトトリエステル合成サイクル内において幾つかの反応
が必要である： I.成長鎖上の反応性官能基（通常５′ヒドロキシル基）
を脱保護すること、 II.モノマー及び賦活剤の添加によりカップリングを達
成すること、 III.未反応５′ヒドロキシル基を更に欠乏配列とカップ
リングすることを防止するためにキャップすること、及
び IV.新たに形成された天然のペンタ配位状態とのヌクレ
チド内リン結合を酸化すること。
ホスホルアミダイト法は175個のヌクレオチド長さ程
度のオリゴヌクレオチドの造築を可能にする高度の最適
化されたものである。Efcavitch,S.W.,65−70頁、Bioph
osphates and Their Analogues:Synthesis,Structure,M
etabolism,and Activity,Bruzik及びStec編（Elsevier,
アムステルダム、1987）。その様な性能はサイクル当り
99％より大きい平均収率を必要とする。この合成サイク
ルの本質的特徴は未反応成長鎖を引続くサイクルへの参
加から永久的に取除く有効なキャッピング反応である。
キャッピングなしには欠乏配列或いは欠失配列、即ち所
望配列に対して１個以上のモノマーヌクレオチドの欠け
ているオリゴヌクレオチド類がキャッピングを用いた場
合よりもより大きい平均長さを達成することになる。キ
ャッピングの有用性は欠乏配列の長さ及び存在を最小に
することである。キャッピングを用いると、正しく成長
するDNA配列により高い濃度のモノマーヌクレオチドが
利用可能である。更に各サイクルに行われる効率的なキ
ャッピング反応を用いると、正しい配列DNA或いは生成
物がより容易に配置され、従ってゲル電気泳動或いはHP
LCなどの通常の手段により精製される。生成物と殆ど同
一の大きさ及び組成を有する欠乏配列の存在は精製を極
めて困難にする。
ホスホルアミダイトDNA合成に際し、欠乏配列は無水
酢酸及びジメチルアミノピリジン（DMAP）の合成カラム
への同時投与により行われるアセチル化によりキャッピ
ングされる。得られた５′アセテートエステルキャップ
はDNAの配列を合成における引続く縮合反応に参加する
ことを防止する。しかしながら不幸にしてアセテートエ
ステルキャップは後−合成アンモニア切断／脱保護工程
の際に除去され、それは欠乏配列汚染物質を完全配列が
調製される各種酵素反応に参加可能とする。その様な参
加は例えばDNAリンカーが造築される効率を測定可能程
度に減少させてそれらの組換えベクターにおける使用を
より困難にする。後−合成切断／脱保護工程後にも残る
キャップの利用可能性が極めて有用である。
水素−ホスホネート方法に対してはアセチル化により
キャッピングは可能でない。欠乏配列の未反応５′ヒド
ロキシル基のアセチル化キャッピングはDMAP、Ｎ−メチ
ルイミダゾール、或いはトリエチルアミンなどの強塩基
による触媒分解によってのみ有用な速度で生ずる。ヌク
レオチド内水素ホスホネート結合はこれらの強塩基の影
響下にリン酸アセチル化により修飾される。リン酸修飾
残基は次いで後−合成切断／脱保護工程の際に切断され
やすく、ヌクレオチド内切断を生ずる。
水素−ホスホネート法においては縮合工程時の欠乏配
列の未反応５′ヒドロキシル基のアシル化により個別の
キャッピング工程は不必要であると主張されている：例
えば、Froehler及びMatteucci（上記引用）及びFroehle
r等（上記引用参照）。アシル化は普通に使用される酸
クロライド賦活剤、或いは反応性カップリング中間体に
よる５′ヒドロキシル基のエステル化により生じ得る。
酸クロライド賦活剤はカップリング反応時に存在しても
モノマーと反応性カプップリング中間体を形成する。し
かしながら、カップリング及びアシル化は縮合工程にお
いて不完全なことがあり、引続く合成サイクルに際して
欠乏配列の大きさを増大するために利用可能なある量の
５′ヒドロキシル基を残すことが示された。水素−ホス
ホネートDNA合成のための有効なキャッピング操作が明
らかに望ましい。
［発明の概要］ 本発明はオリゴヌクレオチド合成におけるホスフィチ
ル化による欠乏配列のキャッピング方法である。好まし
くは、この方法はホスホルアミダイト、ホスホトリエス
テル及び／又はヌクレオシド水素ホスホネート化学によ
る固相、或いは支持体−結合オリゴヌクレオチド合成を
含むものである。キャッピングはホスファイトモノエス
テルキャッピング剤と欠乏配列の５′或いは３′ヒドロ
キシル基とを合成操作における逐次縮合工程の間に反応
させることにより達成される。欠乏配列の３′或いは
５′ホスファイトジエステル置換基は目的オリゴヌクレ
オチド生成物の合成における引続く反応工程に対して不
活性である。
本発明において用いられるキャッピングという用語は
３′から５′に成長する鎖の遊離５′ヒドロキシル基或
いは５′から３′に成長するヌクレオチド鎖の遊離３′
ヒドロキシル基のいづれかをキャッピング剤と反応させ
て鎖を引続く縮合工程に参加することをできなくするこ
とを指す。本発明の好ましいキャッピング剤は次の形態
のホスファイトモノエステル類である： （式中、Ｒは単独で或いはそれに結合した酵素と共に固
相オリゴヌクレオチド合成に用いられる試薬特にホスホ
ルアミダイト類或いはヌクレオシド水素ホスホネート類
と反応しない。好ましくは、Ｒは低級アルキル基、電子
引抜き置換低級アルキル基、低級アルキル−或いはハロ
−置換アリール基、或いは５〜８個の炭素原子を有する
窒素、酸素或いはイオウを含有する複素環基である。よ
り好ましくは、Ｒはメチル、エチル、プロピル、イソプ
ロピル、ｎ−ブチル、sec−ブチル、tert−ブチル、ｎ
−ペンチル、シクロペンチルメチル、イソペンチル、ネ
オペンチル、ｎ−ヘキシル、ネオヘキシル、イソヘキシ
ル、シクロヘキシルメチル、ベータ−シクロペンチルエ
チル、低級アルキル−或いはハロ−置換フェニル基、低
級アルキル−或いはハロ置換ベンジル基、或いは低級ア
ルキル−或いはハロ−置換フェニルエチル基、モルホリ
ニル、チオモルホリニル、ピペリジニル、ピペラジニ
ル、ベータ−電子引抜き−置換エチル基などである。更
に好ましくは、ベータ−電子−引抜き−置換−エチル基
の電子引抜き置換基はシアノ、ニトロ、フェニルスルホ
ニル、或いはフェニルエステル基である。最も好ましく
は、ベータ−電子引抜き置換エチル基は、ベータ−シア
ノエチル基である。更に好ましくは、低級アリキル−或
いはハロ−置換フェニル及びベンジル基の低級アルキル
−或いはハロ−置換基は、メチル、クロロ、或いはブロ
モである。更に好ましくは、モルホリニル、チオモルホ
リニル、及びピペリジニル基はそれぞれモルホリノ、チ
オモルホリノ、及びピペリジノ基である。
本発明において用いられる低級アルキル基とは１〜６
個の炭素原子を含む直鎖、分岐鎖或いは環状アルキル基
を指す。
「電子引抜き性」とは置換基のそれから離れた分子の
原子価電子を吸引する傾向、即ち電子陰性であることを
示す:March,Advanced Organic chemistry16−18頁、（J
ohn Wiley,ニューヨーク、1985）。
本発明で用いられるオリゴヌクレオチドという用語は
少ない例えば２〜20個、乃至多い例えば20〜数百以上の
ヌクレオチドを有するデオキシリボヌクレオチド類或い
はリボヌクレオチド類のいづれかの一本捩れ鎖を指す。
式Ｉに図示された化学構造は文献においてホスファイ
ト類及びホスホネート類の両者として称されている。文
献における近似的使用を反映して、Ｒがヌクレオチドで
ある場合を除いて全構造体についてホスファイト類と称
される。その様な場合においては構造体は水素或いはＨ
−ホスホネートを称される。
本発明はオリゴヌクレオチド合成のヌクレオシド水素
ホスホネート及びホスファイトトリエステル法の両者に
おける欠点を克服するものである。ヌクレオシド水素ホ
スホネート合成におけるキャッピング工程の使用は欠乏
配列の平均長さを減少させることにより収率を相当に高
めるものである。ヌクレオシド水素ホスホネート法及び
ホスファイトトリエステル法の両者において、本発明の
キャッピング剤の結合は欠乏配列を完全配列生成物が目
的とする引続く生成物実験、例えば32Pで標識化するた
めの或いは他のDNA片との引続く表わす連結のための予
備処理としての５′酵素ホスホリル化などに参加するこ
とを不可能にする。
［発明の具体的は説明］ 本発明はオリゴヌクレオチド合成における欠乏配列の
キャッピング方法、及び本発明のキャッピング方法を１
工程として含むオリゴヌクレオチド類の合成方法を包含
するものである。式IIに図示されるように、本発明のキ
ャッピング方法は、式I,1により規定されるホスファイ
トモノエステルを欠乏配列2の遊離５′又は３′ヒドロ
キシル基と立体的に妨害された酸クロライド3の存在下
において反応させて欠乏配列と引続く反応工程に不活性
な基の間にホスファイトジエステル4を形成することを
特徴とするものである。
好ましくは、本発明のキャッピング剤（下記式IIIの
1）は本発明において準用するGibbs等によりSynthesis4
10−413頁（1984年）に記載される対称ホスファイトジ
エステル5のアルカリ加水分解により製造される。ホス
ファイトモノエステル1は反応性生物による揮発分を蒸
発させた後、直ちに塩として、或いは通常の精製後に用
いることができる。
立体的に妨害された酸クロライド3において、Ｒ′は
好ましくはtert−ブチル基、sec−ブチル基、シクロヘ
キシル基、アダマンチル基、ノルボルニル基、フェニル
基、アリール基などである。より好ましくはＲ′はtert
−ブチル基、ノルボルニル基、或いはアダマンチル基で
ある。最も好ましくはＲ′はアダマンチル基である。
好ましくはX+はアンモニウム基、低級アルキルアンモ
ニウム基、ピリジニウム基、ルチジニウム基、シクロヘ
キシルアンモニウム基、Na+，K+，Li+，Ba+，Mg+などの
金属塩カチオンである。より好ましくは、X+はトリエチ
ルアンモニウム基、テトラブチルアンモニウム基、ジイ
ソプロピルエチルアンモニウム基、ピリジニウム基、リ
チジニウム基或いはシクロヘキシルアンモニウム基であ
る。最も好ましくは、X+はトリエチルアンモニウム基、
テトラブチルアンモニウム基、或いはジイソプロピルア
ンモニウム基である。
好ましくは、オリゴヌクレオチドを保有する合成カラ
ムに投与する前に、本発明のホスファイトモノエステル
及びそのカチオン対イオンを非プロトン極性溶媒例えば
アセトニトリル、テトラヒドロフラン、ジクロロメタン
或いはそれらの組合わせなど、及び弱塩基例えばピリジ
ン、ピコリン、ルタジン、コリジンなどを含んでなる溶
液に溶解される。ピリジンが最も好ましい弱塩基であ
る。好ましくは、ホスファイトモノエステルの濃度は0.
1〜1.0モルである。同様に、立体的に妨害された酸クロ
ライド（式IIの3）は合成カラムに投与される前に非プ
ロトン極性溶媒、例えばアセトニトリル、テトラヒドロ
フラン、ジクロロメタンなど或いはその組合わせ及び弱
塩基例えばピリジン、ピコリン、ルタジン、コリジンな
どを含有する溶液に溶解される。ピリジンが最も好まし
い弱塩基である。それぞれの溶液をほぼ等モル量のホス
ファイトモノエステル及び立体的に妨害された酸クロラ
イドが反応液中に存在するように成長された酸クロライ
ドが反応液中に存在するように成長するオリゴヌクレオ
チドを保有する合成カラムに同時に投与する。この操作
はApplied Biosystemsモデル380A,380B,又は381Aなどの
自動化DNAシンセサイザーにより容易に行うことができ
る。本発明のキャッピング操作はカップリング反応後に
各サイクルにおける１工程として行われ、欠乏配列を不
活性にする。好ましくは、合成カラムを反応液中に室温
で約20〜120秒間浸漬し、その後反応試薬をアセトニト
リル、テトラヒドロフラン、ジクロロメタン、ピリジン
など或いはそれらの組合せなどの溶媒を用いてカラムか
ら流出す。機器内の全ての容器はアルゴなどの不活性ガ
スの雰囲気下に厳格に水分及び酸素のない状態に維持さ
れなければならない。
オリゴヌクレオチド合成のホスファイトトリエステル
及び水素ホスホネート法の詳細な操作は、本発明におい
て準用する次の文献に記載されている:Caruthers等、米
国特許第4,458,066号、及び4,500,707号明細書;Matteuc
ci等J.Amer.Chem.Soc.Vol.103,3185−3191頁（1981
年）;Caruthers等、Genetic Genetic Engineering,Vol.
4.1〜17頁（198）;Jones,第２章及びAtkinson等第３
章、Gait編Oligonucleotide Synthesis;A Practical Ap
−proach（IRL Press,Washington D.C.1984）;Froehler
等Tetrahedron Letters,Vol.27,469−472頁（1986）;Ga
regg等、Tetrahedron Letters,Vol.27,4051〜4054及び4
055〜4058頁（1986）；及びFroehler等,Nucleic Acids
Research Vol.14,5399〜5407頁（1986）。
以下の実施例は本発明を例示するものである。試薬の
濃度、温度及びその他の可変パラメータの値は本発明を
例示するのみであり、それらを限定するものではない。
実施例 実施例I.イソプロピルホスファイトトリエチルアンモニ
ウム塩の合成 ジイソプロピルホスファイト（10.0g、0.06モル）、ト
リエチルアミン（14.6g、0.14モル）、イソプロパノー
ル（20ml）及び水（10ml）をアルゴン雰囲気下にフラス
コ内で混合し、60℃で48時間加熱した。揮発成分を真空
下に除去したところ粘稠な透明油状物が残った。得られ
た生成物は、95％収率（12.8g）で生成され、次の分光
データを有した。1 Hnmr（アセトンd6,TMSに対する化学的シフト）： 10.1＋3.3（d,1H,J＝610Hz）、4.4（m,1H）、3.15（q,6
H,J＝7Hz）、1.35（d,6H,J＝7Hz）、1.20（t,9H,J＝7H
z）31 Pnmr（アセトンd6,H3PO4に対する化学的シフト）： 1.10ppm J＝610Hz 実施例II.エチルホスファイトトリエチルアンモニウム
塩の合成 エチルホスファイトのトリエチルアンモニウム塩を実
施例Ｉと同一の方法により合成し、下記分光データを有
する生成物を得た。1 Hnmr（アセトンd6）:10.0＋3.4（d,1H,J＝599Hz）、3.
85（q,2H,J＝7Hz）、3.15（q,6H,J＝7Hz）、1.32（t,9
H,J＝9Hz）、1.20（t,3H,J＝7Hz）31 Pnmr（アセトンd6）:0.64ppm J＝599Hz 実施例III.トリエチルアンモニウムイソプロピルホスフ
ァイトと固体支持体に結合したチミジンとの反応 1:1アセトニトリル：ピリジン中の0.1Mトリエチルア
ンモニウムイソプロピルホスファイトよりなる溶液、及
び1:1アセトニトリル：ピリジン中0.1M 1−アダマンタ
ンカルボン酸クロライドよりなる溶液を、Applied Bios
ystemsモデル380B DNAシンセサイザー中の1.0マイクロ
モルの制御−孔ガラス支持体に３′スクシネートを介し
て結合させたチミジンに同時に投与した。約30秒後、こ
の溶液をカラムから除去し、アセトニトリルで洗浄し
た。ホスファイトジエステル結合の酸化後、生成物をア
ンモニアにより支持体から切断し、HPLC分析にかけた。
真性試料と比較して、生成物の主成分は５′イソプロピ
ルホスフェートチミジンであると決定された。
実施例IV.キャッピングを用いた或いは用いない水素ホ
スホネート法による34塩基のオリゴヌクレオチドの合成 同一の34−merオリゴヌクレオチド、５′−AGGGCCGAG
CGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATをFroehler等（上記引例）
により記載された方法に従い、Applied Biosystemsモデ
ル380DNAシンセサイザー上で水素ホスホネート法によ
り、１回は本発明のキャッピング工程を含み、及び１回
はキャッピング工程を除外して２回合成した。キャッピ
ング工程は実施例IIIの試薬及び反応条件を用いて行っ
た。
第１図は各カラムから切断された物質のゲル電気泳動
分離の結果を図示する：レーン１はキャッピングなしに
生成された物質を含有し、及びレーン２はキャッピング
を用いて生成された物質を含有する。両レーンの物質は
UVシャドーイングにより可視化した。レーン２における
物質はゲル上の34−merに近い低分子量バンドの強度に
より求められるように34−mer生成物の近傍により少な
い欠乏配列を含むことが容易に見られる。
実施例V.キャッピングを用いる或いは用いない水素ホス
ホネート法による18塩基のオリゴヌクレオチドの合成 18−merオリゴヌクレオチド、５′−TCACAGTCTGATCTC
GATを実施例IVと同一の方法に従って、一度はキャッピ
ングを用いて、及び一度はキャッピングを用いることな
く、水素ホスホネート法により２回合成した。各カラム
から切断された物質をHPLCにより分析し、正しい配列生
成物対最も支配的な欠乏配列群（17−mer）をクロマト
グラム上のそれぞれのピークの下の面積から決定した。
キャッピングを用いた場合の比は33.9であった。キャッ
ピングを用いなかった場合の比は4.9であった。
以上の本発明の好ましい実施態様の開示は例示及び説
明を目的として示されたものである。それは説明しつく
されたものではなく、或いは本発明を開示された詳細な
形態に本発明を限定するものではく、明らかに多くの修
正及び変更が上記開示に照らして可能である。これらの
実施態様は本発明の原理及びその実用的応用を最も良く
説明して他の当業者に特別な用途に適した様な各種実施
態様及び各種修正を以って本発明を最良に利用すること
を可能にするために選ばれ説明されたものである。本発
明の範囲は冒頭に掲げた特許請求の範囲により規定され
るものである。
【図面の簡単な説明】
第１図は本発明のキャッピング工程を用いない（レーン
１）及び用いる（レーン２）34−merオリゴヌクレオチ
ドの水素ホスホネート合成からの反応生成物の相対的純
度を図示するデータを表わす図である。
フロントページの続き (72)発明者 リンカーン ジョン マックブライド アメリカ合衆国 カリフォルニア州 94062 レッドウッド シティ アイリ ス ストリート 311 (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C07H 21/00 C07H 1/02 ＣＡ（ＳＴＮ)

Claims (14)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】固相オリゴヌクレオチド合成における欠乏
    配列のキャッピング方法であって、キャッピング剤を欠
    乏配列のヒドロキシル基と縮合させる工程を含み、キャ
    ッピング剤が次式により規定されることを特徴とする方
    法： （式中、Ｒは１〜６個の炭素原子を含む直鎖、分岐鎖、
    或いは環状低級アルキル基、電子引抜き置換低級アルキ
    ル基、低級アルキル−置換又はハロ−置換アリール基、
    或は５〜８個の炭素原子を有する窒素−、酸素−、また
    はイオウ−含有複素環基である）。
  2. 【請求項２】該縮合工程が該キャッピング剤を該ヒドロ
    キシル基と立体的に妨害された酸クロライドの存在にお
    いて反応させることを含む特許請求の範囲第１項記載の
    方法。
  3. 【請求項３】Ｒが１〜６個の炭素原子を含む直鎖、分岐
    或いは環状アルキル基、モルホリニル基、チオモルホリ
    ニル基、ピペリジニル基、ピペラジニル基、或いはベー
    タ−電子引抜き置換エチル基であり、および該立体的に
    妨害された酸クロライドが次式により規定される特許請
    求の範囲第２項記載の方法： （式中、Ｒ′はtert−ブチル基、sec−ブチル基、シク
    ロヘキシル基、アダマンチル基、ノルボルニル基或いは
    フェニル基である）。
  4. 【請求項４】該キャッピング剤が次式により規定される
    塩である特許請求の範囲第３項記載の方法： （式中、X+はアンモニウム基、低級アルキルアンモニウ
    ム基、ピリジニウム基、ルチジニウム基、シクロヘキシ
    ルアンモニウム基及び金属塩カチオンよりなる群から選
    ばれる）。
  5. 【請求項５】X+がトリエチルアンモニウム基、テトラブ
    チルアンモニウム基、ジイソプロピルエチルアンモニウ
    ム基、ピリジニウム基、ルチジニウム基、及びシクロヘ
    キシルアンモニウム基よりなる群から選ばれる特許請求
    の範囲第４項記載の方法。
  6. 【請求項６】X+がトリエチルアンモニウム基、テトラブ
    チルアンモニウム基及びジイソプロピルアンモニウム基
    よりなる群から選ばれる特許請求の範囲第５項記載の方
    法。
  7. 【請求項７】Ｒが１〜４個の炭素原子の直鎖又は分岐鎖
    アルキル基、フェニルエチル基、ベータ−シアノエチル
    基、モルホリノ基、ピペリジノ基、チオモルホリノ基、
    或いはベータ−ニトロエチル基である特許請求の範囲第
    ６項記載の方法。
  8. 【請求項８】該立体的に妨害された酸クロライドが該キ
    ャッピング剤と等モル量で存在する特許請求の範囲第６
    項に記載の方法。
  9. 【請求項９】所定の配列のオリゴヌクレオチドを固体支
    持体上に合成する方法であって、下記工程を含んでなる
    ことを特徴とする方法： （ａ）固体支持体に結合した５′−保護オリゴヌクレオ
    チドを脱保護して脱保護オリゴヌクレオチドを形成する
    工程、 （ｂ）５′−保護ヌクレオチドモノマーを脱保護オリゴ
    ヌクレオチドと反応させて５′−保護オリゴヌクレオチ
    ド或いは５′ヒドロキシル基を有する欠乏配列のいづれ
    かを形成する工程、 （ｃ）欠乏配列を次式により規定されるキャッピング剤
    を欠乏配列の５′ヒドロキシル基と反応させることによ
    りキャッピングする工程： （式中、Ｒは低級アルキル基、電子引抜き置換低級アル
    キル基、或いは低級アルキル−或いはハロ−置換アリー
    ル基である）、及び （ｄ）上記工程（ａ）〜（ｃ）を所定の配列のオリゴヌ
    クレオチドが得られるまで繰返す工程。
  10. 【請求項１０】該キャッピング剤のＲは低級アルキル
    基；ベータ−シアノ−ベータ−ニトロ−、ベータ−フェ
    ニルスルホニル−、或いはベータ−フェニルエステル置
    換エチル基；低級アルキル−或いはハロ−置換フェニル
    基；低級アルキル−或いはハロ−置換ベンジル基；モル
    ホリノ基；チオモルホリノ基；或いはピペリジノ基であ
    り、及び該キャッピング工程が該キャッピング剤を該欠
    乏配列の該５′ヒドロキシル基と次式で表わされる立体
    的に妨害された酸クロライドの存在下において反応させ
    ることを含む特許請求の範囲第８項記載の方法： （式中、Ｒ′はtert−ブチル基、sec−ブチル基、シク
    ロヘキシル基、アダマンチル基、ノルボルニル基或いは
    フェニル基である）。
  11. 【請求項１１】Ｒが１〜４個の炭素数の直鎖或いは分岐
    鎖アルキル基である特許請求の範囲第６項記載の方法。
  12. 【請求項１２】Ｒがモルホリノ基、ピペリジノ基或いは
    チオモルホリノ基である特許請求の範囲第６項記載の方
    法。
  13. 【請求項１３】Ｒが１〜４個の炭素数の直鎖或いは分岐
    鎖アルキル基である特許請求の範囲第９項記載の方法。
  14. 【請求項１４】Ｒがモルホリノ基、ピペリジノ基或いは
    チオモルホリノ基である特許請求の範囲第９項記載の方
    法。
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