JPH01100194A - オリゴヌクレオチド合成時のホスフィチル化による化学的キャッピング - Google Patents

オリゴヌクレオチド合成時のホスフィチル化による化学的キャッピング

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JPH01100194A
JPH01100194A JP63134555A JP13455588A JPH01100194A JP H01100194 A JPH01100194 A JP H01100194A JP 63134555 A JP63134555 A JP 63134555A JP 13455588 A JP13455588 A JP 13455588A JP H01100194 A JPH01100194 A JP H01100194A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は一般的にオリゴヌクレオチド類の合成方法に関
し、より詳細にはＤＮＡ或いはＤＮＡ合成のいづれかに
おける欠乏配列を化学的にキャップするホスファイトモ
ノエステル類の使用に関する。
遺伝子及び遺伝子制御領域は現在分子レベルで日常的に
特性化され、研究されている。これは、ＤＮＡ及びＲＮ
Ａの分析、修飾及び合成に伴う技術における最近の進歩
によって可能にされたものである。特に重要であるのは
支持体−結合一本鎖ＤＮＡの自動化合成のための機械の
開発である。
例えば、Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ及びＣａｒｕｔｈｅｒｓ、
　Ｊ、　Ａｍｅｒ。
Ｃｈｅｍ、　Ｓａｃ、、　Ｖｏｌ、　１０３．３１８５
−３１９１頁（１９８１）　、及びＧａｉｔｌｉｏｌｉ
ｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓｉ　Ａ
　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ＾ｐｐｒｏａｃｈ　（ＩＲＬ　Ｐ
ｒｅｓｓ、　Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、　Ｄ、Ｃ，＋１９
８４）。
自動化ＤＮＡ合成を行うために選ばれる方法は、ホスホ
ルアミダイト、及び、水素−ホスホネート化学である。
例えば、Ｂｅａｕｃａｇｅ及びＣａｒｕｔｈｅｒｓ＋Ｔ
ｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ、　　Ｖｏｌ、
　２２＋　１８５９−１８６２頁（１９８１）；　Ｍｃ
Ｂｒｉｄｅ及びＣａｒｕｔｈｅｒｓ＋　Ｔｅｔｒａｈｅ
ｄｒｏｎＬｅｔｔｅｒｓ、　２４５　２４８頁（１９８
３）；　Ｆｒｏｅｈｌｅｒ　　及びＭａｔｔｅｕｃｃｉ
、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　　Ｌｅｔｔｅｒｓ＋　　Ｖ
ｏｌ、２７＋　　４６９−４７２頁（１９８６）；　Ｇ
ａｒｅｇｇ等、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒ
ｓ＋Ｖｏ１．２７．４０５１−４０５４頁　（ＤＮＡ合
成）、及び４０５５−４０５８頁　（ＲＮＡ合成）；　
及びＦｒｏｅｈｌｅｒ等Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　
　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ＋　　Ｖｏｌ、ＩＣ５３９９５４０
７（１９８６）。合成サイクルはコンピュータ制御下に
繰返され、−度に１個のヌクレオシドモノマー単位を添
加してオリゴヌクレオチドを規定する所望の配列及び長
さを達成する。例えば、ホスホルアミダイト或いはホス
ファイトトリエステル合成サイクル内において幾つかの
反応が必要である：■、成長鎖上の反応性官能基（通常
５°ヒドロキシル基）を脱保護すること、 ■、モノマー及び賦活剤の添加によりカップリングを達
成すること、 ■、未反応５”ヒドロキシル基を更に欠乏配列とカップ
リングすることを防止するためにキャップすること、及
び ■、新たに形成された天然のペンタ配位状態とのヌクレ
オチド内リン結合を酸化すること。
ホスホルアミダイト法は１７５個のヌクレオチド長さ程
度のオリゴヌクレオチドの造築を可能にする高度に最適
化されたものである。Ｅｆｃａｖｉｔｃｈ。
Ｓ、　Ｗ、、　６５−７０頁、Ｂｉｏｐｈｏｓｐｈａｔ
ｅｓ　ａｎｄ　Ｔｈｅｉｒ　Ａｎａ−１ｏｇｕｅｓ：　
５ｙｎｔｈｅｓｉｓ、　５ｔｒｕｃｔｕｒｅ、　Ｍｅｔ
ａｂｏｌｉｓｍ、ａｎｄ＾ｃｔｉｖｉｔｙ、　Ｂｒｕｚ
ｉｋ及び５ｔｅｃ編（Ｈｌｓｅｖｉｅｒ、アムステルダ
ム、１９８７　）。その様な性能はサイクル当り９９％
より大きい平均収率を必要とする。この合成サイクルの
本質的特徴は未反応成長鎖を引続くサイクルへの参加か
ら永久的に取除く有効なキャッピング反応である。キャ
ッピングなしには欠乏配列或いは欠失配列、即ち所望配
列に対して１個以上のモノマーヌクレオチドの欠けてい
るオリゴヌクレオチド類がキャッピングを用いた場合よ
りもより大きい平均長さを達成することになる。
キャッピングの有用性は欠乏配列の長さ及び存在を最小
にすることである。キャッピングを用いると、正しく成
長するＤＮＡ配列により高い濃度のモノマーヌクレオチ
ドが利用可能である。、更に各サイクルに行われる効率
的なキャッピング反応を用いると、正しい配列ＤＮＡ或
いは生成物がより容易に配置され、従ってゲル電気泳動
或いは）ＩＰＬＣなどの通常の手段により精製される。
生成物と殆ど同一の大きさ及び組成を有する欠乏配列の
存在は精製を極めて困難にする。
ホスホルアミダイトＤＮＡ合成に際し、欠乏配列は無水
酢酸及びジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）の合成カ
ラムへの同時投与により行われるアセチル化によりキャ
ッピングされる。得られた５”アセテートエステルキャ
ップはＤＮＡの配列を合成における引続く縮合反応に参
加することを防止する。しかしながら不幸にしてアセテ
ートエステルキャップは後−合成アンモニア切断／脱保
護工程の際に除去され、それは欠乏配列汚染物質を完全
配列が調製される各種酵素反応に参加可能とする。その
様な参加は例えばＤＮＡリンカ−が造築される効率を測
定可能程度に減少させてそれらの組換えベクターにおけ
る使用をより困難にする。後−合成切断／脱保護工程後
にも残るキャップの利用可能性が極めて有用である。
水素−ホスホネート方法に対してはアセチル化によるキ
ャッピングは可能でない。欠乏配列の未反応５゛ヒドロ
キシル基のアセチル化キャッピングはＤＭＡＰ、Ｎ−メ
チルイミダゾール、或いはトリエチルアミンなどの強塩
基による触媒分解によってのみ有用な速度で生ずる。ヌ
クレオチド内水素ホスホネート結合はこれらの強塩基の
影響下にリン酸アセチル化により修飾される。リン酸修
飾残基は次いで後−合成切断／脱保護工程の際に切断さ
れやすく、ヌクレオチド内切断を生ずる。
水素−ホスホネート法においては縮合工程時の欠乏配列
の未反応５゛ヒドロキシル基のアシル化により個別のキ
ャッピング工程は不必要であると主張されている；例え
ば、Ｐｒｏｅｈｌｅｒ及びＭａｔｔｅｕｃｃｉ　（上記
引用）及びＦｒｏｅｈｌｅｒ等（上記引用参照）。アシ
ル化は普通に使用される酸クロライド賦活剤、或いは反
応性カップリング中間体による５′ヒドロキシル基のエ
ステル化により生じ得る。
酸クロライド賦活剤はカップリング反応時に存在しても
モノマーと反応性カップリング中間体を形成する。しか
しながら、カップリング及びアシル化は縮合工程におい
て不完全なことがあり、引続く合成サイクルに際して欠
乏配列の大きさを増大するために利用可能なある量の５
°ヒドロキシル基を残すことが示された。水素−ホスホ
ネートＤＮＡ合成のための有効なキャッピング操作が明
らかに望ましい。
［発明の概要］ 本発明はオリゴヌクレオチド合成におけるホスフィチル
化による欠乏配列のキャッピング方法である。好ましく
は、この方法はホスホルアミダイト、ホスホトリエステ
ル及び／又はヌクレオシド水素ホスホネート化学による
固相、或いは支持体−結合オリゴヌクレオチド合成を含
むものである。
キャッピングはホスファイトモノエステルキャッピング
剤と欠乏配列の５”或いは３゛ヒドロキシル基とを合成
操作における逐次縮合工程の間に反応させることにより
達成される。欠乏配列の３゜或いは５゛ホスフアイトジ
エステル置換基は目的オリゴヌクレオチド生成物の合成
における引続く反応工程に対して不活性である。
本発明において用いられるキャッピングという用語は３
′から５°に成長する鎖の遊離５゛ヒドロキシル基或い
は５”から３°に成長するヌクレオチド鎖の遊離３”ヒ
ドロキシル基のいづれかをキャッピング剤と反応させて
鎖を引続く縮合工程に参加することをできなくすること
を指す、本発明の好ましいキャッピング剤は次の形態の
ホスファイトモノエステル類である： Ｒ−０−Ｐ−０− 一六−」− （式中、Ｒは単独で或いはそれに結合した酵素と共に固
相オリゴヌクレオチド合成に用いられる試薬特にホスホ
ルアミダイト類或いはヌクレオシド水素ホスホネート類
と反応しない。好ましくは、Ｒは低級アルキル基、電子
引抜き置換低級アルキル基、低級アルキル−或いはハロ
−置換アリール基、或いは５〜８個の炭素原子を有する
窒素、酸素或いはイオウを含有する複素環基である。よ
り好ましくは、Ｒはメチル、エチル、プロピル、イソプ
ロピル、ｎ−ブチル、５ｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ　−ブ
チル、ｎ−ペンチル、シクロペンチルメチル、イソペン
チル、ネオペンチル、ｎ−ヘキシル、ネオヘキシル、イ
ソヘキシル、シクロヘキシルメチル、ベーターシクロペ
ンチルエチル、低級アルキル−或いはハロ−置換フェニ
ル基、或いは低級アルキル−或いはハロ−置換フェニル
エチル基、モルホリニル、チオモルホリニル、ピペリジ
ニル、ピペラジニル、ベーター電子引抜き一置換エチル
基などである。更に好ましくは、ベーター電子−引抜き
一置換一エチル基の電子引抜き置換基はシアノ、ニトロ
、フェニルスルホニル、或いはフェニルエステル基であ
る。最も好ましくは、ベーター電子引抜き置換エチル基
は、ベーターシアノエチル基である。更に好ましくは、
低級アルキル−或いはハロ−置換フェニル及びベンジル
基の低級アルキル−或いはハロ−置換基は、メチル、ク
ロロ、或いはブロモである。更に好ましくは、モルホリ
ニル、チオモルホリニル、及びピペリジニル基はそれぞ
れモルホリノ、チオモルホリノ、及びピペリジノ基であ
る。
一本発明において用いられる低級アルキル基とは１〜６
個の炭素原子を含む直鎖、分岐鎖或いは環状アルキル基
を指す。
「電子引抜き性」とは置換基のそれから離れた分子の原
子価電子を吸引する傾向、即ち電子陰性であることを示
す：　　Ｍａｒｃｈ、　Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｏｒｇａｎ
ｉｃｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１６−１１８頁、（Ｊｏｈｎ
　Ｗｉｌｅｙ、　ニューヨーク、１９８５）。
本発明で用いられるオリゴヌクレオチドという用語は少
ない例えば２〜２０個、乃至多い例えば２０〜数百以上
のヌクレオチドを有するデオキシリボヌクレオチド類或
いはりボスクレオチド類のいづれかの一本捩れ鎖を指す
。
式■に図示された化学構造は文献においてはホスファイ
ト類及びホスホネート類の両者として称されている。文
献における近似的使用を反映して、Ｒがヌクレオシドで
ある場合を除いて全構造体についてホスファイト類と称
される。その様な場合においては構造体は水素或いはＨ
−ホスホネートと称される。
本発明はオリゴヌクレオチド合成のヌクレオシド水素ホ
スホネート及びホスファイトトリエステル法の両者にお
ける欠点を克服するものである。
ヌクレオシド水素ホスホネート合成におけるキャッピン
グ工程の使用は欠乏配列の平均長さを減少させることに
より収率を相当に高めるものである。
ヌクレオシド水素ホスホネート法及びホスファイトトリ
エステル法の両者において、本発明のキャッピング剤の
結合は欠乏配列を完全配列生成物が目的とする引続く生
成物的実験、例えば３２Ｐで標識化するための或いは他
のＤＮＡ片との引続（表わす連結のための予備処理とし
ての５゛酵素ホスホリル化などに参加することを不可能
にする。
［発明の詳細な説明］ 本発明はオリゴヌクレオチド合成における欠乏配列のキ
ャッピング方法、及び本発明のキャッピング方法を１工
程として含むオリゴヌクレオチド類の合成方法を包含す
るものである。式■に図示されるように、本発明のキャ
ッピング方法は、式Ｉ、　　１　　により規定されるホ
スファイトモノエステルを欠乏配列量の遊離５°又は３
゛ヒドロキシル基と立体的に妨害された酸クロライド主
の存在下において反応させて欠乏配列と引続く反応工程
に不活性な基の間にホスファイトモエステルエを形成す
ることを特徴とするものである。
好ましくは、本発明のキャッピング剤（下記式■の上）
は本発明において準用するＧｉｂｂｓ等により５ｙｎｔ
ｈｅｓｉｓ　４１０−４１３頁（１９８４年）に記載さ
れる対称ホスファイトモエステルエのアルカリ加水分解
により製造される。ホスファイトモノエステル１は反応
性生物による揮発分を蒸発させた後、直ちに塩として、
或いは通常の精製後に用いることができる。
立体的に妨害された酸クロライド主において、Ｒ゛は好
ましくはｔｅｒｔ−ブチル基、５ｅｃ−ブチル基、シク
ロヘキシル基、アダマンチル基、ノルボルニル基、フェ
ニル基、アリール基などである。
より好ましくはＲ”はｔｅｒ　ｔ−ブチル基、ノルボル
ニル基、或いはアダマンチル基である。最も好ましくは
Ｒ゛はアダマンチル基である。
好ましくはＸ＋はアンモニウム基、低級アルキルアンモ
ニウム基、ピリジニウム基、ルチジニウム基、シクロヘ
キシルアンモニウムＭ、Ｎａ”。
Ｋ＋、Ｌｉ”、Ｂａ”、Ｍｇ＋などの金属塩カチオンで
ある。より好ましくは、Ｘ″″はトリエチルアンモニウ
ム基、テトラブチルアンモニウム基、ジイソプロピルエ
チルアンモニウム基、ピリジニウム基、ルチジニウム基
或いはシクロヘキシルアンモニウム基である。最も好ま
しくは、Ｘｌはトリエチルアンモニウム基、テトラブチ
ルアンモニウム基、或いはジイソプロピルアンモニウム
基である。
好ましくは、オリゴヌクレオチドを保有する合成カラム
に投与、する前に、本発明のホスファイトモノエステル
及びそのカチオン対イオンを非プロトン極性溶媒例えば
アセトニトリル、テトラヒドロフラン、ジクロロメタン
或いはそれらの組合わせなど、及び弱塩基例えばピリジ
ン、ピコリン、ルタジン、コリジンなどを含んでなる溶
液に溶解される。ピリジンが最も好ましい弱塩基である
。
好ましくは、ホスファイトモノエステルの濃度は。
０．１〜１．０モルである。同様に、立体的に妨害され
た酸クロライド（式■の主）は合成カラムに投与される
前に非プロトン極性溶媒、例えばアセトニトリル、テト
ラヒドロフラン、ジクロロメタンなど或いはその組合わ
せ及び弱塩基例えばピリジン、ピコリン、ルタジン、コ
リジンなどを含有する溶液に溶解される。ピリジンが最
も好ましい弱塩基である。それぞれの溶液をほぼ等モル
量のホスファイトモノエステル及び立体的に妨害された
酸クロライドが反応液中に存在するように成長するオリ
ゴヌクレオチドを保有する合成カラムに同時に投与する
。この操作はＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓモ
デル　３８０Ａ、　３８０Ｂ、又は３８１Ａなどの自動
化ＤＮＡシンセサイザーにより容易に行うことができる
。本発明のキャッピング操作はカップリング反応後に各
サイクルにおける１工程として行われ、欠乏配列を不活
性にする。好ましくは、合成カラムを反応液中に室温で
約２０〜１２０秒間浸漬し、その後反応試薬をアセトニ
トリル、テトラヒドロフラン、ジクロロメタン、ピリジ
ンなど或いはそれらの組合せなどの溶媒を用いてカラム
から流出す。機器内の全ての容器はアルゴンなどの不活
性ガスの雰囲気下に厳格に水分及び酸素のない状態に維
持されなければならない。
オリゴヌクレオチド合成のホスファイトトリエステル及
び水素ホスホネート法の詳細な操作は、本発明において
準用する次の文献に記載されている：　Ｃａｒｕｔｈｅ
ｒｓ等、米国特許第４．４５８．０６６号、及び４．５
００．７０７号明細書？　　Ｍａｊｔｅｕｃｃｉ等　Ｊ
、　Ａｍｅｒ。
Ｃｈｅｍ、　Ｓｏｃ、　　Ｖｏｌ、１０３．３１８５−
３１９１頁（１９８１年）；Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ等、Ｇ
ｅｎｅｔｉｃ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎ
ｇ＋Ｖｏ１．４．１〜１７頁（１９Ｂ　）；　Ｊｏｎｅ
ｓ、第２章及び＾ｔｋｉｎｓｏｎ等第３章、Ｇａ１ｔ　
編０１ｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓ
：　Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐ−ｐｒｏａｃｈ　（
ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ。
Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ　Ｄ、Ｃ，１９８４）；Ｐｒｏｅ
ｈｌｅｒ等ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔｅｒｓ、　
　Ｖｏｌ、　２７．４６９−４７２頁（１９８６）；　
Ｇａｒｅｇｇ等、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅ
ｒｓ、　Ｖｏｌ、　２７．４０５１〜４０５４及び４０
５５〜４０５８頁（１９８６）　；及びＦｒｏｅｈｌｅ
ｒ等。
Ｎｕｃ’１ｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｖ
ｏｌ、　ＩＣ５３９９〜５４０７ｇ（１９８６）。
以下の実施例は本発明を例示するものである。
試薬の濃度、温度及びその他の可変パラメータの値は本
発明を例示するのみであり、それらを限定するものでは
ない。
１−施一五 アンモニウム　のＡ ）■ ジイソプロピルホスファイト（１０，０ｇ、０．０６モ
ル）、トリエチルアミン（１４，６ｇ、０．１４モル）
、イソプロパツール（２０ｍｆ）及び水（１０＋ｎｊり
をアルゴン雰囲気下にフラスコ内で混合し、６０°Ｃで
４８時間加熱した。揮発成分を真空下に除去したところ
粘稠な透明油状物が残った。得られた生成物は、９５％
収率（１２，８ｇ）で生成され、次の分光データを有し
た。
’Ｈｎｍｒ（アセトン　ｄ６．ＴＭＳに対する化学的シ
フト）： １０．１　＋　３．３　（ｄ、　ＩＨ，Ｊ＝６１０　Ｈ
ｚ）、４．４　（ｍ、　ＩＨ）、３．１５　（ｑ、　６
Ｈ，Ｊ＝７　Ｈ２）、１．３５　（ｄ、　６ｆｌ、　Ｊ
＝７　Ｈｚ）、１．２０　（ｔ、　９Ｆ１．　Ｊ＝７　
Ｈｚ）”Ｐｎｍｒ（アセトン　ｄ６．Ｈ，ＰＯ，に対す
る化学的シフト）： １．１０　ｐｐｍ　　Ｊ＝６１０　Ｈｚエチルホスファ
イトのトリエチルアンモニウム塩を実施例■と同一の方
法により合成し、下記分光データを有する生成物を得た
。
’Ｈｎｍｒ（アセトン　ｄ　６　）　　：　１０．０　
＋　３．４　（ｄ、　ＩＨ。
Ｊ＝５９９　Ｈｚ）、３．８５　（ｑ、　２Ｈ，Ｊ＝７
　Ｈｚ）、３．１５（ｑ＋　６８．　Ｊ＝７　Ｈｚ）、
１．３２　（ｔ、　９８．　Ｊ＝９　Ｈｚ）、１．２０
　（ｔ、　３Ｈ，Ｊ＝７　Ｈｚ）”Ｐｎｍｒ（アセトン
ｄ　６　）　　：　０，６４　ｐｐｍ　　Ｊ＝５９９　
Ｈｚ実ａ例ｍ、トリエチルアンモニウムイソプロピル１
：１アセトニトリル：ピリジン中の０．１Ｍトリエチル
アンモニウムイソプロピルホスファイトよりなる溶液、
及びｌ：ｌアセトニトリル：ピリジン中０．１Ｍ　　１
−アダマンタンカルボン酸クロライドよりなる溶液を、
Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　　モデル　３
８０Ｂ　　ＤＮＡ　　シンセサイザー中の１．０マイク
ロモルの制御−礼ガラス支持体に３“スクシネートを介
して結合されたチミジンに同時に投与した。約３０秒後
、この溶液をカラムから除去し、アセトニトリルで洗浄
した。ホスファイトジエステル結合の酸化後、生成物を
アンモニアにより支持体から切断し、ＨＰＬＣ分析にか
けた。真性試料と比較して、生成物の主成分は５゛イソ
プロピルホスフエートチミジンであると決定された。
オリゴヌクレオチドの合成 同一の３４−ｍａｒオリゴヌクレオチド、　５゛−＾Ｇ
ＧＧＣＣＧ　ＡＧＣＧＣＡＧ　ＡＡＧＴＧＧＴＣＣＴＧ
ＣＡ　ＡＣＴＴＴＡＴ　＠　Ｆ　ｒｏｅｈ　１　ｅ　ｒ
等（上記引例）により記載された方法に従い、Ａｐｐｌ
ｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓモデル　３８０　　ＤＮ
Ａシンセサイザー上で水素ホスホネート法により、１回
は本発明のキャッピング工程を含み、及び１回はキャン
ピング工程を除外して２回合成した。キャッピング工程
は実施例■の試薬及び反応条件を用いて行った。
第１図は各カラムから切断された物質のゲル電気泳動分
離の結果を図示する：レーン１はキャッピングなしに生
成された物質を含有し、及びレーン２はキャッピングを
用いて生成された物質を含有する。両レーンの物質はＵ
ｖシャドーイングにより可視化した。レーン２における
物質はゲル上の３４−ｍａｒに近い低分子量バンドの強
度により求められるように３４−ｍａｒ生成物の近傍の
より少ない欠乏配列を含むことが容易に見られる。
実施例■、キャッピングを　いる８いは　いない、ホス
ホネート法による１８声　の オリゴヌクレオチドのム １Ｂ−ｍａｒオチゴヌクレオチド、５　’　−ＴＣＡＣ
ＡＧＴＣＴＧＡＴＣＴＣＧＡＴを実施例■と同一の方法
に従って、−度はキャッピングを用いて、及び−度はキ
ャッピングを用いることなく、水素ホスホネート法によ
り２回合成した。各カラムから切断された物質をＨＰＬ
Ｃにより分析し、正しい配列生成物対量も支配的な欠乏
配列群（１７−ｍａｒ）をクロマトグラム上のそれぞれ
のピークの下の面積から決定した。
キャッピングを用いた場合の比は３３．９であった。
キャッピングを用いなかった場合の比は４．９であった
。
以上の本発明の好ましい実施態様の開示は例示及び説明
を目的として示されたものである。それは説明しつくさ
れたものではな（、或いは本発明を開示された詳細な形
態に本発明を限定するものではく、明らかに多くの修正
及び変更が上記開示に照らして可能である。これらの実
施態様は本発明の原理及びその実用的応用を最も良く説
明して他の当業者に特別な用途に適した様な各種実施態
様及び各種修正を以って本発明を最良に利用することを
可能にするために選ばれ説明されたものである。本発明
の範囲は冒頭に掲げた特許請求の範囲により規定される
ものである。
【図面の簡単な説明】
第１図は本発明のキャッピング工程を用いない（レーン
１）及び用いる（レーン２）３４−ｍａｒオリゴヌクレ
オチドの水素ホスホネート合成からの反応生成物の相対
的純度を図示するデータを表わす図である。 図面のｒＤα（内容に変更なし） 才１図 Ｆ−ン　ｆ　　　　　Ｌ−−ン２

Claims (16)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）固相オリゴヌクレオチド合成における欠乏配列の
    キャッピング方法であって、キャッピング剤を欠乏配列
    のヒドロキシル基と縮合させる工程を含み、縮合剤が次
    式により規定されることを特徴とする方法： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｒは低級アルキル基、電子引抜き置換低級アル
    キル基、低級アルキル−置換又はハロ−置換アリール基
    、或いは５〜８個の炭素原子を有する窒素−酸素−また
    はイオウ−含有複素環基である）。
  2. （２）該縮合工程が該キャッピング剤を該ヒドロキシル
    基と立体的に妨害された酸クロライドの存在化において
    反応させることを含む特許請求の範囲第１項記載の方法
    。
  3. （３）Ｒが１〜６個の炭素原子を含む直鎖、分岐或いは
    環状アルキル基、モルホール基、チオモルホリニル基、
    ピペリジニル基、ピペラジニル基、或いはベーター電子
    引抜き置換エチル基であり、および該立体的に妨害され
    た酸クロライドが次式により規定される特許請求の範囲
    第２項記載の方法： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｒ’はｔｅｒｔ−ブチル基、ｓｅｃ−フチル基
    、シクロヘキシル基、アダマンチル基、ノルボルニル基
    或いはフェニル基である）。
  4. （４）該キャッピング剤が次式により規定される塩であ
    る特許請求の範囲第３項記載の方法：▲数式、化学式、
    表等があります▼ （式中、Ｘ＾＋はアンモニウム基、低級アルキルアンモ
    ニウム基、ピリジニウム基、ルチジニウム基、シクロヘ
    キシルアンモニウム基及び金属塩カチオンよりなる群か
    ら選ばれる）。
  5. （５）Ｘ＾＋がトリエチルアンモニウム基、テトラブチ
    ルアンモニウム基、ジイソプロピルエチルアンモニウム
    基、ピリジニウム基、ルチジニウム基、及びシクロヘキ
    シルアンモニウム基よりなる群から選ばれる特許請求の
    範囲第４項記載の方法。
  6. （６）Ｘ＾＋がトリエチルアンモニウム基、テトラブチ
    ルアンモニウム基及びジイソプロピルアンモニウム基よ
    りなる群から選ばれる特許請求の範囲第５項記載の方法
    。
  7. （７）Ｒが１〜４個の炭素原子の直鎖又は分岐鎖アルキ
    ル基、フェニルエチル基、ベーターシアノエチル基、モ
    リホリノ基、ピペリジノ基、チオモルホリノ基、或いは
    ベーターニトロエチル基である特許請求の範囲第６項記
    載の方法。
  8. （８）該立体的に妨害された酸クロライドが該キャッピ
    ング剤と等モル量で存在する特許請求の範囲第６項に記
    載の方法。
  9. （９）所定の配列のオリゴヌクレオチドを固体支持体上
    に合成する方法であって、下記工程を含んでなることを
    特徴とする方法： （ａ）固体支持体に結合した５’−保護オリゴヌクレオ
    チドを脱保護して脱保護オリゴヌクレオチドを形成する
    工程、 （ｂ）５’−保護ヌクレオチドモノマーを脱保護オリゴ
    ヌクレオチドと反応させて５’−保護オリゴヌクレオチ
    ド或いは５’ヒドロキシル基を有する欠乏配列のいづれ
    かを形成する工程、 （ｃ）欠乏配列を次式により規定されるキャッピング剤
    を欠乏配列の５’ヒドロキシル基と反応させることによ
    りキャッピングする工程： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｒは低級アルキル基、電子引抜き置換低級アル
    キル基、或いは低級アルキル−或いはハロ−置換アリー
    ル基である）、及び （ｄ）上記工程（ａ）〜（ｃ）を所定の配列のオリゴヌ
    クレオチドが得られるまで繰返す工程。
  10. （１０）該キャッピング剤のＲが低級アルキル基、ベー
    タ−シアノ−、ベータ−ニトロ−、ベータ−低級アルキ
    ル−置換スルホニル−、或いはベータ−フェニル置換エ
    チル基；低級アルキル−或いはハロ−置換フェニル基；
    低級アルキル−或いはハロ−置換ベンジル基；モルホリ
    ノ基；チオモルホリノ基；或いはピペリジノ基であり、
    及び該キャッピング工程が該キャッピング剤を該欠乏配
    列の該５’ヒドロキシル基と次式で表わされる立体的に
    妨害された酸クロライドの存在下において反応させるこ
    とを含む特許請求の範囲第８項記載の方法： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｒ’はｔｅｒｔ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基
    、シクロヘキシル基、アダマンチル基、ノルボルニル基
    或いはフェニル基である）。
  11. （１１）Ｒ’がｔｅｒｔ−ブチル基、ノルボルニル基或
    いはアダマンチル基である特許請求の範囲第９項記載の
    方法。
  12. （１２）該キャッピング剤が次式で規定される塩である
    特許請求の範囲第１０項記載の方法： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｘ＾＋はトリエチルアンモニウム基、テトラブ
    チルアンモニウム基或いはジイソプロピルエチルアンモ
    ニウム基である）。
  13. （１３）Ｒが１〜４個の炭素数の直鎖或いは分岐鎖アル
    キル基である特許請求の範囲第６項記載の方法。
  14. （１４）Ｒがモルホリノ基、ピペリジノ基或いはチオモ
    ルホリノ基である特許請求の範囲第６項記載の方法。
  15. （１５）Ｒが１〜４個の炭素数の直鎖或いは分岐鎖アル
    キル基である特許請求の範囲第９項記載の方法。
  16. （１６）Ｒがモルホリ基、ピペリジノ基或いはチオモル
    ホリノ基である特許請求の範囲第９項記載の方法。
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