JP2001515086A - オリゴヌクレオチドの溶液相合成 - Google Patents

オリゴヌクレオチドの溶液相合成

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Abstract

(57)【要約】 ホスホロチオエートトリエステルの溶液相での合成法が提供される。この方法は、カップリング剤の存在下でＨ−ホスホネートをアルコールと溶液相カップリングさせてＨ−ホスホネートジエステルを形成させることを含む。このＨ−ホスホネートジエステルをイオウ転移剤でｉｎ ｓｉｔｕ酸化させ、ホスホロチオエートトリエステルを産生する。好ましくは、Ｈ−ホスホネート及びアルコールは保護されたヌクレオシド又はオリゴヌクレオチドである。ホスホロチオエートトリエステルの形成に使用され得るオリゴヌクレオチドＨ−ホスホネートも提供される。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本発明は、Ｈ−ホスホネートカップリング及びｉｎ ｓｉｔｕイオウ転移に基
づいて低温で実施される、オリゴヌクレオチド及びオリゴヌクレオチド・ホスホ
ロチオエートを溶液において合成する方法を提供する。本発明はさらに、１回に
１つのヌクレオシド残基が付加されるオリゴヌクレオチド及びオリゴヌクレオチ
ド・ホスホロチオエートの段階合成及び１回に２つ又はそれ以上のヌクレオシド
残基が付加されるオリゴヌクレオチド及びオリゴヌクレオチド・ホスホロチオエ
ートのブロック合成の方法を提供する。
【０００２】 この１５年ほどで、オリゴデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ配列）、オリゴ
リボヌクレオチド（ＲＮＡ配列）及びそれらの類似体の合成法の開発は格段に進
歩した（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ ２０，Ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｆｏｒ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎ
ｄ Ａｎａｌｏｇｓ，Ａｇｒａｗａｌ，Ｓ．編、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，ト
トワ，１９９３）。研究のほとんどはマイクロモル又はさらに小さいスケールで
実行され、モノマーのホスホロアミダイト基礎単位が関わる自動化固相合成（Ｂ
ｅａｕｃａｇｅ，Ｓ．Ｌ．；Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ，Ｍ．Ｈ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒ
ｏｎ Ｌｅｔｔ．１９８１，２２，１８５９−１８６２）は、最も簡便なアプロ
ーチであるとされている。実際、今日では高分子量のＤＮＡ及び比較的高分子量
のＲＮＡ配列が市販の合成機を用いて常法により製造され得る。これら合成オリ
ゴヌクレオチドは生物学及びバイオテクノロジーにおける多くの重要なニーズに
応えてきた。
【０００３】 合成オリゴヌクレオチドがラウス肉腫ウイルスの遺伝子発現を選択的に阻害し
得るというＺａｍｅｃｎｉｋとＳｔｅｐｈｅｎｓｏｎの可能性を秘めた発見（Ｚ
ａｍａｃｎｉｋ，Ｐ．；Ｓｔｅｐｈｅｎｓｏｎ，Ｍ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９７８，７５，２８０−２８４）に続き、合成オリゴ
ヌクレオチド又はその類似体が化学療法に応用を見出す可能性があるという着想
は、産学の研究所で多いに注目を浴びてきた。例えば、Ｇｕｒａ，Ｔ．Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ，１９９５，２７０，５７５−５７７の論文には、化学療法におけるオリ
ゴヌクレオチド及びそのホスホロチオエート類似体の使用可能性が強調されてい
る。化学療法に対するいわゆるアンチセンス及びアンチジーン・アプローチ（Ｏ
ｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ｃｏｈｅｎ，Ｊ．Ｓ．編、Ｍａｃｍ
ｉｌｌａｎ，Ｂａｓｉｎｇｓｔｏｋｅ １９８９；Ｍｏｓｅｒ，Ｈ．Ｅ．；Ｄｅ
ｒｖａｎ，Ｐ．Ｂ．Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８７，２３８，６４５−６４９）は、
合成オリゴヌクレオチドに対する要求に著しく影響を及ぼしてきた。一般に分子
生物学上の目的にはミリグラム量で十分であるのに対し、グラムから１００グラ
ム以上の量が臨床試験には必要とされる。アンチセンス薬となる可能性があるい
くつかのオリゴヌクレオチド類似体が現在後期臨床試験の段階にある。ごく近い
将来に起こり得るように、これらオリゴヌクレオチド配列の１つが、例えばＡＩ
ＤＳ又はある種の癌の治療薬として承認されれば、キログラム又は恐らくは数キ
ログラム量の特定配列が求められる。
【０００４】 ここ数年で、オリゴヌクレオチド合成のスケールアップについて非常に多くの
研究がなされてきた。この研究のほとんどすべてがますます大型の合成機を構築
すること及び固体支持体上でのそのホスホロアミダイト化学に関するものである
。この出願人は、溶液でのオリゴヌクレオチド合成を大規模スケール及び中規模
スケールでも固相合成より適するものとする、ホスホトリエステルアプローチ方
法の最近の進歩を知らない。
【０００５】 固相合成が溶液合成に優る主な利点は、（ｉ）ずっと迅速であること、（ｉｉ
）カップリング収率が一般により高いこと、（ｉｉｉ）容易に自動化されること
、及び（ｉｖ）配列に関して完全に融通が効くこと、である。従って、多数のオ
リゴヌクレオチド配列が比較的少量、例えばコンビナトリアルの目的で、必要と
されるならば固相合成は特に有用である。しかし、中サイズの特定配列がすでに
同定され、薬物として承認され、キログラム量が求められる場合は、速度や融通
性はさして重要ではなく、溶液での合成がきわめて有利になりやすい。溶液合成
はまた、ブロックカップリング（即ち、１回で２つ又はそれ以上のヌクレオチド
残基を付加すること）がより容易であること及び任意のレベルまでのスケールア
ップが問題になりにくいこと、という点において固相合成に優る利点を有する。
より大型の自動合成機を製造することよりも反応器のサイズを増加させることの
ほうがずっと容易であり、ずっと安いことは確かである。
【０００６】 これまでは、溶液におけるオリゴヌクレオチド合成は、１９７０年代に開発さ
れた従来のホスホトリエステルアプローチ（Ｒｅｅｓｅ，Ｃ．Ｂ．，Ｔｅｔｒａ
ｈｅｄｒｏｎ １９７８，３４，３１４３−３１７９；Ｋａｐｌａｎ，Ｂ．Ｅ．
；Ｉｔａｋｕｒａ，Ｋ．‘Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏ
ｎｓ ｏｆ ＤＮＡ ａｎｄ ＲＮＡ’，Ｎａｒａｎｇ，Ｓ．Ａ．編、Ａｃａｄ
ｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，オーランド、１９８７，ｐｐ．９−４５）によって主に
実施されてきた。このアプローチは固相合成においても使用され得るが、ホスホ
ロアミダイトモノマーが使用される時は、カップリング反応は幾分より速くなり
、カップリング収率は幾分より高くなる。自動化固相合成がホスホロアミダイト
基礎単位の使用に概して基づいてきたのはこのためであるが、比較的大量の合成
オリゴヌクレオチドを必要とする研究者たちがホスホロアミダイトをベースとす
る固相合成のスケールアップを実現させようとしてきたからでもあろう。
【０００７】 オリゴヌクレオチドの化学合成には、３種類の主な方法、つまりホスホトリエ
ステル（Ｒｅｅｓｅ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，１９７８）、ホスホロアミダイ
ト（Ｂｅａｕｃａｇｅ，Ｓ．Ｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ ２０，Ａｇｒａｗａｌ，Ｓ．編、Ｈｕｍａｎａ Ｐ
ｒｅｓｓ，トトワ、１９９３，ｐｐ３３−６１）及びＨ−ホスホネート（Ｆｒｏ
ｅｈｌｅｒ，Ｂ．Ｃ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌ
ｏｇｙ，Ｖｏｌ ２０，Ａｇｒａｗａｌ，Ｓ．編、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，
トトワ、１９９３，ｐｐ６３−８０）のアプローチが有効であることがわかって
いる。ホスホトリエステルアプローチが溶液合成で最も広く使用されてきたのに
対し、ホスホロアミダイト及びＨ−ホスホネートアプローチは専ら固相合成に使
用されてきた。
【０００８】 溶液におけるホスホトリエステルアプローチには２つの異なる合成戦略が適用
されている。
【０００９】 溶液におけるオリゴデオキシリボヌクレオチド合成におそらく最も広く使用さ
れている戦略は、保護された３’−（２−クロロフェニル）リン酸ヌクレオシド
又はオリゴヌクレオチド（Ｃｈａｔｔｏｐａｄｈｙａｙａ，Ｊ．Ｂ．；Ｒｅｅｓ
ｅ，Ｃ．Ｂ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９８０，８，２０３９
−２０５４）とフリーの５’−ヒドロキシ官能基を有し保護されたヌクレオシド
又はオリゴヌクレオチドとのカップリング反応でホスホトリエステルを生成させ
ることを含むものである。１−（メシチレン−２−スルホニル）−３−ニトロ−
１，２，４−１Ｈ−トリアゾール（ＭＳＮＴ）のようなカップリング剤（Ｒｅｅ
ｓｅ，Ｃ．Ｂ．；Ｔｉｔｍａｓ，Ｒ．Ｃ．；Ｙａｕ，Ｌ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏ
ｎ Ｌｅｔｔ．，１９７８，２７２７−２７３０）が必要とされる。この戦略は
ホスホロチオエート類似体の合成にも使用されてきた。保護されたヌクレオシド
又はオリゴヌクレオチド３’−Ｓ−（２−シアノエチル又は、例えば４−ニトロ
ベンジル）ホスホロチオエート（Ｌｉｕ，Ｘ．；Ｒｅｅｓｅ，Ｃ．Ｂ．Ｊ．Ｃｈ
ｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ．１，１９９５，１６８５−１６９
５）とフリーの５’−ヒドロキシ官能基を有し保護されたヌクレオシド又はオリ
ゴヌクレオチドとの間で同じようにカップリングが実効化される。この従来のホ
スホトリエステルアプローチの主要な欠点は、後者の成分で同時に５’−スルホ
ン化がいくらか起こること（Ｒｅｅｓｅ，Ｃ．Ｂ．；Ｚｈａｎｇ，Ｐ．−Ｚ．Ｊ
．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ．１，１９９５，２２９１−
２３０１）及びカップリング反応が概して比較的ゆっくりと進行することである
。スルホン化の副反応は収率を低下させ、所望の生成物の精製を妨げる。
【００１０】 オリゴデオキシリボヌクレオチドの溶液合成に関する第二の戦略は、アリール
（通常は２−クロロフェニル）ホスホロジクロリデート由来の二官能試薬及び２
分子当量の、例えば１−ヒドロキシベンゾトリアゾールのような、添加剤（ｖａ
ｎ ｄｅｒ Ｍａｒｅｌら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９８１，
２２，３８８７−３８９０）の使用を含む。２，５−ジクロロフェニルホスホロ
ジクロリドチオエート由来の関連二官能試薬（反応式１ｂ）もオリゴヌクレオチ
ド・ホスホロチオエートの製造において同じように使用されてきた（Ｋｅｍａｌ
，Ｏら、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１９８３，５９
１−５９３）。
【００１１】 第二の戦略の主な欠点は、二官能試薬の関与から直接生じる。つまり、対称的
なカップリング産物が形成される可能性があること、及び少量の水分が存在する
とカップリング収率が著しく減少することである。
【００１２】 本発明のある側面の目的は、多くの態様において（ａ）きわめて効率的であり
、副反応を導かない、（ｂ）比較的速く進行する、及び（ｃ）オリゴヌクレオチ
ド、そのホスホロチオエート類似体及び、ホスホジエステル及びホスホロチオエ
ートジエステルのヌクレオチド間結合の両方を含有するキメラオリゴヌクレオチ
ドに対して等しく適している、オリゴヌクレオチドの溶液合成に対する新規なカ
ップリング方法を提供することである。
【００１３】 本発明の第一の側面によれば、Ｈ−ホスホネートをカップリング剤の存在下で
アルコールと溶液相カップリングさせることによりＨ−ホスホネートジエステル
を形成させ、このＨ−ホスホネートジエステルをイオウ転移剤とｉｎ ｓｉｔｕ
で反応させ、ホスホロチオエートトリエステルを産生することを含む、ホスホロ
チオエートトリエステルの製造法が提供される。
【００１４】 本発明の方法に利用されるＨ−ホスホネートは、都合よくは、５’又は３’Ｈ
−ホスホネート官能基、特に好ましくは３’Ｈ−ホスホネート官能基を含む、保
護されたヌクレオシド又はオリゴヌクレオチドＨ−ホスホネートである。好まし
いヌクレオシドは２’−デオキシリボヌクレオシド及びリボヌクレオシドであり
；好ましいオリゴヌクレオチドはオリゴデオキシリボヌクレオチド及びオリゴリ
ボヌクレオチドである。
【００１５】 Ｈ−ホスホネート基礎単位が、３’Ｈ−ホスホネート官能基を含む保護された
デオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシド、オリゴデオキシリボヌクレオチ
ド又はオリゴリボヌクレオチド誘導体であるときは、５’ヒドロキシ官能基は都
合よくは適切な保護基によって保護されている。そのような適切な保護基の例は
、酸で化学変化を起こしやすい保護基、特にジメトキシトリチル及び９−フェニ
ルキサンテン−９−イル基のようなトリチル及び置換されたトリチル基；及びＦ
ＭＯＣのような塩基で化学変化を起こしやすい保護基を包含する。
【００１６】 Ｈ−ホスホネート基礎単位が、５’Ｈ−ホスホネート官能基を含む保護された
デオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシド、オリゴデオキシリボヌクレオチ
ド又はオリゴリボヌクレオチド誘導体であるときは、３’ヒドロキシ官能基は都
合よくは適切な保護基によって保護されている。適切な保護基は、３’Ｈ−ホス
ホネート基礎単位の５’ヒドロキシ官能基を保護するための上記に開示されたも
の及び、レブリノイル及び置換されたレブリノイルのような、アシル基を包含す
る。
【００１７】 Ｈ−ホスホネートが保護されたリボヌクレオシド又は保護されたオリゴリボヌ
クレオチドであるときは、２’−ヒドロキシ官能基は、都合よくは適切な保護基
、例えば酸に弱いアセタール保護基、特に１−（２−フルオロフェニル）−４−
メトキシピペリジン−４−イル（Ｆｐｍｐ）；及びトリアルキルシリル基、しば
しば３級ブチルジメチルシリル基のようなトリ（Ｃ1-4−アルキル）シリル基に よって保護される。別のやり方では、リボヌクレオシド又はオリゴリボヌクレオ
チドは、２’−Ｏ−アルキル、２’−Ｏ−アルコキシアルキル又は２’−Ｏ−ア
ルケニル誘導体、普通はＣ1-4アルキル、Ｃ1-4アルコキシＣ1-4アルキル又はア ルケニル誘導体であり得て、いずれの場合も２’位はさらなる保護を必要としな
い。
【００１８】 本発明に記載の方法に利用され得るＨ−ホスホネートは、他の多官能アルコー
ル、特にアルキルアルコール及び好ましくはジオール又はトリオールから派生す
る。アルキルジオールの例は、エタン−１，２−ジオール、及び４００までの分
子量を有するような低分子量ポリ（エチレングリコール）を包含する。アルキル
トリオールの例はグリセロール及びブタントリオールを包含する。通常は、単一
のＨ−ホスホネート官能基が存在し、残りのヒドロキシル基は、リボヌクレオシ
ドの５’又は２’位での保護のために上記に開示されたような適切な保護基によ
って保護されている。
【００１９】 本発明の方法に利用されるアルコールは、通常フリーのヒドロキシル基、好ま
しくはフリーの３’又は５’ヒドロキシル基、及び特に好ましくは５’ヒドロキ
シル基を含んでなる保護されたヌクレオシド又はオリゴヌクレオチドである。
【００２０】 アルコールが保護されたヌクレオシド又は保護されたオリゴヌクレオチドであ
るとき、好ましいヌクレオシドはデオキシリボヌクレオシド及びリボヌクレオシ
ドであり、好ましいオリゴヌクレオチドはオリゴデオキシリボヌクレオチド及び
オリゴリボヌクレオチドである。
【００２１】 アルコールがフリーの５’−ヒドロキシ基を含んでなるデオキシリボヌクレオ
シド、リボヌクレオシド、オリゴデオキシリボヌクレオチド又はオリゴリボヌク
レオチド誘導体であるとき、３’−ヒドロキシ官能基は都合よくは適切な保護基
により保護される。そのような保護基の例は、γ−ケト酸から由来したもののよ
うな１６までの炭素原子を通常含んでなる、レブリノイル基及び置換されたレブ
ノイル基のようなアシル基を包含する。置換されたレブリノイル基は、特に５，
５，５−トリフルオロレブリノイルのような５−ハロ−レブリノイル及びベンゾ
イルプロピオニル基を包含する。他のそのような保護基は、特にラウロイル基の
ような直鎖又は分岐鎖Ｃ6-16アルカノイル基を含む脂肪族アルカノイル基；ベン
ゾイル基及び、アルキル（通常はＣ1-4アルキル）及びハロ（通常はクロロ又は フルオロ）で置換されたベンゾイル基のような、置換されたベンゾイル基；及び
特に３級ブチルジメチルシリル及び３級ブチルジフェニルシリル基を含むアルキ
ル（通常はＣ1-4アルキル）及びアリール（通常はフェニル）シリルエーテルの ようなシリルエーテルを包含する。
【００２２】 アルコールがフリーの３’−ヒドロキシ基を含んでなる保護されたデオキシリ
ボヌクレオシド、リボヌクレオシド、オリゴデオキシリボヌクレオチド又はオリ
ゴリボヌクレオチドであるとき、５’−ヒドロキシ官能基は都合よくは適切な保
護基により保護される。適切な保護基は、デオキシリボヌクレオシド、リボヌク
レオシド、オリゴデオキシリボヌクレオチド及びオリゴリボヌクレオチド３’Ｈ
−ホスホネートの５’ヒドロキシ基の保護のために上記に開示されたようなもの
である。
【００２３】 アルコールがリボヌクレオシド又はオリゴリボヌクレオチドであるとき、２’
−ヒドロキシ官能基は、都合よくは、アセタール、特に１−（２−フルオロフェ
ニル）−４−メトキシピペリジン−４−イル（Ｆｐｍｐ）；及びトリアルキルシ
リル基、多くは３級ブチルジメチルシリル基のようなトリ（Ｃ1-4−アルキル） シリル基のような適切な保護基によって保護されている。別のやり方では、リボ
ヌクレオシド又はオリゴリボヌクレオチドは、２’−Ｏ−アルキル、２’−Ｏ−
アルコキシアルキル又は２’−Ｏ−アルケニル誘導体、通常はＣ1-4アルキル、 Ｃ１−４アルコキシＣ１−４アルキル又はアルケニル誘導体であり得て、この場
合、２’位は更なる保護を必要としない。
【００２４】 本発明に記載の方法に利用され得る他のアルコールは、非サッカライドポリオ
ール、特にアルキルポリオール、及び好ましくはジオール又はトリオールである
。アルキルジオールの例は、エタン−１，２−ジオール、及び４００までの分子
量を有するような低分子量ポリ（エチレングリコール）を包含する。アルキルト
リオールの例はグリセロール及びブタントリオールを包含する。通常は、単一の
フリーのヒドロキシ基が存在し、残りのヒドロキシ基は、リボヌクレオシドの５
’又は２’位での保護のために上記に開示されたような適切な保護基によって保
護されている。しかしながら、１より多いヒドロキシ基において同一のカップリ
ングを実施することが所望されるならば、１より多いフリーヒドロキシ基が存在
し得る。
【００２５】 Ｈ−ホスホネート及びアルコールがいずれも保護されたヌクレオシド又はオリ
ゴヌクレオチドであるとき、本発明は、Ｈ−ホスホネートカップリング反応に基
づいた、オリゴデオキシリボヌクレオチド、オリゴリボヌクレオチド及びそれら
の類似体の溶液における段階及びブロック合成の改良法を提供する。本発明の１
つの好ましい側面によると、３’−末端Ｈ−ホスホネート官能基を有する保護さ
れたヌクレオシド又はオリゴヌクレオチド及び５’−末端ヒドロキシ官能基を有
する保護されたヌクレオシド又はオリゴヌクレオチドは、適切なカップリング剤
の存在下でカップリングし、保護されたジヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド
Ｈ−ホスホネートの中間体を形成し、ここで前記中間体は適切なイオウ転移剤の
存在下でｉｎ ｓｉｔｕイオウ転移反応をする。
【００２６】 ヒドロキシ保護基の存在に加えて、本発明に利用されるヌクレオシド／ヌクレ
オチドに存在する塩基も、必要ならば適切な保護基によって好ましくは保護され
る。利用される保護基は、そのような塩基を保護するために当技術分野で知られ
ているものである。例えば、Ａ及び／又はＣは、例えばアルキル又はアルコキシ
、しばしばＣ1-4アルキル又はＣ1-4アルコシキベンゾイルといった置換されたベ
ンゾイルを包含するベンゾイル；ピバロイル；及びアミジン、特にジアルキルア
ミノメチレン、好ましくはジメチル又はジブチルアミノエチレンのようなジ（Ｃ 1-4 アルキル）アミノメチレン、によって保護され得る。Ｇは、例えば２，５− ジクロロフェニルといった置換されたフェニルを包含するフェニル、及びまたイ
ソブチル基によって保護され得る。Ｔ及びＵは一般に保護されることを必要とし
ないが、ある態様では、例えば２，４−ジメチルフェニルといった置換されたフ
ェニルを包含するフェニル基によって例えばＯ４位で、又はピバロイルオキシメ
チル、ベンゾイル、Ｃ1-4アルキル又はＣ1-4アルコキシベンゾイルのようなアル
キル又はアルコキシ置換ベンゾイルによってＮ３位で、都合よくは保護され得る
。
【００２７】 アルコール及び／又はＨ−ホスホネートが保護されたヒドロキシ基を有する保
護されたヌクレオシド又はオリゴヌクレオチドであるとき、これら保護基の１つ
は第一の発明の方法を実施した後で除去され得る。通常、除去される保護基は３
’−ヒドロキシ官能基の上にあるものである。保護基が除去された後で、このよ
うに形成されたオリゴヌクレオチドはＨ−ホスホネートへ変換され得、次いで所
望のオリゴヌクレオチド配列の合成において、本発明の方法によるさらなる段階
又はブロックカップリング及びイオウ転移へ進行し得る。次にこの方法は、ヌク
レオチド間結合、３’及び５’−ヒドロキシ基及び塩基から保護基を除去する工
程へ進行し得る。同様の方法は、除去される保護基が５’ヒドロキシ官能基の上
にある、５’Ｈ−ホスホネートのカップリングへ適用され得る。
【００２８】 特に好ましい態様では、本発明は、適切なカップリング剤の存在下における、
５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシリボヌクレオシ
ド３’−Ｈ−ホスホネート又は保護されたオリゴデオキシリボヌクレオチド３’
−Ｈ−ホスホネートとフリーの５’−ヒドロキシ官能基を有する成分のカップリ
ングと、及びこれに続く適切なイオウ転移剤の存在下におけるｉｎ ｓｉｔｕイ
オウ転移とを含んでなる方法を提供する。
【００２９】 本発明の方法では、先行技術で利用される任意の適切なカップリング剤及びイ
オウ転移剤が使用され得る。
【００３０】 適切なカップリング剤の例は、アルキル及びアリール酸クロリド、アルカン及
びアレーンスルホニルクロリド、アルキル及びアリールクロロホルメート、アル
キル及びアリールクロロ亜硫酸塩、及びアルキル及びアリールホスホロクロリデ
ートを包含する。
【００３１】 利用し得る適切なアルキル酸クロリドの例は、Ｃ2−Ｃ7アルカノイルクロリド
、特にピバノイルクロリドを包含する。利用し得るアリール酸クロリドの例は、
Ｃ1-4アルコキシ、ハロ、特にフルオロ、クロロ及びブロモ、及びＣ1-4アルキル
で置換したベンゾイルクロリドのような、置換された及び置換されていないベン
ゾイルクロリドを包含する。置換されているとき、特にアルキル及びハロ置換基
の場合は、１〜３の置換基がしばしば存在する。
【００３２】 利用し得る適切なアルカンスルホニルクロリドの例は、Ｃ2−Ｃ7アルカンスル
ホニルクロリドを包含する。利用し得るアレーンスルホニルクロリドの例は、Ｃ 1-4 アルコキシ、ハロ、特にフルオロ、クロロ及びブロモ、及びＣ1-4アルキルで
置換したベンゼンスルホニルクロリドのような、置換された及び置換されていな
いベンゼンスルホニルクロリドを包含する。置換されているとき、特にアルキル
及びハロ置換基の場合は、１〜３の置換基がしばしば存在する。
【００３３】 利用し得る適切なアルキルクロロホルメートの例は、Ｃ2−Ｃ7アルキルクロロ
ホルメート包含する。利用し得るアリールクロロホルメートの例は、Ｃ1-4アル コキシ、ハロ、特にフルオロ、クロロ及びブロモ、及びＣ1-4アルキルで置換し たフェニルクロロホルメートのような、置換された及び置換されていないフェニ
ルクロロホルメートを包含する。置換されているとき、特にアルキル及びハロ置
換基の場合は、１〜３の置換基がしばしば存在する。
【００３４】 利用し得る適切なアルキルクロロ亜硫酸塩の例は、Ｃ2−Ｃ7アルキルクロロ亜
硫酸塩を包含する。利用し得るアリールクロロ亜硫酸塩の例は、Ｃ1-4アルコキ シ、ハロ、特にフルオロ、クロロ及びブロモ、及びＣ1-4アルキルで置換したフ ェニルクロロ亜硫酸塩のような、置換された及び置換されていないフェニルクロ
ロ亜硫酸塩を包含する。置換されているとき、特にアルキル及びハロ置換基の場
合は、１〜３の置換基がしばしば存在する。
【００３５】 利用し得る適切なアルキルホスホロクロリデートの例は、ジ（Ｃ1−Ｃ6アルキ
ル）ホスホロクロリデートを包含する。利用し得るアリールホスホロクロリデー
トの例は、Ｃ1-4アルコキシ、ハロ、特にフルオロ、クロロ及びブロモ、及びＣ1 -4 アルキルで置換したジフェニルホスホロクロリデートのような、置換された及
び置換されていないジフェニルホスホロクロリデートを包含する。置換されてい
るとき、特にアルキル及びハロ置換基の場合は、１〜３の置換基がしばしば存在
する。
【００３６】 利用し得るさらなるカップリング剤は、Ｗａｄａら、Ｊ．Ａ．Ｃ．Ｓ．１９９
７，１１９，１２７１０〜１２７２１頁（参照により本明細書に組込まれている
）によって開示されている、クロロ−、ブロモ−及び（ベンゾトリアゾ−１−イ
ルオキシ）−ホスホニウム及びカルボニウム化合物である。
【００３７】 好ましいカップリング剤はジアリールホスホロクロリデート、特に（ＡｒＯ） 2 ＰＯＣｌ（ここで、Ａｒは、好ましくはフェニル、２−クロロフェニル、２， ４，６−トリクロロフェニル又は２，４，６−トリブロモフェニルである）とい
う式を有するものである。
【００３８】 イオウ転移剤の種類は、オリゴヌクレオチド、ホスホロチオエート類似体又は
オリゴヌクレオチド／オリゴヌクレオチドホスホロチオエートの混合物のいずれ
を求めるかに依存する。本発明の方法に利用されるイオウ転移剤は、しばしば以
下の一般化学式を有する： Ｌ----Ｓ----Ａ ここで、Ｌは脱離基を表し、Ａはアリール基、メチル又は置換されたアルキル基
、又はアルケニル基を表す。通常、脱離基は、窒素−イオウ結合を含むように選
択される。適切な脱離基の例は、モルホリン−３、５−ジオンのようなモルホリ
ン；フタルイミド、スクシンイミド及びマレイン酸イミドのようなイミド；イン
ダゾール、特に４−ニトロインダゾールのような電子吸引性の置換基を有するイ
ンダゾール；及びトリアゾールを包含する。
【００３９】 標準的なホスホジエステル結合が最終産物に求められる場合、イオウ転移剤、
Ａ部分は、フェニル又はナフチル基のようなアリール基を表す。適切なアリール
基の例は、置換された及び置換されていないフェニル基、特にハロフェニル及び
アルキルフェニル基、とりわけ４−ハロフェニル及び４−アルキルフェニル、通
常は４−（Ｃ1-4アルキル）フェニル基、最も好ましくは４−クロロフェニル及 びｐ−トリル基を包含する。標準的なホスホジエステル指向性のイオウ転移剤の
適切なクラスの例は、Ｎ−（アリールスルファニル）フタルイミド（スクシンイ
ミド又は他のイミドもまた使用され得る）である。
【００４０】 ホスホロチオエートジエステル結合が最終産物に求められる場合、Ａ部分は、
メチル、置換されたアルキル又はアルケニル基を表す。適切な置換されたアルキ
ル基の例は、置換されたメチル基、特にベンジル基及びアルキル−、通常はＣ1- 4 アルキル及びハロ−、通常はクロロで置換されたベンジル基のような置換され たベンジル基、及び置換されたエチル基、特に２位が２−（４−ニトロフェニル
）エチル及び２−シアノエチル基のような電子吸引性の置換基で置換されたエチ
ル基を包含する。適切なアルケニル基の例は、アリル及びクロチルである。ホス
ホロチオエート指向性のイオウ転移剤の適切なクラスの例は、例えば、４−［（
２−シアノエチル）−スルファニル］モルホリン−３，５−ジオンのような（２
−シアノエチル）スルファニル誘導体又は３−（フタルイミドスルファニル）プ
ロパノニトリルのような対応する試薬である。
【００４１】 カップリング反応及びイオウ転移を実行するのに適した温度は、約−５５℃〜
室温（通常１０〜３０℃の範囲、例えば２０℃）の範囲、及び好ましくは−４０
℃〜０℃である。
【００４２】 本発明の方法に利用し得る有機溶媒は、ハロアルカン、特にジクロロメタン、
エステル、特に酢酸エチル及びプロピオン酸メチル又はエチルのようなアルキル
エステル、及びピリジンのような塩基性、親核性の溶媒を包含する。カップリン
グ及びイオウ転移工程に好ましい溶媒は、ピリジン、ジクロロメタン及びそれら
の混合物である。
【００４３】 本発明の方法におけるＨ−ホスホネートとアルコールのモル比は、約０．９：
１〜３：１、通常は約１：１から約２：１、及び好ましくは、約１．２：１のよ
うに、約１．１：１〜約１．５：１の範囲でしばしば選択される。しかしながら
、１つ以上のフリーヒドロキシルにおいてカップリングが同時に起こる場合は、
このモル比はそれに比例して増加される。カップリング剤とアルコールのモル比
は、約１：１〜約１０：１、通常は約１．５：１〜約５：１、及び好ましくは、
約２：１〜約３：１の範囲でしばしば選択される。イオウ転移剤とアルコールの
モル比は、約１：１〜約１０：１、通常は約１．５：１〜約５：１、及び好まし
くは、約２：１〜約３：１の範囲でしばしば選択される。
【００４４】 本発明の方法において、Ｈ−ホスホネート及びアルコールは前もって溶液内で
混合され、この混合液へカップリング剤を加え得る。別のやり方では、Ｈ−ホス
ホネート及びカップリング剤が前もって、しばしば溶液内で、混合され、次いで
アルコールの溶液を加え得るか、又はアルコールとカップリング剤を、通常溶液
内で、混合してから、次いでＨ−ホスホネートの溶液へ加えてもよい。ある態様
では、所望により溶液の形態をしたＨ−ホスホネートを、アルコール及びカップ
リング剤の混合物を含んでなる溶液へ加え得る。カップリング反応が実質的に完
了してから、カップリング反応で生成したＨ−ホスホネートジエステルの溶液へ
イオウ転移剤を加える。試薬の添加は、通常連続的に又は添加時間にわたって漸
増的に実施する。
【００４５】 本発明の方法では、特にこの方法が段階的に実施されるときは、適切なイオウ
転移剤を選択することにより、同一分子内にホスホジエステルとホスホロチオエ
ートジエステルのヌクレオチド内結合の両方を含有するオリゴヌクレオチドを製
造することが可能である。
【００４６】 既に述べたように、本発明の方法は、ＲＮＡ、２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡ、
２’−Ｏ−アルコキシアルキル−ＲＮＡ及び２’−Ｏ−アルケニル−ＲＮＡ配列
の合成に使用され得る。２’−Ｏ−（Ｆｐｍｐ）−５’−Ｏ−（４，４−ジメト
キシトリチル）−リボヌクレオシド３’−Ｈ−ホスホネート１及び２’−Ｏ−（
アルキル、アルコキシアルキル又はアルケニル）−５’−Ｏ−（４，４−ジメト
キシトリチル）−リボヌクレオシド３’−Ｈ−ホスホネート２ａ−ｃは、例えば
対応するヌクレオシド基礎単位であるｐ−クレシルＨ−ホスホネートアンモニウ
ム及び塩化ピバロイルから製造され得る。
【００４７】
【化４】
【００４８】 ＤＮＡ及びＤＮＡホスホロチオエート配列の合成と同一のプロトコールが使用
される（スキーム２〜４）。標準的な脱保護法（スキーム２、工程ｖ及びｖｉ）
に倣って、ヌクレオチド間結合の開裂も移動も検出されない温和な酸加水分解の
条件下で、Ｆｐｍｐ保護基が除去される（Ｃａｐａｌｄｉ，Ｄ．Ｃ．；Ｒｅｅｓ
ｅ，Ｃ．Ｂ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９４，２２，２２０９
−２２１６）。化学療法で有用なリボザイム配列のためには、比較的大きいスケ
ールのＲＮＡ溶液合成が実用上重要な問題である。２’−Ｏ−アルキル、２’−
Ｏ−置換アルキル及び２’−Ｏ−アルケニル［特に、２’−Ｏ−メチル、２’−
Ｏ−アリル及び２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）］−リボヌクレオシド（Ｓｐ
ｒｏａｔ，Ｂ．Ｓ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏ
ｇｙ，Ｖｏｌ ２０，Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｆｏｒ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔ
ｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｓ，Ａｇｒａｗａｌ，Ｓ．編、Ｈｕｍａｎａ
Ｐｒｅｓｓ，トトワ，１９９３）をオリゴヌクレオチドへ取込ませることは、こ
れらの修飾により、得られるオリゴマーにヌクレアーゼ消化に対する抵抗性及び
良好なハイブリダイゼーション特性がもたらされるので、現在非常に重要な問題
になっている。
【００４９】 イオウ転移工程は、Ｈ−ホスホネートのｉｎ ｓｉｔｕカップリング産物に対
して、つまりカップリング反応によって生成される中間体を分離及び精製するこ
となく、実施される。好ましくは、イオウ転移剤は、カップリング反応から生じ
る混合物を撹拌しながら加えられる。
【００５０】 均質の溶液において実施されるということに加え、本発明のカップリング法は
、少なくとも２つの他の重要な点で、Ｈ−ホスホネートの固相合成アプローチ（
Ｆｒｏｅｈｌｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏ
ｇｙ，１９９３）の方法と異なる。第一は、ごく低温でそれが実施され得ること
である。それにより、塩化ピバロイル（Ｆｒｏｅｈｌｅｒ，Ｂ．Ｃ．；Ｍａｔｔ
ｅｕｃｃｉ，Ｍ．Ｄ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９８６，２７，
４６９−４７２）ではなくジ−（２−クロロフェニル）ホスホロジクロリデート
がカップリング剤として使用されるときでも、Ｈ−ホスホネートカップリングに
伴い得る副反応（Ｋｕｙｌ−Ｙｅｈｅｓｋｉｅｌｙら、Ｒｅｃ．Ｔｒａｖ．Ｃｈ
ｉｍ．，１９８６，１０５，５０５〜５０６）が回避され得る。第二は、イオウ
転移が、完全なオリゴマー配列アセンブリーの後で１回だけというのではなく、
各カップリング工程の後に実施されることである。
【００５１】 保護基は、特定の保護基及び官能基について当技術分野で知られている方法を
使用して除去され得る。例えば、過渡的な保護基（transient protecting gro
ups）、特にレブリノイル型の保護基のようなγ−ケト酸は、ｖａｎ Ｂｏｏｍ ．Ｊ．Ｈ．；Ｂｕｒｇｅｒｓ，Ｐ．Ｍ．Ｊ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ
．，１９７６，４８７５−４８７８により開示されたごく温和な条件下でのヒド
ラジン処理のように、ヒドラジン、例えば緩衝化されたヒドラジンを用いた処理
により除去され得る。得られる部分的に保護された、フリーの３’−ヒドロキシ
官能基がついたオリゴヌクレオチドは、次いで、オリゴヌクレオチド及びそのホ
スホロチオエート類似体のブロック合成に利用され得る中間体である対応するＨ
−ホスホネートへ変換され得る。
【００５２】 生成された所望の産物を脱保護するときは、ホスホロチオエートトリエステル
結合を産生する、リン上の保護基が普通は最初に除去される。例えば、シアノエ
チル基は、ＤＡＢＣＯ、１，５−ジアザビシクロ［４．３．０］ノナ−５−エン
（ＤＢＮ）、１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エン（ＤＢ
Ｕ）又はトリエチルアミンのような強塩基性アミンでの処理により、除去され得
る。
【００５３】 ホスホロチオエートヌクレオチド間結合及び塩基残基上のフェニル及び置換フ
ェニル基は、例えばアルドキシムの、好ましくはＥ−２−ニトロベンズアルドキ
シム又はピリジン−２−カルボキシアルドキシム（Ｒｅｅｓｅら、Ｎｕｃｌｅｉ
ｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９８１）の共役塩基を用いたオキシメート処理によ
って除去され得る。Ｋａｍｉｍｕｒａ，Ｔ．ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．
１９８４，１０６，４５５２−４５５７及びＳｅｋｉｎｅ，Ｍ．ら、Ｔｅｔｒａ
ｈｅｄｒｏｎ，１９８５，４１，５２７９−５２８８は、Ｓ−フェニルホスホロ
チオエート中間体に基づいたホスホトリエステルアプローチによるオリゴヌクレ
オチドの溶液合成アプローチにおいて、及びｖａｎ Ｂｏｏｍとその共同研究者
は、Ｓ−（４−メチルフェニル）ホスホロチオエート中間体（Ｗｒｅｅｓｍａｎ
，Ｃ．Ｔ．Ｊ．ら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．１９８５，２６，９３
３−９３６）に基づいたオリゴヌクレオチド合成アプローチにおいて、いずれも
、オキシメートイオンでＳ−フェニルホスホロチオエートを（Ｒｅｅｓｅら、１
９７８；Ｒｅｅｓｅ，Ｃ．Ｂ．；Ｚａｒｄ，Ｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．，１９８１，９，４６１１−４６２６の方法を使用して）アンブロック
（ｕｎｂｌｏｃｋｉｎｇ）すると天然のホスホジエステルヌクレオチド間結合を
導くことを示した。本発明では、Ｅ−２−ニトロベンズアルドキシムの共役塩基
を用いたＳ−（４−クロロフェニル）−保護されたホスホロチオエートのアンブ
ロックは、円滑に、検出されるヌクレオチド間の開裂を起こすことなく進行する
。
【００５４】 他の塩基保護基、例えばベンゾイル、ピバロイル及びアミジン基は、濃アンモ
ニア水処理により除去され得る。
【００５５】 存在するトリチル基は酸処理によって除去され得る。オリゴデオキシヌクレオ
チド合成における全体的なアンブロック戦略に関する本発明のもう１つの重要な
考察は、トリチル、しばしば５’−末端ＤＭＴｒ、保護基の除去（「脱トリチル
化」）が、特に６−Ｎ−アシル−２’−デオキシアデノシン残基に併発する脱プ
リン化を起こさずに進行すべきであるということである。本発明の態様によると
、本発明者は、固相合成ではおそらく完全に回避することが難しい、そのような
脱プリン化を、低温において希塩酸溶液で、特に−５０℃において約０．４５Ｍ
の塩化水素／ジオキサン−ジクロロメタン（１：８ｖ／ｖ）溶液で「脱トリチル
化」を実効化することにより完全に抑制し得ることを見出した。これらの反応条
件下では、「脱トリチル化」は速やかに、ある場合は５分間又はそれ以下で、終
了し得る。例えば、６−Ｎ−ベンゾイル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシト
リチル）−２’−デオキシアデノシンをそのような条件下で塩化水素／ジオキサ
ン−ジクロロメタンによって処理したとき、「脱トリチル化」は２分後に完了し
たが、脱プリン化は４時間後も検出されなかった。
【００５６】 シリル保護基は、フッ素処理、例えばテトラブチルアンモニウムフルオリドの
ようなテトラアルキルアンモニウムフルオリド塩の溶液を用いて除去され得る。
【００５７】 Ｆｐｍｐ保護基は、温和な条件下での酸加水分解によって除去され得る。 オリゴヌクレオチドの溶液合成に対するこの新しいアプローチは、（ａ）ホス
ホジエステルのみ、（ｂ）ホスホロチオエートジエステルのみ及び（ｃ）ホスホ
ジエステル及びホスホロチオエートジエステルのヌクレオチド間結合の組み合わ
せ、を有する配列の製造に適している。
【００５８】 本発明はまた（反応式４ｂの例で示されるような）ブロックカップリングの開
発に関する。この点に関し、実施例は、テトラマーブロックからオクタデオキシ
リボヌクレオシド・へプタホスホロチオエートであるｄ［Ｔｐ（ｓ）Ｔｐ（ｓ）
Ｇｐ（ｓ）Ｇｐ（ｓ）Ｇｐ（ｓ）Ｇｐ（ｓ）Ｔｐ（ｓ）Ｔ］（ＩＳＩＳ ５３２
０ Ｒａｖｉｋｕｍａ，Ｖ．Ｔ．；Ｃｈｅｒｏｖａｌｌａｔｈ，Ｚ．Ｓ．Ｎｕｃ
ｌｅｏｓｉｄｅｓ ＆ Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ １９９６，１５，１１４９−
１１５５）を合成することを示す。このオリゴヌクレオチド類似体は、抗−ＨＩ
Ｖ薬としての特性を有する。他の提起されるブロック合成ターゲットは、治療効
果を有する配列、例えばヒトのトロンビン阻害剤及び抗−ＨＩＶ薬を包含する。
本発明の方法はさらにより大きい配列の合成に使用され得る。
【００５９】 本発明の方法がブロック合成に適用される場合、所望される生成物に至るル−
トに関して多くの代替戦略が利用可能であることは明らかであろう。これらは所
望される生成物の性質による。例えば、オクタマーは、ダイマーを製造し、これ
をカップルさせてテトラマーを産生し、次いでこれをカップルさせ所望のオクタ
マーを産生する、というようにして製造し得る。別のやり方では、ダイマーとト
リマーをカップルさせてペンタマーを産生し、これにさらにトリマーをカップル
させて所望のオクタマーを生成し得る。戦略の選択はユーザーが考慮すべきであ
る。しかしながら、そのようなブロックカップリングの一般的な特徴は、２つ又
はそれ以上のユニットを含んでなるオリゴマーのＨ−ホスホネートが、やはり２
つ又はそれ以上のユニットを含んでなるオリゴマーのアルコールとカップリング
することである。最も一般的には、オリゴヌクレオチドの３’−Ｈ−ホスホネー
トがフリーの５’−ヒドロキシ官能基を有するオリゴヌクレオチドとカップリン
グする。
【００６０】 本発明の方法はまた環状オリゴヌクレオチド、特に環状オリゴデオキシリボヌ
クレオチド及び環状リボヌクレオチドを製造するために利用され得る。環状オリ
ゴヌクレオチドの製造では、Ｈ−ホスホネート官能基を含んでなるオリゴヌクレ
オチド、しばしば３’又は５’Ｈ−ホスホネートが製造され、フリーのヒドロキ
シ官能基が適切な脱保護によって導入される。フリーヒドロキシ官能基の位置は
、通常Ｈ−ホスホネートに対応するように選択され、例えば、５’ヒドロキシ官
能基は３’Ｈ−ホスホネートとカップリングし、３’ヒドロキシ官能基は５’Ｈ
−ホスホネートとカップリングする。次いでヒドロキシ及びＨ−ホスホネート官
能基はカップリング剤の存在下で溶液において分子内カップリングし、この反応
にｉｎ ｓｉｔｕイオウ転移が続く。
【００６１】 本発明のさらなる側面によると、以下の一般的化学式を有する新規オリゴマー
Ｈ−ホスホネートが提供される：
【００６２】
【化５】
【００６３】 ここで、 各Ｂは、Ａ、Ｇ、Ｔ、Ｃ又はＵから独立して選択される塩基であり； 各Ｑは独立してＨ又はＯＲ’であって、Ｒ’はアルキル、置換されたアルキル
、アルケニル又は保護基であり； 各Ｒは独立してアリール、メチル、置換されたアルキル又はアルケニル基であ
り； Ｗは、Ｈ、保護基又は以下の式のＨ−ホスホネート基であり、
【００６４】
【化６】
【００６５】 ここでＭ+は１価カチオンであり； 各Ｘは独立してＯ又はＳを表し； 各Ｙは独立してＯ又はＳを表し； ＺはＨ、保護基又は以下の式のＨ−ホスホネート基であり、
【００６６】
【化７】
【００６７】 ここでＭ+は１価カチオンであり；及び ｎは正の整数であるが； ただし、ＷがＨ又は保護基であるときはＺがＨ−ホスホネート基であり、ＺがＨ
又は保護基であるときはＷがＨ−ホスホネート基である。
【００６８】 好ましくは、Ｗ又はＺの１つだけがＨ−ホスホネート基であり、通常はＺだけ
がＨ−ホスホネート基である。
【００６９】 Ｗ又はＺが保護基を表すとき、保護基は３’又は５’位をそれぞれ保護するた
めに上記に開示されたものの１つであり得る。Ｗが保護基であるとき、保護基は
トリチル基、特にジメトキシトリチル基である。Ｚが保護基であるとき、保護基
はトリチル基、特にジメトキシトリチル基又はアシル、好ましくはレブリノイル
基である。
【００７０】 Ｂにより表される塩基Ａ、Ｇ及びＣは、好ましくは保護され、塩基Ｔ及びＵは
保護され得る。好適な保護基は、本発明の第一の側面による方法において塩基の
保護のために上記に記載されたものを包含する。
【００７１】 ＱがＯＲ’の基を表し、Ｒ’がアルケニルであるとき、アルケニル基はしばし
ばＣ1-4アルケニル基、特にアリル又はクロチル基である。Ｒ’がアルキルを表 すとき、アルキルは、好ましくはＣ1-4アルキル基である。Ｒ’が置換されたア ルキルを表すとき、置換されたアルキル基はアルコキシアルキル基、特にメトキ
シエチル基のようなＣ1-4アルコキシＣ1-4アルキル基を包含する。Ｒ’が保護基
を表すとき、保護基は通常酸に対して化学的に不安定なアセタール保護基、特に
１−（２−フルオロフェニル）−４−メトキシピペリジン−４−イル（Ｆｐｍｐ
）又はトリアルキルシリル基、しばしば３級ブチルジメチルシリル基のようなト
リ（Ｃ1-4アルキル）シリル基である。
【００７２】 好ましくは、ＸはＯを表す。 多くの態様で、ＹはＳを表し、各Ｒは、本発明の方法に利用されるイオウ転移
剤から残存するメチル、置換されたアルキル、アルケニル又はアリール基を表す
。好ましくは、各Ｒは、独立してメチル基；置換されたメチル基、特にベンジル
又は、アルキル、通常はＣ1-4アルキル又はハロ、通常はクロロで置換されたベ ンジル基；置換されたエチル基、特に、２−（４−ニトロフェニル）エチル又は
２−シアノエチル基のような電子吸引性の置換基で２位を置換されたエチル基；
Ｃ1-4アルケニル基、好ましくはアリル及びクロチル基；又は置換された又は置 換されていないフェニル基、特にハロフェニル又はアルキルフェニル基、特に４
−ハロフェニル基又は４−アルキルフェニル基、通常は４−（Ｃ1-4アルキル） フェニル基、及び最も好ましくは４−クロロフェニル又はｐ−トリル基、を表す
。
【００７３】 Ｍ+は、好ましくは、トリ（Ｃ1-4アルキルアンモニウム）イオンのようなトリ
アルキルアンモニウムイオン、及び好ましくは、トリエチルアンモニウムイオン
を表す。
【００７４】 ｎは、合成されるように意図されたオリゴヌクレオチドに依存して、１から任
意の数、特に約２０までであり得る。好ましくは、ｎは１〜１６、特に１〜９で
ある。ｎが１、２又は３を表すＨ−ホスホネートは小さなヌクレオチドブロック
を加えるように所望されるときに利用され、より大きなオリゴヌクレオチドブロ
ックがカップリングすることが所望されるならば、それに応じたより大きなｎの
値、例えば５、６又は７又はそれ以上のものが利用される。
【００７５】 本発明によるＨ−ホスホネートは、通常溶液、好ましくは本発明の第一の側面
の方法で利用されるものの形態である。
【００７６】 これらのＨ−ホスホネートはまた、オリゴヌクレオチド及びオリゴヌクレオチ
ド・ホスホロチオエートのブロック合成に有用な中間体である。上記に示したよ
うに、ブロックカップリングは固相合成よりも液相合成においてずっと容易であ
る。
【００７７】 オリゴヌクレオチドＨ−ホスホネートはヌクレオシドＨ−ホスホネートの合成
について当技術分野で知られている一般的な方法を使用して製造され得る。従っ
て、本発明のさらなる側面では、フリーのヒドロキシ官能基、好ましくは３’又
は５’ヒドロキシ官能基を含んでなるオリゴヌクレオチドをアクチベーターの存
在下でアルキル又はアリールＨ−ホスホネート塩と反応させる、オリゴヌクレオ
チドＨ−ホスホネートの製造方法が提供される。
【００７８】 好ましくは、オリゴヌクレオチドは保護されたオリゴヌクレオチド、及び最も
好ましくは、保護されたオリゴデオキシヌクレオチド又は保護されたオリゴリボ
ヌクレオチドである。Ｈ−ホスホネート塩はしばしば、アルキル、アリール及び
アルキル及びアリールが混合したアンモニウム塩を包含するアンモニウム塩であ
る。好ましくは、アンモニウム塩は（ＮＨ4）+又はトリ（Ｃ1-4アルキル）アン モニウム塩である。Ｈ−ホスホネートに存在し得るアルキル基の例は、２，２，
２−トリフルオロエチル及び１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロプロパン
−２−イル基のような、強い電子吸引基、特にハロ及び好ましくはフルオロ基で
置換された、Ｃ1-4アルキル、特にＣ2-4アルキル基である。存在し得るアリール
基の例は、フェニル及び置換されたフェニル、特にアルキルフェニル、通常はＣ 1-4 アルキルフェニル及びハロフェニル、通常はクロロフェニル基を包含する。 好ましくは、置換されたフェニル基は４−置換フェニル基である。特に好ましい
Ｈ−ホスホネートは、アンモニウム及びトリエチルアンモニウムｐ−クレシルＨ
−ホスホネートである。利用され得るアクチベータ−は、カップリング剤として
の使用のために本明細書で開示される化合物、及び特にジアリールホスホロクロ
リデート及び、１−アダマンタンカルボニルクロリドのような、アルキル及びシ
クロアルキル酸クロリド、及び好ましくは塩化ピバロイルを包含する。Ｈ−ホス
ホネートの産生は、溶媒、しばしば本発明の第一の側面の方法における使用のた
めに開示される溶媒、好ましくはピリジン、ジクロロメタン及びそれらの混合物
の存在下で好ましくは起こる。
【００７９】 ホスホロチオエートジエステルだけの合成についての本発明の利点は、アンブ
ロック工程の間［特にアンモニア水で加熱している間（例えば、反応式３、工程
ｖｉｉｉ（ａ））］の脱硫を避けるための配慮がなされるならば、本発明のオリ
ゴヌクレオチド・ホスホロチオエートの合成が、一般的なホスホジエステルヌク
レオチド間結合の混入した生成物を導くことはない、ということである。オリゴ
ヌクレオチドホスホロチオエートの固相合成の場合は、各合成サイクルでの不完
全なイオウ転移により通常ホスホジエステル残基が混入する（Ｚｏｎ，Ｇ．；Ｓ
ｔｅｃ，Ｗ．Ｊ．‘Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇ
ｓ．Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ’，Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｆ．編
、ＩＲＬプレス、オックスフォード、１９９１，ｐｐ８７−１０８）。
【００８０】 本発明により提案されるような溶液合成は、固相合成に対して、低温又はごく
低温で実施することによって反応の選択性を制御する可能性が存在するという、
もう１つの大きな利点を有する。この利点は、脱プリン化が検出されないまま０
℃以下で迅速かつ定量的に進行し得る脱トリチル化の工程（反応式３、工程ｉ）
へ拡張する。脱トリチル化工程の後で、かつて「濾過」アプローチ（Ｃｈａｕｄ
ｈｕｒｉ，Ｂ，；Ｒｅｅｓｅ，Ｃ．Ｂ．；Ｗｅｃｌａｗｅｋ，Ｋ．Ｔｅｔｒａｈ
ｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．１９８４，２５，４０３７−４０４０）として記載され
たものによって、比較的迅速かつ効率的な精製が実効化され得る。このことは、
残存する脱トリチル化した荷電モノマーではなく、ホスホトリエステル（及びホ
スホロチオエートトリエステル）中間体が、シリカゲルのショートカラムからＴ
ＨＦ−ピリジン混合物によって非常に速く溶出されるということに依存する。
【００８１】 以下、本発明に記載の方法を、限定することを意図しない以下の実施例を参照
して説明する： 以下の実施例では、ヌクレオシド残基及びヌクレオチド間結合がイタリック体
（アンダーラインを付す）である場合は、それらが何らかのやり方で保護されて
いることを示す。この文脈では、Ａ、Ｃ、Ｇ及びＴは、ベンゾイル基でＮ−６が
保護された２’−デオキシアデノシン、ベンゾイル基でＮ−４が保護された２’
−デオキシシチジン、イソブチル及び２，５−ジクロロフェニル基でＮ−２及び
Ｏ−６が保護された２’−デオキシグアノシン、及び保護されていないチミンを
表す。例えば、反応式３に示されるように、ｐ（ｓ）及びｐ（ｓ’）は、それぞ
れＳ−（２−シアノエチル）及びＳ−（４−クロロフェニル）ホスホロチオエー
トを表し、保護されていないが故にイタリック体ではないｐ（Ｈ）は、配列の末
端に位置しているか又はモノマーに結合していればＨ−ホスホネートモノエステ
ルを表すが、そうでなければ、それはＨ−ホスホネートジエステルを表す。
【００８２】
【実施例】 ジヌクレオシドリン酸塩の製造の反応式 特にジヌクレオシドリン酸塩の製造に関連し、反応式２はオリゴデオキシリボ
ヌクレオチド及びそのホスホロチオエート類似体の製造についての本発明の方法
をより詳細に記載する。
【００８３】
【化８】
【００８４】
【化９】
【００８５】 反応式２ 試薬及び条件： （ｉ） １８，Ｃ5Ｈ5Ｎ，ＣＨ2Ｃｌ2，−４０℃，５−１０分； （ｉｉ） １９，Ｃ5Ｈ5Ｎ，ＣＨ2Ｃｌ2，−４０℃，１５分，ｂ，Ｃ5Ｈ5Ｎ−Ｈ 2 Ｏ（１：１ｖ／ｖ），−４０℃〜室温； （ｉｉｉ） ４Ｍ ＨＣｌ／ジオキサン，ＣＨ2Ｃｌ2，−５０℃，５分； （ｉｖ） Ａｃ2Ｏ，Ｃ5Ｈ5Ｎ，室温，１５時間； （ｖ） ２０，ＴＭＧ，ＭｅＣＮ，室温，１２時間； （ｖｉ） ａ，濃アンモニア水（ｄ０．８８），５０℃，１５時間，ｂ，アンバ ーライトＩＲ−１２０（プラス），Ｎａ+型，Ｈ2Ｏ； （ｖｉｉ） ａ，２１，Ｃ5Ｈ5Ｎ，ＣＨ2Ｃｌ2，−４０℃，１５分，ｂ，Ｃ5Ｈ5 Ｎ−Ｈ2Ｏ（１：１ｖ／ｖ），−４０℃〜室温； （ｖｉｉｉ） ＤＢＵ，Ｍｅ3ＳｉＣｌ，ＣＨ2Ｃｌ2，室温，３０分； （ｉｘ） ２０，ＤＢＵ，ＭｅＣＮ，室温，１２時間。
【００８６】 反応式２では、オリゴヌクレオチドの合成は中間体８、９、１０及び１１を介
して進行し、ホスホロチオエート類似体の製造は中間体８、９、１２及び１３を
介して進行する。塩基１４、１５及び１６は、保護されたアデニン、保護された
シトシン及び保護されたグアニンに対応する。塩基１７は、保護される必要のな
いチミンに対応する。従来から使用されている任意の保護基を使用し得る。ＲＮ
Ａの合成では、チミンはウラシルに置換される。化合物１８は適切なカップリン
グ剤であり、化合物１９及び２１は適切なイオウ転移剤である。これらの化合物
は以下により詳しく言及される。
【００８７】 反応式２に示される本発明によるカップリング方法に求められるモノマーの基
本単位は、トリエチルアンモニウム５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル
）−２’−デオキシリボヌクレオシド３’−Ｈ−ホスホネート８（塩基Ｂ及びＢ
’は１４−１７）であり、これは最近報告された方法（Ｏｚｏｌａ，Ｖ．，Ｒｅ
ｅｓｅ，Ｃ．Ｂ．，Ｓｏｎｇ Ｑ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９
９６，３７，８６２１−８６２４）によって対応する保護されたヌクレオシド誘
導体からほとんど定量的な収率で容易に製造され得る。例示すると、トリエチル
アンモニウム５’−Ｏ−（ジメトキシトリチル）−２’−デオキシリボヌクレオ
シド３’−Ｈ−ホスホネート８は、以下のようにして製造された：４−メチルフ
ェニルＨ−ホスホネートアンモニウム３０（２．８４ｇ，１５．０ｍｍｏｌ）、
５’−Ｏ−（ジメトキシトリチル）−２’−デオキシリボヌクレオシド誘導体（
５．０ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（４．２ｍｌ，３０ｍｍｏｌ）及び乾燥ピ
リジン（２０ｍｌ）を一緒に減圧下で蒸発させた。残基を再び乾燥ピリジン（２
０ｍｌ）とともに共沸させた。残渣を乾燥ピリジン（４０ｍｌ）に溶かし、この
溶液を−３５℃（工業用メチル化酒精／ドライアイス浴）へ冷却した。この溶液
を撹拌しながら、１分間にわたって塩化ピバロイル（１．８５ｍｌ，１５．０ｍ
ｍｏｌ）を滴加し、反応液を−３５℃に維持した。３０分後、水（５ｍｌ）を加
え、この混合液を撹拌しながら室温まで温めた。リン酸化カリウム緩衝液（１．
０ｍｏｌ／ｄｍ-3，ｐＨ７．０，２５０ｍｌ）をこの生成物へ加え、得られた混
合液を減圧濃縮し、ピリジンをすべて除去した。残渣の混合物をジクロロメタン
（２５０ｍｌ）と水（２００ｍｌ）の間で分配した。有機層をリン酸トリエチル
アンモニウム緩衝液（０．５ｍｏｌ／ｄｍ-3，ｐＨ７．０，３ｘ５０ｍｌ）で洗
浄し、乾燥（ＭｇＳＯ4）し、減圧下で蒸発させた。残渣をシリカゲル（２５ｇ ）のショートカラムクロマトグラフィーにより分画した。ジクロロメタン−メタ
ノール（９５：５〜９０：１０ｖ／v）で溶出する適切な分画を蒸発させ、（５ ’−Ｏ−（ジメトキシトリチル）−２’−デオキシリボヌクレオシド３’−Ｈ−
ホスホネート８を得た。
【００８８】 ６−Ｎ−ベンゾイル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−
デオキシアデノシン３’−Ｈ−ホスホネート（ＤＭＴｒ−Ａｐ（Ｈ））トリエチ
ルアンモニウム（Ｏｚｏｌａら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，１９９６）、８（Ｂ
＝１４）、４−Ｎ−ベンゾイル−３’−Ｏ−レブリノイル−２’−デオキシシチ
ジン（ＨＯ−Ｃ−Ｌｅｖ）９（Ｂ’＝１５）及びジ−（２−クロロフェニル）ホ
スホロクロリデート１８をピリジン−ジクロロメタン溶液において−４０℃で一
緒に反応させると、対応する完全に保護されたジヌクレオシドＨ−ホスホネート
（ＤＭＴｒ−Ａｐ（Ｈ）Ｃ−Ｌｅｖ）が、５〜１０分以内に明らかに定量的な収
率で得られた。この特別な例に使用されたプロトコールは、ＤＭＴｒ−Ａｐ（Ｈ
）のトリエチルアンモニウム塩８（Ｂ＝１４）（３．９５ｇ，約４．８ｍｍｏｌ
）及び４−Ｎ−ベンゾイル−３’−Ｏ−レブリノイル−２’−デオキシシチジン
９（Ｂ’＝１５）（１．７２ｇ，４．０ｍｍｏｌ）の撹拌しているピリジン（３
６ｍｌ）乾燥溶液へ、−４０℃（工業用メチル化酒精＋ドライアイス浴）に維持
しながら、ジ−（２−クロロフェニル）ホスホロクロリデート（２．０３ｇ，６
．０ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（４ｍｌ）を５分間かけて１滴ずつ加える
ことであった。さらに５分間の後、ＤＭＴｒ−Ａｐ（Ｈ）Ｃ−Ｌｅｖと推定され
る唯一のヌクレオチド生成物、及び残存するＨ−ホスホネートモノマー８（Ｂ＝
１４）を逆相ＨＰＬＣによって検出することができた。しかしながら、これらの
反応条件が適切に変え得ることを留意すべきである。
【００８９】 このように高いカップリング効率が約２０％過剰のＨ−ホスホネートモノマー
だけで達成されたことは特に注目に値する。中間体のジヌクレオシドＨ−ホスホ
ネート（ＤＭＴｒ−Ａｐ（Ｈ）Ｃ−Ｌｅｖ）を単離する試みはなされなかった。
【００９０】 −４０℃に維持されたこの反応液を撹拌しながら、Ｎ−［（４−クロロフェニ
ル）スルファニル］フタルイミド１９（２．３２ｇ，８．０ｍｍｏｌ）（Ｂｅｈ
ｆｏｒｏｕｚ，Ｍ．；Ｋｅｒｗｏｏｄ，Ｊ．Ｅ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，１９
６９，３４，５１−５５）を滴加した。１５分後、生成物を回収し、シリカゲル
でクロマトグラフ処理し、対応するＳ−（４−クロロフェニル）ジヌクレオシド
ホスホロチオエートＤＭＴｒ−Ａｐ（ｓ’）Ｃ−Ｌｅｖ１０（Ｂ＝１４，Ｂ’＝
１５）が約９９％の単離収率で得られた。従って、カップリング工程もイオウ転
移工程も−４０℃で比較的迅速に及びほとんど定量的に進行した。
【００９１】 ＤＭＴｒ−Ａｐ（ｓ’）Ｃ−Ｌｅｖ１０（Ｂ＝１４，Ｂ’＝１５）のアンブロ
ックのための４工程法（反応式２、工程ｉｉｉ−ｖｉ）は、好ましくは、「脱ト
リチル化」、５’末端ヒドロキシ官能基のアセチル化、オキシメート処理，及び
最終的に濃アンモニア水で処理して塩基残基及び３’−及び５’−末端ヒドロキ
シ官能基からアシル保護基を除去すること、を含む。このようにして、ごく純粋
なｄ［ＡｐＣ］１１（Ｂ＝アデニン−９−イル、Ｂ’＝シトシン−１−イル）を
、それ以上に精製することなく得て、そのナトリウム塩として単離した。モノマ
ー基本単位８（Ｂ＝１７）及び９（Ｂ’＝１６）を同じようにして、同一のスケ
ールで一緒にカップリングさせた。Ｎ−［（４−クロロフェニル）スルファニル
］フタルイミド１９でイオウ転移をした後に、完全に保護されたジヌクレオシド
ホスホロチオエートＤＭＴｒ−Ｔｐ（ｓ’）Ｇ−Ｌｅｖ１０（Ｂ＝１７，Ｂ’＝
１６）を約９８％の収率で単離した。この物質を上記の方法（反応式２、工程ｉ
ｉｉ−ｖｉ）によって脱保護すると、やはり、ごく純粋なｄ［ＴｐＧ］１１（Ｂ
＝チミン−９−イル、Ｂ’＝グアニン−１−イル）が得られた。
【００９２】 完全に保護されたオリゴヌクレオチド・ホスホロチオエートを製造するプロト
コールがオリゴヌクレオチド合成のために使用されるものと異なるのは、４−［
（２−シアノエチル）スルファニル］モルホリン−３，５−ジオン２１又は３−
（フタルイミドスルファニル）プロパノニトリルでイオウ転移がもたらされるこ
とにおいてだけである。しかしながら、４−［（２−シアノエチル）スルファニ
ル］モルホリン−３，５−ジオンは、イオウ転移の経過で産生されるモルホリン
−３，５−ジオンがフタルイミドより水に溶けやすいという利点を有する。トリ
エチルアンモニウム６−Ｏ−（２，５−ジクロロフェニル）−５’−Ｏ−（４，
４’−ジメトキシトリチル）−２−Ｎ−イソブチリル−２’−デオキシグアノシ
ン３’−Ｈ−ホスホネート（ＤＭＴｒ−Ｇｐ（Ｈ））８（Ｂ＝１６）［約４．８
ｍｍｏｌ］、６−Ｎ−ベンゾイル−３’−Ｏ−レブリノイル−２’−デオキシア
デノシン（ＨＯ−Ａ−Ｌｅｖ）９（Ｂ’＝１４）［４．０ｍｍｏｌ］及びジ−（
２−クロロフェニル）ホスホロクロリデート１８［６．０ｍｍｏｌ］をピリジン
−ジクロロメタン溶液において−４０℃で５〜１０分間一緒に反応させた。次い
で反応液を−４０℃に保ちながら、４−［（２−シアノエチル）スルファニル］
モルホリン−３，５−ジオン２１［８．０ｍｍｏｌ］（反応式２、工程ｖｉｉ）
を加えた。１５分後、生成物を回収し、シリカゲルでクロマトグラフ処理し、完
全に保護されたジヌクレオシドホスホロチオエート（ＤＭＴｒ−Ｇｐ（ｓ）Ａ−
Ｌｅｖ１２（Ｂ＝１４，Ｂ’＝１６）が９９％の単離収率で得られた。この物質
を５工程法（反応式２、工程ｉｉｉ，ｉｖ，ｖｉｉｉ，ｘｉ及びｖｉ）によって
アンブロックした。「脱トリチル化」及びアセチル化の工程の後で、生成物を完
全な無水条件で１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エン（Ｄ
ＢＵ）によって処理し、Ｓ−（２−シアノエチル）保護基を除去した。オキシメ
ート処理によりグアニン残基から６−Ｏ−（２，５−ジクロロフェニル）保護基
を除去し、最終的にアシル保護基を全てアンモニア分解によって除去した。オリ
ゴヌクレオチド・ホスホロチオエートが２’−デオキシグアノシン残基を含有し
なければ、オキシメート処理の工程は省略できる。きわめて純粋なｄ［Ｇｐ（ｓ
）Ａ］１３（Ｂ＝グアニン−９−イル、Ｂ’＝アデニン−１−イル）を、さらに
精製することなく得て、そのナトリウム塩として単離した。
【００９３】 ４−［（２−シアノエチル）スルファニル］モルホリン−３，５−ジオンの製
造 Ｓ−（２−シアノエチル）イソチオウロニウムクロリドを以下のように製造し
た。チオ尿素（３０４ｇ）を濃塩酸（５００ｍｌ）に加熱しながら溶かした。得
られた溶液を減圧下で蒸発させ、残った無色の固体を沸騰している無水エタノー
ル（１３００ｍｌ）に溶かした。この溶液を室温まで冷やし、撹拌しながらアク
リロニトリル（４００ｃｍ3）を数回に分けて加えた。反応物を、還流しながら 、２時間加熱した。生成物を冷却してから濾過し、残渣を冷エタノールで洗浄し
た後、塩化カルシウムで真空乾燥した。
【００９４】 次にジ−（２−シアノエチル）ジスルフィドを以下のように製造した。Ｓ−（
２−シアノエチル）イソチオウロニウムクロリド（８３．０ｇ）を水（５００ｍ
ｌ）に溶かした溶液を撹拌しながら、０℃（氷水浴）でジクロロメタン（４００
ｍｌ）を加えた。過ホウ酸テトラヒドレートナトリウム（４４．１ｇ）を加え、
水酸化ナトリウム（３０．０ｇ）の水（２５０ｍｌ）溶液を１滴ずつ加えた。反
応物は０℃に保った（氷水浴）。５時間後、生成物を分離し、ジクロロメタン（
３ｘ５０ｍｌ）で水層を抽出した。有機層を集めて乾燥（ＭｇＳＯ4）させ、減 圧下で蒸発させて固形物を得て、これをメタノール（３０ｍｌ）から再結晶させ
、無色の結晶を得た。
【００９５】 ジ−（２−シアノエチル）ジスルフィド（４．５１ｇ）及びモルホリン−２，
６−ジオン（５．７５ｇ）をアセトニトリル（１０ｍｌ）、ジクロロメタン（２
０ｍｌ）及び２，６−ルチジン（１７．４ｍｌ）に懸濁し、０℃（氷水浴）へ冷
やした。臭素（４．２８ｇ）のジクロロメタン（２０ｍｌ）溶液を３０分かけて
加えた。この反応混合物を０℃で１．５時間撹拌した。氷冷メタノール（５０ｍ
ｌ）を３０分かけて加えることにより生成物を沈殿させ、濾過して表題化合物（
８．２３ｇ，８２％）を得た。酢酸エチルからの再結晶により無色の針状結晶と
して４−［（２−シアノエチル）スルファニル］モルホリン−３，５−ジオン、
ｍ．ｐ．１２１−１２２℃、を得た。
【００９６】 キメラオリゴヌクレオチド製造の反応式 １つのホスホロチオエートジエステル及び２つのホスホジエステルヌクレオチ
ド間結合を有するｄ［ＴｐＧｐ（ｓ）ＡｐＣ］２５の段階合成を、反応式３の例
により概説する。
【００９７】
【化１０】
【００９８】 反応式３ 試薬及び条件： （ｉ） ４Ｍ ＨＣｌ／ジオキサン，ＣＨ2Ｃｌ2，−５０℃，５分； （ｉｉ） １８，Ｃ5Ｈ5Ｎ，ＣＨ2Ｃｌ2，−４０℃，５−１０分； （ｉｉｉ） ａ，２１，Ｃ5Ｈ5Ｎ，ＣＨ2Ｃｌ2，−４０℃，１５分，ｂ，Ｃ5Ｈ5 Ｎ−Ｈ2Ｏ（１：１ｖ／ｖ），−４０℃〜室温； （ｉｖ） ａ，１９，Ｃ5Ｈ5Ｎ，ＣＨ2Ｃｌ2，−４０℃，１５分，ｂ，Ｃ5Ｈ5Ｎ −Ｈ2Ｏ（１：１ｖ／ｖ），−４０℃〜室温； （ｖ） Ａｃ2Ｏ，Ｃ5Ｈ5Ｎ，室温，１５時間； （ｖｉ） ＤＢＵ，Ｍｅ3ＳｉＣｌ，ＣＨ2Ｃｌ2，室温，３０分； （ｖｉｉ） ２０，ＤＢＵ，ＭｅＣＮ，室温，１２時間； （ｖｉｉｉ） ａ，濃アンモニア水（ｄ０．８８），５０℃，１５時間，ｂ，ア ンバーライトＩＲ−１２０（プラス），Ｎａ+型、Ｈ2Ｏ。
【００９９】 スケールの制限は無い。反応式３に示される反応は限定することを意図するも
のではなく、本発明の方法は、ＲＮＡ、２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡ及び他のオ
リゴヌクレオチド配列に等しく適している。
【０１００】 上記に含まれる反応は全てｄ［ＡｐＣ］１１（Ｂ＝アデニン−９−イル，Ｂ’
＝シトシン−１−イル）又はｄ［Ｇｐ（ｓ）Ａ］１３（Ｂ＝グアニン−９−イル
，Ｂ’＝アデニン−１−イル）のいずれかに使用された（反応式２）。
【０１０１】 まず、完全に保護されたジヌクレオシドホスホロチオエートＤＭＴｒ−Ａｐ（
ｓ’）Ｃ−Ｌｅｖ１０（Ｂ＝１４，Ｂ’＝１５）［約０．７５ｍｍｏｌ］を４工
程及び約９６％の全単離収率で部分保護トリマー２３へ変換した（反応式３ａ）
。各カップリング工程では、約２０％過剰のＨ−ホスホネートモノマー８が使用
されたが、カップリング剤１８の過剰量は反応スケールに依存した。さらに、こ
の実施例では、２倍過剰のイオウ転移剤１９又は２１が使用された。各「脱トリ
チル化」工程の後で、生成物をシリカゲルでクロマトグラフ処理した。
【０１０２】 次いでこの物質をＤＭＴｒ−Ｔｐ（Ｈ）８（Ｂ＝１７）とカップルさせ、この
生成物を３工程及び約９３％の全単離収率で完全保護テトラマー２４へ変換した
（反応式３ｂ）。後者の物質をアンブロックしてｄ［ＴｐＧｐ（ｓ）ＡｐＣ］２
５を得て、これをさらに精製することなくその比較的純粋な（約９６．５％、Ｈ
ＰＬＣによる）ナトリウム塩として単離した。
【０１０３】 テトラヌクレオシド三リン酸ｄ［ＴｐＧｐＡｐＣ］及びテトラヌクレオシドト
リホスホロチオエートｄ［Ｃｐ（ｓ）Ｔｐ（ｓ）Ｇｐ（ｓ）Ａ］もほとんど同一
の方法の段階合成により製造した。以下のプロトコールが反応式３で概説された
ものと異なるのは、ｄ［ＴｐＧｐＡｐＣ］の製造でイオウ転移剤１９が専ら使用
され、ｄ［Ｃｐ（ｓ）Ｔｐ（ｓ）Ｇｐ（ｓ）Ａ］の製造でイオウ転移剤２１が専
ら使用されたことだけである。
【０１０４】 ブロックカップリングの反応式 説明のために、以下に示す反応式４は、本発明の一部であるブロックカップリ
ングの例を示す。
【０１０５】
【化１１】
【０１０６】 反応式４ 試薬及び条件： （ｉ） Ｎ2Ｈ4Ｈ2Ｏ，Ｃ5Ｈ5Ｎ−ＡｃＯＨ（３：１ｖ／ｖ），０℃，２０分； （ｉｉ） ａ，３０，Ｍｅ3Ｃ−ＣＯＣｌ，Ｃ5Ｈ5Ｎ，−３５℃，３０分，ｂ， Ｅｔ3Ｎ，Ｈ2Ｏ； （ｉｉｉ） １８，Ｃ5Ｈ5Ｎ，ＣＨ2Ｃｌ2，−３５℃，； （ｉｖ） ａ，２１，Ｃ5Ｈ5Ｎ，ＣＨ2Ｃｌ2，−３５℃，１０分，ｂ，Ｃ5Ｈ5Ｎ −Ｈ2Ｏ（１：１ｖ／ｖ），−３５℃〜室温。
【０１０７】 ９１％の単離収率で得られた、完全に保護されたオクタデオキシヌクレオシド
へプタホスホロチオエート２９は、ｄ［Ｔｐ（ｓ）Ｔｐ（ｓ）Ｇｐ（ｓ）Ｇｐ（
ｓ）Ｇｐ（ｓ）Ｇｐ（ｓ）Ｔｐ（ｓ）Ｔ］の前駆体である。上記のように、ブロ
ックカップリングは固相合成より溶液合成のほうがずっと容易である。
【０１０８】 このアプローチは、勿論テトラマーカップリングに限定されない。実際、この
Ｈ−ホスホネートアプローチは、ごく大きいオリゴヌクレオチドブロック同士の
カップリング（例えば、１０＋１０）に適していると期待されている。
【０１０９】 ブロックＨ−ホスホネート製造の反応式 例えば、従来の溶液内のホスホトリエステルアプローチ（Ｃｈａｔｔｏｐａｄ
ｈｙａｙａ，Ｊ．Ｂ．；Ｒｅｅｓｅ，Ｃ．Ｂ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒ
ｅｓ．，１９８０，８，２０３９−２０５４；Ｋｅｍａｌ，Ｏ．，Ｒｅｅｓｅ，
Ｃ．Ｂ．；Ｓｅｒａｆｉｎｏｗｓｋａ，Ｈ．Ｔ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｃｈ
ｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１９８３，５９１−５９３）によって製造し得る、部分
保護オリゴヌクレオチド３３ａ及び対応のホスホロチオエート３３ｂを、反応式
５に示されるようにしてその３’−Ｈ−ホスホネート（それぞれ、３４ａ及び３
４ｂ）へ同様に変換し得る。
【０１１０】
【化１２】
【０１１１】 反応式５ 試薬及び条件： （ｉ） ａ，３０，Ｍｅ3Ｃ．ＣＯＣｌ，Ｃ5Ｈ5Ｎ，−３５℃，ｂ，Ｅｔ3Ｎ，Ｈ 2 Ｏ。 実施例１ Ａｃ−Ｔｐ（ｓ）Ｔｐ（ｓ）Ｇｐ（ｓ）Ｇ−ＯＨ ＨＯ−Ｔｐ（ｓ）Ｔｐ（ｓ）Ｇｐ（ｓ）Ｇ−Ｌｅｖ（５．８２ｇ，３ｍｍｏｌ
）を無水ピリジン（２ｘ２０ｍｌ）と共沸させ、無水ピリジン（３０ｍｌ）に再
び溶かした。無水酢酸（１．４２ｍｌ，１５ｍｍｏｌ）を加え、この反応溶液を
室温で１２時間撹拌した。水（１．５ｍｌ）を加えて反応を停止した。１０分後
、混合液を０℃（氷水浴）に冷やし、ヒドラジン水和物（１．５０ｇ，３０ｍｍ
ｏｌ）のピリジン（１５ｍｌ）・氷酢酸（１５ｍｌ）溶液を加えた。この混合物
を０℃で２０分撹拌し、次いで水（１００ｍｌ）とＣＨ2Ｃｌ2（１００ｍｌ）の
間で分配した。２つの層を分離し、有機層を水（３ｘ５０ｍｌ）で洗浄した。こ
の有機層を乾燥（ＭｇＳＯ4）させ、蒸発させた。残渣をシリカゲルクロマトグ ラフィーによって精製した。不純物はメタノール−ジクロロメタン（４：９６ｖ
／ｖ）で溶出し、主生成物はアセトンで溶出した。適切な分画を蒸発させ、部分
的に保護されたテトラデオキシヌクレオシド・トリホスホロチオエートを無色の
固形物として得た（５．３０ｇ，９３％）。 実施例２ Ａｃ−Ｔｐ（ｓ）Ｔｐ（ｓ）Ｇｐ（ｓ）Ｇｐ（Ｈ） ４−メチルフェニルＨ−ホスホネートのアンモニウム塩（１．４２ｇ，７．５
ｍｍｏｌ）をメタノール（１５ｍｌ）及びトリエチルアミン（２．１ｍｌ，１５
ｍｍｏｌ）の混合液に溶かした。減圧下でこの混合物を蒸発させ、ピリジン（２
ｘ１０ｍｌ）とともに共沸させた。Ａｃ−Ｔｐ（ｓ）Ｔｐ（ｓ）Ｇｐ（ｓ）Ｇ−
ＯＨ（４．７１ｇ，２．５ｍｍｏｌ）を加え、乾燥ピリジン（２０ｍｌ）と共沸
させた。残渣を乾燥ピリジン（２０ｍｌ）に溶かし、塩化ピバロイル（１．２３
ｍｌ，１０ｍｍｏｌ）を−３５℃において１分間で加えた。同一温度で３０分経
過した後、水（５ｍｌ）を加えてから混合物を室温まで温め、１時間撹拌した。
この溶液を水（１００ｍｌ）とジクロロメタン（１００ｍｌ）の間で分配した。
有機層を分離し、リン酸トリエチルアンモニウム緩衝液（ｐＨ７．０，０．５Ｍ
，３ｘ５０ｍｌ）で洗浄し、乾燥（ＭｇＳＯ4）させ、濾過した後、シリカゲル カラム（約２５ｇ）にかけた。メタノール−ジクロロメタン（２０：８０，ｖ／
ｖ）で溶出した適切な分画を蒸発させ、Ａｃ−Ｔｐ（ｓ）Ｔｐ（ｓ）Ｇｐ（ｓ）
Ｇｐ（Ｈ）を無色の固形物として得た（４．８５ｇ，９４％）。 実施例３ Ａｃ−Ｔｐ（ｓ）Ｔｐ（ｓ）Ｇｐ（ｓ）Ｇｐ（ｓ）Ｇｐ（ｓ）Ｇｐ（ｓ）Ｔｐ（
ｓ）Ｔ−Ｂｚ Ａｃ−Ｔｐ（ｓ）Ｔｐ（ｓ）Ｇｐ（ｓ）Ｇｐ（Ｈ）（１．２２９ｇ，０．６ｍ
ｍｏｌ）及びＨＯ−Ｇｐ（ｓ）Ｇｐ（ｓ）Ｔｐ（ｓ）Ｔ−Ｂｚ（０．９７３ｇ，
０．５ｍｍｏｌ）を無水ピリジン（２ｘ１０ｍｌ）と共沸させ、残渣を無水ピリ
ジン（１０ｍｌ）に溶かした。この溶液を−３５℃（工業用メチル化酒精−ドラ
イアイス浴）へ冷却し、ジ−（２−クロロフェニル）ホスホロクロリデート（０
．８４ｇ，２．５ｍｍｏｌ）の乾燥ジクロロメタン溶液（１ｍｌ）を１０分かけ
て加えた。４−［（２−シアノエチル）スルファニル］モルホリン−３，５−ジ
オン（０．２０ｇ，１．０ｍｍｏｌ）を加え、この混合物を同一温度で１０分間
撹拌した。次いで水−ピリジン（０．２ｍｌ，１：１ｖ／ｖ）を加え、混合液を
さらに５分間撹拌した。次いでこの反応混合液を減圧下で蒸発させた。残渣をジ
クロロメタン（１００ｍｌ）に溶かし、この溶液を重炭酸ナトリウムの飽和水溶
液で洗浄（３ｘ５０ｍｌ）した。有機層を乾燥（ＭｇＳＯ4）させ、減圧下で濃 縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィーにより精製した。まず、親油性の
不純物がメタノール−ジクロロメタン（４：９６ｖ／ｖ）で除去され、次いで主
生成物をアセトンで溶出した。適切な分画を蒸発させ、完全に保護されたオクタ
デオキシヌクレオシド・へプタホスホロチオエートを無色の固形物として得た（
１．８１ｇ，９１％）。９１％の単離収率で得られたこの完全保護オクタデオキ
シヌクレオシド・へプタホスホロチオエートはｄ［Ｔｐ（ｓ）Ｔｐ（ｓ）Ｇｐ（
ｓ）Ｇｐ（ｓ）Ｇｐ（ｓ）Ｇｐ（ｓ）Ｔｐ（ｓ）Ｔ］の前駆体である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ， ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，Ｌ Ｖ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ， ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，Ｕ Ｓ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ Ｆターム(参考） 4B063 QR32 QR35 QS02 4C057 AA20 BB02 DD01 MM05 4H050 AA02 AC40 WA12 WA13 WA14 WA28

Claims (13)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 カップリング剤の存在下でＨ−ホスホネートをアルコールと
    溶液相カップリングさせることによりＨ−ホスホネートジエステルを形成させ、
    このＨ−ホスホネートジエステルをイオウ転移剤とｉｎ ｓｉｔｕで反応させ、
    ホスホロチオエートトリエステルを産生することを含む、ホスホロチオエートト
    リエステルの製造方法。
  2. 【請求項２】 Ｈ−ホスホネートが、３’−Ｈ−ホスホネート官能基を含ん
    でなる保護されたヌクレオシド又はオリゴヌクレオチドである、請求項１に記載
    の方法。
  3. 【請求項３】 アルコールが、フリーの５’−ヒドロキシ官能基を含んでな
    る保護されたヌクレオシド又はオリゴヌクレオチドである、請求項１及び請求項
    ２のいずれかに記載の方法。
  4. 【請求項４】 カップリング剤が（ＡｒＯ）2ＰＯＣｌなる式のジアリール ホスホロクロリデート（ここで、Ａｒはフェニル、２−クロロフェニル、２，４
    ，６−トリクロロフェニル又は２，４，６−トリブロモフェニルである）である
    、請求項１〜３に記載の方法。
  5. 【請求項５】 イオウ転移剤が以下の一般化学式を有し： Ｌ----Ｓ----Ａ ここで、Ｌが脱離基を表し、Ａがアリール基、メチル基、置換されたアルキル基
    又はアルケニル基を表す、請求項１〜４に記載の方法。
  6. 【請求項６】 脱離基がモルホリン−３、５−ジオン、フタルイミド、スク
    シンイミド、マレイン酸イミド又はインダゾールであり、Ａが４−ハロフェニル
    基、４−アルキルフェニル基、メチル基、ベンジル基、アルキルベンジル基、ハ
    ロベンジル基、アリル基、クロチル基、２−シアノエチル基又は２−（４−ニト
    ロフェニル）エチル基を表す、請求項５に記載の方法。
  7. 【請求項７】 Ｈ−ホスホネート及びアルコールが、リボヌクレオシド、２
    −Ｏ’−（アルキル、アルコキシアルキル又はアルケニル）−リボヌクレオシド
    、オリゴリボヌクレオチド又は２−Ｏ’−（アルキル、アルコキシアルキル又は
    アルケニル）−オリゴリボヌクレオチドである、請求項１〜６のいずれかに記載
    の方法。
  8. 【請求項８】 以下の一般的化学式を有するＨ−ホスホネート。 【化１】 ここで、 各Ｂは、Ａ、Ｇ、Ｔ、Ｃ又はＵから独立して選択される塩基であり； 各Ｑは独立してＨ又はＯＲ’であって、Ｒ’はアルキル、置換されたアルキル
    、アルケニル又は保護基であり； 各Ｒは独立してアリール、メチル、置換されたアルキル又はアルケニル基であ
    り； Ｗは、Ｈ、保護基又は以下の式のＨ−ホスホネート基であり、 【化２】 ここでＭ+は１価カチオンであり； 各Ｘは独立してＯ又はＳを表し； 各Ｙは独立してＯ又はＳを表し； ＺはＨ、保護基又は以下の式のＨ−ホスホネート基であり、 【化３】 ここでＭ+は１価カチオンであり；及び ｎは正の整数であるが； ただし、ＷがＨ又は保護基であるときはＺがＨ−ホスホネート基であり、ＺがＨ
    又は保護基であるときはＷがＨ−ホスホネート基である。
  9. 【請求項９】 Ｗが保護基を表し、各ＸがＯを表し、各ＹがＳを表し、各Ｒ
    がメチル基、ベンジル基、２−シアノエチル基、置換されていないフェニル基又
    は４−ハロフェニル基を表し、Ｍ+がトリ（Ｃ1-4アルキルアンモニウム）イオン
    を表し、ｎが１〜１６である、請求項８に記載のＨ−ホスホネート。
  10. 【請求項１０】 フリーのヒドロキシ官能基、好ましくは３’又は５’ヒド
    ロキシ官能基を含んでなるオリゴヌクレオチドをアクチベーターの存在下でアル
    キル又はアリールＨ−ホスホネート塩と反応させる、オリゴヌクレオチドＨ−ホ
    スホネートの製造方法。
  11. 【請求項１１】 オリゴヌクレオチドが保護されたオリゴデオキシリボヌク
    レオチド又はオリゴリボヌクレオチドである、請求項１０に記載の方法。
  12. 【請求項１２】 Ｈ−ホスホネート塩が、フェニル、アルキルフェニル又は
    ハロフェニルＨ−ホスホネートのアンモニウム塩である、請求項１０又は１１に
    記載の方法。
  13. 【請求項１３】 アクチベータ−が、アリールホスホロクロリデート又はア
    ルキル酸クロリド、好ましくは塩化ピバロイルである、請求項１０〜１２のいず
    れかに記載の方法。
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