ES2197491T3 - Sintesis en fase de solucion de oligonucleotidos. - Google Patents

Abstract

Procedimiento que sirve para efectuar la síntesis en una fase de solución de un triéster de fosforotioato. Este procedimiento consiste en acoplar la fase de solución de un H-fosfonato con un alcohol en presencia de un agente de acoplamiento para obtener un diéster de H-fosfonato. Se oxida este diéster de H-fosfonato in situ por un agente de transferencia de azufre, de manera a obtener el triéster de fosforotioato. El H-fosfonato y el alcanol son, preferentemente, nucleósidos u oligonucleótidos protegidos. La invención se refiere también a H-fosfonatos de oligonucleótidos que se pueden utilizar para producir triésteres de fosforotioato.

Description

Síntesis en fase de solución de oligonucleótidos.

El presente invento proporciona un método de sintetizar en solución oligonucleótidos y fosforotioatos de oligonucleótidos, basado en un acoplamiento con un H-fosfonato y una transferencia de azufre in situ, que se lleva a cabo a una baja temperatura. El invento proporciona además un procedimiento para la síntesis escalonada de oligonucleótidos y fosforotioatos de oligonucleótidos, en el que un residuo de nucleósido se añade de una sola vez, y la síntesis en bloque de oligonucleótidos y fosforotioatos de oligonucleótidos, en que dos o más residuos de nucleótidos se añaden de una sola vez.

En los últimos 15 años aproximadamente, se han hecho enormes progresos en el desarrollo de la síntesis de oligo-desoxirribonucleótidos (secuencias de ADN), oligorribonucleótidos (secuencias de ARN) y sus compuestos análogos, véase ``Methods in Molecular Biology [Métodos en biología molecular], volumen 20, Protocol for Oligonucleotides and Analogs [Protocolo para nucleótidos y compuestos análogos]'', Agrawal, S. coordinador de edición, Humana Press, Totowa, 1993. Gran parte del trabajo se ha llevado a cabo a una escala micromolar o incluso menor, y la síntesis automática en fase sólida que implica bloques de construcción de fosforamiditos monómeros, véase Beaucage, S.L.; Caruthers, M.H. Tetrahedron Lett., 1981, 22, 1859-1862, ha probado ser el enfoque más conveniente. Desde luego, ahora se pueden preparar rutinariamente secuencias de ADN de peso molecular alto y de ARN de peso molecular relativamente alto con equipos sintetizadores comercialmente disponibles. Estos oligonucleótidos sintéticos han satisfecho un cierto número de necesidades cruciales en biología y biotecnología.

Siguiendo el descubrimiento seminal de Zamecnik y Stephenson de que un oligonucleótido sintético podría inhibir selectivamente la expresión de un gen en el virus del sarcoma de Rous (Zamecnik, P.; Stephenson, M. Proc. Natl. Acad. Sci USA 1978, 75, 280-284), la idea de que ciertos oligonucleótidos sintéticos o sus compuestos análogos pueden encontrar perfectamente aplicación en la quimioterapia, ha atraído mucha atención en laboratorios tanto académicos como industriales. Por ejemplo, en el informe de Gura, T. Science, 1995, 270, 575-577, se ha resaltado el posible uso de oligonucleótidos y sus compuestos análogos fosforotioatos en la quimioterapia. Los denominados enfoques de anti-sentido y antígenos en la quimioterapia (Oligonucleotides, Antisense Inhibitors of Gene Expression [Oligonucleótidos, inhibidores anti-sentido de la expresión de genes], Cohen, J.S., coordinadores de edición, Macmillan, Basingstoke 1989 Moser, H.E.; Dervan, P.B. Science 1987, 238, 645-649), han afectado profundamente a los requisitos establecidos para los oligonucleótidos sintéticos. Mientras que unas cantidades del orden de 1 miligramo han sido generalmente suficientes para finalidades de biología molecular, para las pruebas clínicas se requieren cantidades de desde 1 gramo hasta más de 100 gramos. Varios compuestos análogos a oligonucleótidos, que son potenciales fármacos anti-sentido, se encuentran ahora en la fase de pruebas clínicas avanzadas. Sí, como parece probable en un futuro muy próximo, alguna de estas secuencias resultase aprobada, por ejemplo para el tratamiento del SIDA o de una forma del cáncer, se requerirán cantidades del orden de 1 kilogramo o más probablemente de múltiples kilogramos de una o varias secuencia(s) específica(s).

En los pocos últimos años, se ha llevado a cabo mucho trabajo para aumentar la escala de la síntesis de oligonucleótidos. Virtualmente todo este trabajo ha implicado construir equipos sintetizadores cada vez mayores y la misma ciencia química de los fosforamiditos sobre un soporte sólido. El solicitante desconoce cualquier reciente mejora en la metodología del enfoque de los fosfotriésteres a la síntesis de oligonucleótidos en solución, que lo haga más apropiado para el trabajo de síntesis a una escala grande e incluso moderada que una síntesis en fase sólida.

Las ventajas principales que la síntesis en fase sólida tiene sobre la síntesis en solución son (i) que ésta es mucho más rápida, (ii) que los rendimientos de acoplamiento son generalmente mayores, (iii) que es automatizada fácilmente y (iv) que es completamente flexible con respecto a una secuencia. Así, la síntesis en fase sólida es particularmente útil si se requieren cantidades relativamente pequeñas de un gran número de secuencias de oligonucleótidos, por ejemplo, para propósitos combinatorios. Sin embargo, si se ha identificado una secuencia particular de tamaño moderado y se ha aprobado como un fármaco, y se requieren cantidades del orden de un kilogramo, la velocidad y la flexibilidad resultan carecer relativamente de importancia, y es probable que la síntesis en solución sea altamente ventajosa. La síntesis en solución tiene también la ventaja, con respecto a la síntesis en fase sólida, de que es más factible el acoplamiento en bloque (es decir la adición de dos o más residuos de una sola vez) y es improbable que el aumento de escala a cualquier nivel plantee un problema. Es mucho más fácil y ciertamente mucho más barato aumentar el tamaño de un recipiente de reacción que producir equipos sintetizadores automáticos cada vez mayores.

En el pasado, la síntesis de oligonucleótidos en solución se ha llevado a cabo principalmente por el convencional enfoque de los fosfotriésteres, que fue desarrollado en la década de los 1970 (Reese, C.B., Tetrahedron 1978, 34, 3143-3179; Kaplan, B.E.; Itakura, K. en ``Synthesis and Applications of DNA and RNA'' [Síntesis y aplicaciones de los ADN y ARN], Narang, S.A., coordinador de edición, Academic Press, Orlando, 1987, páginas 9-45). Este enfoque se puede usar también en una síntesis en fase sólida, pero las reacciones de acoplamiento son algo más rápidas y los rendimientos de acoplamiento son algo mayores cuando se usan monómeros fosforamiditos. Ésta es la razón de porque una síntesis en fase sólida automática ha estado basada ampliamente en el uso de bloques de construcción a base de fosforamiditos; también ésta es probablemente la razón de porqué los profesionales que requieren cantidades relativamente grandes de oligonucleótidos sintéticos han decidido intentar el aumento de escala de una síntesis en fase sólida basada en fosforamiditos.

Tres métodos principales, a saber los enfoques de los fosfotriésteres (Reese, Tetrahedron, 1978), de los fosforamiditos (Beaucage, S.L. en Methods in Molecular Biology [Métodos en biología molecular], volumen 20, Agrawal, S., coordinador de edición, Humana Press, Totowa, 1993, páginas 33-61) y de los H-fosfonatos (Froehler, B.C. en Methods in Molecular Biology, volumen 20, Agrawal, S., coordinador de edición, Humana Press, Totowa, 1993, páginas 63-80; véanse también el documento de solicitud de patente internacional WO 94/15946 y la cita de Dreef, C.E. en Rec. Trav. Chim. Pays-Bas, 1987, 106, página 512) han probado ser eficaces para la síntesis química de oligonucleótidos. Mientras que el enfoque de los fosfotriésteres se ha usado con la mayor amplitud para la síntesis en solución, los enfoques de los fosforamiditos y los H-fosfonatos han sido usados casi exclusivamente en las síntesis en fase sólida.

Se han aplicado dos distintas estrategias de síntesis al enfoque de los fosfotriésteres en solución.

Posiblemente la estrategia más ampliamente usada para la síntesis de oligodesoxirribonucleótidos en solución implica una reacción de acoplamiento entre un 3'-(2-cloro-fenil)-fosfato de nucleósido o de oligonucleótido protegido (Chattopadhyaya, J.B.; Reese, C.B. Nucleic Acids Res., 1980, 8, 2039-2054) y un nucleósido u oligonucleótido protegido con una función de 5'-hidroxi libre para dar un fosfotriéster. Se requiere un agente de acoplamiento, tal como el 1- (mesitilen-2-sulfonil)-3-nitro-1,2,4-1H-triazol (MSNT) (Reese, C.B.; Titmas, R.C.; Yau, L. Tetrahedron Lett., 1978, 2727-2730). Esta estrategia se ha usado también en la síntesis de compuestos análogos fosforotioatos. El acoplamiento se efectúa luego de la misma manera entre un 3'-S-(2-ciano-etil o, por ejemplo, 4-nitro-bencil)- fosforotioato de nucleósido u oligonucleótido protegido (Liu, X.; Reese, C.B. J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1, 1995, 1685-1695) y un nucleósido u oligonucleótido protegido con una función de 5'-hidroxi libre. Las desventajas principales de este convencional enfoque de los fosfotriésteres son las de que se realiza alguna sulfonación concomitante en 5' del segundo componente (Reese, C.B.; Zhang, P.-Z. J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1, 1995, 2291-2301) y de que las reacciones de acoplamiento se desarrollan generalmente con relativa lentitud. La reacción colateral de sulfonación conduce tanto a menores rendimientos como impide la purificación de los productos deseados.

La segunda estrategia para la síntesis de oligodesoxirribonucleótidos en solución implica el uso de un reactivo bifuncional derivado de un fosforodicloridato de arilo (usualmente 2-cloro-fenilo) y de dos equivalentes moleculares de un aditivo tal como 1-hidroxi-benzotriazol (van der Marel, y colaboradores, Tetrahedron Lett., 1981, 22, 3887-3890). Un reactivo bifuncional relacionado, derivado del fosforodicloridotioato de 2,5-dicloro-fenilo (Esquema 1b) se ha usado similarmente (Kemal, O y colaboradores, J. Chem. Soc., Chem. Commun., 1983, 591-593) en la preparación de fosforotioatos de oligonucleótidos.

Las desventajas principales de la segunda estrategia resultan directamente de la implicación de un reactivo bifuncional. Por lo tanto, existe la posibilidad de que se formen productos de acoplamiento simétricos, y la presencia de pequeñas cantidades de humedad puede conducir a una disminución importante en los rendimientos de acoplamiento.

Un objetivo de ciertos aspectos del presente invento es proporcionar un nuevo procedimiento de acoplamiento para la síntesis de oligonucleótidos en solución, que en muchas realizaciones (a) es extremadamente eficiente y no conduce a reacciones colaterales, (b) se desarrolla con relativa rapidez, y (c) es igualmente apropiado para la preparación de oligonucleótidos, de sus compuestos análogos fosforotioatos y de oligonucleótidos quiméricos que contienen enlaces internucleótidos tanto de fosfodiésteres como de diésteres de fosforotioatos.

De acuerdo con un primer aspecto del presente invento, se proporciona un procedimiento para la preparación de un triéster de fosforotioato, que comprende acoplar en fase de solución un H-fosfonato con un alcohol en la presencia de un agente de acoplamiento para formar de esta manera un diéster de H-fosfonato, y hacer reaccionar, in situ, el diéster de H-fosfonato con un agente de transferencia de azufre para producir un triéster de fosforotioato.

El H-fosfonato empleado en el procedimiento del presente invento es ventajosamente un H-fosfonato de nucleósido u oligonucleótido protegido, que comprende preferiblemente una función de 5' ó 3' H-fosfonato, de modo particularmente preferible una función de 3' H-fosfonato. Los nucleósidos preferidos son 2'-desoxirribonucleósidos y ribonucleósidos; los oligonucleótidos preferidos son oligodesoxirribonucleótidos y oligorribonucleótidos.

Cuando el bloque de construcción de H-fosfonato es un derivado de desoxirribonucleósido, ribonucleósido, oligodesoxirribonucleótido u oligorribonucleótido protegido que comprende una función de 3' H-fosfonato, la función 5'-hidroxi es protegida ventajosamente por un apropiado grupo protector. Ejemplos de dichos apropiados grupos protectores incluyen grupos protectores inestables frente a los ácidos, particularmente grupos tritilo y tritilo sustituidos, tales como grupos dimetoxi-tritilo y 9-fenil-xanten-9-ilo; y grupos protectores inestables frente a las bases, tales como FMOC.

Cuando el bloque de construcción de H-fosfonato es un derivado de desoxirribonucleósido, ribonucleósido, oligodesoxirribonucleótido u oligorribonucleótido protegido, que comprende una función de 5' H-fosfonato, la función 3'-hidroxi es protegida ventajosamente por un apropiado grupo protector. Apropiados grupos protectores incluyen los antes descritos para la protección de las funciones hidroxi en 5' de bloques de construcción de 3' H-fosfonatos y grupos acilo, tales como levulinoílo y levulinoílo sustituidos.

Cuando el H-fosfonato es un ribonucleósido protegido o un oligorribonucleótido protegido, la función de 2'-hidroxi es protegida ventajosamente por un apropiado grupo protector, por ejemplo un grupo protector acetal inestable frente a los ácidos, particularmente 1-(2-fluoro-fenil)-4-metoxi-piperidin-4-ilo (Fpmp); y grupos trialquil-sililo, con frecuencia grupos tri(alquil C_{1-4})sililo tales como un grupo butil terciario-dimetil-sililo. Alternativamente, el ribonucleósido u oligorribonucleótido puede ser un derivado de 2'-O-alquilo, 2'-O-alcoxialquilo o 2'-O-alquenilo, corrientemente un derivado de alquilo C_{1-4}, alcoxi C_{1- 4}-alquilo C_{1-4} o alquenilo, en cuyo caso la posición 2' no necesita una protección adicional.

Otros H-fosfonatos que se pueden emplear en el procedimiento de acuerdo con el presente invento se derivan de otros alcoholes polifuncionales, especialmente alcoholes alquílicos, y preferiblemente dioles o trioles. Ejemplos de alquil- dioles incluyen etano-1,2-diol, y poli(etilen glicoles) de bajo peso molecular, tales como los que tienen un peso molecular de hasta 400. Ejemplos de alquil-trioles incluyen glicerol y butano-trioles. Corrientemente estará presente solamente una única función de H-fosfonato, siendo protegidos los remanentes grupos hidroxi por apropiados grupos protectores, tales como los descritos aquí anteriormente para la protección en las posiciones 5' ó 2' de ribonucleósidos.

El alcohol empleado en el procedimiento del presente invento es corrientemente un nucleósido u oligonucleótido protegido, que comprende un grupo hidroxi libre, preferiblemente un grupo 3'- o 5'-hidroxi libre de modo particularmente preferible un grupo 5'-hidroxi.

Cuando el alcohol es un nucleósido protegido o un oligonucleótido protegido, los nucleósidos preferidos son desoxirribonucleósidos y ribonucleósidos, y los oligonucleótidos preferidos son oligodesoxirribonucleótidos y oligorribonucleótidos.

Cuando el alcohol es un derivado de desoxirribonucleósido, ribonucleósido, oligodesoxirribonucleótido u oligorribonucleótido, que comprende un grupo 5'- hidroxi libre, la función de 3'-hidroxi es protegida ventajosamente por un apropiado grupo protector. Ejemplos de dichos grupos protectores incluyen grupos acilo, que corrientemente comprenden hasta 16 átomos de carbono, tales como los que se derivan de gamma ceto ácidos, tales como grupos levulinoílo y grupos levulinoílo sustituidos. Los grupos levulinoílo sustituidos incluyen particularmente 5-halo- levulinoílo, tales como grupos 5,5,5-trifluoro-levulinoílo y benzoíl-propionilo. Otros grupos protectores de este tipo incluyen grupos alcanoílo grasos, que incluyen particularmente grupos alcanoílo C_{6-16} lineales o ramificados, tales como grupos lauroílo; grupos benzoílo y benzoílo sustituidos, tales como grupos benzoílo sustituidos con alquilo, corrientemente alquilo C_{1-4} y con halo, corrientemente con cloro o fluoro; y silil éteres, tales como alquil-, corrientemente alquil C_{1-4}-, y aril-, corrientemente fenil-silil-éteres, particularmente grupos butil terciario- dimetil-sililo y butil terciario-difenil-sililo.

Cuando el alcohol es un desoxirribonucleósido, ribonucleósido, oligodesoxirribonucleótido u oligorribonucleótido protegido, que comprende un grupo 3'-hidroxi libre, la función de 5'-hidroxi es protegida ventajosamente por un apropiado grupo protector. Apropiados grupos protectores son los antes descritos para la protección del grupo 5'-hidroxi de 3' H-fosfonatos de desoxirribonucleósidos, ribonucleósidos, oligodesoxirribonucleótidos y oligorribonucleótidos.

Cuando el alcohol es un ribonucleósido o un oligorribonucleótido, la función de 2'-hidroxi es protegida ventajosamente por un apropiado grupo protector, tal como un acetal, particularmente 1-(2-fluoro-fenil)-4-metoxi-piperidin-4-ilo (Fpmp); y grupos trialquil-sililo, con frecuencia grupos tri(alquil C_{1-4})sililo tal como un grupo butil terciario- dimetil-sililo. Alternativamente el ribonucleósido u oligorribonucleótido puede ser un derivado de 2'-O-alquilo, 2'-O-alcoxialquilo o 2'-O-alquenilo, corrientemente un derivado de alquilo C_{1-4}, alcoxi C_{1- 4}-alquilo C_{1-4} o alquenilo, en cuyo caso la posición 2' no necesita ninguna protección adicional.

Otros alcoholes que se pueden emplear en el procedimiento de acuerdo con el presente invento son polioles no sacáridos, especialmente alquil polioles, y preferiblemente dioles o trioles. Ejemplos de alquil dioles incluyen etano-1,2- diol, y poli(etilen glicoles) de bajo peso molecular, tales como los que tienen un peso molecular de hasta 400. Ejemplos de alquil trioles incluyen glicerol y butano trioles. Corrientemente estará presente solamente un único grupo hidroxi libre, estando los restantes grupos hidroxi protegidos por apropiados grupos protectores, tales como los descritos aquí anteriormente para la protección en las posiciones 5' ó 2' de ribonucleósidos. Sin embargo, puede estar presente más de un grupo hidroxi libre si se desea realizar acoplamientos idénticos en más de un grupo hidroxi.

Cuando el H-fosfonato y el alcohol son ambos nucleósidos u oligonucleótidos protegidos, el invento proporciona un método mejorado para la síntesis escalonada y en bloque en solución de oligodesoxirribonucleótidos, oligorribonucleótidos y compuestos análogos a ellos, basándose en reacciones de acoplamiento con H-fosfonatos. De acuerdo con un aspecto preferido del presente invento, nucleósidos u oligonucleótidos protegidos con una función de H-fosfonato terminal en 3', y nucleósidos u oligonucleótidos protegidos con una función de hidroxi terminal en 5', son acoplados en la presencia de un apropiado agente de acoplamiento para formar un compuesto intermedio H-fosfonato de dinucleósido u oligonucleótido protegido, en que dichos compuestos intermedios experimentan una transferencia de azufre in situ en la presencia de un apropiado agente de transferencia de azufre.

Además de la presencia de grupos protectores de hidroxi, las bases presentes en los nucleósidos / nucleótidos empleados en el presente invento son también protegidas preferiblemente, cuando es necesario, por apropiados grupos protectores. Los grupos protectores empleados son los conocidos en el sector especializado para proteger a dichas bases. Por ejemplo, A y/o C pueden ser protegidos por benzoílo, inclusive un benzoílo sustituido, por ejemplo alquil- o alcoxi-, con frecuencia un alquil C_{1-4}- o alcoxi C_{1-4}-, benzoílo; pivaloílo; y amidino, particularmente dialquil-aminometileno, preferiblemente di(alquil C_{1-4})- aminometileno, tal como dimetil o dibutil aminometileno. G puede ser protegido por un grupo fenilo, inclusive fenilo sustituido, por ejemplo 2,5-dicloro-fenilo y también por un grupo isobutirilo. T y U no requieren generalmente protección, pero en ciertas realizaciones pueden ser protegidos ventajosamente, por ejemplo en O4 por un grupo fenilo, inclusive fenilo sustituido, por ejemplo 2,4-dimetil-fenilo o en N3 por un pivaloíloximetilo, benzoílo, benzoílo sustituido con alquilo o alcoxi, tal como alquil C_{1-4}- o alcoxi C_{1-4}-benzoílo.

Cuando el alcohol y/o H-fosfonato es un nucleósido u oligonucleótido protegido, que tiene grupos hidroxi protegidos, uno de estos grupos protectores puede ser eliminado después de haber llevado a cabo el procedimiento del primer invento. Corrientemente, el grupo protector eliminado es el situado en la función de 3'-hidroxi. Después de que el grupo protector hubo sido eliminado, el oligonucleótido así formado puede ser convertido en un H-fosfonato y luego se puede proseguir mediante más acoplamientos escalonados o en bloques y transferencias de azufre de acuerdo con el procedimiento del presente invento en la síntesis de una deseada secuencia de oligonucleótido. El método se puede proseguir luego con etapas para eliminar los grupos protectores desde los enlaces internucleótidos, los grupos 3'- y 5'-hidroxi y desde las bases. Una metodología similar puede ser aplicada para acoplar 5' H-fosfonatos, en que el grupo protector eliminado es el situado en la función de 5'-hidroxi.

En una realización particularmente preferida, el invento proporciona un método que comprende el acoplamiento de un 3'-H-fosfonato de 5'-O-(4,4'- dimetoxi-tritil)-2'-desoxirribonucleósido o un 3'-H-fosfonato de oligodesoxirribonucleótido protegido y un componente con una función de 5'-hidroxi libre, en la presencia de un apropiado agente de acoplamiento, y la subsiguiente transferencia de azufre in situ en la presencia de un apropiado agente de transferencia de azufre.

En el procedimiento del presente invento se pueden usar cualesquiera apropiados agentes de acoplamiento y agentes de transferencia de azufre que estén disponibles en la técnica anterior.

Ejemplos de apropiados agentes de acoplamiento incluyen cloruros de alquil y aril ácidos, cloruros de alcano y areno sulfonilo, cloroformiatos de alquilo y arilo, clorosulfitos de alquilo y arilo, y fosforocloridatos de alquilo y arilo.

Ejemplos de apropiados cloruros de alquil ácidos que se pueden emplear, incluyen cloruros de alcanoílo C_{2} a C_{7}, particularmente cloruro de pivaloílo. Ejemplos de cloruros de aril ácidos que se pueden emplear, incluyen cloruros de benzoílo sustituidos y sin sustituir, tales como cloruros de benzoílo sustituidos con alcoxi C_{1-4}, halo, particularmente fluoro, cloro y bromo, y alquilo C_{1- 4}. Cuando están sustituidos, con frecuencia están presentes de 1 a 3 sustituyentes, particularmente en el caso de sustituyentes alquilo y halo.

Ejemplos de apropiados cloruros de alcanosulfonilo que se pueden emplear incluyen cloruros de alcano C_{2} a C_{7}-sulfonilo. Ejemplos de cloruros de arenosulfonilo que se pueden emplear, incluyen cloruros de bencenosulfonilo sustituidos y sin sustituir, tales como cloruros de bencenosulfonilo sustituidos con alcoxi C_{1- 4}, halo, particularmente fluoro, cloro y bromo, y alquilo C_{1-4}. Cuando están sustituidos, se presentan con frecuencia de 1 a 3 sustituyentes, particularmente en el caso de sustituyentes alquilo y halo.

Ejemplos de apropiados cloroformiatos de alquilo que se pueden emplear, incluyen cloroformiatos de alquilo C_{2} a C_{7}. Ejemplos de cloroformiatos de arilo que se pueden emplear, incluyen cloroformiatos de fenilo sustituidos y sin sustituir tales como cloroformiatos de fenilo sustituidos con alcoxi C_{1-4}, halo, particularmente fluoro, cloro y bromo, y alquilo C_{1-4}. Cuando están sustituidos, con frecuencia están presentes de 1 a 3 sustituyentes, particularmente en el caso de sustituyentes alquilo y halo.

Ejemplos de apropiados clorosulfitos de alquilo que se pueden emplear, incluyen clorosulfitos de alquilo C_{2} a C_{7}. Ejemplos de clorosulfitos de alquilo que se pueden emplear incluyen clorosulfitos de fenilo sustituidos y sin sustituir, tales como clorosulfitos de fenilo sustituidos con alcoxi C_{1-4}, halo, particularmente fluoro, cloro y bromo, y alquilo C_{1-4}. Cuando están sustituidos, con frecuencia están presentes de 1 a 3 sustituyentes, particularmente en el caso de sustituyentes alquilo y halo.

Ejemplos de apropiados fosforocloridatos de alquilo que se pueden emplear incluyen fosforocloridatos de di(alquilo C_{1} a C_{6}). Ejemplos de fosforocloridatos de arilo que se pueden emplear, incluyen fosforocloridatos de difenilo sustituidos y sin sustituir, tales como fosforocloridatos de difenilo sustituidos con alcoxi C_{1-4}, halo, particularmente fluoro, cloro y bromo, y alquilo C_{1-4}. Cuando están sustituidos, con frecuencia están presentes de 1 a 3 sustituyentes, particularmente en el caso de sustituyentes alquilo y halo.

Agentes de acoplamiento adicionales, que se pueden emplear, son los compuestos de cloro-, bromo- y (benzotriazo-1-iloxi)-fosfonio y -carbonio descritos por Wada y colaboradores en J.A.C.S. 1997, 119,, páginas 12710-12721 (incorporados a la presente por su referencia).

Agentes de acoplamiento preferidos son los fosforocloridatos de diarilo, particularmente los que tienen la fórmula (ArO)_{2}POCl, en que Ar es preferiblemente fenilo, 2-cloro-fenilo, 2,4,6-tricloro-fenilo o 2,4,6-tribromo-fenilo.

La naturaleza del agente de transferencia de azufre dependerá de si se requiere un oligonucleótido, un compuesto análogo fosforotioato o un oligonucleótido / fosforotioato de oligonucleótido mixto. Los agentes de transferencia de azufre, empleados en el procedimiento del presente invento, tienen con frecuencia la fórmula química general:

L------S-------A

en que L representa un grupo lábil, y A representa un grupo arilo, un grupo metilo o alquilo sustituido o un grupo alquenilo. Corrientemente, el grupo lábil se selecciona de tal manera que comprenda un enlace entre nitrógeno y azufre. Ejemplos de apropiados grupos lábiles incluyen los de morfolinas tales como morfolina-3,5- diona; de imidas tales como ftalimidas, succinimidas y maleimidas; de indazoles, particularmente indazoles con sustituyentes sustractores de electrones, tales como 4-nitro-indazoles; y de triazoles.

Cuando se requiere en el producto final un enlace fosfodiéster clásico, el agente de transferencia de azufre, el resto A representa un grupo arilo, tal como un grupo fenilo o naftilo. Ejemplos de grupos arilo apropiados incluyen grupos fenilo sustituidos y sin sustituir, particularmente grupos halofenilo y alquilfenilo, especialmente grupos 4-halofenilo y 4-alquilfenilo, corrientemente grupos 4- (alquil C_{1-4})fenilo, lo más preferiblemente grupos 4-cloro-fenilo y p-tolilo. Un ejemplo de una clase apropiada de agente de transferencia clásico director de fosfodiésteres es una N-(arilsulfanil) ftalimida (se puede usar también succinimida u otra imida).

Cuando se requiere un enlace de diéster de fosforotioato en el producto final, el resto A representa un grupo metilo, alquilo sustituido o alquenilo. Ejemplos de apropiados grupos alquilo sustituidos incluyen grupos metilo sustituidos, particularmente grupos bencilo y bencilo sustituidos, tales como grupos bencilo sustituidos con alquilo, corrientemente alquilo C_{1-4} y halo, corrientemente con cloro, y grupos etilo sustituidos, especialmente grupos etilo sustituidos en la posición 2 con un sustituyente sustractor de electrones, tales como grupos 2-(4-nitro- fenil) etilo y 2-ciano-etilo. Ejemplos de apropiados grupos alquenilo son alilo y crotilo. Ejemplos de una apropiada clase de agentes de transferencia de azufre directores de fosforotioatos son, por ejemplo, derivados de (2-ciano-etil) sulfanilo tales como 4-[(2-ciano- etil)-sulfanil]morfolina-3,5-diona, o un reactivo correspondiente tal como 3- (ftalimidosulfanil) propanonitrilo.

Una temperatura apropiada para llevar a cabo la reacción de acoplamiento y la transferencia de azufre está situada en el intervalo de aproximadamente -55ºC a la temperatura ambiente (corrientemente en el intervalo de 10 a 30ºC, por ejemplo a aproximadamente 20ºC) y de modo preferible de -40ºC a 0ºC.

Disolventes orgánicos que se pueden emplear en el procedimiento del presente invento incluyen haloalcanos, particularmente diclorometano, ésteres, particularmente ésteres de alquilo tales como acetato de etilo, y propionato de metilo o etilo, y disolventes nucleófilos de carácter básico tales como piridina. Los disolventes preferidos para las etapas de acoplamiento y transferencia de azufre son piridina, diclorometano y sus mezclas.

La relación molar del H-fosfonato al alcohol en el procedimiento del presente invento se selecciona con frecuencia de manera que esté situada en el intervalo entre alrededor de 0,9:1 y 3:1, corrientemente entre alrededor de 1:1 y alrededor de 2:1, y de modo preferible entre alrededor de 1,1:1 y alrededor de 1,5:1, tal como de alrededor de 1,2:1. Sin embargo, cuando están teniendo lugar al mismo tiempo acoplamientos en más de un grupo hidroxilo libre, las relaciones molares serán aumentadas de manera proporcional. La relación molar del agente de acoplamiento al alcohol se selecciona con frecuencia de manera que esté en el intervalo entre alrededor de 1:1 y alrededor de 10:1, corrientemente entre alrededor de 1,5:1 y alrededor de 5:1, y preferiblemente entre alrededor de 2:1 y alrededor de 3:1. La relación molar de agentes de transferencia de azufre a alcohol se selecciona con frecuencia de manera tal que esté situada en el intervalo entre alrededor de 1:1 y aproximadamente 10:1, corrientemente entre alrededor de 1,5:1 y alrededor de 5:1, y preferiblemente entre alrededor de 2:1 y alrededor de 3:1.

En el procedimiento del presente invento, el H-fosfonato y el alcohol se pueden mezclar previamente en solución, y el agente de acoplamiento se puede añadir a esta mezcla. Alternativamente, el H-fosfonato y el agente de acoplamiento se pueden mezclar previamente, con frecuencia en solución, y luego se pueden añadir a una solución del alcohol, o el alcohol y el agente de acoplamiento se pueden mezclar, corrientemente en solución, y luego añadir a una solución del H-fosfonato. En ciertas realizaciones, el H-fosfonato, opcionalmente en la forma de una solución, se puede añadir a una solución que comprenda una mezcla del alcohol y del agente de acoplamiento. Después de que la reacción de acoplamiento esté sustancialmente completa, el agente de transferencia de azufre se añade luego a la solución del diéster de H-fosfonato producido en la reacción de acoplamiento. Las adiciones de reactivos tienen lugar corrientemente en régimen continuo o por incrementos durante un período de tiempo de adición.

En el procedimiento del presente invento es posible preparar oligonucleótidos que contengan enlaces internucleótidos tanto de fosfodiéster como de diéster de fosforotioato en la misma molécula por selección de apropiados agentes de transferencia de azufre, particularmente cuando el procedimiento se lleva a cabo de una manera escalonada.

Tal como se ha señalado con anterioridad, el método del invento se puede usar en la síntesis de secuencias de ARN, 2'-O-alquil-ARN, 2'-O-alcoxialquil-ARN y 2'-O-alquenil-ARN. Los 3'-H-fosfonatos de 2'-O-(Fpmp)-5'-O-(4,4-dimetoxi- tritil)-ribonucleósidos 1 y los 3'-H-fosfonatos de 2'-O-(alquil, alcoxialquil o alquenil)-5'-O-(4,4-dimetoxi-tritil)-ribonucleósidos 2a-c se pueden preparar, por ejemplo, a partir de los correspondientes bloques de construcción de nucleósidos, H-fosfonato de p-cresil amonio y cloruro de pivaloílo.

1

Se usan los mismos protocolos que en la síntesis de secuencias de ADN y fosforotioatos de ADN (Esquemas 2-4) siguiendo el procedimiento clásico de desbloqueo (Esquema 2, etapas V y VI), los grupos protectores Fpmp se eliminan en condiciones suaves de hidrólisis ácida, que no conducen a ninguna disociación o migración detectable de los enlaces internucleótidos (Capaldi, D.C.; Reese C.B. Nucleic Acids Res. 1994, 22, 2209-2216). Para secuencias de ribozimas útiles quimioterapéuticamente, la síntesis de ARN a escala relativamente grande en solución, es una cuestión de considerable importancia práctica. La incorporación de 2'-O-alquil-, 2'-alquil sustituido- y 2'-O-alquenil- [especialmente 2'-O-metil-, 2'-O-alil- y 2'-O-(2-metoxi-etil)-]-ribonucleósidos (Sproat, B.S. en ``Methods in Molecular Biology [Métodos en biología molecular], volumen 20, Protocols for Oligonucleotides and Analogs [Protocolos para oligonucleótidos y análogos]'', Agrawal, S., coordinador de edición, Humana Press, Totowa, 1993) en oligonucleótidos es corrientemente una cuestión de mucha importancia, puesto que estas modificaciones confieren a los oligómeros resultantes a la vez resistencia a la digestión por nucleasas y buenas propiedades de hibridación.

La etapa de transferencia de azufre se lleva a cabo en el producto del acoplamiento con H-fosfonato in situ, es decir sin separación ni purificación del compuesto intermedio producido por la reacción de acoplamiento. Preferiblemente, el agente de transferencia de azufre se añade a la mezcla agitada que resulta de la reacción de acoplamiento.

Además del hecho de que se lleva a cabo en una solución homogénea, el presente procedimiento de acoplamiento difiere del seguido en el enfoque de los H-fosfonatos para una síntesis en fase sólida (Froehler y colaboradores, Methods in Molecular Biology [Métodos en biología molecular], 1993) en al menos otros dos aspectos importantes. En primer lugar, se puede llevar a cabo a una temperatura muy baja. Con ello, se pueden evitar las reacciones colaterales que pueden acompañar al acoplamiento con un H-fosfonato (Kuyl-Yeeheskiely y colaboradores, Rec. Trav. Chim., 1986, 105, 505-506) incluso cuando como agente de acoplamiento se usa el fosforodicloridato de di-(2-cloro-fenilo) en vez de cloruro de pivaloílo (Froehler, B.C.; Matteucci, M.D. Tetrahedron Lett., 1986, 27, 469-472). En segundo lugar, la transferencia de azufre se lleva a cabo después de cada etapa de acoplamiento en lugar de solamente una vez a continuación del ensamble de toda la secuencia de oligómeros.

Los grupos protectores se pueden eliminar usando métodos conocidos en la especialidad para el grupo protector y la función particulares. Por ejemplo, grupos protectores transitorios, particularmente de gamma ceto ácidos, tales como grupos protectores del tipo de levulinoílo, se pueden eliminar por tratamiento con hidrazina, por ejemplo hidrazina tamponada, tal como por el tratamiento con hidrazina en condiciones muy suaves, descrito por van Boom, J.H.; Burgers, P.M.J. Tetrahedron Lett., 1976, 4875-4878. Los resultantes oligonucleótidos parcialmente protegidos, con funciones 3'-hidroxi libres, pueden ser luego convertidos en los correspondientes H-fosfonatos que son compuestos intermedios que se pueden emplear para la síntesis en bloque de oligonucleótidos y sus compuestos análogos fosforotioatos.

Cuando se desprotege el deseado producto, una vez que éste ha sido producido, los grupos protectores situados en el fósforo, que producen enlaces de triésteres de fosforotioatos son eliminados corrientemente en primer lugar. Por ejemplo, un grupo cianoetilo puede ser eliminado por tratamiento con una amina fuertemente básica tal como DABCO, 1,5-diazabiciclo[4.3.0]non-5-eno (DBN), 1,8- diazabiciclo[5.4.0]undec-7-eno (DBU) o trietil-amina.

Los grupos fenilo y fenilo sustituidos en los enlaces internucleótidos de fosforotioatos y en los residuos de bases se pueden eliminar por un tratamiento con un oximato, por ejemplo con la base conjugada de una aldoxima, preferiblemente la de E-2-nitro-benzaldoxima o piridina-2-carboxaldoxima (Reese y colaboradores, Nucleic Acids Res. 1981). Kamimura, T. y colaboradores en J. Am. Chem. Soc., 1984, 106, 4552-4557, y Sekine, M. y colaboradores, Tetrahedron, 1985, 41, 5279-5288, en un enfoque para la síntesis de oligonucleótidos mediante el enfoque de los fosfotriésteres en solución, basado en compuestos intermedios S-fenil fosforotioatos; y van Boom y sus colaboradores en un enfoque para la síntesis de oligonucleótidos, basado en compuestos intermedios S-(4-metil-fenil)fosforotioatos (Wreesman, C.T.J. y colaboradores, Tetrahedron Lett., 1985, 26, 933-936) han demostrado todos ellos que el desbloqueo de S-fenil-fosforotioatos con iones de oximato (usando el método de Reese y colaboradores, 1978; Reese, C.B.; Zard, L. Nucleic Acids Res., 1981, 9, 4611-4626) conduce a enlaces internucleótidos de fosfodiésteres naturales. En el presente invento, el desbloqueo de fosforotioatos protegidos por S-(4-cloro- fenilo) con la base conjugada de E-2-nitro-benzaldoxima se desarrolla con suavidad y sin ninguna detectable disociación entre nucleótidos.

Otros grupos protectores de bases, por ejemplo grupos benzoílo, pivaloílo y amidino, se pueden eliminar por tratamiento con amoníaco acuoso concentrado.

Los grupos tritilo presentes se pueden eliminar por tratamiento con un ácido. Con respecto a la estrategia de desbloqueo global en la síntesis de oligodesoxirribonucleótidos, otra consideración importante del presente invento consiste en que la eliminación del grupo protector tritilo, con frecuencia un DMTr terminal en 5' (``destritilación'') se deberá desarrollar sin ninguna despurinación concomitante, especialmente de cualesquiera residuos 6-N-acil-2'-desoxi- adenosina. De acuerdo con una realización del presente invento, los presentes autores del invento han encontrado que dicha despurinación, que posiblemente es difícil de evitar por completo en una síntesis en fase sólida, se puede suprimir totalmente efectuando la ``destritilación'' con una solución diluida de cloruro de hidrógeno a una baja temperatura, particularmente con una solución de cloruro de hidrógeno aproximadamente 0,45 M en una mezcla de dioxano y diclorometano (1:8 v/v) a -50ºC. En estas condiciones de reacción, la ``destritilación'' puede ser completada con rapidez, y en ciertos casos después de 5 minutos o menos. Por ejemplo, cuando la 6-N-benzoíl-5'-O-(4,4'-dimetoxi-tritil)-2'-desoxi-adenosina se trató con cloruro de hidrógeno en una mezcla de dioxano y diclorometano en dichas condiciones, la ``destritilación'' estaba completa después de 2 min, pero no se detectó ninguna despurinación ni siquiera después de 4 horas.

Los grupos protectores sililo se pueden eliminar mediante tratamiento con un fluoruro, por ejemplo con una solución de una sal fluoruro de tetraalquil-amonio tal como fluoruro de tetrabutil-amonio.

Los grupos protectores Fpmp se pueden eliminar por hidrólisis ácida en condiciones suaves.

Este nuevo enfoque para la síntesis de oligonucleótidos en solución es apropiado para la preparación de secuencias con enlaces internucleótidos (a) solamente de fosfodiésteres, (b) solamente de diésteres de fosforotioatos y (c) una combinación tanto de fosfodiésteres como de diésteres de fosforotioatos.

El invento se refiere también al desarrollo de un acoplamiento en bloque (como se ilustra por ejemplo en el Esquema 4b). A este respecto, los ejemplos proporcionan una ilustración de la síntesis de d[Tp(s)Tp(s)Gp(s)Gp(s)Gp(s)- Gp(s)Tp(s)T] (ISIS 5320 Ravikuma, V.T.; Cherovallath, Z.S. Nucleosides & Nucleosides 1996, 15, 1149-1155), un heptafosforotioato de octadesoxirribonucleósido, procedente de bloques tetrámeros. Este compuesto análogo a oligonucleótido tiene propiedades como agente anti-HIV (virus de la inmunodeficiencia humana. Otras dianas propuestas de síntesis en bloque incluyen secuencias con efectos terapéuticos, por ejemplo, agentes inhibidores de trombina humana y agentes anti-HIV. El método del invento se puede usar además en la síntesis de secuencias de mayor tamaño.

Resultará evidente que cuando el procedimiento del presente invento es aplicado a la síntesis en bloque, están disponibles un cierto número de estrategias alternativas en términos de la ruta seguida hasta llegar al producto deseado. Éstas dependerán de la naturaleza del producto deseado. Por ejemplo, un octámero se puede preparar mediante la preparación de dímeros, acoplados para producir tetrámeros, que luego se acoplan para producir el deseado octámero. Alternativamente, se pueden acoplar un dímero y un trímero para producir un pentámero, que se puede acoplar con un trímero adicional para producir el deseado octámero. La elección de la estrategia se reserva a la discreción del usuario. Sin embargo, la característica común de dicho acoplamiento en bloque es que un H-fosfonato de oligómero que comprende dos o más unidades se acopla con un alcohol oligómero, que también comprende dos o más unidades. Lo más corrientemente, 3'- H-fosfonatos de oligonucleótidos se acoplan con oligonucleótidos que tienen funciones 5'-hidroxi libres.

El procedimiento del presente invento se puede emplear también para preparar oligonucleótidos cíclicos, especialmente oligodesoxirribonucleótidos cíclicos y ribonucleótidos cíclicos. En la preparación de oligonucleótidos cíclicos, se prepara un oligonucleótido que comprende una función de H-fosfonato, con frecuencia un 3' ó 5' H-fosfonato y se introduce una función de hidroxi libre por desprotección apropiada. La posición de la función de hidroxi libre se selecciona usualmente para que corresponda al H-fosfonato, por ejemplo una función de 5'- hidroxi sería acoplada con un 3' H-fosfonato, y una función de 3'-hidroxi sería acoplada con un 5' H-fosfonato. Las funciones hidroxi y H-fosfonato se pueden luego acoplar intramolecularmente en solución, en la presencia de un agente de acoplamiento, y esta reacción es seguida por una transferencia de azufre in situ.

De acuerdo con un aspecto adicional del presente invento, se proporcionan nuevos H-fosfonatos de oligómeros que tienen la fórmula química general:

2

en la que

cada B independientemente es una base seleccionada entre A, G, T, C ó U;

cada Q independientemente es H ó OR' en que R' es alquilo, alquilo sustituido, alquenilo o un grupo protector;

cada R independientemente es un grupo arilo, metilo, alquilo sustituido o alquenilo;

W es H, un grupo protector o un grupo H-fosfonato de fórmula

3

en la que M^{+} es un catión monovalente;

cada X independientemente representa O ó S;

cada Y independientemente representa O ó S;

Z es H, un grupo protector o un grupo H-fosfonato de fórmula

4

en la que M^{+} es un catión monovalente; y

n es un número entero y es por lo menos 2;

con la condición de que cuando W es H o un grupo protector, Z ha de ser un grupo H-fosfonato, y de que cuando Z es H o un grupo protector, W ha de ser un grupo H-fosfonato.

También se proporcionan nuevos H-fosfonatos de oligómeros que tienen la fórmula química general:

5

en la que

cada B independientemente es una base seleccionada entre A, G, T, C ó U;

cada Q independientemente es H ó OR' en que R' es alquilo, alquilo sustituido, alquenilo o un grupo protector;

cada R independientemente es un grupo arilo, metilo, alquilo sustituido o alquenilo;

W es H, un grupo protector o un grupo H-fosfonato de fórmula

6

en la que M^{+} es un catión monovalente;

cada X independientemente representa O ó S;

cada Y representa S;

Z es H, un grupo protector o un grupo H-fosfonato de fórmula

7

en la que M^{+} es un catión monovalente; y

n es un número entero positivo;

con la condición de que cuando W es H o un grupo protector, Z ha de ser un grupo H-fosfonato, y de que cuando Z es H o un grupo protector, W ha de ser un grupo H-fosfonato.

Preferiblemente, sólo uno entre W ó Z es un grupo H-fosfonato, siendo corrientemente sólo Z un grupo H-fosfonato.

Cuando W ó Z representa un grupo protector, el grupo protector puede ser uno de los antes descritos para proteger las posiciones 3' ó 5' respectivamente. Cuando W es un grupo protector, el grupo protector es un grupo tritilo, particularmente un grupo dimetoxitritilo. Cuando Z es un grupo protector, el grupo protector es un grupo tritilo, particularmente un grupo dimetoxitritilo, o un grupo acilo, preferiblemente levulinoílo.

Las bases A, G y C representadas por B están preferiblemente protegidas, y las bases T y U pueden estar protegidas. Apropiados grupos protectores incluyen los descritos aquí con anterioridad para la protección de bases en el procedimiento de acuerdo con el primer aspecto del presente invento.

Cuando Q representa un grupo de OR', y R' es alquenilo, el grupo alquenilo es con frecuencia un grupo alquenilo C_{1-4}, especialmente un grupo alilo o crotilo. Cuando R' representa alquilo, el alquilo es preferiblemente un grupo alquilo C_{1-4}. Cuando R' representa alquilo sustituido, el grupo alquilo sustituido incluye grupos alcoxialquilo, especialmente grupos alquil C_{1-4}-oxi-alquilo C_{1-4} tales como grupos metoxietilo. Cuando R' representa un grupo protector, el grupo protector es corrientemente un grupo protector acetal inestable frente a los ácidos, particularmente un grupo 1-(2-fluoro-fenil)-4-metoxi-piperidin-4-ilo (Fpmp) o un grupo trialquil-sililo, con frecuencia un grupo tri(alquil C_{1-4})sililo tal como un grupo butil terciario-dimetil-sililo.

Preferiblemente X representa O.

En muchas realizaciones, Y representa S y cada R representa el grupo metilo, alquilo sustituido, alquenilo o arilo que queda a partir del o los agente(s) de transferencia de azufre, que se emplean en el procedimiento del presente invento. Preferiblemente, cada R representa independientemente un grupo metilo; un grupo metilo sustituido, particularmente un grupo bencilo o bencilo sustituido, tal como un grupo bencilo sustituido con alquilo, corrientemente con alquilo C_{1-4} o con halo, corrientemente con cloro; un grupo etilo sustituido, especialmente un grupo etilo sustituido en la posición 2 con un sustituyente sustractor de electrones, tal como un grupo 2-(4-nitro-fenil)etilo o 2-ciano-etilo; un grupo alquenilo C_{1-4}, preferiblemente un grupo alilo o crotilo, o un grupo fenilo sustituido o sin sustituir, particularmente un grupo halofenilo o alquilfenilo, especialmente un grupo 4-halo-fenilo, o un grupo 4-alquil-fenilo, corrientemente un grupo 4-(alquil C_{1-4})fenilo, y lo más preferiblemente un grupo 4-cloro-fenilo o p-tolilo.

M^{+} representa preferiblemente un ion de trialquil amonio tal como un ion de tri-(alquil C_{1-4}-amonio) y preferiblemente un ion de trietil amonio.

n puede ser desde 1 hasta cualquier número, dependiendo del oligonucleótido que se pretenda sintetizar, particularmente hasta aproximadamente 20. Preferiblemente, n es de 1 a 16, y especialmente de 1 a 9. Un H-fosfonato en el que n representa 1, 2 ó 3 se puede emplear cuando se desee añadir pequeños bloques de nucleótidos, empleándose valores correspondientemente mayores de n, por ejemplo de 5, 6 ó 7 o más, si se desean acoplar bloques mayores de oligonucleótidos.

Los H-fosfonatos de acuerdo con el presente invento están corrientemente en la forma de soluciones, preferiblemente las empleadas en el procedimiento del primer aspecto del presente invento.

Estos H-fosfonatos son también compuestos intermedios útiles en la síntesis en bloque de oligonucleótidos y fosforotioatos de oligonucleótidos. Como se indica anteriormente, el acoplamiento en bloque es mucho más factible en una fase en solución que en una fase de síntesis sólida.

Los H-fosfonatos de oligonucleótidos se pueden preparar usando métodos generales conocidos en el sector especializado para la síntesis de H-fosfonatos de nucleósidos. Correspondientemente, en un aspecto adicional del presente invento, se proporciona un procedimiento para la producción de un H-fosfonato de oligonucleótido, en el que un oligonucleótido que comprende una función de hidroxi libre, preferiblemente una función de 3'- ó 5'-hidroxi, se hace reaccionar con una sal H-fosfonato de alquilo o arilo sustituido con halo en la presencia de un activador.

Preferiblemente, el oligonucleótido es un oligonucleótido protegido, y lo más preferiblemente un oligodesoxinucleótido protegido o un oligorribonucleótido protegido. La sal H-fosfonato es con frecuencia una sal de amonio, inclusive sales de alquil-, aril- y alquil y aril mixtos- amonio. Preferiblemente, la sal de amonio es una sal de (NH_{4})^{+} de tri(alquil C_{1-4})-amonio. Ejemplos de grupos alquilo que pueden estar presentes en el H-fosfonato son grupos alquilo C_{1-4}, especialmente grupos alquilo C_{2-4}, sustituidos con grupos fuertemente sustractores de electrones, particularmente halo, y preferiblemente grupos con fluoro, tales como grupos 2,2,2-trifluoro-etilo y 1,1,1,3,3,3- hexafluoro-propan-2-ilo. Ejemplos de grupos arilo que pueden estar presentes, incluyen grupos fenilo y fenilo sustituidos, particularmente grupos alquilfenilo, corrientemente grupos alquil C_{1-4}-fenilo, y halofenilo, corrientemente grupos clorofenilo. Preferiblemente, un grupo fenilo sustituido es un grupo fenilo sustituido en posición 4. Los H- fosfonatos particularmente preferidos son H-fosfonatos de amonio- y trietil- amonio-p-cresilo. Los activadores que se pueden emplear incluyen los compuestos que aquí se describen para su uso como agentes de acoplamiento, y particularmente fosforocloridatos de diarilo y cloruros de alquil y cicloalquil ácidos tales como cloruro de 1-adamantano-carbonilo, y preferiblemente cloruro de pivaloílo. La producción de H-fosfonatos tiene lugar preferiblemente en la presencia de un disolvente, con frecuencia los disolventes que se describen para usarse en el procedimiento del primer aspecto del presente invento, preferiblemente piridina, diclorometano y sus mezclas.

Una ventaja del presente invento para la síntesis solamente de diésteres de fosforotioatos consiste en que, con tal de que se tenga cuidado en evitar una desulfuración durante las etapas de desbloqueo [particularmente durante el calentamiento con amoníaco acuoso (por ejemplo el Esquema 3, etapa viii(a))], la síntesis de fosforotioatos de oligonucleótidos no debería conducir a productos que estén contaminados con enlaces internucleótidos de fosfodiésteres clásicos. En el caso de una síntesis de fosforotioatos de oligonucleótidos en fase sólida, una transferencia incompleta de azufre en cada ciclo de síntesis conduce usualmente a una contaminación residual con fosfodiésteres (Zon, G.; Stec, W.J. en ``Oligonucleotides and Analogs. A Practical Approach'' [Oligonucleótidos y compuestos análogos a ellos. Un enfoque práctico], Eckstein, F., coordinador de edición, IRL Press, Oxford, 1991, páginas 87-108).

La síntesis en solución, que se propone por el presente invento, tiene otra enorme ventaja con respecto a la síntesis en fase sólida, de que existe la posibilidad de controlar la selectividad de las reacciones trabajando a temperaturas bajas o incluso a temperaturas muy bajas. Esta ventaja se extiende a la etapa de destritilación (Esquema 3, etapa i) que se puede desarrollar con rapidez y de manera cuantitativa por debajo de 0ºC, sin despurinación detectable. Después de la etapa de destritilación, se puede efectuar una purificación relativamente rápida y eficiente por lo que anteriormente se ha descrito como el enfoque de ``filtración'' (Chaudhuri, B.; Reese, C.B.; Weclawek, K. Tetrahedron Lett. 1984, 25, 4037-4040). Esto depende del hecho de que los compuestos intermedios fosfotriésteres y (triésteres de fosforotioatos), pero no cualesquiera monómeros cargados destritilados remanentes, son eluidos con mucha rapidez a partir de cortas columnas de gel de sílice por mezclas de THF y piridina.

El método de acuerdo con el invento se ilustrará ahora con referencia a los siguientes Ejemplos, que no se pretende que sean limitativos:

En los Ejemplos, deberá señalarse que cuando los residuos de nucleótidos y enlaces internucleótidos están en letra cursiva, esto indica que se encuentran protegidos de una cierta manera. En el presente contexto, A, C, G y T representan 2'-desoxi-adenosina protegida en N-6 con un grupo benzoílo, 2- desoxi-citidina protegida en N-4 con un grupo benzoílo, 2'-desoxi-guanosina protegida en N-2 y en O-6 con grupos isobutirilo y 2,5-dicloro-fenilo, y timina sin proteger. Por ejemplo, como se indica en el Esquema 3, p(s) y p(s') representan fosforotioatos de S-(2-ciano-etilo) y S-(4-cloro-fenilo), respectivamente, y p(H), que no está protegido y por lo tanto no se representa en letra cursiva, representa un monoéster H-fosfonato si está situado en el extremo de una secuencia o unido a un monómero, pero en otro caso representa un diéster de H-fosfonato.

Ejemplos

Esquema de reacción para la preparación de fosfatos de dinucleósidos

Con referencia particular a la preparación de fosfatos de dinucleósidos, el Esquema 2 describe con más detalle el método del invento para la preparación de oligodesoxirribonucleótidos y los compuestos análogos fosforotioatos de ellos.

8

9

Esquema 2 Reactivos y condiciones

(i)

18, C_{5}H_{5}N, CH_{2}Cl_{2}, -40ºC, 5-10 min;

(ii)

19, C_{5}H_{5}N, CH_{2}Cl_{2}, -40ºC, 15 min, b, C_{5}H_{5}N - H_{2}O (1:1 v/v), de -40ºC a la temperatura ambiente;

(iii)

HCl 4 M / dioxano, CH_{2}Cl_{2}, -50ºC, 5 min;

(iv)

Ac_{2}O, C_{5}H_{5}N, temperatura ambiente, 15 h;

(v)

20, TMG, MeCN, temperatura ambiente, 12 h;

(vi)

a, NH_{3} acuoso concentrado (d 0,88), 50ºC, 15 h, b, Amberlite IR-120 (plus), forma de Na^{+}, H_{2}O;

(vii)

a, 21, C_{5}H_{5}N, CH_{2}Cl_{2}, -40ºC, 15 min, b, C_{5}H_{5}N - H_{2}O (1:1 v/v), de -40ºC a la temperatura ambiente;

(viii)

DBU, Me_{3}SiCl, CH_{2}Cl_{2}, temperatura ambiente, 30 min;

(ix)

20, DBU, MeCN, temperatura ambiente, 12 h.

A partir del Esquema 2, la síntesis de oligonucleótidos se desarrolla pasando por los compuestos intermedios 8, 9, 10 y 11, y la preparación de los compuestos análogos fosforotioatos se desarrolla pasando por los compuestos intermedios 8, 9, 12 y 13. Las bases 14, 15 y 16 corresponden a adenina protegida, citosina protegida y guanina protegida. La base 17 corresponde a timina, que no requiere ninguna protección. Se puede usar cualquier grupo protector que se use convencionalmente. En la síntesis de un ARN, la timina será reemplazada por uracilo. El compuesto 18 es un agente de acoplamiento apropiado, y los compuestos 19 y 21 son apropiados agentes de transferencia de azufre. Estos compuestos son citados de modo más completo a continuación.

Los bloques de construcción monómeros requeridos en el procedimiento de acoplamiento de acuerdo con el invento ilustrado en el Esquema 2 son 3'-H- fosfonatos de trietil-amonio 5'-O-(4,4'-dimetoxi-tritil)-2'- desoxirribonucleósidos 8 (Bases B y B' = 14 - 17) que se pueden preparar con facilidad en rendimientos casi cuantitativos a partir de los correspondientes derivados de nucleósidos protegidos por un procedimiento del que recentemente se ha informado (Ozola, V., Reese, C.B., Song Q. Tetrahedron Lett., 1996, 37, 8621-8624). A manera de ilustración, se prepararon 3'-H-fosfonatos de trietil-amonio 5'-O-(dimetoxi-tritil)-2'- desoxirribonucleósido 8 de la siguiente manera: Se evaporaron conjuntamente bajo presión reducida H-fosfonato de amonio 4-metil-fenilo 30 (2,84 g, 15,0 mmol), un derivado de 5'-O-(dimetoxi-tritil)-2'-desoxirribonucleósido (5,0 mmol), trietil- amina (4,2 ml, 30 mmol) y piridina seca (20 ml). El residuo se evaporó conjuntamente de nuevo con piridina seca (20 ml). El residuo se disolvió en piridina seca (40 ml) y la solución se enfrió a -35ºC (con una mezcla de esencia metilada industrial [alcohol desnaturalizado con metanol] y un baño de hielo seco). Se añadió gota a gota cloruro de pivaloílo (1,85 ml, 15,0 mmol) a la solución agitada durante un período de tiempo de 1 min, y los reaccionantes se mantuvieron a -35ºC. Después de 30 min, se añadió agua (5 ml), y la mezcla agitada se dejó calentar hasta la temperatura ambiente. Se añadió a los productos un tampón de fosfato de potasio (1,0 mol\cdotdm^{-3}, pH 7,0, 250 ml), y la mezcla resultante se concentró bajo presión reducida hasta que se hubiera eliminado la totalidad de la piridina. La mezcla residual se repartió entre diclorometano (250 ml) y agua (200 ml). La capa orgánica se lavó con un tampón de fosfato de trietil-amonio (0,5 mol\cdotdm^{-3}, pH 7,0, 3 x 50 ml), se secó (sobre MgSO_{4}) y luego se evaporó bajo presión reducida. El residuo se fraccionó por cromatografía en columna corta en presencia de gel de sílice (25 g). Las fracciones apropiadas, eluidas con mezclas de diclorometano y metanol (desde 95:5 hasta 90:10 v/v), se evaporaron para dar el 3'-H-fosfonato de (5'-O-(dimetoxi-tritil)-2'-desoxirribonucleósido) 8.

Cuando se hicieron reaccionar conjuntamente 3'-H-fosfonato de trietil-amonio 6- N-benzoíl-5'-O-(4,4'-dimetoxi-tritil)-2'-desoxi-adenosina (DMTr-Ap(H)) (Ozola y colaboradores, Tetrahedron, 1996). El compuesto 8 (B = 14), la 4-N-benzoíl-3'-O-levulinoíl-2'-desoxi-citidina (HO-C-Lev) 9 (B' = 15) y el fosforocloridato de di-(2-cloro-fenilo) 18 se hicieron reaccionar conjuntamente en una solución en una mezcla de piridina y diclorometano a -40ºC, el correspondiente H-fosfonato de dinucleósido totalmente protegido (DMTr-Ap(H)C-Lev) se obtuvo aparentemente en un rendimiento cuantitativo en el transcurso de 5-10 minutos. El protocolo usado en este ejemplo particular fue la adición gota a gota de una solución de fosforocloridato de di-(2-cloro-fenilo) (2,03 g, 6,0 mmol) en diclorometano (4 ml) durante 5 min a una solución seca y agitada de la sal de trietil-amonio de DMTr- Ap(H) 8 (B = 14) (3,95 g, aproximadamente 4,8 mmol) y de 4-N-benzoíl-3'- O-levulinoíl-2'-desoxi-citidina 9 (B' = 15) (1,72 g, 4,0 mmol) en piridina (36 ml), mantenida a -40ºC (esencia metilada industrial + un baño de hielo seco). Después de un período de tiempo adicional de 5 min, solamente se podría detectar por HPLC [cromatografía de líquido de alto rendimiento] de fase inversa un producto de nucleótido, que se supone que es DMTr-Ap(H)-C-Lev, y algo de monómero H- fosfonato remanente 8 (B = 14). Sin embargo, deberá señalarse que estas condiciones de reacción se pueden hacer variar de una manera apropiada.

Es particularmente digno de mención que dicha eficiencia alta de acoplamiento se consiguió solamente con un exceso de aproximadamente 20% de un monómero H-fosfonato. No se hizo ningún intento de aislar el H-fosfonato de dinucleósido intermedio (DMTr-Ap(H)C-Lev).

Se añadió N-[(4-cloro-fenil)sulfanil]ftalimida 19 (2,32 g, 8,0 mmol) (Behforouz, M.; Kerwood, J.E. J. Org. Chem., 1969, 34, 51-55) a los reaccionantes agitados que se mantuvieron a -40ºC. Después de 15 min, los productos fueron sometidos a tratamiento y cromatografiados en presencia de gel de sílice, y el correspondiente fosforotioato de S-(4-cloro-fenil) dinucleósido DMTr- Ap(s')C-Lev 10 (B = 14, B' = 15) se obtuvo con un rendimiento aislado de aproximadamente 99%. Por lo tanto, ambas etapas la de acoplamiento y la de transferencia de azufre se desarrollaron con relativa rapidez y virtualmente en grado cuantitativo a -40ºC

El proceso de cuatro etapas (Esquema 2, etapas iii-vi) para el desbloqueo de DMTr-Ap(s')C-Lev 10 (B = 14, B' = 15) implica preferiblemente una ``destritilación'', una acetilación de la función hidroxi terminal en 5', un tratamiento con un oximato y finalmente un tratamiento con amoníaco acuoso concentrado para eliminar grupos protectores acilo a partir de los residuos de bases y a partir de las funciones hidroxi terminales en 3' y 5'. De esta manera, se obtuvo un d[ApC] 11 (B = adenin-9- ilo, B' = citosin-1-ilo)extremadamente puro, sin purificación adicional, y se aisló en forma de su sal de sodio. Los bloques de construcción monómeros 8 (B = 17) y 9 (B' = 16) se acoplaron conjuntamente de la misma manera y a la misma escala. Después de una transferencia de azufre con N-[(4-cloro-fenil)sulfanil]ftalimida 19, el fosforotioato de dinucleósido totalmente protegido DMTr-Tp(s')G-Lev 10 (B = 17, B' = 16) se aisló con un rendimiento de aproximadamente 98%. Nuevamente, se obtuvo d[TpG] 11 (B = timin-1-ilo, B' = guanin-9-ilo) muy puro cuando este material fue desbloqueado por el procedimiento anterior (Esquema 2, etapas iii-vi).

El protocolo para la preparación de fosforotioatos de oligonucleótidos totalmente protegidos difiere del usado para la síntesis de oligonucleótidos, solamente en que la transferencia de azufre se efectúa con 4-[(2-ciano- etil)sulfanil]morfolina-3,5-diona 21 o 3-(ftalimidosulfanil) propanonitrilo. Sin embargo, la 4-(2-ciano-etil)-sulfanil]morfolina-3,5-diona tiene la ventaja de que la morfolina 3,5-diona producida en el curso de la transferencia de azufre es más soluble en agua que la ftalimida. El 3'-H-fosfonato de trietil-amonio 6-O-(2,5- dicloro-fenil)-5'-O-(4,4'-dimetoxi-tritil)-2-N-isobutiril-2'-desoxi guanosina (DMTr-Gp(H)) 8 (B = 16) [aproximadamente 4,8 mmol], la 6-N-benzoíl-3'-O- levulinoíl-2'-desoxi-adenosina (HO-A-Lev) 9 (B = 14) [4,0 mmol] y el fosforocloridato de di-(2-cloro-fenilo) 18 [6,0 mmol] se hicieron reaccionar conjuntamente en una solución en una mezcla de piridina y diclorometano a -40ºC durante 5-10 minutos. Luego se añadió 4-[(2-ciano-etil)sulfanil]morfolina-3,5-diona 21 [8,0 mmol] (Esquema 2, etapa vii), mientras que los reaccionantes se mantenían a -40ºC. Después de 15 minutos, los productos se trataron y fraccionaron por cromatografía en gel de sílice para el fosforotioato de dinucleósido totalmente protegido (DMTr-Gp(s)A-Lev 12 (B = 14, B' = 16) con un rendimiento aislado de 99%. Este material fue desbloqueado por un procedimiento de cinco etapas (Esquema 2, etapas iii, iv, viii, ix y vi). A continuación de las etapas de ``destritilación'' y acetilación, el producto se trató con 1,8-diazabiciclo[5.4.0]undec-7-eno (DBU) en condiciones estrictamente anhidras para eliminar el grupo protector S-(2-ciano-etilo). El grupo protector 6-O-(2,5- dicloro-fenilo) se eliminó luego desde el residuo de guanina por tratamiento con un oximato, y finalmente todos los grupos protectores acilo se eliminaron por amonolisis. La etapa de tratamiento con un oximato se puede omitir si el fosforotioato de oligonucleótido no contiene ningún residuo de 2'-desoxi- guanosina. Se obtuvo d[Gp(s)A] 13 (B = guanin-9-ilo, B' = adenin-9-ilo) extremadamente puro sin purificación adicional, y se aisló como su sal de sodio.

Preparación de 4-[(2-ciano-etil)sulfanil]morfolina 3,5-diona

El cloruro de S-(2-ciano-etil)isotiouronio se preparó de la siguiente manera. Se disolvió tiourea (304 g), con calentamiento, en ácido clorhídrico concentrado (500 ml). La resultante solución se evaporó bajo presión reducida y el material sólido incoloro residual se disolvió en etanol absoluto en ebullición (1.300 ml). La solución se enfrió a la temperatura ambiente y se añadió acrilonitrilo (400 cm^{3}) en porciones con agitación. Los reaccionantes se calentaron, a reflujo, durante 2 horas. Los productos enfriados se filtraron y el residuo se lavó con etanol frío y luego se secó en vacío sobre cloruro de calcio.

Luego se preparó el disulfuro de di-(2-ciano-etilo) de la siguiente manera. Se añadió diclorometano (400 ml) a una solución agitada de cloruro de S-(2-ciano- etil)isotiouronio (83,0 g) en agua (500 ml) a 0ºC (en un baño de hielo y agua). Se añadió tetrahidrato de perborato de sodio (44,1 g) y luego se añadió gota a gota una solución de hidróxido de sodio (30,0 g) en agua (250 ml). Los reaccionantes se mantuvieron a 0ºC (con un baño de hielo y agua). Después de 5 horas, los productos se separaron y la capa acuosa se extrajo con diclorometano (3 x 50 ml). Las capas orgánicas combinadas se secaron (sobre MgSO_{4}) y se evaporaron bajo presión reducida para dar un material sólido que se recristalizó a partir de metanol (30 ml) con el fin de dar cristales incoloros.

El disulfuro de di-(2-ciano-etilo) (4,51 g) y la morfolina-2,6-diona (5,75 g) se suspendieron en acetonitrilo (10 ml), diclorometano (20 ml) y 2,6-lutidina (17,4 ml) se enfriaron a 0ºC (con un baño de hielo y agua). Se añadió en el transcurso de 30 minutos una solución de bromo (4,28 g) en diclorometano (20 ml). La mezcla de reacción se dejó en agitación a 0ºC durante 1,5 horas. Luego el producto se precipitó mediante la adición de metanol enfriado por hielo (50 ml) durante 30 minutos y se filtró para dar el compuesto del título (8,23 g, 82 %). La recristalización a partir de acetato de etilo proporcionó 4-[(2-ciano-etil)sulfanil]-morfolina-3,5-diona en forma de agujas incoloras, de p.f. 121-122ºC.

Esquema de reacción para la preparación de oligonucleótidos quiméricos

La síntesis escalonada de d[TpGp(s)ApC] 25, que tiene un enlace internucleótido de diéster de fosforotioato y dos enlaces internucleótidos de fosfodiésteres, se ilustra en bosquejo a modo de ejemplo en el Esquema 3.

10

Esquema 3 Reactivos y condiciones

(i)

4 M HCl / dioxano, CH_{2}Cl_{2}, -50ºC, 5 min;

(ii)

18, C_{5}H_{5}N, CH_{2}Cl_{2}, -40ºC, 5-10 min;

(iii)

a, 21, C_{5}H_{5}N, CH_{2}Cl_{2}, -40ºC, 15 min, b, C_{5}H_{5}N - H_{2}O (1:1 v/v), desde -40ºC hasta la temperatura ambiente;

(iv)

a, 19, C_{5}H_{5}N, CH_{2}Cl_{2}, 40ºC, 15 min, b, C_{5}H_{5}N - H_{2}O (1:1 v/v), desde -40ºC hasta la temperatura ambiente;

(v)

Ac_{2}O, C_{5}H_{5}N, temperatura ambiente, 15 h;

(vi)

DBU, Me_{3}SiCl, CH_{2}Cl_{2}, temperatura ambiente, 30 min;

(vii)

20, DBU, MeCN, temperatura ambiente, 12 h;

(viii)

a, NH_{3} acuoso concentrado (d = 0,88), 50ºC, 15 h, b, Amberlite IR- 120 (plus) forma Na^{+}, H_{2}O.

No se prevé ninguna limitación de escala. No se pretende que las reacciones mostradas en el Esquema 3 sean limitativas y el método del invento es igualmente apropiado para la síntesis de secuencias de ARN, 2'-O-alquil-ARN y de otros oligonucleótidos.

Todas las reacciones implicadas se usaron anteriormente ya sea en la preparación de d[ApC] 11 (B = adenin-9-ilo, B' = citosin-1-ilo o de d[Gp(s)A] 13 (B = guanin-9-ilo, B' = adenin-9-ilo) (Esquema 2).

En primer lugar, el fosforotioato de dinucleósido totalmente protegido DMTr-Ap(s')C-Lev 10 (B = 14, B' = 15) [aproximadamente 0,75 mmol] se convirtió en cuatro etapas y con un rendimiento aislado global de 96% (Esquema 3a) en el trímero parcialmente protegido 23. En cada etapa de acoplamiento, se usó un exceso de aproximadamente 20% del monómero H-fosfonato 8, pero el exceso de agente de acoplamiento 18 dependía de la escala de la reacción. Además, se usó en este ejemplo un exceso doble de agente de transferencia de azufre 19 ó 21. Los productos fueron cromatografiados en gel de sílice después de cada etapa de ``destritilación''.

Este material se acopló luego con DMTr-Tp(H) 8 (B = 17) y el producto se convirtió en tres etapas con un rendimiento global de aproximadamente 93% (Esquema 3b) en el tetrámero totalmente protegido 24. Este último material fue desbloqueado para dar d[TpGp(s)ApC] 25 que fue aislado sin purificación adicional en forma de su sal de sodio relativamente pura (aproximadamente al 96,5% según HPLC).

El trifosfato de tetranucleósido d[TpGpApC] y el trifosforotioato de tetranucleósido d[Cp(s)Tp(s)Gp(s)A] se prepararon también mediante síntesis escalonada de una manera muy parecida. Los protocolos seguidos diferían del bosquejado en el Esquema 3 solamente mediante síntesis escalonada de una manera muy parecida. Los protocolos seguidos diferían del bosquejado en el Esquema 3 solamente en cuanto a que el agente de transferencia de azufre 19 se usó exclusivamente en la preparación de d[TpGpApC] y el agente de transferencia de azufre 21 se usó exclusivamente en la preparación de d[Cp(s)Tp(s)Gp(s)A].

Esquema de reacción para el acoplamiento en bloque

A manera de ilustración, el Esquema 4 presentado seguidamente ilustra un ejemplo de un acoplamiento en bloque que es parte del invento.

11

Esquema 4 Reactivos y condiciones

(i)

N_{2}H_{4}H_{2}O, C_{5}H_{5}N - AcOH (3:1 v/v), 0ºC, 20 min;

(ii)

a, 30, Me_{3}C-COCl, C_{5}H_{5}N, -35ºC, 30 min, b, Et_{3}N, H_{2}O;

(iii)

18 C_{5}H_{5}N, CH_{2}Cl_{2}, -35ºC;

(iv)

a, 21, C_{5}H_{5}N, CH_{2}Cl_{2}, -35ºC, 10 min, b, C_{5}H_{5}N -H_{2}O (1:1 v/v), desde -35ºC hasta la temperatura ambiente.

El heptafosforotioato de octadesoxinucleósido totalmente protegido 29, que se obtuvo con un rendimiento aislado de 91%, es un compuesto precursor de d[Tp(s)Tp(s)Gp(s)Gp(s)Gp(s)Gp(s)Tp(s)T]. Como antes se indica, un acoplamiento en bloque es mucho más factible en solución que en una síntesis en fase sólida.

Este enfoque, desde luego, no está limitado de ninguna manera al acoplamiento de tetrámeros. Desde luego, se prevé que este enfoque con H-fosfonato será apropiado para acoplar bloques de oligonucleótidos bastante grandes (por ejemplo, 10 + 10) entre ellos.

Esquema de reacción para la preparación de H-fosfonatos en bloque

Por ejemplo, oligonucleótidos parcialmente protegidos 33a y los correspondientes fosforotioatos 33b que se pueden preparar por el enfoque convencional aprobado de fosfotriésteres en solución (Chattopadhyaya, J.B.; Reese, C.B. Nucleic Acids Res., 1980, 8, 2039-2054; Kemal, O., Reese, C.B.; Serafinowska, H.T.J. Chem. Soc., Chem. Commun., 1983, 591-593), se pueden convertir similarmente en sus 3'-H-fosfonatos (34a y 34b, respectivamente) como se indica en el Esquema 5.

12

a, X = O, Ar = 2-ClC_{6}H_{4}; b, X = S, Ar = 2,5-Cl_{2}C_{6}H_{3}

Esquema 5 Reacciones y condiciones

(i) a, 30, Me_{3}C.COCl, C_{5}H_{5}N, -35ºC, b, Et_{3}N, H_{2}O.

Ejemplo 1 Ac-Tp(s)Tp(s)Gp(s)G-OH

El HO-Tp(s)Tp(s)Gp(s)G-Lev (5,82 g, 3 mmol) se evaporó conjuntamente con piridina anhidra (2 x 20 ml) y se volvió a disolver en piridina anhidra (30 ml). Se añadió anhídrido de ácido acético (1,42 ml, 15 mmol) y se dejó la solución de reacción en agitación a la temperatura ambiente durante 12 h. Se añadió agua (1,5 ml) para sofocar la reacción. Después de 10 min, la mezcla se enfrió a 0ºC (con un baño de hielo y agua) y se añadieron hidrato de hidrazina (1,50 g, 30 mmol) en piridina (15 ml) y ácido acético glacial (15 ml). La mezcla se agitó a 0ºC durante 20 min y luego se repartió entre agua (100 ml) y CH_{2}Cl_{2} (100 ml). Las dos capas se separaron y la capa orgánica se lavó con agua (3 x 50 ml). La capa orgánica se secó (sobre MgSO_{4}) y se evaporó. El residuo se purificó por cromatografía en gel de sílice. Las impurezas se eluyeron con una mezcla de metanol y diclorometano (4:96 v/v) y el producto principal se eluyó con acetona. La evaporación de las apropiadas fracciones dio el trifosforotioato de tetradesoxinucleósido parcialmente protegido en forma de un material sólido incoloro (5,30 g, 93%).

Ejemplo 2 Ac-Tp(s)Tp(s)Gp(s)Gp(H)

La sal de amonio del H-fosfonato de 4-metil-fenilo (1,42 g, 7,5 mmol) se disolvió en la mezcla de metanol (15 ml) y trietil-amina (2,1 ml, 15 mmol). La mezcla se evaporó y se evaporó conjuntamente con piridina (2 x 10 ml) bajo presión reducida. Se añadió Ac-Tp(s)Tp(s)Gp(s)G-OH (4,71 g, 2,5 mmol) y se evaporó conjuntamente con piridina seca (20 ml). El residuo se disolvió en piridina seca (20 ml) y se añadió cloruro de pivaloílo (1,23 ml, 10 mmol) a -35ºC en 1 min. Después de 30 min a la misma temperatura, se añadió agua (5 ml) y la mezcla se dejó calentar a la temperatura ambiente y agitar durante 1 h. La solución se repartió entre agua (100 ml) y diclorometano (100 ml). La capa orgánica se separó y se lavó con un tampón de fosfato de trietil-amonio (pH 7,0, 0,5 M, 3x50 ml), se secó (sobre MgSO_{4}) y luego se filtró y se aplicó a una columna de gel de sílice (aproximadamente 25 g). Las apropiadas fracciones, que fueron eluidas con una mezcla de metanol y diclorometano (20:80, v/v), se evaporaron para dar Ac-Tp(s)Tp(s)Gp(s)Gp(H), en forma de un material sólido incoloro (4,85 g, 94%).

Ejemplo 3 Ac-Tp(s)Tp(s)Gp(s)Gp(s)Gp(s)Gp(s)Tp(s)T-Bz

El Ac-Tp(s)Tp(s)Gp(s)Gp(H) (1,229 g, 0,6 mmol) y el HO-Gp(s)Gp(s)Tp(s)T-Bz (0,973 g, 0,5 mmol) se evaporaron conjuntamente con piridina anhidra (2 x 10 ml) y el residuo se disolvió en piridina anhidra (10 ml). La solución se enfrió a -35ºC (mezcla de esencia metilada industrial y un baño de hielo seco) y se añadió fosforocloridato de di-(2-cloro-fenilo) (0,84 g, 2,5 mmol) en diclorometano seco (1 ml) en el transcurso de 10 min. Se añadió 4-[(2-ciano- etil)sulfanil]morfolina-3,5-diona (0,20 g, 1,0 mmol) y la mezcla se dejó en agitación durante 10 min a la misma temperatura. Luego se añadió una mezcla de agua y piridina (0,2 ml, 1:1 v/v) y la mezcla se agitó durante 5 min adicionales. Luego, la mezcla de reacción se evaporó bajo presión reducida. El residuo se disolvió en diclorometano (100 ml) y la solución se lavó con una solución acuosa saturada de bicarbonato de sodio (3 x 50 ml). La capa orgánica se secó (sobre MgSO_{4}) y se concentró bajo presión reducida. El residuo se purificó por cromatografía en presencia de gel de sílice. En primer término, las impurezas lipófilas se eliminaron con una mezcla de metanol y diclorometano (4:96 v/v), y seguidamente el producto principal se eluyó con acetona. La evaporación de las apropiadas fracciones dio un heptafosforotioato de octadesoxinucleósido totalmente protegido en forma de un material sólido incoloro (1,81 g, 91%). El heptafosforotioato de octadesoxinucleósido totalmente protegido, que se había obtenido con un rendimiento aislado de 91%, es un compuesto precursor de d[Tp(s)Tp(s)Gp(s)Gp(s)Gp(s))Gp(s)Tp(s)T].

Claims (33)

1. Un procedimiento para la preparación de un triéster de fosforotioato, que comprende acoplar en fase de solución un H-fosfonato con un alcohol en la presencia de un agente de acoplamiento para formar de esta manera un diéster de H-fosfonato, y hacer reaccionar in situ el diéster de H-fosfonato con un agente de transferencia de azufre para producir un diéster de fosforotioato.

2. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el H-fosfonato es un nucleósido u oligonucleótido protegido que comprende una función de 3'-H-fosfonato.

3. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, en el que el alcohol es un nucleósido u oligonucleótido protegido que comprende una función de 5'-hidroxi libre.

4. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el agente de acoplamiento es un fosforocloridato de diarilo de fórmula (ArO)_{2}-POCl, en que Ar representa fenilo, 2-cloro-fenilo, 2,4,6-tricloro-fenilo o 2,4,6-tribromo- fenilo.

5. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el agente de transferencia de azufre tiene la fórmula química general:

L----S----A

en la que L representa un grupo lábil y A representa un grupo arilo, un grupo metilo, un grupo alquilo sustituido o un grupo alquenilo.

6. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 5, en el que el grupo lábil es un grupo de morfolina-3,5-diona, ftalimida, succinimida, maleimida o indazol, y A representa un grupo 4-halo-fenilo, un grupo 4-alquil-fenilo, un grupo metilo, un grupo bencilo, un grupo alquil-bencilo, un grupo halo-bencilo, un grupo alilo, un grupo crotilo, un grupo 2-ciano-etilo o un grupo 2-(4-nitro- fenil) etilo.

7. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el H-fosfonato y el alcohol se seleccionan entre el conjunto que consta de desoxirribonucleósidos, oligodesoxirribonucleótidos, ribonucleósidos, 2'-O-(alquil, alcoxialquil o alquenil)-ribonucleósidos, oligorribonucleótidos y 2'-O-(alquil, alcoxialquil o alquenil)- oligorribonucleótidos.

8. Un H-fosfonato que tiene la fórmula química general:

13

en la que

cada B independientemente es una base seleccionada entre A, G, T, C ó U;

cada Q independientemente es H ó OR' en que R' es alquilo, alquilo sustituido, alquenilo o un grupo protector;

cada R independientemente es un grupo arilo, metilo, alquilo sustituido o alquenilo;

W es H, un grupo protector o un grupo H-fosfonato de fórmula

14

en la que M^{+} es un catión monovalente;

cada X independientemente representa O ó S;

cada Y independientemente representa O ó S;

Z es H, un grupo protector o un grupo H-fosfonato de fórmula

15

en la que M^{+} es un catión monovalente; y

n es un número entero y es por lo menos 2;

con la condición de que cuando W es H o un grupo protector, Z ha de ser un grupo H-fosfonato, y de que cuando Z es H o un grupo protector, W ha de ser un grupo H-fosfonato.

9. Un H-fosfonato que tiene la fórmula química general:

16

en la que

B independientemente es una base seleccionada entre A, G, T, C ó U;

cada Q independientemente es H ó OR' en que R' es alquilo, alquilo sustituido, alquenilo o un grupo protector;

cada R independientemente es un grupo arilo, metilo, alquilo sustituido o alquenilo;

W es H, un grupo protector o un grupo H-fosfonato de fórmula

17

en la que M^{+} es un catión monovalente;

cada X independientemente representa O ó S;

cada Y representa S;

Z es H, un grupo protector o un grupo H-fosfonato de fórmula

18

en la que M^{+} es un catión monovalente; y

n es un número entero positivo;

con la condición de que cuando W es H o un grupo protector, Z ha de ser un grupo H-fosfonato, y de que cuando Z es H o un grupo protector, W ha de ser un grupo H-fosfonato.

10. Un H-fosfonato de acuerdo con la reivindicación 9, en el que W representa un grupo protector, cada X representa O y cada R representa un grupo metilo, un grupo bencilo, un grupo 2-ciano-etilo, un grupo fenilo sin sustituir o un grupo 4-halo-fenilo, M^{+} representa un ion de tri(alquil C_{1-4}- amonio) y n es de 1 a 16.

11. Un procedimiento para la producción de un H-fosfonato de oligonucleótido que comprende un grupo H-fosfonato terminal en 3' o terminal en 5', en el que un oligonucleótido que comprende una función de 3'- ó 5'-hidroxi libre se hace reaccionar ya sea:

a)

con una sal H-fosfonato de alquilo C_{1-4} en la que el grupo alquilo está sustituido con un grupo halo; o

b)

con una sal H-fosfonato de arilo sustituido o sin sustituir;

en la presencia de un activador.

12. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 11, en la que el oligonucleótido que comprende una función de 3'- ó 5'-hidroxi libre es un oligodesoxirribonucleótido u oligorribonucleótido protegido.

13. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 11 ó 12, en la que la sal H-fosfonato de alquilo o arilo es una sal de amonio de un H-fosfonato de fenilo, alquilfenilo o halofenilo.

14. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, en el que el activador es un fosforocloridato de arilo o un cloruro de ácido alquílico.

15. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 14, en el que el activador es cloruro de pivaloílo.

16. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 15, en el que la función de hidroxi libre es una función de 3'-hidroxi.

17. Un H-fosfonato de acuerdo con la reivindicación 8, en el que W representa un grupo protector, cada X representa O y cada R representa un grupo metilo, un grupo bencilo, un grupo 2-ciano-etilo, un grupo fenilo sin sustituir o un grupo 4-halo-fenilo, M^{+} representa un ion de tri(alquil C_{1-4})- amonio) y n es de 2 a 16.

18. Un H-fosfonato de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8 ó 17, en el que n es 2 ó 3.

19. Un H-fosfonato de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 9 ó 10, en el que n es 1, 2 ó 3.

20. Un procedimiento para la preparación de un oligonucleótido fosfodiéster desprotegido, un oligonucleótido fosforotioato desprotegido o un oligonucleótido desprotegido, que comprende enlaces internucleótidos tanto de fosfodiéster como de diéster de fosforotioato, que comprende:

a)

acoplar en una fase de solución un H-fosfonato de nucleósido u oligonucleótido protegido que comprende una función de 3'- ó 5'- H-fosfonato con un nucleósido u oligonucleótido protegido que comprende una función de 3'- ó 5'-hidroxi libre en la presencia de un agente de acoplamiento para formar de esta manera un diéster de H-fosfonato e, in situ, hacer reaccionar el diéster de H-fosfonato con un agente de transferencia de azufre para producir un triéster de fosforotioato; y

b)

desproteger el triéster de fosforotioato producido en a) para formar con ello un oligonucleótido fosfodiéster desprotegido, un oligonucleótido fosforotioato desprotegido o un oligonucleótido desprotegido, que comprende enlaces internucleótidos tanto de fosfodiéster como de diéster de fosforotioato.

21. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 20, en el que el H-fosfonato de nucleósido u oligonucleótido protegido comprende una función de 3'-H-fosfonato y el nucleósido u oligonucleótido protegido comprende una función de 5'-hidroxi libre.

22. Un procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 20 ó 21, en el que el agente de acoplamiento es un fosforocloridato de diarilo de fórmula (ArO)_{2}POCl, en el que Ar representa fenilo, 2-cloro-fenilo, 2,4,6- tricloro-fenilo o 2,4,6-tribromo-fenilo.

23. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 20 a 22, en el que el agente de transferencia de azufre tiene la fórmula química general:

L----S----A

en la que L representa un grupo lábil y A representa un grupo arilo, un grupo metilo, un grupo alquilo sustituido o un grupo alquenilo.

24. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 23, en el que elgrupo lábil es un grupo de morfolina-3,5-diona, ftalimida, succinimida, maleimida o indazol, y A representa: un grupo 4-halo-fenilo, un grupo 4-alquil-fenilo, un grupo metilo, un grupo bencilo, un grupo alquil-bencilo, un grupo halo-bencilo, un grupo alilo, un grupo crotilo, un grupo 2-ciano-etilo o un grupo 2-(4-nitro- fenil) etilo.

25. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 20 a 24, en el que se emplea un H-fosfonato de oligonucleótido y/o un oligonucleótido que comprende una función de 3'- ó 5'-hidroxi libre, y uno cualquiera o ambos entre el H-fosfonato de oligonucleótido y el oligonucleótido que comprende una función de 3'- ó 5'-hidroxi libre, comprende(n) uno o más enlaces internucleótidos de fosforotioatos.

26. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 20 a 25, en el que el oligonucleótido desprotegido es purificado subsiguientemente.

27. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 26, en el que el oligonucleótido desprotegido comprende uno o más enlaces de diéster de fosforotioato.

28. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 16, en el que el oligonucleótido que comprende un grupo hidroxi libre, comprende uno o más enlaces internucleótidos de fosforotioatos.

29. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 7, en el que el H-fosfonato que comprende una función de 3' H-fosfonato es un H-fosfonato de oligonucleótido protegido que comprende por lo menos un enlace internucleótidos de fosforotioato.

30. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 7, en el que el alcohol que comprende una función de 5'- hidroxi libre es un oligonucleótido que comprende por lo menos un enlace internucleótidos de fosforotioato.

31. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 30, en el que el H- fosfonato es un H-fosfonato de oligonucleótido protegido que comprende una función de 3' H-fosfonato y comprende también por lo menos un enlace internucleótidos de fosforotioato.

32. En un procedimiento mejorado para la síntesis de un oligonucleótido fosfodiéster desprotegido, un oligonucleótido fosforotioato desprotegido o un oligonucleótido desprotegido que comprende enlaces internucleótidos tanto de fosfodiéster como de diéster de fosforotioato, comprendiendo dicho procedimiento un procedimiento de ensamble en el que se ensambla un oligonucleótido triéster fosforotioato protegido, y un procedimiento de desprotección en el que se produce el oligonucleótido fosfodiéster desprotegido, el oligonucleótido fosforotioato desprotegido o un oligonucleótido desprotegido, que comprende enlaces internucleótidos tanto de fosfodiéster como de diéster de fosforotioato, la mejora según la que el procedimiento de ensamble comprende el acoplamiento en fase de solución de un H-fosfonato de nucleósido u oligonucleótido protegido que comprende una función de 3'- ó 5'-H-fosfonato, con un nucleósido u oligonucleótido protegido que comprende una función de 3'- ó 5'-hidroxi libre en la presencia de un agente de acoplamiento para formar de esta manera un diéster de H-fosfonato e, in situ, hacer reaccionar el diéster de H-fosfonato con un agente de transferencia de azufre para producir un triéster de fosforotioato.

33. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 32, en el que se purifica subsiguientemente el oligonucleótido fosfodiéster desprotegido, el oligonucleótido fosforotioato desprotegido o el oligonucleótido desprotegido que comprende enlaces internucleótidos tanto de fosfodiéster como de diéster de fosforotioato.