CN1231492C - 寡核苷酸的溶液相合成 - Google Patents
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Abstract
提供在溶液相中合成硫代磷酸三酯的方法。所述方法包括：在偶联剂存在下，使H-膦酸酯与醇进行溶液相偶联，形成H-膦酸二酯。用硫转移剂现场氧化所述H-膦酸二酯，产生硫代磷酸三酯。所述H-膦酸酯和醇最好是受保护的核苷或寡核苷酸。也提供可以用于形成硫代磷酸三酯的H-膦酸寡核苷酸。
Description
本发明提供基于H-膦酸酯偶联和现场硫转移、于低温下进行的在溶液中合成寡核苷酸和硫代磷酸寡核苷酸的方法。本发明还提供分步合成寡核苷酸和硫代磷酸寡核苷酸的方法(其中一次加入一个核苷残基)和区段合成(block synthesis)寡核苷酸和硫代磷酸寡核苷酸的方法(其中一次加入两个或两个以上的核苷酸残基)。
在过去的约15年中，在开发合成寡脱氧核糖核苷酸(DNA序列)和寡核糖核苷酸(RNA序列)及其类似物方面已经取得了许多进展‘Methods in Molecular Biology，第20卷，Protocol for Oligonucleotidesand Analogs’，Agrawal，S.编辑，Humana Press，Totowa，1993。其中许多工作在微摩尔或甚至更小的规模下进行，已经证明涉及单体亚磷酰胺结构单元的自动固相合成(Beaucage，S.L；Caruthers，M H TetrahedronLett.，1981，22，1859-1862)是最便利的方法。事实上，现在可以用市售的合成仪常规制备高分子量DNA序列和相对高分子量的RNA序列。这些合成的寡核苷酸已经满足了生物学或生物技术方面的许多决定性的需要。
根据Zamecnik和Stephenson的开创性发现，合成寡核苷酸可以选择性地抑制劳斯肉瘤病毒中的基因表达(Zamecnik，P.；Stephenson，M.Proc Ncal.Acad.Sci.USA 1978，75，280-284)，合成寡核苷酸或其类似物完全有可能于化疗中获得应用的想法在高校实验室和工业实验室中都已经引起了广泛注意。例如，在Gura，T.Science，1995，270，575-577的报道中已经强调了寡核苷酸及其硫代磷酸类似物在化疗方面的可能用途。所谓的反义和抗原的化疗方法(Oligonucleotides，AntisenseInhibitors of Gene Expression，Cohen，J.S.编辑，Macmillan，Basingstoke1989 Moser，H.F；Dervan，P.B Science 1987，238，645-649)已经深深地影响了对合成寡核苷酸的需求。对于分子生物学目的一般毫克量已经足够，而对于临床试验而言，需要量超过100克以上。作为潜在反义药物的几种寡核苷酸类似物现在正在后期的临床试验(advancedclinical trials)中。如果(在非常近的将来看来是可能的)比方说这些序列之一被准许用于治疗AIDS或一种形式的癌，则会需要公斤或更优选数公斤量的一种或多种特定序列。
在过去数年中，在扩大比例的寡核苷酸合成方面进行了大量的工作。实际上，所有这项工作均涉及建立越来越大的合成仪和在固相支持体上的相同的亚磷酰胺化学。在于溶液中合成寡核苷酸的磷酸三酯途径的方法学方面，本申请人不知道有任何最新的改进，于溶液中合成寡核苷酸使得它比固相合成更适于大规模和甚至中等规模的合成工作。
固相合成优于溶液合成的主要优点是：(i)快得多，(ii)偶联得率一般更高，(iii)易于自动化，和(iv)在序列方面完全灵活。因此，如果比方说组合目的需要相对少量的种类繁多的寡核苷酸序列，则固相合成特别有用。然而，如果已经鉴定出特定的中等大小的序列，并作为药物被批准，则需要公斤量，速度和灵活性变得相对不重要，而在溶液中合成可能是非常有利的。溶液合成也具有优于固相合成的优点，在于区段偶联(即一次加入两个或两个以上的核苷酸残基)更可行，规模扩大至任何水平都不大可能出现问题。增大反应容器的大小比制造越来越大的自动合成仪容易得多，并且肯定更便宜。
过去，在溶液中的寡核苷酸合成主要通过在20世纪70年代开发的常规的磷酸三酯途径进行(Reese，C.B.，Tetrahedron 1978，34，3143-3179；Kaplan，B.E.；Itakura，K.‘Synthesis and Applications of DNA andRNA’，Narang，S.A.编辑，Academic Press，Orlando，1987，第9-45页)。该方法也可以用于固相合成，但使用亚磷酰胺单体时偶联反应略快，且偶联得率略高。这就是自动固相合成主要基于使用亚磷酰胺结构单元的原因；它也许也是需要相对大量合成寡核苷酸的工作者决定试图扩大基于亚磷酰胺的固相合成规模的原因。
已经证明，磷酸三酯(Reese，Tetrahedron，1978)、亚磷酰胺(Beaucage，S.L.Methods in Molecular Biology，第20卷，Agrawal，S.编辑，Humana Press，Totowa，1993，第33-61页)和H-膦酸酯(Froehler，B.C.Methods in Molecular Biology，第20卷，Agrawal，S.编辑，Humana Press，Totowa，1993，第63-80页；也参见WO94/15946和Dreef，C.E.，Rec.Trav.Chim.Pays-Bas，1987，
106，第512页)这三种主要方法对于化学合成寡核苷酸是有效的。尽管磷酸三酯法已经最广泛地用于溶液合成，但在固相合成中已经几乎仅使用亚磷酰胺和H-膦酸酯法。
两种不同的合成策略已经应用于溶液中的磷酸三酯法。
也许在溶液中合成寡脱氧核糖核苷酸的最广泛使用的策略，涉及受保护核苷或寡核苷酸3’-(2-氯苯基)磷酸酯(Chattopadhyaya，J.B.；Reese，C.B.Mucleic Acids Res，1980，8，2039-2054)和具有游离5’羟基功能的受保护核苷或寡核苷酸之间的偶联反应，产生磷酸三酯。需要偶联剂，诸如1-(-2-磺酰基)-3-硝基-1，2，4-1H-三唑(MSNT)(Reese，C.B.；Titmas，R.C.；Yau，L.Trttrahedron Lett.；1978，2727-2730)。该策略也已经用于合成硫代磷酸酯类似物。然后以相同方式，在受保护的核苷或寡核苷酸3’-S-(2-氰基乙基或例如4-硝基苄基)硫代磷酸酯(Liu，X.；Reese，C.B.J.Chem.Soc.，Perkin Trans.l 1995，1685-1695)和具有游离5’-羟基功能的受保护核苷或寡核苷酸之间进行偶联。该常规磷酸三酯法的主要缺点是发生某些伴随的第二组分5’-磺化以及偶联反应一般进行得相对慢。所述磺化副反应导致得率较低和阻碍所需产物的纯化。
在溶液中合成寡脱氧核糖核苷酸的第二种策略，涉及使用由衍生自二氯化磷酸芳基(通常为2-氯苯基)酯的双官能试剂和两个分子当量的诸如1-羟基苯并三唑的添加剂(van der Marel等，Tetrahedron Lett.，1981，22，3887-3890)。在硫代磷酸寡核苷酸的制备中同样已经使用了一种衍生自二氯硫代磷酸(phosphorodichloridothioate)2，5-二氯苯基酯的相关双官能试剂(流程1b)(Kemal，O等，J.Chem.Soc.，Chem.Commun.，1983，591-593)。
第二种策略的主要缺点直接由于涉及双官能试剂所致。因此，存在形成对称偶联产物的可能性和存在少量水分可能导致偶联得率的显著降低。
本发明某些方面的一个目的是提供用于在溶液中合成寡核苷酸的一种新偶联方法，在许多实施方案中，(a)极其有效，并且不产生副反应，(b)进行得相对快，而(c)同样适于制备寡核苷酸、其硫代磷酸酯类似物和含磷酸二酯和硫代磷酸二酯核苷酸间键合的嵌合寡核苷酸。
根据本发明第一方面，提供制备硫代磷酸三酯的方法，包括在偶联剂的存在下H-膦酸酯与醇进行溶液相偶联，由此形成H-膦酸二酯，并且所述H-膦酸二酯与硫转移剂现场反应，产生硫代磷酸三酯。
本发明的另一方面提供了一种制备去除保护基的磷酸二酯寡核苷酸、去除保护基的硫代磷酸酯寡核苷酸或去除保护基的含磷酸二酯和硫代磷酸二酯核苷酸间键合的寡核苷酸的方法，该方法包括：
a)在偶联剂的存在下，使受保护的含3’-或5’-H-膦酸酯官能团的核苷或寡核苷酸H-膦酸酯与受保护的含游离3’-或5’-羟基官能团的核苷或寡核苷酸进行溶液相偶联，由此形成H-膦酸二酯，并且使所述H-膦酸二酯与硫转移剂现场反应，产生硫代磷酸三酯；和
b)去除在a)中制得的硫代磷酸三酯的保护基，由此形成去除保护基的磷酸二酯寡核苷酸、去除保护基的硫代磷酸酯寡核苷酸或去除保护基的含磷酸二酯和硫代磷酸二酯核苷酸间键合的寡核苷酸。
用于本发明方法的H-膦酸酯最好是受保护的核苷或寡核苷酸H-膦酸酯，优选包括5’或3’H-膦酸酯官能，特别优选3’H-膦酸酯官能。优选的核苷为2’-脱氧核糖核苷和核糖核苷；优选的寡核苷酸为寡脱氧核糖核苷酸和寡核糖核苷酸。
当H-膦酸酯结构单元为包含3’H-膦酸酯官能的受保护的脱氧核糖核苷、核糖核苷、寡脱氧核糖核苷酸或寡核糖核苷酸衍生物时，5’羟基官能最好被合适的保护基保护。这类合适的保护基的实例包括酸不稳定保护基，特别是三苯甲基和取代的三苯甲基，诸如二甲氧基三苯甲基和9-苯基呫吨-9-基；和碱不稳定保护基，诸如FMOC。
当H-膦酸酯结构单元为包含5’H-膦酸酯官能的受保护的脱氧核糖核苷、核糖核苷、寡脱氧核糖核苷酸或寡核糖核苷酸衍生物时，3’羟基官能最好被合适的保护基保护。合适的保护基包括以上公开的用于保护3’H-膦酸酯结构单元的5’羟基官能的那些保护基和酰基，诸如乙酰丙酰基和取代的乙酰丙酰基。
当所述H-膦酸酯为受保护的核糖核苷或受保护的寡核糖核苷酸时，所述2’羟基官能最好被合适保护基保护，所述保护基例如为酸不稳定缩醛保护基，特别是1-(2-氟苯基)-4-甲氧基哌啶-4-基(Fpmp)；和三烷基甲硅烷基，通常为三(C1-4-烷基)甲硅烷基，诸如叔丁基二甲基甲硅烷基。或者，所述核糖核苷或寡核糖核苷酸可以是2’-O-烷基、2’-O-烷氧基烷基或2’-链烯基衍生物，通常为C1-4-烷基、C1-4-烷氧基C1-4-烷基或链烯基衍生物，在这些情况下，2’-位不需要进一步保护。
可以用于按照本发明的方法的其它H-膦酸酯衍生自其它多官能醇，尤其是烷基醇，优选二醇或三醇。烷基二醇的实例包括乙-1，2-二醇和低分子量聚(乙二醇)，诸如分子量高至400的那些聚(乙二醇)。烷基三醇的实例包括甘油和丁三醇。通常，仅存在单个H-膦酸酯官能，其余的羟基用合适的保护基保护，所述保护基诸如以上公开的用于保护核糖核苷5’或2’位的那些保护基。
用于本发明方法的醇通常为包含游离羟基的受保护的核苷或寡核苷酸，所述游离羟基优选游离的3’或5’羟基，特别优选5’羟基。
当所述醇为受保护的核苷或受保护的寡核苷酸时，优选的核苷为脱氧核糖核苷和核糖核苷，优选的寡核苷酸为寡脱氧核糖核苷酸和寡核糖核苷酸。
当所述醇为包含游离5’羟基的脱氧核糖核苷、核糖核苷、寡脱氧核糖核苷酸或寡核糖核苷酸衍生物时，所述3’羟基官能最好被合适的保护基保护。这类保护基的实例包括酰基，通常包括多达16个碳原子的酰基，诸如衍生自γ酮酸的那些酰基，诸如乙酰丙酰基和取代的乙酰丙酰基。取代的乙酰丙酰基具体包括5-卤代-乙酰丙酰基，诸如5，5、5-三氟乙酰丙酰基和苯甲酰基丙酰基。其它这类保护基包括脂肪烷酰基，具体包括直链或支链C6-16-烷酰基，诸如月桂酰基；苯甲酰基和取代的苯甲酰基，诸如烷基(通常为C1-4烷基-)和卤代(通常为氯代或氟代)、取代的苯甲酰基；和甲硅烷基醚，诸如烷基(通常为C1-4烷基-)和芳基(通常为苯基)甲硅烷基醚，特别是叔丁基二甲基甲硅烷基和叔丁基二苯基甲硅烷基。
当所述醇为受保护的包含游离3’-羟基的脱氧核糖核苷、核糖核苷、寡脱氧核糖核苷酸或寡核糖核苷酸时，所述5’羟基官能最好被合适的保护基保护。合适的保护基为以上公开的用于保护脱氧核糖核苷、核糖核苷、寡脱氧核糖核苷酸和寡核糖核苷酸3’H膦酸酯的5’羟基的那些保护基。
当所述醇为核糖核苷或寡核糖核苷酸时，所述2’羟基官能最好被合适的保护基保护，所述保护基诸如缩醛，特别是1-(2-氟苯基)-4-甲氧基哌啶-4-基(Fpmp)；和三烷基甲硅烷基，通常为三(C1-4-烷基)甲硅烷基，诸如叔丁基二甲基甲硅烷基。或者，所述核糖核苷或寡核糖核苷酸可以是2’-O-烷基、2’-O-烷氧基烷基或2’-O-链烯基衍生物，通常为C1-4-烷基、C1-4-烷氧基C1-4-烷基或链烯基衍生物，在这些情况下，2’-位不需要进一步保护。
可以用于按照本发明的方法的其它醇为非糖多元醇，尤其是烷基多元醇，优选二醇或三醇。烷基二醇的实例包括乙-1，2-二醇和低分子量聚(乙二醇)，诸如分子量高至400的那些聚(乙二醇)。烷基三醇的实例包括甘油和丁三醇。通常，仅存在单个游离羟基，其余的羟基用合适的保护基保护，所述保护基诸如以上公开的用于保护核糖核苷5’或2’位的那些保护基。然而，如果需要在一个以上的羟基上进行相同的偶联，则可以存在一个以上的游离羟基。
当所述H-膦酸酯和所述醇均为受保护的核苷或寡核苷酸时，本发明提供基于H-膦酸酯偶联反应的、用于在溶液中分步合成和区段合成寡脱氧核糖核苷酸、寡核糖核苷酸及其类似物的改进方法。按照本发明的一个优选方面，具有3’末端H-膦酸酯官能的受保护核苷或寡核苷酸和具有5’末端羟基官能的受保护核苷或寡核苷酸在合适的偶联剂存在下偶联，形成受保护的二核苷或寡核苷酸H-膦酸酯中间体，其中所述中间体在合适的硫转移剂存在下进行现场硫转移。
除存在羟基保护基外，用于本发明的核苷/核苷酸中存在的碱基必要时也最好被合适的保护基保护。所用的保护基是本领域已知用于保护这类碱基的保护基。例如A和/或C可以用以下基团保护：苯甲酰基，所述苯甲酰基包括取代的苯甲酰基，例如烷基-或烷氧基-(通常为C1-4-烷基或C1-4-烷氧基)苯甲酰基；新戊酰基；和脒，特别是二烷基氨基亚甲基，优选二(C1-4-烷基)氨基亚甲基，诸如二甲基或二丁基氨基亚甲基。G可以用苯基保护，所述苯基包括取代的苯基，例如2，5-二氯苯基，也可以用异丁酰基保护。T和U一般不需要保护，但在某些实施方案中可能最好例如用苯基包括取代的苯基(例如2，4-二甲基苯基)于O4保护，或用新戊酰氧基甲基、苯甲酰基、烷基或烷氧基取代的苯甲酰基(诸如C1-4-烷基或C1-4-烷氧基苯甲酰基)于N3保护。
当所述醇和/或H-膦酸酯为具有受保护羟基的受保护核苷或寡核苷酸时，这些保护基之一可以在实施第一发明方法之后去除。通常，被去除的保护基为3’-羟基官能上的保护基。在所述保护基被去除后，可以将由此形成的寡核苷酸转化为H-膦酸酯，然后通过在所需寡核苷酸序列的合成中进一步分步或区段偶联和按照本发明方法的硫转移而进行。然后所述方法可以分步进行，以从所述核苷酸间键合、所述3’和5’羟基和所述碱基上去除所述保护基。可以应用相似的方法，以偶联5’H-膦酸酯，其中所去除的保护基为5’羟基官能上的保护基。
在一个具体的优选实施方案中，本发明提供一种方法，包括在合适的偶联剂存在下，将5’-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-脱氧核糖核苷3’-H-膦酸酯或受保护的寡脱氧核糖核苷酸3’-H-膦酸酯与具有游离5’羟基官能的一种组分偶联，随后在合适的硫转移剂存在下现场转移硫。
在本发明的方法中，可以使用现有技术可得到的任何合适的偶联剂和硫转移剂。
合适的偶联剂的实例包括烷基和芳基酰基氯、链烷和芳烷磺酰氯、氯甲酸烷基和芳基酯、氯亚硫酸烷基和芳基酯以及氯化磷酸烷基和芳基酯。
可以使用的合适的烷基酰基氯的实例包括C2-C7烷酰基氯，特别是新戊酰基氯。可以使用的芳基酰基氯的实例包括取代和未取代的苯甲酸烷基，诸如C1-4烷氧基、卤代(特别是氟代、氯代和溴代)和C1-4烷基取代的苯甲酰基氯。当被取代时，通常存在1-3个取代基，特别是在烷基和卤代取代基的情况下。
可以使用的合适的链烷磺酰氯的实例包括C2-C7烷磺酰氯。可以使用的芳基磺酰氯的实例包括取代和未取代的苯磺酰氯，诸如C1-4烷氧基、卤代(特别是氟代、氯代和溴代)和C1-4烷基取代的苯磺酰基氯。当被取代时，通常存在1-3个取代基，特别是在烷基和卤代取代基的情况下。
可以使用的合适的氯甲酸烷基酯的实例包括氯甲酸C2-C7烷基酯。可以使用的氯甲酸芳基酯的实例包括取代和未取代的苯基氯甲酸酯，诸如C1-4烷氧基、卤代(特别是氟代、氯代和溴代)和C1-4烷基取代的苯基氯甲酸酯。当被取代时，通常存在1-3个取代基，特别是在烷基和卤代取代基的情况下。
可以使用的合适的氯亚硫酸烷基酯的实例包括氯亚硫酸C2-C7烷基酯。可以使用的氯亚硫酸芳基酯的实例包括取代和未取代的苯基氯亚硫酸酯，诸如C1-4烷氧基、卤代(特别是氟代、氯代和溴代)和C1-4烷基取代的苯基氯亚硫酸酯。当被取代时，通常存在1-3个取代基，特别是在烷基和卤代取代基的情况下。
可以使用的合适的氯化磷酸烷基酯的实例包括氯化磷酸二(C1-C6烷基)酯。可以使用的氯化磷酸芳基酯的实例包括取代和未取代的二苯基氯化磷酸酯，诸如C1-4烷氧基、卤代(特别是氟代、氯代和溴代)和C1-4烷基取代的二苯基氯化磷酸酯。当被取代时，通常存在1-3个取代基，特别是在烷基和卤代取代基的情况下。
可以使用的其它偶联剂为Wada等在J.A.C.S.1997，119，第12710-12721页(该文献通过引用结合到本文中)中公开的氯代、溴代和(苯并三唑-1-基氧基)-鏻和碳鎓化合物。
优选的偶联剂为氯化磷酸二芳基酯，特别是具有式(ArO)2POCl的那些偶联剂，其中Ar最好为苯基、2-氯苯基、2，4，6-三氯苯基或2，4，6-三溴苯基。
所述硫转移剂的性质取决于需要寡核苷酸、硫代磷酸酯类似物还是需要混合寡核苷酸/硫代磷酸寡核苷酸。用于本发明方法的硫转移剂通常具有以下化学通式：
L--------S-------A
其中L代表离去基团，而A代表芳基、甲基或取代的烷基或链烯基。通常，选择所述离去基团，以便包含一个氮-硫键。合适的离去基团的实例包括吗啉，诸如吗啉-3，5-二酮；二酰亚胺，诸如苯邻二甲酰亚胺、琥珀酰亚胺和马来酰亚胺；吲唑，特别是具有吸电子取代基的吲唑，诸如4-硝基吲唑；和三唑。
当在终产物所述硫转移剂中需要标准的磷酸二酯键时，部分A代表芳基，诸如苯基或萘基。合适芳基的实例包括取代的和未取代的苯基，特别是卤代苯基和烷基苯基，尤其是4-卤代苯基和4-烷基苯基，通常为4-(C1-4烷基)苯基，最优选为4-氯苯基和对甲苯基。一类合适的标准磷酸二酯定向硫转移剂的实例为N-(芳基硫烷基)苯邻二甲酰亚胺(也可以使用琥珀酰亚胺或其它二酰亚胺)。
当在终产物中需要硫代磷酸二酯键时，部分A代表甲基、取代的烷基或链烯基。合适的取代烷基的实例包括取代的甲基，特别是苄基和取代的苄基，诸如烷基-(通常为C1-4烷基-)和卤代-(通常为氯代-)取代的苄基；和取代的乙基，尤其是于2位用吸电子取代基(诸如2-(4-硝基苯基)乙基和2-氰基乙基)取代的乙基。合适的链烯基的实例为烯丙基和巴豆基。一类合适的硫代磷酸酯定向硫转移剂的实例为例如(2-氰基乙基)硫烷基衍生物，诸如4-[(2-氰基乙基)-硫烷基]吗啉-3，5-二酮或相应的试剂，诸如3-(邻苯二甲酰亚氨基硫烷基)丙腈。
进行偶联反应和硫转移的合适温度范围为约-55℃至室温(范围通常为10-30℃，例如约20℃)，最好为-40℃至0℃。
可以用于本发明方法的有机溶剂包括卤代链烷(特别是二氯甲烷)、酯(特别是烷基酯，诸如乙酸乙酯以及丙酸甲酯或乙酯)和碱性亲核溶剂(诸如吡啶)。用于偶联和硫转移步骤的优选溶剂为吡啶、二氯甲烷和它们的混合物。
本发明方法中H-膦酸酯与醇的摩尔比通常选择在约0.9∶1至3∶1的范围内，通常为约1∶1至约2∶1，最好为约1.1∶1至约1.5∶1，诸如约1.2∶1。然而，当同时在一个以上游离羟基上发生偶联时，所述摩尔比按比例增加。偶联剂与醇的摩尔比通常选择在约1∶1至约10∶1的范围内，通常为约1.5∶1至约5∶1，最好为约2∶1至约3∶1。硫转移剂与醇的摩尔比通常选择在约1∶1至约10∶1的范围内，通常为约1.5∶1至约5∶1，最好为约2∶1至约3∶1。
在本发明方法中，所述H-膦酸酯和所述醇可以在溶液中预混合，然后将偶联剂加入该混合物中。或者，可以将H-膦酸酯和偶联剂通常在溶液中预混合，然后加入所述醇溶液中，或通常在溶液中将所述醇和偶联剂混合，然后加入H-膦酸酯溶液中。在某些实施方案中，可以将可任选地为溶液形式的H-膦酸酯加至包含所述醇和偶联剂的混合物的溶液中。在偶联反应基本完成后，则将硫转移剂加至在偶联反应中产生的H-膦酸二酯溶液中。试剂的加入通常在加入期间内连续或递增进行。
在本发明的方法中，特别是当该方法以分步方式进行时，通过选择合适的硫转移剂，制备在同一分子中含磷酸二酯和硫代磷酸二酯核苷酸间键合的寡核苷酸是可能的。
如前所述，本发明方法可以用于合成RNA、2’-O-烷基-RNA、2’-O-烷氧基烷基-RNA和2’-O-链烯基-RNA序列。例如由相应的核苷结构单元H-膦酸对甲酚酯铵和新戊酰基氯，可以制备2’-O-(Fpmp)-5’-O-(4，4-二甲氧基三苯甲基)-核糖核苷3’-H-膦酸酯1和2’-O-(烷基、烷氧基烷基或链烯基)-5’-O-(4，4-二甲氧基三苯甲基)-核糖核苷3’-H-膦酸酯2a-c。
Et3N+H 1 2 a：R＝Me
b：R＝CH2＝CHCH2
c：R＝MeOCH2CH2
相同的方案可用于合成DNA和DNA硫代磷酸酯序列(流程2-4)。按照所述标准的去封闭方法(流程2，步骤v和vi)，Fpmp保护基在酸解的温和条件下去除，导致无可检测的所述核苷酸间键合的切割或迁移(Capaldi，D.C.；Reese，C.B.Nucleic Acids Res.1994，22，2209-2216)。对于化疗有用的核酶序列，在溶液中相对大规模的RNA合成是一件值得考虑
实际重要性的事情。2’-O-烷基、2’-O-取代的烷基和2’-O-链烯基[尤其是2’-O-甲基、2’-O-烯丙基和2’-O-(2-甲氧基乙基)]-核糖核苷(Sproat，B.S.‘Methods in Molecular Biology，第20卷，Protocols for Oligonucleotides and Analogs’，Agrawal，S.编辑，HmmanaPress，Totowa，1993)掺入寡核苷酸中，目前是更重要的一件事情，因为这些修饰赋予所得寡聚物对核酸酶消化的抗性和良好的杂交特性。
在H-膦酸酯偶联产物中现场进行硫转移步骤，即不进行分离和纯化通过偶联反应产生的中间体。最好是，将硫转移剂加至由偶联反应产生的搅拌混合物中。
除在均相溶液中进行的事实外，本发明的偶联方法在至少两个其它重要方面不同于按照固相合成的H-膦酸酯途径的偶联方法(Froehler等，Methods in Molecular Biology，1993)。首先，它可以在非常低的温度下进行。由此甚至当不用新戊酰基氯(Froehler，B.C.；Matteucci，M.D.Tetrahedron Lett.，1986，27，469-472)而用二氯化磷酸二-(2-氯苯基)酯作为偶联试剂时，仍可以避免可能伴随H-膦酸酯偶联的副反应(Kuyl-Ysheskiely等，Rec.Trav.Chim.，1986，105，505-506)。其次，不是仅在装配完整的寡聚物序列后进行一次硫转移，而是在每个偶联步骤后均进行硫转移。
可以用本领域已知用于特定保护基和官能的方法，去除保护基。例如，通过用肼(例如缓冲的肼)处理，诸如在van Boom，J.H.；Burgers，P.M.J.Tetrahedron Lett.，1976，4875-4878中公开的非常温和的条件下用肼处理，可以去除瞬时保护基，特别是γ酮酸(诸如乙酰丙酰基型保护基)。然后，所得的部分保护的具有游离3’羟基官能的寡核苷酸，可以转化为相应的H-膦酸酯，它们为可以用于区段合成寡核苷酸及其硫代磷酸酯类似物的中间体。
当一旦将已经产生的所需产物去保护时，通常首先去除在产生硫代磷酸三酯键的磷上的保护基。例如，通过用强碱性胺(诸如DABCO、1，5-二氮杂双环[4.3.0]壬-5-烯(DBN)、1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯(DBU)或三乙胺处理，可以去除氰基乙基。
通过肟盐处理，例如用醛肟的共轭碱优选E-2-硝基苯甲醛肟或吡啶-2-甲醛肟的共轭碱处理，可以去除硫代磷酸酯核苷酸间键合上和碱基残基上的苯基和取代苯基(Reese等，Nucleic Acids Res.1981)。Kamimura，T.等，J.Am.Chem.Soc.，1984，106，4552-4557和Sekine，M.等，Tetrahedron，1985，41，5279-5288在基于硫代磷酸S-苯酯中间体的通过在溶液中的磷酸三酯途径合成寡核苷酸方法方面；和van Boom及其同事在基于硫代磷酸S-(4-甲基苯基)酯中间体的寡核苷酸合成方法(Wreesman，C.T.J.等在 Tetrahedron Lett.，1985，26，933-936)方面，都已经全部证明了，用肟盐离子处理将S-苯基硫代磷酸酯去封闭(采用Reese等，1978；Reese，C.B.；Zard，L.Nucleic Acids Res.，1981，9，4611-4626的方法)产生天然的磷酸二酯核苷酸间键合。在本发明中，用E-2-硝基苯甲醛肟的共轭碱将S-(4-氯苯基)保护的硫代磷酸酯去封闭可进行得很顺利，没有可检测的核苷酸间切割。
用浓氨水处理，可以去除其它的碱基保护基，例如苯甲酰基、新戊酰基和脒基。
通过用酸处理，可以去除存在的三苯甲基。对于寡脱氧核糖核苷酸合成的总的去封闭策略，本发明的另一重要考虑是：三苯甲基(通常为5’-末端DMTr)保护基的去除(“脱三苯甲基”)应该不伴随脱嘌呤，尤其是任何6-N-酰基-2’-脱氧腺苷残基的脱嘌呤。按照本发明的一个实施方案，本发明人已经发现，这种脱嘌呤在固相合成中也许是难以完全避免，但通过于低温下用氯化氢稀溶液(具体为约0.45M盐酸的二恶烷-二氯甲烷(1∶8 v/v)溶液，于-50℃)进行“脱三苯甲基”，可以完全抑制这种脱嘌呤。在这些反应条件下，“脱三苯甲基”可以快速完成，在某些情况下在5分钟或更短的时间后完成。例如，当在这种条件下用氯化氢的二恶烷-二氯甲烷溶液处理6-N-苯甲酰基-5’-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-脱氧腺苷时，2分钟后完成“脱三苯甲基”，但甚至在4小时后也未检测到脱嘌呤。
通过例如用氟化四烷基铵盐(诸如氟化四丁基铵)溶液进行氟化物处理，可以去除甲硅烷基保护基。
通过在温和条件下进行酸水解，可以去除Fpmp保护基。
这种在溶液中合成寡核苷酸的新方法适用于制备以下序列：(a)仅有磷酸二酯核苷酸间键合的序列，(b)仅有硫代磷酸二酯核苷酸间键合的序列，和(c)具有磷酸二酯和硫代磷酸二酯核苷酸间键合组合的序列。
本发明也涉及区段偶联(如流程4b中的实施例所描述的)的开发。在该方面，所述实施例提供由四聚物区段合成一种七硫代磷酸八脱氧核糖核苷d[Tp(s)Tp(s)Gp(s)Gp(s)Gp(s)Gp(s)Tp(s)T]的描述(ISIS 5320Ravikuma，V.T.；Cherovallath，Z.S.Nucleosides & Nucleosides 1996.15，1149-1155)。这种寡核苷酸类似物具有作为抗HIV药剂的特性。提出的其它区段合成靶包括具有治疗效应的序列，例如人凝血酶的抑制剂和一种抗HIV药剂。此外，本发明的方法可以用于合成较大的序列。
显然，当本发明方法用于区段合成时，得到所需产物的途径方面可利用许多替代的策略。这些将取决于所需产物的性质。例如，通过制备二聚物，偶联产生四聚物，然后将其偶联产生所需的八聚物，可以制备八聚物。或者，可以将二聚物和三聚物偶联，产生五聚物，可以将五聚物与三聚物进一步偶联产生所需的八聚物。由用户进行策略的选择。然而，这种区段偶联的共同特征是包含两个或两个以上单位的H-膦酸寡聚物与也包含两个或两个以上单位的寡聚物醇偶联。使最常用的3’-H-膦酸寡核苷酸与具有游离5’羟基官能的寡核苷酸偶联。
本发明的方法也可以用来制备环状寡核苷酸，尤其是环状寡脱氧核糖核苷酸和环状核糖核苷酸。在环状寡核苷酸的制备中，制备包含一个H-膦酸酯官能(通常为3’或5’H-膦酸酯)的寡核苷酸，并通过合适的去保护引入游离羟基官能。通常选择所述游离羟基官能的位置对应于所述H-膦酸酯，例如5’羟基官能应该与3’H-膦酸酯偶联，而3’羟基官能应该与5’H-膦酸酯偶联。然后，在偶联剂的存在下，所述羟基和所述H-膦酸酯官能可以在溶液中进行分子内偶联，通过现场硫转移进行该反应。
按照本发明的再一方面，提供具有以下化学通式的新的H-膦酸寡聚物：
其中
每个B独立地为选自A、G、T、C或U的碱基；
每个Q独立地为H或OR’，其中R’为烷基、取代的烷基、链烯基或保护基；
每个R独立地为芳基、甲基、取代的烷基或链烯基；
W为H、保护基或下式的H-膦酸酯基团：
其中M+为单价阳离子；
每个X独立地代表O或S；
每个Y独立地代表O或S；
Z为H、保护基或下式的H-膦酸酯基团：
其中M+为单价阳离子；而
n为整数，且至少为2；
前提为：当W为H或保护基时，Z为H-膦酸酯基团，而当Z为H或保护基时，W为H-膦酸酯基团。
也提供具有以下化学通式的新H-膦酸寡聚物：
其中
每个B独立地为选自A、G、T、C或U的碱基；
每个Q独立地为H或OR’，其中R’为烷基、取代的烷基、链烯基或保护基；
每个R独立地为芳基、甲基、取代的烷基或链烯基；
W为H、保护基或下式的H-膦酸酯基团：
其中M+为单价阳离子；
每个X独立地代表O或S；
每个Y代表S；
Z为H、保护基或下式的H-膦酸酯基团：
其中M+为单价阳离子；而
n为正整数；
前提为：当W为H或保护基时，Z为H-膦酸酯基团，而当Z为H或保护基时，W为H-膦酸酯基团。
最好是，仅W或Z之一为H-膦酸酯基团，通常仅Z为H-膦酸酯基团。
当W或Z代表保护基时，所述保护基可以是以上公开的分别用于保护3’位或5’位的那些保护基。当W为保护基时，所述保护基为三苯甲基，特别是二甲氧基三苯甲基。当Z为保护基时，所述保护基为三苯甲基，特别是二甲氧基三甲基或酰基，最好是乙酰丙酰基。
最好保护由B代表的碱基A、G和C，可以保护碱基T和U。合适的保护基包括上文公开的在按照本发明第一方面的方法中用于保护碱基的那些保护基。
当Q代表基团OR’，而R’为链烯基时，所述链烯基通常为C1-4链烯基，尤其是烯丙基或巴豆基。当R’代表烷基时，所述烷基最好为C1-4烷基。当R’代表取代的烷基时，所述取代的烷基包括烷氧基烷基，尤其是C1-4烷氧基C1-4烷基，诸如甲氧基乙基。当R’代表保护基时，所述保护基通常为酸不稳定缩醛保护基，特别是1-(2-氟苯基)-4-甲氧基哌啶-4-基(Fpmp)或三烷基甲硅烷基，通常为三(C1-4-烷基)甲硅烷基，诸如叔丁基二甲基甲硅烷基。
最好是，X代表O。
在许多实施方案中，Y代表S，而每个R代表由本发明方法中所用的硫转移剂中保留的甲基、取代的烷基、链烯基或芳基。最好，每个R独立地代表甲基；取代的甲基，特别是苄基或取代的苄基，诸如烷基-(通常为C1-4烷基-)或卤代-(通常为氯代-)取代的苄基；取代的乙基，尤其是于2位用吸电子取代基取代的乙基，诸如2-(4-硝基苯基)乙基或2-氰基乙基；C1-4链烯基，最好是烯丙基和巴豆基；或取代或未取代的苯基，特别是卤代苯基或烷基苯基，尤其是4-卤代苯基或4-烷基苯基，通常为4-(C1-4烷基)苯基，最优选为4-氯苯基或对甲苯基。
M+最好代表三烷基铵离子，诸如三(C1-4-烷基铵)离子，优选三乙铵离子。
根据计划合成的寡核苷酸，n可以是1至任何数目，特别是1-约20。n最好是1-16，尤其是1-9。当希望加入小区段的核苷酸时，可以使用其中n代表1、2或3的H-膦酸酯，而如果需要偶联较大区段的寡核苷酸，则可以使用相对较大的n值，例如5、6或7或更大。
按照本发明的H-膦酸酯通常为溶液形式，最好是在本发明第一方面方法中所用的那些溶液形式。
这些H-膦酸酯在区段合成寡核苷酸和硫代磷酸寡核苷酸中也是有用的中间体。如上所述，区段偶联在溶液相中比在固相合成中更加可行。
采用本领域已知的用于合成H-膦酸核苷的通用方法，可以制备所述H-膦酸寡核苷酸。因此，在本发明的再一方面，提供用于产生一种H-膦酸寡核苷酸的方法，其中在活化剂的存在下，使包含一个游离羟基官能(最好是3’或5’羟基官能)的寡核苷酸与H-膦酸烷基酯盐或芳基酯盐反应。
最好是，所述寡核苷酸是受保护的寡核苷酸，最优选为受保护的寡脱氧核苷酸或受保护的寡核糖核苷酸。所述H-膦酸酯盐通常为铵盐，包括烷基、芳基和混合烷基和芳基铵盐。所述铵盐最好是(NH4)+或三(C1-4烷基)铵盐。可以在所述H-膦酸酯中存在的烷基的实例为C1-4烷基，尤其是用强吸电子基团(特别是卤代基团，优选氟代基团)取代的C2-4烷基，诸如2，2，2-三氟乙基和1，1，1，3，3，3-六氟丙-2-基。可以存在的芳基的实例包括苯基和取代的苯基，特别是烷基苯基(通常为C1-4烷基苯基)和卤代苯基(通常为氯苯基)。取代的苯基最好是4-取代的苯基。特别优选的H-膦酸酯是H-膦酸对甲酚酯铵和H-膦酸对甲酚酯三乙铵。可以使用的活化剂包括本文公开的用作偶联剂的那些化合物，特别是氯化磷酸二芳基酯以及烷基和环烷基酰基氯，诸如1-金刚烷甲酰基氯，最好是新戊酰基氯。H-膦酸酯的产生最好在溶剂存在下进行，所述溶剂通常为公开用于本发明第一方面方法的那些溶剂，最好是吡啶、二氯甲烷和它们的混合物。
本发明在合成仅硫代磷酸二酯方面的一个优点是：只要在去封闭步骤[特别是在与氨水一起加热期间(例如流程3的步骤viii(a))]小心避免脱硫，则硫代磷酸寡核苷酸的合成应该不产生标准磷酸二酯核苷酸间键合伴随的产物。在固相硫代磷酸寡核苷酸合成中，在每个合成循环中的不完全硫转移通常导致残留的磷酸二酯污染(Zon，G.；Stec，W.J.‘Oligonucleotides and Analogs，APractical Approach；Eckstein，F.，编辑，IRL Press，Oxford 1991，第87-108页)。
本发明提出的溶液合成优于固相合成的另一巨大的优点是：通过于低温或甚至非常低的温度下进行处理，存在控制反应选择性的可能性。这一优点扩展至脱三苯甲基步骤(流程3的步骤i)，该步骤在0℃以下快速定量地进行，且无可检测的脱嘌呤。在脱三苯甲基步骤后，通过先前作为“过滤”方法描述的方法(Chaudhuri，B.；Reese，C.B.；Weclawek，K.Tetrahedron Lett.1984，25，4037-4040)，可以进行相对快且有效的纯化。这取决于这样一个事实：用THF-吡啶混合物从硅胶短柱非常快地洗脱下磷酸三酯(和硫代磷酸三酯)中间体，而不是任何残留的脱三苯甲基带电单体。
现在参照以下实施例描述按照本发明的方法，所述实施例不是限制性的。
在所述实施例中，应该注意到，当核苷残基和核苷酸间键合为斜体时，表示它们以某种方式被保护。在本文中，A、C、G和T代表于N-6用苯甲酰基保护的2’-脱氧腺苷、于N-4用苯甲酰基保护的2’-脱氧胞苷、于N-2和O-6用异丁酰基和2，5-二氯苯基保护的的2’-脱氧鸟苷和未保护的胸腺嘧啶。例如，如流程3所示，p(s)和p(s’)分别代表S-(2-氰基乙基)和S-(4-氯苯基)硫代磷酸酯，而p(H)为未保护的，因此不是斜体，如果将其置于序列末端或连接至单体，则代表H-膦酸单酯，而在其它情况下它代表H-膦酸二酯。
实施例
制备磷酸二核苷的反应流程
具体关于磷酸二核苷的制备，流程2更详细地描述了用于制备寡脱氧核糖核苷酸及其硫代磷酸酯类似物的本发明方法。
流程2
试剂和条件：
(i)18，C5H5N，CH2Cl2，-40℃，5-10min；
(ii)19，C5H5N，CH2Cl2，-40℃，15min，b，C5H5N-H2O(1∶1 v/v)，-40℃至室温
(iii)4M HCl/二恶烷，CH2Cl2，-50℃，5min；
(iv)Ac2O，C5H5N，室温，15h；
(v)20，TMG，MeCN，室温，12h；
(vi)a，浓氨水(d 0.88)，50℃，15h，b，Amberlite IR-120(plus)，Na+形式，H2O；
(vii)a，21，C5H5N，CH2Cl2，-40℃，5-10min，b，C5H5N-H2O(1∶1 v/v)，-40℃至室温；
(viii)DBU，Me3SiCl，CH2Cl2，室温，30min；
(ix)20，DBU，MeCN，室温，12h。
从流程2，通过中间体8、9、10和11进行寡核苷酸的合成，而通过中间体8、9、12和13进行硫代磷酸酯类似物的制备。碱基14、15和16对应于受保护的腺嘌呤、受保护的胞嘧啶和受保护的鸟嘌呤。碱基17对应于不需要保护的胸腺嘧啶。可以使用任何常规使用的保护基。在RNA的合成中，胸腺嘧啶将被尿嘧啶取代。化合物18为合适的偶联剂，而化合物19和21为合适的硫转移剂。下文更全面地涉及这些化合物。
在流程2中描述的按照本发明的偶联方法中需要的单体结构单元是5’-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-脱氧核糖核苷3’-H-膦酸酯三乙铵8(碱基B和B’＝14-17)，它们可以用最近报道的方法(Ozola，V.，Reese，C.B.，Song Q.Tetrahedron Lett.，1996，37，8621-8624)以几乎定量的产量由相应的受保护核苷衍生物容易地制备。作为说明，如下制备5’-O-(二甲氧基三苯甲基)-2’-脱氧核糖核苷3’-H-膦酸酯三乙铵8：将H-膦酸4-甲基苯酯铵30(2.84g，15.0mmol)、5’-O-(二甲氧基三苯甲基)-2’-脱氧核糖核苷衍生物(5.0mmol)、三乙胺(4.2ml，30mmol)和无水吡啶(20ml)一起减压蒸发。将残余物与无水吡啶(20ml)再次共蒸发。将残余物溶于无水吡啶(40ml)中，将溶液冷却至-35℃(工业甲醇变性酒精/干冰浴)。将新戊酰基氯(1.85ml，15.0mmol)在1min内滴加至搅拌的溶液中，将反应物于-35℃保持。30min后，加入水(5ml)，让搅拌的混合物温至室温。将磷酸钾缓冲液(1.0mol dm-3，ph7.0，250ml)加入产物中，将所得的混合物减压浓缩，直至去除所有的吡啶。将残留的混合物分配于二氯甲烷(250ml)和水(200ml)之间。有机层用磷酸三乙铵缓冲液(0.5mol dm-3，pH7.0，3×50ml)洗涤，干燥(MgSO4)，然后减压蒸发。残余物经硅胶(25g)短柱层析分级分离。用二氯甲烷-甲醇(95∶5至90∶10v/v)洗脱合适的流分后，蒸发得到(5’-O-(二甲氧基三苯甲基)-2’-脱氧核糖核苷3’-H-膦酸酯8。
当让6-N-苯甲酰基-5’-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-脱氧腺苷3’-H-膦酸酯三乙铵(DMTr-Ap(H))(Ozola等，Tetrahedron，1996)、8(B-14)、4-N-苯甲酰基-3’-O-乙酰丙酰基-2’-脱氧胞嘧啶(HO-C-Lev)9(B’＝15)和氯化磷酸二(2-氯苯基)酯18一起在吡啶-二氯甲烷溶液中于-40℃反应时，在5-10分钟内显然获得大量的相应的全保护H-膦酸二核苷(DMTr-Ap(H)C-Lev)。用于该具体实施例中的方案是在5分钟内，将氯化磷酸二(2-氯苯基)酯(2.03g，6.0mmol)的二氯甲烷(4ml)溶液滴加至搅拌的DMTr-Ap(H)8(B＝14)三乙铵盐(3.95g，约4.8mmol)和4-N-苯甲酰基-3’-O-乙酰丙酰基-2’-脱氧胞嘧啶9(B’＝15)(1.72g，4.0mmol)的吡啶(36ml)无水溶液中，于-40℃(工业甲醇变性酒精+干冰浴)保持。再过5分钟后，推定为DMTr-Ap(H)C-Lev的唯一的一种核苷酸产物和某些残留的H-膦酸酯单体8(B＝14)可以通过反向HPLC检测。然而，应该注意到，这些反应条件可以适当变化。
特别注意到，仅约20％过量的H-膦酸酯单体可达到这种高偶联效率。没有尝试分离中间体H-膦酸二核苷(DMTr-Ap(H)C-Lev)。
将N-[(4-氯苯基)硫烷基]苯邻二甲酰亚胺19(2.32g，8.0mmol)(Behforouz，M.；Kerwood，J.E.J.Org Chem，1969，34，51-55)加入搅拌的反应物中，将其于-40℃保持。15分钟后，处理产物，进行硅胶层析，得到相应的硫代磷酸S-(4-氯苯基)二核苷DMTr-Ap(s’)C-Lev 10(B＝14，B’＝15)，分离得率约99％。因此，于-40℃下，偶联步骤和硫转移步骤均进行得相对快，且实际上定量进行。
DMTr-Ap(s′)C-Lev 10(B＝14，B’＝15)去封闭的四步骤方法最好包括“脱三苯甲基”、5’-末端羟基官能的乙酰化、肟盐处理和最后的用浓氨水处理，以从所述碱基残基和从所述3’-和5’-末端羟基官能去除酰基保护基。以该方法，获得极纯的d[ApC]11(B＝腺嘌呤-9-基，B’＝胞嘧啶-1-基)，而不用进一步纯化，将其作为其钠盐分离。使单体结构单元8(B＝17)和9(B’＝16)以相同方式和相同规模偶联在一起。用N-[(4-氯苯基)硫烷基]苯邻二甲酰亚胺19进行硫转移后，分离出全保护的硫代磷酸二核苷DMTr-Tp(s’)G-Lev 10(B＝17，B’＝16)，得率约98％。此外，当用上述方法(流程2，步骤iii-vi)将该物质去封闭时，获得非常纯的d[TpG]11(B＝胸腺嘧啶-1-基，B’＝鸟嘌呤-9-基)。
用于制备全保护的硫代磷酸寡核苷酸的方案与用于寡核苷酸合成的方案的不同之处，仅在于用4-[(2-氰基乙基)硫烷基]吗啉-3，5-二酮21或3-(苯二酰亚氨基硫烷基)丙腈实施硫转移。然而，4-[(2-氰基乙基)硫烷基]吗啉-3，5-二酮的优点在于，在硫转移过程中产生的吗啉-3，5-二酮比苯邻二甲酰亚胺的水溶性更强。让6-O-(2，5-二氯苯基)-5’-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-2-N-异丁酰基-2’-脱氧鸟苷3’-H-膦酸酯三乙铵(DMTr-Gp(H))8(B＝16)[约4.8mmol]、6-N-苯甲酰基-3’-O-乙酰丙酰基-2’-脱氧腺苷(HO-A-Lev)9(B＝14)[4.0mmol]和氯化膦酸二-(2-氯苯基)酯18[6.0mmol]于-40℃在吡啶-二氯甲烷溶液中一起反应5-10分钟。然后加入4-[(2-氰基乙基)硫烷基]吗啉-3，5-二酮21[8.0mmol](流程2，步骤vii)，同时将反应物于-40℃保持。15分钟后，处理产物并经硅胶层析分级分离，得到全保护的硫代磷酸二核苷(DMTr-Gp(s)A-Lev)12(B＝14，B’＝16)，分离得率为99％。通过一个5步骤方法(流程2，步骤iii、iv、viii、ix和vi)将该物质去封闭。在“脱三苯甲基”和乙酰化步骤后，在严格无水条件下用1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯(DBU)处理产物，以去除S-(2-氰基乙基)保护基。然后，通过肟盐处理，从所述鸟嘌呤残基中去除6-O-(2，5-二氯苯基)保护基，最后通过氨解作用去除所有的酰基保护基。如果所述硫代磷酸寡核苷酸不含任何2’-脱氧鸟苷残基，则可以省略肟盐处理步骤。不用进一步纯化，则可获得极纯的d[Gp(s)A]13(B＝鸟嘌呤-9-基，B’＝腺嘌呤-9-基)，将其作为其钠盐分离。
4-[(2-氰基乙基)硫烷基]吗啉-3，5-二酮的制备
如下制备氯化S-(2-氰基乙基)异硫脲鎓。在加热下将硫脲(304g)溶于浓盐酸(500ml)中。将所得溶液减压蒸发，将残留的无色固体溶于沸腾的无水乙醇(1300ml)中。将溶液冷却至室温，在搅拌下分次加入丙烯腈(400cm3)。将反应物回流下加热2小时。将冷却的产物过滤，用冷乙醇洗涤残余物，然后经氯化钙真空干燥。
然后如下制备二-(2-氰基乙基)二硫醚。于0℃(冰-水浴)将二氯甲烷(400ml)加入搅拌的氯化S-(2-氰基乙基)异硫脲鎓(83.0g)的水(500ml)溶液中。加入过硼酸钠四水合物(44.1g)然后滴加氢氧化钠(30.0g)的水(250ml)溶液。将反应物保持在0℃(冰-水浴)。5小时后，分离产物，并用二氯甲烷(3×50ml)萃取水层。将合并的有机层干燥(MgSO4)并减压蒸发，将得到的固体从甲醇(30ml)中再结晶，得到无色晶体。
将二-(2-氰基乙基)二硫醚(4.51g)和吗啉-2.6-二酮(5.75g)悬浮于乙腈(10ml)、二氯甲烷(20ml)和2，6-二甲基吡啶17.4ml)中，并冷却至0℃(冰-水浴)。在30分钟内加入溴(4.28g)的二氯甲烷(20ml)溶液。将反应混合物于0℃下搅拌1.5小时。然后，通过在30分钟内加入冰冷的甲醇(50ml)沉淀产物，将其过滤，得到标题化合物(8.23g，82％)。从乙酸乙酯中再结晶，得到4-[(2-氰基乙基)硫烷基]吗啉-3，5-二酮无色针状物，m.p.121-122℃。
制备嵌合寡核苷酸的反应流程
通过流程3中的实施例概括描述了具有一个硫代磷酸二酯和两个磷酸二酯核苷酸间键合的d[TpGp(s)ApC]25的分步合成。
流程3
试剂和条件：
(i)4M HCl/二恶烷，CH2Cl2，-50℃，5min；
(ii)18，C5H5N，CH2Cl2，-40℃，5-10min；
(iii)a，21，C5H5N，CH2Cl2，-40℃，15min，b，C5H5N-H2O(1∶1 v/v)，-40℃至室温；
(iv)a，19，C5H5N，CH2Cl2，-40℃，15min，b，C5H5N-H2O(1∶1 v/v)，-40℃至室温；
(v)Ac2O，C5H5N，室温，15h；
(vi)DBU，Me3SiCl，CH2Cl2，室温，30min；
(vii)20，DBU，MeCN，室温，12h；
(viii)a，浓氨水(d 0.88)，50℃，15h，b，Amberlite IR-120(plus)，Na+形式，H2O。
预期没有规模的限制。流程3中所示的反应不是限制性的，本发明的方法同样适用于RNA、2’-O-烷基-RNA和其它寡核苷酸序列的合成。
使用以上在或者d[ApC]11(B＝腺嘌呤-9-基，B’＝胞嘧啶-1-基)或者d[Gp(s)A]13(B＝鸟嘌呤-9-基，B’＝腺嘌呤-9-基)(流程2)的制备中涉及的所有反应。
首先，在四个步骤中将全保护的硫代磷酸二核苷DMTr-Ap(s’)C-Lev10(B＝14，B’＝15)[约0.75mmol]转化为部分保护的三聚物23，总的分离得率约96％(流程3a)。在每个偶联步骤中，使用过量约20％的H-膦酸酯单体8，但偶联剂18的过量取决于反应规模。此外，在该实施例中使用过量2倍的硫转移剂19或21。在每个“脱三苯甲基”步骤后，将产物进行硅胶层析分离。
然后，将该物质与DMTr-Tp(H)8(B＝17)偶联，在三个步骤中将产物转化为全保护的四聚物24，总得率约93％(流程3b)。将后一物质去封闭，得到d[TpGp(s)ApC]25，将其作为相对纯(HPLC检测为约96.5％)的钠盐分离，不用进一步纯化。
也通过以非常相同的方式进行分步合成，制备三磷酸四核苷d[TpGpApC]和三硫代磷酸四核苷d[Cp(s)Tp(s)Gp(s)A]，所按照的方案与流程3所概述方案的不同之处，仅在于以非常相同的方式进行分步合成。所按照的方案与流程3所概述方案不同，仅在于在d[TpGpApC]的制备中只使用硫转移剂19，而在d[Cp(s)Tp(s)Gp(s)A]的制备中只使用硫转移剂21。
区段偶联的反应流程
作为说明，下文给出的流程4描述了为本发明一部分的区段偶联的实施例。
Ac-Tp(s)Tp(s)Gp(s)Gp(s)Gp(s)Gp(s)Tp(s)T-Bz
29
流程4
试剂和条件：
(i)N2H4·H2O，C5H5N-AcOH(3∶1 v/v)，0℃，20min；
(ii)a，30，Me3C-COCl，C5H5N，-35℃，30min，b，Et3N，H2O；
(iii)18，C5H5N，CH2Cl2，-35℃；
(iv)a，21，C5H5N，CH2Cl2，-35℃，10min，b，C5H5N-H2O(1∶1 v/v)，-35℃至室温。
以91％的分离得率获得的全保护七硫代磷酸八脱氧核苷29为d[Tp(s)Tp(s)Gp(s)Gp(s)Gp(s)Gp(s)Tp(s)T]的前体。如上所述，区段偶联在溶液中比在固相合成中适宜得多。
当然，该方法决不限于四聚物偶联。实际上，预期该H-膦酸酯法适用于将相当大的寡核苷酸区段(例如10+10)偶联在一起。
用于制备区段H-膦酸酯的反应流程
例如，如流程5所示，可以将部分保护的寡核苷酸33a和可以通过允许在溶液中进行的常规磷酸三酯(Chattopadhyaya，J.B.； Reese，C.B.Nucleic Acids Res.，1980，8，2039-2054；Kemal，O.，Reese，C.B.；Serafinowska，H.T.J.Chem.Soc.，Chem.Commun.，1983，591-593)制备相应的硫代磷酸酯33b，同样地转化为其3’H-膦酸酯(分别为34a和34b)。
a，X＝O，Ar＝2-ClC6H4；b，X＝S，Ar＝2，5-Cl2C6H3.
流程5
试剂和条件：
(i)a，30，Me3C.COCl，C5H5N，-35℃，b，Et3N，H2O。
实施例1
Ac-Tp(s))Tp(s)Gp(s)G-OH
将HO-Tp(s)Tp(s)Gp(s)G-Lev(5.82g，3mmol)与无水吡啶(2×20ml)一起共蒸发，再溶于无水吡啶(30ml)中。加入乙酸酐(1.42ml，15mmol)，将反应溶液于室温下搅拌12h。加入水(1.5ml)以猝灭反应。10分钟后，将混合物冷却至0℃(冰水浴)，加入水合肼(1.50g，30mmol)的吡啶(15ml)溶液和冰醋酸(15ml)。将混合物于0℃搅拌20分钟，然后将其分配于水(100ml)和二氯甲烷(100ml)之间。分离两层，有机层用水(3×50ml)洗涤。将有机层干燥(MgSO4)并蒸发。残余物经硅胶层析纯化。用甲醇-二氯甲烷(4∶96 v/v)洗脱杂质，用丙酮洗脱主产物。蒸发合适的流分，得到部分保护的三硫代磷酸四脱氧核苷无色固体(5.30g，93％)。
实施例2
Ac-Tp(s)Tp(S)Gp(S)Gp(H)
将H-膦酸4-甲基苯酯的铵盐(1.42g，7.5mmol)溶于甲醇(15ml)和三乙胺(2.1ml，15mmol)的混合物中。将混合物蒸发并与吡啶(2×10ml)在减压下共蒸发。加入Ac-Tp(s)Tp(s)Gp(s)G-OH(4.71g，2.5mmol)，与干燥的吡啶(20ml)一起共蒸发。将残余物溶于干燥吡啶(20ml)中，于-35℃在1分钟内加入新戊酰基氯(1.23ml，10mmol)。于相同温度下30分钟后，加入水(5ml)，让混合物温至室温，并搅拌1小时。将溶液分配于水(100ml)和二氯甲烷(100ml)之间。分离有机层，用磷酸三乙铵缓冲液(pH7.0，0.5M，3×50ml)洗涤，干燥(MgSO4)，然后过滤并上硅胶柱(约25g)。将用甲醇-二氯甲烷(20∶80，v/v)洗脱的合适流分蒸发，得到Ac-Tp(s)Tp(s)Gp(s)Gp(H)，为无色固体(4.85g，94％)。
实施例3
Ac-Tp(s)Tp(s)Gp(s)Gp(s)Gp(s)Gp(s)Tp(s)T-Bz
将Ac-Tp(s)Tp(s)Gp(s)Gp(H)(1.229g，0.6mmol)和HO-Gp(s)Gp(s)Tp(s)T-Bz(0.973g，0.5mmol)与无水吡啶(2×10ml)一起共蒸发，将残余物溶于无水吡啶(10ml)中。将溶液冷却至-35℃(工业甲醇变性酒精-干冰浴)，在10分钟内加入氯化磷酸二-(2-氯苯基)酯(0.84g，2.5mmol)的干燥二氯甲烷(1ml)溶液。加入4-[(2-氰基乙基)硫烷基]吗啉-3，5-二酮(0.20g，1.0mmol)，将混合物于相同温度下搅拌10分钟。然后加入水-吡啶(0.2ml，1∶1v/v)，将混合物再搅拌5分钟。然后减压蒸发反应混合物。将残余物溶于二氯甲烷(100ml)中，溶液用饱和碳酸氢钠水溶液(3×50ml)洗涤。将有机层干燥(MgSO4)并减压浓缩。残余物经硅胶层析纯化。首先，用甲醇-二氯甲烷(4∶96 v/v)去除亲脂杂质，然后用丙酮洗脱主产物。将合适的流分蒸发，得到全保护的七硫代磷酸八脱氧核苷无色固体(1.81g，91％)。以91％的分离得率获得的全保护的七硫代磷酸八脱氧核苷为d[Tp(s)Tp(s)Gp(s)Gp(s)Gp(s)Gp(s)Tp(s)T]的前体。
Claims (10)
1.制备硫代磷酸三酯的方法，所述方法包括：在偶联剂存在下，使H-膦酸酯与醇进行溶液相偶联，由此形成H-膦酸二酯，并且使所述H-膦酸二酯与硫转移剂现场反应，产生硫代磷酸三酯。
2.按照权利要求1的方法，其中所述H-膦酸酯为包含3’-H-膦酸酯官能团的受保护的核苷或寡核苷酸。
3.按照或者权利要求1或者权利要求2的方法，其中所述醇为包含游离5’-羟基官能团的受保护的核苷或寡核苷酸。
4.按照权利要求1或2的方法，其中所述偶联剂为式(ArO)2POCl的氯化磷酸二芳基酯，其中Ar代表苯基、2-氯苯基、2，4，6-三氯苯基或2，4，6-三溴苯基。
5.按照权利要求1或2的方法，其中所述硫转移剂具有以下化学通式：
L-------S-------A
其中L代表离去基团，而A代表芳基，甲基，在2位用吸电子取代基取代的乙基，被烷基或卤素任选取代的苄基，或链烯基。
6.按照权利要求5的方法，其中所述离去基团为吗啉-3，5-二酮、邻苯二甲酰亚胺、琥珀酰亚胺、马来酰亚胺或吲唑，而A代表4-卤代苯基、4-烷基苯基、甲基、苄基、烷基苄基、卤代苄基、烯丙基、巴豆基、2-氰基乙基或2-(4-硝基苯基)乙基。
7.按照权利要求1或2的方法，其中所述H-膦酸酯和所述醇为核糖核苷、2’-O-(烷基、烷氧基烷基或链烯基)-核糖核苷、寡核糖核苷酸或2’-O-(烷基、烷氧基烷基或链烯基)-寡核糖核苷酸。
8.具有以下化学通式的H-膦酸酯：
其中
每个B独立地为选自A、G、T、C或U的碱基；
每个Q独立地为H或OR’，其中R’为烷基、烷氧烷基、链烯基或保护基；
每个R独立地为芳基、甲基、链烯基、在2位用吸电子取代基取代的乙基、或被烷基或卤素任选取代的苄基；
W为H、保护基或下式的H-膦酸酯基团：
其中M+为单价阳离子；
每个X独立地代表O或S；
每个Y独立地代表O或S；
Z为H、保护基或下式的H-膦酸酯基团：
其中M+为单价阳离子；而
n为正整数；
前提为：当n为1时，Y为S；当W为H或保护基时，Z为H-膦酸酯基团，而当Z为H或保护基时，W为H-膦酸酯基团。
9.按照权利要求8的H-膦酸酯，其中W代表保护基，每个X代表O，而每个R代表甲基、苄基、2-氰基乙基、未取代的苯基或4-卤代苯基，M+代表三(C1-4-烷基铵)离子，而n为1-16。
10.一种制备去除保护基的磷酸二酯寡核苷酸、去除保护基的硫代磷酸酯寡核苷酸或去除保护基的含磷酸二酯和硫代磷酸二酯核苷酸间键合的寡核苷酸的方法，该方法包括：
a)在偶联剂的存在下，使受保护的含3’-或5’-H-膦酸酯官能团的核苷或寡核苷酸H-膦酸酯与受保护的含游离3’-或5’-羟基官能团的核苷或寡核苷酸进行溶液相偶联，由此形成H-膦酸二酯，并且使所述H-膦酸二酯与硫转移剂现场反应，产生硫代磷酸三酯；和
b)去除在a)中制得的硫代磷酸三酯的保护基，由此形成去除保护基的磷酸二酯寡核苷酸、去除保护基的硫代磷酸酯寡核苷酸或去除保护基的含磷酸二酯和硫代磷酸二酯核苷酸间键合的寡核苷酸。
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