CN1409719A - 制备硫代磷酸三酯和寡核苷酸的方法 - Google Patents

制备硫代磷酸三酯和寡核苷酸的方法 Download PDF

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Abstract

提供一种合成硫代磷酸三酯的方法。该方法包括在偶联剂的存在下，H－膦酸酯与含游离羟基基团并结合到固体载体上的底物的反应，从而形成载体上的H－膦酸二酯，用硫转移剂使所述H－膦酸二酯经受硫转移。

Description

制备硫代磷酸三酯和寡核苷酸的方法
本发明涉及合成硫代磷酸三酯，特别是寡核苷酸的方法。
在过去的15年左右，在关于寡脱氧核糖核苷酸(DNA序列)、寡核糖核苷酸(RNA序列)以及它们的类似物合成的开发方面已经取得了巨大的进步，参看“Methods in Molecular Biology，20卷，Protocol forOligonucleotides and Analogs”，Agrawal，S.Ed.，Humana Press，Totowa，1993。大部分工作已经在微摩尔或更小的规模下进行，并使包括单体亚磷酰胺构件的固相合成自动化。Beaucage，S.L.；Caruthers，M.H.Tetrahedron Lett.，1981，22，1859-1862被证明是最方便的途径。确实，高分子量DNA和相对高分子量RNA序列现在可以用可买到的合成仪常规地进行制备。这些合成寡核苷酸在生物和生物科技方面满足了许多重要需要。
随着Zamecnik和Stephenson的创造性发现，即合成寡核苷酸可以选择性地在劳斯肉瘤病毒中抑制基因表达(Zamecnik，P.；Stephenson，M.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1978，75，280-284)，合成寡核苷酸或它们的类似物可能在化学疗法中具有良好的应用的想法引起了学院实验室和工业实验室的大量关注。例如，寡核苷酸和它们的硫代磷酸酯类似物在化学疗法中可能的应用在Gura，T.Science，1995，270，575-577的报告中成为最突出的部分。所谓的化学疗法的反义和抗基因(antigene)途径(Oligonucleotides.Antisense Inhibitors ofGene Expression，Cohen.J.S.，Ed.，Macmillan，Basingstoke 1989 Moser，H.E.；Dervan，P.B.Science 1987，238，645-649)深深地影响了对合成寡核苷酸的需求。毫克量通常对于分子生物来说是足够的，而临床试验要求克至大于100克的量。有几种是潜在的反义药物的寡核苷酸类似物目前用在高级临床试验中。似乎在不远的将来，如果一种这些序列被批准用于AIDS或一种癌症的治疗，将需要千克或更可能是几千克量的一种或多种特定序列。
三种主要的方法，即磷酸三酯(Reese，Tetrahedron，1978)、亚磷酰胺(Beaucage，S.L.在Methods in Molecular Biology，20卷，Agrawal，S.，Ed.Humana Press，Totowa，1993，33-61页)和H-膦酸酯(Froehler，B.C.在Methods in Molecular Biology，20卷，Agrawal，S.，Ed.Humana Press，Totowa，1993，63-80页)方法被证明对于寡核苷酸的化学合成是有效的。磷酸三酯方法被最广泛地用于溶液中的合成，而亚磷酰胺和H-膦酸酯方法几乎只被用在固相合成中。发现常规的H-膦酸酯合成方法具有几个不利之处。首先，该方法包括使用含多个反应性H-膦酸酯核苷酸间键合的中间链。这些键的反应性可以引起降解，因此产率较低，纯度较低。此外，在所需分子的组合的最后使用单一的氧化或硫化步骤意味着对于设想的核苷酸的受控生产来说不能容易地使用所述方法。而且，当使用氧化步骤时，比较缓慢，并且可以引起与之相伴的降解；当使用硫化步骤时，不仅反应试剂有毒，反应也比较慢。此外，最普通的硫化试剂，所谓的“Beaucage试剂”可以引入显著的和不可预测的氧气部分来代替预期的硫。提高常规H-膦酸酯方法的尝试例如EP-A-0219 342中所公开的使用酰化剂的方法，其本身就存在问题，如与酰化剂的低偶联收率。
本发明提供一种合成硫代磷酸三酯的方法，该方法包括在偶联剂的存在下，H-膦酸酯与含游离羟基基团并结合在固体载体上的底物反应，从而形成载体上的H-膦酸二酯，并用硫转移剂使所述H-膦酸二酯经历硫转移，形成硫代磷酸三酯。在许多高度优选的实施方案中，进行多个偶联和硫转移步骤，在各偶联步骤之后进行一个硫转移步骤。
在本发明的方法中使用的H-膦酸酯通常是H-膦酸单酯，有利的是受保护的核苷或寡核苷酸H-膦酸酯，优选含5′或3′H-膦酸酯官能团，特别优选3′H-膦酸酯官能团。优选的核苷是2′-脱氧核糖核苷和核糖核苷；优选的寡核苷酸是寡脱氧核糖核苷酸和寡核糖核苷酸。2′-脱氧核糖核苷和寡脱氧核糖核苷酸可以含2′-C-烷基和2′-C-链烯基取代基。
当H-膦酸酯构件是含3′H-膦酸酯官能团的被保护的脱氧核糖核苷、核糖核苷、寡脱氧核糖核苷酸或寡核糖核苷酸衍生物时，5′羟基官能团被适当的保护基保护较为有利。这类适当的保护基团的例子包括酸性不稳定保护基团，特别是三苯甲基和取代的三苯甲基如二甲氧基三苯甲基和9-苯基呫吨-9-基；碱性不稳定保护基团如FMOC。其他可以使用的保护基包括甲硅烷基醚基团。
当H-膦酸酯构件是含5′H-膦酸酯官能团的被保护的脱氧核糖核苷、核糖核苷、寡脱氧核糖核苷酸或寡核糖核苷酸衍生物时，3′羟基官能团被适当的保护基保护较为有利。适当的保护基包括那些上面公开的用于保护3′H-膦酸酯构件的5′羟基官能团的基团以及酰基，如乙酰丙酰基(1evulinoyl)和取代的乙酰丙酰基。
当H-膦酸酯是被保护的核糖核苷或被保护的寡核糖核苷酸时，2′-羟基官能团被适当的保护基保护较为有利。所述保护基团有例如酸性不稳定的缩醛保护基团，特别是1-(2-氟苯基)-4-甲氧基哌啶-4-基(Fpmp)；烷基和芳基甲硅烷基保护基如叔丁基二苯基甲硅烷基，通常是三烷基甲硅烷基，经常是三(C1-4-烷基)甲硅烷基如叔丁基二甲基甲硅烷基。或者，核糖核苷或寡核糖核苷酸可以是2′-O-烷基、2′-O-烷氧基烷基或2′-O-链烯基衍生物，通常是C1-4烷基、C1-4烷氧基C1-4烷基或链烯基衍生物，在这种情况下，所述2′-位不需要进一步的保护。
其他可以用在本发明方法中的H-膦酸酯衍生自多官能醇，特别是烷基醇，优选二醇或三醇。烷基二醇的例子包括乙烷-1，2-二醇，低分子量聚乙二醇如那些分子量最高为400的聚乙二醇。烷基三醇的例子包括丙三醇和丁三醇。其他多官能醇包括糖类，特别是脱碱基核苷，例如核糖和脱氧核糖。通常，仅存在一个单一H-膦酸酯官能团，剩余的羟基基团被适当的保护基保护，如那些上文公开的用于在核糖核苷的5′或2′位进行保护的保护基。
用在本发明方法中的含游离羟基的底物通常是含游离羟基，优选游离3′或5′羟基，特别优选5′羟基的被保护的核苷或寡核苷酸。
当所述含游离羟基的底物是被保护的核苷或被保护的寡核苷酸时，优选的核苷是脱氧核糖核苷和核糖核苷，优选的寡核苷酸是寡脱氧核糖核苷酸和寡核糖核苷酸。
当所述含游离羟基的底物是含游离5′-羟基的脱氧核糖核苷、核糖核苷、寡脱氧核糖核苷酸或寡核糖核苷酸衍生物时，优选所述含游离羟基的底物经3′-羟基官能结合在固体载体上。
当所述含游离羟基的底物是含游离3′-羟基的脱氧核糖核苷、核糖核苷、寡脱氧核糖核苷酸或寡核糖核苷酸衍生物时，优选所述含游离羟基的底物经5′-羟基官能结合在固体载体上。
当所述含游离羟基的底物是核糖核苷或寡核糖核苷酸时，2′-羟基官能被适当的保护基保护较为有利。所述保护基有例如缩醛，特别是1-(2-氟苯基)-4-甲氧基哌啶-4-基(Fpmp)；和三烷基甲硅烷基，经常是三(C1-4-烷基)甲硅烷基如叔丁基二甲基甲硅烷基。或者，所述核糖核苷或寡核糖核苷酸可以是2′-O-烷基、2′-O-烷氧基烷基或2′-O-链烯基衍生物，通常是C1-4烷基、C1-4烷氧基C1-4烷基或链烯基衍生物，在这种情况下，所述2′-位不需要进一步的保护。
其他可以用在本发明方法中的含游离羟基的底物为糖类，特别是脱碱基核苷如核糖和脱氧核糖；以及非糖类多元醇，特别是烷基多元醇，优选二醇或三醇。烷基二醇的例子包括乙烷-1，2-二醇，低分子量聚乙二醇，如那些分子量最高为400的聚乙二醇。烷基三醇的例子包括丙三醇和丁三醇。通常，仅存在一个单一游离羟基，剩余的羟基基团被适当的保护基保护，如那些上文公开的用于在核糖核苷的5′或2′位进行保护的保护基；或者剩余的羟基基团被用于将基质结合到固体载体上。然而，如果需要在超过一个羟基基团上进行相同的偶联，则可以存在超过一个的游离羟基。
除存在羟基保护基团外，也优选通过适当的保护基对本发明所用的核苷/核苷酸中存在的需要保护的碱基进行保护。所用的保护基是那些本领域已知的用来保护这类碱基的基团。例如，腺嘌呤(A)和/或胞嘧啶(C)可以被苯甲酰基保护，所述苯甲酰基包括被取代的苯甲酰基，例如烷基-或烷氧基-，通常是C1-4烷基-或C1-4烷氧基-苯甲酰基；新戊酰基；脒，特别是二烷基氨基亚甲基，优选二(C1-4-烷基)氨基亚甲基如二甲基或二丁基氨基亚甲基。鸟嘌呤(G)可以被苯基保护，所述苯基包括被取代的苯基，例如2，5-二氯苯基，也可以被异丁酰基保护。G也可以被二苯基氨基甲酰基和乙二醛型保护基保护。胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)通常不要求保护，但是在某些实施方案中可以有利地被例如苯基在O4位保护，所述苯基包括被取代的苯基，例如2，4-二甲基苯基；或者也可以被新戊酰氧基甲基、苯甲酰基、烷基或烷氧基取代的苯甲酰基如C1-4-烷基-或C1-4-烷氧基苯甲酰基在N3位保护。
在偶合和硫转移步骤之后，并且当需要进一步进行偶合与硫转移步骤时，经常需要将一个游离羟基引入到由本发明的方法生产的硫代磷酸三酯中。当产生的硫代磷酸三酯是带有被保护羟基的被保护核苷或寡核苷酸时，可以在进行了第一发明的方法之后将这些保护基团中的一个除去。通常，所述被除去的保护基团是在5′-羟基官能上的基团。在所需寡核苷酸序列的合成中，保护基团被除去之后，可以通过进一步的本发明方法的逐步或嵌段偶合(block coupling)以及硫转移来对由此形成的寡核苷酸继续进行处理。然后所述方法可以继续进行从核苷酸间键合、3′和5′-羟基基团和碱基中除去保护基团的步骤，以及从固体载体上裂开产物的步骤。
本发明的方法可以包括一个封端步骤，其中在一个给定偶合后未反应的羟基被封端以防止在后来的偶合中再发生反应。可以使用的封端剂为本领域中已知的那些用于该步骤的封端剂，包括例如酰基化剂如乙酸酐(优选在亲核酰基化催化剂如4-(N，N-二甲基)氨基吡啶的存在下)和低级(例如最高为C4)烷基H-膦酸酯如H-膦酸乙酯和H-膦酸2-氰乙酯。
在一个特别优选的实施方案中，本发明提供一种方法，该方法包括在适当的偶联剂的存在下，5′-O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)-2′-脱氧核糖核苷3′-H-膦酸酯或被保护的寡脱氧核糖核苷酸3′-H-膦酸酯与附载在固体载体上的带有游离羟基官能团的底物(最通常的是2′-脱氧核糖核苷或寡脱氧核糖核苷酸)的偶合，以及随后在适当的硫转移剂的存在下的硫转移。
在本发明的方法中，可以使用任何可用在先有技术中的适当偶联剂和硫转移剂。
适当的偶联剂的例子包括烷基和芳基酰基氯、链烷和芳烃磺酰氯、氯甲酸烷基和芳基酯、氯亚硫酸烷基和芳基酯以及氯磷酸烷基和芳基酯和碳二亚胺。
可以使用的适当的烷基酰基氯的例子包括最多C12的烷基酰基氯，包括金刚基(adamantyl)碳酰氯，特别是C2-C7烷酰氯，尤其是新戊酰氯。可以使用的芳基酰基氯的例子包括取代和未取代的苯甲酰基氯，如C1-4烷氧基、卤(特别是氟、氯和溴)、C1-4烷基取代的苯甲酰基氯。当被取代时，通常存在1-3个取代基，特别是在烷基和卤取代的情况下。
可以使用的适当的链烷磺酰氯的例子包括C2-C7链烷磺酰氯。可以使用的芳烃磺酰氯的例子包括取代和未取代的苯磺酰氯，如C1-4烷氧基、卤(特别是氟、氟和溴)、C1-4烷基取代的苯磺酰氯。当被取代时，通常存在1-3个取代基，特别是在烷基和卤取代的情况下。
可以使用的适当的氯甲酸烷基酯的例子包括氯甲酸C2-C7烷基酯。可以使用的适当的氯甲酸芳基酯的例子包括取代和未取代的氯甲酸苯酯，如C1-4烷氧基、卤(特别是氟、氯和溴)、C1-4烷基取代的氯甲酸苯酯。当被取代时，通常存在1-3个取代基，特别是在烷基和卤取代的情况下。
可以使用的适当的氯亚硫酸烷基酯的例子包括氯亚硫酸C2-C7烷基酯。可以使用的氯亚硫酸芳基酯的例子包括取代和未取代的氯亚硫酸苯酯，如C1-4烷氧基、卤(特别是氟、氯和溴)、C1-4烷基取代的氯亚硫酸苯酯。当被取代时，通常存在1-3个取代基，特别是在烷基和卤取代的情况下。
可以使用的适当的氯磷酸烷基酯的例子包括氯磷酸二(C1-C6烷基)酯。可以使用的氯磷酸芳基酯的例子包括取代和未取代的氯磷酸二苯酯，如C1-4烷氧基、卤(特别是氟、氯和溴)、C1-4烷基取代的氯磷酸二苯酯。当被取代时，在每个苯基上可以存在1-5个取代基，特别是在烷基和卤取代的情况下。
其他可以使用的偶联剂是Wada等在J.A.C.S.1997，119，12710-12721中公开的氯-、溴-和(苯并三唑-1-基氧基)-鏻和碳鎓化合物(被结合到本文作为参考)。
可以使用的适当的碳二亚胺的例子包括烷基碳二亚胺，特别是(C1-C6烷基)碳二亚胺，如1，3-二环己基碳二亚胺、1，3-二异丙基碳二亚胺、1-叔丁基-3-乙基碳二亚胺和1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺。一个或多个烷基基团可以被取代，例如被烷基氨基部分取代。被取代的烷基碳二亚胺的例子有1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺。
优选的偶联剂是氯磷酸二芳基酯，特别是那些具有式(ArO)2POCl的化合物，其中Ar优选为苯基、2-氯苯基、2，4，6-三氯苯基或2，4，6-三溴苯基。
用在本发明方法中的硫转移剂向键中引入一个受保护的含硫部分，从而形成硫代磷酸三酯。所述硫代磷酸三酯通常随后被转化为磷酸二酯或硫代磷酸二酯，可以相应选择硫转移剂。例如，硫转移剂的性质取决于是否需要寡核苷酸、硫代磷酸酯类似物或混合的寡核苷酸/寡核苷酸硫代磷酸酯。在本发明方法中使用的硫转移剂通常具有下述化学式：
              L------S------D
其中L代表离去基团，D代表芳基基团、甲基或取代的烷基基团或链烯基基团。通常选择离去基团以含有氮-硫键。适当的离去基团的例子包括吗啉如吗啉-3，5-二酮；酰亚胺如邻苯二甲酰亚胺、丁二酰亚胺和马来酰亚胺；吲唑，特别是具有吸电子取代基的吲唑如4-硝基吲唑；以及三唑。
当在最终产物中需要一个标准磷酸二酯键时，通常选择硫转移剂以使D部分代表芳基，如苯基或萘基。适当的芳基的例子包括取代和未取代的苯基，特别是卤代苯基和烷基苯基，尤其是4-卤代苯基和4-烷基苯基，通常是4-(C1-4烷基)苯基，最优选4-氯代苯基和对甲苯基。适当的一类标准的磷酸二酯-定向硫转移剂的例子是N-(芳基硫烷基)邻苯二甲酰亚胺(也可以使用丁二酰亚胺或其他酰亚胺)。
当在最终产物中需要一个硫代磷酸二酯键时，D部分通常代表甲基、取代烷基或链烯基。适当的取代烷基的例子包括取代甲基，特别是苄基和取代苄基，如烷基-(通常是C1-4烷基-)和卤-(通常是氯-)取代的苄基，取代乙基，特别是在2位被吸电子取代基取代的乙基如2-(4-硝基苯基)乙基和2-氰基乙基。适当的链烯基的例子有烯丙基、炔丙基和巴豆基。适当的一类硫代磷酸酯-定向硫转移剂的例子有例如(2-氰基乙基)硫烷基衍生物如4-[(2-氰基乙基)-硫烷基]吗啉-3，5-二酮或相应的反应试剂如3-(邻苯二甲酰亚氨基硫烷基)propanonitrile。
进行偶合反应和硫转移的适当的温度在约-55℃至约40℃的范围内，例如0-30℃，优选约室温(通常在10-25℃的范围内，例如约20℃)。
每当需要合成所需数目的硫代磷酸酯键时，实施本发明方法的偶合和硫转移步骤。
用在本发明方法中的优选的核苷或核苷酸H-膦酸酯具有下述化学式：其中
各B独立为有机碱；
各Q独立为H、CH2R′或OR′，其中R′为烷基、取代烷基、链烯基或保护基团；
各R独立为芳基、甲基、取代烷基或链烯基；
W为H、保护基团或下式的H-膦酸酯基团：
其中M+为一价阳离子；
各X独立代表O或S；
各Y独立代表O或S；
Z为H、保护基团或下式的H-膦酸酯：
其中M+为一价阳离子；
n为0或正整数；
条件是当W为H或保护基团时，Z为H-膦酸酯基团；当Z为H或保护基团时，W为H-膦酸酯基团。
优选W或Z中的仅一个为H-膦酸酯基团，通常仅Z为H-磷酸膦基团。
当W或Z代表保护基团时，保护基团可以是那些上面公开的分别用于保护3′或5′位的保护基团中的一个。当W是保护基团时，优选保护基团为三苯甲基，特别是二甲氧基三苯甲基。当Z是保护基团时，优选保护基团为三苯甲基，特别是二甲氧基三苯甲基，或者酰基，优选乙酰丙酰基。
可以由B表示的有机碱包括核碱(nucleobase)，如天然和非天然核碱，特别是嘌呤，如次黄嘌呤，尤其是A和G，以及嘧啶，特别是T、C和U。所述碱可以被保护，优选A、G和C被保护。适当的保护基团包括那些上文公开的用于保护碱的保护基。
当Q表示基团OR′，且R′为链烯基时，所述链烯基经常为C1-4链烯基，特别是烯丙基、炔丙基或巴豆基。当R′表示烷基时，所述烷基优选C1-4烷基。当R′表示取代烷基时，所述取代烷基包括烷氧基烷基，特别是C1-4烷氧基C1-4烷基如甲氧基乙基。当R′表示保护基团时，所述保护基团通常是酸性不稳定缩醛保护基，特别是1-(2-氟苯基)-4-甲氧基哌啶-4-基(Fpmp)或三烷基甲硅烷基，通常为三(C1-4烷基)甲硅烷基如叔丁基二甲基甲硅烷基。
优选X表示O。
在许多实施方案中，Y表示S，各R独立表示甲基、取代烷基、链烯基或芳基。优选各R独立表示甲基；被取代的甲基，特别是苄基或被取代的苄基，如烷基(通常是C1-4烷基)或卤(通常是氯)取代的苄基；被取代的乙基，特别是在2位被吸电子取代基取代的乙基如2-(4-硝基苯基)乙基或2-氰基乙基；C1-4链烯基，优选烯丙基和巴豆基；或者取代或未取代的苯基，特别是卤代苯基或烷基苯基，尤其是4-卤代苯基或4-烷基苯基，通常是4-(C1-4烷基)苯基，最优选4-氯苯基或对甲苯基。
优选M+表示三烷基铵离子，如三(C1-4烷基铵)离子，优选三乙基铵离子或环状碱的阳离子如1，5-二氮杂二环[4.3.0]壬-5-烯(DBN)或1，8-二氮杂二环[5.4.0]十一碳-7-烯(DBU)。
n可以是0或1至任何便于合成所需寡核苷酸的数字，特别是最多至约20。优选n为0-9，特别是0-7。当需要加入核苷酸的小嵌段时，可以使用其中n表示1、2或3的H-膦酸酯；如果需要偶合较大的寡核苷酸嵌段，则可以使用相应具有较大n值如4、5或6的H-膦酸酯。
可以以溶液的形式使用所述H-膦酸酯、偶联剂和硫转移剂，尽管所述偶联剂或硫转移剂可以适当地以纯液体或固体的形式使用。可以使用的有机溶剂包括卤代烷烃，特别是二氯甲烷；酯，特别是烷基酯如乙酸乙酯和丙酸甲酯或丙酸乙酯；腈，如乙腈；酰胺，如二甲基甲酰胺和N-甲基吡咯烷酮(pyrollidinone)；以及碱性亲核溶剂如吡啶。优选的溶剂是吡啶、二氯甲烷、二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮以及它们的混合物。
可以用本领域中已知的用于特殊保护基和官能团的方法除去保护基。例如，过渡保护基团，特别是γ酮酸如乙酰丙酰基型保护基可以通过用肼(例如经缓冲的肼)处理被除去，如van Boom.J.H.；Burgers，P.M.J.Tetrahedron Lett.，1976，4875-4878中公开的在极温和的条件下用肼进行的处理。产生的带有游离3′-羟基官能团的被部分保护的寡核苷酸可以接着被转化为相应的H-膦酸酯，所述H-膦酸酯是中间体，可以被用于寡核苷酸和它们的硫代磷酸酯类似物的嵌段合成。
当对已经形成的所需产物进行脱保护时，通常首先除去产生硫代磷酸三酯键的磷上的保护基团。例如，氰基乙基可以通过用无水强碱性胺如DABCO、1，5-二氮杂二环[4.3.0]壬-5-烯(DBN)、1，8-二氮杂二环[5.4.0]十一碳-7-烯(DBU)或三乙胺处理被除去。
在硫代磷酸酯核苷酸间键合和碱性残余物上的苯基和取代苯基可以通过肟盐处理而被除去，例如用醛肟的共轭碱来处理，优选用E-2-硝基苯甲醛肟或吡啶-2-羧醛肟(carboxaldoxime)的共轭碱来处理(Reese等，Nucleic Acids Res.1981)。Kamimura，T等在J.Am.Chem.Soc.，1984，106 4552-4557和Sekine，M.等，Tetrahedron，1985，41，5279-5288在一个基于S-苯基硫代磷酸酯中间体的、通过在溶液中的磷酸三酯法合成寡核苷酸的方法中；van Boom和他的同事们在一个基于S-(4-甲基苯基)硫代磷酸酯中间体的合成寡核苷酸的方法中(Wreesman，C.T.J.等，Tetrahedron Lett.，1985，26，933-936)都证明了S-苯基硫代磷酸酯与肟盐离子的解块(unblocking)(使用Reese等，1978；Reese，C.B.；Zard，L.Nucleic Acids Res.，1981，9，4611-4626的方法)导致天然磷酸二酯核苷酸间键合。在本发明中，S-(4-氯苯基)-保护的硫代磷酸酯与E-2-硝基苯甲醛肟的共轭碱的解块顺利地进行，并且没有可检测到的核苷酸间键合。
其他保护基团，例如苯甲酰基、新戊酰基和脒基团可以通过用浓氨水处理被除去。
存在的三苯甲基可以通过用酸处理被除去。关于在寡核苷酸合成中全面的解块策略，本发明的另一个重要的考虑是三苯甲基(通常为5′-末端DMTr)保护基团的除去(“脱三苯甲基化”)应当在没有伴随脱嘌呤，特别是任何6-N-酰基-2′-脱氧腺苷残余物的情况下进行。
甲硅烷基保护基团可以通过氟化物处理被除去，例如用氟化铵的溶液，如三氢氟化三烷基胺(trialkylamine trihydrogen fluoride)的溶液或氟化四烷基铵如氟化四丁基铵的溶液。
Fpmp保护基团可以在温和条件下通过酸解被除去。
这种合成寡核苷酸的新方法适合于具有下述(a)、(b)和(c)的序列的制备：(a)单独的磷酸二酯、(b)单独的硫代磷酸二酯和(c)磷酸二酯和硫代磷酸二酯核苷酸间键合的组合。
用在本发明方法中的固体载体基本上不溶于所用的溶剂，包括那些本领域熟知的用于寡核苷酸的固相合成的载体。例子包括硅石、受控细孔玻璃、聚苯乙烯、含聚苯乙烯的共聚物如聚苯乙烯-聚乙二醇共聚物和聚合物如聚乙酸乙烯酯。此外，如果需要的话，也可以使用聚丙烯酰胺载体，特别是多微孔或软凝胶载体，如那些在缩氨酸的固相合成中更常使用的载体。优选的聚丙烯酰胺载体是胺官能化的载体，特别是那些衍生自通过丙烯酰基-肌氨酸甲基酯、N，N-二甲基丙烯酰胺和双丙烯酰基乙二胺的共聚制备的载体的载体，例如以商品目录名PL-DMA销售的可以买到的(Polymer Laboratories)载体。制备该载体的步骤由Atherton，E.；Sheppard，R.C.描述在SolidPhase Synthesis ：A Practical Approach，Publ.，IRL Press at OxfordUniversity Press(1984)中。这种载体上的官能团是甲基酯，它通过与烷基二胺如乙二胺的反应首先被转化为伯胺官能度。
底物通常经可开裂的连接器结合到固体载体上。可以使用的连接器的例子包括那些本领域熟知的用于寡核苷酸的固相合成的连接器，例如氨基甲酸乙酯、草酰、琥珀酰和氨基衍生的连接器。
在许多实施方案中，当底物经可开裂的连接器结合到聚丙烯酰胺载体上并含有核苷时，所述底物通过包括下述任一种的方法附着在载体上：
a)使具有游离3′-羟基基团的5′-保护的核苷与连接器，优选丁二酸酐反应，以形成连接器衍生的核苷；和
b)在用于形成酰胺键的偶联剂和任选的催化剂(如碱，例如二异丙基乙基胺(DIPEA)或N-甲基吗啉(NMM)或羟基苯并三唑)的存在下，使连接器衍生的核苷与胺-官能化的聚丙烯酰胺载体反应；或
c)使胺-官能化的聚丙烯酰胺载体与连接器，优选丁二酸酐反应，以形成连接器衍生的载体；和
d)在用于形成酰胺键的偶联剂和任选的催化剂(如碱，例如DIPEA或NMM或羟基苯并三唑)的存在下，使连接器衍生的
载体与具有游离3′-羟基基团的5′-保护的核苷反应；然后在任一种情况下，除去5′-保护基，该基团优选为三苯甲基或被取代的三苯甲基。但是，将认识到可能希望保留所述5′-保护基团，在这种情况下，可以省去该基团的除去。在这种情况下，可以在将载体上的底物用于本发明的硫代磷酸三酯的合成方法之前，在需要时除去所述5′-保护基团。
可以用在本方法中将底物附着在胺-官能化聚丙烯酰胺载体上的用于形成酰胺键的偶联剂包括那些肽合成领域已知的偶联剂，参看例如那些由Wellings，D.A；Atherton，E.公开在Methods in Enztmology，Publ.，Academic Press，New York(1997)(被结合到本文作为参考)中的偶联剂，如那些含碳二亚胺，特别是二烷基碳二亚胺如N，N’-二异丙基碳二亚胺(DIC)的偶联剂，以及那些形成活性酯的试剂，特别是原位的苯并三唑活性酯，如2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基uronium四氟硼酸盐(TBTU)或苯并三唑-1-基氧基-三(二甲基氨基)鏻六氟磷酸盐(BOP)。
适合采用有机溶剂如N，N-二甲基甲酰胺(DMF)或N-甲基吡咯烷二酮(NMP)将底物附着在胺-官能化聚丙烯酰胺载体上。
本发明的合成硫代磷酸三酯的方法可以通过对结合到固体上的底物在H-膦酸酯、偶联剂或硫转移剂的溶液中形成的淤浆进行搅拌来进行。或者，固体载体可以被装入一个柱中，将H-膦酸酯和偶联剂、硫转化剂的溶液依次通过该柱。
优选使用本发明的方法来生产通常含3个或更多个碱基的寡核苷酸。上限取决于希望制备的寡核苷酸的长度。通常，由本发明方法制备的寡核苷酸含最多40个碱基，通常最多30个碱基，优选5-25，如8-20个碱基。本发明方法的偶合与硫转移步骤可以被重复足够的时间以产生所需长度和序列。
在完成了所需产品的构建之后，可以将所述产品从固体载体上裂开，优选在产品脱保护之后进行。当所需产品为寡核苷酸时，将认识到产品将会是磷酸二酯、硫代磷酸二酯或含磷酸二酯和硫代磷酸二酯部分的嵌合体。所用的开裂方法是那些本领域中已知的用于给定的固体载体的方法。当所述产品经可开裂的连接器结合到固体载体上时，使用对于连接器适当的开裂方法。开裂之后，可以使用本领域已知的技术对产品进行纯化，如离子交换色谱法、反相色谱法和从适当的溶剂中析出中的一种或多种方法。也可以通过例如超滤进一步处理产品。
通过下面的实施例没有限制地对本发明进行说明。实施例1
将经丁二酰亚胺连接器在3′位附载到聚苯乙烯载体(可以以商品名Pharmacia Primer Support 30HL买到，吸附84umol/g；2g)上的4-N-苯甲酰基-5′-O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)-2′-脱氧胞苷(DMT Cbz)倾入烧结的容器中，用100ml CH2CH2浸湿，用工业用(house)氮气进行充气。除去溶剂。在该洗涤步骤之后，如下处理载体上的DMT Cbz：
i)用100ml在二氯甲烷中的3％v/v的二氯乙酸(DCA/DCM)，等待60秒，除去DCA/DCM
ii)用100ml CH2CH2，等待60秒，除去CH2CH2
iii)用100ml 3％DCA/DCM，等待60秒，除去酸
iv)用100ml CH2CH2洗涤，等待60秒；最后
v)再用CH2CH2(100ml)洗涤，用N2干燥树脂以产生载体上的4-N-苯甲酰基-2′-脱氧胞苷(HOCbz-poly)。数量                      当量(Equivs)     量822          DMTAbz(H)    5.0          0.84mmol-690mg
         HOCbz-poly   1.0          0.168mmol232          CESP          10.0         1.68mmol-389mg268.5/1/3    活化剂*      10.0         1.68mmol-0.35ml
*作为在DCM中的1∶1溶液，∴使用 0.69ml
通过与无水吡啶的共蒸发(2×5ml)对6-N-苯甲酰基-5′-O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)-2′-脱氧腺苷-3′-H-膦酸酯(DMTAbz(H)，690mg)进行干燥，并将其与2g HOCbz-poly(在100ml florentine中)合并。加入吡啶，以使所有的DMTAbz(H)都在溶液中，并形成不均匀的淤浆。这需要40ml吡啶。将混合物冷却至-40℃，并在偶合及硫转移阶段保持该温度。用氩气吹扫所述反应混合物，并在该气体的覆盖下进行所述反应。在5分钟内向冷却并搅拌过的淤浆中滴加入0.35ml(0.69ml在无水二氯甲烷中的1∶1体积混合物)氯磷酸二苯酯，再进行15分钟搅拌。这时向一个等分部分中加入在8ml吡啶中的389mg 2-(2-氰基乙基)硫烷基邻苯二甲酰亚胺(CESP)。首先在-40℃对混合物进行搅拌，然后将其加热到室温。然后将淤浆转移到一个烧结容器中，用吡啶(50ml)和DCM(200ml)洗涤，并将树脂在真空下干燥以产生5′-(DMT)-Abz-O-P(＝O)(SCH2CH2CN)-Cbz-(3′-O-聚合物载体)(″DMT-AC-poly″)。
在室温下用二氯乙酸在CH2CH2中的200ml 3％溶液对DMT-AC-poly(1.4g@71μmolg-1吸附)进行60秒的处理。用干净的CH2CH2洗涤树脂，并将其在N2流中干燥以产生5′-(HO)-Abz-O-P(＝O)(SCH2CH2CN)-Cbz-(3′-O-聚合物载体)(“HO-AC-poly″)。
                       当量     量2235         DMTACAC(H)    5.0     0.46mmol-1.03g71μmol/g    HO-AC-poly    1.0     13g@71μmol/g232          CESP          10.0    0.923mmol-214mg268.5/13     活化剂        10.0   *0.923mmol-0.19ml
                          *在CH2CH2中1/1∴ 0.38ml
如下所示由含游离3′-羟基的相应的四聚寡核苷酸(5′-DMT-ACAC-3′-OH)制备具有碱基序列5′-DMT-ACAC的5′-DMT被保护的核苷酸3′-H-膦酸酯，其各个内部核苷酸(internucleotide)被β-氰基乙基硫代部分(5′-DMT-ACAC-3′-H膦酸酯)保护。将甲苯甲酰基-H-膦酸铵溶解在50ml甲醇和5ml三乙胺中。蒸发该混合物以形成树胶，将该树胶与12.3g 5′-DMT-ACAC-3′-OH一起再溶解在100ml吡啶中，蒸发吡啶。然后将残余物再溶解在50ml吡啶中。将吡啶溶液冷却至-30℃，在1分钟内加入新戊酰氯(2.2ml)。将混合物搅拌30分钟，加入15ml水。搅拌10分钟后，加入250ml在二氯甲烷中的10％v/v甲醇溶液，用0.5M磷酸三乙铵缓冲液对其进行洗涤。分离有机层，用25ml甲醇稀释，并重复洗涤。分离有机层，从100ml甲苯中蒸发，然后从200ml 50∶50体积的甲苯/吡啶混合物中蒸发。将粗树胶重新溶解在二氯甲烷中，通过柱色谱法提纯，得到5′-DMT-ACAC-3′-H膦酸酯。
通过从无水吡啶(2×5ml)中共蒸发对所述5′-DMT-ACAC-3′-H膦酸酯进行干燥，并将其再悬浮在40ml相同的溶剂中。将混合物与在100ml florentine中的1.3g HO-AC-poly合并。搅拌该不均匀混合物，用氩气覆盖，并将其冷却至-40℃。在5分钟内滴加入0.38ml在CH2CH2中的1∶1体积氯磷酸二苯酯，将混合物再搅拌15分钟。这时向一个等分部分中加入CESP(在5ml吡啶中的214mg)。在猝灭(1ml水)之前首先在-40℃对混合物进行搅拌，然后将其在20分钟内加热到室温。
将淤浆转移到一个烧结容器中，并进行过滤和洗涤(5×100mlCH2CH2)，在氮气下干燥得到5′-(DMT)-Abz-O-P(＝O)(SCH2CH2CN)-Cbz-O-P(＝O)(SCH2CH2CN)-Abz-O-P(＝O)(SCH2CH2CN)-Cbz-O-P(＝O)(SCH2CH2CN)-Abz-O-P(＝O)(SCH2CH2CN)-Cbz-(3′-O-聚合物载体)(“DMT-AC ACAC-poly”)。
可以通过用无水1，8-二氮杂二环[5.4.0]十一碳-7-烯处理除去氰基乙基，产生硫代磷酸酯键，所述硫代磷酸酯寡核苷酸可以通过用含10％体积巯基乙醇的浓氨水处理从载体上裂开。
实施例2.在聚(二甲基丙烯酰胺)(PDMA)上的H-膦酸酯偶合和硫转移的通常方法
将由丙烯酰基-肌氨酸甲酯、N，N-二甲基丙烯酰胺和双丙烯酰基乙二胺共聚产生的聚(丙烯酰胺)树脂(PDMA树脂，69g)用在2L圆底烧瓶中的乙二胺(700ml)进行处理，该烧瓶是被密封的，并使其保持在室温下过夜。然后将淤浆转移到一个烧结的漏斗中，用DMF(12×700ml)进行洗涤。产生不含痕量胺的DMF洗涤液。然后用含有增加的DCM梯度(2.5L，0-100％DCM)、而在DCM中又具有增加的醚梯度(900ml，0-100％醚)的DMF洗涤树脂。然后将树脂在40℃下氮气流下干燥过夜。产生的树脂具有973微摩尔/克的氨基官能度(“氨基-PDMA树脂)。
在1300ml DMF中制备4-N-苯甲酰基-5′-O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)-2-脱氧胞苷-3′-O-丁二酸酯(“DMT-Cbz-丁二酸酯”，3eqvs，234mmol)、羟基苯并三唑(6eqvs，467mmol)和DIC(二异丙基碳二亚胺，4eqvs，311mmol)的溶液。在2L烧瓶中制备所述溶液，所述烧瓶已预先被硅烷化(这是通过在烧瓶四周简单地旋转氯化三甲基硅烷来实现的)以防止所述树脂粘结到玻璃上。然后将所述氨基-PDMA树脂(1eqv，78mmol)加入到溶液中，使其在室温下保持一夜。产生僵硬的非移动凝胶。在22小时后，除去一些珠子，用新的DMF洗涤。发现所述树脂呈Kaiser阴性，表明树脂上的所有氨基基团都与DMT-Cbz-丁二酸酯反应了。然后将反应混合物转移到一个烧结的漏斗中(直径18cm，孔隙率3)并进行洗涤(5×800ml)。在最终的DMF洗涤之后，进行与所述用于氨基PDMA处理类似的二乙醚处理，以使树脂收缩。在用N2吹扫24小时进行干燥后，在真空炉中干燥过夜，对树脂进行称重。从最初的80g氨基-PDMA得到55.7g的重量增加。产生吸附至573mmol/g的DMT-Cbz-PDMA树脂。
用与上述相同的条件以类似的吸附将5′-DMT-脱氧胞苷二聚体(在内部核苷磷上被β-氰基乙基保护)也附着在树脂上。
制备吸附了的树脂，用于通过如下所述的除去DMT基团进行偶合。将DMT-Cbz-PDMA树脂倾入烧结的漏斗(7cm，孔隙率3)中，对其施加氮气的正压力。然后向树脂中加入DCA在DCM中(15ml/g树脂)的3％溶液，使其轻轻地鼓泡5分钟。重复该操作(两次，与上述相同的量)。这时树脂的所有橙色都被除去，表明脱三苯甲基化完成。通过用DCM洗涤除去残余的酸，进一步用DCM中的醚进行洗涤，从20％v/v醚开始持续到100％醚。然后对HO-Cbz-PDMA树脂进行空气干燥，并在真空中40℃下干燥过夜。
将HO-Cbz-PDMA树脂(1mmol，1.48g)、DMT-Cbz-H-膦酸酯(6eq；4.79g)称入100ml florentine中。然后将其悬浮在60ml无水级DMF中。将混合物放置5分钟，以使树脂在室温下溶胀至其最大能力，加入吡啶(4.36ml)。用小型(12×5mm)flea(在Heidolph MR3001K搅拌器热板上的最大搅拌速度)对反应混合物进行搅拌。用注射器型泵(Razel A99FZ)在5分钟期间滴加纯净的活化剂氯磷酸二苯酯(6eq，1.24ml)。滴加结束后，立即以固体单一等分部分向混合物中加入硫转移剂(CESP，232mg，1mmol)。5分钟后将更多的树脂混合物倾倒入烧结的漏斗(孔隙率3)中。然后在搅拌条件下用50ml DMF洗涤树脂5分钟。将该步骤再重复两次。这时通过用乙酸酐在含4-(N，N-二甲基)氨基吡啶(DMAP，0.5mmol)的吡啶中的35ml 1.4M溶液处理20分钟，将任何未反应的羟基封端，之后进一步用DMF(3×30ml)进行洗涤。在用100ml二乙醚洗涤树脂之前，在最终洗涤的终点除去尽可能多的DMF。在加入醚期间对树脂进行搅拌，使溶剂在重力下滴下通过烧结的容器。将醚洗涤再重复两次。在最终洗涤之后，通过将N2通入树脂30分钟来除去剩余的醚。然后将所述树脂在真空、40℃下干燥过夜。树脂的重量增加和三苯甲基分析表明定量偶合形成DMT-CbzCbz-PDMA，在核苷间键合上被β-氰基乙基保护。
5′-HO-A bz C bz A bz C bz C bz -PDMA的制备
将上述制备的HO-Cbz-PDMA树脂(1mmol，1.48g)和在核苷间键合上被β-氰基乙基保护的5′-DMT-AbzCbzAbzCbz-H-膦酸酯(1.2eq，2.68g)称入100ml florentine中。加入无水DMF(60ml)使树脂在室温下溶胀5分钟。加入吡啶(5mmol，0.4ml)，之后用上述注射器型泵在5分钟期间滴加偶联剂、氯磷酸二苯酯(2mmol，0.41ml)。该滴加结束后，以固体单一等分部分加入硫转移剂(CESP，2.5mmol，0.58g)，并将悬浮液搅拌1小时。然后用DMF洗涤固体，之后如上所述通过用二氯乙酸处理除去DCM和DMT基团。然后将树脂用DCM、DMF洗涤，最后用醚洗涤，之后在氮气流中干燥，再在真空、40℃下干燥过夜。重量的增加和三苯甲基分析表明收率为75％。

Claims (15)

1.一种合成硫代磷酸三酯的方法，该方法包括在偶联剂的存在下，使H-膦酸酯与含游离羟基基团并结合到固体载体上的底物反应，从而形成载体上的H-膦酸二酯，并用硫转移剂使所述H-膦酸二酯经受硫转移，形成硫代磷酸三酯。
2.权利要求1的方法，其中进行多个偶合和硫转移步骤，在各个偶合步骤之后进行硫转移步骤。
3.权利要求1或2的方法，其中所述H-膦酸酯为2′-脱氧核糖核苷、核糖核苷、寡脱氧核糖核苷酸或寡核糖核苷酸。
4.权利要求3的方法，其中所述2′-脱氧核糖核苷、核糖核苷、寡脱氧核糖核苷酸或寡核糖核苷酸包含3′H-膦酸酯官能。
5.上述权利要求中任一项的方法，其中所述含游离羟基的底物为脱氧核糖核苷、核糖核苷、寡脱氧核糖核苷酸或寡核糖核苷酸。
6.权利要求5的方法，其中所述含游离羟基的底物为含游离5′-羟基、并且经3′-位结合到固体载体上的脱氧核糖核苷、核糖核苷、寡脱氧核糖核苷酸或寡核糖核苷酸衍生物。
7.上述权利要求中任一项的方法，其中所述偶联剂为氯磷酸烷基酯或氯磷酸芳基酯，优选氯磷酸二苯酯。
8.上述权利要求中任一项的方法，其中所述硫转移剂具有下述化学式：
                   L----S----D其中L代表离去基团，D代表芳基、甲基或被取代的烷基或链烯基。
9.上述权利要求中任一项的方法，其中所述H-膦酸酯与含游离羟基的底物之间的反应和H-膦酸二酯与硫转移剂之间的反应在选自卤代烷烃、酯、腈、酰胺和碱性亲核溶剂以及它们的混合物的有机溶剂的存在下进行。
10.权利要求9的方法，其中所述有机溶剂选自吡啶、二氯甲烷、二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮和它们的混合物。
11.上述权利要求中任一项的方法，其中所述固体载体选自硅石、受控细孔玻璃、聚苯乙烯、含聚苯乙烯的共聚物、聚乙酸乙烯酯和聚(丙烯酰胺)的载体。
12.权利要求11的方法，其中所述固体载体为丙烯酰基-肌氨酸甲酯、N，N-二甲基丙烯酰胺和双丙烯酰基乙二胺的胺-官能化载体共聚物。
13.上述权利要求中任一项的方法，其中所述方法在约-55℃至约40℃的温度下进行，优选在0-30℃进行。
14.上述权利要求中任一项的方法，其中通过与封端剂的反应对给定偶合后未反应的羟基进行封端。
15.上述权利要求中任一项的方法，其中所述硫代磷酸三酯为寡核苷酸，所述方法包括附加的步骤，该附加步骤为对硫代磷酸三酯进行脱保护，从固体载体上开裂其产物从而形成磷酸二酯、硫代磷酸二酯或含磷酸二酯和硫代磷酸二酯部分的嵌合体，任选之后有一处或多个纯化步骤。
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