CN101868473B - 一种寡核苷酸的制备方法 - Google Patents

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Abstract

一种寡核苷酸的制备方法，其中，该方法包括在缩合反应条件下将式(1)的化合物与式(2)的化合物在液态反应介质中反应，得到式(3)的化合物。本发明的方法中采用适当的保护基保护相应的官能团，只裸露出式(1)的化合物(OH-组分)的需要连接的5’端羟基和式(2)的化合物(P-组分)的需要连接的3’端磷酸盐，在液态反应介质中进行缩合反应，连接OH-组分和P-组分，得到DNA或RNA短链。本发明的方法不需要使用固相柱，可以在液态反应介质中进行，因此能够大规模合成寡核苷酸。

Description

一种寡核苷酸的制备方法
技术领域
本发明涉及一种寡核苷酸的制备方法。
背景技术
寡核苷酸的基本结构单元是核苷酸，核苷酸由碱基、戊糖和磷酸组成。核苷酸可以分为核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸，二者的基本化学结构相同，只是所含戊糖不同，核糖核苷酸的戊糖是D-核糖，脱氧核糖核苷酸的戊糖是D-2-脱氧核糖。碱基的种类一般包括鸟嘌呤基、腺嘌呤基、胞嘧啶基、胸腺嘧啶基或尿嘧啶基。
目前广泛使用的寡核苷酸化学合成方法是固相合成法(也称作亚磷酰三酯法)。《生物化学》(第三版上册，王镜岩等主编，高等教育出版社)第520-521页介绍了固相合成的原理如下：全部反应是在一个不大的固相柱子中进行的。首先将待活化的核苷酸上的某些游离基团保护(封闭)起来，使反应按设计的方向进行。5’-OH用二对甲氧三苯甲基(DMT)保护，碱基上的氨基用苯甲酰基保护。然后对3’-OH则用氨基亚磷酸化合物进行活化。第一个核苷酸的3’-OH与固相(树脂)结合在一起，它的5’-OH与活化的单体(核苷酸)之间形成一个亚磷酸三酯，活化单体上的5’-OH和碱基上的氨基等由于受到保护而不会参与反应。在第二步反应中，亚磷酸三酯经碘氧化形成磷酸三酯；第三步反应中，加入三氯乙酸除去生长链中的5’-OH上的保护剂DMT。至此，DNA链已经延伸了一个核苷酸单元，并可投入下一轮延伸反应。按事先输入的程序，整个DNA片段合成完毕之后，用苯硫酚除去5’-OH上的保护剂DMT，用浓氢氧化铵将DNA片段与固相树脂断开，使DNA得以洗脱下来。再用浓氢氧化铵在加热条件下使碱基上的保护剂除去。最后除去氢氧化铵，在真空中抽干。
由于上述固相合成的全部过程是在固相柱子中进行的，受到固相柱子的体积所限，该方法的合成规模小、产率低，无法满足大量合成的要求。随着对核酸研究的深入，一方面在科学研究中用到的寡聚核糖核酸迅速增加，另一方面，将核糖核酸用于临床方兴未艾，因此，设计能够进行大规模合成RNA的方法意义重大。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有的寡核苷酸化学合成方法的合成规模小的缺点，提供一种能够大规模合成寡核苷酸的制备方法。
本发明提供了一种寡核苷酸的制备方法，其中，该方法包括在缩合反应条件下将式(1)的化合物与式(2)的化合物在液态反应介质中反应，得到式(3)的化合物，
其中，R1表示DMTr(二对甲氧三苯甲基)、RNA或DNA；
R2和R3各自表示位阻型硅烷保护基团；
R4表示卤素原子；
A+表示三烷基铵离子；
B1和B2各自表示N-酰基取代的鸟嘌呤基、N-酰基取代的腺嘌呤基、N-酰基取代的胞嘧啶基、胸腺嘧啶基或尿嘧啶基。
本发明的方法中采用适当的保护基保护相应的官能团，只裸露出式(1)的化合物的需要连接的5’端羟基和式(2)的化合物的需要连接的3’端磷酸盐，在液态反应介质中进行缩合反应，连接OH-组分和P-组分，得到DNA或RNA短链。如果需要的话，在这个步骤完成之后，可以脱除新得到的DNA或RNA短链5’端的保护基，再次和新的式(2)的化合物进行缩合反应，即得到较长的链，重复进行这样的几步反应，最后脱除所有的保护基，即得到要具有所需长度的寡核苷酸；或者，可以脱除新得到的DNA或RNA短链3’端的保护基，然后将3’端羟基磷酸酯化得到新的P-组分(如反应式III所示的反应)，再次和新的式(3)的化合物进行缩合反应缩合，即得到较长的链，重复进行这样的几步反应，最后脱除所有的保护基，即得到要合成的寡核苷酸。本发明的方法不需要使用固相柱，可以在液态反应介质中进行，因此能够大规模合成寡核苷酸。
具体实施方式
本发明提供的寡核苷酸的制备方法包括在缩合反应条件下将式(1)的化合物与式(2)的化合物在液态反应介质中反应，得到式(3)的化合物，
Figure GPA00001131456000031
其中，R1表示DMTr(二对甲氧三苯甲基)、RNA或DNA；
R2和R3各自表示位阻型硅烷保护基团；
R4表示卤素原子；
A+表示三烷基铵离子；
B1和B2各自表示N-酰基取代的鸟嘌呤基、N-酰基取代的腺嘌呤基、N-酰基取代的胞嘧啶基、胸腺嘧啶基或尿嘧啶基。
该步骤可以由反应式I表示：
Figure GPA00001131456000041
反应式I
所述缩合反应条件可以包括：
可以使用MSNT(1-均三甲苯磺酰(3-硝基)-三唑)或MSNI(1-均三甲苯磺酰三唑)中的一种或几种作为缩合剂。
MSNT如式(8)所示：
Figure GPA00001131456000042
所述反应介质可以为吡啶。
相对于1摩尔的式(1)的化合物，式(2)的化合物的用量可以为0.8-3摩尔，优选为1-2摩尔，更优选为1-1.3摩尔；缩合剂的用量可以为2-5摩尔，优选为2.5-3摩尔；反应介质的用量可以为5-50升，优选为5-20升。
反应式I所示的反应的反应温度可以为10-50℃，优选为20-35℃；反应时间可以为0.5-10小时，优选为1-5小时。
在式(1)、式(2)和式(3)中，所述位阻型硅烷保护基团可以为各种具有位阻和保护功能的硅烷基团，优选为叔丁基二甲基氯硅烷基、苯基二甲基氯硅烷基、叔丁基二苯基氯硅烷基或三异丙基氯硅烷基，更优选为叔丁基二甲基氯硅烷基。
所述卤素原子可以为氟、氯、溴或碘，优选为氯或溴，更优选为氯。
所述三烷基铵离子中的各个烷基可以相同或不同，可以各自具有1-6个碳原子，优选具有1-4个碳原子。特别优选的烷基的例子包括但不限于甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基和叔丁基。
B1和B2中的酰基可以为具有2-10个碳原子的酰基，优选为苯甲酰基、异丁酰基或乙酰基。
在式(1)或式(3)中，-CH2-N3可以位于邻位、间位或对位，优选位于邻位。
在式(2)或式(3)中，R4可以位于邻位、间位或对位，优选位于邻位。
反应式I的反应完成之后，可以终止反应，并分离出产物。
终止反应的方法可以为将反应溶液与碳酸氢三乙胺盐的水溶液(TEAB)混合，在搅拌条件下保持10-90分钟。碳酸氢三乙胺盐的水溶液的浓度可以为0.1-1摩尔/升，碳酸氢三乙胺盐的水溶液与所述反应介质的体积比可以为0.02-0.5。
所述分离的方法可以包括将终止反应后的反应溶液与二氯甲烷混合，加入碳酸氢三乙胺盐的水溶液进行洗涤，将有机相干燥、过滤、浓缩、常压柱分离，即可得到产物。二氯甲烷与所述反应介质的体积比可以为2-20。碳酸氢三乙胺盐的水溶液的浓度可以为0.05-0.5摩尔/升，所述洗涤可以进行一次或多次，洗涤用的碳酸氢三乙胺盐的水溶液的总体积与所述反应介质的体积比可以为2-20。所述干燥、过滤、浓缩、常压柱分离的方法已为本领域技术人员所公知，在此不再赘述。
如果需要的话，在反应式I的反应完成之后，可以脱除得到的DNA或RNA短链5’端的保护基(如式II所示的第二步反应)，再次和新的式(2)的化合物进行缩合反应，即得到较长的链，重复进行这样的几步反应，最后脱除所有的保护基，即得到要具有所需长度的寡核苷酸；或者，可以脱除新得到的DNA或RNA短链3’端的保护基，然后将3’端羟基磷酸酯化得到新的P-组分(如反应式III所示的反应)，再次和新的式(3)的化合物进行缩合反应缩合，即得到较长的链，重复进行这样的几步反应，最后脱除所有的保护基，即得到要合成的寡核苷酸。
根据本发明的方法，其中，式(1)的化合物可以如反应式II所示的反应制备得到，即在缩合反应条件下将式(4)的化合物与式(5)的化合物反应，然后去除5’位上的R5保护基。
Figure GPA00001131456000061
反应式(II)
在式(4)和式(5)中，R2表示位阻型硅烷保护基团，可以为各种具有位阻和保护功能的硅烷基团，优选为叔丁基二甲基氯硅烷基、苯基二甲基氯硅烷基、叔丁基二苯基氯硅烷基或三异丙基氯硅烷基，更优选为叔丁基二甲基氯硅烷基。
R5表示DMTr(二对甲氧三苯甲基)、RNA或DNA。
R6表示卤素原子。所述卤素原子可以为氟、氯、溴或碘，优选为氯或溴，更优选为氯。
B1表示N-酰基取代的鸟嘌呤基、N-酰基取代的腺嘌呤基、N-酰基取代的胞嘧啶基、胸腺嘧啶基或尿嘧啶基。酰基可以为具有2-10个碳原子的酰基，优选为苯甲酰基、异丁酰基或乙酰基。
在式(1)或式(4)中，-CH2-N3可以位于邻位、间位或对位，优选位于邻位。
反应式II中，所述缩合反应的条件可以包括：使用N-甲基咪唑作为辅助剂；使用二氯甲烷、吡啶中的一种或几种作为反应介质。
相对于1摩尔的式(4)的化合物，式(5)的化合物的用量可以为1-3摩尔，优选为1.5-3摩尔；辅助剂的用量可以为1-8摩尔，优选为2-3.5摩尔；反应介质的用量可以为20-200升，优选为30-150升。
反应温度可以为-10℃至10℃，优选在冰浴中进行；反应时间可以为5-100小时，优选为10-60小时。
反应式II的缩合反应完成之后，可以终止反应，并分离出缩合反应产物。
终止反应的方法可以为将反应溶液与饱和碳酸氢钠水溶液混合1-20分钟。饱和碳酸氢钠水溶液与所述反应介质的体积比可以为1-10。
所述分离的方法可以包括将终止反应后的反应溶液的有机相和水相分开，有机相用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤，将所有有机相干燥、过滤、浓缩、常压柱分离，即可得到产物。所述洗涤可以进行一次或多次，洗涤用的饱和碳酸氢钠水溶液的总体积与所述反应介质的体积比可以为1-20。所述干燥、过滤、浓缩、常压柱分离的方法已为本领域技术人员所公知，在此不再赘述。
去除5’位上的R5保护基的方法可以为在搅拌下将缩合反应产物与甲酸在氯仿中10-50℃下反应5-60分钟。反应之后可以直接将有机相和甲酸相分开，甲酸相用二氯甲烷萃取，将所有有机相干燥、过滤、浓缩、常压柱分离，即可得到产物。所述萃取可以进行一次或多次，萃取用的二氯甲烷的总体积与甲酸的体积比可以为1-20。所述干燥、过滤、浓缩、常压柱分离的方法已为本领域技术人员所公知，在此不再赘述。相对于1摩尔所述缩合反应产物，甲酸的用量为10-50升。
去除5’位上的R5保护基的方法也可以为在搅拌下将缩合产物在1％浓度的对甲苯磺酸或3％-5％三氯乙酸或3％-5％三氟乙酸的二氯甲烷溶液中搅拌1-60分钟。其中所含有机酸的当量数为反应计量数的5-20倍。反应完成之后用饱和的碳酸氢钠水溶液中和，分出有机相，将有机相干燥、过滤、浓缩、常压柱分离，即可得到产物。所述干燥、过滤、浓缩、常压柱分离的方法已为本领域技术人员所公知，在此不再赘述。
去除3’位上的保护基的方法可以为在搅拌下将缩合产物与三苯基膦或二苯基甲基磷在含水10％的二氧六环中10-50℃下反应过夜。反应完全之后蒸出溶剂，常压柱分离即可得到产物。相对于1摩尔所述缩合反应产物，所用三苯基膦或二苯基甲基磷的用量可以为3-5摩尔，二氧六环的用量可以为50-150升。所述蒸馏、常压过柱为本领域技术人员所公知，在此不再赘述。
式(5)的化合物的制备方法可以包括以下步骤：
(1)在过氧化苯甲酰的存在下，将式(9)的化合物与N-卤代琥珀酰亚胺反应，得到式(10)的化合物；
(2)将式(10)的化合物与碱金属叠氮化物反应，得到式(11)的化合物；
(3)将式(11)的化合物水解，酰化得到式(5)的化合物，
Figure GPA00001131456000081
其中，R9表示卤素原子；R10表示C1-C4的烷基。
其中，在步骤(1)中，反应介质可以为四氯化碳、氯仿、苯、甲苯、庚烷中的一种或几种，相对于1摩尔的式(9)的化合物，N-卤代琥珀酰亚胺的用量可以为1-3摩尔，优选为1-1.2摩尔，过氧化苯甲酰的用量可以为0.01-0.1摩尔，优选为0.1-0.2摩尔，反应介质的用量可以为5-20升，优选为6-10升，反应温度可以为80至120℃，优选为90℃至110℃，反应时间可以为0.5-6小时，优选为1-3小时。
在步骤(2)中，反应介质可以为乙醇、丙酮、N、N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜中的一种或几种，相对于1摩尔的式(10)的化合物，碱金属叠氮化物的用量可以为1-3摩尔，优选为1.5-2摩尔，反应介质的用量可以为3-10升，优选为6-8升，反应温度可以为0℃至80℃，优选为25℃至35℃，反应时间可以为2-30小时。
在步骤(3)中，所述水解包括将式(11)的化合物与碱金属氢氧化物的醇水混合溶液(体积比1∶1)反应，相对于1摩尔的式(10)的化合物，碱金属氢氧化物的用量为5-100摩尔，优选为10-20摩尔，反应温度可以为0℃至50℃，优选为25℃至35℃，反应时间可以为0.1-2小时，优选为0.25-1h，在所述醇水混合溶液中碱金属氢氧化物的浓度可以为5-10重量％。
式(2)的化合物可以如反应式III所示的反应制备得到，即在催化剂存在下将式(6)的化合物、式(7)的化合物和三烷基胺在反应介质中反应而得到的
Figure GPA00001131456000091
反应式III
所述催化剂可以选自1，2，4-三唑、三乙胺、吡啶中的一种或几种。
所述反应介质可以选自二氯甲烷、二氧六环、四氢呋喃中的一种或几种，
在式(6)和式(7)中，R1表示DMTr(二对甲氧三苯甲基)、RNA或DNA；
R3表示位阻型硅烷保护基团，可以为各种具有位阻和保护功能的硅烷基团，优选为叔丁基二甲基氯硅烷基、苯基二甲基氯硅烷基、叔丁基二苯基氯硅烷基或三异丙基氯硅烷基，更优选为叔丁基二甲基氯硅烷基。
R4、R7和R8各自表示卤素原子。所述卤素原子可以为氟、氯、溴或碘，优选为氯或溴，更优选为氯。
B2表示N-酰基取代的鸟嘌呤基、N-酰基取代的腺嘌呤基、N-酰基取代的胞嘧啶基、胸腺嘧啶基或尿嘧啶基。酰基可以为具有2-10个碳原子的酰基，优选为苯甲酰基、异丁酰基或乙酰基。
在式(3)或式(7)中，R4可以位于邻位、间位或对位，优选位于邻位。
反应式III所示的反应的条件可以包括：反应温度可以为-10℃至10℃，优选在冰浴中进行；反应分为两步进行，第一步反应时间可以为0.5-10小时，优选为1-3小时。
相对于1摩尔的式(6)的化合物，式(7)的化合物的用量可以为1-5摩尔，优选为1.5-3摩尔；三烷基胺的用量可以为1-50摩尔，优选为3-20摩尔；催化剂的用量可以为2-10摩尔，优选为2-6摩尔；所述反应介质的用量可以为5-200升，优选为10-100升。
反应第一步完成后，将反应溶液与碳酸氢三乙胺盐的水溶液混合，在搅拌条件下保持10-90分钟，碳酸氢三乙胺盐的水溶液的浓度可以为0.1-1摩尔/升，碳酸氢三乙胺盐的水溶液与所述反应介质的体积比可以为0.2-2；然后直接将有机相和水相分开，有机相用碳酸氢三乙胺盐的水溶液洗涤，将所有有机相干燥、过滤、浓缩、常压柱分离，即可得到产物。洗涤用的碳酸氢三乙胺盐的水溶液的浓度可以为0.1-1摩尔/升，所述洗涤可以进行一次或多次，洗涤用的碳酸氢三乙胺盐的水溶液与所述反应介质的体积比可以为0.5-5。
下面通过实施例更详细地描述本发明。
实施例中所用到的原料如下：
第一核苷酸(A)：式(6)所示的化合物，保护的腺嘌呤核糖核苷，其中B2为N-苯甲酰基腺嘌呤，R1为DMTr，R3为叔丁基二甲基硅烷基，购自上海吉玛制药技术有限公司：
第二核苷酸(A)：式(4)所示的化合物，保护的腺嘌呤核糖核苷，其中B1为N-苯甲酰基腺嘌呤，R5为DMTr， R2为叔丁基二甲基硅烷基，购自上海吉玛制药技术有限公司：
第三核苷酸(C)：式(6)所示的化合物，保护的胞嘧啶核糖核苷，其中B2为N-苯甲酰基胞嘧啶，R1为DMTr，R3为叔丁基二甲基硅烷基，购自上海吉玛制药技术有限公司；
第四核苷酸(G)：式(4)所示的化合物，保护的鸟嘌呤核糖核苷其中B1为N-乙酰基鸟嘌呤，R5为DMTr，R2为叔丁基二甲基硅烷基，购自上海吉玛制药技术有限公司；
第五核苷酸(G)：式(6)所示的化合物，保护的鸟嘌呤核糖核苷，其中B2为N-苯甲酰基鸟嘌呤，R1为DMTr，R3为叔丁基二甲基硅烷基，购自上海吉玛制药技术有限公司；
第六核苷酸(U)：式(4)所示的化合物，保护的尿嘧啶核糖核苷，其中B1为尿嘧啶，R5为DMTr，R2为叔丁基二甲基硅烷基，购自上海吉玛制药技术有限公司；
第七核苷酸(U)：式(6)所示的化合物，保护的尿嘧啶核糖核苷，其中B2为尿嘧啶，R1为DMTr，R3为叔丁基二甲基硅烷基，购自上海吉玛制药技术有限公司；
三乙胺：购自天津市北方天医化学试剂厂；
1，2，4-三唑：购自Alfa Aesar；
2-氯苯基二氯代磷酸酯：式(7)的化合物，其中，R4、R7和R8均为氯，R4位于邻位，购自Alfa Aesar；
邻叠氮甲基苯甲酰氯：式(5)的化合物，其中，R6为氯，位于邻位，在合成实施例6中制得。
MSNT：式(8)的化合物，购自Sigma Aldrich。
合成实施例1
该合成实施例合成用于制备式(3)化合物的原料，即式(2)化合物(P-组分)。
250ml圆底烧瓶中加入1，2，4-三唑(2.76g，40mmol)和三乙胺(10.1g，100mmol)，用15ml二氯甲烷溶解，冰浴条件下滴加2-氯苯基二氯代磷酸酯(4.91g，20mmol)的二氯甲烷溶液10ml，再滴加第一核苷酸(7.87g，10mmol)的二氯甲烷溶液35ml，冰浴下搅拌2.5小时后加入35ml 1M浓度的TEAB，继续搅拌0.5小时后，1M TEAB萃取三次(每次20ml)，全部有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，旋蒸除去溶剂得到产品10.78g，产率100％。31PNMR(CDCl3，121M)δ-6.09.ESI-MS，M-976.2926。产率是产物的重量与按第一核苷酸计算的理论产量的百分比。
合成实施例2
该合成实施例合成用于制备式(3)化合物的原料，即式(1)化合物(OH-组分)。
250ml圆底烧瓶中加入N-甲基咪唑(2.08g，25mmol)，15ml二氯甲烷溶解，冰浴下滴加邻叠氮甲基苯甲酰氯(4.18g，20mmol)的二氯甲烷溶液15ml，再滴加第二核苷酸(7.87g，10mmol)的二氯甲烷溶液40ml，持续冰浴反应40小时，加饱和NaHCO3100ml终止反应，分液后饱和NaHCO3连续洗两次(每次100ml)，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，常压柱分离得到产物8.21g，产率86.8％。产率是产物的重量与按第二核苷酸计算的理论产量的百分比。
将如上得到的产品(8.21g，8.67mmol)加入170ml氯仿溶解，快速搅拌(搅拌速度为500-1000转/分钟)下加入170ml HCOOH，室温反应30分钟，直接分液，HCOOH相用二氯甲烷再萃取三次(每次170ml二氯甲烷)，合并后水洗三次(每次170ml水)，0.1M TEAB洗一次(170ml)，有机相无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，常压柱分离得到产物4.78g，产率85.5％。产率是产物的重量与按第二核苷酸计算的理论产量的百分比。
1HNMR(CDCl3，300M)δ(-0.32，3H，1CH3)，(-0.00，3H，1CH3)，(-0.77，9H，3CH3)，1.89(s，1H)，4.01-4.28(dd，2H，CH2)，4.99(s，2H，CH2)，5.42-5.46(t，1H)，5.88，5.90(d，1H)，6.09，6.12(d，1H)，6.26(d，1H)，7.37(s，1H)，7.58-7.79(m，5H)，8.16-8.31(m，4H)，8.98(s，1H)，9.22(s，1H)，ESI-MS：(M+Na)+667.2419
合成实施例3
按照与合成实施例1相同的方法进行合成，不同的是，用第三核苷酸代替第一核苷酸。
合成实施例4
按照与合成实施例2相同的方法进行合成，不同的是，用第四核苷酸代替第二核苷酸。
合成实施例5
按照与合成实施例1相同的方法进行合成，不同的是，用第五核苷酸代替第一核苷酸。
合成实施例6
按照与合成实施例1相同的方法进行合成，不同的是，用第七核苷酸代替第一核苷酸。
合成实施例7
按照与合成实施例2相同的方法进行合成，不同的是，用第六核苷酸代替第二核苷酸。
合成实施例8
按照与合成实施例2相同的方法进行合成，不同的是，用第三核苷酸代替第二核苷酸。
合成实施例9
该合成实施例合成式(5)的化合物。
(1)在带有回流装置的250ml圆底烧瓶中加入10.0g化合物1，再加入80ml的SOCl2，加热回流，90℃搅拌反应5h。将回流装置改为蒸馏装置，蒸馏出作为溶剂的SOCl2。冷却后，加入60ml甲醇，室温搅拌下滴加入15ml三乙胺，滴加完后，继续室温搅拌反应30min。酰氯全部转化为脂，旋蒸除去过量的甲醇和三乙胺，加入乙酸乙酯50ml，并用水洗两次，饱和食盐水洗一次后，脂层无水Na2SO4干燥。除去溶剂后得到9.7g化合物2，产率88.2％。
Figure GPA00001131456000131
(2)在250ml圆底烧瓶中加入1.50g(10mmol)化合物2，CCl480ml溶解后加入NBS1.98g(11mmol)，BPO48mg(0.2mmol)，加热回流1.5h即反应完全。过滤除去漂浮的不溶物后除去溶剂得到化合物3，反应定量进行。
Figure GPA00001131456000132
中文名：过氧化苯甲酰
NBS＝N-溴代琥珀酰亚胺
Figure GPA00001131456000133
(3)在25ml圆底烧瓶中加入916mg化合物3(4mmol)，20ml乙醇溶解后加入NaN3520mg(8mmol)，室温搅拌过夜(21h)。旋蒸除去乙醇后，加入乙酸乙酯溶解，依次水洗，饱和食盐水洗，有机层旋蒸除去溶剂后，加入40ml5％的NaOH溶液(CH3OH∶H2O体积比1∶1)室温搅拌30min，旋蒸除去甲醇后，2.5M的盐酸调节pH约等于1，CH2Cl2萃取4次。有机层无水Na2SO4干燥后除去溶剂得到化合物5。将化合物5用环己烷重结晶得到白色晶体。
化合物5的核磁数据：
1HNMR(CDCl3，400M)，4.89，(s，2H，CH2)，7.43-7.47(t，1H)，7.54-7.56(d，1H)，7.61-7.64(t，1H)，8.18-8.20(d，1H)。
元素分析：C：53.80，H：3.99，N：23.92，计算值：C：54.24，H：3，98，N23.72
Figure GPA00001131456000134
(4)在100ml圆底烧瓶中加入1.0g化合物5(5.65mmol)，50mlCHCl3溶解后再加入SOCl22.02g(16.95mmol)，加热回流5h。停止反应后旋蒸出溶剂，甲苯3×3ml共沸带出过量的SOCl2，得到化合物6，存于干燥器中备用。
Figure GPA00001131456000141
实施例1
该实施例合成寡核苷酸。
合成目标：全保护的RNA
DMTr[CGAAAGAACG]AZMB
注：[]表示除3’和5’末端外全保护的RNA，
DMTr为二对甲氧三苯甲基，5’端保护基；
AZMB为邻叠氮代甲基苯甲酰基，3’端保护基。
(1)合成DMTr[CpG]AZMB
25ml圆底烧瓶中加入合成实施例4的产物(598mg，1mmol)和合成实施例3的产物(1.19g，1.2mmol)，加无水吡啶10ml溶解样品，分三次加入MSNT(共745mg，2.8mmol)，室温搅拌3小时。加入1M TEAB 1ml搅拌0.5小时终止反应，反应液倒入60ml二氯甲烷中，0.1M TEAB洗三次(每次20毫升)，有机相无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，常压柱分离得到产物831mg，产率56.4％。产率是产物的重量与按合成实施例4的产物计算的理论产量的百分比。
(2)合成OH-[CpG]AZMB
将步骤(1)得到的DMTr[CG]AZMB(800mg，0.54mmol)加7.5ml氯仿溶解，快速搅拌下加入7.5ml HCOOH，室温反应30min，直接分液，HCOOH相用二氯甲烷再萃取三次(每次5毫升)，合并后水洗三次(每次5毫升)，0.1M TEAB洗一次(10毫升)，有机相无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，常压柱分离得到产物500mg，产率79.1％。产率是产物的重量与按DMTr[CG]AZMB计算的理论产量的百分比。
(3)合成DMTr[AA]AZMB
100ml圆底烧瓶中加入合成实施例2的产物(1.39g，2.16mmol)和合成实施例1的产物(3.03g，2.81mmol)，加无水吡啶22ml溶解样品，分三次加入MSNT(1.80g，6.05mmol)，室温搅拌2小时。加入1M TEAB搅拌0.5小时终止反应，反应液倒入150ml二氯甲烷中，0.1M TEAB洗三次，有机相无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，常压柱分离得到产物3.08g，产率87.9％。产率是产物的重量与按合成实施例2的产物计算的理论产量的百分比。
(4)合成OH[AA]AZMB
将步骤(3)得到的DMTr[AA]AZMB(3.08g，1.92mmol)溶于100ml 1％的对甲苯磺酸溶液中，室温搅拌30min，饱和NaHCO3中和后分出有机相，二氯甲烷萃取水相两次，合并有机相，有机相无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，常压柱分离得到产物2.45g，产率98.8％。产率是产物的重量与按DMTr[AA]AZMB计算的理论产量的百分比。
(5)合成DMTr[GAA]AZMB
100ml圆底烧瓶中加入步骤(4)得到OH[AA]AZMB(2.45g，1.88mmol)和合成实施例5的产物(2.39g，2.26mmol)，加无水吡啶19ml溶解样品，分三次加入MSNT(1.56g，5.26mmol)，室温搅拌2小时。加入1M TEAB 2ml搅拌0.5小时终止反应，反应液倒入200ml二氯甲烷中，0.1M TEAB洗三次，有机相无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，常压柱分离得到产物4.068g，产率96.0％。产率是产物的重量与按OH[AA]AZMB计算的理论产量的百分比。
(6)合成OH[GAA]AZMB
将步骤(5)得到的DMTr[GAA]AZMB(4.068g，1.81mmol)加50ml氯仿溶解，快速搅拌下加入50ml HCOOH，室温反应30min，直接分液，HCOOH相用二氯甲烷再萃取三次，合并后水洗三次，0.1M TEAB洗一次，有机相无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，常压柱分离得到产物2.66g，产率75.6％。产率是产物的重量与按DMTr[GAA]AZMB计算的理论产量的百分比。
(7)合成DMTr[AGAA]AZMB
100ml圆底烧瓶中加入步骤(6)得到的OH[GAA]AZMB(1.48g，0.76mmol)和合成实施例1的产物(1.08g，1.00mmol)，加无水吡啶8ml溶解样品，分三次加入MSNT(632mg，2.13mmol)，室温搅拌4小时。加入1M TEAB 1.5ml搅拌0.5小时终止反应，反应液倒入60ml二氯甲烷中，0.1M TEAB洗三次，有机相无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，常压柱分离得到粗产物2.21g。
(8)合成DMTr[AGAA]OH
100ml圆底烧瓶中加入步骤(7)得到的DMTr[AGAA]AZMB(2.21g，0.76mmol)，2.6g的二氧六环/水(9∶1)混合溶剂溶解，加三苯基磷(796mg，3.04mmol)，室温搅拌24小时，蒸干溶剂后，常压柱分离得到粗产物2.1g。
(9)合成DMTr[AGAA]PO-
100ml圆底烧瓶中加入1，2，4-三唑(420mg，6.08mmol)和三乙胺(768mg，7.60mmol)，二氯甲烷7ml溶解，冰浴条件下滴加2-氯苯基二氯代磷酸酯(560mg，2.28mmol)的二氯甲烷溶液3ml，再滴加步骤(8)得到的DMTr[AGAA]OH(2.1g，0.76mmol)的二氯甲烷溶液2.5ml，冰盐浴下搅拌2.5小时后加3ml TEAB终止反应，0.1M TEAB洗三次，有机相无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，常压柱分离得到产物1.31g，三步总产率56.7％。
(10)合成DMTr[CGAA]AZMB
100ml圆底烧瓶中加入步骤(6)得到的OH[GAA]AZMB(1.12g，0.58mmol)和合成实施例3的产物(746mg，0.75mmol)，加无水吡啶6ml溶解样品，分三次加入MSNT(482mg，1.62mmol)，室温搅拌4小时。加入1M TEAB 1.5ml搅拌0.5小时终止反应，反应液倒入60ml二氯甲烷中，0.1M TEAB洗三次，有机相无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，常压柱分离得到粗产物1.63g。
(11)合成DMTr[CGAA]OH
100ml圆底烧瓶中加入步骤(10)得到的DMTr[CGAA]AZMB(1.60g，0.57mmol)，1.6g的二氧六环/水(9∶1)混合溶剂溶解，加三苯基磷(595mg，2.27mmol)，室温搅拌24小时，蒸干溶剂后，常压柱分离得到粗产物1.5g。
(12)合成DMTr[CGAA]PO-
25ml圆底烧瓶中加入1，2，4-三唑(315mg，4.56mmol)和三乙胺(576mg，5.70mmol)，二氯甲烷5ml溶解，冰浴条件下滴加2-氯苯基二氯代磷酸酯(420mg，1.71mmol)的二氯甲烷溶液2ml，再滴加步骤(11)得到的DMTr[CGAA]OH(1.5g，0.57mmol)的二氯甲烷溶液2ml，冰盐浴下搅拌2.5小时后加1.5ml TEAB终止反应，0.1M TEAB洗三次，有机相无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，常压柱分离得到产物1.12g，三步总产率61.9％。
(13)合成DMTr[AGAACG]AZMB
25ml圆底烧瓶中加入步骤(2)得到的OH[CG]AZMB(480mg，0.41mmol)和步骤(9)得到的DMTr[AGAA]PO-(1.20g，0.40mmol)，加无水吡啶8ml溶解样品，分三次加入MSNT(333mg，1.12mmol)，室温搅拌2.5小时。加入1M TEAB 1ml搅拌0.5小时终止反应，反应液倒入60ml二氯甲烷中，0.1M TEAB洗三次，有机相无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，常压柱分离得到产物1.21g，产率73.4％。
(14)合成OH[AGAACG]AZMB
将步骤(13)得到的DMTr[AGAACG]AZMB(1.21g，0.29mmol)加10ml氯仿溶解，快速搅拌下加入10ml HCOOH，室温反应30min，直接分液，HCOOH相用二氯甲烷再萃取三次，合并后水洗三次，0.1M TEAB洗一次，有机相无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，常压柱分离得到产物863mg，产率78.6％。
(15)合成DMTr[CGAAAGAACG]AZMB
25ml圆底烧瓶中加入步骤(14)得到的OH[AGAACG]AZMB(840mg，0.22mmol)和步骤(12)得到的DMTr[CGAA]PO-(786g，0.26mmol)，加无水吡啶5ml溶解样品，分三次加入MSNT(184mg，0.62mmol)，室温搅拌4小时。加入1M TEAB 1ml搅拌0.5小时终止反应，反应液倒入60ml二氯甲烷中，0.1M TEAB洗三次，有机相无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，常压柱分离得到产物1.20g，产率82.4％。MAIDI-TOF MS：6560.787。
实施例2
该实施例合成寡核苷酸。
合成目标：5’-CGAAAGAACG-3’
(1)将46mg(0.28mmol)对硝基苯肟和32mg(0.28mmol)四甲基胍溶于二氧六环和水体积比1∶1的溶液0.6ml，混匀后再加入13mg(2umol)实施例1制得的DMTr[CGAAAGAACG]AZMB，室温反应30小时，此步去除膦上的保护基。
(2)将步骤(1)得到的反应液40℃真空离心干燥后再加入5ml浓氨水(25％-28％)，加热至50℃反应12小时，此步去除碱基和3’末端的保护基。
(3)将步骤(2)得到的反应液40℃真空离心干燥后加入1ml80％的乙酸，室温反应30分钟后再次离心干燥，将残余物溶于2毫升水，用2毫升乙酸乙酯洗涤后-80℃真空冷冻干燥成干粉状。此步去除5’末端保护基。
(4)在冻干后的粉末中加入1ml1M的TBAF(氟化四丁基胺)的四氢呋喃溶液，37℃反应过夜，此步去除2’位保护基。将反应完成的反应液加入等体积的水淬灭后40℃真空离心干燥去除四氢呋喃，残余物经sephadex G25过柱脱盐，收集紫外吸收在260nm处的产品，得到经脱保护的寡聚核糖核酸5’-CGAAAGAACG-3’水溶液，经-80℃真空冷冻干燥后成白色干粉状固体。MAIDI-TOF MS：3233.67。
实施例3
该实施例合成寡核苷酸。
合成目标：全保护的RNA
DMTr[UGCGCGUUGAUGUGAGGUUCCUU]AZMB
和DMTr[GGAACCUCACAUCAACGCGCAUU]AZMB
(1)合成OH[CG]AZMB
在50ml圆底烧瓶中加入合成实施例3的产物(4.433g，4.2mmol)和合成实施例4的产物(2.194g，3.5mmol)，加入无水吡啶30ml溶解样品，加入MSNT(2.911g，9.8mmol)，室温搅拌2小时。加入4ml 0.1M的TEAB，搅拌10分钟终止反应，旋蒸除去溶剂后，将得到的产物溶解于50ml CH2Cl2中，用0.1M TEAB洗涤3次(每次20ml)，用5％草酸调节pH为3，分液得到有机相，并用无水Na2SO4干燥该有机相，过滤，得到的滤液50ml。将得到的滤液转移到250ml的圆底烧瓶中，缓缓加入50ml 6％的CF3COOH，室温搅拌反应5min后，加入饱和NaHCO3中和，分液得到有机相，用饱和NaHCO320ml对得到的有机相进行一次洗涤，用无水Na2SO4干燥有机相，过滤，浓缩，常压柱分离得到产物，产率78％。产率是产物的重量与合成实施例4的产物计算的理论产量的百分比。
(2)合成OH[GG]AZMB
采用与步骤(1)相同的步骤合成OH[GG]AZMB，不同的是，采用合成实施例5的产物(4.471g，4.2mmol)和合成实施例4的产物(2.194g，3.5mmol)，并用20ml无水吡啶溶解，0.1M TEAB的用量为3ml。产率67.1％。产率是产物的重量与合成实施例4的产物计算的理论产量的百分比。
(3)合成OH[AU]AZMB
在50ml圆底烧瓶中加入合成实施例1的产物(4.534g，4.2mmol)，合成实施例7的产物(1.811g，3.5mmol)，加吡啶20ml溶解样品，分批加入MSNT(2.911g，9.8mmol)，室温搅拌反应2h。加入1M TEAB 10ml搅拌10min终止反应，溶于100ml CH2Cl2，用1M TEAB洗涤3次(每次20ml)，分液得到有机相，用无水Na2SO4干燥得到的有机相，过滤，浓缩，常压柱分离得到产物。将得到的产品溶于45ml CH2Cl2，伴随搅拌缓缓倒入45ml 6％的CF3COOH，使得体系中CF3COOH的浓度为3％，室温搅拌反应5min。加入饱和NaHCO3中和，分液得到有机相，用饱和NaHCO320ml)洗涤得到的有机相一次，用无水Na2SO4干燥有机相，过滤，浓缩，常压柱分离得到产物，产率81.1％。产率是产物的重量与合成实施例7的产物计算的理论产量的百分比。
(4)合成OH[UU]AZMB
在250ml圆底烧瓶中加入合成实施例6的产物(10.0g，10.5mmol)，合成实施例7的产物(4.53g，8.75mmol)，加无水吡啶45ml溶解样品，分批加入MSNT(7.28g，24.5mmol)，室温搅拌反应2小时。加入1M TEAB 50ml搅拌20分钟终止反应，溶于300mlCH2Cl2中，用1M TEAB洗涤3次(每次20ml)，分液得到有机相，用无水Na2SO4干燥有机相，过滤，浓缩，常压柱分离得到产物。将得到的产品溶于100ml CH2Cl2中，伴随搅拌缓缓倒入100ml 6％的CF3COOH，室温搅拌反应5分钟。加入饱和NaHCO3中和，分液得到有机相，用饱和NaHCO350ml)洗涤有机相一次，用无水Na2SO4干燥得到的有机相，过滤，浓缩，常压柱分离得到产物，产率73％。产率是产物的重量与合成实施例7的产物计算的理论产量的百分比。
(5)合成OH[CA]AZMB
在500ml圆底烧瓶中加入合成实施例3的产物(31.66g，30mmol)，合成实施例2的产物(16.12g，25mmol)，用无水吡啶150ml溶解样品，分批加入MSNT(20.79g，70mmol)，室温搅拌反应2h。加入1M TEAB 100ml搅拌20min终止反应，溶于600mlCH2Cl2中，用1M TEAB洗涤3次(每次20ml)，分液得到有机相，用无水Na2SO4干燥有机相，过滤，浓缩，常压柱分离得到产物。将得到的产物溶于370ml CH2Cl2中，伴随搅拌缓缓倒入370ml 6％的CF3COOH，，使得体系中CF3COOH的浓度为3％，室温搅拌反应5分钟。加入饱和NaHCO3中和，分液得到有机相，用饱和NaHCO3(？ml)洗涤有机相一次，用无水Na2SO4干燥有机相，过滤，浓缩，常压柱分离得到产物，产率72％。产率是产物的重量与合成实施例2的产物计算的理论产量的百分比。
(6)合成OH[CC]AZMB
采用与步骤(4)相同的方法制备OH[CC]AZMB，不同的是，采用合成实施例3的产物(12.25g，11.6mmol)和合成实施例8的产物(6.0g，9.67mmol)，并用无水吡啶50ml溶解样品，分批加入MSNT(8.01g，27.1mmol)。产率83％。产率是产物的重量与合成实施例8的产物计算的理论产量的百分比。
(7)合成OH[GC]AZMB
在250ml圆底烧瓶中加入合成实施例5的产物(18.47g，17.4mmol)，合成实施例8的产物(9.0g，14.5mmol)，用无水吡啶72ml溶解样品，分批加入MSNT(12.0g，40.6mmol)，室温搅拌反应2h。加入1M TEAB 80ml搅拌20min终止反应，溶于300mlCH2Cl2中，用1M TEAB洗涤3次(每次20ml)，分液得到有机相，用无水Na2SO4干燥有机相，过滤，浓缩，常压柱分离得到产物。将得到的产品溶于150ml CH2Cl2中，伴随搅拌缓缓倒入150ml 6％的CF3COOH，使得体系中CF3COOH的浓度为3％，室温搅拌反应10min。加入饱和NaHCO3中和，分液得到有机相，用饱和NaHCO3120ml)洗涤有机相一次，用无水Na2SO4干燥有机相，产率63.8％。产率是产物的重量与合成实施例8的产物计算的理论产量的百分比。
(8)合成OH[UG]AZMB
在50ml圆底烧瓶中加入合成实施例6的产物(5.14g，5.4mmol)，合成实施例4的产物(2.82g，4.5mmol)，用无水吡啶30ml溶解样品，分批加入MSNT(3.74g，12.6mmol)，室温搅拌反应2h。加入1M TEAB 10ml搅拌20min终止反应，溶于150mlCH2Cl2中，用1M TEAB洗涤3次(每次20ml)，分液得到有机相，用无水Na2SO4干燥有机相，过滤，浓缩，常压柱分离得到产物。将得到的产物溶于450ml CH2Cl2中，伴随搅拌缓缓倒入450ml 6％的CF3COOH，使得体系中CF3COOH的浓度为3％，室温搅拌5min。加入饱和NaHCO3中和，分液得到有机相，用饱和NaHCO3300ml)洗涤有机相一次，用无水Na2SO4干燥有机相，过滤，浓缩，常压柱分离得到产物，产率78％。产率是产物的重量与合成实施例4的产物计算的理论产量的百分比。
(9)合成DMTr[GG]AZMB
在100ml圆底烧瓶中加入合成实施例5的产物(7.64g，7.2mmol)，合成实施例4的产物(3.76g，6mmol)，用无水吡啶35ml溶解样品，分三次加入MSNT(5.0g，16.8mmol)，室温搅拌2.5h。加入1M的TEAB 10ml，搅拌20min终止反应，将反应液倒入200mlCH2Cl2中，用1M TEAB洗涤3次(每次20ml)，分液得到有机相，用Na2SO4干燥有机相，过滤，浓缩，常压柱层分离得到产物，产率81％。产率是产物的重量与合成实施例4的产物计算的理论产量的百分比。
(10)合成DMTr[UGC]AZMB
在250ml圆底烧瓶中加入合成实施例6的产物(7.67g，9.10mmol)，步骤(7)得到的OH[GC]AZMB(7.77g，6.17mmol)，用无水吡啶40ml溶解样品，分三次加入MSNT(5.13g，17.3mmol)，室温搅拌3.5h。加入1M的TEAB 10ml，搅拌20min终止反应，将反应液倒入150ml CH2Cl2中，用1M TEAB洗涤3次(每次20ml)，有机相用Na2SO4干燥，过滤，浓缩，常压柱分离得到产物，产率73％。产率是产物的重量与按OH[GC]AZMB计算的理论产量的百分比。
(11)合成DMTr[UCA]AZMB
在50ml圆底烧瓶中加入合成实施例6的产物(8.67g，9.10mmol)，步骤(5)得到的OH[CA]AZMB(8.95g，7.00mmol)，用无水吡啶50ml溶解样品，分三次加入MSNT(5.82g，19.6mmol)，室温搅拌4h。加入1M的TEAB 10ml，搅拌20min终止反应，将反应液倒入100ml CH2Cl2中，用1M TEAB洗涤3次(每次20ml)，分液得到有机相，有机相用Na2SO4干燥，过滤，浓缩，常压柱分离得到产物，产率77％。产率是产物的重量与按OH[CA]AZMB计算的理论产量的百分比。
(12)合成DMTr[ACG]AZMB
采用与步骤(11)相同的方法制备DMTr[ACG]AZMB，不同的是，采用合成实施例1的产物(2.67g，2.47mmol)和步骤(1)得到的OH[CG]AZMB(2.40g，1.90mmol)，并用无水吡啶15ml溶解样品，分三次加入MSNT(1.58g，5.32mmol)。产率78％。产率是产物的重量与按OH[CG]AZMB计算的理论产量的百分比。
(13)合成DMTr[GUU]AZMB
在100ml圆底烧瓶中加入合成实施例5的产物(4.30g，4.05mmol)，步骤(4)得到的OH[UU]AZMB(3.15g，3.00mmol)，用无水吡啶20ml溶解样品，分三次加入MSNT(2.50g，8.40mmol)，室温搅拌2.5h。加入1M的TEAB 10ml，搅拌20min终止反应，将反应液倒入100ml CH2Cl2中，用1M TEAB洗涤3次(每次30ml)，分液得到有机相，有机相用Na2SO4干燥，过滤，浓缩，常压柱分离得到产物，产率79％。产率是产物的重量与按OH[UU]AZMB计算的理论产量的百分比。
(14)合成DMTr[GUG]AZMB
在100ml圆底烧瓶中加入合成实施例5的产物(4.29g，4.04mmol)，步骤(8)得到的OH[UG]AZMB(3.60g，3.11mmol)，用无水吡啶20ml溶解样品，分三次加入MSNT(2.59g，8.71mmol)，室温搅拌3.5h。加入1M的TEAB 10ml，搅拌20min终止反应，将反应液倒入100ml CH2Cl2中，用1M TEAB洗涤3次(每次20ml)，分液得到有机相，有机相用Na2SO4干燥，过滤，浓缩，常压柱分离得到产物，柱层析纯化产率67％。产率是产物的重量与按OH[UG]AZMB计算的理论产量的百分比。
(15)合成OH[ACC]AZMB
在100ml圆底烧瓶中加入合成实施例1的产物(5.62g，5.20mmol)，步骤(6)得到的OH[CC]AZMB(5.4g，4.33mmol)，用无水吡啶22ml溶解样品，分批加入MSNT(3.59g，12.1mmol)，室温搅拌反应3h。加入1M的TEAB 10ml，搅拌20min终止反应，溶于150ml CH2Cl2中，用1M TEAB洗涤3次(每次20ml)，分液得到有机层，用无水Na2SO4干燥有机相，过滤，浓缩，常压柱分离得到产物。将得到的产物溶解于100mlCH2Cl2中，伴随搅拌缓缓倒入100ml 6％的CF3COOH，使体系中的CF3COOH的浓度为3％，室温搅拌30min。加入饱和NaHCO3中和，分液得到有机相，用饱和NaHCO3(80ml)洗涤有机相一次，用无水Na2SO4干燥有机相，过滤，浓缩，常压柱分离得到产物，产率52％。产率是产物的重量与按OH[CC]AZMB计算的理论产量的百分比。
(16)合成OH[GCA]AZMB
在100ml圆底烧瓶中加入合成实施例5的产物(4.00g，3.77mmol)，步骤(5)得到的OH[CA]AZMB(4.2g，3.28mmol)，用无水吡啶20ml溶解样品，分批加入MSNT(2.73g，9.18mmol)，室温搅拌反应3h。加入1M的TEAB 10ml，搅拌20min终止反应，溶于150ml CH2Cl2中，用1M TEAB洗涤3次(每次20ml)，分液得到有机相，用无水Na2SO4干燥有机相，过滤，浓缩，常压柱分离得到产物。将得到的产物溶解于35ml CH2Cl2中，伴随搅拌缓缓倒入35ml 6％的CF3COOH，使得体系中的CF3COOH的浓度为3％，室温搅拌30min。加入饱和NaHCO3中和，分液得到有机相，用饱和NaHCO3(25ml)洗涤有机相一次，用无水Na2SO4干燥有机相，过滤，浓缩，常压柱分离得到产物，产率68％。产率是产物的重量与按OH[CA]AZMB计算的理论产量的百分比。
(17)合成OH[UCC]AZMB
在50ml圆底烧瓶中加入合成实施例6的产物(3.59g，3.77mmol)，步骤(6)得到的OH[CC]AZMB(2.42g，2.90mmol)，加无水吡啶20ml溶解样品，分批加入MSNT(2.41g，8.12mmol)，室温搅拌反应5h。加入1M的TEAB 10ml搅拌20min终止反应，溶于100mlCH2Cl2中，用1M TEAB洗涤3次(每次20ml)，分液得到有机相，用无水Na2SO4干燥有机相，过滤，浓缩，常压柱分离得到产物。将得到的产品溶于40ml CH2Cl2中，伴随搅拌缓缓倒入40ml 6％的CF3COOH，使得体系中的CF3COOH的浓度为3％，室温搅拌反应30min。加入饱和NaHCO3中和，分液得到有机相，用饱和NaHCO3(30ml)洗涤有机相一次，用无水Na2SO4干燥有机相，过滤，浓缩，常压柱分离得到产物，产率64.1％。产率是产物的重量与按OH[CC]AZMB计算的理论产量的百分比。
(18)合成OH[ACG]AZMB
将步骤(12)得到的产物DMTr[ACG]AZMB溶于20ml CH2Cl2中，伴随搅拌，缓缓倒入20ml 6％的CF3COOH，使得体系中的CF3COOH的浓度为3％，室温搅拌反应10min。加入饱和NaHCO3中和，分液得到有机相，用饱和NaHCO3(15ml)洗涤有机相一次，用无水Na2SO4干燥有机相，过滤，浓缩，常压柱分离得到产物2.0g，产率55.％。产率是产物的重量与按HO[CG]AZMB计算的理论产量的百分比。
(19)合成OH[GAU]AZMB
在100ml圆底烧瓶中加入合成实施例5的产物(3.82g，3.69mmol)，步骤(3)得到的OH[AU]AZMB(3.30g，2.80mmol)，加入无水吡啶20ml溶解样品，分三次加入MSNT(共2.33g，7.84mmol)，室温搅拌4h。加入1M的TEAB 5ml，搅拌30min终止反应，将反应液倒入100ml CH2Cl2中，用1M TEAB洗涤3次(每次20ml)，分液得到有机相，用Na2SO4干燥有机相，过滤，浓缩，常压柱分离得到产物。将得到的产物溶于40ml CH2Cl2中，伴随搅拌，缓缓倒入40ml 6％的CF3COOH，使得体系中的CF3COOH的浓度为3％，室温搅拌反应30min。加入饱和NaHCO3中和，分液得到有机相，用饱和NaHCO3(30ml)洗涤有机相一次，用无水Na2SO4干燥有机相，过滤，浓缩，常压柱分离得到产物，产率63％。产率是产物的重量与按OH[AU]AZMB计算的理论产量的百分比。
(20)合成OH[AGG]AZMB
在100ml圆底烧瓶中加入合成实施例1的产物(3.30g，3.10mmol)，步骤(2)得到的OH[GG]AZMB(2.98g，2.35mmol)，加入无水吡啶15ml溶解样品，分批加入MSNT(1.96g，6.6mmol)，室温搅拌反应2.5h。加入1M TEAB 10ml搅拌20min终止反应，将反应液倒入150ml CH2Cl2中，用1M TEAB洗涤3次(每次20ml)，分液得到有机相，用无水Na2SO4干燥有机相，过滤，浓缩，常压柱分离得到产物。将得到的产物溶于25mlCH2Cl2中，伴随搅拌，缓缓倒入25ml 6％的CF3COOH，使得体系中的CF3COOH的浓度为4％，室温搅拌反应30min。加入饱和NaHCO3中和，分液得到有机相，用饱和NaHCO3(20ml)洗涤有机相一次，用无水Na2SO4干燥有机相，过滤，浓缩，常压柱分离得到产物，产率69％。产率是产物的重量与按OH[GG]AZMB计算的理论产量的百分比。
(21)合成OH[AACC]AZMB
在100ml圆底烧瓶中加入合成实施例1的产物(3.24g，3.00mmol)，步骤(15)得到的OH[ACC]AZMB(4.31g，2.25mmol)，加入无水吡啶15ml溶解样品，分批加入MSNT(1.87g，6.30mmol)，室温搅拌反应3h。加入1M TEAB 10ml搅拌20min终止反应，将反应液倒入100ml CH2Cl2中，用1M TEAB洗涤3次(每次20ml)，分液得到有机相，用无水Na2SO4干燥有机相，过滤，浓缩，常压柱分离得到产物。将得到的产物溶于50ml CH2Cl2中，伴随搅拌，缓缓倒入50ml 6％的CF3COOH，使得体系中的CF3COOH的浓度为3％，室温搅拌30min。加入饱和NaHCO3中和，分液得到有机相，用饱和NaHCO3(40ml)洗涤有机相一次，用无水Na2SO4干燥有机相，过滤，浓缩，常压柱分离得到产物，产率50％。产率是产物的重量与按OH[ACC]AZMB计算的理论产量的百分比。
(22)合成DMTr[CGCA]AZMB
在100ml圆底烧瓶中加入合成实施例3的产物(3.04g，2.88mmol)和步骤(16)得到的OH[GCA]AZMB(4.25g，2.21mmol)，加入无水吡啶15ml溶解样品，分三次加入MSNT(1.84g，6.19mmol)，室温搅拌3.5h。加入1M的TEAB 10ml，搅拌20min终止反应，将反应液倒入100ml CH2Cl2中，用1M TEAB洗涤3次(每次50ml)，分液得到有机相，用无水Na2SO4干燥有机相，过滤，浓缩，常压柱分离得到产物，产率76％。产率是产物的重量与按OH[GCA]AZMB计算的理论产量的百分比。
(23)合成DMTr[UUCC]AZMB
在50ml圆底烧瓶中加入合成实施例6的产物(2.43g，2.55mmol)，步骤(17)得到的OH[UCC]AZMB(3.50g，1.96mmol)，加入无水吡啶15ml溶解样品，分三次加入MSNT(1.63g，5.49ml)，室温搅拌4h。加入1M的TEAB 10ml，搅拌20min终止反应，将反应液倒入100ml CH2Cl2中，用1M TEAB洗涤3次(每次20ml)，分液得到有机相，用无水Na2SO4干燥有机相，过滤，浓缩，常压柱分离得到产物，产率78％。产率是产物的重量与按OH[UCC]AZMB计算的理论产量的百分比。
(24)合成DMTr[GG]OH
在500ml圆底烧瓶中加入步骤(9)得到的DMTr[GG]AZMB(7.55g，4.81mmol)，Ph3P(5.04g，19.2mmol)，加入240ml二氧六环/水(v∶v＝9∶1)溶解样品，室温搅拌反应8h，反应结束，除去溶剂后用高效分离纯化制备色谱(型号：Combiflash Companion/TS生产厂家：Teledyne ISCO INC.)进行快速层析，得到含三苯基氧膦和脱下的3’保护基的粗品，干燥后备用。
(25)合成DMTr[GG]PO-
在100ml圆底烧瓶中加入1，2，4-三唑(1.50g，22.1mmol)和重蒸的三乙胺(3.58g，35.4mmol)，加入16.6ml无水CH2Cl2溶解，冰浴冷却条件下滴加溶于8.8ml无水CH2Cl2的2-氯苯基二氯代磷酸酯(2.17g，8.8mmol)，搅拌反应1h。冰浴改成冰盐浴，将温度调整为-10℃至-5℃，再滴加溶于无水13.3ml CH2Cl2中的步骤(24)得到的产品DMTr[GG]OH，冰盐浴下搅拌反应4h。加入20ml 1M的TEAB，继续搅拌反应0.5小时。停止反应，分液得到有机相，用1M的TEAB洗涤三次，用无水Na2SO4干燥有机相，过滤，浓缩，常压柱分离得到产品，产率60％。产率是产物的重量与按DMTr[GG]AZMB计算的理论产量的百分比。
(26)合成DMTr[UCA]OH
采用与步骤(24)相同的方法合成DMTr[UCA]OH，不同的是，采用步骤(11)得到的DMTr[UCA]AZMB(11.3g，4.69mmol)和Ph3P(4.96g，18.7mmol)。
(27)合成DMTr[UCA]PO-
采用与步骤(25)相同的方法制备DMTr[UCA]PO-，不同的是，用19.5ml无水CH2Cl2溶解1，2，4-三唑(1.77g，26.0mmol)和重蒸的三乙胺(4.21g，41.7mmol)，用10.5ml无水CH2Cl2溶解2-氯苯基二氯代磷酸酯(2.56g，10.4mmol)，用15.6ml无水CH2Cl2溶解步骤(26)得到的DMTr[UCA]OH。产率79％。产率是产物的重量与按DMTr[UCA]AZMB计算的理论产量的百分比。
(28)合成DMTr[UGC]OH
采用与步骤(24)相同的方法合成DMTr[UGC]OH，不同的是，采用步骤(10)得到的DMTr[UGC]AZMB(10.6g，4.42mmol)和Ph3P(4.63g，17.7mmol)。
(29)合成DMTr[UGC]PO-
采用与步骤(25)相同的方法制备DMTr[UGC]PO-，不同的是，用19.4ml无水CH2Cl2溶解1，2，4-三唑(1.76g，25.9mmol)和重蒸的三乙胺(4.18g，41.4mmol)，用10.4ml无水CH2Cl2溶解2-氯苯基二氯代磷酸酯(2.54g，10.3mmol)，用15.5ml无水CH2Cl2溶解步骤(28)得到的DMTr[UGC]OH，产率71％。产率是产物的重量与按DMTr[UGC]AZMB计算的理论产量的百分比。
(30)合成DMTr[GUU]OH
采用与步骤(24)相同的方法合成DMTr[GUU]OH，不同的是，采用步骤(13)得到的DMTr[GUU]AZMB(5.41g，2.36mmol)和Ph3P(2.47g，9.43mmol)，二氧六环/水(v∶v＝9∶1)的用量为120ml。
(31)合成DMTr[GUU]PO-
采用与步骤(25)相同的方法制备DMTr[GUU]PO-，不同的是，用9.8ml无水CH2Cl2溶解1，2，4-三唑(891mg，13.1mmol)和重蒸的三乙胺(2.12g，21.0mmol)，用5.2ml无水CH2Cl2溶解2-氯苯基二氯代磷酸酯(2.54g，10.3mmol)，用7.9ml无水CH2Cl2溶解步骤(30)得到的DMTr[GUU]OH，产率64％。产率是产物的重量与按DMTr[GUU]AZMB计算的理论产量的百分比。
(32)合成DMTr[GUG]OH
采用与步骤(24)相同的方法合成DMTr[GUG]OH，不同的是，采用步骤(14)得到的DMTr[GUG]AZMB(4.40g，1.83mmol)和Ph3P(1.92g，7.33mmol)，二氧六环/水(v∶v＝9∶1)的用量为900ml。
(33)合成DMTr[GUG]PO-
采用与步骤(25)相同的方法制备DMTr[GUG]PO-，不同的是，用6.8ml无水CH2Cl2溶解1，2，4-三唑(622mg，9.15mmol)和重蒸的三乙胺(1.48g，14.7mmol)，用3.6ml无水CH2Cl2溶解2-氯苯基二氯代磷酸酯(898mg，3.66mmol)，用5.5ml无水CH2Cl2溶解步骤(32)得到的DMTr[GUG]OH，产率64％。产率是产物的重量与按DMTr[GUG]AZMB计算的理论产量的百分比。
(34)合成DMTr[CGCA]OH
采用与步骤(24)相同的方法合成DMTr[CGCA]OH，不同的是，采用步骤(22)得到的DMTr[CGCA]AZMB(4.77g，1.67mmol)和Ph3P(1.74g，6.66mmol)。
(35)合成DMTr[CGCA]PO-
采用与步骤(25)相同的方法制备DMTr[CGCA]PO-，不同的是，用10.0ml无水CH2Cl2溶解1，2，4-三唑(604mg，8.88mmol)和重蒸的三乙胺(1.62g，16.0mmol)，用3.5ml无水CH2Cl2溶解2-氯苯基二氯代磷酸酯(873mg，3.55mmol)，用5.4ml无水CH2Cl2溶解步骤(34)得到的DMTr[CGCA]OH，产率64％。产率是产物的重量与按DMTr[GUU]AZMB计算的理论产量的百分比。
(36)合成DMTr[UUCC]OH
采用与步骤(24)相同的方法合成DMTr[UUCC]OH，不同的是，采用步骤(23)得到的DMTr[UUCC]AZMB(3.85g，1.19mmol)和Ph3P(1.25g，4.77mmol)，二氧六环/水(v∶v＝9∶1)的混合溶液的用量为60ml。
(37)合成DMTr[UUCC]PO-
采用与步骤(25)相同的方法制备DMTr[UUCC]PO-，不同的是，用9.8ml无水CH2Cl2溶解1，2，4-三唑(891mg，13.1mmol)和重蒸的三乙胺(2.12g，21.0mmol)，用5.2ml无水CH2Cl2溶解2-氯苯基二氯代磷酸酯(1.29g，5.25mmol)，用5.5ml无水CH2Cl2溶解步骤(36)得到的产品DMTr[UUCC]OH，产率86％。产率是产物的重量与按DMTr[UUCC]AZMB计算的理论产量的百分比。
(38)合成DMTr[GGAACC]AZMB
在100ml圆底烧瓶中加入步骤(25)得到的DMTr[GG]PO-(2.74g，2.15mmol)和步骤(21)得到的HO[AACC]AZMB(2.70g，1.05mmol)，加入10ml无水吡啶完全溶解后，分批加入MSNT(0.873g，2.94mmol)，室温反应3h，加入1ml 1M的TEAB再搅拌25min后，停止反应，倒入约100ml CH2Cl2中，用1M TEAB洗涤3次，分液得到有机相，用无水Na2SO4干燥有机相，过滤，浓缩，常压柱分离得到产品，产率48％。
(39)合成DMTr[UCACA]AZMB
采用与步骤(38)相同的方法合成DMTr[UCACA]AZMB，不同的是，采用步骤(27)得到的DMTr[UCA]PO-(4.84g，2.16mmol)，步骤(5)得到的HO[CA]AZMB(2.01g，1.57mmol)，无水吡啶的用量为15ml，MSNT(1.31g，4.40mmol)。产率66％。
(40)合成DMTr[UCAACG]AZMB
采用与步骤(38)相同的方法合成DMTr[UCAACG]AZMB，不同的是，采用步骤(27)得到的DMTr[UCA]PO-(4.56g，2.03mmol)，步骤(20)得到的HO[ACG]AZMB(2.70g，1.41mmol)，无水吡啶的用量为15ml，MSNT(1.17g，3.95mmol)。产率60％。
(41)合成DMTr[CGCAUU]AZMB
采用与步骤(38)相同的方法合成DMTr[CGCAUU]AZMB，不同的是，采用步骤(35)得到的DMTr[CGCA]PO-(3.2g，1.07mmol)，步骤(4)得到的HO[UU]AZMB(1.05g，1.00mmol)，无水吡啶的用量为10ml，MSNT(832mg，2.80mmol)。产率87％。
(42)合成DMTr[UGCGC]AZMB
采用与步骤(38)相同的方法合成DMTr[UGCGC]AZMB，不同的是，采用步骤(29)得到的DMTr[UGC]PO-(7.00g，3.14mmol)，步骤(7)得到的HO[GC]AZMB(3.10g，2.46mmol)，无水吡啶的用量为25ml，MSNT(2.05g，6.89mmol)。产率78％。
(43)合成DMTr[GUUGAU]AZMB
采用与步骤(38)相同的方法合成DMTr[GUUGAU]AZMB，不同的是，采用步骤(31)得到的DMTr[GUU]PO-(3,20g，1.51mmol)，步骤(19)得到的HO[GAU]AZMB(2.30g，1.27mmol)，无水吡啶的用量为12ml，MSNT(1.06g，3.56mmol)。产率74％。
(44)合成DMTr[GUGAGG]AZMB
采用与步骤(38)相同的方法合成DMTr[GUGAGG]AZMB，不同的是，采用步骤(33)DMTr[GUG]PO-(2.6g，1.16mmol)，步骤(18)得到的HO[AGG]AZMB(1.90g，0.99mmol)，无水吡啶的用量为10ml，MSNT(832mg，2.8mmol)。产率74％。
(45)合成DMTr[UUCCUU]AZMB
采用与步骤(38)相同的方法合成DMTr[UUCCUU]AZMB，不同的是，采用步骤(37)得到的DMTr[UUCC]PO-(2.80g，1.02mmol)，步骤(4)得到的HO[UU]AZMB(0.94g，0.90mmol)，无水吡啶的用量为10ml，MSNT(748mg，2.52mmol)。产率82％。
(46)合成HO[UCACA]AZMB
将步骤(39)得到的DMTr[UCACA]AZMB(3.80g，1.03mmol)溶于15ml CH2Cl2中，缓缓倒入6％的CF3COOH，使得体系中的CF3COOH的浓度为4％，室温搅拌30min。加入饱和NaHCO3中和，分液得到有机相，用15ml饱和NaHCO3洗涤有机相一次，无水Na2SO4干燥有机相，过滤，浓缩，常压柱分离得到产品，产率84％。
(47)合成HO[CGCAUU]AZMB
采用与步骤(46)相同的方法制备HO[CGCAUU]AZMB，不同的是，采用步骤(41)得到的DMTr[CGCAUU]AZMB(3.8g，0.97mmol)。产率58％。
(48)合成HO[GUUGAU]AZMB
采用与步骤(46)相同的方法制备HO[GUUGAU]AZMB，不同的是，采用步骤(43)得到的DMTr[GUUGAU]AZMB(3.50g，0.94mmol)。产率58％。
(49)合成HO[UUCCUU]AZMB
采用与步骤(46)相同的方法制备HO[UUCCUU]AZMB，不同的是，采用步骤(45)得到的DMTr[UUCCUU]AZMB(2.90g，0.79mmol)。产率87％。
(50)合成DMTr[GGAACC]PO-
在100ml圆底烧瓶中加入步骤(38)得到的DMTr[GGAACC]AZMB(2.20g，0.50mmol)，Ph3P(524mg，2.00mmol)，加入25ml二氧六环/水(v∶v＝9∶1)溶解后，室温搅拌反应18h，旋蒸除去溶剂后，用高效分离纯化制备色谱(型号：CombiflashCompanion/TS生产厂家：Teledyne ISCO INC.)进行快速层析，得到含三苯基氧膦和脱下的3’保护基的粗品2.00g，干燥后备用。
在100ml圆底烧瓶中加入1，2，4-三唑(170mg，2.50mmol)和重蒸的三乙胺(454mg，4.50mmol)，加入1.5ml无水CH2Cl2溶解，冰浴冷却条件下，滴加入溶于1.0ml无水CH2Cl2的2-氯苯基二氯代磷酸酯(246mg，1.0mmol)，搅拌反应1h。冰浴改成冰盐浴，将温度调整为-10℃至-5℃，再滴加溶于无水CH2Cl2的上一步得到的产品DMTr[GGAACC]OH，搅拌反应4h。加入10ml 1M的TEAB，继续搅拌反应0.5小时。停止反应，分液得到有机相，用1M的TEAB洗涤有机相三次，用无水Na2SO4干燥有机相，过滤，浓缩，常压柱分离得到产品，两步合计产率54％。
(51)合成DMTr[UCAACG]PO-
采用与步骤(50)相同的方法合成DMTr[UCAACG]PO-，不同的是，采用步骤(40)得到的DMTr[UCAACG]AZMB(3.60g，0.94mmol)。两步的产率66％。
(52)合成DMTr[UGCGC]PO-
采用与步骤(50)相同的方法合成DMTr[UGCGC]PO-，不同的是，采用步骤(42)得到的DMTr[UGCGC]AZMB(6.40g，1.90mmol)。两步的产率70％。
(53)合成DMTr[GUGAGG]PO-
采用与步骤(50)相同的方法合成DMTr[GUGAGG]PO-，不同的是，采用步骤(38)得到的DMTr[GGAACC]AZMB(3.00g，0.75mmol)。两步的产率41％。
(54)合成DMTr[GGAACCUCACA]AZMB
在50ml圆底烧瓶中加入步骤(50)得到的DMTr[GGAACC]PO-(1.2g，0.26mmol)，步骤(46)得到的HO[UCACA]AZMB(0.85g，0.25mmol)，加入5ml无水吡啶完全溶解后，分批加入MSNT(208mg，0.70mmol)，室温反应8h。加入1ml 1M的TEAB搅拌25min后，停止反应，将反应液倒入约50ml CH2Cl2中，用1M TEAB洗涤3次，分液得到有机相，用无水Na2SO4干燥有机相，过滤，浓缩，常压柱分离得到产品1.40g，产率71％。
(55)合成DMTr[UGCGCGUUGAU]AZMB
在50ml圆底烧瓶中加入步骤(52)得到的DMTr[UGCGC]PO-(2.52g，0.72mmol)，步骤(48)得到的HO[GUUGAU]AZMB(2.5g，0.71mmol)，加入8ml无水吡啶完全溶解后，分批加入MSNT(500mg，1.68mmol)，室温反应8h。加入1ml 1M的TEAB搅拌25min后，停止反应，将反应液倒入约50ml CH2Cl2中，用1M TEAB洗涤3次，分液得到有机相，用无水Na2SO4干燥有机相，过滤，浓缩，常压柱分离得到产品，产率49％。
(56)合成DMTr[UCAACGCGCAUU]AZMB
在50ml圆底烧瓶中加入步骤(51)得到的DMTr[UCAACG]PO-(2.43g，0.61mmol)，步骤(47)得到的HO[CGCAUU]AZMB(1.85g，0.51mmol)，加入8ml无水吡啶完全溶解后，分批加入MSNT(424mg，1.43mmol)，室温反应8h，加入1ml 1M的TEAB搅拌25min，停止反应，将反应液倒入约50ml CH2Cl2中，用1M TEAB洗涤3次，分液得到有机相，用无水Na2SO4干燥有机相，过滤，浓缩，常压柱分离得到产品，直接用于下一步反应。
(57)合成DMTr[GUGAGGUUCCUU]AZMB
在50ml圆底烧瓶中加入步骤(53)得到的DMTr[GUGAGG]PO-(1.40g，0.30mmol)和步骤(49)得到的HO[UUCCUU]AZMB(1.24g，0.37mmol)，加入6ml无水吡啶完全溶解后，分批加入MSNT(249mg，0.84mmol)，室温反应8h，加入1ml 1M的TEAB搅拌25min后，停止反应，将反应液倒入约50ml CH2Cl2中，用1MTEAB洗涤3次，分液得到有机相，用无水Na2SO4干燥有机相，过滤，浓缩，常压柱分离得到产品，直接用于下一步反应。
(58)合成HO[UCAACGCGCAUU]AZMB
将步骤(56)得到的DMTr[UCAACGCGCAUU]AZMB溶于10ml CH2Cl2中，缓缓加入6％的CF3COOH，使体系中CF3COOH的浓度为4％，室温搅拌30min。加入饱和NaHCO3中和，分液得到有机相，用饱和NaHCO3洗涤有机相一次，用无水Na2SO4干燥有机相，过滤，浓缩，常压柱分离得到产物，产率53％。产率是产物的重量与按HO[CGCAUU]AZMB计算的理论产量的百分比。
(59)合成HO[GUGAGGUUCCUU]AZMB
将步骤(57)得到的DMTr[GUGAGGUUCCUU]AZMB溶于10ml CH2Cl2中，缓缓加入6％的CF3COOH，使体系中CF3COOH的浓度为4％，室温搅拌30min。加入饱和NaHCO3中和，分液得到有机相，用饱和NaHCO3洗涤有机相一次，用无水Na2SO4干燥有机相，过滤，浓缩，常压柱分离得到产物，产率54％。产率是产物的重量与按HO[UUCCUU]AZMB计算的理论产量的百分比。
(60)合成DMTr[GGAACCUCACA]PO-
在100ml圆底烧瓶中加入步骤(54)得到的DMTr[GGAACCUCACA]AZMB(1.40g，0.18mmol)和Ph3P(200mg，0.76mmol)，加入10ml二氧六环/水(v∶v＝9∶1)溶解后，室温搅拌反应28h，用旋蒸除去溶剂后，用高效分离纯化制备色谱进行快速层析，得到含三苯基氧膦和脱下的3’保护基的粗品1.2g，干燥后备用。
在25ml圆底烧瓶中加入1，2，4-三唑(65mg，0.96mmol)和重蒸的三乙胺(162mg，1.60mmol)，加入0.5ml无水CH2Cl2溶解，冰浴冷却条件下滴加入溶于0.5ml无水CH2Cl2的2-氯苯基二氯代磷酸酯(98mg，0.40mmol)，搅拌反应1h。冰浴改成冰盐浴，将温度调整为-10℃至-5℃，再滴加溶于无水CH2Cl2中的上一步得到的产品DMTr[GGAACCUCACA]OH，搅拌反应5.5h。加入3ml 1M的TEAB，继续搅拌反应1小时。分液得到有机相，用1M的TEAB洗涤有机相三次，无水Na2SO4干燥有机相，过滤，浓缩，常压柱分离得到产物，产率43％。产率是产物的重量与按DMTr[GGAACCUCACA]AZMB计算的理论产量的百分比。
(61)合成DMTr[UGCGCGUUGAU]PO-
在100ml圆底烧瓶中加入步骤(55)得到的DMTr[UGCGCGUUGAU]AZMB(1.95g，0.28mmol)和Ph3P(350mg，1.34mmol)，加入10ml二氧六环/水(v∶v＝9∶1)溶解样品后，室温搅拌反应28h，反应结束，旋蒸除去溶剂后，用高效分离纯化制备色谱进行快速层析，得到含三苯基氧膦和脱下的3’保护基的粗品1.45g，干燥后备用。
在100ml圆底烧瓶中加入1，2，4-三唑(90mg，1.32mmol)和重蒸的三乙胺(224mg，2.22mmol)，加入1.0ml无水CH2Cl2溶解样品，冰浴冷却条件下滴加溶于0.5ml无水CH2Cl2的2-氯苯基二氯代磷酸酯(137mg，0.56mmol)，搅拌反应1h。冰浴改成冰盐浴，将温度调整为-10℃至-5℃，再滴加溶于无水CH2Cl2的上一步得到的产品DMTr[UGCGCGUUGAU]OH，搅拌反应5.5h。加入3ml 1M的TEAB，继续搅拌反应1小时。停止反应，分液得到有机相，用1M的TEAB洗涤有机相三次，用无水Na2SO4干燥有机相，过滤，浓缩，常压柱分离得到产物，产率34.4％。产率是产物的重量与按DMTr[UGCGCGUUGAU]AZMB计算的理论产量的百分比。
(62)合成DMTr[GGAACCUCACAUCAACGCGCAUU]AZMB
在25ml圆底烧瓶中加入步骤(60)得到的DMTr[GGAACCUCACA]PO-(560mg，70mmol)和步骤(58)得到的HO[UCAACGCGCAUU]AZMB(500mg，70mmol)，加入1.5ml无水吡啶完全溶解样品后，分批加入MSNT(62mg，0.21mmol)，室温反应8h，加入1ml 1M的TEAB搅拌25min后，停止反应，将反应液倒入约50ml CH2Cl2中，用1M TEAB洗涤3次，分液得到有机相，用无水Na2SO4干燥有机相，过滤，浓缩，常压柱分离得到产物，产率96％。
(63)合成DMTr[UGCGCGUUGAUGUGAGGUUCCUU]AZMB
在25ml圆底烧瓶中加入步骤(61)得到的DMTr[UGCGCGUUGAU]PO-(560mg，79umol)和步骤(59)得到的HO[GUGAGGUUCCUU]AZMB(600mg，79umol)，加入1.5ml无水吡啶完全溶解样品后，分批加入MSNT(70mg，0.24mmol)，室温反应8h。加入1ml 1M的TEAB搅拌25min后，停止反应，将反应液倒入约50ml CH2Cl2中，用1M TEAB洗涤3次，分液得到有机相，用无水Na2SO4干燥有机相，过滤，浓缩，常压柱分离得到产物，产率88％。
实施例4
该实施例合成寡核苷酸。
合成目标：5’-GGAACCUCACAUCAACGCGCAUU-3’
和5’-UGCGCGUUGAUGUGAGGUUCCUU-3’
采用与实施列2相同的方法脱除保护基，不同的是分别使用实施列3合成的DMTr[GGAACCUCACAUCAACGCGCAUU]AZMB和DMTr[UGCGCGUUG
AUGUGAGGUUCCUU]AZMB代替DMTr[CGAAAGAACG]AZMB。
经测序与设计合成序列相符。

Claims (10)

1.一种寡核苷酸的制备方法，其特征在于，该方法包括在缩合反应条件下将式（1）的化合物与式（2）的化合物在液态反应介质中反应，得到式（3）的化合物，所述缩合反应的条件包括使用1-均三甲苯磺酰（3-硝基）-三唑或1-均三甲苯磺酰三唑作为缩合剂；所述液态反应介质为吡啶；
Figure FDA00001971831400011
其中，R1表示二对甲氧三苯甲基、RNA或DNA；
R2和R3各自表示位阻型硅烷保护基团；
R4表示卤素原子；
A+表示三烷基铵离子；所述三烷基铵离子中的各个烷基具有1-4个碳原子；
B1和B2各自表示N-酰基取代的鸟嘌呤基、N-酰基取代的腺嘌呤基、N-酰基取代的胞嘧啶基、胸腺嘧啶基或尿嘧啶基；B1和B2中的酰基为具有2-10个碳原子的酰基。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述缩合反应条件还包括：相对于1摩尔的式（1）的化合物，式（2）的化合物的用量为0.8-3摩尔，缩合剂的用量为2-5摩尔，反应介质的用量为5-50升；反应温度为10-50℃，反应时间为0.5-10小时。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，R2和R3各自表示叔丁基二甲基氯硅烷基、苯基二甲基氯硅烷基、叔丁基二苯基氯硅烷基或三异丙基氯硅烷基；R4表示氯或溴；所述酰基为苯甲酰基、异丁酰基或乙酰基。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，在式（1）或式（3）中，-CH2-N3位于邻位；在式（2）或式（3）中，R4位于邻位。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，式（1）的化合物是通过在缩合反应条件下将式（4）的化合物与式（5）的化合物反应，然后去除5’位上的R5保护基而得到的，
Figure FDA00001971831400021
其中，R2表示位阻型硅烷保护基团；
R5表示二对甲氧三苯甲基；
R6表示卤素原子；
B1表示N-酰基取代的鸟嘌呤基、N-酰基取代的腺嘌呤基、N-酰基取代的胞嘧啶基、胸腺嘧啶基或尿嘧啶基，B1中的酰基为具有2-10个碳原子的酰基。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述缩合反应条件包括：使用N-甲基咪唑作为辅助剂；使用二氯甲烷、吡啶中的一种或几种作为反应介质；相对于1摩尔的式（4）的化合物，式（5）的化合物的用量为1-5摩尔，辅助剂的用量为1.8-3.5摩尔，反应介质的用量为20-200升；反应温度为-10℃至10℃，反应时间为5-100小时。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其中，式（5）的化合物的制备方法包括以下步骤：
（1）在过氧化苯甲酰的存在下，将式（9）的化合物与N-卤代琥珀酰亚胺反应，得到式（10）的化合物；
（2）将式（10）的化合物与碱金属叠氮化物反应，得到式（11）的化合物；
（3）将式（11）的化合物水解，酰化得到式（5）的化合物，
Figure FDA00001971831400031
其中，R9表示卤素原子；R10表示C1-C4的烷基。
8.根据权利要求7所述的方法，其中，在步骤（1）中，反应介质为四氯化碳、氯仿、苯、甲苯和庚烷中的一种或几种，相对于1摩尔的式（9）的化合物，N-卤代琥珀酰亚胺的用量为1-3摩尔，过氧化苯甲酰的用量为0.01-0.1摩尔，反应介质的用量为5-20升，反应温度为80-120℃，反应时间为0.5-6小时；
在步骤（2）中，反应介质为乙醇、丙酮、N,N-二甲基甲酰胺和二甲基亚砜中的一种或几种，相对于1摩尔的式（10）的化合物，碱金属叠氮化物的用量为1-3摩尔，反应介质的用量为3-10升，反应温度为0至80℃，反应时间为2-30小时；
在步骤（3）中，所述水解包括将式（11）的化合物与碱金属氢氧化物的醇-水混合溶液反应，相对于1摩尔的式（10）的化合物，碱金属氢氧化物的用量为5-100摩尔，反应温度为0-50℃，反应时间为0.1-2小时，在所述醇-水混合溶液中碱金属氢氧化物的浓度为5-10重量％。
9.根据权利要求1所述的方法，其中，式（2）的化合物是通过在催化剂存在下将式（6）的化合物、式（7）的化合物和三烷基胺在反应介质中反应而得到的，所述催化剂选自1,2,4-三唑、三乙胺、吡啶中的一种或几种，所述反应介质选自二氯甲烷、二氧六环、四氢呋喃中的一种或几种，
Figure FDA00001971831400041
其中，R1表示二对甲氧三苯甲基、RNA或DNA；
R3表示位阻型硅烷保护基团；
R4、R7和R8各自表示卤素原子；
B2表示N-酰基取代的鸟嘌呤基、N-酰基取代的腺嘌呤基、N-酰基取代的胞嘧啶基、胸腺嘧啶基或尿嘧啶基，B2中的酰基为具有2-10个碳原子的酰基，所述三烷基胺中的各个烷基具有1-4个碳原子。
10.根据权利要求9所述的方法，其中，所述反应的温度为-10℃至10℃，反应时间为0.5-10小时；相对于1摩尔的式（6）的化合物，式（7）的化合物的用量为1-5摩尔，三烷基胺的用量为1-50摩尔，催化剂的用量为2-10摩尔。
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1245809A (zh) * 1998-08-21 2000-03-01 中国科学院上海生物化学研究所 固定化模板指导的寡核苷酸合成方法
CN1409719A (zh) * 1999-10-14 2003-04-09 艾夫西亚有限公司 制备硫代磷酸三酯和寡核苷酸的方法
CN101133073A (zh) * 2005-03-04 2008-02-27 集润德斯股份公司 寡核苷酸的合成

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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DD273064A1 (de) * 1988-06-20 1989-11-01 Univ Dresden Tech Verfahren zur herstellung von oligonucleotiden

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1245809A (zh) * 1998-08-21 2000-03-01 中国科学院上海生物化学研究所 固定化模板指导的寡核苷酸合成方法
CN1409719A (zh) * 1999-10-14 2003-04-09 艾夫西亚有限公司 制备硫代磷酸三酯和寡核苷酸的方法
CN101133073A (zh) * 2005-03-04 2008-02-27 集润德斯股份公司 寡核苷酸的合成

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