CN101868473A

CN101868473A - 一种寡核苷酸的制备方法

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Publication number: CN101868473A
Application number: CN200980101058A
Authority: CN
Inventors: 席真; 黄金宇; 章骏斌
Original assignee: Suzhou Ribo Life Science Co Ltd
Current assignee: Suzhou Ruibo Biotechnology Co., Ltd
Priority date: 2008-09-23
Filing date: 2009-09-22
Publication date: 2010-10-20
Anticipated expiration: 2029-09-22
Also published as: JP5253578B2; EP2380896A1; EP2380896A4; US8569476B2; CN101868473B; WO2010037326A1; US20110237786A1; JP2012502935A; EP2380896B1; CN101684136A; DK2380896T3

Abstract

一种寡核苷酸的制备方法，其中，该方法包括在缩合反应条件下将式(1)的化合物与式(2)的化合物在液态反应介质中反应，得到式(3)的化合物。本发明的方法中采用适当的保护基保护相应的官能团，只裸露出式(1)的化合物(OH-组分)的需要连接的5’端羟基和式(2)的化合物(P-组分)的需要连接的3’端磷酸盐，在液态反应介质中进行缩合反应，连接OH-组分和P-组分，得到DNA或RNA短链。本发明的方法不需要使用固相柱，可以在液态反应介质中进行，因此能够大规模合成寡核苷酸。

Description

种寡核苷酸的制备方法技术领域

本发明涉及一种寡核苷酸的制备方法。背景技术

寡核苷酸的基本结构单元是核苷酸，核苷酸由碱基、戊糖和磷酸组成。核苷酸可以分为核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸，二者的基本化学结构相同，只是所含戊糖不同，核糖核苷酸的戊糖是 D-核糖，脱氧核糖核苷酸的戊糖是 D-2-脱氧核糖。碱基的种类一般包括鸟嘌吟基、腺嘌吟基、胞嘧啶基、胸腺嘧啶基或尿嘧啶基。

目前广泛使用的寡核苷酸化学合成方法是固相合成法（也称作亚磷酰三酯法）。《生物化学》（第三版上册，王镜岩等主编，高等教育出版社）第 520-521 页介绍了固相合成的原理如下：全部反应是在一个不大的固相柱子中进行的。首先将待活化的核苷酸上的某些游离基团保护（封闭）起来，使反应按设计的方向进行。 5'-OH用二对甲氧三苯甲基（DMT) 保护，碱基上的氨基用苯甲酰基保护。然后对 3'-OH则用氨基亚磷酸化合物进行活化。第一个核苷酸的 3'-OH与固相（树脂）结合在一起，它的 5'-OH与活化的单体（核苷酸）之间形成一个亚磷酸三酯，活化单体上的 5'-OH和碱基上的氨基等由于受到保护而不会参与反应。在第二步反应中，亚磷酸三酯经碘氧化形成磷酸三酯；第三步反应中，加入三氯乙酸除去生长链中的 5'-OH上的保护剂 DMT。至此， DNA链已经延伸了一个核苷酸单元，并可投入下一轮延伸反应。按事先输入的程序，整个 DNA 片段合成完毕之后，用苯硫酚除去 5'-OH上的保护剂 DMT，用浓氢氧化铵将 DNA片段与固相树脂断开，使 DNA得以洗脱下来。再用浓氢氧化铵在加热条件下使碱基上的保护剂除去。最后除去氢氧化铵，在真空中抽干。

由于上述固相合成的全部过程是在固相柱子中进行的，受到固相柱子的体积所限，该方法的合成规模小、产率低，无法满足大量合成的要求。随着对核酸研究的深入，一方面在科学研究中用到的寡聚核糖核酸迅速增加，另一方面，将核糖核酸用于临床方兴未艾，因此，设计能够进行大规模合成 RNA的方法意义重大。发明内容

本发明的目的是为了克服现有的寡核苷酸化学合成方法的合成规模小的缺点，提供一种能够大规模合成寡核苷酸的制备方法。

本发明提供了一种寡核苷酸的制备方法，其中，该方法包括在缩合反应条件下将式（1 ) 的化合物与式（2) 的化合物在液态反应介质中反应，得到式（3 ) 的化合物，

其中，表示 DMTr (二对甲氧三苯甲基）、 RNA或 DNA;

R₂和各自表示位阻型硅烷保护基团；

表示卤素原子；

A⁺表示三烷基铵离子；

8₁和 B₂各自表示 N-酰基取代的鸟嘌吟基、 N-酰基取代的腺嘌吟基、 N-酰基取代的胞嘧啶基、胸腺嘧啶基或尿嘧啶基。

本发明的方法中采用适当的保护基保护相应的官能团，只裸露出式（1 ) 的化合物的需要连接的 5'端羟基和式（2) 的化合物的需要连接的 3'端磷酸盐，在液态反应介质中进行缩合反应，连接 OH-组分和 P-组分，得到 DNA或 RNA短链。如果需要的话，在这个步骤完成之后，可以脱除新得到的 DNA或 RNA短链 5'端的保护基，再次和新的式（2) 的化合物进行缩合反应，即得到较长的链，重复进行这样的几步反应，最后脱除所有的保护基，即得到要具有所需长度的寡核苷酸；或者，可以脱除新得到的 DNA 或 RNA短链 3'端的保护基，然后将 3'端羟基磷酸酯化得到新的 P-组分（如反应式 III 所示的反应），再次和新的式（3 ) 的化合物进行缩合反应缩合，即得到较长的链，重复进行这样的几步反应，最后脱除所有的保护基，即得到要合成的寡核苷酸。本发明的方法不需要使用固相柱，可以在液态反应介质中进行，因此能够大规模合成寡核苷酸。具体实施方式

本发明提供的寡核苷酸的制备方法包括在缩合反应条件下将式（1 ) 的化合物与式 (2) 的化合物在液态反应介质中反应，得到式（3 ) 的化合物，

式 ( 1 ) 式（2)

式 (3 )

其中，表示 DMTr (二对甲氧三苯甲基）、 RNA或 DNA;

R₂和各自表示位阻型硅烷保护基团；

表示卤素原子；

A⁺表示三烷基铵离子；

Bi和 B₂各自表示 N-酰基取代的鸟嘌吟基、 N-酰基取代的腺嘌吟基、 N-酰基取代的胞嘧啶基、胸腺嘧啶基或尿嘧啶基。

该步骤可以由反应式 I表示：

ίΚ. α ) 式（.2) ( 3 ) 反应式 I

所述缩合反应条件可以包括：

可以使用 MSNT ( 1-均三甲苯磺酰（34肖基） -三唑）或 MSNI ( 1-均三甲苯磺酰三唑）中的一种或几种作为缩合剂。

MSNT如式（8) 所示：

式（8)

所述反应介质可以为吡啶。

相对于 1摩尔的式（1 ) 的化合物，式（2) 的化合物的用量可以为 0.8-3摩尔，优选为 1-2摩尔，更优选为 1-1.3摩尔；缩合剂的用量可以为 2-5摩尔，优选为 2.5-3摩尔; 反应介质的用量可以为 5-50升，优选为 5-20升。

反应式 I所示的反应的反应温度可以为 10-50°C，优选为 20-35°C _;反应时间可以为 0.5-10小时，优选为 1-5小时。

在式（1 )、式（2)和式（3 ) 中，所述位阻型硅烷保护基团可以为各种具有位阻和保护功能的硅烷基团，优选为叔丁基二甲基氯硅烷基、苯基二甲基氯硅烷基、叔丁基二苯基氯硅烷基或三异丙基氯硅烷基，更优选为叔丁基二甲基氯硅烷基。

所述卤素原子可以为氟、氯、溴或碘，优选为氯或溴，更优选为氯。

所述三烷基铵离子中的各个烷基可以相同或不同，可以各自具有 1-6个碳原子，优选具有 1-4个碳原子。特别优选的烷基的例子包括但不限于甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基和叔丁基。

8₁和中的酰基可以为具有 2-10个碳原子的酰基，优选为苯甲酰基、异丁酰基或乙酰基。

在式（1 ) 或式（3 ) 中， -CH₂-N₃可以位于邻位、间位或对位，优选位于邻位。在式（2) 或式（3 ) 中，可以位于邻位、间位或对位，优选位于邻位。

反应式 I的反应完成之后，可以终止反应，并分离出产物。

终止反应的方法可以为将反应溶液与碳酸氢三乙胺盐的水溶液（TEAB) 混合，在搅拌条件下保持 10-90分钟。碳酸氢三乙胺盐的水溶液的浓度可以为 0.1-1摩尔 /升，碳酸氢三乙胺盐的水溶液与所述反应介质的体积比可以为 0.02-0.5。

所述分离的方法可以包括将终止反应后的反应溶液与二氯甲烷混合，加入碳酸氢三乙胺盐的水溶液进行洗涤，将有机相干燥、过滤、浓缩、常压柱分离，即可得到产物。二氯甲烷与所述反应介质的体积比可以为 2-20。碳酸氢三乙胺盐的水溶液的浓度可以为 0.05-0.5摩尔 /升，所述洗涤可以进行一次或多次，洗涤用的碳酸氢三乙胺盐的水溶液的总体积与所述反应介质的体积比可以为 2-20。所述干燥、过滤、浓缩、常压柱分离的方法已为本领域技术人员所公知，在此不再赘述。

如果需要的话，在反应式 I的反应完成之后，可以脱除得到的 DNA或 RNA短链 5' 端的保护基（如式 II所示的第二步反应），再次和新的式（2) 的化合物进行缩合反应，即得到较长的链，重复进行这样的几步反应，最后脱除所有的保护基，即得到要具有所需长度的寡核苷酸；或者，可以脱除新得到的 DNA或 RNA短链 3'端的保护基，然后将 3'端羟基磷酸酯化得到新的 P-组分（如反应式 III所示的反应），再次和新的式（3 ) 的化合物进行缩合反应缩合，即得到较长的链，重复进行这样的几步反应，最后脱除所有的保护基，即得到要合成的寡核苷酸。

根据本发明的方法，其中，式（1 )的化合物可以如反应式 Π所示的反应制备得到，即在缩合反应条件下将式（4) 的化合物与式（5 ) 的化合物反应，然后去除 5'位上的保护基。

式（1 ) 反应式（II)

在式（4) 和式（5 ) 中， R₂表示位阻型硅烷保护基团，可以为各种具有位阻和保护功能的硅烷基团，优选为叔丁基二甲基氯硅烷基、苯基二甲基氯硅烷基、叔丁基二苯基氯硅烷基或三异丙基氯硅烷基，更优选为叔丁基二甲基氯硅烷基。

R₅表示 DMTr (二对甲氧三苯甲基）、 RNA或 DNA。

¾表示卤素原子。所述卤素原子可以为氟、氯、溴或碘，优选为氯或溴，更优选为氯。

Bi表示 N-酰基取代的鸟嘌吟基、 N-酰基取代的腺嘌吟基、 N-酰基取代的胞嘧啶基、胸腺嘧啶基或尿嘧啶基。酰基可以为具有 2-10 个碳原子的酰基，优选为苯甲酰基、异丁酰基或乙酰基。

在式（1 ) 或式（4) 中， -CH₂-N₃可以位于邻位、间位或对位，优选位于邻位。反应式 II中，所述缩合反应的条件可以包括：使用 N-甲基咪唑作为辅助剂；使用二氯甲烷、吡啶中的一种或几种作为反应介质。

相对于 1摩尔的式（4) 的化合物，式（5 ) 的化合物的用量可以为 1-3摩尔，优选为 1.5-3摩尔；辅助剂的用量可以为 1-8摩尔，优选为 2-3.5摩尔；反应介质的用量可以为 20-200升，优选为 30-150升。反应温度可以为 -10°C至 10°C，优选在冰浴中进行；反应时间可以为 5-100小时，优选为 10-60小时。

反应式 II的缩合反应完成之后，可以终止反应，并分离出缩合反应产物。

终止反应的方法可以为将反应溶液与饱和碳酸氢钠水溶液混合 1-20分钟。饱和碳酸氢钠水溶液与所述反应介质的体积比可以为 1-10。

所述分离的方法可以包括将终止反应后的反应溶液的有机相和水相分开，有机相用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤，将所有有机相干燥、过滤、浓缩、常压柱分离，即可得到产物。所述洗涤可以进行一次或多次，洗涤用的饱和碳酸氢钠水溶液的总体积与所述反应介质的体积比可以为 1-20。所述干燥、过滤、浓缩、常压柱分离的方法已为本领域技术人员所公知，在此不再赘述。

去除 5'位上的 R₅保护基的方法可以为在搅拌下将缩合反应产物与甲酸在氯仿中 10-50°C下反应 5-60分钟。反应之后可以直接将有机相和甲酸相分开，甲酸相用二氯甲烷萃取，将所有有机相干燥、过滤、浓缩、常压柱分离，即可得到产物。所述萃取可以进行一次或多次，萃取用的二氯甲烷的总体积与甲酸的体积比可以为 1-20。所述干燥、过滤、浓缩、常压柱分离的方法已为本领域技术人员所公知，在此不再赘述。相对于 1 摩尔所述缩合反应产物，甲酸的用量为 10-50升。

去除 5'位上的 R₅保护基的方法也可以为在搅拌下将缩合产物在 1%浓度的对甲苯磺酸或 3%-5%三氯乙酸或 3%-5%三氟乙酸的二氯甲烷溶液中搅拌 1-60分钟。其中所含有机酸的当量数为反应计量数的 5-20倍。反应完成之后用饱和的碳酸氢钠水溶液中和，分出有机相，将有机相干燥、过滤、浓缩、常压柱分离，即可得到产物。所述干燥、过滤、浓缩、常压柱分离的方法已为本领域技术人员所公知，在此不再赘述。

去除 3'位上的保护基的方法可以为在搅拌下将缩合产物与三苯基膦或二苯基甲基磷在含水 10%的二氧六环中 10-50°C下反应过夜。反应完全之后蒸出溶剂，常压柱分离即可得到产物。相对于 1摩尔所述缩合反应产物，所用三苯基膦或二苯基甲基磷的用量可以为 3-5摩尔，二氧六环的用量可以为 50-150升。所述蒸馏、常压过柱为本领域技术人员所公知，在此不再赘述。

式（5 ) 的化合物的制备方法可以包括以下步骤：

( 1 ) 在过氧化苯甲酰的存在下，将式（9) 的化合物与 N-卤代琥珀酰亚胺反应，得到式（10) 的化合物；

(2) 将式（10) 的化合物与碱金属叠氮化物反应，得到式（11 ) 的化合物；

(3 ) 将式（11 ) 的化合物水解，酰化得到式（5 ) 的化合物，

式（9) 式（10) 式（11 )

其中， R₉表示卤素原子； Rw表示 d-C4的烷基。

其中，在步骤（1 ) 中，反应介质可以为四氯化碳、氯仿、苯、甲苯、庚烷中的一种或几种，相对于 1摩尔的式（9) 的化合物， N-卤代琥珀酰亚胺的用量可以为 1-3摩尔，优选为 1-1.2摩尔，过氧化苯甲酰的用量可以为 0.01-0.1摩尔，优选为 0.1-0.2摩尔，反应介质的用量可以为 5-20升，优选为 6-10升，反应温度可以为 80至 120°C，优选为 90°C至 110°C，反应时间可以为 0.5-6小时，优选为 1-3小时。

在步骤（2) 中，反应介质可以为乙醇、丙酮、 N、 N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜中的一种或几种，相对于 1摩尔的式（10)的化合物，碱金属叠氮化物的用量可以为 1-3 摩尔，优选为 1.5-2摩尔，反应介质的用量可以为 3-10升，优选为 6-8升，反应温度可以为 0°C至 80°C，优选为 25°C至 35°C，反应时间可以为 2-30小时。

在步骤（3 ) 中，所述水解包括将式（11 ) 的化合物与碱金属氢氧化物的醇水混合溶液（体积比 1 : 1 )反应，相对于 1摩尔的式（10) 的化合物，碱金属氢氧化物的用量为 5-100摩尔，优选为 10-20摩尔，反应温度可以为 0°C至 50°C，优选为 25°C至 35°C，反应时间可以为 0.1-2小时，优选为 0.25-lh，在所述醇水混合溶液中碱金属氢氧化物的浓度可以为 5-10重量％。

式（2)的化合物可以如反应式 III所示的反应制备得到，即在催化剂存在下将式（6) 的化合物、式（7) 的化合物和三烷基胺在反应介质中反应而得到的

式（6) 式（7)

式 ( 反应式 ΠΙ

所述催化剂可以选自 1,2,4-三唑、三乙胺、吡啶中的一种或几种。

所述反应介质可以选自二氯甲烷、二氧六环、四氢呋喃中的一种或几种，在式（6) 和式（7) 中，表示 DMTr (二对甲氧三苯甲基）、 RNA或 DNA; 表示位阻型硅烷保护基团，可以为各种具有位阻和保护功能的硅烷基团，优选为叔丁基二甲基氯硅烷基、苯基二甲基氯硅烷基、叔丁基二苯基氯硅烷基或三异丙基氯硅烷基，更优选为叔丁基二甲基氯硅烷基。

R₄、 R₇和 R₈各自表示卤素原子。所述卤素原子可以为氟、氯、溴或碘，优选为氯或溴，更优选为氯。

B₂表示 N-酰基取代的鸟嘌吟基、 N-酰基取代的腺嘌吟基、 N-酰基取代的胞嘧啶基、胸腺嘧啶基或尿嘧啶基。酰基可以为具有 2-10 个碳原子的酰基，优选为苯甲酰基、异丁酰基或乙酰基。

在式（3 ) 或式（7) 中，可以位于邻位、间位或对位，优选位于邻位。

反应式 ΠΙ所示的反应的条件可以包括：反应温度可以为 -10°C至 10°C，优选在冰浴中进行；反应分为两步进行，第一步反应时间可以为 0.5-10小时，优选为 1-3小时。

相对于 1摩尔的式（6) 的化合物，式（7) 的化合物的用量可以为 1-5摩尔，优选为 1.5-3摩尔；三烷基胺的用量可以为 1-50摩尔，优选为 3-20摩尔；催化剂的用量可以为 2-10摩尔，优选为 2-6摩尔；所述反应介质的用量可以为 5-200升，优选为 10-100 升。

反应第一步完成后，将反应溶液与碳酸氢三乙胺盐的水溶液混合，在搅拌条件下保持 10-90分钟，碳酸氢三乙胺盐的水溶液的浓度可以为 0.1-1摩尔 /升，碳酸氢三乙胺盐的水溶液与所述反应介质的体积比可以为 0.2-2; 然后直接将有机相和水相分开，有机相用碳酸氢三乙胺盐的水溶液洗涤，将所有有机相干燥、过滤、浓缩、常压柱分离，即可得到产物。洗涤用的碳酸氢三乙胺盐的水溶液的浓度可以为 0.1-1摩尔 /升，所述洗涤可以进行一次或多次，洗涤用的碳酸氢三乙胺盐的水溶液与所述反应介质的体积比可以为 0.5-5。

下面通过实施例更详细地描述本发明。

实施例中所用到的原料如下：

第一核苷酸（A): 式（6) 所示的化合物，保护的腺嘌吟核糖核苷,其中 8₂为 N-苯甲酰基腺嘌吟， R₁为DMT_r， R₃为叔丁基二甲基硅烷基，购自上海吉玛制药技术有限公司：

第二核苷酸（A): 式（4) 所示的化合物，保护的腺嘌吟核糖核苷,其中为 N- 苯甲酰基腺嘌吟， R₅为DMT_r，为叔丁基二甲基硅烷基，购自上海吉玛制药技术有限公司：

第三核苷酸（C): 式（6) 所示的化合物，保护的胞嘧啶核糖核苷，其中 B₂为 N- 苯甲酰基胞嘧啶， R₁为DMT_r， R₃为叔丁基二甲基硅烷基，购自上海吉玛制药技术有限公司；

第四核苷酸（G): 式（4) 所示的化合物，保护的鸟嘌吟核糖核苷其中 B₁为N-乙酰基鸟嘌吟， R₅为DMT_r， R₂为叔丁基二甲基硅烷基，购自上海吉玛制药技术有限公司；第五核苷酸（G): 式（6) 所示的化合物，保护的鸟嘌吟核糖核苷，其中 B₂为N- 苯甲酰基鸟嘌吟， R₁为DMT_r， R₃为叔丁基二甲基硅烷基，购自上海吉玛制药技术有限公司；

第六核苷酸（U): 式（4) 所示的化合物，保护的尿嘧啶核糖核苷，其中为尿嘧啶， R₅为DMT_r，为叔丁基二甲基硅烷基，购自上海吉玛制药技术有限公司；第七核苷酸（U): 式（6) 所示的化合物，保护的尿嘧啶核糖核苷，其中 B₂为尿嘧啶， R₁为DMT_r， R₃为叔丁基二甲基硅烷基，购自上海吉玛制药技术有限公司；三乙胺：购自天津市北方天医化学试剂厂；

1,2,4-三唑：购自 AlfaAesar;

2-氯苯基二氯代磷酸酯：式（7) 的化合物，其中， R₄、 R₇和 R₈均为氯， R₄位于邻位，购自 AlfaAesar; 邻叠氮甲基苯甲酰氯：式（5 ) 的化合物，其中， R₆为氯，位于邻位，在合成实施例 6中制得。

MSNT: 式（8) 的化合物，购自 Sigma Aldrich。合成实施例 1

该合成实施例合成用于制备式（3 ) 化合物的原料，即式（2) 化合物（P-组分）。 250ml 圆底烧瓶中加入 1,2,4-三唑 (2.76g, 40mmol)和三乙胺 (lO.lg, lOOmmol), 用 15ml二氯甲烷溶解，冰浴条件下滴加 2-氯苯基二氯代磷酸酯 (4.91g, 20mmol)的二氯甲烷溶液 10ml，再滴加第一核苷酸 (7.87g, lOmmol)的二氯甲烷溶液 35ml，冰浴下搅拌 2.5小时后加入 35ml 1M浓度的 ΤΕΑΒ,继续搅拌 0.5小时后， 1M ΤΕΑΒ萃取三次（每次 20ml)，全部有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，旋蒸除去溶剂得到产品 10.78g，产率 100%。 ³¹PNMR (CDC1₃， 121M) δ-6.09. ESI-MS, M— 976.2926。产率是产物的重量与按第一核苷酸计算的理论产量的百分比。合成实施例 2

该合成实施例合成用于制备式（3 )化合物的原料，即式（1 )化合物（OH-组分）。 250ml圆底烧瓶中加入 N-甲基咪唑 C2.08g, 25mmol),15ml二氯甲烷溶解，冰浴下滴加邻叠氮甲基苯甲酰氯 (4.18g, 20mmol)的二氯甲烷溶液 15ml，再滴加第二核苷酸 (7.87g, lOmmol)的二氯甲烷溶液 40ml，持续冰浴反应 40小时，加饱和 NaHC0₃ 100ml终止反应，分液后饱和 NaHC0₃连续洗两次（每次 100ml)，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，常压柱分离得到产物 8.21g，产率 86.8%。产率是产物的重量与按第二核苷酸计算的理论产量的百分比。

将如上得到的产品（8.21g, 8.67mmol)加入 170ml氯仿溶解，快速搅拌（搅拌速度为 500-1000转 /分钟）下加入 170ml HCOOH, 室温反应 30分钟，直接分液， HCOOH 相用二氯甲烷再萃取三次（每次 170ml二氯甲烷），合并后水洗三次（每次 170ml水）， 0.1M TEAB洗一次（170ml)，有机相无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，常压柱分离得到产物 4.78g，产率 85.5%。产率是产物的重量与按第二核苷酸计算的理论产量的百分比。

^MR ( CDC1₃ ， 300M ) 8(-0.32,3H,lCH₃) ， (-0.00,3H,lCH₃),(-0.77,9H,3CH₃),1.89(s,lH),4.01-4.28(dd,2H, CH₂ ),4.99 ( s， 2H， CH₂)， 5.42-5.46(t,lH),5.88,5.90(d,lH),6.09,6.12(d,lH) ， 6.26(d,lH),7.37(s,lH),7.58-7.79(m,5H),8.16-8.31(m,4H), 8.98 ( s， 1H) ,9.22(s,lH), ESI-MS: (M+Na) +667.2419 合成实施例 3

按照与合成实施例 1 相同的方法进行合成，不同的是，用第三核苷酸代替第一核苷酸。合成实施例 4

按照与合成实施例 2 相同的方法进行合成，不同的是，用第四核苷酸代替第二核苷酸。合成实施例 5

按照与合成实施例 1 相同的方法进行合成，不同的是，用第五核苷酸代替第一核苷酸。合成实施例 6

按照与合成实施例 1 相同的方法进行合成，不同的是，用第七核苷酸代替第一核苷酸。合成实施例 7

按照与合成实施例 2 相同的方法进行合成，不同的是，用第六核苷酸代替第二核苷酸。合成实施例 8

按照与合成实施例 2 相同的方法进行合成，不同的是，用第三核苷酸代替第二核苷酸。合成实施例 9

该合成实施例合成式（5 ) 的化合物。

( 1 ) 在带有回流装置的 250ml圆底烧瓶中加入 lO.Og化合物 1，再加入 80ml的 SOCl₂，加热回流， 90°C搅拌反应 5h。将回流装置改为蒸馏装置，蒸馏出作为溶剂的 SOCl₂。冷却后，加入 60ml甲醇，室温搅拌下滴加入 15ml三乙胺，滴加完后，继续室温搅拌反应 30min。酰氯全部转化为脂，旋蒸除去过量的甲醇和三乙胺，加入乙酸乙酯 50ml, 并用水洗两次，饱和食盐水洗一次后，脂层无水 Na₂S0₄干燥。除去溶剂后得到 9.7g化合物 2，产率 88.2%。 CH₃O H/Et₃N COOCH3

(2) 在 250ml圆底烧瓶中加入 1.50g ( lOmmol) 化合物 2， CCk80ml溶解后加入 NBS1.98g ( llmmol), BP048mg (0.2mmol)，加热回流 1.5h即反应完全。过滤除去漂浮的不溶物后除去溶剂得到化合物 3，反应定量进行。

BPO= // ^^₀_₀^^Λ 中文名：过氧化苯甲酰

(3 ) 在 25ml圆底烧瓶中加入 916mg化合物 3 (4mmol)， 20ml乙醇溶解后加入 NaN₃520mg ( 8mmol)，室温搅拌过夜（21h )。旋蒸除去乙醇后，加入乙酸乙酯溶解，依次水洗，饱和食盐水洗，有机层旋蒸除去溶剂后，加入 40ml5%的 NaOH 溶液 (CH₃OH:¾0体积比 1： 1 ) 室温搅拌 3 O min，旋蒸除去甲醇后， 2 . 5 M的盐酸调节 pH约等于 1， CH₂C1₂萃取 4次。有机层无水 Na₂S0₄干燥后除去溶剂得到化合物 5。将化合物 5用环己烷重结晶得到白色晶体。

化合物 5的核磁数据：

¹HNMR (CDCl₃,400M) ,4.89,(s,2H,CH₂),7.43-7.47(t,lH),7.54-7.56 (d， 1H)， 7.61-7.64 (t， 1H)， 8.18-8.20 (d， 1H)。

元素分析： C: 53.80, H: 3.99， N: 23.92，计算值： C: 54.24， H: 3， 98， N23.72 (4) 在 100m 1圆底烧瓶中加入 1 . 0 g化合物 5 ( 5 . 6 5 mmol)， 5 0 m l CHC1₃溶解后再加入 S0C1₂ 2 . 0 2 g ( 1 6 . 9 5 mmol),加热回流 5 h。停止反应后旋蒸出溶剂，甲苯 3 X 3 m 1共沸带出过量的 S0C1₂，得到化合物 6，存于干燥器中备用。

实施例 1

该实施例合成寡核苷酸。

合成目标：全保护的 RNA

DMTr[CGAAAGAACG]AZMB

注： []表示除 3'和 5'末端外全保护的 RNA，

DMTr为二对甲氧三苯甲基， 5'端保护基；

AZMB为邻叠氮代甲基苯甲酰基， 3'端保护基。

( 1 ) 合成 DMTr[CpG]AZMB

25ml圆底烧瓶中加入合成实施例 4的产物 (598mg, lmmol)和合成实施例 3的产物 (1.19g, 1.2mmol)，加无水吡啶 10ml溶解样品，分三次加入 MSNT (共 745mg, 2.8mmol)，室温搅拌 3小时。加入 1M TEAB lml搅拌 0.5小时终止反应，反应液倒入 60ml二氯甲烷中， 0.1M TEAB洗三次（每次 20毫升），有机相无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，常压柱分离得到产物 831mg，产率 56.4%。产率是产物的重量与按合成实施例 4的产物计算的理论产量的百分比。

(2) 合成 OH-[CpG]AZMB

将步骤（1 ) 得到的 DMTr[CG]AZMB (800mg, 0.54mmol)加 7.5ml氯仿溶解，快速搅拌下加入 7.5ml HCOOH，室温反应 30min，直接分液， HCOOH相用二氯甲烷再萃取三次（每次 5毫升），合并后水洗三次（每次 5毫升）， 0.1M TEAB洗一次（10毫升），有机相无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，常压柱分离得到产物 500mg，产率 79.1%。产率是产物的重量与按 DMTr[CG]AZMB计算的理论产量的百分比。

( 3 ) 合成 DMTr[AA]AZMB

100ml圆底烧瓶中加入合成实施例 2的产物 (1.39g, 2.16mmol)和合成实施例 1的产物 (3.03g, 2.81mmol)，加无水吡啶 22ml溶解样品，分三次加入 MSNT (1.80g, 6.05mmol), 室温搅拌 2小时。加入 1M TEAB搅拌 0.5小时终止反应，反应液倒入 150ml二氯甲烷中， 0.1M TEAB 洗三次，有机相无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，常压柱分离得到产物 3.08g, 产率 87.9%。产率是产物的重量与按合成实施例 2的产物计算的理论产量的百分比。

(4) 合成 OH[AA]AZMB

将步骤（3 ) 得到的 DMTr[AA]AZMB (3.08g, 1.92mmol)溶于 100ml 1%的对甲苯磺酸溶液中，室温搅拌 30min，饱和 NaHC0₃中和后分出有机相，二氯甲烷萃取水相两次，合并有机相，有机相无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，常压柱分离得到产物 2.45g，产率 98.8%。产率是产物的重量与按 DMTr[AA]AZMB计算的理论产量的百分比。

(5 ) 合成 DMTr[GAA]AZMB

100ml圆底烧瓶中加入步骤（4) 得到 OH[AA]AZMB (2.45g, 1.88mmol)和合成实施例 5的产物 (2.39g, 2.26mmol)，加无水吡啶 19ml溶解样品，分三次加入 MSNT (1.56g, 5.26mmol),室温搅拌 2小时。加入 1M TEAB 2ml搅拌 0.5小时终止反应，反应液倒入 200ml二氯甲烷中， 0.1M TEAB洗三次，有机相无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，常压柱分离得到产物 4.068g，产率 96.0%。产率是产物的重量与按 OH[AA]AZMB计算的理论产量的百分比。

(6) 合成 OH[GAA]AZMB

将步骤（5 )得到的 DMTr[GAA]AZMB (4.068g, 1.81mmol)加 50ml氯仿溶解，快速搅拌下加入 50ml HCOOH，室温反应 30min，直接分液， HCOOH相用二氯甲烷再萃取三次，合并后水洗三次， 0.1M TEAB洗一次，有机相无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，常压柱分离得到产物 2.66g，产率 75.6%。产率是产物的重量与按 DMTr[GAA]AZMB计算的理论产量的百分比。

(7) 合成 DMTr[AGAA]AZMB

100ml圆底烧瓶中加入步骤（6) 得到的 OH[GAA]AZMB (1.48g, 0.76mmol)和合成实施例 1的产物 (1.08g, l.OOmmol)，加无水吡啶 8ml溶解样品，分三次加入 MSNT (632mg, 2.13mmol),室温搅拌 4小时。加入 1M TEAB 1.5ml搅拌 0.5小时终止反应，反应液倒入 60ml二氯甲烷中， 0.1M TEAB洗三次，有机相无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，常压柱分离得到粗产物 2.21g。

( 8) 合成 DMTr[AGAA]OH

100ml圆底烧瓶中加入步骤（7)得到的 DMTr[AGAA]AZMB (2.2 lg, 0.76mmol), 2.6g 的二氧六环 /水 (9:1)混合溶剂溶解，加三苯基磷 (796mg, 3.04mmol),室温搅拌 24小时，蒸干溶剂后，常压柱分离得到粗产物 2.1g。

(9) 合成 DMTr[AGAA]P〇-

100ml圆底烧瓶中加入 1,2,4-三唑 (420mg, 6.08mmol)和三乙胺 (768mg, 7.60mmol)，二氯甲烷 7ml溶解，冰浴条件下滴加 2-氯苯基二氯代磷酸酯 (560mg, 2.28mmol)的二氯甲烷溶液 3ml，再滴加步骤（8) 得到的 DMTr[AGAA]OH (2.1g, 0.76mmol)的二氯甲烷溶液 2.5ml，冰盐浴下搅拌 2.5小时后加 3ml TEAB终止反应， 0.1M TEAB洗三次，有机相无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，常压柱分离得到产物 1.31g，三步总产率 56.7%。

( 10) 合成 DMTr[CGAA]AZMB

100ml圆底烧瓶中加入步骤（6) 得到的 OH[GAA]AZMB (1.12g, 0.58mmol)和合成实施例 3 的产物 (746mg, 0.75mmol), 加无水吡啶 6ml 溶解样品，分三次加入 MSNT (482mg, 1.62mmol),室温搅拌 4小时。加入 1M TEAB 1.5ml搅拌 0.5小时终止反应，反应液倒入 60ml二氯甲烷中， 0.1M TEAB洗三次，有机相无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，常压柱分离得到粗产物 1.63g。

( 11 ) 合成 DMTr[CGAA]OH

100ml圆底烧瓶中加入步骤（10) 得到的 DMTr[CGAA]AZMB (1.60g, 0.57mmol),

1.6g 的二氧六环 /水 (9:1)混合溶剂溶解，加三苯基磷（595mg, 2.27mmol),室温搅拌 24 小时，蒸干溶剂后，常压柱分离得到粗产物 1.5g。

( 12) 合成 DMTr[CGAA]PO-

25ml圆底烧瓶中加入 1,2,4-三唑 (315mg, 4.56mmol)和三乙胺 (576mg, 5.70mmol)，二氯甲烷 5ml溶解，冰浴条件下滴加 2-氯苯基二氯代磷酸酯 (420mg, 1.71mmol)的二氯甲烷溶液 2ml，再滴加步骤（ 11 ) 得到的 DMTr[CGAA]OH (1.5g, 0.57mmol)的二氯甲烷溶液 2ml，冰盐浴下搅拌 2.5小时后加 1.5ml TEAB终止反应， 0.1M TEAB洗三次，有机相无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，常压柱分离得到产物 1.12g，三步总产率 61.9%。

( 13 ) 合成 DMTr[AGAACG]AZMB

25ml圆底烧瓶中加入步骤（2)得到的 OH[CG]AZMB(480mg, 0.41mmol)和步骤（9 ) 得到的 DMTr[AGAA]PO- (1.20g, 0.40mmol), 加无水吡啶 8ml溶解样品，分三次加入 MSNT (333mg, 1.12mmol),室温搅拌 2.5小时。加入 1M TEAB 1ml搅拌 0.5小时终止反应，反应液倒入 60ml二氯甲烷中， 0.1M TEAB洗三次，有机相无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，常压柱分离得到产物 1.21g，产率 73.4%。

( 14) 合成 OH[AGAACG]AZMB

将步骤（13 ) 得到的 DMTr[AGAACG]AZMB(1.21g, 0.29mmol)加 10ml氯仿溶解，快速搅拌下加入 10ml HCOOH，室温反应 30min，直接分液， HCOOH相用二氯甲烷再萃取三次，合并后水洗三次， 0.1M TEAB洗一次，有机相无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，常压柱分离得到产物 863mg，产率 78.6%。

( 15 ) 合成 DMTr[CGAAAGAACG]AZMB

25ml圆底烧瓶中加入步骤（14) 得到的 OH[AGAACG]AZMB (840mg, 0.22mmol) 和步骤（12)得到的 DMTr[CGAA]PO_(786g, 0.26mmol)，加无水吡啶 5ml溶解样品，分三次加入 MSNT (184mg, 0.62mmol),室温搅拌 4小时。加入 1M TEAB lml搅拌 0.5小时终止反应，反应液倒入 60ml二氯甲烷中， 0.1M TEAB洗三次，有机相无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，常压柱分离得到产物 1.20g，产率 82.4%。 MAIDI-TOF MS: 6560.787。实施例 2

该实施例合成寡核苷酸。

合成目标： 5'-CGAAAGAACG-3，

( 1 )将 46mg (0.28mmol)对硝基苯肟和 32mg (0.28mmol) 四甲基胍溶于二氧六环和水体积比 1 : 1 的溶液 0.6ml，混勾后再加入 13mg ( 2umol) 实施例 1 制得的 DMTr[CGAAAGAACG] AZMB , 室温反应 30小时，此步去除膦上的保护基。

( 2 )将步骤（ 1 )得到的反应液 40 °C真空离心干燥后再加入 5ml浓氨水 ( 25%-28% )，加热至 50°C反应 12小时，此步去除碱基和 3'末端的保护基。

(3 )将步骤（2)得到的反应液 40°C真空离心干燥后加入 lml80%的乙酸，室温反应 30分钟后再次离心干燥，将残余物溶于 2毫升水，用 2毫升乙酸乙酯洗涤后 -80°C真空冷冻干燥成干粉状。此步去除 5'末端保护基。

(4) 在冻干后的粉末中加入 lmllM的 TBAF (氟化四丁基胺）的四氢呋喃溶液， 37°C反应过夜，此步去除 2'位保护基。将反应完成的反应液加入等体积的水淬灭后 40°C 真空离心干燥去除四氢呋喃，残余物经 sephadex G25过柱脱盐，收集紫外吸收在 260nm 处的产品，得到经脱保护的寡聚核糖核酸 5'-CGAAAGAACG-3'水溶液，经 -80°C真空冷冻干燥后成白色干粉状固体。 MAIDI-TOF MS :3233.67。实施例 3

该实施例合成寡核苷酸。

合成目标：全保护的 RNA

DMTr[UGCGCGUUGAUGUGAGGUUCCUU]AZMB

禾口 DMTr[GGAACCUCACAUCAACGCGCAUU]AZMB

( 1 ) 合成 OH[CG]AZMB

在 50ml圆底烧瓶中加入合成实施例 3的产物（4.433g， 4.2mmol)和合成实施例 4 的产物（2.194g， 3.5mmol)，加入无水吡啶 30ml溶解样品，加入 MSNT(2.911g， 9.8mmol)，室温搅拌 2小时。加入 4ml 0.1M的 ΤΕΑΒ, 搅拌 10分钟终止反应，旋蒸除去溶剂后，将得到的产物溶解于 50ml CH₂C1₂中，用 0.1M TEAB洗涤 3次（每次 20ml)，用 5%草酸调节 pH为 3，分液得到有机相，并用无水 Na₂S0₄干燥该有机相，过滤，得到的滤液 50ml。将得到的滤液转移到 250ml的圆底烧瓶中，缓缓加入 50ml 6%的 CF₃COOH，室温搅拌反应 5min后，加入饱和 NaHC0₃中和，分液得到有机相，用饱和 NaHCO₃20ml 对得到的有机相进行一次洗涤，用无水 Na₂S0₄干燥有机相，过滤，浓缩，常压柱分离得到产物，产率 78%。产率是产物的重量与合成实施例 4的产物计算的理论产量的百分比。

(2) 合成 OH[GG]AZMB

采用与步骤（1 ) 相同的步骤合成 OH[GG]AZMB，不同的是，采用合成实施例 5 的产物（4.471g， 4.2mmol ) 和合成实施例 4的产物（2.194g， 3.5mmol)，并用 20ml无水吡啶溶解， 0.1M TEAB的用量为 3ml。产率 67.1%。产率是产物的重量与合成实施例 4的产物计算的理论产量的百分比。

(3 ) 合成 OH[AU]AZMB

在 50ml圆底烧瓶中加入合成实施例 1的产物（4.534g， 4.2mmol)，合成实施例 7 的产物（1.811g， 3.5mmol)，加吡啶 20ml溶解样品，分批加入 MSNT (2.911g， 9.8mmol)，室温搅拌反应 2h。加入 1M TEAB 10ml搅拌 lOmin终止反应，溶于 100ml CH₂C1₂，用 1M TEAB洗涤 3次（每次 20ml)，分液得到有机相，用无水 Na₂S0₄干燥得到的有机相，过滤，浓缩，常压柱分离得到产物。将得到的产品溶于 45ml CH2CI2, 伴随搅拌缓缓倒入 45ml 6%的 CF₃COOH，使得体系中 CF₃COOH的浓度为 3%，室温搅拌反应 5min。加入饱和 NaHC0₃中和，分液得到有机相，用饱和 NaHCO₃20ml)洗涤得到的有机相一次，用无水 Na₂S0₄干燥有机相，过滤，浓缩，常压柱分离得到产物，产率 81.1%。产率是产物的重量与合成实施例 7的产物计算的理论产量的百分比。

(4) 合成 OH[UU]AZMB

在 250ml圆底烧瓶中加入合成实施例 6的产物（10.0g， 10.5mmol)，合成实施例 7 的产物（4.53g， 8.75mmol )，加无水吡啶 45ml 溶解样品，分批加入 MSNT (7.28g， 24.5mmol )，室温搅拌反应 2小时。加入 1M TEAB 50ml搅拌 20分钟终止反应，溶于 300mlCH₂Cl₂ ^ , 用 1M TEAB洗涤 3次（每次 20ml)，分液得到有机相，用无水 Na₂S0₄ 干燥有机相，过滤，浓缩，常压柱分离得到产物。将得到的产品溶于 100ml CH₂Cl₂中，伴随搅拌缓缓倒入 100ml 6%的 CF₃COOH，室温搅拌反应 5分钟。加入饱和 NaHC0₃ 中和，分液得到有机相，用饱和 NaHCO₃50ml) 洗涤有机相一次，用无水 N_a2S0₄干燥得到的有机相，过滤，浓缩，常压柱分离得到产物，产率 73%。产率是产物的重量与合成实施例 7的产物计算的理论产量的百分比。

(5 ) 合成 OH[CA]AZMB

在 500ml圆底烧瓶中加入合成实施例 3的产物（31.66g， 30mmol)，合成实施例 2 的产物（16.12g， 25mmol )，用无水吡啶 150ml溶解样品，分批加入 MSNT (20.79g, 70mmol )，室温搅拌反应 2h。加入 1M TEAB 100ml搅拌 20min终止反应，溶于 600ml CH₂C1₂ 用 1M TEAB洗涤 3次（每次 20ml)，分液得到有机相，用无水 Na₂S0₄干燥有机相，过滤，浓缩，常压柱分离得到产物。将得到的产物溶于 370ml〔11₂0₂中，伴随搅拌缓缓倒入 370ml 6%的 CF₃COOH,，使得体系中 CF₃COOH的浓度为 3%，室温搅拌反应 5分钟。加入饱和 NaHC0₃中和，分液得到有机相，用饱和 NaHC0₃ (？ ml)洗涤有机相一次，用无水 Na₂S0₄干燥有机相，过滤，浓缩，常压柱分离得到产物，产率 72%。产率是产物的重量与合成实施例 2的产物计算的理论产量的百分比。

(6) 合成 OH[CC]AZMB

采用与步骤（4) 相同的方法制备 OH[CC]AZMB，不同的是，采用合成实施例 3 的产物（12.25g， 11.6mmol)和合成实施例 8的产物（6.0g， 9.67mmol)，并用无水吡啶 50ml溶解样品，分批加入 MSNT ( 8.01g， 27.1mmol)。产率 83%。产率是产物的重量与合成实施例 8的产物计算的理论产量的百分比。

(7) 合成 OH[GC]AZMB

在 250ml圆底烧瓶中加入合成实施例 5的产物（18.47g， 17.4mmol)，合成实施例 8 的产物（9.0g， 14.5mmol)，用无水吡啶 72ml溶解样品，分批加入 MSNT ( 12.0g, 40.6mmol )，室温搅拌反应 2h。加入 1M TEAB 80ml搅拌 20min终止反应，溶于 300ml CH₂C1₂中，用 1M TEAB洗涤 3次（每次 20ml)，分液得到有机相，用无水 Na₂SC»4干燥有机相，过滤，浓缩，常压柱分离得到产物。将得到的产品溶于 150ml〔¾ 中，伴随，搅拌缓缓倒入 150ml 6%的 CF₃COOH，使得体系中 CF₃COOH的浓度为 3%，室温搅拌反应 10min。加入饱和 NaHC0₃中和，分液得到有机相，用饱和 NaHCO₃120ml)洗涤有机相一次，用无水 Na₂S0₄干燥有机相，产率 63.8%。产率是产物的重量与合成实施例 8 的产物计算的理论产量的百分比。

( 8) 合成 OH[UG]AZMB

在 50ml圆底烧瓶中加入合成实施例 6 的产物（5.14g， 5.4mmol)，合成实施例 4 的产物（2.82g， 4.5mmol)，用无水吡啶 30ml溶解样品，分批加入 MSNT ( 3.74g, 12.6mmol )，室温搅拌反应 2h。加入 1M TEAB 10ml搅拌 20min终止反应，溶于 150ml CH₂C1₂中，用 1M TEAB洗涤 3次（每次 20ml)，分液得到有机相，用无水 Na₂SC»4干燥有机相，过滤，浓缩，常压柱分离得到产物。将得到的产物溶于 450ml〔11₂0₂中，伴随搅拌缓缓倒入 450ml 6%的 CF₃COOH，使得体系中 CF₃COOH的浓度为 3%，室温搅拌 5min。加入饱和 NaHC0₃中和，分液得到有机相，用饱和 NaHCO₃300ml) 洗涤有机相一次，用无水 N S0₄干燥有机相，过滤，浓缩，常压柱分离得到产物，产率 78%。产率是产物的重量与合成实施例 4的产物计算的理论产量的百分比。

(9) 合成 DMTr[GG]AZMB

在 100ml圆底烧瓶中加入合成实施例 5的产物（7.64g， 7.2mmol)，合成实施例 4 的产物（3.76g，6mmol)，用无水吡啶 35ml溶解样品，分三次加入 MSNT(5.0g， 16.8mmol)，室温搅拌 2.5h。加入 1M的 TEAB 10ml, 搅拌 20min终止反应，将反应液倒入 200ml CH₂C1₂中，用 1M TEAB洗涤 3次（每次 20ml)，分液得到有机相，用 Na₂S0₄干燥有机相，过滤，浓缩，常压柱层分离得到产物，产率 81%。产率是产物的重量与合成实施例 4的产物计算的理论产量的百分比。 ( 10) 合成 DMTr[UGC]AZMB

在 250ml圆底烧瓶中加入合成实施例 6的产物（7.67g， 9.10mmol)，步骤（7) 得到的 OH[GC]AZMB (7.77g， 6.17mmol)，用无水吡啶 40ml溶解样品，分三次加入 MSNT (5.13g, 17.3mmol), 室温搅拌 3.5h。加入 1M的 TEAB 10ml，搅拌 20min终止反应，将反应液倒入 150ml CH2CI2中，用 1M TEAB洗涤 3次（每次 20ml)，有机相用 Na₂S0₄ 干燥，过滤，浓缩，常压柱分离得到产物，产率 73%。产率是产物的重量与按 OH[GC]AZMB计算的理论产量的百分比。

( 11 ) 合成 DMTr[UCA]AZMB

在 50ml圆底烧瓶中加入合成实施例 6的产物（8.67g， 9.10mmol)，步骤（5 )得到的 OH[CA]AZMB ( 8.95g， 7.00mmol)，用无水吡啶 50ml溶解样品，分三次加入 MSNT (5.82g， 19.6mmol)，室温搅拌 4h。加入 1M的 TEAB 10ml，搅拌 20min终止反应，将反应液倒入 100ml CH₂C1₂中，用 1M TEAB洗涤 3次（每次 20ml)，分液得到有机相，有机相用 Na₂S0₄干燥，过滤，浓缩，常压柱分离得到产物，产率 77%。产率是产物的重量与按 OH[CA]AZMB计算的理论产量的百分比。

( 12) 合成 DMTr[ACG]AZMB

采用与步骤（11 ) 相同的方法制备 DMTr[ACG]AZMB，不同的是，采用合成实施例 1的产物 (2.67g, 2.47mmol)和步骤 ( 1 )得到的 OH[CG]AZMB (2.40g， 1.90mmol)，并用无水吡啶 15ml溶解样品，分三次加入 MSNT ( 1.58g， 5.32mmol)。产率 78%。产率是产物的重量与按 OH[CG]AZMB计算的理论产量的百分比。

( 13 ) 合成 DMTr[GUU]AZMB

在 100ml圆底烧瓶中加入合成实施例 5的产物（4.30g， 4.05mmol)，步骤（4) 得到的 OH[UU]AZMB (3.15g, 3.00mmol)，用无水吡啶 20ml溶解样品，分三次加入 MSNT

(2.50g， 8.40mmol)，室温搅拌 2.5h。加入 1M的 TEAB 10ml，搅拌 20min终止反应，将反应液倒入 100ml CH₂C1₂中，用 1M TEAB洗涤 3次（每次 30ml)，分液得到有机相，有机相用 N S0₄干燥，过滤，浓缩，常压柱分离得到产物，产率 79%。产率是产物的重量与按 OH[UU]AZMB计算的理论产量的百分比。

( 14) 合成 DMTr[GUG]AZMB

在 100ml圆底烧瓶中加入合成实施例 5的产物（4.29g， 4.04mmol)，步骤（8) 得到的 OH[UG]AZMB (3.60g, 3.11mmol),用无水吡啶 20ml溶解样品，分三次加入 MSNT (2.59g， 8.71mmol)，室温搅拌 3.5h。加入 1M的 TEAB 10ml，搅拌 20min终止反应，将反应液倒入 100ml CH₂C1₂中，用 1M TEAB洗涤 3次（每次 20ml)，分液得到有机相，有机相用 Na₂S0₄干燥，过滤，浓缩，常压柱分离得到产物，柱层析纯化产率 67%。产率是产物的重量与按 OH[UG]AZMB计算的理论产量的百分比。 ( 15 ) 合成 OH[ACC]AZMB

在 100ml圆底烧瓶中加入合成实施例 1的产物（5.62g， 5.20mmol)，步骤（6) 得到的 OH[CC]AZMB (5.4g， 4.33mmol), 用无水吡啶 22ml溶解样品，分批加入 MSNT (3.59g, 12.1mmol)，室温搅拌反应 3h。加入 1M的 TEAB 10ml,搅拌 20min终止反应，溶于 150ml CH₂Cl₂中，用 1M TEAB洗涤 3次（每次 20ml)，分液得到有机层，用无水 Na₂S0₄干燥有机相，过滤，浓缩，常压柱分离得到产物。将得到的产物溶解于 100ml CH₂C1₂中，伴随搅拌缓缓倒入 100ml 6%的 CF₃COOH，使体系中的 CF₃COOH的浓度为 3%,室温搅拌 30min。加入饱和 NaHC0₃中禾 B，分液得到有机相，用饱和 NaHC0₃ ( 80ml) 洗涤有机相一次，用无水 Na₂S0₄干燥有机相，过滤，浓缩，常压柱分离得到产物，产率 52%。产率是产物的重量与按 OH[CC]AZMB计算的理论产量的百分比。

( 16) 合成 OH[GCA]AZMB

在 100ml圆底烧瓶中加入合成实施例 5的产物（4.00g， 3.77mmol), 步骤（5 ) 得到的 OH[CA]AZMB (4.2g， 3.28mmol), 用无水吡啶 20ml溶解样品，分批加入 MSNT (2.73g, 9.18mmol)，室温搅拌反应 3h。加入 1M的 TEAB 10ml,搅拌 20min终止反应，溶于 150ml CH₂Cl₂中，用 1M TEAB洗涤 3次（每次 20ml)，分液得到有机相，用无水 Na₂S0₄干燥有机相，过滤，浓缩，常压柱分离得到产物。将得到的产物溶解于 35ml CH₂C1₂ 中，伴随搅拌缓缓倒入 35ml 6%的 CF₃COOH，使得体系中的 CF₃COOH的浓度为 3%，室温搅拌 30min。加入饱和 NaHC0₃中和，分液得到有机相，用饱和 NaHC0₃ (25ml) 洗涤有机相一次，用无水 Na₂S0₄干燥有机相，过滤，浓缩，常压柱分离得到产物，产率 68%。产率是产物的重量与按 OH[CA]AZMB计算的理论产量的百分比。

( 17) 合成 OH[UCC]AZMB

在 50ml圆底烧瓶中加入合成实施例 6的产物（3.59g， 3.77mmol), 步骤（6)得到的 OH[CC]AZMB(2.42g， 2.90mmol)，加无水吡啶 20ml溶解样品，分批加入 MSNT(2.41g， 8.12mmol )，室温搅拌反应 5h。加入 1M的 TEAB 10ml搅拌 20min终止反应，溶于 100ml CH2CI2中，用 1M TEAB洗涤 3次（每次 20ml)，分液得到有机相，用无水 Na₂S〇4干燥有机相，过滤，浓缩，常压柱分离得到产物。将得到的产品溶于 40ml CH₂Cl₂中，伴随搅拌缓缓倒入 40ml 6%的 CF₃COOH，使得体系中的 CF₃COOH的浓度为 3%，室温搅拌反应 30min。加入饱和 NaHC0₃中和，分液得到有机相，用饱和 NaHC0₃ (30ml) 洗涤有机相一次，用无水 N¾S0₄干燥有机相，过滤，浓缩，常压柱分离得到产物，产率 64.1%。产率是产物的重量与按 OH[CC]AZMB计算的理论产量的百分比。

( 18) 合成 OH[ACG]AZMB

将步骤（12) 得到的产物 DMTr[ACG]AZMB溶于 20ml CH₂Cl₂中，伴随搅拌，缓缓倒入 20ml 6%的 CF₃COOH，使得体系中的 CF₃COOH的浓度为 3%，室温搅拌反应 10min。加入饱和 NaHC0₃中和，分液得到有机相，用饱和 NaHC0₃ ( 15ml) 洗涤有机相一次，用无水 Na₂S0₄干燥有机相，过滤，浓缩，常压柱分离得到产物 2.0g，产率 55.%。产率是产物的重量与按 HO[CG]AZMB计算的理论产量的百分比。

( 19) 合成 OH[GAU]AZMB

在 100ml圆底烧瓶中加入合成实施例 5的产物（3.82g， 3.69mmol), 步骤（3 ) 得到的 OH[AU]AZMB ( 3.30g, 2.80mmol ), 加入无水吡啶 20ml 溶解样品，分三次加入 MSNT (共 2.33g， 7.84mmol)，室温搅拌 4h。加入 1M的 TEAB 5ml，搅拌 30min终止反应，将反应液倒入 100ml CH₂Cl₂中，用 IM TEAB洗涤 3次（每次 20ml)，分液得到有机相，用 Na₂S0₄干燥有机相，过滤，浓缩，常压柱分离得到产物。将得到的产物溶于 40ml CH₂C1₂中，伴随搅拌，缓缓倒入 40ml 6%的 CF₃COOH，使得体系中的 CF₃COOH 的浓度为 3%，室温搅拌反应 30min。加入饱和 NaHC0₃中和，分液得到有机相，用饱禾口 NaHC0₃ (30ml) 洗涤有机相一次，用无水 Na₂S0₄干燥有机相，过滤，浓缩，常压柱分离得到产物，产率 63%。产率是产物的重量与按 OH[AU]AZMB计算的理论产量的百分比。

(20) 合成 OH[AGG]AZMB

在 100ml圆底烧瓶中加入合成实施例 1的产物（3.30g， 3.10mmol), 步骤（2) 得到的 OH[GG]AZMB (2.98g， 2.35mmol)，加入无水吡啶 15ml溶解样品，分批加入 MSNT

( 1.96g， 6.6mmol)，室温搅拌反应 2.5h。加入 IM TEAB 10ml搅拌 20min终止反应，将反应液倒入 150ml CH₂C1₂中，用 IM TEAB洗涤 3次（每次 20ml)，分液得到有机相，用无水 Na₂S0₄干燥有机相，过滤，浓缩，常压柱分离得到产物。将得到的产物溶于 25ml CH₂C1₂中，伴随搅拌，缓缓倒入 25ml 6%的 CF₃COOH，使得体系中的 CF₃COOH的浓度为 4%，室温搅拌反应 30min。加入饱和 NaHC0₃中和，分液得到有机相，用饱和 NaHC0₃ (20ml) 洗涤有机相一次，用无水 Na₂S0₄干燥有机相，过滤，浓缩，常压柱分离得到产物，产率 69%。产率是产物的重量与按 OH[GG]AZMB计算的理论产量的百分比。

(21 ) 合成 OH[AACC]AZMB

在 100ml圆底烧瓶中加入合成实施例 1的产物（3.24g， 3.00mmol), 步骤（15 )得到的 OH[ACC]AZMB (4.31g, 2.25mmol)，加入无水吡啶 15ml溶解样品，分批加入 MSNT ( 1.87g, 6.30mmol)，室温搅拌反应 3h。加入 IM TEAB 10ml搅拌 20min终止反应，将反应液倒入 100ml CH₂Cl₂中，用 IM TEAB洗涤 3次（每次 20ml)，分液得到有机相，用无水 Na₂S0₄干燥有机相，过滤，浓缩，常压柱分离得到产物。将得到的产物溶于 50ml CH2CI2中，伴随搅拌，缓缓倒入 50ml 6%的 CF₃COOH，使得体系中的 CF₃COOH的浓度为 3%，室温搅拌 30min。加入饱和 NaHC0₃中和，分液得到有机相，用饱和 NaHC0₃ (40ml) 洗涤有机相一次，用无水 Na₂S0₄干燥有机相，过滤，浓缩，常压柱分离得到产物，产率 50%。产率是产物的重量与按 OH[ACC]AZMB计算的理论产量的百分比。 (22) 合成 DMTr[CGCA]AZMB

在 100ml圆底烧瓶中加入合成实施例 3的产物（3.04g， 2.88mmol) 和步骤（16) 得到的 OH[GCA]AZMB (4.25g， 2.21mmol), 加入无水吡啶 15ml溶解样品，分三次加入 MSNT ( 1.84g, 6.19mmol)，室温搅拌 3.5h。加入 1M的 TEAB 10ml，搅拌 20min终止反应，将反应液倒入 100ml CH₂Cl₂中，用 1M TEAB洗涤 3次（每次 50ml)，分液得到有机相，用无水 Na₂S0₄干燥有机相，过滤，浓缩，常压柱分离得到产物，产率 76%。产率是产物的重量与按 OH[GCA]AZMB计算的理论产量的百分比。

(23 ) 合成 DMTr[UUCC]AZMB

在 50ml圆底烧瓶中加入合成实施例 6的产物（2.43g， 2.55mmol)，步骤（17) 得到的 OH[UCC]AZMB (3.50g， 1.96mmol)，加入无水吡啶 15ml溶解样品，分三次加入 MSNT ( 1.63g, 5.49ml), 室温搅拌 4h。加入 1M的 TEAB 10ml，搅拌 20min终止反应，将反应液倒入 100ml CH₂C1₂中，用 1M TEAB洗涤 3次（每次 20ml)，分液得到有机相，用无水 Na₂S0₄干燥有机相，过滤，浓缩，常压柱分离得到产物，产率 78%。产率是产物的重量与按 OH[UCC]AZMB计算的理论产量的百分比。

(24) 合成 DMTr[GG]OH

在 500ml圆底烧瓶中加入步骤（9)得到的 DMTr[GG]AZMB (7.55g, 4.81mmol)， Ph₃P (5.04g， 19.2mmol)，加入 240ml二氧六环 /水 (v:v=9:l )溶解样品，室温搅拌反应 8h，反应结束，除去溶剂后用高效分离纯化制备色谱（型号： Combiflash Companion/TS 生产厂家： Teledyne lSCO INC. ) 进行快速层析，得到含三苯基氧膦和脱下的 3 ' 保护基的粗品，干燥后备用。

(25 ) 合成 DMTr[GG]PO- 在 100ml圆底烧瓶中加入 1,2,4-三唑（1.50g， 22.1mmol)和重蒸的三乙胺（3.58g， 35.4mmol )，加入 16.6ml无水 CH₂C1₂溶解，冰浴冷却条件下滴加溶于 8.8ml无水 CH₂C1₂ 的 2-氯苯基二氯代磷酸酯（2.17g， 8.8mmol), 搅拌反应 lh。冰浴改成冰盐浴，将温度调整为 -10°C至 -5 °C，再滴加溶于无水 13.3ml CH₂C1₂中的步骤（24 ) 得到的产品 DMTr[GG]OH，冰盐浴下搅拌反应 4h。加入 20ml 1M的 ΤΕΑΒ,继续搅拌反应 0.5小时。停止反应，分液得到有机相，用 1M的 TEAB洗涤三次，用无水 Na₂S0₄干燥有机相，过滤，浓缩，常压柱分离得到产品，产率 60%。产率是产物的重量与按 DMTr[GG]AZMB 计算的理论产量的百分比。

(26) 合成 DMTr[UCA]OH

采用与步骤（24) 相同的方法合成 DMTr[UCA]OH，不同的是，采用步骤（11 ) 得到的 DMTr[UCA]AZMB ( 11.3g, 4.69mmol) 禾口 Ph₃P (4.96g， 18.7mmol)。 (27) 合成 DMTr[UCA]PO- 采用与步骤 (25 )相同的方法制备 DMTr[UCA]PO-，不同的是，用 19.5ml无水 CH₂C1₂ 溶解 1,2,4-三唑 ( 1.77g, 26.0mmol ) 和重蒸的三乙胺 (4.21g, 41.7mmol )，用 10.5ml 无水 CH₂C1₂溶解 2-氯苯基二氯代磷酸酯（2.56g， 10.4mmol), 用 15.6ml无水 CH₂C1₂ 溶解步骤（26 ) 得到的 DMTr[UCA]OH。产率 79%。产率是产物的重量与按 DMTr[UCA]AZMB计算的理论产量的百分比。

(28) 合成 DMTr[UGC]OH

采用与步骤（24) 相同的方法合成 DMTr[UGC]OH，不同的是，采用步骤（10) 得到的 DMTr[UGC]AZMB ( 10.6g, 4.42mmol) 禾 B Ph₃P (4.63g, 17.7mmol)。

(29) 合成 DMTr[UGC]PO- 采用与步骤 (25 )相同的方法制备 DMTr[UGC]PO—，不同的是，用 19.4ml无水 CH₂C1₂ 溶解 1,2,4-三唑 ( 1.76g, 25.9mmol ) 和重蒸的三乙胺（4.18g， 41.4mmol )，用 10.4ml 无水 CH₂C1₂溶解 2-氯苯基二氯代磷酸酯（2.54g， 10.3mmol), 用 15.5ml无水 CH₂C1₂ 溶解步骤（28 ) 得到的 DMTr[UGC]OH,产率 71%。产率是产物的重量与按 DMTr[UGC]AZMB计算的理论产量的百分比。

(30) 合成 DMTr[GUU]OH

采用与步骤（24) 相同的方法合成 DMTr[GUU]OH，不同的是，采用步骤（13 ) 得到的 DMTr[GUU]AZMB (5.41g, 2.36mmol) 禾 B Ph₃P (2.47g, 9.43mmol)，二氧六环 /水 (v:v=9:l ) 的用量为 120ml。

(31 ) 合成 DMTr[GUU]PO—

采用与步骤（25 )相同的方法制备 DMTr[GUU]PO—，不同的是，用 9.8ml无水 CH₂C1₂ 溶解 1,2,4-三唑（891mg， 13.1mmol) 和重蒸的三乙胺（2.12g， 21.0mmol )，用 5.2ml 无水 C¾C1₂溶解 2-氯苯基二氯代磷酸酯（2.54g， 10.3mmol), 用 7.9ml无水 CH₂C1₂溶解步骤（ 30 ) 得到的 DMTr[GUU]OH,产率 64%。产率是产物的重量与按 DMTr[GUU]AZMB计算的理论产量的百分比。

(32) 合成 DMTr[GUG]OH

采用与步骤（24) 相同的方法合成 DMTr[GUG]OH，不同的是，采用步骤（14) 得到的 DMTr[GUG]AZMB (4.40g, 1.83mmol) 禾 B Ph₃P ( 1.92g， 7.33mmol), 二氧六环 /水 (v:v=9:l ) 的用量为 900ml。

(33 ) 合成 DMTr[GUG]PO- 采用与步骤（25 )相同的方法制备 DMTr[GUG]PO-，不同的是，用 6.8ml无水 CH₂C1₂ 溶解 1,2,4-三唑（622mg， 9.15mmol) 和重蒸的三乙胺（1.48g， 14.7mmol )，用 3.6ml 无水 CH₂C1₂溶解 2-氯苯基二氯代磷酸酯（898mg， 3.66mmol), 用 5.5ml无水 CH₂C1₂ 溶解步骤（ 32 ) 得到的 DMTr[GUG]OH,产率 64%。产率是产物的重量与按 DMTr[GUG]AZMB计算的理论产量的百分比。

(34) 合成 DMTr[CGCA]OH

采用与步骤（24) 相同的方法合成 DMTr[CGCA]OH，不同的是，采用步骤（22) 得到的 DMTr[CGCA]AZMB (4.77g, 1.67mmol) 和 Ph₃P ( 1.74g, 6.66mmol)。 (35 ) 合成 DMTr[CGCA]P〇- 采用与步骤（25 ) 相同的方法制备 DMTr[CGCA]PO—，不同的是，用 10.0ml无水 CH₂C1₂溶解 1,2,4-三唑 (604mg, 8.88mmol) 和重蒸的三乙胺（1.62g， 16.0mmol)，用 3.5ml无水 CH₂C1₂溶解 2-氯苯基二氯代磷酸酯（ 873mg, 3.55mmol)，用 5.4ml无水 CH₂C1₂ 溶解步骤（34 ) 得到的 DMTr[CGCA]OH,产率 64%。产率是产物的重量与按 DMTr[GUU]AZMB计算的理论产量的百分比。

(36) 合成 DMTr[UUCC]OH

采用与步骤（24) 相同的方法合成 DMTr[UUCC]OH，不同的是，采用步骤（23 ) 得到的 DMTr[UUCC]AZMB (3.85g, 1.19mmol) 禾 B Ph₃P ( 1.25g, 4.77mmol), 二氧六环 /水（v:v=9:l ) 的混合溶液的用量为 60ml。

(37) 合成 DMTr[UUCC]PO- 采用与步骤（25 ) 相同的方法制备 DMTr[UUCC]PO—，不同的是，用 9.8ml 无水 CH₂C1₂溶解 1,2,4-三唑（891mg， 13.1mmol) 和重蒸的三乙胺（2.12g， 21.0mmol)，用 5.2ml无水 CH₂C1₂溶解 2-氯苯基二氯代磷酸酯（1.29g，5.25mmol)，用 5.5ml无水 CH₂C1₂ 溶解步骤（36 ) 得到的产品 DMTr[UUCC]OH,产率 86%。产率是产物的重量与按 DMTr[UUCC]AZMB计算的理论产量的百分比。

(38) 合成 DMTr[GGAACC]AZMB

在 100ml圆底烧瓶中加入步骤（25 )得到的 DMTr[GG]PO— (2.74g， 2.15mmol)和步骤 (21 ) 得到的 HO[AACC]AZMB (2.70g， 1.05mmol)，加入 10ml无水吡啶完全溶解后，分批加入 MSNT (0.873g, 2.94mmol)，室温反应 3h，加入 lml 1M的 TEAB再搅拌 25min后，停止反应，倒入约 100ml CH₂C1₂中，用 1M TEAB洗涤 3次，分液得到有机相，用无水 Na₂S0₄干燥有机相，过滤，浓缩，常压柱分离得到产品，产率 48%。 (39) 合成 DMTr[UCACA]AZMB

采用与步骤（38)相同的方法合成 DMTr[UCACA]AZMB，不同的是，采用步骤（27) 得到的 DMTr[UCA]P〇- (4.84g， 2.16mmol)，步骤 (5 ) 得到的 HO[CA]AZMB (2.01g, 1.57mmol )，无水吡啶的用量为 15ml， MSNT ( 1.31g, 4.40mmol)。产率 66%。

(40) 合成 DMTr[UCAACG]AZMB

采用与步骤（38) 相同的方法合成 DMTr[UCAACG]AZMB，不同的是，采用步骤 (27)得到的 DMTr[UCA]P〇- (4.56g， 2.03mmol), 步骤（20)得到的 HO[ACG]AZMB (2.70g, 1.41mmol)，无水吡啶的用量为 15ml， MSNT ( 1.17g, 3.95mmol)。产率 60%。

(41 ) 合成 DMTr[CGCAUU]AZMB

采用与步骤（38) 相同的方法合成 DMTr[CGCAUU]AZMB，不同的是，采用步骤

(35 ) 得到的 DMTr[CGCA]PO" (3.2g, 1.07mmol), 步骤（4 ) 得到的 HO[UU]AZMB ( 1.05g, l.OOmmol), 无水吡啶的用量为 10ml， MSNT ( 832mg, 2.80mmol)。产率 87%。

(42) 合成 DMTr[UGCGC]AZMB

采用与步骤（38)相同的方法合成 DMTr[UGCGC]AZMB，不同的是，采用步骤（29) 得到的 DMTr[UGC]PCT (7.00g, 3.14mmol)，步骤 (7) 得到的 HO[GC]AZMB (3.10g, 2.46mmol )，无水吡啶的用量为 25ml， MSNT (2.05g, 6.89mmol)。产率 78%。

(43 ) 合成 DMTr[GUUGAU]AZMB

采用与步骤（38)相同的方法合成 DMTr[GUUGAU]AZMB，不同的是，采用步骤 (31 )得到的 DMTr[GUU]PO— (3,20g, 1.51mmol)，步骤（19)得到的 HO[GAU]AZMB (2.30g, 1.27mmol)，无水吡啶的用量为 12ml， MSNT ( 1.06g, 3.56mmol)。产率 74%。

(44) 合成 DMTr[GUGAGG]AZMB

采用与步骤（38)相同的方法合成 DMTr[GUGAGG]AZMB，不同的是，采用步骤 (33 ) DMTr[GUG]PO" (2.6g， 1.16mmol)，步骤（18)得到的 HO[AGG]AZMB ( 1.90g, 0.99mmol )，无水吡啶的用量为 10ml， MSNT ( 832mg, 2.8mmol)。产率 74%。

(45 ) 合成 DMTr[UUCCUU]AZMB

采用与步骤（38) 相同的方法合成 DMTr[UUCCUU]AZMB，不同的是，采用步骤 (37) 得到的 DMTr[UUCC]PO" (2.80g, 1.02mmol)，步骤（4) 得到的 HO[UU]AZMB (0.94g, 0.90mmol), 无水吡啶的用量为 10ml， MSNT (748mg, 2.52mmol)。产率 82%。

(46) 合成 HO[UCACA]AZMB

将步骤（39)得到的 DMTr[UCACA]AZMB (3.80g, 1.03mmol)溶于 15ml CH₂C1₂ 中，缓缓倒入 6%的 CF₃COOH，使得体系中的 CF₃COOH的浓度为 4%，室温搅拌 30min。加入饱和 NaHC0₃中和，分液得到有机相，用 15ml饱和 NaHC0₃洗涤有机相一次，无水 Na₂S0₄干燥有机相，过滤，浓缩，常压柱分离得到产品，产率 84%。 (47) 合成 HO[CGCAUU]AZMB

采用与步骤（46)相同的方法制备 HO[CGCAUU]AZMB，不同的是，采用步骤（41 ) 得到的 DMTr[CGCAUU]AZMB (3.8g, 0.97mmol)。产率 58%。

(48) 合成 HO[GUUGAU]AZMB

采用与步骤（46)相同的方法制备 HO[GUUGAU]AZMB，不同的是，采用步骤（43 ) 得到的 DMTr[GUUGAU]AZMB (3.50g, 0.94mmol)。产率 58%。

(49) 合成 HO[UUCCUU]AZMB

采用与步骤（46)相同的方法制备 HO[UUCCUU]AZMB，不同的是，采用步骤（45 ) 得到的 DMTr[UUCCUU]AZMB (2.90g, 0.79mmol)。产率 87%。

(50) 合成 DMTr[GGAACC]P〇- 在 100ml 圆底烧瓶中加入步骤（38 ) 得到的 DMTr[GGAACC]AZMB (2.20g , 0.50mmol ), Ph₃P (524mg， 2.00mmol), 加入 25ml二氧六环 /水 (v:v=9:l ) 溶解后，室温搅拌反应 18h，旋蒸除去溶剂后，用高效分离纯化制备色谱（型号： Combiflash Companion/TS 生产厂家： Teledyne lSCO INC.) 进行快速层析，得到含三苯基氧膦和脱下的 3 ' 保护基的粗品 2.00g，干燥后备用。

在 100ml圆底烧瓶中加入 1,2,4-三唑（170mg， 2.50mmol)和重蒸的三乙胺（454mg， 4.50mmol )，加入 1.5ml无水 CH₂C1₂溶解，冰浴冷却条件下，滴加入溶于 1.0ml无水 C¾C1₂ 的 2-氯苯基二氯代磷酸酯（246mg， l.Ommol), 搅拌反应 lh。冰浴改成冰盐浴，将温度调整为 -10°C至 -5°C，再滴加溶于无水 CH₂C1₂的上一步得到的产品 DMTr[GGAACC]OH，搅拌反应 4h。加入 10ml 1M的 ΤΕΑΒ, 继续搅拌反应 0.5小时。停止反应，分液得到有机相，用 1M的 ΤΕΑΒ洗涤有机相三次，用无水 Na₂S0₄干燥有机相，过滤，浓缩，常压柱分离得到产品，两步合计产率 54%。

(51 ) 合成 DMTr[UCAACG]PO- 采用与步骤（50)相同的方法合成 DMTr[UCAACG]PO_，不同的是，采用步骤（40) 得到的 DMTr[UCAACG]AZMB (3.60g, 0.94mmol)。两步的产率 66%。

(52) 合成 DMTr[UGCGC]PO- 采用与步骤（50)相同的方法合成 DMTr[UGCGC]PO_，不同的是，采用步骤（42) 得到的 DMTr[UGCGC]AZMB (6.40g, 1.90mmol)。两步的产率 70%。

(53 ) 合成 DMTr[GUGAGG]PO- 采用与步骤（50)相同的方法合成 DMTr[GUGAGG]PO—，不同的是，采用步骤（38) 得到的 DMTr[GGAACC]AZMB (3.00g, 0.75mmol)。两步的产率 41%。

(54) 合成 DMTr[GGAACCUCACA]AZMB

在 50ml圆底烧瓶中加入步骤（50)得到的 DMTr[GGAACC]PO— ( 1.2g， 0.26mmol)，步骤（46) 得到的 HO[UCACA]AZMB (0.85g， 0.25mmol) ，加入 5ml无水吡啶完全溶解后，分批加入 MSNT (208mg， OJOmmol), 室温反应 8h。加入 lml 1M的 TEAB搅拌 25min后，停止反应，将反应液倒入约 50ml CH₂C1₂中，用 IM TEAB洗涤 3次，分液得到有机相，用无水 Na₂S0₄干燥有机相，过滤，浓缩，常压柱分离得到产品 1.40g，产率 71%。

(55 ) 合成 DMTr[UGCGCGUUGAU]AZMB

在 50ml圆底烧瓶中加入步骤（52)得到的 DMTr[UGCGC]P〇- (2.52g， 0.72mmol)，步骤（48)得到的 HO[GUUGAU]AZMB (2.5g， OJlmmol)，加入 8ml无水吡啶完全溶解后，分批加入 MSNT (500mg， 1.68mmol)，室温反应 8h。加入 lml 1M的 TEAB搅拌 25min后，停止反应，将反应液倒入约 50ml CH₂C1₂中，用 IM TEAB洗涤 3次，分液得到有机相，用无水 Na₂S0₄干燥有机相，过滤，浓缩，常压柱分离得到产品，产率 49%。

(56) 合成 DMTr[UCAACGCGCAUU]AZMB

在 50ml圆底烧瓶中加入步骤（51 )得到的 DMTr[UCAACG]PO-(2.43g， 0.61mmol)，步骤 (47) 得到的 HO[CGCAUU]AZMB ( 1.85g， 0.51mmol)，加入 8ml无水吡啶完全溶解后，分批加入 MSNT (424mg， 1.43mmol)，室温反应 8h，加入 lml 1M的 TEAB 搅拌 25min，停止反应，将反应液倒入约 50ml CH₂C1₂中，用 IM TEAB洗涤 3次，分液得到有机相，用无水 Na₂S0₄干燥有机相，过滤，浓缩，常压柱分离得到产品，直接用于下一步反应。

(57) 合成 DMTr[GUGAGGUUCCUU]AZMB

在 50ml圆底烧瓶中加入步骤（53 )得到的 DMTr[GUGAGG]PCr ( 1.40g， 0.30mmol) 和步骤（49) 得到的 HO[UUCCUU]AZMB ( 1.24g， 0.37mmol ), 加入 6ml无水吡啶完全溶解后，分批加入 MSNT (249mg， 0.84mmol)，室温反应 8h，加入 lml 1M的 TEAB 搅拌 25min后，停止反应，将反应液倒入约 50ml CH₂C1₂中，用 1MTEAB洗涤 3次，分液得到有机相，用无水 Na₂S0₄干燥有机相，过滤，浓缩，常压柱分离得到产品，直接用于下一步反应。

(58) 合成 HO[UCAACGCGCAUU]AZMB

将步骤（56)得到的 DMTr[UCAACGCGCAUU]AZMB溶于 10ml CH₂C1₂中，缓缓加入 6%的 CF₃COOH，使体系中 CF₃COOH的浓度为 4%，室温搅拌 30min。加入饱和 NaHC0₃中和，分液得到有机相，用饱和 NaHC0₃洗涤有机相一次，用无水 Na₂S〇4干燥有机相，过滤，浓缩，常压柱分离得到产物，产率 53%。产率是产物的重量与按 HO[CGCAUU]AZMB计算的理论产量的百分比。 (59) 合成 HO[GUGAGGUUCCUU]AZMB

将步骤（57)得到的 DMTr[GUGAGGUUCCUU]AZMB溶于 10ml CH₂C1₂中，缓缓加入 6%的 CF₃COOH，使体系中 CF₃COOH的浓度为 4%，室温搅拌 30min。加入饱和 NaHC0₃中和，分液得到有机相，用饱和 NaHC0₃洗涤有机相一次，用无水 Na₂S〇4干燥有机相，过滤，浓缩，常压柱分离得到产物，产率 54%。产率是产物的重量与按 HO[UUCCUU]AZMB计算的理论产量的百分比。

(60) 合成 DMTr[GGAACCUCACA]PO- 在 100ml圆底烧瓶中加入步骤（54)得到的 DMTr[GGAACCUCACA]AZMB( 1.40g， 0.18mmol ) 和 Ph₃P (200mg, 0.76mmol), 加入 10ml二氧六环 /水 (v:v=9:l ) 溶解后，室温搅拌反应 28h，用旋蒸除去溶剂后，用高效分离纯化制备色谱进行快速层析，得到含三苯基氧膦和脱下的 3 ' 保护基的粗品 1.2g，干燥后备用。

在 25ml圆底烧瓶中加入 1,2,4-三唑（65mg， 0.96mmol)和重蒸的三乙胺（162mg， 1.60mmol )，加入 0.5ml无水 CH₂C1₂溶解，冰浴冷却条件下滴加入溶于 0.5ml无水 C¾C1₂ 的 2-氯苯基二氯代磷酸酯（98mg， 0.40mmol)，搅拌反应 lh。冰浴改成冰盐浴，将温度调整为 -10 °C至 -5 °C，再滴加溶于无水 C¾C1₂ 中的上一步得到的产品 DMTr[GGAACCUCACA]OH ,搅拌反应 5.5h。加入 3ml 1M的 TEAB,继续搅拌反应 1小时。分液得到有机相，用 1M的 TEAB洗涤有机相三次，无水 Na₂S0₄干燥有机相，过滤，浓缩，常压柱分离得到产物，产率 43%。产率是产物的重量与按 DMTr[GGAACCUCACA]AZMB计算的理论产量的百分比。

(61 ) 合成 DMTr[UGCGCGUUGAU]PO- 在 100ml圆底烧瓶中加入步骤（55 )得到的 DMTr[UGCGCGUUGAU]AZMB( 1.95g， 0.28mmol ) 和 Ph₃P (350mg, 1.34mmol), 加入 10ml二氧六环 /水 (v:v=9:l ) 溶解样品后，室温搅拌反应 28h，反应结束，旋蒸除去溶剂后，用高效分离纯化制备色谱进行快速层析，得到含三苯基氧膦和脱下的 3 ' 保护基的粗品 1.45g，干燥后备用。

在 100ml圆底烧瓶中加入 1,2,4-三唑（90mg， 1.32mmol)和重蒸的三乙胺（224mg， 2.22mmol )，加入 1.0ml无水 C¾C1₂溶解样品，冰浴冷却条件下滴加溶于 0.5ml无水 CH₂C1₂的 2-氯苯基二氯代磷酸酯（137mg， 0.56mmol)，搅拌反应 lh。冰浴改成冰盐浴，将温度调整为 -10 °C至 -5 °C，再滴加溶于无水 C¾Ch 的上一步得到的产品 DMTr[UGCGCGUUGAU]OH , 搅拌反应 5.5h。加入 3ml 1M的 ΤΕΑΒ, 继续搅拌反应 1 小时。停止反应，分液得到有机相，用 1M的 TEAB洗涤有机相三次，用无水 Na₂S0₄ 干燥有机相，过滤，浓缩，常压柱分离得到产物，产率 34.4%。产率是产物的重量与按 DMTr[UGCGCGUUGAU]AZMB计算的理论产量的百分比。 (62) 合成 DMTr[GGAACCUCACAUCAACGCGCAUU]AZMB

在 25ml圆底烧瓶中加入步骤（60) 得到的 DMTr[GGAACCUCACA]P〇- (560mg, 70mmol)和步骤（58)得到的 HO[UCAACGCGCAUU]AZMB (500mg, 70mmol)，加入 1.5ml无水吡啶完全溶解样品后，分批加入 MSNT (62mg， 0.21mmol)，室温反应 8h，加入 1ml 1M的 TEAB搅拌 25min后，停止反应，将反应液倒入约 50ml CH₂C1₂中，用 IM TEAB洗涤 3次，分液得到有机相，用无水 Na₂S0₄干燥有机相，过滤，浓缩，常压柱分离得到产物，产率 96%。

(63) 合成 DMTr[UGCGCGUUGAUGUGAGGUUCCUU]AZMB

在 25ml圆底烧瓶中加入步骤（61)得到的 DMTr[UGCGCGUUGAU]P〇- (560mg,

79umol) 和步骤（59) 得到的 HO[GUGAGGUUCCUU]AZMB (600mg, 79umol), 加入 1.5ml无水吡啶完全溶解样品后，分批加入 MSNT (70mg， 0.24mmol)，室温反应 8h。加入 1ml 1M的 TEAB搅拌 25min后，停止反应，将反应液倒入约 50ml CH₂C1₂中，用 IM TEAB洗涤 3次，分液得到有机相，用无水 Na₂S0₄干燥有机相，过滤，浓缩，常压柱分离得到产物，产率 88%。实施例 4

该实施例合成寡核苷酸。

合成目标： 5'- GGAACCUCACAUCAACGCGCAUU -3 '

禾口 5'- UGCGCGUUGAUGUGAGGUUCCUU -3'

采用与实施列 2 相同的方法脱除保护基，不同的是分别使用实施列 3 合成的

AUGUGAGGUUCCUU]AZMB代替 DMTr[CGAAAGAACG]AZMB

经测序与设计合成序列相符。

Claims

权利要求书

1、一种寡核苷酸的制备方法，其特征在于，该方法包括在缩合反应条件下将式（1) 的化合物与式（2) 的化合物在液态反应介质中反应，得到式（3) 的化合物，

式 (1) 式（2)

式 (3)

其中， Ri表示二对甲氧三苯甲基、 RNA或 DNA;

¾和 R₃各自表示位阻型硅烷保护基团；

R4表示卤素原子；

A⁺表示三烷基铵离子； B!和 B₂各自表示 N-酰基取代的鸟嘌吟基、 N-酰基取代的腺嘌吟基、 N-酰基取代的胞嘧啶基、胸腺嘧啶基或尿嘧啶基。

2、根据权利要求 1所述的方法，其中，所述缩合反应条件包括：使用 1-均三甲苯磺酰（3-硝基） -三唑和 /或 1-均三甲苯磺酰三唑作为缩合剂；所述反应介质为吡啶，相对于 1摩尔的式（1 ) 的化合物，式（2) 的化合物的用量为 0.8-3摩尔，缩合剂的用量为 2-5摩尔，反应介质的用量为 5-50升；反应温度为 10-50°C，反应时间为 0.5-10小时。
3、根据权利要求 1所述的方法，其中， R2和 R3各自表示叔丁基二甲基氯硅烷基、苯基二甲基氯硅烷基、叔丁基二苯基氯硅烷基或三异丙基氯硅烷基； R4表示氯或溴；所述三烷基铵离子中的各个烷基具有 1-6个碳原子；所述酰基为苯甲酰基、异丁酰基或乙
4、根据权利要求 1 所述的方法，其中，在式（1 ) 或式（3 ) 中， ¾-Ν3位于邻位；在式（2) 或式（3 ) 中，位于邻位。
5、根据权利要求 1所述的方法，其中，式（1 ) 的化合物是通过在缩合反应条件下将式（4) 的化合物与式（5 ) 的化合物反应，然后去除 5'位上的 R5保护基而得到的，

式（4) 式（5 ) 其中，表示位阻型硅烷保护基团;

R₅表示二对甲氧三苯甲基;

表示卤素原子; B!表示 N-酰基取代的鸟嘌吟基、 N-酰基取代的腺嘌吟基、 N-酰基取代的胞嘧啶基、胸腺嘧啶基或尿嘧啶基。

6、根据权利要求 5所述的方法，其中，所述缩合反应条件包括：使用 N-甲基咪唑作为辅助剂；使用二氯甲烷、吡啶中的一种或几种作为反应介质；相对于 1摩尔的式（4) 的化合物，式（5 ) 的化合物的用量为 1-5摩尔，辅助剂的用量为 1.8-3.5摩尔，反应介质的用量为 20-200升；反应温度为 -10°C至 10°C，反应时间为 5-100小时。
7、根据权利要求 5或 6所述的方法，其中，式（5 ) 的化合物的制备方法包括以下

( 1 ) 在过氧化苯甲酰的存在下，将式（9) 的化合物与 N-卤代琥珀酰亚胺反应，得到式（10) 的化合物；

(2) 将式（10) 的化合物与碱金属叠氮化物反应，得到式（11 ) 的化合物；

(3 ) 将式（11 ) 的化合物水解，酰化得到式（5 ) 的化合物，

COORIQ. 式（9) 式（10) 式（11 )

其中， R₉表示卤素原子； Rw表示 d-C4的烷基。

8、根据权利要求 7所述的方法，其中，在步骤（1 ) 中，反应介质为四氯化碳、氯仿、苯、甲苯和庚烷中的一种或几种，相对于 1摩尔的式（9 ) 的化合物， N-卤代琥珀酰亚胺的用量为 1-3摩尔，过氧化苯甲酰的用量为 0.01-0.1摩尔，反应介质的用量为 5-20 升，反应温度为 80-120°C，反应时间为 0.5-6小时；

在步骤（2) 中，反应介质为乙醇、丙酮、 Ν,Ν-二甲基甲酰胺和二甲基亚砜中的一种或几种，相对于 1摩尔的式（10) 的化合物，碱金属叠氮化物的用量为 1-3摩尔，反应介质的用量为 3-10升，反应温度为 0至 80°C，反应时间为 2-30小时；在步骤（3 ) 中，所述水解包括将式（11 ) 的化合物与碱金属氢氧化物的醇-水混合溶液反应，相对于 1摩尔的式（10) 的化合物，碱金属氢氧化物的用量为 5-100摩尔，反应温度为 0-50°C，反应时间为 0.1-2小时，在所述醇 -水混合溶液中碱金属氢氧化物的浓度为 5-10重量％。

9、根据权利要求 1所述的方法，其中，式（2) 的化合物是通过在催化剂存在下将式（6) 的化合物、式（7) 的化合物和三烷基胺在反应介质中反应而得到的，所述催化剂选自 1,2,4-三唑、三乙胺、吡啶中的一种或几种，所述反应介质选自二氯甲烷、二氧六环、四氢呋喃中的一种或几种，

式（6) 式 (7) 其中， Ri表示二对甲氧三苯甲基、 RNA或 DNA;

R₃表示位阻型硅烷保护基团；

、和各自表示卤素原子；

B₂表示 N-酰基取代的鸟嘌吟基、 N-酰基取代的腺嘌吟基、 N-酰基取代的胞嘧啶基、胸腺嘧啶基或尿嘧啶基。

10、根据权利要求 9所述的方法，其中，所述反应的温度为 -10°C至 10°C，反应时间为 0.5-10小时；相对于 1摩尔的式（6) 的化合物，式（7) 的化合物的用量为 1-5摩尔，三烷基胺的用量为 1-50摩尔，催化剂的用量为 2-10摩尔。