RU2066325C1 - АНТИ-СЕНС ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ПРОТИВ μРНК, ТНФ АЛЬФА - Google Patents

АНТИ-СЕНС ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ПРОТИВ μРНК, ТНФ АЛЬФА Download PDF

Info

Publication number
RU2066325C1
RU2066325C1 SU915010468A SU5010468A RU2066325C1 RU 2066325 C1 RU2066325 C1 RU 2066325C1 SU 915010468 A SU915010468 A SU 915010468A SU 5010468 A SU5010468 A SU 5010468A RU 2066325 C1 RU2066325 C1 RU 2066325C1
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
product
tnf
sequence
oligonucleotidal
sense
Prior art date
Application number
SU915010468A
Other languages
English (en)
Inventor
Карим Брахам Абдель
Смет Пьер
Залис Ренэ
Original Assignee
Руссель-Юклаф
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Руссель-Юклаф filed Critical Руссель-Юклаф
Application granted granted Critical
Publication of RU2066325C1 publication Critical patent/RU2066325C1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1136—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against growth factors, growth regulators, cytokines, lymphokines or hormones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/525—Tumour necrosis factor [TNF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/315—Phosphorothioates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/321—2'-O-R Modification
    • H—ELECTRICITY
    • H02—GENERATION; CONVERSION OR DISTRIBUTION OF ELECTRIC POWER
    • H02K—DYNAMO-ELECTRIC MACHINES
    • H02K2203/00—Specific aspects not provided for in the other groups of this subclass relating to the windings
    • H02K2203/03—Machines characterised by the wiring boards, i.e. printed circuit boards or similar structures for connecting the winding terminations

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Silver Salt Photography Or Processing Solution Therefor (AREA)
  • Superconductors And Manufacturing Methods Therefor (AREA)
  • Thin Magnetic Films (AREA)

Abstract

Использование: в качестве анти-сенс последовательности против развития эндотоксического инфекционного шока. Сущность изобретения: продукт:
5' - 3'
(альфа)' TCA TGG TGT CCT TTG CAG - X
1 - 18
где Х - Н, или олигонуклеотидная последовательность от 1 до 17 нуклеотидов в свободной форме или в форме тиолата.

Description

Предметом настоящего изобретения являются новые олигонуклеотидные последовательности против мРНК, ТНФ альфа.
Известно, что ТНФ (Tumor Necrosis Factor) секретируется макрофагами и вызывает метаболические нарушения, приводящие к развитию эндотоксического инфекционного шока. Для того, чтобы заблокировать продукцию ТНФ, заявитель изучал олигонуклеотидные анти-сенс последовательности против мРНК ТНФ альфа, которые способны блокировать синтез ТНФ.
Изучая различные последовательности, заявитель обнаружил, что определенная олигонуклеотидная последовательность обладает этим свойством.
Таким образом, предметом данного изобретения является разработка новых анти-сенс олигонуклеодитов против мРНК. ТНФ альфа, имеющих следующую нуклеотидную последовательность (1):
Figure 00000001

где Х представляет либо атом водорода, либо последовательность нуклеотидов длиной от 1 до 17 нуклеотидов в свободной форме, алкильной или сульфидной форме, либо в форме производного поли L-лизина.
В общей формуле (1) и в последующих
под последовательностью от 1 до 17 нуклеотидов обозначается любая последовательность, содержащая аденин и гуанин (пуриновые основания), цитозин и тимин (пиримидиновые основания),
под алкильной формой подразумеваются алкильные производные фосфатного остатка, в частности метильные, этильные или пропильные группы. Эти группы присутствуют на всех или на части фосфатных остатков.
под сульфидной формой подразумеваются сульфидные производные фосфатной группы, главным образом тио- и дитиоаты. Эти группы присутствуют на всех или на части фосфатных остатков.
Среди продуктов согласно изобретению можно назвать олигонуклеотиды, соответствующие формуле (1), где Х представляет собой атом водорода или последовательность, полностью или частично представленную формулой (1
Figure 00000002
).
A
в свободной форме, алкильной форме, сульфидной форме или в виде производного поли L-лизина.
Из последних предпочтение отдают олигонуклеотидным последовательностям, которые соответствуют формуле (1), где Х представляет собой атом водорода, последовательность -СС или последовательность, представленную формулой (1
Figure 00000003
) в свободном виде, алкильной, сульфидной форме или в виде производного поли L-лизина и в особенности следующим последовательностям:
A
Figure 00000004

Figure 00000005

Способ получения соединений формулы (1) заключается в том, что первый нуклеотид синтезируемой последовательности фиксируют в 3' положении на неподвижной фазе (носителе):
Figure 00000006

в которой S представляет неподвижную фазу, Z углеводородную группу, содержащую от 2 до 20 атомов углерода, В
Figure 00000007
пуриновое или пиримидиновое основание с защищенной аминогруппой, соответствующее первому нуклеотиду, и R 5' защитная группа, затем деблокируют 5'-гидроксильную группу кислотным реагентом для получения следующего продукта:
1
где обозначения S, Z и B
Figure 00000008
имеют указанные выше значения, а этот продукт подвергают реакции со вторым нуклеотидом следующей формулы:
1
где R имеет указанные значения, а В
Figure 00000009
-пуриновое или пиримидиновое основание, соответствующее второму нуклеотиду с защищенной аминогруппой, R2 алкильный радикал или группа OR1' или SR1', где R1 защитная группа, R1 также представляет собой защитную группу; и
получают продукт формулы:
2
где S, R, R
Figure 00000010
, B1 и B1 имеют уже указанные значения, затем производят окисление продукты (V) до получения следующей формулы:
2
где S, R, R
Figure 00000011
, B1, B1 и Z имеют уже указанные значения, а Х2 представляет собой атом кислорода или серы, и далее, как указано выше, начиная с продукта (II), осуществляют новый цикл с продуктом (VI) и мономером нового нуклеотида до получения желаемой последовательности для получения конечного продукта.
1
где S, R, R
Figure 00000012
, B1, B1, X2 и Z имеют уже указанные значения, а В1 последний нуклеотид последовательности, затем удаляют защитную группу, продукт отделяют от неподвижной фазы и в результате получают очищенный продукт (I).
В оптимальных условиях описанный выше способ приготовления характеризуется следующими признаками:
освобождение 5'гидроксида продукта (II) осуществляют в присутствии такого кислотного реагента, как уксусная, ди- или трихлоруксусная кислота,
реакцию сочетания продукта (III) с продуктом (IV) осуществляют с помощью тетразола, растворенного в ацетонитриле,
окисление фосфитной группы продукта (V) в фосфатную продукта (VI) осуществляют с помощью йода, растворенного в следующей смеси: вода/лутидин/тетрагидрофуран или в смеси вода/пиридин/тетрагидрофуран,
окисление фосфитной группы продукта (V) для получения сульфидной формы (VI) осуществляют с помощью серы, растворенной в смеси сероуглерода, пиридина и безводного триэтиламина,
в конце синтеза снятие защиты с концевой 5'-гидроксильной группы осуществляют с помощью таких кислот как уксусная, ди- или трихлоруксусная кислота,
снятие защиты с олигонуклеотида (VII) осуществляют с помощью концентрированного раствора аммония при умеренном подогреве реакционной среды.
Для осуществления описываемого способа в основном используется автоматический синтезатор "Applied Biosystems Modele 381A".
При использовании описываемого способа неподвижная фаза S-твердая и может быть представлена двуокисью кремния или пористым стеклом. Можно также использовать неподвижные фазы, описанные в европейском патенте 0 208 599.
В соответствии с описываемым изобретением, Z представляет собой углеводородную группу -(СHZ)2, где n целое число от 2 до 20. Чаще всего используются соединения, в которых Z представлено радикалом (СНn)2.
В формулах (II)-(VII) основания В2, B1.B2 представляют собой пуриновые или пиримидиновые основания, аминогруппы которых защищены. Защитные группы могут быть, например, бензольными или изобутирильными. В случае аденина или цитозина в основном используются бензольные группы. В случае гуанина в основном используются изобутирильные группы.
Защитной группой R для 5' гидроксильной группы может быть, например, трифенилметильная, монометокси-, диметокситрифенилметильная или пиксильная группы.
Защитная группа R2' для гидроксилов фосфата может состоять, например, из метильной, цианоэтильной, орто- или парахлорофенильной групп. Предпочтение отдается цианоэтильной группе. Защитная группа R1 может быть представлена таким алкильным радикалом как метил, этил, изопропил или радикалом морфолина или пиперидина. Предпочтение отдается использованию изопропильной группе.
При использовании описываемого способа непрореагировавшую фракцию промежуточного продукта (III) сразу же превращают в эфир во избежание ошибок в синтезируемой олигонуклеотидной последовательности при присоединении следующего нуклеотида. Такая каппинг-реакция происходит в основном с помощью ацетангидрида, растворенного в смеси диметилпиридин/тетрагидрофуран и катализируется диметиламинопиридином или метилимидазолом.
Олигонуклеотидные последовательности, производные поли L-лизина, могут быть приготовлены по способу, при котором вступает в реакцию вещество, изображенное формулой (VIII):
2
где S, Z, R, R
Figure 00000013
обозначены выше, с соединением формулы (IV) для получения соединения (IX):
1
где S, R, Z, R
Figure 00000014
, B1 и B1 обозначены выше, которые окисляют, отделяют продукт от неподвижной фазы и удаляют активирующую группу для получения соединения (X):
2 (X)
где R, R
Figure 00000015
, B1 и B1 обозначены выше, X2 атом кислорода или серы, окисляют конечный рибозный остаток, затем полученный продукт подвергают реакции с L-лизином с восстанавливающей среде для получения соединения (XI):
1
где R, R
Figure 00000016
, B1, B1 и Х2 обозначены выше, и затем продолжают синтез исходя из соединения (VI).
Произвольные поли L-лизина могут быть приготовлены по способу I.P.LEONETTI et coll. GENE 72 (1988) 323-332.
Новые олигонуклеотидные последовательности, получаемые по описываемому методу, обладают очень интересными фармакологическими свойствами: они, в частности, обладают способностью блокировать продуцирование клетками ТНФ- альфа за счет специфического комплементарного взаимодействия с последовательностью (166-185) мНРК-мишеней, которая перекрывает кодон AUG.
Эти свойства более подробно рассматриваются ниже в экспериментальной части.
Эти свойства служат основой для использования новых олигонуклеотидных последовательностей, описанных выше формулой (I), в качестве медикаментов.
В ряду медикаментов согласно изобретению можно назвать анти-сенс олигонуклеотидные последовательности против мРНК ТНФальфа, соответствующие следующей формуле (I):
1
в которой Х атом водорода или последовательность от 1 до 17 олигонуклеотидов в свободной, алкильной, сульфидной форме или в виде производной поли L-лизина, а именно те, которые соответствуют формуле (I), где Х атом водорода или последовательность I
Figure 00000017
, представленная полностью или частично:
A
в свободной, алкильной, сульфидной форме или в виде производной поли L-лизина.
В качестве медикаментов особый интерес представляют те олигонуклеотидные последовательности, которые определены ниже, где Х атом водорода или последовательность -СС, либо последовательность, представленная формулой (I
Figure 00000018
в свободной, алкильной, сульфидной форме или в виде производной поли L-лизина, и в особенности те олигонуклеотиды, которые соответствуют формулам:
A
Figure 00000019

в свободной, алкильной, сульфидной форме или в виде производного поли L-лизина.
Эти медикаменты применяются при лечении инфекционных эндотоксических шоков любой этиологии и любых патологических состояний, вызванных гиперпродукцией ТНФ- альфа.
Обычная доза, меняющаяся в зависимости от используемого вещества, от пациента и заболевания может, например, составлять от 1 до 30 микрограмм в день внутривенно.
Новые олигонуклеотидные последовательности (I) могут использоваться для приготовления фармацевтических смесей, включающих по крайней мере одну из указанных последовательностей в качестве активного компонента.
В качестве активных компонентов олигонуклеотидные последовательности, соответствующие формуле (I) в свободной, алкильной, сульфидной форме или в виде производной поли L-лизина, могут быть введены в состав фармацевтических смесей, предназначенных для орального, парентерального или местного применения.
Эти фармацевтические смеси могут быть твердыми или жидкими в обычной форме, принятой в медицине человека, как например, таблетки или драже, желеобразные капсулы, капсулы, гранулы, суппозитории, препараты для инъекции, аэрозоли, изготовляемые обычными методами. Активный компонент или компоненты могут быть введены в состав таких обычных наполнителей, применяемых в фармацевтических смесях, как тальк, гуммеарабик, лактоза, крахмал, стеарат магния, масло какао, водные или гидрофобные переносчики, масла животного или растительного происхождения, производные парафина, гликоли, различные смачивающие вещества, дисперсирующие или эмульгирующие препараты, консерванты.
Пример 1. Последовательность (d)G50® TCA TGG TGT CCT TTG CAG 3' (18-мер анти ТНФ альфа) в свободной форме.
Оборудование.
Применяется автоматический синтезатор "Applied Biosystems Model 381 A". Аппарат загружается всеми необходимыми реактивами. Продукты (IV) растворены в ацетонитриле; под небольшим давлением аргона раствор подается автоматически через отверстие электроклапана по мере надобности.
Составляют программу синтеза. Указывают желаемое количество продукта, с которым собираются работать.
Можно запрограммировать деблокирование конечного продукта (I) для получения искомого вещества либо со свободной 5' гидроксильной группой, либо в виде производного трифенилметила.
Маленькую колонку, заполненную неподвижной фазой (II) (пористое стекло CPG), устанавливают в аппарат.
Вся процедура синтеза осуществляется автоматически.
Растворы для деблокирования собираются автоматически на каждой стадии синтеза в коллектор фракции, соединенный с синтезатором; таким образом на каждой стадии можно знать выход продукта.
Реактивы.
Используются только реактивы высокой степени чистоты.
4 фосфорамида, представленные формулой (IV) (В2 аденин, цитозин, гуанин или тимин) расфасованы в маленькие флаконы. Перед их внесением в аппарат следует добавить необходимое количество растворителя.
В аппарат вносятся также и другие растворы, а именно
раствор 4% тетразоля в ацетонитриле для активирования реакции сочетания,
ацетангидрид/лутидин/тетрагидрофуран (1/1/8) и диметиламинопиридин/тетрагидрофуран (7/93), которые смешиваются in situ для реакции "каппинга",
иод/вода/лутидин/тетрагидрофуран (3/2/2/93) для окисления фосфита продукта (V) в фосфат продукта (VI),
2%-ный раствор трихлоруксусной кислоты в дихлорметане для деблокировки,
чистый ацетонитрил для растворения фосфорамидов.
Метод.
Реакция реализуется на 0,95 микромоля. Продукт деблокируют в аппарате в конце синтеза.
Выход неочищенного продукта составляет 79%
Снятие защиты с продукта (VII) осуществляется следующим способом.
1 28%-ный раствор аммония /1ч при комнатной температуре,
концентрированный раствор аммония (605') 5 ч.
Очистка
1 обессоливание на колонке NAP 10 (Pharmacia) Sephadex o.
2 ВЭЖХ на колонке Portisil 10 SAX® в градиенте от 50-99% растворителя А в смеси А+В в течение 20 мин.
А 0,3 М фосфатный буфер СНG50®CN 7/3 рН 6,2
В 103 М фосфатный буфер СН-3CN 7/3 рН 6,2
скорость потока 2 см3/мин.
3 обессоливание на колонке NAO 25 (Pharmacia) Sephadex 3.
Анализ очищенного продукта:
ВЭЖХ на колонке Partisil 10 SAX® при тех же условиях, время удерживания продукта 13,92 мин.
ВЭЖХ на обращенной фазе microbondapack C18® в градиенте раствора 8,4 - 15% СНG50®CN в ацетате триэтиламмония 103 М рН 5,5 в течение 20 мин, скорость потока 2 см-2/мин, время удерживания 12,13 мин.
Конечный выход составляет 0,125 микромоля чистого продукта (13%).
Пример 2. Последовательность (d)3 TCA TGG TGT CCT TTG CAG 3' (18-мер анти ТНФ альфа) в форме серопроизводного.
Синтез проводят тем же способом, что и в примере 1, с заменой стадии окисления иодом стадией окисления серой в течение 450 с для получения продукта, указанного в названии примера.
Окисление иодом заменяется окислением серой. Раствор иод/вода/лутидин/тетрагидрофуран заменяется следующим раствором:
3 г серы
28,5 мл сероуглерода
28,5 мл безводного пиридина
3 мл безводного триэтиламина.
В случае окисления серой необходимо несколько раз промыть колонку до и после окисления раствором сероуглерода в пиридине (I/I) для удаления остатков серы. В остальном метод не меняется.
Выход синтеза при 1,24 микромоля: 56,5%
Деблокировка:
1 28%-ный раствор аммония/ 1 ч при комнатной температуре,
2 концентрированный раствор аммония (505') 10-15 ч.
Очистка
1 обессоливание на колонке NAP 25 Sephadex o элюент вода.
2 контрольная ВЭЖХ на microbondapack C18®
Время удерживания 24,46
Градиент 30-50% А за 20 мин, скорость потока 2 см
Figure 00000020
/мин.
А 103 м/л ацетат триэтиламмония рН 5,5 (СН-2CN 7/3)
B 103 м/л ацетат триэтиламмония рН 5,5
Выход чистого продукта: 40,3%
Пример 3. Последовательность (d)-2 TCA TGG TGT CCT TTG CAG CC 3' (20-мер анти ТНФ альфа) в свободной форме.
Синтез проводят тем же способом, что и в примере 1, для получения продукта, указанного в названии примера.
Пример 4. Последовательность (d) 5' TCA TGT CCT TTG CAG CC TCA TGC TTT CAG TAG 3' (35-мер анти ТНФ-альфа) в свободной форме.
Синтез проводят тем же способом, что и в примере 1, для получения продукта, указанного в названии примера.
Пример 5. Приготовление раствора для инъекции следующего состава:
Продукт из примера 1 10 микрограмм
Вода для инъекций 2 мл
Пример 6. Приготовление таблеток следующего состава:
Продукт из примера 2 20 микрограмм
Наполнитель до 100 мг1 (состав наполнителя: лактоза, крахмал, тальк, стеарат магния)
Пример 7.
Приготовление раствора для инъекции следующего состава:
Продукт из примера 3 10 микрограмм
Вода для инъекций 2 мл
Исследование олигонуклеотидной последовательности, полученной в примере 3.
1 Биологический тест
1.1 инкубирование моноцитов человека (4 х 105' клеток) в присутствии 6 микромолей 4 видов анти-сенс олигонуклеотидов в течение 3 ч;
1.2 добавление ЛПС (10 микрограмм/мл) и интерферона (50 х 106 и/мл);
1.3 инкубирование 18 ч;
1.4 собрать супернатант культуры;
1.5 добавить супернатант к клеткам, чувствительным к ТНФ (L 929), инкубировать в течение 24 ч.
1.6 определить выживаемость культуры колориметрически, используя при этом фиолетовый фильтр.
2. Иммунологический тест
2.1 инкубирование моноцитов человека (4 х 103 клеток) в присутствии 6 микромолей 4 видов анти-сенс олигонуклеотидов в течение 3 ч;
2.2 добавление ЛПС (10 микрограмм/мл) и интерферона (50 х 106 u/мл) для стимуляции продукции ТНФ;
2.5 инкубирование 18 ч;
2.4 собрать супернатант культуры;
2.5 cделать покрытие с этим супернатантом культуры;
2.6 добавить антитела против ТНФ, меченые иодом (для РИА) или ферментом (для ИФА).
2.8 инкубировать в течение 3 ч.
2,8 Выявление:
а) внести субстрат для фермента (ИФА) и определить оптическую плотность;
б) радиометрия (РИА);
2.9 определить количество ТНФ, выработанное моноцитами;
2.10 рассчитать показатель ингибирования продукции ТНФ.
3 Результаты
Показатель ингибирования продукции ТНФ- альфа моноцитами, обработанными анти-сен олигонуклеотидами.
Показатель ингибирования 3е

Claims (1)

1. Анти-сенсолигонуклеотидные последовательности против μPHKРНК, ТНФ- альфа общей формулы
5' 3' (альфа)'TCA TGG TGT CCT TTG CAG-X 1 18
где X водород,
или олигонуклеотидная последовательность 1 17 нуклеотидов в свободной форме или в форме тиолата.
SU915010468A 1989-08-23 1991-12-24 АНТИ-СЕНС ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ПРОТИВ μРНК, ТНФ АЛЬФА RU2066325C1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR8911171A FR2651130B1 (fr) 1989-08-23 1989-08-23 Sequence d'oligonucleotides anti-sens, anti-arn message du tnf alpha, procede de preparation, application a titre de medicaments et compositions pharmaceutiques.
FR8911171 1989-08-23

Related Parent Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SU4831673 Addition
SU4831673 Division

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RU2066325C1 true RU2066325C1 (ru) 1996-09-10

Family

ID=9384878

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SU915010468A RU2066325C1 (ru) 1989-08-23 1991-12-24 АНТИ-СЕНС ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ПРОТИВ μРНК, ТНФ АЛЬФА

Country Status (19)

Country Link
US (1) US5705389A (ru)
EP (1) EP0414607B1 (ru)
JP (1) JPH0391485A (ru)
KR (1) KR0151153B1 (ru)
CN (1) CN1028760C (ru)
AT (1) ATE120201T1 (ru)
AU (1) AU642423B2 (ru)
CA (1) CA2023899C (ru)
DE (1) DE69017983T2 (ru)
DK (1) DK0414607T3 (ru)
ES (1) ES2069715T3 (ru)
FR (1) FR2651130B1 (ru)
GR (1) GR3015527T3 (ru)
HU (1) HU215242B (ru)
IE (1) IE68592B1 (ru)
IL (1) IL95342A (ru)
PT (1) PT95067B (ru)
RU (1) RU2066325C1 (ru)
ZA (1) ZA906675B (ru)

Families Citing this family (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IT1250722B (it) * 1991-07-30 1995-04-21 Univ Degli Studi Milano Oligonucleotidi antisenso
TW323284B (ru) * 1992-03-23 1997-12-21 Novartis Ag
EP0682705A1 (en) * 1993-02-03 1995-11-22 N.V. Innogenetics S.A. Tnf-alpha muteins and a process for preparing them
US6090382A (en) * 1996-02-09 2000-07-18 Basf Aktiengesellschaft Human antibodies that bind human TNFα
WO1999027086A1 (en) * 1997-11-25 1999-06-03 Brax Group Limited Chimeric antisense oligonucleotides against tnf-alpha and their uses
US20020077276A1 (en) * 1999-04-27 2002-06-20 Fredeking Terry M. Compositions and methods for treating hemorrhagic virus infections and other disorders
US20040006036A1 (en) * 2000-04-12 2004-01-08 Gmr, A Delaware Corporation Silencing transcription by methylation
CA2385745C (en) 2001-06-08 2015-02-17 Abbott Laboratories (Bermuda) Ltd. Methods of administering anti-tnf.alpha. antibodies
US20040009172A1 (en) * 2002-04-26 2004-01-15 Steven Fischkoff Use of anti-TNFalpha antibodies and another drug
ES2535365T3 (es) * 2002-07-19 2015-05-08 Abbott Biotechnology Ltd. Tratamiento de trastornos relacionados con TNF alfa
EP1807111A4 (en) * 2004-10-08 2009-05-27 Abbott Biotech Ltd SYNCYTIAL RESPIRATORY VIRUS INFECTION (RSV)
NZ627177A (en) 2005-05-16 2016-02-26 Abbvie Biotechnology Ltd Use of tnf inhibitor for treatment of erosive polyarthritis
US20070041905A1 (en) * 2005-08-19 2007-02-22 Hoffman Rebecca S Method of treating depression using a TNF-alpha antibody
US20080118496A1 (en) * 2006-04-10 2008-05-22 Medich John R Uses and compositions for treatment of juvenile rheumatoid arthritis
US9605064B2 (en) 2006-04-10 2017-03-28 Abbvie Biotechnology Ltd Methods and compositions for treatment of skin disorders
WO2007120656A2 (en) 2006-04-10 2007-10-25 Abbott Biotechnology Ltd. Uses and compositions for treatment of rheumatoid arthritis
WO2008063213A2 (en) 2006-04-10 2008-05-29 Abbott Biotechnology Ltd. Uses and compositions for treatment of psoriatic arthritis
US20080131374A1 (en) * 2006-04-19 2008-06-05 Medich John R Uses and compositions for treatment of rheumatoid arthritis
EP2171451A4 (en) * 2007-06-11 2011-12-07 Abbott Biotech Ltd METHOD FOR TREATING JUVENILIAN IDIOPATHIC ARTHRITIS
CN101235064B (zh) * 2008-02-27 2011-08-10 东南大学 可脱保护的硫代核苷酸单体

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0090789A1 (en) * 1982-03-26 1983-10-05 Monsanto Company Chemical DNA synthesis
US4959314A (en) * 1984-11-09 1990-09-25 Cetus Corporation Cysteine-depleted muteins of biologically active proteins
FR2584090B1 (fr) 1985-06-27 1987-08-28 Roussel Uclaf Nouveaux supports, leur preparation et les intermediaires obtenus, leur application a la synthese d'oligonucleotides et les nouveaux nucleosides et oligonucleotides relies aux supports ainsi obtenus
WO1988006625A2 (en) * 1987-02-26 1988-09-07 Cetus Corporation Arginine-depleted human tumor necrosis factor
EP0424473B1 (en) * 1988-07-05 1996-05-08 Baylor College Of Medicine Methods for identification of bacteria

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
. J.P. Zeonetti et coll. Gene 72 (1988), 323-32. *

Also Published As

Publication number Publication date
ZA906675B (en) 1991-10-30
JPH0391485A (ja) 1991-04-17
ATE120201T1 (de) 1995-04-15
EP0414607B1 (fr) 1995-03-22
FR2651130A1 (fr) 1991-03-01
CN1028760C (zh) 1995-06-07
PT95067B (pt) 1997-05-28
DE69017983T2 (de) 1995-09-28
AU6119090A (en) 1991-02-28
CN1049668A (zh) 1991-03-06
HU905302D0 (en) 1991-02-28
IL95342A (en) 1995-01-24
CA2023899A1 (fr) 1991-02-24
EP0414607A3 (en) 1991-04-03
US5705389A (en) 1998-01-06
HU215242B (hu) 1998-11-30
IL95342A0 (en) 1991-06-30
PT95067A (pt) 1991-04-18
AU642423B2 (en) 1993-10-21
DK0414607T3 (da) 1995-06-06
CA2023899C (fr) 2002-05-14
EP0414607A2 (fr) 1991-02-27
ES2069715T3 (es) 1995-05-16
HUT56113A (en) 1991-07-29
IE68592B1 (en) 1996-06-26
DE69017983D1 (de) 1995-04-27
KR0151153B1 (ko) 1998-08-17
GR3015527T3 (en) 1995-06-30
IE903036A1 (en) 1991-02-27
FR2651130B1 (fr) 1991-12-13
KR910004198A (ko) 1991-03-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2066325C1 (ru) АНТИ-СЕНС ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ПРОТИВ μРНК, ТНФ АЛЬФА
US5614622A (en) 5-pentenoyl moiety as a nucleoside-amino protecting group, 4-pentenoyl-protected nucleotide synthons, and related oligonucleotide syntheses
US5942610A (en) Non-nucleoside 1,3-diol reagents and their use to label or modify synthetic oligonucleotides
US5955599A (en) Process for making oligonucleotides containing o- and s- methylphosphotriester internucleoside linkages
US6028182A (en) Methylphosphonic acid esters, processes for their preparation, and their use
US5449769A (en) Method and reagent for sulfurization of organophosphorous compounds
Seela et al. Palindromic oiigonucleotides containing 7-deaza-2'-deoxyguanosine: solid-phase synthesis of d [(p) GG* AATTCC] octamers and recognition by the endodeoxyribonnclease EcoRI
CA2151801C (en) 3'-modified oligonucleotide derivatives
EP1314734A1 (en) Novel nucleoside analogs and oligonucleotide derivatives containing these analogs
JPH0714954B2 (ja) ヌクレオチド架橋試薬として使用するためのクマリン誘導体
MXPA96004355A (en) Oligonucleotides and used modified intermediaries in nucleic acids therapeuti
JPH09511250A (ja) 核酸治療に有用な修飾オリゴヌクレオチド及び中間体
EP0090789A1 (en) Chemical DNA synthesis
IL104461A (en) Analogs of oligonucleotide, their preparation and pharmaceutical preparations containing them
WO2005014609A2 (en) Method of producing a highly stereoregular phosphorus atom-modified nucleotide analogue
US6326487B1 (en) 3 modified oligonucleotide derivatives
JP3676388B2 (ja) 非ヌクレオチド基を有する３′−誘導されたオリゴヌクレオチド類似体、その製法および使用
JP2002511840A (ja) オリゴヌクレオチド及びペプチドの液相合成方法
US4950745A (en) Process for synthesis of oligonucleotides and compound for forming polymeric protecting group
EP0749436A1 (en) Compositions and methods for use in the synthesis of oligonucleotides
US6057431A (en) Amidite derivatives and oligonucleotide derivatives
EP0312248B1 (en) Acridinium ester labelling and purification of nucleotide probes
JPH0665280A (ja) 蛍光標識化合物、その調製法および使用
US6033909A (en) Oligonucleotide analogs, their preparation and use
Beigelman et al. Synthesis and biological activities of a phosphorodithioate analog of 2′, 5′-oligoadenylate