JP3676388B2 - 非ヌクレオチド基を有する3′−誘導されたオリゴヌクレオチド類似体、その製法および使用 - Google Patents
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Description
本発明は物理学、生物学および薬理学上の有用な性質を有する新規オリゴヌクレオチド類似体およびその製造方法に関する。それらの適用は遺伝子発現の阻止剤(アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、センスオリゴヌクレオチドおよびトリプレックス形成オリゴヌクレオチド)として、核酸検出用プローブとしておよび分子生物学での補助剤としてのそれらの使用に関する。オリゴヌクレオチドは現在ますます、遺伝子発現阻止剤として使用されている(G. Zon, Pharmaceutical Research 5, 539 (1988); J. S. Cohen, Topics in Molecular and Structural Biology 12 (1989) Macmillan Press; C. Helene and J.J. Toulme, Biochimica et Biophysica Acta 1049, 99 (1990); E. Uhlmann and A. Peyman, Chemical Reviews 90, 543 (1990)参照)。アンチセンスオリゴヌクレオチドは核酸フラグメントであって、その塩基配列は、阻止されるべきmRNAに対して相補的である。これらの標的mRNAは細胞、ウイルスまたはその他の病原性由来からなることができる。適当な細胞標的配列は例えば受容体、酵素、免疫調整剤、イオンチャンネルまたは腫瘍遺伝子の配列である。アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いたウイルス複製の阻止は例えばRSV(Rous sarcomaウイルス)、HSV−1および−2(ヘルペスシンプレックスウイルス型IおよびII)、HIV(ヒト免疫不全ウイルス)およびインフルエンザウイルスについて記載されている。これに関してはウイルス性核酸に対して相補的であるオリゴヌクレオチドが用いられている。逆に、センスオリゴヌクレオチドの配列は該オリゴヌクレオチドが、核酸結合タンパク質または核酸プロセシング酵素を結合(“捕獲”)しそしてそれ故にそれらの生物活性を阻止するように設計されている(Helene, 1990)。ここで例として挙げることができるウイルス性標的は逆転写酵素、DNAポリメラーゼおよびトランスアクチベータタンパク質である。トリプレックス形成オリゴヌクレオチドは一般にそれらの標的としてDNAを有していて、該DNAに結合した後にトリプルヘリックス構造を形成する。一般にmRNAのプロセシング(切り継ぎ等)およびそのタンパク質への翻訳はアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて阻止されるが、トリプレックス形成オリゴヌクレオチドはDNAの転写または複製を阻止する(Helene et al., 1990, Uhlmann and Peyman, 1990)。しかしまた第1ハイブリッド形成においてアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて各一本鎖核酸を結合させて二本鎖にし、次いでそれを第2ハイブリッド形成においてトリプレックス形成オリゴヌクレオチドを用いてトリプレックス構造にすることも可能である。この場合には、アンチセンスおよびトリプレックス結合領域が2種の別個のオリゴヌクレオチド中にまたは1種のオリゴヌクレオチド中のいずれかに含有されうる。リボヌクレアーゼ活性によって標的RNAを分解する、いわゆるリボザイム(J.J. Rossi and N. Sarver, TIBTECH 8, 179 (1990))は合成オリゴヌクレオチドのさらに別の適用を示す。
【0002】
適当に標識された核酸フラグメントはDNA診断検査において、検出すべき核酸に対する特異的ハイブリッド形成のためのいわゆるDNAプローブとして用いられる。ここでは好ましくは放射性でない標識を用いて、新しい二本鎖の特異的形成が行われる。このようにして遺伝的ないし悪性疾患、およびウイルスまたはその他の病原体によって惹起される疾患を発見することができる。
【0003】
天然産の形態でのオリゴヌクレオチドは、多くの前記適用に関してほとんどまたは全く適していない。それらはその特異的要件に適するように化学的に修飾されなければならない。オリゴヌクレオチドが生物系で例えばウイルス複製阻止のために用いられることができるには、それらは下記の前提条件をみたさなければならない。
【0004】
1. それらはインビボ条件下で、すなわち血清中で並びに細胞内で十分に高度の安定性を有していなければならない。
2. それらは細胞膜および核膜を通過することができなければならない。
3. それらは阻止効果を発揮させるために生理学的条件下において塩基特異的手法で標的核酸に結合しなければならない。
【0005】
上記の前提条件はDNAプローブの場合には必須ではないが、しかしこれらのオリゴヌクレオチドは例えば蛍光、化学ルミネッセンス、比色定量法または特異的染色によって検出可能な手法で誘導されなければならない(Beck and Koester, Anal. Chem. 62, 2258 (1990))。
【0006】
オリゴヌクレオチドの化学変化(chemical alteration)は通常、ホスフェートバックボーン、リボース単位またはヌクレオチド塩基を適当な手法で変えることによって行われる(Cohen, 1989; Uhlmann and Peyman, 1990)。頻繁に用いられるさらに別の手法は、5′−ヒドロキシル基を適当なホスホリル化試薬と反応させることによるオリゴヌクレオチド5′−複合体の製造方法である。単に5′−末端で修飾されるオリゴヌクレオチドは、血清中で分解されるという点で不利である。他方、インターヌクレオチドホスフェート基の全てが変更される場合には、該オリゴヌクレオチドの性質が著しく変わることがよくある。例えば、メチルホスフェートオリゴヌクレオチドの水性媒体中における溶解度が減少し、それに伴ってそれらのハイブリッド形成能力も減少する。ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは非特異的作用を有し、そのために例えばホモオリゴマーはまたウイルスに対して活性でもある。
【0007】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは一般に単一極性を有し、通常それはRNAへのハイブリッド形成中にアンチパラレル性を示す(表1;A参照)。ある場合例えばα−ヌクレオシド単位から成るオリゴヌクレオチドでは、極性がパラレルであることも可能である(表1;B)。一般には配列によるが、トリプレックス形成オリゴヌクレオチドはプリンに富んだ核酸の鎖に関してパラレル(表1;C)またはアンチパラレル配向で、二本鎖核酸に対してハイブリッド形成が可能である。このためには塩基対合モティーフT・AT、G・GC、C+・GC、G・TA、CMe・GC、A・ATおよびCPi・GCが主として用いられる。ここでC+はプロトン化されたシトシン残基であり、CMeは5−メチルシトシン残基であり、CPiはプソイドイソシトシン残基でありそして“・”はフーグスティーン(Hoogsteen)型または逆フーグスティーン(reverse-Hoogsteen)型塩基対合である。しかし、これらのフーグスティーン型塩基対合の使用は二本鎖核酸のプリンに富んだ領域に限られている。
【0008】
プリンに富んだ標的配列に関するトリプレックス形成オリゴヌクレオチドの可変性を増大させるために、可変極性を有するオリゴヌクレオチドが製造された。該オリゴヌクレオチドは(5′5′)−鎖の変化(表1;E)または(3′3′)−鎖の変化(これらの変化は場合により互い違いであることができる(表1;F))のために、各場合において反対の鎖のプリンに富んだ領域を結合させることができる(Ono et al., Biochemistry (1991) 30, 9914)。(3′5′)−スペーサーが組み込まれる場合には極性保持下での鎖の変化が可能である。
【0009】
さらに、(5′5′)−ループ(表1;G)または(3′5′)−もしくは(2′5′)−ループを用いると特殊アンチセンスオリゴヌクレオチドを製造することが可能であり、そこでは1つの領域がワトソン−クリック(Watson-Crick)型塩基対合によって核酸の一本鎖を認識しそして第2領域がフーグスティーン型塩基対合によって、ワトソン−クリック型塩基対合から生ずる核酸の二本鎖を認識する。従って、このようなアンチセンス/トリプレックスオリゴヌクレオチド類似体を用いると一本鎖核酸上でのトリプレックス形成が可能である。同様にして、DNA結合タンパク質を配列特異的手法で結合させる二本鎖センスオリゴヌクレオチドが分子内ワトソン−クリック型塩基対合により製造されうる(表1;I)。
【0010】
最後に、5′−末端に5′5′−スペーサーを含有するオリゴヌクレオチドが製造されうる。これらのオリゴヌクレオチド類似体中において、両方の3′(2′)−末端は有利なことにホスホリル基を含有することができる。
【0011】
【表1】
【0012】
【表2】
【0013】
今まで知られておりかつ表1のC〜Iに示された操作原則に従うオリゴヌクレオチド類似体は一般に3′−末端にヒドロキシル基を有し、そのためにそれらは血清中で分解され、大部分は膜を容易に通過せず、単に5′−末端で容易に誘導されるだけである。
【0014】
従って、本発明の目的は一本鎖および二本鎖の核酸に対する特異的ハイブリッド形成性質、増大された血清安定性、良好な溶解性および比活性を有するオリゴヌクレオチド類似体を製造することである。
【0015】
本発明は下記の式IAおよび式IB
【化7】
【0016】
【化8】
で表されるオリゴヌクレオチド類似体およびその生理学的に許容しうる塩に関する。
【0017】
上記式中、
R1は水素、C1〜C18−アルキル、好ましくはC1〜C6−アルキル、C2〜C18−アルケニル、C2〜C18−アルキニル、C2〜C18−アルキルカルボニル、C3〜C19−アルケニルカルボニル、C3〜C19−アルキニルカルボニル、C6〜C20−アリール、(C6〜C14)−アリール−(C1〜C8)−アルキルまたは式II
【化9】
で表される基であり;
R2は水素、ヒドロキシル、C1〜C18−アルコキシ、ハロゲン、アジドまたはNH2であり;
【0018】
Bはヌクレオチド化学における慣用の塩基例えば天然塩基例えばアデニン、シトシン、グアニンおよびチミンまたは非天然塩基例えばプリン、2,6−ジアミノプリン、7−デアザアデニン、7−デアザグアニン、N4N4−エタノシトシン、N6N6−エタノ−2,6−ジアミノプリン、5−メチルシトシン、プソイドイソシトシンであり;
aはオキシまたはメチレンであり;
d、e、fは互いに独立していて、0〜50好ましくは5〜15の整数であり;
iは1〜10好ましくは1〜3の整数であり;
rは0または1の整数であり(但しrが0である場合にはVはY′でありそしてiが1より大きい場合にはrは1である);
Wはオキソ、セレンオキソまたはチオキソであり;
Vはオキシ、チオまたはイミノであり;
Yはオキシ、チオ、イミノまたはメチレンであり;
Y′はオキシ、チオ、イミノ、(CH2)mまたはV(CH2)mであり、ここでmは1〜18好ましくは1〜6の整数であり;
【0019】
Xはヒドロキシルまたはメルカプトであり;
Uはヒドロキシル、メルカプト、SeH、C1〜C18−アルコキシ好ましくはC1〜C6−アルコキシ、C1〜C18−アルキル好ましくはC1〜C6−アルキル、C6〜C20−アリール、(C6〜C14)−アリール−(C1〜C8)−アルキル、NHR3、NR3R4または式(OCH2CH2)pO(CH2)qCH2R11の基であり、ここで
R3はC1〜C18−アルキル好ましくはC1〜C8−アルキル、C6〜C20−アリール、(C6〜C14)−アリール−(C1〜C8)−アルキル、−(CH2)c−〔NH(CH2)c〕d−NR12R12(ここでcは2〜6の整数であり、dは0〜6の整数でありそしてそれぞれのR12は独立していて、水素、C1〜C6−アルキルまたはC1〜C4−アルコキシ−C1〜C6−アルキル好ましくはメトキシエチルである)であり、
【0020】
R4はC1〜C18−アルキル好ましくはC1〜C8−アルキル特に好ましくはC1〜C4−アルキル、C6〜C20−アリールまたは(C6〜C10)−アリール−(C1〜C8)−アルキルであり、またはNR3R4の場合にはR3およびそれらを担持している窒素原子と一緒になって5〜6−員の複素環式環を示し、該環はさらにO、S、Nから成る群より選択される別のヘテロ原子を含有することができ、
pは1〜100好ましくは3〜20特に好ましくは3〜8の整数であり、
qは0〜18好ましくは0〜15の整数であり,
R11は水素または官能基例えばヒドロキシル、アミノ、NHR13、COOH、CONH2、COOR12(ここでR12はC1〜C4−アルキル好ましくはメチルである)またはハロゲンであり;
【0021】
Sは式III
【化10】
で表される基であり、ここで
gおよびg′は0または1の整数であり、
hは0〜10の整数であり、
【0022】
GはC1〜C12−アルキレン特にC2〜C4−アルキレン(ここでアルキレンは場合によりハロゲン、アミノ、ヒドロキシル、C1〜C18−アルキル、C1〜C18−アルコキシ、C1〜C18−アルキルカルボニルオキシ、C6〜C14−アリール、C6〜C14−アリール−C1〜C18−アルキルまたはC6〜C14−アリール−C1〜C8−アルコキシにより置換されうる)、C6〜C14−アリール−ジ−C1〜C8−アルキレン、C6〜C18−アリーレン、式(CH2CH2V)αCH2CH2もしくは(CH2V)αCH2(ここでαは1〜11好ましくは1〜5の整数である)の基、式
【化11】
(ここでβは1〜6の整数である)の単位または式
【化12】
の基であり;
【0023】
Z=Z′はヒドロキシル、メルカプト、SeH、C1〜C22−アルコキシ好ましくはC6〜C18−アルコキシ、−O−(CH2)b−NR12R13(ここでbは1〜6の整数であり、そしてR13はC1〜C6−アルキルであるか、またはR12およびR13はそれらを担持している窒素原子と一緒になって3〜6員環を形成する)、C1〜C18−アルキル好ましくはC1〜C8−アルキル、C6〜C20−アリール、(C6〜C14)−アリール−(C1〜C8)−アルキル好ましくは(C6〜C10)−アリール−(C1〜C4)−アルキル、(C6〜C14)−アリール−(C1〜C8)−アルコキシ好ましくは(C6〜C10)−アリール−(C1〜C4)−アルコキシ(ここでアリールはヘテロアリールを包含し、アリールはカルボキシル、アミノ、ニトロ、C1〜C4−アルキルアミノ、ヒドロキシル、ハロゲンおよびシアノから成る群より選択される1、2または3個の同一または相異なる基によって場合により置換されている)、C1〜C18−アルキルメルカプト、NHR3、NR3R4、式IIIの基または分子内吸収を好むかまたはDNAプローブ用ラベルとして役立つかまたはオリゴヌクレオチド類似体の標的核酸へのハイブリッド形成中に該標的核酸を結合、架橋または分裂により攻撃する基であり;
【0024】
2′−および3′−位の曲線括弧はR2および隣接ホスホリル残基が3′−および2′−位で反対方向に位置することも可能であることを示しており、そして各ヌクレオチドはD−またはL−配置で存在することができ、塩基Bはα−またはβ−位にあることができる。
【0025】
好ましいのは式IAおよびIBにおいて、塩基Bがβ−位にあり、ヌクレオチドがD−配置で存在し、R2が2′−位にありそしてaがオキシであるオリゴヌクレオチド類似体である。
【0026】
特に好ましいのは式IAおよびIBにおいて、
R1が水素、C1〜C6−アルキル特にメチル、または式IIの基であり;
R2が水素またはヒドロキシル特に水素であり;
d、eおよびfが5〜15の整数であり;
iが1〜3の整数であり;
mが1〜6の整数特に1であり;
Uがヒドロキシル、メルカプト、C1〜C6−アルコキシ、C1〜C6−アルキル、NR3R4またはNHR3、特にヒドロキシルまたはC1〜C6−アルキルであり、ここで
R3がC1〜C8−アルキル好ましくはC1〜C4−アルキルまたはメトキシエチルでありそしてB、W、V、Y、Y′、XおよびZが前述の意味を有するオリゴヌクレオチド類似体である。
【0027】
式IAおよびIBにおいてV、Y′およびYがオキシの意味を有するオリゴヌクレオチド類似体が特に好ましい。さらに特に好ましいのは、式IAおよびIBにおいてV、Y、Y′およびWがオキシまたはオキソの意味を有するオリゴヌクレオチド類似体である。極めて特に好ましいのは式IAおよびIBにおいてV、Y、Y′、WおよびUがオキシ、オキソまたはヒドロキシルの意味を有するオリゴヌクレオチド類似体である。さらに、式IAおよびIBにおいてR1が水素であるオリゴヌクレオチド類似体も好ましい。特に好ましいのは式IAおよびIBにおいてU、V,W、X、Y′およびYがオキシ、オキソまたはヒドロキシルの意味を有しそしてR1が水素であるオリゴヌクレオチド類似体である。極めて特に好ましいのはrが0であり、VがY′と同じでありそしてR1が式IIの意味を有する式IAのオリゴヌクレオチドである。
【0028】
繰返し生ずる残基例えばR2、B、a、d、e、f、g、g′、h、W、V、Y、Y′、U、R3、R4、p、q、GおよびZは互いに独立していて、同一または相異なる意味を有する。すなわち、例えばそれぞれのVは互いに独立していて、オキシ、チオまたはイミノである。ハロゲンはフッ素、塩素または臭素であるのが好ましい。ヘテロアリールは環系に1個または2個のN原子および/または1個のSまたはO原子を含有する単環式または二環式(C3〜C9)−ヘテロ芳香族の基を意味するものと解される。
【0029】
細胞内吸収を促進させる基の例としては種々の脂肪親和性基例えば−O−(CH2)x−CH3(ここでxは6〜18の整数である)、−O−(CH2)n−CH=CH−(CH2)m−CH3(ここでnおよびmは互いに独立していて3〜12の整数である)、−O−(CH2CH2O)4−(CH2)9−CH3、−O−(CH2CH2O)8−(CH2)13−CH3および−O−(CH2CH2O)7−(CH2)15−CH3およびまたステロイド残基例えばコレステリル、天然担体系例えば胆汁酸、葉酸、2−(N−アルキル,N−アルコキシ)−アミノアントラキノンを利用する複合体および対応する受容体のペプチドとマンノースとの複合体がある。ここで該ペプチドは受容体仲介によってオリゴヌクレオチドのエンドサイト−シスを行い、その例としてはEGF(表皮成長因子)、ブラジキニンおよびPDGF(血小板由来成長因子)がある。標識基は例えばダンシル(=N−ジメチル−1−アミノナフチル−5−スルホニル)誘導体、フルオレセイン誘導体またはクマリン誘導体の蛍光基または例えばアクリジン誘導体の化学ルミネセンス基並びにELISAにより検出可能なジゴキシゲニン系、ビオチン/アビジン系により検出可能なビオチン基または検出可能レポーター基を用いてその後に誘導体を合成させる官能基含有リンカーアーム例えばアクリジニウム活性エステルと反応して化学ルミネセンスプローブを形成させるアミノアルキルリンカーを意味するものと解される。代表的な標識基は下記のとおりである。
【0030】
【化13】
【0031】
核酸に結合するか、または挿入および/または分裂または架橋を行うオリゴヌクレオチド類似体は例えばアクリジン、プソラレン、フェナンスリジン、ナフトキノン、ダウノマイシンまたはクロロエチルアミノアリール複合体を含有する。代表的な挿入ないし架橋を行う残基は下記のとおりである。
【0032】
【化14】
【0033】
【化15】
【0034】
モルホリニルおよびイミダゾリジニル基はNR3R4基の例として挙げることができる。ここでR3およびR4はそれらを担持している窒素原子と一緒になって5〜6員の複素環式環を形成し、それはさらに別のヘテロ原子を含有する。
【0035】
本発明はα−およびβ−D−またはL−リボフラノシド、α−およびβ−D−またはL−デオキシリボフラノシドおよび対応する炭素環式5員環類似体に限定されるのではなくて、その他の糖成分例えば環の拡張したおよび環の縮小した糖、非環状糖誘導体または別の型の適当な糖誘導体から成るオリゴヌクレオチド類似体についてもまた有効である。さらに本発明は例として式IAおよびIBに記載されているホスフェート基の誘導体に限定されるのではなくて、さらにまた知られているジホスホ誘導体にも関する。
【0036】
式IAのオリゴヌクレオチド類似体は1個以上の5′5′−スペーサー(5′5′S)および場合によりさらに1個以上の3′3′−スペーサー(3′3′S)または2′2′−スペーサーを有し、それぞれは極性の変化をもたらす。式IBのオリゴヌクレオチド類似体は3′5′−スペーサー(3′5′S)または(2′5′S)を有し、それは極性に影響を及ぼさないが、しかしオリゴヌクレオチド類似体の逆折りたたみ(backfolding)または鎖の変化を可能にする。
【0037】
Sの例としてはプロパン−1,3−ジオールホスフェート、2−ベンジル−および2−オクタデシル−オキシプロパン−1,3−ジオールホスフェート、トリエチレングリコールまたはヘキサエチレングリコールホスフェートがあり、それらは場合によりさらに反復されうる。複素環式塩基およびフェニレンジアルキレン基を有していないヌクレオチド類似体はS特に(3′3′S)のさらに別の好ましい態様である。位相数学的理由のために、一般的には(5′5′S)が(3′3′S)より長い。すなわち、(5′5′S)は多くて20〜45好ましくは24〜36個の非分枝状連鎖を有するが、一方(3′3′S)は単に5〜15好ましくは6〜10個の非分子状連鎖を有するだけであって、鎖の変化がなされるものと想定される。他方、例えば核酸の一本鎖上にトリプレックスを形成させるにはSを利用してオリゴヌクレオチド類似体を逆折りたたみ処理する。Sの長さは2〜8好ましくは4〜5個のヌクレオチド単位に相当するのが有利である。ここでは例としてペンタ(2−ベンジルオキシ−1,3−プロパンジオール)ヘキサホスフェートおよびヘキサ(プロパン−1,3−ジオール)ペンタホスフェートを挙げることができ、それぞれは(5′5′S)または(3′5′S)連鎖をもたらすことができる。
【0038】
生物学的オリゴヌクレオチドの合成に関して、式IAおよびIBのオリゴヌクレオチド類似体の製造は、場合により自動合成装置を用いて溶液中または好ましくは固相で実施される。
【0039】
3′−末端にホスフェートまたはホスフェートエステル基を有するオリゴヌクレオチドの固相合成は、カルテルス(M.D. Matteucci and M.H. Caruthers, J. Am. Chem. Soc. 103, 3185 (1981))の標準的なホスホルアミダイト化学によっては可能ではない。その理由は第1ヌクレオチド単位が3′−ヒドロキシル基を介して固形支持体に結合され、そのために該合成からは3′−ヒドロキシル基を有するオリゴヌクレオチドが常に生成するからである。固形法に基づく種々の手法が今までに記載されているが、しかしそれらの手法は全て面倒であって、例えばホスフェートエステルまたはアルキルホスホネートのような誘導体を製造するのに用いることができない場合が多い(R. Eritja et al., Tetrahedron Lett. 32, 1511 (1991); P. Kumar et al., Tetrahedron Lett. 32, 967 (1991);W.T. Markiewicz and T.K. Wyrzykiewicz, Phosphorus, Sulfur and Silicon 51/52, 374 (1990); E. Felder et al., Tetrahedron Lett. 25, 3967 (1984); R. Lohrmann and J. Ruth, DNA 3, 122 (1984))。
【0040】
本発明は式IAおよびIBのオリゴヌクレオチド類似体の製造方法に関する。それは
a) 第1反応サイクルにおいて3′(2′)−末端リン(V)基および遊離5′−ヒドロキシルまたはメルカプト基を有するヌクレオチド単位を、3′(2′)位にリン(III)またはリン(V)基またはその活性誘導体を有するさらに別のヌクレオチド単位と反応させるか、またはスペーサー基の導入を可能にする試薬と反応させ、次のサイクルにおいて3′(2′)−または5′−末端リン(III)またはリン(V)基またはその活性誘導体を有するヌクレオチド単位を、5′−または3′(2′)−末端遊離ヒドロキシルまたはメルカプト基を有するさらに別のヌクレオチド単位と反応させるか、または
b) 同様の手法で各フラグメントを用いてオリゴヌクレオチド類似体を構成し、
そして上記(a)または(b)によって得られたオリゴヌクレオチド中に他の官能基保護のために一時的に導入された保護基を除去し、こうして得られた式IAおよびIBのオリゴヌクレオチド類似体を、適切な場合にはその生理学的に許容しうる塩に変換することからなる。
【0041】
固相合成での出発成分としては式IV
D−X′−CH2CH2−S(O)x−CH2CH2−A−T (IV)
で表される固形支持体が用いられる。上記式中、Aはリンカーアームであって、それは例えばジカルボン酸、ジオール、アルキルアミン、ジカルボン酸モノアルキルアミド、酸アミドまたは式
−O−P(=O)(OR)O−
(ここでRは水素であるか、または場合により−CNによって置換されているC1〜C6−アルキル好ましくはメチルまたは2−シアノエチルである)を有するホスフェートの残基であり、Tは固体支持体であって、例えばCPG(controlled pore glass)、シリカゲルまたは有機樹脂例えばポリスチレン(PS)またはPSとポリエチレングリコール(POE)とのグラフトコポリマーのような物質から成り、側鎖が官能基例えばヒドロキシル、アミノ、ハロゲンまたはCOOHによって修飾されており、DはリンカーアームAおよびX′−CH2CH2−S(O)x−CH2CH2−基(ここでxは0、1または2でありそしてX′はオキシまたはチオである)を分解せずに除去されうる保護基(Bioorg, Chem. 14 (1986) 274〜325参照)例えば4−メトキシテトラヒドロピラニルおよびジメトキシトリチル好ましくはジメトキシトリチルである。
【0042】
固形支持体Tを化学結合(アミド、とりわけエステル)により硫黄含有基に結合させるリンカーアームA(Damka et al., Nucleic Acids Res. 18, 3813 (1990)参照)はコハク酸残基(O−C(O)−CH2CH2−C(O)−)、シュウ酸残基(O−C(O)−C(O)−)、アルキルアミン好ましくはLCAA(長鎖アルキルアミン)またはポリエチレングリコールが好ましい。コハク酸残基が特に好ましい。特別な場合には、例えばアンモニアによる長い処理に耐えない置換基との組合せではより不安定なリンカー例えばオキサリルリンカーが有利である。式IVa-cの固形支持体の製造は実施例1に記載されている。
【0043】
【表3】
【0044】
固相合成はホスフェートトリエステル法、H−ホスホネート法またはホスホルアミダイト法好ましくはホスホルアミダイト法によって実施することができる(E. Sonveaux, Bioorg. Chem. 14, 274 (1986)参照)。保護基Dは常にまず最初にメチレンクロリド中の酸例えばトリフルオロ酢酸によって式IVの支持体から除去される。ホスホルアミダイト法の場合には、こうして得られた式IV′
HX′−CH2−CH2−S(O)x−CH2CH2−A−T (IV′)
(式中、x、X′、AおよびTは前述の意味を有する)の支持体を弱酸例えばテトラゾールの存在下において式V
【化16】
(式中、
B′はBであって、Bに存在するいずれものNH2基は保護されることが可能であり;
Rは穏和な条件下で除去されうる保護基例えば4−メトキシテトラヒドロピラニルまたはジメトキシトリチルであり;
R2は水素、アルコキシ、ハロゲンまたは保護されたヒドロキシルもしくはアミノ基でありそして
R5およびR6は互いに独立してC1〜C12−アルキルであるか、または両残基が一緒になって5〜6員環を形成し;
Y″はオキシ、チオまたは(CH2)mでありそして
a、m、VおよびZは前述の意味を有する)のヌクレオシドホスホルアミダイトと縮合させる。
【0045】
引続き、こうして得られた支持体をそれ自体知られた手法でヨウ素水(W=O)またはTETD(テトラエチルチウラムジスルフィド)または元素状硫黄(W=S)またはセレン(W=Se)を用いて酸化して式VII
【化17】
(式中、R、V、B′、R2′、Z、X′、W、Y″、AおよびTは前述の意味を有する)の誘導された支持体にする。式VIIa
【化18】
の支持体を製造するのが好ましい。
【0046】
式Vのホスホルアミダイトは例えば、式VI
【化19】
(式中、R7およびR8はR5およびR6に等しく、a、R、V、B′、R2′、Y″、R5およびR6は前述の意味を有する)のビスアミダイトから、Zがアルコキシまたはアルキルメルカプトである場合には、テトラゾール触媒作用を利用して対応するアルコールまたはチオアルコールとの反応(実施例2、方法A)により得ることができる(J.E. Marugg et al., Tetrahedron Lett. 127, 2271 (1986)参照)。好ましいビスアミダイトは式VIa
【化20】
で表されるものである。
【0047】
このようにして例えば下記の式VIIIa-mのアミダイトが製造された。
【化21】
〔式中、
R5およびR6は前述の意味を有し、Zは下記a)〜m)
a) O−CH2CH3、
b) O−i−C3H7、
c) O−n−C6H13、
d) O−n−C18H37、
【0048】
【化22】
g〜k) 式IIIの残基であって、その際
g)の場合はp=3およびq=0、
h)の場合はp=4およびq=9、
i)の場合はp=5およびq=4そして
k)の場合はp=8およびq=13、
l) CH3
【化23】
の意味を有しそして
B′はa)、c)およびd)の場合にはCyti-Buであり、
b)およびl)の場合にはThyでありそして
e)〜k)およびm)の場合にはCytBzである〕。
【0049】
支持体を取り込ませるための別法は式IX
【化24】
〔式中、R9およびR10は互いに独立していて、Cl、NR5R6、NR7R8、Z″またはU′であり、U′はC1〜C4−アルキルまたは保護基として存在するヒドロキシル基であり、R5、R6、R7およびR8は前述の意味を有し、Z″=Zであるが、但しヒドロキシル、メルカプトおよびSeHは保護された誘導体例えばY″−G′−X′−DMTr(ここでDMTrはジメトキシトリチルであり、X′−Y′′′=オキシまたはチオでありそしてG′は(CH2CH2O)αCH2CH2またはCH2CH(OR′)CH2であって、ここでのR′はC1〜C18−アルキル、C6〜C14−アリールまたはC6〜C14−アリール−C1〜C8−アルキルでありそしてαは1〜11の整数である)としてまたはO−CH2CH2−CN、O−CH3、S−CH2CH2CN、O−CH2CH2S−CH2CH2−O−Dまたは
【0050】
【化25】
として存在しなければならない〕のホスフィチル化試薬を式X
【化26】
(式中、V、B′、R2′およびRは前述の意味を有しそしてY′′′はオキシまたはチオである)で表される遊離3′(2′)−基を有するヌクレオシドと反応させ、次いで得られた化合物を縮合剤例えばテトラゾール(R9、R10=NR5R6またはNR7R8の場合)またはジイソプロピルアミン(R9、R10=Clの場合)の存在下で式IV′の支持体上に縮合させることからなる。その後ヨウ素水または硫黄またはセレンで酸化すると式VIIaの化合物になる。ここで保護基Rを除去することができそしてオリゴヌクレオチド合成が知られた手法で続けられる。合成の終りには各保護基が、得られた支持体結合のオリゴヌクレオチド類似体から知られた手法で除去され、次いで本発明による式IAまたはIBのオリゴヌクレオチド類似体が支持体から分裂される。
【0051】
合成が最終サイクルにおいて式Vの単位を用いて終結された場合には、5′−ヒドロキシル基および3′(2′)−末端にリン含有共役を有する式IAまたはIB(R1=H)のオリゴヌクレオチド類似体が得られる。他方、例えば式IX(ここでR9=Z″)で表されるホスホリル化試薬が最後の縮合工程で用いられる場合には、3′(2′)−および5′−末端の両方においてリン含有置換分を有する、R1=式IIである式IAまたはIBのオリゴヌクレオチド類似体が該合成から得られる。
【0052】
例えば、3′(2′)−末端ホスホルアミデート基を有するオリゴヌクレオチドの製造は、酸化がJaeger et al., Biochemistry 27, 7237 (1988)に記載のようにヨウ素/H2NR3またはHNR3R4(ここでR3およびR4は前述の意味を有する)を用いて遂行される場合には、テトラゾールの存在下において式IV′の支持体をモノマーのメトキシホスホルアミダイトと反応させることによって可能である。
【0053】
ある場合(Z=NHR3、NR3R4、O、SまたはSe)には、基Zの導入もまたH−ホスホネート法によって遂行される。そこでは式XI
【化27】
(式中、R、V、a、B′、Y′、X′およびWは前述の意味を有する)のヌクレオシドホスフェートを式IV′の支持体と反応させることによって最初に生成される式VII′
【化28】
のH−ホスホネートジエステルを酸化的ホスホルアミド化に付す(B. Froehler, Tetrahedron Lett. 27, 5575 (1986)参照)。こうして3′−末端コレステリル基を有するオリゴヌクレオチドが例えば、四塩化炭素の存在下においてコレステリルオキシカルボニルアミノアルキルアミンを用いて製造されうる。
【0054】
また、式IAおよびIBのオリゴヌクレオチド類似体の製造はトリエステル法を用いても可能であり、そこでは式IV′を有する支持体の基HX′が縮合剤例えばアリールスルホニルクロリドおよび求核触媒例えばテトラゾールの存在下で式XII
【化29】
(式中、R、V、a、B′、R2′、Y′、Z、W、X′および曲線状括弧は前述の意味を有する)の保護されたホスフェートジエステルと反応する。3′5′(2′5′)方向に成長するオリゴヌクレオチド鎖の極性を逆転させる一つの可能性は、該成長鎖の遊離5′−ヒドロキシルまたは5′−チオール基を式XIIIの単位例えば式XIIIaまたはXIIIb
【化30】
(XIIIa):U′=OCH2CH2CN、B″=B′
(XIIIb):U′=CH3、B″=H
の3′−O−DMTr−ヌクレオシド 5′−ホスホルアミダイトと反応させることによる。
【0055】
酸化が引続きヨウ素水または硫黄を用いて遂行される場合には、(5′5′S)はそれぞれホスフェート(PO4 -)またはホスホロチオエート(PO3S-)基の意味を有する。3′(2′)−末端で保護基を除去した後に、オリゴヌクレオチド鎖は必要により、式XIII
【化31】
〔式中、U′はUの意味を有するが、但しU′はNHR3またはNR3R4ではなく、ヒドロキシル、メルカプトおよびSeHは保護された誘導体(例えば前記誘導体、Z″を参照されたい)として存在しそしてR5、R6、Y′′′、V、R、a、R2′およびB′は前述の意味を有する〕の単位との連続結合によって5′3′−方向に拡大されうる。単位XIIIの合成は例えばSeliger et al. (Nucleosides, Nucleotides 10 (1991), 469)に記載のようにして遂行される。それ以上の反転が遂行されない場合には、式IA(ここでrは0である)のオリゴヌクレオチド類似体が得られる。
【0056】
極性は変化していないが、それにもかかわらず(3′5′S)が鎖の逆折りたたみを促進する式IBのオリゴヌクレオチド類似体を製造するには、オリゴヌクレオチド鎖の合成が、2官能価のために多数回、縮合されることも可能な下記式XIVの単位を用いて必要な個所で延長される。
【0057】
【化32】
【0058】
【表4】
【0059】
例えば、(3′5′S)−ループは式XIVbの単位との反復好ましくは4〜5回の連続結合によって導入されうる。次いで該合成は前記のように3′5′−方向で継続される。
【0060】
二本鎖の核酸好ましくはDNAに対するオリゴヌクレオチド類似体のハイブリッド形成に関連して一本鎖の変化が求められる場合には、5′5′−スペーサーはより大きな長さでなければならない。例えば、トリエチレングルコールジホスフェートは鎖上の所望位置に混入されることができ、それは式XIVaの単位との2回反復結合によって3′5′−方向に1回以上好ましくは2回集められている。極性を変えるためには、該合成を式XIIIのヌクレオチド単位を用いて5′3′方向に引続き継続させる。再生された、極性の逆転が必要とされる場合には、3′3′−スペーサーが意図する個所に導入され、引続き3′5′−方向での鎖の合成がヌクレオシド3′−ホスホルアミダイトによる縮合によって継続される。3′3′−スペーサーの1つの例はプロパン−1,3−ジオールジホスフェート基の導入であって、該基は式XIVdの単位との結合によって導入されうる。
【0061】
オリゴヌクレオチド合成がスルフィド(x=0)またはスルフィニル(x=1)支持体を用いて遂行される場合には、これらの基は終りにそれ自体知られている手法で〔Funakoshi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 88 (1991), 6982〕酸化されてスルホニル基になり、塩基好ましくはアンモニアで容易に分解されうる。
【0062】
塩基B′のアミノ保護基の性質およびリンカーアームAの構成はそれぞれの場合、置換基Zの性質による。その理由は該置換基Zは合成が一旦完了したら、容易に除去可能でなければならないからである。例えば、オリゴヌクレオチド3′−ホスフェートイソプロピルエステル(Z=O−i−C3H7)を製造するには、B=AdeおよびCytの場合にはベンゾイル(Bz)保護基を使用することができそしてB=Guaの場合にはイソブチリル(i−Bu)保護基を使用することができる。他方、オリゴヌクレオチド3′−メチルホスホネートエステル(Z=CH3)またはエチルエステル(Z=O−C2H5)を合成するには、B=AdeおよびGuaの場合およびB=Cytの場合のそれぞれについて比較的不安定なフェノキシアセチル(PAC)およびイソブチリル保護基が使用される。
【0063】
多くの複合体はさらに別の官能基を有するが、それらは式VおよびXIIIのモノマー単位中への混入前に適当な手法で保護されなければならない。例えば、フルロレセインのカルボキシル基はアルキルエステルとして保護されなければならない。プソラレンでは、アミド基がN−Fmoc(フルオレニルメトキシカルボニル)−保護された化合物として存在しうる。ヒドロキシル基はアシル化またはシリル化(t−ブチルジメチルシリル)によって副反応から保護されうる。またアミノ基はトリフルオロアセチル保護された形態で存在しうる。異例な場合だが、複合体が極めて不安定であるためにオリゴヌクレオチド合成中の保護基除去の条件下で分解してしまうこともある。このような場合には1つの官能基を有するリンカーアーム例えばZ=HN−(CH2)x−NH−Fmoc(ここでxは2〜12好ましくは4〜6の整数である)を1つだけ式Vのモノマー中に混入させるのが好都合である。オリゴヌクレオチド中へ混入しそして好ましくはアンモニアで保護基を除去した後に、遊離アミノ基は活性エステルに結合されうる。該手法で例えば、塩基不安定性アクリジニウムエステルが製造された。
【0064】
合成されたオリゴヌクレオチド誘導体の特性化は電気噴霧イオン化質量分光測定(electro-spray ionization mass spectrometry)によってなされる(Stults and Masters, Rapid Commun. Mass. Spectr. 5 (1991) 350参照)。
【0065】
本発明による式IAおよびIBのオリゴヌクレオチド類似体は血清中での安定性および知られているエキソヌクレアーゼに対する安定性について試験した。
意外なことに、本発明により未修飾オリゴヌクレオチドと比較して式IAおよびIBのオリゴヌクレオチド類似体は全て、それらのハイブリッド形成作用が僅かだけ影響されるけれども、血清ヌクレアーゼに対して顕著に増大された安定性を有するということが見出された。
【0066】
未修飾オリゴヌクレオチドは胎児牛血清中、約2時間の半減期を有するが、式IAおよびIBのオリゴヌクレオチド類似体の全ては約16時間十分に安定である。さらに、式Iのオリゴヌクレオチド類似体はヘビ毒液ホスホジエステラーゼに対して安定である。未修飾オリゴヌクレオチドはヘビ毒液ホスホジエステラーゼによって3′−末端からおよび脾臓ホスホジエステラーゼによって5′−末端からエキソヌクレオ分解的に(exonucleolytically)分解される。
【0067】
相補的一本鎖ヌクレオチド配列で、式IAおよびIBのオリゴヌクレオチド類似体はワトソン−クリック型塩基対によって安定な二本鎖ハイブリッドを形成しそしてワトソン−クリック型およびフーグスティーン型塩基対によって安定なトリプレックス構造を形成するが、一方それらはフーグスティーン塩基対によって二本鎖核酸を有する三重らせんを形成し、その場合にはスペーサー(5′5′S)および(3′3′S)が鎖の変化を可能にしている。このようにして、本発明のオリゴヌクレオチド類似体を用いると核酸の生物学的機能の調節または抑圧例えば細胞遺伝子並びに腫瘍遺伝子またはウイルス性ゲノム機能の発現の抑圧が可能である。従って、式IAおよびIBのオリゴヌクレオチド類似体はウイルス感染症または癌の治療または予防に用いることができる。
【0068】
本発明によるオリゴヌクレオチドの活性をHSV−1ウイルス複製の阻止に基づいて調べた。
【0069】
【化33】
【0070】
【化34】
【0071】
自然配列すなわち3′−誘導化および5′5′−スペーサーを有してしない配列形態では、選択配列Iは血清中で迅速に分解し易いために細胞培養中においてHSV−1に対して不活性である。他方、式IAの3′−誘導されたオリゴヌクレオチド類似体例えば配列IA−2(実施例4b)はHSV−1複製を阻止する。該配列Iは原則を説明するために任意の1つの例を示しているにすぎない。該配列IはHSV−1のトランスアクチベータ(transactivator)タンパク質Vmw65のmRNAに対して割り当てられる。配列IIおよびIIIはHSV−1のIE 4/5プレカーサーmRNA(IE=immediate early;即時型)のスプライス−アクセプター領域に対して割り当てられそしてまたHSV−1複製を特異的に阻止する。配列IVで表される、両3′−末端がプソラレンで修飾された式IA−4のオリゴヌクレオチド(実施例4e)は、HSV−1のゲノムの複製の由来(oriL)を認識し、それの複製をトリプレックス形成によって阻止する。プソラレン複合体の抗ウイルス活性はUV線での照射によって有意に増大されうる。HSV−1ゲノムは160,000の塩基を有していて、当然、ウイルス複製阻止のために種々の効力を有する無数の選択可能な標的配列を提供する。該ヌクレオチド配列を変えることによって、いずれかその他のウイルス、バクテリアまたは他の病原体に対して治療原則が適用されうる。他の病原体に適用させるための唯一の先行必要要件は、これらの病原体の生活環に必須である遺伝子が知られていることである。該遺伝子の配列は極めて多様にわたり、いわゆる遺伝子データベースに寄託されている。また、その機能が抑圧されるべきである腫瘍遺伝子および他の細胞遺伝子の場合にも同様のことが云える。その他の細胞遺伝子の例としては酵素、受容体、イオンチャンネル、免疫調整剤、成長因子およびその他の調節タンパク質をコード化する遺伝子を挙げることができる。配列Vは例えば、アルツハイマー病における斑形成アミロイドタンパク質の前駆体タンパク質の発現に原因すると考えられているAPP770遺伝子プロモータに対して割り当てられる。センスオリゴヌクレオチドとして、配列VIはアデノウイルスE1bのSP1結合領域を擬似しそして、式IB−2で表される3′5′−スペーサー含有の3′−修飾オリゴヌクレオチド類似体がE1bの転写を阻止する。腫瘍遺伝子の例としてはabl、neu、myc、myb、ras、fos、mos、erbB、ets、jun、p53,srcおよびrelがある。
【0072】
文献で知られている、3′−ヒドロキシル基を有するオリゴヌクレオチド誘導体と比較すると、式IAおよびIBのオリゴヌクレオチド類似体からなる、核酸特にDNA用プローブは一方ではヌクレアーゼ安定性が増大されるという利点を有し、他方ではオリゴヌクレオチドの両末端で同一または相異なるマーカーを受容することが可能である。相異なるマーカー基が1つのオリゴヌクレオチド内で選択的に活性化されうることは(二重標識)有利である。また2官能性誘導化を用いて一方の末端に1つの標識をそして他方の末端に別の官能(例えばアフィニティー標識)を導入することもできる。このためには例えば、アビジンまたはストレプトアビジンを認識するビオチンをオリゴヌクレオチドの一方の3′−末端に混入させ、一方アクリジニウムエステル化学ルミネセンス標識をアルキルアミノリンカーを介して他方の3′−末端に結合させることができる。
【0073】
さらに、本発明によるオリゴヌクレオチド類似体の浸透作用は多くの場合、特に脂肪親和性基が導入される際には未修飾オリゴヌクレオチドの場合よりも有利である。本発明による式IAおよびIBのオリゴヌクレオチド類似体の増大した血清安定性、それらの改善された細胞浸透性、それらの改善された結合アフィニティー、修飾(アルキル化、架橋)によって標的配列を選択的に破壊することができるそれらの能力およびDNA診断検査でのそれらの改善された検出能力は、未修飾オリゴヌクレオチドと比較した場合により高い生物活性の形態で表される。
【0074】
本発明によるオリゴヌクレオチド類似体の前述した診断、予防および治療上の適用は代表例の単なる1つの選択であり、それ故に該類似体の使用はそれらに限定されるものではない。さらに、本発明のオリゴヌクレオチド類似体は例えばバイオテクノロジーおよび分子生物学の補助剤として用いてもよい。
【0075】
さらに本発明は式IAおよび/またはIBの化合物またはそれらの生理学的に許容しうる塩の1種以上の有効量を、適切な場合には生理学的に許容しうる補助剤および/または賦形剤および/またはその他の知られている活性物質を含有する製剤並びに、活性物質が賦形剤および可能な場合にはさらに別の補助剤、添加剤または活性物質と一緒になって適当な剤形に変換される該製剤の製造方法に関する。投与は静脈内、局所または鼻腔内投与が好ましい。
【0076】
【実施例】
実施例1:式IVの支持体の製造
a) アミノプロピル−CPGをビスヒドロキシエチルスルホンジメトキシトリチルエーテルのスクシネートと反応させることによる式IVaの支持体の製造
ビス−(2−ヒドロキシエチル)スルホンのジメトキシトリチル(DMTr)モノエーテル4.56g(10mmol)を2回にわたって無水ピリジン中に取り入れ次いで濃縮することによって乾燥し、無水ピリジン25ml中に溶解し、次にDMAP(ジメチルアミノピリジン)1.78g(14mmol)および無水コハク酸1.4g(14mmol)を加え、この混合物を室温で3時間撹拌する。反応の完了後に混合物を濃縮し、残留物を3回にわたってトルエン中に取り入れ次いで濃縮してピリジンを除去し、次にメチレンクロリド220ml中に取り入れる。有機相を10%クエン酸(110ml)で洗浄し次に3回水110mlで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し次いで濃縮する。得られた固形残留物を真空乾燥する(5.64g)。このスクシネート1.67g(3mmol)を2回にわたって無水ピリジン中に取り入れ次いで濃縮し、無水ピリジン0.65mlとテトラヒドロフラン(THF)6mlとの混合物中に溶解する。次に無水THF 2.1ml中に溶解したp−ニトロフェノール420mg(3mmol)およびDCC 687mg(ジシクロヘキシルカルボジイミド、3.3mmol)の溶液を加え、混合物を室温で2時間撹拌する。反応が完了したら、沈殿したジシクロヘキシル尿素を遠心分離により除去する。沈殿物を無水エーテル1ml中に懸濁し、再び遠心分離にかける。Fluka社製のアミノプロピル−CPG支持体(500Å、アミノ基のg当たり100μmol)1.5gを無水DMF 1.8mlとトリエチルアミン350μlとの混合物中に懸濁し、前記沈殿物から傾瀉させたニトロフェニルスクシネートエステルの合一溶液を加え、混合物を室温で16時間振とうする。固形支持体を完全に分離し、遮断試薬(無水酢酸/2,6−ルチジン/DMAP;それぞれTHF中で0.25M)3mlとともに室温で1時間振とうして反応性基を遮断する。誘導化されたCPG支持体を吸引濾去し、メタノール、THF、メチレンクロリドおよびエーテルで洗浄し次いで40℃で真空乾燥する。ジメトキシトリチル含有成分を有する式IVaの支持体のローディング(loading)は38μmol/gである。
【0077】
b) TentaGelR(R=Rapp社(Tuebingen)の登録商標)をビスヒドロキシエチルスルホンジメトキシトリチルエーテルのスクシネートと反応させることによる式IVbの支持体の製造
25μmol/gのアミノ基を有するPS/POEコポリマーであるアミノ型TentaGel樹脂100mgをDMF 360μlとトリエチルアミン70μlとの混合物中に懸濁し、p−ニトロフェニルスクシネートエステル(製造は実施例1a参照)400μmolを加え、混合物を室温で16時間振とうする。次いで実施例1a)に記載のように後処理する。ジメトキシトリチル含有成分を有する式IVbのTentaGel樹脂の取り込み(loading)は98μmol/gである。
【0078】
c) TentaGel(ヒドロキシ型)を式IX(Z″=DMTr-O-CH2CH2-S-CH2CH2-O-;R9=N(i-C3H7)2; R10=O-CH2CH2CN)のホスフィチル化試薬と反応させることによる支持体IVcの製造
TentaGel樹脂50mgをアセトニトリル中22℃においてテトラゾール25当量の存在下で式IX(Z″=DMTr-O-CH2CH2-S-CH2CH2-O; R9=N(i-C3H7)2; R10=O-CH2CH2CN)のホスフィチル化試薬10当量と反応させる。ヨウ素水(THF/水/ピリジン;70:20:5=v:v:v中のヨウ素1.3g)で酸化した後に、実施例1aに記載のようにして後処理を行う。ジメトキシトリチル含有成分を有する式IVcの支持体のローディングは247μmol/gである。
【0079】
実施例2:式VIIIで表される、保護されたヌクレオシド3′−ホスホルアミダイトの製造
a) VIIIa(B′=CytiBu、 Z=O-CH2CH3、R5=R6=i-C3H7)の製造
式VI(B′=CytiBu、 R5=R6=R7=R8=i-C3H7)で表されるヌクレオシド3′−ホスホロビスアミダイトを2回にわたって無水アセトニトリル20ml中に取り入れ次いで濃縮し、次に無水アセトニトリル20ml中に溶解する。無水アセトニトリル5ml中に溶解したエタノール2.4mmolおよび昇華されたテトラゾール1.2mmolの溶液を15分で滴加する。さらに2.5時間撹拌した後に、混合物をメチレンクロリド75mlで希釈し、有機相を5%炭酸水素ナトリウム溶液50mlで抽出する。水溶液をメチレンクロリド50mlで2回洗浄し、合一した有機相を硫酸ナトリウムで乾燥し次いで真空中で濃縮する。残留物をシリカゲル上でメチレンクロリド/n−ヘプタン/トリエチルアミン(45:45:10;v:v:v)を用いるカラムクロマトグラフィーにより精製する。目的のジアステレオマー物質0.7gが、薄層クロマトグラフィーによれば純粋である化合物(31P−NMR σ=146.7、147.5ppm)として得られる。痕跡量の対応するビス−エチルホスファイトが副生成物として単離される(31P−NMR σ=139.3ppm)。
【0080】
b) VIIIb(B′=Thy、 Z=O-i-C3H7、 R5=R6=i-C3H7)の製造
この製造は、無水メチレンクロリド10ml中でテトラゾール(0.5mmol)の存在下において式X(B′=Thy(β−位);R=DMTr、 V=O、a=O、 Y″=O; 2mmol)の5′−O−ジメトキシトリチルチミジンを式IX(Z″=O-i-C3H7、 R9=R10=N(i-C3H7)2;4mmol)のビスアミダイトでホスフィチル化することによって遂行される。混合物は実施例2aに記載のようにして後処理する(31P−NMR σ=145.04ppm、 145.66ppm)。
【0081】
c) VIIIc(B′=CytiBu、 Z=O-n-C6H13、 R5=R6=i-C3H7)の製造
実施例2aと類似の方法で式VIa(B′=CytiBu、 R5=R6=R7=R8=i-C3H7)のビスアミダイトから、テトラゾール触媒作用でn−ヘキサノール1当量と反応させることによって得られる(31P−NMR 148.1ppm、 148.5ppm)。
【0082】
d) VIIId(B′=CytiBu、 Z=O-n-C18H37、 R5=R6=i-C3H7)の製造
実施例2aと類似の方法で式VIa(B′=CytiBu、 R5=R6=R7=R8=i-C3H7)のビスアミダイトから、テトラゾール触媒作用でのn−オクタデカノール1当量との反応によって得られる(31P−NMR 147.2ppm、 147.9ppm)。
【0083】
e) VIIIe(B′=CytBz、 Z=3−ピリジルプロパン−3−オキシ、R5=R6=R7=R8=i-C3H7)の製造
実施例2aと類似の方法で式VIa(B′=CytBz、 R5=R6=R7=R8=i-C3H7、 R2′=H)のビスアミダイトから、テトラゾール触媒作用での3−ピリジン(プロパン−3−オール)1当量との反応によって得られる。この場合にはカラムクロマトグラフィーによりジアステレオマー2種を分離することが可能であった(31P−NMRジアステレオマー1:147.7ppm、 ジアステレオマー2:148.2ppm)。
【0084】
f) VIIIf(B′=CytBz、 Z=p−ニトロフェニルエチル−2−オキシ、R5=R6=i-C3H7)の製造
実施例2aと類似の方法で式VIa(B′=CytBz、 R5=R6=R7=R8=i-C3H7)のビスアミダイトから、テトラゾール触媒作用でのp−ニトロフェニルエタン−2−オール1当量との反応によって得られる(31P−NMR 148.1ppm、 148.6ppm)。
g) VIIIg(B′=CytBz、 Z=-(OCH2CH2)3OCH3、 R5=R6=i-C3H7)の製造
実施例2aと類似の方法で式VIa(B′=CytBz、 R5=R6=R7=R8=i-C3H7)のビスアミダイトから、テトラゾール触媒作用でのトリエチレングリコールモノメチルエーテル1当量との反応によって得られる(31P−NMR 148.5ppm、 148.9ppm)。
【0085】
h) VIIIh(B′=CytBz、 Z=-(OCH2CH2)4O(CH2)9CH3、 R5=R6=i-C3H7)の製造
実施例2aと類似の方法で式VIa(B′=CytBz、 R5=R6=R7=R8=i-C3H7)のビスアミダイトから、テトラゾール触媒作用でのテトラエチレングリコールモノデシルエーテル1当量との反応によって得られる(31P−NMR 148.4ppm、148.8ppm)。
【0086】
i) VIIIi(B′=CytBz、 Z=-(OCH2CH2)5O(CH2)4CH3、 R5=R6=i-C3H7)の製造
実施例2aと類似の方法で式VIa(B′=CytBz、 R5=R6=R7=R8=i-C3H7)のビスアミダイトから、テトラゾール触媒作用でのペンタエチレングリコールモノペンチルエーテル1当量との反応によって得られる(31P−NMR 148.4ppm、 148.9ppm)。
【0087】
k) VIIIk(B′=CytBz、 Z=-(OCH2CH2)8O(CH2)13CH3、 R5=R6=i-C3H7)の製造
実施例2aと類似の方法で式VIa(B′=CytBz、 R5=R6=R7=R8=i-C3H7)のビスアミダイトから、テトラゾール触媒作用でのオクタエチレングリコールモノテトラデシルエーテル1当量との反応によって得られる(31P−NMR 148.4ppm、148.8ppm)。
【0088】
l) VIIIp(B′=Thy、 Z=CH3、 R5=R6=i-C3H7)の製造
実施例2bと類似の方法で5′−O−ジメトキシトルチルチミジンから式IX(Z″=CH3、 R9=Cl、 R10=N(i-C3H7)2)の試薬ホスフィチル化で得られ、この場合にはテトラゾールの代りにジイソプロピルエチルアミン2当量を用いて触媒作用がもたらされる(31P−NMR 120.6ppm、 121.0ppm)。
【0089】
m) VIIIm(B′=CytBz、 Z=アクリジン−9−(ブチル−4−オキシ)−、R5=R6=i-C3H7)の製造
実施例2aと類似の方法で式VIa(B′=CytBz、 R5=R6=R7=R8=i-C3H7)のビスアミダイトから、テトラゾール触媒作用での9−(4−ヒドロキシブチル)アクリジン1当量との反応によって得られる(31P−NMR 146.7ppm、 147.4ppm)。
【0090】
実施例3:式VIIで表される支持体結合ヌクレオチドの製造
a) 方法A:式VIIIbのヌクレオシド3′−ホスホルアミダイトを結合させることによる式VIIa−1の支持体の製造
ビスヒドロキシエチルスルホンジメトキシトリチルエーテル0.2μmolを結合させた実施例1aからの支持体7.5mgを3%トリクロロ酢酸で処理してDMTr保護基を除去し、アセトニトリルで洗浄し、次いでアセトニトリル中でテトラゾール(10μmol)の存在下において式VIIIb(B′=Thy、 Z=O-i-C3H7、 R5=R6=i-C3H7)のヌクレオシド3′−ホスホルアミダイト2μmolと反応させる。反応時間は2.5分である。次にヨウ素(W=Oの場合;THF/水/ピリジン;70:20:5=v:v:v中におけるヨウ素1.3g)での酸化を行う。
【0091】
b) 方法B:式IXのホスフィチル化試薬を介した反応による式VIIIa−2の支持体の製造
式IX(Z″=n−オクチル、R9=R10=Cl;1当量)のホスフィチル化試薬を無水アセトニトリルまたはメチレンクロリド中でジイソプロピルエチルアミン(DIPEA)1.2当量の存在下において−78℃で式Xのヌクレオシド(5′−O−ジメトキシトリチルチミジン1当量、B″=β−位、Y′′′=O)と反応させて対応するヌクレオシド−3′−O−n−オクチルホスホンモノクロリドを得る。保護基D=DMTrを除去するために、式IVaの支持体を方法Aに記載のように処理し、アセトニトリルで洗浄し次にDIPEAの存在下において反応系中で製造されたヌクレオシド−3′−O−n−オクチルホスホンモノクロリドの過剰量と反応させる。ヨウ素水で酸化後に式VIIa−2で表される支持体結合ヌクレオチドが得られ、それはその後のオリゴヌクレオチド合成に利用されうる。
【0092】
実施例4:式IAおよびIBのオリゴヌクレオチド(モノマーはそれぞれの場合においてβ−D−デオキシリボヌクレオシドである)の製造
a) 式IA−1(R1=R2=H、 Z=O-i-C3H7、 a=U=V=W=X=Y=Y′=O、 B=Thy、 e=8、 f=r=0、 i=1)のオリゴヌクレオチドの製造
T(5′5′p)TpTpTpTpTpTpTpTpTp-(O-i-C3H7)
実施例3aから得られた支持体VIIa−1(B′=Thy、 W=O、 Z=O-i-C3H7)0.2μmolを下記の試薬で順次処理する。
1. 無水アセトニトリル、
2. ジクロロメタン中の3%トリクロロ酢酸、
3. 無水アセトニトリル、
4. 無水アセトニトリル0.15ml中におけるβ−シアノエチル5′−O−ジメトキシトリチルチミジン−3′−ホスファイト−ジイソプロピルアミダイト4μmolおよびテトラゾール25μmol、
5. アセトニトリル、
6. 40%ルチジンおよび10%ジメチルアミノピリジンを有するTHF中の20%無水酢酸、
7. アセトニトリル、
8. ヨウ素(THF/水/ピリジン;70:20:5=v:v:v中の1.3g)。
【0093】
以下、1反応サイクルと称する前記工程1〜8を7回繰り返してデカチミジレート誘導体を合成する。次の第9反応サイクルにおいては工程4での縮合のために5′−O−DMTr−ヌクレオシド3′−ホスホルアミダイトの代りに式XIIIa(B′=Thy)の逆3′−O−DMTr−ヌクレオシド5′−ホスホルアミダイトが用いられる。合成完了後に、ジメトキシトリチル基の除去を工程1〜3に記載のようにして行う。オリゴヌクレオチドを支持体から分裂し、同時にβ−シアノエチル基をアンモニアでの1.5時間の処理によって除去する。該オリゴヌクレオチドはアミノ保護基を含有していないので、アンモニアによるこれ以上の処理は全く必要ない。5′−末端に(5′5′)−インターヌクレオチド結合を含有するイソプロピルデカチミジレート3′−ホスフェートの得られた粗生成物をポリアクリルアミドゲル電気泳動またはHPLCにより精製する。
【0094】
b) 式IA−2(R2=H、 Z=O-i-C3H7、 a=U=V=W=X=Y=Y′=O;e=19、 f=r=0、 i=1;R1=式II、 ここでZ=p−ニトロフェニルエチル−2−オキシおよびZ′=OH)のオリゴヌクレオチドの製造
d(p−ニトロフェニルエチル−2−オキシ−pC(5′5′p)GpTpCpCpApTpGpTpCpGpGpCpApApApCpApGpCpTp-O-i-C3H7)
実施例4aと類似の方法で、モノマー中に種々のヌクレオシド塩基を用いて合成を行う。合成工程1〜8において、モノマーは一般にβ−シアノエチル5′−O−ジメトキシトリチル−ヌクレオシド−3′−ホスファイト−ジアルキルアミドとして用いられ、その際アデニン(Ade)、シトシン(Cyt)またはグアニン(Gua)のアミノ基は適当な保護基で保護されている。本実施例ではN6−ベンゾイル−Ade(AdeBz)、N4−ベンゾイル−Cyt(CytBz)およびN2−イソブチリル−Gua(GuaiBu)が用いられる。鎖の構築は実施例4aに記載のようにして、式VIIa−1(B′=Thy、 W=O、 Z=O-i-C3H7)の支持体から出発しそして前記配列に従って対応する各モノマー上で縮合することにより行われる。第20反応サイクルでは式XIIIa(B′=CytBz)のモノマーが縮合のために用いられる。3′−O−DMTr基を除去後に、遊離3′−ヒドロキシル基を式IX(R9=N(i-C3H7)2、 R10=Z″=p−ニトロフェニルエチル−2−オキシ)のビス−(p−ニトロフェニルエチル−2−オキシ)−ホスホロジイソプロピルアミドでホスフィチル化し、引続きヨウ素水で酸化する。しかし、各アミノ保護基および2つのp−ニトロフェニルエチル基のうちの1つを除去するために、さらにアンモニアによる処理(50℃で16時間)を行う。
【0095】
c) 式IB−1(R1=R2=H、 Z=n-C8H17、 a=U=V=W=X=Y=Y′=O、 i=1、 d=9、 e=16)のオリゴヌクレオチドの製造
【化35】
d(GpGpTpGpGpTpGpGpTpT(3′5′S)TpTpCpCpTpCpCpTpGpCpGpGpGpApApGpGp-n-C8H17
実施例3Bに記載のと類似の方法で製造される式VIIa−2(B′=GuaPAC、 W=O、Z=n-C8H17)の支持体から出発して、鎖の構築を実施例4bのようにして実施する。しかし、合成の終りに分裂するのがより容易である比較的不安定なアミノ保護基N6−フェノキシアセチル−Ade(AdePAC)、N4−イソブチリル−Cyt(CytiBu)、N2−フェノキシアセチル−Gua(GuaPAC)は、塩基不安定である置換分(ここではZ=n-C8H17の場合)を製造するのに使用するのが有利である。第16反応サイクル後に式XIVbの試薬を用いて5つのサイクルを実施して必要とされる(3′5′)−スペーサーを導入する。次に実施例4aに記載のようにして残りの10個のヌクレオチド単位を混入させる。濃アンモニアを用いて支持体からの分裂を行い(室温で1.5時間)、次にエチレンジアミン/エタノール/水(5:4:1;v:v:v)で6時間処理して塩基のアミノ基を遊離させる。
【0096】
d) 式IA−3(R1=式II、 R2=H、 Z=O-i-C3H7、 a=U=V=W=X=Y=Y′=Z′=O、 e=16、f=9、 i=1、 r=0)のオリゴヌクレオチドの製造
(5′5′S)=p〔(CH2CH2O)2CH2CH2p〕2
d(i-C3H7-O-pGGTGGTGGTT(5′5′S)TTCCTCCTGCGGGAAGGp-O-i-C3H7)
合成は最初は実施例4bに記載のようにして、支持体VIIa−3(B′=GuaiBu、W=O、 Z=O-i-C3H7)から出発して行う。第16反応サイクルの後に、式XIVaの試薬を用いて2つのサイクルを実施して5′5′−スペーサーを導入する。その後の10個のサイクル中に、縮合のために式XIIIaのモノマー部分を用いる。添加すべき最後のGヌクレオチドの3′−O−DMTr保護基を除去した後に、遊離3′−ヒドロキシル基を式IX(R9=N(i-C3H7)2、 R10=OCH2CH2CN、 Z″=O-i-C3H7)のシアノエチルオキシ−i−プロピルオキシホスホルアミダイトでホスフィチル化し次にヨウ素水で酸化する。
【0097】
e) 式IA−4(R2=H、 Z=“プソラレン”、 a=U−V=W=X=Y=Y′=O、 e=13、 f=15、 i=1、 r=0、 R1=式II、 ここでZ′=O)のオリゴヌクレオチドの製造
d(3′−“プソラレン−pGpGpTpGpTpTpTpGpGpGpGpGpTpTpGpG(5′5′S)GpTpTpGpGpGpGpT2pTpGpTpGpTpGp−“プソラレン”)
(5′5′S)=p3′(G)5′-pMe-(CH2)3-pMe-5′(G)3′p
【化36】
合成は実施例4cに記載のようにして、式IIa−4(B′=GuaPAC、 Z=“プソラレン”、W=O)の支持体から出発して行う。該支持体はあらかじめ実施例2aと類似の方法でビスアミダイトVIa−3(B′=GuaPAC、 R5=R8=i-C3H7)から“プソラレン”−Hとの反応によって得た式VIII(B′=GuaPAC、 Z=“プソラレン”、R5=R6=i-C3H7)のモノマーから、実施例3aと類似の方法で製造された(U. Pieles and U. Englich, Nucleic Acids Research (1989) 17, 285参照)。第13反応サイクルの後に、第14サイクルでは結合用に式XVのモノマーを用い、第15サイクルでは式XIVcのモノマーをそして第16サイクルでは式XIIIbのモノマーを用いる。次の16個のサイクルでは式XIIIaの単位を縮合用に再び用いる。3′−O−DMTr基を除去した後に、遊離3′−ヒドロキシル基を式IX(R9=N(i-C3H7)2、 R10=OCH2CH2CN、 Z″=“プソラレン”)のプソラレンホスホルアミダイトでホスフィチル化し次いでヨウ素水で酸化する。保護基をアンモニアで除去した後に、式IA−4のオリゴヌクレオチドが得られる。
【0098】
f) 式IA−5(R1=R2=H、 Z=n-C8H17、 a=U=V=W=Y=Y′=O、 d=12、 e=f=7、 i=r=1)のオリゴヌクレオチドの製造
d(TpTpGpTpGpTpTpTpGpTpGpTpT(3′3′S)TpGpTpTpTpTpGpG(5′5′S)GpGpTpGpGpGpGpGp-n-C8H17)
(3′3′S)=p(CH2CH2CH2)p (5′5′S)=実施例4eの場合と同じ
製造は実施例4cと類似の方法で行われるが、しかし第7反応サイクルの後に1つのサイクルを式XV、XIVcおよびXIIIbの単位のそれぞれを記載された配列で順次に用いて実施することにより(5′5′S)を導入する。次の8個のサイクルでは式IIIaのヌクレオシド5′−ホスホルアミダイトを用いる。次のサイクルにおいて(3′3′S)の混入が、結合工程で式XIVdのモノマーを用いて行われる。残りの13個のサイクルが最初の7個のサイクルの場合のようにヌクレオシド3′−ホスホルアミダイトを用いて実施される。その後の操作は実施例4cに記載のとおりである。
【0099】
g) 式IA−6(R1=式II、R2=H、 Z=“フルオレセイン"、 a=U=V=W=X=Y=Y′=Z′=O、 e=13、 f=15、 i=1、 r=0)のオリゴヌクレオチドの製造
d(3′−“フルオレセイン"−pGpGpTpGpTpTpTpGpGpGpGpGpTpTpGpG(5′5′S)GpTpTpGpGpGpGpTpTpGpTpGpTpGp−“フルオレセイン”)
合成は実施例4eと類似の方法で、式VIIa−5(B′=GuaPAC、 Z=“フルオレセイン"、 W=O)の支持体から出発して行われる。該支持体は、あらかじめ実施例2aと類似の方法でビスアミダイト(VIa)(B′=GuaPAC、 R5=R8=i-C3H7)から“フルオレセイン”−Hとの反応によって得られた式VIII(B′=GuaPAC、Z=“フルオレセイン"、 R5=R6=i-C3H7)のモノマーから、実施例3aと類似の方法で製造された(Schubert et al., Nucleic Acids Research (1991) 18, 3427参照)。3′−O−DMTr基を除去した後に遊離3′−ヒドロキシル基を式IX(R9=N(i-C3H7)2、R10=OCH2CH2CN、 Z″=“フルオレセイン")のフルオレセインホスホルアミダイトでホスフィチル化し次にヨウ素水で酸化する。保護基をアンモニアで除去した後に、式IA−6のオリゴヌクレオチドが得られる。
【0100】
h) 式IB−2(R1=R2=H、 Z=O-(CH2CH2O)8(CH2)3、 a=U=V=W=X=Y=Y′=O、 d=e=15、 i=1)のオリゴヌクレオチドの製造
(3′5′S)=p(CH2CH2CH2p)4
d(GpGpGpCpGpGpGpGpCpTpTpApApApGpG(3′5′S)CpCpTpTpTpApApGpCpCpCpCpGpCpCpCp-O-(CH2CH2O)8(CH2)13CH3)
実施例3aに記載のようにして、式VIIIkのアミダイトを用いて製造した式VIIa−6(B′=CytBz、 W=O、 Z=-O-(CH2CH2O)8(CH2)13CH3)の支持体から出発して、オリゴヌクレオチド合成は最初に実施例4bと類似の方法で行われる。第15反応サイクルの後に、式XIVdの単位を用いて4個のサイクルを実施する。残りの16個のヌクレオチドは、5′−O−DMTr−ヌクレオシド3′−ホスホルアミダイトを用いて実施例4bのように混入する。
【0101】
実施例5:ヌクレアーゼ安定性の試験
検査するオリゴヌクレオチド10mmolをRPMI培地中の20%胎児牛血清450μlおよび2回蒸留した水50ml中に溶解し、37℃でインキュベートする。次にゲル電気泳動用の10μl試料およびHPLC用の20μl試料を、直後並びに1、2、4、7および24時間後に取り出し、各場合にそれぞれホルムアミド5μlまたは10μlと混合して反応を停止させ次いで95℃で5分間加熱する。ゲル電気泳動の場合には試料を15%ポリアクリルアミドゲル(2%ビス)上に取り込み、約3,000ボルト時間流す。バンドを銀染色によって視覚化する。HPLC分析の場合には試料をGen−Pak Fax HPLCカラム(Waters/Millipore社製)上に注入し、バッファーB中の5〜50%バッファーA(バッファーA:10mAリン酸二水素ナトリウム、アセトニトリル/水 1:4(v:v)中の0.1M NaCl pH6.8;バッファーB:1.5M NaCl以外はAと同じ)を用いて毎分1mlでクロマトグラフィー処理する。
【0102】
実施例6:抗ウイルス活性
本発明化合物の抗ウイルス活性をインビトロ実験で試験する。このためには、本発明化合物をマイクロタイタープレート中のヘラ(HeLa)細胞およびベロ(Vero)細胞の細胞培養に種々の希釈度で加える。3時間後に、これらの培養物にヒトの病原体である種々のウイルス(例えばヘルペスウイルスHSV−1、HSV−2、オルソミクソウイルスインフルエンザA2、ピコルナウイルスライノウイルス2)を感染させる。感染後48〜72時間後に治療成功を細胞変性作用に基づいて、顕微鏡でおよびニュートラルレッド吸収の光学的測定(フィンターカラーテスト)で決定する(Finter, N.B. in “Interferons", N.B. Finter et al., North Holland Publishing Co., Amsterdam, 1966)。感染細胞の半分が細胞変性作用を全く示さない最小濃度を最小阻止濃度(MIC)であるとみなす。
Claims (9)
- 式IA
上記式中、
R1は水素、C1〜C18−アルキル、C2〜C18−アルケニル、C2〜C18−アルキニル、C2〜C18−アルキルカルボニル、C3〜C19−アルケニルカルボニル、C3〜C19−アルキニルカルボニル、C6〜C20−アリール、(C6〜C14)−アリール−(C1〜C8)−アルキルまたは式II
R2は水素、ヒドロキシル、C1〜C18−アルコキシ、ハロゲン、アジドまたはNH2であり;
Bはヌクレオチド化学における慣用の塩基であり;
aはオキシまたはメチレンであり;
d、e、fは互いに独立していて、0〜50の整数であり;
iは1〜10の整数であり;
rは0または1の整数であり(但しrが0である場合にはVはY′でありそしてiが1より大きい場合にはrは1である);
Wはオキソ、セレンオキソまたはチオキソであり;
Vはオキシ、チオまたはイミノであり;
Yはオキシ、チオ、イミノまたはメチレンであり;
Y′はオキシ、チオ、イミノ、(CH2)mまたはV(CH2)mであり、ここでmは1〜18の整数であり;
Xはヒドロキシルまたはメルカプトであり;
Uはヒドロキシル、メルカプト、SeH、C1〜C18−アルコキシ、C1〜C18−アルキル、C6〜C20−アリール、(C6〜C14)−アリール−(C1〜C8)−アルキル、NHR3、NR3R4または式(OCH2CH2)pO(CH2)qCH2R11の基であり、ここで
R3はC1〜C18−アルキル、C6〜C20−アリール、(C6〜C14)−アリール−(C1〜C8)−アルキル、−(CH2)c−〔NH(CH2)c〕d−NR12R12(ここでcは2〜6の整数であり、dは0〜6の整数でありそしてそれぞれのR12は独立していて、水素、C1〜C6−アルキルまたはC1〜C4−アルコキシ−C1〜C6−アルキルである)であり、
R4はC1〜C18−アルキル、C6〜C20−アリールまたは(C6〜C10)−アリール−(C1〜C8)−アルキルであり、またはNR3R4の場合にはR3およびそれらを担持している窒素原子と一緒になって5〜6−員の複素環式環を示し、該環はさらにO、S、Nから成る群より選択される別のヘテロ原子を含有することができ、
pは1〜100の整数であり、
qは0〜18の整数であり,
R11は水素または以下からなる群より選択される官能基:ヒドロキシル、アミノ、NHR13、COOH、CONH2、COOR12またはハロゲン(ここでR12はC1〜C4−アルキルであり、そしてR13はC1〜C6−アルキルである)であり;
Sは式III
g′は0または1の整数であり、
hは0〜10の整数であり、
GはC1〜C12−アルキレン(ここでアルキレンは場合によりハロゲン、アミノ、ヒドロキシル、C1〜C18−アルキル、C1〜C18−アルコキシ、C1〜C18−アルキルカルボニルオキシ、C6〜C14−アリール、C6〜C14−アリール−C1〜C18−アルキルまたはC6〜C14−アリール−C1〜C8−アルコキシにより置換されうる)、C6〜C14−アリール−ジ−C1〜C8−アルキレン、C6〜C18−アリーレン、式(CH2CH2V)αCH2CH2もしくは(CH2V)αCH2(ここでαは1〜11の整数である)の基、式
Z=Z′はヒドロキシル、メルカプト、SeH、C1〜C22−アルコキシ、−O−(CH2)b−NR12R13(ここでbは1〜6の整数であり、そしてR12はC1〜C4−アルキルであり、R13はC1〜C6−アルキルであるか、またはR12およびR13はそれらを担持している窒素原子と一緒になって3〜6員環を形成する)、C1〜C18−アルキル、C6〜C20−アリール、(C6〜C14)−アリール−(C1〜C8)−アルキル、(C6〜C14)−アリール−(C1〜C8)−アルコキシ(ここでアリールはヘテロアリールを包含し、アリールはカルボキシル、アミノ、ニトロ、C1〜C4−アルキルアミノ、ヒドロキシル、ハロゲンおよびシアノから成る群より選択される1、2または3個の同一または相異なる基によって場合により置換されている)、C1〜C18−アルキルメルカプト、NHR3、NR3R4、式IIIの基(ここで3′リン酸基においてZはOHでない)であるか、またはZ=Z′(3′リン酸基におけるZを除く)は分子内吸収を促進するかまたはDNAプローブ用標識として役立つかまたはオリゴヌクレオチド類似体の標的核酸へのハイブリッド形成中に該標的核酸を結合、架橋または分裂により攻撃する基であり;
2′−および3′−位の曲線括弧はR2および隣接ホスホリル残基が3′−および2′−位で反対方向に位置することも可能であることを示しており、そして各ヌクレオチドはD−またはL−配置で存在することができ、塩基Bはα−またはβ−位にあることができる。 - 塩基Bがβ−位にあり、ヌクレオチドがD−配置で存在し、R2が2′−位にありそしてaがオキシである請求項1記載のオリゴヌクレオチド類似体。
- R1が水素、C1〜C6−アルキルまたは式IIの基であり;
R2が水素またはヒドロキシルであり;
d、eおよびfが5〜15の整数であり;
iが1〜3の整数であり;
mが1〜6の整数であり;
Uがヒドロキシル、メルカプト、C1〜C6−アルコキシ、C1〜C6−アルキル、NR3R4またはNHR3であり、ここで
R3がC1〜C8−アルキルまたはメトキシエチルでありそしてB、W、V、Y、Y′、XおよびZが前述の意味を有する、請求項1または2記載のオリゴヌクレオチド類似体。 - V、YおよびY′がオキシの意味を有する請求項1〜3のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチド類似体。
- Wがオキソの意味を有する請求項1〜4のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチド類似体。
- Uがヒドロキシルの意味を有する請求項1〜5のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチド類似体。
- R1が水素である請求項1〜5のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチド類似体。
- 請求項1記載の式IAのオリゴヌクレオチド類似体の製造において、
a) 第1反応サイクルにおいて3′(2′)−末端リン(V)基および遊離5′−ヒドロキシルまたはメルカプト基を有するヌクレオチド単位を、3′(2′)位にリン(III)またはリン(V)基またはその活性誘導体を有するさらに別のヌクレオチド単位と反応させるか、またはスペーサー基の導入を可能にする試薬と反応させ、次のサイクルにおいて3′(2′)−または5′−末端リン(III)またはリン(V)基またはその活性誘導体を有するヌクレオチド単位を、5′−または3′(2′)−末端遊離ヒドロキシルまたはメルカプト基を有するさらに別のヌクレオチド単位と反応させるか、または
b) 工程(a)の手法でヌクレオチド単位の代わりにヌクレオチドフラグメントを用いてオリゴヌクレオチド類似体を構成し、
そして上記(a)または(b)によって得られたオリゴヌクレオチド中に他の官能基保護のために一時的に導入した保護基を除去し、こうして得られた式IAのオリゴヌクレオチド類似体を、適切な場合にはその生理学的に許容しうる塩に変換することからなる前記の製造方法。 - 請求項1〜7のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチド類似体からなる核酸検出用プローブ。
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