PL172245B1 - S posób wytwarzania analogów oligonukleotydów 3’-podstawionych grupami nienukleotydowymi PL PL - Google Patents

Abstract

1 Sposób wytwarzania analogów oligonukleotydów 3 ' podstawionych grupami nienukleotydowymi o wzorze 1A i 1B, jak równiez ich fizjologicznie tolerowanych soli, w którym R 1 oznacza wodór. C 2-C1 8 alkil, C2-C 1 8 alkenyl C2-C1 8 -alkinyl, C3 - C 1 9 -alkilokarbonyl C3-C1 9 -alke n oylokarbonyl, C3 -C1 9 -atkinylokabonyl C 6 -C3 0 -aryl, (C6-C1 4 )-arylo -(C 1 -C4)-alkil albo rodnik o wzorze 2, R2 oznacza wodór, grape hydro ksy, C1 -C1 8 -alkoksy chlorowiec azydo albo NH2 , B oznacza zasade zwykla w chemii nukleotydów, a oznacza oksy albo metylen, d.e, f niezaleznie od siebie o znaczaja liczbe calkowita od O do 50 i jest liczba calkowita od 1 do 10 r oznacza liczbe calkowita 0 lub 1 , z tym, z e jesli r jest równe 0 to V = Y , a jesli i jest wieksze niz 1 r= 1 W oznacza grupy okso selonokso lu b tiokso V oznacza oksy, sulfandlyl albo imino Y oznacza oksy. sulfandryl imino albo metylen, Y ' oznacza oksy, sulfandryt imino (CH2) . albo V(CH2), przy czym m oznacza liczbe calkowita od 1 do 18,X oznacza hydroksy albo merkapto, U oznacza hydroksy, merkapto, SeH, C1 - C18 alkoksy, C1 C18 alkil C4-C3 0 -aryl (C4-C1 4 )- aryl o - ( C3 C 8 ) -alkil NHR3 NR3R3 albo rodnik o wzorze (OCH-CH-)pO(CH2),CH+ R1 1 , gdzie R3 oznacza C 1 -C1 8 -alkil, korzystnie C 1 -C8 -alkil, C6 -C2 0 -aryl (C6-C14)arylo-(C1 -C6)-alkil.-(CH2)c-N H (CH2)c/d-NR12R 12 gdzie e jest liczba calkowita o d 2 d o 6 zas d jest liczba calkowita od 0 do 6, a R 1 2 niezaleznie od siebie oznacza wodór albo C1 C6 -alkil albo C 1 -C4 alkoksy- C 1 C4-alikil, R3 oznacza C 1-C1 3 alkil C4-C3 0 aryl albo (C4-C1 0 )-grylo-(C1 -C6)-alkil, albo w przypadku NR3R4 razem z atomem azotu do którego sa one przylaczone oznacza 5- 6 czlonowy pierscien heterocykliczny który dodatkowo moze zawierac dalszy heteroatom z szeregu O , S, N, p jest liczba calkowita od 1 do 100; q jest liczba calkowita od 0 do 18, R 1 1 oznacza wodór albo grupe funkcjonalna S oznacza grupe o wzorze 3 w którym g i g' sa liczbami calkowitymi zero albo 1, h jest liczba calkowita od zera do 10; G oznacza C 1 -C1 2 -alkilen, przy czym alkilen moze ewentualnie byc podstawiony przez chlorowiec, amino hydroksy, C 1 -C1 3 -alkil C 1 -C1 3 -alkoksy, C1 -C1 3 -alkilokarbonyloksy. C6 C1 4 -aryl C6 -C1 4 -arylo-C1-C1 4 alkil albo przez C 6- C 1 4 -arylo-C1 -C6 -alkoksy, dalej oznacza C 6 -C1 4 arylo-di-C1 C6-alkilen, C6-C1 8 -arylen grupy o wzorze (CH-CH2 V) a - CH2 CH2 albo (CH2 V)aCH - gdzie a jest liczba calkowita od 1 do 11 jednostki o wzorze 25 gdzie ß oznacza liczbe calkowita od 1 d o 6 albo grupy o wzorze 26, Z = Z' oznaczaja hydroksy merkapto SeH, C 1 -C22-alkoksy O-(CHa)b N R 1 -R 1 3 , gdzie j e s t liczba calkowita od 1 do 6, a R 1 3 oznacza C 1 - C6 alkil albo R1 i R1 3 razem z atomem azolu do którego sa one przylaczone tworza 3 do 6-czlonowy pierscien C 1 C 1 2 -alkil C 1 -C4 -alkil C6 - C 3 0 aryl (C6 ,-C17)-arylo-(C1 C7) alkil (G6 -C1 7 ) arylo-(C1 C8)-alkoksy przy czym aryl oznacza takze heteroaryl i aryl ewentualnie j est podstawiony przez 1 2 albo 3 takie same lub rózne rodniki z szeregu kartoksy, amino. n iro .C 1 - C 4 -alkiloam ino, hydroksy, chlorowiec i p rzez cyjano, C1 -C1 8 - alkilomerkapio NHR3 NHR3 R3 rodnik o wzorze 3, albo oznacza grupe która ulatwia wewnatrzkomórkowe wchlanianie, albo sluzy jak o znacznik (marker)sondy DNA albo przy hybrydyzacji analoguoligonukleotydu z docelowym kwasem nukleinowym atakuje ten ostatni przez wiazanie, poprzeczne usieciowana, albo rozszczepienie, wygiety nawias w pozycji 2 ' i 3 ' oznacza ze R’ i sasiedni rednik tosforylowy moga byc w pozycji odwróconej 3' 1 2', przy czym kazdy nukleotyd moze wystepowac w swojej konfiguracji D albo L, zas zasada B moze sie znajdowac w pozycji a lub ß, znam ienny ty m , z e sprzega sie znanymi technikami sprzegania, stopniowo w ilosci i w kolejnosci wynikajacej z ukladu sekwencji we wzorze produktu,jednostke nukleotydowa z 3'(2')koncowa grupa fosforowa (V) i wolna grupa 5 ' hydroksy albo merkapto o wzorze A' w którym R' V a,B Y R1 , U i W m aja wyzej podd a n e znaczenia G '' oznacza grupe odszczepialna z nastepna jednostka nukleotydowa z 3'(2')-koncowa grupa fostorowa (III) lub grupa foslorowa(V)lub jej aktywowana pochodna albo z odczynnikiem wprowadzajacym grupy spacer (3'3'S) (5',5' S) lub (3' 5 S ) i w dalszym cyklu jednostka nukleotydowa z 3'(2' )- wzglednie 3' koncowa grupa fosforowa (III) lub grupa fosforowa(V) alb o jej aktywowana pochodna reaguje z dalsza jednostka nukleotydowa z 5 ' wzglednie 3'(2') koncowa wolna grupa hydroksy albo merkapto o wzorze A " w którym V, a, B, Y', R3 Z. W, X ' maja wyzej podane znaczenia R oznacza grupe zabezpieczajaca albo b) analogi oligonukleotydów buduje sie w taki sam sposób poprzez fragmenty nukleotydów wyzej wskazane i w oligomildeotydach otrzymanych wedlug (a) lub (b) grupy zabezpieczajace wprowadzone czasowo dla zabezpieczenia innych funkcji zostaja odszczcz e pione i tak otrzymane analogi oligonukleotydów o w z w e 1A i 1D ewentualnie przeprowadza sie, w ich fizjologicznie tolerowane sole W ZÓR 1A W ZÓR 1B PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania analogów oligonukleotydów o wzorze 1A i 1B, w których podstawniki mają wyżej podane znaczenia charakteryzujący się tym, że

a) sprzęga się znanymi technikami sprzęgania, stopniowo, w ilości i w kolejności wynikającej z układu sekwencji we wzorze produktu, jednostkę nukleotydową z 3'(2') końcową grupą fosforową (V) i wolną grupę 5'-hydroksy albo merkapto o wzorze A', w którym R', V, a, B, Y, r2, U i W mają wyżej podane znaczenia a G oznacza grupę odszczepialną z następną jednostką nukleotydową z 3'(2')-końcową grupą fosforową (III) lub grupą fosforową (V) lub jej aktywowaną pochodną, albo z odczynnikiem wprowadzającym grupy spacer (3', 3'S), (5', 5'S) lub (3', 5',S) i w dalszym cyklu jednostka nukleotydowa z 3'(2') - względnie 5'-końcową grupą fosforową (III) lub grupą fosforową (V), albo jej aktywowana pochodna reaguje z dalszą jednostką nukleotydową z 5' - względnie 3'(2')-końcową wolną grupą hydroksy albo merkapto o wzorze A, w którym V, a, B, Y', R², Z, W, X' mają wyżej podane znaczenia a R oznacza grupę zabezpieczającą albo

b) analogi oligonukleotydów buduje się w taki sam sposób poprzez fragmenty nukleotydów wyżej wskazane i w oligonukleotydach otrzymanych według (a) lub (b) grupy zabezpieczające wprowadzone czasowo dla zabezpieczenia innych funkcji zostają odszczepione, i tak otrzymane analogi oligonukleotydów o wzorze 1A i 1D ewentualnie przeprowadza się w ich fizjologicznie tolerowane sole.

Korzystnie stosuje się jednostki nukleotydowe, w których zasada B znajduje się w pozycji (3, nukleotydy występują w konfiguracji D, R² znajduje się w pozycji 2', zaś a oznacza grupę oksy.

Korzystnie stosuje się jednostki nukleotydowe, w których R ¹ oznacza wodór, Ci-C6-alkil, zwłaszcza metyl, albo rodnik o wzorze 2; R oznacza wodór albo grupę hydroksy, zwłaszcza wodór; m oznacza liczbę całkowitą od 1 do 6, szczególnie 1; U oznacza -grupę hydroksy, merkapto, Ci-C6-alkoksy, Ci-C6-alkil, NR ³R⁴ albo NHR, zwłaszcza hydroksy lub Ci-C6-alkil, przy czym R³ oznacza Ci-Cs-alkil, zwłaszcza Ci-C4-alkil, albo metoksyetyl, B, W, V, V, V', X i Z mają wyżej podane znaczenie, przy czym sprzęga się jednostki nukleotydowe w ilości d, e i f równej liczbie całkowitej od 5 do 15 i równej liczbie całkowitej od 1 do 3.

Korzystnie stosuje się jednostki nukleotydowe, w których V, Y i Y' oznaczają grupę oksy.

Korzystnie stosuje się jednostki nukleotydowe, w których W oznacza grupę okso.

Korzystnie stosuje się jednostki nukleotydowe, w których U oznacza grupę hydroksy.

Korzystnie stosuje się jednostki nukleotydowe, w których r1 oznacza wodór.

Korzystnie stosuje się jednostki nukleotydowe z grupą fosforu wprowadzoną czynnikiem fosforynującym o wzorze ogólnym 61, w którym podstawnik R⁵ i r6 niezależnie od siebie oznaczają alkil C1-C12 lub oba podstawniki tworzą razem pierścień 5-6 członowy, DMTr oznacza grupę dimetoksytrietylową, X' = Y' i oznacza grupę oksy lub sulfandiylową, U' oznacza alkil C1-C4 lub grupę hydroksylową w postaci zabezpieczonej G' oznacza grupę (CH2CH2O)aCH2CH2 lub CH2CH(OR')CH2, w których R' oznacza alkil-C1-C18; aryl-Có-C14 lub C6-C14-arylo-C1-C6-alkil, a a oznacza liczbę całkowitą 1-11.

Jako składnik wyjściowy do syntezy w fazie stałej wprowadza się stały nośnik o wzorze 4, w którym A oznacza łącznik (ramię łączące, którym jest na przykład reszta kwasu dikarboksylowego, diolu, alkiloaminy, monoalkiloamidu kwasu dikarboksy lowego, amidu kwasu albo fosforanu o wzorze 42, w którym R oznacza wodór albo C1-C6-alkil, który ewentualnie jest podstawiony przez -CN, zwłaszcza metyl lub 2-cyjanoetyl; T oznacza stały nośnik z materiałów na przykład takich jak CPG (Controlled Pore Glass - szkło spiekane o kalibrowanych porach), żel krzemionkowy albo żywica organiczna jak polistyrol (PS), lub prasowany kopolimer z PS i glikolu polietylenowego (POE), który jest zmodyfikowany w łańcuchu bocznym przez grupy funkcjonalne jak hydroksy, amino, chlorowiec albo COOH; D oznacza grupę zabezpieczającą, która daje się usunąć bez odszczepienia łącznika A i rodnika X'-CH2CH2-S(O)-CH2CH2 (patrz Bioorg. Chem. 14(1986) 274-325), jak 4-metoksytetrahydropiranoil i dimetoksytrityl, zwłaszcza dla dimetoksytritylu x oznacza liczbę całkowitą zero, 1 lub 2 a X' oznacza oksy albo sulfandiyl.

Ramię łączące (łącznik) A, które przez chemiczne wiązanie (amid, ester i in) łączy stały nośnik T z resztą zawierającą siarkę (Damka i in, Nucleic Acid Res. 18, 3813 (1990)), jest to zwłaszcza reszta kwasu bursztynowego (O-C(O)-CH2CH2-C(O)-), reszta kwasu szczawiowego (O-C(O)-C(O)-), alkiloamina, szczególnie LCAA (Long Chain Alkyl Amin - alkiloamina o

172 245 długim łańcuchu), albo glikol polietylenowy. Szczególnie korzystna jest reszta kwasu bursztynowego. W określonych przypadkach, na przykład w kombinacji z podstawnikami które nie wytrzymują dłuższego traktowania amoniakiem, korzystne są bardziej labilne łączniki jak łącznik szczawiowy. Wytwarzanie stałych nośników o wzorach 4 a-c jest opisane w przykładzie I.

Nośnik	D	X’	X	A-T
Wzór 4r	DMTr	0	2	wzór 43
Wzór 4b	DMT)	0	2	wzór 44
Wzór 4c	DMTr	0	0	wzór 45

Synteza w fazie stałej może nastąpić według metody fosfotrójestrowej, metody H-fosfonianowej i metody fosforamidynowej, szczególnie według metody fosforamidynowej (E. Sonveaux, Bioorg. Chem. 14, 274 (1986)). Najpierw zawsze odszczepia się z nośnika o wzorze 4 grupę zabezpieczającą D, przy pomocy kwasu na przykład kwasu trójchlorooctowego w chlorku metylenu. W przypadku metody fosforamidynowej tak otrzymany nośnik o wzorze 4', w którym x, X' A i T mają wyżej podane znaczenie, w obecności słabego kwasu jak tetrazol kondensuje się z fosforamidynem nukleozydu o wzorze 5, w którym

B' oznacza B, przy czym ewentualnie grupy Nh 2 obecne w B mogą występować jako zabezpieczone;

R jest grupą zabezpieczającą, która daje się usunąć w łagodnych warunkach, jak 4-metoksytetrąhydropiranoil albo dimetoksytrityl;

R² oznacza wodór, alkoksy, chlorowiec albo zabezpieczoną funkcję hydroksy lub amino;

R⁵ i R- niezależnie od siebie oznaczają C1-C12-alkil, albo obie reszty' razem tworzą 5- do 6-członowy pierścień, Y oznacza oksy, sulfandiyl albo (CH2)m, zaś a, m, V i Z mają wyżej podane znaczenie.

Następnie w znany sposób utlenia się tak otrzymany nośnik jodowodorem (W = O) względnie TETD (dwusiarczkiem tetraetylotiuramu) albo atomową siarką (W = S) lub selenem (W = Se) do pochodnego nośnika o wzorze 7, w którym R, V, B', R6, Z, X', W, Y, A i T mają wyżej podane znaczenie. Korzystnie wytwarza się nośniki o wzorze 7a.

Fosforamidyn o wzorze 5 można otrzymać na przykład z bis-amidynu o wzorze 6, w którym R⁷ i R⁸ równają się R⁵ i R⁶, zaś a, R, V, B', R², Y, R5 i R⁶ mają wyżej podane znaczenie, przez reakcję z odpowiednim alkoholem albo tioalkoholem z katalizą tetrazolem (przykład II, metoda A), gdy Z = alkoksy albo alkilomerkapto (J. E. Marugg i in, Tetrahedron Lett. 27. 2271 (1986)).

Korzystne bis-amidyny są to te o wzorze 6a.

W ten sposób wytworzono na przykład amidyny o wzorze 8 a-m, w którym r5 i r6 mają wyżej podane znaczenie, Z oznacza

a) O-CH2CC3, C O- 1-C3H7, c) O-n-C6Hi3, 6) O-n-Ci8H3C, e) wzór 46, f) wzór 47, g-k) oznacza resztę o wzorze 3 w którym przy g) p = 3 i q = 0, h) p =4 i q = 9, i) p = 5 i q = 4 i przy

k) p = 8 i q = 13. p) CH), m) wzór 48, a B' oznacza przy a), c) i d) Cyt’^Bu, przy b) i p) Thy i przy e) - k) i m) Cyt .

Alternatywną metodą obciążenia nośnika jest reakcja odczynnika fosforynującego o wzorze 9, w którym

R^v i R niezależnie od siebie oznaczają Cl, NR°r6, NRT, Z albo U', przy czym U' oznacza C1-C4-alkil albo grupę hydroksy występującąjako zabezpieczona pochodna, R , R6, R⁷ i R⁸ majj wyżej ppdane znaazznie, Z = Z, pod warunkiem że hydiOksyy merrapto i SeH muszą występować jako pozyodne zabezpieczone, na przykład jako Y'-G'-X'-DMTr, gdzie DMTr oznacza dimetkayytrityl, X' = Y' =s y ksy a lbu suldiyd iyj , a G' lpznacza (CH2CH2O) aCH2CH2 albo CH2CH(OR')CH2, R' = C1-C18-alkil, C6-Clk-a)yl albo C 6-C14prylo-C1-C8-rlkil, zaś a = liczba całkowita od 1 do 11, albo jako O-CH 2CH 2-CN, O-CH), SCH2CH2CN, O-CH2CH2-S-CH2CH2-O-D, albo wzór 49, z nuklrkzydem z wolną funkcją 3'(2') o wzorze 10, w którym V, B', R² i R mają wyżej pkdaee znaczenie a Y'=oksy albo sulfaediyl,

172 245 a końcowa kondensacja tak otrzymanego z.wiązkujia nośniku o wzorce 4, w obecności środka kondensacyjnego jak tetrazol (dla R.R'' = NR κ względnie NRk) albo diizeprepyloomina (dla R ,R ^ΠΤ = Cl) często przedstawia metodę szybszą (przykład III, metodo B; potrz także równoważne co do priorytetu zgłoszenie patentowe pod tytułem Analogi eligenukleetydów, ich wytwarzanie i zastosowanie).

Końcowe utlenianie jodewedergm względnie siarką lub selenem prowadzi następnie do związku o wzorze 7a. Teraz można usunąć grupę zabezpieczającą R i syntezę eligonukleotydu prowadzić dalej znanym sposobem. Na końcu syntezy z tok otrzymanego związanego na nośniku analogu eligooukleetydu usuwa się grupy zabezpieczające w znany sposób, poczem analog eligooukleetydu o wzorze 1A albo 1B edsaczepia się z nośnika.

Jeśli synteza zostaje zakończona w ostatnim cyklu składnikiem o wzorze 5, otrzymuje się analog eligeouklgetydu o wzorze 1A lub 1B (R' = H) z grupą ó^hydroksy i koojugacją zawierającą fosfor na końcu 3'(2'). Jeśli natomiast w ostatnim etapie kondensacji wprowadza się odczynnik fosforujący, na przykład o wzorze 9, w którym R⁹ = Z, wynikiem syntezy jest analog oligoouklgetydu o wzorze 1A lub 1B, gdzie R' = wzór 2, który zarówno no końcu 3'(2') jak i na końcu 5' wykazuje podstawienie zawierające fosforan.

Wytworzenie eligeouklgetydów z 3'(2')-końcewą grupą fotforamidooewą jest możliwe na przykład przez reakcję nośnika o wzorze 4' z monomerem metoks^-l^c^i^l^^i^iOT^idynu o wzorze 5 (Z = O-CH3) w obecności tetrazolu, gdy utlenianie przeprowadza się według Jagera i in. (Biochemistry 27,7237 (1988) przez Jod/H2NR3 względnie HNr3r⁴, gdzie rS i r4 mają wyżej podane znaczenie. _{3 4}

W określonych przypadkach (Z = NHR'', NR^JR, O, S albo Se) wprowadzenie grupy Z może również nastąpić metodą H-fosfonianewą, w której najpierw fesfooiao nukłgeaydu o wzorze 11, w którym R, V, a, B', Y', X' i W mają wyżej podane znaczenie, reaguje z nośnikiem o wzorze 4' z wytworzeniem diestru H--os-ooiaou o wzorze 7', który poddaje się eksydatywngmu fesferamidewaniu (B. Froehler, Tgtrahgdroo Lett. 27, 5575, (1986)). W ten sposób z cholestgryloeksykareenyle-aminealkiloamioy, w obecności czterochlorku węgla, można na przykład wytworzyć eligenuklgetyd z 3'-keńcową grupą cholgstgrylową.

Wytwarzanie analogów ellgenukleetydów o wzorach 1A i 1B jest dalej możliwe metodą trójestrową, w której grupa HX' nośnika’ o wzorce 4' reaguje z zabezpieczonym diestrem fosforanowym o wzorze 12, w którym R; V, a, B', R, Y', Z, W, X' i wygięty nawias mają wyżej podone znaczenie, w obecności środka kondensacyjnego jak chlorku kwasu arylokarhoksylowego i nuldeofilowóge katalizatora jak tetrazol. Możliwość inwersji polaroeści łańcucha eligeoukleetydu, rosnącego w kierunku 3'5'(2'5') polega na tym, że wolną grupę 5'-hydroksylewą względnie 5'-tielewą rosnącego łańcucha poddaje się reakcji z jednostką o wzorze 13, na przykład z 3'-O-DMTr-ouklgezyde-5'-fosforamidyoem o wzorze 13a (13o): U' = OCH2CH2CN, B = B' (13b): U' = CH3, B = H.

Jeśli na koniec utlenia się jodowodorem względnie siarką, (5'5'S) ma znaczenie reszty fosforanowej (PO4’) albo fopforotionianewgj (PO3S). Po edsaczgpienlu grupy zabezpieczającej na końcu 3'(2') łańcuch ellgonukleotydu można w razie potrzeby przedłużać w kierunku 5'3', przez kolejne sprzęganie z jednostkami o wzorze 13, w którym U' ma znaczenie U, z założeniem że U' nie oznacza NHR³ albo NR ³rS, i hydroksy, merkapto i SeH występują jako zabezpieczone pochodne (przykłady takich pochodnych patrz Z), zaś R5, r6, Y', v, R, a, r2 i B' mają wyżej podane znaczenie.

Synteza jednostek 13 następuje na przykład według Seligera i in. (Nucleosides, Nucleotides 10 (1991) 469). Jeśli dalsza inwersja nie następuje, otrzymuje się analog oligeoukleetydu o wzorze 1A, przy czym r jest równe zeru.

Dla wytworzenia analogów ollgoosklgetydów o wzorze 1B, których pelarność nie jest zmieniona i których (3'5'S) jednak ułatwia fałdowanie łańcucha, syntezę łańcucha eligeouklgotydu w pożądanej pozycji przedłuża się jednostką 14, która ze względu na swoją bifuokcjeoαlność może również być keodgnsewana wielokrotnie·.

172 245

Wzór 14	r5=r6	U'	(Y'-G-X'-D)
a	i-CsHy	O-CH2CH2-CN	(O-CH2CH2)3-O-DMTr
b		O-CH2CH2-CN	wzór 50
c	55	CH3	OCH2CH2CH2-ODMTr
d		O-CH2CH2-CN	-OCH2CH2CH2-O-DMTr
e	łł	OCH2CH2-CN	wzór 51

Na przykład można wprowadzić pętlę (3'5'S) przez wielokrotne, korzystnie 4- do 5-krotne, kolejne sprzęganie z jednostką o wzorze 14b. Potem syntezę prowadzi się dalej w kierunku 3'5', jak opisano wyżej.

Jeśli przy hybrydyzacji analogu oligonukleotydu z dwuniciowymi kwasami nukleinowymi, korzystnie DnA, dąży się do zmiany nici, 5'5'-spacer musi mieć większą długość. Na przykład difosforan trietylenoglikolu można wbudować jedno- lub wielokrotnie, korzystnie dwukrotnie, w pożądanej pozycji do łańcucha zbudowanego w kierunku 3'5', przez dwukrotne sprzęganie z jednostką o wzorze 14a. Celem zmiany polarności następnie prowadzi się dalej syntezę w kierunku 5'3' jednostkami nukleotydowymi o wzorze 13. Jeśli pożądane jest ponowne odwrócenie polarności, w zamierzonej pozycji wprowadza się 3'3'-spacer i następnie syntezę łańcucha prowadzi się dalej w kierunku 3'5' przez kondensację z nukłeozydo-3'-fosforamidynami. Jako spacer 3'3' nadaje się na przykład grupa difosforanu propan-1,3-diolu, która daje się wprowadzić przez sprzęganie z jednostką o wzorze 14d.

Jeśli syntezę oligonukleotydu przeprowadza się na nośniku siarczkowym (x=0) albo sulfinylowym (x=1), grupy te na końcu utlenia się do reszty sulfonylowej w znany sposób (Funakoshi i in., Proc. Natl. Acad. Sci. 88 (1991) 6982), aby umożliwić łatwe odszczepienie zasadami, korzystnie amoniakiem.

Rodzaj aminowych grup zabezpieczających zasady B' oraz rodzaj łącznika A zależą w określonym przypadku od rodzaju podstawnika Z, ponieważ po całkowitej syntezie muszą one dać się odszczepić bez problemu. Na przykład przy wytwarzaniu estru izopropylowego 3'-fosforanu oligonukleotydu (Z = O-i-C3H7) można pracować z grupami zabezpieczającymi benzoilo (Bz) dla B = Ade i Cyt, względnie izobutyrylo (i-Bu) dla B = Gua. Natomiast do syntezy estru 3'-metylosulfonianowego oligonukleotydu (Z = CH3) albo estrów etylowych (Z = O-C2H5) stosuje się dla B = Ade i Gua korzystnie bardziej labilne grupy zabezpieczające fenoksyacetyl (PAC) lub dla B = Cyt izobutyryl.

Liczne konjugaty posiadają dodatkowe grupy funkcjonalne, które przed wbudowaniem do monomerów o wzorze 5 i 13 muszą zostać w odpowiedni sposób zabezpieczone. Na przykład grupa karboksylowa fluoresceiny powinna być zabezpieczona jako ester alkilowy. W psoralenie grupa amidowa może występować jako związek zabezpieczony N-Fmoc (fluorenylometoksykarbonyl). Grupy hydroksylowe mogą zostać zabezpieczone przed reakcjami ubocznymi przez acylowanie albo silylowanie (t-butylodimetylosilyl). Grupy aminowe mogą także występować jako zabezpieczone trifluoroacetylem. W wyjątkowych przypadkach konjugaty mogą być tak mało stabilne, że mogą zostać zniszczone już w warunkach odszczepiania grup zabezpieczających w syntezie oligonukleotydu. W takich przypadkach jest dogodne w monomerze o wzorze 5 dobudować tylko ramię łączące (łącznik) z grupą funkcjonalną, na przykład Z=HN-(CH2)x-NH-Fmoc, w której x oznacza liczbę całkowitą od 2 do 12, korzystnie 4 - 6. Po wbudowaniu do oligonukleotydu i usunięciu grup zabezpieczających, korzystnie amoniakiem, wolna grupa aminowa może zostać sprzęgnięta z aktywnymi estrami. Tak wytwarza się na przykład podatny na zasady ester akry dyniowy.

Syntetyzowane pochodne oligonukleotydów charakteryzuje się przy pomocy spektrometrii masowej elektro-spray-jonizacyjnej (Stults i Masters, Rapid Commun. Mass. Spectr. 5, (1991)350).

Analogi oligonukleotydów według wynalazku o wzorze 1A i 1B testuje się na ich stabilność w surowicy i wobec znanych egzonukleaz.

172 245

Nieoczekiwanie stwierdzono, że analogi oligonukleotydów o wzorze 1A i IB, w porównaniu z oligonukleotydami niezmodyfikowanymi, wykazują wyższą stabilność wobec nukleaz surowicy, podczas gdy ich zachowanie się w' hybrydyzacji zmienia się tylko nieznacznie.

Podczas gdy niezmodyfikowane oligonukleotydy wykazują w płodowej surowicy cielęcej okres półtrwania około dwu godzin, wszystkie analogi oligonukleotydów o wzorze 1A i 1B są wystarczająco stabilne przez około 16 godzin. Analogi oligonukleotydów o wzorze 1 są ponadto stabilne wobec fosfofiesterazy jadu węża. Niezmodyfikowane oligonukleotydy są egzonukleolitycznie rozkładane od końca 3' przez fosfodiesterazę jadu węży i od końca 5' przez fosfodiesterazę śledziony.

Analogi oligonukleotydów o wzorze 1A i 1B, przez parowanie zasad Watsona-Cricka z jednonicieniowymi sekwencjami nukleotydowymi tworzą stabilne dwuniciowe hybrydy, względnie przez parowanie zasad Watsona-Cricka i Hoogsteena tworzą stabilne struktury trypleksowe, natomiast z dwuniciowymi kwasami nukleinowymi przez parowanie zasad Hoogsteena tworzą struktury potrójnej spirali, przy czym spacery (5'5'S) i (3'3'S) umożliwiają wymianę nici. Dzięki temu możliwajest regulacja lub stłumienie biologicznych funkcji kwasów nukleinowych analogami oligonukleotydów według wynalazku, na przykład stłumienie ekspresji genów komórkowych jak również onkogenów albo funkcji genomów wirusowych. Analogi oligonukleotydów o wzorze 1A i 1B są zatem możliwe do wprowadzenia w terapii lub profilaktyce zakażeń wirusowych albo chorób nowotworowych.

Działanie oligonukleotydów według wynalazku badano na podstawie hamowania namnażania się wirusa HS V-1.

Sekwencja 1 o wzorze 52 - punkt docelowy

Sekwencja 11 o wzorze 53 - punkt docelowy

Sekwencja 111 o wzorze 54 - punkt docelowy

Sekwencja V1 (Ad Elb) o wzorze 55

Sekwencja 1V o wzorze 56 - punkt docelowy HSV-1 (pierwotny)

Sekwencja V o wzorze 57 - punkt docelowy APP 770 (Alzheimer)

Wybrana sekwencja 1 w postaci naturalnej sekwencji, także bez podstawienia 3' i bez spacera 5'5', nie działa przeciw HSV-1 w hodowli komórkowej, ponieważ ulega szybkiemu rozkładowi w surowicy. Natomiast 3'-podstawione analogi oligonukleotydów o wzorze 1A, na przykład sekwencja 1A-2 (przykład 1Vb) hamują namnażanie się HSV-1.

Sekwencja 1 przedstawia tylko dowolny przykład dla uwidocznienia zasady. Sekwencja 1 jest skierowana przeciw mRNA białka transaktywatora Vmw65 HSV-1. Sekwencje Π i TTT są skierowane przeciw regionowi splice-acceptor (akceptor rozszczepienia) 1E4/5 prekursora mRNA (1E = immediate early - natychmiastowy) HSV-1 i również specyficznie hamują replikację HSV-1. Oligonukleotyd o wzorze 1A-4 (przykład 1Ve), zmodyfikowany psoralenem na obu końcach 3' w sekwencji 1V, rozpoznaje początek replikacji (oriL) genomu HSV-1 i hamuje tę replikację przez wytworzenie trypleksu. Działanie przeciwwirusowe konjugatów psoralenu można wyraźnie podwyższyć przez naświetlenie UV. Genom HSV-1 z jego 160 Οθ0 zasad przedstawia oczywiście niezliczenie wiele innych sekwencji docelowych o różnej wydajności dla hamowania namnażania się wirusa. Przez zmianę sekwencji nukleotydów zasada leczenia daje się zastosować także do dowolnych innych wirusów, bakterii albo innych patogenów.

Warunkiem przeniesienia na inne czynniki chorobotwórcze jest tylko znajomość genów istotnych dla cyklu życiowego tego czynnika etiologicznego choroby. Są one w swojej sekwencji zdeponowane w wielkiej różnorodności w tak zwanych pulach genów. Podobnie dotyczy to onkogenów albo innych genów komórkowych, które powinny być stłumione w swojej funkcji. Przykładami innych genów komórkowych są te, które kodują enzymy, receptory, kanaliki jonowe, immunomodulatory, czynniki wzrostowe albo inne białka regulatorowe. Sekwencja V jest skierowana na przykład dla genu-promotora APP770, który uznano za odpowiedzialny za ekspresję białka prekursorowego tworzących plamki białek amyloidowych w chorobie Alzheimera. Sekwencja V1 symuluje jako oligonukleotyd sensowny region wiązania SP1 adenowirusa Elb i hamuje transkrypcję Elb jako 3'-zmodyfikowany analog oligonukleotydu ze spacerem 3'5' o wzorze 1B-2. Przykładami onkogenów są abl, neu, myc, myb, ras, fos, mos, erbB, ets, jun, p53, src i rei.

172 245

Sondy dla kwasów nukleinowych, w szczególności dla DNA, z analogów oligonukleotydów o wzorze IA i B, w przeciwieństwie do znanych z literatury pochodnych oligonukleotydów z grupą 3'-hydroksy, dają z jednej strony korzystne podwyższenie stabilności wobec nukleaz a z drugiej pozwalają także na wprowadzenie takich samych lub różnych cząsteczek znaczników (markerów) na obu końcach oligonukleotydu. Jest korzystne, że różne grupy znacznikowe (markery) wewnątrz oligonukleotydu dają się selektywnie pobudzać (podwójne znakowanie). Bifunkcjonalne podstawienie można także zastosować w tym celu, aby wprowadzić na jednym końcu znacznik (marker) a na drugim dodatkową funkcję (na przykład znacznik powinowactwa). W tym celu można na przykład na jednym końcu 3' wbudować biotynę, która rozpoznaje awidynę albo streptawidynę, a na drugim końcu 3' wprowadzić ester akrydyniowy jako marker chemiłuminescencyjny poprzez łącznik alkiloaminowy.

W wielu przypadkach jest przy tym zdolność penetracji analogów' oligonukletydów wytworzonych sposobem według wynalazku lepsza niż niemodyfikowanych oligonukleotydów, zwłaszcza gdy wprowadzi się reszty lipofilowe. Podwyższona stabilność w surowicy analogów oligonukleotydów według wynalazku o wzorze IA i IB, ich lepsza penetracja do komórki, ich lepsza zdolność wiązania, ich zdolność selektywnego niszczenia sekwencji docelowych przez modyfikację (alkilację, cross-linking - wiązanie krzyżowe), oraz możliwościach lepszego badania w diagnostyce DNA wyrażają wyższą aktywność biologiczną w porównaniu z oligonukleotydarni niezmodyfikowanymi.

Dotychczas wymienione diagnostyczne, profilaktyczne i terapeutyczne zastosowania analogów oligonukleotydów wytworzonych sposobem według wynalazku przedstawiają tylko wybór reprezentatywnych przykładów i ich zastosowanie nie ogranicza się do w/w. Ponadto analogi oligonukleotydów wytworzonych sposobem według wynalazku mogą być używanejako środki pomocnicze w biotechnologii i biologii molekularnej.

Preparaty farmaceutyczne, które zawierają skuteczną ilość jednego lub więcej związków o wzorze IA i/lub IB albo ich fizjologicznie tolerowanych soli, ewentualnie z fizjologicznie tolerowanymi substancjami pomocniczymi albo nośnikami i/lub innymi znanymi substancjami czynnymi, wytwarza się w ten sposób, że substancję czynną, razem z nośnikiem i ewentualnie innymi substancjami pomocniczymi, dodatkowymi albo substancjami czynnymi doprowadza się do postaci odpowiedniej do podawania. Stosuje się korzystnie dożylnie, miejscowo albo donosowo.

W następujących przykładach symbole literowe (a - m) oznaczają szczególne przypadki odpowiednich wzorów.

Przykład I. Wytwarzanie nośnika o wzorze 4

a) wytwarzania nośnika o wzorze 4a przea reakz-ę aminopropolo-CPG z bursztyuianem eteru yishydroksyetylosulfopo-dimktokaytritylowkgo. 4,56 g zwykłego eteru' dimetoksytritylu (DMTr) z bia-(2-hydroksyetylo)-aulfonu (10 mmoli) suszono przez dwukrotne rozpuszczenie 1 aatężepir w abs. pirydynie, rozpuszczono w 25 ml abs. pirydyny, dodano 1,78 g (14 mmoli) DMAP (dimrtyłoamipopięydyna) i 1,4 g bezwodnika kwasu bursztynowego (14 mmoli) i tę mieszaninę przez 3 godziny mieszano w temperaturze pokojowej. Po całkowitej reakcji zatężono, osad celem usunięcia pirydyny trzykrotnie rozpuszczono i zatężono w toluenie i następnie rozpuszczono w 220 ml chlorku metylenu. Fazę organiczną przemyto 10% kwasem cytrynowym (110 ml) i trzykrotnie wodą (110 ml), suszono nad siarczanem sodu i zatężono. Otrzymany stały osad suszono pod próżnią (5,64 g). Z tego yuraztypiapu 1,67 g (3 mmole) dwukrotnie rozpuszczono i zatężono w abs. pirydynie i rozpuszczono w mieszaninie z 0,65 ml pirydyny abs. i 6 ml tetiahydrofuiośu (THF). Następnie dodano roztwór 420 mg (3 mmole) p-nitrofenolu i 687 mg DCC (dicykloheksylokaryodπmid, 3,3 mmola) w 2,1 ml THF abs. i mieszano dwie godziny w temperaturze pokojowej. Po całkowitej reakcji odwirowano wytrącony dicykloheksylomocz^nik. Osad odpłukano 1 ml abs. eteru i jeszcze raz wirowano. 1,5 g nośnika omipopiopyl-CPG firmy Fluka (500 A, 100 |imol/g funkcja aminowa) odpłukano mieszaniną 1,8 ml dMf abs. i 350 μΐ tiójetyloomipy, dodano połączone zdkkantowape z nad osadu roztwory estru bursztynianowonitrofenylowrgo i wstrząsano przez 16 godzin w temperaturze pokojowej. Stały nośnik oddzielono i dla zablokowania grup reaktywnych wytrząsano z 3 ml odczynnika maskującego (bezwodnik octowy) 2.6-lutydyny (DMAP, 0,25 M w THF) przez godzinę w temperaturze

172 245 pokojowej. Następnie podstawiony CPG-nośnik odciągnięto, przemyto metanolem, THF, chlorkiem metylenu i eterem i na koniec suszono pod próżnią w 40°C. Obładowanie nośnika o wzorze 4a składnikiem zawierającym dimetoksytrityl wynosi 38 μmola/g.

b) wytwarzanie nośnika o wzorze 4b przez reakcję TentaGelR = zarejestrowany znak fabryczny firmy Rapp, Tubingen) z bursztynianem eteru bishydroksyetylosulfono-dimetoksytritylowego. Forma aminowa żywicy TentaGel, kopolimeru PS/POE z funkcją aminową 250 pmola/g (100 mg) odpłukano w mieszaninie 360 pl DMF i 70 pl trójetyloaminy, dodano 400 pl estru bursztyniancwo-p-nitrofenylowego (wytwarzanie patrz przykład 1a) i wytrząsano 16 godzin w temperaturze pokojowej. Następnie postępowano jak w przykładzie 1a. Obładowanie żywicy TentaGel o wzorze 4b składnikiem zawierającym dimetoksytrityl wynosi 98 pmoli/g.

c) wytwarzanie nośnika 4c przez reakcję TentaGel (forma hydroksy) z odczynnikiem fosforynującym o wzorze 9 (Z = DMTr-O-CH2CH2-S-CH2-CH2-O-; r9 = N(i-C3Hy)2; R z = O-CH2CH2CN). Formę hydroksy żywicy TentaGel, funkcją hydroksy 500 pmoli/g (50 mg) poddano reakcji z 10 równoważnikami odczynnika fosforynującego o wzorze 9 (Z = DMTrO-CH2CH2-S-CH2CH2-O-; r9 = N(i-C3H7)2 r1° = O-CH2CH2CN), w obecności 25 równoważników tetrazolu w acetonitrylu w 22°C. Po utlenieniu jodowodorem (1,3 g jodu w THF/woda/pirydyna, 70:20:5 = objętościowo) postępowano jak w przykładzie Ia. Obładowanie nośnika o wzorze 4c składnikiem zawierającym dimetoksytrityl wynosi 27 pmoli/g.

Przykład II. Wytwarzanie zabezpieczonego nukleozydo-3'-fosforamidynu o wzorze 8

a) wytwarzanie 8a (B' = Cyt^ffiu,Z = Q-CH2CH3, R =R⁶=i-C3H7) 2 mmole nukleozydo3'-fosforamidynu o wzorze 6 (B'=Cyt ^u, R=R=R-R=i-C3H7) dwukrotnie rozpuszcza się i wytrąca w 20 ml acetonitrylu abs. i rozpuszcza w 20 ml acetonitrylu abs. Następnie wkrapla się w ciągu 15 minut roztwór 2,4 mmola etanolu i 1,2 mmola sublimowanego tetrazolu w 5 ml acetonitrylu abs. Po dalszym mieszaniu jeszcze przez 2,5 godziny, rozcieńcza się 75 ml chlorku metylenu i ekstrahuje fazę organiczną 50 ml 5% roztworu wodorowęglanu sodu. Roztwór wodny przemywa się 2-krotnie 50 ml chlorku metylenu, połączone fazy organiczne suszy się nad siarczanem sodu i zatęża pod próżnią. Celem oczyszczenia chromatografuje się na kolumnie z żelem krzemionkowym, przy użyciu chlorku metylenu/n-heptanu/trójetyloaminy (45:45:10 objętościowo). Otrzymuje się 0,7 g substancji diastereoizomerycznej, jako związek jednorodny w chromatografii cienkowarstwowej ( P-NMRa = 146,7, 147,5 ppm). Jako produkt uboczny można izolować ślady odpowiedniego bis-etylo-fosforynu (³¹P-NMR(a = 139,3 ppm).

b) wytwarzanie 8b (B' = Thy, Z = O-i-C 3H7, R⁵=R =i-C 3H7)

Wytwarzanie następuje przez fosforynowanie 5'-dimetoksytritylo-tymidyny o wzorze 10 (B' = Thy (pozycja β); R=DMTr, V=0, a=O, Y=0,2 mmola) bisamidynem o wzorze 9 (Z = O-i-C3H7), R⁹=R=N(i-C3H7)2; 4 mmole) w obecności tetrazolu (0,5 mmola) w 10 ml abs. chlońku metylenu. Osad opracowuje siei ak w przykładzie IIa (³¹P-NMRa = 145.04 ppm, 145,66 ppm).

c) wytwarzanie 8c (B' = Cyt¹®¹¹, Z =:-O-n-C6H13,_R⁵=R⁶= i-C3H7) analogicznie jak w przykładzie IIa z bisamidynu 6a (B' = Cyt , R=R=r7=R=i-C3H7) przez reakcję z równoważnikiem n-heksanolu przy kataliz^ tetrazolem ( ³¹P-NMR 148,1 ppm, 148,5 ppm) ·

d) wytwarzanie 8d (B' = Cyt¹’ , Z = -O-n-C1&H37, R =R = i-C3H7) analogicznie jak w przykładzie IIa z bisamidynu o wzorze 6a (B' = Cyt , R=R=R'=R⁸=i-C3H7) przez reakcję z równoważnikiem n-oktadekanoluprzy katalizie tetrazolem (^P-NMR 147,2 ppm, 147,9 ppm).

e) wytwarzanie 8e (B' = Cyt, Z = 3-pirydylopropan-3-oksy, R⁵=R⁶=R =R⁸=i-C3H7B.

Analogicznie jak w przykładzie IIa z bisamidynu o wzorze 6a (B' = Cyt,

R⁵=R⁶=R⁷=R=i-C3H7, R=H) przez reakcję z równoważnikiem 3-pirydyno-(propan-3-olu) przy katalizie te^azGlem. W tym przypadku oba diasteneomery można rozdzielić w kolumnie chromatograficznej (³1p-NMR diastereomer 1: 147,7 ppm, diastereomer 2: 148,2 ppm).

f) wytwarzanie 8f (B' = Cyt^Bz, p-nitrofenykκJtyI-2-oksy. R=R=i-C 3H7).

Analogicznie jak w przykładzie IIa z bisamidynu o wzorze 6a (B' = Cyt^Bz, R⁵=R⁶=R=R⁸=i-C3H7) przez reakcję z równoważnikiem p-nitπofenyloeIan-2-olu przy katalizie tetrazolem (31p-NMR 148,1 ppm, 148,6 ppm).

g) wytwarzanie 8g (B' = Cyt^Bz, Z = -(OCH2CH2)3)OCH3, R⁵=R=i-C3H7).

172 245

Β7

Analogicznie jak w przykładzie 11a z bisamidynu o wzorze 6a (B' = Cyt ', R⁵=R=R⁷=R=i-C 3H7) przez reakcję z równoważnikiem eteru trietylenoglikol-monometylowego przy katalizie tetrazolem ( 1P-NMR 148,5 ppm, 148,9 ppm).

h) wytwarzanie 8h (B' = Cyt, Z = -(OCH2CH2)4O(CH2)9CH3, R⁵=R6=i-C 3H7)

Analogicznie jak w przykładzie 11a z bisamidynu o wzorze 6a (B' = Cyt^Bz, r5=r6=r⁷=r8=i-c3H7) przez reakcję z równoważnikiem eteru monodecylowego tetraetylenoglikolu przy katalizie tetrazolem ( ^5IP-NMR 148,4 ppm, 148,8 ppm).

i) wytwarzanie 8i (B' = Cyt^Bz, Z = -(OCH2CH2)5O(CH2)4CH3, r5=r6=1-C3H7)

Analogicznie jak w przykładzie 11a z bisamidynu o wzorze 6a (B' = Cyt , r5₌r⁶=r7₌r8=i-C3H7) przez reakcję z równoważnikiem eteru monopentylowego pentaetylenoglikolu przy katalizie tetrazolern,(^MP NMR 148,4 ppm, 148,9 ppm).

k) wytwarzanie 8k (B' = Cyt, Z = -(OCH2CH2)sO(CH2)i3CH3, R5=R⁶=i-C3H7)

Analogicznie jak w przykładzie 11a z bisamidynu o wzorze 6a (B' = Cyt^Bz, r5₌r⁶=r7₌r⁸=i-c3H7) przez reakcję z równoważnikiem eteru monotetradecylowego oktaetylenoglikolu przy katalizie tetrazolem ( ³¹P-NMR 148,4 ppm, 148,8 ppm).

l) wytwarzanie 8p (B' = Thy, Z = CH 3, R=R⁶=i-C 3H 7)

Analogicznie jak w przykładzie 11b z 5'-O-dimetoksytritylotymidyny przez fosforanowanie odczynnikiem o wzorze 9 (Z = CH 3, r9=C1, R ¹ -N(i-C3H7,)2), przy czym zamiast tetrazolu katalizuje się dwoma równoważnikami diizopropyloetyloaminy (^3rP-NMR 120,6 ppm, 121,0 ppm).

m) wytwarzanie 8m (B' = Cyt, Z = akr;^a^'^am-9-^(bi^nyd-^ⁱ^-oksy)-, r5=R ⁶=l-C 3H7)

Analogicznie jak w przykładzie 11a z bisamidynu o wzorze 6a (B' = Cyt^Bz, r⁵=R⁶=r7=r⁸=1-C 3H7) przez reakcję z równoważnikiem 9-(4-hydroksybutyl)akrydyny przy katalizie tetrazolem (r-NMR 146,7 ppm, 147,4 ppm).

Przykład ΠΣ. Wytwarzanie związanego z nośnikiem nukleotydu o wzorze 7

a) metoda A: wytwarzanie nośnika o wzorze 7a-1 przez sprzęganie nukleozydo-3'-fosforamidynu o wzorze 8b

7,5 mg nośnika z przykładu 1a, który zawiera 0,2 μmola związanego eteru dimetoksytritylowego bishydroksyetylosulfonu, traktuje się 3% kwasem trójchlorooctowym, przy czym grupa zabezpieczająca DMTr zostaje odszczepiona, przemywa się acetonitrylem i następnie poddaje się reakcji z 2 gmol nukl«)zydo-3'-fosforamidyriu o wzorze 8b (B' = Thy, Z = (O1-C3H7, R⁵=R=i-C3H7) w obecności tetrazolu (10 μmoll) w acetonitrylu. Czas reakcji wynosi 2,5 minuty. Następnie utlenia się jodem (dla W=O; 1,3 g jodu w THF/woda/pirydyna, 70:20:5 objętościowo, 5 minut).

b) metoda B: wytwarzanie nośnika o wzorze 7a-2 przez reakcję z odczynnikiem fosforynującym o wzorze 9.

Odczynnik fosforynujący o wzorze 9 (Z = n-oktyl, r9=R ¹⁰=Cl; 1 równoważnik) w obecności 1,2 równoważników diizopropyloetyloaminy (D1PEA) w abs. acetonitrylu albo chlorku metylenu reaguje z nukleozydem o wzorze 10 (1 równoważnik 5'-0dlmetoksytritylotymidyny, B' = pozycja (3, Y' = O) w -78°C do odpowiedniego monochlorku nukleozydo-3'-0-n-oktylofosfonu. Nośnik o wzorze 4a traktuje się jak w metodzie A, celem odszczeplenia grupy zabezpieczającej D = DMTr, przemywa się acetonitrylem i w obecności D1PEA poddaje się reakcji z nadmiarem monochlorku nukleozydo-3'-O-n-oktylofosfonu przygotowanym in situ. Po utlenieniu jodowodorem otrzymuje się związany z nośnikiem nukleotyd o wzorze 7a-2, który jest do dyspozycji dla dalszej syntezy oligonukleotydu.

Przykład 1V. Wytwarzanie oligonukleotydów o wzorze 1A i 1B (monomer jest w tym przypadku β-D-dezoksyrybonukleozydem)

a) wytwarzaare oligonuklnutydu o wzorze rA-1 (R=R=H, Z = O-1-C3H7 a=U=V=W=X=Y=Y'=O, B=Thy, e=8, f=r=O, i=1)

T(5'5'p)TpTpTpTpTpTpTpTpTp-(O-i-C3H7)

0,2 μmola nośnika 7a-1 (B' = Thy, W=O, Z=O-i-C3H7) z przy kład u Ilia traktuje się kolejno następującymi odczynnikami:

1. acetonitrylabs.

2. 3% kwas trójchlorooctowy w dichlorometanie

3. acdtonitryl abs.

172 245

4. 4 gmole 5'-O-dimetoksytritylotymidyna-3'-kwαt fosforany-β-ester cyjanoetylowydiizopropyloamidyn i 25 Umoli tetrazolu w 0,15 aceton^lu abs.

5. acetoni^l

6. 20% bezwodnik octowy w THF z 40% lutydyny i 10% Oimetyloaminopirydyny

7. acetonitryl

8. Jod (1,3 g w T-HF/woda/pirydyna 70:20:5 objętościowo)

Etapy 1 do 8, dalej zwane cyklem reakcji, powtarza się 7 razy dla zbudowania pochodnej dekatymidylanowej. W następnym 9 cyklu reakcji w etapie 4 zamiast 5'-O-DMTr-nukledzy0o3'-fosfdramidynu wprowadza się celem kondensacji inwertowany 3'-O-DMTr-nukleozydo-5^/fdtfdrami0yn. Po zakończonej syntezie następuje o0sbzbspienie grupy Oimetdksytritylowej, jak opisano w etapach 1 do 3. Przez K-godzinne traktowanie amoniakiem zostaje ddszczepiony nukleotyd od nośnika i jednocześnie eliminuje się grupy β-cyJandetylowe. Ponieważ oligonukleotyd nie zawiera aminowych grup zabezpieczających, nie jest konieczne dalsze traktowanie amoniakiem. Otrzymany jako surowy produkt ester izopropylowy 0ekatyml0ylan-3'-fotforan, który na końcu 5' zawiera wiązanie (5^/5')-internukledty0dwe, oczyszcza się elektroforezą w żelu poliakrylamidowym albo HPLC.

• b) wytwarzanie oligonuklsdtyOu o wzorze 1A-2 (R =H, Z=O-i-C3H7, a=U=V=W=X=Y=Y'=0; e=19, f=r=0, i=1; Ri=wzór 2 w którym Z=p-nitrofenyloetyl-2-ókty zaś Z=OH) d(p-nitrofenyloetyl-2-oksy-pC(5'5'p)GpTpCpCpApTpGpTpCpGpGpCpApApApCp

ApGpCpTp-0-i-C3,H7)

Syntezajest analogicznajak w przykładzie IVa, jednak z różnymi zasadami nukleinowymi w monomerze. W etapach syntezy 1 do 8 monomer ogólnie biorąc występuje jako dialkiloamid 5'-0-0imetoksytrityldnukledby0-3'-kwat fosforawy-β-ester cyjαnoetyldwy, przy czym funkcje amino adeniny (Ade), cytozyny (Cyt) albo guaniny (Gua) są zaopatrzone wodpowiednie grupy zabezpieczajace. W tym przykładzie stosuje się N-benzoil-Ade (Ade^Bz), N^benzoil-Cyt (Cyt^Bz) i N²-izobutyryl-Gua (Giui^u). Budowa łańcucha następuje wychodząc z nośnika o wzorze 7a-1 (B'=Thy, W=0, Z=O-i-C3H7) jak opisano w przykładzie IVa, przy czym odpowiednie monomery są kondensowane według powyższej sekwencji. W 20 cyklu reakcji monomer o wzorze 13a (B^Cy^) zostaje wprowadzony do kondensacji. Po ddtzcbsplenlu grupy 3'-ODMTr wolna grupa 3'-hydroksy ulega fosforanowaniu bis-i((p-nitrofenyloetyl-2-dkty)-fdtforddiizoprdpyldamidem o wzorze 9 (R =N(i-C3H7)2, Ri^Ό=Z=p-nitrofenyloetyl-2-dkty) i następnie zostaje utleniona joddwodorem. Dla odczepienia aminowych grup zabezpieczających oraz jednej z dwu grup p-nltrofenyldetylowyzh następuje w tym przypadku dodatkowe traktowanie amoniakiem (16 godzin w 50°C).

c) wytwarzanie dligdnukledtydu o wzorze 1B-1 (r1=R=H, Z=n-CsCH17, a=U=V=W= X=Y=Y'=0, i=1, d=9, d=16) wzór 58 d(GpGpTpGpGpTpGpGpT pT(3 '5 'S)T pTpCpCpTpCpCpT pGpCpGpGpGpApApGpG p-n-C8CH17)

Wychodząc z nośnika o wzorze 7a-2 (B'=Gua^rA , W=O, Z=n-C8CH17), którego przygotowanie jest analogiczne jak w przykładzie IUIb, budowę łańcucha przeprowadza się jak w przykładzie UVb. W tym przypadku do wytworzenia podstawień bardziej podatnych na zasady (jak tu dla Z=n-C8H17) stosuje się korzystnie bardziej labilne aminowe grupy zabezpieczające N -fendktyαzetyl-Ade (Ade^), N-izobutyryl-Cyt (CytI^Bu), N²fenoktyazetyl-Gua (Guaa ), które na końcu syntezy są łatwiejsze do o0tzzzepienla. Po 16 cyklu reakcji przeprowadza się 5 cykli z odczynnikiem o wzorze 14b, aby wprowadzić pożądany spacer (3'5'). Następnie wbudowuje się pozostałych 10 jednostek nukledtydowyzh jak opisano w przykładzie IVa. Odszcbepienie nośnika (1,5 godziny w temperaturze pokojowej) stężonym amoniakiem następuje po 6-godzinnym traktowaniu etylenodiamina/etanol/woda (5:4:1 objętościowo) dla uwolnienia funkcji amino zasad.

d) wytwarzanie dligdnuklsoty0u o wzorze 1A-3 (Ri=wzór 2, R=H, Z=O-i-C3H7, a=U=V=W=X=Y=Y'=Z'=O, e=16, f=9, i=1, r=0) (5'5'S)=p/(CH2CH2O)2CH2CH2p/2

0(i-C3H7-O-pGGTGGTGGTT(5'5'S)TTCCTCCTGCGGGAAGGp-O-i-C3H7)

172 245

Syntezę przeprowadza się najpierw jak w przykładzie IVb, w tym przypadku wychodząc z nośnika 8a-3 (B'Gua- , W=O, Z=O-i-C3H7). Po 16 cyklu reakcji przeprowadza się dwa cykle z odczynnikiem o wzorze 14a, celem wprowadzenia spacera 5'5'. W następnych 10 cyklach wprowadza się jednostki monomeru o wzorze 13a celem koedensazji. Po usunięciu grupy zabezpieczającej 3'-O-DM.Tu, wolna grupa 3'-yydroksy dodanego na końcu nuklektydu G ulega fksforyekwaeiu cyjaeoetyloasy-i-p)opyloayy-fosforamidyerm o wzorze 9 (Ri^NCi-C^H^ r11=OCH2CH2CN, Z=O-i-C3H7) i na koniec zostaje utleniona jodkwkdorem.

e) wytwarzanie oligoeukleotydn o - wzorze 1A-4 (R=H, ^'pso^len, a=U=V=W=X=Y=Y'=O, e=13, f=15, i=1, r=O, R=wzóu 2 w którym Z'=O) d (3' pyk)rlen''--tG*GTpGTpTpTp Gp(JpGpGpGpTpTtGpG(5^/5' Sχ3pTpΑpGpCpCpCpΑ2pΑpCpTp

GpΑpGp-psoralen) (5'5'S)=p3^/(G)5--pMr-(CH2)3-pMr-5'(G)3'p G = wzór 59, w którym a) R'/=R/= wiązanie, albo b) wzór 15, R= DMTR-O i R'=wzór 60, pMe=-O-P-(O)(Me)-O-. Synteza przebiega analogicznie jpk w przykładzie IVc, wychodząc z nośnika o wzorze 8 (B'=GuaPr , Z=pzkrplen, R^Rt^^H©), który uprzednio uzyskano z bisamidynu 6a (B'=GupP^A , R⁵=R=i-C3H7) przez reakcję z psoralenem-H (U. Pieles i U. Eng^ch,

Acid Researzy (1989) 17, 285) analogizzeie jak w przykładzie Ha. Po 13 cyklu reakcji wprowadzono do sprzęgania w 14 cyklu monomer o wzorze 15, w 15 cyklu monomer o wzorze 14z i w 16 cyklu monomer o wzorze 13b. W następnych 16 cyklach ponownie zastosowano do Ιπη-,eypzJi jednostki o wzorze 13a. Po odszzzepirnin grupy 3'-ODMTr, wolną grupę 3'-yydrokyy fosforanuje się pyoralee-foyfo)amidynem o wzorze 9 (R⁹=N(i-C3H))2, R*=OCH2CH2CN, Z=pykralen) i utlenia jodowodorem. Po odyzczepieeiu grup zabezpieczających amoniakiem otrzymuje się kligknnkleotyd o wzorze 1A-4.

f) wytwarzanie oligonnkleotydn o wzorze 1A-5 (r1=R²=H, =-η-08Ηπ, a=U=V=W=X=Y=Y'=O, d=12, e=f=7, i=^1) d(TpTpGpTpGpTpTpTpGpTpGpTpT( 3 '3 'S) TpGpΑpTpTpΑpGpG (5 '5 'S) GpGpTpG pCpCpCpCpGp-n-CsH 1 -) (3'3'S) = p(CH2CH2CH2)p (5'5'S) = jak w przykładzie IVe.

Wytwarzanie przebiega analogicznie jrk IVc, w tym przypadku po 7 cyklu reakcji dla wprowadzenia (5'5'S) przeprowadza się po jednym cyklu z jednostkami o wzorach 15,14c i 13b w podanej kolejności. W następnych 8 cyklach wprowadza się nnklekzyd-5'-fksforamidyey o wzorze 13a. Potem w następnym cyklu wbudowuje się (3'3'S) z monomerem o wzorze 14d w etapie sprzęgania. Pozostałych 13 cykli przeprowadza się tak jak pierwszych 7 z nnkleozyd-3'fkyforrmidyermi. Następnie postępuje się tak jak opisano w przykładzie IVc.

g) wytwarzanie oligonuklektydn o wzorze 1A-6 (R^wzór 2, R =H, Z=fluoresceina, a=U=V=W=X=Y=Y'=Z'=O, e=13, f=15, i=1, r=0) d(3'flno)ez-riaa-pCJpGpApGpApApApGpGpGpGpGpApApGpG(5'5^/S)GpTpTpCpCpC pGpTpTpGpΑpGpΑpGp-Ωuoreyzeiep)

Synteza następuje aaalogiczaiejaa w przykładzie IVe, wychodząc z nośnika o wzorze 7a-5 (B'=GuphP^C, Z=ίΊnoresceiea, W=OC, który analogicznie jak w przykładzie IIIa otrzymano z monomeru o wzorze 8 (B'=Cua^FA ^=flnoreyceina, R⁵=R6=i-C3H7), który uprzednio otrzymano z biyamidyen 6a (B'=Gua^FA , R-R=i-C3H7) przez reakcję z fluoreszeiną-H (Schubert i in., Nucleic Acid Reyea)zh (1991) 18, 3427) analogicznie jak w przykładzie IIp. Po kdyzczepieniu grupy 3'O-DMT) wolną grupę ^-hydroksy fksforyeuJe się foyfo)amidynrm flnoreyzeiny o wzorze 9 (R=N(i-C3H7)2, r1 =OCH2CH2CN, Z=fluoreszeiep) i utlenia jodkwkd.krem. Po kdszczepienin grup zabezpiezzającyzy amoniakiem otrzymuje się kligknukleotyd o wzorze 1A-6.

h) wytwarzanie kligknnkleotydu o wzorze 1B-2 (R !=R²=H, Z=0(CH2CH2O)8(CH2)13CH3. a=U=V=W=X=Y=Y'=O, d=e=15, i=1) (3'5'S) = p(CH2CH2CH2p)4 d(GpCpCpCpCpGpGpGpCpTpTpApApApCpG(3'5'S)CpCpTpTpTpApApCpCpCpCpC pGpCpCpCp-O-(CH2CH2O)8(CH2) 1 )CH))

Wychodząc z nośnika o wzorze 7a-6 (B'=Cyt , W=O, Z= -O-(CH2CH2O)8 (CH2) 1)CH)), który jak opisano w przykładzie IIIa został wytworzony przy pomocy amidynu o wzorze 8k, synteza kligoenkleotydu następuje najpierw analogicznie jak w przykładzie IVb. Po 15 cyklach

172 245 reakcji przeprowadza się 4 cykle z jednostką o wzorze 14d. Pozostałych 16 nukleotydów wbudowuje się jak w przykładzie IVb z 5'-O-DMTr-nukleozydo-3'-fosforamidynami.

Przykład V. Sprawdzanie stabilności wobec nukleaz nmoli badanego oligonukleotydu rozpuszcza się w 450 μΐ 20% płodowej surowicy cielęcej w płynie RPMI i 50 wody bidestylowanej i inkubuje się w 37°C. Następnie natychmiast oraz po 1, 2, 4, 7 i 24 godzinach pobiera się 10 μΐ próbki do elektroforezy w żelu względnie 20 μΐ próbki do HPLC, dla przerwania reakcji dodaje się 5 μΐ lub 10 μΐ formamidu i ogrzewa się 5 minut w 95°C. Do elektroforezy w żelu próbki nanosi się na 15% żel poliakrylamidowy (2% BIS) i rozwija się przy około 3000 woltogodzin. Prążki uwidacznia się barwieniem srebrowym. Do analizy HPLC próbki wstrzykiwano do kolumny HPLC Gen-Pak Fax (firmy Waters/Millipore) i przy przepływie 1 ml/min chromatografowano 5 do 50% buforem A w B (bufor A: 10 mM dwuwodorofosforan sodu, 0,1 M NaCl; w acetonitryl/woda 1:4 objętościowo; bufor B iak A z 1,5 M NaCl).

Przykład VI. Aktywność przeciwwirusowa

Działanie przeciwwirusowe związków według wynalazku sprawdzano w doświadczeniach in vitro. W tym celu związki według wynalazku dodawano w różnych rozcieńczeniach do hodowli komórek HeLa i Vero w płytkach mikrotitracyjnych. Po 3 godzinach hodowle zakażano różnymi wirusami patogennymi dla człowieka (na przykład wirusy opryszczki HSV-1 i HSV-2, ortomyksowirusy grypy A2, pikomawirusy rhinowirus 2). 48 do 72 godziny po zakażeniu wynik terapeutyczny oznaczano na podstawie mikroskopowego efektu cytopatogennego oraz testu czerwieni obojętnej (test barwny według Fintera) fotometrycznie (Finter N. B. w Interferons, N. B. Finter i in, North Holland Publishing Co., Amsterdam 1966). Najmniejsze stężenie, przy którym około połowa komórek zakażonych nie wykazywała efektu cytopatogennego, traktowano jako minimalne stężenie hamujące (MHK).

172 245

172 245

Υ ι

. ''

U-P-G

II

W

WZÓR A

Z-P -X II

W

WZÓR A

172 245

ω «κ

LD

LÓ

WZÓR 1A

172 245

WZOR 1β

172 245

Z- P -Z’ II w

WZOR 2

	U )			f u i
r-	| -p-r-		G	| -Y-P —	-Y’
	II			II
	ί w >	g		1 w	g’

WZOR 3

D - X’ - C H₂C H₂-S(O )_χ - C H₂C H₂- A -T

WZOR 4

HX' - ch₂ - C H₂-S(O )_χ - c h₂c h₂ - A -T WZÓR 4’

172 245

WZÓR 5

R—V

B’

W r r²

8>N-P —N< ₆

WZÓR 6

DMTr-O

O

O

B’

R⁷ I R 8>N-P-N<

R⁶

WZÓR 6 a

172 245

LJJ

O· <

I

CM

X

O i

CM

X

O — LU ω—o 1 co

O

Οι i

O cT¹ ω

I

CM

X

O

CM

X

CL p

N

O:

X

O i

:O i

O i

CM .CM

CL

CM

CM

WZÓR 7a

CL

172 245

R-V

B⁹

2’

W=P ^X’<}y:H₂-SO₂-CH₂CH₂-A-T

WZÓR 7'

DMTr-O-ι o?

Ϊ ^r5

Z-P-N<_r6 WZÓR 8 p9

2”— P<

\_R1O

WZÓR 9

172 245

WZÓR D

B’

2’

H-P -X II

W »θ

,θ

Ζ-Ρ-Χ

II w

WZÓR 12

172 245

R'

R fi/

WZÓR 13 (i-C^H^N

U'

P-0

O - DMTr

WZÓR 13a

R⁵ U’

N-- P

R⁶^ ^(Y”’-G

X’- D)

WZÓR 4

172 245

A 5’·

3’

5'

3^:

WZÓR 15

B 5’— 3’

-o 3

WZÓR 16

C 5’3’Pu

5»-_@ 3«

WZÓR 17

Pu

Py

WZÓR 18

5’

172 245

5’·

Pu

3’<

3’

Py

Py \5⁹

5^;--3^>

Pu

WZÓR 19

WZÓR 20

5’

5’

3’

5’ \j

WZÓR 21

172 245

5’

3’*

5’5’

3'

WZÓR 22

3’·

5’®

WZÓR 23

K 5’3Ή5’5’}

WZÓR 24

172 245

U	—, „ H
!	ka\/
-iG-Y-P-Y-L II 1 W	h$ Rz
WZÓR 25	WZÓR 26

WZÓR 27

172 245

WZÓR 28

WZÓR 29

172 245

WZÓR 32

172 245

ch₃

WZÓR 34

WZÓR 35

172 245

WZOR 36

WZOR 37

O OH O

172 245

(C^k-O

WZÓR 39

Cl-CH₉CHL·

N cl-ch₂ch₂ (CH₂)_x-0

WZÓR 40

- C-R II o

WZÓR 41

172 245

OR

WZÓR 42

OEt

I

O-C-(CH₀)₀- C - N - (CH₀)o-Si - CPG II ^zz 11 I I

O OH OEt

WZÓR 43

- O - C -(C H,),- C - N - TentaGel II ^zz II I O OH

WZÓR 44

O

II

-O- P -O-TentaGel I och₂-ch₂-cn

WZÓR 45

172 245

WZÓR 47 (CH₂)2, -0-

WZÓR 48

172 245

Cl

WZOR 49

O-CH₂-CH-CH₂-ODMTr o-ch₂-c₆h₅

WZÓR 50

0CH₂CHCH₂-0-DMTr o-ich₂)₁₇ch₃

WZÓR 51

172 245

3’....GCAGGTACAGCCGTTTGTCGA... 5’ RNA-target I I I I I I l I I I I I I I I I I I I I I

3* CGT CCATGTC GGCAAACAGCT 3’ ( ) (5’5^?S)

WZÓR 52

3’/TTGGTGGTGG 5'

3’....CTCCTG(cAAGGAGGAĆGCCCT TC CG.... 5-target V I I I I I I I I I I I I I I I l I XTCCTCCTGCGGGAAGG (3’5’S) 5’ 3’

WZÓR 53

172 245

TGGTGGTGG 3’

3’... CTCCTGiCAAGGAGGAĆGCCCTTCCG... 5’-target II I I I I I I I I I I I I I I I (5’5’S) ^XT T C C TCC TGCGGGAAGG

5’ 3’

WZÓR 54 (AdE1b) 5'

3’

GGGCGGGGCTTAAAGG^ (3'5’S)

CCCGCCCCGAATT T CC—⁷

WZÓR 55

172 245

3’

I

G

G

T

G

T

T

T

G

G

G

G

G

T

T

G

5’G

5’ 3’

A - T G- C G -C A - T C - G A - T A - T A - T G - C T -A G -C C - G G - C A - T A - T C - G G - C <£>

LD

C - G T - A T

C - G G 2 δ

£ -a

T A C -G A ^C-1 -A ś· ś tarqet

5·

T

G

G

G

G

G

T

G i

3’

HSV-1 (origin)

CL

O

IN

172 245

5’ 3'

T -A	0
τ	©
C -G	©
T A	9
Ć -G	&
A - T	&
I A	0
i Ά	0
Ć -G	0
I Ά	©
T -A	0
C -G73

G»C G ® G

G

Τ

Τ τ

G

C

C

C τ

G

C

C

C

G<

G¹

Α¹

C

G

G

G

G 5’

G

Τ >G »G Ό »G

3’ 5’ 3’ target

ΑΡΡ 770 (Alzheimer)

WZÓR 57

172 245 (3’5’S) = p(CH₂CHCH₂p)₅

OCH„C,H_c 2 6 5

WZÓR

O-P-N(iC₃H₇)2

OlCh^^CN

WZÓR 59

WZÓR 60

U'

I

DMTr-X’-G’-Y'-P

NR⁵R⁶

WZÓR 61

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz. Cena 6,00 zł

Claims (8)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób wytwarzania analogów oligonukleotydów 3'-podstawionych grupami nienukleotydowymi o wzorze 1A i IB, jak również ich fizjologicznie tolerowanych soli, w którym R¹ oznacza wodór, Ci-Ci8-alkil, C2-Ci8-alkenyl, C2-Ci8-alkinyl, C2-Ci8-alkilokarbonyl, C3-C19alkenylokarbonyl, C3-Ci9-alkinylokarbonyl, C6-C20-aryl, (C6-Ci4)-arylo-(Ci-C8)-alkil, albo rodnik o wzorze 2;

   R oznacza wodór, grupę hydroksy, Ci-Ci8-alkoksy, chlorowiec, azydo albo NH2;

   B oznacza zasadę zwykłą w chemii nukleotydów, a oznacza oksy albo metylen;

   d, e, f niezależnie od siebie oznaczają liczbę całkowitą od 0 do 50, ljest liczbą całkowitą od 1 do 10, r oznacza liczbę całkowitą 0 lub 1, z tym, że jeśli r jest równe 0, to

   V = Y', a jeśli i jest większe niż 1, r = 1;

   W oznacza grupy okso, selenokso lub tiokso;

   V oznacza oksy, sulfandiyl albo imino;

   V oznacza oksy, sulfandiyl, imino albo metylen,

   Y' oznacza oksy, sulfandiyl, imino, (CH2)m albo V(CH2)m, przy czym m oznacza liczbę całkowitą od 1 do 18,

   X oznacza hydroksy albo merkapto;

   U oznacza hydroksy. merkapto, SeH, Ci-Ci8-alkoksy, Ci-Ci8-alkil, Có-C20-aryl, (C6-C14)arylo-(Ci-C8)-alkil, NHR³, NR³R⁴ albo rodnik o wzorze (OCH2CH2)pO(CH2)qCH2R^lł, gdzie R³ oznacza Ci-Ci8-alkil korzystnie Ci-Cs-alkil, C6-C20-aryl, (C6-Ci4)-arylo-(Ci-C8)-alkil, -(CH2)c-/NH(CH2)c/d-NR¹²R , gdzie c jest liczbą całkowitą od 2 do 6, zaś d jest liczbą całkowitą od 0 do 6, a R¹² niezależnie od siebie oznacza wodór albo Ci-C6-alkil albo Ci-Cą-alkoksy-Ci-C6-alkil, R^oznacza C1 -C18-alkil, C6-C20-aryl albo (C6-Cio)-arylo-(Ci-C8)-alkil, albo w przypadku NR κ razem z atomem azotu do którego są one przyłączone oznacza 56-członowy pierścień heterocykliczny, który dodatkowo może zawierać dalszy heteroatom z szeregu O, S, N, p jest liczbą całkowitą od 1 do 100; q jest liczbą całkowitą od 0 do 18;

   R¹¹ oznacza wodór albo grupę funkcjonalną;

   S oznacza grupę o wzorze 3, w którym g i g' są liczbami całkowitymi zero albo 1; h jest liczbą całkowitą od zera do 10;

   G oznacza Ci-Ci2-alkilen, przy czym alkilen może ewentualnie być podstawiony przez chlorowiec, amino, hydroksy, Ci-Ci8-alkil, Ci-Ci8-alkoksy, Ci-Ci8-alkilokarbonyloksy, C6-C14aryl, C6-Ci4-arylo-Ci-Ci8-alkil albo przez C6-Ci4-arylo-Ci-C8-alkoksy; dalej oznacza C6-C14aryło-di-Ci-Cs-alkilen, Có-Ci8-arylen grupy o wzorze (CH2CH2V)_a - CH2CH2 albo (CH2V)_aCH2, gdzie a jest liczbą całkowitą od 1 do 11, jednostki o wzorze 25 gdzie β oznacza liczbę całkowitą od 1 do 6; albo grapy o wzorze 26, Z = Z' oznaczają hydroksy, merkąpto, SeH, Ci-C22-alkoksy, -O-(CH2lb-NR¹²R , gdzie b jest liczbą całkowitą od 1 do 6, a R oznacza Ci-C6-alkil, albo R¹² i R³ razem z atomem azotu do którego są one przyłączone tworzą 3- do 6-członowy pierścień, Ci-Ci8-alkil, Ci-Cs-alkil, C6-C20-aryl, (C6-Ci4)-arylo-(Ci-C8)-alkil, (C6-Ci4)-arylo-(Ci-C8)-alkoksy, przy czym aryl oznacza także heteroaryl i aryl ewentualnie jest podstawiony przez 1, 2 albo 3 takie same lub różne rodniki z szeregu karboksy, amino, nitro, Ci-Ca-alkiloamino, hydroksy, chlorowiec i przez cyjano, Ci-Ci8-alkilomerkapto, NHR³, NHR³R⁴, rodnik o wzorze 3, albo oznacza grupę, która ułatwia wewnątrzkomórkowe wchłania172 245 nie, albo służy jako znacznik (marker) sondy DNA, albo przy hybrydyzacji analogu oligonukleotydu z docelowym kwasem nukleinowym atakuje ten ostatni przez wiązanie, poprzeczne usieciowanie albo rozszczepienie; wygięty nawias w pozycji 2'- i 3'- oznacza, że R² i sąsiedni rodnik fosforylowy mogą być w pozycji odwróconej 3' i 2', przy czym każdy nukleotyd może występować w swojej konfiguracji D albo L, zaś zasada B może się znajdować w pozycji a lub (3, znamienny tym, że sprzęga się znanymi technikami sprzęgania, stopniowo, w ilości i w kolejności wynikającej z układu sekwencji we wzorze produktu, jednostkę nukleotydową z 3'(2')końcową grupą fosforową (V) i wolną grupą 5'-hydroksy albo merkapto o wzorze A', w którym R', V, a, B, Y, R², U i W mają wyżej podane znaczenia a G oznacza grupę odszczepialną z następną jednostką nukleotydową z 3'(2')-końcową grupą fosforową (III) lub grupą fosforową (V) lub jej aktywowaną pochodną albo z odczynnikiem wprowadzającym grupy spacer (3'3'S), (5',5',S) lub (3',5',S) i w dalszym cyklu jednostka nukleotydowa z 3'(2')- względnie 5'-końcową grupą fosforową (III) lub grupą fosforową (V), albo jej aktywowana pochodna reaguje z dalszą jednostką nukleotydowa z 5'- względnie 3'(2')-końcową wolną grupą hydroksy albo merkapto o wzorze A, w którym V, a, B, Y', R, Z, W, X' mają wyżej podane znaczenia R oznacza grupę zabezpieczającą albo

   b) analogi oligonukleotydów buduje się je taki sam sposób poórzez fragmenty nukleotydów wyżej wskazane i w oligooukleotydach otrzymanych według (a) lub (b) grupy zabezpieczające wprowadaooó czasowo dla zabezpieczenia innych funkcji zostają odszczepiooe, i tak otrzymane analogi eligooukleetydów o wzorze 1A i 1D ewentualnie przeprowadza się w ich fizjologicznie tolerowane pele.
2. 2. Sposób według zasto. 1, znamienny tym, że stosuje się jednostki oukleetydewg w których zasada B znajduje się w pozycji β, ouklgotydy występują w konfiguracji D, R znajduje się w pozycji 2', zaś o oznacza grupę oksy.
3. 3. Sposób według aabtrz. 1, aoamióooy tym, że stotujg się jednostki oukleotydowó, w których rS oznacza wodór, Ci-C6-alkil, zwłaszcza metyl, albo rodnik o wzorze 2.

   R² oznacza wodór albo grupę hydroksy, zwłaszcza wodór. m oznacza liczbę całkowitą od 1 do 6, szczególnie 1;

   U oznacza grupę hydroksy, mgrkapte, C1-C6-alkil, NR³r4 albo NHR³, zwłaszcza hydroksy lub C1-C6-alkil, przy czym rS oznacza C1-C8-alkil, zwłaszcza C1-C4-alkil, albo metoksyótyl, B, W, V, Y, Y', X i Z mają wyżej podane znaczenie, przy czym sprzęgo się jednostki nukleetydewe w ilości d, ó i f równej liczbie całkowitej od 5 do 15 i w ilości i równej liczbie całkowitej od 1 do 3.
4. 4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się jednostki oukleotydowg, w których V, Y i Y' oznaczają grupę oksy.
5. 5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się jednostki nukleotydowe, w których W oznacza grupę okso.
6. 6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się jednostki nuldeetydewe, w których U oznacza grupę hydroksy.
7. 7. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się jednostki nukleotydowe, w których R ¹ oznacza wodór.
8. 8. Sposób według zastrz. 1, aoamigooy tym, że stosuje się jednostki nukleotydowe z grupą fosforu wprowadzona czynnikiem fosforującym o wzorze ogólnym 61, w którym podstawnik R⁵ i rS* niezależnie od siebie oznaczają alkil C1-C12 lub oba podstawniki tworzą razem pierścień 5-6 członowy, DMTr oznacza grupę dimetoktytritylewą, X' = Y' i oznacza grupę oksy lub tulfandiylową, U' oznacza alkil C1-C4 lub grupę hydroksylową w postaci zabezpieczonej G' oznacza grupę (CH2CH2O)«CH2CH2 lub CH2CH(oR')CH2, w których R' oznacza alkil-C1-C18; aryl-C6-C14 lub C6-C14-arylo-C1-Cs-alkil, a α oznacza liczbę całkowitą 1-11.

   Niniejszy wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania analogów' oligonukleotydów 3'-pedstawionych grupami nigoukleotydewyml o cennych właściwościach fizycznych, biologicznych

   172 245 i farmakologicznych, oraz sposobu ich wytwarzania. Ich zastosowanie odnosi się do użycia ich jako inhibitorów ekspresji genów (oligonukleotydy nonsensowne, rybozymy, oligonukleotydy sensowne i oligonukleotydy tworzące trypleksy), jako sondy w badaniu kwasów nukleinowych, oraz jako środki pomocnicze w biologii molekularnej.

   Oligonukleotydy znajdują rosnące zastosowanie jako inhibitory ekspresji genów (G. Zon, Pharmaceutical Research 5, 539 (1988); J. S. Cohen, Topics in Molecular and Structural 12 (1989) Macmillan Press; C. Helene i J. J. Toulme, Biochemica et Biophysica Acta 1049, 99 (1990); E. Uhlmann i A. Peyman, Chemical Reviews 90, 543 (1990). Oligonukleotydy nonsensowne są fragmentami kwasów nukleinowych, których sekwencja zasad jest komplementarna do mRNA, który ma być hamowany. Ten docelowy mRNA może pochodzić z komórek, wirusów lub innych patogenów. Jako komórkowe sekwencje docelowe wchodzą w rachubę na przykład sekwencje receptorów, enyzmów, immunomodulatorów, kanalików jonowych lub onkogenów. Hamowanie namnażania się wirusów przy pomocy oligonukleotydów nonsensownych zostało opisane na przykład dla RSV (wirus mięsaka Rousa), HSV-1 i HSV-2 (wirus opryszczki zwykłej typ I i U), HTV (ludzki wirus niewydolności immunologicznej) i wirusów grypy. Przy tym używa się oligonukleotydy które są komplementarne do wirusowych kwasów nukleinowych. Natomiast oligonukleotydy sensowne są w swojej sekwencji tak pomyślane, że na przykład wiążą one ('wychwytują) białka wiążące się z kwasami nukleinowymi albo enzymy działające na kwasy nukleinowe i w ten sposób hamują ich aktywność biologiczną. (Helene, 1990). Jako wirusowe elementy docelowe trzeba tu wymienić odwrotną transkryptazę, polimerazę dNa i białko - transaktywator.

   Dla oligonukleotydów tworzących trypleksy na ogół docelowy jest DNA i po związaniu się z nim tworzą one strukturę potrójnej spirali. Podczas gdy przy pomocy oligonukleotydów nonsensownych hamowane są na ogół przemiany mRNA (rozszczepienie itd.) albo jego translacja do białek, oligonukleotydy tworzące trypleksy hamują transkrypcję lub replikację DNA (Helene i in., 1990; Uhlmann i Peyman 1990). Jest jednak także możliwe w pierwszej hybrydyzacji wiązanie jednoniciowego kwasu nukleinowego z oligonukleotydem nonsensownym, z wytworzeniem podwójnej nici, która następnie w drugiej hybrydyzacji z oligonukleotydem tworzącym trypleks wytwarza strukturę potrójnej spirali. Nonsensowne i trypleksowe regiony wiązania mogą przy tym być umiejscowione w dwu oddzielnych nukleotydach albo w jednym. Dalszym zastosowaniem syntetycznych oligonukleotydów są tak zwane rybozymy, które dzięki swej aktywności rybonukłeazy niszczą docelowy RNA (J. J. Rossi i N. Sarver, TdStEcH 8,179,1990).

   W rozpoznawaniu DNA stosuje się odpowiednio znakowane fragmenty kwasu nukleinowego, jako tak zwane sondy DNA albo próby DNA do swoistej hybrydyzacji z badanym kwasem nukleinowym. Swoiste wytworzenie nowej podwójnej nici śledzi się przy tym przy pomocy znakowania które przeważnie jest nieradioaktywne. Ten sposób pozwala badać choroby genetyczne, złośliwe, wirusowe albo wywołane innymi patogenami.

   Dla większości wymienionych zastosowań oligonukleotydy występujące w postaci naturalnej są mało przydatne lub całkowicie nieprzydatne. Muszą one zostać chemicznie zmodyfikowane tak, żeby odpowiadały specjalnym wymaganiom. Aby oligonukleotydy mogły być stosowane w układach biologicznych, na przykład do hamowania namnażania się wirusów, muszą spełniać następujące warunki:

   1. Muszą one w warunkach in vivo, zarówno w surowicy jak również wewnątrzkomórkowo, wykazywać wystarczająco dużą stabilność.

   2. Muszą one być w takim stanie, aby mogły przechodzić przez błonę komórkową i jądrową.

   3. Muszą one w warunkach fizjologicznych w sposób swoisty wiązać się z zasadami swego docelowego kwasu nukleinowego, aby rozwinąć efekt inhibicyjny.

   Dla sond DNA te warunki nie są nieodzowne; jednak te oligonukleotydy muszą być tak podstawione, aby było możliwe badanie przy pomocy fluorescencji, chemiluminescencji, kolorymetrii albo swoistego barwienia (Beck i Koster, Anal. Chem. 62, 2258 (1990)).

   Zmiana chemiczna oligonukleotydu następuje przeważnie w ten sposób, że rdzeń fosforanowy, jednostka rybozy lub zasady nukleinowe zostają odpowiednio zmienione (Cohen 1989; Uhlmann i Peyman 1990). Inną często stosowaną metodą jest wytworzenie 5'-konjugatów

   172 245 oligonukleotydu przez przetworzenie grupy 5'-hyd^^ikisylowej odpowiednimi odczynnikami fosforylacji. Oligonukleotydy zmodyfikowane tylko na końcu 5' mają tę wadę, że zostają rozłożone w surowicy. Jednak gdy wszystkie intemukleotydowe reszty fosforanowe zostają zmienione, zmieniają się często drastycznie właściwości oligonukleotydu. Na przykład rozpuszczalność w środowisku wodnym oligonukleotydu metylofosfonianowego jest zmniejszona i zredukowana jest jego zdolność hybrydyzacji. Oligonukleotydy fosforotionowe (Phosphothioat-Oligonukleotide) działają niespecyficznie, tak że na przykład również homooligomery są skuteczne przeciw wirusom.

   Oligonukleotydy nonsensowne ogólnie biorąc posiadają jednolitą polamość, która przy hybrydyzacji z RNA przeważnie przybiera charakter przeciwrównoległy (patrz Tabela I, A). W określonych przypadkach, na przykład przy oligonukleotydach zbudowanych z jednostek α-nukleozydowych, polarność może także być równoległa (Tabela I, B). Oligonukleotydy tworzące trypleksy mogą hybrydyzować z dwuniciowymi kwasami nukleinowymi, na ogół zależnie od sekwencji z orientacją równoległą (Tabela I, C) albo przeciwrównoległą (Tabela I, D) w odniesieniu do nici kwasu nukleinowego bogatej w puryny. Przy tym wykorzystywane są głównie elementy parowania zasad T*AT, G*GC, C^+eGC, G•TA, C: °CC, Α·ΑΤ i cP°^oCC, w których C+ oznacza protonowaną resztę cytozyny, C^Me oznacza resztę 5-metylocytozyny, C^P1 oznacza resztę pseudoizocytozyny a o oznacza parowanie zasad Hoogsteena albo odwrotne parowanie zasad Hoogsteena. Jednak zastosowanie tego parowania zasad Hoogsteena ogranicza się do bogatych w puryny regionów dwuniciowych kwasów nukleinowych.

   Aby podwyższyć zmienność oligonukleotydów tworzących trypleksy w odniesieniu do obfitujących w puryny sekwencji docelowych, wytworzono oligonukleotydy o zmiennej polarności, które na zasadzie zmiany nici (5'5') (Tabela I, E) lub zmiany nici (3'3'), które ewentualnie mogą się wymienić (T abela I, F), w danym przypadku mogą się wiązać z bogatą w puryny okolicą nici przeciwległej (Ono i in., Biochemistry (1991) 30, 9914). Zmiana nici przy zachowaniu polarności jest możliwa, gdy wbuduje się spacer (3'5').

   Jest dalej możliwe, przy pomocy pętli (5'5') (Tabela I, G) albo (3'5') albo (2'5'), wytworzyć specjalne oligonukleotydy, w których jeden region rozpoznaje przez parowanie zasad WatsonaCrickajedną nić kwasu nukleinowego, a drugi region rozpoznaje drugą nić kwasu nukleinowego, wynikającą z parowania zasad Watsona-Cricka, przez parowanie zasad Hoogsteena. Stąd przy pomocy takich nonsensownych/trypleksowych analogów oligonukleotydów można budować trypleks na jednoniciowych kwasach nukleinowych. W podobny sposób da się wytworzyć dwuniciowe oligonukleotydy sensowne, które w sposób swoisty do sekwencji wiążą białka wiążące DNA, przez wewnątrzcząsteczkowe parowanie zasad Watsona-Cricka (Tabela I, I).

   Na koniec można wytworzyć oligonukleotydy, które na końcu 5' zawierają spacer (5'5') (Tabela I, K). W tych analogach oligonukleotydów oba końce 3'(2') mogą korzystnie zawierać grupy fosforylowe.

   Tabela I. Schematyczne przedstawienie możliwych zasad działania

   A. Wzór 15 - przeciwrównolegle

   B. Wzór 16 - równolegle

   C. Wzór 17 - równolegle do nici bogatej w puryny

   D. Wzór 18 - przeciwrównolegle do nici bogatej w puryny

   E. Wzór 19 - zmienna polarność ze zmianą nici (5' 5')

   F. Wzór 20 - zmienna polarność ze zmianą nici (5' 5') i (3' 3')

   G. Wzór 21 - Oligonukleotyd nonsensowny/tryplcksowy z pętlą (5', 5')

   H. Wzór 22 - Oligonukleotyd nonsensowny/trypleksowy z pętlą (3', 5')

   I. Wzór 23 - Oligonukleotyd sensowny

   K. Wzór 24 - Oligonukleotyd nonsensowny z dwoma końcami możliwymi do podstwienia.

   Dotychczas znane analogi oligonukleotydów, które podlegają zasadom działania przedstawionym w Tabeli IC-I, posiadają na ogół na końcu 3' grupę hydroksylową, tak że rozkładają się one w surowicy, przeważnie źle przechodzą przez błony i dają się łatwo podstawić tylko na końcu 5'.

   172 245

   Zadanie polega więc na tym, aby postawić do dyspozycji analogi oligonukleotydów o swoistych cechach hybrydyzacji wobec jedno- i dwuniciowych kwasów nukleinowych, zwiększonej stabilności w surowicy, dobrej rozpuszczalności i swoistym działaniu.

   Przedmiot wynalazku dotyczy sposobu wytwarzania analogów oligonukleotydów o wzorze 1A i wzorze 1B, oraz ich fizjologicznie tolerowanych soli, w których

   R¹ oznacza wodór, C1-C18-alkil, korzystnie C1-C6-alkil, C2-Ci8-alkenyl, C2-C18-alkinyl, C2-C18-alkilokarbonyl, C3-C19-alkenylokarbonyl, C3-C19-alkinylokarbonyl, C6-C20-aryl, (C6-C14)-arylo-(C1-C 8)-alkil, albo rodnik o wzorze 2;

   R ² oznacza wodór, grupę hydroksy, C1-C18-alkoksy, chlorowiec, azydo albo NH2;

   B oznacza zasadę zwykłą w chemii nukleotydów, na przykład naturalne zasady jak adenina, cytozyna, guanina i tymina, albo zasady nienaturalne jak puryna, 2,6-diaminopuryna, 7-deazaadenina, 7-deazaguanina, N⁴N-etanocytozyna, N iN -etano-2A-diamiru)puryna, 5metylocytozyna, pseudoizocytozyna;

   a oznacza oksy albo metylen;

   d, e, f niezależnie od siebie oznaczają liczbę całkowitą od 0 do 50, korzystnie 5 do 15; i jest 1 iczbą całkowitą od 1 do 10, korrystnńe 1 do 3; r oznacza liczbę całkowitą 0 lub 1, z tym, że jeśli r jest równe 0,

   V = Y', a jeśli i jest większe niż 1, r = 1;

   W oznacza okso, seleno^o lub bokso;

   V oznacza oksy, sulfandiyl albo imino;

   V oznacza oksy, sulfandiyl, imino albo metylen,

   Y' oznacza oksy, sulfandiyl, imino, (CH2)m albo V(CH2)m, przy czym m oznacza liczbę całkowitą od 1 do 18, korzystnie 1 do 6;

   X oznacza hydroksy albo merkapto;

   U oznacza hyOroksy, merkapto, SeH, C1-C18-alkoksy, korzystnie Ci-C6-alkdksy, C1-C18-akfl, korzystnie C1-C6-alkil, Có-C20-aryl, (Cn-Co 4)-^710-(^^8 l-alkil, NHR³, NHR³r4 albo rodnik o wzorze (OCH2CH2)pO(CH2)qCH2R , w którym

   R³ oznaczaCj-C^-alkil korzystnie C1-C8-alkil, Cp-Cyo-aryl, (C6-C14)-arylo-(C1-C8)-alkil, -(CH2)z-/NH(CH2)z/o-NRl2R , gdzie c oznacza liczbę całkowitą od 2 do 6, a d oznacza liczbę całkowitą od 0 do 6, a R ¹² niezależnie od siebie oznacza wodór albo C1-C6-alkil albo C1-C4-alkoksy-Ci-C6-alkil, korzystnie metoksyetyl;

   R⁴ oznacza C1-C18-alkil, korzystnie C1-C8-alkil, a szczególnie korzystnie C1-C4-alkil, C6-C20-aryl albo (C6-Ci0)-arylo-(Ci-C8)-alkil, albo w przypadku NR³r4 razem z R i atomem azotu do którego jest on przyłączony oznacza 5-6-Zbłdndwy pierścień heterocykliczny, który dodatkowo może zawierać dalszy heteroatom z szeregu O, S, N;

   P jest liczbą całkowitą od 1 do 100, korzystnie od 3 do 20, a szczególnie korzystne 3 do 8;

   Ojest liczbą całkowitą od 0 do 18, korzystnie 0 do 15;

   R ^ri oznacza wodór albo grupę funkcjonalną jak hydroksy, amino, NHr13, COOH, CONH2, COOR¹² lub chlorowiec, gdzie R ¹² oznacza C1-C4-alkil, zwłaszcza metyl;

   S oznacza grupę o wzorze 3, w którym g i g' są liczbami całkowitymi 0 albo 1, h jest liczbą całkowitą od 0 do 10,

   G oznacza Ck^-alkilen, korzystnie C2-C4-alkilen, przy czym alkilen ewentualnie może być podstawiony przez chlorowiec, amino, hydroksy, CkC18-alkil, Ck^-alkoksy, C1-C18alkilokarbonyloksy, C6-C14-aryl, Có-C 14-arylo-CkC 10-alkil albo przez Cp-C 14-arylo-C1-C8-alkoksy; C6-Ci4-arylo-di-Ci-C8-alkilsn, C6-C18-arylen grupy o wzorze (CH2CH2V)«CH2CH2 albo (CH2V)aCH2, w którym a oznacza liczbę całkowitą od 1 do 11, korzystnie 1 do 5, jednostki o wzorze 25, w którym (3 oznacza liczbę całkowitą od 1 do 6, albo grupy o wzorze 26;

   Z = Z' oznaczają hydroksy, merkapto, SeH, C.kC22-al koksy, korzystnie C6-Ci8-alkdkty, -O-(CH₁2)b-NRi²Ri , gdzie b jest liczbą całkowitą od 1 do 6, a Rⁿ oznacza CkCe-alkil, albo r12 i R° razem z atomem azotu do którego są one przyłączone tworzą pierścień 3- h-członowy CkC^-alkil, korzystnie C1-C8-alkil, C6-C20-aryl, (C6-Ci4)-arylo-(CkC8)-αlkil, korzystnie (C6-Ci0)-arylo-(Ci-C4)-alkil, (C6-C14)-arylo-(C1-C8)-alkoksy, korzystnie (0(,-^())^010(04C4)-alkoksy, przy czym aryl oznacza także heteroaryl, zaś aryl ewentualnie jest podstawiony

   172 245 przez 1, 2 lub 3 takie same albo różne rodniki z szeregu karboksy, amipo^mtro, Ci-C4-alkiloamino, hydroksy, chlorowiec i cyjano; C1-Ci8-alkilomerkapto, NHR3 NR'R.4, rodnik o wzorze 3, albo oznacza grupę, która ułatwia wewnątrzkomórkowe wchłanianie, albo służy jako znacznik (marker) sondy DNA, albo przy hybrydyzacji analogu oligonukleotydu z docelowym kwasem nukleinowym atakuje ten ostatni przez wiązanie, poprzeczne usieciowanie albo rozszczepienie; wygięty nawias w pozycji 2'- i 3'- oznacza, że R² i sąsiedni rodnik fosforylowy mogą się znajdować w pozycji odwróconej 3' i 2', przy czym każdy nukleotyd może występować w swojej konfiguracji D lub L, a zasada B może się znajdować w pozycji α względnie β.

   Korzystne są analogi oligonukleotydów o wzorze 1A i 1B, w których zasada B znajduje się w pozycji β, nukleotydy występują w konfiguracji D, R² znajduje się w pozycji 2' i a oznacza oksy.

   Korzystne są zwłaszcza analogi oligonukleotydów o wzorze 1A i 1B, w których

   Ri oznacza wodór, Ci-C6-alkil, szczególnie metyl, albo resztę o wzorze 2;

   R² oznacza wodór lub hydroksy, szczególnie wodór; d, e i f oznaczają liczbę całkowitą od 5 do 15; i oznacza liczbę całkowitą od 1 do 3; m oznacza liczbę całkowitą od 1 do 6, korzystnie 1;

   U oznacza hydroksy, merkapto, C1-C6-alkoksy, C1-C6-alkil, NR³r4 albo NHR³, korzystnie hydroksy lub C1-C6-alkil, przy czym R oznacza C1-Cs-alkil, korzystnie C1-C4-alkil, albo metoksyetyl, a B, W, V, Y, Y', X i Z mają wyżej podane znaczenie.

   Szczególnie korzystne są analogi oligonukleotydów o wzorze 1A i 1B, w których V, Y' i

   Y oznaczają oksy.

   Następnie szczególnie korzystne są analogi oligonukleotydów o wzorze 1A i 1B, w których

   V, Y, Y' i W oznaczają oksy lub okso.

   Zwłaszcza korzystne są analogi oligonukleotydów o wzorze 1A i 1B, w których V, Y, Y', W i U oznaczają oksy, okso lub hydroksy.

   Dalej korzystne są analogi oligonukleotydów o wzorze 1A i 1B, w których r1 oznacza wodór.

   Szczególnie korzystne są analogi oligonukleotydów o wzorze 1A i 1B, w których U, V,

   W, X, Y' i Y oznaczają oksy, okso lub hydroksy, a R ¹ oznacza wodór.

   Szczególnie bardzo korzystne są oligonukleotydy o wzorze 1A, w którym r jest równe 0,

   V równa się Y' a r1 ma znaczenie wzoru 2.

   Powtarzające się rodniki jak R², B, a, d, e, f, g, g', h, W, V, Y, Y', U, R³, r4, p, q, G i Z mogą niezależnie od siebie mieć takie same lub różne znaczenia, to znaczy na przykład V oznacza niezależnie oksy, sulfandiyl albo imino.

   Chlorowiec oznacza przede wszystkim fluor, chlor albo brom.

   Przez heteroaryl należy rozumieć rodnik monocyklicznego albo bicyklicznego heteroaromatu, który w układzie pierścieni zawiera jeden lub dwa atomy N i/lub atom S albo O.

   Przykładem grup, które ułatwiają wewnątrzkomórkowe wchłanianie, są różne rodniki lipofilowe jak -O-(CH2)x-CH3, w którym x oznacza liczbę całkowitą od 6 do 18, -O-(CH2)nCH=CH-(CH2)m-CH3, w którym n i m niezależnie od siebie oznaczają liczbę całkowitą od 6 do 12, -O-(CH2CH2O)4-(CH2)9-CH3, -O-(CH2CH2O)8-(CH2)13-CH3 oraz -O-(CH2CH2O)7-(CH2)15-CH3, ale także rodniki sterydowe jak cholesteryl, oraz konjugaty, które wykorzystują naturalne układy nośników jak kwasy żółciowe, kwas foliowy, 2-(N-alkil, N-alkoksy)-aminoantrachinon, oraz konjugaty mannozy i peptydów odpowiednich receptorów, które prowadzą do endocytozy oligonukleotydów za pośrednictwem receptorów, jak EGF (Epidermal Growth Factor - naskórkowy czynnik wzrostu), bradykinina i PDGF (Platelet Derived Growth Factor - czynnik wzrostu pochodzący z płytek krwi). Przez grupy znacznikowe (markery) należy rozumieć grupy fluoryzujące, na przykład pochodne dansylu (=D-Dimetylo-1-aminonaftylo-5-sulfonyl-), fluoresceiny albo kumaryny, albo grupy chemiluminescencyjne na przykład pochodne akrydyny; należą tu także dający się wykryć testem ELISA układ digoksygeniny, grupa biotyny dająca się wykryć w układzie awidyna) biotyna, ale także łączniki (Linker-Arme) z grupami funkcjonalnymi, które pozwalają na dodatkowe podstawienie grupami znakującymi (Reporter-Gruppen), na przykład łącznik aminoalkilowy który przy pomocy aktywnego estru akrydyniowego przekształca się w próbę chemiluminescencyjną. Typowymi grupami znakującymi są: pochodna fluoresceiny o wzorze 27, ester akry dyniowy o wzorze 28, pochodna fluoresceiny o wzorze 29 (x = 2 - 18,

   172 245 korzystnie 4; R = H albo C1-C4-alkil; (= fluoresceina dla x = 4 i R = CH3), konjugat biotyny o wzorze 30 (= biotyna dla R = Fmoc; R = H albo aminowa grupa zabezpieczająca), konjugat digoksygeniny i wzorze 31.

   Analogi oligonukleotydów, które wiążą się lub wstawiają z kwasami nukleinowymi i/lub je rozszczepiają albo dają poprzeczne usieciowanie, obejmują na przykład konjugaty akrydyny, psoralenu, fenantrydyny, naftochinonu, daunomycyny albo chloroetyloaminoarylu. Typowymi rodnikami wstawiającymi się i dającymi poprzeczne usieciowanie są: pochodna akrydyny o wzorze 32 (x = 2 - 12, korzystnie 4), rodnik o wzorze 33 (x = 2 - 12, korzystnie 4), trimetylopsoralen o wzorze 34 (x = NH albo -O-) (=psoralen dla X = 0), konjugat fenantroliny o wzorze 35, konjugat psoralenu o wzorze 36, konjugat naftochinonu o wzorze 37, pochodna daunomycyny o wzorze 38, rodnik o wzorze 39 (x = 1 - 18, X = alkil, chlorowiec, NO2, CN, grupa o wzorze 41), rodnik o wzorze 40 (x = 1 - 18, X = alkil, chlorowiec, NO 2, CN, grupa o wzorze 41). 34

   Jako przykłady grup NR'R⁴, w których R ³ i R⁴ razem z atomem azotu, do którego są one przyłączone tworzą 5- do 6-członowy pierścień heterocykliczny, który dodatkowo zawiera dalszy heteroatom, niech będą wymienione rodniki morfolinylo- i imidazolidynylo.

   Wynalazek nie ogranicza się do α- i β—D- względnie L-rybofuranozydu i α- i β-Dwzględnie L-dezoksyrybofuranozydu oraz odpowiednich analogów karbocyklicznych o pięciu pierścieniach. Odnosi się on natomiast także do analogów nukleotydów, które są zbudowane z innych składników cukrowych, na przykład cukru o rozszerzonym lub zwężonym pierścieniu, pochodnych cukrowych acyklicznych albo określonego innego rodzaju. Dalej wynalazek nie ogranicza się do przytoczonych przykładowo pochodnych reszt fosforanowych o wzorze 1A i 1B, ale odnosi się także do znanych pochodnych defosfo.

   Analogi oligonukleotydów o wzorze 1A posiadają jedną grupę wydłużającą łańcuch lub więcej 5'5' (5'5'S) i ewentualnie jedną lub więcej takich grup 3'3' (3'3'S) albo grupy 2'2', które w danym przypadku wywołują zmianę polarności. Analogi oligonukleotydów o wzorze 1B posiadają grupę wydłużającą łańcuch 3'5' (3'5'S) albo (2'5'S), który nie wpływa na polarność ale pozwala na fałdowanie się analogu oligonukleotydu albo wymianę nici.

   Przykładami S są fosforan propan-1,3-diolu, fosforan 2-benzyl- względnie 2-oktadecyloksypropan-1,3-diolu, fosforan trójctylenoglikolu lub heksaetylenoglikolu, które ewentualnie mogą się również powtarzać. Analogi nukleotydów bez zasady heterocyklicznej i reszt fenylenodialkilenowych są dalszymi korzystnymi postaciami realizacji S, zwłaszcza (3'3'S). Ogólnie biorąc, ze względów topologicznych (5'5'S) jest dłuższy od (3'3'S). I tak (5'5'S) posiada co najmniej 20 do45, korzystnie 24 do 36, wiązań nierozgałęzionych, podczas gdy (3'3'S) wykazuje tylko 5 do 15, korzystnie 6 do 10, wiązań nierozgałęzionych, przy założeniu że zapobieganie się wymianie nici. Jeśli natomiast S służy do pofałdowania analogu oligonukleotydu, na przykład do zbudowania trypleksu na pojedynczej nici kwasu nukleinowego, długości S wynoszą 2 do 8, zwłaszcza korzystnie 4 do 5 jednostek nukleotydowych. Jako przykład można tu wymienić heksafosforan penta-(2-henzy loksy-1,3-propandiolu) i pentafosforan heksa-(propan-1,3-diolu), które w danym przypadku mogą powodować związanie (5', 5'S) albo (3', 5'S). Wytwarzanie analogów oligonukleotydów wzorze 1A i B następuje podobnie jak synteza biologicznych oligonukleotydów w roztworze albo szczególnie w fazie stałej, ewentualnie przy pomocy automatycznego syntez.atora.

   Synteza w fazie stałej oligonukleotydów z resztą fosforanową względnie fosforoestrową na końcu 3' nie jest możliwa przy pomocy standardowej chemii fosforamidynowej według Caruthers (M.D. Matteucci 1 M.H. Caruthers, J. Am. Chem. Soc. 103, 3185 1981)), ponieważ pierwszy składnik nukleotydowy poprzez grupę 3'-hydroksy wiąże się na stałym nośniku i stąd takie syntezy dają zawsze oligonukleotydy z grupą 3'-hydroksylową. Opisano różne sposoby według metody fazy stałej, ale wszystkie one są kłopotliwe i często z ich pomocą nie daje się wytworzyć pochodnych takich jak ester fosforanowy albo alkilofosfonian (R. Eritja i in, Tetrahedron Lett, 32, 1511, (1991); P. Kumar i in, Tetrahedron Lett. 32, 967 (1991); W.T. Markewicz i T.K. Wyrzykiewicz, Phosphorus, sulfur and Silicon 51/52, 374 (1990); E. Felder i in, Tetrahedrin Lett. 25, 3967 (1984) R. Lohrmann i J. Ruth DNA 3, 122 (1984)).

   172 245