ES2250268T3 - Analogos de oligonucleotidos 3'-derivatizados con agrupaciones no nucleotidicas, su preparacion y utilizacion. - Google Patents

Abstract

Compuestos análogos a oligonucleótidos de la **fórmula** así como de sus sales fisiológicamente compatibles, caracterizados porque R1 significa hidrógeno, alquilo C1-C18, alquenilo C2- C18, alquinilo C2-C18, alquilcarbonilo C2-C18, alquenilcarbonilo C3-C19, alquinilcarbonilo C3-C19, arilo C6-C20, aril (C6-C14)-alquilo (C1-C8), o un radical de la **fórmula** ; R2 significa hidrógeno, hidroxi, alcoxi C1-C18, halógeno, azido o NH2; B representa una base usual en la química de los oligonucleótidos; a representa oxi o metileno; d, e, independientemente unos de otros, significan un número entero de 0 a 50; i significa un número entero de 1 a 10; W significa oxo, selenoxo o tioxo; V significa oxi, sulfanodiílo o imino; Y significa oxi, sulfanodiílo, imino o metileno; Y'' significa oxi, sulfanodiílo, imino, (CH2)m o V(CH2)m, en que m significa un número entero de 1 a 18; X significa hidroxi o mercapto; U significa hidroxi, mercapto, SeH, alcoxi C1-C18, alquilo C1-C18, arilo C6-C20, aril (C6-C14)-alquilo (C1-C8), NHR3, NR3R4 o un radical de la fórmula (OCH2CH2)pO(CH2)qCH2R11.

Description

Análogos de oligonucleótidos 3'-derivatizados con agrupaciones no nucleotídicas, su preparación y utilización.

El presente invento se refiere a nuevos compuestos análogos a oligonucleótidos con valiosas propiedades físicas, biológicas y farmacológicas, así como a un procedimiento para su preparación. Su aplicación se refiere a la utilización como agentes inhibidores de la expresión de genes (oligonucleótidos antisentido, ribozimas, oligonucleótidos del mismo sentido y oligonucleótidos formadores de triplex), como sondas para la detección de ácidos nucleicos y como agentes auxiliares en la biología molecular.

Los oligonucleótidos están encontrando aplicación en medida creciente como agentes inhibidores de la expresión de genes (G. Zon, Pharmaceutical Research 5, 539 (1988); J. S. Cohen, Topics in Molecular and Structural Biology 12 (1989) Macmillan Press; C. Helene y J. J. Toulme. Biochemica et Biophysica Acta 1049, 99 (1990); E. Uhlmann y A. Peyman, Chemical Reviews 90, 543 (1990)). Los oligonucleótidos antisentido son fragmentos de ácidos nucleicos, cuya secuencia de bases es complementaria con un ARNm (ácido ribonucleico mensajero) inhibidor. Este ARNm diana puede ser de origen celular, vírico o patógeno de otro modo. Como secuencias dianas celulares entran en cuestión por ejemplo las de receptores, enzimas, moduladores inmunitarios, canales de iones u oncogenes. La inhibición de la reproducción de virus con ayuda de oligonucleótidos antisentido se describió por ejemplo para los RSV (virus de sarcoma de Rous), HSV-1 y -2 (virus del herpes simple de los tipos I y II), HIV (virus de la inmunodeficiencia humana) y virus de influenza. En tal caso se emplean oligonucleótidos que son complementarios con el ácido nucleico vírico. Por el contrario, los oligonucleótidos del mismo sentido están concebidos en su secuencia de tal manera que fijen ("capten") por ejemplo proteínas que fijan a ácidos nucleicos o enzimas que tratan a ácidos nucleicos, y de esta manera inhiben su actividad biológica (Helene 1990). Como dianas víricas se han de mencionar en este caso por ejemplo la transcriptasa inversa, la polimerasa de ADN y las proteínas transactivadoras.

Los oligonucleótidos formadores de triplex tienen en general el ADN como diana y después de la fijación a éste forman una estructura helicoidal triple. Mientras que con ayuda de los oligonucleótidos antisentido se inhiben en general el tratamiento (empalme, etc.) de los ARNm o su traducción en la proteína, los oligonucleótidos formadores de un triplex inhiben la transcripción o replicación de los ADN (Helene y colaboradores, 1990, Uhlmann y Peyman, 1990). Sin embargo, también es posible fijar ácidos nucleicos monocatenarios en una primera hibridación con un oligonucleótido antisentido mediando formación de una doble cadena, que luego en una segunda hibridación con un oligonucleótido formador de triplex forma una estructura triplex. Las regiones de fijación a antisentido y triplex pueden estar albergadas en tales casos o bien en dos oligonucleótidos separados o por el contrario en un único oligonucleótido. Una aplicación adicional de los oligonucleótidos sintéticos son las denominadas ribozimas, que destruyen al ARN diana como consecuencia de su actividad de ribonucleasa (J. J. Rossi y N. Sarver, TIBTECH 8, 179 (1990)).

En el diagnóstico por ADN los fragmentos de ácidos nucleicos con una marcación apropiada se emplean como las denominadas sondas de ADN para la hibridación específica a un ácido nucleico que se ha de detectar. La formación específica de la nueva doble cadena se vigila en tal caso con ayuda de la marcación, que con preferencia no es radiactiva. De esta manera se pueden detectar enfermedades genéticas, malignas, víricas o causadas por otros patógenos.

Para la mayor parte de las mencionadas aplicaciones, los oligonucleótidos en su forma que se presenta en la naturaleza son poco apropiados o totalmente inapropiados. Ellos deben ser modificados químicamente de tal manera que se adapten a los requisitos especiales. Para que los oligonucleótidos se puedan emplear en sistemas biológicos, por ejemplo para la inhibición de la reproducción de virus, deben cumplir las siguientes premisas:

1.

Deben presentar una estabilidad suficientemente grande en condiciones in vivo, es decir tanto en el suero como también intracelularmente.

2.

Deben estar constituidos de tal manera que puedan pasar a través de las membranas celulares y de núcleos.

3.

Deben fijarse en condiciones fisiológicas a su ácido nucleico diana de un modo específico para ciertas bases, con el fin de desarrollar el efecto inhibidor.

Para las sondas de ADN, estas premisas no son indispensables; sin embargo, estos oligonucleótidos deben ser derivatizados de tal manera que sea posible una detección, por ejemplo mediante fluorescencia, quimioluminiscencia, colorimetría o coloración específica (Beck y Köster, Anal. Chem. 62, 2258 (1990)).

La modificación química de los oligonucleótidos se efectúa en la mayor parte de los casos de un modo tal que el esqueleto de fosfato, la unidad de ribosa o las núcleobases se modifican de un modo correspondiente (Cohen, 1989; Uhlmann y Peyman, 1990). Un método adicional, utilizado con frecuencia, es la preparación de conjugados en 5' con oligonucleótidos por reacción del grupo 5'-hidroxi con correspondientes reactivos de fosforilación.

Los oligonucleótidos, que están modificados solamente junto al extremo 5', tienen la desventaja de que son descompuestos en el suero. Cuando, por el contrario, se modifican todos los radicales de fosfatos situados entre nucleótidos, se modifican con frecuencia drásticamente las propiedades de los oligonucleótidos. Por ejemplo la solubilidad de los metil-fosfonato-oligonucleótidos en un medio acuoso se disminuye y la capacidad para la hibridación se reduce.

Los fósforo-tioato-oligonucleótidos actúan inespecíficamente, de manera tal que por ejemplo también los homo-oligómeros son activos contra los virus.

Los oligonucleótidos antisentido poseen por lo general una polaridad uniforme, que en el caso de la hibridación con un ARN presentan en la mayor parte de los casos un carácter antiparalelo (véase la Tabla 1; A). En determinados casos, por ejemplo también en el caso de oligonucleótidos construidos por unidades de \alpha-nucleósidos, la polaridad puede también ser paralela (Tabla 1; B). Los oligonucleótidos formadores de triplex se pueden hibridar con ácidos nucleicos de doble cadena en general, de un modo dependiente de la secuencia, en orientación paralela (Tabla 1; C) o antiparalela (Tabla 1; D) en lo que se refiere a la cadena de ácido nucleico rica en purina. Para ello se usan principalmente los motivos de emparejamiento de bases T\bulletAT, G\bulletGC, C^{+}\bulletGC, G\bulletTA, C^{Me}\bulletGC, A\bulletAT y C^{PI}\bulletGC, en los que C^{+} significa un radical de citosina protonado, C^{Me} significa un radical de 5-metil-citosina, C^{PI} significa un radical de pseudo-iso-citosina y "\bullet" significa un emparejamiento de bases de Hoogsteen o de Hoogsteen inverso. Sin embargo la aplicación de estos emparejamientos de bases de Hoogsteen se limita a regiones ricas en purina de los ácidos nucleicos bicatenarios.

Con el fin de aumentar la flexibilidad de los oligonucleótidos formadores de triplex en lo que se refiere a secuencias dianas ricas en purina, se prepararon oligonucleótidos con polaridad variable, que como consecuencia de un cambio de cadenas (5'5') (Tabla 1; E) o de un cambio de cadenas (3'3'), que eventualmente se pueden alternar (Tabla 1; F), pueden fijar en cada caso regiones ricas en purina de la cadena opuesta (Ono y colaboradores, Biochemistry (1991) 30, 9914)).

Es posible un cambio de cadenas mediando mantenimiento de la polaridad, cuando se incorpora un espaciador (3',5').

Además, es posible, con ayuda de bucles (5'5') (Tabla 1; G) o de bucles (3'5') o (2'5'), preparar oligonucleótidos antisentido especiales, en los cuales una región, mediante un emparejamiento de bases según Watson-Crick, reconoce a una cadena individual de ácido nucleico y una segunda región, mediante un emparejamiento de bases según Hoogsteen, reconoce a una doble cadena de ácido nucleico, que se establece a partir del emparejamiento de bases según Watson-Crick. Con ayuda de tales compuestos análogos a oligonucleótidos antisentido/triplex es posible por lo tanto una formación de un triplex en ácidos nucleicos monocatenarios. De una manera similar se pueden preparar oligonucleótidos del mismo sentido bicatenarios que fijan de modo específico para una secuencia a las proteínas que fijan a los ADN, a través de emparejamientos de bases según Watson-Crick intramoleculares (Tabla 1; I).

Finalmente, se pueden preparar oligonucleótidos, que junto al extremo 5' contienen un espaciador 5'5' (Tabla 1; K). En estos compuestos análogos a oligonucleótidos, ambos extremos 3'(2') pueden contener de modo ventajoso grupos fosforilo.

TABLA 1 Representación esquemática de posibles principios de acción

1

102

2

Los compuestos análogos a oligonucleótidos conocidos hasta ahora, que obedecen los principios de acción representados en la Tabla 1 desde C hasta I, poseen en general un grupo hidroxi junto al extremo 3', de manera tal que son descompuestos en el suero, en la mayor parte de los casos son mal capaces de pasar a través de membranas y son derivatizables con facilidad solamente junto al extremo 5'.

Es por lo tanto misión del invento poner a disposición compuestos análogos a oligonucleótidos con propiedades específicas de hibridación frente a ácidos nucleicos monocatenarios y bicatenarios, con una aumentada estabilidad en suero, una buena solubilidad y una actividad específica.

Son objeto del invento compuestos análogos a oligonucleótidos de fórmula IB

3

así como sus sales fisiológicamente compatibles,

en los que

R^{1}

significa hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{18}, con preferencia alquilo C_{1}-C_{6}, alquenilo C_{2}-C_{18}, alquinilo C_{2}-C_{18}, alquilcarbonilo C_{2}-C_{18}, alquenilcarbonilo C_{3}-C_{19}, alquinilcarbonilo C_{3}-C_{19}, arilo C_{6}-C_{20}, aril (C_{6}-C_{14})-alquilo (C_{1}-C_{8}), o un radical de la fórmula II:

(II)Z ---

\melm{\delm{\dpara}{W}}{P}{\para}

--- Z';

R^{2}

significa hidrógeno, hidroxi, alcoxi C_{1}-C_{18}, halógeno, azido o NH_{2};

B

representa una base usual en la química de los oligonucleótidos, por ejemplo representa bases naturales tales como adenina, citosina, guanina y timina, o bases no naturales tales como purina, 2,6-diamino-purina, 7-desaza-adenina, 7-desaza-guanina, N^{4}N^{4}-etano-citosina, N^{6}N^{6}-etano-2,6-diamino-purina, 5-metil-citosina, pseudo-iso-citosina;

a

representa oxi o metileno;

d, e, f independientemente unos de otros, significan un número entero de 0 a 50, con preferencia de 5 a 15;

i

significa un número entero de 1 a 10, con preferencia de 1 a 3;

W

significa oxo, selenoxo o tioxo;

V

significa oxi, sulfanodiílo o imino;

Y

significa oxi, sulfanodiílo, imino o metileno;

\newpage

Y'

significa oxi, sulfanodiílo, imino, (CH_{2})_{m} o V(CH_{2})_{m}, en que

m

significa un número entero de 1 a 18, con preferencia de 1 a 6;

X

significa hidroxi o mercapto;

U

significa hidroxi, mercapto, SeH, alcoxi C_{1}-C_{18}, con preferencia alcoxi C_{1}-C_{6}, alquilo C_{1}-C_{18}, con preferencia alquilo C_{1}-C_{6}, arilo C_{6}-C_{20}, aril (C_{6}-C_{14})-alquilo (C_{1}-C_{8}), NHR^{3}, NR^{3}R^{4} o un radical de la fórmula (OCH_{2}CH_{2})_{p} O(CH_{2})_{q}CH_{2}R^{11}, en que

R^{3}

significa alquilo C_{1}-C_{18}, con preferencia alquilo C_{1}-C_{8}, arilo C_{6}-C_{20}, aril (C_{6}-C_{14})-alquilo (C_{1}-C_{8}), -(CH_{2})_{c}-[NH(CH_{2})_{c}]_{d}-NR^{12}R^{12}, en que c es un número entero de 2 a 6 y d es un número entero de 0 a 6, y los R^{12} independientemente uno de otro son hidrógeno o alquilo C_{1}-C_{6}, o alcoxi C_{1}-C_{4}-alquilo C_{1}-C_{6}, con preferencia metoxietilo;

R^{4}

significa alquilo C_{1}-C_{18}, con preferencia alquilo C_{1}-C_{8} y con especial preferencia alquilo C_{1}-C_{4}, arilo C_{6}-C_{20} o aril (C_{6}-C_{10})-alquilo (C_{1}-C_{8}), o en el caso de NR^{3}R^{4} en común con R^{3} y el átomo de nitrógeno que los lleva, significa un anillo heterocíclico de 5-6 miembros, que adicionalmente puede contener un heteroátomo adicional seleccionado entre la serie formada por O, S, N,

p

significa un número entero de 1 a 100, con preferencia de 3 a 20 y con especial preferencia de 3 a 8,

q

es un número entero de 0 a 18, con preferencia de 0 a 15,

R^{11}

significa hidrógeno o un grupo funcional tal como hidroxi, amino, NHR^{13}, COOH, CONH_{2}, COOR^{12} o halógeno, en que R^{12} significa alquilo C_{1}-C_{4}, con preferencia metilo;

S

es un grupo de la fórmula III

4

en la que

h

es cuatro o cinco;

G

tiene el significado de alquileno C_{1}-C_{12}, en particular alquileno C_{2}-C_{4}, pudiendo el alquileno estar sustituido eventualmente con halógeno, amino, hidroxi, alquilo C_{1}-C_{18}, alcoxi C_{1}-C_{18}, alquil C_{1}-C_{18}-carboniloxi, arilo C_{6}-C_{14}, aril C_{6}-C_{14}-alquilo C_{1}-C_{18}, o aril C_{6}-C_{14}-alcoxi C_{1}-C_{8}, aril C_{6}-C_{14}-di-alquileno C_{1}-C_{8}, arileno C_{6}-C_{18} de un grupo de la fórmula (CH_{2}CH_{2}V)_{\alpha}CH_{2}CH_{2} ó (CH_{2}V)_{\alpha}CH_{2}, en que \alpha es un número entero de 1 a 11, con preferencia de 1 a 5,

\quad

de una unidad de la fórmula

---[G --- Y ---

\melm{\delm{\dpara}{W}}{P}{\uelm{\para}{U}}

--- Y' ---]_{\beta}

en la que \beta significa un número entero de 1 a 6, o de un grupo de la fórmula

\vskip1.000000\baselineskip

5

Z = Z' significan hidroxi, mercapto, SeH, alcoxi C_{1}-C_{22}, con preferencia alcoxi C_{6}-C_{18}, -O-(CH_{2})_{b}-NR^{12}R^{13}, en que b es un número entero de 1 a 6, y R^{13} es alquilo C_{1}-C_{6} ó R^{12} y R^{13} en común con el átomo de nitrógeno que los lleva, forman un anillo de 3-6 miembros, alquilo C_{1}-C_{18}, con preferencia alquilo C_{1}-C_{8}, arilo C_{6}-C_{20}, aril (C_{6}-C_{14})-alquilo (C_{1}-C_{8}), con preferencia aril (C_{6}-C_{10})-alquilo (C_{1}-C_{14}), aril (C_{6}-C_{14})-alcoxi (C_{1}-C_{8}), con preferencia aril (C_{6}-C_{10})-alcoxi (C_{1}-C_{4}), significando el arilo también heteroarilo y estando el arilo eventualmente sustituido con 1, 2 ó 3 radicales iguales o diferentes seleccionados entre la serie formada por carboxi, amino, nitro, alquil C_{1}-C_{4}-amino, hidroxi, halógeno y ciano, alquilmercapto C_{1}-C_{18}, NHR^{3}, NR^{3}R^{4}, un radical de la fórmula III o un grupo que favorece la admisión intracelular o que sirve como marcación para una sonda de ADN;

el paréntesis alargado en posiciones 2' y 3' señala que R^{2} y el radical fosforilo contiguo se pueden encontrar también de manera inversa en posiciones 3' y 2',

pudiendo presentarse cada nucleótido en su configuración D ó L, y pudiendo encontrarse la base B en posición \alpha ó \beta.

Se prefieren los compuestos análogos a oligonucleótidos de la fórmula IB, en los que la base B se encuentra en posición \beta, los nucleótidos se presentan en la configuración D, R^{2} se encuentra en posición 2' y a representa oxi.

Son especialmente preferidos los compuestos análogos a oligonucleótidos de las fórmulas IB, en los que

R^{1}

significa hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{6}, en particular metilo,

\quad

o un radical de la fórmula II;

R^{2}

significa hidrógeno o hidroxi, en particular hidrógeno;

d, e y f significan un número entero de 5 a 15;

i

significa un número entero de 1 a 3;

m

significa un número entero de 1 a 6, en particular de 1;

U

significa hidroxi, mercapto, alcoxi C_{1}-C_{6}, alquilo C_{1}-C_{6}, NR^{3}R^{4} ó NHR^{3},

\quad

en particular hidroxi o alquilo C_{1}-C_{6}, en que

R^{3}

es alquilo C_{1}-C_{8}, con preferencia alquilo C_{1}-C_{4}, o metoxietilo, y B, W, V, Y, Y', X y Z tienen los significados antes mencionados.

Son preferidos en particular los compuestos análogos a oligonucleótidos de la fórmula IB, en los que V, Y' e Y tienen los significados de oxi.

Son además especialmente preferidos los compuestos análogos a oligonucleótidos de la fórmula IB, en los que V, Y, Y' y W tienen los significados de oxi u oxo.

Son muy especialmente preferidos los compuestos análogos a oligonucleótidos de la fórmula IB, en los que V, Y, Y', W y U tienen los significados de oxi, oxo o hidroxi.

Además, son preferidos los compuestos análogos a oligonucleótidos de la fórmula IB, en los que R^{1} representa hidrógeno.

En particular son preferidos los compuestos análogos a oligonucleótidos de la fórmula IB, en los que U, V, W, X, Y' e Y tienen los significados de oxi, oxo o hidroxi y R^{1} es igual a hidrógeno.

Los radicales que aparecen de modo repetido tales como R^{2}, B, a, d, e, f, h, W, V, Y, Y', U, R^{3}, R^{4}, p, q, G y Z pueden tener, independientemente unos de otros significados iguales o diferentes, es decir que p.ej. los V significan independientemente unos de otros oxi, sulfanodiílo o imino.

El halógeno representa con preferencia fluoro, cloro o bromo.

Por heteroarilo ha de entenderse el radical de un compuesto heteroaromático (C_{3}-C_{9}) monocíclico o bicíclico, que en el sistema anular contiene uno o dos átomos de N y/o un átomo de S o un átomo de O.

Son ilustrativos de grupos que favorecen la admisión intracelular, diferentes radicales lipófilos tales como -O-
(CH_{2})_{x}-CH_{3}, en que x significa un número entero de 6-18, -O-(CH_{2})_{n}-CH=CH-(CH_{2})_{m}-CH_{3}, en que n y m independientemente uno de otro, significan un número entero de 6 a 12, -O-(CH_{2}CH_{2}O)_{4}-(CH_{2})_{9}-CH_{3}, -O-(CH_{2}CH_{2}O)_{8}-
(CH_{2})_{13} y -O-(CH_{2}CH_{2}O)_{7}-(CH_{2})_{15}-CH_{3}, pero también radicales de esteroides tales como colesterilo y conjugados, que aprovechan sistemas de vehículos portadores naturales, tales como ácidos biliares, ácido fólico, 2-(N-alquil, N-alcoxi)-amino-antraquinona y conjugados de la manosa y de péptidos de los correspondientes receptores, que conducen a la endocitosis de los oligonucleótidos, mediada por receptores, tales como EGF (Epidermal Growth Factor = factor de crecimiento epidérmico), bradiquinina y PDGF (Platelet Derived Growth Factor = factor de crecimiento derivado de plaquetas). Por grupos de marcación han de entenderse grupos fluorescentes, por ejemplo de derivados de dansilo (= de N-dimetil-1-amino-naftil-5-sulfonilo), de fluoresceína o de cumarina, o grupos quimioluminiscentes, por ejemplo de derivados de acridina, así como el sistema de digoxigenina detectable a través de un ELISA, el grupo de biotina detectable a través del sistema de biotina/avidina, o por el contrario brazos de elementos enlazadores (linker) con grupos funcionales, que permiten una posterior derivatización con grupos reporteros detectables, por ejemplo un elemento enlazador aminoalquilo, que se hace reaccionar con un éster activo de acridinio para formar la sonda de quimioluminiscencia. Típicos grupos de marcación son:

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6

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103

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8

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9

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Los compuestos análogos a oligonucleótidos, que se fijan a ácidos nucleicos o se intercalan entre ellos y/o los desdoblan o reticulan, contienen p.ej. acridina, psoraleno, fenantridina, naftoquinona, daunomicina o conjugados con cloroetilamino-arilo. Típicos radicales que se intercalan y reticulan son:

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Como ejemplos de grupos NR^{3}R^{4}, en los que R^{3} y R^{4} en común con el átomo de nitrógeno que los lleva, forman un anillo heterocíclico de 5 a 6 miembros, que adicionalmente contiene otro heteroátomo, se mencionarán los radicales morfolinilo e imidazolinilo.

El invento no está limitado a \alpha- y \beta-D- ó L-ribofuranósidos, \alpha y \beta-D- ó L-desoxi-ribofuranósidos y correspondientes compuestos carbocíclicos análogos a compuestos con anillos de cinco miembros, sino que es válido también para compuestos análogos a oligonucleótidos, que están constituidos por otros eslabones de azúcares, por ejemplo azúcares ensanchados en el anillo y estrechados en el anillo, derivados de azúcares acíclicos o de otros tipos apropiados.

Los compuestos análogos a oligonucleótidos de la fórmula IB poseen un espaciador 3'5' (3'5'S) ó (2'5'S), que no influye sobre la polaridad, pero permite por ejemplo un retroplegamiento del compuesto análogo a oligonucleótido o un cambio de cadena.

Ejemplos de S son propano-1,3-diol-fosfatos, 2-bencil- ó 2-octadecil-oxipropano-1,3-diol-fosfatos, trietilen-glicol- o hexaetilen-glicol-fosfatos, que eventualmente también se pueden repetir. Compuestos análogos a oligonucleótidos sin ninguna base heterocíclica y radicales fenil-dialquileno son otras formas preferidas de realización de S, en particular de (3'3'S). Por lo general, el (5'5'S) es, por razones topológicas, más largo que (3'3'S). Así, el (5'5'S) posee en la mayor parte de los casos de 20 a 45, con preferencia de 24 a 36 enlaces no ramificados, mientras que el (3'3'S) presenta solamente de 5 a 15, con preferencia de 6 a 10 enlaces no ramificados, con la premisa de que se busque un cambio de cadenas. Si S, por el contrario, sirve para el retroplegamiento del compuesto análogo a oligonucleótido, por ejemplo para la formación de un triplex junto a la cadena individual de ácido nucleico, son ventajosas unas longitudes de S correspondientes a 4 hasta 5 unidades de nucleótidos. Como ejemplo se mencionarán en este caso penta-(2-benciloxi-1,3-propanodiol)-hexafosfato y hexa-(propano-1,3-diol)-pentafosfato, que en cada caso pueden producir una unión en (5'5'S) o (3'5'S).

La preparación de compuestos análogos a oligonucleótidos de la fórmula IB se efectúa de un modo similar a la síntesis de oligonucleótidos biológicos, en solución o con preferencia en fase sólida, eventualmente tomando ayuda de un aparato automático de síntesis.

La síntesis en fase sólida de oligonucleótidos con un radical de fosfato o éster fosfato junto al extremo 3' no es posible de acuerdo con la química clásica del fósforo-amidito de acuerdo con Caruthers (M. D. Matteucci y M. H. Caruthers, J. Am. Chem. Soc. 103, 3185 (1981)), puesto que el primer eslabón de nucleótido está unido al soporte sólido a través del grupo 3'-hidroxi y por lo tanto a partir de estas síntesis resultan siempre oligonucleótidos con un grupo 3'-hidroxi. Se describieron diferentes procedimientos de acuerdo con el método de la fase sólida, pero todos ellos son complicados y con ellos, con frecuencia, no se pueden preparar derivados, tales como ésteres fosfatos o alquil-fosfonatos (R. Eritja y colaboradores, Tetrahedron Lett. 32, 1511 (1991); P. Kumar y colaboradores, Tetrahedron Lett. 32, 967 (1991); W. T. Markiewcz y T. K. Wyrzykiewcz, Phosphorus, Sulfur and Silicon [Fósforo, Azufre y Nitrógeno] 51/52, 374 (1990); E. Felder y colaboradores, Tetrahedron Lett. 25, 3967 (1984); R. Lohrmann y J. Ruth, DNA 3, 122 (1984)).

Es objeto del invento un procedimiento para la preparación de compuestos análogos a oligonucleótidos de la fórmula IB, en el que

a)

en el primer ciclo de reacción se hace reaccionar una unidad de nucleótido con una agrupación de fósforo(V) terminal en 3'(2') y un grupo hidroxi o mercapto en 5' libre, con otra unidad de nucleótido que tiene una agrupación con fósforo(III) o fósforo(V) situada en 3'(2') o uno de sus derivados activados, en los ciclos ulteriores se hace reaccionar una unidad de nucleótido que tiene una agrupación con fósforo(III) o fósforo(V) terminal en 3'(2') o 5' o uno de sus derivados activados o con un reactivo, que permite la introducción de grupos espaciadores, con una unidad de nucleótido adicional con grupo hidroxi o mercapto libre terminal en 5' ó 3'(2') o

b)

el compuesto análogo a oligonucleótido se constituye de igual modo por fragmentos, se separan grupos protectores introducidos provisionalmente en los compuestos análogos a oligonucleótidos obtenidos según (a) o (b) para la protección de otras funciones, y los compuestos análogos a oligonucleótidos de la fórmula IB, así obtenidos, se transforman eventualmente en sus sales fisiológicamente compatibles.

Como componente de partida para la síntesis en fase sólida se emplea un soporte sólido de la fórmula IV

(IV)D-X'-CH_{2}CH_{2}-S(O)_{x}-CH_{2}CH_{2}-A-T,

en el que

A representa un brazo enlazador, que es por ejemplo un radical de un ácido dicarboxílico, de un diol, de una alquil-amina, de una monoalquil-amida de ácido dicarboxílico, de una amida de ácido o de un fosfato de la fórmula,

--- O ---

\melm{\delm{\para}{OR}}{P}{\uelm{\dpara}{O}}

--- O ---

en el que

R significa = hidrógeno o alquilo C_{1}-C_{6}, que eventualmente está sustituido con -CN, con preferencia metilo o 2-ciano-etilo, T significa un soporte sólido, constituido por ejemplo por materiales tales como CPG (de Controlled Pore Glass = vidrio de poros controlados), gel de sílice o una resina orgánica tal como un poliestireno (PS) o un copolímero de injerto a base de un PS y un polietilen-glicol (POR), que está modificado en la cadena lateral mediante grupos funcionales tales como hidroxi, amino, halógeno o COOH,

D representa un grupo protector que se puede eliminar sin separación del brazo enlazador A y del radical X'-CH_{2}CH_{2}-S(O)_{x}-CH_{2}CH_{2} (véase Bioorg. Chem. 14 (1986) 274-325), tal como 4-metoxi-tetrahidropiranoílo y dimetoxitritilo, con preferencia dimetoxitritilo, x es un número entero de cero, 1 ó 2 y X' significa oxi o sulfanodiílo.

El brazo enlazador A, que une mediante un enlace químico (de amida, éster, etc.) al soporte sólido T con el radical que contiene azufre (Damka y colaboradores, Nucleic Acids Res. 18, 3813 (1990)), es con preferencia un radical de ácido succínico (O-C(O)-CH_{2}CH_{2}-C(O)-), un radical de ácido oxálico (O-C(O)-C(O)-), una alquil-amina, con preferencia una LCAA (Long Chain Alkyl Amin = alquil-amina de cadena larga), o un polietilen-glicol. Se prefiere especialmente un radical de ácido succínico. En determinados casos, por ejemplo en combinación con sustituyentes, que no aguantan un tratamiento prolongado con amoníaco, son ventajosos elementos enlazadores más inestables, tales como el elemento enlazador oxalilo. La preparación de soportes sólidos de las fórmulas IV a-c se describe en el Ejemplo 1.

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La síntesis en fase sólida se puede efectuar de acuerdo con el método del fosfato-triéster, el método del H-fosfonato y el método del fósforo-amidito, con preferencia de acuerdo con el método del fósforo-amidito (E. Sonveaux, Bioorg. Chem. 14, 274 (1986)). En primer término, se separa siempre el grupo protector D desde el soporte de la fórmula IV mediante un ácido, por ejemplo ácido tricloroacético en el seno de cloruro de metileno. En el caso del método del fósforo-amidito, el soporte así obtenido de la fórmula IV'

(IV')HX'-CH_{2}-CH_{2}-S(O)_{x}-CH_{2}CH_{2}-A-T,

en el que x, X', A y T tienen los significados antes mencionados, se condensa con un nucleósido-fósforo-amidito de la fórmula V

18

en la que

B'

significa B, pudiendo presentarse en estado protegido los grupos NH_{2} eventualmente presentes en B;

R

es un grupo protector, que se puede eliminar en condiciones suaves, tal como 4-metoxi-tetrahidropiranoílo o dimetoxitritilo,

R^{2'}

es hidrógeno, alcoxi, halógeno o una función hidroxi o amino protegida, y

R^{5} y R^{6} independientemente uno de otro, son alquilo C_{1}-C_{12}, o ambos radicales forman en común un anillo de 5 a 6 miembros,

\quad

Y'' es oxi, sulfanodiílo o (CH_{2})_{m}, y

\quad

a, m, V y Z tienen los significados antes mencionados,

en presencia de un ácido débil tal como tetrazol. A continuación, el soporte así obtenido se oxida de manera en sí conocida con agua yodada (W=O) o con TETD (disulfuro de tetraetil-tiuram) o con azufre elemental (W=S), o con selenio (W=Se) para formar el soporte derivatizado de la fórmula VII

19

en el que

R, V, B', R^{2'}, Z, X', W, Y'', A y T tienen los significados antes mencionados. Se preparan con preferencia soportes de la fórmula VIIa

20

El fósforo-amidito de la fórmula V se puede preparar por ejemplo a partir del bis-amidito de la fórmula VI

21

en el que

R^{7} y R^{8} son iguales que R^{5} y R^{6} y

a, R, V, B', R^{2'}, Y'', R^{5} y R^{6} tienen los significados antes mencionados,

por reacción con el correspondiente alcohol o tioalcohol mediando catálisis por tetrazol (Ejemplo 2, Método A), cuando Z es = alcoxi o alquil-mercapto (J. E. Marugg y colaboradores, Tetrahedron Lett. 27, 2271 (1986)).

Los bis-amiditos preferidos son los de la fórmula VIa

22

De este modo, se prepararon por ejemplo los amiditos de las fórmulas VIII a-m

23

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en los que

R^{5} y R^{6} tienen los significados antes mencionados, Z tiene el significado de

a)

O-CH_{2}CH_{3},

b)

O-i-C_{3}H_{7},

c)

O-n-C_{6}H_{13},

d)

O-n-C_{18}H_{37},

e)

24

f)

25

g-k)

un radical de la fórmula III, en el que en el caso de que

g)

p = 3 y q = 0,

h)

p = 4 y q = 9,

i)

p = 5 y q = 4 y

k)

p = 8 y q = 13,

p)

CH_{3}

m)

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y B' en los casos de

a), c) y d) significa Cyt^{i-Bu}, en los casos de

b) y p) significa Thy y en los casos

e) - k) y m) significa Cyt^{Bz}.

Un método alternativo para cargar el soporte es la reacción del reactivo de fosfitilación de la fórmula IX

27

en la que

R^{9} y R^{10} independientemente uno de otro, significan Cl, NR^{5}R^{6}, NR^{7}R^{8}, Z'' ó U' y siendo U' alquilo C_{1}-C_{4} o un grupo hidroxi presente en forma de un derivado protegido, teniendo R^{5}, R^{6}, R^{7} y R^{8} los significados antes mencionados, siendo Z'' = Z, con la condición de que hidroxi, mercapto y SeH se deben presentar como derivados protegidos, por ejemplo como Y'''-G'-X'-DMTr, en que DMTr es dimetoxitritilo, X' = Y''' = oxi o sulfanodiílo y G' es (CH_{2}CH_{2}O)_{\alpha}
CH_{2}CH_{2} ó CH_{2}CH(OR')CH_{2} con

R' = alquilo C_{1}-C_{18}, arilo C_{6}-C_{14} o aril C_{6}-C_{14}-alquilo C_{1}-C_{8} y

\alpha = un número entero de 1 a 11, o como

O-CH_{2}CH_{2}-CN, O-CH_{3}, S-CH_{2}CH_{2}CN, O-CH_{2}CH_{2}-S-CH_{2}CH_{2}-O-D o

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con un nucleósido que tiene una función en 3'(2') libre de la fórmula X

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en la que

V, B', R^{2'} y R tienen los significados antes mencionados e Y''' es = oxi o sulfanodiílo, y la subsiguiente condensación del compuesto así obtenido con el soporte de la fórmula IV' en presencia de un agente de condensación, tal como tetrazol (para R^{9}, R^{10} = NR^{5}R^{6} ó NR^{7}R^{8}) o diisopropil-amina (para R^{9}, R^{10} = Cl).

La subsiguiente oxidación con agua yodada o con azufre o selenio conduce entonces al compuesto de la fórmula VIIa. Seguidamente el grupo protector R se puede eliminar y se puede proseguir de una manera conocida la síntesis del oligonucleótido. Al final de la síntesis desde el compuesto análogo a oligonucleótido fijado a un soporte, así obtenido, se eliminan los grupos protectores de una manera conocida y después de ello el compuesto análogo a oligonucleótido conforme al invento de la fórmula IA o IB se separa desde el soporte.

Si la síntesis se hizo terminar con un eslabón de la fórmula V en el último ciclo, se obtiene un compuesto análogo a oligonucleótido de la fórmula IA o IB (R^{1} = H) con un grupo 5'-hidroxi y con una conjugación que contiene fósforo junto al extremo 3'(2'). Si, por el contrario en la última etapa de condensación se emplea un reactivo de fosforilación, por ejemplo de la fórmula IX, en el que R^{9} es = Z'', entonces a partir de la síntesis resulta un compuesto análogo a oligonucleótido de la fórmula IA o IB con R^{1} = fórmula II, que tanto junto al extremo 3'(2') como también junto al extremo 5' presenta una sustitución que contiene fosfato.

La preparación de oligonucleótidos con un grupo fósforo-amidato terminal en 3'(2') es posible por ejemplo por reacción del soporte de la fórmula IV' con el metoxi-fósforo-amidito de la fórmula V (Z=O-CH_{3}) en presencia de tetrazol, cuando se realiza la oxidación tal como se describe en la cita de Jäger y colaboradores (Biochemistry 27, 7237 (1988)) con una mezcla de yodo y H_{2}NR^{3} ó HNR^{3}R^{4}, en los que R^{3} y R^{4} tienen los significados antes mencionados.

En casos determinados (Z = NHR^{3}, NR^{3}R^{4}, O, S o Se) la introducción del grupo Z puede efectuarse también de acuerdo con el método del H-fosfonato, sometiendo al diéster de H-fosfonato de la fórmula VII',

30

formado en primer lugar por reacción de un nucleósido-fosfonato de la fórmula XI

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en el que R, V a, B', Y', X' y W tienen los significados antes mencionados, con un soporte de la fórmula IV',

a una fósforo-amidación en condiciones oxidantes (B. Froehler, Tetrahedron Lett. 27, 5575 (1986)). De esta manera se puede preparar por ejemplo con una colesteril-oxicarbonil-amino-alquil-amina, en presencia de tetracloruro de carbono, un oligonucleótido con un grupo colesterilo terminal en 3'.

La preparación de compuestos análogos a oligonucleótidos de la fórmula IB es posible además de acuerdo con el método del triéster, haciendo reaccionar el grupo HX' del soporte de la fórmula IV' con un fosfato-diéster protegido de la fórmula XII

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en la que R, V, a, B', R^{2'}, Y', Z, W, X' y el paréntesis alargado tienen los significados antes mencionados, en presencia de un agente de condensación tal como un cloruro de ácido aril-sulfónico y de un catalizador nucleófilo tal como tetrazol. Una posibilidad para la inversión de la polaridad de una cadena de oligonucleótido que crece en la dirección 3'5' (2'5'), consiste en que se hace reaccionar el grupo 5'-hidroxi o el grupo 5'-tiol libre, de la cadena en crecimiento con un eslabón de la fórmula XIII,

por ejemplo con un 3'-O-DMTr-nucleósido-5'-fósforo-amidito de la fórmula XIIIa,

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Si a continuación se oxida con agua yodada o con azufre, entonces (5'5'S) tiene el significado de un radical de fosfato (PO_{4}^{-}) o de fósforo-tioato (PO_{3}S^{-}). Después de haber separado el grupo protector situado junto al extremo 3'(2') la cadena de oligonucleótido se puede prolongar en dirección 5'3' en caso necesario por acoplamiento sucesivo con eslabones de la fórmula XIII

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en los que

U'

tiene el significado de U, con la condición de que U' no ha de significar NHR^{3} ó NR^{3}R^{4} y los hidroxi, mercapto y SeH se presentan como derivados protegidos (para ejemplos de tales derivados véase Z'') y

R^{5}, R^{6}, Y''', V, R, a, R^{2'} y B' tienen los significados antes mencionados. La síntesis de los eslabones XIII se efectúa por ejemplo tal como se describe en la cita de Seliger y colaboradores (Nucleosides, Nucleotides 10 (1991), 469)).

Para la preparación de compuestos análogos a oligonucleótidos de la fórmula IB, cuya polaridad está inalterada, pero cuyo (3'5'S) facilita un retroplegamiento de la cadena, en un sitio deseado la síntesis la cadena de oligonucleótidos se prolonga con un eslabón de la fórmula XIV, que por causa de su bifuncionalidad también se puede condensar múltiples veces.

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Por ejemplo un bucle (3'5'S) se puede introducir por acoplamiento sucesivo realizado múltiples veces, con preferencia de 4 a 5 veces, con el eslabón de la fórmula XIVb. Después de ello se prosigue la síntesis tal como se ha descrito con anterioridad en la dirección 3'5'.

Si en el caso de la hibridación del compuesto análogo a oligonucleótido con ácidos nucleicos bicatenarios, con preferencia con ADN, se pretende un cambio de cadena, entonces el espaciador 5'5' debe ser de mayor longitud. Por ejemplo, un trietilen-glicol-difosfato se puede incorporar una o múltiples veces, con preferencia dos veces, en el sitio deseado junto a una cadena constituida en la dirección 3'5', mediante acoplamiento con el eslabón de la fórmula XIVa. Con el fin de modificar la polaridad, se prosigue a continuación la síntesis en la dirección 5'3' con eslabones de nucleótidos de la fórmula XIII. Si se desea una inversión renovada de la polaridad, en el sitio pretendido se introduce un espaciador 3'3' y a continuación se prosigue la síntesis de la cadena en dirección 3'5' por condensación con nucleósido-3'-fósforo-amiditos. Como espaciador 3'3' se recomienda por ejemplo la introducción de un grupo propano-1,3-diol-difosfato, que se puede introducir por acoplamiento con el eslabón de la fórmula XIVd.

Si la síntesis de un oligonucleótido se lleva a cabo con el soporte de sulfuro (x=0) o sulfinilo (x=1), estos grupos se oxidan al final de una manera en sí conocida [Funakoshi y colaboradores, Proc. Notl. Acad. Sci. 88 (1991), 6982] para formar el radical sulfonilo, con el fin de garantizar un fácil desdoblamiento con bases, de preferencia con amoníaco.

El tipo de los grupos protectores de amino de las bases B' y la constitución del brazo enlazador A se ajustan en cada caso individual al tipo del sustituyente Z, puesto que éstos después de una síntesis apropiada deben poder ser desdoblados sin problemas. Por ejemplo, en el caso de la preparación de un oligonucleótido-3'-fosfato-isopropil-éster (Z = O-i-C_{3}H_{7}), para B = Ade y Cyt se puede trabajar con el grupo protector benzoílo (Bz) o para B = Gua se puede trabajar con el grupo protector isobutirilo (i-Bu). Por el contrario, para la síntesis de un oligonucleótido-3'-metil-fosfonato-éster (Z = CH_{3}) o de un éster etílico (Z= -O-C_{2}H_{5}) para B = Ade y Gua se utilizan con preferencia el grupo protector fenoxi-acetilo (PAC) más inestable o para B = Cyt se utiliza con preferencia el grupo protector iso-butirilo.

Algunos conjugados poseen grupos funcionales adicionales, que antes de la incorporación en los eslabones monómeros de las fórmulas V y XII se deben proteger de una manera apropiada. Por ejemplo, el grupo carboxilo de la fluoresceína se ha de proteger como éster de alquilo. En el psoraleno, el grupo amido se puede presentar como compuesto protegido con N-Fmoc (fluorenil-metoxi-carbonilo). Los grupos hidroxi se pueden proteger con respecto de reacciones secundarias por acilación o sililación (con t-butil-dimetil-sililo). Los grupos amino se pueden presentar también protegidos con trifluoroacetilo. En casos excepcionales, los conjugados pueden ser tan poco estables que en ya serían destruidos en las condiciones de la separación de grupos protectores de la síntesis de oligonucleótidos. En tales casos es favorable incorporar en el monómero de la fórmula V solamente un brazo enlazador con un grupo funcional, por ejemplo Z = HN-(CH_{2})_{x}-NH-Fmoc, en el que x significa un número entero de 2-12, con preferencia de 4-6. Después de la incorporación en el oligonucleótido y de la eliminación de los grupos protectores, con preferencia con amoníaco, el grupo amino libre se puede acoplar con ésteres activos. De esta manera se preparó por ejemplo el éster de acridinio inestable frente a bases.

La caracterización de los derivados de oligonucleótidos sintetizados se efectúa mediante espectrometría de masas con ionización por proyección eléctrica (Stults y Masters, Rapid Commun. Mass. Spectr. 5 (1991) 350).

Los compuestos análogos a oligonucleótidos de la fórmula IB de acuerdo con el invento, se ensayaron en cuanto a su estabilidad en un suero y frente a exonucleasas conocidas.

Sorprendentemente, se encontró que todos los compuestos análogos a oligonucleótidos de la fórmula IB presentan, en comparación con los oligonucleótidos no modificados, una estabilidad grandemente aumentada frente a las nucleasas del suero, mientras que su comportamiento de hibridación es influenciado solamente poco.

Mientras que los oligonucleótidos no modificados presentan en un suero de ternero fetal un valor de la semivida de aproximadamente dos horas, todos los compuestos análogos a oligonucleótidos de la fórmula IB son suficientemente estables durante aproximadamente 16 horas. Los compuestos análogos a oligonucleótidos de la fórmula IA son además de ello estables frente a una fosfodiesterasa de veneno de serpiente. Los oligonucleótidos no modificados son descompuestos exo-nucleolíticamente por la fosfodiesterasa de veneno de serpiente desde el extremo 3' y por la fosfodiesterasa de bazo desde el extremo 5'.

Los compuestos análogos a oligonucleótidos de la fórmula IB forman híbridos bicatenarios estables mediante un emparejamiento de bases según Watson-Crick con secuencias de nucleótidos monocatenarias complementarias, o estructuras triplex estables mediante un emparejamiento de bases según Watson-Crick y Hoogsteen, mientras que ellos forman estructuras de hélices triples con ácidos nucleicos bicatenarios mediante un emparejamiento de bases según Hoogsteen, haciendo posible los espaciadores (5'5'S) y (3'3'S) un cambio de cadenas. Con ello es posible la regulación o la represión de funciones biológicas de ácidos nucleicos con los compuestos análogos a oligonucleótidos conformes al invento, por ejemplo la represión de la expresión de genes celulares así como también la de oncogenes o de funciones de genomas víricos. Los compuestos análogos a oligonucleótidos de la fórmula IB se pueden emplear por lo tanto para la terapia o profilaxis de infecciones víricas y enfermedades de cáncer.

La actividad de los oligonucleótidos conformes al invento se comprobó con ayuda de la inhibición de la multiplicación de virus del HSV-1.

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Secuencia I

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Secuencia II

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Secuencia III

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Secuencia VI

(junto a E1b)

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Secuencia IV

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Secuencia V

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La Secuencia I seleccionada es inactiva frente al HSV-1 en un cultivo celular en forma de la secuencia natural, es decir sin derivatización en 3' y sin espaciador 5'5', puesto que experimenta una rápida descomposición en un suero. Por el contrario, los compuestos análogos a oligonucleótidos derivatizados en 3' de la fórmula IA, por ejemplo la Secuencia IA-2 (Ejemplo 4b), inhiben la reproducción de los HSV-1. La Secuencia I constituye solamente un ejemplo arbitrario para la explicación del principio. La Secuencia I se orienta hacia el ARNm de la proteína transactivadora Vmw65 del HSV-1. Las Secuencias II y III están orientadas contra la región de aceptor- empalme de los precursores IE4/5 de ARNm (IE = immediate early = temprano inmediato) del HSV-1, e inhiben también específicamente la replicación de HSV-1. Un oligonucleótido de la fórmula IA-4 (Ejemplo 4e) de la Secuencia IV, modificado en ambos extremos 3' con psoraleno, reconoce al origen de replicación (ori_{i}) del genoma de HSV-1 e inhibe la replicación de éste mediante formación de un triplex. La actividad antivírica de los conjugados de psoraleno se puede aumentar manifiestamente mediante irradiación con luz UV (ultravioleta). El genoma del HSV-1 con sus 160.000 bases ofrece naturalmente otras incontables secuencias dianas distintas con diversa eficiencia para la inhibición de la reproducción de los virus. Por variación de las secuencias de nucleótidos se puede aplicar el principio terapéutico también a cualesquiera otros virus, bacterias u otros patógenos. Una premisa para una transferencia a otros agentes provocadores de enfermedades es solamente el hecho de que se conozca el gen de este agente patógeno de enfermedad que es esencial para el ciclo de vida. Éstos se presentan en su secuencia en gran multiplicidad en los denominados bancos de datos de genes. Algo similar resulta válido para oncogenes o otros genes celulares que tengan que ser reprimidos en su función. Ejemplos de otros genes celulares son los que codifican enzimas, receptores, canales de iones, moduladores inmunitarios, factores del crecimiento u otras proteínas reguladoras. La secuencia V se orienta por ejemplo hacia el promotor del gen APP770, que ha sido hecho responsable de la expresión de la proteína precursora de las proteínas amiloides formadoras de calvas en la enfermedad de Alzheimer. La Secuencia VI simula como oligonucleótido del mismo sentido la región de fijación a SP1 del adenovirus E1b e inhibe la transcripción de E1b como compuesto análogo a oligonucleótido modificado en 3' con un espaciador 3'5' de la fórmula IB-2. Ejemplos de oncogenes son abl, neu, myc, myb, ras, fos, mos, erbB, ets, jun, p53, src y rel.

Sondas para ácidos nucleicos, en particular para los ADN obtenidos a partir de compuestos análogos a oligonucleótidos de la fórmula IA y B ofrecen, al contrario que los derivados de oligonucleótidos con un grupo 3'-hidroxi, conocidos por la bibliografía, por un lado, la ventaja de una estabilidad aumentada frente a nucleasas, pero, por otro lado, permiten también la admisión de moléculas de marcadores iguales o diferentes en ambos extremos del oligonucleótido. Es ventajoso el hecho de que se pueden excitar selectivamente dentro de un oligonucleótido diferentes agrupaciones de marcadores (doble marcación). La derivatización bifuncional se puede utilizar también para introducir en un extremo un marcador y en el otro extremo una función adicional (por ejemplo una marca de afinidad). Con esta finalidad se puede incorporar por ejemplo biotina en un extremo 3' del oligonucleótido, que reconoce a avidina o estreptavidina, mientras que en el otro extremo 3' se puede disponer a través de un elemento enlazador alquil-amino un marcador de quimioluminiscencia del tipo de éster de acridinio.

En muchos casos, además, el comportamiento de penetración de los compuestos análogos a oligonucleótidos conformes al invento es más favorable que en el caso de los oligonucleótidos no modificados, en particular cuando se introducen radicales lipófilos. La estabilidad en suero aumentada de los compuestos análogos a oligonucleótidos de la fórmula IB conformes al invento, su mejorada accesibilidad a las células, su mejorada afinidad de fijación, su capacidad para destruir selectivamente secuencias dianas mediante modificación (alquilación, reticulación), así como su detectabilidad mejorada en el caso del diagnóstico por ADN, pasan a expresarse en una actividad biológica más alta en comparación con la de los oligonucleótidos no modificados.

Las aplicaciones diagnósticas, profilácticas y terapéuticas precedentemente mencionadas de los compuestos análogos a oligonucleótidos conformes al invento constituyen solamente una selección de ejemplos representativos y su utilización no está limitada por tanto a ellos. Además de ello, los compuestos análogos a oligonucleótidos conformes al invento se pueden emplear por ejemplo también como agentes auxiliares en la biotecnología y en la biología molecular.

El invento se refiere además a formulaciones farmacéuticas, que contienen una cantidad eficaz de uno o varios compuestos de la fórmula IB o de sus sales fisiológicamente compatibles, eventualmente en común con materiales auxiliares y/o de vehículo fisiológicamente compatibles y/o en común con otras sustancias activas conocidas, así como a un procedimiento para la preparación de estas formulaciones, caracterizado porque la sustancia activa, juntamente con el vehículo y eventualmente otras sustancias auxiliares, aditivas o activas, se lleva a una forma de presentación apropiada. La aplicación se efectúa con preferencia por vía intravenosa, tópica o intranasal.

Ejemplo 1 Preparación de un soporte de la fórmula IV a) Preparación del soporte de la fórmula IVa por reacción de amino-propil-CPG con el succinato del bis-hidroxietil-sulfono-dimetoxitritil-éter

4,56 g del dimetoxitritil (DMTr)-éter sencillo de bis-(2-hidroxi-etil)-sulfona (10 mmol) se secan mediante recogida y concentración realizadas dos veces en piridina absoluta, se disuelven en 25 ml de piridina absoluta, se mezclan con 1,78 g (14 mmol) de DMAP (dimetilamino-piridina) y 1,4 g del anhídrido de ácido succínico (14 mmol), y esta mezcla se agita durante 3 horas a la temperatura ambiente. Después de haberse completado la reacción, se concentra, el residuo, para la eliminación de la piridina, se recoge tres veces en tolueno y se concentra y después de ello se recoge en 220 ml de cloruro de metileno. La fase orgánica se lava con ácido cítrico al 10% (110 ml) y 3 veces con 110 ml de agua, se seca sobre sulfato de sodio y se concentra. El residuo sólido resultante se seca en vacío (5,64 g). 1,67 g (3 mmol) de este succinato se recogen dos veces en piridina absoluta y se concentran, y se disuelven en una mezcla de 0,65 ml de piridina absoluta y 6 ml de tetrahidrofurano (THF) absoluto. Luego se añade una solución de 420 mg (3 mmol) de p-nitro-fenol y 687 mg de DCC (diciclohexil-carbodiimida, 3,3 mmol) en 2,1 ml de THF absoluto y se agita durante dos horas a la temperatura ambiente. Después de haberse completado la reacción, se separa por centrifugación con respecto de la diciclohexil-urea precipitada. El sedimento se suspende en 1 ml de éter absoluto y se centrifuga nuevamente. 1,5 g del soporte aminopropil-CPG de la entidad Fluka (500 \Delta, 100 \mumol/g de función amino) se suspenden en una mezcla de 1,8 ml de DMF absoluta y 350 \mul de trietil-amina, se mezclan con las soluciones reunidas del succinato-nitro-fenil-éster, separadas del sedimento por decantación, y se agitan durante 16 horas a la temperatura ambiente. El soporte sólido se separa y para el bloqueo de grupos reactivos se agita durante una hora a la temperatura ambiente con 3 ml de un reactivo de remate (mezcla de anhídrido de ácido acético, 2,6-lutidina y DMAP; de cada uno 0,25 M en THF). Luego el soporte de CPG derivatizado se filtra con succión, se lava con metanol, THF, cloruro de metileno y un éter y a continuación se seca en vacío a 40ºC. La carga del soporte de la fórmula IVa con el componente que contiene dimetoxitritilo es de 38 \mumol/g.

b) Preparación del soporte de la fórmula IVb por reacción de TentaGel®

(® = marca registrada de producto de la entidad Rapp, Tübingen) con el succinato del bis-hidroxietil-sulfono-dimetoxitritil-éter.

La forma con amino de la resina TentaGel, que es un copolímero de PS y POE con 250 \mumol/g de función amino (100 mg), se suspende en una mezcla de 360 \mul de DMF y 70 \mul de trietil-amina, se reúne con 400 \mumol del succinato-p-nitro-fenil-éster (para cuya preparación véase el Ejemplo 1a) y se agita durante 16 horas a la temperatura ambiente. A continuación se trata tal como se ha descrito en el Ejemplo 1a. La carga de la resina TentaGel de la fórmula IVb con el componente que contiene dimetoxitritilo es de 98 \mumol/g.

c) Preparación del soporte IVc por reacción del TentaGel (en la forma de hidroxi) con el reactivo de fosfitilación de la fórmula IX

(Z'' = DMTr-O-CH_{2}CH_{2}-S-CH_{2}CH_{2}-O-; R^{9} = N(i-C_{3}H_{7})_{2}; R^{10} = O-CH_{2}CH_{2}CN).

La forma de hidroxi de la resina TentaGel con 500 \mumol/g de la función hidroxi (50 mg) se hace reaccionar con 10 equivalentes del reactivo de fosfitilación de la fórmula IX

(Z'' = DMTr-O-CH_{2}CH_{2}-S-CH_{2}CH_{2}-O-; R^{9} = N(i-C_{3}H_{7})_{2}; R^{10} = O-CH_{2}CH_{2}CN)

en presencia de 25 equivalentes de tetrazol en acetonitrilo a 22ºC. Después de la oxidación con agua yodada (1,3 g de yodo en una mezcla de THF, agua y piridina: 70:20:5 = v:v:v = volumen : volumen : volumen) se somete a tratamiento como en el Ejemplo 1a. La carga del soporte de la fórmula IVc con el componente que contiene dimetoxitritilo es de 247 \mumol/g.

Ejemplo 2 Preparación de nucleósido-3'-fósforo-amiditos protegidos de la fórmula VIII a) Preparación de VIII a (B' = Cyt^{iBu}, Z = O-CH_{2}CH_{3}, R^{5} = R^{6} = i-C_{3}H_{7})

2 mmol del nucleósido-3'-fósforo-bis-amidito de la fórmula VI (B' = Cyt^{iBu}, R^{5} = R^{6} = R^{7} = R^{8} = i-C_{3}H_{7}) se recogen dos veces en 20 ml de acetonitrilo absoluto y se emplean y se disuelven en 20 ml de acetonitrilo absoluto. Luego se añade gota a gota una solución de 2,4 mmol de etanol y 1,2 mmol de tetrazol sublimado en 5 ml de acetonitrilo absoluto durante 15 minutos. Después de que se hubo seguido agitando todavía durante 2,5 horas, se diluye con 75 ml de cloruro de metileno y la fase orgánica se extrae con 50 ml de una solución al 5% de hidrógeno-carbonato de sodio. La solución acuosa se lava 2 veces con 50 ml de cloruro de metileno, las fases orgánicas reunidas se secan sobre sulfato de sodio y se concentran en vacío. Para la purificación, el residuo se cromatografía a través de una columna de gel de sílice con una mezcla de cloruro de metileno, n-heptano y trietil-amina (45:45:10; v:v:v). Se obtienen 0,7 g de la deseada sustancia diastereoisómera como compuesto uniforme según la cromatografía de capa fina. (^{31}P-NMR \sigma = 146,7, 147,5 ppm). Como producto secundario se pueden aislar vestigios del correspondiente bis-etil-fosfito (^{31}P-NMR \sigma = 139,3 ppm).

b) Preparación de VIII b (B' = Thy, Z = O-i-C_{3}H_{7}, R^{5} = R^{6} = i-C_{3}H_{7})

La preparación se efectúa por fosfitilación de la 5'-O-dimetoxitritil-timidina de la fórmula X (B' = Thy (posición \beta); R = DMTr, V = 0, a = 0, Y'' = 0, 2 mmol) con el bis-amidito de la fórmula IX (Z'' = O-i-C_{3}H_{7}, R^{9}= R^{10}= N(i-C_{3}H_{7})_{2}; 4 mmol) en presencia de tetrazol (0,5 mmol) en 10 ml de cloruro de metileno absoluto. La tanda se somete a tratamiento como en el Ejemplo 2a. (^{31}P-NMR \sigma = 145,04 ppm, 145,66 ppm).

c) Preparación de VIII c (B' = Cyt^{iBu}, Z = O-n-C_{6}H_{13}, R^{5} = R^{6} = i-C_{3}H_{7})

Análogamente al Ejemplo 2a a partir del bis-amidito de la fórmula VIa (B' = Cyt^{iBu}, R^{5} = R^{6} = R^{7} = R^{8} = i-C_{3}H_{7}) por reacción con un equivalente de n-hexanol mediando catálisis por tetrazol. (^{31}P-NMR 148,1 ppm, 148,5 ppm).

d) Preparación de VIII d (B' = Cyt^{iBu}, Z = O-n-C_{18}H_{37}, R^{5} = R^{6} = i-C_{3}H_{7})

Análogamente al Ejemplo 2a a partir del bis-amidito de la fórmula VIa (B' = Cyt^{iBu}, R^{5} = R^{6} = R^{7} = R^{8} = i-C_{3}H_{7}) por reacción con un equivalente de n-octadecanol mediando catálisis por tetrazol. (^{31}P-NMR 147,2 ppm, 147,9 ppm).

e) Preparación de VIII e (B' = Cyt^{Bz}, Z = 3-piridil-propan-3-oxi, R^{5} = R^{6} = R^{7} = R^{8} = i-C_{3}H_{7})

Análogamente al Ejemplo 2a a partir del bis-amidito de la fórmula VIa (B' = Cyt^{Bz}, R^{5} = R^{6} = R^{7} = R^{8} = i-C_{3}H_{7}, R^{2'} = H) por reacción con un equivalente de 3-piridin-(propan-3-ol) mediando catálisis por tetrazol. En este caso se pudieron separar los dos diastereoisómeros por cromatografía en columna. (^{31}P-NMR diastereoisómero 1: 147,7 ppm, diastereoisómero 2: 148,2 ppm).

f) Preparación de VIII f (B' = Cyt^{Bz}, p-nitro-fenil-etil-2-oxi, R^{5} = R^{6} = i-C_{3}H_{7})

Análogamente al Ejemplo 2a a partir del bis-amidito de la fórmula VIa (B' = Cyt^{Bz}, R^{5} = R^{6} = R^{7} = R^{8} = i-C_{3}H_{7}) por reacción con un equivalente de p-nitro-fenil-etan-2-ol mediando catálisis por tetrazol. (^{31}P-NMR 148,1 ppm, 148,6 ppm).

g) Preparación de VIII g (B' = Cyt^{Bz}, Z = -(OCH_{2}CH_{2})_{3}OCH_{3}, R^{5} = R^{6} = i-C_{3}H_{7})

Análogamente al Ejemplo 2a a partir del bis-amidito de la fórmula VIa (B' = Cyt^{Bz}, R^{5} = R^{6} = R^{7} = R^{8} = i-C_{3}H_{7}) por reacción con un equivalente de trietilen-glicol-monometil-éter mediando catálisis por tetrazol. (^{31}P-NMR 148,5 ppm, 148,9 ppm).

h) Preparación de VIII h (B' = Cyt^{Bz}, Z = -(OCH_{2}CH_{2})_{4}O(CH_{2})_{9}CH_{3}, R^{5} = R^{6} = i-C_{3}H_{7})

Análogamente al Ejemplo 2a a partir del bis-amidito de la fórmula VIa (B' = Cyt^{Bz}, R^{5} = R^{6} = R^{7} = R^{8} = i-C_{3}H_{7}) por reacción con un equivalente de tetraetilen-glicol-monodecil-éter mediando catálisis por tetrazol. (^{31}P-NMR 148,4 ppm, 148,8 ppm).

i) Preparación de VIII i (B' = Cyt^{Bz}, Z = -(OCH_{2}CH_{2})_{5}O(CH_{2})_{4}CH_{3}, R^{5} = R^{6} = i-C_{3}H_{7})

Análogamente al Ejemplo 2a a partir del bis-amidito de la fórmula VIa (B' = Cyt^{Bz}, R^{5} = R^{6} = R^{7} = R^{8} = i-C_{3}H_{7}) por reacción con un equivalente de pentaetilen-glicol-monopentil-éter mediando catálisis por tetrazol. (^{31}P-NMR 148,4 ppm, 148,9 ppm).

k) Preparación de VIII k (B' = Cyt^{Bz}, Z = -(OCH_{2}CH_{2})_{8}O(CH_{2})_{13}CH_{3}, R^{5} = R^{6} = i-C_{3}H_{7})

Análogamente al Ejemplo 2a a partir del bis-amidito de la fórmula VIa (B' = Cyt^{Bz}, R^{5} = R^{6} = R^{7} = R^{8} = i-C_{3}H_{7}) por reacción con un equivalente de octaetilen-glicol-monotetradecil-éter mediando catálisis por tetrazol. (^{31}P-NMR 148,4 ppm, 148,8 ppm).

l) Preparación de VIII p (B' = Thy, Z = CH_{3}, R^{5} = R^{6} = i-C_{3}H_{7})

Análogamente al Ejemplo 2b a partir de 5'-O-dimetoxitritil-timidina mediante fosfitilación con el reactivo de la fórmula IX (Z'' = CH_{3}, R^{9} = Cl, R^{10} = N(i-C_{3}H_{7})_{2}, catalizándose con dos equivalentes de diisopropil-etil-amina en vez de con tetrazol. (^{31}P-NMR 120,6 ppm, 121,0 ppm).

m) Preparación de VIII k (B' = Cyt^{Bz}, Z = acridin-9-(butyl-4-oxi)-, R^{5} = R^{6} = i-C_{3}H_{7})

Análogamente al Ejemplo 2a a partir del bis-amidito de la fórmula VIa (B' = Cyt^{Bz}, R^{5} = R^{6} = R^{7} = R^{8} = i-C_{3}H_{7}) por reacción con un equivalente de 9-(hidroxibutil)acridina mediando catálisis por tetrazol. (^{31}P-NMR 146,7 ppm, 147,4 ppm).

Ejemplo 3 Preparación del nucleótido de la fórmula VII fijado a un soporte

a) Método A

Preparación de un soporte de la fórmula VIIa-1 por acoplamiento del nucleósido-3'-fósforo-amidito de la fórmula VIIIb

7,5 mg del soporte del Ejemplo 1a, que mantiene fijados 0,2 \mumol del bis-hidroxietil-sulfono-dimetoxitritil-éter, se tratan con ácido tricloroacético al 3%, siendo separado el grupo protector DMTr, se lavan con acetonitrilo y a continuación se llevan a reaccionar con 2 \mumol del nucleósido-3'-fósforo-amidito de la fórmula VIIIb (B' = Thy, Z = O-i-C_{3}H_{7}, R^{5} = R^{6} = i-C_{3}H_{7}) en presencia de tetrazol (10 \mumol) en acetonitrilo. El período de tiempo de reacción es de 2,5 minutos. Después de ello se oxida con agua yodada (para W = O; 1,3 g de yodo en una mezcla de THF, agua y piridina; 70:20:5 = v:v:v, 5 minutos).

b) Método B

Preparación de un soporte de la fórmula VIIa-2 por reacción a través del reactivo de fosfitilación de la fórmula IX

El reactivo de fosfitilación de la fórmula IX (Z'' = n-octilo, R^{9} = R^{10} = Cl; 1 equivalente) se hace reaccionar en presencia de 1,2 equivalentes de diisopropil-etil-amina (DIPEA) en acetonitrilo absoluto o cloruro de metileno con un nucleósido de la fórmula X (1 equivalente de 5'-O-dimetoxitritil-piridina, B' = posición \beta, Y''' = O,) a -78ºC, para formar el correspondiente nucleósido-3'-O-n-octil-fosfono-monocloruro. El soporte de la fórmula IVa se trata tal como se ha descrito en el Método A para la separación del grupo protector D = DMTr, se lava con acetonitrilo y se hace reaccionar en presencia de DIPEA con un exceso del nucleósido-3'-O-n-octil-fosfono-monocloruro preparado in situ. Después de una oxidación con agua yodada se obtiene un nucleótido de la fórmula VIIa-2 fijado a un soporte, que está a disposición para la síntesis ulterior del oligonucleótido.

Ejemplo 4 Preparación de oligonucleótidos de la fórmula IB (El monómero es en cada caso un \beta-D-desoxi-ribonucleósido) a) Preparación de un oligonucleótido de la fórmula IB-1 (R^{1} = R^{2} = H, Z = n-C_{8}CH_{17}, a = U = V = W = X = Y = Y' = O, i = 1, d = 9, e = 16)

(3'5'S) = p(CH_{2}

\delm{C}{\delm{\para}{OCH _{2} C _{6} H _{5} }}

HCH_{2}p)_{5}

d(GpGpTpGpGpTpGpGpTpT(3'5'S)TpTpCpCpTpCpCpTpGpCpGpGpGpApApGpGp-n-C_{8}CH_{17}

Partiendo del soporte de la fórmula VIIa-2 (B' = Gua^{PAC}, W = O, Z = n-C_{8}CH_{17}), cuya preparación se efectúa de manera análoga a como se describe en el Ejemplo 3b, la constitución de la cadena se efectúa como se describe en el Ejemplo 4b del documento EP-A-0 552 767. Sin embargo, para la preparación de sustituciones lábiles en cuanto a las bases (como aquí para Z = n-C_{8}CH_{17}), se utilizan ventajosamente los grupos protectores amino más lábiles N^{6}-fenoxiactil-Ade (Ade^{PAC}), N^{4}-isobutiril-Cyt (Cyt^{IBu}), N^{2}-fenoxiactil-Gua (Gua^{PAC}), los cuales son más fáciles de separar al final de la síntesis. Después del 16º ciclo de reacción se llevan a cabo 5 ciclos con el reactivo de la fórmula XIVb con el fin de introducir el espaciador (3'5') deseado. Después se incorporan las restantes 10 unidades de nucleótidos tal como se describe en el Ejemplo 4a del documento EP-A-0 552 767. A la separación del soporte (1,5 horas a la temperatura ambiente) con amoníaco concentrado le sigue un tratamiento durante 6 horas con etilendiaina/etanol/agua (5:4:1, v:v:v) para la liberación de la función amino de las bases.

b) Preparación de un oligonucleótido de la fórmula IB-2 (R^{1} = R^{2} = H, Z = O-(CH_{2}CH_{2}O)_{8}(CH_{2})_{13}CH_{3}, a = U = V = W = X = Y = Y' = O, d, e = 15, i = 1)

(3'5'S) = p(CH_{2}CH_{2}CH_{2}p)_{4}

d(GpGpGpCpGpGpGpGpCpTpTpApApApGpG(3'5'S)CpCpTpTpTpApApGpCpCpCpCpGpCpCpCp-O-(CH_{2}CH_{2}O)_{8}(CH_{2})_{13}CH_{3})

Partiendo del soporte de la fórmula VIIa-6 (B' = Cyt^{Bz}, W = O, Z = O-(CH_{2}CH_{2}O)_{8}(CH_{2})_{13}CH_{3}), la cual se preparó como se describe en el Ejemplo 3a con ayuda del amidito de la fórmula VIIIk, la síntesis de oligonucleótidos se efectúa inicialmente de manera análoga al Ejemplo 4b del documento EP-A-0 552 767. Después del 15º ciclo de reacción se llevan a cabo 4 ciclos con el eslabón de la fórmula XIVd. Los restantes 16 nucleótidos se incorporan tal como se describe en el Ejemplo 4b con 5'-O-DMTr-nucelósido-3'-fosforoamiditos.

Ejemplo 5 Comprobación en cuanto a la estabilidad frente a nucleasas

10 nmol del oligonucleótido que se ha de investigar se disuelven en 450 \mul de un suero de ternero fetal al 20% en un medio RPMI y 50 ml de agua bidestilada, y se incuban a 37ºC. Luego, de modo inmediato y después de 1, 2, 4, 7 y 24 horas se sacan muestras de 10 \mul para la electroforesis en gel o muestras de 20 \mul para la HPLC, con el fin de interrumpir la reacción se mezcla con 5 \mul y 10 \mul respectivamente de formamida y se calienta a 95ºC durante 5 minutos. Para la electroforesis en gel, las muestras se aplican sobre un gel de poli(acril-amida) al 15% (2% de BIS) y éste se revela a aproximadamente 3.000 voltios-horas. Las bandas se hacen visibles mediante la coloración con plata. Para el análisis por HPLC las muestras se proyectan sobre una columna para HPLC Gen-Pak Fax (entidad Waters/Millipore) y se cromatografían a razón de 1 ml/min con un gradiente de 5 a 50% de un tampón A en B (tampón A: dihidrógeno-fosfato de sodio 10 \muM, NaCl 0,1 M en una mezcla de acetonitrilo y agua 1:4 (v:v) de pH 6,8; tampón B: como el A pero con NaCl 1,5 M).

Ejemplo 6 Actividad antivírica

El efecto antivírico de los compuestos conformes al invento se ensaya en experimentos in vitro. Para ello los compuestos conformes al invento se añaden en diferentes diluciones a cultivos celulares de células HeLa y Vero dentro de placas de microtitulación. Después de 3 h, los cultivos se infectan con diferentes virus patógenos para seres humanos (p.ej.: virus de herpes HSV-1, HSV-2, ortomixovirus de influenza A2, picornavirus rinovirus 2). A las 48 hasta 72 h después de la infección se determina en un microscopio el éxito de la terapia con ayuda del efecto citopatógeno y fotométricamente después de una fotografía con rojo neutro (ensayo colorimétrico de acuerdo con Finter) (Finter, N.B., en "Interferones", N.B. Finter y colaboradores, North Holland Publishing Co., Amsterdam, 1966). La concentración mínima, a la que aproximadamente la mitad de las células infectadas no muestra ningún efecto citopatógeno, se considera como concentración inhibidora mínima (MHK de minimale Hemmkonzentration).

Claims (11)

1. Compuestos análogos a oligonucleótidos de la fórmula IB

42

así como de sus sales fisiológicamente compatibles, caracterizados porque

R^{1}

significa hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{18}, alquenilo C_{2}-C_{18}, alquinilo C_{2}-C_{18}, alquilcarbonilo C_{2}-C_{18}, alquenilcarbonilo C_{3}-C_{19}, alquinilcarbonilo C_{3}-C_{19}, arilo C_{6}-C_{20}, aril (C_{6}-C_{14})-alquilo (C_{1}-C_{8}), o un radical de la fórmula II:

(II)Z ---

\melm{\delm{\dpara}{W}}{P}{\para}

--- Z';

R^{2}

significa hidrógeno, hidroxi, alcoxi C_{1}-C_{18}, halógeno, azido o NH_{2;}

B

representa una base usual en la química de los oligonucleótidos;

a

representa oxi o metileno;

d, e, independientemente unos de otros, significan un número entero de 0 a 50;

i

significa un número entero de 1 a 10;

W

significa oxo, selenoxo o tioxo;

V

significa oxi, sulfanodiílo o imino;

Y

significa oxi, sulfanodiílo, imino o metileno;

Y'

significa oxi, sulfanodiílo, imino, (CH_{2})_{m} o V(CH_{2})_{m}, en que

m

significa un número entero de 1 a 18;

X

significa hidroxi o mercapto;

U

significa hidroxi, mercapto, SeH, alcoxi C_{1}-C_{18}, alquilo C_{1}-C_{18}, arilo C_{6}-C_{20}, aril (C_{6}-C_{14})-alquilo (C_{1}-C_{8}), NHR^{3}, NR^{3}R^{4} o un radical de la fórmula (OCH_{2}CH_{2})_{p}O(CH_{2})_{q}CH_{2}R^{11}, en que

R^{3}

significa alquilo C_{1}-C_{18}, con preferencia alquilo C_{1}-C_{8}, arilo C_{6}-C_{20}, aril (C_{6}-C_{14})-alquilo (C_{1}-C_{8}), -(CH_{2})_{c}-[NH(CH_{2})_{c}]_{d}-NR^{12}R^{12}, en que c es un número entero de 2 a 6 y d es un número entero de 0 a 6, y los R^{12} independientemente uno de otro, son hidrógeno o alquilo C_{1}-C_{6}, o alcoxi C_{1}-C_{4}-alquilo C_{1}-C_{6};

R^{4}

significa alquilo C_{1}-C_{18}, arilo C_{6}-C_{20} o aril (C_{6}-C_{10})-alquilo (C_{1}-C_{8}), o en el caso de NR^{3}R^{4} en común con R^{3} y el átomo de nitrógeno que los lleva, significa un anillo heterocíclico de 5-6 miembros, que adicionalmente puede contener un heteroátomo adicional seleccionado entre la serie formada por O, S, N,

p

significa un número entero de 1 a 100,

q

es un número entero de 0 a 18,

R^{11}

significa hidrógeno o un grupo funcional hidroxi, amino, NHR^{12}, COOH, CONH_{2}, COOR^{12} o halógeno, en donde R^{12} significa alquilo C_{1}-C_{4};

S

es un grupo de la fórmula III

43

en la que

h

es cuatro o cinco;

G

tiene el significado de alquileno C_{1}-C_{12}, pudiendo el alquileno estar sustituido eventualmente con halógeno, amino, hidroxi, alquilo C_{1}-C_{18}, alcoxi C_{1}-C_{18}, alquil C_{1}-C_{18}-carboniloxi, arilo C_{6}-C_{14}, aril C_{6}-C_{14}-alquilo C_{1}-C_{18}, o aril C_{6}-C_{14}-alcoxi C_{1}-C_{8}, aril C_{6}-C_{14}-di-alquileno C_{1}-C_{8}, arileno C_{6}-C_{18} de un grupo de la fórmula (CH_{2}CH_{2}V)_{\alpha} CH_{2}CH_{2} ó (CH_{2}V)_{\alpha}CH_{2}, en que \alpha es un número entero de 1 a 11,

\quad

de una unidad de la fórmula

---[G --- Y ---

\melm{\delm{\dpara}{W}}{P}{\uelm{\para}{U}}

--- Y' ---]_{\beta}

en la que \beta significa un número entero de 1 a 6, o de un grupo de la fórmula

\vskip1.000000\baselineskip

44

\newpage

Z = Z' significan hidroxi, mercapto, SeH, alcoxi C_{1}-C_{22}, -O-(CH_{2})_{b}-NR^{12}R^{13}, en que b es un número entero de 1 a 6, y R^{13} es alquilo C_{1}-C_{6} ó R^{12} y R^{13} en común con el átomo de nitrógeno que los lleva, forman un anillo de 3-6 miembros, alquilo C_{1}-C_{18}, alquilo C_{1}-C_{8}, arilo C_{6}-C_{20}, aril (C_{6}-C_{14})-alquilo (C_{1}-C_{8}), aril (C_{6}-C_{14})-alcoxi (C_{1}-C_{8}), significando el arilo también heteroarilo y estando el arilo eventualmente sustituido con 1, 2 ó 3 radicales iguales o diferentes seleccionados entre la serie formada por carboxi, amino, nitro, alquil C_{1}-C_{4}-amino, hidroxi, halógeno y ciano, alquilmercapto C_{1}-C_{18}, NHR^{3}, NR^{3}R^{4}, un radical de la fórmula III, o un grupo que favorece la admisión intracelular o que sirve como marcación para una sonda de ADN;

el paréntesis alargado en las posiciones 2' y 3' señala que R^{2} y el radical fosforilo contiguo se pueden encontrar también de manera inversa en posiciones 3' y 2',

pudiendo presentarse cada nucleótido en su configuración D ó L, y pudiendo encontrarse la base B en posición \alpha o \beta.

2. Compuestos análogos a oligonucleótidos según la reivindicación 1, caracterizados porque la base se encuentra en posición \beta, los nucleótidos se presentan en la configuración D, R^{2} se encuentra en la posición 2' y a representa oxi.

3. Compuestos análogos a oligonucleótidos según la reivindicación 1 ó 2, caracterizados porque

R^{1}

significa hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{6}, en particular metilo, o un radical de la fórmula II;

R^{2}

significa hidrógeno o hidroxi, en particular hidrógeno;

d, e significan un número entero de 5 a 15;

i

significa un número entero de 1 a 3;

m

significa un número entero de 1 a 6, en particular 1;

U

significa hidroxi, mercapto, alcoxi C_{1}-C_{6}, alquilo C_{1}-C_{6}, NR^{3}R^{4} o NHR^{3}, en particular hidroxi o alquilo C_{1}-C_{6}, en el que

R^{3}

es alquilo C_{1}-C_{8}, con preferencia alquilo C_{1}-C_{4}, o metoxietilo y B, W, V, Y, Y', X y Z tienen los significados antes mencionados.

4. Compuestos análogos a oligonucleótidos según una o varias de las reivindicaciones 1, 2 ó 3, caracterizados porque V, Y e Y' tienen los significados de oxi.

5. Compuestos análogos a oligonucleótidos según una o varias de las reivindicaciones 1-3 ó 4, caracterizados porque W tiene el significado de oxo.

6. Compuestos análogos a oligonucleótidos según una o varias de las reivindicaciones 1-4 ó 5, caracterizados porque U tiene el significado de hidroxi.

7. Compuestos análogos a oligonucleótidos según una o varias de las reivindicaciones 1-4 ó 5, caracterizados porque R^{1} representa hidrógeno.

8. Procedimiento para la preparación de compuestos análogos a oligonucleótidos de la fórmula IA según la reivindicación 1, en el que

a)

en el primer ciclo de reacción una unidad de nucleótido con una agrupación de fósforo(V) en el extremo terminal de 3'(2') y un grupo 5'-hidroxi o mercapto libre, se hace reaccionar con otra unidad de nucleótido con una agrupación de fósforo(III) o fósforo(V) situada en posición 3'(2') o uno de sus derivados activados, o con un reactivo que permite la introducción de grupos espaciadores, en los ciclos ulteriores una unidad de nucleótido con una agrupación de fósforo(III) o de fósforo(V) en el extremo terminal de 3'(2') o 5' respectivamente o uno de sus derivados activados se hace reaccionar con otra unidad de nucleótido adicional con un grupo hidroxi o mercapto libre junto al extremo terminal de 5' ó 3'(2') respectivamente, o

b)

los compuestos análogos a oligonucleótidos se constituyen de igual manera mediante fragmentos,

en los oligonucleótidos obtenidos según (a) o (b) se separan grupos protectores introducidos provisionalmente para la protección de otras funciones, y los compuestos análogos a oligonucleótidos de la fórmula IA y IB así obtenidos se transforman eventualmente en sus sales fisiológicamente compatibles.

9. Utilización de los compuestos análogos a oligonucleótidos según una o varias de las reivindicaciones 1-6 ó 7 para la preparación de un medicamento para la inhibición de la expresión de genes.

10. Utilización de los compuestos análogos a oligonucleótidos según una o varias de las reivindicaciones 1-6 ó 7 para la preparación de una sonda para la detección de ácidos nucleicos.

11. Formulación farmacéutica que contiene uno o varios compuestos análogos a oligonucleótidos de la fórmula IB según una o varias de las reivindicaciones 1-6 ó 7, eventualmente junto con materiales auxiliares y/o de vehículo fisiológicamente compatibles.