ES2250268T3 - Analogos de oligonucleotidos 3'-derivatizados con agrupaciones no nucleotidicas, su preparacion y utilizacion. - Google Patents
Analogos de oligonucleotidos 3'-derivatizados con agrupaciones no nucleotidicas, su preparacion y utilizacion.Info
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Abstract
Compuestos análogos a oligonucleótidos de la **fórmula** así como de sus sales fisiológicamente compatibles, caracterizados porque R1 significa hidrógeno, alquilo C1-C18, alquenilo C2- C18, alquinilo C2-C18, alquilcarbonilo C2-C18, alquenilcarbonilo C3-C19, alquinilcarbonilo C3-C19, arilo C6-C20, aril (C6-C14)-alquilo (C1-C8), o un radical de la **fórmula** ; R2 significa hidrógeno, hidroxi, alcoxi C1-C18, halógeno, azido o NH2; B representa una base usual en la química de los oligonucleótidos; a representa oxi o metileno; d, e, independientemente unos de otros, significan un número entero de 0 a 50; i significa un número entero de 1 a 10; W significa oxo, selenoxo o tioxo; V significa oxi, sulfanodiílo o imino; Y significa oxi, sulfanodiílo, imino o metileno; Y'' significa oxi, sulfanodiílo, imino, (CH2)m o V(CH2)m, en que m significa un número entero de 1 a 18; X significa hidroxi o mercapto; U significa hidroxi, mercapto, SeH, alcoxi C1-C18, alquilo C1-C18, arilo C6-C20, aril (C6-C14)-alquilo (C1-C8), NHR3, NR3R4 o un radical de la fórmula (OCH2CH2)pO(CH2)qCH2R11.
Description
Análogos de oligonucleótidos
3'-derivatizados con agrupaciones no nucleotídicas,
su preparación y utilización.
El presente invento se refiere a nuevos
compuestos análogos a oligonucleótidos con valiosas propiedades
físicas, biológicas y farmacológicas, así como a un procedimiento
para su preparación. Su aplicación se refiere a la utilización como
agentes inhibidores de la expresión de genes (oligonucleótidos
antisentido, ribozimas, oligonucleótidos del mismo sentido y
oligonucleótidos formadores de triplex), como sondas para la
detección de ácidos nucleicos y como agentes auxiliares en la
biología molecular.
Los oligonucleótidos están encontrando aplicación
en medida creciente como agentes inhibidores de la expresión de
genes (G. Zon, Pharmaceutical Research 5, 539 (1988); J. S. Cohen,
Topics in Molecular and Structural Biology 12 (1989) Macmillan
Press; C. Helene y J. J. Toulme. Biochemica et Biophysica Acta 1049,
99 (1990); E. Uhlmann y A. Peyman, Chemical Reviews 90, 543 (1990)).
Los oligonucleótidos antisentido son fragmentos de ácidos nucleicos,
cuya secuencia de bases es complementaria con un ARNm (ácido
ribonucleico mensajero) inhibidor. Este ARNm diana puede ser de
origen celular, vírico o patógeno de otro modo. Como secuencias
dianas celulares entran en cuestión por ejemplo las de receptores,
enzimas, moduladores inmunitarios, canales de iones u oncogenes. La
inhibición de la reproducción de virus con ayuda de oligonucleótidos
antisentido se describió por ejemplo para los RSV (virus de sarcoma
de Rous), HSV-1 y -2 (virus del herpes simple de los
tipos I y II), HIV (virus de la inmunodeficiencia humana) y virus de
influenza. En tal caso se emplean oligonucleótidos que son
complementarios con el ácido nucleico vírico. Por el contrario, los
oligonucleótidos del mismo sentido están concebidos en su secuencia
de tal manera que fijen ("capten") por ejemplo proteínas que
fijan a ácidos nucleicos o enzimas que tratan a ácidos nucleicos, y
de esta manera inhiben su actividad biológica (Helene 1990). Como
dianas víricas se han de mencionar en este caso por ejemplo la
transcriptasa inversa, la polimerasa de ADN y las proteínas
transactivadoras.
Los oligonucleótidos formadores de triplex tienen
en general el ADN como diana y después de la fijación a éste forman
una estructura helicoidal triple. Mientras que con ayuda de los
oligonucleótidos antisentido se inhiben en general el tratamiento
(empalme, etc.) de los ARNm o su traducción en la proteína, los
oligonucleótidos formadores de un triplex inhiben la transcripción o
replicación de los ADN (Helene y colaboradores, 1990, Uhlmann y
Peyman, 1990). Sin embargo, también es posible fijar ácidos
nucleicos monocatenarios en una primera hibridación con un
oligonucleótido antisentido mediando formación de una doble cadena,
que luego en una segunda hibridación con un oligonucleótido formador
de triplex forma una estructura triplex. Las regiones de fijación a
antisentido y triplex pueden estar albergadas en tales casos o bien
en dos oligonucleótidos separados o por el contrario en un único
oligonucleótido. Una aplicación adicional de los oligonucleótidos
sintéticos son las denominadas ribozimas, que destruyen al ARN diana
como consecuencia de su actividad de ribonucleasa (J. J. Rossi y N.
Sarver, TIBTECH 8, 179 (1990)).
En el diagnóstico por ADN los fragmentos de
ácidos nucleicos con una marcación apropiada se emplean como las
denominadas sondas de ADN para la hibridación específica a un ácido
nucleico que se ha de detectar. La formación específica de la nueva
doble cadena se vigila en tal caso con ayuda de la marcación, que
con preferencia no es radiactiva. De esta manera se pueden detectar
enfermedades genéticas, malignas, víricas o causadas por otros
patógenos.
Para la mayor parte de las mencionadas
aplicaciones, los oligonucleótidos en su forma que se presenta en la
naturaleza son poco apropiados o totalmente inapropiados. Ellos
deben ser modificados químicamente de tal manera que se adapten a
los requisitos especiales. Para que los oligonucleótidos se puedan
emplear en sistemas biológicos, por ejemplo para la inhibición de la
reproducción de virus, deben cumplir las siguientes premisas:
- 1.
- Deben presentar una estabilidad suficientemente grande en condiciones in vivo, es decir tanto en el suero como también intracelularmente.
- 2.
- Deben estar constituidos de tal manera que puedan pasar a través de las membranas celulares y de núcleos.
- 3.
- Deben fijarse en condiciones fisiológicas a su ácido nucleico diana de un modo específico para ciertas bases, con el fin de desarrollar el efecto inhibidor.
Para las sondas de ADN, estas premisas no son
indispensables; sin embargo, estos oligonucleótidos deben ser
derivatizados de tal manera que sea posible una detección, por
ejemplo mediante fluorescencia, quimioluminiscencia, colorimetría o
coloración específica (Beck y Köster, Anal. Chem. 62, 2258
(1990)).
La modificación química de los oligonucleótidos
se efectúa en la mayor parte de los casos de un modo tal que el
esqueleto de fosfato, la unidad de ribosa o las núcleobases se
modifican de un modo correspondiente (Cohen, 1989; Uhlmann y Peyman,
1990). Un método adicional, utilizado con frecuencia, es la
preparación de conjugados en 5' con oligonucleótidos por reacción
del grupo 5'-hidroxi con correspondientes reactivos
de fosforilación.
Los oligonucleótidos, que están modificados
solamente junto al extremo 5', tienen la desventaja de que son
descompuestos en el suero. Cuando, por el contrario, se modifican
todos los radicales de fosfatos situados entre nucleótidos, se
modifican con frecuencia drásticamente las propiedades de los
oligonucleótidos. Por ejemplo la solubilidad de los
metil-fosfonato-oligonucleótidos en
un medio acuoso se disminuye y la capacidad para la hibridación se
reduce.
Los
fósforo-tioato-oligonucleótidos
actúan inespecíficamente, de manera tal que por ejemplo también los
homo-oligómeros son activos contra los virus.
Los oligonucleótidos antisentido poseen por lo
general una polaridad uniforme, que en el caso de la hibridación con
un ARN presentan en la mayor parte de los casos un carácter
antiparalelo (véase la Tabla 1; A). En determinados casos, por
ejemplo también en el caso de oligonucleótidos construidos por
unidades de \alpha-nucleósidos, la polaridad puede
también ser paralela (Tabla 1; B). Los oligonucleótidos formadores
de triplex se pueden hibridar con ácidos nucleicos de doble cadena
en general, de un modo dependiente de la secuencia, en orientación
paralela (Tabla 1; C) o antiparalela (Tabla 1; D) en lo que se
refiere a la cadena de ácido nucleico rica en purina. Para ello se
usan principalmente los motivos de emparejamiento de bases
T\bulletAT, G\bulletGC, C^{+}\bulletGC, G\bulletTA,
C^{Me}\bulletGC, A\bulletAT y C^{PI}\bulletGC, en los que
C^{+} significa un radical de citosina protonado, C^{Me}
significa un radical de
5-metil-citosina, C^{PI} significa
un radical de pseudo-iso-citosina y
"\bullet" significa un emparejamiento de bases de Hoogsteen o
de Hoogsteen inverso. Sin embargo la aplicación de estos
emparejamientos de bases de Hoogsteen se limita a regiones ricas en
purina de los ácidos nucleicos bicatenarios.
Con el fin de aumentar la flexibilidad de los
oligonucleótidos formadores de triplex en lo que se refiere a
secuencias dianas ricas en purina, se prepararon oligonucleótidos
con polaridad variable, que como consecuencia de un cambio de
cadenas (5'5') (Tabla 1; E) o de un cambio de cadenas (3'3'), que
eventualmente se pueden alternar (Tabla 1; F), pueden fijar en cada
caso regiones ricas en purina de la cadena opuesta (Ono y
colaboradores, Biochemistry (1991) 30, 9914)).
Es posible un cambio de cadenas mediando
mantenimiento de la polaridad, cuando se incorpora un espaciador
(3',5').
Además, es posible, con ayuda de bucles (5'5')
(Tabla 1; G) o de bucles (3'5') o (2'5'), preparar oligonucleótidos
antisentido especiales, en los cuales una región, mediante un
emparejamiento de bases según Watson-Crick, reconoce
a una cadena individual de ácido nucleico y una segunda región,
mediante un emparejamiento de bases según Hoogsteen, reconoce a una
doble cadena de ácido nucleico, que se establece a partir del
emparejamiento de bases según Watson-Crick. Con
ayuda de tales compuestos análogos a oligonucleótidos
antisentido/triplex es posible por lo tanto una formación de un
triplex en ácidos nucleicos monocatenarios. De una manera similar se
pueden preparar oligonucleótidos del mismo sentido bicatenarios que
fijan de modo específico para una secuencia a las proteínas que
fijan a los ADN, a través de emparejamientos de bases según
Watson-Crick intramoleculares (Tabla 1; I).
Finalmente, se pueden preparar oligonucleótidos,
que junto al extremo 5' contienen un espaciador 5'5' (Tabla 1; K).
En estos compuestos análogos a oligonucleótidos, ambos extremos
3'(2') pueden contener de modo ventajoso grupos fosforilo.
Los compuestos análogos a oligonucleótidos
conocidos hasta ahora, que obedecen los principios de acción
representados en la Tabla 1 desde C hasta I, poseen en general un
grupo hidroxi junto al extremo 3', de manera tal que son
descompuestos en el suero, en la mayor parte de los casos son mal
capaces de pasar a través de membranas y son derivatizables con
facilidad solamente junto al extremo 5'.
Es por lo tanto misión del invento poner a
disposición compuestos análogos a oligonucleótidos con propiedades
específicas de hibridación frente a ácidos nucleicos monocatenarios
y bicatenarios, con una aumentada estabilidad en suero, una buena
solubilidad y una actividad específica.
Son objeto del invento compuestos análogos a
oligonucleótidos de fórmula IB
así como sus sales fisiológicamente
compatibles,
en los
que
- R^{1}
- significa hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{18}, con preferencia alquilo C_{1}-C_{6}, alquenilo C_{2}-C_{18}, alquinilo C_{2}-C_{18}, alquilcarbonilo C_{2}-C_{18}, alquenilcarbonilo C_{3}-C_{19}, alquinilcarbonilo C_{3}-C_{19}, arilo C_{6}-C_{20}, aril (C_{6}-C_{14})-alquilo (C_{1}-C_{8}), o un radical de la fórmula II:
(II)Z ---
\melm{\delm{\dpara}{W}}{P}{\para}--- Z';
- R^{2}
- significa hidrógeno, hidroxi, alcoxi C_{1}-C_{18}, halógeno, azido o NH_{2};
- B
- representa una base usual en la química de los oligonucleótidos, por ejemplo representa bases naturales tales como adenina, citosina, guanina y timina, o bases no naturales tales como purina, 2,6-diamino-purina, 7-desaza-adenina, 7-desaza-guanina, N^{4}N^{4}-etano-citosina, N^{6}N^{6}-etano-2,6-diamino-purina, 5-metil-citosina, pseudo-iso-citosina;
- a
- representa oxi o metileno;
d, e, f independientemente unos de
otros, significan un número entero de 0 a 50, con preferencia de 5 a
15;
- i
- significa un número entero de 1 a 10, con preferencia de 1 a 3;
- W
- significa oxo, selenoxo o tioxo;
- V
- significa oxi, sulfanodiílo o imino;
- Y
- significa oxi, sulfanodiílo, imino o metileno;
\newpage
- Y'
- significa oxi, sulfanodiílo, imino, (CH_{2})_{m} o V(CH_{2})_{m}, en que
- m
- significa un número entero de 1 a 18, con preferencia de 1 a 6;
- X
- significa hidroxi o mercapto;
- U
- significa hidroxi, mercapto, SeH, alcoxi C_{1}-C_{18}, con preferencia alcoxi C_{1}-C_{6}, alquilo C_{1}-C_{18}, con preferencia alquilo C_{1}-C_{6}, arilo C_{6}-C_{20}, aril (C_{6}-C_{14})-alquilo (C_{1}-C_{8}), NHR^{3}, NR^{3}R^{4} o un radical de la fórmula (OCH_{2}CH_{2})_{p} O(CH_{2})_{q}CH_{2}R^{11}, en que
- R^{3}
- significa alquilo C_{1}-C_{18}, con preferencia alquilo C_{1}-C_{8}, arilo C_{6}-C_{20}, aril (C_{6}-C_{14})-alquilo (C_{1}-C_{8}), -(CH_{2})_{c}-[NH(CH_{2})_{c}]_{d}-NR^{12}R^{12}, en que c es un número entero de 2 a 6 y d es un número entero de 0 a 6, y los R^{12} independientemente uno de otro son hidrógeno o alquilo C_{1}-C_{6}, o alcoxi C_{1}-C_{4}-alquilo C_{1}-C_{6}, con preferencia metoxietilo;
- R^{4}
- significa alquilo C_{1}-C_{18}, con preferencia alquilo C_{1}-C_{8} y con especial preferencia alquilo C_{1}-C_{4}, arilo C_{6}-C_{20} o aril (C_{6}-C_{10})-alquilo (C_{1}-C_{8}), o en el caso de NR^{3}R^{4} en común con R^{3} y el átomo de nitrógeno que los lleva, significa un anillo heterocíclico de 5-6 miembros, que adicionalmente puede contener un heteroátomo adicional seleccionado entre la serie formada por O, S, N,
- p
- significa un número entero de 1 a 100, con preferencia de 3 a 20 y con especial preferencia de 3 a 8,
- q
- es un número entero de 0 a 18, con preferencia de 0 a 15,
- R^{11}
- significa hidrógeno o un grupo funcional tal como hidroxi, amino, NHR^{13}, COOH, CONH_{2}, COOR^{12} o halógeno, en que R^{12} significa alquilo C_{1}-C_{4}, con preferencia metilo;
- S
- es un grupo de la fórmula III
en la
que
- h
- es cuatro o cinco;
- G
- tiene el significado de alquileno C_{1}-C_{12}, en particular alquileno C_{2}-C_{4}, pudiendo el alquileno estar sustituido eventualmente con halógeno, amino, hidroxi, alquilo C_{1}-C_{18}, alcoxi C_{1}-C_{18}, alquil C_{1}-C_{18}-carboniloxi, arilo C_{6}-C_{14}, aril C_{6}-C_{14}-alquilo C_{1}-C_{18}, o aril C_{6}-C_{14}-alcoxi C_{1}-C_{8}, aril C_{6}-C_{14}-di-alquileno C_{1}-C_{8}, arileno C_{6}-C_{18} de un grupo de la fórmula (CH_{2}CH_{2}V)_{\alpha}CH_{2}CH_{2} ó (CH_{2}V)_{\alpha}CH_{2}, en que \alpha es un número entero de 1 a 11, con preferencia de 1 a 5,
- \quad
- de una unidad de la fórmula
---[G --- Y ---
\melm{\delm{\dpara}{W}}{P}{\uelm{\para}{U}}--- Y' ---]_{\beta}
en la que \beta significa un
número entero de 1 a 6, o de un grupo de la
fórmula
\vskip1.000000\baselineskip
Z = Z' significan hidroxi,
mercapto, SeH, alcoxi C_{1}-C_{22}, con
preferencia alcoxi C_{6}-C_{18},
-O-(CH_{2})_{b}-NR^{12}R^{13}, en que
b es un número entero de 1 a 6, y R^{13} es alquilo
C_{1}-C_{6} ó R^{12} y R^{13} en común con
el átomo de nitrógeno que los lleva, forman un anillo de
3-6 miembros, alquilo
C_{1}-C_{18}, con preferencia alquilo
C_{1}-C_{8}, arilo
C_{6}-C_{20}, aril
(C_{6}-C_{14})-alquilo
(C_{1}-C_{8}), con preferencia aril
(C_{6}-C_{10})-alquilo
(C_{1}-C_{14}), aril
(C_{6}-C_{14})-alcoxi
(C_{1}-C_{8}), con preferencia aril
(C_{6}-C_{10})-alcoxi
(C_{1}-C_{4}), significando el arilo también
heteroarilo y estando el arilo eventualmente sustituido con 1, 2 ó 3
radicales iguales o diferentes seleccionados entre la serie formada
por carboxi, amino, nitro, alquil
C_{1}-C_{4}-amino, hidroxi,
halógeno y ciano, alquilmercapto C_{1}-C_{18},
NHR^{3}, NR^{3}R^{4}, un radical de la fórmula III o un grupo
que favorece la admisión intracelular o que sirve como marcación
para una sonda de
ADN;
el paréntesis alargado en
posiciones 2' y 3' señala que R^{2} y el radical fosforilo
contiguo se pueden encontrar también de manera inversa en posiciones
3' y
2',
pudiendo presentarse cada
nucleótido en su configuración D ó L, y pudiendo encontrarse la base
B en posición \alpha ó
\beta.
Se prefieren los compuestos análogos a
oligonucleótidos de la fórmula IB, en los que la base B se encuentra
en posición \beta, los nucleótidos se presentan en la
configuración D, R^{2} se encuentra en posición 2' y a representa
oxi.
Son especialmente preferidos los compuestos
análogos a oligonucleótidos de las fórmulas IB, en los que
- R^{1}
- significa hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{6}, en particular metilo,
- \quad
- o un radical de la fórmula II;
- R^{2}
- significa hidrógeno o hidroxi, en particular hidrógeno;
d, e y f significan un número
entero de 5 a
15;
- i
- significa un número entero de 1 a 3;
- m
- significa un número entero de 1 a 6, en particular de 1;
- U
- significa hidroxi, mercapto, alcoxi C_{1}-C_{6}, alquilo C_{1}-C_{6}, NR^{3}R^{4} ó NHR^{3},
- \quad
- en particular hidroxi o alquilo C_{1}-C_{6}, en que
- R^{3}
- es alquilo C_{1}-C_{8}, con preferencia alquilo C_{1}-C_{4}, o metoxietilo, y B, W, V, Y, Y', X y Z tienen los significados antes mencionados.
Son preferidos en particular los compuestos
análogos a oligonucleótidos de la fórmula IB, en los que V, Y' e Y
tienen los significados de oxi.
Son además especialmente preferidos los
compuestos análogos a oligonucleótidos de la fórmula IB, en los que
V, Y, Y' y W tienen los significados de oxi u oxo.
Son muy especialmente preferidos los compuestos
análogos a oligonucleótidos de la fórmula IB, en los que V, Y, Y', W
y U tienen los significados de oxi, oxo o hidroxi.
Además, son preferidos los compuestos análogos a
oligonucleótidos de la fórmula IB, en los que R^{1} representa
hidrógeno.
En particular son preferidos los compuestos
análogos a oligonucleótidos de la fórmula IB, en los que U, V, W, X,
Y' e Y tienen los significados de oxi, oxo o hidroxi y R^{1} es
igual a hidrógeno.
Los radicales que aparecen de modo repetido tales
como R^{2}, B, a, d, e, f, h, W, V, Y, Y', U, R^{3}, R^{4}, p,
q, G y Z pueden tener, independientemente unos de otros significados
iguales o diferentes, es decir que p.ej. los V significan
independientemente unos de otros oxi, sulfanodiílo o imino.
El halógeno representa con preferencia fluoro,
cloro o bromo.
Por heteroarilo ha de entenderse el radical de un
compuesto heteroaromático (C_{3}-C_{9})
monocíclico o bicíclico, que en el sistema anular contiene uno o dos
átomos de N y/o un átomo de S o un átomo de O.
Son ilustrativos de grupos que favorecen la
admisión intracelular, diferentes radicales lipófilos tales como
-O-
(CH_{2})_{x}-CH_{3}, en que x significa un número entero de 6-18, -O-(CH_{2})_{n}-CH=CH-(CH_{2})_{m}-CH_{3}, en que n y m independientemente uno de otro, significan un número entero de 6 a 12, -O-(CH_{2}CH_{2}O)_{4}-(CH_{2})_{9}-CH_{3}, -O-(CH_{2}CH_{2}O)_{8}-
(CH_{2})_{13} y -O-(CH_{2}CH_{2}O)_{7}-(CH_{2})_{15}-CH_{3}, pero también radicales de esteroides tales como colesterilo y conjugados, que aprovechan sistemas de vehículos portadores naturales, tales como ácidos biliares, ácido fólico, 2-(N-alquil, N-alcoxi)-amino-antraquinona y conjugados de la manosa y de péptidos de los correspondientes receptores, que conducen a la endocitosis de los oligonucleótidos, mediada por receptores, tales como EGF (Epidermal Growth Factor = factor de crecimiento epidérmico), bradiquinina y PDGF (Platelet Derived Growth Factor = factor de crecimiento derivado de plaquetas). Por grupos de marcación han de entenderse grupos fluorescentes, por ejemplo de derivados de dansilo (= de N-dimetil-1-amino-naftil-5-sulfonilo), de fluoresceína o de cumarina, o grupos quimioluminiscentes, por ejemplo de derivados de acridina, así como el sistema de digoxigenina detectable a través de un ELISA, el grupo de biotina detectable a través del sistema de biotina/avidina, o por el contrario brazos de elementos enlazadores (linker) con grupos funcionales, que permiten una posterior derivatización con grupos reporteros detectables, por ejemplo un elemento enlazador aminoalquilo, que se hace reaccionar con un éster activo de acridinio para formar la sonda de quimioluminiscencia. Típicos grupos de marcación son:
(CH_{2})_{x}-CH_{3}, en que x significa un número entero de 6-18, -O-(CH_{2})_{n}-CH=CH-(CH_{2})_{m}-CH_{3}, en que n y m independientemente uno de otro, significan un número entero de 6 a 12, -O-(CH_{2}CH_{2}O)_{4}-(CH_{2})_{9}-CH_{3}, -O-(CH_{2}CH_{2}O)_{8}-
(CH_{2})_{13} y -O-(CH_{2}CH_{2}O)_{7}-(CH_{2})_{15}-CH_{3}, pero también radicales de esteroides tales como colesterilo y conjugados, que aprovechan sistemas de vehículos portadores naturales, tales como ácidos biliares, ácido fólico, 2-(N-alquil, N-alcoxi)-amino-antraquinona y conjugados de la manosa y de péptidos de los correspondientes receptores, que conducen a la endocitosis de los oligonucleótidos, mediada por receptores, tales como EGF (Epidermal Growth Factor = factor de crecimiento epidérmico), bradiquinina y PDGF (Platelet Derived Growth Factor = factor de crecimiento derivado de plaquetas). Por grupos de marcación han de entenderse grupos fluorescentes, por ejemplo de derivados de dansilo (= de N-dimetil-1-amino-naftil-5-sulfonilo), de fluoresceína o de cumarina, o grupos quimioluminiscentes, por ejemplo de derivados de acridina, así como el sistema de digoxigenina detectable a través de un ELISA, el grupo de biotina detectable a través del sistema de biotina/avidina, o por el contrario brazos de elementos enlazadores (linker) con grupos funcionales, que permiten una posterior derivatización con grupos reporteros detectables, por ejemplo un elemento enlazador aminoalquilo, que se hace reaccionar con un éster activo de acridinio para formar la sonda de quimioluminiscencia. Típicos grupos de marcación son:
\vskip1.000000\baselineskip
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Los compuestos análogos a oligonucleótidos, que
se fijan a ácidos nucleicos o se intercalan entre ellos y/o los
desdoblan o reticulan, contienen p.ej. acridina, psoraleno,
fenantridina, naftoquinona, daunomicina o conjugados con
cloroetilamino-arilo. Típicos radicales que se
intercalan y reticulan son:
\vskip1.000000\baselineskip
Como ejemplos de grupos NR^{3}R^{4}, en los
que R^{3} y R^{4} en común con el átomo de nitrógeno que los
lleva, forman un anillo heterocíclico de 5 a 6 miembros, que
adicionalmente contiene otro heteroátomo, se mencionarán los
radicales morfolinilo e imidazolinilo.
El invento no está limitado a \alpha- y
\beta-D- ó L-ribofuranósidos,
\alpha y \beta-D- ó
L-desoxi-ribofuranósidos y
correspondientes compuestos carbocíclicos análogos a compuestos con
anillos de cinco miembros, sino que es válido también para
compuestos análogos a oligonucleótidos, que están constituidos por
otros eslabones de azúcares, por ejemplo azúcares ensanchados en el
anillo y estrechados en el anillo, derivados de azúcares acíclicos o
de otros tipos apropiados.
Los compuestos análogos a oligonucleótidos de la
fórmula IB poseen un espaciador 3'5' (3'5'S) ó (2'5'S), que no
influye sobre la polaridad, pero permite por ejemplo un
retroplegamiento del compuesto análogo a oligonucleótido o un cambio
de cadena.
Ejemplos de S son
propano-1,3-diol-fosfatos,
2-bencil- ó
2-octadecil-oxipropano-1,3-diol-fosfatos,
trietilen-glicol- o
hexaetilen-glicol-fosfatos, que
eventualmente también se pueden repetir. Compuestos análogos a
oligonucleótidos sin ninguna base heterocíclica y radicales
fenil-dialquileno son otras formas preferidas de
realización de S, en particular de (3'3'S). Por lo general, el
(5'5'S) es, por razones topológicas, más largo que (3'3'S). Así, el
(5'5'S) posee en la mayor parte de los casos de 20 a 45, con
preferencia de 24 a 36 enlaces no ramificados, mientras que el
(3'3'S) presenta solamente de 5 a 15, con preferencia de 6 a 10
enlaces no ramificados, con la premisa de que se busque un cambio de
cadenas. Si S, por el contrario, sirve para el retroplegamiento del
compuesto análogo a oligonucleótido, por ejemplo para la formación
de un triplex junto a la cadena individual de ácido nucleico, son
ventajosas unas longitudes de S correspondientes a 4 hasta 5
unidades de nucleótidos. Como ejemplo se mencionarán en este caso
penta-(2-benciloxi-1,3-propanodiol)-hexafosfato
y
hexa-(propano-1,3-diol)-pentafosfato,
que en cada caso pueden producir una unión en (5'5'S) o (3'5'S).
La preparación de compuestos análogos a
oligonucleótidos de la fórmula IB se efectúa de un modo similar a la
síntesis de oligonucleótidos biológicos, en solución o con
preferencia en fase sólida, eventualmente tomando ayuda de un
aparato automático de síntesis.
La síntesis en fase sólida de oligonucleótidos
con un radical de fosfato o éster fosfato junto al extremo 3' no es
posible de acuerdo con la química clásica del
fósforo-amidito de acuerdo con Caruthers (M. D.
Matteucci y M. H. Caruthers, J. Am. Chem. Soc. 103, 3185 (1981)),
puesto que el primer eslabón de nucleótido está unido al soporte
sólido a través del grupo 3'-hidroxi y por lo tanto
a partir de estas síntesis resultan siempre oligonucleótidos con un
grupo 3'-hidroxi. Se describieron diferentes
procedimientos de acuerdo con el método de la fase sólida, pero
todos ellos son complicados y con ellos, con frecuencia, no se
pueden preparar derivados, tales como ésteres fosfatos o
alquil-fosfonatos (R. Eritja y colaboradores,
Tetrahedron Lett. 32, 1511 (1991); P. Kumar y colaboradores,
Tetrahedron Lett. 32, 967 (1991); W. T. Markiewcz y T. K.
Wyrzykiewcz, Phosphorus, Sulfur and Silicon [Fósforo, Azufre y
Nitrógeno] 51/52, 374 (1990); E. Felder y colaboradores, Tetrahedron
Lett. 25, 3967 (1984); R. Lohrmann y J. Ruth, DNA 3, 122
(1984)).
Es objeto del invento un procedimiento para la
preparación de compuestos análogos a oligonucleótidos de la fórmula
IB, en el que
- a)
- en el primer ciclo de reacción se hace reaccionar una unidad de nucleótido con una agrupación de fósforo(V) terminal en 3'(2') y un grupo hidroxi o mercapto en 5' libre, con otra unidad de nucleótido que tiene una agrupación con fósforo(III) o fósforo(V) situada en 3'(2') o uno de sus derivados activados, en los ciclos ulteriores se hace reaccionar una unidad de nucleótido que tiene una agrupación con fósforo(III) o fósforo(V) terminal en 3'(2') o 5' o uno de sus derivados activados o con un reactivo, que permite la introducción de grupos espaciadores, con una unidad de nucleótido adicional con grupo hidroxi o mercapto libre terminal en 5' ó 3'(2') o
- b)
- el compuesto análogo a oligonucleótido se constituye de igual modo por fragmentos, se separan grupos protectores introducidos provisionalmente en los compuestos análogos a oligonucleótidos obtenidos según (a) o (b) para la protección de otras funciones, y los compuestos análogos a oligonucleótidos de la fórmula IB, así obtenidos, se transforman eventualmente en sus sales fisiológicamente compatibles.
Como componente de partida para la síntesis en
fase sólida se emplea un soporte sólido de la fórmula IV
(IV)D-X'-CH_{2}CH_{2}-S(O)_{x}-CH_{2}CH_{2}-A-T,
en el
que
A representa un brazo enlazador, que es por
ejemplo un radical de un ácido dicarboxílico, de un diol, de una
alquil-amina, de una
monoalquil-amida de ácido dicarboxílico, de una
amida de ácido o de un fosfato de la fórmula,
--- O ---
\melm{\delm{\para}{OR}}{P}{\uelm{\dpara}{O}}--- O ---
en el
que
R significa = hidrógeno o alquilo
C_{1}-C_{6}, que eventualmente está sustituido
con -CN, con preferencia metilo o
2-ciano-etilo, T significa un
soporte sólido, constituido por ejemplo por materiales tales como
CPG (de Controlled Pore Glass = vidrio de poros controlados), gel de
sílice o una resina orgánica tal como un poliestireno (PS) o un
copolímero de injerto a base de un PS y un
polietilen-glicol (POR), que está modificado en la
cadena lateral mediante grupos funcionales tales como hidroxi,
amino, halógeno o COOH,
D representa un grupo protector que se puede
eliminar sin separación del brazo enlazador A y del radical
X'-CH_{2}CH_{2}-S(O)_{x}-CH_{2}CH_{2}
(véase Bioorg. Chem. 14 (1986) 274-325), tal
como 4-metoxi-tetrahidropiranoílo y
dimetoxitritilo, con preferencia dimetoxitritilo, x es un número
entero de cero, 1 ó 2 y X' significa oxi o sulfanodiílo.
El brazo enlazador A, que une mediante un enlace
químico (de amida, éster, etc.) al soporte sólido T con el radical
que contiene azufre (Damka y colaboradores, Nucleic Acids Res. 18,
3813 (1990)), es con preferencia un radical de ácido succínico
(O-C(O)-CH_{2}CH_{2}-C(O)-),
un radical de ácido oxálico
(O-C(O)-C(O)-), una
alquil-amina, con preferencia una LCAA (Long Chain
Alkyl Amin = alquil-amina de cadena larga), o un
polietilen-glicol. Se prefiere especialmente un
radical de ácido succínico. En determinados casos, por ejemplo en
combinación con sustituyentes, que no aguantan un tratamiento
prolongado con amoníaco, son ventajosos elementos enlazadores más
inestables, tales como el elemento enlazador oxalilo. La preparación
de soportes sólidos de las fórmulas IV a-c se
describe en el Ejemplo 1.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La síntesis en fase sólida se puede efectuar de
acuerdo con el método del fosfato-triéster, el
método del H-fosfonato y el método del
fósforo-amidito, con preferencia de acuerdo con el
método del fósforo-amidito (E. Sonveaux, Bioorg.
Chem. 14, 274 (1986)). En primer término, se separa siempre el grupo
protector D desde el soporte de la fórmula IV mediante un ácido, por
ejemplo ácido tricloroacético en el seno de cloruro de metileno. En
el caso del método del fósforo-amidito, el soporte
así obtenido de la fórmula IV'
(IV')HX'-CH_{2}-CH_{2}-S(O)_{x}-CH_{2}CH_{2}-A-T,
en el que x, X', A y T tienen los
significados antes mencionados, se condensa con un
nucleósido-fósforo-amidito de la
fórmula
V
en la
que
- B'
- significa B, pudiendo presentarse en estado protegido los grupos NH_{2} eventualmente presentes en B;
- R
- es un grupo protector, que se puede eliminar en condiciones suaves, tal como 4-metoxi-tetrahidropiranoílo o dimetoxitritilo,
- R^{2'}
- es hidrógeno, alcoxi, halógeno o una función hidroxi o amino protegida, y
R^{5} y R^{6}
independientemente uno de otro, son alquilo
C_{1}-C_{12}, o ambos radicales forman en común
un anillo de 5 a 6
miembros,
- \quad
- Y'' es oxi, sulfanodiílo o (CH_{2})_{m}, y
- \quad
- a, m, V y Z tienen los significados antes mencionados,
en presencia de un ácido débil tal
como tetrazol. A continuación, el soporte así obtenido se oxida de
manera en sí conocida con agua yodada (W=O) o con TETD (disulfuro de
tetraetil-tiuram) o con azufre elemental (W=S), o
con selenio (W=Se) para formar el soporte derivatizado de la fórmula
VII
en el
que
R, V, B', R^{2'}, Z, X', W, Y'',
A y T tienen los significados antes mencionados. Se preparan con
preferencia soportes de la fórmula
VIIa
El fósforo-amidito de la fórmula
V se puede preparar por ejemplo a partir del
bis-amidito de la fórmula VI
en el
que
R^{7} y R^{8} son iguales que R^{5} y
R^{6} y
a, R, V, B', R^{2'}, Y'', R^{5} y R^{6}
tienen los significados antes mencionados,
por reacción con el correspondiente
alcohol o tioalcohol mediando catálisis por tetrazol (Ejemplo 2,
Método A), cuando Z es = alcoxi o alquil-mercapto
(J. E. Marugg y colaboradores, Tetrahedron Lett. 27, 2271
(1986)).
Los bis-amiditos preferidos son
los de la fórmula VIa
De este modo, se prepararon por ejemplo los
amiditos de las fórmulas VIII a-m
\vskip1.000000\baselineskip
en los
que
R^{5} y R^{6} tienen los significados antes
mencionados, Z tiene el significado de
- a)
- O-CH_{2}CH_{3},
- b)
- O-i-C_{3}H_{7},
- c)
- O-n-C_{6}H_{13},
- d)
- O-n-C_{18}H_{37},
- e)
-
24
- f)
-
25
- g-k)
- un radical de la fórmula III, en el que en el caso de que
- g)
- p = 3 y q = 0,
- h)
- p = 4 y q = 9,
- i)
- p = 5 y q = 4 y
- k)
- p = 8 y q = 13,
- p)
- CH_{3}
- m)
-
26
\vskip1.000000\baselineskip
y B' en los casos
de
a), c) y d) significa
Cyt^{i-Bu}, en los casos de
b) y p) significa Thy y en los casos
e) - k) y m) significa Cyt^{Bz}.
Un método alternativo para cargar el soporte es
la reacción del reactivo de fosfitilación de la fórmula IX
en la
que
R^{9} y R^{10} independientemente uno de
otro, significan Cl, NR^{5}R^{6}, NR^{7}R^{8}, Z'' ó U' y
siendo U' alquilo C_{1}-C_{4} o un grupo hidroxi
presente en forma de un derivado protegido, teniendo R^{5},
R^{6}, R^{7} y R^{8} los significados antes mencionados,
siendo Z'' = Z, con la condición de que hidroxi, mercapto y SeH se
deben presentar como derivados protegidos, por ejemplo como
Y'''-G'-X'-DMTr, en
que DMTr es dimetoxitritilo, X' = Y''' = oxi o sulfanodiílo y G' es
(CH_{2}CH_{2}O)_{\alpha}
CH_{2}CH_{2} ó CH_{2}CH(OR')CH_{2} con
CH_{2}CH_{2} ó CH_{2}CH(OR')CH_{2} con
R' = alquilo C_{1}-C_{18},
arilo C_{6}-C_{14} o aril
C_{6}-C_{14}-alquilo
C_{1}-C_{8} y
\alpha = un número entero de 1 a 11, o como
O-CH_{2}CH_{2}-CN,
O-CH_{3}, S-CH_{2}CH_{2}CN,
O-CH_{2}CH_{2}-S-CH_{2}CH_{2}-O-D
o
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
con un nucleósido que tiene una
función en 3'(2') libre de la fórmula
X
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la
que
V, B', R^{2'} y R tienen los significados antes
mencionados e Y''' es = oxi o sulfanodiílo, y la subsiguiente
condensación del compuesto así obtenido con el soporte de la fórmula
IV' en presencia de un agente de condensación, tal como tetrazol
(para R^{9}, R^{10} = NR^{5}R^{6} ó NR^{7}R^{8}) o
diisopropil-amina (para R^{9}, R^{10} = Cl).
La subsiguiente oxidación con agua yodada o con
azufre o selenio conduce entonces al compuesto de la fórmula VIIa.
Seguidamente el grupo protector R se puede eliminar y se puede
proseguir de una manera conocida la síntesis del oligonucleótido. Al
final de la síntesis desde el compuesto análogo a oligonucleótido
fijado a un soporte, así obtenido, se eliminan los grupos
protectores de una manera conocida y después de ello el compuesto
análogo a oligonucleótido conforme al invento de la fórmula IA o IB
se separa desde el soporte.
Si la síntesis se hizo terminar con un eslabón de
la fórmula V en el último ciclo, se obtiene un compuesto análogo a
oligonucleótido de la fórmula IA o IB (R^{1} = H) con un grupo
5'-hidroxi y con una conjugación que contiene
fósforo junto al extremo 3'(2'). Si, por el contrario en la última
etapa de condensación se emplea un reactivo de fosforilación, por
ejemplo de la fórmula IX, en el que R^{9} es = Z'', entonces a
partir de la síntesis resulta un compuesto análogo a oligonucleótido
de la fórmula IA o IB con R^{1} = fórmula II, que tanto junto al
extremo 3'(2') como también junto al extremo 5' presenta una
sustitución que contiene fosfato.
La preparación de oligonucleótidos con un grupo
fósforo-amidato terminal en 3'(2') es posible por
ejemplo por reacción del soporte de la fórmula IV' con el
metoxi-fósforo-amidito de la fórmula
V (Z=O-CH_{3}) en presencia de tetrazol, cuando se
realiza la oxidación tal como se describe en la cita de Jäger y
colaboradores (Biochemistry 27, 7237 (1988)) con una mezcla de yodo
y H_{2}NR^{3} ó HNR^{3}R^{4}, en los que R^{3} y R^{4}
tienen los significados antes mencionados.
En casos determinados (Z = NHR^{3},
NR^{3}R^{4}, O, S o Se) la introducción del grupo Z puede
efectuarse también de acuerdo con el método del
H-fosfonato, sometiendo al diéster de
H-fosfonato de la fórmula VII',
formado en primer lugar por reacción de un
nucleósido-fosfonato de la fórmula XI
en el que R, V a, B', Y', X' y W
tienen los significados antes mencionados, con un soporte de la
fórmula
IV',
a una
fósforo-amidación en condiciones oxidantes (B.
Froehler, Tetrahedron Lett. 27, 5575 (1986)). De esta manera se
puede preparar por ejemplo con una
colesteril-oxicarbonil-amino-alquil-amina,
en presencia de tetracloruro de carbono, un oligonucleótido con un
grupo colesterilo terminal en
3'.
La preparación de compuestos análogos a
oligonucleótidos de la fórmula IB es posible además de acuerdo con
el método del triéster, haciendo reaccionar el grupo HX' del soporte
de la fórmula IV' con un fosfato-diéster protegido
de la fórmula XII
\vskip1.000000\baselineskip
en la que R, V, a, B', R^{2'},
Y', Z, W, X' y el paréntesis alargado tienen los significados antes
mencionados, en presencia de un agente de condensación tal como un
cloruro de ácido aril-sulfónico y de un catalizador
nucleófilo tal como tetrazol. Una posibilidad para la inversión de
la polaridad de una cadena de oligonucleótido que crece en la
dirección 3'5' (2'5'), consiste en que se hace reaccionar el grupo
5'-hidroxi o el grupo 5'-tiol libre,
de la cadena en crecimiento con un eslabón de la fórmula
XIII,
por ejemplo con un
3'-O-DMTr-nucleósido-5'-fósforo-amidito
de la fórmula XIIIa,
\vskip1.000000\baselineskip
Si a continuación se oxida con agua yodada o con
azufre, entonces (5'5'S) tiene el significado de un radical de
fosfato (PO_{4}^{-}) o de fósforo-tioato
(PO_{3}S^{-}). Después de haber separado el grupo protector
situado junto al extremo 3'(2') la cadena de oligonucleótido se
puede prolongar en dirección 5'3' en caso necesario por acoplamiento
sucesivo con eslabones de la fórmula XIII
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\vskip1.000000\baselineskip
en los
que
- U'
- tiene el significado de U, con la condición de que U' no ha de significar NHR^{3} ó NR^{3}R^{4} y los hidroxi, mercapto y SeH se presentan como derivados protegidos (para ejemplos de tales derivados véase Z'') y
R^{5}, R^{6}, Y''', V, R, a,
R^{2'} y B' tienen los significados antes mencionados. La síntesis
de los eslabones XIII se efectúa por ejemplo tal como se describe en
la cita de Seliger y colaboradores (Nucleosides, Nucleotides 10
(1991),
469)).
Para la preparación de compuestos análogos a
oligonucleótidos de la fórmula IB, cuya polaridad está inalterada,
pero cuyo (3'5'S) facilita un retroplegamiento de la cadena, en un
sitio deseado la síntesis la cadena de oligonucleótidos se prolonga
con un eslabón de la fórmula XIV, que por causa de su
bifuncionalidad también se puede condensar múltiples veces.
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\vskip1.000000\baselineskip
Por ejemplo un bucle (3'5'S) se puede introducir
por acoplamiento sucesivo realizado múltiples veces, con preferencia
de 4 a 5 veces, con el eslabón de la fórmula XIVb. Después de ello
se prosigue la síntesis tal como se ha descrito con anterioridad en
la dirección 3'5'.
Si en el caso de la hibridación del compuesto
análogo a oligonucleótido con ácidos nucleicos bicatenarios, con
preferencia con ADN, se pretende un cambio de cadena, entonces el
espaciador 5'5' debe ser de mayor longitud. Por ejemplo, un
trietilen-glicol-difosfato se puede
incorporar una o múltiples veces, con preferencia dos veces, en el
sitio deseado junto a una cadena constituida en la dirección 3'5',
mediante acoplamiento con el eslabón de la fórmula XIVa. Con el fin
de modificar la polaridad, se prosigue a continuación la síntesis en
la dirección 5'3' con eslabones de nucleótidos de la fórmula XIII.
Si se desea una inversión renovada de la polaridad, en el sitio
pretendido se introduce un espaciador 3'3' y a continuación se
prosigue la síntesis de la cadena en dirección 3'5' por condensación
con
nucleósido-3'-fósforo-amiditos.
Como espaciador 3'3' se recomienda por ejemplo la introducción de un
grupo
propano-1,3-diol-difosfato,
que se puede introducir por acoplamiento con el eslabón de la
fórmula XIVd.
Si la síntesis de un oligonucleótido se lleva a
cabo con el soporte de sulfuro (x=0) o sulfinilo (x=1), estos grupos
se oxidan al final de una manera en sí conocida [Funakoshi y
colaboradores, Proc. Notl. Acad. Sci. 88 (1991), 6982] para formar
el radical sulfonilo, con el fin de garantizar un fácil
desdoblamiento con bases, de preferencia con amoníaco.
El tipo de los grupos protectores de amino de las
bases B' y la constitución del brazo enlazador A se ajustan en cada
caso individual al tipo del sustituyente Z, puesto que éstos después
de una síntesis apropiada deben poder ser desdoblados sin problemas.
Por ejemplo, en el caso de la preparación de un
oligonucleótido-3'-fosfato-isopropil-éster
(Z = O-i-C_{3}H_{7}), para B =
Ade y Cyt se puede trabajar con el grupo protector benzoílo (Bz) o
para B = Gua se puede trabajar con el grupo protector isobutirilo
(i-Bu). Por el contrario, para la síntesis de un
oligonucleótido-3'-metil-fosfonato-éster
(Z = CH_{3}) o de un éster etílico (Z=
-O-C_{2}H_{5}) para B = Ade y Gua se utilizan
con preferencia el grupo protector fenoxi-acetilo
(PAC) más inestable o para B = Cyt se utiliza con preferencia el
grupo protector iso-butirilo.
Algunos conjugados poseen grupos funcionales
adicionales, que antes de la incorporación en los eslabones
monómeros de las fórmulas V y XII se deben proteger de una manera
apropiada. Por ejemplo, el grupo carboxilo de la fluoresceína se ha
de proteger como éster de alquilo. En el psoraleno, el grupo amido
se puede presentar como compuesto protegido con
N-Fmoc
(fluorenil-metoxi-carbonilo). Los
grupos hidroxi se pueden proteger con respecto de reacciones
secundarias por acilación o sililación (con
t-butil-dimetil-sililo).
Los grupos amino se pueden presentar también protegidos con
trifluoroacetilo. En casos excepcionales, los conjugados pueden ser
tan poco estables que en ya serían destruidos en las condiciones de
la separación de grupos protectores de la síntesis de
oligonucleótidos. En tales casos es favorable incorporar en el
monómero de la fórmula V solamente un brazo enlazador con un grupo
funcional, por ejemplo Z =
HN-(CH_{2})_{x}-NH-Fmoc,
en el que x significa un número entero de 2-12, con
preferencia de 4-6. Después de la incorporación en
el oligonucleótido y de la eliminación de los grupos protectores,
con preferencia con amoníaco, el grupo amino libre se puede acoplar
con ésteres activos. De esta manera se preparó por ejemplo el éster
de acridinio inestable frente a bases.
La caracterización de los derivados de
oligonucleótidos sintetizados se efectúa mediante espectrometría de
masas con ionización por proyección eléctrica (Stults y Masters,
Rapid Commun. Mass. Spectr. 5 (1991) 350).
Los compuestos análogos a oligonucleótidos de la
fórmula IB de acuerdo con el invento, se ensayaron en cuanto a su
estabilidad en un suero y frente a exonucleasas conocidas.
Sorprendentemente, se encontró que todos los
compuestos análogos a oligonucleótidos de la fórmula IB presentan,
en comparación con los oligonucleótidos no modificados, una
estabilidad grandemente aumentada frente a las nucleasas del suero,
mientras que su comportamiento de hibridación es influenciado
solamente poco.
Mientras que los oligonucleótidos no modificados
presentan en un suero de ternero fetal un valor de la semivida de
aproximadamente dos horas, todos los compuestos análogos a
oligonucleótidos de la fórmula IB son suficientemente estables
durante aproximadamente 16 horas. Los compuestos análogos a
oligonucleótidos de la fórmula IA son además de ello estables frente
a una fosfodiesterasa de veneno de serpiente. Los oligonucleótidos
no modificados son descompuestos
exo-nucleolíticamente por la fosfodiesterasa de
veneno de serpiente desde el extremo 3' y por la fosfodiesterasa de
bazo desde el extremo 5'.
Los compuestos análogos a oligonucleótidos de la
fórmula IB forman híbridos bicatenarios estables mediante un
emparejamiento de bases según Watson-Crick con
secuencias de nucleótidos monocatenarias complementarias, o
estructuras triplex estables mediante un emparejamiento de bases
según Watson-Crick y Hoogsteen, mientras que ellos
forman estructuras de hélices triples con ácidos nucleicos
bicatenarios mediante un emparejamiento de bases según Hoogsteen,
haciendo posible los espaciadores (5'5'S) y (3'3'S) un cambio de
cadenas. Con ello es posible la regulación o la represión de
funciones biológicas de ácidos nucleicos con los compuestos análogos
a oligonucleótidos conformes al invento, por ejemplo la represión de
la expresión de genes celulares así como también la de oncogenes o
de funciones de genomas víricos. Los compuestos análogos a
oligonucleótidos de la fórmula IB se pueden emplear por lo tanto
para la terapia o profilaxis de infecciones víricas y enfermedades
de cáncer.
La actividad de los oligonucleótidos conformes al
invento se comprobó con ayuda de la inhibición de la multiplicación
de virus del HSV-1.
\newpage
Secuencia I
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Secuencia II
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Secuencia III
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Secuencia VI
(junto a E1b)
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\newpage
Secuencia IV
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\newpage
Secuencia V
La Secuencia I seleccionada es inactiva frente al
HSV-1 en un cultivo celular en forma de la secuencia
natural, es decir sin derivatización en 3' y sin espaciador 5'5',
puesto que experimenta una rápida descomposición en un suero. Por el
contrario, los compuestos análogos a oligonucleótidos derivatizados
en 3' de la fórmula IA, por ejemplo la Secuencia
IA-2 (Ejemplo 4b), inhiben la reproducción de los
HSV-1. La Secuencia I constituye solamente un
ejemplo arbitrario para la explicación del principio. La Secuencia I
se orienta hacia el ARNm de la proteína transactivadora Vmw65 del
HSV-1. Las Secuencias II y III están orientadas
contra la región de aceptor- empalme de los precursores IE4/5 de
ARNm (IE = immediate early = temprano inmediato) del
HSV-1, e inhiben también específicamente la
replicación de HSV-1. Un oligonucleótido de la
fórmula IA-4 (Ejemplo 4e) de la Secuencia IV,
modificado en ambos extremos 3' con psoraleno, reconoce al origen de
replicación (ori_{i}) del genoma de HSV-1 e inhibe
la replicación de éste mediante formación de un triplex. La
actividad antivírica de los conjugados de psoraleno se puede
aumentar manifiestamente mediante irradiación con luz UV
(ultravioleta). El genoma del HSV-1 con sus 160.000
bases ofrece naturalmente otras incontables secuencias dianas
distintas con diversa eficiencia para la inhibición de la
reproducción de los virus. Por variación de las secuencias de
nucleótidos se puede aplicar el principio terapéutico también a
cualesquiera otros virus, bacterias u otros patógenos. Una premisa
para una transferencia a otros agentes provocadores de enfermedades
es solamente el hecho de que se conozca el gen de este agente
patógeno de enfermedad que es esencial para el ciclo de vida. Éstos
se presentan en su secuencia en gran multiplicidad en los
denominados bancos de datos de genes. Algo similar resulta válido
para oncogenes o otros genes celulares que tengan que ser reprimidos
en su función. Ejemplos de otros genes celulares son los que
codifican enzimas, receptores, canales de iones, moduladores
inmunitarios, factores del crecimiento u otras proteínas
reguladoras. La secuencia V se orienta por ejemplo hacia el promotor
del gen APP770, que ha sido hecho responsable de la expresión de la
proteína precursora de las proteínas amiloides formadoras de calvas
en la enfermedad de Alzheimer. La Secuencia VI simula como
oligonucleótido del mismo sentido la región de fijación a SP1 del
adenovirus E1b e inhibe la transcripción de E1b como compuesto
análogo a oligonucleótido modificado en 3' con un espaciador 3'5' de
la fórmula IB-2. Ejemplos de oncogenes son abl, neu,
myc, myb, ras, fos, mos, erbB, ets, jun, p53, src y rel.
Sondas para ácidos nucleicos, en particular para
los ADN obtenidos a partir de compuestos análogos a oligonucleótidos
de la fórmula IA y B ofrecen, al contrario que los derivados de
oligonucleótidos con un grupo 3'-hidroxi, conocidos
por la bibliografía, por un lado, la ventaja de una estabilidad
aumentada frente a nucleasas, pero, por otro lado, permiten también
la admisión de moléculas de marcadores iguales o diferentes en ambos
extremos del oligonucleótido. Es ventajoso el hecho de que se pueden
excitar selectivamente dentro de un oligonucleótido diferentes
agrupaciones de marcadores (doble marcación). La derivatización
bifuncional se puede utilizar también para introducir en un extremo
un marcador y en el otro extremo una función adicional (por ejemplo
una marca de afinidad). Con esta finalidad se puede incorporar por
ejemplo biotina en un extremo 3' del oligonucleótido, que reconoce a
avidina o estreptavidina, mientras que en el otro extremo 3' se
puede disponer a través de un elemento enlazador
alquil-amino un marcador de quimioluminiscencia del
tipo de éster de acridinio.
En muchos casos, además, el comportamiento de
penetración de los compuestos análogos a oligonucleótidos conformes
al invento es más favorable que en el caso de los oligonucleótidos
no modificados, en particular cuando se introducen radicales
lipófilos. La estabilidad en suero aumentada de los compuestos
análogos a oligonucleótidos de la fórmula IB conformes al invento,
su mejorada accesibilidad a las células, su mejorada afinidad de
fijación, su capacidad para destruir selectivamente secuencias
dianas mediante modificación (alquilación, reticulación), así como
su detectabilidad mejorada en el caso del diagnóstico por ADN, pasan
a expresarse en una actividad biológica más alta en comparación con
la de los oligonucleótidos no modificados.
Las aplicaciones diagnósticas, profilácticas y
terapéuticas precedentemente mencionadas de los compuestos análogos
a oligonucleótidos conformes al invento constituyen solamente una
selección de ejemplos representativos y su utilización no está
limitada por tanto a ellos. Además de ello, los compuestos análogos
a oligonucleótidos conformes al invento se pueden emplear por
ejemplo también como agentes auxiliares en la biotecnología y en la
biología molecular.
El invento se refiere además a formulaciones
farmacéuticas, que contienen una cantidad eficaz de uno o varios
compuestos de la fórmula IB o de sus sales fisiológicamente
compatibles, eventualmente en común con materiales auxiliares y/o de
vehículo fisiológicamente compatibles y/o en común con otras
sustancias activas conocidas, así como a un procedimiento para la
preparación de estas formulaciones, caracterizado porque la
sustancia activa, juntamente con el vehículo y eventualmente otras
sustancias auxiliares, aditivas o activas, se lleva a una forma de
presentación apropiada. La aplicación se efectúa con preferencia por
vía intravenosa, tópica o intranasal.
4,56 g del dimetoxitritil (DMTr)-éter sencillo de
bis-(2-hidroxi-etil)-sulfona
(10 mmol) se secan mediante recogida y concentración realizadas dos
veces en piridina absoluta, se disuelven en 25 ml de piridina
absoluta, se mezclan con 1,78 g (14 mmol) de DMAP
(dimetilamino-piridina) y 1,4 g del anhídrido de
ácido succínico (14 mmol), y esta mezcla se agita durante 3 horas a
la temperatura ambiente. Después de haberse completado la reacción,
se concentra, el residuo, para la eliminación de la piridina, se
recoge tres veces en tolueno y se concentra y después de ello se
recoge en 220 ml de cloruro de metileno. La fase orgánica se lava
con ácido cítrico al 10% (110 ml) y 3 veces con 110 ml de agua, se
seca sobre sulfato de sodio y se concentra. El residuo sólido
resultante se seca en vacío (5,64 g). 1,67 g (3 mmol) de este
succinato se recogen dos veces en piridina absoluta y se concentran,
y se disuelven en una mezcla de 0,65 ml de piridina absoluta y 6 ml
de tetrahidrofurano (THF) absoluto. Luego se añade una solución de
420 mg (3 mmol) de p-nitro-fenol y
687 mg de DCC (diciclohexil-carbodiimida, 3,3 mmol)
en 2,1 ml de THF absoluto y se agita durante dos horas a la
temperatura ambiente. Después de haberse completado la reacción, se
separa por centrifugación con respecto de la
diciclohexil-urea precipitada. El sedimento se
suspende en 1 ml de éter absoluto y se centrifuga nuevamente. 1,5 g
del soporte aminopropil-CPG de la entidad Fluka (500
\Delta, 100 \mumol/g de función amino) se suspenden en una
mezcla de 1,8 ml de DMF absoluta y 350 \mul de
trietil-amina, se mezclan con las soluciones
reunidas del
succinato-nitro-fenil-éster,
separadas del sedimento por decantación, y se agitan durante 16
horas a la temperatura ambiente. El soporte sólido se separa y para
el bloqueo de grupos reactivos se agita durante una hora a la
temperatura ambiente con 3 ml de un reactivo de remate (mezcla de
anhídrido de ácido acético, 2,6-lutidina y DMAP; de
cada uno 0,25 M en THF). Luego el soporte de CPG derivatizado se
filtra con succión, se lava con metanol, THF, cloruro de metileno y
un éter y a continuación se seca en vacío a 40ºC. La carga del
soporte de la fórmula IVa con el componente que contiene
dimetoxitritilo es de 38 \mumol/g.
(® = marca registrada de producto de la entidad
Rapp, Tübingen) con el succinato del
bis-hidroxietil-sulfono-dimetoxitritil-éter.
La forma con amino de la resina TentaGel, que es
un copolímero de PS y POE con 250 \mumol/g de función amino (100
mg), se suspende en una mezcla de 360 \mul de DMF y 70 \mul de
trietil-amina, se reúne con 400 \mumol del
succinato-p-nitro-fenil-éster
(para cuya preparación véase el Ejemplo 1a) y se agita durante 16
horas a la temperatura ambiente. A continuación se trata tal como se
ha descrito en el Ejemplo 1a. La carga de la resina TentaGel de la
fórmula IVb con el componente que contiene dimetoxitritilo es de 98
\mumol/g.
- (Z'' = DMTr-O-CH_{2}CH_{2}-S-CH_{2}CH_{2}-O-; R^{9} = N(i-C_{3}H_{7})_{2}; R^{10} = O-CH_{2}CH_{2}CN).
La forma de hidroxi de la resina TentaGel con 500
\mumol/g de la función hidroxi (50 mg) se hace reaccionar con 10
equivalentes del reactivo de fosfitilación de la fórmula IX
- (Z'' = DMTr-O-CH_{2}CH_{2}-S-CH_{2}CH_{2}-O-; R^{9} = N(i-C_{3}H_{7})_{2}; R^{10} = O-CH_{2}CH_{2}CN)
en presencia de 25 equivalentes de
tetrazol en acetonitrilo a 22ºC. Después de la oxidación con agua
yodada (1,3 g de yodo en una mezcla de THF, agua y piridina: 70:20:5
= v:v:v = volumen : volumen : volumen) se somete a tratamiento como
en el Ejemplo 1a. La carga del soporte de la fórmula IVc con el
componente que contiene dimetoxitritilo es de 247
\mumol/g.
2 mmol del
nucleósido-3'-fósforo-bis-amidito
de la fórmula VI (B' = Cyt^{iBu}, R^{5} = R^{6} = R^{7} =
R^{8} = i-C_{3}H_{7}) se recogen dos veces en
20 ml de acetonitrilo absoluto y se emplean y se disuelven en 20 ml
de acetonitrilo absoluto. Luego se añade gota a gota una solución de
2,4 mmol de etanol y 1,2 mmol de tetrazol sublimado en 5 ml de
acetonitrilo absoluto durante 15 minutos. Después de que se hubo
seguido agitando todavía durante 2,5 horas, se diluye con 75 ml de
cloruro de metileno y la fase orgánica se extrae con 50 ml de una
solución al 5% de hidrógeno-carbonato de sodio. La
solución acuosa se lava 2 veces con 50 ml de cloruro de metileno,
las fases orgánicas reunidas se secan sobre sulfato de sodio y se
concentran en vacío. Para la purificación, el residuo se
cromatografía a través de una columna de gel de sílice con una
mezcla de cloruro de metileno, n-heptano y
trietil-amina (45:45:10; v:v:v). Se obtienen 0,7 g
de la deseada sustancia diastereoisómera como compuesto uniforme
según la cromatografía de capa fina. (^{31}P-NMR
\sigma = 146,7, 147,5 ppm). Como producto secundario se pueden
aislar vestigios del correspondiente
bis-etil-fosfito
(^{31}P-NMR \sigma = 139,3 ppm).
La preparación se efectúa por fosfitilación de la
5'-O-dimetoxitritil-timidina
de la fórmula X (B' = Thy (posición \beta); R = DMTr, V = 0, a =
0, Y'' = 0, 2 mmol) con el bis-amidito de la fórmula
IX (Z'' = O-i-C_{3}H_{7},
R^{9}= R^{10}=
N(i-C_{3}H_{7})_{2}; 4 mmol) en
presencia de tetrazol (0,5 mmol) en 10 ml de cloruro de metileno
absoluto. La tanda se somete a tratamiento como en el Ejemplo 2a.
(^{31}P-NMR \sigma = 145,04 ppm, 145,66
ppm).
Análogamente al Ejemplo 2a a partir del
bis-amidito de la fórmula VIa (B' = Cyt^{iBu},
R^{5} = R^{6} = R^{7} = R^{8} =
i-C_{3}H_{7}) por reacción con un equivalente de
n-hexanol mediando catálisis por tetrazol.
(^{31}P-NMR 148,1 ppm, 148,5 ppm).
Análogamente al Ejemplo 2a a partir del
bis-amidito de la fórmula VIa (B' = Cyt^{iBu},
R^{5} = R^{6} = R^{7} = R^{8} =
i-C_{3}H_{7}) por reacción con un equivalente de
n-octadecanol mediando catálisis por tetrazol.
(^{31}P-NMR 147,2 ppm, 147,9 ppm).
Análogamente al Ejemplo 2a a partir del
bis-amidito de la fórmula VIa (B' = Cyt^{Bz},
R^{5} = R^{6} = R^{7} = R^{8} =
i-C_{3}H_{7}, R^{2'} = H) por reacción con un
equivalente de
3-piridin-(propan-3-ol)
mediando catálisis por tetrazol. En este caso se pudieron separar
los dos diastereoisómeros por cromatografía en columna.
(^{31}P-NMR diastereoisómero 1: 147,7 ppm,
diastereoisómero 2: 148,2 ppm).
Análogamente al Ejemplo 2a a partir del
bis-amidito de la fórmula VIa (B' = Cyt^{Bz},
R^{5} = R^{6} = R^{7} = R^{8} =
i-C_{3}H_{7}) por reacción con un equivalente de
p-nitro-fenil-etan-2-ol
mediando catálisis por tetrazol. (^{31}P-NMR 148,1
ppm, 148,6 ppm).
Análogamente al Ejemplo 2a a partir del
bis-amidito de la fórmula VIa (B' = Cyt^{Bz},
R^{5} = R^{6} = R^{7} = R^{8} =
i-C_{3}H_{7}) por reacción con un equivalente de
trietilen-glicol-monometil-éter
mediando catálisis por tetrazol. (^{31}P-NMR 148,5
ppm, 148,9 ppm).
Análogamente al Ejemplo 2a a partir del
bis-amidito de la fórmula VIa (B' = Cyt^{Bz},
R^{5} = R^{6} = R^{7} = R^{8} =
i-C_{3}H_{7}) por reacción con un equivalente de
tetraetilen-glicol-monodecil-éter
mediando catálisis por tetrazol. (^{31}P-NMR 148,4
ppm, 148,8 ppm).
Análogamente al Ejemplo 2a a partir del
bis-amidito de la fórmula VIa (B' = Cyt^{Bz},
R^{5} = R^{6} = R^{7} = R^{8} =
i-C_{3}H_{7}) por reacción con un equivalente de
pentaetilen-glicol-monopentil-éter
mediando catálisis por tetrazol. (^{31}P-NMR 148,4
ppm, 148,9 ppm).
Análogamente al Ejemplo 2a a partir del
bis-amidito de la fórmula VIa (B' = Cyt^{Bz},
R^{5} = R^{6} = R^{7} = R^{8} =
i-C_{3}H_{7}) por reacción con un equivalente de
octaetilen-glicol-monotetradecil-éter
mediando catálisis por tetrazol. (^{31}P-NMR 148,4
ppm, 148,8 ppm).
Análogamente al Ejemplo 2b a partir de
5'-O-dimetoxitritil-timidina
mediante fosfitilación con el reactivo de la fórmula IX (Z'' =
CH_{3}, R^{9} = Cl, R^{10} =
N(i-C_{3}H_{7})_{2},
catalizándose con dos equivalentes de
diisopropil-etil-amina en vez de con
tetrazol. (^{31}P-NMR 120,6 ppm, 121,0 ppm).
Análogamente al Ejemplo 2a a partir del
bis-amidito de la fórmula VIa (B' = Cyt^{Bz},
R^{5} = R^{6} = R^{7} = R^{8} =
i-C_{3}H_{7}) por reacción con un equivalente de
9-(hidroxibutil)acridina mediando catálisis por tetrazol.
(^{31}P-NMR 146,7 ppm, 147,4 ppm).
a) Método
A
7,5 mg del soporte del Ejemplo 1a, que mantiene
fijados 0,2 \mumol del
bis-hidroxietil-sulfono-dimetoxitritil-éter,
se tratan con ácido tricloroacético al 3%, siendo separado el grupo
protector DMTr, se lavan con acetonitrilo y a continuación se llevan
a reaccionar con 2 \mumol del
nucleósido-3'-fósforo-amidito
de la fórmula VIIIb (B' = Thy, Z =
O-i-C_{3}H_{7}, R^{5} =
R^{6} = i-C_{3}H_{7}) en presencia de tetrazol
(10 \mumol) en acetonitrilo. El período de tiempo de reacción es
de 2,5 minutos. Después de ello se oxida con agua yodada (para W =
O; 1,3 g de yodo en una mezcla de THF, agua y piridina; 70:20:5 =
v:v:v, 5 minutos).
b) Método
B
El reactivo de fosfitilación de la fórmula IX
(Z'' = n-octilo, R^{9} = R^{10} = Cl; 1
equivalente) se hace reaccionar en presencia de 1,2 equivalentes de
diisopropil-etil-amina (DIPEA) en
acetonitrilo absoluto o cloruro de metileno con un nucleósido de la
fórmula X (1 equivalente de
5'-O-dimetoxitritil-piridina,
B' = posición \beta, Y''' = O,) a -78ºC, para formar el
correspondiente
nucleósido-3'-O-n-octil-fosfono-monocloruro.
El soporte de la fórmula IVa se trata tal como se ha descrito en el
Método A para la separación del grupo protector D = DMTr, se lava
con acetonitrilo y se hace reaccionar en presencia de DIPEA con un
exceso del
nucleósido-3'-O-n-octil-fosfono-monocloruro
preparado in situ. Después de una oxidación con agua yodada
se obtiene un nucleótido de la fórmula VIIa-2 fijado
a un soporte, que está a disposición para la síntesis ulterior del
oligonucleótido.
(3'5'S) =
p(CH_{2}
\delm{C}{\delm{\para}{OCH _{2} C _{6} H _{5} }}HCH_{2}p)_{5}
- d(GpGpTpGpGpTpGpGpTpT(3'5'S)TpTpCpCpTpCpCpTpGpCpGpGpGpApApGpGp-n-C_{8}CH_{17}
Partiendo del soporte de la fórmula
VIIa-2 (B' = Gua^{PAC}, W = O, Z =
n-C_{8}CH_{17}), cuya preparación se efectúa de
manera análoga a como se describe en el Ejemplo 3b, la constitución
de la cadena se efectúa como se describe en el Ejemplo 4b del
documento EP-A-0 552 767. Sin
embargo, para la preparación de sustituciones lábiles en cuanto a
las bases (como aquí para Z = n-C_{8}CH_{17}),
se utilizan ventajosamente los grupos protectores amino más lábiles
N^{6}-fenoxiactil-Ade
(Ade^{PAC}),
N^{4}-isobutiril-Cyt
(Cyt^{IBu}),
N^{2}-fenoxiactil-Gua
(Gua^{PAC}), los cuales son más fáciles de separar al final de la
síntesis. Después del 16º ciclo de reacción se llevan a cabo 5
ciclos con el reactivo de la fórmula XIVb con el fin de introducir
el espaciador (3'5') deseado. Después se incorporan las restantes 10
unidades de nucleótidos tal como se describe en el Ejemplo 4a del
documento EP-A-0 552 767. A la
separación del soporte (1,5 horas a la temperatura ambiente) con
amoníaco concentrado le sigue un tratamiento durante 6 horas con
etilendiaina/etanol/agua (5:4:1, v:v:v) para la liberación de la
función amino de las bases.
(3'5'S) =
p(CH_{2}CH_{2}CH_{2}p)_{4}
- d(GpGpGpCpGpGpGpGpCpTpTpApApApGpG(3'5'S)CpCpTpTpTpApApGpCpCpCpCpGpCpCpCp-O-(CH_{2}CH_{2}O)_{8}(CH_{2})_{13}CH_{3})
Partiendo del soporte de la fórmula
VIIa-6 (B' = Cyt^{Bz}, W = O, Z =
O-(CH_{2}CH_{2}O)_{8}(CH_{2})_{13}CH_{3}),
la cual se preparó como se describe en el Ejemplo 3a con ayuda del
amidito de la fórmula VIIIk, la síntesis de oligonucleótidos se
efectúa inicialmente de manera análoga al Ejemplo 4b del documento
EP-A-0 552 767. Después del 15º
ciclo de reacción se llevan a cabo 4 ciclos con el eslabón de la
fórmula XIVd. Los restantes 16 nucleótidos se incorporan tal como se
describe en el Ejemplo 4b con
5'-O-DMTr-nucelósido-3'-fosforoamiditos.
10 nmol del oligonucleótido que se ha de
investigar se disuelven en 450 \mul de un suero de ternero fetal
al 20% en un medio RPMI y 50 ml de agua bidestilada, y se incuban a
37ºC. Luego, de modo inmediato y después de 1, 2, 4, 7 y 24 horas se
sacan muestras de 10 \mul para la electroforesis en gel o muestras
de 20 \mul para la HPLC, con el fin de interrumpir la reacción se
mezcla con 5 \mul y 10 \mul respectivamente de formamida y se
calienta a 95ºC durante 5 minutos. Para la electroforesis en gel,
las muestras se aplican sobre un gel de
poli(acril-amida) al 15% (2% de BIS) y éste
se revela a aproximadamente 3.000 voltios-horas. Las
bandas se hacen visibles mediante la coloración con plata. Para el
análisis por HPLC las muestras se proyectan sobre una columna para
HPLC Gen-Pak Fax (entidad Waters/Millipore) y se
cromatografían a razón de 1 ml/min con un gradiente de 5 a 50% de un
tampón A en B (tampón A: dihidrógeno-fosfato de
sodio 10 \muM, NaCl 0,1 M en una mezcla de acetonitrilo y agua 1:4
(v:v) de pH 6,8; tampón B: como el A pero con NaCl 1,5 M).
El efecto antivírico de los compuestos conformes
al invento se ensaya en experimentos in vitro. Para ello los
compuestos conformes al invento se añaden en diferentes diluciones a
cultivos celulares de células HeLa y Vero dentro de placas de
microtitulación. Después de 3 h, los cultivos se infectan con
diferentes virus patógenos para seres humanos (p.ej.: virus de
herpes HSV-1, HSV-2, ortomixovirus
de influenza A2, picornavirus rinovirus 2). A las 48 hasta 72 h
después de la infección se determina en un microscopio el éxito de
la terapia con ayuda del efecto citopatógeno y fotométricamente
después de una fotografía con rojo neutro (ensayo colorimétrico de
acuerdo con Finter) (Finter, N.B., en "Interferones", N.B.
Finter y colaboradores, North Holland Publishing Co., Amsterdam,
1966). La concentración mínima, a la que aproximadamente la mitad de
las células infectadas no muestra ningún efecto citopatógeno, se
considera como concentración inhibidora mínima (MHK de minimale
Hemmkonzentration).
Claims (11)
1. Compuestos análogos a oligonucleótidos de la
fórmula IB
así como de sus sales
fisiológicamente compatibles, caracterizados
porque
- R^{1}
- significa hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{18}, alquenilo C_{2}-C_{18}, alquinilo C_{2}-C_{18}, alquilcarbonilo C_{2}-C_{18}, alquenilcarbonilo C_{3}-C_{19}, alquinilcarbonilo C_{3}-C_{19}, arilo C_{6}-C_{20}, aril (C_{6}-C_{14})-alquilo (C_{1}-C_{8}), o un radical de la fórmula II:
(II)Z ---
\melm{\delm{\dpara}{W}}{P}{\para}--- Z';
- R^{2}
- significa hidrógeno, hidroxi, alcoxi C_{1}-C_{18}, halógeno, azido o NH_{2;}
- B
- representa una base usual en la química de los oligonucleótidos;
- a
- representa oxi o metileno;
d, e, independientemente unos de
otros, significan un número entero de 0 a
50;
- i
- significa un número entero de 1 a 10;
- W
- significa oxo, selenoxo o tioxo;
- V
- significa oxi, sulfanodiílo o imino;
- Y
- significa oxi, sulfanodiílo, imino o metileno;
- Y'
- significa oxi, sulfanodiílo, imino, (CH_{2})_{m} o V(CH_{2})_{m}, en que
- m
- significa un número entero de 1 a 18;
- X
- significa hidroxi o mercapto;
- U
- significa hidroxi, mercapto, SeH, alcoxi C_{1}-C_{18}, alquilo C_{1}-C_{18}, arilo C_{6}-C_{20}, aril (C_{6}-C_{14})-alquilo (C_{1}-C_{8}), NHR^{3}, NR^{3}R^{4} o un radical de la fórmula (OCH_{2}CH_{2})_{p}O(CH_{2})_{q}CH_{2}R^{11}, en que
- R^{3}
- significa alquilo C_{1}-C_{18}, con preferencia alquilo C_{1}-C_{8}, arilo C_{6}-C_{20}, aril (C_{6}-C_{14})-alquilo (C_{1}-C_{8}), -(CH_{2})_{c}-[NH(CH_{2})_{c}]_{d}-NR^{12}R^{12}, en que c es un número entero de 2 a 6 y d es un número entero de 0 a 6, y los R^{12} independientemente uno de otro, son hidrógeno o alquilo C_{1}-C_{6}, o alcoxi C_{1}-C_{4}-alquilo C_{1}-C_{6};
- R^{4}
- significa alquilo C_{1}-C_{18}, arilo C_{6}-C_{20} o aril (C_{6}-C_{10})-alquilo (C_{1}-C_{8}), o en el caso de NR^{3}R^{4} en común con R^{3} y el átomo de nitrógeno que los lleva, significa un anillo heterocíclico de 5-6 miembros, que adicionalmente puede contener un heteroátomo adicional seleccionado entre la serie formada por O, S, N,
- p
- significa un número entero de 1 a 100,
- q
- es un número entero de 0 a 18,
- R^{11}
- significa hidrógeno o un grupo funcional hidroxi, amino, NHR^{12}, COOH, CONH_{2}, COOR^{12} o halógeno, en donde R^{12} significa alquilo C_{1}-C_{4};
- S
- es un grupo de la fórmula III
en la
que
- h
- es cuatro o cinco;
- G
- tiene el significado de alquileno C_{1}-C_{12}, pudiendo el alquileno estar sustituido eventualmente con halógeno, amino, hidroxi, alquilo C_{1}-C_{18}, alcoxi C_{1}-C_{18}, alquil C_{1}-C_{18}-carboniloxi, arilo C_{6}-C_{14}, aril C_{6}-C_{14}-alquilo C_{1}-C_{18}, o aril C_{6}-C_{14}-alcoxi C_{1}-C_{8}, aril C_{6}-C_{14}-di-alquileno C_{1}-C_{8}, arileno C_{6}-C_{18} de un grupo de la fórmula (CH_{2}CH_{2}V)_{\alpha} CH_{2}CH_{2} ó (CH_{2}V)_{\alpha}CH_{2}, en que \alpha es un número entero de 1 a 11,
- \quad
- de una unidad de la fórmula
---[G --- Y ---
\melm{\delm{\dpara}{W}}{P}{\uelm{\para}{U}}--- Y' ---]_{\beta}
en la que \beta significa un
número entero de 1 a 6, o de un grupo de la
fórmula
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Z = Z' significan hidroxi,
mercapto, SeH, alcoxi C_{1}-C_{22},
-O-(CH_{2})_{b}-NR^{12}R^{13}, en que
b es un número entero de 1 a 6, y R^{13} es alquilo
C_{1}-C_{6} ó R^{12} y R^{13} en común con
el átomo de nitrógeno que los lleva, forman un anillo de
3-6 miembros, alquilo
C_{1}-C_{18}, alquilo
C_{1}-C_{8}, arilo
C_{6}-C_{20}, aril
(C_{6}-C_{14})-alquilo
(C_{1}-C_{8}), aril
(C_{6}-C_{14})-alcoxi
(C_{1}-C_{8}), significando el arilo también
heteroarilo y estando el arilo eventualmente sustituido con 1, 2 ó 3
radicales iguales o diferentes seleccionados entre la serie formada
por carboxi, amino, nitro, alquil
C_{1}-C_{4}-amino, hidroxi,
halógeno y ciano, alquilmercapto C_{1}-C_{18},
NHR^{3}, NR^{3}R^{4}, un radical de la fórmula III, o un grupo
que favorece la admisión intracelular o que sirve como marcación
para una sonda de
ADN;
el paréntesis alargado en las
posiciones 2' y 3' señala que R^{2} y el radical fosforilo
contiguo se pueden encontrar también de manera inversa en posiciones
3' y
2',
pudiendo presentarse cada
nucleótido en su configuración D ó L, y pudiendo encontrarse la base
B en posición \alpha o
\beta.
2. Compuestos análogos a oligonucleótidos según
la reivindicación 1, caracterizados porque la base se
encuentra en posición \beta, los nucleótidos se presentan en la
configuración D, R^{2} se encuentra en la posición 2' y a
representa oxi.
3. Compuestos análogos a oligonucleótidos según
la reivindicación 1 ó 2, caracterizados porque
- R^{1}
- significa hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{6}, en particular metilo, o un radical de la fórmula II;
- R^{2}
- significa hidrógeno o hidroxi, en particular hidrógeno;
d, e significan un número entero de
5 a
15;
- i
- significa un número entero de 1 a 3;
- m
- significa un número entero de 1 a 6, en particular 1;
- U
- significa hidroxi, mercapto, alcoxi C_{1}-C_{6}, alquilo C_{1}-C_{6}, NR^{3}R^{4} o NHR^{3}, en particular hidroxi o alquilo C_{1}-C_{6}, en el que
- R^{3}
- es alquilo C_{1}-C_{8}, con preferencia alquilo C_{1}-C_{4}, o metoxietilo y B, W, V, Y, Y', X y Z tienen los significados antes mencionados.
4. Compuestos análogos a oligonucleótidos según
una o varias de las reivindicaciones 1, 2 ó 3, caracterizados
porque V, Y e Y' tienen los significados de oxi.
5. Compuestos análogos a oligonucleótidos según
una o varias de las reivindicaciones 1-3 ó 4,
caracterizados porque W tiene el significado de oxo.
6. Compuestos análogos a oligonucleótidos según
una o varias de las reivindicaciones 1-4 ó 5,
caracterizados porque U tiene el significado de hidroxi.
7. Compuestos análogos a oligonucleótidos según
una o varias de las reivindicaciones 1-4 ó 5,
caracterizados porque R^{1} representa hidrógeno.
8. Procedimiento para la preparación de
compuestos análogos a oligonucleótidos de la fórmula IA según la
reivindicación 1, en el que
- a)
- en el primer ciclo de reacción una unidad de nucleótido con una agrupación de fósforo(V) en el extremo terminal de 3'(2') y un grupo 5'-hidroxi o mercapto libre, se hace reaccionar con otra unidad de nucleótido con una agrupación de fósforo(III) o fósforo(V) situada en posición 3'(2') o uno de sus derivados activados, o con un reactivo que permite la introducción de grupos espaciadores, en los ciclos ulteriores una unidad de nucleótido con una agrupación de fósforo(III) o de fósforo(V) en el extremo terminal de 3'(2') o 5' respectivamente o uno de sus derivados activados se hace reaccionar con otra unidad de nucleótido adicional con un grupo hidroxi o mercapto libre junto al extremo terminal de 5' ó 3'(2') respectivamente, o
- b)
- los compuestos análogos a oligonucleótidos se constituyen de igual manera mediante fragmentos,
- en los oligonucleótidos obtenidos según (a) o (b) se separan grupos protectores introducidos provisionalmente para la protección de otras funciones, y los compuestos análogos a oligonucleótidos de la fórmula IA y IB así obtenidos se transforman eventualmente en sus sales fisiológicamente compatibles.
9. Utilización de los compuestos análogos a
oligonucleótidos según una o varias de las reivindicaciones
1-6 ó 7 para la preparación de un medicamento para
la inhibición de la expresión de genes.
10. Utilización de los compuestos análogos a
oligonucleótidos según una o varias de las reivindicaciones
1-6 ó 7 para la preparación de una sonda para la
detección de ácidos nucleicos.
11. Formulación farmacéutica que contiene uno o
varios compuestos análogos a oligonucleótidos de la fórmula IB según
una o varias de las reivindicaciones 1-6 ó 7,
eventualmente junto con materiales auxiliares y/o de vehículo
fisiológicamente compatibles.
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