ES2253740T3 - Derivados de oligonucleotidos 3'-modificados. - Google Patents

Derivados de oligonucleotidos 3'-modificados.

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ES2253740T3 ES95108896T ES95108896T ES2253740T3 ES 2253740 T3 ES2253740 T3 ES 2253740T3 ES 95108896 T ES95108896 T ES 95108896T ES 95108896 T ES95108896 T ES 95108896T ES 2253740 T3 ES2253740 T3 ES 2253740T3
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Anuschirwan Dr. Peyman
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    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes

Abstract

Compuestos de la fórmula I así como sus sales fisiológicamente tolerables, en donde a es un número de cero a 20; b es un número de cero a 20; R1 es hidrógeno, alquilo C1-C18, alquenilo C2-C18, alquenilo C3-C18, alquilcarbonilo C1-C18, alquenilcarbonilo C2-C19, alquinilcarbonilo C3-C19, arilo C6-C20, aril C6-C14-alquilo C C1-C8, o un radical de la fórmula III R2 es hidrógeno, hidroxi, alcoxi C1-C18, halógeno, azido o NH2; D es hidroxi, O-PO32-; B es una base usual en la química de los nucleótidos, por ejemplo, para bases naturales y bases no naturales; n es un número entero de 7 a 25; n¿ es un número entero de cero a 50; m¿ es en la fórmula I es un número entero de cero a 5.

Description

Derivados de oligonucleótidos 3'-modificados.
La presente invención se refiere a nuevos análogos de oligonucleótidos con valiosas propiedades físicas, biológicas y farmacológicas. Su aplicación se refiere al uso como inhibidores de la expresión genética (oligonucleótidos antisentido, ribozimas, oligonucleótidos con sentido y oligonucleótidos formadores de triplete), como sondas para la detección de ácidos nucleicos y como auxiliares en la biología molecular.
Los oligonucleótidos se aplican cada vez en mayor medida como inhibidores de la expresión genética (J. F. Milligan, M. D. Matteucci y J. C. Martin, J. Med. Chem. 36 (1993) 1923; E. Uhlmann y A. Peyman, Chemical Reviews 90 (1990) 543).
Los oligonucleótidos antisentido son fragmentos de ácido nucleico cuya secuencia de bases es complementaria a un ARNm por inhibir. Este ARNm blanco puede tener origen celular, viral u otro origen patógeno. Como secuencias blanco celulares se tienen en cuenta, por ejemplo, las de receptores, encimas, factores del crecimiento, inmunomoduladores, canales iónicos u oncogenes. La inhibición de la reproducción viral con ayuda de oligonucleótidos antisentido fue descrita, a modo de ejemplo, para RSV (Rous Sarcoma Virus), HSV-1 y -2 (Herpes Simplex Virus tipos I y II), HIV (virus de inmunodeficiencia humana) y virus de la gripe. En este caso, se aplican oligonucleótidos que son complementarios del ácido nucleico viral.
Por el contrario, los oligonucleótidos con sentido están concebidos en su secuencia de modo tal que unan ("capturen"), por ejemplo, proteínas de unión con ácido nucleico o enzimas que procesan ácido nucleico, inhibiendo así su actividad biológica (C. Hélène y J. J. Toulmé, Biochim. Biophys. Acta 1049 (1990) 99). Como blancos virales se han de mencionar aquí, por ejemplo, la transcriptasa inversa, la polimerasa de ADN y las proteínas transactivadoras. Los oligonucleótidos formadores de tripletes tienen en general el ADN como blanco y forman, después de unirse a él, una estructura de triple hélice.
Mientras que, con ayuda de los oligonucleótidos antisentido, se inhiben en general el procesamiento (splicing, etc.) del ARNm o su traducción en la proteína, los oligonucleótidos formadores de tripletes inhiben la transcripción o la replicación del ADN (N. T. Tuong y C. Hélène, Angew. Chem. 105 (1993) 697; Uhlmann y Peyman, Chemical Reviews 90 (1990) 543). Pero también es posible unir ácidos nucleicos monocatenarios en una primera hibridación con su oligonucleótido antisentido con la formación de una doble cadena que luego conforma una estructura triple en una segunda hibridación con un oligonucleótido formador de tripletes. Las regiones de unión antisentido y de tripletes pueden, en este caso, estar albergadas ya sea en dos oligonucleótidos separados o en un oligonucleó-
tido.
Otra aplicación de oligonucleótidos sintéticos son las llamadas ribozimas, que destruyen el ARN blanco como consecuencia de su actividad de ribonucleasa (D. Castanotto, J. J. Rossi, J. O. Deshler, Critical Rev. Eukar. Gene Expr. 2 (1992) 331).
En su diagnóstico de ADN, se aplican fragmentos de ácido nucleico con una marcación apropiada como las llamadas sondas de ADN para la hibridación en un ácido nucleico por detectar. La formación específica de la nueva cadena doble se sigue en este caso con ayuda de la marcación que preferentemente no es radiactiva. De esta manera se pueden detectar enfermedades genéticas, malignas, virales o causadas por otros agentes patógenos.
Para la mayoría de las aplicaciones mencionadas, los oligonucleótidos son poco apropiados o totalmente inapropiados en su forma natural. Deben modificarse químicamente de modo que satisfagan especiales requerimientos. Para que los oligonucleótidos puedas utilizarse en sistemas biológicos, por ejemplo para la inhibición de la reproducción viral, deben cumplir con las siguientes condiciones:
1. Deben presentar una suficiente estabilidad en condiciones in vivo, es decir, tanto en suero como también de modo intracelular.
2. Deben estar constituidos de forma tal que puedan pasar la membrana celular y nuclear.
3. Se deben unir en condiciones fisiológicas de una forma específica de bases con su ácido nucleico blanco para desplegar su efecto inhibidor.
Para sondas de ADN, estas condiciones no son indispensables; pero estos oligonucleótidos deben estar derivados de forma tal que sea posible una detección, por ejemplo, por medio de fluorescencia, quimioluminiscencia, colorimetría o coloración específica (Beck y Köster, Anal. Chem. 62 (1990) 2258).
La modificación química de los oligonucleótidos se realiza la mayor parte de las veces de modo tal que se modifique correspondientemente la columna vertebral del fosfato, la unidad de ribosa o las nucleobases (Uhlmann y Peyman, Chemical Reviews 90 (1990) 543). Otro método utilizado frecuentemente es la producción de conjugados de oligonucleótidos 5' por reacción del grupo 5'-hidroxi con los pertinentes reactivos de fosforilación. Los oligonucleótidos que sólo están modificados en el extremo 5' tienen la desventaja de que se degradan en suero. Si, por el contrario, se modifican todos los restos de fosfato internucleótido, a menudo se modifican drásticamente las propiedades de los oligonucleótidos. A modo de ejemplo, la solubilidad de los oligonucleótidos de metilfosfonato se reduce en medio acuoso, disminuyendo la capacidad de hibridación. Los oligonucleótidos de fosforotioato actúan de manera inespecífica, de modo que, por ejemplo, también divulga homooligómeros (Uhlmann y Peyman, Chemical Reviews 90 (1990) 543) K MISIURA ET AL., (NUCLEIC ACID RESEARCH, 1990, volumen 18, N.º 15, páginas 4345-4354) (p. 4346, columna 1, Z. 6-16; p. 4347, columna 1, Z. 6-10; p. 4348, columna 2, Z. 1-2) oligonucleótidos que están modificados en posiciones internas y/o en el extremo 5' con sondas de marcación de ADN como unidades de ligadores de biotinilo y unidades de ligadores de fosfotirosinilo y que se preparan con ayuda de síntesis en fase sólida convencional partiendo de unidades de fosforamidita.
La degradación de oligonucleótidos por la actividad 3'-nucleolítica se considera en general la degradación preponderante por nucleasas en suero. Por ello, era un objeto poner a disposición análogos de oligonucleótidos 3'-derivados con eficacia específica, mayor estabilidad en suero y buena tolerancia.
Por ello, son objeto de esta invención los compuestos de la fórmula I
1
así como sus sales fisiológicamente tolerables, en donde
a
es un número de cero a 20, con preferencia de cero a 10, con preferencia especial de cero a 6, con preferencia muy especial de cero a 4;
b
es un número de cero a 20, con preferencia de cero a 10, con preferencia especial de cero a 4, con preferencia muy especial de cero;
R^{1}
es hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{18}, con preferencia alquilo C_{1}-C_{6}, en especial metilo, alquenilo C_{2}-C_{18}, alquinilo C_{3}-C_{18}, alquilcarbonilo C_{1}-C_{18}, alquenilcarbonilo C_{2}-C_{19}, alquinilcarbonilo C_{3}-C_{19}, arilo C_{6}-C_{20}, aril C_{6}-C_{14}-alquilo C_{1}-C_{8}, o un radical de la fórmula III
(III)Z --- 
\melm{\delm{\dpara}{W}}{P}{\uelm{\para}{}}
--- Z'
con preferencia hidrógeno o un radical de la fórmula III, con preferencia muy especial hidrógeno;
R^{2}
es hidrógeno, hidroxi, alcoxi C_{1}-C_{18}, halógeno, azido o NH_{2}, con preferencia hidrógeno, hidroxi, alcoxi C_{1}-C_{4}, flúor o NH_{2}, con preferencia especial hidrógeno o hidroxi, con preferencia muy especial hidrógeno;
B
es una base usual en la química de los nucleótidos, por ejemplo, para bases naturales tales como adenina, citosina, guanina, uracilo y timina o bases no naturales, tales como, por ejemplo, purina, 2,6-diaminopurina, 7-desazaadenina, 7-desazaguanina, N^{4}N^{4}-etanocitosina, N^{6}N^{6}-etano-2.6-diaminopurina, pseudoisocitosina, 5-propinuracilo, 5-propincitosina, 5-fluorocitosina, 5-fluorouracilo, 5-hidroximetiluracilo y 5-bromocitosina o bien, con preferencia muy especial adenina, citosina, guanina, uracilo, timina, 5-propinuracilo y 5-propincitosina;
n
es un número entero de 7 a 25;
n'
es un número entero de cero a 50, con preferencia cero a 40, con preferencia especial cero a 30, con preferencia muy especial cero a 25;
m
es un número entero de cero a 5, con preferencia muy especial cero;
m'
en la fórmula I es un número entero de cero a 5, con preferencia muy especial es cero o 1;
A
es oxi, tioxi o metileno, con preferencia es oxi;
W
es oxo, tioxo o selenoxo, con preferencia oxo o tioxo, con preferencia especial oxo;
V
es oxi o sulfandiílo, con preferencia muy especial es oxi;
T
es oxi, sulfandiílo o imino, con preferencia muy especial es oxi;
Y
es oxi, sulfandiílo, imino o metileno, con preferencia muy especial es oxi;
X
es hidroxi o mercapto;
U
es hidroxi, mercapto, BH_{3}, SeH, alcoxi C_{1}-C_{18}, con preferencia alcoxi C_{1}-C_{6}, alquilo C_{1}-C_{18}, con preferencia alquilo C_{1}-C_{6}, arilo C_{6}-C_{20}, aril C_{6}-C_{14}-alquilo C_{1}-C_{8}, NHR^{3}, NR^{3}R^{4} o un radical de la fórmula IV
(IV)(OCH_{2}CH_{2})_{p}O(CH_{2})_{q}CH_{2}R^{5}
\quad
con preferencia hidroxi, mercapto, alcoxi C_{1}-C_{6}, alquilo C_{1}-C_{6}, NR^{3}R^{4} o NHR^{3} y con preferencia especial es hidroxi o alquilo C_{1}-C_{6}, en donde
R^{3}
es alquilo C_{1}-C_{18}, con preferencia alquilo C_{1}-C_{8}, arilo C_{6}-C_{20}, aril C_{6}-C_{14}-alquilo C_{1}-C_{8}, -(CH_{2})_{c}-[NH(CH_{2})_{c}]d-NR^{6}R^{6}, en donde c es un número entero de 2 a 6 y d es un número entero de cero a 6, y R^{6} es, de modo independiente entre sí, hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{6} o alcoxi C_{1}-C_{4}-alquilo C_{1}-C_{6}, con preferencia metoxietilo, con preferencia alquilo C_{1}-C_{8}, en especial alquilo C_{1}-C_{4};
R^{4}
es alquilo C_{1}-C_{18}, arilo C_{6}-C_{20} o aril C_{6}-C_{10}-alquilo C_{1}-C_{8}, con preferencia alquilo C_{1}-C_{8}, en especial alquilo C_{1}-C_{4}, arilo C_{6}-C_{20} o aril C_{6}-C_{10}-alquilo C_{1}-C_{8}
\quad
o en el caso de NR^{3}R^{4} junto con R^{3} y el átomo de nitrógeno que los lleva es un anillo heterocíclico de 5-6 miembros, que adicionalmente puede contener otro heteroátomo de la serie O, S, N;
p
es un número entero de 1 a 100, con preferencia 3 a 20 y con preferencia especial 3 a 8;
q
es un número entero de cero a 22, con preferencia cero a 15;
R^{5}
es hidrógeno o un grupo funcional seleccionado de hidroxi, amino, NHR^{7}, COOH, CONH_{2}, COOR^{8} o halógeno, en donde R^{7} es alquilo C_{1}-C_{6} y R^{8} es alquilo C_{1}-C_{4}, con preferencia metilo;
Z, Z' son, de modo independiente entre sí, hidroxi, mercapto, SeH, alcoxi C_{1}-C_{22}, con preferencia alcoxi C_{6}-C_{18}, -O-(CH_{2})_{b}-NR^{7}R^{8}, en donde b es un número entero de 1 a 6, y R^{7} es alquilo C_{1}-C_{6} y R^{8} es alquilo C_{1}-C_{4} o R^{7} y R^{8} forman junto con el átomo de nitrógeno que llevan un anillo de 3-6 miembros; alquilo C_{1}-C_{18}, con preferencia alquilo C_{1}-C_{8}, arilo C_{6}-C_{20}, aril C_{6}-C_{14}-alquilo C_{1}-C_{8}, con preferencia aril C_{6}-C_{10}-alquilo C_{1}-C_{4}, aril C_{6}-C_{14}-alcoxi C1-C8, con preferencia aril C_{6}-C_{10}-alcoxi C_{1}-C_{4}, en donde el arilo también significa heteroarilo y arilo está eventualmente sustituido con 1, 2 ó 3 radicales iguales o diferentes de la serie carboxi, amino, nitro, alquil C_{1}-C_{4}-amino, alcoxi C_{1}-C_{6}, hidroxi, halógeno y ciano, alquil C_{1}-C_{18}-mercapto, NHR^{3}, NR^{3}R^{4}, en donde R^{3} y R^{4} son como se definieron con anterioridad, o son un grupo mencionado más abajo, que favorece la captación intracelular o sirve como marcación de una sonda de ADN o ataca en la hibridación del análogo del oligonucleótido en el ácido nucleico blanco por unión, reticulación o separación, o un nucleósido u oligonucleótido unido a través del extremo 5' o 3'; y
la llave indica que R^{2} y el radical fosforilo adyacente pueden estar en posición 2' y 3' o también viceversa, en posición 3' y 2',
en donde cada nucleótido puede estar en su configuración D o L y la base B se puede hallar en posición \alpha o \beta.
Se prefieren análogos de oligonucleótidos de la fórmula I, así como sus sales fisiológicamente tolerables, en donde la base B se halla en la posición \beta, los nucleótidos tienen configuración D y R^{2} se halla en posición 2'.
Se prefieren especialmente los análogos de oligonucleótidos de la fórmula I, en donde V e Y tienen el significado de oxi.
Además, se prefieren especialmente los análogos de oligonucleótidos de la fórmula I, en donde V, Y y W tienen el significado de oxi u oxo.
Se prefieren muy especialmente los análogos de oligonucleótidos de la fórmula I, en donde V, Y, W y U tienen el significado de oxi, oxo o hidroxi.
Además, se prefieren análogos de oligonucleótidos de la fórmula I, en donde R^{1} es hidrógeno.
Se prefieren especialmente los análogos de oligonucleótidos de la fórmula I, en donde U, V, W, X e Y tienen el significado de oxi, oxo o hidroxi y R^{1} es igual a hidrógeno.
Los radicales que aparecen repetidamente, tales como R^{2}, B, A, W, V, Y, U, R^{3}, R^{4}, T, a, b, p, q y Z, pueden tener, de modo independiente entre sí, significados iguales o diferentes, es decir, V significa por ejemplo, de modo independiente entre sí, oxi, sulfandiílo o imino.
Halógeno es con preferencia flúor, cloro o bromo.
Por heteroarilo se entiende en especial radicales derivados de fenilo o naftilo, en los que uno o varios grupos CH están reemplazados por N y/o en los que al menos dos grupos CH adyacentes (con la formación de un anillo aromático de cinco miembros) están reemplazados por S, NH u O. Además, uno o ambos átomos del sitio de condensación de radicales bicíclicos (como en el indolizinilo) pueden ser átomos de N. Como heteroarilo rigen en especial furanilo, tienilo, pirrolilo, imidazolilo, pirazolilo, triazolilo, tetrazolilo, oxazolilo, isoxazolilo, tiazolilo, isotiazolilo, piridilo, pirazinilo, pirimidinilo, piridazinilo, indolilo, indazolilo, quinolilo, isoquinolilo, ftalazinilo, quinoxalinilo, quinazolinilo, cinolinilo.
Los grupos que favorecen la captación intracelular son diversos radicales lipofílicos como -O-(CH_{2})_{x}-CH_{3}, en donde x es un número entero de 6-18, -O-(CH_{2})_{e}-CH=CH-(CH_{2})_{f}-CH_{3}, en donde e y f son, de modo independiente entre sí, un número entero de 6 a 12, -O-(CH_{2}CH_{2}O)_{4}-(CH_{2})_{9}-CH_{3}, -O-(CH_{2}CH_{2}O)_{8}-(CH_{2})_{13}-CH_{3} y -O-(CH_{2}CH_{2}
O)_{7}-(CH_{2})_{15}-CH_{3}, pero también radicales de esteroides como colesterilo y conjugados que aprovechan los sistemas portadores naturales como ácido biliar, ácido fólico, 2-(N-alquil-N-alcoxi)-aminoantraquinona y conjugados de manosa y péptidos de los correspondientes receptores, que llevan a la endocitosis mediada por receptores de los oligonucleótidos como EGF (factor de crecimiento epidérmico), bradiquinina y PDGF (factor del crecimiento derivado de plaquetas). Por grupos de marcación se entienden grupos fluorescentes, por ejemplo, de derivados de dansilo (=N-dimetil-1-aminonaftil-5-sulfonilo), fluoresceína o cumarina o grupos quimioluminiscentes, por ejemplo, de derivados de acridina, así como el sistema de digoxigenina comprobable por ELISA, el grupo de biotina comprobable a través del sistema de biotina/avidina o también los brazos de ligadores con grupos funcionales que permiten una posterior derivación con grupos informantes detectables, por ejemplo, un ligador de aminoalquilo que se hace reaccionar con un éster activo de acridinio para la prueba de quimioluminiscencia. Típicos grupos de marcación
son:
2 
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3 
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4 
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análogos de oligonucleótidos que se unen o bien intercalan y/o separan o reticulan ácidos nucleicos, contienen conjugados de acridina, psoraleno, fenantrolina, naftoquinona, daunomicina o cloroetilaminoarilo. Típicos radicales intercalantes y reticulantes son:
5 
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Por sales fisiológicamente tolerables de los compuestos de la fórmula I se entienden tanto sales orgánicas como inorgánicas, tal como se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publ. Co., Easton, PA, 17.ª edición (1985) 1418). Debido a su estabilidad física y química, se prefieren para grupos ácidos entre otras las sales de sodio, potasio, calcio y amonio.
La obtención de análogos de oligonucleótidos de la fórmula I se produce de acuerdo con métodos conocidos análogamente a la síntesis de oligonucleótidos biológicos en disolución o con preferencia en fase sólida, eventualmente con ayuda de un aparato de síntesis automático.
Existen diversos métodos para introducir moléculas de conjugados en el extremo 3' de oligonucleótidos. Sin embargo, proporcionan compuestos de la fórmula I. Brindan una síntesis el estado de la técnica: M. Manoharan en Antisense Research and Applications, Crooke y Lebleu, Eds., Chapter 17, S. 303ff, CRC Press Boca Ratón 1993, así como los documentos EP-A 0 552 766 (HOE 92/F 012) y EP-A 0 552 767 (HOE 92/F 013). Mientras que la derivación en el extremo 5' de un oligonucleótido es comparativamente fácil de llevar a cabo, por ejemplo, por reacción con una fosforamidita de la correspondiente molécula del conjugado utilizando un ciclo estándar de síntesis de oligonucleótidos, no existe un procedimiento de aplicación universal para el extremo 3'. La conjugación 3' se realiza ya sea después de la síntesis, es decir después de la separación del portador o bien después de la separación de los grupos protectores, o a través de un material de soporte por preparar especialmente para una molécula de conjugado específica. P. S. Nelson et al. (Nucl. Acids Res. 20 (1992) 6253) describen un ligador 3', del que se separan después de realizada la síntesis en el portador sólido todos los grupos protectores, luego se acoplan después de la síntesis moléculas de conjugados en el grupo amino libre. Gamper et al (Nucl. Acids Res. 21 (1993) 145) describen la síntesis en fase sólida con material de soporte que se derivó con la molécula de conjugado por introducir. Para cada molécula de conjugado debe derivarse el portador de manera trabajosa. En los documentos EP-A 0 552 766 y EP-A 0 552 767 se describe un ligador \beta-eliminable en el que se acoplan fosforamiditas de nucleósido que, en lugar del grupo protector de cianoetilo usual, llevan la correspondiente molécula del conjugado. Luego se produce la síntesis del oligonucleótido. Esto provoca que la molécula del conjugado no pueda llevar ningún grupo protector lábil a ácidos que se separaría en el curso del ciclo de síntesis. Además, la síntesis de las unidades monoméricas del conjugado de nucleósido es muy costosa.
Los compuestos según la invención pueden prepararse por medio de un procedimiento de uso universal para la 3'-modificación de oligonucleótidos en el portador sólido que permite, en el marco de la síntesis en fase sólida, la introducción de una molécula del conjugado a través de la química de las fosforamiditas. Para la conjugación se pueden emplear las fosforamiditas del conjugado de fácil acceso y usuales para la 5'-derivación. La molécula del ligado utilizada para ello con los grupos protectores correspondientes no puede ser introducida en el extremo 3' del oligonucleótido, sino que también una o varias veces dentro del oligonucleótido, usando la química de las fosforamiditas.
El procedimiento para preparar los compuestos de la fórmula I se caracteriza porque
a)
se hace reaccionar un compuesto de la fórmula V
14
en la que
a, b, V, T están definidos con anteriormente en la fórmula I y
V' tiene el significado de V y los grupos funcionales V, V' y T también pueden estar eventualmente protegidos de manera temporaria (con preferencia, en caso de que V = V' = T = oxi y b = 0, como acetal cíclico, que se obtiene por reacción con acetona bajo catálisis de Fe^{III} y se vuelve a separar con ácido acético después de introducir el grupo protector S1 con ácido acético),
con un grupo protector S1, que se puede separar de un oligonucleótido aún completamente protegido y unido con el portador, sin que se separen otros grupos protectores o el enlace con el portador sólido como, por ejemplo, el grupo protector de levuloílo, así como orto-, meta- o para- R-O-arilo-, en donde R es alquilo C_{1}-C_{20}, alquenilo C_{2}-C_{20}, alquenilo C_{3}-C_{20}, aril C_{6}-C_{12}-alquilo C_{1}-C_{6}, con preferencia el grupo protector de levuloílo y el grupo protector de para-metoxifenilo,
y un grupo protector S2, que se puede eliminar sin separación del brazo del ligador Li en la fórmula VII y sin separación del grupo protector S1, se prefieren dimetoxitritilo, monometoxitritilo, tritilo, pixilo, 4-metoxitetra-hidropiranilo, con preferencia especial monometoxitritilo y dimetoxitritilo, de acuerdo con procedimientos conocidos (por ejemplo, M. J. Gait, "Oligonucleotide Synthesis - a practical approach", IRL press 1984), por ejemplo se introduce el grupo para-metoxifenilo por reacción con para-metoxifenol, difenilazodicarboxilato y trifenilfosfina en un disolvente apropiado, por ejemplo tetrahidrofurano (THF) a reflujo, luego se vuelve a separar el acetal ácido, por ejemplo con ácido acético y finalmente se introduce el grupo protector de monometoxi-tritilo por reacción con cloruro de monometoxitritilo en piridina, en un compuesto de la fórmula VI,
15
en la que
S1, S2, V, V', T, a y b son como se definieron con anterioridad,
b)
luego se hace reaccionar el compuesto de la fórmula VI de acuerdo con procedimientos conocidos con 1 a 10 equivalentes, con preferencia con 1 a 2 equivalentes de un ligador Li como, por ejemplo, anhídrido de ácido succínico, en un disolvente orgánico apropiado como, por ejemplo, cloruro de metileno, eventualmente tras añadir un catalizador, por ejemplo, 4-dimetilaminopiridina, en un compuesto de la fórmula VII,
16
en la que significan
S1, S2, V, V', T, a y b son como se definieron con anterioridad, y
Li es un brazo de ligador que por unión química (amida, éster, entre otros) puede unir el compuesto de la fórmula VI con un portador sólido (Damka et al., Nucleic Acids Res. 18 (1990) 3813, Sonveaux (Bioorg. Chem. 14 (1986) 274), con preferencia un radical de ácido succínico (O-C(O)-CH_{2}CH_{2}-C(O)-), un radical de ácido oxálico, (O-C(O)-C(O)-), una alquilamina, con preferencia LCAA (alquilamina de cadena larga), o polietilenglicol, con preferencia especial un radical de ácido succínico, en donde en determinados casos, por ejemplo, en combinación con sustituyentes que no soportan un tratamiento prolongado con amoníaco, son de preferencia también ligadores más estables, como el ligador de oxalilo, y luego se elabora según procedimientos conocidos como, por ejemplo, extracción, cristalización, cromatografía;
c)
se acopla el compuesto de la fórmula VII de acuerdo con procedimientos conocidos en un portador sólido SS, como por ejemplo, aminopropil-CPG (CPG = Controlled Pore Glass) o ®Tentagel (empresa Rapp, Alemania), por ejemplo, por reacción con DCC y p-nitrofenol en un disolvente apropiado o con tetrafluoroborato de O-(benzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronio (TBTU) y una base como, por ejemplo, N-etilmorfolina, en un disolvente apropiado como, por ejemplo, DMF (por ejemplo, M. J. Gait, Oligonucleotide Synthesis - a practical approach, IRL Press, 1984) y se obtiene un compuesto de la fórmula VIII,
17
en la que
S1, S2, V, V', T, Li, a y b son como se definieron con anterioridad y
SS es el portador sólido, por ejemplo, de materiales como CPG (Controlled Pore Glass), gel de sílice o una resina orgánica o poliestireno (PS) o un copolímero de tapón de PS y polietilenglicol (POE), y modificado por grupos funcionales tales como hidroxi, amino, halógeno o COOH en la cadena lateral;
d)
se separa el grupo protector S2 de acuerdo con procedimientos conocidos, por ejemplo, por tratamiento con 1-4% de ácido dicloroacético (DCA) en diclorometano o cloroformo, o
alternativamente se separa antes el grupo protector S1 de acuerdo con procedimientos conocidos, por ejemplo, el grupo protector de levuloílo por tratamiento con hidrazina, se ejecutan las etapas de reacción l) y m), luego las etapas de reacción e) - i) y por último la etapa de reacción n), o
alternativamente a ello, se ejecutan, después de la separación del grupo protector S2, las etapas de reacción I) y m), luego se separa el grupo protector S1 de acuerdo con procedimientos conocidos, por ejemplo, el grupo protector de levuloílo por tratamiento con hidrazina o el grupo protector de para-metoxifenilo por tratamiento con Ce^{IV}, luego se ejecutan las etapas de reacción e) - i) y por último la etapa de reacción n);
e)
a continuación, en caso de que m = 1 a 5, se hace reaccionar el compuesto obtenido de acuerdo con d) con un compuesto de la fórmula IX
18
en la que
S1, S2, V, V', T, a y b son como se definieron con anterioridad, y
R^{9} y R^{10} son iguales o diferentes y son alquilo C_{1}-C_{8}, con preferencia isopropilo, o cicloalquilo C_{5}-C_{12}, con preferencia hasta C_{8}, bencilo o fenilo o junto con el nitrógeno al que están unidos, son un anillo heterocíclico saturado o insaturado con eventualmente otros heteroátomos como, por ejemplo, morfolina, y sustituyentes, como éster de OC(O)O-alquilo C_{1}-C_{4},
R^{12} es OR^{13} o alquilo C_{1}-C_{18}, alcoxi C_{1}-C_{18}, arilo C_{6}-C_{20}, aril C_{6}-C_{14}-alquilo C_{1}-C_{8}, con preferencia es OR^{13}, alquilo C_{1}-C_{6}, alcoxi C_{1}-C_{6}, arilo C_{6}-C_{20}, aril C_{6}-C_{14}-alquilo C_{1}-C_{8}, con preferencia especial es OR^{13} o alquilo C_{1}-C_{6}, R^{13} es un grupo de las fórmulas
19
o un grupo bencilo que no está sustituido o que está mono- a tetrasustituido en el anillo, con preferencia no está sustituido, en donde el o los sustituyentes son, de modo independiente entre sí, flúor, cloro, bromo, un grupo alquilo C_{1}-C_{4}, nitro, metoxi o carboxilo,
en presencia de un compuesto de la fórmula [HNR^{14}R^{15}R^{16}]^{(+)} E^{(-)}, en donde R^{14}, R^{15}, R^{16} son iguales o diferentes entre sí y significan un grupo alquilo C_{1}-C_{4} y E = flúor, cloro, bromo, en especial cloro, o en presencia de tetrazol o tetrazol sustituido como, por ejemplo, 5-(4-nitrofenil)-1H-tetrazol o 5-metiltio-1H-tetrazol o 5-etiltio-1H-tetrazol, con preferencia en presencia de tetrazol sustituido como, por ejemplo, 5-(4-nitrofenil)-1H-tetrazol o 5-metiltio-1H-tetrazol o 5-etiltio-1H-tetrazol, con preferencia especial en presencia de 5-metiltio-1H-tetrazol, en un disolvente orgánico apropiado, con preferencia acetonitrilo,
se oxida el compuesto obtenido de acuerdo con procedimientos conocidos, por ejemplo, tal como se describe en la etapa de reacción m), se realiza un recubrimiento de la manera usual, se separa el grupo protector S2 (por ejemplo, Beaucage y Lyer Tetrahedron 49 (1993) 1925 & 2223 & 6123; E. Sonveaux, Bioorg. Chem. 14 (1986) 274; E. Uhlmann y A. Peyman, Chemical Reviews 90 (1990) 543)
y eventualmente se repite esta etapa de reacción una (m-1)-vez, obteniendo así un compuesto de la fórmula X
20
en la que
Li, S1, SS, T, U, V, V', W, a, b y m son como se definieron con anterioridad;
f)
en caso de que m = 0, se hace reaccionar el compuesto obtenido de acuerdo con d) de acuerdo con el método de la fosforamidita (E. Sonveaux, Bioorg. Chem. 14 (1986) 274) con una fosforamidita de nucleósido de la fórmula XI,
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21 
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en la que significan
B' está definido como B y R^{2}' como R^{2} y eventualmente también pueden estar protegidos, por ejemplo, R^{2} = hidroxi puede estar protegido con butildimetilsililo terciario, y
R^{9}, R^{10}, R^{12}, S2 y V son como se definieron con anterioridad,
se oxida el compuesto obtenido de acuerdo con procedimientos conocidos, se realiza un recubrimiento de la manera usual, se separa el grupo protector S2, con preferencia dimetoxitritilo o monometoxitritilo, de acuerdo con procedimientos conocidos (por ejemplo, Beaucage y Lyer, Tetrahedron 49 (1993) 1925 & 2223 & 6123; E. Sonveaux, Bioorg. Chem. 14 (1986) 274; E. Uhlmann y A. Peyman, Chemical Reviews 90 (1990) 543)
y eventualmente se repite esta etapa de reacción una (n-1)-vez, obteniendo así un compuesto de la fórmula XII
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22 
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en la que
A, B', Li, R^{2}', S1, SS, T, U, V, V', W, Y, a, b, m y n son como se definieron con anterioridad;
\newpage
g)
en caso m' = 1 a 5, se ejecuta la etapa de reacción e), que eventualmente se repite (m'-1)-vez, obteniendo el compuesto de la fórmula XIII,
23
en la que
A, B', Li, R^{2}', S1, SS, T, U, V, V', W, Y, a, b, m, m' y n son como se definieron con anterioridad;
h)
en caso de que m' = 0 y n' = 1-50, se ejecuta la etapa de reacción f), que se repite eventualmente (n'-1)-vez, obteniendo los compuestos de la fórmula XIV,
24
en la que
A, B', Li, R^{2}', S1, SS, T, U, V, V', W, Y, a, b, m, m', n y n' son como se definieron con anterioridad;
i)
eventualmente se introduce, en caso de que en la fórmula I R^{1} \neq H, en el compuesto obtenido de acuerdo con f), g) o h) el radical R^{1} según procedimientos conocidos, con preferencia por la pertinentes reacción análogamente a las etapas de reacción l) y m),
en donde
R^{1} es alquilo C_{1}-C_{18}, con preferencia alquilo C_{1}-C_{6}, en especial metilo, alquenilo C_{2}-C_{18}, alquinilo C_{3}-C_{18}, alquil C_{1}-C_{18}-carbonilo, alquenilcarbonilo C_{2}-C_{19}, alquinilcarbonilo C_{3}-C_{19}, arilo C_{6}-C_{20}, aril C_{6}-C_{14}-alquilo C_{1}-C_{8}, o un radical de la fórmula III
(III)Z --- 
\melm{\delm{\dpara}{W}}{P}{\uelm{\para}{}}
--- Z'
en la que
W, Z y Z' son como se definieron con anterioridad, con preferencia un radical de la fórmula III;
j)
en caso de que en la fórmula I R^{1} = H, se recubre de acuerdo con métodos conocidos, por ejemplo, por reacción con acetanhídrido y N-metilimidazol;
k)
a continuación de los oligonucleótidos protegidos, aún unidos con los portadores, obtenidos de esta manera, se separa el grupo protector S1 de acuerdo con procedimientos conocidos (por ejemplo, Greene, Wuts, "Protective Groups in Organic Synthesis", J. Wiley, Nueva York 1991), de modo que quedan el ligador con el portador sólidos y los demás grupos protectores contenidos en la molécula, por ejemplo, para S1 = levuloílo por tratamiento con hidrazina y para S1 = para-metoxifenilo con preferencia por tratamiento con Ce^{IV}, por ejemplo, con una disolución 0,05-1 M de Ce^{IV}(NH_{4})_{2}(NO_{3})_{6} en acetonitrilo/H_{2}O a -10 a 100ºC durante 0,2 a 500 minutos, con preferencia con una disolución 0,05 a 0,5 M, en especial disolución 0,1 M de Ce^{IV}(NH_{4})_{2}(NO_{3})_{6} en acetonitrilo/H_{2}O (2:1 a 8:1, en especial 4:1) a 0-50ºC, en especial 20-30ºC durante 1-30 min, en especial durante 2 a 10 min;
l)
y el compuesto obtenido de esta manera se hace reaccionar con un compuesto de la fórmula XV,
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25 
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en la que
R^{9}, R^{10}, R^{12} tienen los significados mencionados con anterioridad y
Z'' tiene el significado de Z, que se define como con anterioridad, o también es Z protegido de acuerdo con procedimientos conocidos, en donde se usan con preferencia grupos protectores que se separan en condiciones que se aplican en la síntesis de oligonucleótidos para la separación de grupos protectores, se mencionan a modo de ejemplo hidroxi, mercapto y SeH, que deben estar como derivados protegidos, por ejemplo, como O-CH_{2}-CH_{2}-CN, O-CH_{3}, S-CH_{2}-CH_{2}-CN o
26
en presencia de un compuesto de la fórmula [HNR^{14}R^{15}R^{16}]^{(+)} E^{(-)}, en donde R^{14}, R^{15}, R^{16} y E son como se definieron con anterioridad, o en presencia de tetrazol o tetrazol sustituido como, por ejemplo, 5-(4-nitrofenil)-1H-tetrazol o 5-metiltio-1H-tetrazol o 5-etiltio-1H-tetrazol, con preferencia en presencia de tetrazol sustituido como, por ejemplo, 5-(4-nitrofenil)-1H-tetrazol o 5-metiltio-1H-tetrazol o 5-etiltio-1H-tetrazol, con preferencia especial en presencia de 5-metiltio-1H-tetrazol, en un disolvente orgánico apropiado, con preferencia acetonitrilo;
m)
se oxida el compuesto obtenido de acuerdo con procedimientos conocidos, por ejemplo, por reacción con yodo en presencia de piridina, lutidina o colidina acuosas, eventualmente también en presencia de otros disolventes orgánicos tales como, por ejemplo, tetrahidrofurano, o por ejemplo, por reacción con N,N,N',N'-tetraetil-tiuramdisulfuro en acetonitrilo, o por ejemplo, por reacción con yodo en presencia de alquilamina o aril-amina, en donde se resumen los distintos procedimientos de oxidación conocidos por el especialista que sirven para la preparación de oligonucleótidos naturales y modificados, por ejemplo, en Beaucage y Lyer, Tetrahedron 49 (1993) 1925 & 2223 & 6123; E. Sonveaux, Bioorg. Chem. 14 (1986) 274, así como E. Uhlmann y A. Peyman, Chemical Reviews 90 (1990) 543, y luego se efectúa la oxidación con preferencia por reacción con yodo en presencia de piridina, lutidina o colidina acuosas, eventualmente también en presencia de otros disolventes orgánicos como tetrahidrofurano;
n)
se separa el oligonucleótido de acuerdo con procedimientos conocidos del portador, por ejemplo con NH_{3} a 50-60ºC, y se separan los grupos protectores restantes en el fosfato y las nucleobases también de acuerdo con procedimientos conocidos.
El tipo de grupos aminoprotectores de las bases y la naturaleza del ligador Li se rigen en el caso individual según el tipo del sustituyente Z, ya que deben ser separables sin problemas después de una síntesis completa. Por ejemplo, en la preparación de un éster 3'-fosfatisopropílico de oligonucleótido (Z=O-i-C_{3}H_{7}), para B = Ade y Cyt se puede trabajar con los grupos protectores de benzoílo (Bz) o para B = Gua con los grupos protectores de isobutirilo (i-Bu). Contrariamente, para la síntesis de un 3' metilfosfonato de oligonucleótido (Z = CH_{3}) o éster etílico (Z = O-C_{2}H_{5}) para B = Ade y Gua se usan con preferencia los grupos protectores fenoxiacetilo (PAC) o para B = Cyt los grupos protectores de iso-butirilo más lábiles.
Los compuestos de la fórmula IX
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27 
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en la que
S1, S2, V, V', T, a, y b, son como se definieron con anterioridad,
R^{9} y R^{10} son iguales o diferentes y son alquilo C_{1}-C_{8}, con preferencia isopropilo, o cicloalquilo C_{5}-C_{12}, con preferencia hasta C_{8}, bencilo o fenilo o junto con el nitrógeno al que están unidos, son un anillo heterocíclico saturado o insaturado con eventualmente otros heteroátomos como, por ejemplo, morfolina, y sustituyentes, como éster de OC(O)O-alquilo C_{1}-C_{4}, y
R^{12} es OR^{13} o alquilo C_{1}-C_{18}, alcoxi C_{1}-C_{18}, arilo C_{6}-C_{20}, aril C_{6}-C_{14}-alquilo C_{1}-C_{8}, con preferencia OR^{13}, alquilo C_{1}-C_{6}, alcoxi C_{1}-C_{6}, arilo C_{6}-C_{20}, aril C_{6}-C_{14}-alquilo C_{1}-C_{8},
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28 
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con preferencia especial es OR^{13} o alquilo C_{1}-C_{6};
R^{13} es un grupo de la fórmula o un grupo bencilo que no está sustituido o que está mono- a tetrasustituido en el anillo, con preferencia no está sustituido, en donde el o los sustituyentes son, de modo independiente entre sí, flúor, cloro, bromo, un grupo alquilo C_{1}-C_{4}, nitro, metoxi o carboxilo,
\newpage
pueden obtenerse por reacción de un compuesto de la fórmula VI
29
con un compuesto de la fórmula XX
30
en la que
R^{9}, R^{10} y R^{12} son como se definieron con anterioridad y
R^{11} es cloro o bromo o un radical de la fórmula NR^{9}R^{10}, en donde R^{9} y R^{10} son como se definieron con anterioridad;
en presencia de una base, con preferencia piridina o una mezcla de tetrahidrofurano (THF), dioxano, diclorometano (DCM), cloroformo y/o acetonitrilo con una trialquilamina C_{1}-C_{4}, con preferencia trimetil-, trietil- o diisopropiletil-amina, o, cuando R^{11} es un radical de la fórmula NR^{9}R^{10}, en presencia de un compuesto de la fórmula [HNR^{14}R^{15}
R^{16}]^{(+)} E^{(-)}, en donde R^{14}, R^{15}, R^{16} son iguales o diferentes y son un grupo alquilo C_{1}-C_{4} y E = flúor, cloro, bromo, en especial cloro, o en presencia de tetrazol o tetrazol sustituido, como por ejemplo, 5-(4-nitrofenil)-1H-tetrazol o 5-metiltio-1H-tetrazol o 5-etiltio-1H-tetrazol, con preferencia en presencia de tetrazol.
En lugar del método de la fosforamidita, los compuestos de la fórmula I también se pueden obtener por medio del método de H-fosfonato o el método del fosfotriéster (E. Uhlmann y A. Peyman, Chemical Reviews 90 (1990) 543).
Al usar el método del H-fosfonato, se hace reaccionar el compuesto de la fórmula VI obtenido de acuerdo con la etapa de reacción a) (preparación de compuestos de la fórmula I) según procedimientos conocidos (por ejemplo, B. Froehler, Tetrahedron Lett. 27 (1986) 5575) en un compuesto de la fórmula XXI,
31
en donde V, V', T, a, b, y W tienen el significado mencionado con anterioridad. A modo de ejemplo se menciona la reacción con
32
en un disolvente orgánico apropiado, por ejemplo, diclorometano y posterior hidrólisis. Al introducir el grupo Z (etapa de reacción i) en el caso de los compuestos de la fórmula I y la etapa de reacción e) en el caso de los compuestos de la fórmula II) según el método del H-fosfonato, se hace reaccionar con un compuesto de la fórmula XXII
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(XXII)H --- 
\melm{\delm{\dpara}{W}}{P}{\uelm{\para}{O ^{-} }}
--- Z'' 
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en donde Z'' y W tienen los significados mencionados con anterioridad,
en presencia de un agente de condensación como cloruro de pivaloílo o adamantoílo y una base como piridina. El diéster de H-fosfonato formado se somete luego a una fosforamidación oxidativa (B. Froehler, Tetrahedron Lett. 27, (1986) 5575) o bien a una oxidación en agua yodada, azufre o selenio. De esta manera se puede preparar un oligonucleótido, por ejemplo, con colesteriloxicarbonil-aminoalquilamina en presencia de tetracloruro de carbono, con un grupo colesterilo 3'-terminal. Por amidación oxidativa con 2-metoxietilamina se obtienen, por ejemplo, oligonucleótidos con un radical 3'-O-(2-metoxietil)-fosforamidato.
De acuerdo con el método del triéster, el compuesto de la fórmula VI obtenido de acuerdo con la etapa de reacción a) (preparación de compuestos de la fórmula I) se hace reaccionar según procedimientos conocidos (por ejemplo, Sonveaux, Bioorg. Chem. 14 (1986) 274) en un compuesto de la fórmula XXIII
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33 
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en donde V, V', T, a, b, y W tienen el significado mencionado con anterioridad, y R^{17} es uno de los grupos protectores usuales en el procedimiento con triésteres conocidos por el especialista, por ejemplo, 2,4-diclorofenilo (E. Sonveaux, Bioorg. Chem. 14 (1986) 274). Al introducir el grupo Z (etapa de reacción i) en el caso de los compuestos de la fórmula I y la etapa de reacción e) en el caso de los compuestos de la fórmula II) según el método del triéster, se hace reaccionar con un compuesto de la fórmula XXIV
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(XXIV)R^{17} --- O --- 
\melm{\delm{\dpara}{W}}{P}{\uelm{\para}{O ^{-} }}
--- Z'' 
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en donde Z, W y R^{17} son como se definieron con anterioridad, en presencia de un agente de condensación. Los reactivos de condensación preferidos son cloruros de ácido arilsulfónico tales como cloruro de mesitileno, cloruro de 2.4.6-triisopropilbenceno o cloruro de ácido 8-quinolinsulfónico en presencia de catalizadores nucleofílicos como imidazol, triazol, tetrazol o sus derivados sustituidos como N-metilimidazol, 3-nitrotriazol o 5-(p-nitrofenil)-tetrazol. Los agentes de condensación de particular preferencia son derivados 4-sustituidos de N-óxido de piridina o N-óxido de quinolina (Efimov et al., Nucleic Acids Research 13 (1985) 3651).
Los análogos de oligonucleótidos de la fórmula I se utilizan como inhibidores de la expresión genética.
Los compuestos de la presente invención pueden utilizarse, por ejemplo, como medicamentos en el tratamiento de enfermedades que son causadas por virus (HIV, HSV-1, HSV-2, gripe, VSV, hepatitis B o papilomavirus).
\newpage
Las secuencias de oligonucleótido antisentido, modificadas según la invención, que son efectivas contra tales blancos, son, a modo de ejemplo:
\vskip1.000000\baselineskip
200
Los compuestos de la presente invención también son apropiados, por ejemplo, para el tratamiento del cáncer. A modo de ejemplo, en este caso también se pueden usar secuencias de oligonucleótidos que están dirigidas contra blancos que son responsables de la generación o el crecimiento del cáncer. Por otra parte, medicamentos de la presente invención también son apropiados, por ejemplo, para evitar la restenosis. A modo de ejemplo, en este caso también se pueden usar secuencias de oligonucleótidos que están dirigidas contra blancos que son responsables de la proliferación o migración. Estos blancos son, por ejemplo:
1) Oncoproteínas nucleares tales como, por ejemplo, c-myc, N-myc, c-myb, c-fos, c-fos/jun, PCNA, p120
2) Oncoproteínas citoplasmáticas/asociadas a membrana tales como, por ejemplo, EJ-ras, c-Ha-ras, N-ras, rrg, bcl-2, cdc-2, c-raf-1, c-mos, c-src, c-abl
3) Receptores celulares tales como, por ejemplo, receptor EGF, receptor FGF, c-erbA, receptores de retinoides, subunidad reguladora de la proteína quinasa, c-fms, cdc2 quinasa,
4) Citoquinas, factores del crecimiento, matriz extracelular tales como, por ejemplo, CSF-1, IL-6, IL-1a, IL-1b, IL-2, IL-4, bFGF, IGF, mieloblastina, fibronectina.
\newpage
Las secuencias de oligonucleótido antisentido, modificadas según la invención, que son efectivas contra tales blancos, son, a modo de ejemplo:
201
Los compuestos de la presente invención son apropiados también, por ejemplo, para el tratamiento de enfermedades que están influenciadas por las integrinas o los receptores de adhesión célula-célula, por ejemplo, por VLA-4, VLA-2, ICAM o ELAM.
Las secuencias de oligonucleótido antisentido, modificadas según la invención, que son efectivas contra tales blancos, son, a modo de ejemplo:
203
Además, los análogos de oligonucleótidos de la fórmula I pueden servir como sonda para la detección de ácidos nucleicos o como auxiliares en la biología molecular.
Otros objetos de la invención son preparaciones farmacéuticas que contienen uno o varios análogos de oligonucleótidos de la fórmula I eventualmente junto con excipientes y/o coadyuvantes fisiológicamente tolerables y/o junto con otros principios activos conocidos, así como procedimientos para su preparación.
Ejemplos 1) Síntesis de éter (4-metoxifenil)-6-O-(4-metoxitrifenilmetil)-5-O-succinilhexílico 1a) 2,2-Dimetil-4-hidroxibutil-1,3-dioxolano
Se disolvieron 15 g (112 mmol) de 1,2,6-hexantriol junto con 0,5 g de FeCl_{3} en 1 l de acetona y se hirvió durante 7 h a reflujo. Se filtró y se destiló la acetona excedente, obteniendo el producto en forma pura. Rendimiento: 18,8 g (96%);
^{1}H-RMN (200MHz, CDCl_{3}/TMS): d = 1,35 (s, 3H, CH_{3}); 1,40 (s, 3H, CH_{3}); 1,30-1,40 (m, 6H, -(CH_{2})_{3}-); 3,52 (t, 1H, C^{4}-H); 3,68 (t, 2H, CH_{2}-OH); 4,00-4,20 (m, 2H, -C^{5}H_{2}-);
MS (EI): m/e = 175 (M+H^{+}, 50%); 159 (30%)
1b) Éter (4-metoxifenil)-4-(2,2-dimetil)dioxolano-4-il)butílico
Se disolvieron 1,74 g (10 mmol) de 2,2-dimetil-4-hidroxibutil-1,3-dioxolano del Ejemplo 1a, 3,41 g (13 mmol) de trifenilfosfina, 2,26 g (13 mmol) de dietilazodicarboxilato y 3,72 g (30 mmol) de 4-metoxifenol en 30 ml de tetrahidrofurano absoluto (THF) y se hirvió durante 1 h a reflujo. El disolvente se destiló y el residuo se cromatografió sobre gel de sílice con acetato de etilo (AE)/n-heptano (1:4). Rendimiento: 2,1 g (74%);
^{1}H-RMN (200MHz, CDCl_{3}/TMS): d = 1,35 (s, 3H, CH_{3}); 1,41 (s, 3H, CH_{3}); 1,45-1,90 (m, 6H, -(CH_{2})_{3}-); 3,53 (t, 1H, C^{4}'-H); 3,77 (s, 3H, O-CH_{3}); 3,92 (t, 2H, CH_{2}-OAr); 3,99-4,21 (m, 2H, -C^{5}'H_{2}-); 6,84 (s, 4H, Ar-H); MS (EI): m/e = 280 (M+H+, 90%); 265 (50%); 223 (100%)
1c) Éter (4-metoxifenil)-(5,6-dihidroxi)hexílico
Se disolvieron 2,08 g de éter (4-metoxifenil)-4-(2,2-dimetildioxolano-4-il)butílico del Ejemplo 1b en 165 ml de ácido acético al 80% y se agitó durante 4 h a temperatura ambiente. El ácido acético se evaporó al vacío, se coevaporó otras dos veces con tolueno/metanol. En este caso, el producto se obtuvo de forma cristalina.
Rendimiento: 1,15 g (65%), pf: 69ºC
^{1}H-RMN (200MHz, CDCl_{3}/TMS): d = 1,40-1,91 (m, 6H, -(CH_{2})_{3}-); 3,39-3,52 (m, 1H, C^{5}-H); 3,42-3,74 (m, 2H, C^{6}H_{2}); 3,77 (s, 3H, O-CH_{3}); 3,93 (t, 2H, CH_{2}-OAr); 6,82 (s, 4H, Ar-H);
MS (EI): m/e = 241 (M+H^{+}, 60%); 240 (M+, 100%) 223 (30%), 205 (30%)
1d) Éter (4-metoxifenil)-6-O-(4-metoxitrifenilmetil)-5-hidroxi-hexílico
Se disolvieron 1,96 g (8,2 mmol) de éter (4-metoxifenil)-5,6-dihidroxi-hexílico del Ejemplo 1c y 2,78 g (9,0 mmol) de cloruro de 4-metoxitrifenilmetilo en 30 ml de piridina absoluta y se agitó durante 3 h a temperatura ambiente. La piridina se evaporó al vacío, el residuo se tomó en 40 ml de diclorometano (DCM) y primero se extrajo con 40 ml de disolución al 5% de NaHCO_{3}, luego con 40 ml de disolución saturada de NaCl y dos veces se lavó con agua. Se secó sobre sulfato de sodio, el disolvente se destiló, el residuo se cromatografió con AE/n-heptano (1:2) sobre gel de sílice.
Rendimiento: 3,10 g (74%);
^{1}H-RMN (200MHz, CDCl_{3}/TMS): d = 1,37-1,80 (m, 6H, -(CH_{2})_{3}-); 2,30 (d, J = 5Hz, 1H, C^{5}-H); 3,00-3,23 (m, 2H, CH_{2}-OMMtr); 3,73 (s, 3H, O-CH_{3}); 3,80 (s, 3H, O-CH_{3}); 3,88 (t, 2H, CH_{2}-OAr); 6,80 (s, 4H, Ar-H); 7,15-7,47 (m, 14H, Ar-H);
MS (ES^{+}, +LiCl): m/e = 519 (M+Li^{+}, 100%);
1e) Éter (4-metoxifenil)-6-O-(4-metoxitrifenilmetil)-5-O-succinilhexílico
Se disolvieron 3,1 g (6,05 mmol) de éter (4-metoxifenil)-6-O-(4-metoxitrifenilmetil)-5-hidroxihexílico del Ejemplo 1d junto con 0,85 g (8,47 mmol) de anhídrido de ácido succínico y 1,04 g (8,47 mmol) de N,N-dimetilaminopiridina (DMAP) en 20 ml de piridina absoluta y se agitó durante 19 h a temperatura ambiente. El disolvente se evaporó al vacío. Se coevaporó dos veces con tolueno/metanol, el residuo se tomó en 280 ml de DCM y con 140 ml de ácido cítrico al 10%, luego se lavó dos veces con agua y se secó sobre sulfato de sodio. El disolvente se destiló, el residuo se cromatografía con AE/n-heptano 2:1 sobre gel de sílice. Rendimiento: 2,55 g (69%);
^{1}H-RMN (200MHz, CDCl_{3}/TMS): d = 1,27-1,49 (m, 2H, C^{2}H_{2}); 1,60-1,82 (m, 4H, C^{1}H_{2} & C^{3}H_{2}); 2,66 (s, 4H, CO-(CH_{2})_{2}-CO); 3,15 (d, 2H, CH_{2}-OMMtr); 3,75 (s, 3H, O-CH_{3}); 3,78 (s, 3H, O-CH_{3}); 3,89 (t, 2H, CH_{2}-OAr); 5,12 (dt, 1H, CH-Osucc); 6,80 (s, 4H, Ar-H); 7,11-7,52 (m, 14H, Ar-H);
MS (FAB+LiCl): m/e = 625,3 (M+2Li^{+}-H^{+}, 100%); 619,2 (M^{+}Li^{+}, 70%); 612,2 (M^{+}, 100%)
2) Síntesis de hexiléter de (3-cianoetiléster-N,N-di-isopropilamida del ácido (4-metoxifenil)-6-O-(4-metoxitrifenilmetil)-5-O-fosforoso
Se disolvieron 512 mg (1,0 mmol) de éter (4-metoxifenil)-1-(6-O-(4-metoxitrifenilmetil)-5-hidroxi)hexílico del Ejemplo 1d después de coevaporar junto con 390 mg (3,0 mmol) de diisopropiletilamina con acetonitrilo absoluto en 4 ml de THF absoluto. Bajo gas de protección se añadieron lentamente gota a gota 330 mg (1,4 mmol) de N,N-diisopropil-cianoetil-fosforamidocloruro. Se agitó durante 2 h a temperatura ambiente. El disolvente se evaporó, el residuo se tomó en 20 ml de AE y se extrajo con 40 ml de disolución saturada de NaCl. La fase orgánica se lavó dos veces con agua, luego se secó sobre sulfato de sodio. El disolvente se destiló, el residuo se cromatografió con DCM/etanol/trietilamina (TEA) (100:4:2) sobre gel de sílice.
Rendimiento: 520 mg;
^{1}H-RMN (200MHz, CDCl_{3}/TMS): d = 1,00-1,93 (m, 18H, -(CH_{2})_{3}- & 4 x CH_{3}); 2,38 & 2,57 (c/u: t, 1H, CH_{2}-CN); 2,92-3,26 (m, 2H, P-O-CH_{2}), 3,45-4,20 (m, 13H, 2 x OCH_{3} & 2 x CH(CH_{3})_{2} & CH_{2}-OAr & CH_{2}-O-MMtr & C^{5}H); 6,70-6,87 (s, 4H, Ar-H); 7,14-7,32 (m, 14H, Ar-H);
MS (FAB, LiCl; NBA): m/e = 735,5 (M+Na^{+}, 100%); 719,5 (M+Li^{+}, 50%)
3) Síntesis de éter (4-metoxifenil)-3-O-(4-metoxitrifenilmetil)-2-O-succinilpropílico 3a) Éter (4-metoxifenil)-(2,2-dimetildioxolano-4-il)metílico
La síntesis se realizó análogamente al Ejemplo 1b a partir de 2,2-dimetil-4-hidroximetil-1,3-dioxolano. Rendimiento: 56%;
^{1}H-RMN (200MHz, CDCl_{3}/TMS): d = 1,40 (s, 3H, CH_{3}); 1,44 (s, 3H, CH_{3}); 3,78 (s, 3H, O-CH_{3}); 3,89 (dd, 2H, CH_{2}-OAr); 3,97-4,21 (m, 2H, -C^{3}H_{2}-); 4,45 (dt, 1H, C^{2}H); 6,83 (s, 4H, Ar-H);
MS (EI): m/e = 239 (M+H^{+}, 40%); 238 (M^{+}, 50%)
3b) Éter (4-metoxifenil)-2,3-dihidroxipropílico
La síntesis se realizó análogamente al Ejemplo 1c a partir de éter (4-metoxifenil)-(2,2-dimetildioxolano-4il)metílico (Ejemplo 3a).
Rendimiento: 98%;
MS (EI): m/e = 199 (M+H^{+}, 100%); 198 (M^{+}, 80%); 181 (40%); 163 (70%)
3c) Éter (4-metoxifenil)-3-O-(4-metoxitrifenilmetil)-2-hidroxipropílico
La síntesis se realizó análogamente al Ejemplo 1d a partir de éter (4-metoxifenil)-2,3-dihidroxipropílico (Ejemplo 3b). Rendimiento: 46%;
^{1}H-RMN (200MHz, CDCl_{3}/TMS): d = 3,3,31 (d, 2H, CH_{2}-OMMtr); 3,77 (s, 3H, O-CH_{3}); 3,79 (s, 3H, O-CH_{3}); 3,96-4,20 (m, 3H, O-CH_{2}-CH); 6,76-6,90 (m, 4H, Ar-H); 7,15-7,55 (m, 14H, Ar-H);
MS (FAB+LiCl): m/e = 477,2 (M+Li^{+}, 20%); 470,2 (M+, 10%)
3d) Éter (4-metoxifenil)-3-O-(4-metoxitrifenilmetil)-2-O-succinilpropílico
La síntesis se realizó análogamente al Ejemplo 1e a partir de éter (4-metoxifenil)-3-O-(4-metoxitrifenilmetil)-2-hidroxipropílico (Ejemplo 3c).
Rendimiento: 98%;
^{1}H-RMN (200MHz, CDCl_{3}/TMS): d = 2,63 (s, 4H, CO-(CH_{2})_{2}-CO); 3,31-3,40 (m, 2H, CH_{2}-OMMtr); 3,76 (s, 3H, O-CH_{3}); 3,79 (s, 3H, O-CH_{3}); 4,04-4,10 (m, 2H, CH_{2}-O-MOP); 5,35 (dt, 1H, CH-Osucc); 6,79 (s, 4H, Ar-H); 7,15-7,47 (m, 14H, Ar-H);
MS (FAB+LiCl): m/e = 583,3 (M+2Li^{+}-H^{+}, 40%); 577,3 (M+Li^{+}, 100%);
4) Síntesis de éter (6-O-(4-metoxitrifenilmetil)-5-O-succinil)hexílico de ácido levulínico 4a) Éster 4-(2,2-dimetil-dioxolano-4-il)butílico del ácido levulínico
Se coevaporaron 0,81 g (5 mmol) de 2,2-dimetil-4-hidroxibutil-1,3-dioxolano a partir de 1 a dos veces con acetonitrilo absoluto, luego se disolvieron junto con 1,5 g (7 mmol) de anhídrido de ácido levulínico y 0,86 g (7 mmol) de dimetilaminopiridina (DMAP) en piridina absoluta y se agitó durante 15 h a temperatura ambiente. El disolvente se evaporó al vacío y se coevaporó otras tres veces con tolueno. El residuo se tomó en AE, la fase orgánica se lavó con disolución saturada de NaCl y con agua, luego se secó sobre sulfato de sodio. El disolvente se evaporó, el residuo se cromatografió con AE sobre gel de sílice.
Rendimiento: 0,65 g (48%);
^{1}H-RMN (200MHz, CDCl_{3}/TMS): d = 1,37 (s, 3H, CH_{3}); 1,41 (s, 3H, CH_{3}); 1,42-1,75 (m, 6H, -(CH_{2})_{3}-); 2,19 (s, 3H, CH_{3}-CO); 2,49-2,82 (m, 4H, COCH_{2}CH_{2}CO); 3,45-3,58 (m, 1H, C^{4}'-H); 3,97-4,16 (m, 4H, -C^{5}'H_{2}- & CH_{2}-OCO); MS (EI): m/e = 273 (M+H+, 45%); 257 (35%)
4b) Éster 5,6-dihidroxihexílico del ácido levulínico
La síntesis se realizó análogamente al Ejemplo 1c a partir de éster (4-(2,2-dimetil-dioxolano-4-il)butílico del ácido levulínico (Ejemplo 4a).
Rendimiento: 90%;
^{1}H-RMN (200MHz, CDCl_{3}/TMS): d = 1,37-1,75 (m, 6H, -(CH_{2})_{3}-); 2,20 (s, 3H, CH_{3}-CO); 2,47-2,82 (m, 4H, COCH_{2}CH_{2}CO); 3,39-3,52 (dd, 1H, CH-OH); 3,60-3,79 (m, 2H, CH_{2}-OH); 4,11 (t, 2H, CH_{2}-OLev); MS (EI): m/e = 233 (M+H+, 20%); 215 (15%)
4c) Éster 6-O-(4-metoxitrifenilmetil)-5-hidroxihexílico del ácido levulínico
La síntesis se realizó análogamente al Ejemplo 1d a partir de éster 5,6-dihidroxihexílico del ácido levulínico (Ejemplo 4b). Rendimiento: 40%;
^{1}H-RMN (200MHz, CDCl_{3}/TMS): d = 1,22-1,70 (m, 6H, -(CH_{2})_{3}-); 2,19 (s, 3H, CH_{3}-CO); 2,48-2,79 (m, 4H, COCH_{2}CH_{2}CO); 2,97-3,21 (m, 2H, CH_{2}-OMMtr); 3,79 (s, 3H, OCH_{3}); 3,68-3,82 (m, 1H, CH-OH); 4,03 (t, 2H, CH_{2}-OLev); 6,80-7,48 (m, Ar-H, 14H)
MS (ES+ + LiCl): m/e = 511 (M+Li^{+}, 100%)
4d) Éster (6-O-(4-metoxitrifenilmetil)-5-O-succinil)hexílico del ácido levulínico
La síntesis se realizó análogamente al Ejemplo 1e a partir del 1-(6-O-(4-metoxitrifenilmetil)-5-hidroxi)hexílico del ácido levulínico (Ejemplo 4c).
Rendimiento: 80%;
^{1}H-RMN (200MHz, CDCl_{3}/TMS): d = 1,20-1,72 (m, 6H, -(CH_{2})_{3}-); 2,19 (s, 3H, CH_{3}-CO); 2,49-2,80 (m, 8H, 2 x COCH_{2}CH_{2}CO); 3,15 (d, 2H, CH_{2}-OMMtr); 3,79 (s, 3H, OCH_{3}); 4,03 (t, 2H, CH_{2}-OLev); 5,15 (m, 1H, CH-OSucc); 6,79-7,50 (m, Ar-H, 14H)
MS (ES+ + LiCl): m/e = 627 (M+Na+, 20%); 611 (M+Li^{+}, 50%)
5) Preparación de un portador de la fórmula VIII-1 por carga de aminopropil-CPG con éter (4-metoxifenil)-6-O-(4-metoxitrifenilmetil)-5-O-succinilhexílico
Se coevaporaron dos veces 123 mg (20 mmol) de éter (4-metoxifenil)-1-(6-O-(4-metoxitrifenilmetil)-5-O-succinil)hexílico (del Ejemplo 1) con acetonitrilo absoluto y luego se disolvieron junto con 7,1 mg (22 mmol) de tetrafluoroborato de O-(benzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronio (TBTU) y 3,2 mg (28 mmol) de N-etilmorfolina en 0,75 ml de dimetilformamida absoluta (DMF). A esta disolución se añadieron 100 mg de aminopropil-CPG (0,1 mmol/g, 550 A) de la empresa Fluka y la suspensión se agitó durante 7 h a temperatura ambiente. El portador derivado se filtró por succión, se lavó con metanol, DMF, THF, acetonitrilo, nuevamente con metanol y con cloruro de metileno y se secó durante 1 h a 40ºC al vacío. La carga del portador con un componente con contenido de monometoxitritilo era de 12,2 mmol/g. El recubrimiento de los grupos reactivos se realiza en el sintetizador de ADN con reactivos de recubrimiento (acetanhídrido/2,6-lutidina/1-metilimidazol; 0,25 M en THF), luego se enjuaga con acetonitrilo.
6) Preparación de un portador de la fórmula VIII-2 por carga de aminopropil-CPG con éter (4-metoxifenil)-(2,2-di-metil-dioxolano-4-il)metílico
Preparación análoga al Ejemplo 5 usando éter (4-metoxifenil)-(2,2-dimetil-dioxolano-4-il)metílico (del Ejemplo 3). La carga del portador con un componente con contenido de monometoxitritilo era de 36,7 mmol/g.
7) Preparación de un portador de la fórmula VIII-3 por carga de aminopropil-CPG con éster (6-O-(4-me-toxitrifenilmetil)-5-O-succinil)hexílico del ácido levulínico
Preparación análoga al Ejemplo 5 usando éster (6-O-(4-metoxitrifenilmetil)-5-O-succinil)hexílico del ácido levulínico (del Ejemplo 4). La carga del portador con un componente con contenido de monometoxitritilo era de 14,3 mmol/g.
8) Preparación de un portador de la fórmula VIII-4 por carga de ®Tentagel con éter (4-metoxifenil)-6-O-(4-metoxi-trifenilmetil)-5-O-succinilhexílico
Se coevaporaron dos veces 306 mg (0,5 mmol) de éter (4-metoxifenil)-6-O-(4-metoxitrifenilmetil)-5-O-succinilhexílico (del Ejemplo 1) con acetonitrilo absoluto y se disolvieron en una mezcla de 1,25 ml de THF absoluto y 65 ml de piridina absoluta. Luego se vertió una disolución de 70 mg (0,5 mmol) de 4-nitrofenol y 115 mg (0,55 mmol) de diciclohexil-carbodiimida (DCC) en 0,35 ml de THF absoluto y se agitó durante 2 h a temperatura ambiente. Una vez terminada la reacción, se centrifugó de la diciclohexilurea producida. El sedimento se suspendió nuevamente en 1 ml de éter y se centrifugó. Se suspendieron 200 mg de resina ®Tentagel (copolímero de PS/POE con 175 mmol/g de función amino) en una mezcla de 0,7 ml de DMF abs. y 0,14 ml de TEA y se mezclaron con la disolución antes obtenida del éster succinat-4-nitrofenílico y se agitó durante 17 h a temperatura ambiente. Se filtró por succión y se elaboró como se describió en el Ejemplo 5. La carga del portador con un componente con contenido de monometoxitritilo era de 28,7 mmol/g.
Síntesis de oligonucleótidos: Los oligonucleótidos se purifican primero por precipitación de butanol (Sawadogo, Van Dyke, Nucl. Acids Res. 19 (1991) 674). Luego se obtiene la sal sódica por precipitación de una disolución 0,5 M de NaCl con 2,5 partes en vol. de etanol.
El análisis de los oligonucleótidos se realiza por
a)
Electroforesis analítica de gel en 20% de acrilamida, 8 M de urea, 454 M de tampón de tris-borato, pH 7,0 y/o
b)
Análisis por HPLC: Waters GenPak FAX, gradiente CH_{3}CN (400 ml), H_{2}O (1,6 l), NaH_{2}PO_{4} (3,1 g), NaCl (11,7 g), pH 6,8 (NaCl 0,1 M) después CH_{3}CN (400 ml), H_{2}O (1,6 l), NaH_{2}PO_{4} (3,1 g), NaCl (175,3 g), pH 6,8 (NaCl 1,5 M) y/o
c)
Electroforesis capilar de gel Beckmann Kapillare eCAP^{TM}, columna de gel U100P, 65 cm de largo, 100 mm I.D., ventana 15 cm desde un extremo, tampón 140 \muM de Tris, 360 mM de ácido bórico, 7 M de urea y/o
d)
Electronebulización - espectroscopia de masa
9) Preparación de oligonucleótidos de la fórmula I: TpTpTpTpTpTpTpTp-CH_{2}-CH(OH)(CH_{2})_{4}-(O-metoxifenilo)
El monómero es, en cada caso, un (3-D-desoxirribonucleósido; R^{1}=R^{2}=H; Z=O-(4-metoxifenilo); n=8,
m=m'=n'=b=0; A=V=W=U=X=Y=T=oxi; a=3;
a)
0,2 \mumol del portador VIII-4 del Ejemplo 8 se tratan sucesivamente con los siguientes reactivos:
1.
acetonitrilo abs.
2.
3% de ácido tricloroacético en diclorometano
3
acetonitrilo abs.
4.
4 \mumol de 3-cianoetiléster-diisopropilamida del ácido 5'-O-dimetoxitritiltimidin-3'-fosforoso y 25 \mumol de tetrazol en 0,15 ml de acetonitrilo abs.
5.
acetonitrilo
6.
20% de acetanhídrido en THF con 40% de lutidina y 10% de dimetilaminopiridina
7.
acetonitrilo
8.
yodo (0,1 M de J_{2} en THF/agua/piridina; 70:20:5=v:v:v)
Las etapas 1 a 8, a continuación denominadas un ciclo de reacción, se repiten 7 veces para estructurar el derivado de octatimidilato.
b)
Una vez finalizada la síntesis, se produce la separación del grupo dimetoxitritilo tal como se describió en las etapas 1 a 3.
c)
Por tratamiento de 1,5 horas con amoníaco, el oligonucleótido se separa del portador y al mismo tiempo se eliminan los grupos de \beta-cianoetilo. Dado que el oligonucleótido no contiene grupos aminoprotectores, no es necesaria un posterior tratamiento con amoníaco.
10) Preparación de oligonucleótidos de la fórmula I: TpTpTpTpTpTpTpTp-CH_{2}-CH(OH)(CH_{2})_{4}-(OH)
El monómero es, en cada caso, un (3-D-desoxirribonucleósido; R^{1}=R^{2}=H; Z=OH; n=8, m=m'=n'=b=0;
A=V=W=U=X=Y=T=oxi; a=3;
a)
La preparación se realiza de forma análoga al Ejemplo 9a;
b)
Una vez finalizada la síntesis, se produce la separación del grupo dimetoxitritilo (grupo DMTr) tal como se describió en las etapas 1 a 3. Luego se separa el grupo 4-metoxifenilo (grupo MOP) por tratamiento con un Ce^{IV}(NH_{4})_{2}(NO_{3})_{6} 0,1 M en acetonitrilo/H_{2}O 4:1 a temperatura ambiente durante 5 min.
c)
Por tratamiento de 1,5 horas con amoníaco, el oligonucleótido se separa del portador y al mismo tiempo se eliminan los grupos de \beta-cianoetilo.
11) Preparación de oligonucleótidos de la fórmula I: TpTpTpTpTpTpTpTp-CH_{2}-CH(OH)(CH_{2})_{4}-(O-(CH_{2})_{4}-pireno) partiendo del portador VIII-4
El monómero es, en cada caso, un (3-D-desoxirribonucleósido; R^{1}=R^{2}=H; Z=O-(-(CH_{2})_{4}-pireno); n=8,
m=m'=n'=b=0; A=V=W=U=X=Y=T=oxi; a=3;
a)
La preparación se realiza de forma análoga al Ejemplo 9a;
b)
Una vez finalizada la síntesis, se produce la separación del grupo dimetoxitritilo tal como se describió en las etapas 1 a 3. A continuación, se recubre el grupo 5'-hidroxi libre obtenido tal como se describió en las etapas 6 y 7. Luego se separa el grupo 4-metoxifenilo por tratamiento con un Ce^{IV}(NH_{4})_{2}(NO_{3})_{6} 0,1 M en acetonitrilo/H_{2}O 4:1 a temperatura ambiente durante 5 min.
c)
La introducción del [4-(1-pirenil)butil]fosfodiéster en el extremo 5' se realiza tal como se describe en J. S. Mann et al. Bioconj. Chem. 3 (1992) 554 por tratamiento con 4 \mumol de 4-(1-pirenil)butil-2-cianoetil-N,N-diisopropilfosforamidita y 25 \mumol de metiltio-1H-tetrazol en 0,15 ml de acetonitrilo abs. y ulterior lavado con acetonitrilo.
d)
Oxidación con J_{2} 0,1 M en THF/agua/piridina; 70:20:5=v:v:v.
c)
Por tratamiento de 1,5 horas con amoníaco, el oligonucleótido se separa del portador y al mismo tiempo se eliminan los grupos de 3-cianoetilo.
12) Preparación de oligonucleótidos de la fórmula I: TpTpTpTpTpTpTpTp-CH_{2}-CH(OH)(CH_{2})_{4}(O-(CH_{2})_{4}-pireno) partiendo del portador VIII-1
El monómero es, en cada caso, un (3-D-desoxirribonucleósido; R^{1}=R^{2}=H; Z=O-(-(CH_{2})_{4}-pireno); n=8,
m=m'=n'=b=0; A=V=W=U=X=Y=T=oxi; a=3;
La preparación se realiza análogamente al Ejemplo 9a, pero usando el portador VIII-1.
13) Preparación de oligonucleótidos de la fórmula I: TpTpTpTpTpTpTpTp-CH_{2}-CH(OH)(CH_{2})_{4}-(O-(CH_{2})_{11}CH_{3}) partiendo del portador VIII-4
El monómero es, en cada caso, un (3-D-desoxirribonucleósido; R^{1}=R^{2}=H; Z=O-(CH_{2})_{11}CH_{3}; n=8, m=m'=n'=b=0; A=V=W=U=X=Y=T=oxi; a=3;
a)
La preparación se realiza de forma análoga al Ejemplo 9a;
b)
Separación del grupo DMtr, recubrimiento y separación del grupo MOP tal como se describió en el Ejemplo 11b;
c)
Tratamiento con 4 \mumol de dodecil-2-cianoetil-N,N-diisopropilfosforamidita y 25 \mumol de metiltio-1H-tetrazol en 0,15 ml de acetonitrilo abs. y posterior lavado con acetonitrilo.
d)
Oxidación con J_{2} 0,1 M en THF/agua/piridina; 70:20:5=v:v:v.
c)
Por tratamiento de 1,5 horas con amoníaco, el oligonucleótido se separa del portador y al mismo tiempo se eliminan los grupos de \beta-cianoetilo.
14) Preparación de oligonucleótidos de la fórmula I: TpTpTpTpTpTpTpTp-CH_{2}-CH(OH)(CH_{2})_{4}-(O-(CH_{2})_{13}CH_{3}) partiendo del portador VIII-1
El monómero es en cada caso un \beta-D-desoxirribonucleósido; R^{1}=R^{2}=H; Z=O-(CH_{2})_{13}CH_{3}; n=8, m=m'=n'=b=0; A=V=W=U=X=Y=T=oxi; a=3;
a)
La preparación se realiza de forma análoga al Ejemplo 9a;
b)
Separación del grupo DMtr, recubrimiento y separación del grupo MOP tal como se describió en el Ejemplo 11b;
c)
Tratamiento con 4 \mumol de tetradecil-2-cianoetil-N,N-diisopropilfosforamidita y 25 \mumol de metiltio-1H-tetrazol en 0,15 ml de acetonitrilo abs. y posterior lavado con acetonitrilo.
d)
Oxidación con J_{2} 0,1 M en THF/agua/piridina; 70:20:5=v:v:v.
c)
Por tratamiento de 1,5 horas con amoníaco, el oligonucleótido se separa del portador y al mismo tiempo se eliminan los grupos de \beta-cianoetilo.
15) Preparación de oligonucleótidos de la fórmula I: TpTpTpTpTpTpTpTp-CH_{2}-CH(OH)(CH_{2})-(O-3'-T-ODMtr) partiendo del portador VIII-2
El monómero es en cada caso un \beta-D-desoxirribonucleósido; R^{1}=R^{2}=H; Z=O-3'-T-ODMtr; n=8, m=m'=n'=b=0; A=V=W=U=X=Y=T=oxi; a=0;
a)
La preparación se realiza de forma análoga al Ejemplo 9a;
\newpage
b)
Separación del grupo DMtr, recubrimiento y separación del grupo MOP tal como se describió en el Ejemplo 11b;
c)
Tratamiento con 4 \mumol de 3-cianoetiléster-diisopropilamida del ácido 5'-O-dimetoxitritiltimidin-3'-fosforoso y 25 \mumol de metiltio-1H-tetrazol en 0,15 ml de acetonitrilo abs. y posterior lavado con acetonitrilo.
d)
Oxidación con J_{2} 0,1 M en THF/agua/piridina; 70:20:5=v:v:v.
e)
Por tratamiento de 1,5 horas con amoníaco, el oligonucleótido se separa del portador y al mismo tiempo se eliminan los grupos de \beta-cianoetilo.
16) Preparación de oligonucleótidos de la fórmula I: TpTpTpTpTpTpTpTp-(CH_{2})_{4}-CH(OH)-CH_{2}-(O-(CH_{2})_{13}CH_{3}) partiendo del portador VIII-4
El monómero es en cada caso un \beta-D-desoxirribonucleósido; R^{1}=R^{2}=H; Z=O-(4-metoxifenilo); n=8,
m=m'=n'=a=0; A=V=W=U=X=Y=T=oxi; b=3;
a)
0,2 \mumol del portador VIII-4 del Ejemplo 8 se tratan sucesivamente con los siguientes reactivos:
1.
acetonitrilo abs.
2.
3% de ácido tricloroacético en diclorometano
3
acetonitrilo abs.
4.
4 \mumol de tetradecil-2-cianoetil-N,N-diisopropilfosforamidita y 25 \mumol de metiltio-1H-tetrazol en 0,15 ml de acetonitrilo abs.
5.
acetonitrilo
6.
Ce^{IV}(NH_{4})_{2}(NO_{3})_{6} 0,1 M en acetonitrilo/H_{2}O 4:1 a temperatura ambiente durante 5 min
7.
acetonitrilo
8.
4 \mumol de 3-cianoetiléster-diisopropilamida del ácido 5'-O-dimetoxitritiltimidin-3'-fosforoso y 25 \mumol de tetrazol en 0,15 ml de acetonitrilo abs.
9.
acetonitrilo
10.
20% de acetanhídrido en THF con 40% de lutidina y 10% de dimetilaminopiridina
11.
acetonitrilo
12.
yodo (1,3 g en THF/agua/piridina; 70:20:5=v:v:v)
13.
acetonitrilo
14.
3% de ácido tricloroacético en diclorometano
Las etapas 7 a 14, a continuación denominadas un ciclo de reacción, se repiten 7 veces para estructurar el derivado de octatimidilato.
c)
Por tratamiento de 12 horas a 60ºC con amoníaco, el oligonucleótido se separa del portador y al mismo tiempo se eliminan los grupos de \beta-cianoetilo.
17) Preparación de oligonucleótidos de la fórmula I: GpGpApCpCpGpApApGpGp-(CH_{2})_{4}-CH(OH)-CH_{2}-(O-(CH_{2})_{13}CH_{3}) partiendo del portador VIII-4
El monómero es en cada caso un \beta-D-desoxirribonucleósido; R^{1}=R^{2}=H; Z=O-(4-metoxifenilo); n=10,
m=m'=n'=a=0; A=V=W=U=X=Y=T=oxi; b=3;
La síntesis se realiza de modo análogo al Ejemplo 16, pero en la etapa 8 se aplica la correspondiente (3-cianoetiléster-diisopropilamida del ácido 3'-fosforoso de la correspondiente base.
\newpage
18) Preparación de oligonucleótidos de la fórmula I: TpTpTpTpTpTpTpTp-(CH_{2})_{4}-CH(OH)-CH_{2}-(O-(CH_{2})_{13}CH_{3}) partiendo del portador VIII-3
El monómero es en cada caso un \beta-D-desoxirribonucleósido; R^{1}=R^{2}=H; Z=O-(4-metoxifenilo); n=8,
m=m'=n'=a=0; A=V=W=U=X=Y=T=oxi; b=3;
La síntesis se realiza de modo análogo al Ejemplo 16, pero la etapa 6 se reemplaza por el tratamiento con 0,5 M de hidrato de hidrazina en ácido acético/piridina 2:3 durante 30 min.
19) Preparación de oligonucleótidos de la fórmula I: TpTpTpTpTpTpTpTp-CH_{2}-CH(OH)(CH_{2})_{4}-(O-acridina) partiendo del portador VIII-4
El monómero es, en cada caso, un (3-D-desoxirribonucleósido; R^{1}=R^{2}=H; Z=acridina, en donde acridina es 6-(2-metoxi-6-cloro-9-acridin)amino)-2-hidroximetilhexoxi; n=8, m=m'=n'=b=0; A=V=W=U=X=Y=T=oxi; a=3;
a)
La preparación se realiza de forma análoga al Ejemplo 9a;
b)
Separación del grupo DMtr, recubrimiento y separación del grupo MOP tal como se describió en el Ejemplo 11b;
c)
Tratamiento con 4 \mumol de 6-(2-metoxi-6-cloro-9-acridin)amino)-2-dimetoxitritiloximetil-1-(2-cianoetil-N,N-diisopropilfosfino)hexano (empresa Glen Research) y 25 \mumol de metiltio-1H-tetrazol en 0,15 ml de acetonitrilo abs. y posterior lavado con acetonitrilo.
d)
Oxidación con 0,1 M de J_{2} en THF/agua/piridina; 70:20:5=v:v:v y lavado con acetonitrilo
e)
Separación del grupo DMtr
f)
Por tratamiento de 1,5 horas con amoníaco, el oligonucleótido se separa del portador y al mismo tiempo se eliminan los grupos de \beta-cianoetilo.
20) Preparación de oligonucleótidos de la fórmula I: TpTpTpTpTpTpTpTp-CH_{2}-CH(OH)(CH_{2})_{4}-(O-biotina) partiendo del portador VIII-4
El monómero es, en cada caso, un (3-D-desoxirribonucleósido; R^{1}=R^{2}=H; Z=biotina, en donde biotina es 6-bio-tinamido-5-hidroximetil-hexoxi;
n=8, m=m'=n'=b=0; A=V=W=U=X=Y=T=oxi; a=3;
a)
La preparación se realiza de forma análoga al Ejemplo 9a;
b)
Separación del grupo DMtr, recubrimiento y separación del grupo MOP tal como se describió en el Ejemplo 11b;
c)
Tratamiento con 4 \mumol de 6-biotinamido-5-dimetoxitritiloximetil-hexan-(2-cianoetil-N,N-diisopropilfosforamidita) (empresa Glen Research) y 25 mol de metiltio-1H-tetrazol en 0,15 ml de acetonitrilo abs. y posterior lavado con acetonitrilo.
d)
Oxidación con J_{2} 0,1 M en THF/agua/piridina; 70:20:5=v:v:v y lavado con acetonitrilo
e)
Separación del grupo DMtr
f)
Por tratamiento de 1,5 horas con amoníaco, el oligonucleótido se separa del portador y al mismo tiempo se eliminan los grupos de \beta-cianoetilo.
21) Preparación de oligonucleótidos de la fórmula I: TpTpTpTpTpTpTpTp-CH_{2}-CH(OH)(CH_{2})_{4}-(O-TEGbiotina) partiendo del portador VIII-4
El monómero es, en cada caso, un (3-D-desoxirribonucleósido; R^{1}=R^{2}=H; Z=TEGbiotina, en donde TEGbiotina es 16-biotinamido-4,7,10,13-tetraoxi-1-hidroxi-hexadecan-2-oxi; n=8, m=m'=n'=b=0; A=V=W=U=X=Y=T=oxi;
a=3;
a)
La preparación se realiza de forma análoga al Ejemplo 9a;
b)
Separación del grupo DMtr, recubrimiento y separación del grupo MOP tal como se describió en el Ejemplo 11b;
c)
Tratamiento con 4 \mumol de 16-biotinamido-4,7,10,13-tetraoxi-1-dimetoxitritiloxi-2-hexadecan-(2-cianoetil-N,N-diisopropilfosforamidita) (empresa Glen Research) y 25 \mumol de metiltio-1H-tetrazol en 0,15 ml de acetonitrilo abs. y posterior lavado con acetonitrilo.
d)
Oxidación con J_{2} 0,1 M en THF/agua/piridina; 70:20:5=v:v:v y lavado con acetonitrilo
e)
Separación del grupo DMtr
f)
Por tratamiento de 1,5 horas con amoníaco, el oligonucleótido se separa del portador y al mismo tiempo se eliminan los grupos de \beta-cianoetilo.
22) Preparación de oligonucleótidos de la fórmula I: TpTpTpTpTpTpTpTp-CH_{2}-CH(OH)(CH_{2})_{4}-(O-colesterol) partiendo del portador VIII-4
El monómero es en cada caso un \beta-D-desoxirribonucleósido; R^{1}=R^{2}=H; Z=colesterol, en donde colesterol es 16-N-colesteriaminol-4,7,10,13-tetraoxi-1-hidroxi-hexadecan-2-oxi; n=8, m=m'=n'=b=0; A=V=W=U=X=Y=T=oxi; a=3;
a)
La preparación se realiza de forma análoga al Ejemplo 9a;
b)
Separación del grupo DMtr, recubrimiento y separación del grupo MOP tal como se describió en el Ejemplo 11b;
c)
Tratamiento con 4 \mumol de 16-N-colesterilamino-4,7,10,13-tetraoxi-1-dimetoxitritiloxi-2-hexadecan-(2-cianoetil-N,N-diisopropilfosforamidita) (empresa Glen Research) y 25 \mumol de metiltio-1H-tetrazol en 0,15 ml de acetonitrilo abs. y posterior lavado con acetonitrilo.
d)
Oxidación con J_{2} 0,1 M en THF/agua/piridina; 70:20:5=v:v:v y lavado con acetonitrilo
e)
Separación del grupo DMtr
f)
Por tratamiento de 1,5 horas con amoníaco, el oligonucleótido se separa del portador y al mismo tiempo se eliminan los grupos de \beta-cianoetilo.
23) Preparación de oligonucleótidos de la fórmula I: TpTpTpTpTpTpTpTp-CH_{2}-CH(OH)(CH_{2})_{4}-(O-psoraleno) partiendo del portador VIII-4
El monómero es, en cada caso, un (3-D-desoxirribonucleósido; R^{1}=R^{2}=H; Z=psoraleno, en donde psoraleno es 2-[4'-(hidroximetil)-4,5',8-trimetilpsoralen]-etilo-; n=8, m=m'=n'=b=0; A=V=W=U=X=Y=T=oxi; a=3;
a)
La preparación se realiza de forma análoga al Ejemplo 9a;
b)
Separación del grupo DMtr, recubrimiento y separación del grupo MOP tal como se describió en el Ejemplo 11b;
c)
Tratamiento con 4 \mumol de 2-[4'-(hidroximetil)-4,5',8-trimetilpsoralen]-etil-2-cianoetil-N,N-diisopropilfosforamidita (empresa Glen Research) y 25 \mumol de metiltio-1H-tetrazol en 0,15 ml de acetonitrilo abs. y posterior lavado con acetonitrilo.
d)
Oxidación con J_{2} 0,1 M en THF/agua/piridina; 70:20:5=v:v:v y lavado con acetonitrilo
e)
Por tratamiento de 1,5 horas con amoníaco, el oligonucleótido se separa del portador y al mismo tiempo se eliminan los grupos de \beta-cianoetilo.
24) Preparación de oligonucleótidos de la fórmula I: TpTpTpTpTpTpTpTp-CH_{2}-CH(OH)(CH_{2})-(O-(CH_{2})_{13}CH_{3}) partiendo del portador VIII-2
El monómero es en cada caso un \beta-D-desoxirribonucleósido; R^{1}=R^{2}=H; Z=O-(CH_{2})_{13}CH_{3}; n=8, m=m'=n'=b=0; A=V=W=U=X=Y=T=oxi; a=0;
a)
0,2 \mumol del portador VIII-2 del Ejemplo 6 se tratan sucesivamente con:
1.
acetonitrilo abs.
2.
3% de ácido tricloroacético en diclorometano
3.
acetonitrilo abs.
4.
4 \mumol de 1-tetradecil-[(2-cianoetil)-N,N-diisopropilfosforamidita] y 25 \mumol de metiltio-1H-tetrazol en 0,15 ml de acetonitrilo abs.
5.
acetonitrilo
6.
20% de acetanhídrido en THF con 40% de lutidina y 10% de dimetilaminopiridina
7.
acetonitrilo
8.
yodo (0,1 M de J_{2} en THF/agua/piridina; 70:20:5=v:v:v)
9.
Ce^{IV}(NH_{4})_{2}(NO_{3})_{6} 0,1 M en acetonitrilo/H_{2}O 4:1 (ver también Ejemplo 11b).
10.
acetonitrilo
b)
y por último se tratan con
1.
4 \mumol de \beta-cianoetiléster-diisopropilamida del ácido 5'-O-dimetoxitritiltimidin-3'-fosforoso y 25 \mumol de tetrazol en 0,15 ml de acetonitrilo abs.
2.
acetonitrilo
3.
20% de acetanhídrido en THF con 40% de lutidina y 10% de dimetilaminopiridina
4.
acetonitrilo
5.
yodo (0,1 M de J_{2} en THF/agua/piridina; 70:20:5=v:v:v)
6.
acetonitrilo abs.
7.
3% de ácido tricloroacético en diclorometano
8.
acetonitrilo abs.
Las etapas 1 a 8, a continuación denominadas un ciclo de reacción, se repiten 7 veces para estructurar el derivado de octatimidilato.
c)
Por tratamiento de 1,5 horas con amoníaco, el oligonucleótido se separa del portador y al mismo tiempo se eliminan los grupos de \beta-cianoetilo. Dado que el oligonucleótido no contiene grupos aminoprotectores, no es necesaria un posterior tratamiento con amoníaco.
25) Preparación de oligonucleótidos de la fórmula I: CpApCpGpTpTpGpApGpGpGpGpCpApTp-CH_{2}-CH(OH)(CH_{2})-(O-(CH_{2})_{13}CH_{3}) partiendo del portador VIII-2
El monómero es, en cada caso, un (3-D-desoxirribonucleósido; R^{1}=R^{2}=H; Z=O-(CH_{2})_{13}CH_{3};n=15, m=m'=n'=b=0; A=V=W=U=X=Y=T=oxi; a=0;
Síntesis análoga al Ejemplo 24, pero usando los nucleósidos de 3'-(2-cianoetil)-N,N-diisopropilfosforamidita protegidos con 5'-O-dimetoxitritiltimidina estándar en la etapa b1. Por tratamiento de 1,5 horas con amoníaco, el oligonucleótido se separa del portador, la desprotección se produjo por tratamiento de 16 horas con amoníaco a 60ºC.
26) Preparación de oligonucleótidos de la fórmula I: CpApCpGpTpTpGpApGpGpGpGpCpApTp-CH_{2}-CH(OH)(CH_{2})-(O-vitamina E) partiendo del portador VIII-2
El monómero es en cada caso un \beta-D-desoxirribonucleósido; R^{1}=R^{2}=H; Z=O-vitamina E; n=15, m=m'=n'=b=0; A=V=W=U=X=Y=T=oxi; a=0;
Síntesis análogamente al Ejemplo 24, pero usando vitamina E-(2-cianoetil)-N,N-diisopropilfosforamidita en la etapa a4.
27) Síntesis de éster (3-O-(4-metoxitrifenilmetil)-2-O-succinil)propílico del ácido levulínico 27a) Éster (2,2-dimetil-dioxolano-4-il)metílico del ácido levulínico
La síntesis se realizó análogamente al Ejemplo 4b a partir de 2,2-dimetil-4-hidroximetil-1,3-dioxolano. Rendimiento: 71%.
^{1}H-RMN (200MHz, CDCl_{3}/TMS): \delta = 1,38 (s, 3H, CH_{3}); 1,42 (s, 3H, CH_{3}); 2,19 (s, 3H, CH_{3}-CO); 2,51-2,82 (m, 4H, COCH_{2}CH_{2}CO); 3,75 (dd, 1H, C^{4}'-H); 4.01-4.39 (m, 4H, -C^{5}'H_{2}- & CH_{2}-OCO);
27b) Éster 1-(2,3-dihidroxi)propílico del ácido levulínico
Síntesis análoga a 1c a partir de éster (2,2-dimetil-dioxolano-4-il)metílico del ácido levulínico (27a); Rendimiento: 90%;
^{1}H-RMN (200MHz, CDCl_{3}/TMS): \delta = 2,20 (s, 3H, CH_{3}-CO); 2,60, 2,80 (c/u t, 4H, COCH_{2}CH_{2}CO); 3.54-3.80 (m, 2H, CH_{2}-OH); 3.80 (t,1H, OH); 3.95 (m, 1H, CH-OH); 4,21 (d, 2H, CH_{2}-OLev);
27c) Éster 3-O-(4-metoxitrifenilmetil)-2-hidroxipropílico del ácido levulínico
Síntesis análoga a 1d a partir del éster (2,3-dihidroxi)propílico del ácido levulínico (24b); Rendimiento: 20%;
27d) Éster 3-O-(4-metoxitrifenilmetil)2-O-succinilpropílico del ácido levulínico
Síntesis análoga a 1e a partir del éster 3-O-(4-metoxitrifenilmetil)-2-hidroxipropílico del ácido levulínico (27c); Rendimiento: 51%;
MS (FAB/LiCl): m/e = 599.3 (M+Li^{+});
28) Preparación de un portador de la fórmula VIII-5 por carga de aminopropil-CPG con éster 1-(3-O-(4-metoxitrifenilmetil)-2-O-succinil)propílico del ácido levulínico
Preparación análoga al Ejemplo 5 usando éster 1-(3-O-(4-metoxitrifenilmetil)-2-O-succinil)propílico del ácido levulínico (del Ejemplo 27). La carga del portador con un componente con contenido de monometoxitritilo era de 24,7 mmol/g.

Claims (6)

  1. \global\parskip0.990000\baselineskip
    1. Compuestos de la fórmula I
    34
    así como sus sales fisiológicamente tolerables, en donde
    a
    es un número de cero a 20;
    b
    es un número de cero a 20;
    R^{1}
    es hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{18}, alquenilo C_{2}-C_{18}, alquenilo C_{3}-C_{18}, alquilcarbonilo C_{1}-C_{18}, alquenilcarbonilo C_{2}-C_{19}, alquinilcarbonilo C_{3}-C_{19}, arilo C_{6}-C_{20}, aril C_{6}-C_{14}-alquilo C_{1}-C_{8}, o un radical de la fórmula III
    (III);Z --- 
    \melm{\delm{\dpara}{W}}{P}{\uelm{\para}{}}
    --- Z'
    R^{2}
    es hidrógeno, hidroxi, alcoxi C_{1}-C_{18}, halógeno, azido o NH_{2};
    D
    es hidroxi, O-PO_{3}^{2-};
    B
    es una base usual en la química de los nucleótidos, por ejemplo, para bases naturales y bases no naturales;
    n
    es un número entero de 7 a 25;
    n'
    es un número entero de cero a 50;
    m'
    es en la fórmula I es un número entero de cero a 5;
    \newpage
    A
    es oxi, tioxi o metileno;
    W
    es oxo, tioxo o selenoxo;
    V
    es oxi o sulfandiílo;
    T
    es oxi, sulfandiílo o imino;
    Y
    es oxi, sulfandiílo, imino o metileno;
    X
    es hidroxi o mercapto;
    U
    es hidroxi, mercapto, BH_{3}, SeH, alcoxi C_{1}-C_{18}, alquilo C_{1}-C_{18}, arilo C_{6}-C_{20}, aril C_{6}-C_{14}-alquilo C_{1}-C_{8}, NHR^{3}, NR^{3}R^{4} o un radical de la fórmula IV
    (IV)(OCH_{2}CH_{2})_{p}O(CH_{2})_{q}CH_{2}R^{5}
    en donde
    R^{3}
    es alquilo C_{1}-C_{18}, arilo C_{6}-C_{20}, aril C_{6}-C_{14}-alquilo C_{1}-C_{8}, -(CH_{2})_{c}-[NH(CH_{2})_{c}]_{d}-NR^{6}R^{6}, en donde c es un número entero de 2 a 6 y d es un número entero de cero a 6, y R^{6} es, de modo independiente entre sí, hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{6} o alcoxi C_{1}-C_{4}-alquilo C_{1}-C_{6};
    R^{4}
    es alquilo C_{1}-C_{18}, arilo C_{6}-C_{20} o aril C_{6}-C_{10}-alquilo C_{1}-C_{8} o en el caso de NR^{3}R^{4} junto con R^{3} y el átomo de nitrógeno que llevan es un anillo heterocíclico de 5-6 miembros, que adicionalmente puede contener otro heteroátomo de la serie O, S, N;
    p
    es un número entero de 1 a 100;
    q
    es un número entero de cero a 22;
    R^{5}
    hidrógeno o un grupo funcional seleccionado de hidroxi, amino, NHR^{7}, COOH, CONH_{2}, COOR^{8} o halógeno, en donde R^{7} es alquilo C_{1}-C_{6} y R^{8} es alquilo C_{1}-C_{4};
    Z, Z' son, de modo independiente entre sí, hidroxi, mercapto, SeH, alcoxi C_{1}-C_{22}, -O-(CH_{2})_{b}-NR^{7}R^{8}, en donde b es un número entero de 1 a 6, y R^{7} es alquilo C_{1}-C_{6} y R^{8} es alquilo C_{1}-C_{4} o R^{7} y R^{8} forman junto con el átomo de nitrógeno que llevan un anillo de 3-6 miembros; alquilo C_{1}-C_{18}, con preferencia alquilo C_{1}-C_{8}, arilo C_{6}-C_{20}, aril C_{6}-C_{14}-alquilo C_{1}-C_{8}, con preferencia aril C_{6}-C_{10}-alquilo C_{1}-C_{4}, aril C_{6}-C_{14}-alcoxi C_{1}-C_{8}, con preferencia aril C_{6}-C_{10}-alcoxi C_{1}-C_{4}, en donde arilo también significa heteroarilo y arilo está eventualmente sustituido con 1, 2 ó 3 radicales iguales o diferentes de la serie carboxi, amino, nitro, alquilamino C_{1}-C_{4}, alcoxi C_{1}-C_{6}, hidroxi, halógeno y ciano, alquil C_{1}-C_{18}-mercapto, NHR^{3}, NR^{3}R^{4}, en donde R^{3} y R^{4} son como se definieron con anterioridad, o son un grupo que
    a)
    favorece la captación intracelular, es decir, radicales lipofílicos como -O-(CH_{2})_{x}-CH_{3}, en donde x es un número entero de 6 a 18, -O-(CH_{2})_{e}-CH=CH-(CH_{2})_{f}-CH_{3}, en donde e y f son, de modo independiente entre sí, un número entero de 6 a 12, -O-(CH_{2}CH_{2}O)_{4}-(CH_{2})_{9}-CH_{3}, -O-(CH_{2}CH_{2}O)_{8}-(CH_{2})_{13}-CH_{3} y -O-(CH_{2}CH_{2}O)_{7}-(CH_{2})_{15}-CH_{3}, radicales de esteroides como colesterilo y conjugados, que aprovechan los sistemas de portadores naturales como ácido biliar, ácido fólico, 2-(N-alquil-N-alcoxi)-aminoantraquinona y conjugados de manosa y péptidos de los correspondientes receptores que llevan a la endocitosis mediada por receptores de los oligonucleótidos como EGF (factor de crecimiento epidérmico), bradiquinina y PDGF (factor del crecimiento derivado de plaquetas) o
    b)
    sirve como marcación de una sonda de ADN, es decir, grupos fluorescentes, por ejemplo, derivados de dansilo (=N-dimetil-1-aminonaftil-5-sulfonilo-), fluoresceína o cumarina o grupos quimioluminiscentes, por ejemplo, derivados de acridina, el sistema de digoxigenina, el grupo de biotina o los brazos de ligadores con grupos funcionales que permiten una posterior derivación con grupos informantes detectables, por ejemplo, un ligador de aminoalquilo que se hace reaccionar con un éster activo de acridinio para la sonda de quimioluminiscencia, o
    c)
    en la hibridación del análogo del oligonucleótido en el ácido nucleico blanco lo ataca con unión, reticulación o separación, a saber, conjugado de acridina, psoraleno, fenantrolina, naftoquinona, daunomicina o cloroetilaminoarilo o d) un nucleósido u oligonucleótido unido a través del extremo 5' o 3'; y la llave indica que R^{2} y el radical fosforilo adyacente pueden estar en posición 2' y 3' o también viceversa, en posición 3' y 2',
    en donde cada nucleótido puede estar en su configuración D o L y la base B se puede hallar en posición \alpha o \beta.
  2. 2. Compuestos de la fórmula I de acuerdo con la reivindicación 1, así como sus sales fisiológicamente tolerables, caracterizados porque la base se halla en posición \beta, los nucleótidos tienen configuración D y R^{2} se halla en la posición 2'.
  3. 3. Compuestos de la fórmula I de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, así como sus sales fisiológicamente tolerables, caracterizados porque
    a
    es un número de cero a 10;
    b
    es un número de cero a 10;
    R^{1}
    es hidrógeno o un radical de la fórmula III;
    (III)Z --- 
    \melm{\delm{\dpara}{W}}{P}{\uelm{\para}{}}
    --- Z'
    R^{2}
    es hidrógeno o hidroxi;
    n'
    es un número entero de cero a 30;
    A
    es oxi;
    W
    es oxo o tioxo;
    U
    es hidroxi, mercapto, alcoxi C_{1}-C_{6}, alquilo C_{1}-C_{6}, NR^{3}R^{4} o NHR^{3}, en donde
    R^{3}
    es alquilo C_{1}-C_{8}; i
    R^{4}
    es alquilo C_{1}-C_{8}, arilo C_{6}-C_{20} o aril C_{6}-C_{10}-alquilo C_{1}-C_{8}
    o en el caso de NR^{3}R^{4} junto con R^{3} y el átomo de nitrógeno que los lleva es un anillo heterocíclico de 5-6 miembros,
    {}\hskip0,4cm que adicionalmente puede contener otro heteroátomo de la serie O, S, N.
  4. 4. Compuestos de la fórmula I de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 3, así como sus sales fisiológicamente tolerables, caracterizados porque
    a
    es un número de cero a 4;
    b
    es un número de cero;
    R^{1}
    es hidrógeno;
    R^{2}
    es hidrógeno;
    D
    es hidroxi;
    B
    es adenina, citosina, guanina, uracilo, timina, 5-propinuracilo o 5-propincitosina;
    n'
    es un número entero de cero a 25;
    m
    es cero;
    m'
    en la fórmula I es un número entero de cero ó 1;
    T
    es oxi;
    Y
    es oxi; y
    U
    es hidroxi o alquilo C_{1}-C_{6}.
  5. 5. Uso de compuestos de la fórmula I de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 4 como sonda para la detección de ácidos nucleicos in vitro.
  6. 6. Preparación farmacéutica que contiene un compuesto de la fórmula I de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 4 eventualmente junto con excipientes y/o coadyuvantes fisiológicamente tolerables y/o junto con otros principios activos conocidos.
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