JP2019534862A - ホスホルアミダイト化学を使用する骨格修飾モルホリノオリゴヌクレオチド及びキメラの合成 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2017年5月31日付けで出願された米国仮特許出願第62/513,089号及び2016年9月20日付けで出願された米国仮特許出願第62/397,277号の利益を主張するものである。これらの出願はどちらも引用することにより本明細書の一部をなす。
又はRNAとより安定な二重鎖を形成することがわかった(RNAとの二重鎖形成で1つの修飾当たりN,N−ジメチル類縁体よりもおよそ1.75倍安定)。さらに、これらのPMO−DNAキメラは、RNアーゼH1と活性である。これは、完全に置換されたPMOがRNアーゼH1と不活性である標準的なN,N−ジメチルアミノPMO類縁体と比べて有望である。これらのキャップ/ギャップN,N−ジメチルアミノPMOキメラは、RNアーゼH1を活性化することによって、生物学における様々な適用に有用な種々の生化学的特性を有する類縁体を提供する(例えば、アミノアミデート誘導体は、二重鎖形成に対して安定性が増強されている)。相補的なRNAとの(修飾されていない二重鎖と比較した)これらのPMO−DNAキメラの安定化の増加によって、この種のキャップ/ギャップ類縁体は、より短い一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドを使用することができるため、オフターゲット効果を減少する。さらに、これらのPMO−DNAキメラを一般的に良く知られているトランスフェクト用試薬を使用して容易に細胞にトランスフェクトすることができ、マイクロインジェクション、PMOとDNAとのハイブリダイゼーション、及びエトキシル化ポリエチレンイミンによる送達、又はペプチド若しくは樹状分子トランスポーターのいずれかとの共役等の手法によるPMOの送達に関連する課題を排除する。
2015, 137:3253-64)、本開示の合成方法の3つの顕著な利点をもたらす:
1)これらの方法は、ホスホルアミダイト化学を使用する標準的なDNA/RNA合成方法と独立しており(orthogonal)、また適合性であることから、PMO合成は通常のDNA合成装置で行うことができ、
2)N,N−ジメチルアミノホスホロアミデートモルホリノ以外のヌクレオチド間結合を有するPMOを初めて合成することができ、
3)これらの合成方法は、PMO−DNAキメラの合成を可能とする。これらのキメラは、アニオン性であることから、水溶性であり、RNAにハイブリダイズすることで、RNアーゼHを活性化する。
ション条件に相当する。所与のイオン強度及びpHにおいて、Tmは、50%の標的配列が相補性ポリヌクレオチドにハイブリダイズする温度である。ここでも、かかるハイブリダイゼーションは、正確な相補性を有する場合と同じく、標的配列に対するアンチセンスオリゴマーの「およその」又は「実質的な」相補性によって起こり得る。
アンチセンスオリゴマーは、遊離(非複合体化)形態で投与された場合に宿主細胞膜を越える促進された若しくは積極的な輸送によって、又は複合体化形態で投与された場合にエンドサイトーシス機構によって宿主細胞により取り込まれ得る。
味する。この技術を支持して行われた実験は、少数の正味の電荷、例えば、15−mer〜20−merのオリゴマーに対して1〜2の電荷は、実際、実質的に帯電していない骨格を有する特定のオリゴマーの細胞取り込みを増強することができることを示す。電荷は、オリゴマー自体、例えば骨格結合において保有されてもよく、又は末端荷電基付加物(terminal charged-group appendages)であってもよい。帯電した結合の数は、帯電して
いない結合4つ当たり1個以下の帯電した結合であることが好ましい。上記数は、帯電していない結合10個当たり1個以下、又は帯電していない結合20個当たり1個以下の帯電した結合であることがより好ましい。一実施形態では、オリゴマーは完全に帯電していない。
は、所与の数のアニオン性結合、例えば、ホスホロチオエート又はN3’→P5’ホスホルアミデート結合、及びN,N−ジエチレンジアミンホスホルアミデート等の匹敵する数のカチオン性結合を有してもよい。正味荷電は、中性又は多くてもオリゴマー1個当たり1〜2の正味荷電であることが好ましい。
る。投与後、複合体は、典型的にはエンドソーム体における粒子カプセル化を含む、エンドサイトーシス機構を通して細胞によって取り込まれる。
アンチセンスオリゴヌクレオチドによる発現の阻害を説明するため2つの一般的な機構が提案されている。第1に、オリゴヌクレオチドとウイルスRNAとの間に形成されるヘテロ二重鎖は、RNアーゼHに対する基質として作用し、標的RNAの切断をもたらす。このクラスに属する又はそれに属することが提案されるオリゴヌクレオチドとして、ホスホロチオエート、ホスホトリエステル及びホスホジエステル(修飾されていない「天然」オリゴヌクレオチド)が挙げられる。かかる化合物は、オリゴマー:RNA二重鎖構造中のウイルスRNAをRNアーゼHによる加水分解に曝露して、機能を喪失させる。
ーゼH抵抗性」と称される第2のクラスのオリゴヌクレオチド類縁体は、RNアーゼHに対して基質として作用することが観察されておらず、標的RNAの核細胞質輸送、スプライシング、翻訳、又は複製を立体的に遮断することによって作用すると考えられる。このクラスは、メチルホスホネート、モルホリノオリゴヌクレオチド、ペプチド核酸(PNA)、特定の2’−O−アリル又は2’−O−アルキル修飾オリゴヌクレオチド、及びN3’→N5’ホスホルアミデートを含む。
迅速試験は、所与のアンチセンスオリゴマー型が上に言及される必要な特性、すなわち高いTm、宿主細胞によって積極的に取り込まれる能力、及びRNアーゼHに対する実質的な抵抗性を提供することを確認するため存在する。この方法は、正しく設計されたアンチセンス化合物が、哺乳動物被験体に投与された場合に標的RNAの相補的な部分と安定なヘテロ二重鎖を形成し、その後、該ヘテロ二重鎖が尿(又は他の体液)中に現れるという発見に基づく。この方法の詳細は、「標的RNAを検出する非侵襲的方法(Non-Invasive Method for Detecting Target RNA)」(非侵襲法)と題される米国特許出願第09/736,920号に提示され、その開示は、引用することにより本明細書の一部をなす。簡潔には、既知のRNAに対して標的化された塩基配列を有する評価される骨格を含む試験オリゴマーが、動物、例えば哺乳動物被験体に注入される。アンチセンスオリゴマーは、宿主RNA又は感染ウイルスのRNAを含む、任意の細胞内RNAに対して向けられてもよい。投与から数時間後(典型的には8時間後〜72時間後)、アンチセンス−RNA
ヘテロ二重鎖の存在について尿をアッセイする。ヘテロ二重鎖が検出される場合、その骨格は、本発明のアンチセンスオリゴマーにおける使用に適している。
オリゴヌクレオチド類縁体で使用され得る非イオン結合の例を図4に示す。これらの図では、Bは、好ましくはアデニン、シトシン、グアニン及びウラシルから選択されるポリヌクレオチド中の塩基に対して、塩基特異的水素結合によって結合するのに有効なプリン又はピリミジンの塩基対合部分を表す。好適な骨格構造として、カーボネート(R=O)結合及びカルバメート(R=NH2)結合;アルキルホスホネート結合及びホスホトリエステル結合(R=アルキル又は−O−アルキル);アミド結合;スルホン結合及びスルホンアミド結合(R1、R2=CH2);並びにチオホルムアセチル結合(2E)が挙げられる。後者は、ホスホロチオエートアンチセンス化合物に関して、増強された二重鎖及び三重鎖の安定性を有すると報告されている。3’−メチレン−N−メチルヒドロキシアミノ化合物も報告されている。
アルコキシ、及びチオアルコキシは、1個〜6個の炭素原子を含むことが好ましい。Y部分は、硫黄又は酸素であり、好ましくは酸素である。
B又はB*は、シリル保護基、又は酸不安定性保護基、又は塩基不安定性保護基であってもよく、
X=シアノエチル若しくはその誘導体、アルキル、チオアルキル、チオカルボニル、カルボキシレート、アセテート、又はホルメート誘導体であり、
R=ジメトキシトリチル、トリメトキシトリチル、又は任意のシリルに基づく保護基であり、
R1及びR2は独立して、イソプロピル、C2〜20直鎖若しくは分岐鎖のアルキル鎖、又は5員〜7員の脂肪族環である)からなる群から選択される化学構造を有するホスホルアミダイトが挙げられる。
目的として含まれる以下の実施例を参照することでより容易に理解される。実施例は、他の技法及び方法が特許請求の範囲を満たし、特許請求される開示の範囲から逸脱することなく用いることができることが上記の教示及び以下の実施例から当業者により認識されるように、本開示を限定することを意図するものではない。
N−ジ−tertブチルイソブチル保護モルホリノホスホルアミダイトの合成
ボランホスホルアミデートモルホリノ結合を生成するため、必要な4塩基全てに対してホスホラジアミダイトシントンを開発した(図3の合成スキームを参照されたい)。文献プロトコル(Zhang, et al., Tetrahedron Letters 2008, 49, 3570、Pattanayak, et al., Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids, 2012, 31, 763-782)に従ってホスホラジアミダイトチミジンモルホリノ単量体シントンの合成を行った。最初に、アルゴン雰囲気下、チミジンを無水ピリジン中のジメトキシトリチルクロリド(DMT−Cl)により処理して、5’O−DMTr−チミジン(7)を生じ、それを、その後過ヨウ素酸ナトリウム、続いて二ホウ酸アンモニウムで処理して、2’,3’−ジヒドロキシル−モルホリノ−チミジンを生成した(図示していない)。弱酸性条件下でシアノ水素化ホウ素ナトリウムを使用して2’及び3’のヒドロキシル基の還元を行い(更なる精製を行わない)、チミンモルホリノ単量体(8)を生成した。その後、アルゴン雰囲気下、ジクロロメタン中の2−シアノエチル−N,N,N’,N’−テトライソプロピルホスホロジアミダイト及び4,5−ジシアミノイミダゾール(DCI)による化合物(8)のホスフィチル化によって、基本単位のチミジンシントン(9)を収率86%で作製した。チミジンシントン(9)は塩基保護を必要としない。
2013, 135:6234-41)を使用して最初にヌクレオシドアミノ基をビス(tert−ブチル)イソブチルシリル(BIBS)で保護することによって開始した。
5’−ジメトキシトリチル保護ヌクレオシドをメタノールに溶解した後、1.2当量の過ヨウ素酸ナトリウム及び二ホウ酸アンモニウム四水和物(1.2当量)を添加した。混合物を室温で3時間撹拌したところ、TLCは出発材料の完全な消費を示した。反応混合物をセライト(celite)のパッドを通して濾過し、活性化された粉体の4A°モレキュラーシーブ(0.4g/mmol)に添加した後、それぞれ2.0当量のシアノ水素化ホウ
素ナトリウム及び氷酢酸を添加した。その後、反応混合物を4時間〜5時間撹拌したところ、中間体ジオールは完全に還元された。反応混合物をセライトのパッドを通して濾過し、蒸発乾固させた。生成物をクロロホルムに溶解し、飽和NaHCO3及びブラインで洗浄した。有機相を収集し、Na2SO4で乾燥して濾過し、溶媒を減圧下で除去した。生成物をシリカゲルカラム上のフラッシュクロマトグラフィーによって精製した。全ての例において、シリカゲルスラリーを、追加の5%トリエチルアミンを含む出発溶離液の混合物を用いて作製した。スラリーを注いだ後、トリエチルアミンを含まない2カラム容量の出発溶媒混合物でカラムを洗浄した。8、13及び18を19:1のクロロホルム:メタノールまでのクロロホルムの勾配を使用して溶出した。1:1の酢酸エチル:ヘキサンから7:3の酢酸エチル:ヘキサンへの勾配を使用して、化合物23を精製した。以下の欄に記載される全ての収率は、5’−ジメトキシトリチル−N−BIBS保護ヌクレオシドから開始する2工程に対して得られたものを表す。
1、113.04、86.06、80.44、76.89、64.39、60.14、59.88、50.16、49.93、48.49、47.36、47.12、46.08、46.00、43.93、43.83、43.71、26.82、26.28、26.19、24.80、24.36、24.27、24.18、21.04、20.81、20.79、20.35、20.07。ESI−MS(m/z):751.4238(M+H)+。
NMR(CDCl3)δ:160.69、159.39、158.62、154.10、145.01、135.56、135.85、130.02、128.06、127.79、126.73、116.84、113.06、85.99、80.73、77.41、64.42、60.23、49.83、47.78、26.31、24.89、24.72、21.94、21.40、20.73。ESI−MS(m/z):965.5944(M+H)+。
)δ:164.02、163.96、158.66、150.13、144.95、135.92、135.90、135.79、135.68、135.52、129.99、128.07、127.77、126.77、117.89、117.74、113.05、110.48、110.39、86.05、80.54、80.49、80.20、77.36、77.21、64.37、60.09、59.84、55.20、49.05、48.83、47.58、47.06、46.83、45.87、45.78、43.91、43.74、24.36、24.29、24.22、24.20、20.77、20.33、20.66、12.29。ESI−MS(m/z):727.4047(M+H)+。
34、80.22、76.94、76.81、64.39、60.14、59.91、55.18、50.16、49.93、48.49、48.44、47.35、47.12、46.08、46.00、43.95、43.83、43.71、28.62、26.28、26.19、24.80、24.35、24.29、24.18、21.04、20.79、20.36、20.27。ESI−MS(m/z):951.5437(M+H)+。
に入手可能な供給元(Glen Research)から得た。
5’−ジメトキシトリチル−N−BIBS保護2’−デオキシヌクレオシドを、アルゴンを吹き込んだ丸底フラスコに添加した。無水ジクロロメタン及び2−シアノエチル−N,N,N’,N’−テトライソプロピルホスホロジアミダイト(1.2当量)をシリンジによって添加した。1.0当量のテトラゾール(Glen Researchから得たCH3CN中0
.4M)をこの溶液に30分かけて撹拌しながら滴加した。反応物を室温で2時間〜3時間撹拌し、このとき、TLCが出発材料の完全な消失を示した。反応混合物をジクロロメタン中に希釈し、飽和NaHCO3溶液で2回抽出した。有機層をNa2SO4で乾燥し、濾過し、蒸発乾固させた。生成物をシリカカラム上のフラッシュクロマトグラフィーによって精製した。追加の5%トリエチルアミンを含む出発溶離液の混合物を用いてシリカゲルスラリーを作製した。スラリーを注いだ後、トリエチルアミンを含まない2カラム容量の出発溶媒混合物でカラムを洗浄した。26及び27を3:7の酢酸エチル:ヘキサンから1:1の酢酸エチル:ヘキサンへの勾配を使用して精製した。28を7:3のヘキサン:ジメチルエーテル混合物を使用して精製した。
5〜2.45(4H,m)、2.25〜2.17(1H,m)、2.12〜2.05(1H,m)、1.23〜1.15(48H,m)、1.06−0.97(18H,m)。13C NMR(CD2Cl2)δ:160.64、159.27、158.67、154.21、144.77、136.28、135.71、135.60、130.08、128.11、127.87、126.80、117.56、117.14、113.13、86.39、85.40、85.09、83.79、83.63、63.78、63.48、58.37、58.16、43.34、43.18、40.88、40.55、28.74、28.09、26.30、26.17、24.89、24.69、24.52、24.45、24.36、24.29、21.90、21.37、20.77、20.73、20.71、20.62、20.40、20.33、20.22、20.15。ESI−MS(m/z):1188.6903(M+Na)+。
BIBS保護モルホリノホスホラジアミダイトを使用するモルホリノオリゴヌクレオチドの合成
一旦、実施例1に記載されるシントンが利用可能となると、次の目標は、ボランホスホロアミデートモルホリノ誘導体を作製し、これらの化合物を対応するPMOに変換するため固相合成サイクルを最適化することであった。合成サイクルを図4及び表1に概説する。合成に先立って、ポリスチレン支持体に連結された2’−デオキシリボチミジン上の5’−DMT基を、10%トリメチルホスファイトボラン(TMPB)を含むクロロホルム中の0.5%トリフルオロ酢酸で除去した。
脱保護を以下の2工程で行った:固体支持体に連結されたボラン−ホスホルアミデートモルホリノオリゴヌクレオチドを、最初にトリエチルアミンの1:1アセトニトリル溶液で10分間処理した後、アセトニトリルで広範囲に洗浄した。次いで、アルゴン流を使用して樹脂を乾燥し、ガラスバイアルに移した。ヨウ素(0.05M)及びTHF中のジメチルアミン(2.0M)の溶液をガラスバイアルに添加した。アンモニアとの反応のため、同量のヨウ素をアンモニア(2.0M)のイソプロパノール溶液に溶解し、この溶液を樹脂に添加した。次いで、ガラスバイアルを24時間に亘り機械的シェーカーに置いた。メチルアミン及びモルホリノジアミデート誘導体の合成のため、各アミンの2.0MTHF溶液を使用した。
4000rpmで5分間遠心分離機に置き、上清を除去した。アミノ修飾モルホリノ誘導体については、イソプロパノールのアンモニア溶液を真空下で除去した。これらのモルホリノオリゴヌクレオチドを、一晩のフルオリド(テトラブチルアンモニウムフルオリドの1.0MTHF溶液1.0mL)処理によって脱シリル化した。次いで、樹脂から生成物を除去するため樹脂を37%水酸化アンモニウム水1mLで1時間処理し、0.2μm遠心分離フィルターを使用してポリスチレン樹脂ビーズを除去した。
水が重力流動によってゲル床に完全に入った後、2.5mLの試料をカラムに充填し、Milipore水3.5mLを使用して精製された試料を溶出した。AMICON(商標)Ultra−4 3K装置を使用して、10個超のヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドに対して第2の工程の精製を行った。Napカラム精製後に蓄積した溶液(総容量3.5mL)をAmicon装置に充填し、4000×gで30分間遠心分離した。濃縮溶質を、同様に、Milipore水3.0mLで2回洗浄した。オリゴヌクレオチドを収集し、様々な実験に使用した。
レオマーに対するピーク面積と比較することで、化合物29は収率94%と計算された。二量体が作製される同様の実験において、第1のカップリング収率は、他の報告される手順よりもはるかに良好な96%ということがわかった(Bioorg. Med. Chem. Lett. 2012,
22:1445-47、Tetrahedron Letters, 2015, 56;4565-68)。
PMO−DNAキメラの合成
PMO−DNAキメラの合成のため、4,5−ジシアミノイミダゾール(0.12M及び300秒のカップリング時間)及びETT(0.25M及び180秒のカップリング時間)を、モルホリノホスホルジアミダイトシントン(9、14、19又は24)及び5’−ジメトキシトリチル−2’−デオキシリボヌクレオシド−3’−ホスホルアミダイト(25、26、27又は28)に対してそれぞれ使用した。縮合の後、モルホリノホスホルアミダイトジエステルをリン(IV)ボラン結合に変換し、THF/水/ピリジン中の0.02Mヨウ素による標準的な酸化を使用してホスファイトトリエステルをホスフェートトリエステルに変換した。所望の配列/長さのPMO−DNAキメラが作製されるまでこれらの合成工程を繰り返した。表1はこれらの合成工程を概説する。
を含む一連の21−merのオリゴチミジンとして作製した。これらの21−merにおいて、モルホリノジアミデート結合を、5’末端若しくは3’末端のいずれかに隣接して、又は21merの真ん中付近に近接して、またオリゴマーを通して第3位毎に置いた(表2;ODN9、10、11、12及び13)。これらのキメラに対して、ヨウ素による活性化の際のジエチルアミンによるボランの置換は効率的に進行し、粗反応混合物のLCMSによる分析は、予想されるホスホロジアミデート結合がほぼ定量的収率で形成されたことを明らかにした。これらの有望な結果は、4つ全てのヌクレオ塩基を様々な場所に含み、多数のPMO結合を含むPMO−DNAキメラの合成(表2;ODN14、15及び16)をもたらした。反応混合物のLCMS分析及び31P NMRは、予想されたPMO−DNAキメラが平均収率10〜20 A260単位(0.2μMの合成サイクルから)によって高収率で得られたことを実証した。これらの実験もまた、ジメチルアミンによる処理がスクシネート結合の計測可能な切断及び合成中に生成物の喪失をもたらさないことを実証した。
アミノ結合、N−メチルアミノ結合及びモルホリノ結合を有するPMOの固相合成
ボランホスホネート結合は、多数の求核分子による置き換えに対して、ヨウ素によって活性化され得ることが知られている。したがって、N,N−ジメチルアミノ−ホスホロジアミデート結合を有するPMO類縁体を合成することによるこの新たな合成経路を試験することに加えて、本発明者らは、幾つかの新たなPMO−DNA誘導体を生成するため他のアミンを使用することができるかどうか調べることにした。
PMO−DNAキメラの融解温度
修飾PMO−DNAキメラの標的結合能力を評価するため、アミノ、メチルアミノ、モルホリノ及びジメチルアミノ−モルホリノヌクレオチド間結合を有する2’−デオキシオリゴチミジンを用いて二重鎖ハイブリダイゼーション研究を行った。二重鎖の全体濃度1
.0μM、バッファー(1.0M NaCl、10mMリン酸ナトリウム、pH7.1)中1:1の比でPMO11、17、18及び19を21ヌクレオチド長の2’−デオキシリボ−又はリボアデノシン−オリゴヌクレオチドと混合した。試料を96℃で変性し、15℃まで冷却した。その後、試料を1℃/分の速度で加熱し、A260対時間を記録した。融解温度を半分解離の温度とし、一次導関数プロット(表4)から得た。
キメラPMO−RNAヘテロ二重鎖のRNアーゼH1活性
N,N−ジメチルアミノPMO−DNAキメラを、RNアーゼH1活性を刺激するそれらの能力について試験した。試験系は、5’−O−フルオレセイン標識RNA及び相補性N,N−ジメチルアミノPMOキメラで構成された。
た。環外のアミンのヨウ素酸化反応及び脱シリル化を行った後、逆相HPLCを使用してオリゴヌクレオチドを精製した(バッファーA:重炭酸トリエチルアンモニウム、0.05M、バッファーB:アセトニトリル;0%→100%B 50分間;55℃;流速4.0mL/分)。精製されたODNを、1:1 NH4OH:CH3NH2の溶液1mLに溶解し、65℃で3時間加熱してトリフルオロアセトアミド基を除去した。反応混合物を乾燥し、20mMリン酸ナトリウム及び0.15M NaClを含むバッファー(200マイクロL)(pH8.0)に溶解し、濃度を測定した。20倍のモル過剰の5−(及び6−)カルボキシ−フルオレセインスクシンイミジルエステル(Thermo Fisher Scientific)をDMSOに溶解し、ODN溶液に添加した。反応混合物を室温で1時間撹拌した後、4℃で3時間に亘って撹拌した。反応混合物を300マイクロLの水で希釈し、ILLUSTRA(商標)NAP(商標)−5カラムを使用して過剰なNHS−フルオレセインを除去した。分析したPMOは、いずれかの末端にN,N−ジメチルアミノPMO結合、及び類縁体の中心に3−7ホスホジエステル結合を有するキャップ/ギャップ配列を含むオリゴチミジン14−mer(ODN24〜ODN26、表5)であった。対照は、相補性DNA及び2’−O−メチルRNA(それぞれRNアーゼH1活性を活性化するもの、
及び刺激しないもの)であった。これらのキャップ/ギャップオリゴヌクレオチド類縁体はいずれもRNA加水分解を活性化することがわかった。
RNアーゼH1(Promega)の実験を以前に記載される条件(J. Am. Chem. Soc., 2003, 125:940-50)を使用して行った。50mM Tris−HCl(pH8.0)、20mM
KCl、9mM MgCl2、1mM β−メルカプトエタノール及び250μg/mLウシ血清アルブミンのアッセイバッファーを使用して、上記反応を行った。オリゴデオキシヌクレオチド又は修飾されたオリゴデオキシヌクレオチド(200pmol)及び5’−O−フルオレセイン標識相補性オリゴリボヌクレオチドをアッセイバッファー(35μL)に添加した。E.コリのRNアーゼH1(3単位)の添加に続いて、25℃で12時間に亘り反応を行った。トラッキング色素を含む同じ容量の80%ホルムアミドゲルローディングバッファーで反応混合物を希釈し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析した(20%、19:1架橋、7M尿素)。全ての反応を3回繰り返して行った。Molecular Dynamics Typhoon Phosphorimagerを使用して現像したゲルを分析した。
細胞取り込み
脂質系トランスフェクション試薬を使用して細胞に帯電していないPMOを送達することができないため、一般的に使用されるsiRNAトランスフェクション試薬であるDharmafect 1の存在下で、これらのPMO−DNAキメラの細胞取り込みを調べた。PMO−DNAキメラを合成し(ODN27、5’−FL−T*G*T*A*apapcpcpaptpgpaptpgptpgpcptpG*C*T*A*t、これらの略称の説明については表2を参照されたい)、ここで、内部の通常のヌクレオチドは、5’−末端及び3’−末端においてN,N−ジメチルアミノPMOヌクレオチドに挟まれる。また、ODN27は、6炭素リンカーによってつながれたフルオレセイン色素(FL)を含んだ。Dharmafect 1の存在下、生細胞及び固定した細胞を用いてHeLa細胞をODN27(100nM濃度)でトランスフェクションし(図7)、それぞれ20時間及び18時間のインキュベーションの後、蛍光顕微鏡によって画像化した。
ンする前に、細胞を2回洗浄した(2.0mL D−PBS/洗浄)。D−PBSをHela細胞から取り除き、1.0mLのトランスフェクション混合物を各ウェルに添加した。その後、細胞を37℃で18時間インキュベートし、2回洗浄した(2.0mL D−PBS/洗浄)。10%の中性バッファーホルマリン1.0mLで細胞を15分間覆った。ホルマリン溶液を除去し、室温にて10分間DPBS 3.0mLで細胞を覆った。カバーガラスをウェルから取り除き、封入剤としてDAPIを含むFlouromount−Gを使用してカバースライドに上下逆さまに封入し、Hamamatsu C4742−95 CCD及びCoolSNAP ESデジタルカメラを備えた倒立顕微鏡(OlympusIX 81)を使用して観察した。
Claims (16)
- 式I:
Bはそれぞれ独立して、核酸塩基(アデノシン、グアノシン、ウラシル、チミン、シトシン、イノシン)、又はシリル保護基若しくは酸不安定性の保護基若しくは塩基不安定性の保護基で保護された核酸塩基であり、
Xは、酸素若しくは硫黄、メチル、エチル、任意のC3〜7アルキル、5員〜7員の脂肪族環若しくは芳香環、カルボキシレート、アセテート若しくはホルメートの誘導体、アミン、又は任意の直鎖若しくは分岐鎖のC1〜5アルキルで置換されたアミンであり、
Yは酸素又は硫黄であり、
Rはそれぞれ独立して、ガラス基体、ポリスチレン樹脂、ジメトキシトリチル保護基、リン誘導体、DNA若しくはRNAオリゴヌクレオシド/オリゴヌクレオチド、トリメトキシトリチル、モノメトキシトリチル、トリチル、任意のシリル、又は式Iの別のモルホリノに連結され、ここで、リンカーは、ホスフェート/ホスホロチオエート/ボラノホスフェート結合を有するホスホロジアミデートリンカー、又はホスホロアミデートリンカー、ホスフェート結合若しくはチオ結合、又は上に記載されるXを有するモルホリノ環との任意の他の結合である)の化学構造を含む単量体サブユニットを含むオリゴマー。 - 前記核酸塩基性保護基が、
- 2個〜40個の単量体のサブユニットを含む、請求項1に記載のオリゴマー。
- 下記の化学構造:
Bはそれぞれ独立して、核酸塩基(アデノシン、グアノシン、ウラシル、チミン、シトシン、イノシン)、又はシリル保護基若しくは酸不安定性の保護基若しくは塩基不安定性の保護基で保護された核酸塩基であり、
Rはそれぞれ独立して、ガラス基体、ポリスチレン樹脂、ジメトキシトリチル保護基、リン誘導体、DNA若しくはRNAオリゴヌクレオシド/オリゴヌクレオチド、トリメトキシトリチル、モノメトキシトリチル、トリチル、任意のシリル、又は式Iの別のモルホリノに連結され、ここで、リンカーは、ホスフェート/ホスホロチオエート/ボラノホスフェート結合を有するホスホロジアミデートリンカー、又はホスホロジアミデートリンカー、ホスフェート結合若しくはチオ結合である)を有するホスホルアミダイトシントン。 - 前記核酸塩基保護基が、
- ホスホロジアミダイト単量体を作製する方法であって、
a.5’−O−ジメトキシトリチルリボ−塩基を過ヨウ素酸ナトリウム及び二ホウ酸アンモニウムと接触させてジヒドロキシリボースモルホリノ単量体を生成することと、
ここで、前記塩基が、保護基によってヌクレオシドアミノ基において保護されていてもよいチミジン、シトシン、アデニン、及びグアニンの1つである;
b.前記ジヒドロキシリボースモルホリノ単量体上のヒドロキシル基をシアノ水素化ホウ素ナトリウムで還元してモルホリノ単量体を生成することと、
c.ジクロロメタン中の2−シアノエチル−N,N,N’,N’−テトライソプロピルホスホルジアミダイト及び4,5−ジシアノイミダゾール(DCI)で前記モルホリノ単量体をホスフィチル化してホスホロジアミダイト単量体を生成することと、
を含む、方法。 - 前記ヌクレオシドアミノ基における前記保護基が、請求項4又は請求項5に記載の任意の他の保護基である、請求項6に記載の方法。
- 請求項1に記載の、少なくとも1つの単量体サブユニットを含むオリゴマーを形成する方法であって、
a.ポリスチレン/CPG支持体に連結された5’−未保護−2’−デオキシリボヌクレオシドを準備することと、
b.前記5’−未保護−2’−デオキシリボヌクレオシドと、4,5−ジシアノイミダゾール(DCI)を含む無水アセトニトリル中の請求項3に記載のホスホルアミダイトとを反応させてホスホルアミダイトジエステルヌクレオチド間結合を有する二量体を生成することと、
c.前記二量体のホウ素化、又は硫化、又は酸化の少なくとも1つを含む、前記二量体を化学的に活性化することと、
d.前記二量体をキャッピングすることと、
e.前記二量体を脱トリチル化することと、
f.工程b〜工程eを繰り返して前記オリゴマーを伸長することと、
g.モルホリノボランホスホロアミデート単量体を、テトラヒドロフラン中のヨウ素及びジメチルアミンと接触させて、モルホリノホスホロアミデートをN,N−ジメチルアミノPMOに変換することと、
h.前記オリゴマーを、水酸化アンモニウム及びエチレンジアミンを含む溶液と接触させて、前記ポリスチレン支持体から前記オリゴマーを除去することと、
を含む、方法。 - 前記活性化工程cが、前記二量体のホウ素化を含み、前記伸長工程fの後、前記接触工程gの前に、前記ヌクレオチド間結合からシアノエチル基を除去する追加工程を更に含む、請求項8に記載の方法。
- 前記活性化工程cが、前記二量体のホウ素化を含み、前記接触工程gの後、工程hの前に、前記単量体をテトラブチルアンモニウムフルオリド(TBAF)のTHF溶液と接触させて前記単量体からBIBS保護基を除去する追加工程を更に含む、請求項8に記載の方法。
- 前記反復合成工程fが市販のDNA合成装置で行われる、請求項8に記載の方法。
- 硫化してチオモルホリノ結合を生成した後、前記合成されたオリゴマーが、以下の表のODN1〜ODN11から選択される少なくとも1つのオリゴマーである、請求項8に記載の方法。
- 相補的なDNA又はRNAと、天然DNA又はDNA/RNA複合体よりも安定な二重鎖を容易に形成するチオモルホリノヌクレオチド間結合を含む、請求項1に記載のオリゴヌクレオチド、又は請求項8に記載の方法によって形成されるオリゴヌクレオチド。
- RNアーゼH1酵素活性を活性化する、請求項1に記載のオリゴヌクレオチド、又は請求項8に記載の方法によって形成されるオリゴヌクレオチド。
- 酵素活性を不活性化する、請求項1に記載のオリゴヌクレオチド、又は請求項8に記載の方法によって形成されるオリゴヌクレオチド。
- 標準的な脂質試薬を使用して細胞に容易にトランスフェクトされる、請求項1に記載のオリゴヌクレオチド、又は請求項8に記載の方法によって形成されるオリゴヌクレオチド。
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