CN113651865A - 一种去除四丁基氟化铵的方法 - Google Patents

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Abstract

一种去除四丁基氟化铵的方法，属于核苷领域。该去除四丁基氟化铵的方案能够被用于制备目标核苷，且制备方法包括：利用硅保护基团对核苷起始物进行选定位的羟基保护，形成核苷修饰物；对所述核苷修饰物进行化学反应，以制备携带对所述选定位的羟基进行保护的所述硅保护基团的核苷前体；采用四丁基氟化铵脱除所述核苷前体中的所述硅保护基团并经水解，获得至少含有所述目标核苷和四丁基季铵盐的待分离物；利用阳离子交换树脂从所述待分离物中将所述四丁基季铵盐分离，获得所述目标核苷。该方案可以简便对在核苷的制备过程中去除四丁基氟化铵。

Description

一种去除四丁基氟化铵的方法
技术领域
本申请涉及核苷领域，具体而言，涉及一种去除四丁基氟化铵的方法。
背景技术
四丁基氟化铵(TBAF)是一种亲脂性的季铵氟化物，其在有机合成中有广泛的应用。与其他脱保护试剂(氢氟酸、氟化氢胺络合物和氟代无机盐等)相比，TBAF的安全性更高、脱保护能力更强，因此，是一种性能良好的硅醚脱保护试剂。
虽然TBAF作为脱硅醚保护试剂具有非常好的优势，但是在核苷合成中，脱完硅保护基后，TBAF杂质难以去除。
发明内容
本申请提供了一种去除四丁基氟化铵的方法，该方法能够部分或全部地改善、甚至解决通过硅保护基团对羟基进行保护的核苷，在脱保护之后四丁基氟化铵杂质难以与核苷分离开的问题。
本申请是这样实现的：
在第一方面，本申请的示例提供了一种制备目标核苷的方法。
该方法包括：
利用硅保护基团对核苷起始物进行选定位的羟基保护，形成核苷修饰物；
对核苷修饰物进行化学反应，以制备携带对选定位的羟基进行保护的硅保护基团的核苷前体；
采用四丁基氟化铵脱除核苷前体中的硅保护基团并经水解，获得至少含有目标核苷和四丁基季铵盐的待分离物；
利用阳离子交换树脂从待分离物中将四丁基季铵盐分离，获得目标核苷。
根据本申请的一些示例，目标核苷为单核苷、由单核苷聚合形成的寡聚核苷或多聚核苷；其中，单核苷的碱基部分包括是腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶或非天然碱基。
根据本申请的一些示例，硅保护基团包括TMS、TES、TBDMS、TIPS、TIPDS或TBDPS；
或者，对多个选定位的羟基利用硅保护基团进行保护时，各个硅保护基团分别独立地选自TMS、TES、TBDMS、TIPS、TIPDS和TBDPS中的任意一种；
或者，选定位的羟基包括2′、3′和5′中的任意一个或多个。
根据本申请的一些示例，利用阳离子交换树脂从待分离物中将目标核苷和四丁基季铵盐分离的方法包括：利用阳离子交换树脂进行柱层析。
在第二方面，本申请示例提出了一种阳离子交换树脂作为吸附剂从至少含有核苷和四丁基铵的混合物中去除四丁基铵的应用。
在第三方面，本申请示例提出了一种去除四丁基氟化铵的方法，该方案可以被用于对采取硅保护基团对羟基进行保护的核苷修饰物在利用四丁基氟化铵脱除硅保护基团之后进行分离。
其中的方法包括：
将脱除硅保护基团之后且经过水解获得的混合物，与阳离子交换树脂进行混合。
根据本申请的一些示例，核苷修饰物在四丁基氟化铵的四氢呋喃溶液中反应脱除硅保护基团，再进行水解以获得混合物。
根据本申请的一些示例，以阳离子交换树脂为固定相、以水为流动相，对混合物进行柱层析，以使四丁基铵被吸附而附着于阳离子交换树脂、核苷被洗脱而进入到下柱液中。
根据本申请的一些示例，阳离子交换树脂的用量为混合物中核苷的质量的3至5倍；和/或，在洗脱过程中，使用洗脱液直接流穿阳离子交换树脂色谱柱。
根据本申请的一些示例，核苷的收率达到50％以上；或者，核苷的收率达到65％至70％。
在以上实现过程中，本申请实施例提供的采用阳离子交换树脂作为吸附剂，将其用于对保护羟基的硅保护基团被脱除之后的四丁基产物分离。该方案可以适用于多种核苷的制备工艺中，能够有效缓解、甚至解决因为使用四丁基氟化铵作为脱保护剂而导致的制备过程中的后续纯化和分离困难、目标产品收率低等问题。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示出了本申请实施例1中制作的核苷产物的色谱图；
图2示出了本申请实施例2中制作的核苷产物的色谱图；
图3-1和图3-2示出了本申请实施例3中制作的核苷产物的色谱图。
具体实施方式
在核苷或核苷酸及其衍生物等生物材料的制备过程中，通常都会涉及到对羟基的保护，以防止其在制备过程中发生改变或者参与反应或为了让特定的羟基参与反应。然后在适当选择的步骤中再通过脱去保护基团，将其“还原”为羟基。
因此，羟基保护基团和脱保护试剂的选择就尤为重要。
在一些实践中，羟基保护基团被选择为含硅类有机物，例如硅醚等。此外还有一些诸如苄醚保护、烷氧基甲基醚保护或烷氧基甲基取代醚保护等等。
其中，硅醚保护方案中，含硅的保护基团例如可以选择TMS、TES、TBS、TBDMS、TIPS、TIPDS或TBDPS等。这种类型的保护基团具有易保护，也去保护/脱保护的优点。其中，去保护可以采用四丁基氟化铵(Bu4NF)，另外也存在一些能够提供酸碱性条件的物质进行脱除。但是其中仍以使用四丁基氟化铵尤为普遍。
虽然四丁基氟化铵的脱硅保护基的效果很好，然而，这会对后续的纯化过程造成很大的困难。特别是在核酸、核苷等的合成中，这样的问题描述尤为突出。
经过研究，发明人发现，这是由于使用硅醚进行羟基保护的核苷，经过四丁基氟化铵的脱保护之后，核苷产品和四丁基反应物(例如四丁基季铵盐，示例性地，四丁基氢氧化铵)在同一反应体系中并且二者的极性都较大，使得要获得纯化的核苷—将核苷和四丁基反应物分离—的难度大。
此前，发明人主要采取如下方式进行处理：
1)硅胶去除；但是该方案会导致产品(核苷)损失较大，且往往需要多次纯化才能去除，导致试剂使用量大、流程繁琐、耗时长；
2)反向C18色谱柱制备；该方案同样存在产品的分离损失较大的问题，且制备效率低。
3)手性制备柱正相纯化：该方案存在手性制备柱价格昂贵，成本较高的问题。
此外，上述方案通常具有一定的专一性，即针对特定的核苷底物。同时，这些方案还存在分离周期长、无法产业化大生产等缺点。
因此，开发一种成本适当、产品损失小的将核苷和四丁基反应物分离的方案是迫切的需求。
换言之，鉴于核苷类化合物高昂的医用药用价值，寻找简便、快捷去除TBAF的方法一直是科学家努力的方向。
有鉴于此，在本申请中特提出一种方案，其可以满足上述的需求。
大体上而言，本申请示例中的方案主要针对核苷及其衍生物存在的分离技术问题而开发。本申请示例方案提出了通过阳离子交换树脂实现快速去除核苷及其衍生物中的TBAF的方法。
下面将结合实施例对本申请的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本申请，而不应视为限制本申请的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下针对本申请实施例的一种去除四丁基氟化铵的方法进行具体说明。
整体上，在本公开中，利用了阳离子交换树脂作为吸附剂，将四丁基铵(四丁基氢氧化铵)吸附，从而将四丁基铵去除。并且，作为在核苷合成中的应用，示例的方案，从至少含有核苷和四丁基铵的混合物中利用阳离子交换树脂去除四丁基铵，从而获得纯化或分离的核苷产品。
作为一种可选的方案，部分示例，以单核苷(相对的是，可以使用寡聚核苷或多聚核苷或核苷酸或其衍生物，其中衍生物可以是在碱基或核糖基或磷酸基上进行了基团或者元素修饰的产物)而言，其羟基使用硅保护基团进行保护，从而构成核苷修饰物。当对核苷修饰物进行脱保护时，采用四丁基氟化铵作为脱保护试剂。然后在经过水解结合获得核苷产品和四丁基铵，以及保护基团与氟形成的氟化物。
其中氟化物极性较小，因此，可以通过小极性溶剂打浆除去或者说对于该极性小的产物(氟化物)可以直接萃取而与核苷分离。但是由于核苷产品的极性和四丁基铵的极性都比较大，因此，二者难分离，至少难以通过硅胶柱或反相C18柱分离。
换言之，在核苷修饰物经过脱保护之后，经过水解会至少产生核苷产品、四丁基铵杂质和氟化物杂质。其中，氟化物杂质容易与核苷产品分离，而四丁基铵杂质难以分离，本申请示例方案能够用于将核苷产品和四丁基铵杂质进行分离。
本公开采用阳离子交换树脂(大孔强酸阳树脂LXC-105，大孔强酸阳树脂LXC-107，美国陶氏树脂UP6150)对四丁基铵杂质的吸附特性，使得核苷产品和四丁基铵杂质在于阳离子交换树脂接触反应的过程中，四丁基铵被吸附，而核苷产品却可不吸附而作为分离产品被获得，从而实现纯化。
一种示例中，利用阳离子交换树脂进行柱层析的方式来进行纯化制备核苷。
例如制备核苷的步骤可以参阅下述式1和式2。
Figure BDA0003219554480000071
上述式中，Base代表的是核苷的碱基，可以是AGCTU等自然碱基，即腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶等；或者是人工碱基/非自然碱基。其中的，R1、R2、R3、R4和R5分别表示的是羟基保护基团。其中，R1是核苷的5′羟基保护基团，R2是3′羟基保护基团，R3是5′羟基保护基团，R4是3′羟基保护基团，R5是2′羟基保护基团。上述R1至R5的各保护基团可以分别独立地进行选择，例如可以是分别独立地选自：
TMS(三甲基硅基，
Figure BDA0003219554480000072
)；
TES(三乙基硅基，
Figure BDA0003219554480000073
)；
TBDMS(TBS，叔丁基二甲基硅基，
Figure BDA0003219554480000074
)；
TIPS(三异丙基硅基，
Figure BDA0003219554480000081
)；
TIPDS(1,1,3,3-四异丙基二硅氧基，
Figure BDA0003219554480000082
)；
TBDPS(叔丁基二苯基硅基，
Figure BDA0003219554480000083
)。
上述式1和式2中，分别进行了两个或三个羟基的保护以及脱保护，但是，对于仅选择一个羟基进行保护的情况，本申请示例的方案也同样适用。此外，上述式中，采用的是单个核苷进行的示例性说明。但是，基于本申请方案，对于多聚核苷或寡聚核苷或核苷酸及其衍生物的情况也同样适用。
在上述反应式给出的示例中，核苷修饰物(羟基保护)在四丁基氟化铵的四氢呋喃溶液中反应脱除硅保护基团，再直接(可以不进行浓缩或纯化)进行水解(例如，向反应体系中加入反应液的体积5至10倍的去离子水)以获得液态的混合物。然后以阳离子交换树脂为固定相、以水为流动相/洗脱液，对上述的混合物直接进行柱层析。由此，可以使四丁基铵被吸附而附着于阳离子交换树脂、核苷被洗脱而进入到下柱液中。下柱液可以进一步处理，以将其中氟化物去除。或者，在另一些示例中，在进行柱层析之前，将混合物中的氟化物去除。
由于氟化物和核苷产品在走柱时的性质差异，可以通过UV测定的方式监控下柱液，以便收集到更纯的核苷产品。即通过UV测定，从下柱液中收集核苷；然后可以直接浓缩干获得核苷固体。
在上述柱层析的过程中，阳离子交换树脂的使用量可以根据下柱液中的核苷产品的量进行选择。但是在示例中，阳离子交换树脂的用量可以选择为混合物中核苷的质量的3至5倍。在这样的使用量的情况下可以在核苷的洗脱效率、收率以及树脂的利用率方面取得很好的平衡。其中，混合物中的核苷的质量可以通过对混合物进行UV方法进行测定。例如通过混合物中的核苷有机物的UV吸光值来判定核苷的含量。
特别地，在本申请的示例方案中，进行柱层析的洗脱操作时，可以使用洗脱液直接流穿阳离子交换树脂色谱柱。即，核苷产品可以直接通过洗脱被冲下色谱柱，而不会发生吸附或解析等过程。换言之，在洗脱过程中，不需要进行诸如梯度洗脱(梯度洗脱需要配置不同浓度的洗脱液)，也不需要担心其他难以分离的杂质会混入核苷。
另外需要说明的是，考虑到阳离子交换树脂在储放、运输等过程中容易受到污染等导致其失效或降效的情况，在进行洗脱之前可以进行预处理。例如，将阳离子交换树脂填柱之后，可以依次通过碱洗、水洗以及酸洗的方式进行预处理。示例性地，填柱后，采用0.2N至2.02N当量浓度/0.2mol/L至2.02mol/L的氢氧化钠溶液进行冲洗。氢氧化钠溶液的用量可以为填柱容积的5倍。再经过水洗去除杂质盐，然后用酸液(例如是0.2N至2.0N当量浓度/0.2mol/L至2mol/L的盐酸)进行酸洗确保制作的色谱柱为酸性的。
通过上述方式可以实现快速、高效、简便且经济地对使用四丁基氟化铵进行硅醚保护基团(保护羟基)脱除的核苷合成的工艺中对四丁基季铵盐的脱除。该利用离子交换树脂的纯化步骤的产品回收率可以达到50％以上，部分示例中可以达到60％至70％，并且，两步(脱保护和纯化)收率为35mol％至45mol％。
Figure BDA0003219554480000101
如前文所述，本申请方案具有更好TBAF去除效果，并且，本申请示例的方案还至少具有如下一些特点。
1、核苷类化合物用TBAF脱除硅保护后，核苷产物极性一般较大，在用硅胶分离纯化时，TBAF242的丰度很强，往往需要2～3次纯化才能纯化干净，这非常容易导致纯度不足。
本申请示例方案首次采用阳离子交换树脂(阳树脂)吸附四丁基铵吸附，直接得到纯化后的核苷产物。该方法得到的产物使用的溶剂量小(例如进行柱层析时洗脱液用量少)，工艺简单，能够相对彻底去除242的四正丁基胺，可应用于大工业化生产。
2、本申请的示例方案直接采用无毒无害的水进行洗脱，避免使用乙酸乙酯、二氯甲烷/甲醇、乙腈等有机溶剂，节省工业成本，适合工业化大生产。由于可以直接流穿色谱柱进行洗脱，洗脱制度更佳简单易于实施和工艺监控，便于工业化生产。
3、传统TBAF脱保护反应，经过硅胶纯化/C18反相纯化收率大约在40-50％，收率较低。本公开直接将产物流穿，直接得到纯化后的产物，收率可达到65％-70％。
4、本公开首次将阳树脂用于去除四正丁基氟化胺(TBAF)，针对于对于阳树脂稳定的底物进行方法转移，具有平台意义。
上述示例方案中，采用的时具有确定结构的单个核苷在用四丁基氟化铵脱保护之后的纯化工艺。但是，应当理解的是，该方案同样也能够适用于寡聚或多聚核苷的合成过程。
因此，可以提出这样的一种制备目标核苷的方法，其包括：
步骤S1、利用硅保护基团对核苷起始物进行选定位的羟基保护，形成核苷修饰物。
其中的核苷起始物可以是任意类型的核苷，或核苷中间体或修饰有其他功能性基团的核苷衍生产物或核苷酸衍生物；本公开中不对其进行具体限定。
步骤S2、对核苷修饰物进行化学反应，以制备携带对选定位的羟基进行保护的硅保护基团的核苷前体。
其中的化学反应例如是核苷的聚合反应，或者特定基团的取代，或者用于制作核苷酸的结合磷酸化的反应等等。
步骤S4、采用四丁基氟化铵脱除核苷前体中的硅保护基团并经水解，获得至少含有目标核苷和四丁基季铵盐的待分离物。
由于氟与硅具有较强的亲和性，因此，二者的结合性强于硅醚保护基团与氧的结构性。因此，使用四丁基氟化铵脱除硅保护基团时，氟可以与硅保护基团结合形成氟化物(例如，当采用TMS(三甲基硅基)作为羟基保护基团时，可以获得三甲基氟硅烷，
Figure BDA0003219554480000111
)，而四丁基可以与核苷上的羟基氧结合，再通过水解可以“还原”得到结合于核苷上的羟基和游离的四丁基铵(四丁基氢氧化铵)。因此，待分离物可以存在氟化物、四丁基铵和核苷等。
步骤S5、利用阳离子交换树脂从待分离物中将四丁基季铵盐分离，获得目标核苷。
其中，利用阳离子交换树脂进行分离的方案例如是前文所述的柱层析。其中，固定相采用阳离子交换交换树脂，而流动相则可以根据核苷底物以及反应过程中所使用的试剂等灵活选择，本公开对此不作具体限定。
以下结合实施例对本申请的一种去除四丁基氟化铵的方法作进一步的详细描述。
实施例1
3′-Bz-A(N-Bz)合成中去除TBAF的方法。
Figure BDA0003219554480000121
如上式进行5′羟基的“还原”，其中省略了水解步骤。
以5′-O-TBDMS-3′-O-Bz-A(N-Bz)(6.45kg,1eq)为原料，THF(28.7kg)做反应溶剂，四丁基氟化铵(3.73kg，1.2eq)试剂，30℃，反应16小时。
UPLC监控反应完全后，反应液无须浓缩直接加去离子水(5V)形成上样液，并且上样液通过UV方法测定核苷含量。
利用质量为核苷质量的5倍的阳离子交换树脂柱(美国陶氏树脂UP6150)填柱制作色谱柱。再利用去离子水作为洗脱液进行柱层析纯化，合格的下注液(下注液HPLC纯度≥98.5％为合格下注液)直接浓缩拿到2.75kg产品，纯度99.0％，重量收率43％，产品纯度数据如图1。
实施例2
3′-Bz-Ur合成中去除TBAF的方法。
Figure BDA0003219554480000122
如上式进行5′羟基的“还原”，其中省略了水解步骤。
以5′-O-TBDMS-3′-O-Bz-Ur(2kg,1eq)为原料，THF(9kg)做反应溶剂，以及四丁基氟化铵(1.3kg，1.2eq)试剂，30℃，反应16小时。
UPLC监控反应完全后，反应液无须浓缩可直接加去离子水(10V)上样液，并且上样液通过UV方法测定核苷含量。
利用质量为核苷质量的5倍的阳离子交换树脂柱(美国陶氏树脂UP6150)填柱制作色谱柱。再利用去离子水作为洗脱液进行柱层析纯化，合格的下注液直接浓缩拿到1kg产品，纯度99.9％，重量收率50％。产品纯度数据如图2。
实施例3
Figure BDA0003219554480000131
如上式进行5′羟基的“还原”，其中省略了水解步骤。
以5′-O-TBDMS-3′-O-Bz-Cr(2kg,1eq)为原料，THF(9kg)做反应溶剂，以及四丁基氟化铵(1.2kg，1.2eq)试剂，30℃，反应16小时。
UPLC监控反应完全后，反应液无须浓缩可直接加去离子水(10V)上样液，并且上样液通过UV方法测定核苷含量。
利用质量为核苷质量的5倍的阳离子交换树脂柱(美国陶氏树脂UP6150)填柱制作色谱柱。再利用去离子水作为洗脱液进行柱层析纯化，合格的下注液直接浓缩拿到0.9kg，纯度99.5％，重量收率45％。产品纯度数据如图3-1和图3-2所示。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种制备目标核苷的方法，其特征在于，所述方法包括：
利用硅保护基团对核苷起始物进行选定位的羟基保护，形成核苷修饰物；
对所述核苷修饰物进行化学反应，以制备携带对所述选定位的羟基进行保护的所述硅保护基团的核苷前体；
采用四丁基氟化铵脱除所述核苷前体中的所述硅保护基团并经水解，获得至少含有所述目标核苷和四丁基季铵盐的待分离物；
利用阳离子交换树脂从所述待分离物中将所述四丁基季铵盐分离，获得所述目标核苷。
2.根据权利要求1所述的制备目标核苷的方法，其特征在于，所述目标核苷为单核苷、由单核苷聚合形成的寡聚核苷、由单核苷聚合形成的多聚核苷或其中任意一项的衍生物；其中，所述单核苷的碱基部分包括是腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶或非天然碱基。
3.根据权利要求1所述的制备目标核苷的方法，其特征在于，所述硅保护基团包括TMS、TES、TBDMS、TIPS、TIPDS或TBDPS；
或者，对多个选定位的羟基利用所述硅保护基团进行保护时，各个硅保护基团分别独立地选自TMS、TES、TBDMS、TIPS、TIPDS和TBDPS中的任意一种；
或者，所述选定位的羟基包括2′、3′和5′中的任意一个或多个。
4.根据权利要求1至3中任意一项所述的制备目标核苷的方法，其特征在于，利用阳离子交换树脂从所述待分离物中将所述目标核苷和所述四丁基季铵盐分离的方法包括：利用所述阳离子交换树脂进行柱层析。
5.一种阳离子交换树脂作为吸附剂从至少含有核苷和四丁基铵的混合物中去除四丁基铵的应用。
6.一种去除四丁基氟化铵的方法，用于对采取硅保护基团对羟基进行保护的核苷修饰物在利用四丁基氟化铵脱除所述硅保护基团之后进行纯化，其特征在于，所述方法包括：
将脱除所述硅保护基团之后且经过水解获得的混合物，与阳离子交换树脂进行混合。
7.根据权利要求6所述的去除四丁基氟化铵的方法，其特征在于，所述核苷修饰物在四丁基氟化铵的四氢呋喃溶液中反应脱除所述硅保护基团，再进行水解以获得所述混合物。
8.根据权利要求6或7所述的去除四丁基氟化铵的方法，其特征在于，以所述阳离子交换树脂为固定相、以水为流动相，对所述混合物进行柱层析，以使四丁基铵被吸附而附着于所述阳离子交换树脂、而核苷则被洗脱进入到下柱液中。
9.根据权利要求8所述的去除四丁基氟化铵的方法，其特征在于，所述阳离子交换树脂的用量为所述混合物中核苷的质量的3至5倍；和/或，在洗脱过程中，使用洗脱液直接流穿所述阳离子交换树脂色谱柱。
10.根据权利要求6所述的去除四丁基氟化铵的方法，其特征在于，所述核苷的收率达到50％以上；或者，所述核苷的收率达到65％至70％。
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