CN109456376A

CN109456376A - 核苷修饰物5’-DMTr-2’-EOE-5-Me-胞嘧啶核苷的新型制备方法

Info

Publication number: CN109456376A
Application number: CN201811563509.1A
Authority: CN
Inventors: 李喜群; 孙波; 姚峰; 刘洋
Original assignee: Shanghai Zhao Wei Biological Engineering Co Ltd; Hongene Biotechnology Ltd
Current assignee: Shanghai Zhao Wei Biological Engineering Co Ltd; Hongene Biotechnology Ltd
Priority date: 2018-12-20
Filing date: 2018-12-20
Publication date: 2019-03-12
Anticipated expiration: 2038-12-20
Also published as: CN109456376B

Abstract

本发明涉及一种新型核苷修饰物5’‑DMTr‑2’‑乙氧乙基(EOE)‑5‑Me‑胞嘧啶核苷的制备方法。本发明的方法以新型核苷修饰物5’‑DMTr‑2’‑EOE‑胸腺嘧啶核苷作为起始原料，通过与氯化剂，三氮唑反应，氨解处理等工艺处理，高收率，高选择性地生成另一种新型核苷修饰物5’‑DMTr‑2’‑EOE‑5‑Me‑胞嘧啶核苷。本发明的方法可以简便、经济地大量合成新型核苷修饰物5’‑DMTr‑2’‑EOE‑5‑Me‑胞嘧啶核苷。

Description

核苷修饰物5’-DMTr-2’-EOE-5-Me-胞嘧啶核苷的新型制备方法

技术领域

本发明属于核苷化合物合成领域，更具体地，本发明涉及一种新型核苷修饰物5’-DMTr-2’-EOE-5-Me-胞嘧啶核苷及其制备方法。

背景技术

近年，随着基因组创药的发展，反义寡核苷酸药物被急速开发，究其原因在于其较传统药物来讲具有以下几点优势：1)特异性较强。一个15聚体的反义寡核苷酸含有30-45氢键，而低分子的传统药物(200-600u)与靶点一般只形成1-4个键；2)信息量较大。遗传信息从DNA-RNA-蛋白质，用互补寡核苷酸阻断某种蛋白的合成是很准确的；3)反义药物以核酸为靶点，与蛋白质作为靶点比较，更易合理设计新药物。由于作用于遗传信息传递的上游，所需药量较低，副作用可能较少。

5’-DMTr-2’-EOE(乙氧乙基)-5-Me-胞嘧啶核苷是合成新型反义寡核苷酸的最基础原料。随着技术研究的推进，对反义药物的研究正兴盛起来。国内已有数家科研单位正在开展反义药物的研究，并已有若干反义寡核苷酸产品处在临床前试验阶段，相信国产反义药物有望在未来5～8年内上市并造福于国内广大患者。

5’-DMTr-2’-EOE-5-Me-胞嘧啶核苷除可作为药物开发工具外，还可用于科学研究，特别是功能基因组学研究。但是，目前国内外还没有相关文献对其工业化合成工艺进行报道。而实验室规模的工艺制备，无法满足工业化要求。

另一方面，在医药品的用途中，为了极力抑制由含有的杂质生成的副生成物，有必要使用非常高纯度的寡核苷。本发明提出了一种制备高纯度的5’-DMTr-2’-EOE-5-Me-胞嘧啶核苷的方法。

迄今为止还没有适合工业化制备5’-DMTr-2’-EOE-5-Me-胞嘧啶核苷的方法。即使是实验室规模的实验，国内外也鲜有文献报道。

因此，本领域迫切需要提供一种有效且无需特别设备，适合大规模工业化生产，可得到高纯度新型核苷修饰物5’-DMTr-2’-EOE-5-Me-胞嘧啶核苷的制备方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新型核苷修饰物5’-DMTr-2’-EOE-5-Me-胞嘧啶核苷及其制备方法。

在本发明的第一方面，提供一种式A所示核苷修饰化合物的制备方法，

所述的方法包括：

(1)以化合物D(核苷修饰物5’-DMTr-2’-EOE-胸腺嘧啶核苷)作为起始原料，将其3’位的羟基替换为OR1，获得中间体化合物C；其中R1为保护基；

(2)将步骤(1)的中间体化合物C与氯化剂和三氮唑进行反应，得到中间体B；

(3)将式B化合物与氨试剂进行反应，将三氮唑基团置换成胺基，并且将OR1恢复为OH基团，获得式A所示核苷修饰化合物。

在一个优选例中，步骤(1)中，R1为硅醚化合物保护基；较佳地，R1选自：三甲基硅基(TMS)或其他硅烷化基团；更佳地，所述其他硅烷化基团包括：叔丁基二苯基硅基(TBDPS)，叔丁基二甲基硅基(TBS/TBDMS)或三异丙基硅基(TIPS)。

在另一优选例中，当R1为三甲基硅基(TMS)时，步骤(3)中OR1直接恢复为OH基团；当R1为硅烷化基团时，步骤(3)中OR1进一步辅以氟试剂恢复为OH基团；进一步更佳地，所述氟试剂选自(但不限于)：四丁基氟化铵；氟化氢吡啶盐，氟化氢三乙胺盐。

在另一优选例中，所述氟试剂优选四丁基氟化铵，该四丁基氟化铵和化合物D的摩尔比为2.0-8.0∶1；较佳地为2.0-5.0∶1；最佳地为3.0∶1。

在另一优选例中，步骤(1)中，化合物D与R1-Cl反应；较佳地，R1-Cl试剂选自：TMS-Cl，TBDMS-Cl，TBDPS-Cl。

在另一优选例中，步骤(1)的反应在碱性条件下进行。

在另一优选例中，所述化合物D与所述R1-Cl试剂的摩尔比为1∶1-3；较佳地为1∶1.2-2.5；更佳地为1∶1.5。

在另一优选例中，步骤(1)中，将所述化合物D在溶剂1加入到溶剂1中，将其3’位的羟基替换为OR1；该溶剂1选自：二氯甲烷/三乙胺)(较佳地，两者比例(w/w)为20-40-1∶1；更佳地为25-30∶1)，吡啶，乙腈/三乙胺(较佳地，两者比例(w/w)为10-30∶1；更佳地为15-20∶1)，二氯甲烷/DMAP(较佳地，两者比例(w/w)为20-40∶1；更佳地为25-30∶1)。

在另一优选例中，步骤(1)中，先将化合物D在溶剂中溶解，再加入R1-Cl进行反应。

在另一优选例中，步骤(1)中，溶剂1的用量为化合物D重量体积比的5-10倍。

在另一优选例中，步骤(1)中，混合溶剂中的碱性试剂用量为化合物D的5～8倍摩尔当量。

在另一优选例中，步骤(1)中，化合物C为粗品，无需提纯，直接用于下一步反应中。

在另一优选例中，步骤(2)中，所述氯化剂选自：三氯氧磷，氯化亚砜。

在另一优选例中，所述的中间体化合物C与氯化剂和三氮唑在溶剂2中反应，所述的溶剂2选自：二氯甲烷/三乙胺(较佳地，两者比例(w/w)为20-40：1；更佳地为25-30：1)；吡啶；乙腈/三乙胺(较佳地，两者比例(w/w)为10-30：1；更佳地为15-20：1)；二氯甲烷/DMAP(较佳地，两者比例(w/w)为:20-40：1；更佳地为25-30：1)。

在另一优选例中，先将三氮唑加入溶剂中混合搅拌，冷却(较佳地至0±2℃)，再加入氯化剂搅拌，之后加入中间体化合物C，在室温下(较佳地至25±2℃)反应。

在另一优选例中，步骤(2)中，氯化剂的用量为化合物D的1～2倍摩尔当量。

在另一优选例中，步骤(2)中，三氮唑的用量为化合物D的4～8倍摩尔当量。

在另一优选例中，步骤(2)中，溶剂2的用量为化合物D重量体积比的5-10倍。

在另一优选例中，步骤(2)中，混合溶剂中的碱性试剂用量为化合物D的5～8倍摩尔当量；化合物B为粗品，也无需提纯，直接用于下一步反应中

在另一优选例中，步骤(3)中，所述的式B化合物与氨试剂在溶剂3中进行反应，所述溶剂3选自：氨水/乙腈(较佳地，两者比例(w/w)为1：1-1.5；更佳地为1：1.1-1.2)；氨水/四氢呋喃(较佳地，两者比例(w/w)为1：1-1.5；更佳地为1：1.1-1.2)；氨气/甲醇(较佳地，两者比例(w/w)为1：1-1.5；更佳地为1：1.1-1.2)；较佳地，该反应在25±2℃进行；较佳地，氨试剂的用量为化合物D的1～2倍摩尔当量。

在另一优选例中，步骤(3)中，溶剂3的用量为化合物D重量体积比的5-10倍。

在另一优选例中，步骤(3)中，生成含有式A所示核苷修饰化合物的产物后，还包括：将该产物进行结晶纯化，获得高纯度的式A所示核苷修饰化合物；较佳地，以乙酸乙酯/正庚烷(较佳地，两者比例(w/w)为(2～8)∶1；更佳地为(3～6)∶1)作为溶剂，将所述产物溶解、结晶。

在另一优选例中，步骤(3)中，反应在惰性气体(更佳地为氩气或氮气)氛围下进行。

在另一优选例中，步骤(3)中，反应温度为15～25℃。

在本发明的另一方面，提供一种化合物，其结构式如式A所示：

在另一优选例中，其由前面任一所述方法制备获得。

在本发明的另一方面，提供所述的化合物的用途，用于合成反义寡核苷酸。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

具体实施方式

发明人经过广泛的研究和试验，发现可使用新型核苷修饰物5’-DMTr-2’-EOE-胸腺嘧啶核苷作为起始原料，通过与氯化剂，三氮唑反应，氨解处理等工艺处理，可以高收率、高选择性地生成另一种新型核苷修饰物5’-DMTr-2’-EOE-5-Me-胞嘧啶核苷。本发明所阐述的方法可以简便、经济地大量合成5’-DMTr-2’-EOE-5-Me-胞嘧啶核苷，获得非常高纯度的目标化合物。本发明的方法无需特别设备，适合于大规模工业化生产。

本发明中，所述的5’-DMTr-2’-EOE-5-Me-胞嘧啶核苷的结构如下式A：

首先，本发明提供了一种式B所示的中间体化合物的制备方法，该化合物具有如下式B所示的结构式：

在本发明的优选方式中，所述的式B化合物可通过如下合成路线制备获得：

更进一步地，本发明提供了一种适合工业化生产制备5’-DMTr-2’-EOE-5-Me-胞嘧啶核苷(式A化合物)的方法，合成路线如下：

在本发明的优选方式中，本发明上述涉及的各中间体合成中：

所述的特定溶剂1选自：二氯甲烷/三乙胺；吡啶；乙腈/三乙胺；二氯甲烷/DMAP；R1-Cl试剂选自：TMS-Cl；TBDMS-Cl，TBDPS-Cl；应理解，溶剂1以及R1-Cl试剂可以应用本领域技术人员熟悉的那些，只要能够实现溶解反应物且缚酸作用，同时不与R1-Cl起反应的溶剂均是可以用于本发明中的。作为本发明的优选方式，所述的溶剂1试剂为二氯甲烷/三乙胺，R1-Cl为TMS-Cl。

所述的特定溶剂2选自：二氯甲烷/三乙胺；吡啶；乙腈/三乙胺；二氯甲烷/DMAP，氯化剂选自：三氯氧磷，氯化亚砜；作为本发明的优选方式，所述的Solvent 2试剂选自：二氯甲烷/三乙胺，氯化剂选自：三氯氧磷。

所述的特定溶剂3选自：氨水/乙腈；氨水/四氢呋喃；氨气/甲醇；作为本发明的优选方式，所述的solvent 3试剂选自氨水/乙腈。

作为本发明的优选方式，所述化合物D和氯化剂的摩尔比为1∶1.0-3.0；较佳地为1∶1.2-2.5；最佳地为1∶1.5。

本发明中，为了减少劳动强度，节约试剂，能源等资源，所述的化合物C，化合物B均为粗品，不必纯化，直接用于下一步反应中。这一方面非常有利于本发明的产品的工业化制造。

本发明中，在进行氨解反应之后，还包括步骤：在获得了式A的化合物粗品之后，还通过结晶工序，进而获得高纯度的式A化合物。应理解，尽管本发明中提供了优选的结晶溶剂体系，但本领域已知的一些可替代溶剂体系也是可用于式A化合物的纯化的。

在本发明的具体实施例中，提供了一种式A化合物的制备方法，包括步骤：

第一步，将化合物D溶于二氯甲烷/三乙胺体系中，降温至0℃左右，然后滴加R1-Cl试剂，制得化合物C粗品；

第二步，将三氮唑溶于二氯甲烷/三乙胺体系中，降温至0℃左右，然后滴加入氯化试剂；接着将第一步所得化合物C的反应液滴加到反应釜中，制得化合物B反应液粗品；

第三步，将制得化合物B反应液粗品经水洗后，浓缩干，得到化合物B粗品；

第四步，将化合物B粗品溶于氨水/乙腈体系中，搅拌反应后，制得化合物A粗品；

第五步，将式A粗品通过结晶纯化工艺，得到高纯度的目标化合物A。

据此，本发明提供了有效且无需特别设备，适合大规模工业化生产，可得到高纯度5’-DMTr-2’-EOE-5-Me-胞嘧啶核苷的制备方法，可满足市场的需求。

反应完毕后，通过简单萃取工序得到粗品式A所示化合物，然后使用混合溶剂进行结晶纯化工艺处理，从而获得高纯度的式A所示的新型核苷修饰化合物。

本发明的主要优点在于：

1、发明人筛选较多条件后，得到一条经济合理，可行性较高的合成工艺路线，可以优势合成5’-DMTr-2’-EOE-5-Me-胞嘧啶核苷，较大地提高了转化率以及降低了产物纯化难度，便于规模化生产。

2、本发明制备过程中无需特殊或危险性试剂，对设备，人员素质等无高等级要求。

3、本发明过程简单，便捷，可通过简单的三步反应即可制的目标化合物。

4、本发明提供的纯化方法简便，无需特殊设备，成本低廉。

5、本发明提供的纯化方法效果显著，目标化合物的含量可以达到99.5％以上。

本发明提到的上述特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本案说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，实施例中的定义各试剂的量的百分比(％)是质量体积比(w/v)。

本发明下述实施例中的HPLC(高效液相色谱)条件：

柱：YMC-AQ C18 5μm 4.6*250mm

流速：0.8mL/min

波长：260nm

流动相：A液：TEAA缓冲液(0.1摩尔/升的乙酸水溶液用三乙胺调至PH＝7.0)。B液：色谱级乙腈。分析过程中A液，B液在线脱气，氦气流速50ml/min。

梯度：

时间(min)	A％	B％
			0	100	0
4	100	0
			8	20	80
16	20	80
			20	100	0
30	100	0

实施例1、化合物C的制备

称取5’-DMTr-2’-EOE-胸腺嘧啶核苷47.70kg加入二氯甲烷(DCM)500L溶解，反应液降温至0℃，加入三乙胺(TEA)22.89kg，搅拌30min，向体系中滴加TMS-Cl 16.38kg，滴加过程体系温度保持在0℃，滴毕0℃搅拌反应直至原料反应完全，制得化合物C粗品。此反应液无需处理，直接用于下一步。

实施例2、化合物B的制备

在另一反应釜中，加入二氯甲烷(DCM)480L，三氮唑31.24kg，三乙胺61.03kg，搅拌30min。冰浴冷却至0℃，向体系中滴加POCl₃ 17.34kg，滴毕搅拌30min。然后于0℃下，将上述化合物C的反应液粗品滴加入到反应釜中；滴加完毕后，于25℃下搅拌反应，直至原料C反应完全。然后反应液经水淬灭，水洗后，有机相浓缩干，制得化合物B粗品。此粗品无需纯化，直接用于下一步反应中。

实施例3、5’-DMTr-2’-EOE-5-Me-胞嘧啶核苷(化合物A)的制备

向上述含有化合物B粗品的浓缩釜中，加入乙腈600L和浓氨水400L，溶解浓缩剩余物，然后于25℃搅拌反应。

反应完全后，反应液浓缩至干，残余物用乙酸乙酯/正庚烷＝8/2的混合溶剂结晶，离心后制得化合物A 41.3kg，纯度99.7％，收率86.6％。

¹H NMR(600MHz,DMSO-d₆)δ(ppm):7.64(s,1H),7.41-6.89(m,13H),5.86(d,J＝3.5Hz,1H),4.98(d,J＝6.5Hz,1H),4.22-4.18(m,1H),3.98-3.89(m,2H),3.79-3.70(m,8H),3.53-3.41(m,4H),3.27-3.22(m,2H),1.44(s,3H)1.08(t,J＝7.0Hz,3H).

后续，根据常规方法，可以合成下游反义核苷酸物质。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用以限定本发明的实质技术内容范围，本发明的实质技术内容是广义地定义于申请的权利要求范围中，任何他人完成的技术实体或方法，若是与申请的权利要求范围所定义的完全相同，也或是一种等效的变更，均将被视为涵盖于该权利要求范围之中。

Claims

1.一种式A所示核苷修饰化合物的制备方法，

其特征在于，所述的方法包括：

(1)以化合物D作为起始原料，将其3’位的羟基替换为OR1，获得中间体化合物C；其中R1为保护基；

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，R1为硅醚化合物保护基；较佳地，R1选自：三甲基硅基或其他硅烷化基团；更佳地，所述其他硅烷化基团包括：叔丁基二苯基硅基，叔丁基二甲基硅基或三异丙基硅基。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，当R1为三甲基硅基时，步骤(3)中OR1直接恢复为OH基团；当R1为硅烷化基团时，步骤(3)中OR1进一步辅以氟试剂恢复为OH基团；进一步更佳地，所述氟试剂选自：四丁基氟化铵；氟化氢吡啶盐，氟化氢三乙胺盐。

4.如权利要求1～3任一所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，化合物D与R1-Cl反应；较佳地，R1-Cl试剂选自：TMS-Cl，TBDMS-Cl，TBDPS-Cl；或

步骤(1)的反应在碱性条件下进行；或

所述化合物D与所述R1-Cl试剂的摩尔比为1∶1-3；较佳地为1∶1.2-2.5；更佳地为1∶1.5。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，将所述化合物D在溶剂1加入到溶剂1中，将其3’位的羟基替换为OR1；该溶剂1选自：二氯甲烷/三乙胺，吡啶，乙腈/三乙胺，二氯甲烷/DMAP。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述氯化剂选自：三氯氧磷，氯化亚砜。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的中间体化合物C与氯化剂和三氮唑在溶剂2中反应，所述的溶剂2选自：二氯甲烷/三乙胺；吡啶；乙腈/三乙胺；二氯甲烷/DMAP。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，先将三氮唑加入溶剂中混合搅拌，冷却，再加入氯化剂搅拌，之后加入中间体化合物C，在室温下反应。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述的式B化合物与氨试剂在溶剂3中进行反应，所述溶剂3选自：氨水/乙腈；氨水/四氢呋喃；氨气/甲醇；较佳地，该反应在25±2℃进行；较佳地，氨试剂的用量为化合物D的1～2倍摩尔当量。

10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，生成含有式A所示核苷修饰化合物的产物后，还包括：将该产物进行结晶纯化，获得高纯度的式A所示核苷修饰化合物；较佳地，以乙酸乙酯/正庚烷作为溶剂，将所述产物溶解、结晶。

11.一种化合物，其结构式如式A所示：

12.如权利要求11所述的化合物，其特征在于，其由权利要求1～10任一所述方法制备获得。

13.权利要求11～12所述的化合物的用途，用于合成反义寡核苷酸。