CN103804447B - 氮杂化鸟嘌呤核苷及其合成方法和在dna测序中的用途 - Google Patents

氮杂化鸟嘌呤核苷及其合成方法和在dna测序中的用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种氮杂化鸟嘌呤核苷及其合成方法和在DNA测序中的用途；所述合成方法包括如下步骤：式(Ⅲ)化合物在碱性条件下去保护基得式(Ⅱ)化合物；进一步去甲基得式(Ⅰ)化合物，即7‑去氮‑7‑卤素‑8‑氮‑鸟嘌呤核苷；其中，R1为H或OH，R2为I、Br或Cl，R3为H或本发明的氮杂化鸟嘌呤核苷是用于DNA测序的新型试剂，与8位未取代氮的鸟嘌呤核苷相比，具有更好的碱基识别效果、更稳定的DNA链结构。同时，现有技术中8位氮取代鸟嘌呤核苷的合成方法复杂，产率低，尚未商业化生产，而本发明的合成方法所需原料简单易得，采用常规化学合成反应，且收率较高，适用于广泛推广使用。

Description

氮杂化鸟嘌呤核苷及其合成方法和在DNA测序中的用途
技术领域
本发明涉及化学合成和生物化学领域，具体涉及一种氮杂化鸟嘌呤核苷及其合成方法和在DNA测序中的用途。
背景技术
2001年人类基因组工作草图的发表，标志着后基因组时代的到来，人们对测序技术的需求没有减少反而增加，DNA测序技术依旧处于高速发展时期。近年来，人类基因组计划促进了DNA测序效率的提高和测序成本的下降，但是目前的DNA测序方法依然存在成本高和耗时长的问题，这影响了DNA测序技术的市场化应用，阻碍了科学的发展。科学家们一直致力于发展高通量、低成本的测序技术，因此，三代高通量测序技术即单分子测序技术应运而生。
三代测序技术的核心是直接对单个DNA分子进行测序，不做任何的DNA扩增反应，从而减少成本，提高通量。单分子测序技术虽然已有商业化产品，但是都还存在技术上的难点，尚未达到规模化测序的要求。尽管如此，当前国内市场上的高通量测序平台仍被进口产品所垄断，产品范围涵盖了测序平台中的硬件和试剂等配套产品。因此，国家863计划、973计划和“十二五”技术都将研发新一代测序技术及配套产品的研发列为重点发展方向，旨在改变目前的市场格局，建立我国自主的高通量测序平台，是一项具有战略性的意义工作。
DNA合成测序的可逆终端选取U，C，A，G四个碱基的核苷酸与敏感性连接单元和荧光标记化合物，通过化学合成方式得到。合成测序的首要工作是合成四个不同碱基核苷酸及其衍生物。文献报道发现，四个不同碱基(U，C，A，G)的含取代基核苷及其衍生物，合成方式复杂且价格高昂。与此同时，8位取代氮的鸟嘌呤核苷被证明具有优良的生物活性和测序识别效果，但该种鸟嘌呤核苷及其衍生物的合成报道尚未报道。合成8位取代氮的鸟嘌呤核苷及其衍生物具有广阔的理论研究价值和市场应用前景。我们在专利申请CN201310489397.0，CN201310489350.4中分别报道了鸟嘌呤核苷两种不同的合成方法，本发明中8位取代氮的鸟嘌呤核苷包括7-去氮-7-卤素-8-氮-2’-脱氧鸟嘌呤核苷和7-去氮-7-卤素-8-氮-鸟嘌呤核苷，其具有更佳的测序识别效果和生物活性，并且合成方法更高效而实用，反应条件温和，反应过程有效且可控，适用于大规模生产。专利CN201310489350.4和专利CN201310489397.0中，糖苷化反应所需原料价格高昂，反应的产率很低，不适用于规模化生产。本专利中选取简单易得的原料，高产率地首次合成了7-去氮-7-卤素-8-氮-2’-脱氧鸟嘌呤核苷和7-去氮-7-卤素-8-氮-鸟嘌呤核苷，进而合成得到可被聚合酶识别的7-去氮-7-丙炔胺-8-氮-2’-脱氧鸟嘌呤核苷酸和7-去氮-7-丙炔胺-8-氮-鸟嘌呤核苷酸，从而参与DNA与RNA链延伸反应，达到单分子测序的效果。
发明内容
本发明的目的在于提供一种氮杂化鸟嘌呤核苷及其合成方法和在DNA测序中的用途。具体提供了氮杂化鸟嘌呤核苷酸的合成方法，中间体化合物7-去氮-7-卤素-8-氮-鸟嘌呤核苷、7-去氮-7-丙炔胺-8-氮-2’-脱氧鸟嘌呤核苷酸以及化合物7-去氮-7-丙炔胺-8-氮-鸟嘌呤核苷酸的合成方法；本发明的方法合成原料简单易得，反应条件温和，作简单，适用于规模化生产。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
第一方面，本发明涉及一种7-去氮-7-卤素-8-氮-鸟嘌呤核苷的合成方法，所述方法包括如下步骤：
A、式(Ⅲ)化合物在碱性条件下去保护基得式(Ⅱ)化合物；
B、所述式(Ⅱ)化合物在碱性条件下去甲基得式(Ⅰ)化合物，即所述7-去氮-7-卤素-8-氮-鸟嘌呤核苷；
其中，R1为H或OH，R2为I、Br或Cl，R3为H或
步骤A中，R3为H时，生成式(Ⅱ1)化合物；R3为时，生成式(Ⅱ2)化合物。
其中，R2为I、Br或Cl。
优选地，所述式(Ⅲ)化合物通过式(Ⅳ)化合物与式(Ⅵ)化合物发生糖苷化反应制备而得。
其中，R2为I、Br或Cl，R3为H或
优选地，所述式(Ⅳ)化合物通过在式(V)化合物嘌呤碱基的7位上接上卤素原子制备而得，
优选地，所述式(V)化合物是通过如下步骤制备而得的：
A、式(Ⅷ)化合物的合成：2-氨基-4，6-二羟基嘧啶在三氯氧磷的作用下，反应得到式(Ⅷ)化合物，
B、式(Ⅶ)化合物的合成：式(Ⅷ)化合物在联氨的作用下，反应得到化合物式(Ⅶ)化合物，
C、式(V)化合物的合成：式(Ⅶ)化合物在碱性条件反应下即得所述化合物式(V)化合物。
第二方面，本发明还涉及一种7-去氮-7-丙炔胺-8-氮-2’-脱氧鸟嘌呤核苷酸的合成方法，所述方法包括由前述的方法合成得到的式(Ⅰ)化合物进一步合成所述7-去氮-7-丙炔胺-8-氮-2’-脱氧鸟嘌呤核苷酸；式(Ⅰ)中R1为H。
优选地，所述方法包括如下步骤：
A、化合物dG(AP3)的合成：在CuI、Pd(PPh3)4(四三苯基磷钯)和TEA(三乙胺)存在的条件下，三氟乙酰丙炔胺和式(Ⅰ)化合物反应，得化合物dG(8-aza)(AP3)，
dG(8-aza)(AP3)；
其中，所述式(Ⅰ)化合物、三氟乙酰丙炔胺、CuI、Pd(PPh3)4和TEA的摩尔比为1∶(2～3)∶0.072∶0.025∶(1.5～2)；
B、化合物dG(8-aza)TP(AP3)的合成：化合物dG(8-aza)(AP3)与三正丁胺焦磷酸盐、2-氯-4H-1，3，2-苯并二氧磷-4-酮，在TEA和I2存在的条件下反应，反应产物去保护，得化合物dG(8-aza)TP(AP3)，即所述7-去氮-7-丙炔胺-8-氮-2’-脱氧鸟嘌呤核苷酸，
dG(8-aza)TP(AP3)；
其中，所述三正丁胺焦磷酸盐、2-氯-4H-1，3，2-苯并二氧磷-4-酮和dG(8-aza)(AP3)的摩尔比为2∶2∶1。
第三方面，本发明还涉及一种7-去氮-7-丙炔胺-8-氮-鸟嘌呤核苷酸的合成方法，所述方法包括由前述的方法合成得到的式(Ⅰ)化合物进一步合成所述7-去氮-7-丙炔胺-8-氮-鸟嘌呤核苷酸；式(Ⅰ)中R1为OH。
优选地，所述方法包括如下步骤：
A、化合物G(AP3)的合成：在CuI、Pd(PPh3)4和TEA存在的条件下，三氟乙酰丙炔胺和式(Ⅰ)化合物反应，得化合物G(8-aza)(AP3)，
G(8-aza)(AP3)；
其中，所述式(Ⅰ)化合物、三氟乙酰丙炔胺、CuI、Pd(PPh3)4和TEA的摩尔比为1∶(2～3)∶0.072∶0.025∶(1.5～2)；
B、化合物G(8-aza)TP(AP3)的合成：化合物G(8-aza)(AP3)与三正丁胺焦磷酸盐、2-氯-4H-1，3，2-苯并二氧磷-4-酮，在TEA和I2存在的条件下反应，反应产物去保护，得化合物G(8-aza)TP(AP3)，即所述7-去氮-7-丙炔胺-8-氮-鸟嘌呤核苷酸，
G(8-aza)TP(AP3)；
其中，所述三正丁胺焦磷酸盐、2-氯-4H-1，3，2-苯并二氧磷-4-酮和化合物G(8-aza)(AP3)的摩尔比为2∶2∶1。
第四方面，本发明还涉及一种前述的7-去氮-7-丙炔胺-8-氮-2’-脱氧鸟嘌呤核苷酸在参与DNA链延伸反应中的应用。
第五方面，本发明还涉及一种前述的7-去氮-7-丙炔胺-8-氮-2’-脱氧鸟嘌呤核苷酸在合成荧光素标记氮杂化鸟嘌呤核苷酸作为可逆终端中的用途。
第六方面，本发明还涉及一种荧光素标记氮杂化鸟嘌呤核苷酸可逆终端dG(8-aza)TP(AP3)-SS-Texas Red的合成方法，所述方法包括如下步骤：
A、化合物dG(8-aza)(AP3)-SPDP的合成：在TEA存在的条件下，前述的化合物dG(8-aza)(AP3)和SPDP(3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯)反应，得化合物dG(8-aza)(AP3)-SPDP，
dG(8-aza)(AP3)-SPDP；
其中，所述dG(8-aza)(AP3)、SPDP、和TEA的摩尔比为1∶(1～3)∶(1.5～2)；
B、化合物Texas Red-SH的合成：在DTT(二硫苏糖醇)存在的条件下，Texas Red(N-琥珀酰亚胺酯磺酸罗丹明101)和半胱胺反应，得化合物Texas Red-SH，
Texas Red--SH；
其中，所述Texas Red N-羟基琥珀酰亚胺酯、半胱胺和DTT的摩尔比为1∶(1～2)∶(1～3)；
C、化合物dG(8-aza)TP(AP3)-SS-Texas Red的合成：化合物dG(8-aza)TP(AP3)-SPDP与化合物Texas Red-SH在室温避光下反应，得所述荧光素标记氮杂化鸟嘌呤核苷酸可逆终端dG(8-aza)TP(AP3)-SS-Texas Red，
dG(8-aza)TP(AP3)-SS-TexasRed；
其中，所述化合物dG(8-aza)TP(AP3)-SPDP与化合物Texas Red-SH的摩尔比为1∶(0.5～2)。
第七方面，本发明还涉及一种前述的荧光素标记氮杂化鸟嘌呤核苷酸可逆终端dG(8-aza)TP(AP3)-SS-Texas Red在DNA测序中的用途。
本发明具有如下有益效果：
(1)本发明合成了7-去氮-7-碘-8-氮-2’-脱氧鸟嘌呤核苷和7-去氮-7-碘-8-氮-鸟嘌呤核苷，这两种化合物是一种新型的在DNA测序基本原料，具有更佳的测序识别效果。
(2)本发明的合成方法中，糖苷化反应所需原料简单易得，而专利CN201310489397.0糖苷化反应需要原料价格高昂，本发明降低了实验成本，具有广阔的市场潜力。
(3)本发明方法较之前专利CN201310489350.4的方法，提高了最终产物的纯度。本发明最后一步纯化采用有机溶剂淋洗的方法，有效的除去了无机盐，同时避免了产品损失，进而提高了产品的纯度。
(4)本发明的合成方法所需原料简单易得，采用常规化学合成反应，适用于广泛推广使用。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显。
图1为7-去氮-7-碘-8-氮-2’-脱氧鸟嘌呤核苷的合成过程示意图。
图2为7-去氮-7-碘-8-氮-鸟嘌呤核苷合成过程示意图。
图3为7-去氮-7-碘-8-氮-2’-脱氧鸟嘌呤核苷合成dG(8-aza)TP(AP3)的过程示意图。
图4为7-去氮-7-碘-8-氮-鸟嘌呤核苷合成G(8-aza)TP(AP3)的过程示意图。
图5为dG(8-aza)TP(AP3)合成dG(8-aza)TP(AP3)-SS-TexasRed中的过程示意图。
图6为7-去氮-7-碘-8-氮-2’-脱氧鸟嘌呤核苷的1H-NMR。
图7为7-去氮-7-碘-8-氮-2’-脱氧鸟嘌呤核苷的13C-NMR。
图8为7-去氮-7-碘-8-氮-2’-脱氧鸟嘌呤核苷酸的31P-NMR。
图9为Texas Red-SH的HRMS谱图。
图10为dG(8-aza)TP(AP3)-SS-TexasRed的分析RP-HPLC谱图。
图11为dG(8-aza)TP(AP3)的DNA链延伸反应荧光扫描结果图。
图12为dG(8-aza)TP(AP3)-SS-TexasRed的DNA链延伸反应荧光扫描结果图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干调整和改进。这些都属于本发明的保护范围。本发明所用的原料、试剂均为市售AR、CP级。本发明所得中间产物及最终产物采用核磁共振波谱等进行表征；
实施例1、7-去氮-7-碘-8-氮-2’-脱氧鸟嘌呤核苷的合成方法
本实施例中式(Ⅰ1-iodine)化合物(即7-去氮-7-卤素-8-氮-鸟嘌呤核苷)的合成示意图如图1所示，具体合成方法分别包括如下步骤：
步骤一、
将2-氨基-4，6-二羟基嘧啶(12.5g，100mmol)溶于75mL POCl3和17.5mL无水DMF的混合液中，室温搅拌10min后，氮气保护，105℃回流1.5h，停止加热，冷却至室温后，旋出溶剂，固体溶于2L冰水，50℃下搅拌2h后过滤，并用水和乙酸乙酯洗涤，真空干燥，得淡黄色固体11.0g，产率57.6％。
1H NMR(400MHz，DMSO)：δ＝10.05(s，1H，-CHO)，8.49(brs，2H，-NH2).
步骤二、
将式(Ⅷ)化合物(2.4g，12.5mmol)加入37.5mL THF和12.5mL H2O混合溶液中，加热至50℃，加入水合肼(1.5g，25.2mmol)，50℃搅拌5min后，室温搅拌20min，加入100mL冰水搅拌15min，旋出THF后过滤，真空干燥，得黄色固体2.06g，产率97.6％。
1H NMR(400MHz，DMSO)：δ＝13.25(brs，1H，-NH)，7.94(s，1H，CH)，7.14(brs，2H.-NH2).
步骤三、
将式(Ⅶ)化合物(800mg，4.73mmol)加入12.5mL无水甲醇中，氮气保护，加入2.3mL5.4M甲醇钠/甲醇溶液，65℃回流2h后，加入7.5mL乙酸搅拌5min，旋出溶剂，真空干燥，得黄褐色固体745mg，产率95.4％。
1H NMR(400MHz，DMSO)：δ＝12.84(brs，1H，NH)，7.79(s，1H，CH)，6.64(brs，2H，-NH2)，3.96(s，3H，-CH3).
步骤四、
将式(V)化合物(675mg，4.09mmol)和乙酸钠(1.73g，21.08mmol)加入15mL水中，避光下，加入氯化碘(905mg，5.58mmol)，氮气保护，95℃回流2.5h后，加入20mL水和焦亚硫酸钠(1.1g，5.79mmol)，室温搅拌0.5h后过滤，真空干燥，得淡红色固体938mg，产率78.8％。
1H NMR(400MHz，DMSO)：δ＝13.13(brs，1H，NH)，6.80(brs，2H，-NH2)，3.97(s，3H，-CH3).
步骤五、当化合物Ⅵ中，R3为H时，具体反应式如下：
(Ⅲ1-iodine)
将式(Ⅳ-iodine)化合物(938mg，3.22mmol)加入3mL无水甲醇中，后加入1.25mL2.85M氢氧化钾/甲醇溶液，室温搅拌1min后，加入3mL甲苯，旋出溶剂，固体真空干燥后，加入3mL无水乙腈和1mL无水DMF混合溶液中，氮气保护，加入1-氯-3，5-二对氯苯甲酰氧基-2-脱氧-D-呋喃核糖(1.36g，3.16mmol)，室温搅拌24h后，旋出溶剂，柱层析[V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)＝5∶1]，得白色固体539mg，产率49.0％。
1H NMR(400MHz，DMSO)：δ＝8.04(t，4H，Ar，J＝8.7Hz)，7.63(dd，4H，Ar，J＝8.45.1Hz)，7.06(brs，2H，-NH2)，6.51(t，1H，OCHCH2，J＝6.6Hz)，5.72(d，1H，OCHCH，J＝2.7Hz)，4.47(m，3H，OCH2CH OCHCH)，3.98(s，3H，OCH3)，3.16(m，1H，CHCH2CH)，2.67(m，1H，CHCH2CH).
步骤六、
(Ⅱ1-iodine)
将式(Ⅲ1-iodine)化合物(480mg，0.704mmol)加入25mL无水甲醇中，后加入25mL5.4M甲醇钠/甲醇溶液，65℃回流反应18h后，冷却至零下10℃后过滤，用冷的甲醇洗涤，真空干燥，柱层析[V(二氯甲烷)∶V(甲醇)＝10∶1]，得白色固体237mg，产率83％。
1H NMR(400MHz，DMSO)：δ＝7.01(brs，2H，-NH2)，6.31(t，1H，OCHN，J＝6.7Hz)，5.23(d，1H，OCHCH2，J＝4.3Hz)，4.72(t，1H，OCHCH2，J＝5.7Hz)，4.35(brs，1H，-OH)，3.97(s，3H，OCH3)，3.74(brs，1H，-OH)，3.46(m，2H，OHCH2CH)，2.69(m，1H，CHCH2CH)，2.16(m，1H，CHCH2CH).
步骤七、
(Ⅰ1-iodine)
将式(Ⅱ1-iodine)化合物(76.8mg，0.188mmol)加入6.5mL2M氢氧化钠溶液和1.5mL二氧六环混合溶液中，105℃回流反应5h后，加入2mL乙酸，旋出溶剂，柱层析[V(二氯甲烷)∶V(甲醇)＝7∶1]，得白色固体44.8mg，即7-去氮-7-碘-8-氮-2’-脱氧鸟嘌呤核苷，产率60.6％。其1H-NMR、13C-NMR、31P-NMR谱图分别如图6、7、8所示。
1H NMR(400MHz，DMSO)：δ＝7.06(brs，2H，-NH2)，6.22(t，1H，OCHN，J＝6.5Hz)，5.20(s，1H，OCHCH)，4.73(s，1H，OCHCH2)，4.33(brs，1H，-OH)，3.74(dd，1H，-OH，J＝9.05.7Hz)，3.48(m，2H，OHCH2CH)，2.64(m，1H，CHCH2CH)，2.13(m，1H.CHCH2CH)
注：本方法同样适合7-去氮-7-溴-8-氮-2’-脱氧鸟嘌呤核苷(Ⅰ1-bromine)和7-去氮-7-氯-8-氮-2’-脱氧鸟嘌呤核苷(Ⅰ1-chlorine)的合成，不同之处在于步骤四反应时，用氯化溴或N-氯代丁二酰亚胺代替氯化碘即可，其它所有反应步骤和方法均相同。
实施例2、7-去氮-7-碘-8-氮-鸟嘌呤核苷的合成方法
本实施例中(Ⅰ2-iodine)的合成示意图如图2所示，具体合成方法分别包括如下步骤：
步骤一、当化合物Ⅵ中，R3为时，具体反应式如下：
(Ⅲ2-iodine)
将式(Ⅳ-iodine)化合物(879mg，3.02mmo1)加入3mL无水甲醇中，后加入1.25mL2.85M氢氧化钾/甲醇溶液，室温搅拌1min后，加入3mL甲苯，旋出溶剂，固体真空干燥后，加入3.5mL无水乙腈和1.5mL无水DMF混合溶液中，氮气保护，加入1-氯2，3，5-二对氯苯甲酰氧基-2-脱氧-D-呋喃核糖(1.79g，3.06mmol)，室温搅拌24h后，旋出溶剂，柱层析[V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)＝5∶1]，得白色固体1.32g，产率52.3％。
1H NMR(400MHz，DMSO)：δ＝8.05(t，6H，Ar，J＝8.7Hz)，7.62(dd，6H，Ar，J＝8.65.2Hz)，7.05(brs，2H，-NH2)，6.51(t，1H，OCHCH2，J＝6.5Hz)，5.74(d，1H，OCHCH，J＝3.4Hz)，4.54(m，3H，OCH2CH OCHCH)，4.02(s，3H，OCH3).
步骤二、
(Ⅱ2-iodine)
将式(Ⅲ2-iodine)化合物(628mg，0.75mmol)加入25mL无水甲醇中，后加入25mL5.4M甲醇钠/甲醇溶液，65℃回流反应18h后，冷却至零下10℃后过滤，用冷的甲醇洗涤，真空干燥，柱层析[V(二氯甲烷)∶V(甲醇)＝10∶1]，得白色固体241mg，产率76％。
1H NMR(400MHz，DMSO)：δ＝7.05(brs，2H，-NH2)，6.35(t，1H，OCHN，J＝6.7Hz)，5.32(d，1H，OCHCH2，J＝4.8Hz)，4.76(t，1H，OCHCH2，J＝5.4Hz)，4.41(brs，1H，-OH)，4.02(s，3H，OCH3)，3.69(brs，1H，-OH)，3.56(brs，1H，-OH)，3.32(m，2H.OHCH2CH).
步骤三、
(Ⅰ2-iodine)
将式(Ⅱ2-iodine)化合物(84.6mg，0.20mmol)加入6.5mL 2M氢氧化钠溶液和1.5mL二氧六环混合溶液中，105℃回流反应5h后，加入2mL乙酸，旋出溶剂，柱层析[V(二氯甲烷)∶V(甲醇)＝7∶1]，得白色固体53.8mg，即7-去氮-7-碘-8-氮-鸟嘌呤核苷，产率65.8％。
1H NMR(400MHz，DMSO)：δ＝7.05(brs，2H，-NH2)，6.32(t，1H，OCHN，J＝6.5Hz)，5.30(s，1H，OCHCH)，4.75(s，1H，OCHCH2)，4.43(brs，1H，-OH)，3.70(dd，1H，-OH，J＝9.05.7Hz)，3.55(brs，1H，-OH)，3.34(m，2H，OHCH2CH).
注：本方法同样适合7-去氮-7-溴-8-氮-鸟嘌呤核苷和7-去氮-7-氯-8-氮-鸟嘌呤核苷的合成，不同之处在于步骤一的式(Ⅳ)化合物的鸟嘌呤碱基的7位是溴或氯即可，其它所有反应步骤和方法均相同。
实施例3、7-去氮-7-碘-8-氮-2’-脱氧鸟嘌呤核苷在合成dG(8-aza)TP(AP 3 )中的 用途
本实施例中dG(8-aza)TP(AP3)的合成示意图如图3所示，具体合成方法分别包括如下步骤：
步骤一、
向一单口瓶中加入式(Ⅰ1-iodine)化合物(78.6mg，0.2mmol)，再称取CuI(9.5mg，0.5mmol)和Pd(PPh3)4(23.1mg，0.02mmol)加入反应瓶中，抽真空，氮气保护，铝箔包裹，加入5mL无水DMF，搅拌溶解，注入TEA(40.4mg，0.4mmol)和三氟乙酰丙炔胺(90.6mg，0.6mmol)，50℃搅拌12小时后，反应结束，旋出溶剂，将残余物溶于50mL乙酸乙酯，依次用饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，柱层析[V(正己烷)∶V(乙酸乙酯)＝3∶1]，得38.4mg白色固体，即dG(8-aza)(AP3)，产率46.2％。
1H NMR(400MHz，MeOD)：δ＝6.22(t，1H，OCHN，J＝6.5Hz)，4.73(s，1H，OCHCH2)，4.21(s，2H，NHCH2CO)，3.48(m，2H，OHCH2CH)，2.64(m，1H，CHCH2CH)，2.13(m，1H，CHCH2CH).
步骤二、
将化合物dG(8-aza)(AP3)真空干燥12h，在手套箱中分别称取化合物dG(8-aza)(AP3)(41.6mg，0.1mmol)、三正丁胺焦磷酸盐(110.3mg，0.2mmol)、2-氯-4H-1，3，2-苯并二氧磷-4-酮(40.5mg，0.2mmol)置于三个反应管中。将三正丁胺焦磷酸盐溶于0.25mL无水DMF中，再加入0.3mL新蒸的三正丁胺，常温搅拌半小时后，把反应液注入2-氯-4H-1，3，2-苯并二氧磷-4-酮的无水DMF(0.25mL)溶液中，常温搅拌半小时。然后将该混合液注入到2中，搅拌1.5h。加入1mL3％碘(9∶1Py/H2O)溶液，保持碘液颜色15min不退色。15min后加入2mL水，2h后，加入0.75mL3M NaCl溶液、20mL无水乙醇，-20℃冷冻12h，离心(20min，3200rpm)。倾去上清液，沉淀抽干溶剂后，加入浓氨水，室温搅拌24小时。减压旋出溶剂，出现棕色固体，RP-HPLC分析[条件：柱子：C18，5μm，4.6×250mm；流速：1mL/min；流动相：20mM TEAA和EtOH，0-20％EtOH(35min)，紫外检测器波长：254nm]，保留时间t＝16.6min。RP-HPLC分离[条件：柱子：C18，5μm，9.4×250mm；流速：4mL/min；流动相：20mM TEAA和MeOH，0-15％MeOH(25min)，紫外检测器波长：254nm]，保留时间t＝15-16min。NaCl/EtOH除去乙酸三乙胺盐，得15.8mg白色固体，即dG(8-aza)TP(AP3)，即所述7-去氮-7-丙炔胺-8-氮-2’-脱氧鸟嘌呤核苷酸，产率28.2％。
1H NMR(400MHz，D2O)：δ＝6.22(t，1H，OCHN，J＝6.5Hz)，4.73(s，1H，OCHCH2)，4.21(s，2H，NHCH2CO)，3.48(m，2H，OHCH2CH)，2.64(m，1H，CHCH2CH)，2.13(m，1H，CHCH2CH).
31P NMR(D2O，162MHz)：-10.65(s，1P)，-11.24(d，1P，J＝17.3Hz)，-22.91(s，1P).
注：本方法同样适合7-去氮-7-溴-8-氮-2’-脱氧鸟嘌呤核苷(Ⅰ1-bromine)和7-去氮-7-氯-8-氮-2’-脱氧鸟嘌呤核苷(Ⅰ1-chlorine)在合成dGTP(AP3)中的用途，不同之处在于步骤一时，用式(Ⅰ1-bromine)化合物和式(Ⅰ1-chlorine)化合物代替式(Ⅰ1-iodine)化合物即可，其它所有反应步骤和方法均相同。
实施例4、7-去氮-7-碘-8-氮-鸟嘌呤核苷在合成G(8-aza)TP(AP 3 )中的用途
本实施例中G(8-aza)TP(AP3)的合成示意图如图4所示，具体合成方法分别包括如下步骤：
步骤一、
向一单口瓶中加入式(Ⅰ2-iodine)化合物(81.8mg，0.2mmol)，再称取CuI(9.5mg，0.5mmol)和Pd(PPh3)4(23.1mg，0.02mmol)加入反应瓶中，抽真空，氮气保护，铝箔包裹，加入5mL无水DMF，搅拌溶解，注入TEA(40.5mg，0.4mmol)和三氟乙酰丙炔胺(90.6mg，0.6mmol)，50℃搅拌12小时后，反应结束，旋出溶剂，将残余物溶于50mL乙酸乙酯，依次用饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，柱层析[V(正己烷)∶V(乙酸乙酯)＝3∶1]，得34.2mg白色固体，即G(8-aza)(AP3)，即所述7-去氮-7-三氟乙酰丙炔胺-8-氮-鸟嘌呤核苷，产率39.6％。
1H NMR(400MHz，MeOD)：δ＝6.02(d，1H，OCHN，J＝6.5Hz)，4.75(t，1H，CHCHCH，J＝4.8Hz)，4.51(t，1H，CHCHCH，J＝4.8Hz)，4.43(q，1H，OCHCH2，J＝7.9Hz)，4.21(s，2H，NHCH2CO)，3.48(m，2H，OHCH2CH).
步骤二、
将化合物G(8-aza)(AP3)真空干燥12h，在手套箱中分别称取化合物G(8-aza)(AP3)(43.2mg，0.1mmol)、三正丁胺焦磷酸盐(109.7mg，0.2mmol)、2-氯-4H-1，3，2-苯并二氧磷-4-酮(40.7mg，0.2mmol)置于三个反应管中。将三正丁胺焦磷酸盐溶于0.25mL无水DMF中，再加入0.3mL新蒸的三正丁胺，常温搅拌半小时后，把反应液注入2-氯-4H-1，3，2-苯并二氧磷-4-酮的无水DMF(0.25mL)溶液中，常温搅拌半小时。然后将该混合液注入到2中，搅拌1.5h。加入1mL3％碘(9∶1Py/H2O)溶液，保持碘液颜色15min不退色。15min后加入2mL水，2h后，加入0.75mL3M NaCl溶液、20mL无水乙醇，-20℃冷冻12h，离心(20min，3200rpm)。倾去上清液，沉淀抽干溶剂后，加入浓氨水，室温搅拌24小时。减压旋出溶剂，出现棕色固体，RP-HPLC分析[条件：柱子：C18，5μm，4.6×250mm；流速：1mL/min；流动相：20mM TEAA和EtOH，0-20％EtOH(35min)，紫外检测器波长：254nm]，保留时间t＝14.2min。RP-HPLC分离[条件：柱子：C18，5μm，9.4×250mm；流速：4mL/min；流动相：20mM TEAA和MeOH，0-15％MeOH(25min)，紫外检测器波长：254nm]，保留时间t＝14-15min。NaCl/EtOH除去乙酸三乙胺盐，得15.6mg白色固体，即G(8-aza)TP(AP3)，即所述7-去氮-7-丙炔胺-8-氮-鸟嘌呤核苷酸，产率27.7％。
1H NMR(400MHz，D2O)：δ＝6.02(d，1H，OCHN，J＝6.4Hz)，4.75(t，1H，CHCHCH，J＝4.8Hz)，4.51(t，1H，CHCHCH，J＝4.8Hz)，4.28(m，2H，OCH2CH)，3.39(s，2H，NHCH2CO).
31P NMR(D2O，162MHz)：-11.2(t，1P，J＝10.1Hz)，-13.08(d，1P，J＝18.5Hz)，-21.22(d，1P，J＝19.8Hz).
注：本方法同样适合7-去氮-7-溴-8-氮-鸟嘌呤核苷(Ⅰ2-bromine)和7-去氮-7-氯-8-氮-鸟嘌呤核苷(Ⅰ2-chlorine)在合成GTP(AP3)中的用途，不同之处在于步骤一时，用式(Ⅰ2-bromine)化合物和式(Ⅰ2-chlorine)化合物代替式(Ⅰ2-iodine)化合物即可，其它所有反应步骤和方法均相同。
实施例5、7-去氮-7-碘-8-氮-2’-脱氧鸟嘌呤核苷在合成荧光素标记可逆终端dG (8-aza)TP(AP 3 )-SS-TexasRed中的用途
本实施例中dG(8-aza)TP(AP3)-SS-Texas Red的合成示意图如图5所示，具体合成方法分别包括如下步骤：
步骤一、
在10mL的单口瓶中加入dG(8-aza)TP(AP3)(5.6mg，0.01mmol)，再加入0.4mL0.1MNa2CO3/NaHCO3缓冲液(pH＝8.8)，室温搅拌，把SPDP(6.2mg，0.02mmol)溶于无水CH3CN(0.1mL)，加入上述溶液，再加入1mL TEA，室温搅拌反应1小时。冷冻干燥后，用1mL TEAAbuffer(100mM，pH＝7.0)溶解，RP-HPLC分析[条件：柱子：C18，5μm，4.6×250mm；流速：1mL/min；流动相：100mM TEAA和CH3CN，0-20％EtOH(35min)，紫外检测器波长：293nm]，保留时间t＝34.2min。RP-HPLC分离[条件：柱子：C18，5μm，9.4×250mm；流速：4mL/min；流动相：100mMTEAA和CH3CN，0-5％CH3CN(5min)，5％-20％CH3CN(30min)，紫外检测器波长：293nm]，保留时间t＝34min。分离后的产物冷冻干燥，NaCl/EtOH除去乙酸三乙胺盐，得2.4mg无色油状液体，即dGTP(AP3)-SPDP，产率33％。
1H NMR(400MHz，D2O)：δ＝8.25(d，1H，Ar，J＝7.4Hz)，7.63(t，1H，Ar，J＝7.5Hz)，7.39(d，1H，Ar，J＝7.5Hz)，7.18(t，1H，Ar，J＝7.9Hz)，6.22(t，1H，OCHN，J＝6.5Hz)，4.73(s，1H，OCHCH2)，4.21(s，2H，NHCH2CO)，3.48(m，2H，OHCH2CH)，2.84(m，2H，SCH2CH)，2.48(t，2H，SCH2CH2，J＝4.9Hz)，2.64(t，1H，CHCH2CH，J＝4.6Hz)，2.13(m，1H，CHCH2CH).
31P NMR(D2O，162MHz)：-9.49(s，1P)，-11.13(d，1P，J＝18.8Hz)，-22.52(d，1P.J＝24.1Hz).
步骤二、
将半胱胺(5mg，0.006mmol)溶于0.3mL0.1M Na2CO3/NaHCO3(pH＝8)缓冲液后，加入Texas-Red N-羟基琥珀酰亚胺酯(5mg，0.006mL)，常温避光搅拌0.5h，再加入0.086mL 1MDTT，室温搅拌0.5h。最后，反应用0.1％TFA(1mL)溶液淬灭，冷冻干燥后，RP-HPLC分析[条件：柱子：C18，5μm，4.6×250mm；流速：1mL/min；流动相：0.1％TFA水溶液和CH3CN，0-5％CH3CN(5min)，5％-50％CH3CN(25min)，可见检测器波长：585nm]，保留时间，异构体1＝32.8min，异构体2＝35.2min。RP-HPLC分离[条件：色谱柱：C18，5μm，9.4×250mm；流速：4mL/min；流动相：0.1％TFA水溶液和CH3CN，0-5％CH3CN(5min)，5％-50％CH3CN(25min)，可见检测器波长：585nm]，保留时间，异构体1＝32min，异构体2＝35min。冷冻干燥，得到两个异构体红色固体(异构体1，红色固体，1.2mg，产率26％；异构体2，红色固体，1.6mg，产率35％)。Texas Red-SH的HRMS谱图如图9所示，ESI-HRMS：calc for C39H45N4O7S3[M-H]-777.2450，found777.2483.
步骤三、
将dG(8-aza)TP(AP3)-SPDP(1mg，1.3μmol)溶于Na3PO4-EDTA缓冲液0.75mL[50mMNa3PO4，10mM EDTA(pH＝7.4)]和乙腈0.25mL的混合液中，然后加入Texas Red-SH(异构体1，1.2mg，1.5μmol)，避光下室温搅拌反应1h。反应产物RP-HPLC分离[条件：柱子：C18，5μm，9.4×250mm；流速：4mL/min；流动相：20mM TEAA和CH3CN，0-5％CH3CN(5min)，5％-17.5％CH3CN(25min)；紫外及可见检测波长：254nm和585nm，保留时间t＝27min]。冷冻干燥后，NaCl/EtOH除去乙酸三乙胺盐，得0.8mg棕色固体，即荧光素标记可逆终端dG(8-aza)TP(AP3)-SS-Texas Red，产率43％。RP-HPLC检测纯度(＞93％)[条件：柱子：C18，10μm，4.6×250mm；流速：1mL/min；流动相：100mM TEAA和CH3CN，0-5％CH3CN(5min)，5％-35％CH3CN(60min)；紫外及可见检测波长：254nm和：585nm。保留时间t＝62.5min]。分析RP-HPLC谱图如图10所示，具体数据见下表：
峰 保留时间 峰面积 峰高 峰面积％ 峰高％
1 61.824 1008830 59417 3.992 4.508
2 62.507 23534085 1219199 93.119 92.503
3 63.573 730340 39398 2.890 2.989
注：本方法同样适合7-去氮-7-碘-8-氮-鸟嘌呤核苷和在合成G(8-aza)TP(AP3)-SS-Texas Red中的用途，不同之处在于步骤一时，用7-去氮-7-碘-8-氮-鸟嘌呤核苷代替7-去氮-7-碘-8-氮-2’-脱氧鸟嘌呤核苷即可，其它所有反应步骤和方法均相同。
实施例6、dG(8-aza)TP(AP 3 )参与DNA链延伸反应
按照如下体系在eppendorf管里设立可逆终端的DNA链延伸反应：
所用测序模板序列如下(5’-3’)：
GAGGAAAGGGAAGGGAAAGGAAGG SEQ ID NO.1 Primer
CTCCTTTCCCTTCCCTTTCCTTCCCATGATCGCCATGTGC SEQ I D NO.2
其中SEQ ID NO.1的5’端用荧光素Dylight800标记。
实验步骤：
步骤一、
聚合酶灭活：将反应体系置于30℃水浴箱中处理15分钟，再置于75℃水浴中处理10分钟，灭活DNA聚合酶，冷却至室温。
步骤二、
分离纯化：酚氯仿抽提，乙醇沉淀浓缩为固体，加入20uL ddH2O和1uL0.1M NaOH，95℃处理5min，冰水浴冷却2min后，进行电泳分析。
步骤三、
电泳分析：Lane1：Primer(Oligol)；Lane2：含有dG(8-aza)TP(AP3)的链延伸产物；从图11中结果可以看出，dG(8-aza)TP(AP3)可以被DNA聚合酶识别，作为其底物参与DNA链的延伸，从而进一步证明所合成的dG(8-aza)TP(AP3)的结构是正确的。类似的实验证实，G(8-aza)TP(AP3)在RNA聚合酶存在下，可以参与RNA链的延伸反应，从而进一步证明其结构是正确的.
实施例7、可逆终端dG(8-aza)TP(AP 3 )-SS-TexasRed参与DNA链延伸反应
按照如下体系在eppendorf管里设立可逆终端的DNA链延伸反应：
所用测序模板序列如下：(5’-3’)
GAGGAAAGGGAAGGGAAAGGAAGG SEQ ID NO.1 Primer
CTCCTTTCCCTTCCCTTTCCTTCCCATGATCGCCATGTGC SEQ ID NO.2
其中SEQ ID NO.1的5’端用荧光素Dylight800标记。
实验步骤：
步骤一、
聚合酶灭活：将反应体系置于30℃水浴箱中处理15分钟，再置于75℃水浴中处理10分钟，灭活DNA聚合酶，冷却至室温。
步骤二、
分离纯化：酚氯仿抽提，乙醇沉淀浓缩为固体，加入20uL ddH2O和1uL 0.1M NaOH，95℃处理5min，冰水浴冷却2min后，进行电泳分析。
步骤三、
电泳分析：Lane1：Primer(oligol)；Lane2：含有dG(8-aza)TP(AP3)-SS-TexasRed的链延伸产物；从图中结果可以看出，dG(8-aza)TP(AP3)-SS-TexasRed可以被DNA聚合酶识别，作为其底物参与DNA链的延伸，从而进一步证明所合成的dG(8-aza)TP(AP3)-SS-TexasRed的结构是正确的，相应的该试剂可以用于DNA测序研究与应用.在RNA聚合酶存在下，G(8-aza)TP(AP3)-SS-Texas Red同样可以参与RNA链的延伸反应，从而进一步证明其结构是正确的.
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。

Claims (6)

1.一种7-去氮-7-丙炔胺-8-氮-2'-脱氧鸟嘌呤核苷酸的合成方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
A、式(Ⅲ)化合物在碱性条件下去保护基得式(Ⅱ)化合物；
B、所述式(Ⅱ)化合物在碱性条件下去甲基得式(Ⅰ)化合物，即所述7-去氮-7-卤素-8-氮-脱氧鸟嘌呤核苷；
其中，R1为H，R2为I、Br或Cl，R3为H；所述在碱性条件下去甲基是在氢氧化钠和二氧六环存在的条件下进行的；
C、化合物dG(8-aza)(AP3)的合成：在CuI、Pd(PPh3)4和TEA存在的条件下，三氟乙酰丙炔胺和式(Ⅰ)化合物反应，得化合物dG(8-aza)(AP3)，式(Ⅰ)中R1为H，R2为I、Br或Cl，
其中，所述式(Ⅰ)化合物、三氟乙酰丙炔胺、CuI、Pd(PPh3)4和TEA的摩尔比为1:(2～3):0.072:0.025:(1.5～2)；
D、化合物dG(8-aza)TP(AP3)的合成：化合物dG(8-aza)(AP3)与三正丁胺焦磷酸盐、2-氯-4H-1,3,2-苯并二氧磷-4-酮,在TEA和I2存在的条件下反应，反应产物去保护，得化合物dG(8-aza)TP(AP3)，即所述7-去氮-7-丙炔胺-8-氮-2'-脱氧鸟嘌呤核苷酸，
其中，所述三正丁胺焦磷酸盐、2-氯-4H-1,3,2-苯并二氧磷-4-酮和化合物dG(8-aza)(AP3)的摩尔比为2:2:1。
2.一种7-去氮-7-丙炔胺-8-氮-鸟嘌呤核苷酸的合成方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
A、式(Ⅲ)化合物在碱性条件下去保护基得式(Ⅱ)化合物；
B、所述式(Ⅱ)化合物在碱性条件下去甲基得式(Ⅰ)化合物，即所述7-去氮-7-卤素-8-氮-鸟嘌呤核苷；
其中，R1为OH，R2为I、Br或Cl，R3为所述在碱性条件下去甲基是在氢氧化钠和二氧六环存在的条件下进行的；
C、化合物G(8-aza)(AP3)的合成：在CuI、Pd(PPh3)4和TEA存在的条件下，三氟乙酰丙炔胺和式(Ⅰ)化合物反应，得化合物G(8-aza)(AP3)，式(Ⅰ)中R1为OH，R2为I、Br或Cl，
其中，所述式(Ⅰ)化合物、三氟乙酰丙炔胺、CuI、Pd(PPh3)4和TEA的摩尔比为1:(2～3):0.072:0.025:(1.5～2)；
D、化合物G(8-aza)TP(AP3)的合成：化合物G(8-aza)(AP3)与三正丁胺焦磷酸盐、2-氯-4H-1,3,2-苯并二氧磷-4-酮,在TEA和I2存在的条件下反应，反应产物去保护，得化合物G(8-aza)TP(AP3)，即所述7-去氮-7-丙炔胺-8-氮-鸟嘌呤核苷酸，
其中，所述三正丁胺焦磷酸盐、2-氯-4H-1,3,2-苯并二氧磷-4-酮和G(8-aza)(AP3)的摩尔比为2:2:1。
3.一种如权利要求1所述的合成方法制得的7-去氮-7-丙炔胺-8-氮-2'-脱氧鸟嘌呤核苷酸在参与DNA链延伸反应中的用途。
4.一种如权利要求1所述的合成方法制得的7-去氮-7-丙炔胺-8-氮-2'-脱氧鸟嘌呤核苷酸在合成荧光素标记氮杂化鸟嘌呤核苷酸作为可逆终端中的用途。
5.一种荧光素标记氮杂化鸟嘌呤核苷酸可逆终端dG(8-aza)TP(AP3)-SS-Texas Red的合成方法，其特征在于，包括如下步骤：
A、化合物dG(8-aza)(AP3)-SPDP的合成：在TEA存在的条件下，如权利要求1所述的化合物dG(8-aza)(AP3)和SPDP反应，得化合物dG(8-aza)(AP3)-SPDP，
其中，所述dG(8-aza)(AP3)、SPDP、和TEA的摩尔比为1:(1～3):(1.5～2)；
B、化合物Texas Red-SH的合成：在DTT存在的条件下，Texas-Red N-羟基琥珀酰亚胺酯和半胱胺反应，得化合物Texas Red-SH，
其中，所述Texas-Red N-羟基琥珀酰亚胺酯、半胱胺和DTT的摩尔比为1:(1～2):(1～3)；
C、化合物dG(8-aza)TP(AP3)-SS-Texas Red的合成：化合物dG(8-aza)TP(AP3)-SPDP与化合物Texas Red-SH在室温避光下反应，得所述荧光素标记氮杂化鸟嘌呤核苷酸可逆终端dG(8-aza)TP(AP3)-SS-Texas Red，
其中，所述化合物dG(8-aza)TP(AP3)-SPDP与化合物Texas Red-SH的摩尔比为1:(0.5～2)。
6.一种如权利要求5所述的合成方法制得的荧光素标记氮杂化鸟嘌呤核苷酸可逆终端dG(8-aza)TP(AP3)-SS-Texas Red在DNA测序中的用途。
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