WO2022081046A1 - Химическое соединение с триазиновой группой и способ его получения - Google Patents

Химическое соединение с триазиновой группой и способ его получения Download PDF

Info

Publication number
WO2022081046A1
WO2022081046A1 PCT/RU2021/050339 RU2021050339W WO2022081046A1 WO 2022081046 A1 WO2022081046 A1 WO 2022081046A1 RU 2021050339 W RU2021050339 W RU 2021050339W WO 2022081046 A1 WO2022081046 A1 WO 2022081046A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
oligonucleotide
group
oligonucleotides
modified
groups
Prior art date
Application number
PCT/RU2021/050339
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Максим Сергеевич КУПРЮШКИН
Тимофей Дмитриевич Жарков
Илья Сергеевич Довыденко
Олег Владимирович Марков
Original Assignee
Максим Сергеевич КУПРЮШКИН
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from RU2020133433A external-priority patent/RU2799452C2/ru
Application filed by Максим Сергеевич КУПРЮШКИН filed Critical Максим Сергеевич КУПРЮШКИН
Publication of WO2022081046A1 publication Critical patent/WO2022081046A1/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/712—Nucleic acids or oligonucleotides having modified sugars, i.e. other than ribose or 2'-deoxyribose
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups

Definitions

  • the present invention relates to new compounds and methods for their preparation in the field of nucleotide chemistry.
  • the present invention relates to nucleotides and oligonucleotides containing a modified phosphate group, and a method for their preparation.
  • the present invention can be used in cytological studies, in the diagnosis of DNA- or RNA-containing pathogens, in gene therapy, as well as in the treatment of various diseases of a bacterial and viral nature, including COVID-19.
  • Nucleic acid (NA) derivatives such as synthetic oligonucleotides modified with various additional functional groups, are widely used as research tools in various fields of molecular biology, biotechnology, and medicine.
  • One of the most promising directions can be considered the use of oligonucleotides as therapeutic agents - more than 100 drugs have already been approved by the FDA (Food & Drug Administration, USA) and more than 150 are at various stages of clinical trials.
  • oligonucleotide drugs approved for use in the clinic include the angiogenesis-suppressing aptamer Macugene (Pegaptanib sodium), Exondys 51 (eteplirsen) and Vyondys 53 (golodirsen) for the treatment of Duchenne muscular dystrophy, Spinraza (nusinersen) for the treatment of spinal muscular atrophy, and dr (https://www.fda.gov/drugs/development-approval-process-drugs/drug- approvals-and-atabases).
  • Macugene Pegaptanib sodium
  • Exondys 51 eteplirsen
  • Vyondys 53 golodirsen
  • Spinraza nusinersen
  • dr https://www.fda.gov/drugs/development-approval-process-drugs/drug- approvals-and-atabases.
  • oligonucleotide drugs are directed to the treatment of diseases caused by mutations in one or more genes of the patient. Accordingly, such drugs are aimed at adjusting the expression of genes responsible for the development of the disease.
  • Oligonucleotides are capable of inhibiting transcription, translation, or modulating the activity of a target gene product. Transcription is inhibited by DNA binding by triplex-forming oligonucleotides [1], including peptide nucleic acids (PNA) [2]. Translation inhibition, or the antisense (antisense) mechanism, is carried out by blocking translation from a specific mRNA [3]. Modulation of the activity of the protein encoded by the target gene, occurs due to the binding of the oligonucleotide to the protein itself or to a low molecular weight cofactor, for example, in the case of aptamers [4].
  • PNA peptide nucleic acids
  • oligonucleotides act by an antisense mechanism by binding to a specific mRNA in the cell, however, the principle and conditions of translation inhibition differ for different types of oligonucleotides.
  • small interfering RNAs siRNAs
  • mRNA messenger RNA
  • NK enzymes - catalytic nucleic acids which are oligonucleotides with a characteristic secondary structure, also cause mRNA cleavage.
  • NA enzymes do not require cellular proteins [6].
  • oligonucleotides bind to mRNA and suppress translation, acting on the principle of steric blocking [7]. These include many analogs of oligonucleotides with a modified ribose residue: 2'-fluorine [8], 2'-O-methyl [9], 2'-O-P-methoxyethyl (2'-MOE) [10], LNA [ eleven]. Analogues with an uncharged internucleotide phosphate group: methylphosphonates [12], phosphotriesters [13], and phosphoramides [14] also act on the principle of steric blocking.
  • NA derivatives where ribose and phosphate groups are simultaneously modified, for example, peptide nucleic acids (PNA) [15] and morpholine oligonucleotides (PMO) [16].
  • PNA peptide nucleic acids
  • PMO morpholine oligonucleotides
  • Oligonucleotide preparations are also being developed and used to treat diseases caused by viruses such as human cytomegalovirus (HCMV), HIV (HIV-1), hepatitis B (HBV), hepatitis C (HCV), Ebola virus, respiratory syncytial virus (RSV ), the SARS-CoV coronavirus causing severe acute respiratory syndrome (SARS), etc. [17-24].
  • viruses such as human cytomegalovirus (HCMV), HIV (HIV-1), hepatitis B (HBV), hepatitis C (HCV), Ebola virus, respiratory syncytial virus (RSV ), the SARS-CoV coronavirus causing severe acute respiratory syndrome (SARS), etc. [17-24].
  • viruses such as human cytomegalovirus (HCMV), HIV (HIV-1), hepatitis B (HBV), hepatitis C (HCV), Ebola virus, respiratory syncytial virus (RSV ), the SARS-CoV cor
  • antisense oligonucleotides are being developed that are complementary to the FSE (frameshift stimulation element), a highly conserved region of the SARS-CoV-2 genome [25].
  • FSE frameshift stimulation element
  • the use of oligonucleotides to combat the SARS-CoV-2 coronavirus is especially relevant due to the complexity obtaining an effective vaccine due to the high rate of mutation of the genes encoding the envelope proteins of the virus.
  • oligonucleotides must have therapeutic potential.
  • the therapeutic potential is understood as a whole range of useful properties necessary to achieve a pronounced therapeutic effect.
  • therapeutic oligonucleotides should have the following properties:
  • High stability allows the drug to stay in the body longer, achieving the desired therapeutic effect with a minimum number of injections of the drug.
  • high stability in biological media provides a variety of ways to administer the drug.
  • An accessible method for preparing compounds can be considered one that is compatible with existing and widely used synthesis protocols in various fields of technology.
  • nucleic acids and their derivatives Being a popular and rapidly developing field, the chemistry of automatic synthesis of nucleic acids and their derivatives is constantly updated with new ones, including commercially available components for oligonucleotide synthesis, such as various nucleoside and non-nucleoside monomers, various modifiers, in particular fluorescent labels and fluorescence quenchers, as well as various protective groups.
  • oligonucleotide synthesis such as various nucleoside and non-nucleoside monomers, various modifiers, in particular fluorescent labels and fluorescence quenchers, as well as various protective groups.
  • Natural oligonucleotides although capable of forming selective complementary complexes with a biological target, while not being a toxic class of compounds for the body, do not have sufficient stability in biological media and poorly penetrate cells.
  • various chemical modifications are introduced into the composition of oligonucleotides.
  • the introduction of various chemical modifications into the composition of the oligonucleotide makes it possible to increase the efficiency of its penetration through the cell membrane, resistance to enzymatic hydrolysis, stability in a wide pH range, specificity and stability of the complex formed with the complementary site of the target nucleic acid, while maintaining a low level of toxicity. for the organism [26].
  • In the structure of the oligonucleotide there are several positions for modification - nitrogenous bases, a ribose residue, an internucleotide phosphate group.
  • Modification at the internucleotide phosphate group compares favorably with other positions for the introduction of non-natural chemical groups.
  • the introduction of modifications through the phosphate group of the backbone slightly affects the fundamental property of oligonucleotides - the ability to form strong and specific complexes with a biological target. In this case, the introduction of various groups can endow the created compound with new properties in a wide range.
  • Various modifications of internucleotide phosphate groups are known, for example, methylphosphonates [27], thiophosphates [28,29], dithiophosphates [30], boranophosphates [31], (W01991008213A1, publ. 06/13/1991; IPC A61K31 / 69, A61K31 /70, A61K31/7135, A61P29/00, A61P3/06, A61P35/00, C07H21/00, C07H21/04, C07H23/00, C12N15/113, C12Q1/68), amidophosphates, phosphorylguanidines and others.
  • Methylphosphonate oligonucleotides are highly resistant to enzymatic hydrolysis by nucleases, as well as a slightly increased degree of complementary complex formation. At the same time, methylphosphonate oligonucleotides are chemically unstable and easily subject to alkaline hydrolysis. In addition, methods of obtaining methylphosphonate oligonucleotides are used other than amidophosphite synthesis, which reduces the efficiency of their production and deprives manufacturers of the possibility of using a wide range of commercially available monomers and modifiers. The need to use special monomers significantly reduces the prospects of methylphosphonate oligonucleotides as a platform for creating therapeutic drugs [32, 33].
  • Boranophosphate oligonucleotides have enhanced enzymatic and chemical stability. Unlike methylphosphonate modifications, boranophosphate modifications do not lead to the disappearance of the negative charge on the phosphate group. As a result, methylphosphonate oligonucleotides are able to recruit RNase H to cleave the hybrid DNA/RNA complex. This mechanism of action on the target target, in contrast to simple steric blocking, allows the therapeutic agent to work in the catalytic mode. However, the complementary complexes formed with such modified oligonucleotides are less stable compared to natural oligonucleotides. In addition, methods for producing boranophosphate oligonucleotides are also incompatible with amidophosite synthesis, and also require the preparation of a set of special monomers [34, 35].
  • Amidophosphate oligonucleotides contain an N-substituted amino group instead of an oxygen atom in the phosphate group. Due to the neutralization of the negative charge of the phosphate group, amidophosphate oligonucleotides are more resistant to the action of nucleases. Substituents at the amino group can be a source of introduction of various functional groups into the composition of the created oligonucleotide. However, the main disadvantage of amidophosphates, which limits their use, is the susceptibility to acid hydrolysis due to the protonation of the amino group [36-38].
  • Thiophosphate oligonucleotides are one of the few classes of compounds that have found application in the field of creating therapeutic NA. Thiophosphate oligonucleotides are stable to the action of cellular nucleases, their synthesis is compatible with the protocols of solid-phase phosphoramide synthesis. However, this type of modification does not imply any variety of introduced groups, except for the replacement of an oxygen atom by a sulfur atom. Thus, a change in properties within this class can only be achieved by varying the amount and site of introduction of thiophosphate units. Also, thiophosphate oligonucleotides have a relatively high toxicity and somewhat reduced ability to form complexes with NA, compared to unmodified oligonucleotides. Probably, it is these shortcomings that hinder the wide use of this class of compounds as therapeutic agents [39].
  • Dithiophosphate oligonucleotides are capable of activating RNase H, although to a lesser extent than thiophosphate oligonucleotides. At the same time, dithiophosphate oligonucleotides are even more resistant to the action of nucleases. However, due to the increased sulfur content, dithiophosphate oligonucleotides are less specific in inhibiting translation due to stronger protein binding. In addition, their chemical synthesis is more complicated than that of thiophosphates.
  • Phosphate-modified oligonucleotides may also include morpholine oligonucleotides in which the entire ribose-phosphate backbone has been changed to a morpholine-phosphordiamide backbone.
  • a backbone is extremely far from natural, which excludes the possibility of interaction of morpholine oligonucleotides with any NA-dependent enzymes, including RNase H.
  • Morpholine oligonucleotides are stable to the action of nucleases and are also capable of forming fairly strong complementary complexes with NA. However, this class of compounds contains only one representative, which makes it extremely difficult to vary the properties morpholine oligonucleotides.
  • morpholine oligonucleotides require specialized equipment, monomers, and reagents.
  • the methods used to obtain morpholine oligonucleotides are incompatible with the standard amidophosphite synthesis [16,40,41].
  • the recently discovered class of phosphorylguanidine oligonucleotides is also a class of compounds containing a modification at the internucleotide phosphate group (RU2708237C2, publ. 05.12.2019; IPC: A61KZ 1/712, A61P31/12, C07F9/24, C07H19/10, C07H19/20 ). In this case, this is the residue of a substituted or unsubstituted guanidine, which makes the resulting phosphorylguanidine group electrically neutral.
  • Representatives of this class of oligonucleotides are stable to the action of cellular nucleases and stable in a wide pH range.
  • Alkyl is a branched or unbranched cyclic or acyclic substituent based on saturated hydrocarbons with a free valency on the carbon atom.
  • Cm alkyl groups include but are not limited to methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, or t-butyl radicals.
  • Alkynyl is a branched or unbranched acyclic substituent with a free valency on a carbon atom based on unsaturated hydrocarbons containing at least one carbon-carbon triple bond.
  • the alkynyl may or may not contain double carbon-carbon bonds.
  • Aryl - refers to an aromatic or heteroaromatic organic group with a free valence on a carbon atom or, in some embodiments, on a heteroatom.
  • aromatic groups may include, but are not limited to, phenyl and naphthyl (1-naphthyl or 2-naphthyl).
  • Aryl groups can be monocyclic or polycyclic.
  • a protecting group is a chemical group that is used to temporarily block a reactive site in an organic compound and can be removed under certain conditions.
  • Linker is a non-nucleotide chemical group that can connect adjacent nucleotides in an oligonucleotide (internucleotide linker); or connect the nucleotide or its analogue with another non-nucleotide group; or connect the oligonucleotide or its analogue with a polymeric carrier; or couple the nucleoside or analog thereof to the polymeric carrier.
  • a nucleoside is a chemical compound containing a sugar residue and a heterocyclic base residue.
  • nucleosides may include, but are not limited to, ribose, 2-deoxyribose, arabinose, and the like.
  • heterocyclic bases may include, but are not limited to, thymine, uracil, cytosine, adenine, guanine, purine, hypoxanthine, xanthine, 2-aminopurine, 2,6-diaminopurine, 5-methylcytosine.
  • 5-fluoro cytosine 5-chlorocytosine. 5-bromocytosine. 5-iodocytosine. 2-thiouracil, 4-thiouracil, 2-thiothymine, 4-thiothymine, 5-propynyluracil. 5-propynylcytosine, 7-deazaadenine, 7-deazaguanine, 7-deaza-8-azaadenine, 7-deaza-8-azaguanine, isocytosine, isoguanine, etc.
  • nucleoside can also mean a protected nucleoside, a nucleoside analog, and a protected nucleoside analog.
  • nucleoside analogues in which the sugar residue is replaced by a different ring structure may include, but are not limited to, morpholino oligonucleotide (PMO) and tricyclo-DNA monomers.
  • PMO morpholino oligonucleotide
  • Examples of nucleoside analogues, in which the sugar residue is replaced by another acyclic structure may include, among other things, peptide nucleic acids (PNA) and glyceric nucleic acids (GNA) monomers.
  • nucleoside analog is used to refer to a nucleoside containing a chemical modification, for example, a substituent on a sugar residue and/or on a heterocyclic base.
  • nucleoside analogs may include, but are not limited to, 2'-substituted 2'-deoxynucleosides such as 2'-amino and 2'-fluoro, and ribonucleosides such as 2'-O-methyl, 2'-O -allyl, 2'-O- - methoxyethylribonucleosides, "closed" nucleosides (LNA), etc.
  • nucleoside analogs may include analogs in which the sugar residue is replaced by a morpholine ring, as shown in the formula below:
  • Base is a heterocyclic base.
  • a protected nucleoside is a nucleoside containing one or more protective groups.
  • a nucleoside analogue may also be protected.
  • a DMTr nucleoside contains a DMTr protecting group at the 5' end.
  • a nucleotide is a chemical compound containing a nucleoside and at least one phosphate group attached to it by a covalent bond.
  • a covalent bond independently and without limitation, is an ether bond between the 3', 2' or 5' hydroxyl group of the nucleoside and the phosphate group.
  • nucleotide may also refer to a nucleotide analog.
  • a nucleotide analog is a chemical compound containing a nucleoside analog and at least one phosphate group attached to it by a covalent bond.
  • nucleotide analogues with a sugar residue replaced may include, but are not limited to, 2'-substituted 2'-deoxynucleotides such as 2'-amino and 2'-fluoro, and ribonucleotides such as 2'-O-methyl, 2'- O-allyl, 2'-O-P-methoxyethylribonucleotides, "closed" nucleotides (LNA), morpholino nucleotides, tricyclodeoxyribonucleotides, glycol nucleotides.
  • An oligonucleotide is a chemical compound consisting of two or more nucleotides linked together to form a polymer chain.
  • the oligonucleotide may be a DNA or RNA fragment.
  • the oligonucleotides may be single stranded or double stranded, ie. contain two strands with a high degree of complementarity.
  • any or both of the circuits can be modified according to the present invention.
  • the key feature of an oligonucleotide is the ability to form stable duplexes with complementary regions of NA and their derivatives due to non-covalent bonding.
  • An example of such a non-covalent bond is the hydrogen bond.
  • oligonucleotide can also mean an analog of an oligonucleotide or a modified oligonucleotide containing a modification not covered by the present invention.
  • An oligonucleotide analog is a variant of an oligonucleotide that includes at least one nucleotide analog, and the total number of nucleotides and/or nucleotide analogs is two or more.
  • the oligonucleotide analog may consist entirely of nucleotide analogs.
  • the oligonucleotide analogue may include at least one phosphate group, which can be modified according to the present invention.
  • Oligonucleotide analogs may contain, for example, chemical moieties at the 3' and/or 5' end of the oligonucleotide (e.g., the 3'-"inverted" nucleoside residue), residues of a high molecular weight compound of low immunogenicity (e.g., polyethylene glycol), small molecular weight compounds (eg, cholesterol), peptides (eg, cell entry peptides), phosphate groups with modifications not covered by the present invention (eg, a thiophosphate group). Oligonucleotide analogs may also contain modified heterocyclic bases.
  • chemical moieties at the 3' and/or 5' end of the oligonucleotide e.g., the 3'-"inverted" nucleoside residue
  • residues of a high molecular weight compound of low immunogenicity e.g., polyethylene glycol
  • small molecular weight compounds e.g, cholesterol
  • peptides eg, cell
  • chemical modification of heterocyclic bases may include, but is not limited to, substitution at C-5 of a pyrimidine nucleotide, substitution at C-7 of a 7-deazapurine nucleotide, substitution at an exocyclic amino group, introduction of 4-thiouracil residues, 5-bromo- and/ or 5-ioduracil, etc.
  • Oligonucleotide analogs may also contain modified sugar residues.
  • modification of a sugar residue may include the introduction of a 2'-aminonucleotide, a 2'-fluoronucleotide, a 2'-O-methylribonucleotide, a 2'-O-allylribonucleotide, a 2'-O-
  • a 2'-aminonucleotide a 2'-fluoronucleotide
  • a 2'-O-methylribonucleotide a 2'-O-allylribonucleotide
  • 3-methoxyethylribonucleotide a "locked" nucleotide (locked nucleic acid, LNA) and/or tricyclo-DNA nucleotide.
  • the bonds between the central phosphorus atom in the phosphate group can be carried out, inter alia, through an oxygen atom (ordinary phosphate), a nitrogen atom (N3'-P5' phosphoramide) or a sulfur atom (3'-thiophosphate); accordingly, the 3'- and/or 5'-terminus of the nucleoside may terminate, among other things, with a hydroxyl group, as in a natural nucleoside, a 3'-amino group (N3'-P5' phosphoramide) or a 3'-mercapto group (3'-thiophosphate ).
  • oligonucleotide analogs may also include, but are not limited to, thiophosphates (PS), selenophosphates, dithiophosphates, phosphoramides, boranophosphates, phosphorodiamide derivatives of morpholino oligonucleotides (PMOs), tricyclo-DNA, phosphorylguanidine oligonucleotides (PGOs), and peptide nucleic acids (PNAs).
  • PNA thiophosphates
  • PMOs morpholino oligonucleotides
  • PGOs phosphorylguanidine oligonucleotides
  • PNAs peptide nucleic acids
  • PNA peptide nucleic acids
  • a protected oligonucleotide is an oligonucleotide containing one or more protective groups.
  • Phosphate group - A phosphoric acid residue of H3PO4 in which one or more hydrogen atoms are replaced by an organic radical to give a phosphomonoester, phosphodiester, or phosphotriester, respectively.
  • the term phosphate group may also refer to a modified phosphate group.
  • a modified phosphate group is a phosphate group in which any of the oxygen atoms is replaced by any chemical group.
  • substituents include, but are not limited to, sulfur atoms, selenium atoms, an imino group (-NHR), a borane residue (-BH3'), a substituted or unsubstituted guanidine residue.
  • Preferred examples of the modified phosphate group are thiophosphate group, phosphoramide group, phosphorylguanidine group.
  • the final release is the removal of protective groups and the cleavage of the oligonucleotide or its analogue from the solid-phase carrier (in the case when the method for obtaining the oligonucleotide or its analogue is implemented in the solid-phase version).
  • Therapeutic oligonucleotide an oligonucleotide or an oligonucleotide analogue with therapeutic potential, 5-1000 nucleotides in length, used as a drug in the treatment of cancer, genomic disorders and infectious diseases of various nature, for example, as ASO for inhibition of translation (siRNA, miRNA) , for splicing modulation due to exon skipping, for genotype correction using the CRISPR/Cas method, and also as aptamers for specific inhibition of target proteins or targeted drug transport.
  • ASO inhibition of translation
  • miRNA miRNA
  • splicing modulation due to exon skipping for genotype correction using the CRISPR/Cas method
  • aptamers for specific inhibition of target proteins or targeted drug transport.
  • NA - nucleic acid DNA or RNA
  • HepG2 is a cell line derived from human hepatocellular carcinoma
  • IMDM - Iscove's Modified Dulbecco's Medium mammalian cell culture medium
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle's Medium
  • additional amino acids and vitamins sodium pyruvate
  • HEPES 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid
  • potassium nitrate instead of iron nitrate.
  • ME - International Unit a unit of measurement of the dose of a substance based on its biological activity. The amounts of a substance in 1 IU are different for different classes of substances. Units of action, ED, most often coincide with ME.
  • MEM - Minimum Essential Medium Needle medium; medium for culturing cell cultures, contains a buffer solution to maintain an optimal pH of 7.4, glucose, amino acids, vitamins and other substances.
  • Opti-MEM - cell culture medium is a modification of the minimum MEM recommended for transfection.
  • PBS - Phosphate buffered saline, isotonic sodium phosphate buffer which is an aqueous salt solution containing sodium chloride, sodium hydrogen phosphate, potassium chloride and potassium dihydrogen phosphate.
  • the osmolarity and concentration of ions in the solution approximately correspond to the concentrations in the human body.
  • PNA - peptide nucleic acid usually refers to analogs of oligonucleotides in which, among other things, phosphate groups are replaced by peptide bonds.
  • peptide nucleic acids may also include compounds that contain modified phosphate groups, which are the subject of the present invention. Thus, it should be considered that such compounds can also be covered by this invention.
  • the objective of the present invention is to create compounds with therapeutic potential, as well as to develop an affordable method for their preparation.
  • substituent Z is selected from the group: -OH, -SH, -SeH, -NHR N , -O-PG, -S-PG, -Se-PG or -N(PG)R N
  • X is selected from the group consisting of the 5'-O-terminus of the nucleoside or oligonucleotide
  • Y is selected from the group consisting of the 3'-O-terminus of the nucleoside or oligonucleotide, -H, -OH, -SH , -NHR N , -O-PG or -S-PG, linker, monophosphate or diphosphate.
  • Y is selected from the group consisting of the 5'-O-terminus of the nucleoside or oligonucleotide
  • X is selected from the group consisting of the 3'-O-terminus of the nucleoside or oligonucleotide, -H, -OH, -SH , -NHR N , -O-PG or -S-PG, linker, monophosphate or diphosphate.
  • the substituents R 1 , R 2 , R 3 R 4 are selected from the range — H, — C
  • the lipophilicity and charge of the claimed compounds can be widely varied. In this way it is possible to modulate the parameters of biodistribution in the body, in particular the ability to penetrate into a certain cell type. This can be used to create targeted therapeutic drugs.
  • the rest of the triazine group imparts chemical and enzymatic stability to the claimed compounds.
  • the phosphate group modified according to the present invention is electrically neutral, which increases the ability of the claimed compounds to penetrate the cell membrane.
  • the subject of the present invention may be an oligonucleotide comprising at least one modified phosphate group corresponding to the formula Fx: where - indicates the place of attachment of the substituents corresponding to the oligonucleotide.
  • the subject of the present invention is also a method for producing a compound corresponding to the formula (F0).
  • the method consists in reacting a trivalent phosphorus derivative of formula (F1) with an azidotriazine of formula (F2) to obtain a compound of formula (F3), followed by treatment with HNR'R 2 amines. HNR 3 R 4 or HNR X R Y .
  • the substituents R x and R Y will be converted to substituents R 1 , R 2 , R 3 , R 4 using known in the art transformation reactions of the corresponding reactive groups that make up R x and R Y .
  • a and B can be independently selected from -NR?R 2 , -NR 3 R 4 , -NR X R Y , -Q.
  • Q is a group capable of undergoing substitution reactions.
  • Q is selected from the range: -OR, -OC(O)R, -OS(O)2R, -CN, -Cl, -Br, -I, -F, -N3.
  • the Q group can be replaced by -NR X R 2 , -NR 3 R 4 , -NR X R Y in reaction with the corresponding amine INR'R 2 , HNR 3 R 4 , HNR X R Y .
  • A -NR X R 2
  • B -NR 3 R 4 .
  • obtaining a compound corresponding to the formula (F0) does not require additional chemical transformations.
  • the Q group is replaced by -NR 1 R 2 , -NR 3 R 4 , -NR X R Y in reaction with the corresponding amine HNR X R 2 , HNR 3 R 4 , HNR X R Y .
  • the substitution can be carried out both in the composition of the compound of formula (F2) and in the composition of the compound of formula (F3).
  • the substituents R x and R Y contain reactive centers, which are further subjected to a chemical transformation or a sequence of chemical transformations, bringing the structures of the substituents R x and R Y to the structures R 1 , R 2 , R 3 , R 4 .
  • the transformation of R x , R Y into R 1 , R 2 , R 3 or R 4 can be carried out both in the composition of the compound of formula (F2) and in the composition of the compound of formula (F3).
  • R 1 , R 2 , R 3 , R 4 , R x and R Y can be broadly defined using the corresponding commercial and separately synthesized amines HNR ⁇ 2 , HNR 3 R 4 and HNR X R Y , which provides the flexibility of the chosen method obtaining and variability of the resulting class of compounds with the general formula (F0). While R x and R Y can be converted to R 1 , R 2 , R 3 or R 4 in several successive steps. Such a multi-stage transformation of R x and R Y also makes it possible to obtain a wide variety of claimed compounds without complicating the process.
  • the trivalent phosphorus derivative is an H-phosphonate unit prepared according to the H-phosphonate oligonucleotide synthesis method or a phosphite unit prepared according to the phosphoramide oligonucleotide synthesis method.
  • the method for obtaining modified oligonucleotides according to the present invention can be implemented in a liquid-phase version, when all reagents in all reactions are in solution.
  • the implementation of the claimed method is carried out in a solid-phase version, where the synthesized oligonucleotide is immobilized on a solid-phase carrier.
  • a polymeric carrier can be used as a solid phase carrier.
  • all amidophosphite units are condensed automatically using a DNA synthesizer.
  • the triazine group can be introduced into any internucleotide phosphate group of the synthesized oligonucleotide.
  • one or more internucleotide phosphate groups within an oligonucleotide can be modified. In one embodiment, all of the internucleotide phosphate groups in the oligonucleotide may be modified. However, in a preferred embodiment, the oligonucleotide contains one or two modified internucleotide phosphate groups [00120]
  • One of the advantages of the claimed method is the possibility of its combination with the standard protocol of amidophosphate synthesis, which greatly simplifies and reduces the cost of obtaining modified oligonucleotides.
  • An equally important advantage of the claimed method is the great variability of the compounds obtained, which is provided by the hierarchical sequence of steps for obtaining the target compound.
  • the present invention can be used in cytological studies, in molecular diagnostics, in the field of creating therapeutic drugs aimed at treating cancer, genomic disorders, various diseases of a bacterial and viral nature, including COVID-19.
  • oligonucleotides modified according to the present invention can be used in such techniques as, for example, alternative splicing, antisense miRNA and siRNA therapy, the use of aptamers, genome editing using CRISPR/Cas, and others.
  • Fig. 1 shows examples of chromatographic analysis (RPHPLC) of the compounds obtained.
  • Fig. 2 shows examples of mass spectrometric analysis (ESI MS) of the resulting compounds.
  • FIG. 3 shows the results of a study of the chemical stability of the modified oligonucleotide under alkaline conditions.
  • Fig. 4 shows the results of a study of the chemical stability of the modified oligonucleotides in an acidic environment.
  • FIG. 5 shows the results of an enzymatic stability study of triazinyl amidophosphate modified oligonucleotides.
  • FIG. 6 shows the results of a study on the penetration efficiency of the modified oligonucleotide into cultured human HEK293T, T98G cells.
  • Fig. 7 shows the results of laser confocal microscopy of human cells transfected with the modified oligonucleotide.
  • FIG. Figure 8 presents the results of a study on the efficiency of penetration into human cells of oligonucleotides containing dodecyl residues as part of modifications with different backbones.
  • Figure 9 shows the results of a study on the efficiency of entry into human cells of HEPG2 modified oligoribonucleotides.
  • FIG. 10 shows the results of a study of the cytotoxicity of the modified oligonucleotides.
  • the present invention relates to compounds corresponding to the formula F0:
  • substituent Z is selected from the group: -OH, -SH, -SeH, -NHR N , -O-PG, -S-PG, -Se-PG or -N(PG)R N
  • X is selected from the group consisting of the 5'-O-terminus of the nucleoside or oligonucleotide
  • Y is selected from the group consisting of the 3'-O-terminus of the nucleoside or oligonucleotide, -H, -OH, -SH , -NHR N , -O-PG or -S-PG, linker, monophosphate or diphosphate.
  • Y is selected from the group consisting of the 5'-O-terminus of the nucleoside or oligonucleotide and X is selected from the group consisting of the 3'-O-terminus nucleoside or oligonucleotide, -H, -OH, -SH, -NHR N , -O-PG or -S-PG, linker, monophosphate or diphosphate.
  • Examples of protecting groups may include, but are not limited to, acetyl (Ac), benzoyl (Bz), isobutyryl (Ibu), m-butylphenoxyacetyl (Tac), levulinyl (Lev), methyl (Me), (3 - cyanoethyl (CE), allyl (AP), o-chlorophenyl (o-CIPh), 4,4'-dimethoxytrityl (DMTr), 4-methoxytrityl (MMTg), m-butyldimethylsilyl (TBDMS), triisopropylsilyloxymethyl (TOM) and others groups.
  • linkers may include, but are not limited to, succinyl, diglycolyl, oxalyl, hydroquinone-O, O'-diacetyl (Q-linker), phthaloyl, 4,5-dichlorophthaloyl, malonyl, glutaryl, diisopropylsilyl, 1, 1, 3,3-tetraisopropyldisiloxane-1,3-diyl, BHQ linker, amino linker and other linkers.
  • Substituents R 1 , R 2 , R 3 . R 4 are selected from -H, -Cmzalkyl, -C 2 l8alkenyl, -C lchalkynyl and -C6 varyl, which may include -NH-, -N ⁇ , -O-, -NHC(O)-, -
  • the substituents R 5 , R 6 , R 7 R 8 are selected from the series containing -H, -C m x alkyl.
  • PG is a protecting group and RN is -H or -C 4 alkyl.
  • the substituents R 1 and R 2 ; R 3 and R 4 ; R 5 and R 6 ; R 7 and R 8 together with their associated atom may form a 5-8 membered heterocyclic substituent selected from the group consisting of N-pyrrolidinyl, N-piperidinyl, N-azepanyl, N-azocanyl or N-piperazinyl.
  • the introduced residue of the triazine group gives them chemical and enzymatic stability.
  • the phosphate group modified according to the present invention is electrically neutral, in contrast to the negatively charged unmodified phosphate group, which increases the ability of the claimed compound to penetrate the cell membrane.
  • a single modification located at the 3'-end or 5'-end of the oligonucleotide minimally changes the overall structure of the ribose phosphate backbone oligonucleotide. This preserves the possibility of the interaction of the modified oligonucleotide with NK enzymes, in particular with RNase H.
  • the claimed modification has little effect on the ability of the modified oligonucleotides to form specific complexes with complementary regions of NA targets. This is explained by the fact that in the complementary complex, the triazine group and substituents attached to it, when forming complexes with complementary DNA or RNA regions, are exposed outside the double helix and thus do not affect the complementary interaction of nitrogenous bases inside it.
  • the modified phosphate group may be chiral.
  • the structure includes both the Rp and Sp configuration, both separately and as a mixture: for example, a racemic mixture (racemate).
  • the structure includes the following structures as shown below:
  • the claimed compounds may also include more than one chiral center.
  • the structure should be considered to cover all possible enantiomers and diastereomers.
  • the subject of the present invention may be an oligonucleotide containing at least one modified phosphate group corresponding to the formula (Fx): where - indicates the place of attachment of the substituents corresponding to the oligonucleotide, and R 1 , R 2 , R 3 and R 4 are determined in the same way as in the formula (F0).
  • Formula (Fx) reflects the structure of the oligonucleotide modified according to the present invention after the final deblocking step.
  • Oligonucleotides of the present invention may be any number of nucleotides, at least 2.
  • an oligonucleotide may have a minimum length of 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 or 40 nucleotides.
  • the oligonucleotide can have a maximum length of 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45,
  • an oligonucleotide consisting of 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46 , 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 or 100 nucleotides.
  • one or more, for example, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,10 or more nucleotides, or all of the nucleotides may contain a phosphate group modified according to with the present invention.
  • the implementation of the oligonucleotide contains no more than two claimed modifications. In an even more preferred embodiment, the implementation of the oligonucleotide contains one claimed modification.
  • Oligonucleotides from 5 to 500 nucleotides in length modified according to the present invention can be used in the treatment of cancer, genomic disorders and infectious diseases, for example, as ASO for translation inhibition (siRNA, microRNA), for splicing modulation due to exon skipping, for genotype correction using the CRISPR/Cas method, as well as aptamers for specific inhibition of target proteins or targeted drug transport, and in other applications.
  • ASO for translation inhibition
  • siRNA microRNA
  • splicing modulation due to exon skipping for genotype correction using the CRISPR/Cas method
  • aptamers for specific inhibition of target proteins or targeted drug transport
  • the length of the modified oligonucleotide 5-500 nucleotides provides the specificity of the complex that forms the oligonucleotide with a complementary NA site. On the other hand, this length makes it possible to obtain a modified oligonucleotide using an automated DNA synthesizer.
  • Oligonucleotides within the scope of the present invention can be obtained and isolated in pure form.
  • the method for preparing the claimed compounds of formula (F0) consists in reacting a trivalent phosphorus derivative of formula (F1) with an azidotriazine of formula (F2) to obtain a compound of formula (F3), as shown in the scheme.
  • a and B can be independently selected from -NR 1 !? 2 , -NR 3 R 4 , -NR X R Y , - Q.
  • Q is a group capable of undergoing substitution reactions.
  • Q may be, for example, -OR; -OC(O)R; -OS(O)2R; -CN; -Cl; -Br; -I; -F; -N3.
  • the group may be, for example, -OR; -OC(O)R; -OS(O)2R; -CN; -Cl; -Br; -I; -F; -N3.
  • the group may be, for example, -OR; -OC(O)R; -OS(O)2R; -CN; -Cl; -Br; -I; -F; -N3.
  • Q is replaced by -NR ⁇ 2 , -NR 3 R 4 , -NR X R Y In reaction with the corresponding amine HNR' R 2 , HNR 3 R 4 , HNR X R Y .
  • the substitution can be carried out both in the composition of the used azidotriazine (F2) and in the composition of the compound (F3).
  • azidotriazines are much more reactive than azides with more electron-donating substituents, such as, for example, alkyl azides.
  • the structural features of the azidotriazine used make it possible to introduce two functional groups (A and B) at once into the composition of the resulting compound within the same phosphate group, which in most cases makes it possible to endow the resulting compound with the desired property using only a single modification.
  • R x and R Y are substituents that contain lipophilic and / or cationic groups in their composition, and in addition contain reactive centers that will be additionally subjected to chemical transformation or sequences of chemical transformations, bringing the substituent structures to the structures R 1 , R 2 , 3 or R 4 .
  • the conversion of R x , R Y to R 1 , R 2 , R 3 or R 4 can be carried out both in the composition of the compound (F2) and in the composition of the compound (F3).
  • R x , R Y are selected from the range containing -H, -Cmzalkyl, -Cgchzalkenyl, -C 2 -
  • R x , R Y or R 1 , R 2 , R 3 , R 4 are determined by the amines below:
  • R x , R Y contain a -NH 2 group
  • this group can be converted, for example, to -NR X1 2 in reaction with QR X1 ; or in - NHR X1 in reaction with TsOR xl ; or in -NHC(O)R X1 in reaction with QC(O)R X1 ; or c - NHS(O)2R X1 In reaction with QS(O)2R X1 ; or in -N ⁇ u003d C (N (R N 2)) 2 In reaction with
  • R x , R Y contain a -OH group
  • this group can be converted, for example, to -OR X1 in reaction with R xl ; or in -NHR X1 in successive reactions with QTs and amine NH 2 R X1 ; or into a nucleotide or oligonucleotide after continued automatic synthesis, where the -OH group is the growth point of the oligonucleotide chain.
  • R xl , R x2 , R x3 , R x4 end in -OH, then this terminal group can be converted to -OR in reaction with QR; or in -NHR in successive reactions with QTs and amine NH 2 R; or into a nucleotide or oligonucleotide sequence after continued automatic synthesis.
  • E' is an anionic moiety selected from the group consisting of G, Br", SG, succinimide ((CH 2 ) 2 (CO) 2 N"), CC13', CBg3", CI3', CH1 2 ", trifluoromethanesulfonate (CF3SO3'), p-toluene sulfonate (C 7 H 7 803), dichlorophosphate (PO 2 C1 2 ), perchlorate (CIO4), tetrafluoroborate (BF4), tetraphenylborate (BPI14'), or hexafluorophosphate (PE- , ).
  • R x , R Y has primary or secondary amino groups ( ⁇ NH 2 , -NH-), it is possible to obtain modified groups ending in residues selected from the series tosyl, acetyl, an unsubstituted or substituted guanidinine residue , residue 4,6-dichloro-1,3,5-triazine. If 4,6-dichloro-1,3,5-triazine is chosen as the terminal residue, it can be further modified using amines NHR X1 R X2 selected from the series of methylamine, butylamine, piperazine, etc.
  • R x , R Y contains hydroxy groups - OH
  • these groups can be converted to other derivatives by reaction with appropriate nucleophilic reagents.
  • hydroxyl groups can be converted into ether, ester residues, be the growth point of a new oligonucleotide sequence.
  • substitution by a tosyl residue its further modification with the use of NHR ⁇ R 2 amines is possible, yielding the corresponding residues of secondary and primary amines.
  • An oligonucleotide containing at least one modified phosphate group corresponding to the formula (Fx) can also be obtained within the claimed method, using standard protocols for automatic solid-phase phosphoramide synthesis.
  • amidophosphite method is the most efficient and widely used method for the synthesis of oligonucleotides.
  • Amidophosphite synthesis protocols are known to those skilled in the art of preparing oligonucleotides and are generally carried out in the solid phase variant using an automated DNA synthesizer. Briefly, a DMTr nucleoside immobilized on a polymeric carrier is detritylated and then condensed with an appropriately activated nucleoside amidophosphite to form a triester phosphite. This is usually followed by "capping", i.e.
  • the method for producing modified oligonucleotides according to the present invention includes the following steps:
  • the synthesis of the oligonucleotide chain is carried out on a DNA synthesizer according to the standard amidophosphite protocol up to the stage of condensation of the link, whose phosphate part will be modified according to the present invention; After condensation of the corresponding monomer, the synthesis is stopped after the formation of the phosphite triester (F1), before the "capping" and oxidation steps.
  • the phosphite triester (F1) formed in the condensation step is treated with azidotriazine (F2) at 5°C to 65°C, preferably 14°C to 29°C, even more preferably 20°C to 25°C, to form compounds (F3);
  • a and B in the azidotriazine (F2) are -NR 1 R 2 and -NR 3 R 4 , step 2) is omitted.
  • a and B in the azidotriazine (F2) may be chlorine atoms.
  • 2-azido-4,6-dichloro-1,3,5-triazine can be prepared in one step from commercially available cyanuric chloride as shown in Example 1.
  • the azidotriazine (F2) is 2-azido-4-alkylamino-6-chloro-1,3,5-triazine, which can be prepared from cyanuric chloride and the corresponding amine as shown in Examples 2-4 .
  • the azidotriazine (F2) is 2-azido-4,6-dialkylamino-1,3,5-triazine, which can be prepared from cyanuric chloride and the corresponding amines as shown in Example 5.
  • the described method for obtaining a modified oligonucleotide can be implemented in a liquid-phase version, when all reagents in all reactions are in solution and are not associated with solid-phase media.
  • the claimed method is implemented in the solid-phase version, when the synthesized oligonucleotide is associated with a solid-phase carrier.
  • a polymeric carrier can be used as a solid phase carrier.
  • polymeric carriers may include, but are not limited to, controlled pore glass (CPG), polystyrene resins, TentaGel®, TSK Gel® Toyopearl®, polyvinyl alcohol, cellulose acetate, and the like.
  • the condensation of all amidophosphite monomers is performed automatically using an automatic DNA synthesizer.
  • the triazine group can be introduced into any internucleotide phosphate group of the synthesized oligonucleotide.
  • One of the main advantages of the claimed method is the possibility of introducing into the composition of the oligonucleotide a wide variety of combinations of organic radicals Rl, R2, R3 R4 as part of even one triazinamide phosphate modification.
  • the claimed method provides for the initial preparation of a common precursor - compound (F3) - with the possibility of further sequential assembly of target organic radicals Rl, R2, R3 R4, by treating compound (F3) with various reagents, as described above.
  • Such a hierarchical assembly of the final structure (F0) makes it possible to obtain a wide range of representatives of the claimed class of compounds in an accessible way, the special advantage of which is compatibility with the standard protocol for automated solid-phase phosphoramide oligonucleotide synthesis.
  • the obtained modified oligonucleotides are stable over a wide range of pH values.
  • oligonucleotide will be used to refer to oligodeoxymbonucleotides, unless specifically stated otherwise.
  • modified oligonucleotides were synthesized on an automatic DNA synthesizer ASM-800 (Biosset, Russia) according to the amidophosphite protocol [42] on a scale of 0.2 ⁇ mol using standard 25 ⁇ l reactors.
  • phosphite triester for introduction into the Staudinger reaction with azidotriazine was carried out as follows.
  • a reactor containing 10 mg of a polymer carrier based on porous glass (500 A) with an immobilized nucleoside (nucleoside loading 40 ⁇ mol/g) was placed in a DNA synthesizer and a protocol for automated solid-phase oligonucleotide synthesis was launched according to the (3-cyanoethyl phosphitamide scheme on a scale of 0.2 ⁇ mol
  • the synthesis of the oligonucleotide chain was carried out up to the link, whose phosphate part will be modified with a triazine residue.
  • the reactor was removed from the synthesizer, dried on a water jet pump after washing with dry acetonitrile, the polymer carrier with immobilized phosphite triester was transferred from
  • the introduction of the 6-carboxyfluorescein residue in the form of fluorescein amidophosphite monomer was carried out according to a special protocol with a concentration of fluorescein amidophosphite monomer of 0.1 M, a total volume of fluorescein amidophosphite monomer of 70 ⁇ l, and a feeding time of fluorescein amidophosphite monomer of 30 minutes.
  • the 6-carboxyfluorescein residue in the oligonucleotide is referred to as [FAM]
  • the polymer carrier was transferred from the reactor into a plastic tube and the stage of final deblocking was carried out with a concentrated aqueous solution of methylamine. After the final deblocking, the supernatant was evaporated to dryness in a vacuum on a SpeedVac setup. 200 ⁇ l of deionized water (mQ) was added to the residue and the polymer carrier was separated by centrifugation.
  • mQ deionized water
  • the modified oligonucleotides were isolated by reverse phase high performance liquid chromatography (RPHPLC). Isolation was carried out on an Agilent 1200 chromatograph (USA) with an 'orbax SB-C18 (5 ⁇ m) 4.6 x 150 mm column in a gradient of acetonitrile in 20 mM triethylammonium acetate, pH 7 from 0 to 90%, for 30 min at a flow rate 1.5 ml/min. Fractions containing the target product were evaporated in vacuum using a SpeedVac setup.
  • RPHPLC reverse phase high performance liquid chromatography
  • the oligonucleotides were precipitated by adding 1 ml of a solution of 1 M LiCICE in acetone, the precipitate was washed with acetone and dried in air for 20 minutes.
  • PAAT denaturing polyacrylamide gel electrophoresis
  • the molecular weights of the modified oligonucleotides were determined using MALDI-TOF or ESI mass spectroscopy in the detection of positive or negative ions.
  • the suspension was centrifuged at 13400 rpm for 30 sec, the supernatant was taken, the polymer carrier was washed three times with 200 ⁇ l of dry acetonitrile. . After completion of the oligonucleotide synthesis, the final deblocking was performed with a concentrated aqueous solution of methylamine.
  • Option 2 Introduction of a 4,6-dialkylamino-1,3,5-triazino-2-amidophosphate moiety using 2-azido-4-alkylamino-6-chloro-1,3,5-triazines.
  • Option 3 Introduction of a 4,6-dialkylamino-1,3,5-triazino-2-amidophosphate moiety using 2-azido-4,6-dialkylamino-1,3,5-triazines. 1) Oligonucleotide chain synthesis up to a link whose phosphate part will be modified by a triazine residue was carried out on a DNA synthesizer, described in general methods.
  • the phosphite triester immobilized on a solid-phase carrier was transferred into a test tube, and 200 ⁇ l of 0.5 M solutions of 2-azido-4,6-dialkylamino-1,3,5-triazine in DMF were added, purged with argon, and shaken on a shaker for 1 - 3 hours at 65°C. suspension centrifuged at 13400 rpm for 30 sec, the supernatant was taken, the polymer carrier was washed three times with 200 ⁇ l of dry acetonitrile. After completion of the oligonucleotide synthesis, the final deblocking was performed with a concentrated aqueous solution of methylamine.
  • Example 6 Obtaining modified oligonucleotides according to option 1 with the introduction of methylamine residues.
  • Example 7 Synthesis of modified oligonucleotides according to option 1 with treatment with piperidine solution.
  • modified oligonucleotides 5'-d(T*TTTT), 5'-d(T*TTTTTTTT), 5'-d(T*TTTT*T) were prepared.
  • Modified oligonucleotides were obtained according to option 1, where the sequential processing in paragraph 2) - 10% (vol.) piperidine in dry acetonitrile, 1 hour, 25°C.
  • Example 8 Synthesis of a modified oligonucleotide according to option 1 with treatment with a solution of (M-methyl)butylamine.
  • a modified oligonucleotide 5'-d(T*TTTTT) was obtained according to option 1, where the sequential treatments in step 2) are 50% (vol.) (N-methyl)butylamine in dry acetonitrile, 30 minutes, 25 °C.
  • Modified oligonucleotides were obtained according to option 1, where the sequential processing in paragraph 2) - 3 M dodecylamine in dry pyridine, 30 minutes, 55°C.
  • Example 10 Synthesis of modified oligonucleotides according to option 1 with treatment with a butylamine solution.
  • modified oligonucleotides 5'-d(CTGACTATGAAGTAT*T), 5'-[FAM]-d(CTGACTATGAAGTAT*T), 5'-d(TTTTTTTT*T), 5'-d(T* T*TTTTTTTT).
  • Modified oligonucleotides were obtained according to option 1, where the sequential processing in paragraph 2) - 20% (vol.) butylamine in dry acetonitrile, 1 hour, 40°C. [00242] Molecular weight:
  • Example 11 Synthesis of a modified oligonucleotide according to option 1 with treatment with an oleylamine solution.
  • the modified oligonucleotide 5'-d(T*TTTT) was obtained according to option 1, where the sequential processing in paragraph 2) - 2 M oleylamine in dry pyridine, 30 minutes, 55°C.
  • Example 12 Synthesis of the modified oligonucleotide according to option 1 with treatment with a solution of (M-methyl-M-octadecyl)amine,
  • a modified oligonucleotide 5'-d(T*TTTT) was obtained according to option 1, where the sequential treatments in step 2) are 2 M M-methyl-N-octadecylamine in dry pyridine, 30 minutes, 55°C.
  • a modified oligonucleotide 5'-d(T*TTTTT) was prepared according to option 1, where step 2 was omitted; the oligonucleotide was deblocked from the solid phase carrier using conc. (approx. 40%) aq. dimethylamine solution at 55°C.
  • Example 14 Synthesis of a modified oligonucleotide according to option 1 with treatment with a solution of dihexylamine.
  • a modified 5'-d(T*TTTT) oligonucleotide was prepared according to option 1, where the sequential treatments in step 2) are 10% (v/v) dihexylamine in dry acetonitrile, 1 hour, 25°C.
  • Example 15 Synthesis of modified oligonucleotides according to option 1 with treatment with a solution of (,M-dimethylamino)propylamine.
  • Modified oligonucleotides were prepared according to option 1, where the sequential treatments in step 2) are 10% (v/v) (K[,M-dimethylamino)propylamine in dry acetonitrile, 1 hour, 25°C.
  • Example 16 Synthesis of modified oligonucleotides according to option 1 with treatment with a solution of 3,3'-iminobis(M,M-dimethyl-propylamine).
  • modified oligonucleotides in this variant were prepared according to variant 1, where the successive treatments in step 2) are 10% (vol.) 3,3'-HMHHO6HC(N,N-dimethyl-propylamine) in dry acetonitrile, 1 hour, 25 °C.
  • Example 17 Synthesis of a modified oligonucleotide according to option 1 with treatment with a solution of 1,6-diaminohexane.
  • a modified oligonucleotide 5'-d(T*TTTTTTTT) was obtained according to option 1, where the sequential processing in paragraph 2) - 2 M 1,6-diaminohexane in dry acetonitrile, 1 hour, 55°C.
  • Example 18 Synthesis of a modified oligonucleotide according to option 1 with treatment with a solution of 1,4-diaminobutane.
  • a modified oligonucleotide 5'-d(T*TTTTTTTT) was obtained according to option 1, where the sequential treatments in step 2) are 10% (v/v) 1,4-diaminobutane in dry acetonitrile, 1 hour, 55° WITH.
  • Example 19 Synthesis of modified oligonucleotides according to option 1 with treatment with a solution of tris-(2-aminoethyl)amine.
  • modified oligonucleotides 5'-d(T*TTTT), 5'-d(T*T), 5'-d(T*TTTTTTTT) were obtained according to option 1, where the sequential treatments in step 2) - 10% (vol.) tris-(2-aminoethyl)amine in dry acetonitrile, 1 hour, 25°C.
  • the modified oligonucleotide 5'-d(T*TTTTTTTT) was obtained according to option 1, where the successive treatments in paragraph 2) - 2 M piperazine in dry chloroform, 2 hours, 25°C.
  • Example 21 Synthesis of a modified oligonucleotide according to option 1 with successive treatments with solutions of tris-(2-aminoethyl)amine and guanidine and S-methylurea.
  • a modified oligonucleotide 5'-d(T*TTTTT) was prepared according to option 1, where the sequential treatments in step 2) are 10% (vol.) tris-(2-aminoethyl)amine in dry acetonitrile, 1 hour , 25°C —> 10 mg S-methylurea/100 ⁇ l dry acetonitrile/50 ⁇ l 25 mM NaHCCh, day, 55°C.
  • modified oligonucleotides 5'-d(T*TTTT), 5'-d(T*TTTTTTTTTT), 5'-[FAM]-d(T*TTTTTTTT), 5'-d(T* T).
  • modified oligonucleotides in this variant were prepared according to variant 1, where successive treatments in step 2) - 10% (vol.) Tris-(2-aminoethyl)amine in dry acetonitrile, 1 hour, room temperature - "10 mg dimethylimidazolidinium chloride hexafluorophosphate/200 ⁇ l dry acetonitrile/7 ⁇ l
  • Example 23 Synthesis of modified oligonucleotides according to option 1 with successive treatments with solutions of tris-(2-aminoethyl)amine and acetic anhydride.
  • modified oligonucleotides 5'-d(T*TTTT), 5'-d(T*TTTTTTTTTT), 5'-[FAM]-d(T*TTTTTTTT) were prepared.
  • Modified oligonucleotides in this variant were obtained according to variant 1, where successive treatments in step 2) - 10% (vol.) tris-(2-aminoethyl)amine in dry acetonitrile, 1 hour, 25 ° C - standard solutions and conditions copying stages in automatic solid-phase amidophosphite synthesis.
  • a modified oligonucleotide 5'-d(T*TTTTTTTT) was prepared according to option 1, where sequential treatments in step 2) - 2 M piperazine in dry chloroform, 2 hours, 25 ° C - 2 M tosyl chloride in dry acetonitrile with the addition of 2 M DIPEA in dry acetonitrile, 1 hour, 25°C.
  • Example 25 Synthesis of a modified oligonucleotide according to option 1 with successive treatments with solutions of 1,6-diaminohexane and tosyl chloride.
  • the modified oligonucleotide 5'-d(T*TTTTTTTT) was obtained according to option 1, where the sequential treatments in step 2) - 2 M 1,6-diaminohexane in dry acetonitrile, 1 hour, 55 ° C - 2 M tosyl chloride in dry acetonitrile supplemented with 2 M DIPEA in dry acetonitrile, 1 hour, 25°C.
  • a modified oligonucleotide 5'-d(T*TTTTTTTT) was obtained according to option 1, where successive treatments in step 2) - 2 M piperazine in dry chloroform, 2 hours, 25 ° C - > 1.5 M cyanuric chloride in dry acetonitrile with the addition of 1.5 M DIPEA in dry acetonitrile, 15 minutes, 25°C.
  • Example 27 Synthesis of a modified oligonucleotide according to option 1 with successive treatments with solutions of piperazine, cyanuric chloride and butylamine.
  • the modified oligonucleotide 5'-d(T*TTTTTTTT) was obtained according to option 1, where successive treatments in step 2) - 2 M piperazine in dry chloroform, 2 hours, 25 ° C - "1.5 M cyanuric chloride in dry acetonitrile with the addition of 1.5 M DIPEA in dry acetonitrile, 15 minutes, 25°C - > 10% (vol.) butylamine in dry acetonitrile, 1 hour, 55°C.
  • the modified oligonucleotide 5'-d(T*TTTTTTTT) was obtained according to option 1, where successive treatments in step 2) - 2 M piperazine in dry chloroform, 2 hours, 25 ° C - "1.5 M cyanuric chloride in dry acetonitrile with the addition of 1.5 M DIPEA in dry acetonitrile, 15 minutes, 25°C - 2 M piperazine in dry chloroform, 15 minutes, 25°C - 2 M tosyl chloride in dry acetonitrile with the addition of 2 M DIPEA in dry acetonitrile, 1 hour, 25 °C.
  • Example 29 Synthesis of the modified oligonucleotide according to option 1 with treatment with a solution of (M-methyl)aminoethanol.
  • a modified oligonucleotide 5'-d(T*TTTT) was prepared according to option 1, where the successive treatments in step 2) are 10% 2-(N-methyl)aminoethanol in dry acetonitrile, 1 hour, 25°C .
  • modified oligonucleotides 5'-d(T*TTTTTTTT), 5'-d(T*TTTTTT) were obtained according to option 1, where the sequential treatments in step 2) are 5% (vol.) diethanolamine in a mixture of acetone : acetonitrile 1:1, 1 hour, 55°C.
  • Example 31 Synthesis of a modified oligonucleotide according to option 1 with treatment with a solution of 3-aminopropanol.
  • a modified oligonucleotide 5'-d(T*TTTTTTTT) was obtained according to option 1, where the successive treatments in paragraph 2) - 1.5 M 3 -aminopropanol- 1 in dry acetonitrile, 1 hour, 55°C.
  • Example 32 Synthesis of the modified oligonucleotide according to option 1 with treatment with a solution of 6-aminohexanol.
  • a modified oligonucleotide 5'-d(T*TTTTTTTT) was obtained according to option 1, where the sequential treatments in step 2) are 1.5 M 6-aminohexanol-1 in dry acetonitrile, 1 hour, 55°C.
  • Example 33 Synthesis of a modified oligonucleotide according to option 1 with treatment with a solution of 2-(2-aminoethoxy)ethanol.
  • a modified oligonucleotide 5'-d(T*TTTTT) was prepared according to option 1, where the sequential treatments in step 2) are 62.5% (v/v) 2-(2-aminoethoxy)ethanol in dry acetonitrile, 1 hour, 25°C.
  • Example 34 Synthesis of modified oligonucleotides according to option 1 with successive treatments with solutions of 3-aminopropanol and piperidine.
  • modified oligonucleotides 5'-d(T*TTTTTTTTT), 5'-d(T*T) were obtained according to option 1, where the sequential treatments in paragraph 2) - 1.5 M 3 -aminopropanol- 1 in dry acetonitrile , 1 hour, 55°C - > 2 M tosyl chloride in dry acetonitrile with the addition of 2 M DIPEA in dry acetonitrile, 1 hour, 25°C - 10% (v/v) piperidine in dry acetonitrile, 24 hours, 40°C.
  • a modified oligonucleotide 5'-d(TT(T)2*TTTTTT) was obtained according to option 1, where the sequential treatments in step 2) -
  • Example 36 Synthesis of a modified oligonucleotide according to option 1 with successive treatments with solutions of 6-aminohexanol and amidophosphite monomers of thymidylate units.
  • a modified oligonucleotide 5'-d(TT(T)2*TTTTTT) was obtained according to option 1, where the sequential treatments in step 2) - 1.5 M 6-aminohexanol-1 in dry acetonitrile, 1 h, 55° ⁇ — > condensation of the thymidylate unit according to the standard protocol of solid-phase phosphoramidite synthesis.
  • Example 37 Synthesis of a modified oligonucleotide according to variant 1 with successive treatments with solutions of 2-(2-aminoethoxy)ethanol and amidophosphite monomers of thymidylate units.
  • a modified oligonucleotide 5'-d(TTT(T 2 ) 2 *TTTTT) was obtained according to option 1, where the sequential processing in paragraph 2) is 62.5% (vol.) 2-(2-aminoethoxy) ethanol in dry acetonitrile, 1 hour, 25° ⁇ — condensation of two thymidylate units according to the standard protocol for solid-phase phosphoramidite synthesis.
  • Example 38 Synthesis of modified oligonucleotides according to option 2 using 2-azido-4-dodecylamino-6-chloro-1,3,5-triazine with treatment with a solution of methylamine.
  • modified oligonucleotides 5'-d(T*TTTT), 5'-d(TTTT*TTTT) were prepared according to option 2 using a 0.1 M solution of 2-azido-4-dodecylamino-6-chloro- 1,3,5-triazine in toluene in point 1), point 2) was omitted.
  • a modified oligonucleotide 5'-d(T*TTTT) was prepared according to option 2 using a 0.1 M solution of 2-azido-4-dodecylamino-6-chloro-1,3,5-triazine in toluene in point 1), successive treatments in point 2) - 10% (vol.) (M,M-dimethylamino)propylamine in dry acetonitrile, 1 hour, 25°C.
  • Example 40 Synthesis of the modified oligonucleotide according to option 2 using 2-azido-4-oleylamino-6-chloro-1,3,5-triazine with treatment with a solution of methylamine,
  • a modified oligonucleotide 5'-d(T*TTTT) was prepared according to option 2 using a 0.1 M solution of 2-azido-4-oleylamino-6-chloro-1,3,5-triazine in toluene in paragraph 1), paragraph 2) were omitted.
  • a modified oligonucleotide 5'-d(T*TTTT) was prepared according to option 2 using a 0.1 M solution of 2-azido-4-(G-methyl-G-octadecyl)amino-6-chloro-1 ,3,5-triazine in toluene in point 1), point 2) was omitted.
  • Example 42 Synthesis of modified oligonucleotide variant 3 using 2-azido-4,6-dibutylamino-1,3,5-triazine.
  • a modified oligonucleotide 5'-d(T*TTTT) was prepared according to option 3 using a 0.5 M solution of 2-azido-4-dodecylamino-6-chloro-1,3,5-triazine in DMF in paragraph 1).
  • Example 43 [00311]
  • Modified oligonucleotides were obtained according to option 1, where the sequential processing in paragraph 2) - 10% (vol.) piperidine in dry acetonitrile, 1 hour, 25°C.
  • Oligonucleotide 02 5'-d(T*TTTTTTTTT), where * is a triazinyl amidophosphate unit with butyl residues, was synthesized as described in example 10.
  • the final deblocking was carried out with a concentrated aqueous solution of methylamine for 30 min at 65°C. From the chromatography profile in Fig. 3 it can be seen that the reaction mixture does not contain any peaks indicating degradation of the obtained target product.
  • oligonucleotides containing a modified phosphate group corresponding to formula (Fx) have been shown to be highly stable under both alkaline and acidic conditions.
  • Example 45 Testing the resistance of modified oligonucleotides to the action of nucleases from whole cell extracts of HEK293T and T98G cells.
  • oligonucleotide 5'-[FAM]-CTGACTATGAAGTAT*T-3' was used to study enzymatic resistance, where * is the position of the triazinyl amidophosphate unit containing butyl residues.
  • a control unmodified oligonucleotide 5 [FAM]-CTGACTATGAAGTATT-3' was used for comparison.
  • the reactions were carried out for 7.5 and 15 minutes for each extract at 37°C.
  • the reactions were stopped by introducing EDTA to a final concentration of 20 mM. After that, aliquots were analyzed by electrophoresis in PAAT under denaturing conditions [43].
  • Panel A shows the electropherogram obtained for the unmodified oligonucleotide
  • panel B for the modified oligonucleotide.
  • the following designations are accepted on each panel: 1 - oligonucleotide control solution; 2 - HEK293T, 7.5 min; 3 - HEK293T, 15 min; 4 - T98G, 7.5 min; 5 - T98G, 15 min.
  • Example 46 Flow cytometry study of the efficiency of transfection of HEK293T and T98G cells with OSN4F oligonucleotide.
  • oligonucleotide 5'-[FAM]-CTGACTATGAAGTAT*T-3' was used, where * is the position of the triazinyl amidophosphate link carrying two dodecyl residues, and the control unmodified oligonucleotide 5'-[FAM] -CTGACTATGAAGTATT-3' (OSNF).
  • HEK293T and T98G cells were plated in the wells of a 24-well plate at a concentration of 20x104 cells/moon (HEK293T) or 12x104 cells/moon (T98G) in 500 ⁇ l/mole of IMDM medium containing 10% FBS and 1%- solution of antibiotics-antimycotics (10 mg/ml streptomycin, 10000 U/ml penicillin and 25 mg/ml amophtericin (IMP Biomedicals, Germany) (hereinafter complete medium) and incubated for 18 h for cell attachment.
  • antibiotics-antimycotics 10 mg/ml streptomycin, 10000 U/ml penicillin and 25 mg/ml amophtericin (IMP Biomedicals, Germany
  • Histograms C and D show that in the absence of additional transfectants, the modified OSN4F oligonucleotide enters T98G cells more efficiently than the control oligonucleotide.
  • the efficiency of oligonucleotide penetration is lower compared to HEK293T kidney cells, while a dose-dependent increase in transfection efficiency was preserved.
  • One of the reasons for the difference in the efficiency of oligonucleotide penetration is the peculiarities of the composition of the HEK293T and T98G cell membranes, due to the difference in cell types.
  • the modified OSN4F oligonucleotide is able to efficiently enter cultured human HEK293T and T98G cells in the absence of additional transfecting agents. Moreover, the efficiency of its penetration is much higher than that of the control unmodified oligonucleotide. This indicates a positive effect of this modification on the ability to penetrate into human cells.
  • the penetration efficiency of the modified OSN4F oligonucleotide without additional transfection agents is comparable to that of the unmodified control oligonucleotide with the widely used transfection agent Lipofectamine2000.
  • Example 46 Confocal microscopy data on the penetration of the modified oligonucleotide into human cells.
  • cover slips with cells were placed on glass slides in a drop of ProLong Glass Antifade Mounting Medium (ThermoFisher Scientific, USA) containing NucBlue for staining. cells, and the slides were incubated in a horizontal position in the dark at room temperature for 12 h to polymerize the medium.
  • ProLong Glass Antifade Mounting Medium ThermoFisher Scientific, USA
  • the intracellular localization of the OSN4F oligonucleotide was examined using an LSM710 confocal microscope (Zeiss, Germany) using a planapochromat 63 x/1.40 Oil DIC M27 objective (Zeiss, Germany) and two channels, blue and green. Fluorescence in the blue channel at an excitation laser wavelength of 405 nm was consistent with NucBlue (staining of cell nuclei); the green channel at the excitation laser wavelength of 488 nm corresponded to the fluorescence of the OSN4F oligonucleotide labeled with a 6-carboxyfluorescein residue.
  • FIG. 7 shows a typical photomicrograph series of HEK293T cells transfected with a modified OSN4F oligonucleotide.
  • Cell nuclei are visible on the left photo, OSN4F (center) is in the center, channel overlay is on the right.
  • oligonucleotides were used to study the effect of backbone modification on penetration efficiency: OSN4F - with triazinyl amidophosphate modification; PGO - with phosphorylguanidine modification; PN - with two amidophosphate modifications; and ODF - with two non-nucleotide units. All oligonucleotides contained two dodecyl residues.
  • oligonucleotides tested in this example contained the same amount of lipophilic dodecyl residues. This means that it is the triazinyl amidophosphate backbone, which defines belonging to the class of patented compounds, that provides improved cell penetration.
  • Example 48 Study of the efficiency of penetration into human cells of modified oligoribonucleotides.
  • HepG2 human hepatocellular carcinoma
  • oligoribonucleotide conjugate were incubated for 12 hours in a CO2 incubator. After that, the medium was changed to MEM, then the cells were incubated in a CO2 incubator for another 2 hours in order to completely degrade the conjugate adhering to the cell surface.
  • the efficiency of oligoribonucleotide penetration into cells was assessed using flow cytofluorometry, for which the cells were washed with sodium phosphate buffer before analysis and detached from the plate surface using Trypsin-EDTA solution according to the standard protocol. The analysis was carried out in DME without phenol red dye.
  • Example 49 Study of the efficiency of the formation of complementary complexes with the participation of modified oligonucleotides.
  • OSN1F, OSN4F and OSNF oligonucleotides were mixed with complementary ISN oligonucleotide. Oligonucleotides OSN1F and OSNF were mixed with a modified complementary oligonucleotide ISN4. Mixing was carried out in phosphate buffer PBS at an oligonucleotide concentration of 2.5 ⁇ M. The results of experiments on measuring the melting temperature of the obtained complementary complexes are presented in the table:
  • the modified oligonucleotides are able to effectively bind to complementary oligonucleotides.
  • the melting temperature of the complementary complexes formed differs only slightly from the melting temperature of the complementary complexes formed by oligonucleotides that do not contain the triazine modification (OSNF/ISN).
  • the cytotoxicity of the OSN4F oligonucleotide was studied on HEK293T and T98G cell cultures in real time using the xCELLigence device (ACEA Biosciences, USA) for 24 hours. /lunes of complete IMDM medium and incubated under standard conditions for 20 h to attach the cells to the bottom of the plate. After that, the medium was replaced with 150 ⁇ l/lune of IMDM medium containing 10% FBS and 0.5, 1, 2.5, 5, 10, 20, 50 ⁇ M OSN4F oligonucleotide. Cells were incubated for 24 h under standard conditions. Cell index values were measured every 30 min.
  • Dose-dependent cell survival curves were generated using MS Excel software for a time point of 24 h after addition of the oligonucleotide to the cells. IC50 values were calculated as the concentration of oligonucleotide required to reduce the cell index by 50% compared to control cells incubated in the absence of oligonucleotide.
  • VEGF165 vascular endothelial growth factor

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

Химическое соединение с триазиновой группой и способ его получения относится к новым соединениям и способам их получения в области химии нуклеотидов. В частности, настоящее изобретение относится к нуклеотидам и олигонуклеотидам, содержащим модифицированную фосфатную группу, и способу их получения. Настоящее изобретение может применяться в цитологических исследованиях, в диагностике ДНК- или РНК-содержащих патогенов, в генной терапии, а также в терапии различных заболеваний бактериальной и вирусной природы, в том числе, COVID-19. Задачей настоящего изобретения является создание соединений, обладающих терапевтическим потенциалом, а также разработка доступного способа их получения.

Description

Химическое соединение с триазиновой группой и способ его получения
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
[001] Настоящее изобретение относится к новым соединениям и способам их получения в области химии нуклеотидов. В частности, настоящее изобретение относится к нуклеотидам и олигонуклеотидам, содержащим модифицированную фосфатную группу, и способу их получения. Настоящее изобретение может применяться в цитологических исследованиях, в диагностике ДНК- или РНК-содержащих патогенов, в генной терапии, а также в терапии различных заболеваний бактериальной и вирусной природы, в том числе, COVID-19.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
[002] Производные нуклеиновых кислот (НК), такие как синтетические олигонуклеотиды, модифицированные различными дополнительными функциональными группами, широко используются как инструменты исследования в различных областях молекулярной биологии, биотехнологии и медицины. Одним из наиболее перспективных направлений можно считать использование олигонуклеотидов в качестве терапевтических агентов - более И препаратов уже одобрено организацией FDA (Food & Drug Administration, США) и более 150 находятся на различных стадиях клинических испытаний. Например, к применению в клинике одобрены такие олигонуклеотидные препараты, как подавляющий ангиогенез аптамер Macugene (Pegaptanib sodium), препараты Exondys 51 (eteplirsen) и Vyondys 53 (golodirsen) для лечения мышечной дистрофии Дюшенна, препарат для лечения спинальной мышечной атрофии Spinraza (nusinersen) и др (https://www.fda.gov/drugs/development-approval-process-drugs/drug- approvals-and-atabases).
[003] Многие олигонуклеотидные препараты направлены на лечение заболеваний, вызванных мутациями в одном или нескольких генах пациента. Соответственно, такие препараты направлены на корректировку экспрессии генов, ответственных за развитие заболевания.
[004] Олигонуклеотиды способны ингибировать транскрипцию, трансляцию или модулировать активность продукта целевого гена. Ингибирование транскрипции осуществляется путем связывания ДНК триплекс-образующими олигонуклеотидами [1], в том числе пептидными нуклеиновыми кислотами (PNA) [2]. Ингибирование трансляции, или антисмысловой (антисенс) механизм осуществляется путем блокирования трасляции со специфической мРНК [3]. Модуляция активности белка, кодируемого целевым геном, происходит за счет связывания олигонуклеотида с самим белком или с низкомолекулярным кофактором, например, в случае аптамеров [4].
[005] Большинство известных олигонуклеотидов действуют по антисмысловому механизму, связываясь со специфической мРНК в клетке, однако принцип и условия ингибирования трансляции отличаются для разных типов олигонуклеотидов. Например, малые интерферирующие РНК (siRNA) вызывают каталитическое расщепление специфической матричной РНК (мРНК) путем формирования НК-белкового комплекса RISC, обладающего нуклеазной активностью. Таким образом, взаимодействие siRNA с целевой мРНК приводит к деградации последней, предотвращая трансляцию мРНК на рибосомах в кодируемый ею белок [5].
[006] НК -энзимы — каталитические нуклеиновые кислоты, представляющие собой олигонуклеотиды с характерной вторичной структурой, также вызывают расщепление мРНК. Однако будучи сами катализаторами гидролитического расщепления РНК, НК- энзимы не нуждаются в клеточных белках [6].
[007] Большинство антисмысловых аналогов олигонуклеотидов связываются с мРНК и подавляют трансляцию, действуя по принципу стерического блокирования [7]. К их числу относятся многие аналоги олигонуклеотидов с модифицированным остатком рибозы: 2'- фтор [8], 2'-О-метильные [9], 2'-О-Р-метоксиэтильные (2'-МОЕ) [10], LNA [11]. Аналоги с незаряженной межнуклеотидной фосфатной группой: метилфосфонаты [12], фосфотриэфиры [13] и фосфорамиды [14] также действуют по принципу стерического блокирования. Аналогичный механизм осуществляется и в случае производных НК где модифицированными являются одновременно остатки рибозы и фосфатной группы, например пептидные нуклеиновые кислоты (PNA) [15] и морфолиновые олигонуклеотиды (РМО) [16].
[008] Олигонуклеотидные препараты также разрабатываются и применяются для лечения болезней, вызванных такими вирусами, как цитомегаловирус человека (HCMV), ВИЧ (HIV-1), гепатит В (HBV), гепатит С (HCV), вирус Эбола, респираторносинцитиальный вирус (РСВ), коронавирус SARS-CoV, вызывающий тяжелый острый респираторный синдром (ТОРС) и др. [17-24].
[009] Разработка терапии с использованием антисмысловых олигонуклеотидов является перспективным направлением борьбы с коронавирусом SARS-CoV-2, вызывающим COVID-19. В частности, разрабатываются антисмысловые олигонуклеотиды, комплементарные элементу FSE (frameshift stimulation element) — высококонсервативному участку генома SARS-CoV-2 [25]. Применение олигонуклеотидов для борьбы с коронавирусом SARS-CoV-2 особенно актуально ввиду сложности получения эффективной вакцины из-за высокой скорости мутирования генов, кодирующих белки оболочки вируса.
[0010] Независимо от механизма действия, соединения, пригодные для создания лекарственных препаратов, в частности олигонуклеотиды, должны обладать терапевтическим потенциалом. Под терапевтическим потенциалом понимается целый спектр полезных свойств необходимых для достижения выраженного терапевтического эффекта. В частности, терапевтические олигонуклеотиды должны обладать следующими свойствами:
[ООП] а) Улучшенное проникновение в клетки, предпочтительно в отсутствие трансфекционных агентов;
[0012] Улучшенное проникновение обеспечивает достижение биологической мишени и необходимость применения более низких дозировок при применении соответствующих препаратов.
[0013] б) Низкая токсичность для клеток;
Низкая токсичность позволяет применять соответствующие препараты в широком диапазоне концентраций с достижением лучших терапевтических эффектов, без вредных последствий для организма.
[0014] в) Высокая стабильность в биологических средах;
[0015] Высокая стабильность позволяет препарату дольше находиться в организме, достигая нужного терапевтического эффекта при минимальном количестве введений препарата. Кроме того, высокая стабильность в биологических средах обеспечивает возможность разнообразного способа введения препарата.
[0016] г) Способностью формировать прочные и специфические комплексы с биологической мишенью;
[0017] Способность формировать прочные комплексы с биологической мишенью обеспечивает необходимый уровень необратимости процесса воздействия для достижения терапевтического эффекта. При этом специфичность образования соответствующих комплексов обеспечивает отсутствие воздействия на другие биологические мишени, минимизируя побочное воздействие на организм.
[0018] д) Доступностью получения.
[0019] Доступным способом получения соединений можно считать такой способ, который будет совместим с существующими и широко применяемыми протоколами синтеза в различных областях техники.
[0020] Существуют технологические аспекты создания соответствующих классов соединений. Например, возможность доведения олигонуклеотидного препарата до действующего лекарства будет сильно лимитирована при использовании не гибкого, дорогостоящего или слишком специфичного, т.е. малосовместимого с широко применяемыми, способа получения. Например, в настоящее время амидофосфитный метод является наиболее эффективным и широко используемым способом синтеза олигонуклеотидов. Протоколы амидофосфитного метода с использованием автоматических ДНК/РНК-синтезаторов известны специалистам в области химии нуклеотидов. Являясь востребованной и быстро развивающейся областью химия автоматического синтеза нуклеиновых кислот и их производных постоянно пополняется новыми, в том числе коммерчески доступными компонентами для олигонуклеотидного синтеза, таких как различные нуклеозидные и ненуклеозидные мономеры, различные модификаторы, в частности флуоресцентные метки и гасители флуоресценции, а также различные защитные группы.
[0021] Таким образом, при получении олигонуклеотида, обладающего терапевтическим потенциалом, совместимость способа получения с существующими синтетическими протоколами амидофосф итной химии является одним из наиболее критических факторов конкурентного преимущества при создании олигонуклеотидных препаратов.
[0022] Обладание даже одним из перечисленных полезных свойств позволяет рассматривать его как соединение, обладающее терапевтическим потенциалом. Чем большее количество перечисленных полезных свойств сочетает в себе определенный класс соединений, и чем выше степень проявления этих свойств, тем выше терапевтический потенциал данного класса соединений и тем более он перспективен для создания терапевтических препаратов.
[0023] Природные олигонуклеотиды хоть и способны образовывать избирательные комплементарные комплексы с биологической мишенью, не являясь при этом токсичным классом соединений для организма, не обладают достаточной стабильностью в биологических средах и плохо проникают в клетки. Для улучшения перечисленных параметров, в состав олигонуклеотидов вводятся различные химические модификации. Введение различных химических модификаций в состав олигонуклеотида, в частности, позволяет повысить эффективность его проникновения через клеточную мембрану, устойчивость к ферментативному гидролизу, устойчивость в большом диапазоне pH, специфичность и стабильность комплекса, образуемого с комплементарным участком целевой нуклеиновой кислоты, при этом сохраняя низкий уровень токсичности для организма [26]. [0024] В структуре олигонуклеотида присутствует несколько положений для модификации - азотистые основания, остаток рибозы, межнуклеотидная фосфатная группа.
[0025] Модификация по межнуклеотидной фосфатной группе выгодно отличаются от остальных позиций для введения неприродных химических групп. Введение модификаций через фосфатную группу остова незначительно влияет на фундаментальное свойство олигонуклеотидов - способностью формировать прочные и специфические комплексы с биологической мишенью. При этом введение различных групп способно наделить создаваемое соединение новыми свойствами в широком диапазоне.
[0026] Известны различные варианты модификаций межнуклеотидных фосфатных групп, например, метилфосфонаты [27], тиофосфаты [28,29], дитиофосфаты [30], боранофосфаты [31], (W01991008213A1, опубл. 13.06.1991; МПК А61К31/69, А61К31/70, А61К31/7135, А61Р29/00, А61РЗ/06, А61Р35/00, С07Н21/00, С07Н21/04, С07Н23/00, C12N15/113, C12Q1/68), амидофосфаты, фосфорилгуанидины и другие.
[0027] Метилфосфонатные олигонуклеотиды обладают высокой устойчивостью к ферментативному гидролизу нуклеазами, а также несколько увеличенной степенью образования комплементарного комплекса. В то же время, метилфосфонатные олигонуклеотиды являются химически нестойкими и легко подвергаются щелочному гидролизу. Кроме того, для получения метилфосфонатных олигонуклеотидов применяются способы получения отличные от амидофосфитного синтеза, что снижает эффективность их получения и лишает производителей возможности использования широкого спектра коммерчески доступных мономеров и модификаторов. Необходимость использования специальных мономеров значительно снижает перспективы метилфосфонатных олигонуклеотидов как платформы для создания терапевтических препаратов [32, 33].
[0028] Боранофосфатные олигонуклеотиды обладают повышенной ферментативной и химической стабильностью. В отличие от метилфосфонатных модификаций боранофосфатные модификации не приводят к исчезновению отрицательного заряда на фосфатной группе. В результате метилфосфонатные олигонуклеотиды способны рекрутировать РНКазу Н для расщепления гибридного ДНК/РНК комплекса. Такой механизм воздействия на целевую мишень, в отличие от простого стерического блокирования, позволяет работать терапевтическому агенту в каталитическом режиме. Однако, образуемые с такими модифицированными олигонуклеотидами комплементарные комплексы менее стабильны по сравнению с природными олигонуклеотидами. Кроме того, способы получения боранофосфатных олигонуклеотидов также несовместимы с амидофоситным синтезом, и также требуют получения набора специальных мономеров [34, 35].
[0029] Амидофосфатные олигонуклеотиды содержат N-замещенную амино группу вместо атома кислорода в составе фосфатной группы. За счет нейтрализации отрицательного заряда фосфатной группы, амидофосфатные олигонуклеотиды более устойчивы к действию нуклеаз. Заместители при аминогруппе могут быть источником введения разнообразных функциональных групп в состав создаваемого олигонуклеотида. Однако, основным недостатком амидофосфатов, ограничивающим их применение, является подверженность кислотному гидролизу вследствие протонирования аминогруппы [36-38]. [0030] Тиофосфатные олигонуклеотиды — один из немногих классов соединений, нашедший применение в области создания терапевтических НК. Тиофосфатные олигонуклеотиды стабильны к действию клеточных нуклеаз, их синтез совместим с протоколами твердофазного амидофосфитного синтеза. Однако, данный тип модификаций не подразумевает никакого разнообразия вводимых групп, кроме как замены атома кислорода на атом серы. Таким образом, изменение свойств в рамках данного класса может быть достигнуто лишь варьированием количества и места введения тиофосфатных звеньев. Также тиофосфатные олигонуклеотиды обладают относительно высокой токсичностью и несколько пониженной способностью образовывать комплексы с НК, по сравнению немодифицированными олигонуклеотидами. Вероятно, именно эти недостатки сдерживают широкое применение данного класса соединений в качестве терапевтических препаратов [39].
[0031] Дитиофосфатные олигонуклеотиды способны активировать РНКазу Н, хотя и с меньшей эффективностью, чем тиофосфатные олигонуклеотиды. При этом дитиофосфатные олигонуклеотидыеще более устойчивы к действию нуклеаз. Однако из-за повышенного содержания серы дитиофосфатные олигонуклеотиды менее специфичны в ингибировании трансляции засчет более сильного связывания с белками. Кроме того, их химический синтез по сравнению с тиофосфатами более сложен.
[0032] К модифицированным по фосфатной группе олигонуклеотидам можно также отнести морфолиновые олигонуклеотиды, у которых изменен весь рибозо-фосфатный остов на морфолино-фосфордиамидный. Такой остов крайне далек от природного, что исключает возможность взаимодействия морфолиновых олигонуклеотидов с любыми НК- зависимыми ферментами, в том числе и с РНКазой Н. Морфолиновые олигонуклеотиды стабильны к действию нуклеаз, а также способны образовывать достаточно прочные комплементарные комплексы с НК. Однако данный класс соединений содержит лишь один представитель, что делает крайне затруднительным варьирование свойств морфолиновых олигонуклеотидов. Кроме того, получение морфолиновых олигонуклеотидов требует специализированного оборудования, мономеров и реактивов. Используемые способы получения морфолиновых олигонуклеотидов несовместимы со стандартным амидофосфитным синтезом [16,40,41].
[0033] Стоит отметить что все выше перечисленные модификации, кроме тиофосфатов и морфолиновых олигонуклеотидов, несмотря на давнюю известность не нашли применения в области создания терапевтических олигонуклеотидов. Часто основной причиной этому служит именно низкий уровень сочетаемости способов их получения со стандартным амидофосфитным методом синтеза.
[0034] Недавно открытый класс фосфорилгуанидиновых олигонуклеотидов также является классом соединений, содержащих модификацию по межнуклеотидной фосфатной группе (RU2708237C2, опубл. 05.12.2019; МПК: А61КЗ 1/712, А61Р31/12, C07F9/24, С07Н19/10, С07Н19/20). В данном случае это остаток замещенного или незамещенного гуанидина, что делает получаемую фосфорилгуанидиновую группу электронейтральной. Представители данного класса олигонуклеотидов стабильны к действию клеточных нуклеаз и устойчивы в широком диапозоне pH. Также при введение достаточно большого количества таких модификаций в состав создаваемого олигонуклеотида, предпочтительно по всем межнуклеотидным фосфатным группам, можно добиться незначительного улучшения проникновения в клетки. Однако при введении большого количества модификаций в состав олигонуклеотида, его остов оказывается сильно отличным от природного рибозо-фосфатного остова. В результате такие модифицированные олигонуклеотиды теряют способность к взаимодействию с НК- зависимыми ферментами, в частности с РНКазой Н, что сильно ограничивает доступные механизмы терапевтического действия данного класса соединений.
[0035] Таким образом, существует необходимость в создании соединений, обладающих высоким терапевтическим потенциалом, получаемых доступным легко масштабируемым способом.
ТЕРМИНЫ И ОПРЕДЕЛЕНИЯ
[0036] Алкил - разветвленный или неразветвленный циклический или ациклический заместитель на основе насыщенных углеводородов со свободной валентностью на атоме углерода. Например, См алкильные группы включают в себя, в том числе, метильный, этильный, н-пропильный, изопропильный или трет-бутильный радикалы.
[0037] Алкенил - разветвленный или неразветвленный ациклический заместитель со свободной валентностью на атоме углерода на основе ненасыщенных углеводородов, содержащих, по крайней мере, одну углерод-углеродную двойную связь, который может содержать или не содержать углерод-углеродных тройных связей.
[0038] Алкинил - разветвленный или неразветвленный ациклический заместитель со свободной валентностью на атоме углерода на основе ненасыщенных углеводородов, содержащих, по крайней мере, одну углерод-углеродную тройную связь. При этом алкинил может содержать или не содержать двойные углерод-углеродные связи.
[0039] Арил - понимается ароматическая или гетероароматическая органическая группа со свободной валентностью на атоме углерода или, в некоторых вариантах реализации, на гетероатоме. Примеры ароматических групп могут включать в себя, в том числе, фенил и нафтил (1-нафтил или 2-нафтил). Арильные группы могут быть моноциклическими или полициклическими .
[0040] Защитная группа — это химическая группа, которая используется для временного блокирования реакционного сайта в органическом соединении и может удаляться в определенных условиях.
[0041] Линкер — ненуклеотидная химическая группа, которая может соединять соседние нуклеотиды в олигонуклеотиде (межнуклеотидный линкер); или соединять нуклеотид или его аналог с другой ненуклеотидной группой; или соединять олигонуклеотид или его аналог с полимерным носителем; или соединять нуклеозид или его аналог с полимерным носителем.
[0042] Нуклеозид — химическое соединение, содержащее остаток сахара и остаток гетероциклического основания. Примеры нуклеозидов могут включать, в том числе, рибозу, 2-дезоксирибозу, арабинозу и т.п. Примеры гетероциклических оснований могут включать в себя, в том числе, тимин, урацил, цитозин, аденин, гуанин, пурин, гипоксантин, ксантин, 2-аминопурин, 2,6-диаминопурин, 5-метилцитозин. 5-фторурацил, 5-хлорурацил. 5-бромурацил. 5-иодурацил. 5-трифторметилурацил. 5 -фтор цитозин. 5- хлорцитозин. 5-бромцитозин. 5-иодцитозин. 2-тиоурацил, 4-тиоурацил, 2-тиотимин, 4- тиотимин, 5-пропинилурацил. 5-пропинилцитозин, 7-деазааденин, 7-деазагуанин, 7-деаза- 8-азааденин, 7-деаза-8-азагуанин, изоцитозин, изогуанин и т. п.
[0043] Под термином «нуклеозид» также может подразумеваться защищенный нуклеозид, аналог нуклеозида и защищенный аналог нуклеозида.
[0044] Аналог нуклеозида — используется для обозначения модифицированного нуклеозида, в котором остаток сахара заменён иной циклической или ациклической структурой. Примеры аналогов нуклеозидов, в которых остаток сахара заменён иной циклической структурой, могут включать в себя, в том числе, мономеры морфолиноолигонуклеотидов (РМО) и трицикло-ДНК. Примеры аналогов нуклеозидов, в которых остаток сахара заменён иной ациклической структурой, могут включать в себя, в том числе, мономеры пептидных нуклеиновых кислот (PNA) и глицериновых нуклеиновых кислот (GNA). Также, термин «аналог нуклеозида» используется для обозначения нуклеозида, содержащего химическую модификацию, например, заместитель в остатке сахара и/или в гетероциклическом основании. Примеры таких аналогов нуклеозидов могут включать в себя, в том числе, 2'-замещённые 2'-дезоксинуклеозиды, такие как 2'-амино и 2'-фтор, и рибонуклеозиды, такие как 2'-О-метил, 2'-О-аллил, 2'-О- - метоксиэтилрибонуклеозиды, «замкнутые» нуклеозиды (LNA) и т. п.
[0045] В том числе, аналоги нуклеозидов могут включать в себя аналоги, в которых остаток сахара заменён морфолиновым кольцом, как показано на формуле ниже:
Figure imgf000010_0001
[0046] где Base - гетероциклическое основание.
[0047] В структурах данного типа обозначения 3' и 5' применяются по аналогии с природными нуклеозидами. В частности, на показанной выше структуре гидроксиметильный заместитель в морфолиновом кольце соответствует 5 '-концу, а третья валентность атома азота - З'-концу нуклеозида.
[0048] Защищенный нуклеозид — нуклеозид, содержащий одну или более защитных групп. Защищенным может быть и аналог нуклеозида. Например, DMTr-нуклеозид содержит DMTr защитную группу на 5'-конце.
[0049] Нуклеотид — химическое соединение, содержащее нуклеозид и хотя бы одну фосфатную группу, присоединенную к нему ковалентной связью. Примером ковалентной связи независимо и без ограничений является эфирная связь между 3'-, 2'- или 5'- гидроксильной группой нуклеозида и фосфатной группой.
[0050] Под термином «нуклеотид» также могут подразумеваться аналог нуклеотида.
[0051] Аналог нуклеотида — химическое соединение, содержащее аналог нуклеозида и хотя бы одну фосфатную группу, присоединенную к нему ковалентной связью. Примеры аналогов нуклеотидов с замененным остатком сахара могут включать, не ограничиваясь этим, 2'-замещенные 2'-дезоксинуклеотиды, такие как 2'-амино и 2'-фтор, и рибонуклеотиды, такие как 2'-О-метил, 2'-О-аллил, 2'-О-Р-метоксиэтилрибонуклеотиды, «замкнутые» нуклеотиды (LNA), морфолино-нуклеотиды, трициклодезоксирибонуклеотиды, гликоль-нуклеотиды. [0052] Олигонуклеотид — химическое соединение, состоящее из двух или более нуклеотидов, соединенных между собой в полимерную цепь. Олигонуклеотид может представлять собой фрагмент ДНК или РНК. Олигонуклеотиды могут быть одноцепочечными или двуцепочечными, т.е. содержать две цепи с высокой степенью комплементарности. При этом любая из цепей или обе могут быть модифицированы согласно настоящему изобретению. Ключевым признаком олигонуклеотида является способность образовывать устойчивые дуплексы с комплементарными участками НК и их производных за счет нековалентной связи. Примером подобной нековалентной связи может служить водородная связь.
[0053] Под термином «олигонуклеотид» также может подразумеваться аналог олигонуклеотида или модифицированный олигонуклеотид, содержащий модификацию, не охватываемую настоящим изобретением.
[0054] Аналог олигонуклеотида — вариант олигонуклеотида, который включает не менее одного аналога нуклеотида, и при этом общее количество нуклеотидов и/или аналогов нуклеотидов составляет два или более. При этом аналог олигонуклеотида может полностью состоять из аналогов нуклеотидов. При этом аналог олигонуклеотида может включать по меньшей мере одну фосфатную группу, которая может быть модифицирована согласно настоящему изобретению.
[0055] Аналоги олигонуклеотидов могут содержать, например, химические группировки на 3'- и/или 5'-конце олигонуклеотида (например, остатка 3 '-«инвертированного» нуклеозида), остатки высокомолекулярного соединения низкой иммуногенности (например, полиэтиленгликоля ), низкомолекулярные соединения (например, холестерин), пептиды (например, пептиды, облегчающие проникновение в клетки), фосфатные группы с модификациями, не охватываемыми настоящим изобретением (например, тиофосфатную группу). Аналоги олигонуклеотидов также могут содержать модифицированные гетероциклические основания. Например, химическая модификация гетероциклических оснований может включать в себя, в том числе, замещение по С-5 пиримидинового нуклеотида, замещение по С-7 7-деазапуринового нуклеотида, замещение по экзоциклической аминогруппе, введение остатков 4-тиоурацила, 5-бром- и/или 5-иодурацила и пр. Аналоги олигонуклеотидов также могут содержать модифицированные остатки сахара. Например, модификация остатка сахара может включать в себя введение 2'-аминонуклеотида, 2'-фторнуклеотида, 2'-О- метилрибонуклеотида, 2'-О-аллилрибонуклеотида, 2'-О-|3-метоксиэтилрибонуклеотида, «замкнутого» нуклеотида (locked nucleic acid, LNA) и/или трицикло-ДНК нуклеотида. Кроме того, в аналогах олигонуклеотидов связи между центральным атомом фосфора в фосфатной группе могут осуществляться, в том числе, через атом кислорода (обычный фосфат), атом азота (N3'-P5' фосфорамид) или атом серы (З'-тиофосфат); соответственно, 3'- и/или 5'-конец нуклеозида может оканчиваться, в том числе, гидроксильной группой, как в природном нуклеозиде, 3' -аминогруппой (N3'-P5' фосфорамид) или 3'- меркаптогруппой (З'-тиофосфат). Примеры аналогов олигонуклеотидов также могут включать, в том числе, тиофосфаты (PS), селенофосфаты, дитиофосфаты, фосфорамиды, боранофосфаты, фосфордиамидные производные морфолиноолигонуклеотидов (РМО), трицикло-ДНК, фосфорилгуанидиновые олигонуклеотиды (PGO) и пептидные нуклеиновые кислоты (PNA). В PNA фосфатные группы заменены пептидными связями. Однако существуют варианты PNA, включающие фосфатные группы, которые могут быть модифицированы согласно настоящему изобретению.
[0056] Защищенный олигонуклеотид — олигонуклеотид, содержащий одну или более защитных групп.
[0057] Фосфатная группа — остаток фосфорной кислоты Н3РО4, в котором один или более атомов водорода замещены органическим радикалом с получением, соответственно, фосфомоноэфира, фосфодиэфира или фосфотриэфира. Под термином фосфатная группа также может подразумеваться модифицированная фосфатная группа.
[0058] Модифицированная фосфатная группа — фосфатная группа, в которой любой из атомов кислорода замещен любой химической группой. Примерами заместителей могут быть, в том числе, атомы серы, селена, иминогруппа (-NHR), остаток борана (-ВН3’), остаток замещенного или незамещенного гуанидина. Предпочтительными примерами модифицированной фосфатной группы являются тиофосфатная группа, фосфорамидная группа, фосфорилгуанидиновая группа.
[0059] Финальное деблокирование — удаление защитных групп и отщепление олигонуклеотида или его аналога от твердофазного носителя (в случае, когда способ получения олигонуклеотида или его аналога реализуется в твердофазном варианте).
[0060] Терапевтический олигонуклеотид - олигонуклеотид или аналог олигонуклеотида, обладающий терапевтическим потенциалом, длиной 5-1000 нуклеотидов, используемый в составе лекарства при терапии рака, геномных нарушений и инфекционных заболеваний различной природы, например, в качестве ASO для ингибирования трансляции (siRNA, микроРНК), для модуляции сплайсинга за счет пропуска экзона, для коррекции генотипа с помощью метода CRISPR/Cas, а также в качестве аптамеров для специфичного ингибирования белков-мишеней или направленного транспорта лекарств. [0061] СОКРАЩЕНИЯ И УСЛОВНЫЕ ОБОЗНАЧЕНИЯ
[0062] ВИЧ — вирус иммунодефицита человека
[0063] ДНК — дезоксирибонуклеиновая кислота
[0064] НК — нуклеиновая кислота (ДНК или РНК)
[0065] офВЭЖХ — обращённо-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография ВЭЖХ (RP-HPLC)
[0066] РНК — рибонуклеиновая кислота
[0067] ASO — antisense oligonucleotide, антисмысловой олигонуклеотид
[0068] DMF — диметилформамид
[0069] DMTr — 4,4'-диметокситритильная группа
[0070] FAM — 6-карбоксифлуоресцеин
[0071] FBS — Fetal Bovine Serum, фетальная бычья сыворотка
[0072] НЕК293Т — Human Embryonic Kidney 293, клеточная линия, полученная из эмбриональных почек человека
[0073] HepG2 — клеточная линия, полученная из гепатоцеллюлярной карциномы человека
[0074] IMDM — Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium, среда для культивации клеток млекопитающих; модификация среды DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium), содержащая селенит натрия, добавочные аминокислоты и витамины, пируват натрия, HEPES (4-(2 -hydroxyethyl)- 1 -piperazineethanesulfonic acid) и нитрат калия вместо нитрата железа.
[0075] LNA — locked nucleic acid, «замкнутая нуклеиновая кислота»
[0076] ME — Международная Единица, единица измерения дозы вещества, основанная на его биологической активности. Количества вещества в 1 ME для разных классов веществ разные. Единицы действия, ЕД, чаще всего совпадают с ME.
[0077] МЕМ — Minimum Essential Medium, среда Игла; среда для культивирования клеточных культур, содержит буферный раствор для поддержания оптимального pH 7,4, глюкозу, аминокислоты, витамины и друге вещества.
[0078] mQ — деионизированная вода, вода I типа (сверхчистая вода)
[0079] Opti-MEM — среда для культивирования клеточных культур; является модификацией минимальной среды МЕМ, рекомендованной для трасфекции.
[0080] PBS — Phosphate buffered saline, изотонический натрий-фосфатный буфер, представляющий собой водный раствор солей, содержащий хлорид натрия, гидрофосфат натрия, хлорид калия и дигидрофосфат калия. Осмолярность и концентрации ионов в растворе приблизительно соответствуют концентрациям в теле человека. [0081] PG — protective group, защитная группа
[0082] PMO — phosphorodiamidate morpholino oligomer, олигонуклеотиды на основе морфолинов.
[0083] PNA — peptide nucleic acid. Термин «пептидные нуклеиновые кислоты» обычно относят к аналогам олигонуклеотидов, в которых, в том числе, фосфатные группы заменены пептидными связями. Однако, термин «пептидные нуклеиновые кислоты» может также включать в себя соединения, которые содержат модифицированные фосфатные группы, являющиеся предметом настоящего изобретения. Таким образом, следует считать, что такого рода соединения также могут быть охвачены данным изобретением.
[0084] siRNA — small interfering RNA, малые интерферирующие РНК
[0085] T98G — клеточная линия, полученная из глиобластомы человека
[0086] THF — тетрагидрофуран
[0087] Ts — тозил
[0088] * — в Примерах обозначает положение заявленной модификации в составе олигонуклеотида
[0089] d — в Примерах обозначает положение додециламидофосфатной группы в составе олигонуклеотида .
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0090] Задачей настоящего изобретения является создание соединений, обладающих терапевтическим потенциалом, а также разработка доступного способа их получения.
[0091] Данная задача решается заявляемым изобретением за счет достижения такого технического результата, как создание соединений, в том числе олигонуклеотидов, которые могут обладать одним или несколькими из следующих свойств:
[0092] а) улучшенным проникновением в клетки, предпочтительно в отсутствие трансфекционных агентов;
[0093] б) низкой токсичностью для клеток;
[0094] в) высокой химической и ферментативной устойчивостью;
[0095] г) способностью формировать прочные и специфические комплексы с биологической мишенью.
[0096] Также важной частью технического результата является возможность получения заявляемых соединений доступным способом (д), т.е способом совместимым с существующими широко применяемыми методами синтеза.
[0097] Заявленный технический результат достигается за счет того, что заявленное изобретение включает соединения, соответствующие формуле F0:
Figure imgf000015_0001
[0098] В котором заместитель Z выбран из группы: -ОН, -SH, -SeH, -NHRN, -O-PG, -S- PG, -Se-PG или -N(PG)RN
[0099] В одном варианте реализации X выбран из группы, состоящей из 5'-О-конца нуклеозида или олигонуклеотида, a Y выбран из группы, состоящей из 3 '-О-конца нуклеозида или олигонуклеотида, -Н, -ОН, -SH, -NHRN, -O-PG или -S-PG, линкера, монофосфата или дифосфата.
[00100] В другом варианте реализации Y выбран из группы, состоящей из 5'-О— конца нуклеозида или олигонуклеотида, а X выбран из группы, состоящей из 3 '-О-конца нуклеозида или олигонуклеотида, -Н, -ОН, -SH, -NHRN, -O-PG или -S-PG, линкера, монофосфата или дифосфата.
[00101] Заместители R1, R2, R3 R4 выбраны из ряда — Н, — С| |Щлкил, — С2 ^алкенил, — Сглхалкинил и -Сблварил, которые могут включать различные липофильные и/или катионные группы.
[00102] Используя различные заместители R1, R2, R3 и R4 в составе триазиновой группы можно широко варьировать липофильность и заряд заявленных соединений. Таким образом можно модулировать параметры биораспеределения в организме, в частности, способность проникать в определенный тип клеток. Это может применяться при создании терапевтических препаратов направленного действия.
[00103] Остаток триазиновой группы придает химическую и ферментативную устойчивость заявленным соединениям. Кроме того, фосфатная группа, модифицированная согласно настоящему изобретению, является электронейтральной, что повышает способность заявленных соединений проникать через клеточную мембрану. Эти свойства характерны для всех заявленных соединений независимо от заместителей, входящих в состав триазинового остатка.
[00104] Предметом настоящего изобретения может являться олигонуклеотид, включающий по меньшей мере одну модифицированную фосфатную группу, соответствующую формуле Fx:
Figure imgf000016_0001
где — показывает место присоединения соответствующих олигонуклеотиду заместителей.
[00105] Наличие даже одной заявленной модификации может улучшать терапевтический потенциал создаваемого соединения, в частности, способность олигонуклеотида проникать через клеточные мембраны. Это позволяет создавать модифицированные олигонуклеотиды с желаемой эффективностью и специфичностью проникновения в клетки при минимальной степени модифицированности олигонуклеотида. Минимизация количества модификаций заметно упрощает процесс получения заявленного олигонуклеотида, и получаемый остов соединения сохраняет способность к взаимодействию с клеточными ферментами. Не менее важно, что заявленная модификация, не ослабляет способность модифицированных олигонуклеотидов образовывать специфические комплексы с комплементарными участками НК или их производными.
[00106] Предметом настоящего изобретения также является способ получения соединения, соответствующего формуле (F0). Способ заключается во взаимодействии производного трехвалентного фосфора формулы (F1) с азидотриазином формулы (F2) с получением соединения формулы (F3), с последующим обработкой аминами HNR'R2. HNR3R4 или HNRXRY. При этом заместители Rx и RY будут преобразованы в заместители R1, R2, R3, R4 с использованием известных в области техники реакций превращения соответствующих реакционных групп, входящих в состав Rx и RY.
Figure imgf000016_0002
[00107] Заместители X, Y, Z определены так же, как они определены в формуле
(F0). [00108] А и В могут быть независимо выбраны из ряда -NR?R2, -NR3R4, -NRXRY, - Q.
[00109] Заместители R1, R2, R3, R4’ R как они описаны в п. Определены так же, как они определены в формуле (F0).
[00110] Q — это группа, способная вступать в реакции замещения. Q выбирается из ряда: -OR, -OC(O)R, -OS(O)2R, -CN, -Cl, -Br, -I, -F, -N3. Группа Q может быть замещена на -NRXR2, -NR3R4, -NRXRY в реакции с соответствующим амином INR'R2, HNR3R4, HNRXRY. Заместители Rx, RY выбраны из ряда, содержащего -Н, -Сь^алкил, -С2- 18алкенил, -Сз-ыалкинил и -Сб-ы рил, которые могут включать группы -NH-, -N<, -О-, - NHC(O)-, -NHS(O)2- И/ИЛИ -N(CH2CH2)2N-, а также оканчиваться группами -NR2, -OR, - SR, -OC(O)R, -NHC(O)R, -C(O)OR, -C(O)NHR, -N=C(N(R2))2, -S(O)R, -S(O)2R, - S(O)2NR2, -CN, -Cl, -Br, -I, -F, -N3.
[00111] При этом R представляет собой заместитель, выбранный из ряда -Н, -Сь 18алкил, -С2.18алкенил, -С2.18алкинил и -Сб-^арил, которые могут включать группы -NH-, -N<, -О-, -NHC(O)-, -NHS(O)2- И/ИЛИ -N(CH2CH2)2N- И могут оканчиваться группами - NRN 2, -ORN, -SRN, -OC(O)RN, -NHC(O)RN, -C(O)ORN, -C(O)NHRN, -N=C(N(R2))2, - S(O)R, -S(O)2R, -S(O)2NR2, -CN, -Cl, -Br, -I, -F, -N3.npn этом заместители R1, R2, R3, R4 определены так же, как они определены в формуле (F0).
[00112] В одном из вариантов реализации способа А = -NRXR2, В = -NR3R4. В этом случае получение соединения, соответствующего формуле (F0), не требует дополнительных химических преобразований.
[00113] В другом варианте реализации способа А = В = -Q. Еще в одном варианте реализации способа А = -NRXR2, В = -Q. В обоих случаях, когда один или оба заместителя А и В представляют собой -Q, группу Q замещают на -NR 1 R2, -NR3R4, -NRXRY в реакции с соответствующим амином HNRXR2, HNR3R4, HNRXRY. Замещение может проводиться как в составе соединения формулы (F2), так и в составе соединения формулы (F3).
[00114] Заместители Rx и RY содержат реакционно способные центры, которые дополнительно подвергают химическому превращению или последовательности химических превращений, приводя структуры заместителей Rx и RY к структурам R1, R2, R3, R4. Причем преобразование Rx, RY в R1, R2, R3 или R4 может проводиться как в составе соединения формулы (F2), так и в составе соединения формулы (F3).
Figure imgf000018_0001
[00115] Заместители R1, R2, R3, R4, Rx и RY могут широко определяться использованием соответствующих коммерческих и отдельно синтезированных аминов HNR^2, HNR3R4 и HNRXRY, ЧТО обеспечивает гибкость выбранного способа получения и вариативность получаемого класса соединений с общей формулой (F0). При этом Rx и RY могут быть преобразованы в R1, R2, R3 или R4 в несколько последовательных этапов. Такая многоэтапность преобразований Rx и RY также обеспечивает возможность получения широко вариативного ряда заявленных соединений без усложнения способа.
[00116] В одном из воплощений способа, относящему к получению олигонуклеотида, производное трехвалентного фосфора — это Н-фосфонатное звено, полученное согласно Н-фосфонатному методу олигонуклеотидного синтеза, или фосфитное звено, полученного согласно амидофосфитному методу олигонуклеотидного синтеза.
[00117] При этом способ получения модифицированных олигонуклеотидов согласно настоящему изобретению может быть реализован в жидкофазном варианте, когда все реагенты во всех реакциях находятся в растворе. В предпочтительном варианте реализации заявленный способ осуществляется в твердофазном варианте, где синтезируемый олигонуклеотид иммобилизован на твердофазном носителе. В качестве твердофазного носителя может быть использован полимерный носитель.
[00118] В предпочтительном варианте реализации конденсация всех амидофосфитных звеньев производится в автоматическом режиме с помощью ДНК- синтезатора. При этом триазиновая группа может быть введена в любую межнуклеотидую фосфатную группу синтезируемого олигонуклеотида.
[00119] В рамках настоящего изобретения модифицированными могут быть одна и более межнуклеотидных фосфатных групп в составе олигонуклеотида. В одном из вариантов реализации модифицированными могут быть все межнуклеотидные фосфатные группы в составе олигонуклеотида. Однако в предпочтительном варианте реализации олигонуклеотид содержит одну или две модифицированных межнуклеотидных фосфатных групп [00120] Одним из достоинств заявленного способа является возможность его совмещения со стандартным протоколом амидофосфатного синтеза, что заметно упрощает и удешевляет получение модифицированных олигонуклеотидов.
[00121] Не менее важным достоинством заявленного способа является большая вариативность получаемых соединений, которая обеспечивается иерархической последовательностью этапов получения целевого соединения.
[00122] Настоящее изобретение может применяться в цитологических исследованиях, в молекулярной диагностике, в области создания терапевтических препаратов, направленных на лечение рака, геномных нарушений, различных заболеваний бактериальной и вирусной природы, в том числе, COVID-19. В частности, олигонуклеотиды, модифицированные согласно настоящему изобретению, могут быть использованы в таких методиках, как, например, альтернативный сплайсинг, антисмысловая микроРНК- и siRNA-терапия, использование аптамеров, редактирование генома с помощью CRISPR/Cas и другие.
ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
[00123] На Фиг. 1 приведены примеры хроматографического анализа (офВЭЖХ) получаемых соединений.
[00124] На Фиг. 2 приведены примеры масс-спектрометрического анализа (ESI MS) получаемых соединений.
[00125] На Фиг. 3 показаны результаты исследования химической устойчивости модифицированного олигонуклеотида в щелочных условиях.
[00126] На Фиг. 4 показаны результаты исследования химической устойчивости модифицированных олигонуклеотидов в кислой среде.
[00127] На Фиг. 5 показаны результаты исследования ферментативной устойчивости триазиниламидофосфатных модифицированных олигонуклеотидов.
[00128] На Фиг. 6 представлены результаты исследования эффективности проникновения модифицированного олигонуклеотида в культивируемые клетки человека НЕК293Т, T98G.
[00129] На Фиг. 7 показаны результаты лазерной конфокальной микроскопии клеток человека, трансфецированных модифицированным олигонуклеотидом.
[00130] На Фиг. 8 представлены результаты исследования эффективности проникновения в клетки человека олигонуклеотидов, содержащих додецильные остатки в составе модификаций с различными остовами. [00131] На Фиг 9 приведены результаты исследования эффективности проникновения в клетки человека HEPG2 модифицированных олигорибонуклеотидов.
[00132] На Фиг. 10 представлены результаты исследования цитотоксичности модифицированных олигонуклеотидов.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[00133] В приведенном ниже подробном описании реализации изобретения приведены многочисленные детали реализации, призванные обеспечить отчетливое понимание настоящего изобретения. Однако, квалифицированному в предметной области специалисту, очевидно, каким образом можно использовать настоящее изобретение, как с данными деталями реализации, так и без них. В других случаях хорошо известные методы, процедуры и компоненты не описаны подробно, чтобы не затруднять излишне понимание особенностей настоящего изобретения.
[00134] Кроме того, из приведенного изложения ясно, что изобретение не ограничивается приведенной реализацией. Многочисленные возможные модификации, изменения, вариации и замены, сохраняющие суть и форму настоящего изобретения, очевидны для квалифицированных в предметной области специалистов.
[00135] Настоящее изобретение относится к соединениям, соответствующим формуле F0:
Figure imgf000020_0001
[00136] В котором заместитель Z выбран из группы: -ОН, -SH, -SeH, -NHRN, -О- PG, -S-PG, -Se-PG или -N(PG)RN
[00137] В одном варианте реализации X выбран из группы, состоящей из 5'-О-конца нуклеозида или олигонуклеотида, a Y выбран из группы, состоящей из 3 '-О-конца нуклеозида или олигонуклеотида, -Н, -ОН, -SH, -NHRN, -O-PG или -S-PG, линкера, монофосфата или дифосфата.
[00138] В другом варианте реализации Y выбран из группы, состоящей из 5'-О— конца нуклеозида или олигонуклеотида, а X выбран из группы, состоящей из 3 '-О-конца нуклеозида или олигонуклеотида, -Н, -ОН, -SH, -NHRN, -O-PG или -S-PG, линкера, монофосфата или дифосфата.
[00139] Примеры защитных групп (PG) могут включать, в том числе, ацетильную (Ас), бензоильную (Bz), изобутирильную (Ibu), m-бутилфеноксиацетильную (Тас), левулинильную (Lev), метильную (Me), (3- цианэтильную (СЕ), аллильную (АП), о- хлорфенильную (o-CIPh), 4,4'-диметокситритильную (DMTr), 4-метокситритильную (ММТг), m-бутилдиметилсилильную (TBDMS), триизопропилсилилоксиметильную (ТОМ) и другие группы.
[00140] Примеры линкеров могут включать, в том числе, сукцинильный, дигликолильный, оксалильный, гидрохинон-О, О'-диацетильный (Q-линкер), фталоильный, 4,5-дихлорфталоильный, малонильный, глутарильный, диизопропилсилильный, 1, 1,3,3-тетраизопропилдисилоксан-1,3-диильный, BHQ-линкер, аминолинкер и другие линкеры.
[00141] Заместители R1, R2, R3. R4 выбраны из ряда -Н, -Смзалкил, -С2л8алкенил, - С лхалкинил и -Сб варил, которые могут включать группы -NH-, -N<, -О-, -NHC(O)-, -
Figure imgf000021_0001
[00142] Заместители R5, R6, R7 R8 выбраны из ряда, содержащего -Н, -См халкил. - Сглвалкенил, -Сз алкинил и -Сел вар ил, которые могут включать группы -NH-, -N<, -О- , -NHC(O)-, -NHS(O)2- И/ИЛИ -N(CH2CH2)2N-, а также оканчиваться группами -NR2, - OR, -SR, -OC(O)R, -NHC(O)R, -C(O)OR, -C(O)NHR, -N=C(N(R2))2, -S(O)R, -S(O)2R, - S(O)2NR2, CN, Cl, Br, I, F, -N3. [00143] При этом R представляет собой заместитель, выбранный из ряда -Н, -С ыалкил, -Сглвалкенил, -С2-1залкинил и -Сел варил, которые могут включать группы -NH-, -N<, -О-, -NHC(O)-, -NHS(O)2- и/или -N(CH2CH2)2N- и могут оканчиваться группами - NRN 2, -ORN, -SRN, -OC(O)RN, -NHC(O)RN, -C(O)ORN, -C(O)NHRN, -N=C(N(R2))2, - S(O)R, -S(O)2R, -S(O)2NR2, -CN, -Cl, -Br, -I, -F, -N3.
[00144] При этом PG — это защитная группа, a RN представляет собой -Н или -Сц 4алкил.
[00145] В некоторых вариантах воплощения заместители R1 и R2; R3 и R4; R5 и R6; R7 и R8 совместно со связанным с ними атомом могут формировать 5-8 членный гетероцикличный заместитель, выбранный из группы, состоящей N-пирролидинила, N- пиперидинила, N-азепанила, N-азоканила или N-пиперазинила.
[00146] В заявленных соединениях вводимый остаток триазиновой группы придает им химическую и ферментативную устойчивость. Кроме того, фосфатная группа, модифицированная согласно настоящему изобретению, является электронейтральной, в отличие от отрицательно заряженной немодифицированной фосфатной группы, что повышает способность заявленного соединения проникать через клеточную мембрану. Эти свойства характерны для всего класса описываемых соединений независимо от заместителей, входящих в состав триазинового остатка.
[00147] Используя различные заместители R1, R2, R3 и R4 в составе триазиновой группы можно широко варьировать липофильность и заряд получаемого соединения, и соответственно модулировать способность заявленного соединения к биораспеределению в организме, в частности, проникать в клетки в зависимости от состава клеточной мембраны определенного типа клеток. Это может применяться при создании терапевтических препаратов, которые должны специфично проникать только в определенный тип клеток.
[00148] Важно отметить, что наличие даже одной заявленной модификации может улучшать терапевтический потенциал создаваемого соединения, в частности, способность олигонуклеотида проникать через клеточные мембраны. Это позволяет создавать модифицированные олигонуклеотиды с желаемой эффективностью и специфичностью проникновения в клетки при минимальной степени модифицированности олигонуклеотида. Минимизация количества модификаций заметно упрощает процесс получения заявленного олигонуклеотида,
[00149] Кроме того, минимизация количества модификаций, в предпочтительном варианте реализации единичная модификация, локализованная в З'-конце или 5 '-конце олигонуклеотида, минимально меняет общую структуру рибозо-фосфатного остова олигонуклеотида. Это сохраняет возможность взаимодействия модифицированного олигонуклеотида с НК-ферментами, в частности с РНКазой Н.
[00150] Не менее важно, что заявленная модификация незначительно сказывается на способности модифицированных олигонуклеотидов образовывать специфические комплексы с комплементарными участками НК-мишеней. Это объясняется тем что в комплементарном комплексе триазиновая группа и присоединенные к ней заместители, при образовании комплексов с комплементарными участками ДНК или РНК оказываются экспонированными наружу от двойной спирали и тем самым не оказывают влияния на комплементарное взаимодействие азотистых оснований внутри нее.
[00151] В зависимости от заместителей модифицированная фосфатная группа может быть хиральной. В случае, если стереохимическая конфигурация не обозначена, структура включает в себя как Rp, так и Sp конфигурацию, как раздельно, таки и в виде смеси: например, рацемической смеси (рацемата). Например, структура:
Figure imgf000023_0001
включает в себя следующие структуры, как показано ниже:
Figure imgf000023_0002
[00152] Заявленные соединения также могут включать в себя более одного хирального центра. В таком случае следует считать, что структура охватывает все возможные энантиомеры и диастереомеры.
[00153] В частном случае, когда заместитель Z представляет собой -ОН, формула F0 может быть записана в виде двух таутомерных форм:
Figure imgf000024_0001
[00154] Предметом настоящего изобретения может быть олигонуклеотид, содержащий хотя бы одну модифицированную фосфатную группу соответствующую формуле (Fx):
Figure imgf000024_0002
где — показывает место присоединения соответствующих олигонуклеотиду заместителей, а R1, R2, R3 и R4 определяются так же, как в формуле (F0).
[00155] Формула (Fx) отражает структуру олигонуклеотида, модифицированного согласно настоящему изобретению после этапа финального деблокирования.
[00156] Олигонуклеотиды согласно настоящему изобретению могут состоять из любого количества нуклеотидов, не менее 2. Например, олигонуклеотид может иметь минимальную длину в 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 или 40 нуклеотидов. Опционально, олигонуклеотид может иметь максимальную длину в 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45,
46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71,
72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97,
98, 99, 100, ПО, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270,
280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, или 500 нуклеотидов, хотя и более длинные олигонуклеотиды могут быть использованы в отдельных применениях. Исключительно для примера, может быть получен олигонуклеотид, состоящий из 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100 нуклеотидов.
[00157] В олигонуклеотидах, являющихся предметом настоящего изобретения, один или несколько, например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,10 или более нуклеотидов, или же все нуклеотиды могут содержать фосфатную группу, модифицированную в соответствии с настоящим изобретением. В предпочтительно варианте реализации олигонуклеотид содержит не более двух заявленных модификаций. В еще более предпочтительном варианте реализации олигонуклеотид содержит одну заявленную модификацию.
[00158] Олигонуклеотиды длиной от 5 до 500 нуклеотидов, модифицированные согласно настоящему изобретению, могут применяться при терапии рака, геномных нарушений и инфекционных заболеваний, например, в качестве ASO для ингибирования трансляции (siRNA, микроРНК), для модуляции сплайсинга за счет пропуска экзона, для коррекции генотипа с помощью метода CRISPR/Cas, а также в качестве аптамеров для специфичного ингибирования белков-мишеней или направленного транспорта лекарств и в других применениях. Длина модифицированного олигонуклеотида 5-500 нуклеотидов, с одной стороны, обеспечивает специфичность комплекса, который формирует олигонуклеотид с комплементарным участком НК. С другой стороны, указанная длина позволяет получать модифицированный олигонуклеотид, используя автоматический ДНК- синтезатор.
[00159] Олигонуклеотиды в рамках настоящего изобретения могут быть получены и выделены в чистом виде.
[00160] Часть предпочтительных соединений, охватываемых настоящим изобретением, соответствуют формулам, приведённым ниже:
Figure imgf000026_0001
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЗАЯВЛЕННОГО СОЕДИНЕНИЯ
[00161] Способ получения заявленных соединений формулы (F0) заключается во взаимодействии производного трехвалентного фосфора формулы (F1) с азидотриазином формулы (F2) с получением соединения формулы (F3), как показано на схеме.
Figure imgf000027_0001
(F1) (F2) (F3)
[00162] Заместители X, Y, Z определены так же, как они определены в формуле (F0).
[00163] А и В могут быть независимо выбраны из ряда -NR1!?2, -NR3R4, -NRXRY, - Q.
[00164] Заместители R1, R2, R3, R4 определены так же, как они определены в формуле (F0).
[00165] Q — это группа, способная вступать в реакции замещения. Q может представлять собой, например, -OR; -OC(O)R; -OS(O)2R; -CN; -Cl; -Br; -I; -F; -N3. В рамках заявленного способа группу
[00166] Q замещают на -NR^2, -NR3R4, -NRXRY В реакции с соответствующим амином HNR' R2, HNR3R4, HNRXRY. Причем замещение может производиться как в составе используемого азидотриазина (F2), так и в составе соединения (F3).
[00167] Использование азидотриазина (F2) для окисления производного трехвалентного фосфора (F1) обеспечивает сразу несколько технических преимуществ.
Во-первых, ввиду акцепторной природы триазиновой группы, азидотриазины являются гораздо более реакционно способными соединениями, чем азиды с более электронодонорными заместителями, такими как, например, алкил-азиды. Во-вторых, структурные особенности используемого азидотриазина позволяют вводить сразу две функциональные группы (А и В) в состав получаемого соединения в пределах одной фосфатной группы, что в большинстве случаев позволяет наделять получаемое соединение желаемым свойством используя лишь единичную модификацию.
[00168] Rx и RY представляют собой заместители, которые содержат в своем составе липофильные и/или катионные группы, а кроме того содержат реакционноспособные центры, которые будут дополнительно подвергнуты химическому превращению иди последовательности химических превращений, приводя структуры заместителей к структурам R1, R2, 3или R4. Причем преобразование Rx, RY в R1, R2, R3 или R4 может проводиться как в составе соединения (F2), так и в составе соединения (F3).
Figure imgf000028_0001
использованием соответствующих коммерческих и отдельно синтезированных аминов HNRXR2, HNR3R4 и HNRXRY, что обеспечивает гибкость заявленного способа получения и разнообразие представителей получаемого класса соединений с общей формулой (F0).
Заместители Rx, RY выбраны из ряда, содержащего -Н, -Смзалкил, -Сгчзалкенил, -С2-
18алкинил и -Сблварил, которые могут включать группы -NH-, -N<, -О-, -NHC(O)-, - NHS(O)2- И/ИЛИ -N(CH2CH2)IN-, а также оканчиваться группами -NR2, -OR, -SR, - OC(O)R, -NHC(O)R, -C(O)OR, -C(O)NHR, -N=C(N(R2))2, -S(O)R, -S(O)2R, -S(O)2NR2, -
CN, -Cl, -Br, -I, -F, -N3.
[00170] В частных вариантах реализации, Rx, RY либо R1, R2, R3, R4 определяются аминами, приведенными ниже:
Figure imgf000028_0002
[00171] Присутствующие функциональные группы, такие как -NH2, -ОН, -NH-, в составе заместителей Rx, RY могут быть преобразованы в другие функциональные группы с использованием простых реакций органического синтеза, известных специалистам предметной области.
[00172] В частности, если Rx, RY содержат в своем составе группу -NH2, то эта группа может быть преобразована, например, в -NRX12 в реакции с QRX1; или в - NHRX1 в реакции с TsORxl; или в -NHC(O)RX1 в реакции с QC(O)RX1; или в - NHS(O)2RX1 В реакции с QS(O)2RX1; или в -N=C(N(RN2))2 В реакции с
[QC+(NR 2)2]Е"; или
Figure imgf000029_0001
последовательно проведенных реакциях с
Figure imgf000029_0002
, , аминами
NHRX1RX2 и NHRX3RX4.
[00173] Если Rx, RY содержат в своем составе группу -ОН, то эта группа может быть преобразована, например, в -ORX1 в реакции с Rxl; или в -NHRX1 в последовательно проведенных реакциях с QTs и амином NH2RX1; или в нуклеотид или олигонуклеотид после продолжения автоматического синтеза, где группа -ОН является точкой роста олигонуклеотидной цепи.
[00174] При этом Rxl, Rx2, Rx3, Rx4 выбираются из ряда, содержащего -Н, -Сц 18алкил, -Сг-18алкенил, -Сглвалкинил и -Св- арил, которые могут включать группы -NH-, -N<, -О-, -NHC(O)-, -NHS(O)2- И/ИЛИ -N(CH2CH2)2N- а также оканчиваться группами - NR2, -OR, -SR, -OC(O)R, -NHC(O)R, -C(O)OR, -C(O)NHR, -N=C(N(R2))2, -S(O)R, -
S(O)2R, -S(O)2NR2, -CN, -Cl, -Br, -I, -F, -N3.
[00175] Если RX1, RX2, RX3, RX4 содержат группу -NH2, то эта группа может быть преобразована в -NR2 в реакции с QR; или в -NHR в реакции с TsOR; или в - NHC(O)R в реакции с QC(O)R; или в -NHS(O)2R в реакции с QS(O)2R; или в - N=C(N(RN 2))2 В реакции c [QC+(NRN 2)2]E“; ИЛИ В
Figure imgf000030_0001
В последовательно проведенных реакциях с
[00176]
Figure imgf000030_0004
, либо
Figure imgf000030_0003
либо
Figure imgf000030_0002
и аминами NHR5R6 и NHR7R8.
[00177] Если Rxl, Rx2, Rx3, Rx4 оканчиваются на -ОН, то эта терминальная группа может быть преобразована в -OR в реакции с QR; или в -NHR в последовательно проведенных реакциях с QTs и амином NH2R; или в нуклеотид или олигонуклеотидную последовательность после продолжения автоматического синтеза.
[00178] При этом заместители R5, R6, R7, R8, R, RN как они описаны в (F0).
[00179] При этом Е’ представляет собой анионную составную часть, выбранную из группы, содержащей Г, Вг", СГ, сукцинимид ((CH2)2(CO)2N“), СС1з', СВгз", CI3’, СН12“, трифторметансульфонат (CF3SO3’), пара-толуол сульфонат (С7Н780з ), дихлорфосфат (РО2С12 ), перхлорат (СЮ4 ), тетрафторборат (BF4 ), тетрафенилборат (BPI14’), или гексафторфосфат (РЕ-, ).
[00180] В частных вариантах реализации в случае наличия в Rx, RY первичных или вторичных аминогрупп (~NH2, -NH-) возможно получение модифицированных групп, оканчивающихся на остатки, выбираемых из ряда тозил, ацетил, остаток незамещенного или замещенного гуанидинина, остаток 4, 6-дихлоро-1, 3,5-триазина. В случае выбора 4,6- дихлоро- 1,3, 5-триазина как концевого остатка возможна его дальнейшая модификация с использованием аминов NHRX1RX2, выбираемых из ряда метиламина, бутиламина, пиперазина и др.
[00181] В частных вариантах реализации в случае наличия в Rx, RY гидроксигрупп - ОН данные группы могут быть преобразованы в другие производные в реакции с соответствующими нуклеофильными реагентами. В частности гидроксигруппы могут быть преобразовнаы в отсатки простого эфира, сложного эфира, являться точкой роста новой олигонуклеотидной последовательности. В случае замещения остатком тозила возможна его дальнейшая модификация с использованием аминов NHR^R 2 С получением соответствующих остатков вторичных и первичных аминов.
[00182] Некоторые примеры химических преобразований групп -NH2 и -ОН представлены ниже:
Figure imgf000031_0001
[00183] Олигонуклеотид, содержащий хотя бы одну модифицированную фосфатную группу, соответствующую формуле (Fx), также может быть получен в рамках заявленного способа, с использованием стандартных протоколов автоматического твердофазного амидофосфитного синтеза.
[00184] Амидофосф итный метод является наиболее эффективным и широко используемым способом синтеза олигонуклеотидов. Протоколы амидофосфитного синтеза известны специалистам в области получения олигонуклеотидов и в основном осуществляются в твердофазном варианте с использованием автоматического ДНК- синтезатора. Вкратце, DMTr-нуклеозид, иммобилизованный на полимерном носителе, подвергается детритилированию, а затем конденсации с соответствующим образом активированным нуклеозид-амидофосфитом с образованием фосфит-триэфира. За этим обычно следует «кэппинг», т.е. ацилирование непрореагировавших гидроксильных групп нуклеозидов, иммобилизованных на полимерном носителе, после чего фосфит-триэфир окисляется в фосфотриэфир при помощи соответствующего окислителя. Данный цикл повторяют до окончания наращивания целевой олигонуклеотидной последовательности.
[00185] Способ получения модифицированных олигонуклеотидов согласно настоящему изобретению, включает следующие этапы:
[00186] 1) синтез олигонуклеотидной цепи проводится на ДНК синтезаторе по стандартному амидофосфитному протоколу вплоть до этапа конденсации звена, чья фосфатная часть будет модифицирована согласно настоящему изобретению; После конденсации соответствующего мономера, синтез останавливают после образования фосфит-триэфира (F1), до стадий «кэппинга» и окисления. Образовавшийся на этапе конденсации фосфит-триэфир (F1) обрабатывают азидотриазином (F2) при температуре от 5°С до 65°С, предпочтительно от 14°С до 29°С, еще более предпочтительно от 20°С до 25°С, с образованием соединения (F3);
[00187] 2) при необходимости проводят обработку безводным раствором амина с замещением А и/или В на остатки -NE'E2, -NR3R4, либо -NRXRY в составе соединения (F3) и проводят дополнительные химические превращения функциональных групп Rx и RY до получения структур R1, R2, R3 и R4;
[00188] 3) продолжают синтез олигонуклеотида по амидофосфитному протоколу вплоть до следующего этапа конденсации звена, чья фосфатная часть будет модифицирована согласно настоящему изобретению и повторяют этапы 1, 2; либо продолжают синтез до получения полноразмерного олигонуклеотида. Проводят финальное деблокирование синтезированного олигонуклеотида с получением целевой структуры согласно формуле (Fx).
[00189] В том случае, когда А и В в составе азидотриазина (F2) представляют собой -NR 1 R2 и -NR3R4, этап 2) опускают. [00190] В одном варианте реализации А и В в составе азидотриазина (F2) могут представлять собой атомы хлора. 2-азидо-4,6-дихлоро- 1,3,5-триазин может быть получен в одну стадию из коммерчески доступного цианурхлорида, как показано в Примере 1.
[00191] В другом варианте реализации азидотриазин (F2) представляет собой 2- азидо-4-алкиламино-6-хлоро-1, 3,5-триазин, который может быть получен из цианурхлорида и соответствующего амина, как показано в Примерах 2-4.
[00192] В другом варианте реализации азидотриазин (F2) представляет собой 2- азидо-4,6-диалкиламино-1, 3,5-триазин, который может быть получен из цианурхлорида и соответствующих аминов, как показано в Примере 5.
[00193] Описанный способ получения модифицированного олигонуклеотида, может быть реализован в жидкофазном варианте, когда все реагенты во всех реакциях находятся в растворе и не связаны с твердофазными носителями. Однако предпочтительно заявленный способ реализуется в твердофазном варианте, когда синтезируемый олигонуклеотид связан с твердофазным носителем.
[00194] В качестве твердофазного носителя может быть использован полимерный носитель. Примеры полимерных носителей могут включать, в том числе, стекло с контролируемым размером пор (CPG), полистирольные смолы, TentaGel®, TSK Gel® Toyopearl®, поливиниловый спирт, ацетат целлюлозы и т. п.
[00195] Проведение дополнительных обработок олигонуклеотида на твердой фазе обеспечивает такие технологические преимущества, как простота отделения продукта обработки от непрореагировавшего раствора реагента, малые затраты модифицирующих агентов, высокая эффективность проводимых реакций.
[00196] В предпочтительном варианте реализации конденсация всех амидофосфитных мономеров производится в автоматическом режиме с помощью автоматического ДНК-синтезатора. При этом триазиновая группа может быть введена в любую межнуклеотидую фосфатную группу синтезируемого олигонуклеотида.
[00197] Одним из главных достоинств заявленного способа является возможность введения в состав олигонуклеотида большого разнообразия комбинаций органических радикалов Rl, R2, R3 R4 в составе даже одной триазинамидофосфатной модификации. При этом заявленный способ предусматривает первоначальное получение общего предшественника — соединения (F3) — с возможностью дальнейшей последовательной сборки целевых органических радикалов Rl, R2, R3 R4, путем обработки соединения (F3) различными реагентами, как описано выше. Такая иерархичная сборка финальной структуры (F0) позволяет получать широкий спектр представителей заявленного класса соединений доступным способом, особым преимуществом которого является совместимость co стандартным протоколом автоматического твердофазного амидофосфитного метода синтеза олигонуклеотидов. Кроме того благодаря химической устойчивости как в щелочных, так и кислотных средах получаемой амидотриазиновой связи данного типа модификации в структуре (Fx), получаемые модифицированные олигонуклеотиды стабильны в широком диапозоне значений pH.
[00198] Широкое разнообразие олигонуклеотидов, получаемых в рамках заявленного способа, проиллюстрировано Примерами с 6 по 43.
ОПИСАНИЕ РЕАЛИЗАЦИИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[00199] В настоящих материалах заявки представлено предпочтительное раскрытие осуществления заявленного технического решения, которое не должно использоваться как ограничивающее иные, частные воплощения его реализации, которые не выходят за рамки испрашиваемого объема правовой охраны и являются очевидными для специалистов в соответствующей области техники.
[00200] Далее термин «олигонуклеотид» будет применяться к олигодезоксмрмбонуклеотидам, если специально не указано что-либо другое.
ОБЩИЕ МЕТОДЫ
[00201] Модифицированные олигонуклеотиды, были синтезированы на автоматическом ДНК-синтезаторе ASM-800 (Биоссет, Россия) согласно амидофосфитному протоколу [42] в масштабе 0,2 мкмоль с использованием стандартных реакторов объемом 25 мкл.
[00202] Получение фосфит-триэфира для введения в реакцию Штаудингера с азидотриазином проводили следующим образом. Реактор, содержащий 10 мг полимерного носителя на основе пористого стекла (500 А) с иммобилизованным нуклеозидом (загрузка нуклеозида 40 мкмоль/г) помещали в ДНК синтезатор и запускали протокол автоматизированного твердофазного синтеза олигонуклеотидов по (3 -цианэтильной фосфитамидной схеме в масштабе 0,2 мкмоль. Проводили синтез олигонуклеотидной цепи вплоть до звена, чья фосфатная часть будет модифицирована триазиновым остатком. После стадии конденсации с получением фосфит-триэфира, синтез останавливали, реактор вынимали из синтезатора, подсушив на водоструйном насосе после промывки сухим ацетонитрилом, полимерный носитель с иммобилизованным фосфит -триэфиром переносили из реактора в пластиковую пробирку для дальнейшей реакции с соответствующим азидотриазином и, при необходимости, дополнительных обработок. [00203] Введение остатка 6-карбоксифлуоресцеина в виде флуоресцеинового амидофосфитного мономера осуществлялось по специальному протоколу с концентрацией флуоресцеинового амидофосфитного мономера 0,1 М, суммарным объемом флуоресцеинового амидофосфитного мономера 70 мкл, временем подачи флуоресцеинового амидофосфитного мономера 30 минут. Во всех последующих примерах остаток 6-карбоксифлуоресцеина в составе олигонуклеотида обозначается как [FAM], [00204] Для всех реакций использовали пластиковые пробирки объемом 1,5 мл с завинчивающейся крышкой. После твердофазного синтеза полимерный носитель из реактора переносили в пластиковую пробирку и проводили этап финального деблокирования концентрированным водным раствором метиламина. После финального деблокирования супернатант упаривали досуха в вакууме на установке SpeedVac. К остатку прибавляли 200 мкл деионизированной воды (mQ) и отделяли полимерный носитель центрифугированием.
[00205] Модифицированные олигонуклеотиды выделяли с помощью обращенно- фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (офВЭЖХ). Выделение проводили на хроматографе Agilent 1200 (США) с колонкой 'orbax SB-C18 (5 мкм) 4,6 х 150 мм в градиенте ацетонитрила в 20 мМ ацетате триэтиламмония, pH 7 от 0 до 90%, в течение 30 мин при скорости потока 1.5 мл/мин. Фракции, содержащие целевой продукт, упаривали в вакууме на установке SpeedVac. Затем олигонуклеотиды высаживали добавлением 1 мл раствора 1 М LiCICE в ацетоне, осадок промывали ацетоном и сушили на воздухе 20 минут. Для контроля чистоты модифицированных олигонуклеотидов использовали денатурирующий гель-электрофорез в полиакриламидном геле (ПААТ) с 15% или 20% метилен-бис-акриламида с визуализацией полосок путём окрашивания раствором красителя Stains- АП. Молекулярные массы модифицированных олигонуклеотидов определяли при помощи масс-спектроскопии MALDI-TOF или ESI в варианте регистрации положительных или отрицательных ионов.
ВАРИАНТЫ РЕАЛИЗАЦИИ СПОСОБА ПОЛУЧЕНИЯ МОДИФИЦИРОВАННЫХ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ
[00206] Вариант 1. Введение остатка 4,6-диалкиламино-1,3,5-триазино-2- амидофосфата с использованием 2-азидо-4,6-дихлоро- 1,3, 5-триазина.
[00207] 1) Синтез олигонуклеотидной цепи вплоть до звена, чья фосфатная часть будет модифицирована триазиновым остатком проводили на ДНК синтезаторе, как описано в общих методах. Далее фосфит-триэфир, иммобилизованный на твердофазном носителе переносили в пробирку и добавляли 200 мкл 0,03-1 М раствора 2-азидо-4,6- дихлоро-1, 3,5-триазина, задували аргоном и встряхивали на шейкере в течение 15 минут при комнатной температуре. Суспензию центрифугировали на 13400 об/мин в течение 30 сек, отбирали супернатант, трижды промывали полимерный носитель 200 мкл сухого ацетонитрила.2) В пластиковую пробирку с полимерным носителем добавляли 200 мкл раствора (0.1 - ЗМ) амина, содержащего желаемые функциональные остатки, либо функциональные остатки для дальнейшей модификации, такие как -ОН, -NH2, -NH- и т.д. В последнем случае проводили последовательные химические превращения путем обработок различными растворами для дополнительной модификации, такие как реакции с тозилхлоридом, хлорангидридами, аминами, гуанидирующими реагентми и др.; (см. раздел ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ). Между обработками растворами суспензию центрифугировали на 13400 об/мин в течение 30 сек, отбирали супернатант, трижды промывали полимерный носитель 200 мкл сухого ацетонитрила.3) Носитель с иммобилизованным модифицированным олигонуклеотидом переносили в реактор для синтеза олигонуклеотидов, после чего продолжали автоматизированный твердофазный синтез по амидофосфитному протоколу. После завершения олигонуклеотидного синтеза проводили финальное деблокирование концентрированным водным раствором метиламина.
Figure imgf000037_0001
[00208] Вариант 2. Введение остатка 4,6-диалкиламино-1,3,5-триазино-2- амидофосфата с использованием 2-азидо-4-алкиламино-6-хлоро-1, 3,5-триазинов.
[00209] 1) Синтез олигонуклеотидной цепи вплоть до звена, чья фосфатная часть будет модифицирована триазиновым остатком проводили на ДНК синтезаторе, как описано в общих методах. Далее фосфит-триэфир, иммобилизованный на твердофазном носителе переносили в пробирку и добавляли 200 мкл 0,1 - 3 М раствора 2-азидо-4- алкиламино-6-хлоро- 1,3, 5-триазина в безводном ацетонитриле или толуоле, задували аргоном и встряхивали на шейкере в течение 1 - 3 часов при комнатной температуре. Суспензию центрифугировали на 13400 об/мин в течение 30 сек, отбирали супернатант, трижды промывали полимерный носитель 200 мкл сухого ацетонитрила.
[00210] 2) В пластиковую пробирку с полимерным носителем добавляли 200 мкл раствора (0.1 - ЗМ) амина, содержащего желаемые функциональные остатки, либо функциональные остатки для дальнейшей модификации, такие как -ОН, -NH2, -NH- и т.д. В последнем случае проводили последовательные химические превращения путем обработок различными растворами для дополнительной модификации, такие как реакции с тозилхлоридом, хлорангидридами, аминами, гуанидирующими реагентми и др.; (см. раздел ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ). Между обработками растворами суспензию центрифугировали на 13400 об/мин в течение 30 сек, отбирали супернатант, трижды промывали полимерный носитель 200 мкл сухого ацетонитрила.
[00211] 3) Носитель с иммобилизованным модифицированным олигонуклеотидом переносили в реактор для синтеза олигонуклеотидов, после чего продолжали автоматизированный твердофазный синтез по амидофосфитному протоколу. После завершения олигонуклеотидного синтеза проводили финальное деблокирование концентрированным водным раствором метиламина.
Figure imgf000039_0001
[00212] Вариант 3. Введение остатка 4,6-диалкиламино-1,3,5-триазино-2- амидофосфата с использованием 2-азидо-4, 6-диалкиламино-1,3, 5-триазинов.1) Синтез олигонуклеотидной цепи вплоть до звена, чья фосфатная часть будет модифицирована триазиновым остатком проводили на ДНК синтезаторе, описано в общих методах. Далее фосфит-триэфир, иммобилизованный на твердофазном носителе переносили в пробирку и добавляли 200 мкл 0,5 М растворов 2-азидо-4,6-диалкиламино- 1,3, 5-триазина в DMF, задували аргоном и встряхивали на шейкере в течение 1 - 3 часов при 65°С. Суспензию центрифугировали на 13400 об/мин в течение 30 сек, отбирали супернатант, трижды промывали полимерный носитель 200 мкл сухого ацетонитрила.2) Носитель с иммобилизованным модифицированным олигонуклеотидом переносили в реактор для синтеза олигонуклеотидов, после чего продолжали автоматизированный твердофазный синтез по Р-цианэтильному фосфитамидному протоколу. После завершения олигонуклеотидного синтеза проводили финальное деблокирование концентрированным водным раствором метиламина.
Figure imgf000040_0001
ПРИМЕРЫ
[00213] В настоящих материалах заявки представлено предпочтительное раскрытие осуществления заявленного технического решения, которое не должно использоваться как ограничивающее иные, частные воплощения его реализации, которые не выходят за рамки испрашиваемого объема правовой охраны и являются очевидными для специалистов в соответствующей области техники.
[00214] Примеры хроматографического и масс-спектрометрического анализа получаемых соединений представлены на рисунках 1 и 2.
[00215] Получение азидо-триазинов Пример 1. Получение 2-азидо-4,6-дихлоро-1, 3,5-триазина.
Figure imgf000041_0001
[00216] К раствору цианурхлорида (3,0 г, 16,3 ммоль) в 40 мл ацетона добавляли 1 эквивалент азида натрия (1,06 г, 16,3 ммоль), перемешивали на магнитной мешалке в течение 2 часов при комнатной температуре. Ацетон упаривали, осадок растворяли в хлористом метилене. Вещество очищали от избытка хлорида натрия в делительной воронке, последовательно четыре раза промывали 20 мл концентрированного раствора NaCl. Органический слой высушивали над Na2SO4, упаривали досуха, образовавшийся осадок сушили под вакуумом. Получали 2,36 г (76%) продукта в виде белого осадка. Дополнительную очистку вещества проводили методом колоночной хроматографии с использованием 50 г силикагеля в смеси хлористый метилен/гексан с градиентом хлористого метилена от 0 до 25%. Хроматографические фракции, содержащие продукт, упаривали досуха, сушили в вакууме. Получали 0,616 г (19,8%) чистого продукта.
Пример 2. Получение 2-азидо-4-додециламино-6-хлоро- 1,3,5-триазина.
Figure imgf000041_0002
[00217] К раствору цианурхлорида (0,7 г, 3,8 ммоль) в 25 мл хлороформа добавляли 1 эквивалент додециламина (0,7 г, 3,8 ммоль) и 10 мл 10% (масс.) раствора NaOH, перемешивали на магнитной мешалке в течение суток при комнатной температуре. Вещество очищали от избытка хлорида натрия в делительной воронке, трижды промывали 15 мл концентрированного раствора NaCl. Органический слой высушивали над Na2SO4, упаривали досуха, образовавшийся осадок сушили под вакуумом. Дополнительную очистку вещества проводили методом перекристаллизации в смеси метанол/хлороформ 5:1 при 0°С. Смесь для перекристаллизации отделяли от осадка, сушили в вакууме. Получали 0,872 г (68,7%) продукта в виде белого осадка 2-додециламино-4,6-дихлоро-
1,3,5-триазина.
[00218] К раствору 2-додециламино-4,6-дихлоро-1, 3,5-триазина (0,822 г, 2,47 ммоль) в 40 мл ацетона добавляли 1,25 эквивалента азида натрия (0,2 г, 3,09 ммоль), перемешивали на магнитной мешалке в течение 5 часов при комнатной температуре. Ацетон упаривали, осадок растворяли в хлористом метилене. Вещество очищали от избытка хлорида натрия в делительной воронке, четыре раза промывали 15 мл концентрированного раствора NaCl. Органический слой высушивали над NaiSC упаривали досуха, образовавшийся осадок сушили под вакуумом. Получали 0,693 г (82,5 %) продукта в виде белого осадка. Дополнительную очистку вещества проводили методом колоночной хроматографии с использованием 40 г силикагеля в смеси этилацетат/гексан с градиентом этилацетата от 0 до 10%. Хроматографические фракции, содержащие продукт, упаривали досуха, сушили в вакууме. Получали 0,168 г (20%) чистого продукта в виде белого осадка 2-азидо-4-додециламино-6-хлоро- 1,3,5-триазина. [00219] Для приготовления 0,1 М раствора растворяли 6,8 мг 2-азидо-4- додециламино-6-хлоро-1,3,5-триазина в 200 мкл сухого толуола, встряхивали на шейкере до растворения осадка, задували аргоном. Раствор готовили непосредственно перед проведением реакции.
Пример 3. Получение 2-азидо-4-олеиламино-6-хлоро-1, 3,5-триазина.
Figure imgf000042_0001
[00220] К раствору цианурхлорида (0,7 г, 3,8 ммоль) в 20 мл хлороформа добавляли 1 эквивалент олеиламина (1,25 мл, 3,8 ммоль) и 10 мл 10% (масс.) раствора NaOH, перемешивали на магнитной мешалке в течение суток при комнатной температуре. Вещество очищали от избытка хлорида натрия в делительной воронке, трижды промывали 15 мл концентрированного раствора NaCl. Органический слой высушивали над Na2SO4, упаривали досуха, образовавшийся осадок сушили под вакуумом. Получали 1,498 г (95%) розового маслообразного продукта. Дополнительную очистку вещества проводили методом колоночной хроматографии с использованием 40 г силикагеля в смеси этилацетат/гексан с градиентом этилацетата от 0 до 7,5%. Хроматографические фракции, содержащие продукт, упаривали досуха, сушили в вакууме. Получали 0,953 г (60%) чистого маслообразного продукта - 2-олеиламино-4,6-дихлоро- 1,3, 5-триазина.
[00221] К раствору 2-олеиламино-4,6-дихлоро-1, 3,5-триазина (0,881 г, 2,12 ммоль) в 30 мл ацетона добавляли 1,25 эквивалента азида натрия (0,173 г, 2,65 ммоль), перемешивали на магнитной мешалке в течение 6 часов при комнатной температуре. Ацетон упаривали, осадок растворяли в хлористом метилене. Вещество очищали от избытка хлорида натрия в делительной воронке, четыре раза промывали 15 мл концентрированного раствора NaCl. Органический слой высушивали над Na2SO4, упаривали досуха, образовавшийся осадок сушили под вакуумом. Получали 0,787 г (87,9 %) желтого маслообразного продукта. Дополнительную очистку вещества проводили методом колоночной хроматографии с использованием 40 г силикагеля в смеси этилацетат/гексан с градиентом этилацетата от 0 до 10%. Хроматографические фракции, содержащие продукт, упаривали досуха, сушили в вакууме. Получали 0,438 г (49%) чистого маслообразного продукта - 2-азидо-4-олеиламино-6-хлоро-1, 3,5-триазина.
[00222] Для приготовления 0,1 М раствора растворяли 8,4 мг 2-азидо-4-олеиламино- 6-хлоро-1, 3,5-триазина в 200 мкл сухого ацетонитрила, встряхивали на шейкере до растворения осадка, сушили над ситами в течение суток при комнатной температуре, задували аргоном. Раствор готовили непосредственно перед проведением реакции.
Пример 4. Получение 2-азидо-4-(ЬГ-метил-М-октадецил)амино-6-хлоро-1, 3,5-триазина.
Figure imgf000043_0001
[00223] К раствору цианурхлорида (0,25 г, 1,36 ммоль) в 20 мл хлороформа добавляли 1 эквивалент (Х-метил- Т-октадецил)амина (0,38 г, 1,36 ммоль) и 10 мл 10% (масс.) раствора NaOH, перемешивали на магнитной мешалке в течение суток при комнатной температуре. Вещество очищали от избытка хлорида натрия в делительной воронке, трижды промывали 15 мл концентрированного раствора NaCl. Органический слой высушивали над Na2SO4, упаривали досуха, образовавшийся осадок сушили под вакуумом. Получали 0,472 г (80%) чистого продукта в виде белого осадка 2-( Г-метил- Г- октадецил)амино-4,6-дихлоро- 1,3,5-триазина.
[00224] К раствору 2-(Х-метил-Х-октадецил)амино-4,6-дихлоро-1, 3,5-триазина (0,428 г, 0,99 ммоль) в 30 мл ацетона добавляли 1,2 эквивалента азида натрия (0,079 г, 1,19 ммоль), перемешивали на магнитной мешалке в течение 6 часов при комнатной температуре. Ацетон упаривали, осадок растворяли в хлористом метилене. Вещество очищали от избытка хлорида натрия в делительной воронке, четыре раза промывали 15 мл концентрированного раствора NaCl. Органический слой высушивали над Na2SO4, упаривали досуха, образовавшийся осадок сушили под вакуумом. Получали 0,351 г (80,5 %) продукта в виде белого осадка. Дополнительную очистку вещества проводили методом колоночной хроматографии с использованием 35 г силикагеля в смеси этилацетат/гексан с градиентом этилацетата от 0 до 4%. Хроматографические фракции, содержащие продукт, упаривали досуха, сушили в вакууме. Получали 0,306 г (49%) чистого продукта в виде белого осадка 2-азидо-4-(М-метил-М-октадецил)амино-6-хлоро- 1,3,5-триазина.
[00225] Для приготовления 0,1 М раствора растворяли 8,8 мг 2-азидо-4-(М-метил- Г- октадецил)амино-6-хлоро- 1,3, 5-триазина в 200 мкл сухого толуола, встряхивали на шейкере до растворения осадка, задували аргоном. Раствор готовили непосредственно перед проведением реакции.
Пример 5. Получение 2-азидо-4,6-дибутиламино-1, 3,5-триазина.
Figure imgf000044_0001
[00226] К раствору 2-азидо-4, 6- дихлоро- 1,3, 5-триазина (0,25 г, 1,3 ммоль) в 20 мл
THF добавляли 4 эквивалента бутиламина (0,52 мл, 5,2 ммоль), перемешивали на магнитной мешалке в течение суток при комнатной температуре. Отфильтровывали осадок гидрохлорида бутиламина на стеклянном пористом фильтре (16 пор), оставшийся раствор упаривали досуха, образовавшийся осадок сушили под вакуумом. Получали 0,34 г (98,6%) чистого продукта в виде белого осадка 2-азидо-4,6-дибутиламино-1, 3,5-триазина. [00227] Для приготовления 0,5 М раствора растворяли 26,4 мг 2-азидо-4,6- дибутиламино-1, 3,5-триазина в 200 мкл сухого DMF, встряхивали на шейкере до растворения осадка, задували аргоном. Раствор готовили непосредственно перед проведением реакции.
[00228] Получение модифицированных олигонуклеотидов
Пример 6. Получение модифицированных олигонуклеотидов по варианту 1 с введением остатков метиламина.
Figure imgf000044_0002
[00229] В данном примере получали модифицированные олигонуклеотиды 5’- d(T*TTTT), 5’-d(T*TTTTTTTTT), 5’-d(T*TTTTT), 5’-d(TT*TTTTT), 5’-d(T*T*TTTTTTTT).
[00230] Модифицированные олигонуклеотиды получали по варианту 1, где пункт 2) пропускали.
[00231] Молекулярные массы:
5’-d(T*TTTT): расчетная [М] 1595,19, полученная [М+Н] 1595,41.
5’-d(TT*TTTTT): расчетная [М] 2202,0, полученная [М-Н] 2203,0.
Пример 7. Синтез модифицированных олигонуклеотидов по варианту 1 с обработкой раствором пиперидина.
Figure imgf000045_0001
[00232]В данном примере получали модифицированные олигонуклеотиды 5’-d(T*TTTT), 5’ -d(T*TTTTTTTTT), 5 ’ -d(T*TTTT*T).
[00233] Модифицированные олигонуклеотиды получали по варианту 1, где последовательные обработки в пункте 2) - 10% (об.) пиперидин в сухом ацетонитриле, 1 час, 25°С.
[00234] Молекулярная масса:
5’-d(T*TTTT*T): расчетная [М] 2250,0, полученная [М-Н] 2250,8.
Пример 8. Синтез модифицированного олигонуклеотида по варианту 1 с обработкой раствором (М-метил)бутиламина.
Figure imgf000045_0002
[00235] В данном примере модифицированный олигонуклеотид 5’-d(T*TTTTT) получали по варианту 1, где последовательные обработки в пункте 2) - 50% (об.) (N- метил)бутиламин в сухом ацетонитриле, 30 минут, 25°С.
[00236] Молекулярная масса:
5’-d(T*TTTTT): расчетная [М] 2011,6, полученная [М-Н] 2010,6. Пример 9. Синтез модифицированных олигонуклеотидов по варианту 1 с обработкой раствором додециламина.
Figure imgf000046_0001
[00237] В данном примере получали модифицированные олигонуклеотиды 5’- d(T*TTTT), 5’-d(TTTT*T), 5’-d(CTGACTATGAAGTAT*T), 5’-[FAM]- d(CTGACTATGAAGTAT*T), 5’-[FAM]-d(CTGACTATGAAGTAT*T*T), 5’- d(TTTTTTTTT*T), 5’-d(AATACTTCATAGTCAGT*T).
[00238] Модифицированные олигонуклеотиды получали по варианту 1, где последовательные обработки в пункте 2) - 3 М додециламин в сухом пиридине, 30 минут, 55°С.
[00239] Молекулярные массы:
5’-d(T*TTTT): расчетная [М] 1903,8, полученная [М-Н] 1902,6.
5’-d(AATACTTCATAGTCAGT*T): расчетная [М] 5917,4, полученная [М-Н] 5916,4.
5’-[FAM]-d(CTGACTATGAAGTAT*T): расчетная [М] 5876,8, полученная [М-Н] 5876,4.
Пример 10. Синтез модифицированных олигонуклеотидов по варианту 1 с обработкой раствором бутиламина.
Figure imgf000046_0002
[00240] В данном примере получали модифицированные олигонуклеотиды 5’- d(CTGACTATGAAGTAT*T), 5’-[FAM]-d(CTGACTATGAAGTAT*T), 5’- d(TTTTTTTTT*T), 5 ’ -d(T*T*TTTTTTTT).
[00241] Модифицированные олигонуклеотиды получали по варианту 1, где последовательные обработки в пункте 2) - 20% (об.) бутиламин в сухом ацетонитриле, 1 час, 40°С. [00242] Молекулярная масса:
5’-[FAM]-d(CTGACTATGAAGTAT*T): расчетная [М] 5652,5, полученная [М-Н] 5652,1.
Пример 11. Синтез модифицированного олигонуклеотида по варианту 1 с обработкой раствором олеиламина.
Figure imgf000047_0001
[00243] В данном примере модифицированный олигонуклеотид 5’-d(T*TTTT) получали по варианту 1, где последовательные обработки в пункте 2) - 2 М олеиламин в сухом пиридине, 30 минут, 55°С.
[00244] Молекулярная масса:
5’-d(T*TTTT): расчетная [М] 2068,1, полученная [М-Н] 2066,1.
Пример 12. Синтез модифицированного олигонуклеотида по варианту 1 с обработкой раствором (М-метил-М-октадецил)амина,
Figure imgf000047_0002
[00245] В данном примере модифицированный олигонуклеотид 5’-d(T*TTTT) получали по варианту 1, где последовательные обработки в пункте 2) - 2 М М-метил-N- октадециламин в сухом пиридине, 30 минут, 55°С.
[00246] Молекулярная масса:
5’-d(T*TTTT): расчетная [М] 2100,0, полученная [М-Н] 2099,1. Пример 13. Синтез модифицированного олигонуклеотида по варианту 1 с обработкой раствором диметиламина.
Figure imgf000048_0001
[00247] В данном примере получали модифицированный олигонуклеотид 5’- d(T*TTTTT) получали по варианту 1, где пункт 2 пропускали; олигонуклеотид деблокировали с твердофазного носителя с использованием конц. (ок. 40%) водн. раствора диметиламина при 55°С.
[00248] Молекулярная масса:
5’-d(T*TTTTT): расчетная [М] 1927,4, полученная [М-Н] 1926,4.
Пример 14. Синтез модифицированного олигонуклеотида по варианту 1 с обработкой раствором дигексиламина.
Figure imgf000048_0002
[00249] В данном примере модифицированный олигонуклеотид 5’-d(T*TTTT) получали по варианту 1, где последовательные обработки в пункте 2) - 10% (об.) дигексиламин в сухом ацетонитриле, 1 час, 25°С.
[00250] Молекулярная масса:
5’-d(T*TTTT): расчетная [М] 1903,8, полученная [М-Н] 1902,7.
Пример 15. Синтез модифицированных олигонуклеотидов по варианту 1 с обработкой раствором ( ,М-диметиламино)пропиламина.
Figure imgf000048_0003
[00251] В данном примере получали модифицированные олигонуклеотиды 5’- d(T*TTTT), 5’-d(CTGACTATGAAGTAT*T), 5’-[FAM]-d(CTGACTATGAAGTAT*T), 5’- d(TTTTTTTTT*T), 5’-d(T*TTTTTTTTT), 5’-d(TTTTTTTT*T*T)
[00252] Модифицированные олигонуклеотиды получали по варианту 1, где последовательные обработки в пункте 2) - 10% (об.) (К[,М-диметиламино)пропиламин в сухом ацетонитриле, 1 час, 25°С.
[00253] Молекулярная масса:
5’-d(T*TTTT): расчетная [М] 1737,43, полученная [М+Н] 1737,64.
Пример 16. Синтез модифицированных олигонуклеотидов по варианту 1 с обработкой раствором 3,3’-иминобис(М,М-диметил-пропиламина).
Figure imgf000049_0001
[00254] В данном примере получали модифицированные олигонуклеотиды 5’- d(T*TTTT), 5’-d(TTTT*T), 5’-d(T*T), 5’-d(CTGACTATGAAGTAT*T), 5’-[FAM]- d(CTGACTATGAAGTAT*T), 5’-d(T*TTTTTTTTT), 5’-d(TTTTTTTTT*T).
[00255] Модифицированные олигонуклеотиды в данном варианте получали по варианту 1, где последовательные обработки в пункте 2) - 10% (об.) 3,3’-HMHHO6HC(N,N- диметил-пропиламин) в сухом ацетонитриле, 1 час, 25°С.
[00256] Молекулярные массы:
5’-d(TTTT*T): расчетная [М] 1907,7, полученная [М-Н] 1906,6.
5’-d(T*T): расчетная [М] 995,1, полученная [М+Н] 994,1.
Пример 17. Синтез модифицированного олигонуклеотида по варианту 1 с обработкой раствором 1,6-диаминогексана.
Figure imgf000049_0002
[00257] В данном примере модифицированный олигонуклеотид 5’- d(T*TTTTTTTTT) получали по варианту 1, где последовательные обработки в пункте 2) - 2 М 1,6-диаминогексан в сухом ацетонитриле, 1 час, 55°С.
[00258] Молекулярная масса:
5’-d(T*TTTTTTTTT): расчетная [М] 3286,5, полученная [М-Н] 3285,8.
Пример 18. Синтез модифицированного олигонуклеотида по варианту 1 с обработкой раствором 1 ,4-диаминобутана.
Figure imgf000050_0001
[00259] В данном примере модифицированный олигонуклеотид 5’- d(T*TTTTTTTTT) получали по варианту 1, где последовательные обработки в пункте 2) - 10% (об.) 1 ,4-диаминобутан в сухом ацетонитриле, 1 час, 55°С.
[00260] Молекулярная масса:
5’-d(T*TTTTTTTTT): расчетная [М] 3230,3, полученная [М-Н] 3229,7.
Пример 19. Синтез модифицированных олигонуклеотидов по варианту 1 с обработкой раствором трис-(2-аминоэтил)амина.
Figure imgf000050_0002
[00261] В данном примере модифицированные олигонуклеотиды 5’-d(T*TTTT), 5’- d(T*T), 5’-d(T*TTTTTTTTT) получали по варианту 1, где последовательные обработки в пункте 2) - 10% (об.) трис-(2-аминоэтил)амин в сухом ацетонитриле, 1 час, 25°С.
[00262] Молекулярные массы:
5’-d(T*TTTTTTTTT): расчетная [М] 3346,5, полученная [М-Н] 3345,0. 5’-d(T*TTTT): расчетная [М] 1825,5, полученная [М-Н] 1824,2. Пример 20. Синтез модифицированного олигонуклеотида по варианту 1 с обработкой раствором пиперазина.
Figure imgf000051_0001
[00263] В данном примере модифицированный олигонуклеотид 5’- d(T*TTTTTTTTT) получали по варианту 1, где последовательные обработки в пункте 2) - 2 М пиперазин в сухом хлороформе, 2 часа, 25°С.
[00264] Молекулярная масса:
5’-d(T*TTTTTTTTT): расчетная [М] 3226,3, полученная [М-Н] 3225,7.
Пример 21. Синтез модифицированного олигонуклеотида по варианту 1 с последовательными обработками растворами трис-(2-аминоэтил)амина и гуанидина и S- метилмочевины.
Figure imgf000051_0002
[00265] В данном примере модифицированный олигонуклеотид 5’-d(T*TTTTT) получали по варианту 1, где последовательные обработки в пункте 2) - 10% (об.) трис-(2- аминоэтил)амин в сухом ацетонитриле, 1 час, 25°С — > 10 мг S-метилмочевина/ЮО мкл сухой ацетонитрил/50 мкл 25 мМ NaHCCh, сутки, 55°С.
[00266] Молекулярная масса:
5’-d(T*TTTTT): расчетная [М] 2297,9, полученная [М-Н] 2297,0. Пример 22. Синтез модифицированье олигонуклеотидов по варианту 1 с последовательными обработками растворами трис-(2-аминоэтил)амина и диметилимидазолидиний хлорид гексафторфосфата.
Figure imgf000052_0001
[00267] В данном примере получали модифицированные олигонуклеотиды 5’- d(T*TTTT), 5’-d(T*TTTTTTTTT), 5’-[FAM]-d(T*TTTTTTTTT), 5’-d(T*T).
[00268] Модифицированные олигонуклеотиды в данном варианте получали по варианту 1, где последовательные обработки в пункте 2) - 10% (об.) трис-(2- аминоэтил)амин в сухом ацетонитриле, 1 час, комнатная температура — » 10 мг диметилимидазолидиний хлорид гексафторфосфат/200 мкл сухой ацетонитрил/7 мкл
DIPEA, 30 минут, 55°С.
[00269] Молекулярная масса:
5’-d(T*T): расчетная [М] 1297,5, полученная [М+Н] 1296,0.
Пример 23. Синтез модифицированных олигонуклеотидов по варианту 1 с последовательными обработками растворами трис-(2-аминоэтил)амина и уксусного ангидрида.
Figure imgf000052_0002
[00270] В данном примере получали модифицированные олигонуклеотиды 5’- d(T*TTTT), 5’-d(T*TTTTTTTTT), 5’-[FAM]-d(T*TTTTTTTTT).
[00271] Модифицированные олигонуклеотиды в данном варианте получали по варианту 1, где последовательные обработки в пункте 2) - 10% (об.) трис-(2- аминоэтил)амин в сухом ацетонитриле, 1 час, 25°С — стандартные растворы и условия стадии копирования в автоматическом твердофазном амидофосфитном синтезе.
[00272] Молекулярные массы:
5’-d(T*TTTTTTTTT): расчетная [М] 3514,6, полученная [М-Н] 3513,3.
5’-d(T*TTTT): расчетная [М] 1993,7, полученная [М-Н] 1992,4. Пример 24. Синтез модифицированного олигонуклеотида по варианту 1 с последовательными обработками растворами пиперазина и тозилхлорида.
Figure imgf000053_0001
[00273] В данном примере модифицированный олигонуклеотид 5’- d(T*TTTTTTTTT) получали по варианту 1, где последовательные обработки в пункте 2) - 2 М пиперазин в сухом хлороформе, 2 часа, 25°С — 2 М тозилхлорид в сухом ацетонитриле с добавлением 2 М DIPEA в сухом ацетонитриле, 1 час, 25°С.
[00274] Молекулярная масса:
5’-d(T*TTTTTTTTT): расчетная [М] 3534,6, полученная [М-Н] 3533,4.
Пример 25. Синтез модифицированного олигонуклеотида по варианту 1 с последовательными обработками растворами 1,6-диаминогексана и тозилхлорида.
Figure imgf000053_0002
[00275] В данном примере модифицированный олигонуклеотид 5’- d(T*TTTTTTTTT) получали по варианту 1, где последовательные обработки в пункте 2) - 2 М 1,6-диаминогексан в сухом ацетонитриле, 1 час, 55°С — 2 М тозилхлорид в сухом ацетонитриле с добавлением 2 М DIPEA в сухом ацетонитриле, 1 час, 25°С.
[00276] Молекулярная масса:
5’-d(T*TTTTTTTTT): расчетная [М] 3594,8, полученная [М-Н] 3593,4. Пример 26. Синтез модифицированного олигонуклеотида по варианту 1 с последовательными обработками растворами пиперазина, цианурхлорида и метиламина.
Figure imgf000054_0001
[00277] В данном примере модифицированный олигонуклеотид 5’- d(T*TTTTTTTTT) получали по варианту 1, где последовательные обработки в пункте 2) - 2 М пиперазин в сухом хлороформе, 2 часа, 25°С — > 1.5 М цианурхлорид в сухом ацетонитриле с добавлением 1.5 М DIPEA в сухом ацетонитриле, 15 минут, 25°С.
[00278] Молекулярная масса:
5’-d(T*TTTTTTTTT): расчетная [М] 3498,0, полученная [М-Н] 3498,9.
Пример 27. Синтез модифицированного олигонуклеотида по варианту 1 с последовательными обработками растворами пиперазина, цианурхлорида и бутиламина.
Figure imgf000054_0002
[00279] В данном примере модифицированный олигонуклеотид 5’- d(T*TTTTTTTTT) получали по варианту 1, где последовательные обработки в пункте 2) - 2 М пиперазин в сухом хлороформе, 2 часа, 25°С — » 1.5 М цианурхлорид в сухом ацетонитриле с добавлением 1.5 М DIPEA в сухом ацетонитриле, 15 минут, 25°С — > 10% (об.) бутиламин в сухом ацетонитриле, 1 час, 55°С.
[00280] Молекулярная масса:
5’-d(T*TTTTTTTTT): расчетная [М] 3668,9, полученная [М-Н] 3667,2. Пример 28. Синтез модифицированного олигонуклеотида по варианту 1 с последовательными обработками растворами пиперазина, цианурхлорида, пиперазина и
Figure imgf000055_0001
[00281] В данном примере модифицированный олигонуклеотид 5’- d(T*TTTTTTTTT) получали по варианту 1, где последовательные обработки в пункте 2) - 2 М пиперазин в сухом хлороформе, 2 часа, 25°С — » 1.5 М цианурхлорид в сухом ацетонитриле с добавлением 1.5 М DIPEA в сухом ацетонитриле, 15 минут, 25°С — 2 М пиперазин в сухом хлороформе, 15 минут, 25°С — 2 М тозилхлорид в сухом ацетонитриле с добавлением 2 М DIPEA в сухом ацетонитриле, 1 час, 25°С.
[00282] Молекулярная масса:
5’-d(T*TTTTTTTTT): расчетная [М] 4337,7, полученная [М-Н] 4336,0.
Пример 29. Синтез модифицированного олигонуклеотида по варианту 1 с обработкой раствором (М-метил)аминоэтанола.
Figure imgf000055_0002
[00283] В данном примере модифицированный олигонуклеотид 5’-d(T*TTTTT) получали по варианту 1, где последовательные обработки в пункте 2) - 10% 2-(N- метил)аминоэтанол в сухом ацетонитриле, 1 час, 25°С.
[00284] Молекулярная масса:
5’-d(T*TTTTT): расчетная [М] 1987,5, полученная [М-Н] 1986,6. Пример 30. Синтез модифицированных олигонуклеотидов по варианту 1 с обработкой раствором диэтаноламина.
Figure imgf000056_0001
[00285] В данном примере модифицированные олигонуклеотиды 5’- d(T*TTTTTTTTT), 5’-d(T*TTTTT) получали по варианту 1, где последовательные обработки в пункте 2) — 5% (об.) диэтаноламин в смеси ацетон: ацетонитрил 1:1, 1 час, 55°С.
[00286] Молекулярные массы:
5’-d(T*TTTTT): расчетная [М] 2047,5, полученная [М-Н] 2046,4.
5’-d(T*TTTTTTTTT): расчетная [М] 3264,3, полученная [М-Н] 3262,8.
Пример 31. Синтез модифицированного олигонуклеотида по варианту 1 с обработкой раствором 3 -аминопропанола.
Figure imgf000056_0002
[00287] В данном примере модифицированный олигонуклеотид 5’- d(T*TTTTTTTTT) получали по варианту 1, где последовательные обработки в пункте 2) - 1.5 М 3 -аминопропанол- 1 в сухом ацетонитриле, 1 час, 55°С.
[00288] Молекулярная масса:
5’-d(T*TTTTTTTTT): расчетная [М] 3204,3, полученная [М-Н] 3203,6.
Пример 32. Синтез модифицированного олигонуклеотида по варианту 1 с обработкой раствором 6-аминогексанола.
Figure imgf000056_0003
[00289] В данном примере модифицированный олигонуклеотид 5’- d(T*TTTTTTTTT) получали по варианту 1, где последовательные обработки в пункте 2) - 1.5 М 6-аминогексанол-1 в сухом ацетонитриле, 1 час, 55°С.
[00290] Молекулярная масса:
5’-d(T*TTTTTTTTT): расчетная [М] 3288,4, полученная [М-Н] 3287,7.
Пример 33. Синтез модифицированного олигонуклеотида по варианту 1 с обработкой раствором 2-(2-аминоэтокси)этанола.
Figure imgf000057_0001
[00291] В данном примере модифицированный олигонуклеотид 5’-d(T*TTTTT) получали по варианту 1, где последовательные обработки в пункте 2) - 62,5% (об.) 2-(2- аминоэтокси)этанол в сухом ацетонитриле, 1 час, 25°С.
[00292] Молекулярная масса:
5’-d(T*TTTTT): расчетная [М] 2047,5, полученная [М-Н] 2046,4.
Пример 34. Синтез модифицированных олигонуклеотидов по варианту 1 с последовательными обработками растворами 3 -аминопропанола и пиперидина.
Figure imgf000057_0002
[00293] В данном примере модифицированные олигонуклеотиды 5’- d(T*TTTTTTTTT), 5’-d(T*T) получали по варианту 1, где последовательные обработки в пункте 2) - 1.5 М 3 -аминопропанол- 1 в сухом ацетонитриле, 1 час, 55°С — > 2 М тозилхлорид в сухом ацетонитриле с добавлением 2 М DIPEA в сухом ацетонитриле, 1 час, 25°С — 10% (об.) пиперидин в сухом ацетонитриле, сутки, 40°С.
[00294] Молекулярная масса:
5’-d(T*T): расчетная [М] 905,0, полученная [М+Н] 905,4. Пример 35. Синтез модифицированного олигонуклеотида по варианту 1 с последовательными обработками растворами 3 -аминопропанола и амидофосфитных мономеров тимидилатных звеньев.
Figure imgf000058_0001
[00295] В данном примере модифицированный олигонуклеотид 5’- d(TT(T)2*TTTTTT) получали по варианту 1, где последовательные обработки в пункте 2) -
1.5 М 3 -аминопропанол- 1 в сухом ацетонитриле, 1 час, 55°С — > конденсация тимидилатного звена по стандартному протоколу твердофазного фосфорамидитного синтеза.
[00296] Молекулярная масса:
5’-d(TT(T)2*TTTTTT): расчетная [М] 3204,3, полученная [М-Н] 3203,6.
Пример 36. Синтез модифицированного олигонуклеотида по варианту 1 с последовательными обработками растворами 6-аминогексанола и амидофосфитных мономеров тимидилатных звеньев.
Figure imgf000058_0002
[00297] В данном примере модифицированный олигонуклеотид 5’- d(TT(T)2*TTTTTT) получали по варианту 1, где последовательные обработки в пункте 2) - 1.5 M 6-аминогексанол-1 в сухом ацетонитриле, 1 час, 55°С — > конденсация тимидилатного звена по стандартному протоколу твердофазного фосфорамидитного синтеза.
[00298] Молекулярная масса:
5’-d(TT(T)2*TTTTTT): расчетная [М] 3288,4, полученная [М-Н] 3287,7.
Пример 37. Синтез модифицированного олигонуклеотида по варианту 1 с последовательными обработками растворами 2-(2-аминоэтокси)этанола и амидофосфитных мономеров тимидилатных звеньев.
Figure imgf000059_0001
[00299] В данном примере модифицированный олигонуклеотид 5’- d(TTT(T2)2*TTTTT) получали по варианту 1, где последовательные обработки в пункте 2) - 62,5% (об.) 2-(2-аминоэтокси)этанол в сухом ацетонитриле, 1 час, 25°С — конденсация двух тимидилатных звеньев по стандартному протоколу твердофазного фосфорамидитного синтеза.
[00300] Молекулярная масса:
5’-d(T*TTTTT): расчетная [М] 3872,7, полученная [М-Н] 3871,2.
Пример 38. Синтез модифицированных олигонуклеотидов по варианту 2 с использованием 2-азидо-4-додециламино-6-хлоро-1, 3,5-триазина с обработкой раствором метиламина.
Figure imgf000059_0002
[00301] В данном примере модифицированные олигонуклеотиды 5’-d(T*TTTT), 5’- d(TTTT*TTTT) получали по варианту 2 с использованием 0,1 М раствора 2-азидо-4- додециламино-6-хлоро- 1,3, 5-триазина в толуоле в пункте 1), пункт 2) пропускали.
[00302] Молекулярная масса:
5’-d(T*TTTT): расчетная [М] 1749,48, полученная [М+Н] 1749,57. Пример 39. Синтез модифицированного олигонуклеотида по варианту 2 с использованием 2-азидо-4-додециламино-6-хлоро- 1,3,5-триазина с обработкой раствором (N,N- диметиламино)пропиламина.
Figure imgf000060_0001
[00303] В данном примере модифицированный олигонуклеотид 5’-d(T*TTTT) получали по варианту 2 с использованием 0, 1 М раствора 2-азидо-4-додециламино-6- хлоро-1, 3,5-триазина в толуоле в пункте 1), последовательные обработки в пункте 2) - 10% (об.) (М,М-диметиламино)пропиламин в сухом ацетонитриле, 1 час, 25°С.
[00304] Молекулярная масса:
5’-d(T*TTTT): расчетная [М] 1820,61, полученная [М+Н] 1820,59.
Пример 40. Синтез модифицированного олигонуклеотида по варианту 2 с использованием 2-азидо-4-олеиламино-6-хлоро-1, 3,5-триазина с обработкой раствором метиламина,
Figure imgf000060_0002
[00305] В данном примере модифицированный олигонуклеотид 5’-d(T*TTTT) получали по варианту 2 с использованием 0,1 М раствора 2-азидо-4-олеиламино-6-хлоро- 1,3, 5-триазина в толуоле в пункте 1), пункт 2) пропускали.
[00306] Молекулярная масса:
5’-d(T*TTTT): расчетная [М] 1831,65, полученная [М+Н] 1831,30. Пример 41. Синтез модифицированного олигонуклеотида по варианту 2 с использованием 2-азидо-4-(Н-метил-Н-октадецил)амино-6-хлоро- 1,3, 5-триазина с обработкой раствором метиламина,
Figure imgf000061_0001
[00307] В данном примере модифицированный олигонуклеотид 5’-d(T*TTTT) получали по варианту 2 с использованием 0,1 М раствора 2-азидо-4-( Г-метил- Г- октадецил)амино-6-хлоро-1,3,5-триазина в толуоле в пункте 1), пункт 2) пропускали.
[00308] Молекулярная масса:
5’-d(T*TTTT): расчетная [М] 1847,67, полученная [М+Н] 1847,59.
Пример 42. Синтез модифицированного олигонуклеотида варианту 3 с использованием 2- азидо-4,6-дибутиламино-1,3,5-триазина.
Figure imgf000061_0002
[00309] В данном примере модифицированный олигонуклеотид 5’-d(T*TTTT) получали по варианту 3 с использованием 0,5 М раствор 2-азидо-4-додециламино-6- хлоро-1, 3,5-триазина в DMF в пункте 1).
[00310] Молекулярная масса:
5’-d(T*TTTT): расчетная [М] 1679,35, полученная [М+Н] 1679,53.
Пример 43. Синтез модифицированных олигормйонуклеотидов по варианту 1 с обработкой раствором пиперидина
Figure imgf000061_0003
[00311] В данном примере модифицированные олигонуклеотиды 5’-AmCmGmUm*Um, 5’-UmUmUmUm*[BHQ], 5’-AmCmGmUm*[NH2]; 111 в этом примере обозначает 2’-О-метильные нуклеотиды в составе последовательности; [BHQ] и [NH2] обозначают полимерные носители CPG с остатками гасителя флуоресценции Black Hole Quencher™ и гексиламина соответственно.
[00312] Модифицированные олигонуклеотиды получали по варианту 1, где последовательные обработки в пункте 2) - 10% (об.) пиперидин в сухом ацетонитриле, 1 час, 25°С.
[00313] Молекулярные массы:
5’-AmCmGmUm*Um: расчетная [М] 1844,5, полученная [М-Н] 1843,5. 5’-UmUmUmUm*[BHQ]: расчетная [М] 2017,7, полученная [М-Н] 2016,5. 5’-AmCmGmUm*[NH2]: расчетная [М] 1703,4, полученная [М-Н] 1702,5. Исследование терапевтического потенциала модифицированных олигонуклеотидов Пример 44. Исследование химической устойчивости олигонуклеотидов, содержащих триаз иниламидофосфатную модификацию .
[00314] Олигонуклеотид 02, 5'-d(T*TTTTTTTTT), где * - триазиниламидофосфатное звено с бутильными остатками, был синтезирован, как описано в примере 10. Для исследования устойчивости получаемого олигонуклеотида финальное деблокирование проводилось концентрированным водным раствором метиламина в течение 30 мин при 65°С. Из профиля хроматографии на Фиг. 3 видно, что в реакционной смеси отсутствуют какие-либо пики, свидетельствующие о деградации получаемого целевого продукта.
[00315] Для исследования устойчивости олигонуклеотида 02 в кислых условиях к раствору олигонуклеотида добавляли концентрированный раствор соляной кислоты до концентрации 0,1 М. После 30, 90, 180 и 780 минут отбирали равные по объему аликвоты реакционной смеси и нейтрализовали добавлением избытка концентрированного водного раствора аммиака. Затем аликвоты упаривали и проводили аналитическую офВЭЖХ для оценки степени кислотного гидролиза модифицированного олигонуклеотида. Параллельно проводили аналогичный эксперимент с олигонуклеотидом Bz 5'- d(TbTTTTTTTTT), где b -бензиламидофосфатное звено.
[00316] Результаты экспериментов, представленные на Фиг. 4, показывают, что количество олигонуклеотида, содержащего бензиламидофосфатную модификацию (Bz), уже через три часа снизилось более чем на 60%, а после 13 часов более чем на 80%, относительно исходного количества. В то же время количество олигонуклеотида, содержащего триазиниламидофосфатную модификацию (02) не менялось на протяжении всего времени эксперимента. Это говорит о специфической устойчивости триазиниламидофосфатной модификации.
[00317] Таким образом, было показано, что олигонуклеотиды, содержащие модифицированную фосфатную группу соответствующую формуле (Fx) обладают высокой устойчивостью как в щелочных, так и в кислотных условиях.
Пример 45. Проверка устойчивости модифицированных олигонуклеотидов к действию нуклеаз цельноклеточных экстрактов клеток НЕК293Т и T98G.
[00318] Для исследования ферментативной устойчивости использовали олигонуклеотид 5'-[FAM]-CTGACTATGAAGTAT*T-3', где * — положение триазиниламидофосфатного звена, содержащего бутильные остатки.
[00319] Для сравнения использовали контрольный немодифицированный олигонуклеотид 5 [FAM] -CTGACTATGAAGTATT-3' .
[00320] Реакционные смеси содержали 1 мг/мл белков экстракта культивируемых клеток человека T98G или НЕК293Т, 0.1 мкМ одного из указанных олигонуклеотидов и буферные компоненты 10 мМ MgC12, 50 мМ трис-HCl (рН=8.0), 50 мМ NaCl. Реакции проводили в течение 7.5 и 15 минут для каждого экстракта при 37°С. Реакции останавливали введением ЭДТА до конечной концентрации 20 мМ. После этого аликвоты анализировали с помощью электрофореза в ПААТ в денатурирующих условиях [43].
[00321] Результаты эксперимента представлены на Фиг. 5. На панели А показана электрофореграмма, полученная для немодифицированного олигонуклеотида, на панели В — для модифицированного олигонуклеотида. На каждой панели приняты следующие обозначения: 1 - контрольный раствор олигонуклеотида; 2 - НЕК293Т, 7,5 мин; 3 - НЕК293Т, 15 мин; 4 - T98G, 7,5 мин; 5 - T98G, 15 мин.
[00322] Как видно из полученных экспериментальных данных введение даже одной триазиниламидофосфатной модификации значительно увеличивает ферментативную устойчивость модифицированного олигонуклеотида в обоих клеточных экстрактах. [00323] Таким образом, было показано, что олигонуклеотиды, содержащие модифицированную фосфатную группу соответствующую формуле (Fx) обладают высокой устойчивостью в биологических средах.
Пример 46. Исследование методом проточной цитофлуорометрии эффективности трансфекции клеток НЕК293Т и T98G олигонуклеотидом OSN4F.
[00324] Для исследования эффективности проникновения в клетки использовали олигонуклеотид 5'-[FAM]-CTGACTATGAAGTAT*T-3' (OSN4F), где * - положение триазиниламидофосфатного звена, несущего два додецильных остатка, и контрольный немодифицированный олигонуклеотид 5'-[FAM]-CTGACTATGAAGTATT-3' (OSNF).
[00325] Культивируемые клетки человека НЕК293Т и T98G высеивали в лунки 24- луночного планшета в концентрации 20x104 кл/лун (НЕК293Т) или 12x 104 кл/лун (T98G) в 500 мкл/лун среды IMDM, содержащей 10% FBS и 1%-ный раствор антибиотиков- антимикотика (10 мг/мл стрептомицина, 10000 ед/мл пенициллина и 25 мг/мл амофтерицина (IMP Biomedicals, Германия) (далее полная среда) и инкубировали в течение 18 ч для прикрепления клеток. Далее, клеточную среду заменяли на 200 мкл/лун среды IMDM в отсутствие сыворотки и антибиотиков. Олигонуклеотиды (OSNF, OSN4F) растворяли в среде Opti-MEM, и добавляли к клеткам до финальной концентрации 1 или 5 мкМ (по 50 мкл/лун). В качестве положительного контроля использовали трансфекцию клеток контрольным олигонуклеотидом OSNF с помощью коммерчески доступного трансфектанта Eipofectamine 2000 (Thermo Fisher Scientific, США). Трансфекцию выполняли согласно протоколу фирмы-изготовителя. Клетки инкубировали в течение 4 ч в стандартных условиях. После инкубации клетки снимали с культурального пластика с помощью 2%-ного трипсина (MP Biomedicals, США), ресуспендировали в полной среде IMDM, центрифугировали при 200 g в течение 5 мин, промывали PBS и фиксировали в 2%-ном растворе формальдегида в PBS (10 мин, комнатная температура). Клетки анализировали на проточном цитометре NovoCyte 3000 (АСЕА Biosciences, США). Все экспериментальные точки выполняли в трех повторах для статистического анализа. Эффективность проникновения олигонуклеотидов характеризовали двумя показателями - процентом флуоресцентных клеток в популяции и средней интенсивностью флуоресценции клеток в образце, которые измеряли с помощью проточной цитометрии через 4 ч после трансфекции. Результаты эксперимента представлены на Фиг. 6. Гистограммы А и В показывают процент флуоресцентных клеток, гистограммы Б и Г — среднюю интенсивность флуоресценции. RFU - относительные флуоресцентные единицы, LF - Lipofectamine 2000. Данные представлены как среднее±стандартное отклонение.
[00326] Из представленных данных видно, что олигонуклеотид OSN4F в отсутствие дополнительных трансфекционных агентов эффективно проникает в клетки НЕК293Т как с точки зрения количества трансфицированных клеток, так и с точки зрения интенсивности флуоресценции. При этом эффективность проникновения OSN4F была сопоставима с эффективностью проникновения контрольного олигонуклеотида OSNF в присутствии коммерческого трансфекционного агента Lipofectamine 2000.
[00327] По гистограммам В и Г видно, что в отсутствие дополнительных трансфектантов модифицированный олигонуклеотид OSN4F проникает в клетки T98G эффективнее контрольного олигонуклеотида. Однако можно заметить, что для клеток глиобластомы T98G эффективность проникновения олигонуклеотидов кснижена по сравнению с клетками почек НЕК293Т, при этом сохранялась дозозависимая закономерность увеличения эффективности трансфекции. Одной из причин отличия эффективности проникновения олигонуклеотида являются особенности состава клеточных мембран НЕК293Т и T98G, обусловленные различием типов клеток.
[00328] Таким образом, модифицированный олигонуклеотид OSN4F способен эффективно проникать в культивируемые клетки человека НЕК293Т и T98G в отсутствие дополнительных трансфецирующих агентов. При этом эффективность его проникновения гораздо выше, чем у контрольного немодифицированного олигонуклеотида. Это говорит о положительном влиянии указанной модификации на способность к проникновению в клетки человека.
[00329] Важно, что эффективность проникновения модифицированного олигонуклеотида OSN4F без дополнительных трансфецирующих агентов сопоставима с эффективностью проникновения контрольного немодифицированного олигонуклеотида с помощью широко используемого трансфецирующего агента Lipofectamine2000.
[00330] Различия в эффективности проникновения модифицированного олигонуклеотида OSN4F в различные типы клеток говорят об избирательности проникновения, которая может быть обусловлена особенностями состава клеточных мембран. Такая избирательность вместе с зависимостью эффективности проникновения от дозы олигонуклеотида предоставляет возможности для создания высокоспецифических терапевтических препаратов.
Пример 46. Данные конфокальной микроскопии по проникновению модифицированного олигонуклеотида в клетки человека.
[00331] В данном исследовании использовали олигонуклеотид 5'-[FAM]- CTGACTATGAAGTAT*T-3' (OSN4F), где * - положение триазиниламидофосфатного звена, несущего два додецильных остатка.
[00332] Культивируемые клетки человека НЕК293Т высеивали на покровные стекла, помещенные в лунки 24-луночного планшета, в концентрации 6x104 кл/лун в полной среде IMDM и инкубировали при 37 °C в атмосфере 5%-ного СО2 в течение 12- 18 ч для прикрепления клеток. Далее, среду заменяли на IMDM в отсутствие сыворотки и антибиотика, содержащую OSN4F в концентрации 1 мкМ. Клетки инкубировали в присутствии олигонуклеотида при 37 °C в атмосфере 5%-ного СО2 в течение 4 ч. После инкубации покровные стекла с клетками помещали на предметные стекла в каплю среды ProLong Glass Antifade Mounting Medium (ThermoFisher Scientific, США), содержащей NucBlue для окраски клеточных ядер, и инкубировали стекла в горизонтальном положении в темноте при комнатной температуре в течение 12 ч для полимеризации среды.
[00333] Внутриклеточную локализацию олигонуклеотида OSN4F исследовали с помощью конфокального микроскопа LSM710 (Zeiss, Германия), используя объектив planapochromat 63 х/1.40 Oil DIC М27 (Zeiss, Германия) и два канала - синий и зеленый. Флуоресценция в синем канале при длине волны возбуждающего лазера 405 нм соответствовала NucBlue (окраска клеточных ядер); зеленый канал при длине волны возбуждающего лазера 488 нм соответствовал флуоресценции олигонуклеотида OSN4F, меченого остатком 6-карбоксифлуоресцеина.
[00334] На Фиг. 7 показана типичная серия микрофотографий клеток НЕК293Т, трансфецированных модифицированным олигонуклеотидом OSN4F. На левой фотографии видны ядра клеток, по центру — OSN4F (центр), справа — наложение каналов.
[00335] Данные конфокальной микроскопии показывают, что модифицированный олигонуклеотид OSN4F эффективно проникает в клетки человека, не налипая на клеточную мембрану, а локализуясь в цитоплазме и различных компартментах клетки. Это обеспечивает возможность модифицированным олигонуклеотидам достигать широкого круга разнообразных внутриклеточных молекулярных мишеней. Пример 47. Сравнение эффективности проникновения в клетки человека олигонуклеотидов, содержащих липофильные остатки в составе различных остовов модификации.
[00336] Исследование проводили на культивируемых клетках человека НЕК293Т. Работа с клетками и условия трансфекции осуществлялась как в примере 45.
[00337] Для исследования влияния остова модификации на эффективность проникновения использовали следующие модифицированные олигонуклеотиды: OSN4F - с триазиниламидофосфатной модификацией; PGO - с фосфорилгуанидиновой модификацией; PN - с двумя амидофосфатными модификациями; и ODF - с двумя ненуклеотидными звеньями. При этом все олигонуклеотиды содержали по два додецильных остатка.
OSN4F 5'- [FAM]CTGACTATGAAGTAT*T -3'
PGO 5'- [FAM]CTGACTATGAAGTAT*T -3'
PN 5'- [FAM]GGTAGCAAGTCGAGA*C*T -3'
ODF 5'-[FAM]CTGACTATGAAGTAT[D][D]T -3'
[00338] Результаты эксперимента представлены на Фиг. 8. Процент флуоресцентных клеток (слева) и среднюю интенсивность флуоресценции (справа) измеряли с помощью проточной цитометрии через 4 ч после трансфекции. RFU - относительные флуоресцентные единицы, LF - Lipofectamine 2000. Данные представлены как среднее±стандартное отклонение.
[00339] Из представленных данных видно, что уже при концентрации 1 мкМ олигонуклеотид OSN4F эффективно проникает в клетки. При этом частота его проникновения значительно выше, чем у всех остальных использованных олигонуклеотидов. Если посмотреть на интенсивность флуоресценции, то очевидно, что олигонуклеотид OSN4F проникает в клетки в больших количествах, чем остальные олигонуклеотиды .
[00340] Важно отметить, что все исследованные в данном примере олигонуклеотиды несли в своем составе одинаковое количество липофильных додецильных остатков. Это означает, что именно триазиниламидофосфатный остов, определяющий принадлежность к классу патентуемых соединений, обеспечивает улучшенное проникновение в клетки. Пример 48. Исследование эффективности проникновения в клетки человека модифицированных олигорибонуклеотидов.
[00341] Сравнение эффективности проникновения модифицированных олигорибонуклеотидов (ONI, ON2 и ON3) проводили на клеточной линии гепатоцеллюлярной карциномы человека (HepG2). Клетки культивировали в 24-х луночном планшете в среде МЕМ, содержащей 10% FBS, 1 мМ пирувата натрия и смесь антибиотиком 100 ЕД/мл (пенецилин/стрептомицин). По достижении 70% конфлюэнтности среду удаляли, а монослой промывали натрий-фосфатным буфером для удаления следов сыворотки, далее к культуре клеток приливали среду OptiMEM, содержащию один из конъюгатов в концентрации 1 или 2,5, или 5 мкМ. Клетки в присутствии конъюгата олигорибонуклеотида инкубировали 12 часов в СО2-инкубаторе. После чего среда менялась на МЕМ, далее клетки инкубировали в СО2-инкубаторе еще 2 часа с целью полной деградации налипшего на поверхность клеток конъюгата. Эффективность проникновения в клетки олигорибонуклеотидов оценивали с помощью проточной цитофлуорометрии, для чего клетки перед анализом отмывали натрийфосфатным буфером и открепляли от поверхности планшета с помощью раствора Трипсин-ЭДТА по стандартному протоколу. Анализ проводили в среде DME не содержащей красителя феноловый красный.
ONI 5 ’ - rGrArGrCrCrCrCrCrUrArCrArGrGrGrCrUrCrUrUT*T-FAM -3 '
ON2 5 ’ - rGrArGrCrCrCrCrCrUrArCrArGrGrGrCrUrCrUrUT*T-FAM -3 '
ON3 5 ’ - rGrArGrCrCrCrCrCrUrArCrArGrGrGrCrUrCrUrUT*T-FAM -3 '
Figure imgf000069_0001
Figure imgf000070_0001
[00342] Результаты эксперимента представлены на Фиг. 9. Видно, что все исследованные в данном примере модифицированные олигорибонуклеотиды способны проникать в клетки человека. Причем эффективность проникновения в клетки у модифицированных олигорибонуклеотидов значительно выше, чем в контроле.
[00343] Таким образом, проведенный анализ показал, что различные представители класса патентуемых соединений обладают таким свойством как улучшенное проникновение в клетки человека в отсутствие трансфекционных агентов.
Пример 49. Исследование эффективности образования комплементарных комплексов с участием модифицированных олигонуклеотидов.
[00344] Эффективность образования комплементарных комплексов исследовали для модифицированных олигонуклеотидов, содержащих триазиниламидофосфатную группу с остатками бутила (OSN1F) и додециламина (OSN4F, ISN4), а также немодифицированные олигонуклеотиды (OSNF, ISN).
[00345] Олигонуклеотиды OSN1F, OSN4F и OSNF смешивали с комплементарным олигонуклеотидом ISN. Олигонуклеотидов OSN1F и OSNF смешивали с модифицированным комплементарным олигонуклеотидом ISN4. Смешивание проводили в фосфатном буфере PBS при концентрации олигонуклеотидов 2,5 мкМ. Результаты экспериментов по измерению температуры плавления получаемых комплементарных комлексов представлены в таблице:
Figure imgf000071_0001
[00346] Видно, что во всех случаях модифицированные олигонуклеотиды способны эффективно связываться с коплементарными олигонуклеотидами. При этом температура плавления образуемых комплементарных комплексов лишь незначительно отличается от температуры плавления комплементарных комплесков, образованных олигонуклеотидами, не содержащими триазиновую модификацию (OSNF/ISN).
[00347] Приведенные данные показывают, что вне зависимости от размеров заместителей при триазиновой группе, в комплементарном комплексе триазиновая группа при образовании комплексов с комплементарными участками оказывается экспонированной наружу от двойной спирали и тем самым не оказывает влияния на комплементарное взаимодействие азотистых оснований внутри нее. [00348] Это говорит о том, что фосфатная группа согласно формуле (Fx) не оказывают существенного влияния на способность олигонуклеотидов формировать прочные и избирательные комплементарные комплексы с биологической мишенью. Пример 50. Исследование цитотоксичности модифицированных олигонуклеотидов.
[00349] Цитотоксичность олигонуклеотида OSN4F исследовали на клеточных культурах НЕК293Т и T98G в режиме реального времени с помощью прибора xCELLigence (АСЕА Biosciences, США) в течение 24 ч. Клетки высевали на 16-луночные Е-планшеты в плотности 105 кл/лун в 150 мкл/лун полной среды IMDM и инкубировали в стандартных условиях в течение 20 ч для прикрепления клеток ко дну планшета. После этого среду заменяли на 150 мкл/лун среды IMDM, содержащей 10% FBS и 0.5, 1, 2.5, 5, 10, 20, 50 мкМ олигонуклеотида OSN4F. Клетки инкубировали в течение 24 ч в стандартных условиях. Значения клеточных индексов измеряли каждые 30 мин. Дозозависимые кривые выживаемости клеток строили с помощью программного обеспечения MS Excel для временной точки 24 ч после добавления олигонуклеотида к клеткам. Значения IC50 рассчитывали как концентрацию олигонуклеотида, необходимого для снижения клеточного индекса на 50% по сравнению с контрольными клетками, инкубированными в отсутствие олигонуклеотида.
[00350] Результаты эксперимента представлены на Фиг. 10. Видно, что олигонуклеотид OSN4F является нетоксичным в отношении клеток НЕК293Т и T98G (IC50 201.8 мкМ и 385.8 мкМ, соответственно). Рассчитанные значения IC50 значительно превышают типовые концентрации терапевтических олигонуклеотидов, (1-5 мкМ).
[00351] Экспериментальные данные показывают, что олигонуклеотид, модифицированный согласно настоящему изобретению, обладает низкой токсичностью для клеток человека.
Список цитированной литературы:
1. Duca М, Vekhoff Р, Oussedik К, Halby L, Arimondo РВ. The triple helix: 50 years later, the outcome. Nucleic Acids Res. 2008;36:5123-5138.
2. Nielsen PE. Sequence-selective targeting of duplex DNA by peptide nucleic acids. Curr Opin Mol Ther. 2010;12:184-191.
3. Zamecnik PC, Stephenson ML. Inhibition of Rous sarcoma virus replication and cell transformation by a specific oligodeoxynucleotide. Proc Natl Acad Sci U S A. 1978;75:280-284.
4. Lee JF, Stovall GM, Ellington AD. Aptamer therapeutics advance. Curr Opin Chem Biol. 2006;10:282-9. 5. Crooke ST. Progress in antisense technology: The end of the beginning. Methods Enzymol. 2000;313:3-45.
6. Xu ZJ, Yang LF, Sun LQ, Cao Y. Use of DNAzymes for cancer research and therapy. Chinese Sci Bull. 2012;57:3404-3408.
7. Perez B, Rodriguez-Pascau L, Vilageliu L, Grinberg D, Ugarte M, Desviat LR. Present and future of antisense therapy for splicing modulation in inherited metabolic disease. J Inherit Metab Dis. 2010;33:397-403.
8. Ruckman J, Green LS, Beeson J, Waugh S, Gillette WL, Henninger DD, et al. 2’- fluoropyrimidine RNA-based aptamers to the 165-amino acid form of vascular endothelial growth factor (VEGF165): Inhibition of receptor binding and VEGF-induced vascular permeability through interactions requiring the exon 7-encoded domain. J Biol Chem. 1998;273:20556-67.
9. Lamond Al, Sproat BS. Antisense oligonucleotides made of 2’-O-alkylRNA: their properties and applications in RNA biochemistry. FEBS Lett. 1993;325:123-7.
10. Chi KN, Eisenhauer E, Fazli L, Jones EC, Goldenberg SL, Powers J, et al. A phase I pharmacokinetic and pharmacodynamic study of OGX-011, a 2'-methoxyethyl antisense oligonucleotide to clusterin, in patients with localized prostate cancer. J Natl Cancer Inst. 2005;97:1287-96.
11. Kaur H, Babu BR, Maiti S. Perspective on chemistry and therapeutic applications of locked nucleic acid (LNA). Chem Rev. 2007;107:4672-97.
12. Jager A, Engels J. Synthesis of deoxynucleoside methylphosphonates via a phosphonamidite approach. Tetrahedron Lett. 1984;25:1437-40.
13. Hau JF, Asseline U, Thuong NT. Octathymidylates involving alternating neopentylphosphothionotriester-phosphodiester linkages with controlled stereochemistry at the modified P-center. Tetrahedron Lett. 1991;32:2497-8.
14. Jager A, Levy MJ, Hecht SM. Oligonucleotide N-Alkylphosphoramidates: Synthesis and Binding to Polynucleotides. Biochemistry. 1988;27:7237-7246.
15. Egholm M, Buchardt O, Nielsen PE, Berg RH. Peptide Nucleic Acids (PNA). Oligonucleotide Analogues with an Achiral Peptide Backbone. J Am Chem Soc. 1992;114:1895-1897.
16. Summerton J, Weller D. Morpholino antisense oligomers: Design, preparation, and properties. Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 1997;7:187-95.
17. Spurgers KB, Sharkey CM, Warfield KL, Bavari S. Oligonucleotide antiviral therapeutics: Antisense and RNA interference for highly pathogenic RNA viruses. Antiviral Res. 2008;78:26- 36. 18. Berkhout В, Haasnoot J. Nucleic acids-based therapeutics in the battle against pathogenic viruses. Handb Exp Pharmacol. 2009;189:243-63.
19. Ahn DG, Lee W, Choi JK, Kim SJ, Plant EP, Almazan F, et al. Interference of ribosomal frameshifting by antisense peptide nucleic acids suppresses SARS coronavirus replication. Antiviral Res. 2011;91:1-10.
20. Lee CH, Kim JH, Lee SW. Prospects for nucleic acid-based therapeutics against hepatitis C virus. World J Gastroenterol. 2013;19:8949-62.
21. H. F. Rosenberg, J. B. Domachowske. Inflammatory Responses to Respiratory Syncytial Virus (RSV) Infection and the Development of Immunomodulatory Pharmacotherapeutics. Curr Med Chem. 2012;19:1424-31.
22. Choi JH, Croyle MA. Emerging Targets and Novel Approaches to Ebola Virus Prophylaxis and Treatment. BioDrugs [Internet]. 2013;27:565-583. Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3624763/pdf/nihms412728.pdf
23. Maepa MB, Roelofse I, Ely A, Arbuthnot P. Progress and prospects of anti-HBV gene therapy development. Int J Mol Sci. 2015;16:17589-610.
24. Asha K, Kumar P, Sanicas M, Meseko C, Khanna M, Kumar B. Advancements in Nucleic Acid Based Therapeutics against Respiratory Viral Infections. J Clin Med. 2018;8:6.
25. Zhang K, Zheludev IN, Hagey RJ, Teng M, Wu P, Haslecker R, et al. Cryo-electron Microscopy and Exploratory Antisense Targeting of the 28-kDa Frameshift Stimulation Element from the SARS-CoV-2 RNA Genome. bioRxiv [Internet]. 2020; Available from: https://doi.org/10.1101/2020.07.18.209270
26. Sharad S. Antisense Therapy: An Overview. Intech [Internet]. 2016. p. 1-11. Available from: https://www.intechopen.com/books/advanced-biometric-technologies/liveness-detection-in- biometrics
27. Miller PS, Yano J, Yano E, Carroll C, Jayaraman K, Ts’o POP. Nonionic Nucleic Acid Analogues. Synthesis and Characterization of Dideoxyribonucleoside Methylphosphonates. Biochemistry. 1979;18:5134-43.
28. Stec WJ, Zon G, Egan W, Stec B. Automated Solid-Phase Synthesis, Separation, and Stereochemistry of Phosphorothioate Analogues of Oligodeoxyribonucleotides. J Am Chem Soc. 1984;106:6077-6079.
29. Burgers PMJ, Eckstein F. Diastereomers of S’-O-Adenosyl S’-O-Uridyl Phosphorothioate: Chemical Synthesis and Enzymatic Properties. Biochemistry. 1979;18:592-596.
30. Seeberger PH, Caruthers MH, Yau E. 2’ -Deoxynucleoside Dithiophosphates: Synthesis and Biological Studies. J Am Chem Soc. 1995;117:1472-1478. 31. Hall AHS, Wan J, Spesock A, Sergueeva Z, Shaw BR, Alexander KA. High potency silencing by single-stranded boranophosphate siRNA. Nucleic Acids Res. 2006;34:2773-81.
32. Hogrefe RI, Vaghefi MM, Reynolds MA, Young KM, Arnold LJ. Deprotection of methylphosphonate oligonucleotides using a novel one -pot procedure. Nucleic Acids Res. 1993;21:2031-2038.
33. Reynolds MA, Hogrefe RI, Jaeger JA, Schwartz DA, Riley TA, Marvin WB, et al. Synthesis and thermodynamics of oligonucleotides containing chirally pure R(p) methylphosphonate linkages. Nucleic Acids Res. 1996;24:4584-4591.
34. Rait V, Sergueev D, Summers J, He K, Huang F, Krzyzanowska B, et al. Boranophosphate nucleic acids - A versatile DNA backbone. Nucleosides and Nucleotides. 1999;18:1379-80.
35. Hall AHS, Wan J, Shaughnessy EE, Shaw BR, Alexander KA. RNA interference using boranophosphate siRNAs: Structure-activity relationships. Nucleic Acids Res. 2004;32:5991- 6000.
36. Letsinger RL, Singman CN, Histand G, Salunkhe M. Cationic oligonucleotides. J Am Chem Soc. 1988;110:4470-1.
37. Laurent A, Naval M, Debart F, Vasseur JJ, Rayner B. Chiral and steric effects in the efficient binding of a-anomeric deoxyoligonucleoside N-alkylphosphoramidates to ssDNA and RNA. Nucleic Acids Res. 1999;27:4151-4159.
38. Maier MA, Guzaev AP, Manoharan M. Synthesis of chimeric oligonucleotides containing phosphodiester, phosphorothioate, and phosphoramidate linkages. Org Lett. 2000;2:1819-22.
39. Aboul-Fadl T. Antisense Oligonucleotides: The State of the Art. Curr Med Chem. 2005;12:2193-214.
40. Alter J, Lou F, Rabinowitz A, Yin HF, Rosenfeld J, Wilton SD, et al. Systemic delivery of morpholino oligonucleotide restores dystrophin expression bodywide and improves dystrophic pathology. Nat Med. 2006;12:175-7.
41. Wu B, Moulton HM, Iversen PL, Jiang J, Li J, Li J, et al. Effective rescue of dystrophin improves cardiac function in dystrophin-deficient mice by a modified morpholino oligomer. Proc Natl Acad Sci U S A. 2008;105:14814-9.
42. Sinha ND, Biemat J, Mcmanus J, Koster H. Polymer support oligonucleotide synthesis XVIII: Use of p-cyanoethyi-N,N-dialkylamino-/N-morpholino phosphoramidite of deoxynucleosides for the synthesis of DNA fragments simplifying deprotection and isolation of the final product. Nucleic Acids Res. 1984;12:4539-4557.
43. Maniatis T, Fritsch EF, Sambrook J. Molecular Cloning : a laboratory manual. 2nd edition. Cold Spring Harb ,New York. 1989;

Claims

Формула изобретения
1. Соединение, отвечающее формуле F0:
Figure imgf000076_0001
В котором заместитель Z выбран из группы: -ОН, -SH, -SeH, -NHRN, -O-PG, -S-PG, -Se- PG или -N(PG)RN
В одном варианте реализации X выбран из группы, состоящей из 5'-О-конца нуклеозида или олигонуклеотида, a Y выбран из группы, состоящей из 3 '-О-конца нуклеозида или олигонуклеотида, -Н, -ОН, -SH, -NHRN, -O-PG или -S-PG, линкера, монофосфата или дифосфата.
В другом варианте реализации Y выбран из группы, состоящей из 5'-О-конца нуклеозида или олигонуклеотида, а X выбран из группы, состоящей из 3 '-О-конца нуклеозида или олигонуклеотида, -Н, -ОН, -SH, -NHRN, -O-PG или -S-PG, линкера, монофосфата или дифосфата.
Заместители R1, R2, R3 R4 выбраны из ряда -Н, -Сывалкил, -С2_1залкенил, -Сг-^алкинил и -Сб-18арил, которые могут включать группы -NH-, -N< -О-, -NHC(O)-, -NHS(O)2-, -
Figure imgf000076_0002
также оканчиваться группами -NR2, -OR, -
SR, -OC(O)R, -NHC(O)R, -C(O)OR, -C(O)NHR, -N=C(N(R2)2, -S(O)R, -S(O)2R, - S(O)2NR2, -CN, -Cl, -Br, -I, -F, -N3,
75
Figure imgf000077_0001
Заместители R5, R6, R7 R8 выбраны из ряда, содержащего -Н, -Смвалкил, -С2- ^алкенил, - С2-|Щлкинил и -Сб-18арил, которые могут включать группы -NH-, -N<, -О- -NHC(O)-, - NHS(O)2-, -N(CH2CH2)2N-, а также оканчиваться группами -NR2, -OR, -SR, -OC(O)R, - NHC(O)R, -C(O)OR, -C(O)NHR, -N=C(N(R2))2, -S(O)R, -S(O)2R, -S(O)2NR2, -CN, -Cl, - Br, -I, -F, -N3.
При этом R представляет собой заместитель, выбранный из ряда -Н, -Сыхалкил, -С2_ 18алкенил, -С2-|халкинил и -Св-ыарил, которые могут включать группы -NH-, -N<, -О-, - NHC(O)-, -NHS(O)2-, -N(CH2CH2)2N- И могут оканчиваться группами -NRN 2, -ORN, - SRN, -OC(O)RN, -NHC(O)RN, -C(O)ORN, -C(O)NHRN, -N=C(N(R2))2, -S(O)R, -S(O)2R, - S(O)2NR2, -CN, -Cl, -Br, -I, -F, -N3.
Где PG — это защитная группа,
RN представляет собой -Н или -Сг алкил.
2. Соединение, по п.1, в котором Заместители R1, R2, R3 R4 выбраны из ряда -Н, -Сп 18алкил, -C2-i «алкенил, -С2- халкинил и -Селхарил, которые могут включать группы -NH-
Figure imgf000077_0002
3. Соединение, по п.1, в котором R1, R2, R R4 выбраны из ряда -Н, -Сыхалкил, -С2. 18алкенил, — С2-1«алкинил и -Сб-ixapru, которые могут оканчиваться группами — NR2, -OR, — SR, -OC(O)R, -NHC(O)R, -C(O)OR, -C(O)NHR, -N=C(N(R2)2, -S(O)R, -S(O)2R, - S(O)2NR2, -CN, -Cl, -Br, -I, -F, -N3,
Figure imgf000078_0001
4. Соединение, по п.1, в котором R1 = R3, R2 = R4
5. Соединение, по п.4, в котором R1 = R3 = -Н или -СН3, R2 = R4
6. Соединение, по п.5, в котором R1 = R3 = — Н или — СН3, R2 = R4 = — Сныалкил.или -Сц 18алкенил.
7. Соединение, по п.1, в котором R1 и R2 и/или R3 и R4, вместе формируют =C(NRi)2 группу.
8. Соединение, по п.1, в котором R1 и R2; R3 и R4; R5 и R6; R7 и R8 совместно со связанным с ними атомом формируют 5-8 членный гетероцикличный заместитель, выбранный из группы, состоящей N-пирролидинила, N-пиперидинила, N-азепанила, N-азоканила или N- пиперазинила.
9. Способ получения соединения согласно п. 1 (F0), заключающийся во взаимодействии производного трехвалентного фосфора формулы (F1) с азидотриазином формулы (F2) с получением соединения формулы (F3), с последующим обработкой аминами HNR'R2. HNR3R4 или HNRXRY. При этом заместители Rx и RY будут преобразованы в заместители R1, R2, R3 R4 с использованием известных в области техники реакций превращения соответствующих реакционных групп, входящих в состав Rx и RY.
Figure imgf000078_0002
Заместители X, Y, Z определены так же, как они определены в формуле (F0).
А и В могут быть независимо выбраны из ряда NR'R2, -NR3R4, -NRXRY, Q.
Где Q это группа, способная вступать в реакции замещения. Q выбирается из ряда: -OR, - OC(O)R, -OS(O)2R, -CN, -Cl, -Br, -I, -F, -N3. Группа Q может быть замещена на -NR'R2. -NR3R4, -NRXRY В реакции с соответствующим амином HNR'R2, HNR3R4, HN XRY.
77 Где заместители Rx, RY выбраны из ряда, содержащего -Н, -С и «ал кил, -C2-i «алкенил, -С2. 18алкинил и -Сб-18 рил, которые могут включать группы -NH-, -N<, -О-, -NHC(O)-, - NHS(O)2- и/или -N(CH2CH2)2N-, а также оканчиваться группами -NR2, -OR, -SR, - OC(O)R, -NHC(O)R, -C(O)OR, -C(O)NHR, -N=C(N(R2))2, -S(O)R, -S(O)2R, -S(O)2NR2, - CN, -Cl, -Br, -I, -F, -N3.
При этом заместители R1, R2, R3, R4, R как они описаны в п. 1 (F0).
10. Способ получения соединения согласно п. 9, где производное трехвалентного фосфора это Н-фосфонатное звено, полученное согласно Н-фосфонатному методу олигонуклеотидного синтеза, или фосфитное звено, полученного согласно амидофосфитному методу олигонуклеотидного синтеза.
11. Способ по п. 10, где А = В = -Q
12. Способ по п. 11, где Q = С1.
13. Способ по п. 10, где А = -NRLR2, В = -Q.
14. Способ по п. 13, где Q = С1.
15. Способ по п. 10, где А = -NRLR2, В = -NR3R4
16. Олигонуклеотид, в котором хотя бы одна модифицированная фосфатная группа, соответствует формуле Fx:
Figure imgf000079_0001
где — показывает место присоединения соответствующих олигонуклеотиду заместителей, a R1, R2, R3 и R4 определяются так же, как в формуле (F0) п. 1.
17. Использование олигонуклеотида по п. 16 в качестве исследовательского средства in vitro.
18. Использование олигонуклеотида по п. 16 в качестве исследовательского средства in VIVO.
19. Использование олигонуклеотида по и. 16 в качестве диагностического средства.
20. Использование олигонуклеотида по п. 16 в качестве терапевтического олигонуклеотида.
21. Использование олигонуклеотида по и. 16 в качестве противовирусного средства.
22. Использование олигонуклеотида по и. 16 в качестве противомикробного средства.
23. Использование олигонуклеотида по и. 16 в качестве противоракового средства.
24. Использование олигонуклеотида по и. 16 в качестве противоракового средства, модулирующего экспрессию микро-РНК.
79
PCT/RU2021/050339 2020-10-12 2021-10-13 Химическое соединение с триазиновой группой и способ его получения WO2022081046A1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2020133433 2020-10-12
RU2020133433A RU2799452C2 (ru) 2020-10-12 Химическое соединение с триазиновой группой и способ его получения

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2022081046A1 true WO2022081046A1 (ru) 2022-04-21

Family

ID=81208387

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/RU2021/050339 WO2022081046A1 (ru) 2020-10-12 2021-10-13 Химическое соединение с триазиновой группой и способ его получения

Country Status (1)

Country Link
WO (1) WO2022081046A1 (ru)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116606488A (zh) * 2023-06-12 2023-08-18 深圳市好年璟科技有限公司 一种耐磨橡塑复合材料

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007059816A1 (en) * 2005-11-23 2007-05-31 Roche Diagnostics Gmbh Polynucleotide containing a phosphate mimetic
WO2008128686A1 (en) * 2007-04-18 2008-10-30 Roche Diagnostics Gmbh Nucleotide with an alpha-phosphate mimetic
RU2708237C2 (ru) * 2014-08-22 2019-12-05 Общество с ограниченной ответственностью "НооГен" Модифицированные олигонуклеотиды и способ их получения

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007059816A1 (en) * 2005-11-23 2007-05-31 Roche Diagnostics Gmbh Polynucleotide containing a phosphate mimetic
WO2008128686A1 (en) * 2007-04-18 2008-10-30 Roche Diagnostics Gmbh Nucleotide with an alpha-phosphate mimetic
RU2708237C2 (ru) * 2014-08-22 2019-12-05 Общество с ограниченной ответственностью "НооГен" Модифицированные олигонуклеотиды и способ их получения

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116606488A (zh) * 2023-06-12 2023-08-18 深圳市好年璟科技有限公司 一种耐磨橡塑复合材料
CN116606488B (zh) * 2023-06-12 2024-05-17 深圳市好年璟科技有限公司 一种耐磨橡塑复合材料

Also Published As

Publication number Publication date
RU2020133433A3 (ru) 2022-04-12
RU2020133433A (ru) 2022-04-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US12084468B2 (en) Synthesis of backbone modified morpholino oligonucleotides and chimeras using phosphoramidite chemistry
AU2017315670B2 (en) Compositions comprising reversibly modified oligonucleotides and uses thereof
RU2708237C2 (ru) Модифицированные олигонуклеотиды и способ их получения
AU2005325262B2 (en) Single-stranded and double-stranded oligonucleotides comprising a 2-arylpropyl moiety
AU2005328382C1 (en) Oligonucleotides comprising a modified or non-natural nucleobase
US20050119470A1 (en) Conjugated oligomeric compounds and their use in gene modulation
WO2004044141A2 (en) Conjugated oligomeric compounds and their use in gene modulation
WO2018156056A1 (ru) Модифицированные олигонуклеотиды, активирующие рнказу н
Skakuj et al. Mercury-free automated synthesis of guanidinium backbone oligonucleotides
WO2022081046A1 (ru) Химическое соединение с триазиновой группой и способ его получения
RU2799452C2 (ru) Химическое соединение с триазиновой группой и способ его получения
US20180251485A1 (en) Pyrazolotriazolyl nucleoside analogues and oligonucleotides comprising them
Li Novel oligonucleotide mimics for antisense therapeutics: Design, syntheses, biophysical and sequence-selective DNA cleavage studies of hydroxamate linked oligomers

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 21880661

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 21880661

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1