DE3650349T2

DE3650349T2 - Immunotestmittel für polynukleotid und verfahren.

Info

Publication number: DE3650349T2
Application number: DE3650349T
Authority: DE
Inventors: James Summerton
Original assignee: Antivirals Inc
Current assignee: Sarepta Therapeutics Inc
Priority date: 1985-03-15
Filing date: 1986-03-14
Publication date: 1995-12-14
Anticipated expiration: 2006-03-15
Also published as: EP0215942B1; DE3650699D1; EP0639582A2; JP2528107B2; DE3650699T2; JPH08193998A; AU5698186A; ATE81872T1; AU5661386A; CA1268404A; US5142047A; ATE124999T1; JPS62502357A; DE3650349D1; JP2670434B2; JP3022967B2; EP0216860A4; WO1986005519A1; EP0216860B1; ATE171185T1

Description

1. Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein diagnostisches System und Verfahren für Polynukleotide.

2. Hintergrund

Zwei allgemeine Typen von diagnostischen Systemen für Polynukleotide, beide beruhend auf der Hybridisierung zwischen komplementären Segmenten einer Polynukleotidsonde und eines einzelsträngigen Polynukleotid-Analyten, sind entwickelt worden. Bei dem ersten Typ wird der Polynukleotid-Analyt einzelsträngig gemacht und an einen festen Träger, wie etwa einen Nitrocellulose-Filter, fixiert. Unter Annealing-Bedingungen für komplementäre Stränge wird der Träger dann mit einer reportermarkierten Sonde zur Reaktion gebracht, welche komplementär zu einer Zielbasensequenz-Region des Analyten ist. Nach mehrmaligen Waschen, um ungebundene Sonde zu entfernen, wird der feste Träger auf das Vorhandensein des Reporters analysiert. Dieses System ist nicht vollständig zufriedenstellend gewesen, insbesondere in klinischen Situationen, worin Einfachheit und Empfindlichkeit des Tests erforderlich sind. Das zur Fixierung des einzelsträngigen Polynukleotid-Materials an den festen Träger verwendete Verfahren ist ziemlich verwickelt und zeitaufwendig. Die Empfindlichkeit des Systems ist beschränkt, weil im Normalfall jedes Analytmolekül mit einem einzelnen Sondenmolekül hybridisiert und jede Sonde im allgemeinen etwa 100 Reporter-Gruppen enthält.
Ein zweiter Typ eines diagnostischen Systems für Polynukleotide beinhaltet zwei analytspezifische Sonden, welche jeweils zu einer unterschiedlichen Region des Analyt- Polynukleotides komplementär sind. Die erste Sonde ist an einen festen Träger geknüpft, und die zweite Sonde ist frei in Lösung und trägt mehrere Reportermoleküle. In der Praxis wird der Analyt mit den zwei Sonden unter Bedingungen vermischt, welche die Anlagerung von komplementären Polynukleotidsträngen erlauben, einschließlich der Anlagerung sowohl der immobilisierten als auch der reportertragenden Sonden an den Polynukleotid-Analyten, um den Reporter mittels des Analyten an den festen Träger zu knüpfen.
Obwohl das Zweifach-Sondensystem das Problem vermeidat, das Test- Nukleinsäurematerial an einen festen Träger knüpfen zu müssen, weist das Verfahren nichtsdestoweniger eine Anzahl von Einschränkungen auf. Erstens kompetitiert, wenn die Test-Nukleinsäure von doppelsträngiger Nukleinsäure abgeleitet ist, wie dies oft der Fall ist, die Hybridisierung zwischen dem analyt-Polynukleotid und dessen komplementären Strang mit der Hybridisierung zwischen dem Analyten und den beiden Sonden. Weiterhin ist das Zwei-Sondensystem, da es auf Kinetiken von höherer Größenordnung beruht, als dies für Einzel-Sondensysteme der Fall ist, inhärent langsamer als ein Einzel-Sondensystem. Auch steigert die Notwendigkeit für zwei verschiedene Sonden die Kosten des Systems. Letztendlich, hinsichtlich der Testempfindlichkeit, leidet das Zweifach-Sondensystem unter denselben Einschränkungen wie das obenstehend erwähnte Einfach-Sondensystem -- jedes Analyt- Polynukleotid bindet nur eine "Reporter"-Sonden.

3. Zusammenfassung der Erfindung

Es ist ein allgemeines Ziel der Erfindung, ein diagnostisches System und Verfahren zum Einsatz beim Nachweis eines Polynukleotides zur Verfügung zu stellen, welches die obenstehend erörterten Probleme und Einschränkungen, welche mit dem Stand der Technik verbunden sind, im wesentlichen überwindet.
Es ist ein weiteres Ziel der Erfindung, in einem derartigen System eine Reagenz zur Verfügung zu stellen, welches ein Polynukleotid-bindendes Polymer aufweist, das so angepaßt ist, eine basenspezifische Duplex-Struktur mit einem einzelsträngigen Polynukleotid-Analyten unter Bedingungen, bei denen komplementäre Polynukleotidstränge in dem einzelsträngigen Zustand verbleiben, zu bilden. Das Binden des Analyten kann deshalb unter Bedingungen, bei denen eine sequenzspezifische Paarung zwischen dem Reagenz-Polymer und dem Analyten ohne Kompetition durch Anlagerung von zum Analyten komplementären Strängen in der Testreaktions-Mischung stattfindet, durchgeführt werden.
Es ist ein weiteres Ziel der Erfindung, in einem derartigen System einen Reporter zur Verfügung zu stellen, der daran angepaßt ist, durch elektrostatische Kräfte an das Grundgerüst eines Analyt-Polynukleotides unter Bedingungen zu binden, bei denen eine Bindung des Reporters an das Reagenz-Polymer nicht stattfindet. Das System besitzt deshalb, dank der relativ großen Anzahl von Reportermolekülen, welche mit jedem Polynukleotid-Analytmolekül kombinieren können, die Fähigkeit zu sehr hohen Signal- Werten.
Ein diagnostisches Verfahren für Polynukleotide zur Verfügung zu stellen, das schnell, bequem und empfindlich ist, ist noch ein weiteres Ziel der Erfindung.
Die Erfindung beinhaltet ein diagnostisches Reagenz zur Verwendung beim Nachweis eines Analyt-Polynukleotides mit einer definierten Ziel-Basensequenz. Das Reagenz besteht aus einem festen Träger und verbunden mit dem Träger, mehreren Polynukleotidbindenden Polymeren. Jedes Polymer ist aus einer Sequenz von basenkomplementären Erkennungsgruppen aufgebaut, von denen jede an eine Wasserstoffbrückenbindung zu entsprechenden in Folge angeordneten Basen innerhalb der Zielregion des Analyten, unter ausgewählten Bindungsbedingungen, adaptiert ist, und einem unverzweigten, im wesentlichen stereoregulären Grundgerüst (1), das die Erkennungsgruppen an Positionen trägt, welche Wasserstoffbrückenbindung zwischen den Erkennungsgruppen und den entsprechenden in Folge angeordneten Basen des Ziels ermöglichen, und daß (2) eine Grundgerüst-Ladungsdichte aufweist, welche wesentlich niedriger ist, als diejenige des Analyten unter den gewählten Bindungsbedingungen. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung enthalten die Erkennungs-gruppen Purin- und Pyrimidin-Basen, und das Grundgerüst ist aus einer Reihe von Gerüstgruppen aufgebaut, welche durch achirale, vorwiegend ungeladene Veknüpfungen verbunden sind. Gemäß einer anderen Ausführungsform der Erfindung werden dieselben Erkennungsgruppen auf einem Grundgerüst getragen, dessen Bindungen nicht-geladene, stereoisomer definierte oder achirale Verknüpfungen im Wechsel mit negativ geladenen, achiralen Verknüpfungen umfassen.
Ein diagnostisches System zur Detektion eines Polynukleotid-Analyten mit einer definierten Zielsequenz umfaßt das diagnostische Reagenz und einen Reporter, welcher einen polykationischen Schwanz aufweist, der adaptiert ist, unter vorherbestimmten Bindungsbedingungen durch elektrostatische Anziehung an das geladene Grundgerüst des Polynukleotid-Analyten zu binden, aber nicht an das wesentlich weniger geladene oder ungeladene Grundgerüst des Reagenz-Polymers. Eine oder mehrere an den polykationischen Schwanz angeknüpfte Reporter-Gruppen, sind daran angepaßt, ein Signal zu erzeugen, durch welches die Anwesenheit des Reporters nachgewiesen werden kann.
Bei dem Verfahren der Erfindung wird der Polynukleotid-Analyt zu dem diagnostischen Reagenz unter Bedingungen zugegeben, bei denen der Analyt in einer einzelsträngigen Form vorliegt, und welche sequenzspezifische Paarung zwischen dem Analyten und den Reagenz-Polymeren erlauben. Nach der Analyt/Polymer-Anlagerungsreaktion wird das Reagenz gewaschen, um ungebundenes Testmaterial zu entfernen. Das Reagenz und der gebundene Analyt werden dann, unter vorherbestimmten Bedingungen, mit dem Reporter zur Reaktion gebracht, bei denen der polykationische Schwanz in dem Reporter elektrostatisch an das geladene Grundgerüst des Polynukleotides bindet aber nicht an das wesentlich weniger geladene oder ungeladene Grundgerüst des Reagenz-Polymers. Das Reagenz wird wieder gewaschen, um ungebundenen Reporter zu entfernen. Die Anwesenheit und/oder die Menge des an das Reagenz gebundenen Analyten wird in situ durch Messen des mit dem Reagenz gebundenen Analyten assoziierten Reportersignals bestimmt, oder der Reporter wird von dem Reagenz/Analyt eluiert, und das Reportersignal in dem Eluat wird gemessen.
Diese und andere Ziele und Merkmale der vorliegenden Erfindung werden noch vollständiger offensichtlich werden, wenn die folgende detaillierte Beschreibung der Erfindung in Verbindung mit den begleitenden Figuren gelesen wird.

Kurze Beschreibung der Figuren

Die Figur 1 zeigt bevorzugte Purin- und Pyrimidin-Strukturen, die bei der Bildung von Polymermolekülen der Erfindung verwendet werden;
die Figur 2 zeigt bevorzugte Purin-ähnliche und Pyrimidin-ähnliche Erkennungsgruppen, die bei der Bildung der Polymermoleküle verwendet werden;
die Figur 3 zeigt bevorzugte cyclische Grundgerüstgruppen, welche bei der Bildung der Polymermoleküle verwendet werden;
die Figur 4 zeigt bevorzugte acyclische Grundgerüstgruppen, die bei der Bildung der Polymermoleküle verwendet werden;
die Figuren 5A und 5B veranschaulichen zwei bevorzugte Zusammenbau- Schemata der Untereinheiten zur Kopplung von Grundgerüstuntereinheiten des N&sub1;---N&sub2;- Typs;
die Figur 6 zeigt die Grundgerüststrukturen der Untereinheit-Dimere A-A bis D-D, die gemäß den in Figur 5A und 5B veranschaulichten Verfahren gebildet wurden, und zwei cyclische Grundgerüststrukturen, die gemäß den in den Figuren 7A und 7B veranschaulichten Verfahren gebildet wurden;
die Figuren 7A bis 7C veranschaulichen drei bevorzugte Untereinheit- Zusammenbauschemata zur Kopplung von Untereinheit-Grundgerüststrukturen des N&sub1;---E-Typs; und
die Figur 8 zeigt bevorzugte acyclische Grundgerüststrukturen von Untereinheit-Dimeren, welche gemäß den in den Figuren 7A bis 7C veranschaulichten Verfahren gebildet wurden; und
die Figur 9 zeigt die Synthese eines Tetranukletotid-Analagons, das Methylphosphonat-Grundgerüst-Bindungen im Wechsel mit einer Phosphotriester- Bindung aufweist;
die Figur 10 veranschaulicht Reaktionen zur Anknüpfung von Verbindungsarm- Molekülen an einen festen Träger;
die Figur 11 zeigt ein allgemeines Verfahren für die Synthese von Polyaminen von N-Methyl-Aminosäuren;
die Figur 12 zeigt ein Verfahren für die Synthese von Polyaminen mit einer terminalen primären Amino-Gruppe;
die Figur 13 zeigt die Herstellung des quaternären Ammonium-kationischen Schwanzes mit einer terminalen primären Amino-Gruppe;
die Figur 14 veranschaulicht eine Reaktion zur Herstellung eines mehrfach geladenen enzymatischen Reporters gemäß einer Ausführungsform der Erfindung;
die Figur 15 veranschaulicht eine Reaktion zur Herstellung eines zweifachgeladenen Fluoreszenz-Reporters gemäß einer Ausführungsform der Erfindung; und die Figur 16 veranschaulicht verschiedene Bestandteile, die in dem diagnostischen System und Verfahren der Erfindung beteiligt sind.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Das diagnostische System der Erfindung beinhaltet ein festes Träger-Reagenz, das aus einem festen Träger aufgebaut ist, welcher eine Vielzahl von Nukleotid-bindenden Polymermolekülen trägt. Die polymere Zusammensetzung der Erfindung ist entworfen, um mit einer ausgewählten Bindungsaffinität an ein Polynukleotid zu binden, das eine Zielsequenz von Basen enthält. Die Zusammensetzung besteht aus Nicht- Homopolymeren, im wesentlichen stereoregulären Molekülen oder Spezies der Form:
worin B-Ri eine Reihe von basenspezifischen Untereinheiten sind, welche eine Grundgerüstgruppe B enthalten und eine Erkennungsgruppe Ri, welche so ausgewählt ist, um spezifisch durch Watson/Crick-Basenpaarung an eine entsprechende in Folge angeordnete Base der Zielsequenz zu binden, und die Untereinheiten über ihre Grundgerüstteile vorwiegend durch achirale, im wesentlichen ungeladene Verknüpfungen verbunden sind. Der Entwurf und die Auswahl geeigneter Untereinheiten zum Einsatz in der Konstruktion der Polymerspezies wird in dem nachfolgenden Abschnitt I beschrieben werden. Verfahren zur Kopplung von Untereinheiten durch achirale Verknüpfungen sind in Abschnitt III beschrieben, wobei bei der Synthese der Untereinheiten beteiligte Strategien hinsichtlich Untereinheit-Schutzgruppen im Abschnitt II diskutiert werden.
Die vorliegende Erfindung stellt somit ein diagnostisches System zur Bestimmung eines einzelsträngigen Polynukleotid-Analyten, der eine ausgewählte Zielsequenz von Basen enthält, zur Verfügung, wobei das System folgendes umfaßt:
ein diagnostisches Reagenz, bestehend aus einem festen Träger und am Träger gebunden multiplen Polymeren, wobei jedes Polymer dahingehend wirksam ist, mit einer ausgewählten Bindungsaffinität an dem einzelsträngigen Polynukleotid zu binden, wobei die Polymere nicht-homopolymere Polymermoleküle der Form:
umfassen, worin:
(a) R&sub1; - Rn aus Purin, purinartigen Heterocyclen, Pyrimidin und pyrimidinartigen Heterocyclen gewählte Erkennungsteile sind, die wirksam sind, durch Watson/Crick- Paarung an entsprechenden, in Reihe angeordneten Basen in der Zielsequenz zu binden;
(b) n dergestalt ist, daß die Gesamtanzahl der Watson/Crick- Wasserstoffbindungen, die zwischen einem Polymermolekül und einer Zielsequenz ausgebildet werden, mindestens etwa 15 beträgt;
(c) B - B Grundgerüstteile sind, die vornehmlich mittels chemisch stabilen, im wesentlichen ungeladenen, vornehmlich achiralen Verknüpfungen verbunden sind, ausgewählt aus der aus folgenden bestehenden Gruppe:
worin Y = O oder S ist und
ist; und
(d) die Gerüstgruppen die Erkennungsgruppen an Positionen tragen, welche die Watson/Crick-Basenpaarung zwischen den Erkennungsgruppen und den entsprechenden, der in Reihe angeordneten Basen der Zielsequenz erlauben,
und
Moleküle eines Reporters, wobei der Reporter aus einem oligokationischen Schwanz, der so gewählt ist, daß er elektrostatisch an dem geladenen Gerüst des Polynukleotid- Analyten unter vorgewählten Bedingungen, bei denen der Schwanz nicht an dem weniger dicht geladenen oder ungeladenen Gerüst der Polymeren binden kann, bindet, und, am Schwanz gebunden, einer oder mehrerer Reporter-Gruppen, die zur Bildung eines Signals gewählt sind, durch das die Anwesenheit des Reports aufgespürt werden kann.
Ferner ermöglicht die Erfindung die Verwendung einer Morpholino-Untereinheit der Form:
worin P ein Basenpaarungsteil ist, der in der Lage ist, mittels Watson/Crick-Paarung an komplementäre Basen in einem Polynukleotid zu binden,
und worin T H oder eine N-Schutzgruppe ist, zur Herstellung eines Polymeren für die Verwendung in dem diagnostischen System der Erfindung.
Die Erfindung stellt ferner diagnostische Systeme des obenstehend beschriebenen Types zur Verfügung, worin die Polymere
gebildet werden unter Verwendung von Morpholino-Untereinheiten der Form
worin P ein Basenpaarungsteil ist, der in der Lage ist, mittels Watson/Crick-Paarung an komplementäre Basen in einem Polynukleotid zu binden, und worin T H oder eine N- Schutzgruppe ist.
Die Erfindung stellt gleichfalls eine Polymerzusammensetzung zur Verfügung, welche aus Morpholino-Untereinheitstrukturen der Form:
besteht, worin (i) die Strukturen durch ungeladene, achirale Verknüpfungen, ein bis drei Atome lang, miteinander verknüpft sind, welche das Morpholino-Stickstoffatom einer Untereinheit an das 5'-, exocyclische Kohlenstoffatom einer benachbarten Untereinheit knüpfen, und worin (ii) Pi eine Purin- oder Pyrimidin-Basenpaarungsgruppe ist, die dahingehend wirksam ist, mittels basenspezifischer Wasserstoffbrückenbindung an eine Base in einem Polynukleotid zu binden.
Die Erfindung stellt ebenfalls ein Verfahren zur Bestimmung eine Polynukleotid-Analyten zur Verfügung, der eine ausgewählte Zielbasensequenz enthält, wobei das Verfahren folgendes umfaßt:
Bereitstellen eines diagnostischen Reagenz, bestehend aus einem festen Träger und am Träger gebunden, multiplen Polymeren, wobei jedes Polymer dahingehend wirksam ist, mit einer ausgewählten Bindungsaffinität an das einzelsträngige Polynukleotid zu binden, wobei die Polymere nicht-homopolymere Polymermoleküle der Formel:
umfassen, worin:
(a) R&sub1; - Rn aus Purin, purinartigen Heterocyclen, Pyrimidin und pyrimidinartigen Heterocyclen gewählte Erkennungsteile sind, die wirksam sind, durch Watson/Crick- Paarung an entsprechenden, in Reihe angeordneten Basen in der Zielsequenz zu binden;
(b) n dergestalt ist, daß die Gesamtanzahl der Watson/Crick- Wasserstoffbindungen, die zwischen einem Polymermolekül und der Zielsequenz ausgebildet werden, mindestens etwa 15 beträgt;
(c) B - B Grundgerüstteile sind, die vornehmlich mittels chemisch stabilen, im wesentlichen ungeladenen, vornehmlich achiralen Verknüpfungen verbunden sind, ausgewählt aus der aus folgenden bestehenden Gruppe:
worin Y = O oder S ist und
ist; und
(d) die Grundgerüstteile die Erkennungsteile an Positionen tragen, welche die Watson/Crick-Basenpaarung zwischen den Erkennungsteilen und den entsprechenden, in Sequenz angeordneten Basen der Zielsequenz erlauben, und
Mischen des Reagenz und einer Analyt-haltigen Probe unter solchen gewählten Bedingungen, daß eine Sequenz-spezifische Bindung des Analyten an den Reagenzpolymeren verursacht wird,
Bereitstellen eines Reporters, bestehend aus einem oligokationischen Schwanz, der so angepaßt ist, daß er an das geladene Gerüst des Polynukleotid-Analyten unter vorgewählten Bedingungen bindet, bei denen der Schwanz nicht an den weniger dicht geladenen oder ungeladenen Gerüst solcher Polymeren bindet, und, gebunden an den oligokationischen Schwanz, einer oder mehreren Reportergruppen, die so gewählt sind, daß sie ein Signal erzeugen, durch das die Anwesenheit des Reporters bestimmt werden kann,
Hinzusetzen des Reporters zu dem Reagenz unter solchen vorgewählten Bedingungen,
Trennen des Reagenz von dem ungebundenen Material vor oder nach dem Hinzusetzen des Reporters, oder beidem, und
Bestimmen des Reportersignals von dem mit dem Analyten assoziierten Reporter.
Die Polymerspezies werden durch sequentielle Kopplung von Untereinheiten synthetisiert, um Polymermoleküle einer ausgewählte Länge und Sequenz zu bilden. Wie in Abschnitt IV beschrieben werden wird, wird die Länge der Zielsequenz und Polymersequenz gewählt, um eine gewünschte Bindungsspezifität zu erreichen. Die Bindungsaffinität des Polymers für das Ziel kann durch mehrere in Abschnitt IV diskutierte Strategien selektiv variiert werden, einschließlich der Wahl von Erkennungsgruppen, welche fähig sind, entweder drei (für größere Bindungsaffinität) oder zwei (für geringere Affinität) Basenpaarungs-Wasserstoffbrücken mit der entsprechenden Zielbase zu bilden. Die resultierende Zusammensetzung enthält Polymerspezies oder Moleküle, die alle im wesentlichen die gleiche Abfolge von Untereinheiten und im wesentlichen die gleiche Abfolge von Verknüpfungstypen zwischen den Untereinheiten aufweisen. In funktioneller Hinsicht besitzen alle der Polymerspezies im wesentlichen die gleiche Bindungsaffinität für das Ziel-Polynukleotid.
Verfahren für den Zusammenbau des Polymers, sobald eine gewünschte Abfolge der Untereinheiten ausgewählt wird, sind in Abschnitt V dargestellt.
Die Polymerzusammensetzung ist einem neuartigen diagnostischen Festphasen-System anwendbar, welches in Abschnitt VI bis VII beschrieben wird. Dieses System beruht auf der Bindung von Analyt-Polynukleotidmolekülen an am Träger gebundenen Polymermolekülen und anschließender elektrostatischer Anlagerung von multiplen polykationischen Reportermolekülen an das Polynukleotid, um ein verstärktes Reportersignal für jedes gebundene Analyt-Molekül zu ergeben.

I. Struktur der Untereinheiten

A. Die Erkennungsgruppe

Der Entwurf der Untereinheiten B-Ri, welche für die Verwendung bei der Bildung der Polymerspezies der Erfindung geeignet sind, beinhaltet eine Anzahl von strukturellen und/oder stereochemischen Kriterien, welche sowohl von den Gerüst- und Erkennungsgruppen als auch von der Verknüpfung zwischen diesen beiden erfüllt werden müssen. Die Anforderung an das Design der Erkennungsgruppe wird zuerst betrachtet.
Die Erkennungsgruppe jeder Untereinheit muß zwei oder drei Wasserstoffbrückenbindungs-Gruppen aufweisen, welche in einer eindeutigen Konfiguration gehalten werden, welche für Wasserstoffbrückenbindungen an zwei oder drei der Watson/Crick-Wasserstoffbrücken-Stellen auf einer bestimmten in der Sequenz eingeordneten Base der genetischen Zielsequenz angepaßt ist. Um unerwünschte Fehlpaarung zwischen der Erkennungsgruppe und ihrer entsprechenden Zielbase unter den Anwendungsbedingungen zu vermeiden, sollte (1) der tautomere Zustand der Erkennungsgruppe relativ stabil sein, und sollte (2) die Erkennungsgruppe eine Struktur aufweisen, welche eine verhältnismäßig rigide Anordnung der Wasserstoffbrückenformenden Gruppen zur Verfügung stellt. Eine derartige Rigidität wird am besten durch eine Ringstruktur gewährleistet, welche die polaren Wasserstoffbrücken-formenden Gruppen entweder als Teil des Ringes oder direkt angeheftet an den Ring aufweist.
Die bevorzugten Strukturen für die Erkennungsgruppe umfassen Purin-, purinartige, Pyrmidin- und pyrimidinartige Strukturen, welche entworfen sind, um über entweder zwei oder drei Wasserstoffbrücken Watson/Crick-Basenpaarung mit ausgewählten Polynukleotid-Basen zu bilden. Die in der Polymer-Synthese verwendete Gruppe von Untereinheiten umfaßt mindestens zwei Erkennungsgruppen, welche für verschiedene Polynukleotid-Basen basenspezifisch sind, und vorzugsweise eine oder mehrere Erkennungsgruppen für jede der vier Basen in einem natürlichen DNA- oder RNA- Polynukleotid. Wie im folgenden ersichtlich, ist es ebenfalls wünschenswert, eine Gruppe von Erkennungsgruppen, Ri, zur Verfügung zu stellen, welche zur Basenpaarung mit Nukleotidbasen über zwei Wasserstoffbrücken fähig sind, und eine zweite Gruppe, Rj, zur Verfügung zu stellen, welche zur Bindung mit denselben Basen über drei Wasserstoffbrücken fähig ist. Figur 1 zeigt exemplarisch Erkennungsgruppen vom Purin- und Pyrimidin-Typ. Die Purin-Strukturen 1 und 2 sind entworfen, um an Thymin- oder Uracil-Basen zu binden, die Strukturen 3 bis 6 an Guanin-Basen; Strukturen 7 bis 9 an Cytosin-Basen, und die Strukturen 10 bis 12 an Adenin-Basen. Die Strukturen 1, 4, 5, 6, 8, und 10 bis 12 sind Gruppen vom Ri-Typ, welche daran angepaßt sind, an entsprechende in der Sequenz eingeordnete Basen über zwei Wasserstoffbrücken zu binden, und die übrigen Strukturen sind Gruppen vom Rj-Typ, welche bei der Basenpaarung drei Wasserstoffbrücken ausformen. Wie im folgenden ersichtlich, sind Purin- und Pyrimidin-Nukleoside bei der Synthetisierung einer Vielzahl anderer Untereinheiten nutzvoll, welche für die Verwendung bei der Polymersynthese geeignet sind. Diese Untereinheiten, falls nötig mit Amin-Schutzgruppen modifiziert, können über den Handel erhalten werden oder gemäß bekannten Verfahren hergestellt werden, wie etwa denjenigen, welche in Beispiel 1 beschrieben oder zitiert sind.
Eine Anzahl von purinartigen oder pyrimidinartigen Strukturen, in denen die Erkennungsgruppe über ein Ring-Kohlenstoffatom an das Gerüst geknüpft ist, wird in Figur 2 gezeigt. Diese Strukturen besitzen Basenpaarungs-Spezifitäten und Wasserstoffbrückenbindungs-Eigenschaften ähnlich denjenigen der in Figur 1 gezeigten analogen Strukturen. Obwohl die Bindungseigenschaften eines Polymeres mit einer über Kohlenstoff verknüpften Erkennungsgruppe nicht signifikant unterschiedlich von denjenigen eines Polymeres, dessen Erkennungsgruppen über Stickstoff verknüpft sind, wie in Figur 1, sein müssen, erfordern Untereinheiten, welche die über Kohlenstoff verknüpften Gruppen beinhalten, im allgemeinen einen größeren Syntheseaufwand, als Untereinheiten, welche vorgeformte Purine und Pyrimidine enthalten. Gleichwohl stellen die über Kohlenstoff verknüpften Erkennungsgruppen für manche Untereinheit- Synthesen, wie etwa der Synthese der achiralen, acyclischen Gerüstuntereinheiten, beschrieben in Beispiel 10, ein nützliches Ausgangsmaterial zur Verfügung.

B. Das Grundgerüstteil

Das Grundgerüstteil bzw. die Grundgerüstgruppe jeder Untereinheit besitzt die allgemeine Form N&sub1;---E oder N&sub1;---N&sub2;, worin N&sub1; und N&sub2; nukleophile Gruppen sind und E eine elektrophile Gruppe ist. Ausgehend von der Einfachkeit der Kopplung der Untereinheiten und der erforderlichen Stabilität der resultierenden Verknüpfung zwischen den Untereinheiten, wie im folgenden diskutiert, sind die bevorzugten nukleophilen Gruppen Amino-, Hydroxy- und Hydrazin-Gruppe; und die bevorzugten elektrophilen Gruppen, und/oder elektrophilen Verknüpfungsmittel sind Derivate von Carbon-, Thiocarbon-, Carboxyl- und Sulfonsäuren.
Grundgerüstteile können entweder eine cyclische oder eine acyclische Struktur aufweisen. Obwohl die Gesamtanzahl von möglichen Grundgerüstteil-Strukturen sehr groß ist, ist nichtsdestotrotz aufgrund einer Anzahl von Faktoren nur eine ziemlich begrenzte Anzahl von Strukturen von tatsächlichem praktischen Nutzen. Das anfängliche Verfahren, durch welches vielversprechende Grundgerüstteile ausgewählt wurden, war wie folgt beschaffen:
Als erste Bedingung wurden nur diejenigen cyclischen Grundgerüstteile in Betracht gezogen, welche aus Desoxyribose oder Ribose bestanden, oder von diesen leicht abgeleitet werden konnten. Dies ist eine praktische Einschränkung und spiegelt die Schwierigkeit und den entsprechend größeren Aufwand einer de novo-Synthese von Ringstrukturen mit multiplen chiralen Zentren wider. Im allgemeinen wurden prospektive Grundgerüstteile und Verknüpfungen zwischen den Untereinheiten, von denen erwartet wurde, daß sie für die Polymere geeignet waren, auf der Grundlage eines oder mehrerer der folgenden Faktoren ausgewählt: leichte Durchführbarkeit der Synthese, beruhend auf bekannten Reaktionen; erwartete Einfachheit der Synthese aus verfügbaren Ausgangsmaterialien; Einfachheit der Struktur; und erwartete Stabilität des letztendlichen Grundgerüstes.
Das anfängliche Screening versprechender Grundgerüstteile und Verknüpfungen zwischen Untereinheiten wurde wie folgt durchgeführt. Raumerfüllende CPK- Molekularmodelle von doppelsträngiger DNA und RNA wurden gemäß Parametern konstruiert, welche durch Röntgenbeugung von Oligodesoxyribonukleotiden in der B-Form und Oligonukleotiden in der A-Form bestimmt wurden. In jedem dieser konstruierten Doppelstränge wurde eines der zwei Zucker-Phosphat-Gerüste entfernt. Als nächstes wurde jedes prospektive Grundgerüst, wenn möglich, an die Stellen auf den Basen angefügt, von welchen das ursprüngliche Zucker-Phosphat-Grundgerüst entfernt wurde. Jedes resultierende Polynukleotid/Polymer-Duplex wurde dann hinsichtlich Koplanarität der Waston/Crick-Basenpaare, Torsions- und Winkelspannung in dem prospektiven Polymer-Grundgerüst, den auf den Nukleinsäure-Strang ausgeübten Grad der Distorsion, und hinsichtlich Nicht-Bindungs-Wechselwirkungen zwischen den Strängen und innerhalb der Stränge untersucht. Besondere Beachtung wurde darauf verwendet, ob oder ob nicht jedes Amid-enthaltende Grundgerüst leicht eine Konformation einnehmen konnte, worin seine Amid-Gruppen planar waren. Dies ist aufgrund des wesentlichen Energieaufwandes, welcher erforderlich ist, um ein Amid in eine nonplanare Konformation zu zwingen, bedeutsam.
Diese Anfangs-Untersuchungen bestätigten, daß die erforderliche Grundgerüst- Einheiten-Länge (d.h., der N&sub1;---E-Abstand in einer N&sub1;---E- oder aktivierten N&sub1;---N&sub2;-E- Untereinheit) 5 bis 7 Atome für Grundgerüstteile beträgt, welche aus Desoxyribose oder Ribose bestehen oder daraus abgeleitet sind (cyclische Grundgerüst-Strukturen), wobei eine Länge von 6 Atomen optimal ist.
Die in den obigen genannten Modellstudien als annehmbar beurteilten Untereinheit- Strukturen wurden dann hinsichtlich ihrer Einfachheit der Synthese (auf der Grundlage von in der Literatur berichteten Schlüsselsynthesereaktionen, oder Reaktionen, die an Modellverbindungen ausgeführt wurden, und/oder über tatsächliche Synthese der Untereinheiten) und Stabilität des zusammengefügten Polymer-Grundgerüsts (vorläufige Stabilitätsuntersuchungen wurden im allgemeinen mit geeignet verknüpften Modellverbindungen oder Untereinheit-Dimeren ausgeführt) geprüft. Diese Typen von Untersuchungen wurden verwendet, um die Anzahl von möglichen Grundgerüst- Strukturen weiter einzuschränken. Aus dieser eingeschränkten Kandidaten-Menge wurden die in Figur 3 gezeigten cyclischen Grundgerüst-Strukturen A bis G letztlich als bevorzugte Strukturen ausgewählt.
In dieser Figur umfassen die Untereinheiten A bis D, welche cyclische Grundgerüstteile vom Typus Ni----N&sub2; einschließen:
2'-Desoxyribonukleoside (Struktur A); an den 5'- und 3'-Positionen mit einer Amino- Gruppe substituierte 2'-Desoxyribonukleoside (Strukturen B bzw. C); und Morpholino- Derivate von Ribonukleosiden (Struktur D). Untereinheiten, welche Grundgerüstteile des Typs N&sub1;---E enthalten, umfassen:
an ihren 5'-Positionen mit ein- und zwei-kohlenstoffatomigen Säuren substituierte 2'- Desoxyribonukleoside (Strukturen E bzw. F); und an ihren 5'-Positionen mit Carboxylsäure (Struktur G) oder Sulfonsäure (Struktur H) substituierte N- Aminomorpholino-Derivate von Ribonukleosiden.
Dasselbe Molekularmodell-Vorgehen, angewandt auf acyclische (unverzweigt-kettige) Grundgerüstteile, zeigte daß, Grundgerüsteinheit-Längen im Bereich von 4 bis 6 Atomen hinsichtlich der Polymer-Konformation bei Basenpaar-Wasserstoffbrückenbindungen an ein einzelsträngiges Polynukleotid annehmbar sind, wobei eine Grundgerüstlänge von 5 Atomen optimal ist. Dies steht im Gegensatz zu cyclischen Grundgerüsten, bei denen eine Grundgerüsteinheit-Länge von 6 Atomen optimal ist. Ferner zeigte die Arbeit mit Modellen, daß die ringförmige Erkennungsgruppe nicht direkt an das lineare Grundgerüstteil angeknüpft werden kann, ohne die Koplanarität der komplementären Basen schwer zu behindern und unerwünschte Interaktionen zwischen der Erkennungsgruppe und dem Grundgerüst einzufügen. Die minimale Bindungsspannung trat auf, wenn die Erkennungsgruppe über einen einatomigen Abstandshalter an das Grundgerüstteil verknüpft wurde. Zweiatomige, aber nicht dreiatomige Abstandshalter können toleriert werden, obwohl erhöhte Freiheitsgrade zwischen den Erkennungsgruppen und dem linearen Grundgerüst zu einer Fehlpaarung mit Zielbasen mit zweiatomigen Abstandshaltern führen können.
Die in Figur 4 gezeigten acyclischen Grundgerüstteil-Strukturen I-N, von denen alle einen einatomigen Methylen-Abstandshalter zwischen dem Grundgerüst und den Erkennungsgruppen enthalten, ergaben eine gute Modellvorhersage für günstige Basenpaarung an ein komplementäres Polynukleotid. Analoge Strukturen mit einem zweiatomigen Abstandshalter zeigten eine annehmbare aber weniger günstige Bindungs- Konformation. Die in der Figur gezeigten Strukturen und die analogen Strukturen mit zweiatomigem Abstandshalter sind wegen ihrer allgemeinen Synthese-Einfachkeit bevorzugte acyclische Grundgerüstteile. Es sollte jedoch bemerkt werden, daß eine Anzahl anderer Grundgerüstteile ebenso gänzlich annehmbar und geeignet sind -- obwohl im allgemeinen nicht so leicht und/oder kostengünstig zu synthetisieren.

C. Grundgerüstteil/Erkennungsgruppe-Verknüpfung

Wie obenstehend angedeutet, muß die Verknüpfung oder der Abstandshalter, welcher das Gerüst und die Erkennungsgruppen in der Polymer-Untereinheit verbindet, gewissen Anforderungen an sein Design entsprechen, welche dahingehend wirksam sind, die Erkennungsgruppen für Basenpaarbindung an die Polynukleotid-Basen zu positionieren. Im Falle der in Figur 3 gezeigten, cyclischen Grundgerustteile, zeigen Modellstudien, daß die günstigste Bindungskonformation in dem Polymer auftritt, wenn die Erkennungsgruppe direkt an das 1'-Kohlenstoffatom der Ribose oder der riboseartigen Strukturen und an die analoge 1'-Position der Morpholino-Strukturen verknüpft ist. D.h. die Gruppe ist am normalen Anknüpfungspunkt und mit der normalen stereoisomeren Konfiguration von Purin- oder Pyrimidin-Basen an die Ribose- oder Desoxyribose-Gruppen von Nukleosiden geknüpft. Für die acyclischen Strukturen sind ein- und zweiatomige Abstandshalter zur Plazierung der Erkennungsgruppen an günstigen Bindungs-Positionen erforderlich, wobei einatomige Abstandshalter bevorzugt werden, wie obenstehend diskutiert.
Um eine, für gleichmäßige Bindungsaffinität der Polymermoleküle an ein Polynukleotid- Ziel erforderliche, stereoreguläre Polymer-Konfiguration zu erreichen, ist es ebenfalls notwendig, daß alle Gerüst/Erkennungsgruppen-Verknüpfungen entweder von definierter Chiralität oder achiral sind. Aus Definitionsgründen werden die Verknüpfungen hier als von definierter Chiralität betrachtet, wenn jede der Verknüpfungen in jeder gegebenen Untereinheit-Position in allen der Polymermoleküle die gleiche stereoisomere Konfiguration oder Chiralität aufweist. D.h., daß, obwohl die Untereinheiten in verschiedenen Sequenz-Positionen verschiedene interne stereoisomere Konfigurationen (einschließlich Achiralität an spezifischen Sequenz-Positionen) aufweisen können, alle Verknüpfungen an einer gegebenen Sequenz-Position unter den Polymermolekülen die gleiche stereoisomere Konfiguration besitzen. Gewöhnlich wird definierte Chiralität am leichtesten erreicht, indem die gleiche stereoisomere Konfiguration in allen Untereinheiten verwendet wird.
Für die cyclischen Grundgerüstteile findet die günstigste Bindung in Nukleosid-Analogen statt, welche die in Figur 3 gezeigte natürliche D-stereoisomere Konfiguration besitzen. Untereinheiten von diesem Typ werden auch unter Verwendung von natürlichen D- Nukleosid-Ausgangsmaterial leicht synthetisiert, wie im folgenden erörtert wird. Unter Bezugnahme auf Figur 4 ist ersichtlich, daß nur die Strukturen I und L chirale Verknüpfungen zwischen dem Grundgerüst und den Erkennungsgruppen aufweisen. Diese Untereinheiten werden durch Verwendung von homochiralem Ausgangsmaterial leicht in homochiraler Form synthetisiert, wie beschrieben werden wird. Für alle anderen in Figur 4 gezeigten acyclischen Strukturen sind die einatomigen Verknüpfungen an Stickstoffatomen des Grundgerüsts verbunden, und deshalb achiral. Natürlich sind auch die Methylen-Abstandshalter selbst achiral.

II. Schutzgruppen-Strategien

Aufgrund der ziemlich hohen Reaktivität der zur Aktivierung und/oder Kopplung der Untereinheiten verwendeten Verbindungen ist es im allgemeinen erwünscht und oft notwendig, die exocyclischen Ring-Stickstoffatome der Erkennungsgruppen zu schützen. Die Auswahl dieser Schutzgruppen wird vor allem vom Verknüpfungstyp zwischen den Untereinheiten, welcher in dem aus diesen Untereinheiten zusammengebauten Polymer verwendet werden soll, festgelegt, und in zweiter Linie durch die relative Reaktivität des zu schützenden Stickstoffatomes bestimmt.
An den Basen geschützte Nukleosiden sind ebenfalls in einer Anzahl der im folgenden beschriebenen Untereinheit-Synthesereaktionen nutzvolle Ausgangsreagenzien. Verfahren zum Schutz der Basen einer Reihe der gewöhnlicheren Ribo- und Desoxynukleoside aus Beispiel 1 werden in Beispiel 2 veranschaulicht. Die in dem Beispiel detailliert beschriebenen Verfahren sind im allgemeinen zur Bildung von Nukleosiden mit Amin-Schutzgruppen anwendbar.
Wenn die zu verwendende Verknüpfung zwischen den Untereinheiten relativ stabil gegenüber Nukleophilen, und insbesondere gegen Ammoniumhydroxid ist, sind die Standard-Basen-Schutzgruppen, die in der Nukleinsäure-Chemie verwendet werden, geeignet. Solche gegen Nukleophile insensitive Verknüpfungen zwischen den Untereinheiten umfassen Carbamat-, Amid- und Sulfonamid-Verknüpfungen. Die entsprechenden gegen Nukleophile sensitiven Schutzgruppen für die Erkennungsgruppen umfassen: Benzoyl für das N4 von C; Benzoyl oder p-Nitrobenzoyl für das N6 von A; Acetyl oder Isobutyryl für das N2 von G; und N2, N6-Bisisobutyryl für 2,6- Diaminopurin-Reste. Die Entfernung dieser Gruppen nach Vervollständigung des Polymerzusammenbaues wird durch Behandlung mit Ammoniumhydroxid bewirkt.
Im Gegensatz dazu sind, wenn die zu verwendende Verknüpfung zwischen den Untereinheiten sensitiv gegen Nukleophile wie etwa Ammoniumhydroxid ist, geeignete Schutzgrüppen solche, die durch starke nicht-nukleophile Basen entfernt werden können -- über einen β-Eliminationsmechanismus. Solche nukleophil-sensitive Verknüpfungen zwischen den Untereinheiten umfassen: Carbonat-; Ester-; und in einem geringeren Ausmaß, Thiocarbamat-Verknüpfungen. Geeignete, über die β-Elimination entfernbare Schutzgruppen für die Erkennungsgruppen schließen folgende ein: 2-(4- Nitrophenyl)ethoxycarbonyl oder 2-(Phenylsulfonyl)ethoxycarbonyl für sowohl das N4 von C als auch das N6 von A; und 9-Fluorenylmethoxycarbonyl für das N2 von G und das N2 und N6 von 2,6-Diaminopurin-Resten. Die Entfernung dieser Gruppen nach Vervollständigung des Polymerzusammenbaus wird durch Behandlung mit der starken nicht-nukleophilen Base 1,8-Diazabicyclo[5.4.0]undec-7-en (DBU) unter strikt wasserfreien Bedingungen bewirkt.
Im Hinblick auf zeitweiligen Schutz eines Nukleophiles der Grundgerüstgruppe (im allgemeinen N1 in den oben genannten Strukturen) verwendet die Polymerzusammenbau-Strategie im allgemeinen ausgewählte Schutzgruppen für das Grundgerüst, welche leicht durch milde Säure entfernt werden. Ein hauptsächliches Kriterium für die Wahl von Schutzgruppen besteht darin, daß diese angemessen stabil, aber nicht so stabil sind, daß die für ihre Entfernung benötigten Bedingungen das wachsende Polymer beschädigen würden. Ein grundlegendes Problem im Falle von aus cyclischen Grundgerüstteilen zusammengebauten Polymeren ist die besondere Säureempfindlichkeit der glycosidischen Bindung, welche geschützte Purin-Reste an das C1 ihrer Grundgerüstteile verknüpft. Ein zweites Kriterium für die Auswahl der Grundgerüst-Schutzgruppe ist, daß sie leicht einführbar sein sollte. Ausgehend von dem oben genannten, werden die folgenden Grundgerüst-Schutzgruppen bevorzugt: für primäre Hydroxyle, die Di(p-methoxy)trityl-Gruppe; für primäre Amine, p-Methoxytrityl; und für ein sekundäres Amin (wie in Grundgerüstteilen vom Morpholino-Typ), die Phenylisopropoxycarbonyl-Gruppe. Diese Schutzgruppen können leicht durch Behandlung mit 0,2 M Dichloressigsäure in Dichlormethan entfernt werden.

III. Untereinheit-Synthese

A. Cyclische Grundgerüstteile

Untereinheiten mit einer Desoxydesoxynukleosid-Untereinheitstruktur (Struktur A in Figur 3) können über den Handel erhalten oder über Verfahren in der Literatur wie in Beispiel I beschrieben hergestellt werden. Die Untereinheiten umfassen die folgenden Riboside und Desoxyriboside, welche nach den in Figur 1 angegebenen Strukturnummern der Erkennungsgruppen identifiziert werden: Adenosin und Desoxyadenosin (Struktur 1); 2,6-Diaminopurinribosid und -desoxyribosid (Struktur 2); Cytidin und Desoxycytidin (Struktur 3); 4-Methoxy-2-pyrimidinondesoxyribosid (Struktur 4); 2-Hydroxy-5-methylpyrimidindesoxyribosid (Struktur 5); 2- Hydroxypyrimidinribosid (Struktur 6); Guanosin und Desoxyguanosin (Struktur 7); Inosin und Desoxyinosin (Struktur 8); Thioguanosin und Desoxythioguanosin (Struktur 9); Uridin und Desoxyuridin (Struktur 10); Thymidin und 5-Methyluridin (Struktur 11); und 5-Halogenuridine und 5-Halogendesoxyuridine (Struktur 12).
Die 5'-Amino-2',5'-didesoxyribonukleoside (Struktur B in Figur 3) werden gemäß Verfahren, die in Beispiel detailliert geschildert sind, hergestellt. Kurz gesagt, werden die ausgewählten Desoxyribonukleoside, falls nötig an den Basen geschützt, mit Triphenylphosphin, Tetrabromkohlenstoff und Lithiumazid zur Reaktion gebracht, um das entsprechende 5'-Azidonukleosid zu bilden, welches danach durch Hydrierung in der Gegenwart eines Palladium/Aktivkohle-Katalysators reduziert wird. Die Nukleoside können wie in Beispiel 1 erhalten werden, und wie in Beispiel 2 an den Basen geschützt werden. Die Stereochemie der Reaktanten-Nukleoside wird bei der Bildung der 5'- Aminonukleosid-Analogen beibehalten.
Ein alternatives Reduktionsverfahren wird bei der Reduktion der Azid-Gruppe von 5'- Azido-5-bromuridin angewandt, wie in Beispiel 3.2 beschrieben. Hier wird nicht katalysierte Hydrierung benötigt, um Entfernung des Ring-Bromatomes zu verhindern. Bei der Bildung der 5'-Aminoguanosin-Verbindung wird das Azid zuerst durch Tosylieren der 5'-Hydroxyl-Gruppe und danach Verdrängung mit Azid, wie in Beispiel 3.2 detailliert ausgeführt, an die 5'-Position gebracht.
Die 3'-Amino-2',3'-didesoxyribonukleoside (Struktur C in Figur 3) werden gemäß in Beispiel 4 ausgeführten Verfahren hergestellt. Kurz gesagt, wird Thymidin, welches an seinem 5'-Hydroxyl geschützt ist, an seinem 3'-Hydroxyl tosyliert, und danach folgt eine intramolekulare Verdrängung unter Beteiligung des 2-Oxy-Basen-Substituenten. Der resultierende Ring wird nun durch Behandlung mit Azid geöffnet, was ein 3'-Azido- Analog der korrekten stereoisomeren Form ergibt. Dieses Analog kann in ein ausgewähltes Basenanalogon umgesetzt werden, indem die Azid-Verbindung mit einer ausgewählten Purin- oder Pyrimidin-Base zur Reaktion gebracht wird. Selbiges kann, falls erforderlich, für anschließende Untereinheit-Kopplungsreaktionen, wie im folgenden beschrieben, an den Basen geschützt werden. Das Thymidin- oder ein anderes Azid- Analog wird dann reduziert, um das gewünschte 3'-Aminnukleosid herzustellen. Die Stereochemie des Thymidin-Ausgangsmaterials bleibt bei der Synthese erhalten.
Die Synthese der Untereinheit-Derivate vom Morpholino-Typ, die durch Struktur D in Figur 3 dargestellt sind, wird für eine Reihe verschiedener Erkennungsgruppen in Beispiel 5 aufgeführt. Kurz gesagt, wird ein ausgewähltes Nukleosid, falls erforderlich basengeschützt, in einem Ammoniumsalz wie etwa Ammoniumbiborat gelöst, und danach mit Natriumperjodat zur Reaktion gebracht, um transiente 2',3'-Dialdehyde zu bilden, welche sich danach an ein Ammonium-Ion anlagern, um den Morpholino-Ring zu bilden, der 2'- und 4'-Hydroxyl-Gruppen aufweist. Die Verbindung wird dann mit Natriumcyanoborhydrid behandelt, um die Ring-Hydroxyl-Gruppen zu entfernen. Das Ring-Stickstoffatom wird bevorzugt als ein 2-Phenylisopropylcarbamat für die anschließende Untereinheit-Kopplung geschützt. Die Stereochemie des Nukleosid- Ausgangsmateriales wird beibehalten.
Desoxyribose-Untereinheitstrukturen mit einer 5'-Essigsäure-Gruppe (Struktur F in Figur 3) können gemäß dem allgemeinen Syntheseschema, das in Beispiel 6 beschrieben ist, hergestellt werden, welches die Synthese der 5'-Essigsäure-Verbindungen, welche durch die Struktur F repräsentiert werden, ausführt. Hierin wird ein ausgewähltes Desoxyribonukleosid, das an der 3'-Hydroxyl-Gruppe geschützt ist, in das 5'-Aldehyd umgesetzt und anschließend mit einem 2-Kohlenstoff-Wittig-Reagenz behandelt, um das ungesättigte Essigsäure-Derivat zu erhalten. Reduktion des Seitenketten-Olefins ergibt die gewünschte 5'-Essigsäure-Verbindung. Die Reaktion erhält die Stereochemie des Ausgangs-Nukleosid-Materials.
Die analoge 5'-Formiat-Verbindung (Struktur E in Figur 3) wird durch Behandeln des oben genannten 5-Nukleosidaldehydes mit einem Ein-Kohlenstoff-Wittig-Reagenz und Hydrolysieren des resultierenden Enols gebildet, um das entsprechende Formaldehyd- Derivat zu bilden, welches zu der gewünschten Säure oxidiert wird. Die Reaktion erhält die Stereochemie des Ausgangs-Nukleosid-Materials.

B. Synthese der acyclischen Untereinheit-Grundgerüste

Die durch Struktur I in Figur 4 repräsentierte Aminosäure-Untereinheit mit 5-atomiger Kettenlänge wird gemäß den in Beispiel 7 bis 9 geschilderten allgemeinen Verfahren hergestellt. Kurz gesagt, wurde ein (S)-5-Carboxypyrrolidon mittels bekannter Verfahren in das entsprechende stereochemisch reine (S)-5-Tosylmethyl-2-pyrrolidon umgesetzt und danach mit einem ausgewählten Purin oder Pyrimidin zur Reaktion gebracht, um das entsprechende (S)-5-Methylpurin- oder Pyrimidinpyrrolidon zu bilden. Die Austauschreaktion erhält die ursprüngliche Stereospezifität, so daß die Untereinheiten, welche gebildet werden, an der Anknüpfungsstelle der Erkennungsgruppe an das Grundgerüst- Kohlenstoffatom homoisomer sind.
Das in der Synthese der Untereinheiten verwendete Purin enthält bevorzugt eine elektronenanziehende Gruppe an der 6-Position, um die Reaktivität der 1- und 3-Ring- Stickstoffatome zu reduzieren, d.h., Pyrrolidon-Kopplung an ein Ring-Stickstoffatom zu minimieren. Vor dem Ringöffnungsschritt, welcher im folgenden beschrieben wird, kann das mit Pyrrolidon derivatisierte Purin oder Pyrimidin dann in das Amin-Derivat umgesetzt werden, und an den Basen geschützt werden, falls erforderlich. Beispiel 7.1 und 7.2 erläutern detailliert Verfahren zur Bildung des Cytosinpyrrolidons und seinem basen-geschützten Derivat. Das in den Beispielen 7.3 bis 7.5 gebildete Adenosinpyrrolidon benutzt 6-Chlorpurin als Ausgangsmaterial, und das entsprechende Pyrrolidon wird durch Azid-Bildung wie beschrieben in das Adenosin-Derivat umgesetzt. Das Adenosin wird vor Ringöffnung, wie in Beispiel 7.6 basen-geschützt. Ein ähnliches Vorgehen wird angewandt, um ausgehend von 2-Amino-6-chlorpurin basen-geschütztes Guaninpyrrolidon zu erzeugen, wie in Beispielen 7.7 bis 7.9 beschrieben. Ähnliche Verfahren werden angewandt beim Synthetisieren von 2,6-Diaminopurinpyrrolidon, Inosinpyrrolidon und 2-Hydroxypyrimidinpyrrolidon, was ebenfalls in Beispiel 7 ausgeführt wird.
Das Pyrrolidon wird dann über eine Reihe von Reaktionen, welche den Pyrrolidon-Ring aufschneiden, behandelt, um eine Aminosäure mit einem t-BOC-geschützten Amin zu bilden. Die Beispiele 8.1 bis 8.4 beschreiben die Synthese von solchen t-BOC- Aminosäuren, welche eine aus einer Anzahl von ausgewählten Erkennungsgruppen besitzen. In einem letzten Schritt (Beispiel 5) können die t-BOC-Schutzgruppen entfernt werden, um die entsprechende, durch Struktur I in Figur 4 dargestellte, Aminosäure zu bilden. Die Aminosäure kann gemäß dem im folgenden angegebenen Reaktionen direkt zur Untereinheit-Kopplung verwendet werden. Alternativ dazu kann die t-BOC- geschützte Verbindung an ihrer Säure-Gruppe zur Verwendung in Untereinheit- Kopplungsreaktionen aktiviert werden.
Die Strategie zur Bildung der von Struktur J in Figur 4 repräsentierten Untereinheit wird für die Bildung der Cytidin- bzw. Uridin-analogen Untereinheiten in Beispiel 10.1 und 10.2 dargestellt. Kurz gesagt, wird bei der Bildung einer Untereinheit vom Pyrimidin- Typ ein 6-gliedriger Heterocyclus wie etwa ein Pyrimidin oder Nicotinat modifiziert, um eine reaktives Methylen an der Kohlenstoff-Ringposition zu enthalten, an welcher die Anknüpfung an das Grundgerüst gewünscht wird. Wie in Beispiel 10.1 ausgeführt, wird das Cytosin-Analog durch Reaktion von 5-Amino-5-bromopyrimidin gebildet, um das entsprechende Carboxaldehyd an der 5-Position auszubilden. In Beispiel 12 wird das Uridin-Analog durch Umsetzen von 6-Hydroxynicotinestern in die entsprechenden Benzylalkohole gebildet. Diese Verbindung wird durch Reaktion in Gegenwart von Mangandioxid in das Aldehyd umgesetzt.
Die Aldehyd-Verbindung wird dann mit gewünschten Aminosäuren, wie etwa 4- Aminobuttersäure, zur Reaktion gebracht, wobei die Reaktion an der Amino-Gruppe ein instabiles Imin erzeugt, welches reduziert wird, um die stabile Amin-Untereinheit zu bilden. Das sekundäre Amin kann für Untereinheit-Kopplung, welche Aktivierung der Säure-Gruppe beinhaltet, durch eine t-BOC-Gruppe geschützt werden, wie in Beispiel 10.1 beschrieben. Die Basenanknüpfung an das Grundgerüst an einem Grundgerüst- Stickstoffatom, über einen Methylen-Abstandshalter bzw. Spacer, stellt sicher, daß den Untereinheiten chirale Zentren fehlen, und sie somit nicht stereoregular sein können.
Um die unter K in Figur 4 gezeigten Untereinheit-Strukturen zu bilden, wird das C- Kohlenstoff-Grundgerüstanalog der obenstehenden Verbindung unter Verwendung von 3-Aminopropionsäure hergestellt, und diese Verbindung wird mit Distickstoffoxid weiterbehandelt, um die entsprechende N-Nitrosoverbindung zu bilden, welche anschließend mit H&sub2;IPd in Gegenwart von Eisensalzen reduziert wird, um die Hydrazin- Säure-Untereinheit zu ergeben.

III. Grundgerüst-Kopplungsreaktionen

Die bei der Bildung der Polymermoleküle der Erfindung verwendeten Kopplungsreaktionen sind stufenweise Reaktionen, welche eine ausgewählte Untereinheit oder Untereinheit-Sequenz an eine andere ausgewählte Untereinheit oder Untereinheit- Sequenz verknüpfen. Für die Zwecke der vorliegenden Erörterung werden die Kopplungsreaktionen im allgemeinen im Hinblick auf Koppeln einer Einzel-Untereinheit B-R&sub1; mit einer ausgewählten Erkennungsgruppe R&sub1; an eine andere Einzel-Untereinheit B-R&sub2; mit derselben oder einer anderen ausgewählten Erkennungsgruppe R&sub2;, um ein Dimer der Form
zu bilden, beschrieben, worin R&sub1; und R&sub2; die gezeigte spezifische Sequenz besitzen.

A. Untereinheit-Kopplung: N&sub1;----N&sub2;-Grundgerüst-Konfigurationen

Allgemeine Verfahren zur Kopplung von Untereinheiten mit einer N&sub1;--------N&sub2;- Grundgerüst-Konfiguration sind in den Figuren 5A und 5B veranschaulicht. Wie in dem obenstehendem Abschnitt I nachzulesen, sind N&sub1; und N&sub2; nukleophile Grundgerüstgrüppen wie etwa Hydroxyl- und Amin-Gruppen, welche mit einem Elektrophil E aktiviert werden können, um eine aktiviertes Grundgerüstteil N&sub1;-E oder N&sub2;-E zu bilden, welches dann mit einem zweiten N&sub1;----N&sub2;-Typ-Grundgerüstteil reagieren kann, um ein verknüpftes N&sub1;----N&sub2;-E-N&sub1;----N&sub2;-Grundgerüst-Dimer zu bilden. Die Untereinheit-Grundgerüste dieser Typen, welche obenstehend im genauen beschrieben worden sind, sind die cyclischen Grundgerüst-Strukturen A-D in Figur 3. In den Strukturen A und B ist das aktivierte N&sub2;-Nukleophil die 3'-Hydroxyl-Gruppe, in Struktur C das 5'-Hydroxyl und in Struktur D das 6'-Position-Hydroxyl, entsprechend zu der 5'-Position-Hydroxyl-Gruppe in Struktur C.
In einem bevorzugten Köpplungsverfahren, das in Figur 5A veranschaulicht ist, wird eine Untereinheit mit einer ausgewählten Erkennungsgruppe R&sub1; mit einem Elektrophil E aktiviert. Der Stern an der Erkennungsgruppe steht für irgendeine, erforderliche Basen- Schützung. Wie in der Figur zu sehen ist, wird die ausgewählte Untereinheit an ihrem N&sub1;-Nukleophil geschützt, um sicherzustellen, daß (a) nur das N&sub2;-Nukleophil aktiviert wird und (b) die aktivierte Untereinheit nicht mit sich selbst polymerisieren kann. In den Strukturen A, C und D in Figur 3, worin die Grundgerüst-Schutzgruppe am 5'-Hydroxyl ist, ist die Schutzgruppe vorzugsweise eine säurelabile Gruppe wie etwa Dimethoxytrityl (DMTO).
Das in Figur 5A gezeigte Aktivierungsreagenz besitzt die allgemeine Formel:
worin
X Sauerstoff oder Schwefel ist, und C ein aktives Elektrophil ist, das fähig ist, mit einem Nukleophil, wie etwa einem Hydroxyl-Sauerstoff oder Amin-Stickstoff, unter Verdrängung von Y zu reagieren, um die aktivierte Untereinheit zu bilden.
Aktivierungsmittel wie etwa Bis-p-nitrophenylcarbonat, welche die Carbonyl-aktivierte Untereinheit (X=O) ergeben, werden bei der Bildung von Carbonat- und Carbamat- Untereinheitverknüpfungen eingesetzt. In ähnlicher Weise werden Aktivierungsmittel wie etwa Thiocarbonyl-di-(1,2,4-triazol) (X=S) bei der Bildung von Thiocarbamat- Verknüpfungen eingesetzt.
Untereinheit-Aktivationsreaktionen, welche Carbonyl-aktivierte Untereinheiten beinhalten, sind in Beispiel 11 aufgeführt für die 5'-geschützten 2'-Desoxynukleoside, die unter A in Figur 4 dargestellt sind; in Beispiel 12 für die unter B in Figur 4 dargestellten 5'-geschützten Aminonukleoside; und in Beispiel 13 für die unter D in Figur 4 dargestellten N-geschützten Untereinheiten vom Morpholino-Typ. Die zur Aktivierung der Hydroxyl-Gruppen in diesen Strukturen verwendeten allgemeinen Reaktionsbedingungen sind allgemein anwendbar; Untereinheit-Aktivierungsreaktionen, die Thiocarbonyl-aktivierte Untereinheiten beinhalten, sind in Beispiel 14 für die unter B dargestellten 5'-Amino-Nukleoside ausgeführt; und in Beispiel 15 für die unter D in Figur 3 gezeigten Untereinheiten vom Morpholino-Typ.
Folgend der Aktivierungsreaktion wird der aktivierte Komplex durch herkömmliche Verfahren wie etwa Siliciumdioxid- bzw. Silicagel-Chromatographie gereinigt, und dann mit einer zweiten Untereinheit zur Reaktion gebracht, deren ausgewählte Erkennungsgruppe R&sub2; die nächste in Reihe angeordnete Erkennungsgruppe in dem vervollständigtem Polymer bilden wird. Die Kopplungsreaktion wird bevorzugt unter schonenden Bedingungen ausgeführt, bei denen die aktivierte Gruppe mit N&sub2;-Amin- Gruppen des Grundgerüsts reagieren kann, aber nicht mit N&sub1;-Hydroxyl-Gruppen. Deshalb ist das Verfahren geeignet zur Kopplung von Untereinheiten des durch die Strukturen B-D in Figur 4 dargestellten Typs, aber nicht für die Untereinheitstruktur A. Ein Vorteil dieses Kopplungsverfahrens ist, daß die zweite Untereinheit -- welche ein Amin-N&sub1;-Nukleophil und ein Hydroxyl-N&sub2;-Nukleophil enthält -- nur über das N&sub1;-Amin an die erste aktivierte Untereinheit gekoppelt wird, so daß es nicht notwendig ist, die N&sub2;-Grundgerüstgruppe zu schützen. Die resultierenden Dimer-Untereinheiten werden deshalb durch eine N&sub2;-E-N&sub1;-Verknüpfung gekoppelt, wie in der Figur angezeigt.
Das Oligomer kann durch Wiederholen der oben genannten Schritte des (a) Aktivierens des freien N&sub2;-Nukleophiles in der zweiten Untereinheit, Abtrennens der aktivierten Spezies von dem Aktivierungsmittel, und Koppelns der aktivierten Verbindung mit der nächsten in Reihe angeordneten Untereinheit, deren Grundgerust ungeschützt ist, erweitert werden. Dieses Verfahren wird insbesondere bei der Bildung kurzer Oligomer- Blöcke durch Verfahren in Lösung angewandt, welche im folgenden beschrieben werden und welche für Block-Zusammenbau auf Festphase geeignet sind.
Für Bildung eines Polymers durch sequentielle Festphasen-Anfügung von Untereinheiten wird die in Figur 5B geschilderte Kopplungsmethode sehr bevorzugt. Das zweite Verfahren unterscheidet sich von dem ersten Verfahren dadurch, daß das Polymerwachstum durch Zugabe eines Überschusses von aktivierter Untereinheit zu einer existierenden Untereinheit oder Polymerkette bewirkt wird, anstatt wie in dem ersten Verfahren durch Zugabe einer unaktivierten Untereinheit zu einer aktivierten Kette. In Figur 5B wird die existierende Untereinheit oder Untereinheit-Kette durch eine Untereinheit gezeigt, deren Erkennungsgruppe R&sub1; ist (zweite Zeile in Figur 5 B). Diese Untereinheit besitzt ein freies N&sub1;-Grundgerüst-Nukleophil und ein N&sub2;-Nukleophil, welches durch eine vorzugsweise säurestabile Verknüpfung an einen festen Träger oder dadurch, daß es an eine Kette von Untereinheiten verknüpft ist, welche an einen festen Träger geknüpft sind, geschützt ist. Verfahren zur Bildung von cyclischen Grundgerüst- Untereinheiten, welche in dieser Weise N&sub2;-geschützt sind, sind allgemein in den Beispielen 12 bis 15 beschrieben. Die erste Untereinheit (die zuletzt in einem wachsenden Polymer angefügte Untereinheit) wird nun mit einer aktivierten Untereinheit zur Reaktion gebracht, welche dadurch die nächste in der Sequenz angeordnete Untereinheit in dem Polymer wird. Diese aktivierte Untereinheit, welche an ihrer N&sub2;-Gerüststelle aktiviert ist und an ihrer N&sub1;-Stelle, vorzugsweise durch eine säurelabile Schutzgruppe, geschützt ist, wird durch die obenstehend unter Bezugnahme auf Figur 6 beschriebenen Verfahren hergestellt.
Wie in Figur 5B ersichtlich, fügt die Kopplungsreaktion die N&sub2;-aktivierte zweite Untereinheit an die N&sub1;-geschützte erste Untereinheit an, um diese beiden durch eine N&sub2;-E-N&sub1;-Bindung zu koppeln, und eine Verbindung zu bilden, welche an beiden freien nukleophilen Stellen des Grundgerüsts geschützt ist. Diese Verbindung wird nun, z.B. durch die Reaktion mit Säure, behandelt, um die säurelabile N&sub1;-Schutzgruppe an der zuletzt angefügten Untereinheit zu entschützen, und das Verfahren wird wiederholt, um ein gewünschtes Sequenz-Polymer aufzubauen.
Es kann aus dem Obengenannten abgeleitet werden, daß die N&sub2;-aktivierte Untereinheit, welche die letzte in der Sequenz angeordnete Untereinheit bilden wird, an ihrer N&sub1;- Grundgerüststelle geschützt werden muß, um die selektive Aktivierung an der N&sub2;-Stelle zu erlauben und Selbst-Polymerisierung der aktivierten Verbindung zu verhindern. Ebenso sollte die N&sub1;-entschützte Untereinheit, welche an die aktivierte Untereinheit gekoppelt werden soll, an ihrer N&sub2;-Stelle geschützt werden, um selektive Reaktion ihrer N&sub1;-Gruppe mit der N&sub2;-aktivierten Untereinheit zu ermöglichen.
Zumal die reagierenden Untereinheiten beide an einer Grundgerüst-Stelle geschützt sind, ist das Verfahren deshalb sowohl für die Kopplung von Nukleosiden (Struktur A in Figur 4) als auch von Untereinheiten, deren cyclische Grundgerüste sowohl Amin- als auch Hydroxyl-Grundgerüst-Nukleophile enthalten, wie etwa Strukturen B-D in dieser Figur, geeignet. Die bei der Kopplung von Struktur A-Untereinheiten über eine Carbonat- Bindung verwendeten Reaktionsverfahren sind in Beispiel 12 ausgeführt. Kurz gesagt wird, eine Untereinheit mit einem 5'-geschützten Grundgerüstteil an ihrem 3'-Hydroxyl aktiviert und mit einer anderen Untereinheit (oder wachsenden Kette), welche an ihrem 3'-Hydroxyl geschützt ist, zur Reaktion gebracht. Die Kopplungsreaktion wird in der Gegenwart eines Katalysators wie etwa N-Methylimidazol oder N,N- Dimethylaminopyridin durchgeführt, was zur Bildung der Carbonat-Bindung notwendig ist. Für die Kopplung von Untereinheiten, die cyclische Grundgerüste der Strukturen B-D enthalten, wobei Carbamat- oder Thiocarbamat-Verknüpfungen zwischen den Untereinheiten gebildet werden, sind viel schonendere unkatalysierte Kopplungs- Bedingungen als die im Hinblick auf die erste, obenstehende Methode beschriebenen geeignet.
Der Vorteil dieses zweiten Kopplungsverfahrens zur Bildung eines Polymeres durch Festphasen-Addition von Untereinheiten liegt darin, daß ein wesentlicher molarer Überschuß der aktivierten Untereinheit zu dem wachsenden träger-gebundenenen Polymer bei jedem Polymer-Additionsschritt zugefügt werden kann, um Untereinheiten- Kopplung an einen sehr hohen Prozentsatz der träger-gebundenen Polymere zu erreichen. Dies gewährleistet, daß ein großer Prozentsatz der träger-gebundenen Polymere die vollständige gewünschte Abfolge von Untereinheiten enthalten wird. Im Gegensatz dazu ist in dem ersten Verfahren, worin das wachsende Polymer an seiner letzt-zugefügten Untereinheit aktiviert wird, die Effizienz der Untereinheit-Addition durch die Effizienz der Aktivierungsschritte begrenzt.
Figur 6 zeigt die durch Kopplung der unter A-A bis D-D in Figur 4 angezeigten cyclischen Grundgerüst-Untereinheiten hergestellten dimeren Strukturen. Die Nukleosid- Untereinheiten in Struktur A der Figur werden durch ein Carbonat verknüpft (Y=O). In den restlichen drei Strukturen B-D werden die Untereinheiten durch Carbamat- (Y=O) oder Thiocarbamat- (Y=S)-Verknüpfungen verbunden. Wie aus der Figur ersichtlich, sind alle Untereinheit Verknüpfungen ungeladen und achiral, d.h. sie enthalten keine chiralen Zentren. Darüber hinaus sind die Verknüpfungen in wäßrigem Medium stabil, wie durch die Fähigkeit der Polymere der Hydrolyse über eine längere Zeitdauer in neutraler wäßriger Lösung zu widerstehen, beurteilt wurde.
Gemäß einem anderen wichtigen Merkmal der Erfindung zeigen die Strukturen, wenn verknüpft, um Polymere zu bilden, annehmbare Watson/Crick-Basenpaarung mit komplementären Polynukleotiden.
Gemäß einem weiteren wichtigen Merkmal der Erfindung schließlich sind die aus den Untereinheiten gebildeten Polymere stereoregulär. Dies wird in den gezeigten Strukturen erreicht durch (a) Verwendung natürlicher Nukleoside oder Nukleosid-Derivate oder synthetischer Nukleoside, welche als Untereinheiten die natürliche stereoisomere Konfiguration aufweisen, und (b) Verknüpfen der Untereinheiten über achirale Verknüpfungen zwischen den Untereinheiten. Exemplarische Kopplungsverfahren sind in den Beispielen 11 bis 15 aufgeführt.

B. Untereinheit-Kopplung: N&sub1;----E-Grundgerüst-Konfigurationen

Allgemeine Verfahren für die Kopplung von Untereinheiten mit einer N&sub1;-----E- Grundgerüst-Konfiguration sind in Figuren 7A, 7B und 7C dargestellt. Wie im obenstehenden Abschnitt I nachzulesen, ist N&sub1; eine nukleophile Grundgerüstgruppe, wie etwa eine Hydroxyl- oder Amin-Gruppe, und E ist ein Elektrophil, wie etwa eine Carboxyl- oder Sulfonyl-Gruppe, welche, wenn aktiviert, mit einem zweiten N&sub1;-----E- Typ-Grundgerüst reagieren kann, um ein N&sub1;-----E-N&sub1;-----E-Grundgerüst-verknüpftes Dimer zu bilden. Die Untereinheiten-Grundgerüste dieser Typen, welche obenstehend spezifisch beschrieben worden sind, sind die cyclischen Grundgerüst-Strukturen E-H in Figur 3 und die acyclischen Grundgerüst-Strukturen I-N in Figur 4. In den cyclischen Strukturen E und F ist das N&sub1;-Nukleophil die 3'-Hydroxyl-Gruppe, und in den Strukturen G und H, das an den 3'-Stickstoff des Morpholino-Ringes angeknüpfte Amin. Die E-Gruppe in allen der cyclischen Strukturen ist die Carboxyl- oder die entsprechende Sulfonyl-Gruppe, welche an die 5'-Position des Ribose-Ringes oder an die 6'-Position des Morpholino-Ringes verknüpft ist. In allen diesen Strukturen, die in Figur 4 gezeigt sind, sind die N&sub1;- bzw. E-Gruppen die Grundgerüst-Amin- oder Hydrazin-Gruppen und Carboxyl- oder Sulfonsäure-Gruppen an den Grundgerüstteil-Enden.
Das erste Kopplungsverfahren, welches in Figur 7A veranschaulicht ist, ist analog zu der obenstehend unter Bezug auf Figur 5A beschriebenen Methode, worin eine erste N&sub1;- geschützte Untereinheit aktiviert wird, danach direkt an eine Grundgerüst-ungeschützte Untereinheit gekoppelt wird, welche die nächste in der Sequenz angeordnete Untereinheit in dem wachsenden Polymer bildet. Die P&sub1;-Schutzgruppe an der N&sub1;-Gruppe einer Untereinheit ist bevorzugt eine säurelabile Schutzgruppe wie etwa t-Butoxycarbonyl oder ein an den Festphasenträger gebundener, abspaltbarer Abstandshalter. Verfahren für die N&sub1;-Schützung von cyclischen Grundgerüst-Strukturen sind analog zu den obenstehend beschriebenen Verfahren für die cyclischen Strukturen A-D. Ähnliche Verfahren sind dahingehend wirksam, um die Amin-Stickstoffe in den acyclischen Grundgerüst-Strukturen zu schützen. Alternativ dazu kann, wenn das Polymer auf einem Festphasenträger konstruiert werden soll, wie im folgenden beschrieben, die Grundgerüst-N&sub1;-Stelle durch ihre Anknüpfung an einen Festphasenträger geschützt werden, wobei die Untereinheit-Addition an das wachsende Polymer über das aktivierte E-Elektrophil der zuletzt angefügten Untereinheit stattfindet.
Die Aktivierungsreaktion wird so entworfen, daß sie eine aktivierte oder kettenendständige Gruppe der Form N&sub1;-----E-X ergibt, worin X wie obenstehend unter Bezugnahme auf Figur 6 beschrieben beschaffen ist, und die aktivierte Untereinheit besitzt in großem Maße dieselbe Reaktivität gegenüber nukleophilen Grundgerüstgruppen wie dies bei der aktivierten Untereinheit in dem zuvor beschriebenen Verfahren der Fall ist. D.h. die Aktivierung ist so entworfen, daß sie in großem Maße dieselbe aktive Kopplungsgruppe wie in den Grundgerüsten vom N&sub1;--- N&sub2;-Typ herstellt, wobei jedoch die reaktive Carbonyl- oder Sulfonyl-Gruppe durch das Grundgerüst selbst, anstatt durch ein Carbonyl- oder Sulfonyl-Aktivierungsreagenz, wie in den in Figur 6 gezeigten Verfahren, zur Verfügung gestellt wird.
Die Aktivierung kann leicht durch Reagieren der Untereinheit des N&sub1;----E-Typs mit einem Carbodiimid in der Gegenwart von p-Nitrophenol, wobei das Grundgerüst- Elektrophil eine Carbonyl-Gruppe ist, oder durch Reagieren mit einem Carbodiimid in der Gegenwart von Imidazol, 1,2,4-Triazol oder Tetrazol, wobei das Grundgerüst ein Sulfonyl ist, durchgeführt werden. Untereinheit-Aktivierungs-Reaktionen, die Carbonyl- Elektrophil-Gruppen beinhalten, sind in Beispiel 16 und 17 ausgeführt. Die allgemeinen Reaktionsbedingungen, die verwendet wurden, um die N-Amino-morpholino- und geradkettigen Grundgerüst-Carbonyl-Gruppen zu aktivieren, sind im allgemeinen auf die anderen, in Figur 3 und 4 gezeigten, Grundgerüst-Strukturen vom N&sub1;----E-Typ anwendbar.
Im Anschluß an die Aktivierungsreaktion wird der aktivierte Komplex mittels herkömmlichen Verfahren wie etwa Silica-Chromatographie gereinigt, oder im Falle einer träger-gebundenen aktivierten Kette einfach gewaschen, und danach mit einer zweiten Untereinheit zur Reaktion gebracht, deren ausgewählte Erkennungsgruppe R&sub2; die nächste in Reihe angeordnete Erkennungsgruppe in dem vollständigen Polymer bildet. Die Kopplungsreaktion ergibt ein Dimer, dessen Untereinheiten deshalb durch eine E-N&sub1;-Bindung gekoppelt sind, wie in der Figur angezeigt. Wie obenstehend, müssen beide Untereinheiten während der Aktivierungs- und Kopplungsreaktionen geeigneten basen-geschützt werden.
Das Polymer kann durch Wiederholen der oben genannten Schritte des (a) Aktivierens des freien E-Elektrophils in der zweiten Untereinheit, (b) Abtrennens der aktivierten Spezies von dem Aktivierungsmittel, und (c) Koppelns der aktivierten Verbindung mit der nächsten in Reihe angeordneten Untereinheit, deren Grundgerüst ungeschützt ist, erweitert werden.
Das zweite Kopplungsverfahren, das in Figur 7B veranschaulicht ist, ist direkt analog zu dem obenstehend unter Bezug auf Figur 5B beschriebenen Verfahren. Hier wird eine erste Untereinheit mit einem E-geschützten Grundgerüst mit einer zweiten Untereinheit zur Reaktion gebracht, die eine aktivierte E-Gruppe und ein geschütztes N&sub1;-Nukleophil besitzt, um ein Dimer zu bilden, welches über eine E-N&sub1;-Bindung verknüpft und an beiden freien Grundgerüst-Endgruppen geschützt ist. Wenn das Polymer durch Festphasen-Synthese gebildet wird, nimmt die P&sub2;-Schutz-"Gruppe" die Form einer säurestabilen Verknüpfung an einen Festphasenträger an. Die N&sub1;-geschützte Untereinheit wird wie obenstehend hergestellt und aktiviert. Die Kopplungsbedingungen folgen im allgemeinen denen, die in den oben genannten Kopplungsreaktionen der cyclischen Untereinheiten verwendet wurden.
In dem dritten Kopplungsverfahren, gezeigt in Figur 7C, werden die n&sub1;-geschützten und E-ungeschützten Untereinheiten (oder Polymer-Einheiten) miteinander in der Gegenwart eines geeigneten E-Aktivierungsmittels, wie etwa Carbodiimid, zur Reaktion gebracht, wie angegeben.
Figur 8 zeigt die durch Kopplung der unter E-K in Figuren 3 und 4 bzw. unter E-E bis K-K gezeigten cyclischen und acyclischen Grundgerüst-Untereinheiten hergestellten Dimer-Strukturen. Die Nukleosid-Untereinheiten in Struktur F-F in Figur 3 werden durch eine Esterbindung verknüpft. In der verbleibenden cyclischen Grundgerüst- Struktur G-G werden die Untereinheiten über eine Hydrazid- oder Sulfonylhydrazid- Bindung verknüpft. Alle von den acyclischen Grundgerüst-Untereinheiten, die unter I-I, J-J und K-K gezeigten, werden über Amid- (E=Carbonyl)- oder Sulfonamid- (E=Sulfonyl)-Bindungen verknüpft. Wie in den obenstehenden erörterten cyclischen Grundgerüst-Untereinheit-Strukturen sind alle Untereinheit-Verknüpfungen ungeladen und achiral, und alle der Bindungen sind in wäßrigem Medium praktisch stabil, wie beurteilt über die bekannte Stabilität von Ester-, Hydrazid- und Amid-Bindungen in Lösung.
Gemäß einem anderen wichtigen Merkmal der Erfindung zeigen die Strukturen, wenn verknüpft, um Polymere zu bilden, Watson/Crick-Basenpaarungen mit komplementären Polynukleotiden.
Schließlich sind, wie bei den obenstehend beschriebenen N&sub1;-----N&sub2;-Grundgerüst- Untereinheiten, alle gezeigten N&sub1;----E-Grundgerüst-Strukturen stereoregular. Dies beruht (a) auf der homochiralen (Struktur E-H in Figur 3 und I und L in Figur 4) oder achiralen (Struktur J, K, M und N in Figur 4) Beschaffenheit der Erkennungsgruppen- Anheftung an das Grundgerüstteil, und (b) auf der achiralen Untereinheit-Verknüpfung.

C. Untereinheit-Kopplung: Alternierende geladene und ungeladene achirale Verknüpfungen

Bei manchen Anwendungen kann es erwünscht sein, eine oder mehrere geladene achirale Untereinheit-Verknüpfungen in die Polymermoleküle einzubringen. Die Grundgerüst- Ladung kann benutzt werden, um die Polymerlöslichkeit in vielen Lösungs- Anwendungen zu erhöhen, oder die Polymer-Ziel-Bindungskonstanten einzustellen, wie weiter untenstehend beschrieben wird. Polymere mit gleichmäßig voneinander entfernten bzw. gespaceten geladenen achiralen Grundgerüst-Verknüpfungen, z.B. zwischen jeder zweiten und dritten Untereinheit, sind für das neuartige diagnostische System, das im folgenden beschrieben wird, geeignet. Für die Zwecke der vorliegenden Erörterung wird angenommen, daß Polymer-Einheiten, welche aus zwei oder mehreren Untereinheiten bestehen, die intern durch achirale ungeladene Verknüpfungen verbunden sind, über eine geladene achirale Verknüpfung verbunden werden sollen. Diese ungeladenen Einheiten werden durch eine der in den Abschnitten A und B obenstehend beschriebenen Methoden bzw. Verfahren gebildet.
Die Dimer-Untereinheiten, welche verknüpft werden sollen, werden so ausgewählt, daß die freie N&sub2;-Gruppe eines Dimers an die freie N&sub1;-Gruppe des anderen Dimers über eine geeignet geladene achirale Verknüpfung gekoppelt werden kann. Die bevorzugte Verknüpfung ist eine Phosphodiesterbindung, was erfordert, daß die freie N&sub2;-Gruppe auf einer Untereinheit und die freie N&sub1;-Gruppe auf der anderen Untereinheit beide Hydroxyl- Gruppen sind. Wie in Figur 3 ersichtlich, wird diese Bedingung erfüllt, wenn Dimere, welche entweder aus Untereinheiten der Struktur A oder der Struktur B gebildet wurden, welche beide eine freie N&sub2;-Hydroxyl-Gruppe besitzen, an Dimere geknüpft werden, welche aus Untereinheiten der Struktur A, C oder D gebildet wurden, die alle eine freie N&sub1;-Hydroxyl-Gruppe aufweisen.
In einem typischen Kopplungsverfahren durchläuft das Dimer A, welches an seiner N&sub1;- Position geschützt ist, wie angezeigt, eine Reihe von Reaktionen, welche zu einer reaktiven Phosphoester-Kopplungs-Spezies führen, die über eine Phosphoester-Bindung an die N&sub2;-Hydroxyl-Gruppe wie in Figur 9 gezeigt verknüpft ist. Das bevorzugte Kopplungsverfahren wird in Beispiel 23 und 24 nachfolgend, unter Bezug auf die Bildung eines Tetrameres mit alternierenden ungeladenen, stereospezifischen Methylphosphonat-Bindungen und geladenen, achiralen Phosphodiester-Bindungen, detailliert geschildert. Kurz gesagt, beinhaltet das veranschaulichte Verfahren zuerst die Bildung von durch Methylphosphonat-Bindungen verknüpften Nukleotid-Dimeren, die Isolierung von stereoisomeren Formen der Dimere und die Aktivierung von einem der stereoisomeren Dimere, um eine reaktives N&sub1;-geschütztes N&sub2;-(p-Chlorophenyl-2- cyanoethyl)-phosphat zu bilden. Das aktivierte Dimer wird dann mit einem zweiten Dimer zur Reaktion gebracht, um ein Tetramer zu bilden, das alternierend durch ungeladene stereoisomere Verknüpfungen und geladene achirale Verknüpfungen zwischen den Untereinheiten verknüpft ist.
Das Phosphodiester-Verknüpfungsverfahren kann in Polymersynthese-Verfahren entweder von in Lösung erfolgendem Typ oder vom Träger-Typ gemäß den allgemeinen in den Abschnitten A und B dargestellten Vorgehensweisen zur Polymerkopplung, welche achirale, aber ungeladene Verknüpfungsreaktionen beinhalten, eingebunden werden. Wie angegeben, können die Phosphodiester-Bindungen verwendet werden, um Dimere oder polymere Einheiten zu koppeln, welche selbst durch ungeladene achirale Bindungen gekoppelt sind, gebildet wie obenstehend angegeben, oder zur Kopplung von durch ungeladene chirale aber stereoisomere Verknüpfungen verknüpften dimeren Untereinheiten wie etwa den abgetrennten stereoisomeren Formen von Methylphosphonaten-verknüpften Dimeren verwendet werden.
Für die im folgenden beschriebenen diagnostischen Anwendungen wird es im allgemeinen bevorzugt, so wenige geladene Verknüpfungen, wie zur Erzielung einer angemessenen Polymerlöslichkeit in einem wäßrigen Medium nötig, einzuführen. Die Erhöhung der Löslichkeit wird im allgemeinen mit 1 bis 3 geladenen Grundgerüst-Verknüpfungen je Polymer von etwa 20 Untereinheiten, und bevorzugt nicht mehr als etwa einer geladenen Verknüpfung pro 4 Untereinheiten erreicht. Wie hier definiert, werden achirale Grundgerüst-Verknüpfungen im wesentlichen als ungeladen betrachtet, wenn sie weniger als etwa eine geladene Grundgerüst-Verknüpfung pro Dimer-Einheit und vorzugsweise eine oder weniger Grundgerüst-Verknüpfungen pro tetramerer Einheit enthalten.

IV. Betrachtungen zum Polymer-Targeting

Die Überlegungen hinsichtlich des bei der Herstellung eines Polynukleotid-bindenden Polymers zur Verwendung in der Erfindung angewandten Designs sind von der Beschaffenheit des Zielanalyten und den Reaktionsbedingungen, unter denen der Analyt getestet werden soll, bestimmt. Als eine erste Überlegung wird eine nicht-homopolymere Zielbasensequenz ausgewählt, gegen die das Polymer gerichtet ist. Die Zielsequenz ist vorzugsweise einzigartig bei dem zu testenden Analyten vorhanden, d.h. sie ist so berechnet, daß sie nur mit einer definierten geringen Wahrscheinlichkeit (wie etwa 1 % oder weniger) in einem Test-Gemisch vorkommt, das eine gegebene Anzahl von einzigartig vorkommenden Sequenz-Basen enthält. Die Wahrscheinlichkeit des Vorkommens einer gegebenen n-basigen Zielsequenz ist etwa 1/4n -- d.h. eine gegebene n-basige Zielsequenz würde nach Erwartung einmal in einem Polymer mit 4n-Basen vorkommen. Deshalb ist die Wahrscheinlichkeit P, daß eine gegebene n-basige Sequenz in Polynukleotiden vorkommen wird, welche insgesamt N einzigartig vorkommende Sequenzbasen enthalten, etwa P=N/4n. Die Wahrscheinlichkeit P, daß eine 9-basige Zielsequenz in einem 20 Kilobasen langen Polynukleotid gefunden werden wird, ist, zur Veranschaulichung, etwa 20x10³/2x10&sup5; oder 0,08, die Wahrscheinlichkeit, daß eine 16- basige Zielsequenz vorhanden sein wird, ist etwa 20x10³/4,3x10&sup9; oder 0,0000047. Aus diesen Berechnungen ist ersichtlich, daß ein Polymer mit 9-16 Erkennungsgruppen, das spezifisch für eine definierte Zielsequenz von 9-16-Basen ist, eine hohe Spezifität für die Zielsequenz in einem Testgemisch aufweisen sollte, welches nur virale Genome enthält, deren größte Komplexitäten etwa 400K Basen in einzigartig vorkommenden Sequenzen entsprechen.
Ähnliche Typen von Berechnungen zeigen, daß ein Polymer von 12 bis 16 Untereinheiten eine adäquate Spezifität für eine virale oder bakterielle Zielsequenz in einem Testgemisch zur Verfügung stellen kann, welches nur virales und bakterielles Genom-Material (größte Genomgrößen etwa 5 000 Kilobasen) enthält, und das ein Polymer von 16 bis 22 Untereinheiten eine adäquate Spezifität für eine Zielsequenz in einem Polynukleotid- Gemisch, welches genomisches Säuger-DNA-Material enthält (Genomgrößen von etwa 5 Milliarden Basenpaaren einzigartig vorkommender DNA-Sequenzen) zur Verfügung stellen kann.
Die Polymer/Analyt-Bindungsaffinität, und insbesondere die Temperatur, bei der das Polymer nur mit der Zielsequenz bindet (die Aufschmelz-Temperatur, oder Tm) können gemäß (a) Polymerlänge, (b) der Anzahl von Wasserstoffbrückenbindungen, welche zwischen den Erkennungsgruppen und den entsprechenden in der Sequenz angeordneten Basen der Analyt-Zielsequenz gebildet werden können, und (c) der Grundgerüst- Ladungsdichte selektiv variiert werden. Aus einer Anzahl von Studien an Modell- Homopolymer-Duplexen bzw. Doppelsträngen, ist bekannt, daß die Aufschmelz- Temperatur von Oligonukleotid-Doppelsträngen in dem Bereich von 10 bis 20 bp um etwa 3ºC pro zusätzlichem Basenpaar zunimmt, wo die komplementären Basen dazu fähig sind, zwei Wasserstoffbrückenbindungen auszubilden, und um etwa 6ºC pro zusätzlichem Basenpaar, wo die komplementären Basen fähig sind, drei Wasserstoffbrücken auszubilden. Deshalb kann die Länge einer Zielsequenz, welche anfänglich gewählt wird, um eine hohe Bindungsspezifität mit dem Polymer zu gewährleisten, erweitert werden, um eine gewünschte Aufschmelz-Temperatur mit dem basenkomplementären Polymer unter ausgewählten Testbedingungen zu erreichen. Wo die bei der Konstruktion des Polymeres verwendeten Erkennungsgruppen die Standard- Nukleinsäurebasen sind, wie obenstehend veranschaulicht, kann die Zielsequenz ebenfalls ausgewählt werden, um einen hohen Prozentsatz von Guanin- plus Cytosin-Basen zur Erzielung einer relativ hohen Polymer/Analyt-Aufschmelz-Temperatur aufzuweisen, oder einen relativ hohen Prozentsatz von Adenin- plus Thymin-Basen zur Erzielung einer relativ niedrigen Aufschmelz-Temperatur.
Die Grundgerüst-Ladungsdichte des Polymers muß wesentlich geringer sein als diejenige des Polynukleotid-Analyten, um präferentielle Bindung von polykationischen Reportermolekülen an den Analyten, unter Bedingungen zu ermöglichen, bei denen Reporter-Bindung an das Polymer, wie bereits bemerkt, nicht stattfindet. Diese Anforderung ist erfüllt, wo das Spacing bzw. der Abstand zwischen den benachbarten negativen Ladungen in dem Polymer-Grundgerüst mindestens zweimal so groß ist wie das Spacing zwischen benachbarten geladenen Phosphodiester-Verknüpfungen in dem Analyten. Die Ladungsdichte des Grundgerüsts besitzt ebenfalls einen bedeutenden Effekt auf die Polymer/Analyt-Aufschmelz-Temperatur, insbesondere unter Niedrigsalz- Bedingungen, bei denen jegliche Ladungs-Ladungsabstoßung zwischen den Analyt- und Polymer-Grundgerüsten dahingehend wirken kann, die Temperatur zu senken, bei der diese zwei sich aneinander anlagern bzw. annealen können. Im allgemeinen würde deshalb von einem Polymer mit einem weniger geladenen Grundgerüst erwartet werden, (1) eine höhere Analyt/Polymer-Aufschmelz-Temperatur, und (2) eine geringere Abhängigkeit der Aufschmelz-Temperatur von der Salzkonzentration zu zeigen. Basierend auf diesen Betrachtungen, wird ein ungeladenes achirales Polymer, wie etwa die mehreren, obenstehend unter Bezug auf Figur 6 und 8 beschriebenen Polymere, ermöglichen, daß die Analyt/Polymer-Annealing-Reaktion in dem diagnostischen Verfahren unter einem breiteren Bereich von Salzkonzentrationen ausgeführt wird, als bei einem partiell geladenen Polymer, wie etwa einem Polymer, das aus alternierenden geladenen achiralen Phosphodiester-Bindungen und ungeladenen Verknüpfungen gebildet ist, welche entweder achiral oder chiral sein können, aber stereospezifisch definiert sind.

V. Polymer-Zusammenbau-Verfahren

A. Geometrischer Zusammenbau

Nach Auswählen einer gewünschten Polymerlänge und Erkennungsgruppenabfolge, gemäß den in Abschnitt IV betrachteten Faktoren, wird das Polymer unter Verwendung der obenstehend geschilderten allgemeinen Untereinheit-Kopplungsverfahren zusammengebaut. Ein Verfahren des Polymer-Zusammenbaus beinhaltet anfängliche Herstellung einer geeigneten Auswahl von Dimeren, Verknüpfen ausgewählter Dimere, um Tetramere zu bilden, Verknüpfung dieser, um Oktamere zu bilden, usw. Dieses Verfahren wird in Lösung, im wesentlichen gemäß unter Bezug auf die Figuren 5A und 7A obenstehend beschriebenen Verfahren durchgeführt. Es sollte bemerkt werden, daß nicht alle Kopplungen notwendigerweise zwischen Oligomeren von gleicher Größe erfolgen müssen. Zum Beispiel ist es in der letzten Kopplung oft erwünscht, ein Hexadekamer mit einem Tetramer zu verknüpfen, um ein 20-mer zu ergeben, oder ein Hexadekamer mit einem Oktamer zu verknüpfen, um ein 24-mer zu ergeben.
Ein besonderer Vorteil dieses Assembly-Verfahrens ist, daß jedes Kopplungsprodukt etwa die zweifache Masse der Vorläufer hat, und die Reinigung des Produktes aus jeder Kopplung somit ein vereinfachter Vorgang ist. Das nachfolgende Beispiel 18 schildert den Zusammenbau eines Carbamat-verknüpften Polymers von 8 Untereinheiten, welches mittels diesem Verfahren gebildet wurde (b).

B. Schrittweiser Zusammenbau auf einem Festphasenträger

Ein bevorzugtes Verfahren für die Polymersynthese ist der schrittweise Aufbau auf einem festen Träger. Hierbei wird die erste Untereinheit in dem Polymer über ihre N&sub2;- Grundgerüstgruppe an einen Festphasenträger geknüpft. Typischerweise wird ein Festphasentrager, wie etwa mit abspaltbaren, vorzugsweise säurestabilen, langkettigen Linkern bzw. Verbindungsstücken derivatisierte Glaskügelchen, als das Trägermaterial verwendet, und für die Anknüpfung eines N&sub2;-Nukleophils, wie etwa einer 5'-Hydroxy- Gruppe eines Nukleosides, wie in Beispiel 19 beschrieben, vorbereitet. Die Glaskügelchen werden mit einer Untereinheit zur Reaktion gebracht, welche vorzugsweise eine säurelabile N&sub1;-geschützte Gruppe und eine aktivierte N&sub2;- oder E- Grundgerüstgruppe aufweist, wie in Abschnitt III obenstehend geschildert. Die Kopplung von verschiedenen Typen von Untereinheiten an einen Glaskügelchen-Träger wird allgemein in den Beispielen 20 bis 22 beschrieben.
Nach der Kopplung der zweiten Untereinheit (oder Polymereinheit, welche in Lösung zusammengebaut werden kann) an den Träger, werden jegliche nicht-reagierten Linker- Nukleophile durch Zugabe eines geeigneten Abdeckungsreagenz wie etwa p- Nitrophenylacetat gecappt bzw. abgedeckt, und danach wird der Träger gewaschen und filtriert. Die Schutzgruppe an der N&sub1;-terminalen Untereinheit wird, typischerweise durch Säurebehandlung, entfernt, und nach Neutralisation wird der Träger dann mit einem Überschuß der nächsten in der Sequenz angeordneten Untereinheit (oder Polymereinheit) zur Reaktion gebracht, welche an ihrer freien N&sub2;-Grundgerüstgruppe aktiviert ist. Der Überschuß an aktivierter Untereinheit maximiert die Anzahl von trägergebundenen Untereinheiten, welche ketten-verlängert werden. D.h. ein Merkmal des Festphasen- Assembly-Verfahrens ist die Notwendigkeit für hohe Kopplungseffizienzen bei jedem Untereinheit Additionsschritt, und die Konzentration der zugegebenen aktivierten Untereinheit wird ausgewählt, um diese Effizienz zu maximieren. Die Kettenelongation wird in dieser Weise, unter Abdeckung (capping) von Fehlsequenz, nach jeder Untereinheit-Addition, fortgeführt, bis das Polymer der gewünschten Länge und Sequenz erhalten wird. Das allgemeine Verfahren ist in Beispiel 20 für die Herstellung eines Carbonat-verknüpften Polymers von 14 Untereinheit veranschaulicht, in Beispiel 21 für die Synthese eines Carbamat-verknüpften Polymers von 19 Untereinheiten, und in Beispiel 22 für den Zusammenbau eines Amid-verknüpften Polymers von 19 Untereinheiten.
Nach Zugabe der letzten in der Sequenz angeordneten Untereinheit kann das Polymer mit einer geeigneten geladenen oder ungeladenen, an die terminale N&sub1;-Gruppe gekoppelten, Gruppe abgedeckt werden. Falls der Grundgerüstzusammenbau ausschließlich mit ungeladenen achiralen Verknüpfungen ausgeführt worden ist, ist das Capping-Reagenz vorzugsweise eine geladene Gruppe, welche dem Polymer eine terminale Entladung verleiht. Nach Capping bzw. Abdeckung des Polymers wird das Polymer vom Träger z.B. durch Behandlung mit einem Nukleophil wie etwa Ammoniumhydroxid abgespalten, und das Polymer wird gereinigt, etwa durch Anionen- Austauschchromatographie. Die zusammengebauten, gereinigten Polymere werden mittels Verfahren, welche nachfolgend betrachtet werden sollen, an einen Festphasenträger angeknüpft.
Die obenstehend erörterten Grundsätze für das Polymer-Design sind in Beispiel 18 für eine in Lösung erfolgende Synthese aus zuvor aufgebauten Dimer-Einheiten, in Beispielen 20 bis 23 für die Herstellung einer Vielzahl von ungeladenen achiralen Verknüpfungen und in Beispiel 24 für die Herstellung eines Polymers vom Typus mit alternierenden Ladungen veranschaulicht.

VI. Diagnostisches Reagenz

A. Festphasenträger-Reagenz

Das Reagenz der Erfindung wird durch Kopplung multipler bzw. mehrerer Bindungspolymere aus dem oben genannten an einen Festphasenträger gebildet. Alternativ dazu können die Polymere in einer schrittweisen oder blockweisen Art und Weise auf dem Träger synthetisiert werden, wie obenstehend für die Carbamatverknüpften Polymere beschrieben. Die Polymere können direkt gekoppelt werden an den (oder direkt gebildet werden auf dem) Träger, z.B. über eine OH-Endgruppe auf dem Polymer an eine OH-reaktive Gruppe auf einem Festphasenträger, wie etwa aktivierter Agarose, Cellulose oder dgl. Direkte Kopplung bringt jedoch häufig die Träger-proximalen Untereinheiten zu nahe an den Träger, um eine basenkomplementäre Bindung zwischen dem Analyten und den Erkennungsgruppen der proximalen Untereinheiten zu erlauben. Deshalb sind die Polymermoleküle vorzugsweise jeweils über einen Spacer-Arm, der angepaßt ist, das Polymer von der Oberflächenregion des Trägers zu entfernen, so daß eine im wesentlichen unbehinderte Bindung zwischen dem Polymer und der Analyt-Zielsequenz ermöglicht wird, an den Festphasenträger gebunden.
Der Spacer-Arm ist vorzugsweise eine unverzweigte Kette mit einer Gesamtkettenlänge von mindestens 6 Atomen, und besitzt geeignete reaktive Endgruppen zur Anknüpfung an den Träger an einem Ende, und an das Polymer an dem anderen Ende. Eine Vielzahl von Typen von Spacer-Armen, insbesondere Kohlenstoff-enthaltende Ketten von verschiedener Länge und Hydrophilizität, sind wohlbekannt, wie auch reaktive Gruppen, welche in Spacer-Arm-Kopplungsreaktionen verwendet werden. Das nachfolgende Beispiel 25 beschreibt die Synthese eines Aminohexyl-Spacer-Armes, dessen Anknüpfung an das 5'-Ende eines gemischten Methylphosphonat/Phosphodiester- Polymers, und die Kopplung an einen Festphasenträger. Das folgende Beispiel 26 schildert die Herstellung eines Polymer-Trägers mit multiplen oberflächengebundenen geradkettigen Spacer-Armen, zur Verwendung bei der Bildung eines diagnostischen Reagenz, welches Carbamat-verknüpfte Polymere aufweist. Das Verfahren von Beispiel 26 ist in Figur 10 veranschaulicht. Der in der Figur gezeigte Träger ist ein aminomethyliertes Polystyrol, welches zuerst mit Bernsteinsäureanhydrid zur Reaktion gebracht wird, um ein carboxyliertes Derivat zu bilden. Aktivation des Trägers mit Di(succinimid)carbonat und Reaktion mit 6-Aminohexanol führt zu den gezeigten 13- atomigen Spacer-Arm mit terminaler Hydroxyl-Gruppe.
Bevorzugte Festphasenträger umfassen Agarose, Cellulose, Nitrocellulose, Latex, Polystyrol und andere im Handel erhältliche streifenartige oder partikel-kugelförmige Trägermaterialien mit oberflächen-reaktiven oder aktivierbaren Gruppen, welche effiziente Kopplung von Polymermolekülen, insbesondere über Polymer-gebundene Spacer-Arme, ermöglichen. Die Konzentration der an die Trägeroberfläche gekoppelten Polymere ist vorzugsweise so ausgewählt, daß ein 10 bis 1000-facher molarer Überschuß von Polymermolekülen gegenüber Analyt-Molekülen ermöglicht wird, wenn in dem diagnostischen Verfahren ein geeignetes Probenvolumen des Testmaterials mit dem Träger gemischt wird, wie im folgenden beschrieben wird. Ein Verfahren zur Kopplung eines zielbindenden Polymers an Agarose-Kügelchen über einen Aminohexyl-Spacerarm aus Beispiel 25 ist in demselben Beispiel beschrieben.

B. Reporter

Der Reporter des diagnostischen Systems der Erfindung besteht aus zwei Teilen: (1) einem polykationischen Bereich oder Schwanz, entworfen um elektrostatisch an ein vollständig geladenes Polynukleotid unter Bedingungen zu binden, bei denen der Reporter nicht an das weniger geladene Bindungs-Polymer bindet, welches auf dem diagnostischen Reagenz getragen wird, und (2) einer oder mehreren, an den Schwanz geknüpften Reporter-Gruppen, welche daran angepaßt sind, ein Signal zu erzeugen, durch welches die Gegenwart des Reporters nachgewiesen werden kann. Wie der Begriff "polykationisch" hier verwendet wird, beinhaltet er Schwänze mit zwei oder mehreren geeignet voneinander entfernten kationischen Gruppen.
Der kationische Schwanz ist vorzugsweise konstruiert, um mindestens zwei positiv geladene Gruppen zur Verfügung zu stellen, welche für die Bindung an benachbarte negative Ladungen auf den Zucker-Phosphat-Grundgerüst des Polynukleotid-Analyten einen Zwischenraum voneinander aufweisen. Gleichzeitig ist der Zwischenraum bzw. das Spacing zwischen benachbarten Ladungen auf dem kationischen Schwanz so beschaffen, daß eine elektrostatische Bindung an das Reagenz-Polymer-Grundgerüst, welche mehr als die Hälfte der Reporter-Ladungen beansprucht, energetisch ungünstig ist. Zum Beispiel ist in dem obenstehend beschriebenen Polymer mit alternierenden ungeladenen Phosphonat- und geladenen Phosphat-Bindungen, die Distanz zwischen benachbarten negativen Ladungen in dem Polymer-Grundgerüst etwa doppelt so groß wie diejenige in einem Polynukleotid-Grundgerüst. Deshalb würde eine Bindung zwischen im wesentlichen allen der geladenen Gruppen des kationischen Schwanzes und den alternierend angeordneten negativen Ladungen des Polymer-Grundgerüsts eine energetisch ungünstige Verdrehung des Polymer-Grundgerüst erfordern. Es kann davon ausgegangen werden, daß, wo das Polymer-Grundgerüst eine alternierende geladene/ungeladene Konfiguration aufweist, das Spacing zwischen benachbarten positiven Ladungen in dem kationischen Schwanz dem Minimalspacing nahekommen sollte, welches eine starke elektrostatische Bindung zwischen dem Reporter-Schwanz und dem Polynukleotid-Grundgerüst ermöglicht. Die Anforderung an das Ladungs- Spacing in dem Reporter wird natürlich weniger ausschlaggebend, wo das Reagenz- Polymer eine Dichte von negativen Ladungen von weniger als einer pro zwei Untereinheit-Verknüpfungen aufweist, oder wo das Reagenz-Polymer ein ungeladenes Grundgerüst aufweist.
Es wird gleichfalls angemerkt, daß, wenn das Polymer-Grundgerüst eine alternierende geladene/ungeladene Konfiguration besitzt, wie etwa geladene Phosphodiester- Bindungen im Wechsel mit ungeladenen Methylphosphonat-Bindungen, der kationische Reporter am effektivsten zwischen den vollständig geladenen Polynukleotiden und dem Polymer unterscheiden kann, wenn seine kationischen Gruppen nicht dazu in der Lage sind, an die ungeladene Verknüpfung, wie etwa an den doppelt gebundenen Sauerstoff der Methylphosphonat-Verknüpfung, Wasserstoffbrücken auszubilden. Aus diesem Grunde ist es im allgemeinen vorteilhaft, quaternäre Ammonium-Ionen als die kationischen Gruppen in solch einem Reporter zu verwenden.
Die Anzahl von kationischen Gruppen in dem Reporterschwanz kann, gemäß der gesamten elektrostatischen Anziehung, welche erforderlich ist, damit der Reporter an dem Polynukleotid-Analyten unter Bindungs-Bedingungen bindet, bei denen der Reporter nicht an das Reagenz-Polymer-Grundgerüst bindet, von 2 bis zu etwa 8 oder mehr variieren. Für Reporter mit relativ großen Reporter-Gruppen, wie etwa Enzymen, können multiple bzw. mehrfache elektrostatische Bindungen erforderlich sein, um den Reporterschwanz an das Analyt-Grundgerüst anzuheften. Ein Reporterschwanz mit einer Anzahl von gespaceten kationischen Gruppen ist besonders für den Einsatz mit einem Reagenz geeignet, dessen Polymer-Grundgerüst ungeladen ist und somit keine elektrostatischen Bindungen mit dem Schwanz ausformen kann. Verfahren für die Konstruktion eines, für die Anwendung in der Erfindung geeigneten, kationischen Schwanzes, sind in den Figuren 11-13 dargestellt. Unter Bezugnahme zuerst auf Figur 11, wird eine N-Methylaminosäure mit Di-t-butyldicarbonat (BOC) N-geschützt, mit Carbonyldiimidazol aktiviert und danach über eine Amid-Bindung an Dimethylamin gekoppelt. Nach dem Entschützen wird das Amid mit einer N-geschützten, Carbonyldiimidazol-aktivierten Aminosäure aus dem obenstehenden zur Reaktion gebracht, um eine Diamid-Verbindung zu bilden, welche in der Mitte von Figur 11 gezeigt ist. Die Entschützungsreaktion und die Reaktion mit der N-geschützten Diimidazol-aktivierten Aminosäure werden wiederholt, bis das Polyamid von der gewünschten Länge gebildet ist. Details der Synthese-Reaktionen sind in den Beispielen 28 bis 30 dargestellt.
Typischerweise wird eine Reportergruppe am einfachsten an eine primäre Amin-Gruppe in dem Polykation angeheftet. Um ein primäres Amin, gemäß einem geeigneten Verfahren, an das sekundäre-Amin-Ende der Verbindung aus Figur 11 anzuknüpfen, wird eine Aminosäure, z.B. 4-Aminobuttersäure, BOC-geschützt, mit Diimidazol aktiviert und mit dem entschützten Polyamin zur Reaktion gebracht, wie in Figur 12 dargestellt. Die resultierende BOC-geschützte Verbindung kann dann, nach Behandlung mit Trifluoressigsäure, um die BOC-Gruppe zu entfernen, durch Reaktion mit Borantetrahydrofuran reduziert werden. Diese Verfahren sind in Beispiel 31 bis 32 beschrieben.
Die Figur 13 zeigt ein Reaktionsschema zur Umsetzung eines Polyamins, wie etwa obenstehend synthetisiert, in ein polyquarternäres-Ammoniumsalz. Das Verfahren beinhaltet Schützen des terminalen 1º-Amines, gefolgt von Reaktion mit Methyljodid, um das polyquarternäre Ammoniumsalz zu bilden und Entschützen mit Trifluoressigsäure. Das nachfolgende Beispiel 33 gibt Details des Verfahrens wider.
Die eine oder die mehreren Reporter-Gruppen in dem Reporter sollten (1) leicht an den kationischen Schwanz angeheftet werden und (2) fähig sein, ein leicht nachweisbares Signal, entweder wenn der Reporter an ein Polynukleotid-Grundgerüst gebunden ist oder nachdem der Reporter von dem Analyten eluiert worden ist, zu erzeugen. Kleine Reporter-Gruppen, die Chromophore, wie etwa Nitroanilin oder andere stark absorbierende Farbstoffe, und Fluorophore beinhalten, wie etwa Dansyl- oder Rhodaminartige fluoreszente Moleküle, sind geeignet, und haben den Vorteil, daß sie leicht durch photometrische Ausrüstung, oder im Fall der Farbstoffe, visuelle Inspektion nachgewiesen werden können. Reporter-Gruppen aus Radioisotopen können Vorteile in der diagnostischen Sensitivität zur Verfügung stellen, aber der Reporternachweis kann komplexer und teurer sein. Stabile paramagnetische Moleküle wie etwa Nitroxid-Spin- Markierungen, können ebenfalls verwendet werden, wobei die Bindung des Reporters an das Polynukleotid durch Verbreiterung der für immobilisierte paramagnetische Spezies charakteristischen Absorptionslinien der Elektronenspin-Resonanz (ESR) nachgewiesen wird.
Eine andere Klasse von geeigneten Reporter-Gruppen enthält Ligand-Moleküle und vorzugsweise kleine antigene Moleküle, welche fähig sind, spezifisch und mit hoher Affinität an Anti-Ligand-Moleküle zu binden. Exemplarische Ligand/Anti-Ligand-Paare beinhalten Antigen/Antikörper, Lectin/Kohlenhydrat und Biotin/Avidin. Das Anti- Ligand-Molekül ist Teil eines signalerzeugenden Bindungs-Konjugates, welches auch eine signalerzeugende Gruppe enthält, wie etwa ein Chromophor, Fluorophor oder Enzym, durch das die Gegenwart von Liganden-Gruppen nachgewiesen werden kann wenn Ligand/Anti-Ligand-Bindung stattgefunden hat.
Der Reporter kann Enzym-Reportergruppen besitzen, insbesondere, wie obenstehend bemerkt, wo der Reporterschwanz mehr als zwei kationische Gruppen aufweist. Stellvertretende Enzym-Klassen sind Oxidoreduktasen, vertreten durch Luciferase; Glucoseoxidase; Galactoseoxidase und Katalase; Hydrolasen, vertreten durch verschiedene Arten von Phosphatasen; Glycosylhydrolasen, wie etwa β-Galactosidase; Peptidasen; und Lyasen.
Typischerweise werden die Reporter-Gruppe oder -Gruppen an ein Amin des polykationischen Schwanzes und vorzugsweise gemäß bekannten Kopplungs-Verfahren an ein primäres Amin gekoppelt. In einem bevorzugten Verfahren, veranschaulicht in Figur 15, wird ein Polyamin mit einem geeigneten bifunktionellen Kopplungsmittel, wie etwa 4-Fluor-3-nitrophenylazid, zur Reaktion gebracht, und dann an eine Reporter- Gruppe, wie etwa ein Enzym, gekoppelt. Eine Vielzahl von bifunktionellen Reagenzien zur Kopplung von Aminen an reaktive Reporter-Gruppen wie etwa Amin, Carboxyl, OH und Sulhydral-Gruppen sind wohlbekannt. Ein detailliertes Verfahren zur Bildung eines tetrakationischen Reporters mit einer Alkalische-Phosphatase-Reportergruppe ist in Beispiel 38 wiedergegeben. In einem anderen bevorzugten Verfahren, veranschaulicht in Figur 15, wird ein Reporter durch Reagieren von Bis-3,3'-aminopropyl-methylamin mit einer Amin-reaktiven Dansyl-Gruppe hergestellt. Das Reaktionsschema in der Figur zeigt ebenfalls, wie die Amino-Gruppen des Reporterschwanzes vor der oder folgend der Reporterkopplung an den Schwanz vollständig alkyliert werden können. Details des Verfahrens sind in Beispiel 34 wiedergegeben.

VII. Diagnostisches Verfahren

Dieser Abschnitt beschreibt die Verwendung des obenstehend beschriebenen diagnostischen Systems zur Bestimmung eines Polynukleotid-Analyten. Der Analyt kann ein solcher sein, der normalerweise in einer einzelsträngigen Form existiert, wie etwa Messenger-RNA (mRNA), ribosomale RNA (rRNA) oder ein einzelsträngiges virales RNA- oder DNA-Genom, oder kann ein solcher sein, der unter physiologischen Bedingungen in einer doppelsträngigen oder Duplex-Form vorkommt, wie etwa doppelsträngige virale RNA, virale replikative RNA/DNA-Intermediate, und doppelsträngige DNA, wie etwa die aus einem Virus, einem Bakterium oder einer eukaryotischen Zelle hergeleitete. Die bei der Auswahl einer Zielsequenz in dem Analyt- Polynukleotid, gegen welches die Reagenz-Polymere gerichtet sind, angewandten Überlegungen und Berechnungen, werden in Abschnitt I betrachtet.
Bei der Durchführung der Diagnose, wird eine, hinsichtlich des Analyten zu untersuchende, Probe typischerweise durch herkömmliche klinische Techniken im Umgang mit Proben gewonnen. Wo der Analyt ein Virus oder ein aus Bakterien abgeleitetes Polynukleotid ist, ist es oft hilfreich, die Probe zuerst zu verarbeiten, um gröberes Nicht-Analyt-Zellmaterial zu entfernen. Zum Beispiel ist es beim Test auf die Gegenwart eines viralen Pathogens oft hilfreich, die Probe durch eine Membran mit 0,2 um Porengröße zu filtrieren, um Bakterienmaterial zu entfernen. Beim Test auf das Vorhandensein eines bakteriellen Pathogens ist es oft hilfreich, die Probe durch eine Membran mit 1,0 um Porengröße zu filtrieren, um eukaryotische Zellen zu entfernen, welche ebenfalls in der Probe vorhanden sein können. Typische Herstellungs- bzw. Präparationsverfahren für Proben sind für die Diagnose von viralen Pathogenen in den Beispielen 36 und 37 beschrieben.
Um das Analyt-Probematerial in einer für die Bindung an das Reagenz-Polymer geeigneten Form herzustellen, sollte die Probe behandelt werden, um die Nukleinsäure des Organismus freizusetzen. Für Organismen ohne Zellwände sind Detergenzien und/oder chaotrope Salze im allgemeinen angemessen. Für Organismen mit Zellwänden können Alkali (wenn der Analyt DNA ist) oder geeignete Enzyme (z.B. für viele Bakterien Lysozym) verwendet werden. Falls gewünscht können die freigesetzten Nukleinsäuren durch die Zugabe eines chaotropen Salzes (Natriumtrichloracetat) gefolgt von selektiver Fällung der Nukleinsäure mit Ethanol bequem von Proteinen und anderen Kontaminanten abgetrennt werden.
Ein wirkungsvolles Verfahren zur Freisetzung und Isolierung des Nukleinsäure-Materials von viralen oder Zell-Komponenten ist von dem Erfinder in Anal. Biochem. (1983) 133: 79 beschrieben worden. Das Verfahren, das in Beispiel 36 geschildert ist, beinhaltet das Suspendieren der Probe in 4M Trichloracetat, 100 mmol EDTA, um proteinartiges Material zu denaturieren und in Lösung zu bringen, und dann die Fällung des freigesetzten Nukleinsäure-Materials in der Salzlösung durch die Zugabe eines gleichen Volumens von kühlem Ethanol. Ein Träger-Polynukleotid, wie etwa Polyuridylsäure, kann zugegeben werden, um die Nukleinsäure-Fällung zu erleichtern. Nach einer kurzen Abkühlzeit wird die präzipitierte Nukleinsäure durch Zentrifugation pelletiert und mit wäßrigem Ethanol gewaschen, um das Salz zu entfernen.
Die Nukleinsäure-Fraktion wird in Annealing- bzw. Anlagerungs-Puffer resuspendiert, der eine ausgewählte Salzkonzentration und ein Chelatisierungsmittel für zweiwertige Kationen aufweist. Ein Annealing-Puffer, der etwa 100 mmol oder weniger eines einwertigen Salzes wie etwa NaCl und etwa 10 mmol eines Chelatisierungsmittels wie etwa EDTA enthält, ist allgemein für die Bindung eines Polynukleotides geeignet, welches normalerweise in einer doppelsträngigen DNA-Form existiert. Eine signifikant niedrigere Salzkonzentration als 100 mmol kann schwierig mit Genauigkeit erreicht werden. Höhere Salzkonzentrationen, insbesondere über etwa 0,5 M, neigen dazu, Doppelstrangbildung zwischen komplementären Polynukleotid-Strängen zu ermöglichen, was zur Kompetition zwischen dem Reagenz-Polymer und dem komplementären Strang um die Bindung an das Analyt-Polynukleotid führt. Doppelstrang-Bildung zwischen komplementären Polynukleotiden wird auch durch das Chelatisierungsmittel inhibiert, welches dahingehend wirkt, Mg&spplus;²- und Ca&spplus;&spplus;-Ionen in der Annealing-Mischung abzufangen. Wenn der Analyt eine RNA ist, kann es von Vorteil sein, die Probe mit DNAse zu behandeln, um die Kompetition zwischen dissoziierter DNA und dem RNA- Analyten um die Bindung an das Reagenz-Polymer zu Verhindern.
Die Anlagerungs- bzw. Annealing-Reaktion wird bevorzugt bei einer Temperatur durchgeführt, welche etwa 5ºC bis 15ºC unter der Aufschmelz-Temperatur der Analyt/Polymer-Duplexstruktur liegt, welche sich während der Reaktionsdauer bildet. Die Annealing-Temperatur begünstigt eine zuverlässige Basen-Sequenz-Paarung zwischen der Analyt-Zielsequenz und dem Polymer. Wie obenstehend dargelegt, ist die Reaktionstemperatur, wenn das Analyt-Polynukleotid normalerweise mit seinem komplementären Strang als eine Duplex-Struktur existiert, bevorzugterweise höher als die Aufschmelz-Temperatur der nativen Polynukleotid-Duplex, um die unerwünschte Paarung des Analyten mit seinem komplementären Polynukleotid zu verhindern, was mit der erwünschten Paarung des Analyten mit dem Reaganz-Polymer kompetitiert. Bei einer Annealing-Pufferkonzentration von etwa 100 mmol des einwertigen Kations, sind Annealing-Temperaturen in dem Bereich von 24º bis 60ºC im allgemeinen geeignet. Wie bereits bemerkt, ist die tatsächliche optimale Annealing-Temperatur eine Funktion der Länge des Bindungspolymers, seinem Verhältnis von A + T zu C + G-Erkennungsgruppen und, für partiell geladene Polymere, der Salzkonzentration.
Abhängig von den Struktur-Charakteristika des Polymers, wie obenstehend erörtert, kann die Aufschmelztemperatur der Analyt-Polymer-Duplexstruktür wesentlich höher sein als eine bevorzugte Reaktionstemperatur, wie etwa 37ºC, in dem jeweiligen verwendeten Annealing-Puffer, wie etwa 100 mmol eines einwertigen Salzes. In solchen Fällen kann es angebracht sein, die Aufschmelztemperatur der Polymer-Analyt- Duplexstruktur durch die Zugabe eines Denaturierungsmittels wie etwa Formamid auf die gewünschte Temperatur zu verringern. Um die zum Erreichen der gewünschten Aufschmelztemperatur benötigte Menge von Formamid zu bestimmen, wird die Aufschmelz-Kurve des Polymers und der Zielsequenz, welche ein synthetisches Oligonukleotid mit der Analyt-Zielsequenz sein kann, auf herkömmlichen Wege und bei einer Anzahl von verschiedenen Denaturierungsmittel-Konzentrationen bestimmt, und, im Falle von zugesetztem Formamid, liegt sie typischerweise im Bereich zwischen etwa 5 Vol.-% und 50 Vol.-% Denaturierungsmittel. Aus dieser Bestimmung wird die Formamid-Menge, welche in dem Annealing-Puffer benötigt wird, um eine Aufschmelztemperatur von etwa 5º bis 15º über der gewünschten Reaktionstemperatur zu erreichen, ermittelt.
Die Analyt-Probe in dem Reaktionspuffer wird zu dem diagnostischen Reagenz, vorzugsweise unter Bedingungen, bei denen die Bindungs-Polymere des Reagenz in einem 10- bis 1000-fachen molaren Überschuß über der molaren Konzentration von Analyt- Molekülen in der Test-Mischung vorliegen, zugegeben. Die Polymer/Polynukleotid- Annealing-Reaktion wird bei der ausgewählten Reaktionstemperatur über eine Zeitdauer hinweg ausgeführt, welche ausreichend ist, um substantielles Polymer/Analyt-Annealing zu ermöglichen, typischerweise zwischen 10 Minuten und 3 h. Das Festphasen-Reagenz wird einmal oder mehrere Male gewaschen, um ungebundenes Material zu entfernen.
Dann wird unter vorherbestimmten Bedingungen Reporter zu dem gewaschen Reagenz zugegeben, um Reporter-Moleküle an das vollständig geladene Grundgerüst des reagenz-gebundenen Analyten zu binden. Die Raum/Ladungs-Charakteristika des Reporters, welche selektive Bindung des Reporters an das Polynukleotid-Grundgerüst erlauben, sind obenstehend erörtert worden. Wo das Reagenz-Polymer einige negative Grundgerüst-Ladungen aufweist, ist die Salzkonzentration des Bindungsmediums ein wichtiger Faktor. Bei sehr geringen Salzkonzentrationen sind elektrostatische Wechselwirkungen stärker und dies kann zu unerwünschter Bindung des Reporters an die voneinander weit entfernten anionischen Gruppen des Reagenz-Polymers führen. Im Gegensatz dazu kann, bei sehr hohen Salzkonzentrationen, die Abschirmung von elektrostatischen Ladungen die gewünschte Bindung des Reporters an die nahe zueinander angeordneten anionischen Gruppen des Analyt-Grundgerüsts verhindern. Die optimale Salzkonzentration des Bindungsmediums ist die maximale oder beinahe maximale Konzentration des einwertigen Salzes, welche eine adäquate elektrostatische Bindung des Reporters an das vollständig geladene Analyt-Grundgerüst erlaubt. Diese optimale Salzkonzentration kann durch Gleichgewichts-Dialysetechniken festgestellt werden, bei welchen die Bindung eines diffüsionsfähigen Reporters an ein nichtdiffüsionsfähiges Polynukleotid als eine Funktion der Salzkonzentration des Suspendierungs-Mediums gemessen wird. Optimale Ionenstärke-Bedingungen für die Bindung des Reporters an den Analyten können auch durch Binden des Reporters an immobilisiertes Polynukleotid unter Niedrigsalzbedingungen und Eluieren des Reporters mit einem Salzgradienten leicht festgestellt werden.
Die Bindungs-Komponenten in dem diagnostischen System, wie sie in dem diagnostischen Verfahren der Erfindung wirksam sind, sind nachfolgend in Figur 16 gezeigt. Hier bedeutet "S" den Festphasenträger mit einer Anzahl von Bindungs- Polymeren, welche an dessen Oberfläche über Spacer-Arme, angezeigt durch die Sägezahn-Linien, verknüpft sind, und die Verknüpfungen zwischen den Untereinheiten "m" und "p" stehen für ungeladene, stereoisomer definierte Methylphosphonat- bzw. geladene Phosphodiester-Verknüpfungen. Der Reporter hat einen dikationischen Schwanz und eine Reporter-Gruppe R. Aus Zwecken der Veranschaulichung besitzt jedes Polymer die Sequenz von Erkennungsgruppen, welche komplementär zu der ausgewählten 16-basigen Zielsequenz im Herpes simplex-Virus Typ I und II, wie in Beispiel XXI beschrieben, ist. Die Basen-komplementäre Bindung eines dieser Polymere an die Zielsequenz in einem Herpes simplex-Analyt-Polynukleotid ist gezeigt.
Der in der Figur gezeigte Reporter ist der dikationische Reporter aus Beispiel 34. Jeder Reporter ist daran angepaßt, über elektrostatische Anziehung an ein Paar benachbarter Phosphodiester-Bindungen in dem Polynukleotid, über elektrostatische Anziehung mit benachbarten Phosphodiester-Bindungen, zu binden. Die Reportermoleküle sind in ihrer erwartungsgemäßen Bindungskonfiguration gezeigt, worin im wesentlichen jede Phosphodiester-Bindung mit einem Reporter-Kation gepaart ist, und die Reportermoleküle Kopf an Kopf und Schwanz an Schwanz angeordnet sind. Unter der Annahme einer maximalen Dichte von gebundenen Reportermolekülen, kann davon ausgegangen werden, daß ein N-basiger Analyt bis zu etwa N/2 Reportermoleküle binden kann. Allgemeiner gesagt, führt das Testverfahren in Abhängigkeit von der Größe des Analyten und der relativen Anzahl sowohl der Reportergruppen als auch der kationischen Gruppen pro Reporter, leicht zur Bindung von Tausenden bis mehreren Hunderttausenden oder mehreren Reportermolekülen an jedes reagenzgebundene Analytmolekül. Die Nachweisempfindlichkeit kann deshalb um zwischen zwei und vier Größenordnungen größer sein als in existierenden Typen von Polynukleotid-basierenden Diagnostika, worin der Analyt-Nachweis im allgemeinen auf einem oder wenigen Sonden-Molekülen pro Analyt-Molekül beruht, wobei jede Sonde typischerweise ungefähr 100 Reporter-Gruppen enthält.
Nach Reaktion mit der Reporter-Lösung, typischerweise 1 bis 2 min lang bei Raumtemperatur, wird das Reagenz gewaschen, um ungebundenen Reporter zu entfernen und kann dann direkt nach gebundenem Reporter untersucht werden. Bei der Bestimmung der Menge von mit dem Reagenz assoziierten Reporter, kann es, insbesondere im Fall von fluoreszenten oder chromophoren Reporter-Gruppen, erwünscht sein, den Reporter mit einer Hochsalzlösung von dem Reagenz zu eluieren, und dann das Eluat nach dem Reporter zu untersuchen. Andere Typen von Reporter- Gruppen, wie etwa Enzyme, können leicht nachgewiesen werden, wobei die Reporter entweder an das Reagenz gebunden oder von dem Reagenz eluiert sind. Verfahren zur Bestimmung einer Vielzahl verschiedener Reporter-Gruppen, wie etwa den obenstehend erwähnten, sind wohlbekannt. Beispiel 36 und 37 veranschaulichen diagnostische Verfahren, welche auf dem Nachweis fluoreszenter bzw. enzymatischer Reporter beruhen.
Aus dem Vorangehenden kann ersehen werden, wie verschiedene Ziele und Merkmale der Erfindung erfüllt werden. Das diagnostische Reagenz kann einfach durch Reagenz- Polymerdesign für den Nachweis eines jeden Ribo- oder Desoxyribopolynukleotides mit einer einzigartigen Basenpaarsequenz maßgeschneidert werden. Ferner kann das Reagenz-Polymer angefertigt werden, um eine gegebene Zielsequenz mit hoher Sequenzspezifität bei einer angebrachten bzw. bequemen Temperatur zu binden.
Zum Nachweis von Doppelstrang-Polynukleotiden, kann die Reaktion unter Niedrigsalz- und/oder denaturierenden Bedingungen ausgeführt werden, welche eine Kompetition durch komplementäre Polynukleotid-Stränge um die Bindung des Analyten an das Reagenz verhindern. Dieses diagnostische System stellt deshalb den Vorteil des diagnostischen Festphasen-Systems für Polynukleotide mit einer Einzelsonde nach dem Stand der Technik dadurch zur Verfügung, daß Kompetition zwischen komplementären Strängen eliminiert wird, aber es vermeidet die ziemlich arbeitsaufwendigen Schritte, welche bei diesem System mit der Anknüpfung einzelsträngiger Test-Nukleinsäuren an den Festphasenträger assoziiert sind. Gleichzeitig verhindert das System die mit dem früher beschriebenen diagnostischen System für Polynukleotide mit zwei Sonden bzw. Dual- Sonde verbundenen Probleme dadurch, daß die Analyt-Detektion auf Kinetiken pseudoerster Ordnung beruht und nur ein sequenzspezifisches Bindungs-Polymer benötigt wird.
Gemäß einem anderen wichtigen Merkmal der Erfindung beruht die Reporterbindung an den Analyten auf sequenzunabhängigen elektrostatischen Wechselwirkungen anstatt auf sequenzspezifischer Bindung, wie in existierenden Typen von Polynukleotid-Diagnostika. Folglich kann der Reporter selbst relativ billig hergestellt werden, kann mit dem Analyten rasch und unter einer breiten Auswahl von Bedingungen reagieren, und kann, am wichtigsten, bei einer Dichte an den Analyten binden, welche im Bereich bis zu multiplen Reporter-Gruppen pro Polynukleotid-Untereinheit in dem Analyten liegt. Folglich kann die Sensitivität des diagnostischen Systems um den Bereich von 2 bis 4 oder mehr Größenordnungen größer als bei existierenden Tests sein, welche auf dem Nachweis von einer oder von wenigen Sonden beruhen, die eine beschränkte Anzahl von Reporter- Gruppen pro Analyt-Molekül enthalten.
Die folgenden Beispiele veranschaulichen Herstellung und Verwendung von gemäß bestimmten Ausführungsformen der Erfindung aufgebauten Testsystemen, sind aber keineswegs daraufhin ausgelegt, den Umfang der Erfindung zu beschränken.

Beispiel 1

Herstellung von Ribonukleosiden und Desoxyribonukleosiden

Die folgenden Nukleoside werden von Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, erhalten: Desoxyuridin, Desoxyguanosin, Thymidin, Desoxyadenosin, Desoxycytidin, 5-Bromdesoxyuridin, Desoxyinosin, 2,6-Diamino-9-(2-desoxy-β-D-erythro-pentofuranosyl)-9H-purin (2,6-Diaminopurindesoxyribosid), Uridin, Guanosin, 5-Methyluridin, Adenosin, Cytidin, 5-Bromouridin, Inosin.
2,6-Diamino-9-(β-D-ribofuranosyl)-9H-purin (2,6-Diaminopurinribosid) wird von Pfaltz und Bauer, Inc., Division of Aceto Chemical Co., Inc., Waterbury, CT erhalten.
Die folgenden Nukleoside werden durch die angegebenen Verfahren der Literatur hergestellt:
1-(2-Desoxy-β-D-erythro-pentofuranosyl)-2-pyrimidinon (2-Hydroxypyrimidindesoxyribosid) wird mittels dem Verfahren von P. Kohler, E. Volz, U. Sequin und C. Tamm in Nucleic Acid Chemistry (L. B. Townsend and R. S. Tipson, Hersg.) John Wiley and Sons, Inc. (1976) hergestellt.
1-(2-Desoxy-β-D-erythro-pentofuranosyl)-4-methoxy-2-pyrimidinon wird mittels dem folgenden Verfahren hergestellt:
1-(3',5'-Di-O-benzoyl-2-desoxy-β-D-erythro-pentofuranosyl)-4-methylthio-2-pyrimidinon (hergestellt wie in D. Cech und A. Holy, Collection of Czechoslov Chem. Comm. (1977), 42: 2246) wird mit 200 ml 0,2 M Natriummethoxid-Lösung behandelt. Die resultierende Lösung wird über Nacht bei Raumtemperatur stehen gelassen. Diese Lösung wird dann mit Dowex 50X8 (H+-Form) neutralisiert und filtriert; der Rückstand wird in Wasser (100 ml) gelöst, mit Ether (2,50 ml) extrahiert, und die wäßrige Phase wird eingedampft. Der Rückstand ist ein amorphes Material, welches direkt in den anschließenden Reaktionen verwendet wird.
2-Amino-9-(2-desoxy-β-D-erythro-pentofuranosyl)-1,9-dihydro-6H-purin-6-thion (Desoxythioguanosin) wird durch das Verfahren von R. H. Iwamoto, E. M. Acton und L. Goodman, J. Med. Chem. (1963) 6: 684 hergestellt.
1-(β-D-Ribofuranosyl)-2-pyrimidinon (2-Hydroxypyrimidinribosid) wird mittels dem Verfahren von U. Niedballa und H. Vorbruggen, J. Org. Chem. (1974) 39:3668 hergestellt
1-(2-Desoxy-β-D-ribofuranosyl)-4-methoxy-2-pyrimidinon (2-Hydroxypyrimidindesoxyribosid) wird mittels dem Verfahren von R. Wightman und D. Holy, Collection of Czechoslov Chem. Comm. (1973) 38: 1381 hergestellt.
2-Amino-9-(β-D-ribofuranosyl)-1,6-dihydro-6H-purin-6-thion (Thioguanosin) wird mittels dem Verfahren von J. J. Fox, I. Wempen, A. Hampton und I. L. Doerr, J. Amer. Chem. Soc. (1958) 80:1669 hergestellt.

Beispiel 2

Herstellung von Basen-geschützten Nukleotiden

Dimethoxytritylchlorid, N-Benzoyladenosin, N-Benzoyl-2'-desoxyadenosin, N-Benzoylcytidin, N-Benzoyl-2'-desoxycytidin und N-Isobutyryl-2'-desoxyguanosin werden von Sigma Chemicals, St. Louis, Missouri erhalten. 9-Fluorenylmethoxycarbonylchlorid (FMOC-Chlorid), Trimethylchlorosilan, Isobuttersäureanhydrid, 4-Nitrobenzoylchlorid und alle organischen Lösungsmittel für Reaktionen und Chromatographie werden von Aldrich Chemical Co., Milwaukee, Wisconsin, erhalten. Siliciumdioxid- bzw. Silica-Gel wird von EM Science, Cherry Hill, New Jersey erhalten.

2.1 Guanosin

Das N-2 - 9-Fluorenylmethoxycarbonyl-Derivat wird durch das nachstehende Verfahren hergestellt, welches allgemein für den Schutz von Nukleosidamino-Gruppen gilt:
Guanosin (1 mmol) wird in Pyridin (5 ml) suspendiert und mit Trimethylchlorsilan (5 mmol) behandelt. Nachdem die Lösung 15 Minuten lang gerührt worden ist, wird 9-Fluorenylmethoxycarbonylchlorid (5 mmol) zugegeben, und die Lösung wird 3 h bei Raumtemperatur gehalten. Die Reaktion wird in einem Eisbad abgekühlt, und Wasser (1 ml) wird zugegeben. Nach 5 Minuten langem Rühren wird konzentriertes Ammoniak (1 ml) zugegeben, und die Reaktion wird 15 Minuten lang gerührt. Die Lösung wird beinahe bis zur Trockenheit eingedampft, und der Rückstand wird in Chloroform (10 ml) gelöst. Diese Lösung wird mit Natriumbicarbonat-Lösung (5 ml, 10 %) gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Der Rückstand wird mehrere Male mit Toluol zusammen eingedampft bzw. co-evaporiert, und das Produkt wird auf Silicagel unter Verwendung eines Gradienten von Methanol in Methylenchlorid (0 - 50%) chromatographiert.
N-Isobutyrylguanosin wird mittels des Verfahrens von Letsinger und Miller, J. Amer. Chem. Soc. (1969) 91: 3356 hergestellt.
N-2 - Acetylguanosin wird mittels des Verfahrens von C. B. Reese und R. S. Saffhill, J. Chem. Soc. Perkin Trans. (1972) 1:2937 erhalten.

2.2 Desoxyguanosin

Das N-2 - 9-Fluorenylmethoxycarbonyl-Derivat wird nach dem Verfahren von J. Heikkla und J. Chattopadhyaya, Acta Chem. Scand. (1983) B37: 263 hergestellt.
Das N-2 - Acetyl-Derivat wird von Research Plus Inc., Bayonne, N.J. erhalten.

2.3. Desoxyadenosin

Das N-6 - 2-(4-Nitrophenyl)-ethoxycarbonyl-Derivat wird mittels des Verfahrens von F. Himmelsbach und W. Pfleiderer, Tetrahedron Lett. (1983) 24: 3583 hergestellt.
N-6 - 4-Nitrobenzoyl-2'-desoxyadenosin wird unter Verwendung des obenstehenden Verfahrens für FMOC-Guanosin hergestellt, mit der Ausnahme, daß 4-Nitrobenzoylchlorid anstelle des FMOC-Chlorid eingesetzt wird.
Das N-6 2-(Phenylsulfonyl)-ethoxycarbonyl-Derivat wird mittels des Verfahrens für FMOC-Guanosin hergestellt, mit der Ausnahme, daß das 2-(Phenylsulfonyl)- ethylchlorformiat (erhalten von N. Balgobin, S. Josephson und B. Chattopadhyaya, Tetrahedron Lett. (1981) 22: 3667) als das Acylierungsmittel verwendet wird, und N-Methylimidazol oder Pyridin als das Lösungsmittel verwendet wird.

2.4 Adenosin

Das N-6 - 2-(4-Nitrophenyl)-ethoxycarbonyl-Derivat wird mittels des Verfahrens von F. Himmelsbach und W. Pfleiderer, Tetrahedron Lett. (1983) 24: 3583 hergestellt.
N-6 - 4-Nitrobenzoyladenosin wird unter Verwendung des oben genannten Verfahrens für FMOC-Guanosin hergestellt, mit der Ausnahme daß 4-Nitrobenzoylchlorid anstelle von FMOC-Chlorid eingesetzt wird.
Das N-6 - 2-(Phenylsulfonyl)-ethoxycarbonyl-Derivat wird mittels dem Verfahren für FMOC-Guanosin hergestellt, mit der Ausnahme, daß das 2-(Phenylsulfonyl)- ethylchloroformiat (erhalten von N. Balgobin, S. Josephson und B. Chattopadhyaya, Tetrahedron Lett. (1981) 22: 3667) als das Acylierungsmittel verwendet wird, und N-Methylimidazol oder Pyridin als das Lösungsmittel verwendet wird.

2.5 Desoxycytidin

Das N4 - 2-(4-Nitrophenyl)-ethoxycarbonyl-Derivat wird mittels des Verfahrens von F. Himmelsbach und W. Pfleiderer, Tetrahedron Lett. (1983) 24: 3583 hergestellt.
Das N-6 - 2-(Phenylsulfonyl)-ethoxycarbonyl-Derivat wird mittels des Verfahrens für FMOC-Guanosin hergestellt, außer daß das 2-(Phenylsulfonyl)-ethylchloroformiat (erhalten von N. Balgobin, S. Josephson und B. Cattopadhyaya, Tetrahedron Lett. (1981) 22: 3667) als das Acylierungsmittel verwendet wird, und N-Methylimidazol oder Pyridin als das Lösungsmittel verwendet wird.

2.6 Cytidin

Das N-4 - 2-(4-Nitrophenyl)-ethoxycarbonyl-Derivat wird mittels des Verfahrens von F. Himmelsbach und W. Pfleiderer, Tetrahedron Lett. (1983) 24: 3583 hergestellt.
Das N-6 - 2-(Phenylsulfonyl)-ethoxycarbonyl-Derivat wird mittels des Verfahrens für FMOC-Guanosin hergestellt, mit der Ausnahme, daß das 2-(Phenylsulfonyl)- ethylchloroformiat (erhalten von N. Balgobin, S. Josephson und B. Chattopadhyaya, Tetrahedron Lett. (1981), 22: 3667) als das Acylierungsmittel verwendet wird, und N- Methylimidazol oder Pyridin als das Lösungsmittel verwendet wird.

2.7 2,6-Diaminopurinribosid

Das N-2,N-6-Bis(9-Fluorenylmethoxycarbonyl)-Derivat von 2,6-Diaminopurinribosid wird mittels des allgemeinen Verfahrens hergestellt.
Das N-2,N-6-Bis(isobutyryl)-Derivat wird mittels des allgemeinen Verfahrens hergestellt.

2.8 2.6-Diaminopurin-2'-desoxyribosid

Das Bis-N-2,N-6-(9-fluorenylmethoxycarbonyl)-Derivat von 2,6-Diaminopurin-2'- desoxyribosid wird mittels des allgemeinen Verfahrens hergestellt.

2.9 Thioguanosin

Das N-2 - 9-Fluorenylmethoxycarbonyl-Derivat von Thioguanosin wird mittels des allgemeinen Verfahrens hergestellt.

2.10 2'-Desoxythioguanosin

Das N-2 - 9-Fluorenylcarbonyl-Derivat von 2'-Desoxythioguanosin wird mittels des allgemeinen Verfahrens hergestellt.

Beispiel 3

Herstellung von 5'-Amino-2',5-didesoxyribonukleosid-Untereinheiten.

Tetrabromkohlenstoff, Natriumazid, p-Toluolsulfonylchlorid (Tosylchlorid), Triphenylphosphin und 10 % Palladium auf Aktivkohle werden von Aldrich Chem. Co. erworben. Lithiumazid wird von Kodak-Laboratory and Specialty Chemicals erhalten.

3.1 Allgemeines Verfahren

Die in diesem Beispiel angewandten Nukleoside sind Thymidin, N6-Benzoyl-2'- desoxyadenosin, N4-Benzoyl-2'-desoxcytidin und 2'-Desoxyinosin, 2-Hydroxypyrimidin-2'-desoxyrosid und das N2-N6-Bisisobutyryl-Derivat von 2'6-Diaminopurin-2'- desoxyribosid (siehe Beispiel 1). Das benötigte getrocknete Nukleosid (1 mmol) wird in ein Reaktionsgefäß eingewogen, welches Triphenylphosphin (1,01 mmol) und Lithiumazid (5 mmol) enthält. Nachdem die Feststoffe in DMF suspendiert sind, wird Tetrabromkohlenstoff (1,0 mmol) in das Gefäß zugegeben. Die Lösung wird 24 h lang bei Raumtemperatur gerührt. Nach Quenchen der Reaktion mit Methanol wird die Lösung bis zur Trockenheit eingedampft. Der Rückstand wird auf Silicagel chromatographiert, wobei mit Methanol/Chloroform-Mischungen eluiert wird, um das gewünschte 5'-Azido-2',5'-desoxynukleosid zu erhalten.
Das 5'-Azidonukleosid (1 mmol) wird in Ethanol gelöst. Die Hydrierung in der Gegenwart von 10 % Palladium auf Aktivkohle (katalytische Menge) unter einer Wasserstoffatmosphäre (35 psi) findet über 10 h lang statt. Die Lösung wird filtriert, und Evaporation bzw. Verdampfung unter reduziertem Druck liefert einen rohen Feststoff. Der Feststoff wird durch Trituration mit dem angemessenen Lösungsmittel gereinigt.

3.2 5'-Azidouridin-Derivat

Das 5'-Azido-Derivat von 5-Brom-2'-desoxyuridin wird mittels des obenstehend beschriebenen Verfahrens hergestellt. Das 5'-Azido-t-brom-2'-desoxyuridin (1 mmol) wird mit Triphenylphosphin (1,5 mmol) in Pyridin 2 h lang bei Raumtemperatur behandelt. Konzentrierter Ammoniak (1 ml) wird in das Reaktionsgefäß zugegeben. Nach 14 h wird das Lösungsmittel unter Vakuum entfernt. Der Rückstand wird in THF gelöst, und diese Lösung wird zu Hexanen zugegeben. Der Niederschlag wird gesammelt, und der Feststoff mit dem geeigneten Lösungsmittel trituriert, um das 5'- Amino-5-brom-2'-desoxyuridin zu gewinnen.

3.3 5'-Azidoguanosin

Eine alternative Herstellung von 5'-Amino-2',5'-didesoxyguanosin ist, das geschützte 2'-Desoxyguanosin (geschützt entweder an dem N-2-Acetyl, oder das N-2-FMOC- Derivat) (1 mmol) mit Tosylchlorid (1,3 mmol) in Pyridin bei 0ºC über Nacht zu behandeln. Die Lösung wird zur Trockenheit eingedampft, und der Rückstand in Chloroform gelöst. Die resultierende Lösung wird zweimal mit wäßrigem Natriumbicarbonat gewaschen, und über Natriumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wird eingedampft und der Rückstand auf Silicagel chromatographiert, wobei mit Methanol/Chloroform-Mischungen eluiert wird. Das resultierende Tosylat (1 mmol) wird einige Stunden lang bei 80 bis 100ºC mit Natriumazid (6 mmol) in DMF behandelt. Das Lösungsmittel wird durch Rotationsverdampfüng (Rotovap) entfernt, und der Rückstand wird auf Silicagel chromatographiert, wobei mit Chloroform/Methanol-Lösungsmittelgemischen eluiert wird. Das Azid wird unter Verwendung des obenstehenden Verfahrens zu dem gewünschten Amin reduziert.
Alternative Schutzgruppen für die Basen-Stickstoffe von 2'-Desoxycytidin, 2'-Desoxyadenosin, 2'-Desoxyguanosin und 2,6-Diaminopurindesoxyribosid sind 2-(Phenylsulfonyl)ethoxycarbonyl für 2'-Desoxycytidin und 2'-Desoxyadenosin, und die Verwendung von 9'-Fluorenylmethoxycarbonyl (FMOC), um 2'-Desoxyguanosin und 2,6-Diaminopurindesoxyribosid wie in Beispiel 2 zu schützen.

Beispiel 4

Herstellung von 3'-Amino-2',3'-didesoxyribonukleosid-Untereinheiten

Thymidin wird zu 5'-O-Acetyl-3'-azido-2',3'-didesoxythymidin umgewandelt, und dieses wird mittels des Verfahrens von M. Imazawa und F. Eckstein, J. Org. Chem. (1978) 43: 3044 zu 3'-Azido-2',3'-didesoxyadenosin und 3'-Azido-2',3'-didesoxyguanosin umgesetzt. Die basische Gruppe des 3'-Azidoadenosins wird entweder als das Benzoyl- oder das 2- (Phenylsulfonyl)ethoxycarbonyl-Derivat geschützt (wie in Beispiel 1 gezeigt). N-2 des 3'- Azidoguanosins wird entweder als das Acetyl- oder FMOC-Derivat (siehe Beispiel 1) geschützt. Die Reduktion dieser 3'-Azido-Funktionen zu den 3'-Amino-2',3'- didesoxyribonukleosiden wird wie in Beispiel 3 gezeigt durchgeführt.

Beispiel 5

Herstellung von Untereinheiten vom Morpholino-Typ welche aus Ribonukleosiden abgeleitet sind

Ammoniumbiborat, Natrium-m-perjodat, Natriumcyanoborhydrid, Uridin, N4-Benzoylcytidin und N6-Benzoyladenosin werden von Sigma Chemical Co. erhalten. N2-Isobutyrylguanosin wird mittels dem allgemeinen Verfahren von Letsinger und Miller (J. Amer. Chem. Soc. (1969) 91: 3356) hergestellt. 2-Phenyl-2-propanol und Bis(p-nitrophenyl)carbonat werden von Aldrich Chemical Co. erhalten.
Das Morpholino-Derivat von Uridin wird durch Auflösen von 1 mmol Uridin plus 2 mmol Ammoniumbiborat (NH&sub4;)&sub2; B&sub2;O&sub7; in 5 ml Wasser hergestellt. Während dem Rühren in einem vor direktem Licht geschützten Eisbad werden 1,2 mmol Natrium-m- perjodat in 5 ml Wasser zugegeben. Nach 90 min, werden 0,2 ml 1,2-Propandiol zugegeben, und das Rühren wird 10 min lang bei Raumtemperatur fortgesetzt. Danach werden, unter Rühren in einen gut-ventilierten Abzug, 0,25 g Natriumcyanoborhydrid, gelöst in 3 ml Wasser, zugegeben, und die Mischung wird 4 h lang bei Raumtemperatur gerührt. Danach wird die Reaktionsmischung unter Vakuum in einem Warmwasserbad zu einem Öl reduziert, in einem minimalen Volumen von Methanol resuspendiert, auf eine Silica-Gelchromatographie-Säule aufgetragen, und die Säule wird mit Methanol/1 % Triethylamin eluiert. Das Morpholino-Produkt eluiert von der Säule als eine scharfe Bande, welche sich signifikant langsamer bewegt als das ursprüngliche Ribonukleosid und dessen Oxidations-Produkte. Das Morpholino-Produkt weist ein im wesentlichen zu dem Ausgangs-Ribonukleosid identisches UV-Spektrum auf, aber seine Masse ist um 17 Dalton geringer (ermittelt durch massenspektrometrische Analyse unter Verwendung von Aktivation durch Bombardierung mit schnellen Atomen).
Der Morpholinostickstoff wird als nächstes durch Reagieren des Produktes mit 2-Phenylisopropylphenylcarbonat geschützt. Das erforderliche aktive Carbonat wird im wesentlichen mittels dem Verfahren von Sandberg und Ragmarsson (Int. J. Peptide Protein Res. (1974) 6: 111) hergestellt und mit der Morpholino-Untereinheit zur Reaktion gebracht. Schließlich kann, falls gewünscht (in Abhängigkeit von dem zu verwendenden Verfahren für den Untereinheit-Einbau in Polymere), die Hydroxyl- Gruppe an der Position, welche der ursprünglichen 5'-Position entspricht, durch Auflösen der N-geschützten Untereinheit in einem minimalen Volumen von trockenem Dimethylformamid und Zugeben von 2 Äquivalenten Bis(p-nitrophenyl)carbonat plus 0,2 Äquivalenten Triethylamin, N-Methylimidazol oder N,N-Dimethylaminopyridin aktiviert werden. Nach 3 h bei Raumtemperatur wird die Reaktionsmischung hinsichtlich ihres Volumens unter Vakuum in einem Warmwasserbad reduziert. Der dickflüssige Sirup wird in einem kleinen Volumen Dichlormethan resuspendiert und auf eine Silicagel-Säule aufgetragen, welche anschließend mit einer Mischung aus Dichlormethan/Ether (1:1 Vol.-Verhältnis) zu 0,2 Vol.-% in N,N-Dimethylanilin eluiert wird. Mit diesem Lösungsmittelsystem bewegt sich das aktivierte Produkt wesentlich langsamer als p-Nitrophenol und Bis(p-nitrophenyl)carbonat, aber viel schneller als das nicht reagierte Ausgangsmaterial. Das aktivierte Produkt wird auf Silicagel TLC (Dünnschichtchromatographie)-Platten einfach durch Exposition an Ammoniakdämpfe leicht sichtbar gemacht, woraufhin ein gelbes Nitrophenolat-Ion innerhalb von ein bis zwei Minuten erzeugt wird.
Andere Ribonukleoside (Basen, wo notwendig, geschützt wie in Beispiel 2) werden in durch die im wesentlichen gleichen Verfahren ihre entsprechenden Morpholino-Derivate umgewandelt -- obwohl variierende Mengen von Methanol zugegeben werden müssen, um Auflösung der geschützten Ribonukleoside vor dem initialen bzw. anfänglichen Perjodat-Oxidationsschritt zu bewirken.
Wenn die Untereinheiten vom Morpholino-Typ über Thiocarbamat-Verknüpfungen gekoppelt werden sollen, sind die bevorzugten Basen-Schutzgruppen für die gewöhnlichen Ausgangs-Ribonukleoside: Die Phenylsulfonylethoxycarbonyl-Gruppe für Cytidin und Adenosin, und die 9-Fluorenylmethoxycarbonyl-Gruppe für Guanosin.

Beispiel 6

Herstellung von 5'-Acetyl-2',5'-didesoxyribonukleosid-Untereinheiten

Triethylamin, Pyridin/Schwefeltrioxid-Komplex, p-Nitrophenol, Dicyclohexylcarbodiimid und 40%iges wäßriges Dimethylamin werden von Aldrich erhalten.
3'-O-tert-Butyldimethylsilyl-N-2-(phenylsulfonyl)ethoxycarbonyladenosin (1 mmol), hergestellt wie in Beispiel 12.1, wird bei 0ºC in Methylenchlorid und Dimethylsulfoxid (10 ml, 1/1, v/v) gelöst, und Triethylamin (3 mmol) und der Pyridin/Schwefeltrioxid- Komplex (3 mmol) werden zugegeben. Die Mischung wird 1 h lang bei dieser Temperatur gerührt, dann mit Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und unter reduziertem Druck eingedampft. Der Rückstand wird in trockenem Pyridin (10 ml) gelöst und mit Benzyloxycarbonylmethylentriphenylphosphoran (1,5 mmol) 24 h lang bei 37ºC behandelt. Die Mischung wird dann unter reduziertem Druck bis zur Trockenheit eingedampft, und der Rückstand in Methylenchlorid gelöst, mit verdünnter HCl und Wasser gewaschen, dann werden die organischen Phasen über Natriumsulfat getrocknet, und das Lösungsmittel unter reduziertem Druck entfernt. Der Rückstand wird auf Silica unter Verwendung eines Gradienten von Methanol in Chloroform (0 bis 20 %) chromatographiert.
Der ungesättigte Ester (1 mmol) aus dem vorhergehenden Abschnitt wird in Ethylacetat/Ethanol (40 ml 1/1, v/v) enthaltend Cyclohexadien (5 ml) und 10 % Palladium auf Aktivkohle (100 mg) gelöst, und die Suspension wird 5 bis 24 h lang unter einer Stickstoffatmosphäre kräftig geschüttelt. Die Mischung wird filtriert, und die Lösungsmittel werden unter reduziertem Druck entfernt. Der Rückstand wird auf einem Silicagel unter Verwendung eines Gradienten von Methanol in Chloroform (5 bis 50 %) chromatographiert.
Zu einer 0,2 bis 0,5 M Lösung der Säure aus dem vorangehenden Abschnitt in Ethylacetat (oder Methylenchlorid) wird p-Nitrophenol in einem etwa 20 %igen Überschuß zugegeben. Die berechnete Menge von Dicyclohexylcarbodiimid wird bei 0ºC zu der Lösung zugegeben. Nach 0,5 h wird die Mischung auf Raumtemperatur kommen gelassen, und sie wurde 1 h lang dabei gehalten. Der Dicyclohexylharnstoff, welcher sich abtrennte, wird filtriert und mit Lösungsmittel gewaschen. Die mit dem Filtrat vereinigten Waschungen, werden unter reduziertem Druck zur Trockenheit eingedampft. Der Ester kann direkt für Kopplungsreaktionen verwendet werden oder kann durch kurze Säulenchromatographie auf Silica unter Verwendung eines Isopropanol-in- Chloroform-Gradienten (0 bis 50 %) gereinigt werden.
Die analoge Folge von Reaktionen kann mit den anderen, geeignet geschützten, 2'-Desoxynukleosiden durchgeführt werden.
Der aktive Ester (1 mmol) wird mit 40 %igem wäßrigen Dimethylamin (2 mmol) in Methanol behandelt, um das N,N-Dimethylamid der N-geschützten 3'-O-tert- Butyldimethylsilyl-2',5'-didesoxyadenosin-5'-essigsäure zu bilden. Die Lösungsmittel werden durch Verdampfung unter reduziertem Druck entfernt, und der Rückstand wird unter Verwendung des in B. L. Gaffney und R. A. Jones, Tetrahedron Lett. (1982) 23: 2257 beschriebenen 2 M HF/1M tert-Butylammoniumfluorid (TBAF-Reagenz) desilyliert. Zu den 2M HF/1M tert-Butylammoniumfluorid in Pyridin (1 mmol TBAF) wird das entschützte Nukleosid aus dem vorangehenden Abschnitt zugegeben. Nach 24 h langem Rühren wird die Reaktion zwischen Methylen und wäßrigem Natriumbicarbonat partitioniert. Die organische Phase wird mit Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet, und zur Trockenheit eingedampft. Der Rückstand wird durch Chromatographie auf Silica unter Verwendung eines Gradienten von Methanol in Methylenchlorid (5 bis 25 %) gereinigt.

Beispiel 7

Herstellung von Purin- und Pyrimidinpyrrolidonen

Kalium-t-butoxid, Anisoylchlorid, 6-Chlorpurin, 10 % Palladium auf Aktivkohle, Phthaloylchlorid, 2-Amino-6-chlorpurin, 20 % wäßriges Tetraethylammoniumhydroxid, 25 % wäßriges Trimethylamin, 2-Pyrimidinon, N-Bromsuccinimid, Trifluoressigsäure, 4-Nitrophenol und N'N-Disuccinimydylcarbonat werden von Aldrich erhalten. Lithiumazid wird von Eastman Kodak, Rochester, New York erhalten. C18-Umkehrphasen-Silicagel wird von Whatman, Hillsboro, Oregon erhalten.

7.1. Herstellung von (S)-5-[(4-Amino-2-oxopyrimidinyl)methyl]pyrrolidon (im folgenden bezeichnet als das Cytosin-Pyrrolidon)

Cytosin (2,2 mmol) wird in Dimethylsulfoxid (2 ml) gelöst, das Kalium-tert-butoxid (2 mmol) enthielt. Diese Lösung wird in einen Kolben gegeben, welcher (S)-5- (Tosyloxymethyl)-2-pyrrolidon (1 mmol), hergestellt nach dem Verfahren von E. Hardegger und H. Ott, Helv. Chim. Acta (1955) 38: 312) enthielt. Nach dem Auflösen wird die Mischung 6 h lang bei 25ºC gerührt. Die Mischung wird mit Essigsäure (2 mmol) neutralisiert und unter reduziertem Druck eingedampft. Der Rückstand wird in Dimethylformamid (5 ml) aufgenommen und unter reduziertem Druck eingedampft, und dieses Vorgehen wird dreimal wiederholt.

7.2. Herstellung von N-4-Anisoylcytosin-pyrrolidon

Die Mischung aus dem vorstehenden Paragraphen wird in Pyridin oder N-Methylimidazol (10 ml) gelöst und mit Anisoylchlorid (2,8 mmol) bei Raumtemperatur behandelt. Nach 2 h langem Rühren wird die Mischung mit Eis (0,5 g) gequencht. Nach 5 min wurde 1 ml 29%iger Ammoniak zugegeben. Nach 15 min bei Raumtemperatur wird die Lösung in Ethylacetat (15 ml) aufgelöst und zweimal mit Kochsalzlösung (15 ml) gewaschen. Die Waschungen werden vereinigt und mit Ethylacetat (2 x 30 ml) gewaschen, die vereinigten organischen Phasen mit Natriumsulfat getrocknet und unter reduziertem Druck eingedampft. Der Rückstand wird mehrere Male mit Toluol coevaporiert, und der Rückstand wird auf Silicagel mit einem Gradienten von Methanol in Methylenchlorid (0 - 20 %) chromatographiert.

7.3 Herstellung von 6-Chlorpurinpyrrolidon

Diese Verbindung wird hergestellt wie bei der Alkylierung von Cytosin, außer daß die Alkylierung an 6-Chlorpurin durchgeführt wird, und die Mischung mehrere Stunden lang auf 35 bis 95ºC erwärmt wurde. Die Mischung wird auf Raumtemperatur abgekühlt, mit Essigsäure (2 mmol) neutralisiert und unter reduziertem Druck eingedampft und mit einer Mischung 20 % Methanol/Chloroform und 10 % Natriumbicarbonat ausgeschüttelt. Die waßrige Phase wird mit Chloroform gewaschen, die vereinigten organischen Phasen werden über Natriumsulfat getrocknet und unter reduziertem Druck eingedampft. Der Rückstand wird auf Silicagel unter Verwendung eines Gradienten von Methanol in Chloroform (0 bis 25 %) chromatographiert.

7.4 Herstellung von 6-Azidopurinpyrrolidon

Das 6-Chlorpurinpyrrolidon (1 mmol) wird mit Lithiumazid (2 mmol) in Dimethylsulfoxid (2 ml) mehrere Stunden lang bei 30ºC - 100ºC behandelt. Am Ende dieser Zeit wird die Mischung unter reduziertem Druck eingedampft, in Chloroform gelöst, mit 10 % Natriumbicarbonat gewaschen, und die organische Phase wird über Natriumsulfat getrocknet und unter reduziertem Druck konzentriert. Der Rückstand wird auf Silica unter Verwendung eines Gradienten von Methanol in Chloroform (0 bis 25 %) chromatographiert.

7.5 Herstellung von Adenosinpyrrolidon

Das Azid aus dem vorhergehenden Beispiel wird durch Schütteln des Azides (1 mmol) mit 30 Pfund Wasserstoffdruck in einer Lösung von Ethanol (10 ml) mit Palladium auf Aktivkohle (100 mg, 10 Gew.-% Pd) 24 h lang hydriert. Die Lösung wird durch Celite filtriert, und das Lösungsmittel wird eingedampft. Der Rückstand wird direkt für den nächsten Schritt verwendet.

7.6. Herstellung von N-6-Phthaloyladenosinpyrrolidon

Die Phthaloyl-Gruppe wird an der Position N-6 durch die Acylierung des Adenosinpyrrolidons (1 mmol) mit Phthaloylchlorid (1,4 mmol) eingeführt, wobei das obengenannte Verfahren für die Anisoylierung von Cytidin verwendet wurde, außer daß bei der Aufarbeitung kein Ammoniak zugegeben wurde.

7.7. Herstellung von 2-Amino-6-chlorpurinpyrrolidon

Das Pyrrolidontosylat wird mit 2-Amino-6-chlorpurin wie bei der Herstellung des 6-Chlorpurin-Derivates alkyliert.

7.8 Herstellung von Guaninpyrrolidon

Das Chlorpurinpyrrolidon (1 mmol) aus dem vorhergehenden Abschnitt wird in Diglyme (10 ml) und 25 % wäßrigem Trimethylamin (2 ml) gelöst. Die Lösung wird 5 h lang bei Raumtemperatur gerührt, Wasser (10 ml) wird zugegeben, und die Mischung wird unter reduziertem Druck auf 10 ml konzentriert. Essigsäure (2 ml) wird zugegeben, und die Mischung wurde unter vermindertem Druck zu einem Öl eingedampft. Der Rückstand, welcher Tetraethylammoniumacetat enthält, wird direkt für den nächsten Schritt verwendet.

7.9 Herstellung von N-2-Acetylguaninpyrrolidon

Guaninpyrrolidon (1 mmol) aus dem vorhergehenden Abschnitt wird mit Essigsäureanhydrid (5 ml) 2 h lang unter Rückfluß zur Reaktion gebracht. Das Lösungsmittel wird eingedampft, und der Rückstand wird mit Dimethylformamid coevaporiert. Der Rückstand wird in Methanol (5 ml), gesättigt mit Ammoniak bei 0ºC, gelöst, und die Lösung wird 2 h lang bei dieser Temperatur gerührt. Das Lösungsmittel wird unter reduziertem Druck verdampft, und der Rückstand durch Chromatographie auf einer kürzen Säule aus Silica unter Verwendung eines Gradienten von Methanol in Chloroform (5 bis 50 %) gereinigt.

7.10 Herstellung von 2-Amino-6-azidopurinpyrrolidon

Diese Verbindung wird aus dem 2-Amino-6-chlorpurinpyrrolidon durch Verwendung des Verfahrens von Beispiel 7.4. hergestellt, mit der Ausnahme, daß die Reaktion längere Zeiten erfordert, und bei einer höheren Temperatur durchgeführt wurde.

7.11 Herstellung von 2,6-Diaminopurinpyrrolidon

Diese Verbindung wird, wie für das Adenosinpyrrolidon gültig, durch Reduktion des 2-Amino-6-azidoderivates hergestellt.

7.12. Herstellung von N-2-Acetyl-N-6-phthaloyl-2,6-diaminopurinpyrrolidon

Die Acetyl-Gruppe wird durch das oben genannte Verfahren für N-2 - Acetylguanidinpyrrolidon eingeführt, mit der Ausnahme, daß die methanolische Ammoniak-Behandlung 8 h durchgeführt wird. Die Lösungsmittel werden eingedampft und der Rückstand wird phthaloyliert, wie für das Adenosin-Derivat.

7.13. Herstellung von Inosinpyrrolidon

6-Chlorpurinpyrrolidon (1 mmol) wurden mittels dem für die Herstellung des Guaninpyrrolidon-Derivates verwendeten Verfahrens in das Inosin-Derivat umgewandelt. Die Verbindung wird durch Chromatographie auf Silica unter Verwendung eines Gradienten von Methanol in Chloroform (5 bis 25 % gereinigt).

7.14 Herstellung von 2-Hydroxypyrimidinpyrrolidon

Diese Verbindung wird durch die Alkylierung von 2-Pyrimidinon durch das für die Herstellung des 6-Chlorpurin-Derivates verwendete Verfahren erhalten.

Beispiel 8

Herstellung von Purin- und Pyrimidin-t-BOC-Aminosäuren

Das im folgenden für das Cytosinpyrrolidon beschriebene allgemeine Verfahren kann auf alle geeignet geschützten Pyrrolidon-Derivate angewendet werden. Das als die t-BOC- Säure bezeichnete Produkt wird durch Spaltung des Pyrrolidon-Ringes in eine Säure und ein t-BOC-Amin gebildet.

8.1. Herstellung der Cytosin-t-BOC-Säure

N-4-Anisoylcytosinpyrrolidon (1 mmol) wird in Methylenchlorid (0,5 M Lösung) gelöst, welches Di-tert-butyldicarbonat (2 mmol), Triethylamin (1 mmol) und Dimethylaminopyridin (1 mmol) enthält. Die Lösung wird 10 h lang bei Raumtemperatur gerührt. Die volatilen bzw. leicht flüchtigen Stoffe werden entfernt, und der Rückstand wird auf Silica unter Verwendung eines Gradienten von Methanol in Chloroform (0 bis 20 %) gereinigt. Der Rückstand wird in Tetrahydrofuran (0,2 M Lösung) gelöst, zu welchem dann Lithiumhydroxid (3 mmol, als eine 1 M Lösung) zugegeben wird. Nach 5 h bei Raumtemperatur wird die Lösung durch Zugabe von 10 % Essigsäure (3 mmol) neutralisiert, und die Lösungsmittel werden unter reduziertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde in 9 N Ammoniak gelöst und bei Raumtemperatur 1 bis 10 h lang gerührt. Das Lösungsmittel wird unter reduziertem Druck entfernt, und der Rückstand wird durch Chromatographie auf C18-Umkehrphasen-Silicagel unter Verwendung von Mischungen aus Wasser und Methanol (oder Trifluorethanol) gereinigt.

8.2. Herstellung der Uracil-t-BOC-Säure

Diese wird durch das folgende Verfahren aus der Cytosin-t-BOC-Säure hergestellt:
Die Cytosin-t-BOC-Säure (1 mmol) wird in wäßriger Essigsäure gelöst und bei 4ºC mit Natriumnitrit (1 mmol) behandelt. Die Mischung wird 1 h lang gerührt und unter reduziertem Druck zur Trockenheit eingedampft. Das Produkt wird durch Chromatographie auf C18-Umkehrphasen-Silicagel unter Verwendung von Wasser- und Methanol- (oder Trifluorethanol-) Mischungen gereinigt.

8.3. Herstellung von 5-Bromuracil-t-BOC-Säure

Diese Verbindung wird aus der Uracil-t-BOC-Säure durch das folgende Verfahren erhalten:
Die Uracil-t-BOC-Säure (1 mmol) wird in DMF (3 ml) gelöst und mit N-Bromsuccinimid (1,2 mmol) behandelt. Die Lösung wird 16 h lang bei Raumtemperatur stehen gelassen. Nach Entfernen der Lösungsmittel unter reduziertem Druck wird das Produkt durch Chromatographie auf C18-Umkehrphasen-Silicagel unter Verwendung von Wasser- und Methanol- (oder Trifluorethanol)-Mischungen gereinigt.

8.4. Herstellung von N-geschützter t-BOC-Säure

Dieses allgemeine Verfahren für die Acylierung der exocyclischen Amino-Gruppen des Erkennungsteiles ist ebenfalls für die Schützung des Adenosin-Derivates anwendbar.
Die Cytosin-t-BOC-Säure (1 mmol) aus dem vorhergehenden Abschnitt wird in N-Methylimidazol oder Pyridin (5 ml) gelöst und mit Chlortrimethylsilan (5 mmol) behandelt. Nach 15 min bei Raumtemperatur wird die Lösung mit 2-(4-Nitrophenyl)ethylchlorformiat (3 mmol), erhalten von F. Himmelsbach und W. Pfleiderer, Tetrahedron Lett. (1983) 24: 3583) behandelt. Die Reaktion wird 8 h lang bei Raumtemperatur gehalten, dann in einem Eisbad abgekühlt, und Wasser (1 ml) wurde zugegeben. Nach 5 min wird 1 ml konzentrierter Ammoniak zugegeben, und die Mischung wird 15 min lang bei RT gerührt. Die Reaktion wird dann bis zur Trockenheit eingedampft, und der Rückstand in Wasser aufgelöst. Die Lösung wird mit 2 N HCl saurer gemacht und mit Chloroform exträhiert. Die vereinigten organischen Extrakte werden über Natriumsulfat getrocknet und unter reduziertem Druck eingedampft. Der Rückstand wird durch Chromatographie auf Silica unter Verwendung eines Gradienten von Methanol in Chloroform (5 bis 50 %) gereinigt.
Zur Schützung der Guanin- und 2,6-Diaminopurin-Derivate wurde das obenstehende Verfahren so modifiziert, daß die Reaktion in Pyridin ausgeführt wurde, und das Acylierungsmittel 9-Fluorenylmethylchlorformiat war.

Beispiel 9

Herstellung von Purin- und Pyrimidinaminosäuren

Das folgende Verfahren ist für alle Derivate anwendbar. Es entfernt die t-BOC-Gruppe und setzt die primäre Amino-Gruppe des Grundgerüsts frei.
Die t-BOC-Säure (1 mmol) wurde in 20 % Trifluoressigsäure in Methylenchlorid (5 ml) gelöst und bei Raumtemperatur 30 min lang gerührt. Toluol (3 ml) wird zugegeben, und die Lösungsmittel werden unter reduziertem Druck eingedampft, um das Trifluoracetatsalz der Aminosäure zu ergeben. Dieses wird direkt für Kopplungsreaktionen verwendet.

Beispiel 10

Herstellung von Untereinheiten für den Zusammenbau von achiralen acyclischen Polynukleotid-Analogen

10.1. Herstellung des Cytidin-Analoges

Lithiumborhydrid, Di-tert-butyldicarbonat und Bis(triphenylphosphin)palladium-II- chlorid wurden von Aldrich Chemical Co. Milwaukee, WI., erhalten. 2-Amino-5- brompyrimidin wird wie in T. Nishikawa, Chem. Pharm. Bull., 9: 38 (1961) hergestellt.
2-Amino-5-brompyrimidin wird an der exocyclischen Amino-Gruppe durch das allgemeine Verfahren in Beispiel 2 unter Verwendung von Benzoylchlorid benzoyliert. Das Benzamid-Produkt (25 mmol) wird in ein 45 ml-Druckgefäß zugegeben, welches Triethylamin (10 ml), Benzol (10 ml) und Bis(triphenylphosphin)palladium-II-chlorid (0,375 mmol) enthält. Das Druckgefäß wird mit Argon gespült, versiegelt und mit Kohlenmonoxid auf 600 psi Druck gebracht, und dann mit Wasserstoff auf 1200 psi Druck gebracht. Das Reaktionsgefäß wird in einem Ölbad unter Rühren auf 145ºC erwärmt. Nachdem alle Gasabsorption zurückgegangen war, wird die Reaktion abgekühlt und die Gase langsam entlüftet. Nach Zugabe von wasserfreiem Ether wird die Reaktionsmischung filtriert und im Vakuum eingedampft. Das Produkt wurde im Anschluß an Chromatographie in Silicagel unter Verwendung eines Gradienten von Isopropanol in Methylenchlorid (0 bis 20 %) isoliert.
Das 2-Benzamidpyrimidin-5-carboxaldehyd (1 mmol) aus dem vorherigen Abschnitt wird in Ethanol (5 ml) gelöst und mit 4-Aminobuttersäure (1 mmol) und Triethylamin (1 mmol) behandelt. Nach einstündigem Rühren wird die Mischung bei 30 psi unter Verwendung von 10 % Palladium auf Aktivkohle (100 mg) hydriert. Nachdem die Absorption von Wasserstoff zurückgegangen war, wird die Reaktion filtriert, und die Lösungsmittel unter reduziertem Druck entfernt. Der Rückstand wird in Methanol gelöst, welcher mit Ammonium bei 0ºC gesättigt ist, und bei Raumtemperatur 10 h gerührt. Nach Verdampfung der Lösungsmittel wird der Rückstand durch Chromatographie auf C18-Silicagel unter Verwendung von Methanol-Wasser- Mischungen gereinigt, welche mit Ammoniumacetat (0,2 M) auf pH 7 gepuffert sind.
Die Aminosäure (1 mmol) aus dem vorherigen Abschnitt wird in Ethanol (3 ml) gelöst, welcher Di-tert-butyldicarbonat (1 mmol) enthält. Triethylamin (1,5 mmol) wird langsam bei Raumtemperatur zugegeben. Nachdem die Entstehung von Kohlendioxid zurückgegangen war, werden die Lösungsmittel im Vakuum entfernt und der Rückstand wird direkt für nächste Reaktion verwendet.
Die t-BOC-Aminosäure aus dem vorherigen Abschnitt wird an der exocyclischen Amino- Gruppe mittels dem allgemeinen Verfahren in Beispiel 2 unter Verwendung von 2-(Phenylsulfonyl)ethoxycarbonylchlorid acyliert. Das Produkt kann durch Chromatographie auf Silicagel unter Verwendung eines Gradienten von Methanol in Chloroform (0 bis 50 %) gereinigt werden.
Die 2-(Phenylsulfonyl)ethoxycarbonyl-geschützte BOC-Aminosäure aus dem vorherigen Abschnitt wurde durch die Verfahren in den Beispielen 11.3 und 11.4 in den aktiven p-Nitrophenyl- oder N-Hydroxysuccinimidoyl-Ester umgewandelt.

10.2. Herstellung des Uridin-Analogs

Ethyl-6-hydroxynicotinat wurde wie in H. Gault, J. Gilbert und D. Briaucourt, C. R. Acad. Sci.. Paris Ser. C. 266: 131 (1968) hergestellt. Lithiumborhydrid wird von Aldrich erhalten. Mangandioxid wird wie in Vereshchagin et al., Zhurnal Arganicheskoi Khimil, 8: 1129 (1972) hergestellt. Dowex-Harz wird von Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA, erhalten.
Ethyl-6-hydroxynicotinat (49 mmol) in Tetrahydrofuran (10 ml) wird tropfenweise zu einer Suspension von Lithiumborhydrid (100 mmol) in Tetrahydrofuran (THF) (75 ml) bei Raumtemperatur unter Stickstoff zugegeben. Die viskose Mischung wird bei 25ºC 16 h lang gerührt. Danach werden 60 ml 20 %ige Essigsäure zu der abgekühlten Suspension zugegeben. Das THF wird unter reduziertem Druck verdampft und die verbleibende waßrige Lösung wird auf eine Ionenaustauschersäule (Dowex-50W-X8) aufgetragen, um das Lithium-Ion zu entfernen. Die Säule wird vorsichtig mit 250 ml Wasser gewaschen, welches dann verdampft wird. Borsäure wird aus dem resultierenden Rückstand durch wiederholte Evaporation bzw. Verdampfung mit Methanol entfernt. Das Produkt wird durch Destillation unter reduziertem Druck gereinigt.
Der in dem vorherigen Abschnitt hergestellte Benzylalkohol (66 mmol) wird in Ether (250 ml) gelöst und langsam (exotherm) mit einer Aufschlämmung von Mangandioxid (54 g) in Ether (100 ml) behandelt. Nach 12 Stunden bei Raumtemperatur wird die Mischung filtriert, das Lösungsmittel unter reduziertem Druck entfernt und der Rückstand im Vakuum destilliert, was 6-Hydroxynicotinaldehyd ergab.
Das Aldehyd aus dem vorherigen Abschnitt wird wie bei der Herstellung des Cytidin- Analogs in Beispiel 11.1 mit 4-Aminobuttersäure zur Reaktion gebracht.
Die Aminosäure aus dem vorherigen Abschnitt wurde wie bei der Herstellung des Cytidin-Analoges in Beispiel 10.1 in das entsprechende BOC-Derivat umgewandelt.
Die BOC-Aminosäure aus dem vorherigen Abschnitt wird mittels den Verfahren in Beispiel 11.3 und 11.4 in den aktiven p-Nitrophenyl- oder N-Hydroxysuccinimidoyl- Ester umgewandelt.

Beispiel 11

Herstellung von 5'-geschütztem, 3'-aktivierten 2'-Desoxynukleosiden

11.1 2'-Desoxynukleosid-5'-O-dimethoxytrityl-Derivate

Das nachfolgende Verfahren gilt allgemein für die Herstellung von 2'-Desoxynukleosid- 5'-O-dimethoxytrityl-Derivaten:
N-2 9-Fluorenylmethoxycarbonyl-2'-desoxyguanosin (1 mmol) wird in wasserfreiem Pyridin (2,0 ml) gelöst und bei 0ºC gehalten. Dimethoxytritylchlorid (1,2 mmol) wird in Portionen bzw. Teilmengen (0,15 mmol) während eines 8 stündigen Zeitraumes zugegeben. Nach weiteren 2 Stunden wurde Methanol (0,5 ml) zugegeben und die Lösung bei reduziertem Druck konzentriert. Der Rückstand wird mit einer Mischung aus Natriumbicarbonat (2 ml, 5 %) und Methylenchlorid (5 ml) behandelt.
Die wäßrige Phase wird mit Methylenchlorid (2 x 5 ml) exträhiert, und die vereinigten organischen Phasen werden über Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Der Rückstand wird mehrere Male mit Toluol co-evaporiert, und das Produkt wird durch Chromatographie aus Silicagel unter Verwendung eines Gradienten von Methanol in Methylenchlorid (0 bis 10 %) gereinigt.

11.2 5'-O-Dimethoxytrityl-2'-desoxynukleosid-3'-O-(4-nitrophenyl)carbonat

Die Herstellung von 5'-O-Dimethoxytrityl-2-desoxycytidin-3'-O-(4-nitrophenyl)carbonaten wird in dem folgenden Verfahren beschrieben, welches für die Herstellung von den 4-Nitrophenylcarbonaten allgemein gilt. Bis(4-nitrophenyl)carbonat und N,N-Dimethylaminopyridin werden von Sigma erhalten.
5'-O-Dimethoxytrityl-N-2-(4-nitrophenyl)ethoxycarbonyl-2'-desoxycytidin (1 mmol) wird bei Raumtemperatur in wasserfreiem Dimethylformamid (5 ml) gelöst und mit Bis(4-nitrophenyl)carbonat (2 mmol) behandelt, und dann unter reduziertem Druck evaporiert bzw. eingedampft. Der Rückstand wird in Dimethylformamid (5 ml) gelöst, und N,N-Dimethylaminopyridin (0,1 mmol) wird zugegeben. Die gelbe Lösung wird eingedampft und 1 h lang reagieren gelassen. Die Reaktionsmischung wird in Chloroform (10 ml) aufgelöst und mit wäßriger HCl (5 ml, 0,1 M) gewaschen. Die organische Phase wird zweimal mit wäßriger NAOH (5 ml, 0,1 M), Wasser (2 ml) gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Der Rückstand wird auf eine Silicagel-Säule aufgetragen und mit einem Gradienten von Isopropanol in Chloroform (0 bis 10 %) eluiert. Die Fraktionen, die das Produkt enthalten, werden vereinigt, eingedampft, in Chloroform (10 ml) gelöst, und die wäßrigen NaOH-Waschungen werden wiederholt, um Spuren von 4-Nitrophenol zu entfernen. Die organische Phase wird mit Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Das Produkt ist in der Dünnschichtchromatographie (TLC) homogen, und wird direkt für die Herstellung von den dimeren Carbonaten eingesetzt.
Für die Herstellungen der Carbonate von Nukleosiden, welche die FMOC-Gruppe enthalten, ist es manchmal vorteilhaft, N-Methylimidazol anstelle von N,N- Dimethylaminopyridin als Katalysator zu verwenden.

11.3 N-geschützter t-BOC-p-Nitrophenylester

Die folgenden zwei Verfahren stellen aktive Ester für die Kopplung von Untereinheiten her. Dies gilt allgemein für alle t-BOC-Säurederivate.
Zu einer 0,2 bis 0,5 M-Lösung der t-BOC-Säure aus Beispiel 8.4 in Ethylacetat (oder Methylenchlorid) wird p-Nitrophenol in etwa 20 %igem Überschuß zugegeben. Die berechnete Menge von Dicyclohexylcarbodiimid wird bei 0ºC zu der Lösung zugegeben. Nach 0,5 h wird der Mischung erlaubt, auf Raumtemperatur zu kommen, und sie wurde 1 h lang darauf gehalten. Der Dicyclohexylharnstoff, welcher sich abtrennte, wird filtriert und mit Lösungsmittel gewaschen. Das Filtrat und die Waschungen vereinigt, werden unter reduziertem Druck bis zur Trockenheit eingedampft. Der Ester kann direkt für Kopplungsreaktionen verwendet werden oder kann durch kurze Säulenchromatographie auf Silica unter Verwendung eines Isopropanol-in-Chloroform-Gradienten (0 bis 50 %) gereinigt werden.

11.4 N-geschützter t-BOC-N-Hydroxysuccinimidoylester

Zu einer Lösung der t-BOC-Säure aus Beispiel 8.4 (1 mmol) in Acetonitril (5 ml) werden Pyridin (1 mmol) und N,N'-Disuccinimidylcarbonat (1 mmol) zugegeben. Die Lösung wird 3 h lang bei Raumtemperatur gerührt. Die Lösungsmittel werden unter reduziertem Druck entfernt, und der Rückstand wird in Chloroform aufgelöst, die organische Phase mit 0,1 M HCl und Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet, und zur Trockenheit eingedampft. Die Ester sind ausreichend rein, um direkt eingesetzt zu werden.

Beispiel 12

Bildung einer Carbonat-Verknüpfung zwischen den Untereinheiten

Die Herstellung von Cytidinyl-(3'-5')-cytidincarbonat wird in den nachstehenden Verfahren beschrieben. Dies ist ein allgemeines Vorgehen für die Bildung der Carbonat- Verknüpfung zwischen Untereinheiten und die Entschützung des Oligocarbonates. Man bemerke, daß die Basen-Schutzgruppen 2-(4-Nitrophenyl)ethoxycarbonyl, 2-(Phenylsulfonyl)ethoxycarbonyl oder FMOC sein müssen. Tert-Butyldimethylsilylchlorid wird von Aldrich erhalten.

12.1 Herstellung von 2'-Desoxynukleosid-3'-O-tert-butyldimethylsilyl-Derivaten

Die Herstellung von 3'-O-tert-Butyldimethylsilyl-N-2-(4-nitrophenyl)ethoxycarbonyl-2'- desoxycytidin wird in dem folgenden Verfahren beschrieben, welches ein allgemeines Verfahren für die Herstellung von 2'-Desoxynukleosid-3'-O-tert-butyldimethylsilyl- Derivaten ist:
Zu einer gerührten Lösung von 5'-O-Dimethoxytrityl-N-4-(4-nitrophenyl)ethoxycarbonyl-2'-desoxycytidin (1 mmol) und Imidazol (3,5 mmol) in trockenem Dimethylformamid oder Tetrahydrofuran (10 ml) wird tropfenweise eine Lösung von tert-Butyldimethylsilylchlorid (3 mmol) in trockenem DMF (10 ml) zugegeben. Die Reaktion wird 1 h lang gerührt, mit Eis gequencht, mit Methylenchlorid exträhiert, mit Wasser gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Die organische Phase wird unter reduziertem Druck bis zur Trockenheit eingedampft und durch Chromatographie über Silicagel mit Methylenchlorid als Elutionsmittel gereinigt.
Zu einer Lösung des 5'-O-Dimethoxytrityl-Derivates aus dem vorherigen Abschnitt (1 mmol) in Methylenchlorid (5 mmol) wird eine Lösung von Zinkbromid in Methylenchlorid (10 ml, 1 M) zugegeben, welche Methanol (15 % v/v) enthält. Die Reaktionsmischung wird 30 min lang gerührt, mit Eis abgeblockt, und mit Methylenchlorid exträhiert. Die organische Phase wird mit Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und unter reduziertem Druck bis zur Trockenheit eingedampft. Das Produkt wird durch Chromatographie über Silicagel unter Verwendung eines Gradienten von Methanol in Methylenchlorid (0 bis 10 %) gereinigt.
5'-O-Dimethoxytrityl-N-2-(4-nitrophenyl)ethoxycarbonyl-2'-desoxycytidin-3'-O-(4- nitrophenyl)carbonat (1,5 mmol) und 3'-O-tert-Butyldimethylsilyl-N-4-(4-nitrophenyl)ethoxycarbonyl-2'-desoxycytidin (1 mmol) werden in Dimethylformamid (5 ml) gelöst, und das Lösungsmittel wird unter reduziertem Druck entfernt. Dies wird zweimal wiederholt. Der Rückstand wird in Dimethylformamid (5 ml) gelöst und mit N,N- Dimethylaminopyridin (0,5 mmol) oder N-Methylimidazol (1 mmol) behandelt. Das Lösungsmittel wird unter reduziertem Druck durch Eindampfen entfernt, und die Reaktion wird über Nacht bei Raumtemperatur absetzen gelassen. Der Rückstand wird in Chloroform (20 ml) gelöst und mit wäßriger HCl (2 ml, 0,1 M), Wasser (2 ml), wäßrigem NaOH (2 x 2 ml, 0,2 M), Wasser (2 ml) gewaschen, und die organische Phase wird über Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Der Rückstand wird auf Silicagel unter Verwendung eines Gradienten von Isopropanol in Chloroform (0 bis 30 %) gereinigt. Das isolierte Produkt ist in der Dünnschichtchromatographie (TLC) und bei 400 MHz-NMR homogen.
Der Rückstand wird durch Verwenden des 2 M HF/1 M tert-Butylammoniumfluorid (TBAF)-Reagenz desilyliert, welches in B. L. Gaffney und R. A. Jones, Tetrahedron Lett. (1982) 23: 2257 beschrieben ist. Zu den 2 M HF/1 M tert-Butylammoniumfluorid in Pyridin (1 mmol TBAF) wird das entschützte Nukleosid aus dem vorherigen Abschnitt zugefügt. Nach 24 h langem Rühren wird die Reaktion zwischen Methylenchlorid und wäßrigem Natriumbicarbonat partitioniert bzw. aufgeteilt. Die organische Phase wird mit Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und zur Trockenheit eingedampft. Der Rückstand wird durch Chromatographie auf Silicagel unter Verwendung eines Gradienten von Methanol in Methylenchlorid (5 bis 25 %) gereinigt.
Die 3'-Hydroxydinuklesosidcarbonate werden durch das Verfahren in Beispiel 11 in die 3'-(4-Nitrophenyl)carbonate umgewandelt. Diese Derivate können mit der 5'-Hydroxyl- Gruppe eines Nukleosid- oder Oligonukleosidcarbonates zur Reaktion gebracht werden, um Oligonukleosidcarbonate höherer Ordnung herzustellen.

Beispiel 13

Bildung einer Carbamat-Verknüpfung zwischen den Untereinheiten

Bis(p-nitrophenyl)carbonat, p-Anisoyldiphenylmethylchlorid, N,N-Dimethylanilin (DMA) und Triethylamin sind von Aldrich Chemical Co. erhältlich.
Das benötigte, im obenstehenden Beispiel 3 hergestellte 5'-Amino-2',5'-didesoxyribonukleosid (unter Anwendung von Acetyl- oder Benzoyl-Gruppen zur Schützung der Basen, wo notwendig) (1 mmol) wird mit p-Anisoyldiphenylmethylchlorid (1,2 mmol) in Pyridin behandelt. Nach 12 h wird das Lösungsmittel verdampft, und der Rückstand wird in Chloroform gelöst. Diese Lösung wird jeweils einmal mit waßrigem NaHCO&sub3; und Wasser gewaschen und dann über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet. Nach Verdampfen des Lösungsmittels wird der Rückstand auf Silicagel chromatographiert, wobei mit Chloroform/Methanol/1 % Triethylamin-Mischungen eluiert wird.
Das 5'-tritylierte Aminonukleosid (1 mmol) wird zweimal aus DMF eingedampft, und dann mit Bis-(p-nitrophenyl)carbonat (2 mmol) in der Gegenwart von Triethylamin (oder N,N-Dimethylaminopyridin oder N-Methylimidazol) (katalytische Menge) unter Verwendung von DMF als dem Lösungsmittel behandelt. Nach 3 h wird das Lösungsmittel eingedampft und der Rückstand in Chloroform gelöst. Diese Lösung wird zweimal mit 0,01 N wäßriger NaOH gewaschen, einmal mit Wasser gewaschen und dann über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet. Das Lösungsmittel wird durch Rotationsverdampfung (Rotovap) entfernt und der Rückstand wird auf Silicagel chromatographiert, wobei zuerst mit einer Chloroform/0,1 % DMA-Mischung eluiert wird, und danach mit einem Chloroform/Methanol/0,1 % DMA-Lösungsmittelsystem. Die entsprechenden bzw. geeigneten Fraktionen werden vereinigt und bis zur Trockenheit eingedampft. Der Rückstand wird in einem Minimum von THF gelöst, und diese Lösung wird zu einem Überschuß von Hexanen zugegeben. Das gefällte aktivierte Nukleosid wird durch Filtration gesammelt und unter Vakuum getrocknet.
Das benötigte 5'-Aminonukleosid (1,1 mmol), wie in Beispiel 3 obenstehend hergestellt, wird zweimal aus DMF eingedampft. Das aktivierte Nukleosid (1 mmol) wird in das Reaktionsgefäß gegeben, und die Feststoffe werden in DMF gelöst. Die Lösung wird auf ein kleines Volumen konzentriert und über Nacht stehen gelassen. Das Lösungsmittel wird unter Vakuum vollständig entfernt, und der resultierende Rückstand wird in Chloroform gelöst. Diese Lösung wird zweimal mit 0,01 N wäßrigem Natriumhydroxid gewaschen, einmal mit Wasser gewaschen, und dann über festem Natriumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wird durch Rotationsverdampfung (Rotovap) entfernt, und der Rückstand wird auf Silicagel chromatographiert, wobei mit dem passenden Methanol/Chloroform/1 % Triethylamin-Lösungsmittelsystem eluiert wird. Die Fraktionen, welche das Nukleosid-Dimer enthalten, werden vereinigt und dann bis zur Trockenheit eingedampft. Der Rückstand wird in einem Minimum von THF gelöst, und diese Lösung wird zu Hexanen zugegeben. Das Präzipitat bzw. der Niederschlag wird gesammelt und unter Vakuum getrocknet.

Beispiel 14

Bildung einer Thiocarbamat-Verknüpfung zwischen den Untereinheiten

N,N-Dimethylaminopyridin (DMAP) wird von Aldrich Chemical Co. erworben.
Die Bildung der Thiocarbamat-Verknüpfung zwischen den Untereinheiten der in Beispiel 3 hergestellten 5'-Aminonukleoside wird auf dieselbe Weise wie obenstehend in Beispiel 13 beschrieben mit den folgenden Veränderungen in dem Vorgehen erzielt. Die verwendeten 5'-Aminonukleoside besitzen als Basen-Schutzgruppen entweder 2-(Phenylsulfonyl)ethoxycarbonyl-Gruppen (für Desoxycytidin und Desoxyadenosin) oder 9-FMOC-Gruppen (für Guanosin und 2,6-Diamino-2'-desoxyribosid). Die Herstellung dieser Moleküle ist obenstehend beschrieben (Beispiel 3). Die Aktivierung des 5'-Tritylaminonukleosides (1 mmol) wird mit p-Nitrophenylchlorthioformiat (hergestellt wie von G Hilgetag und R. Phillippson, Monatsber. Deut. Akad. Wiss. Berlin (1964), 6: 897) (1,2 mmol) in der Gegenwart von Triethylamin (2 mmol) und DMAP (katalytische Menge) in DMF erreicht. Der Kopplungsschritt verwendet dieses aktivierte Monomer (1 mmol) mit dem erforderlichen 5'-Aminonukleosid (1,1 mmol) unter Verwendung von DMAP oder N-Methylimidazol als Katalysator und DMF als dem Lösungsmittel. Bei dieser wäßrigen Aufarbeitung dieser Schritte werden die Waschschritte mit 0,01 N wäßrigem NaOH weggelassen, wobei an ihrer Stelle Waschungen mit Wasser angewandt werden.

Beispiel 15

Bildung von Carbamt- und Thiocarbamat-Untereinheitverknüpfungen zwischen Untereinheiten vom Morpholino-Typ

N-Methylimidazol wird von Aldrich Chemical Co. erworben.
Das erforderliche trockene, N-geschützte Morpholino-Typ-Nukleosid mit freier Alkohol- Gruppe an der 5'-Position (unter Anwendung von Acetyl- oder Benzoyl-Gruppen zum Basenschutz, wo notwendig) (1 mmol), hergestellt in dem obenstehenden Beispiel 5, wird mit Bis-(p-nitrophenyl)carbonat und Triethylamin (oder DMAP oder N-Methylimidazol) (katalytische Menge) in DMF unter wasserfreien Bedingungen behandelt. Die Lösung wird 3 h lang gerührt, und dann bis zur Trockenheit eingedampft. Der Rückstand wird in Chloroform gelöst, und die Lösung wird zweimal mit 0,01 N wäßriger NaOH, einmal mit Wasser gewaschen, und danach über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet. Das Lösungsmittel wird durch Rotationsverdampfung entfernt, und der Rückstand wird auf Silicagel chromatographiert, wobei mit einer geeigneten Chloroform/Isopropanol/0,1 % DMA-Mischung eluiert wird. Die Fraktionen, die das gewünschte aktivierte Nukleosid enthalten werden vereinigt, eingedampft, und der resultierende Feststoff wird, in einem Minimum von THF gelöst. Die THE-Lösung wird zu einem Überschuß von Hexanen zugegeben, und das resultierende Präzipitat wird gesammelt und getrocknet.
Das erforderte Nukleosid vom Morpholino-Typ mit freier 5'-Hydroxyl-Gruppe und freier N'-Position (unter Anwendung der identischen Basen-Schutzgruppen wie obenstehend in diesem Beispiel aufgelistet) (1,1 mmol) wird nach zweimaligem Eindampfen aus DMF mit der 5'-(p-Nitrophenoxycarbonyl)morpholino-Untereinheit (1 mmol) in DMF behandelt. Das Volumen der Reaktionslösung wird unter Vakuum zu einem kleinen Volumen reduziert. Falls erforderlich, wird eine katalytische Menge von N- Methylimidazol oder Triethylamin in das Reaktionsgefäß zugegeben. Die resultierende Lösung wird über Nacht bei Raumtemperatur stehen gelassen. Das verbleibende Lösungsmittel wird verdampft und der Rückstand wird in Chloroform gelöst. Die Chloroform-Lösung wird zweimal mit 0,01 N wäßriger NaOH, einmal mit Wasser gewaschen, und dann über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet. Das Lösungsmittel wird durch Rotationsverdampfüng entfernt, und der Rückstand wird auf Silicagel chromatographiert, wobei mit Chloroform/Methanol-Lösungsmittelmischungen eluiert wird. Die Fraktionen, welche das gewünschte Dimer enthalten, werden vereinigt, und danach bis zur Trockenheit rotationsverdampft. Der Rückstand wird in einem Minimum von THF gelöst, und die Lösung wird zu einem Überschuß von Hexanen zugegeben. Das Präzipitat bzw. der Niederschlag wird gesammelt und unter Vakuum getrocknet.
Über Thiocarbamat-Gruppen verknüpfte Morpholino-Untereinheiten werden, mit den folgenden experimentellen Abweichungen, wie obenstehend in diesem Beispiel betroffen, hergestellt. Die Basen-Schutzgruppen sind entweder 1-(Phenylsulfonyl)ethoxycarbonyl(für Desoxycytidin und Desoxyadenosin) oder 9-FMOC-Gruppen (für Desoxyguanosin und 2,6-Diamino-2'-desoxyribosid). Die Herstellung dieser Moleküle ist obenstehend beschrieben (Beispiel 5). Aktivierung des N-geschützten Morpholinonukleosides (1 mmol) wird mit p-Nitrophenylchlorthioformiat (1,2 mmol) in der Gegenwart von Triethylamin (2 mmol) und DMAP oder N-Methylimidazol (katalytische Menge) in DMF erreicht. Der Kopplungsschritt macht Gebrauch von diesem aktivierten Monomer (1 mmol) mit dem erforderlichen N'-freiem Morpholino-Nukleosid (1,1 mmol) unter Verwendung von DMAP oder N-Methylimidazol als Katalysator und DMF als dem Lösungsmittel, unter Erwärmung der Lösung auf 35ºC bis 40ºC. In der wäßrigen Aufarbeitung dieser Schritte werden die Waschungen mit 0,01 N, wäßriger NaOH weggelassen, und an ihrer Stelle Waschschritte mit Wasser angewandt.

Beispiel 16

Herstellung einer Ester-Verknüpfüng zwischen den Untereinheiten

N,N-Dimethylaminopyridin und N-Methylimidazol werden von Aldrich erhalten.
Die Kopplung zweier Untereinheiten wird durch die Reaktion des 5'-N,N-Acetamid-3'- hydroxy-Derivates mit dem 3'-silylierten-5'-aktivem Ester durchgeführt. Diese werden wie in Beispiel 6 hergestellt. Die Reagenzien (jeweils 1 mmol) werden mehrere Male mit Dimethylformamid co-evaporiert, dann in Dimethylformamid (5 ml) gelöst und mit N,N- Dimethylaminopyridin (0,2 mmol) oder N-Methylimidazol (1 mmol) behandelt. Das Lösungsmittel wird unter reduziertem Druck entfernt, und die Reaktion wird 2 h lang bei Raumtemperatur stehen gelassen. Der Rückstand wird in Chloroform gelöst und mit verdünnter HCL und Wasser gewaschen, und die organische Phase wird mit Natriumsulfat getrocknet, und die Lösungsmittel werden unter reduziertem Druck verdampft.
Der Rückstand wird durch Chromatographie auf Silicagel unter Verwendung eines Gradienten von Methanol in Chloroform gereinigt.
Die Kette kann durch Desylilierung wie in Beispiel 6 und Behandlung der resultierenden Verbindung mit freier 3'-Hydroxyl-Gruppe mit dem aktiven Ester wie in dem vorherigen Abschnitt verlängert werden.

Beispiel 17

Bildung eines Amid-verknüpften t-BOC-Dimers

Ein vollständig t-BOC-geschützter N-Hydroxysuccinimidoylester oder p-Nitrophenylester, hergestellt wie in Beispiel 11.3 und 11.4, (1 mmol) wird durch mehrere Co- Evaporationen bzw. Verdampfungen mit trockenem Dimethylformamid getrocknet. Das geschützt Aminosäure-Trifluoracetatsalz aus Beispiel 9 (1 mmol) wird ähnlich behandelt. Die zwei Bestandteile werden getrennt in trockenem Dimethylformamid (2 ml) gelöst, vermischt und mit Diisopropylethylamin (1,0 mmol) behandelt. Die Lösung wird 1 h lang bei Raumtemperatur gerührt, dann wird das Lösungsmittel unter reduziertem Druck durch Verdampfung entfernt, der Rückstand in Chloroform gelöst und mit verdünnter HCl gewaschen. Die organische Phase wird über Natriumsulfat getrocknet, unter reduziertem Druck bis zur Trockenheit eingedampft, und der Rückstand wird durch Chromatographie auf Silicagel unter Verwendung eines Gradienten von Methanol in Chloroform (5 bis 50 %) gereinigt. Alternativ dazu kann das t-BOC-Säuredimer durch Chromatographie auf C18-Umkehrphasen-Silicagel unter Verwendung Wasser- und Methanol- (Trifluorethanol-) Mischungen gereinigt werden.

17.1. Herstellung des aktiven Esters des t-BOC-Dimers

Die Säure aus dem vorherigen Abschnitt wird durch Anwendung der generellen Verfahren in Beispiel 11.3 und 11.4 in den N-Hydroxysuccinimidoylester oder p-Nitrophenylester umgewandelt.

17.2 Herstellung des Aminosäuretrifluoracetats des t-BOC-Dimers

Das t-BOC-Säuredimer wird mit Trifluoracetat wie mittels dem allgemeinen Verfahren in Beispiel 9 behandelt.

17.3 Herstellung einer Säure des t-BOC-Tetramers

Das t-BOC-Dimer des aktiven Esters und das Säuretrifluoracetat-Dimer werden über das allgemeine Verfahren zu der t-BOC-Tetramer-Säure gekoppelt. Eine Aufreinigung wird am besten durch Chromatographie auf C18-Umkehrphasen-Silicagel unter Verwendung von, mit Triethylammoniumacetat auf pH 7,0 gepufferten, Mischungen aus Wasser und Methanol (oder Trifluorethanol) bewirkt. Auf diese Weise können Ketten jeglicher Länge durch Koppeln eines aktiven Esters mit einer freien Amin-Komponente hergestellt werden.

Beispiel 18

Geometrischer Zusammenbau eines Carbamat-verknüpften Polymeres von 8 Untereinheiten

DEAE-Cellulose wird von Sigma Chemical Co. erworben. Präparative Dünnschichtchromatographie (TLC) - Platten sind ein Produkt von E. M. Science, erworben von VWR Scientiftic. HPLC-Ausrüstüng, Säulen und Gerätschaften sind von Beckman Instruments, Inc., erhältlich.
Das erforderliche, Carbamat-verknüpfte Dimer (0,2 mmol), hergestellt wie in Beispiel 12 beschrieben, wird mit 4 ml einer 1/1/1-Mischung von Methanol/THF/Eisessig 12 h lang bei Raumtemperatur behandelt. Das Lösungsmittel wird unter Vakuum entfernt und der Rückstand wird in einem Minimum von THF aufgenommen. Die THF-Lösung wird zu einem großen Volumen von Hexanen zugegeben, und das resultierende Präzipitat wird gesammelt und getrocknet. Das Acetatsalz wird in einer Mischung aus THF/Ethanol im Verhältnis 4:1 gelöst, und DEAE-Cellulose (0,8 mmol der Base) wird in das Gefäß zugegeben. Nach 20 min langem Rühren wird die heterogene Mischung filtriert, und das Filtrat wird bis zur Trockenheit eingedampft. Der Rückstand wird in einem Minimum von THF/Ethanol im Verhältnis von 4:1 gelöst, und diese Lösung wird zu Hexanen gegeben. Der Feststoff wird gesammelt und getrocknet. Das Fällungs-Verfahren wird einmal wiederholt.
Das erforderliche N-5'-Trityldimer (0,1 mmol) (hergestellt wie in Beispiel 12) wird zweimal aus DMF eingedampft, und danach mit Bis(p-nitrophenyl)carbonat (2 mmol) in der Gegenwart von Triethylamin (oder DMAP oder N-Methylimidazol) (katalytische Menge) unter Verwendung von DMF als dem Lösungsmittel behandelt. Nach 3 h wird das Lösungsmittel eingedampft, und der Rückstand wird in Chloroform gelöst. Diese Lösung wird zweimal mit 0,01 N wäßriger NaOH und einmal mit Wasser gewaschen, und danach über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet. Das Lösungsmittel wird durch Rotationsverdampfüng entfernt, und der Rückstand wird auf Silicagel chromatographiert, wobei mit einer Chloroform/Isopropanol- oder Methanol/0,1 % DMA-Mischung eluiert wird. Die geeigneten Fraktionen werden vereinigt und bis zur Trockenheit eingedampft. Der Rückstand wird in einem Minimum von THF gelöst, und diese Lösung wird zu einem Überschuß von Hexanen zugegeben. Das gefällte aktivierte Dimer wird durch Filtrat gesammelt und unter Vakuum getrocknet.
Das obenstehend hergestellte Dimer aus 5'-Amino-Nukleosiden (0,11 mmol) wird zweimal aus DMF eingedampft. Das aktivierte Dimer (0,1 mmol) wird in das Reaktionsgefäß zugegeben, und die Feststoffe werden in DMF gelöst. Die Lösung wird auf ein kleines Volumen konzentriert und über Nacht stehen gelassen. Das Lösungsmittel wird unter Vakuum vollständig entfernt, und der resultierende Rückstand wird in Chloroform gelöst. Diese Lösung wird zweimal mit 0,01 N wäßrigem Natriumhydroxid und einmal mit Wasser gewaschen, und dann über Natriumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wird durch Rotationsverdampfung (Rotovap) entfernt, und der Rückstand wird auf einer präparativen Dünnschichtchromatographie (TLC)-Platte chromatographiert, wobei mit dem angemessenen bzw. geeigneten Methanol/Chloroform/1 % Triethylamin-Lösungsmittelsystem eluiert wird. Die Bande, welche das Nukleosid- Tetramer enthält, wird eluiert, und das Lösungsmittel wird verdampft. Der Rückstand wird in einem Minimum von THF gelöst, und diese Lösung wird zu Hexanen zugegeben. Der Niederschlag wird gesammelt und unter Vakuum getrocknet.
Die folgenden Umsetzungen werden unter Verwendung der obenstehend in diesem Beispiel aufgezähltem Verfahren durchgeführt. Das erforderliche N-5'-Trityl- Nukleosidtetramer (0,06 mmol) wird mit 1/1/1 THF/Methanol/Eisessig behandelt und danach gereinigt, um das 5'-Amino-Nukleosidtetramer zu erhalten. Ein anderes Aliquot des N-5'-Trityl-Nukleosidtetrameres (0,05 mmol) wird mit Bis(p-nitrophenyl)carbonat aktiviert und anschließend gereinigt. Die zwei Tetramere werden gekoppelt, aufgearbeitet, und weitere Aufreinigung wird entweder durch Chromatographie auf einer präparativen TLC-Platte oder durch HPLC-Chromatographie erzielt. Das chromatographierte Material wird als ein Feststoff isoliert, in einem Minimum von THF gelöst, und danach aus Hexanen gefällt. Das Nukleosid-Oktamer wird gesammelt und getrocknet.
Das Oktamer wird für weitere Verwendung wie folgt konfiguriert. Das N-5'-Tritylnukleosidoktamer wird mit 1/1/1-THF/Methanol/Eisessig behandelt und gereinigt, wobei die obenstehend aufgelisteten Bedingungen angewendet werden. Das 5'-Aminonukleosidoktamer (0,01 mmol) wird mit Bernsteinsäureanhydrid (0,02 mmol) in Pyridin bei Raumtemperatur 2 h lang behandelt. Das Lösungsmittel wird durch Rotationsverdampfung entfernt, und der Rückstand wird mehrere Male aus Ethanol eingedampft. Der Rückstand wird in THF/Ethanol im Verhältnis 3:1 aufgenommen und zu einer Mischung von Hexan/Benzol im Verhältnis 2:1 zugegeben. Der Feststoff wird gesammelt und getrocknet. Das N-5'-succinylierte Nukleosid-Oktamer (0,01 mmol) wird mit einer 1/1-Mischung von Pyridin/konzentriertem Ammoniak (1 ml) behandelt. Nach Stehenlassen über Nacht, wird das Lösungsmittel durch Rotationsverdampfung entfernt, und der Rückstand wird mehrere Male aus Ethanol eingedampft. Der rohe Feststoff wird unter Verwendung von Umkehrphasen-(RP-18)-HPLC-Chromatographie gereinigt. Die Elutionsmittel werden verdampft und der Rückstand wird in DMSO aufgenommen und aus einer 1/1 Hexan-Benzol-Lösungsmittelmischung gefällt. Der Feststoff wird gesammelt und getrocknet.

Beispiel 19

Herstellung eines trägergebundenen abspaltbaren Linkers bzw. Verbindungsstücks, welches für schrittweisen und schrittweisen/blockweisen Zusammenbau von Polymeren geeignet ist: Aktivierung des Trägers und Anknüpfung des Linkers

Mit langkettigem Alkylamin derivatisiertes Glas von kontrollierter Porengröße (Cat.- Nr. 24875) wird von Pierce Chemical Co. erhalten. 2,2-Sulfonyldiethanol und Dicyclohexylcarbodiimid werden von Aldrich Chemical Co. erhalten.
Die Amino-Gruppen des Glasträgers (etwa 40 mmol je Gramm des Trägers) werden mit Bernsteinsäureanhydrid im wesentlichen mittels des Verfahrens von Matteucci und Caruthers (J. Amer. Chem. Soc. (1981) 103: 3185) umgesetzt, um freie Carbonsäure- Endgruppen zu erhalten. Ein Zehntel Mol 2,2'-Sulfonyldiethanol (60 Gew.-% in Wasser) wird durch Vermischen mit 3 Volumen Dimethylformamid (DMF), Einengen zu einem dicken Sirup unter Vakuum in einem Warmwasserbad, Zugeben einer zweiten Menge von DMF, Einengen zu einem dicken Sirup und Wiederholen des Vorgangs ein drittes Mal getrocknet. Dann wird trockenes DMF zugegeben, um eine Sulfonyldiethanol- Endkonzentration von 2 M zu ergeben. Eine Mischung von 1 ml der Sulfonyldiethanol- Lösung plus 0,2 g Dicyclohexylcarbodiimid wird zu 1 g des trockenen Glasträgers von kontrollierter Porengröße, welcher Carbonsäure-Reste trägt, zugegeben, und die Aufschlämmung wird durch Rollen oder Schütteln (nicht durch Rühren) über Nacht bei Raumtemperatur vermischt. Danach wird der Glasträger gründlich mit Methanol gewaschen und getrocknet.

Beispiel 20

Herstellung eines gegen eine konservierte Sequenz in dem AIDS-Virusgenom gerichteten Carbonat-verknüpften Polymers von 14 Untereinheiten: schrittweiser Zusammenbau auf einem Festphasenträger; Addition der ersten Untereinheit und Kettenverlängerung.

N-Methylimidazol, 4-(N,N-Dimethylamino)pyridin (DMAP) und 1,8-Diazabicyclo [5.4.0]undec-7-en (DB) werden von Aldrich Chemical Co. erhalten. Methyl-p-nitrophenylcarbonat wird aus Methylchloroformiat und p-Nitrophenol hergestellt.
Die wie in Beispiel 4.2. hergestellte 2'-Desoxycytidin-Untereinheit (0,1 mmol) (worin das N4 eine p-Nitrophenethoxycarbonyl-Gruppe, das 5'-Sauerstoffatom eine Di(p-methoxy)trityl-Gruppe (DMT) und das 3'-Sauerstoffatom eine p-Nitrophenoxycarbonyl- Gruppe trägt) wird in einem minimalen Volumen von trockenem Tetrahydrofüran (THF) oder Dimethylformamid gelöst und zu 0,5 g gründlich getrocknetem Glasträger mit kontrollierter Porengröße, welcher einen abspaltbaren Linker trägt, hergestellt wie in Beispiel 19, zugegeben. Katalysator (entweder 1 mmol N-Methylimidazol oder 0,1 mmol DMAP) wird eingebracht, und die Aufschlämmung wird durch Hin- und Her-Bewegen oder Schütteln (nicht durch Rühren) 2 h lang vermischt. Die Aufschlämmung wird als nächstes filtriert, und der Feststoff gründlich mit THF gewaschen.
Jegliche nicht-reagierten Hydroxyl-Gruppen werden durch Zugabe von 2 ml THF, 1 M bzgl. Methyl-p-nitrophenylcarbonat und 0,5 M bzgl. DMAP, und 20 min langem Mischen bei Raumtemperatur abgedeckt bzw. gecappt. Danach wird der Glasträger mit THF gewaschen und filtriert.
Das Dimethoxytrityl an dem 5'-Terminus wird dann durch Waschen des Trägers mit Dichlormethan, gefolgt von 5 min langer Behandlung mit 5 ml 0,2 M Dichloressigsäure in Dichlormethan bei RT entfernt. Der Glasträger wird als nächstes mit Dichlormethan gewaschen und filtriert.
Darauffolgende Untereinheiten, hergestellt wie in Beispiel 1 und aktiviert wie in Beispiel 2, werden in einer ähnlichen Weise und in der folgenden Reihenfolge hinzugefügt: G,A,T,A,A,C,A,T,T,T,T,T,C (G ist geschützt mit der der FMOC-Gruppe, A und C sind geschützt mit der p-Nitrophenethoxycarbonyl-Gruppe).

Beispiel 21

Herstellung eines gegen eine konservierte Sequenz in dem AIDS-Virusgenom gerichteten, Carbamat-verknüpften Polymers von 19 Untereinheiten: schrittweiser Zusammenbau von Oligomer-Blocks auf einen Festphasenträger: Addition der ersten Untereinheit und Kettenverlängerung

Die wie in Beispiel 3 hergestellte 5'-Amino-2',5'-didesoxycytidin-Untereinheit (0,2 mmol) (worin das N4 eine Benzoyl-Gruppe trägt, das 5'-Amin eine p-Methoxytrityl-Gruppe trägt und der 3'-Sauerstoff eine p-Nitrophenoxycarbonyl-Gruppe trägt) wird in einem minimalen Volumen von trockenem THF gelöst und zu 0,5 g getrocknetem Glasträger von kontrollierter Porengröße, welcher einen abspaltbaren Linker trägt, hergestellt wie in Beispiel 19, zugegeben. Katalysator (entweder 1 mmol N-Methylimidazol oder 0,1 mmol DMAP) wird eingebracht, und die Aufschlämmung wird durch Hin- und Her-Bewegen und Schütteln 2 h lang vermischt. Die Aufschlämmung wird als nächstes filtriert, und der Feststoff gründlich mit THF gewaschen.
Das Mono-p-methoxytrityl wird durch Waschen mit Dichlormethan, gefolgt von 1 min langer Behandlung mit 5 ml 0,2 M Dichloressigsäure in Dichlormethan bei Raumtemperatur entfernt. Der Träger wird dann mit Dichlormethan gewaschen und filtriert. Die 5'-Amino-Termini werden in freies Amin umgesetzt durch eine kurze Waschung mit 3 ml THF, enthaltend 1 Vol.-% Diisopropylethylamin, gefolgt von Waschen mit THF und Filtration.
0,1 mmol 3'-p-Nitrophenoxycarbonyl-aktiviertes Dimer mit der Sequenz 5'-A-G-3', hergestellt wie in Beispiel 13 (worin das Guanin-N2 mit einer Acetyl-Gruppe geschützt ist und das Adenin-N6 mit einer Benzoyl- oder einer p-Nitrobenzoyl-Gruppe geschützt ist), wird in einem minimalen Volumen von trockenem THF gelöst und zu dem Glasträger zugegeben, und es wird 2 h langes Mischen durchgeführt (für dies und für die nachfolgenden Kopplungsschritte wird kein Katalysator zugegeben). Die Aufschlämmung wird als nächstes mit THF gewaschen und filtriert.
Jegliche nicht-reagierten Amin-Grüppen werden durch Zugabe von 2 ml THF, 2 M bzgl. p-Nitrophenylacetat, und 20 min langen Mischen bei Raumtemperatur abgedeckt bzw. gecappt. Danach wird der Glasträger mit THF gewaschen und filtriert.
Das Mono-methoxytrityl am 5'-Terminus wird, wie zuvor, mit Dichloressigsäure entfernt.
Darauffolgende aktivierte Untereinheit-Dimere, hergestellt wie in Beispiel 17 (worin das exocyclische Ring-Stickstoffatom von Cytosin mit einer Benzyl-Gruppe geschützt ist, und das exocyclische Ring-Stickstoffatom von A mit einer Benzoyl- oder einer p-Nitrobenzoyl-Gruppe geschützt ist), werden in einer ähnlichen Weise und in der folgenden Reihenfolge hinzugefügt: A-T, C-A, T-A, T-T, T-T, A-C, A-C, C-A (5' nach 3').
Es können auch Untereinheiten, die durch starke nicht-nukleophile Basen entfernbare Basen-Schutzgruppen für das exocyclische Ring-Stickstoffatom (z.B. p-Nitrophenethoxycarbonyl oder Phenylsulfonylethoxycarbonyl für A und C, und FMOC für G) besitzen, für den Zusammenbau von Polymeren nach dem obenstehenden Verfahren verwendet werden. Allerdings werden Polymere mit diesen alternativen Schutzgruppen im allgemeinen eher durch Behandlung mit DBU entschützt als mit Ammoniumhydroxid.

Beispiel 22

Herstellung eines 19 Untereinheiten langen amidverknüpften Polymers, welches gegen eine konservierte Sequenz im Genom des AIDS-Virus gerichtet ist. Schrittweiser Zusammenbau von Oligomerblöcken auf einem festen Träger: Addition der ersten Untereinheit und Kettenverlängerung.

Eine Cytosin enthaltende Untereinheit mit acyclischem Grundgerüst (0,2 mmol), die wie in Beispiel 11.3 hergestellt wurde (worin der N4 des Cytosins eine 2(p-Nitrophenyl)ethoxycarbonylgruppe, das Amin des Grundgerüsts eine t-Butoxycarbonylgruppe trägt, und das Carboxyl in der Form eines p-Nitrophenylesters vorliegt), wird in einem minimalen Volumen trockenem THF gelöst, und zu 0,5 g getrocknetem Glasträgermaterial mit kontrollierten Poren gegeben, das einen abspaltbaren Linker, hergestellt wie in Beispiel 19, trägt. Der Katalysator wird zugesetzt (entweder 1 mmol N-Methylimidazol oder 0,1 mmol DMAP) und der Träger 2 h lang gerührt, filtriert, und der Bodensatz gründlich mit THF gewaschen.
Das t-BOC wird durch Waschen des Trägers mit Dichlormethan, gefolgt von 30 min langer Behandlung bei RT mit 5 ml 20 Vol.-%iger Trifluoressigsäure in Methylenchlorid entfernt. Der Träger wird mit Dichlormethan gewaschen und filtriert. Der trägergebundene Aminoterminus wird durch kurzes Waschen mit 3 ml THF, welches 1 Vol.-% Diisopropylethylamin enthält, gefolgt von einem THF-Waschgang, in die freie Aminform umgewandelt.
Die aktivierte dimere, wie in Beispiel 17 hergestellte Untereinheit (0,1 mmol) mit der Sequenz (Aminoterminus)-G-A-(Carboxyterminus) (in der der N2 des Guanins eine FMOC-Gruppe, der N6 des Adenins eine p-Nitrophenethoxycarbonylgruppe, der Grundgerüst-Aminoterminus eine t-BOC-Gruppe trägt, und der Carboxyterminus in der Form eines p-Nitrophenylesters vorliegt), wird in einem minimalen Volumen trockenem THF gelöst, zum Glasträger gegeben und 2 h lang gemischt (Für diesen oder die folgenden Kopplungsschritte wird kein Katalysator zugesetzt). Der Träger wird mit THF gewaschen.
Jedwede nicht umgesetzte Aminogruppen werden durch Zugabe von 2 ml 2 M p-Nitrophenylacetat in THF und 20-minütigem Mischen bei Raumtemperatur gecappt. Danach wird der Glasträger mit THF gewaschen.
Die terminale t-BOC-Gruppe wird mit TFA entfernt, und der Träger wie oben beschrieben neutralisiert.
Die folgenden, wie in Beispiel 17 hergestellten, dimeren Untereinheiten werden in ähnlicher Weise in folgender Reihenfolge angefügt: (C-Terminus) T-A, A-C, A-T, T-T, T-T, C-A, C-A, A-C (N-Terminus).
Untereinheiten, die exocyclische Ring-Stickstoff-Schutzgruppen haben, welche durch gute Nucleophile entfernbar sind (z.B. Benzoyl- für C, Benzoyl- oder Nitrobenzoyl- für A und Acetyl- oder Isobutyryl- für G) können ebenso zum Zusammenbau von Polymeren durch obige Arbeitsvorschrift verwendet werden. Jedoch werden Polymere, die diese alternativen Schutzgruppen besitzen, in der Regel eher durch Behandlung mit Ammoniumhydroxid, als mit DBU entschützt.

Beispiel 23

Herstellung von Nukleosid-3'-O-(p-Chlorphenyl-2-cyanoethyl)-Phosphaten

23.1 Herstellung von Nukleosiden mit einer 3'-Schutzgruppe

Thymidin, N-Benzoyldesoxyadenosin, N-Benzoyldesoxycytidin, N-Isobutyryldesoxyguanosin und ihre 5'-O-(Di-p-methoxytrityl)- bzw. 5'-ODMT-Nucleosidderivate werden von Pharmacia P-L Biochemicals (Piscataway, NJ) erhalten. β-Benzoylpropionsäure und Dicyclohexylcarbodiimid (DCCD) werden über den Handel erworben.
Ein ausgewähltes 5'-O-Dimethoxytritylnukleosid (1 mmol) wird mit β-Benzoylpropionsäure (3 mmol) und DCCD (4 mmol) in 6 ml Pyridin zur Reaktion gebracht. Die Reaktionsmischung wird bei 25ºC drei Stunden lang gerührt, wonach 1,5 ml Wasser zugegeben und die Mischung 5 Stunden lang bei 25ºC gerührt wird. Die Reaktionsmischung wird gefiltert, und nach Eindampfen des Filtrats wird der Rückstand vom Pyridin durch mehrmalige Co-Evaporationen mit Ethanol befreit. Der gereinigte Rückstand wird in Ethylacetat aufgenommen, und auf Silicagel unter Verwendung von Ethylacetat einer Chromatographie unterzogen. Das konzentrierte Ethylacetat-Eluat wird zur Fällung des resultierenden 3'-O-β-Benzoylpropionylnukleosides (3'-OβB-Nukleosid) mit Hexan behandelt.

23.2 Nukleosidaktivierung

p-Chlorphenylphosphordichloridat wird von Aldrich (Milwaukee, WI) bezogen. Benzolsulfonsäure, Tetrahydrofüran, Triethylamin und 3-Hydroxypropannitril werden aus dem Handel bezogen.
Eine Lösung aus p-Chlorphenylphosphorditriazolid wird durch sequentielle Reaktion von 3 mmol Triazol in 10 ml Tetrahydrofuran mit 3 mmol Triethylamin und 1,5 mmol p-Chlorphenylphosphordichloridat bereitet. Nach einer 10-minütigen Reaktion bei 25ºC wird 1 mmol eines gewählten 5'-ODMT-Nukleosides in 2 ml trockenem Pyridin der Reaktionsmischung zugesetzt. Nach Stehenlassen bei 25ºC für bis zu zwei Stunden wird die Mischung mit einer Lösung aus Benzolsulfonsäure (4 mmol) und Triethylamin (4 mmol) in 3 ml wasserfreiem Pyridin behandelt, gefolgt von der Zugabe von 3-Hydroxypropannitril (2 mmol). Die Reaktionsmischung wird unter Vakuum auf 4 ml konzentriert und bis zu zwei Stunden bei 25ºC, dann bis zu 24 Stunden bei 4ºC gehalten. Die Reaktion wird durch Schütten der Mischung in 20 ml einer 5%igen wäßrigen Natriumbicarbonatlösung bei 0ºC, gründliches Extrahieren mit Chloroform, Trocknen der Extrakte mit Natriumsulfat und Entfernen der Lösungsmittel unter vermindertem Druck beendet. Das 5'-ODMT-Nukleosid-3'-O-(p-chlorphenyl-(2-cyanoethyl))-phosphat- Produkt wird durch Chromatographie auf Silicagel unter Verwendung von aufeinanderfolgenden Elutionen mit Ether, Ethylacetat und Tetrahydrofüran erhalten.

Beispiel 24

Herstellung eines Tetramers mit alternierenden geladenen und ungeladenen Verknüpfungen

Methylphosphordichloridat wird von Aldrich erhalten. Benzolsulfonyl-tetrazolid wird nach Stawinski, et. al, Nucleic Acids Research (1977) 4: 353 hergestellt.

24.1 Dimersynthese

Eine Lösung aus Methylphosphorditriazolid wird durch 2-10 Stunden lange Reaktion von 1,2,4,-Triazol (3 mmol) und Triethylamin (3 mmol) in 20 ml wasserfreiem Tetrahydrofüran in der Anwesenheit von Methylphosphordichloridat (1,2 mmol) bei 25ºC hergestellt. Anschließend an eine Filtration wird dem Filtrat eine Lösung eines ausgewählten 5'-ODMT-Nucleosids (1mmol) in 10 ml trockenem Pyridin zugesetzt, die Mischung auf 8 ml konzentriert und bis zu 2 Stunden lang bei 25ºC stehen gelassen. Der Lösung wird Benzolsulfonyltetrazolid (1,2 mmol) und das ausgewählte 3'-OβB- Nukleosid zugegeben. Nach 2,5-stündiger Inkubation bei 25ºC wird die Reaktion durch Zugabe von 20 ml 50%iger Natriumbicarbonatlösung bei -78ºC gequencht und gründlich mit Chloroform extrahiert. Das Lösungsmittel wird mit Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Die Reaktion kann auch im wesentlichen wie oben durchgeführt werden, wobei mit dem 3'-O-PO-(OpCP)(OCE)-geschützten Nucleosidphosphat aus Beispiel II begonnen wird.

24.2 Trennung von stereoisomeren Methylphosphonat-Dimeren

Die im obenstehenden Abschnitt hergestellten stereoisomeren Dimere werden durch Chromatographie auf einer Silicagelsäule getrennt, durchgeführt bei atmosphärischem Druck in mit Silicagel 60 gefüllten Glassäulen unter Verwendung von Ethylacetat/Tetrahydrofüran-Mischungen (0-100% Tetrahydrofüran) oder Chloroform/Methanol- Mischungen (0-20% Methanol). Die das schneller laufende Stereoisomer enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und aus der Tetrahydrofüranlösung durch die Zugabe von Hexan ausgefällt. Das langsamer laufende Stereoisomer wird nicht weiter verwendet.

24.3 Phosphodiester/Methylphosphonat-verknüpftes Tetramer

Die ersten und zweiten stereospezifischen Methylphosphonatdimere, die jedes eine ausgewählte 2-Basen-Kombination und 3'-OβD und 5'-ODMT-Schutzgruppen haben, werden jeweils wie in den Beispielen 24.1 und 24.2 hergestellt. Mesitylensulfonyltetrazolid wird nach Stawinski, et. al, Nuc Acids Res (1977) 4: 353 hergestellt.
Die 5'-ODMT-Schutzgruppe an dem ersten Dimer wird entfernt, um die reine 5'- Hydroxyverbindung zu erhalten. Die Cyanoethylgruppe des zweiten Dimers wird durch einstündige Behandlung von 1 mmol des Dimers mit einer Lösung von Pyridin (8,5 ml), Wasser (2,9 ml) und Triethylamin (2,9 ml) bei 25ºC und Eindampfen der Lösungsmittel entfernt, um das 3'-Hydroxynukleotid zu erhalten.
Die Dimerkondensationsreaktion wird durch Lösen des 5'-OH-Dimers (1mmol) und des 3'-Hydroxynukleotid-Dimers (1mmol) in 8 ml Pyridin und 3,5 stündige Behandlung mit Mesitylensulfonyltetrazolid (3-6 mmol) bei 25ºC durchgeführt. Die Reaktionsmischung wird mit 4 ml kaltem 50%igem wäßrigen Pyridin versetzt und in 80 ml wäßrige Natriumbicarbonatlösung gegossen. Das Reaktionsprodukt wird gründlich mit mit Chloroform extrahiert und nach dem Trocknen über Natriumsulfat und Verdampfen des organischen Lösungsmittels auf Silicagel unter Verwendung einer Methanol/Chloroform- Mischung gereinigt. Das eluierte Produkt wird mit Hexan gefällt. Tetramere, die die 3'- O-PO-(OpCP)(OCE)-Schutzgruppe besitzen, können im wesentlichen mit dem gleichen Verfahren hergestellt werden, wobei mit einem Dimer begonnen wird, das die 3'-O-PO- (OpCP)(OCE)-Gruppe besitzt.

Beispiel 25

Befestigung von Polymer an einen festen Träger durch einen Linkerarm

25.1 Herstellung eines bifünktionellen Hexan-Linkerarmes

Dowex 50x Pyridinharz wird von Bio-Rad (Richmond, CA), und 6-Aminohexanol, Dimethylformamid und 3-Hydroxypropannitril aus dem Handel bezogen. 6-(2-Methylsulfonyl)-ethyl-p-nitrophenylcarbonat wird nach Eberle, et al., Helvetica Chimica Acta (1975) 58:2106 hergestellt.
Ein bifunktioneller Hexan-Linkersarm 6-(2-Methylsulfonyl)-ethoxycarbonylamino)hexanol wird durch Reaktion von 6-Aminohexanol (1 mmol) mit 2-(Methylsulfonyl)ethyl-p-nitrophenylcarbonat (1 mmol) in 1 ml Dimethylformamid für bis zu 4 Stunden bei 25ºC hergestellt. Die Reaktionsmischung wird in Wasser geschüttet, gründlich mit Benzol extrahiert, das Benzol mit Wasser gewaschen und das organische Lösungsmittel dann mit Natriumsulfat getrocknet und eingedampft, um den Carbamatalkohol zu erhalten, der mit Silicagel-Chromatographie unter Verwendung einer Methanol/Chloroform-Lösungsmittelmischung gereinigt wird.

25.2 Herstellung eines Oligonukleotidanalogs mit einem 5'-O-(6-Aminohexyl)-Linkerarm

Triethylammoniumbicarbonat und Tetrabutylammoniumfluorid werden aus dem Handel bezogen. Ein vollkommen geschütztes Oligonukleotidanalog wird durch das in Beispiel VI beschriebene Methylphosphonat-Dimer-Kondensationsschema hergestellt. Das Oligonukleotid (1 mmol) wird in 10 ml Chloroform/Methanol (7:3, v/v), das 2% Benzolsulfonsäure enthält, gelöst, und bei 0ºC 40 Minuten belassen. Die Reaktionsmischung wird mit einer 5%igen Natriumbicarbonatlösung und dann mit Wasser gewaschen. Die Chloroformphase wird über Natriumsulfat getrocknet, filtriert, und unter vermindertem Druck eingedampft. Das Material wird in Chloroform gelöst und der Rückstand auf Silicagel unter Verwendung von Chloroform/Methanol- Mischungen einer Chromatographie unterworfen, um die 5'-Hydroxy- Oligonukleotidverbindung zu erhalten.
Eine Lösung von 6-(2-Methylsulfonyl)-ethoxycarbonylamino)-hexyl-methylphosphonyl triazolid (5 mmol) in Pyridin (10 ml) wird durch Behandlung des Carbamat-alkohols aus Beispiel 25.1 mit Methylphosphorditriazolid, das wie in Beispiel 24.1 beschrieben hergestellt wurde, hergestellt. Zu der Lösung wird die 5'-Hydroxyverbindung (1 mmol) aus dem vorherigen Abschnitt und Benzolsulfonyltetrazolid (4 mmol) gegeben. Die Reaktion wird fortgesetzt, und wie in Beispiel 24.1 aufgearbeitet.
Der Rückstand wird auf Silicagel unter Verwendung einer Chloroform/Methanol- Lösungsmittelmischung einer Chromatographie unterworfen. Das geschützte Oligonukleotid (1 mmol) wird mit 4 ml Hydrazinhydrat in 14 ml 20%iger Essigsäure/Pyridin 16-24 Stunden lang bei 25ºC behandelt. Nach dem Eindampfen wird der Rückstand 24 Stunden lang bei 25ºC mit einer Lösung behandelt, die 0,017 M Tetrabutylammoniumfluorid in 30 ml Tetrahydrofuran/Pyridin/Wasser (8:1:1 v/v/v) enthält. Die Lösung wird dann mit 60 ml 50%igem konzentrierten Ammoniumhydroxid in Pyridin 10 Stunden lang bei 4ºC behandelt. Das resultierende Oligomer wird auf einer Umkehrphasen-HPLC-Säule unter Verwendung einer wäßrigen Acetonitrilmischung in 0,1 M Ammoniumacetatpuffer, pH 5,8, als Chromatographie-Lösungsmittel gereinigt.

25.3 Anheften eines 5'-O-(Aminohexyl)-Oligonukleotidanalogs an einen festen Träger

Affi-Gel 10 wird von Bio-Rad (Richmond, CA) erhalten. 10 ml des geladenen Gels werden mit Isopropanol (3 Bettvolumina) und dann mit eiskaltem entionisierten Wasser (3 Bettvolumina) gewaschen. Ein 5'-O-(6-Ammohexyl)-Oligonukleotid (150 mmol) wird wie in Beispiel 26 beschrieben hergestellt. Das Oligonukleotid (150 M), in 5 ml 0,1 M Natriumbicarbonatpuffer, pH 8,0 wird mit dem gewaschenen Gel 1-4 Stunden lang bei 25ºC aufgeschlämmt. Die Mischung dann mit 1 ml M Ethanolamin/HCl-Puffer, pH 8,0, behandelt, um jegliche nicht umgesetzten aktiven Ester im Gel abzudecken. Das Gel wird mit Wasser gewaschen, bis der gesamte Puffer entfernt ist, und bei 4ºC in Gegenwart von 0,02% Natriumazid aufbewahrt.

Beispiel 26

Herstellung des Reagenz-Trägers

Aminomethyliertes Polystyrol wird wie von B.A. Mukhitdinova, E.E Eighozin und G.A. Makhmudova, Izv Akad Nauk Kaz SSR., Ser Khim (1980) 48 hergestellt. Disuccinimidodicarbonat und 6-Aminohexanol werden von Aldrich erhalten.
Aminomethyliertes Polystyrol (1 g, 3,0 meq/g) wird in Wasser/Acetonitril (10 ml, 3:1 v/v) suspendiert und bei 4ºC mit Bernsteinsäureanhydrid (20 mmol) behandelt. Der pH der Lösung wird durch die Zugabe von 20%iger NaOH bei 6,0 gehalten. Wenn der pH der Lösung konstant bleibt, wird die Reaktion 24 Stunden fortgesetzt. Die Kügelchen werden filtriert, mit 2 N HCl und Wasser (bis der pH der Waschflüssigkeit neutral ist) gewaschen, und durch wiederholtes Waschen mit Dioxan vom wasserfrei gemacht.
Der Träger aus dem vorherigen Abschnitt (der gebundene Säuregruppen hat) wird mit Disuccinimidocarbonat (20 mmol) in Acetonitril (10 ml) 24 Stunden lang bei 25 ºC zur Reaktion gebracht. Der Träger wird durch Filtration isoliert, und der Träger mit dem gebundenen Succinimidoester wird gründlich mit Acetonitril gewaschen.
Der obenstehende Träger wird in Dimethylformamid (10 ml) suspendiert und mit 6- Aminohexanol (20 mmol) 24 Stunden lang bei 25ºC zur Reaktion gebracht. Der Träger wird durch Filtration isoliert, und der Träger mit der gebundenen Alkoholkette wird gründlich mit Dimethylformamid gewaschen.

Beispiel 27

Verfahren zur Kopplung von Aminonukleosiden an den Träger

N-Methylimidazol, Tetrabutylammoniumchlorid, Tetrabutylammoniumfluorid und Imidazol werden von Aldrich erhalten. Bis-(p-nitrophenyl)-carbonat wird von Sigma (St. Louis, MO) bezogen.
Der am Träger vorhandene Alkohol (10 mmol) wird mit einem Kopplungsreagenz wie Carbonyldiimidazol (50 mmol) in Dimethylformamid (30 ml) 3 Stunden lang bei 25ºC zur Reaktion gebracht. Der aktivierte Träger wird durch Filtration isoliert und gründlich mit Dimethylformamid gewaschen. Der Träger wird in 30 ml Dimethylformamid resuspendiert und mit einem ausgewählten Polycarbamatpolymer (50 mmol) behandelt, das wie in Beispiel 21 hergestellt wurde. Nach 3 Stunden wird der am Träger vorhandene Alkohol filtriert und gründlich mit Dimethylformamid gewaschen.
Eine ausgewählte Sonde, die spezifisch für eine Zielsequenz ist, die die Positionen 8441 bis 8456 des ORF-2-Gens von ARV-2, dem ethiologischen Agens des AIDS-Virus (Sanchez-Pescador et al., Science (1985) 227:484), umfaßt, wird durch Koppeln des Gels mit den folgenden 5'-Aminonukleotiden (in der Reihenfolge der frühesten Einführung): C,T,G,C,T,C,C,C,A,C,C,C,C,A,T,C, wobei C, G und A für N-(β-(Trimethylsilyl)ethoxycarbonyl)-geschütztes 5'-Amino-2',5'-didesoxycytidin, -guanosin bzw. -adenosin stehen, und T 5'-Amino-2',5'-didesoxythymidin repräsentiert, synthetisiert.
Das am Träger vorhandene Polycarbamat (10 mmol) wird in Acetonitril (30 mmol) suspendiert, mit Tetrabutylammoniumchlorid (3 mmol pro meq der Schutzgruppe) und Kaliumfluorid-Dihydrat (4 mmol pro meq der Schutzgruppe) behandelt und 12 Stunden lang auf 50ºC erhitzt. Nach Ablauf dieser Zeitspanne wird Wasser (30 ml) zugegeben und die am Träger vorhandene Sonde gründlich mit Wasser gewaschen. Die Schutzgruppe kann auch mit Tetrabutylammoniumfluorid in Tetrahydrofuran (3 mmol pro meq der Schutzgruppe) unter den gleichen Bedingungen entfernt werden.

Beispiel 28

Schutz der Aminogruppe als das BOC-Derivat 4-(N-tert-Butoxycarbonyl-N-methylamino)-buttersäure

4-(Methylamino)-buttersäure wird von Aldrich bezogen. Di-tert-Butyldicarbonat wird von Pierce (Rockford, IL) bezogen.
4-(Methylamino)-buttersäure (10 mmol) wird in Dioxan/Wasser (30 ml, 2/1) gelöst und, 1 N NaOH (10 ml) wird zugegeben. Die Lösung wird auf 0ºC gekühlt, und di-tert-Butylcarbonat (11 mmol) wird unter Rühren zugesetzt. Nach 30 Minuten bei 25ºC wird das Dioxan unter vermindertem Druck entfernt und der pH der Lösung durch die Zugabe von Kaliumbisulfat auf pH - 2,5 eingestellt. Die wäßrige Phase wird gründlich mit Ethylacetat extrahiert, die organischen Schichten vereinigt und über Natriumsulfat getrocknet. Entfernen der Lösungsmittel unter vermindertem Druck ergibt die freie Säure, die durch Umkristallisieren aus Chloroform/Hexan oder durch Chromatographie auf Silicagel unter Verwendung von Chloroform/Methanol-Mischungen gereinigt wird.

Beispiel 29

Einführen der terminalen Dimethylaminogruppe und allgemeines Verfahren zur Aktivierung der Säure durch Umsetzung in das Imidazolid und allgemeines Verfahren zur Kopplung mit einem Amin

N,N'-Carbonyldiimidazol wird von Aldrich erhalten.
Eine Lösung der BOC-geschützten Aminosäure (oder Oligopeptidsäure, 1 mmol) wird mit Carbonyldiimidazol (1 mmol) bei -20ºC 6 lang Stunden behandelt. An diesem Zeitpunkt wird eine Lösung von Dimethylamin (im Überschuß) oder Oligopeptidamin (1 mmol), hergestellt wie in Beipiel 30, in DMF (1 ml) bei -20ºC zugesetzt und die Reaktion dann bei 25ºC 12 Stunden lang gerührt. Das Lösungsmittel wird unter vermindertem Druck entfernt und der Rückstand auf Silicagel unter Verwendung von Methanol/Chloroform einer Chromatographie unterworfen, um N,N-dimethyl-4-(N-tertbutoxycarbonyl-N-methylamino)-Butyramid zu ergeben.

Beispiel 30

Allgemeines Verfahren der Entfernung der BOC-Schutzgruppe von N,N-Dimethyl-4-(methylamino)-butyramid

Trifluoressigsäure wird von Aldrich bezogen.
N,N-Dimethyl-4-(N-tert-butoxycarbonyl-N-methylamino)-butyramid (des BOC-geschützten Oligopeptids, 1 mmol) (Beispiel XV) wird in Trifluoressigsäure (5 ml) gelöst und bei 25ºC eine Stunde lang gerührt. Das Lösungsmitel wird entfernt und der Rückstand zwischen 1 N NaOH/gesättigtem NaCl (1/10) und Chloroform aufgeteilt. Die wäßrige Phase wurde gründlich mit Chloroform extrahiert, die vereinigten organischen Schichten über Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck eingedampft, um das freie Amin zu ergeben. Dies konnte direkt für weitere Kopplungsreaktionen verwendet werden, oder auf Silicagel unter Verwendung von Methanol/Chloroform-Mischungen, die 1% Triethylamin enthielten, gereinigt werden.
Unter Verwendung des Kopplungsverfahrens und der BOC-Entschützungs-Sequenz können Polyamide verschiedener Längen hergestellt werden. Zum Beispiel liefert die Reaktion von 4-(N-tert-Butoxycarbonyl-N-methylamino)-butyrylimidazolid mit N,N-Dimethyl-4-(methylamino)-butyramid das dimere Monoamid. Entfernen der BOC-Gruppe und Kopplung mit einem anderen Äquivalent des Imidazolids ergibt das trimere Diamid, wobei das Verfahren bis zum Erreichen der gewünschten Kettenlänge wiederholt wird.
Alternativ dazu wird 4-(N-tert-Butoxycarbonyl-N-methylamino)-butyrylimidazolid mit 4-(Methylamino)-buttersäure zur Reaktion gebracht, und die resultierende dimere Säure wird mit N,N-Carbonyldiimidazol aktiviert und mit freien Amino-Oligoamiden gekoppelt.

Beispiel 31

Allgemeines Verfahren zur Reduktion der Amidverknüpfungen zu Aminen

AG-50 und Dowex-50W werden von Bio-Rad (Richmond, CA) erhalten.
Das zu reduzierende oligomere Polyamid wird mit Trifluoressigsäure wie in dem allgemeinen Verfahren behandelt, um die BOC-Gruppe zu entfernen. Nach der Isolierung und Reinigung wird das freie Amin (1 mmol) in Tetrahydrofuran (1 ml) tropfenweise einer Lösung von Boran (2 mmol pro Amidrest) in Tetrahydrofuran (3 ml) bei 25ºC zugesetzt. Die farblose Lösung wird 1 Stunde lang refluxiert, auf 0ºC gekühlt und tropfenweise mit 6 N HCl (1ml) behandelt. Nach Beendigung sämtlicher Gasbildung wird die Lösung unter vermindertem Druck zur Beseitigung des Tetrahydrofurans eingedampft, und die verbleibende wäßrige Lösung wird auf ein AG-50-Ionenaustauscherharz aufgetragen und durch Waschen der Säule mit Wasser (10 ml) und Eluieren des Polyamides mit einem Puffer, der Natriumacetat (0,1-2,0 M) und Natriumchlorid (0,1-2,0 M) bei pH 5 enthält, gereinigt. Nach dem Sammeln und Eindampfen der das gewünschte Produkt enthaltenden Fraktionen wird der Rückstand in 1 N HCl (4 ml) gelöst und auf eine Dowex 50W-Ionenaustauschersäule aufgetragen. Nach dem Waschen mit Wasser und dann 2 M HCl wird das Produkt durch Elution mit 6 N HCl und Entfernen des Lösungsmittels unter vermindertem Druck als das Hydrochlorid erhalten.
Die primäre Aminogruppe des Polyamins wird als das BOC-Derivat geschützt und unter Verwendung von Methyljodid wie in Beispiel 33 in das Ammoniumsalz umgewandelt.

Beispiel 32

Allgemeines Verfahren zur Einführung einer terminalen primären Aminogruppe in das Polyamin

4-Aminobuttersäure wird in das BOC-Derivat umgewandelt. Dieses wird mit Carbonyldiimidazol wie Beispiel 28 zur Reaktion gebracht und mit dem dimeren Amid aus Beispiel 29 behandelt. Abtrennen der BOC-Gruppe und Reduktion wie in Beispiel 31 lieferte das Polyamin.
Die primäre Aminogruppe des Polyamins wird als das BOC-Derivat wie im allgemeinen Verfahren geschützt, und unter Verwendung von Methyljodid wie in Beispiel 33 in das Ammoniumsalz umgewandelt.

Beispiel 33

Allgemeines Verfahren der Umsetzung des Polyamins in das Poly-(quarternäre Ammonium)-Salz (3-Aminopropyl-)-dimethyl-(3-(5'-dimethylamino-1- naphtalinsulfonylamino)-propyl)-ammoniumchlorid

Methyljodid und Ethyldiisopropylamin werden von Aldrich erhalten.
Zu einer Lösung von Bis-(3-aminopropyl)-methylamin (1 mmol) in Dioxan/Wasser (3 ml, 2/1) wird 1 N NaOH (1 ml) gegeben. Unter Rühren bei 0ºC wird Di-tert- Butyldicarbonat (1,1 mmol) zugegeben und die Mischung wird bei 25ºC 30 Minuten lang gerührt. Die basische Lösung wird gründlich mit Chloroform extrahiert, die vereinigten organischen Schichten werden über Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Das Produkt wird durch Eindampfen mit wasserfreiem Dimethylformamid (5ml) getrocknet. Der Rückstand wird in DMF gelöst, und die Lösung mit Methyljodid (12 mmol) bei 25ºC eine Stunde lang behandelt. Das Lösungsmittel wird eingedampft und der Rückstand in Trifluoressigsäure (5 ml) gelöst. Nach einer Stunde wird das Lösungsmitel eingedampft und der Rückstand in Pyridin (5 ml) gelöst. Zu dieser Lösung wird Ethyldiisopropylamin (2 mmol pro mmol primärer, sekundärer und tertiärer Aminogruppe) gegeben, und die Dansylgruppe wird durch Behandlung der Lösung mit 5-Dimethylamino-naphtalinsulfonylchlorid (0,9 mmol) (erhalten wie in Beispiel XX) bei 0ºC eingeführt, und dann wird die Mischung über Nacht bei 4ºC stehengelassen. Das Reaktionsprodukt wird wie in dem vorigen Abschnitt durch Ionenaustauschchromatographie gereinigt und als das Hydrochloridsalz isoliert.
Alternativ dazu kann der dansylierte Reporter direkt mit Methyljodid in Dimethylformamid behandelt, und wie oben durch Ionenaustauschchromatographie gereinigt werden.

Beispiel 34

Allgemeines Verfahren zur Einführung des Fluorophors

5-Dimethylamino-1-naphtalinsulfonylchlorid wird von Aldrich bezogen.
Zu einer Lösung eines Ausgangs-Polyamins (1 mmol) in Pyridin (5 ml) wird bei 0ºC 5-Dimethylamino-1-naphtalinsulfonylchlorid (0,85 mmol) gegeben, und die Mischung wird über Nacht bei 4ºC gerührt. Das Pyridin wird dann bei 25ºC unter vermindertem Druck entfernt, und der Rückstand wird in 1 N HCl (5 ml) gelöst und auf eine AG-50W- Ionenaustauschersäule aufgetragen. Nach Waschen mit Wasser (10 ml) wird das Produkt mit einem Puffer eluiert, der aus Natriumacetat (0,1-2,0 M) und Natriumchlorid (0,1-2,0 M) bei pH 5 besteht. Nach dem Sammeln und Konzentrieren der das Produkt enthaltenden Fraktionen wird der Rückstand in Wasser (10 ml) gelöst, und auf eine Dowex 50-W-Ionenaustauschersäule (Bio-Rad) aufgetragen, mit Wasser (10 ml) und 0,5 N HCl (5 ml) gewaschen, und zuletzt wird das Produkt mit 6 N HCl eluiert. Das Hydrochloridsalz des Produkts wird durch Entfernen des Lösungsmittels unter vermindertem Druck erhalten.

Beispiel 35

Herstellung eines diagnostischen Reagenz zur Detektion von Herpes Simplex Typ I und II

Die 16 Basen lange Sequenz an den Positionen 462 bis 477 des 2gD-Gens von Herpes Simplex-Virus, Typ I und II, 5'-GCGGGGCTGCGTTCGG-3', umfaßt die gewählte Zielsequenz (Lasky & Downbenko, DNA (1984) 3:23). Ein komplementäres Reagenz- Polymer, zusammengesetzt aus alternierenden Methylphosphonat/Phosphodiester- Bindungen, wird im wesentlichen gemäß den Verfahren der Beispiele 23 und 24 konstruiert.
Das Polymer wird in das 5'-O-(6-Aminohexyl)-Oligonukleotidanalog umgewandelt und mittels konventioneller Kopplungsverfahren über den Aminohexyl-Verbindungsarm an das Affi-Gel 10 Fesphasenträger-Material gekoppelt.
Die Schmelztemperatur der Polymer/Analyt-Duplex wurde bestimmt unter Verwendung eines synthetischen Oligonukleotids mit der 5'-GCGGGGCTGCGTTCGG-3'-Zielsequenz. Diese Zielsequenz, die gekauft oder mit konventionellen Verfahren konstruiert wird, wird mit einer im wesentlichen äquimolaren Menge des Polymers in Annealing- Puffer (10 mM EDTA, 100 mM Natriumphosphat, pH 7,2) gemischt (vor der Polymeranheftung an den festen Träger). Diese Lösung wird auf 90ºC erhitzt und langsam auf Raumtemperatur abgekühlt, um Annealing zu bewirken. Die Temperatur wird dann langsam erhöht, und die Absorption als Funktion der Temperatur aufgezeichnet. Die Schmelztemperatur (Tm) wird als die Temperatur festgelegt, bei der die Hälfte der gesamten Absorptionsänderung stattgefünden hat.

Beispiel 36

Detektion von Herpes Simplex Typ I und II

Eine Analytprobe, gewonnen als Hautabschabung eines infizierten Gebiets, wird in 0,1 ml EDTA-Detergenzlösung (10mM EDTA, 1% w/v Natriumdodecylsulfat, pH bis 7,0) suspendiert, kurz in einem "micro tissue grinder" (Kontes #K-885470) homogenisiert, und das Homogenat durch Zentrifugation in einem Mikrofilter (VWR Scientific # 28151-807) filtriert. Ein halber ml 4,5 M Natriumtrichloracetat wird zugesetzt, wonach nach einigen Sekunden 0,6 ml Ethanol folgen. Diese Präparation wird 30 min lang auf Eis gestellt und dann 5 min lang bei 10 000 g zentrifugiert. Der Überstand wird sorgfältig dekantiert und verworfen, und das Gefäß wird vorsichtig mit wäßrigem 80%igen Ethanol gespült. Das gefallte Material (oft nicht sichtbar) wird in 0,05 in' Annealing-Puffer (10 mM EDTA, 100 mM Natriumphosphat, pH 7,2) resuspendiert und zu einer angemessenen Menge diagnostischem Reagenz aus Beispiel XXI gegeben (geschätztes Molverhältnis Polymerreagenz/Analyt > 100). Das Annealing wurde 30 Minuten lang durchgeführt bei einer Temperatur 8ºC unter der Tm der Polymer/Ziel-Duplex (vorbestimmt wie in Beispiel 35 beschrieben), und dann wurde das diagnostische Reagenz dreimal mit 2 ml-Volumina Anneallingpuffer gewaschen. Dieses Waschen wird bequemerweise durch Zentrifügation in einem Mikrofilter ausgeführt. Nach dem Waschen wird das diagnostische Reagenz in 0,2 ml Reporterlösung suspendiert, die 1 mg des fluoreszenten diquarternären Ammonium-Reporters enthält, dessen Synthese in Beispiel 34 beschrieben ist. Die Reporterlösung enthält nur NaCl von einer wie obenstehend beschrieben ermittelten geeigneten Konzentration. Das diagnostische Reagenz wird als nächstes dreimal mit 2 ml-Volumina reporterfreier Bindungslösung gewaschen. Schließlich wird der Reporter aus dem diagnostischen Reagenz mit 0,1 ml 2 M NaCl eluiert, und das Eluat auf Fluoreszenz in einem Spektrofluorometer geprüft. Die Fluoreszenz einer Kontrollprobe ohne Analyt wird subtrahiert, um ein quantitatives Mäß proportional zu dem in der ursprünglichen Probe enthaltenen Analyten zu erhalten.

Beispiel 37

Herstellung eines diagnostischen Reagenz zur Detektion des AIDS-Virus

Die 16 Basen lange Sequenz an den Positionen 8441-8456 des ORF2-Gens des AIDSassoziierten Retrovirus (ARV-2), 5'-GATGGGGTGGGAGCAG-3' umfäßt die gewahlte Zielsequenz (Sanchez-Pescador et al., Science (1985) 227:484). Ein komplementäres Polymer mit carbamatverknüpften Untereinheiten wird im wesentlichen gemäß den in Beispiel 21 beschriebenen Verfahren konstruiert. Kurzgefaßt werden die 2'- Deoxyribonukleoside dA, dC und dG wie in Beispiel X geschützt. Diese geschützten Nukleoside plus Thymidin werden dann in ihre 5'-Aminoderivate umgewandelt. Polymerer Träger wird dann wie in Beispiel 25 oder 26 hergestellt, und die Untereinheiten werden sequentiell an diesen Träger durch das in diesen Beispielen beschriebene Verfahren geknüpft, um ein trägergebundenes geschütztes Polymer der Sequenz: Träger---CTGCTCCCACCCCATC-3' zu erhalten. Im abschließenden Schritt werden die Basenschutzgruppen entfernt, um das gewünschte carbamat-verknüpfte diagnostische Reagenz zu ergeben.
Die Schmelztemperatur des Polymer/Analytes wird wie folgt bestimmt. Ein RNA- Transkript wird aus einem einzelsträngigen Polynukleotid hergestellt. das eine zur Zielsequenz komplementäre Sequenz besitzt. Diese das Ziel enthaltende RNA wird in Annealing-Puffer (10 mM EDTA, 100 mM Natriumphosphat pH 7,0) suspendiert und dem obigen diagnostischen Reagenz zugesetzt. Die Mischung wird auf 90ºC erwärmt und langsam auf Raumtemperatur abgekühlt, um Annealing zu bewirken. Anschließend wird das diagostische Reagenz auf eine kleine wasserummantelte Cliromatographiesäule gegeben, durch die langsam Annealing-Puffer gepumpt wird. Die Temperatur wird langsam erhöht während der Ausfluß auffreigesetzte RNA überwacht wird. Die Freisetzungstemperatur (Tr) ist die Temperatur. bei der die RNA aus der Säule eluiert wird. Dieser Tr-Wert unterscheidet sich oft um ein bis einige Grad C von der entsprechenden Tm, die durch das in Beispiel XXI beschriebene Verfahren der hyperchromen Verschiebung bestimmt wird.

Beispiel 38

Herstellung eines enzymatischen Reporters zur Verwendung in Systemen, die ungeladene diagnostische Reagenzien verwenden

Ein polykationischer Schwanz mit einem primären Amin an einem Ende wird, wie es in den Beispielen XIV-XVIII beschrieben ist, hergestellt, was zur Struktur:
führt.
Ein mmol dieses Produkts wird im Dunkeln bei Raumtemperatur 24 Stunden lang mit einem Überschuß von 4-Fluor-3- zur Reaktion gebracht.
Unter Schwachlicht-Bedingungen wird das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt, und der Feststoff wird mit Hexan trituriert, um unreagiertes Phenylazid zu entfernen. Der Feststoff wird als nächstes in 10 ml 0,1 M NaCl suspendiert. und Cacodylsäure wird zugesetzt. um den pH auf 7,2 zu erniedrigen. Als nächstes werden 5 mg Alkalische Phosphatase (Sigina Chem Co., #P5778) zu 1 ml der vorherigen Schwanz-Lösung zugesetzt und 1 h lang mit einem hohen Lichtfluß von bei Licht 366 nm bestrahlt. Der resultierende Reporter wird 18 Stunden lang gegen ein großes Volumen an Puffer (0,1 M NaCl, 0.05 M Natriumcacodylat, pH7,0) dialysiert um den kationischen. nicht an das Enzym gebundenen Schwanz zu entfernen. Rinderserumalbumih (1% w/v) und Natriumazid (0,020% w/v) werden zur Stabilisierung des enzymatischen Teils dieses tetrakationischen Reporters zugesetzt. Aufbewahrt wird dieser Reporter bei 4ºC im Dunkeln.

Beispiel 39

Nachweis des AIDS-Virus

Fünf ml Blut, die vermutlich den AIDS-Virus enthalten, werden zentrifügiert, und 2 ml des zellfreien Serums werden zu 8 ml 4,5 M Natriumtrichloracetat, das 0,1 mg Polyadenylsäure (Sigma Chem Co #P9403) enthält, gegeben. Nach einigen Sekunden werden 10 ml Ethanol zugesetzt, und die Präparation wird 30 Minuten lang in einem Eisbad gekühlt und dann 5 min lang bei 10 000 g zentrifugiert. Der Überstand wird vorsichtig dekantiert und verworfen. Die ausgefallene Nukleinsäure (oft nicht sichtbar) wird mit wäßrigem 80%igen Ethanol gewaschen, gut getrocknet in 0,1 ml Annealing- Puffer (10 mM EDTA, 100 mM Natriumphosphat, pH 7,2) resuspendiert und zu einer angemessenen Menge diagnostischem Reagenz aus Beispiel 37 (geschätztes Molverhältnis Polymer/Ziel> 100) gegeben. Das Annealing wurde eine Stunde lang bei einer Temperatur 7ºC unter der Tr der Polymer/Ziel-Duplex (vorbestimmt wie in Beispiel 37) durchgeführt und dann wurde das diagnostische Reagenz dreimal mit 2 ml- Volumina Anneallingpuffer gewaschen. Dieses Waschen wird bequemerweise durch Zentrifügation in einem Mikrofilter ausgeführt.
Nach dem Waschen wird das diagnostische Reagenz in 0.2 ml einer Lösung des enzymatischen tetrakationschen Reporters, hergestellt wie in Beispiel 38, suspendiert. Nach 30 Sekunden wird das diagnostische Reagenz dreimal mit 2 ml-Volumina reporterfreier Bindungslösung gewaschen. Danach wird das diagnostische Reagenz in Entwicklungslösung (15 mM p-Nitrophenylphosphat 0,5 mM MgCl&sub2;. 1,0 M Diethanolamin, pH 9,8) suspendiert und 3 h lang bei 37ºC inkubiert. Durch den Reporter gebildetes p-Nitrophenol wird spektrophotometrisch quantitativ bestimmt. Die korrespondierende Absorption einer Kontrollprobe ohne Analyt wird subtrahiert, um ein quantitatives Maß proportional zu dem in der ursprünglichen Probe enthaltenen Analyten zu erhalten.
Während die Erfindung unter Bezug auf die spezifischen Ausführungsformen beschrieben wurde sollte erkannt werden daß verschiedene Anderungen und Modifikationen durchgeführt werden können ohne von der Erfindung abzuweichen. Zum Beispiel kann das diagnostische Reagenz mehrere Spezies trägergebundener Polymere beeinhalten, wobei jede Spezies so entworfen ist daß sie an eine unterschiedliche ausgewählte Zielsequenz in den Polynukleotidsträngen von verschiedenen Analyten bindet, oder das diagnostische Reagenz kann zwei Spezies trägergebundener Polymere beeinhalten, wobei jede Spezies so beschaffen ist daß sie an einen unterschiedlichen komplementären Strang eines Duplexanalyten bindet. Diese multi-Spezies-Reagenzien bieten das Potential zur Detektion mehr als eines Analyten in einem diagnostischen Test oder zur Verdoppelung der Sensitivität der Detektion eines einzelnen Duplexanalyten.

Claims

1. Diagnostisches System zur Bestimmung eines einzelsträngigen Polynucleotid-Analyten, der eine ausgewählte Zielbasensequenz enthäk wobei das System folgendes umfaßt:

ein diagnostisches Reagenz, bestehend aus einem festen Träger und am Träger gebundenen, multiplen Polymeren, wobei jedes Polymer dahlngehend wirksam ist, mit einer ausgewählten Bindungsaftinität an dem einzelsträngigen Polynucleotid zu bindeu wobei die Polymere nicht-homopolymere Polymermoleküle der Form

umfassen, worin:

(a) R&sub1; - Rn aus Purin, purinartigen Heterocyclen, Pyrimidin und pyrimidinartigen Heterocyclen gewählte Erkennungsteile sind, die wirksam sind durch Watson/Crick-Paarung an entsprechenden in Sequenz angeordneten Basen in der Zielsequenz zu binden;

(b) n dergestalt ist, daß die Gesamtanzahl der Watson/Crick-Wasserstoffbindungen, die zwischen einem Polymermolekül und einer Zielsequenz ausgebildet werden, mindestens etwa 15 beträgt;

(c) B B Gerüstteile sind, die vornehmlich mittels chemisch stabilen, rm wesentlichen ungeladenen, vornehmlich achiralen Verknüpfungen verbunden sind, ausgewählt aus der aus folgenden bestehenden Gruppe:

worin Y = O oder S ist, und E = oder

ist; und

(d) die Gerüstteile die Erkennungsteile an Positionen tragen, welche die Watson/- Crick-Basenpaarung zwischen den Erkennungsteilen und den entsprechenden, in Sequenz angeordneten Basen der Zielsequenz erlauben, und

Reportermoleküle wobei der Reporter aus einem oligokationischem Schwanz, der so gewählt ist daß er elektrostatisch an dem geladenen Gerüst des Polynucleotid-Analyten unter vorgewählten Bedingungen, bei denen der Schwanz nicht an dem weniger dicht geladenen oder ungeladenen Gerüst der Polymeren binden kann, bindet, und, am Schwanz gebunden einer oder mehreren Reportergruppen, die zur Bildung eines Signals gewählt sind, durch das die Anwesenheit des Reporters aufgespürt werden kann, besteht.

s

2. Diagnostisches System nach Anspruch 1, worin die Erkennungstelle des diagnostischen Reagenz aus der folgenden Gruppe gewählt sind:

3. Diagnostisches System nach Anspruch 1, worin die Erkennungsteile des diagnostischen Reagenz aus der folgenden Gruppe gewählt sind:

4. Diagnostisches Reagenz zur Verwendung im diagnostischen System nach Anspruch 1, worin der Gerüstteil B B eine der folgenden Formen aufweist:

worin Y = O oder S ist und E oder ist.

5. Diagnostisches Reagenz zur Verwendung in dem diagnostischen System nach Anspruch 1, worin der Gerüstteil B B eine der folgenden Formen besitzt:

worin Y = S oder O ist.

6. Diagnostisches Reagenz zur Verwendung in dem diagnostischen System nach Anspruch 1, worin der Gerüstteil B B eine der folgenden Formen besitzt:

worin und E = oder

ist.

7. Verwendung einer Morpholino-Untereinheit der Form:

worin P ein Basenpaarungsteil ist, der in der Lage ist, mittels Watson/Crick-Paarung an komplementäre Basen in einem Polynucleotid zu binden,

und worin T H oder eine N-Schutzgruppe ist, zur Herstellung eines Polymeren für die Verwendung in dem diagnostischen System von Anspruch 1.

8. Verwendung der Untereinheit nach Anspruch 7, worin P aus der aus

bestehenden Gruppe gewählt ist.

9. Verwendung der Untereinheit gemäß Anspruch 8, worin P ein N-geschütztes, exocyclisches Aminist.

10. Das diagnostische System nach Anspruch 1, worin die Polymermoleküle geladene Gruppen an einem oder an beiden Molekülenden enthalten.

11. Das diagnostische System nach Anspruch 1, worin die kationischen Gruppen in dem Reporterschwanz räumlich getrennt sind zur Bindung an konsekutiven negativen Ladungen in einem derartigen Zucker-Phosphat-Gerüst.

12. Das diagnostische System nach Anspruch 11, worin der Schwanz einen oligokationischen Teil der allgemeinen Formel:

--N&spplus;(R&sub1;)(R&sub2;)-(CH&sub2;)n-m--N&spplus;(R&sub3;)(R&sub4;)(R&sub5;)

besitzt, worin n = 2-5 ist, m > 0 ist und jedes R&sub1;-R&sub5; = H oder eine Alkylgruppe bedeutet.

13. Das diagnostische System nach Anspruch 1, worin die Reportergruppe eine oder mehrere fluoreszierende Gruppen, Enzym-Gruppen radioaktive Gruppen, chromophore Gruppen oder Radioisotop-Gruppen einschließt.

14. Verfahren zur Bestimmung eines Polynucleotid-Analyten, der eine ausgewählte Zielbasensequenz enthält, wobei das Verfahren folgendes umfaßt:

Bereitstelien eines diagnostischen Reagenz, bestehend aus einem festen Träger und am Träger gebundenen, multiplen Polymeren, wobei jedes Polymer dahingehend wirksam ist, mit einer ausgewählten Bindungsaffinität an das einzelsträngige Polynucleotid zu binden, wobei die Polymere nicht-homopolymere Polymermoleküle der Form:

umfassen, worin :

(a) R&sub1; - Rn aus Purin, purinartigen Heterocyclen, Pyrimidin und pyrimidinartigen Heterocyclen gewählte Erkennungsteile sind, die wirksam sind, um durch Watson/Crick-Paarung an entsprechenden, in Sequenz angeordneten Basen in der Zielsequenz zu binden;

(b) n dergestalt ist, daß die Gesamtanzahl der Watson/Crick-Wasserstoffbindungen, die zwischen einem Polymermolekül und der Zielsequenz ausgebildet werden mindestens etwa 15 beträgt;

(c) B B Gerüstteile sind, die vornehmlich mittels chemisch stabilen, im wesentlichen ungeladenen, vornehmlich achiralen Verknüpfungen verbunden sind, ausgewählt aus der aus folgendem bestehenden Gruppe:

worin Y = O oder S ist, und E = oder

ist; und

(d) die Gerüstteile die Erkennungsteile an Positionen tragen, welche die Watson/Crick-Basenpaarung zwischen den Erkennungsteilen und den entsprechenden, in Sequenz angeordneten Basen der Zielsequenz erlauben, und Mischen des Reagenz und einer Analyt-haltigen Frobe unter solchen gewählten Bedingungen, daß eine Sequenz-spezifische Bindung des Analyten an den Reagenzpolymeren verursacht wird,

Bereitstellen eines Reporters, bestehend aus einem oligokationischen Schwanz, der so angepaßt ist, daß er an das geladene Gerüst des Polynucleotid-Analyten unter vorgewählten Bedingungen bindet, bei denen der Schwanz nicht all den weniger dicht geladenen oder ungeladenen Gerüst solcher Polymeren bindet, und, gebunden an den oligokationischen Schwanz, einer oder mehreren Reportergruppen, die so gewählt sind, daß sie ein Signal erzeugen, durch das die Anwesenheit des Reporters bestimmt werden kann,

Hinzusetzen des Reporters zu dem Reagenz unter solchen vorgewählten Bedingungen,

Trennen des Reagenz von dem ungebundenen Material vor oder nach dem Hinzusetzen des Reporters, oder beidem, und

Bestimmen des Reportersignals vom Analyt-assoziierten Reporter.

15. Verfahren von Anspruch 14 zur Verwendung bei der Bestimmung eines doppelsträngigen Nucleinsäure-Analyten, wobei das Mischen bei einer ausgewählten Ionenstärke von weniger als etwa 0,2 M einwertigem Kation in Gegenwart eines Chelatisierungsmittels für zweiwertige Kationen und bei einer Temperatur oberhalb der Schmelztemperatur des doppelsträngigen Analyten durchgeführt wird.

16. Verfahren nach Anspruch 14, welches ferner das Begründen solcher vorgewählten Bedingnng als höchste Salzkonzentration einschließt, bei der ein adäquates Binden des Reporters an dem Reagenz-gebundenen Polynucleotid bei einer bestimmten Temperatur auftritt.

17. Diagnostisches System zur Bestimmung eines einzelsträngigen Polynucleotid-Analyten, der eine ausgewählte Zielbasensequenz enthält, wobei das System folgendes umfaßt:

ein diagnostisches Reagenz, bestehend aus einem festen Träger und am Träger gebundenen, multiplen Polymeren, wobei jedes Polymer dahingehend wirksam ist, mit einer ausgewählten Bindungsafrinität an dem einzelsträngigen Polynucleotid zu binden, wobei die Polymere nicht-homopolymere Polymermoleküle der Form

umfassen, worin:

(a) R&sub1; - Rn aus Purin, purinartigen Heterocyclen, Pymidin und pyrimidinartigen Heterocyclen gewählte Erkennungsteile sind, die wirksam sind, durch Watson/Crick-Paarung an entsprechenden, in Sequenz angeordneten Basen in der Zielsequenz zu binden;

(b) n dergestalt ist, daß die Gesamtanzahl der Watson/Crick-Wasserstollbindungen die zwischen einem Polymermolekül und einer Zielsequenz ausgebildet werden, mindestens etwa 15 beträgt;

(c) B B Gerüstteile sind, die vornehmlich mittels chemisch stabilen, im wesentlichen ungeladenen, vornehmlich achiralen Verknüpfiingen verbunden sind,

(d) die Polymere gebildet werden unter Verwendung von Morpholino-Untereinheiten der Form

worin P ein Basenpaarungsteil ist, der in der Lage ist, mittels Watson/Crick- Paarung an komplementären Basen in einem Polynucleotid zu binden, und worin T H oder eine N-Schutzgruppe ist, und

(e) die Gerütsteile die Erkennungsteile an Positionen tragen, die die Watson/Crick- Basenpaarung zwischen den Erkennungsteilen und den entsprechenden, in Sequenz angeordneten Basen der Zielsequenz ermöglichen, und

Reportermoleküle, wobei der Reporter aus einem oligokationischem Schwanz, der so gewählt ist, daß er elektrostatisch an dem geladenen Gerüst des Polynucleotid-Analyten unter vorgewählten Bedingungen, bei denen der Schwanz nicht an dem weniger dicht geladenen oder ungeladenen Gerüst der Polymeren binden kann, bindet, und, am Schwanz gebunden einer oder mehreren Reportergruppen, die zur Bildung eines Signals gewählt sind durch das die Anwesenheit des Reporters aufgespürt werden kann, besteht.

18. Diagnostisches Reagenz zur Verwendung in dem diagnostischen System nach Anspruch 17, worin P aus der aus

bestehenden Gruppe gewählt ist.

19. Diagnostisches Reagenz zur Verwendung in dem diagnostischen System von Anspruch 18, worin P ein N-geschütztes, exocyclisches Amin enthält.