JP3022967B2 - 立体規則性ポリヌクレオチド結合ポリマー - Google Patents

立体規則性ポリヌクレオチド結合ポリマー

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Description

【発明の詳細な説明】 1.発明の技術分野 本発明は塩基特異性のポリヌクレオチド結合ポリマー
に関する。 2.発明の背景 ポリヌクレオチド中の標的塩基配列を認識しかつこれ
と特異的に結合し得る化合物は，多くの潜在的に有益な
応用がある。例えば，治療用途では，この化合物は，ウ
イルス性のゲノムまたは他の一本鎖ポリヌクレオチド種
と結合して感染性微生物の特性を不活性化する作用があ
るだろう。診断上の応用では，この化合物は，一本鎖ポ
リヌクレオチドの分析の際に，ウイルスまたはバクテリ
アに特異的な核酸種の存在を検出するべく“ハイブリダ
イズ”するのに用いられるだろう。 ポリヌクレオチドの塩基特異的な標的領域に特異的に
結合し得る試薬を得る最も初期の試みは，（ベリコフ
（Belikov），ツァロトバ（Zarotova），グリネフ（Gri
nev））の概念に基づいていた。この概念では，アルキ
ル化試薬を用いて標的特異的なポリヌクレオチドを誘導
し，この誘導された化合物を標的の一本鎖RNAまたはDNA
と結合させる（スメルトン（Summerton）およびバルト
レット（Bartlett）（1978）,J.Molec.Biol,122:14
5）。次いで，この標的鎖をアルキル化すれば，この化
合物がこの標的に不可逆的に結合するだろう。この方法
には，主として２つの困難な点がある。１つは，この誘
導されたポリヌクレオチドの負に荷電したバックボーン
が，重要なことに，生体細胞の移動を制限している。２
番目には，この試薬中のホスホジエステル連鎖は，特
に，試薬を不活性化する遺伝子がエンドサイト−シスを
経て細胞内に入るときに，細胞ヌクレアーゼにより急速
な開裂を受ける。 より最近では，アンチセンス遺伝子（このRNA転写は
特定の標的一本鎖ポリヌクレオチドを認識しかつこれと
結合し得る）を運ぶプラスミドの設計には，組換えDNA
方法が与えられている。このようなプラスミドを細胞中
に導入すれば，アンチセンスmRNAが継続的に生成する。
このアンチセンスmRNAは，相補的な標的mRNAと対にな
り，それにより翻訳を阻害することは明らかである（イ
ツァント（Izant）およびバイントラウプ（Weintraub）
（1984）,Cell,36:1007:イツァントおよびバイントラウ
プ（1985）,Science,229:345）。この方法の特有の長所
は以下にある。このような単一のプラスミドでさえ，う
まく導入すれば，この標的化された遺伝子活性の継続的
な不活性化および／またはこの標的化された遺伝子配列
を含む病原体に対する永久的な抵抗性に潜在的な効果が
あるだろう。しかしながら，この方法は，このプラスミ
ド構造を用いて，大量の組織細胞または器官細胞を形質
転換するという問題により，厳密に制約されている。 細胞に容易に取り込まれるだけでなく細胞内分解に対
しても安定なポリヌクレオチド結合試薬を設計する試み
は，荷電されていないかまたは実質的に荷電されていな
いバックボーンを有するポリヌクレオチド類似物に焦点
がある。このような非荷電の化合物についての最も初期
のある報文には，多くのポリヌクレオチド類似物が包含
されていた。この類似物中では，通常の核酸の糖−リン
酸エステルバックボーンがポリビニルバックボーンによ
り置換されていた。このような核酸類似物は，相補的な
ポリヌクレオチドとともに正規のワトソン／クリック対
特異性を有することが示された。しかし，これは，実質
的にTm値の低下を伴っている（ピサ（Pitha）（1970）,
Biochem.Biophys.Acta,240:39）。 続いて，荷電されていないおよび実質的に荷電されて
いないヘテロ重合性ポリヌクレオチド類似物（これは核
酸とほとんど等構造である）は，標的化された一本鎖遺
伝子配列をインビボで不活性化するために調製されてい
る。これらの物質は，アリール窒素マスタードを誘導し
たオリゴヌクレオチド（カルポバ（Karpova）ら（198
0）,FEBS Letters,122:21）およびこれを誘導していな
いオリゴヌクレオチド（リチャード ツリス（Richard
Tullis）,Personal Communication,Molecular Biosyste
ms,Inc.,サンジエゴ）の両方を含んでいる。これらのヌ
クレオチドは，荷電されていないトリエステル状態で，
そのリン酸塩を有している。最近報告されているポリヌ
クレオチド類似物の新規なクラスには，主として荷電さ
れていないアタクチックなメチルホスホネートバックボ
ーン連鎖，またはホモキラルなメチルホスホネート連鎖
（これには，荷電されたアキラルなホスホジエステル連
鎖が交互に組み込まれている）が含まれる（Miller,Yan
o,Caroll,Jayaraman,and Ts'o（1979）,Biochem.,18:51
34;Miller,Dreon,Pulford,and Parland（1980）,J.Bio
l.Chem.,255:9659;Murakami,Blake,and Miller（198
5）,Biochem.,24:4041;Blake,Murakami,Spitz,Glave,Re
ddy,Ts'o,and Miller（1985），24:6132;Miller,Agris,
Aurelian,Blake,Murakami,Reddy,Spitz,and Ts'o（198
5）,Biochimie,67:769）。 上記荷電されていないまたは実質的に荷電されていな
いオリゴヌクレオチド類似物は，生体細胞内に入り，そ
の中の相補的な遺伝子配列と対になることが報告されて
いる。特に，この化合物が１分子当たり１つまたは２〜
３のイオン性基で設計されているなら，水性媒質中の溶
解性を高めるために，この細胞による最適な取り組みが
達成されることが見出されている。しかしながら，この
バックボーン上での荷電密度が著しく増すと，細胞膜を
通る輸送が不充分になるという問題が生じる。また，ホ
スホジエステル連鎖が離されると，ヌクレアーゼの安定
性がより大きくなる。 上記荷電されていないおよび実質的に荷電されていな
いポリヌクレオチド類似物は，すべて，キラルなバック
ボーン連鎖，すなわち２つの可能な立体異性体形状を与
える連鎖を有する。結果として，サブユニットを連結す
ることにより生じるポリマーのバックボーンは，左巻き
形状および右巻き形状のランダム配列を有する。このタ
イプのバックボーン構造は，また，アタクチックバック
ボーンとして述べられている。この構造は，類似物／標
的結合定数が広範囲なところに特徴がある。正規の相補
的なポリヌクレオチド間の結合定数に関しては，この平
均の結合定数は著しく低減され得る。 このホスホトリエステルおよびメチルホスホネートが
結合した核酸類似物に関し，この結合定数の減少および
広がりは，おそらく，近接した塩基のワトソン／クリッ
ク対を助けるある鎖状異性体，および近接した塩基のワ
トソン／クリック対を阻害する他の鎖状異性体に由来す
る。この連鎖の塩基対上のキラリティー効果は，メチル
ホスホネートを連結したジデオキシリボヌクレオシドの
２つの分かれた異性体形状を包括する研究により，うま
く確立されている。これらの２量体の各々は，その相補
的なポリリボヌクレオチドと混合された。ある異性体は
19.8℃のTmで結合することが見出された。これに対し
て，他の異性体は,15.4℃の対応するTm値しか有してい
なかった（Miller,Dreon,Pulford,and Parland（198
0）,J.Biol.Chem,255:9659）。この異性体のメチルホス
ホネート２量体を通常のホスホジエステル連鎖と連結す
ることにより形成される同種の異性化10量体についてTm
結合値を調べるために，これらの研究はさらに拡大され
た。好ましい異性化メチルホスホネート連鎖を有する２
量体から形成されたこの10量体は,33℃のTmで相補的な
遺伝子配列と対になった。対照では，メチルホスホネー
ト連鎖の他の異性体形状を含む対応する10量体は,0℃で
もその相補的な遺伝子配列と対になはらなかった（Mill
er,Dreon,Pulford,and Parland（1980）,J.Biol.Chem,2
55:9659）。 理論的な領域では，治療上および／または診断上の価
値のある配列特異的なポリヌクレオチド結合試薬に関
し，これが実質的に一定の結合定数をもった相補的な標
的配列と対になると信ずべき理由がある。ここでの理由
づけは，以下のとおりである。与えられた調製物が多数
の分子種を含むなら，その各々はそれ自体の標的結合定
数に分かれる。次いで，低い結合定数を有する分子種
は，ほとんど標的結合活性を与えない。これに対して，
著しく高い結合定数を有するいくつかの分子種も，ま
た，標的でない配列に誤って対になった比較的安定な複
合体を形成する。治療上の状況では，標的でない配列に
著しく結合すれば，有害な副作用の生じる可能性があ
る。これに対して，診断上の状況では，このような結合
によれば，高いバックグラウンドおよび／または誤った
正電荷が生じるだろう。 原則として，現在利用できる方法を用いれば，あらか
じめ荷電されるかまたは一部荷電され，かつキラリーに
連結された核酸類似物（これは実質的に一定の標的結合
定数を有する）を調製できるだろう。このことを達成す
る１つの方法には，ポリマー溶液をアフィニティーカラ
ムに結合させることが包含されるだろう。このポリマー
溶液は，与えられた標的配列に対し広範囲のTm値をもっ
たポリマー種を含有する。このアフィニティーカラム
は，一定の形式で標的配列を有している。次いで，この
類似物は，ホルムアミドのような溶離液に濃度勾配を設
けて溶出されるかおよび／または徐々に温度を上げて溶
出することにより溶出される。この溶離液は，より強固
に結合された類似物を，より高い溶離液濃度でしだいに
放出する。この溶離液を狭い範囲でカットすれば，そこ
には，実質的に一定の標的結合定数を有する分子が主と
して含まれるだろう。この方法で結合の同質性をより大
きくすれば，実質的に使用可能なポリマーの最終的な収
量が明らかに減少する。必要に応じて，タクチックな連
鎖（すなわち，すべての分子は，キラル中心の同じ配列
を有する）をもった荷電されていないオリゴヌクレオチ
ド類似物は，幾何学的な集合手順により調製され得る可
能性がある。この手順では，各サブユニットの添加段階
で形成される２つの立体異性体のうちの１つが保持さ
れ，そしてもう１つが除かれる。この方法では，もちろ
ん，次のような制約がある。これは，各サブユニットの
添加段階において，物質の少なくとも半分が捨てられ，
その結果，収量がせいぜい出発物質の1/2nとされ得るこ
とである。ここで,nは合成に要するカップリングの繰り
返し数である。 それゆえ，キラルなサブユニット間連鎖（これは，実
質的に一定の結合定数で相補的な標的配列と対になる）
を有する荷電されていないポリヌクレオチド類似物を調
製することが可能になるけれども，それにもかかわら
ず，このようなキラリーに連結されたポリマーを合成お
よび精製すれば，時間がかかるうえにどうしても収量が
少なくなるだろう。 3.発明の要旨 それゆえ，本発明の１つの一般的な目的は，従来技術
のポリヌクレオチド結合試薬に関連した問題点および制
約を実質的に解決する塩基特異的なポリヌクレオチド結
合ポリマー構造体を提供することにある。 本発明の関連した目的には，以下の事項が包含され
る： （ａ）ポリマーの分子成分が，一本鎖ポリヌクレオチド
中の標的配列に関し，全て実質的に同じ結合親和性を有
するようなポリマー構造体を提供すること。 （ｂ）約５〜30塩基対の間の長さ範囲内にあるほとんど
のヌクレオチド標的配列に対し標的化するべく設計され
得，かつ相対的に高収率で調製され得るようなポリマー
構造体を提供すること。 （ｃ）選択された標的配列に対し所望の結合親和性を有
するような結合ポリマー構造体を提供すること。 （ｄ）種々の治療上および診断上の応用に適当な結合化
合物を提供すること。この応用は，この化合物中のバッ
クボーン連鎖の立体規則的で荷電されていないかまたは
実質的に荷電されていない性質を利用する。 本発明は，選択された結合親和性をもって，塩基の標
的配列を含む一本鎖ポリヌクレオチドと結合するべく設
計されたポリマー構造体を包含する。このポリマー構造
体は、次の式の非単独重合性で実質的に立体規則的なポ
リマー分子を含む： ここで， （ａ）R1−Rnは，プリン，プリン類似物，ピリミジン，
およびピリミジン類似の複素環化合物から選択された認
識部分であり，この部分は，標的配列内の対応する内部
配列塩基とワトソン／クリック対により効果的に結合す
る； （ｂ）ｎは，ポリマー分子と標的配列との間で形成され
るワトソン／クリック水素結合の全数が少なくとも約15
であるような数である； （ｃ）Ｂ〜Ｂは，化学的に安定であり実質的に荷電され
ておらず主としてアラキルな連鎖により連結されるバッ
クボーン部分である； （ｄ）ユニットバックボーン長は５から７原子の範囲で
あり，そして該バックボーン部分が次の環状構造 を有し,;そして， （ｅ）このバックボーン部分は，この標的配列の対応す
る内部配列塩基とこの認識部分との間にワトソン／クリ
ック塩基対を入れる位置において，この認識部分を支持
している。 診断上の応用に用いるより好ましい実施態様では，こ
のポリマー分子は，水性媒質中での化合物の溶解性を増
すべく，少数の電荷を有している。この電荷は，分子の
末端領域またはアキラルに荷電されたバックボーン鎖で
付加され得る。 このポリマー分子は，本発明の合成方法に従って，ま
ず標的ポリヌクレオチド中の塩基配列を選択することに
より，構成される。この配列は，最終的な結合ポリマー
中のサブユニット数に対応して，典型的には約５−32塩
基，好ましくは約８−20塩基である。この結合ポリマー
の標的ポリヌクレオチドに対応する結合親和性は，標的
配列塩基の数（そして，対応していえば，この結合ポリ
マー中のサブユニット数）の増加により，増やされ得
る。次いで，このＢ−Riおよび／またはＢ−Rj形状のポ
リマーサブユニットが，標的特異的な配列中の塩基配列
に対応して，規定された配列で結合される。ここで,Ri
およびRjは，上記に定義されるごとく，認識部分であ
り，これは，それぞれ２つまたは３つのいずれかの水素
結合を介して，対応するポリヌクレオチドとともに，ワ
トソン／クリック塩基対を形成し得る。この結合ポリマ
ーの標的ポリヌクレオチドに対する結合親和性またはTm
は，このポリマーの形成に用いられるRi認識部分とRj認
識部分との比に従って，選択的に変えられ得る。Ri認識
部分の割合が大きくなるほど，標的ポリヌクレオチドに
対する結合親和性がより低くなる。 このポリマーは，規定された標的塩基配列を有する分
析ポリヌクレオチドを検出するための診断システムに有
用である。このシステムは，固形担体と連結した本発明
のポリマー分子からなる担体試薬を含む。本発明の一実
施態様では，分子をつなぐポリマーは，主として荷電さ
れていない。別の実施態様では，このバックボーン部分
は，アキラルで荷電された連鎖（例えば，ホスホジエス
テル連鎖）により,1つまたはそれ以上の荷電されていな
いアキラル連鎖を交互に伴って連結されている。 この検出方法を実施するに際し，ポリヌクレオチド分
析物は，以下の条件でこの診断試薬に加えられる。この
条件では，この分析物は一本鎖の形状であり，この分析
物と試薬ポリマーとの間に配列特異的な対が入れられ
る。この分析物質／ポリマーアニーリング反応の後，こ
の試薬は，結合していない試験物質を除去するべく洗浄
される。この試薬および結合した分析物は，次いで，オ
リゴカチオン性レポーターと反応する。このレポーター
は，この結合した分析物の荷電されたホスホジエステル
連鎖とは静電引力により結合するが，荷電されていない
かまたは実質的に荷電されていないポリマー分子とは結
合しないように設計されている。このシステムの１つの
特徴は，結合したレポーターの結合した分析ポリヌクレ
オチドに対する比（分析分子当たりに結合されたレポー
ター分子の数）は，高感度の検定では,102〜104とされ
得るところにある。 治療上の応用では，このポリマー構造体は，選択され
た標的一本鎖ポリヌクレオチド（例えばRNAウイルス）
の発現を阻害するように設計されている。ここで，この
ポリマーは，好ましくは，非特異的結合効果を最小にす
るべく，標的発現の所望の阻害を生じるのに要する最小
の結合を伴って，この標的ポリヌクレオチドと特異的に
結合するように構成されている。 本発明のこれらの目的および他の目的および特徴は，
以下の本発明の詳細な説明を添付の図面と関連させて読
むと，よりいっそう明らかとなるであろう。 図面の簡単な説明 第１図は，本発明のポリマー分子を形成する際に用い
られるより好ましいプリン構造およびピリミジン構造を
示す。 第２図は，このポリマー分子を形成する際に用いられ
るより好ましいプリン類似物認識部分およびピリミジン
類似物認識部分を示す。 第３図は，このポリマー分子を形成する際に用いられ
るより好ましい環状バックボーン部分を示す。 第４図は，このポリマー分子を形成する際に用いられ
るより好ましい非環状バックボーン部分を示す。 第5A図および第5B図は,N1−−−−N2タイプのサブユ
ニットバックボーンをカップリングするための２つのよ
り好ましいサブユニット組立スキームを例示している。 第６図は，第5A図および第5B図に例示の方法に従って
形成されたＤ−Ｄを介したサブユニットダイマーＡ−Ａ
のバックボーン構造を示し，かつ第7A図および第7B図に
例示の方法に従って形成された２つの環状バックボーン
構造を示す。 第7A−7C図は,N1−−−−Ｅタイプのサブユニットバ
ックボーンをカップリングするための３つのより好まし
いサブユニット組立てスキームを例示している。そし
て， 第８図は，第7A−7C図に例示の方法に従って形成され
たサブユニットダイマーのより好ましい非環状バックボ
ーン構造を示す。 本発明の詳細な説明 本発明の診断システムは，多数のヌクレオチド結合ポ
リマー分子を備えた固体担体からなる固体担体試薬を含
んでいる。本発明のポリマー構造体は，選択された結合
親和性で，塩基の標的配列を含むポリヌクレオチドと結
合するように設計されている。このポリマー構造体は，
非単独重合性で実質的に立体規則的な分子または種（以
下の形式である）からなっている： ここで,B−Riは，バックボーン部分Ｂおよび認識部分
Ri含む一連の塩基特異的なサブユニットである。この認
識部分Riは，標的配列中の対応する内部配列塩基と，ワ
トソン／クリック塩基対により特異的に結合するように
選択されている。このサブユニットは，これらバックボ
ーン部分を介して，主としてアキラルであり実質的に非
荷電の結合と連結されている。このポリマー種を構成す
る際の使用に適当なサブユニットの設計および選択は，
以下の第１節に記述されるだろう。アキラルな連鎖を介
したサブユニットのカップリング方法は，第２節に記述
されている。サブユニット保護基とともに，サブユニッ
ト合成の際に包含される戦略は，第２節で論じられてい
る。 このポリマー種は，連続して起こるサブユニットカッ
プリングにより合成され，選択された長さおよび配列の
ポリマー分子が形成される。第４節に記述のように，こ
の標的配列およびポリマー配列の長さは，所望の結合特
異性を達成するべく選択される。このポリマーの標的に
対する結合親和性は，第４節に論じるいくつかの戦略に
より選択的に変えられ得る。この戦略には認識部分の選
択が含まれる。この認識部分は，対応する標的塩基とと
もに,3つ（より大きい結合親和性のために）または２つ
（より小さな結合親和性のために）のいずれかの塩基と
対になった水素結合を形成し得る。この得られた組成物
は，ポリマー種またはポリマー分子を含む。これらのす
べては，実質的に同じサブユニット配列および実質的に
同じ内部サブユニット連鎖のタイプを有している。機能
的な言い方では，このポリマー種のすべては，この標的
ポリヌクレオチドに対し，実質的に同じ結合親和性を有
している。いったん所望のサブユニット配列が選択され
ると，このポリマーを組立てる方法は第４節に示され
る。 このポリマー構造体は，第４節に記述の新規な固相診
断システムに有用である。このシステムは，各結合され
た分析分子に対し増幅されたレポーターシグナルを与え
るべく，分析ポリヌクレオチド分子の担体結合ポリマー
分子への結合および続いて起こる多数のポリカチオン性
レポーター分子のこのポリヌクレオチドへの静電気的な
付加に基づいている。このポリマーもまた，診断上の応
用を含めた種々の溶液への適用これは第４節でも考察さ
れる）に有用である。 I.サブユニット構造 A.認識部分 本発明のポリマー種を形成する際の使用に適当なサブ
ユニットＢ−Riの設計には，多数の構造上の規準および
／または立体化学的な規準が包含される。この規準は，
バックボーン部分および認識部分だけでなく，この２つ
の間の連鎖によっても達成されるに違いない。この認識
部分の設計上の必要条件がまず考慮されるだろう。 各サブユニットの認識部分は，確かな立体配置で保持
された２つまたは３つの水素結合基を供給するに違いな
い。この立体配置は，標的遺伝子配列の特異化された内
部配列塩基上の２つまたは３つのワトソン／クリック水
素結合部位に対する水素結合に適合する。認識部分とそ
れに対応する標的塩基との間の望ましくないミスペアリ
ングを避けるために，使用条件下において，（１）この
認識部分の互変異性状態を相対的に安定化すべきであ
り，そして（２）この認識部分は，水素結合基が相対的
に固定した配置となる構造を有するべきである。このよ
うな固定化は，最適には，極性の水素結合基を有する環
構造により供給される。この極性の水素結合基は，環の
一部を形成するかあるいは環に直接付加されるかいずれ
かである。 このより好ましい認識部分の構造は，プリン，プリン
類似物，ピリミジン，およびピリミジン類似物の構造を
含んでいる。この構造は,2つまたは３つのいずれかの水
素結合を介して，選択されたポリヌクレオチド塩基とワ
トソン／クリック塩基対を形成するように設計されてい
る。ポリマーの合成で用いられるサブユニット基は，少
なくとも２つの認識部分を含んでおり，この認識部分
は，異なるポリヌクレオチド塩基に対し塩基特異的であ
る。好ましくは，天然のDNAヌクレオチドまたはRNAヌク
レオチド中の４つの塩基のそれぞれに対し,1つまたはそ
れ以上の認識部分がある。また，以下でわかるように，
認識部分の１つの基Ri（これは２つの水素結合を介して
ヌクレオチド塩基と塩基対になり得る）と,2番目の基Rj
（これは３つの水素結合を介して同じ塩基と結合し得
る）とを供給するのが望ましい。第１図に，典型的なプ
リン型の認識部分およびピリミジン型の認識部分を示
す。このプリン構造１および２は，チミン塩基またはウ
ラシル塩基と結合するべく設計されており，構造３−６
はグアニン塩基と，構造７−９はシトシン塩基と，そし
て構造10−12はアデニン塩基と結合するべく設計されて
いる。構造1,4,5,6,8および10−12は,2つの水素結合を
介して，対応する内部配列塩基と結合するように適合さ
れたRiタイプの部分である。残りの構造は,Rjタイプの
部分であり，これは塩基対上に３つの水素結合を形成す
る。以下でわかるように，プリンヌクレオシドおよびピ
リミジンヌクレオシドは，ポリマー合成での使用に適当
な種々の他のサブユニットを合成する際に有用である。
これらのサブユニットは，必要ならアミン保護基で修飾
される。これらは，市販の原料から得られるかまたは公
知方法（例えば，実施例１に記述されているかまたはそ
れに関連した方法）に従って調製され得る。 多くのプリン類似物構造またはピリミジン類似物構造
が第２図に示されている。これらの構造内では，認識部
分が環状炭素を介してバックボーンと連結されている。
これらの構造は，第１図に示される類似物構造の塩基対
特異性や水素結合特性と似かよった塩基対特異性や水素
結合特性を有する。炭素で連結された認識部分を含むポ
リマーの結合特性は，認識部分が窒素で結合されるポリ
マー（第１図のような）の結合特性と著しく変わらない
けれども，この炭素で結合した部分を含むサブユニット
は，一般に，実施されたプリンおよびピリミジンを含む
サブユニットよりも合成が困難である。しかしながら，
あるサブユニットの合成，例えば，実施例10に記述のア
キラルな非環状のバックボーンサブユニットの合成で
は，炭素で結合した認識部分が有用な出発物質を提供し
ている。 B.バックボーン部分 各サブユニットのバックボーン部分は，一般式N1−−
−−ＥまたはN1−−−−N2を有する。ここで,N1およびN
2は求核性基であり,Eは求電子性基である。以下で論じ
るように，得られるサブユニット間連鎖に必要な安定性
およびサブユニット結合の容易性に基づくと，より好ま
しい求核性基はアミノ基，水酸基およびヒドラジノ基で
ある。そして，より好ましい求電子性基および／または
求電子性結合試薬は，炭酸，チオ炭酸，カルボン酸およ
びスルホン酸の誘導体である。 バックボーン部分は，環状構造または非環状構造のい
ずれかを有し得る。可能なバックボーン部分の構造の全
数は極めて多いものの，それにもかかわらず，多くの要
因のために，かなり限られた数の構造しか実際に実施す
るに値しない。都合のよいバックボーン部分を選択する
最初の手順を次に示した。 第一の条件としては，これらの環状のバックボーン部
分だけは，デオキシリボースまたリボースからなるかま
たはそこから容易に誘導され得ると考えられた。この制
約は実際的な制約であり，これは，多数のキラル中心を
もつ環構造を新生合成することが困難であるうえにそれ
に対応してより多くの経費がかかることを反映してい
る。一般に，ポリマーに適当と行われる可能性のあるバ
ックボーン部分およびサブユニット間連鎖は，以下の要
因の１つまたはそれ以上に基づいて選択された：公知の
反応に基づく合成の実行可能性；入手可能な出発物質か
らの合成の予期された容易性：構造の簡単さ；および最
終的なバックボーンの予期された安定性。 都合のよいバックボーン部分およびサブユニット間連
鎖の最初の選抜は，以下のように行われた。Ｂ型のオリ
ゴデオキシリボヌクレオチドおよびＡ型のオリゴヌクレ
オチドのΧ線回折により決定されたパラメーターに従っ
て，二重のDNAおよびRNAの空間−充填CPK分子モデルが
構成された。これら構成された各二重構造において,2つ
の糖−リン酸塩バックボーンのうちの１つは除去され
た。次いで，可能であれば，この塩基形状における最初
の糖−リン酸塩バックボーンが除かれた部位に，各可能
性のあるバックボーンが付加された。得られた各ポリヌ
クレオチド／ポリマー二重構造は，次いで，そのワトソ
ン／クリック塩基対の同一平面性，可能性のあるポリマ
ーバックボーン中のねじれ歪みおよび角度歪み，この核
酸鎖上で付与される歪みの程度，および鎖間および鎖内
の非結合性相互作用について調べられた。各アミド基を
含むバックボーンについて，そのアミド部分が平面的で
あるようなコンホーメーションを容易に採用し得るかど
うかに，特に注目が払われた。このことは，アミドを平
面的でないコンホーメーションにするためには，かなり
のエネルギー損失を要することから重要である。 これら初期の研究から，次のことが立証された。必要
なユニットバックボーン長（すなわち,N1−−−−Ｅ内
のN1−−−−Ｅ間隔または活性化されたN1−−−−N2−
Ｅサブユニット内のN1−−−−Ｅ間隔）は，デオキシリ
ボースまたはリボース（環状バックボーン構造）を構成
するか，またはそこから誘導されるバックボーン部分に
対し,5−７原子であり,6原子長さが最適である。 上記モデル研究で受け入れ可能と判断されたサブユニ
ット構造は，次いで，合成の実行可能性および集められ
たポリマーバックボーンの安定性に関して評価された。
（この合成の実行可能性は，文献で報告された主要な合
成反応またはモデル化合物に関して実施される反応に基
づくか，および／またはこのサブユニットの実際の合成
を媒介としている。）（この集められたポリマーバック
ボーンの安定性では，一般に，適当に連結されたモデル
化合物またはサブユニットダイマーを用いて予備の安定
性研究が実行された。）これらのタイプの研究は，候補
となるバックボーン構造の数をさらに制限するべく用い
られた。この制限された候補のプールから，より好まし
い構造として，第３図に示す環状バックボーン構造Ａ−
Ｇが最終的に選択された。 この図では,N1−−−−N2タイプの環状バックボーン
部分を含むサブユニットＡ−Ｄは,2′−デオキシリボヌ
クレオシド（構造Ａ）:5′位置および３′位置がアミノ
基で置換された２′−デオキシリボヌクレオシド（それ
ぞれ，構造ＢおよびＣ）：およびリボヌクレオシドのモ
ルホリノ誘導体（構造Ｄ）を包含している。N1−−−−
Ｅタイプのバックボーン部分を含むサブユニットは，こ
れらの５′位置が１つまたは２つの炭素酸で置換された
２′−デオキシリボヌクレオシド（それぞれ，構造Ｅお
よびＦ）；および，これらの５′位置がカルボン酸で置
換されたリボヌクレオシドのＮ−アミノモルホリノ誘導
体（構造Ｇ）またはスルホン酸で置換されたリボヌクレ
オシドのＮ−アミノモルホリノ誘導体（構造Ｈ）を包含
している。 非環状（分岐していない鎖）のバックボーン部分に適
用される同じ分子モデルの方法では，一本鎖ポリヌクレ
オチドに対する塩基対水素結合内のポリマーコンホーメ
ーションに関して,4−６原子の範囲のユニットバックボ
ーン長が受け入れられ,5原子のバックボーン長が最適で
あることが示された。これは,6原子のユニットバックボ
ーン長が最適である環状バックボーンと対照的である。
さらに，このモデル化研究では，以下のことが示され
た。この環状の認識部分は，この相補的な塩基の同一平
面性を厳密に阻害することなく，しかもこの認識部分と
バックボーンとの間の望ましくない相互作用を導入する
ことなしでは，線状のバックボーン部分に直接付加し得
ない。この認識部分が１原子のスペーサーでこのバック
ボーン部分と連結されると，結合歪みが最小となった。
２原子スペーサーは許容されるが,3原子スペーサーは許
容され得ない。しかし，この認識部分と線状のバックボ
ーンとの間の自由度が増すと,2原子スペーサーでは標的
塩基と誤って対になり得る。 第４図に示される非環状バックボーン部分の構造Ｉ−
Ｎは，すべてバックボーン部分と認識部分との間に１原
子のメチレンスペーサーを含んでいる。この構造では，
相補的なポリヌクレオチドに好ましい塩基対に対する良
好なモデルが得られると予測された。２つの炭素スペー
サーを含む類似構造は受け入れ可能なことが示された
が，結合コンホーメーションは好ましくなかった。図に
示される構造および類似の２つの炭素スペーサー構造
は，一般に合成が容易なために，より好ましい非環状バ
ックボーン部分である。しかしながら，多くの他のバッ
クボーン部分もまた，一般に合成が容易でないかおよび
／または合成には安価ではないものの，まったく実行可
能でありかつ適当であることに触れておくべきである。 C.バックボーン／認識部分の結合 上記に示されるように，このポリマーサブユニット内
のバックボーンと認識部分とを接続する連鎖またはスペ
ーサーは，ある設計規準に適合するに違いない。この規
準は，ポリヌクレオチド塩基と結合する塩基対に対し，
この認識部分を位置決めするのに効果的である。第３図
に示される環状バックボーン部分の場合では，この認識
部分が，リボース構造またはリボース類似構造の１′炭
素に直接付加するときやモルホリノ構造の類似の１′位
置に直接付加するとき，このポリマー内の結合コンホー
メーションが最も好ましいことがモデル化研究により示
される。すなわち，この部分は，正規の結合位置におい
て，ヌクレオチドのリボース基またはデオキシリボース
基に対するプリン塩基またはピリミジン塩基の正しい立
体異性化立体配置で付加している。非環状の構造に関
し，この認識部分を好ましい結合位置に置くためには,1
つおよび２つの炭素原子スペーサーが必要である。１原
子スペーサーは，上記に論じられるごとくより好まし
い。 ポリヌクレオチド標的に対しこのポリマー分子が一定
の結合親和性を得るのに要する立体規則性ポリマーの立
体配置を達成するためには，このバックボーン／認識部
分の結合が，すべて一定のキラリティーを有するかまた
はアキラルかいずれかであることも必要である。もし，
各結合がこのすべてのポリマー分子のあるサブユニット
位置において，同じ立体異性化立体配置またはキラリテ
ィーを有するなら，ここでの定義のために，この結合は
一定のキラリティーを有すると考えられる。すなわち，
異なる配列位置でのサブユニットは，異なる内部の立体
異性化立体配置（特定の配列位置でのアキラリティーを
含む）を有し得るけれども，このポリマー分子間で与え
られた配列位置における結合は，すべて同じ立体異性化
立体配置を有する。ふつうに定義されたキラリティー
は，すべてのサブユニットに同じ立体異性化立体配置を
用いることにより，極めて容易に達成される。 この環状のバックボーン部分に対し，第３図に示され
る天然のＤ型立体異性化立体配置を有するヌクレオシド
類似物では，最も好ましい結合が起こる。このタイプの
サブユニットもまた，以下に論じられるごとく，天然の
Ｄ型ヌクレオシド出発物質を用いて，容易に合成され
る。第４図に関して，構造ＩおよびＬだけが，このバッ
クボーンと認識部分との間にキラルな連鎖を有すること
がわかる。これらのサブユニットは，記述のように，ホ
モキラルな出発物質を用いることにより，ホモキラルな
形状で容易に合成される。第４図に示される他の非環状
構造のすべてに対し，バックボーンの窒素原子にこの１
原子鎖が付加され，それゆえアキラルとなる。もちろん
このメチレンスペーサーもまたそれ自体アキラルであ
る。 II.保護基の戦略 このサブユニットの活性化および／またはカップリン
グに用いられる化合物がかなり高い反応性を有するため
に，この認識部分の環外にあって環に結合した窒素を保
護することが，一般に望ましく，またしばしば必要であ
る。これら保護基の選択は，まず第１に，これらサブユ
ニットから組立てられるポリマー内で用いるサブユニッ
ト間結合のタイプにより決定される。２番目には，保護
されるべき窒素の相対的な反応性により決定される。 塩基保護されたヌクレオシドは，また，以下で述べら
れるような多くのサブユニット合成反応において，有用
な出発試薬である。実施例１の極くありふれた多数のリ
ボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドを塩基
保護する方法は，実施例２に例示されている。この実施
例に詳述されている方法は，一般に，アミン保護基をも
ったヌクレオシドの形成に適用できる。 用いられるサブユニット間連鎖が求核剤，特に水酸化
アンモニウムに相対的に安定であると，核酸化学に用い
られる一般の塩基保護基が適している。このような求核
感度のないサブユニット間連鎖には，カルバミン酸塩連
鎖，アミド連鎖およびスルホンアミド連鎖が含まれる。
この認識部分に対し，対応する求核感度のある保護基に
は,CのN4に対するベンゾイル基,AのN6に対するベンゾイ
ル基またはｐ−ニトロベンゾイル基,GのN2に対するアセ
チル基またはイソブチリル基，および2,6−ジアミノプ
リン残基に対するN2,N6−ビスイソブチリル基がある。
ポリマー集合体の完成後において，水酸化アンモニウム
で処理することにより，これらの基の除去が達成され
る。 対照的に，用いられるサブユニット間連鎖が水酸化ア
ンモニウムのような求核剤に感度があると，適当な保護
基は，強力な非求核性塩基により，β脱離機構を経て除
去され得る保護基である。このような求核感度のあるサ
ブユニット間連鎖には，炭酸塩連鎖，エステル連鎖，お
よびより狭い範囲では，トリカルバミン酸塩連鎖が含ま
れる。この認識部分に対し，β脱離を経て除去可能な適
当な保護基には,CのN4およびＡのN6の両方に対する２−
（４−ニトロフェニル）エトキシカルボニル基または２
−（フェニルスルホニル）エトキシカルボニル基，およ
びＧのN2および2,6−ジアミノプリン残基のN2およびN6
に対する９−フルオレニルメトキシカルボニル基が包含
される。ポリマー集合体の完成後におけるこれらの基の
除去は，厳しい無水条件下での強力な非求核塩基1,8−
ジアザビシクロ〔5,4,O〕ウンデク−７−エン（DBU）の
処理により達成される。 このバックボーン部分（一般には上記構造のN1）の一
時的な求核保護に関して，一般的なポリマー集合戦略で
は，温和な酸により容易にに取り除かれる選択されたバ
ックボーン保護基が用いられる。保護基の選択に関する
１つの主要な規準は，これらの基が充分に安定ではある
が，除去に要する条件が成長ポリマーを損なうほど安定
ではないことにある。環状のバックボーン部分から集め
られたポリマーの場合のおもな問題点は，保護されたプ
リン残基をこれらバックボーン部分のC1に連結されるグ
リコシド結合の著しい酸感度にある。このバックボーン
保護基の選択に関する第２の基準は，この保護基が容易
に導入されるところにある。上記に基づいて，以下のバ
ックボーン保護基がより好ましい:1級水酸基に対するジ
（ｐ−メトキシ）トリチル基;1級アミン基に対するｐ−
メトキシトリチル基；および２級アミン基（モルホリノ
タイプのバックボーン部分中におけるような）に対する
フェニルイソプロポキシカルボニル基。これら保護基
は，ジクロメタン中で0.2Mのジクロ酢酸の処理により，
容易に除去され得る。 III.サブユニット合成 A.環状バックボーン部分 デオキシリボヌクレオシドサブユニット構造（第３図
の構造Ａ）を有するサブユニットは，市販の原料から得
られるかまたは実施例Ｉに記述のように，文献の方法に
より調製され得る。このサブユニットは，以下のリボシ
ドおよびデオキシリボシドを含んでおり，第１図で得ら
れる認識部分の構造数に従って同定される：アデノシン
およびデオキシアデノシン（構造１）;2,6−ジアミノプ
リンリボシドおよびデオキシリボシド（構造２）；シト
ジンおよびデオキシシトジン（構造３）;4−メトキシ−
２−ピリミジノンデオキシリボシド（構造４）;2−ヒド
ロキシ−５−メチルピリミジンデオキシリボシド（構造
５）;2−ヒドロキシピリミジンリボシド（構造６）；グ
アノシンおよびデオキシグアノシン（構造７）；イノシ
ンおよびデオキシイノシン（構造８）；チオグアノシン
およびデオキシチオグアノシン（構造９）；ウラジンお
よびデオキシウリジン（構造10）；チミジンおよび５−
メチルウリジン（構造11）；および５−ハロウリジンお
よび５−ハロデオキシウリジン（構造12）。 この５′−アミノ−２′,5′−ジデオキシリボヌクレ
オシド（第３図の構造Ｂ）は，実施例３に詳細の方法に
従って調製される。簡単に言えば，この選択されたデオ
キシリボヌクレオシド（必要に応じて塩基で保護され
た）は，トリフェニルホスフィン，四臭化炭素およびリ
チウムアジドとの反応に供され，対応する５′−アジド
ヌクレオシドが形成される。これは，次いで，炭素触媒
上のパラジウム存在下にて水素化により還元される。こ
のヌクレオシドは実施例１のように得られ，そして実施
例２のように塩基保護され得る。この反応物ヌクレオシ
ドの立体化学は５−アミノヌクレオシド類似物を形成す
る際に保存される。 他の還元方法は，実施例3.2に記述のように,5′−ア
ジド−５−ブロモウリジンのアジド基を還元する際に用
いられる。ここで，触媒なしの水素化は，環の水素原子
の分離を妨げるために必要である。この５′−アミング
アノシン化合物を形成する際に，実施例3.2に詳述のよ
うに，まずこの５′水酸基のトシル化，次いでアジドで
の置換により，このアジドは５′位に配置される。 この３′−アミノ−２′,3′−ジデオキシリボヌクレ
オシド（第３図の構造Ｃ）は，実施例４に詳述の方法に
従って調製される。簡単に言えば,5′位の水酸基にて保
護されるチミジンは,3′位の水酸基にてトシル化され，
次いで,2オキシ塩基置換基により分子内置換される。得
られた環はアジドによる処理によりすぐに開環され，正
確な立体異性形状のアジド類似物が生じる。この類似物
は，このアジド化合物と，選択されたプリン塩基または
ピリミジン塩基との反応により，選択された塩基類似物
に転化され得る。この後者は，必要に応じて，以下に記
述のように，続いて起こるサブユニットカップリング反
応に対し塩基保護されてもよい。このチミジンまたは他
のアジド類似物は，次いで還元され，所望の３′−アミ
ンヌクレオシドが生成する。このチミジン出発物質の立
体化学は，合成において保存される。 第３図の構造Ｄに示されるこのモルホリノタイプのサ
ブユニット誘導体の合成は，種々の異なる認識部分に対
し，実施例５で詳述されている。簡単に言えば，選択さ
れたヌクレオシド（必要に応じて塩基保護された）は，
重ホウ酸アンモニウムのようアンモニウム塩に溶解さ
れ，次いで，過ヨウ素酸ナトリウムとの反応に供され
て，過渡的な２′,3′−ジアルデヒドが形成される。こ
れは，次いで，アンモニウムイオン上で閉環され,2′位
および４′位に水酸基を有するモルホリノ環が形成され
る。この化合物は，次いで，この環の水酸基を除去する
べく，シアノ水酸化ホウ素ナトリウムで処理される。こ
の環の窒素は，好ましくは，続いて起こるサブユニット
カップリングに対し,2−フェニルイソプロピルカルバミ
ン酸塩として保護される。このヌクレオシド出発物質の
立体化学は保持される。 ５′位に酢酸基を有するデオキシリボースサブユニッ
ト構造（第３図の構造Ｆ）は，実施例６に記述の一般的
な合成スキームに従って調製され得る。このスキーム
は，構造Ｆで示される５′位が酢酸の化合物の合成を詳
述している。ここで,3′位が水酸基で保護されている選
択されたデオキシリボヌクレオシドは,5′位にアルデヒ
ドが転化され，続いて，不飽和な酢酸誘導体を与えるべ
く,2位に炭素のあるウィッティヒ試薬で処理される。こ
の側鎖オレフィンの還元により,5′位が酢酸である所望
の化合物が得られる。この反応は，出発ヌクレオシド物
質の立体化学を保存している。 この類似の５′位がギ酸塩の化合物（第３図の構造
Ｅ）は，上記５′ヌクレオシドアルデヒドを１個の炭素
のウィッティヒ試薬で処理し，得られたエノールを加水
分解して対応するホルムアルデヒド誘導体（これは所望
の酸に酸化される）を形成することにより，形成され
る。この反応は，出発ヌクレオシド物質の立体化学を保
存する。 B.サブユニット合成−非環状バックボーン 第４図の構造Ｉで示される５原子の鎖状アミノ酸サブ
ユニットは，実施例７−９で概説されている一般的な方
法に従って調製される。簡単に言えば，（Ｓ）−５−カ
ルボキシピロリドンが，公知方法により，立体化学的に
純粋な対応する（Ｓ）−５−トシルメチル−２−ピロリ
ドンに転化された。次いで，これは，選択されたプリン
またはピリミジンとの反応とに供され，対応する（Ｓ）
−５−メチルプリン（またはメチルピリミジン）ピロリ
ドンが形成される。この置換反応は最初の立体特異性を
保持し，その結果，形成されるサブユニットは，この認
識部分の結合部位において，このバックボーン炭素に対
し，同一異性である。 サブユニット合成に用いられるプリンは,1位および３
位の環窒素の反応性を減ずるべく，すなわち，環窒素に
ピロリドンがカップリングすることを最小にするべく，
好ましくは６位に電子吸引性基を含んでいる。このピロ
リドンが誘導されたプリンまたはピリミジンは，次い
で，以下の記述の開環ステップ前に，アミン誘導体に転
化され，必要に応じて塩基保護されてもよい。実施例7.
1および7.2はシトシンピロリドンおよびその塩基保護さ
れた誘導体の形成方法を詳述している。実施例7.3−7.5
で形成されるアデノシンピロリドンは，出発物質として
６−クロロプリンを用いている。この対応するピロリド
ンは，記述のように，アジド形成を経て，アデノシン誘
導体に転化される。このアデノシンは，実施例7.6のよ
うに開環前に塩基保護される。実施例7.7−7.9に記述の
ように,2−アミノ−６−クロロプリンから出発して，塩
基保護されたグアニンピロリドンを生ずるべく，類似の
方法が用いられる。2,6−ジアミノプリンピロリドン，
イノシンピロリンおよび２−ヒドロキシピリミジンピロ
リドンの合成にもまた，実施例７に詳述のように，類似
の方法が用いられる。 このピロリドンは，次いで,t−BOCで保護されたアミ
ンを用いてピロリドン環を開裂し，アミノ酸を形成する
一連の反応を経て処理される。実施例8.1−8.4は，多数
の選択された認識部分を有するこのようなｔ−BOCアミ
ノ酸の合成を記述している。最終ステップ（実施例５）
では，このｔ−BOC保護基は，第４図の構造Ｉで示され
る対応するアミノ酸を形成するべく，除去されてもよ
い。このアミノ酸は，以下の反応に従って，サブユニッ
トカップリングに対し直接用いられ得る。他方，このｔ
−BOCで保護された化合物は，サブユニットカップリン
グ反応で使用するために，その酸基において活性化され
得る。 第４図の構造Ｊで示されるサブユニット形成方法は，
それぞれシトジン類似物サブユニットおよびウリジン類
似物サブユニットを形成するために，実施例10.1と10.2
に概説される。簡単に言うと，ピリミジンタイプのサブ
ユニットを形成する際には，ピリミジンまたはニコシン
酸塩のような６員環の複素環が，バックボーンへの付加
がうまくできる炭素環部位で，反応性のあるメチレンを
含むように修飾される。実施例10.1に詳説されるよう
に，このシトシン類似物は,5−アミノ−５−ブロモピリ
ミジンを反応させて対応する５−位のカルボキシアルデ
ヒドを形成することにより形成される。実施例12にある
ように，このウリジン類似物は,6−ヒドロキシニコチン
酸エステルを対応するベンジリックアルコールに転化す
ることにより，形成される。この化合物は，二酸化マン
ガン存在下の反応により，アルデヒドに転化される。 このアルデヒド化合物は，次いで,4−アミノ酪酸のよ
うな所望のアミノ酸との反応に供される。安定なアミン
サブユニット形成のために還元される不安定なイミンを
生成するアミン基で反応がなされる。この２級アミン
は，実施例10.1に記述のように,t−BOC基により，酸基
の活性化を含むサブユニットカップリングに対して保護
され得る。バックボーン窒素においてメチレンスペーサ
ーを通じて，バックボーンに塩基が付加され，このサブ
ユニットがキラル中心を持たず，それゆえ立体規則的で
ないようにされる。 第４図のＫに示されるサブユニット構造を形成するた
めに，上記化合物のＣ−炭素バックボーン類似物が,3−
アミノプロピオン酸を用いて調製され，この化合物はさ
らに，酸化窒素で処理され，対応するＮ−ニトロソ化合
物が形成される。この化合物は，鉄塩存在下でH2IPdに
より，順に還元されて，ヒドラジノ酸サブユニットが得
られる。 II.バックボーンカップリング反応 本発明のポリマー分子の形成に用いられるカップリン
グ反応は，ひとつの選択されたサブユニットまたはサブ
ユニット配列を，もうひとつの選択されたサブユニット
またはサブユニット配列に結合させる階段的反応であ
る。この議論をするため，このカップリング反応は，一
般に，選択された認識部分R1を有する単一のサブユニッ
トＢ−R1が，同一または相異なる選択された認識部分R2
を有するもう１つの単一のサブユニットＢ−R2とカップ
リングして以下の形状の２量体を形成することに関して
記述されるだろう。 R1 R2 B B ここでR1およびR2は示された特異的配列を有する。 A:サブユニットのカップリング;N1−−−−N2バックボ
ーン立体配置 N1−−−−N2バックボーン立体配置を有するサブユニ
ットのカップリングの一般的な方法は，第5A図および第
5B図に例示される。上記第Ｉ節から想起されるように,N
1およびN2は，水酸基やアミン基のような求核性のバッ
クボーン基である。この基は，求電子基Ｅによって活性
化され得，活性化されたN1−Ｅバックボーン基またはN2
−Ｅバックボーン基が形成される。これらの基は，次い
で，第２のN1−−−−N2タイプのバックボーン部分と反
応してN1−−−−N2−Ｅ−N1−−−−N2バックボーン結
合された２量体を形成する。このタイプのサブユニット
バックボーンは，上記に特に記述されており，第３図の
構造Ａ−Ｄの環状バックボーンである。構造ＡおよびＢ
では，この活性化されたN2求核基が３′水酸基であり，
構造Ｃでは５′水酸基，そして，構造Ｄでは構造Ｃの
５′位の水酸基に相当する６′位の水酸基である。 第5A図に例示されるより好ましいカップリング方法で
は，選択された認識部分R1を有するサブユニットは，求
電子基Ｅによって活性化される。この認識部分の星印
は，必要な塩基保護を示す。この図からわかるように，
この選択されたサブユニットは,N1求核基で保護されて
おり，（ａ）N2求核基だけが活性化される，および
（ｂ）この活性化されたサブユニットは，それ自体で重
合し得ないことを保証している。第３図の構造A,Cおよ
びＤでは，このバックボーン保護基が５′水酸基であ
り，この保護基は，好ましくはジメトキシトリチル（DM
TO）のような酸不安定基である。 第5A図に示される活性化試薬は以下の一般式を有す
る： ここでΧは，酸素または硫黄，そしてＣは，求核基
（例えば，水酸基の酸素かアミンの窒素）と反応しＹと
置換して活性化されたサブユニットを形成し得る活性な
求電子基である。 活性化剤（例えば，ビス−ｐ−ニトロフェニルカーボ
ネート）は，カルボニルで活性化されたサブユニット
（Χ＝Ｏ）を与え，カーボネートやカルバメートサブユ
ニット連鎖を形成する際に使用される。同様に，チオカ
ルボニル−ジ−（1,2,4−トリアゾール）（Χ＝Ｓ）の
ような活性化剤は，チアカルバメート連鎖を形成する際
に使用される。 カルボニルで活性化されたサブユニットを含むサブユ
ニット活性化反応は，第４図のＡで示される５′位が保
護された２′−デオキシヌクレオシドに対し，実施例11
に詳述されている；実施例12では，第４図のＢで示され
る５′位が保護されたアミノヌクレオシド；実施例13で
は，第４図のＤに示されるＮが保護されたモルホリノタ
イプのサブユニットについて詳述されている。これらの
構造中の水酸基の活性化に用いられる一般的な反応条件
は，一般に適用可能である；チオカルボニル活性化サブ
ユニットを含むサブユニット活性化反応は,Bに示される
５′−アミノヌクレオシドに関し実施例14で，そして第
３図のＤに示されるモリホリノタイプのサブユニットは
実施例15に示した。 この活性化反応に続いて，シリカゲルクロマトグラフ
ィーのような通常の方法により，活性化複合体が精製さ
れる。次いで，これは２番目のサブユニットとの反応に
供される。このサブユニットの選択された認識部分R
2は，完成したポリマー中の次の配列中の認識部分を形
成する。このカップリング反応は，好ましくは，活性基
がバックボーンのN2アミン基とは反応し得るが,N1水酸
基とは反応し得ないような，温和な条件下で実行され
る。それゆえ，この方法は，第４図の構造Ｂ−Ｄに示さ
れるタイプのサブユニットのカップリングには適してい
るが，構造Ａのサブユニットには適さない。このカップ
リング方法の有利な点は，第２のサブユニット−これ
は，アミンN1の求核基および水酸基N2の求核基を含む−
が，最初に活性化されたサブユニットと，このN1アミン
を介してのみカップリングし，それゆえN2バックボーン
基を保護する必要がないことにある。従って，得られる
２量体サブユニットは，図示に示されるように,N2−Ｅ
−N1結合を通じてカップリングされる。 （ａ）この第２のサブユニットの遊離のN2求核基を活性
化し，活性化剤からこの活性化された種を分離し，そし
て活性化された化合物を，バックボーンが保護されてい
ない次の配列中のサブユニットとカップリングさせると
いう上記のステップをくり返すことにより，このオリゴ
マーが伸長され得る。この方法は，固相ブロックの集合
に適した溶液法（下記で記述されている）によって，短
いオリゴマーブロックを形成するのに特に使用される。 固相の連続的なサブユニット添加によってポリマーを
形成するために，第5Bに概説される第２のカップリング
法が，より好ましい。この第２の方法は，存在するサブ
ユニットまたはポリマー鎖に，活性化された過剰のサブ
ユニットを付加することにより，ポリマーの成長が起こ
る点で，最初の方法とは異なっている。むしろ最初の方
法では，活性化されていないサブユニットを活性化され
た鎖に付加することにより，ポリマーの成長が生じる。
第5B図には，認識部分がR1（第6B図の２列め）のサブユ
ニットにより，存在するサブユニットまたはサブユニッ
ト鎖が示される。このサブユニットは，遊離のN1バック
ボーン求核基およびN2求核基を有する。このN2求核基
は，固体担体との比較的酸に安定な結合により，または
固体担体と結合するサブユニット鎖に連結されることに
より，保護されている。このようにN2が保護された環状
バックボーンサブユニットを形成する方法は，一般的に
実施例12〜15に述べられている。この最初のサブユニッ
ト（成長するポリマー中で最も最近付加されたサブユニ
ット）は，ポリマー中の次の配列内のサブユニットにな
る活性化されたサブユニットとの反応にすぐに供され
る。この活性化されたサブユニットは,N2バックボーン
部位で活性化され，そして比較的酸に不安定な保護基に
よってN1部位が保護されている。このサブユニットは，
第６図に関連して上記で述べた方法により調製される。 第5B図でわかるように，このカップリング反応によ
り,N2−活性化した第２のサブユニットが,N1−保護され
た第１のサブユニットに付加され,N2−Ｅ−N1結合を介
して両者がカップリングされ，そして遊離のバックボー
ン求核部位の両方が保護された化合物が形成される。こ
の化合物は，例えば酸と反応させることによりすぐに処
理され，最後に付加されたサブユニット上の酸に不安定
なN1保護基が脱保護される。この手順は，所望の配列ポ
リマーを構築するべく繰り返される。 上記のことから，このN2−活性化されたサブユニット
（これは，最後の配列中のサブユニットを形成する）
は，そのN1バックボーン部位で保護され，それによりN2
部位での選択的な活性化を可能にするとともに活性化さ
れた化合物の自己重合を防止するに違いない。また，こ
のN1−脱保護されたサブユニットは，活性化サブユニッ
トとカップリングし得る。このサブユニットは,N2−活
性化されたサブユニットとそのN1部分との選択的な反応
を可能にするべく,N2部位が保護されるだろう。それゆ
え，この反応するサブユニットは,1つのバックボーン部
位がともに保護されているので，この方法は，ヌクレオ
シド（第４図の構造Ａ）のカップリングだけでなく，ア
ミンと水酸基バックボーン求核基の両方を含んだ環状バ
ックボーンを有するサブユニット（例えば，この図の構
造Ｂ−Ｄ）のカップリングにも適している。構造Ａのサ
ブユニットを，カーボネート結合を介してカップリング
するのに用いられる反応方法は，実施例12に詳述され
る。簡単に言うと,5′位が保護されたバックボーン部分
を含むサブユニットが,3′位の水酸基にて活性化され,
3′位の水酸基を保護した他のサブユニット（または成
長鎖）との反応に供される。このカップリング反応は,N
−メチルイミダゾールまたはN,N−ジメチルアミノピリ
ジンのような，カーボネート結合を形成するのに必要な
触媒の存在下で実行される。構造Ｂ〜Ｄの環状バックボ
ーンを含むサブユニットのカップリングには，サブユニ
ット間のカーバメート結合またはチオカーバメート結合
が形成される場合において，最初の方法に関して上に記
述のようなより温和な，触媒のないカップリング条件が
適している。 この第２のカップリング方法の，固相サブユニット添
加によるポリマーの形成に対する有利な点は，実質的に
過剰のモル数の活性化されたサブユニットが，各ポリマ
ーの添加階段において，成長している担体結合ポリマー
に加えられ，その結果，非常に高い割合で担体結合ポリ
マーにカップリングしているサブユニットが得られる点
にある。このことは，大部分の担体結合ポリマーが，所
望のサブユニットの完全な配列を含むことを保証してい
る。第１の方法と比較すると，この成長しているポリマ
ーが，最後に添加されたサブユニットで活性化される場
合には，サブユニット添加の効率は，活性化階段の効率
によって制限される。 第６図は，第４図でＡ−ＡからＤ−Ｄまで示される環
状バックボーンサブユニットのカップリングにより形成
される２量体構造を示す。この図の構造Ａ中のヌクレオ
シドサブユニットは，カーボネート（Ｙ＝Ｏ）による結
合される。残った３つの構造Ｂ−Ｄでは，このサブユニ
ットは，カーバメート（Ｙ＝Ｏ）結合またはチオカーバ
メート（Ｙ＝Ｓ）結合により連結される。この図からわ
かるように，すべてのサブユニット連鎖は，荷電してお
らずしかもアキラルである。すなわちキラル中心を含ん
でいない。添付に際し，この連鎖は，水系媒質中で安定
である。このことは，中性の水系溶液中において，長期
間にわたって加水分解に耐性があるというポリマーの性
能から判断される。 本発明の他の重要な特徴によれば，この構造は，ポリ
マーを形成するべく結合されるとき，相補的なポリヌク
レオチドとともに正しいワトソン／クリック塩基対を示
す。 最後に，もう１つの本発明の重要な特徴によれば，こ
のサブユニットから形成されるポリマーは，立体規則性
である。これは，（ａ）天然のヌクレオシドまたはヌク
レオシド誘導体または天然の立体異性化立体配置を有す
る合成ヌクレオシドをサブユニットとして用いること，
および（ｂ）アキラルなサブユニット間連鎖によりこの
サブユニットを連結すること，により達成される。カッ
プリング方法の例は，実施例11〜15に詳述される。 B.サブユニットカップリング;N1−−−−Ｅバックボー
ン立体配置 N1−−−−Ｅバックボーン立体配置を有するサブユニ
ットの一般的なカップリング方法は，第7A図，第7B図お
よび第7C図に例示される。上記第Ｉ節から想起されるよ
うに,N1は水酸基またはアミン基のような求核性バック
ボーン基であり,Eは，カルボキシル基またはスルホニル
基のような求電子基である。このN1は，活性化される
と，第２のN1−−−−Ｅタイプのバックボーンと反応し
て,N1−−−−Ｅ−N1−−−−Ｅバックボーン結合２量
体を形成し得る。このタイプのサブユニットバックボー
ン，特に上記に述べられるバックボーンは，第３図の環
状バックボーン構造Ｅ〜H,および第４図の非環状バック
ボーン構造Ｉ〜Ｎである。この環状構造ＥおよびＦにお
いて，このN1求核基は,3′位の水酸基であり，構造Ｇお
よびＨでは，モルホリノ環上の３′位の窒素に付加され
たアミンである。すべての環状構造において，このＥ基
は，リボース環の５′位かまたはモルホリノ環の６′位
に付加したカルボキシル基または対応するスルホニル基
である。第４図に示される全ての構造では，このN1基お
よびＥ基は，それぞれバックボーンアミンまたはヒドラ
ジンおよびバックボーン部分末端のカルボキシル基また
はスルホン酸基である。 この第１のカップリング方法は，第7A図に例示されて
おり，第5A図に関連して上記に述べた方法と類似してい
る。ここでは，第１のN1−保護されたサブユニットが活
性化され，次いで，バックボーン−非保護サブユニット
と直接カップリングされる。このサブユニットは，成長
しているポリマー中の次の配列内のサブユニットを形成
する。このサブユニットN1のP1保護基は，好ましくは，
固体担体に結合した開裂可能なリンカーか,t−ブトキシ
カルボニル基のような酸に不安定な保護基である。環状
バックボーン構造のN1−保護の方法は，環状構造Ａ〜Ｄ
に対し上記に述べた手順に類似している。同様の方法
が，非環状バックボーン構造中のアミンの窒素の保護に
効果的である。他方，もしこのポリマーが固相の担体上
で構成され得るなら，下記に述べるように，このバック
ボーンのN1部位は，成長ポリマーへのサブユニットの添
加に伴うN1部の固体担体への結合により保護され得る。
この成長ポリマーは，最後に添加されるサブユニットの
活性化された求電子基Ｅにより生じる。 この活性化反応は，活性化された部分または鎖の末端
部分が,N1−−−−Ｅ−Χを形成するように設計され
る。ここで，Χは第６図に関連して上記に記述されてい
る。この活性化されたサブユニットは，バックボーン求
核基に対して，以前に述べた方法で活性化されたサブユ
ニットと，ほとんど同様の反応性を有する。すなわち，
この活性化は,N1−−−−N2タイプのバックボーンとほ
とんど同様の活性化カップリング基を生成するべく設計
されている。しかし，その場合，この反応性のカルボニ
ル基またはスルホニル基が，第６図に示される方法のよ
うに，活性化試薬のカルボニル基またはスルホン基より
むしろバックボーン自身により供給される。この活性化
は，バックボーンの求電子基がカルボニル基の場合,p−
ニトロフェノールの存在下で,N1−−−−Ｅタイプのサ
ブユニットをカルボジイミドと反応させることにより，
容易に達成され得る。また，このバックボーンがスルホ
ニルの場合には，イミダ−ゾール,1,2,4−トリアゾール
またはテトラゾールの存在下でこのサブユニットをカル
ボジイミドと反応させることにより達成され得る。カル
ボニル求電子基を含むサブユニット活性化反応は，実施
例16および17に詳述される。このＮ−アミノ−モルフィ
リノ基および線状鎖バックボーンのカルボニル基を活性
化するのに用いられる一般的な反応条件は，一般に，第
３図および第４図に示される他のN1−−−−Ｅタイプの
バックボーン構造にも適用できる。 この活性化反応につづいて，この活性化複合体は，シ
リカクロマトグラフィーのような通常の方法により精製
される。または担体結合され活性化された鎖の場合に
は，単に洗浄される。次いで，選択された認識部分R2が
完全なポリマー中の配列内の次の認識部分を形成するよ
うな第２のサブユニットとの反応に供される。このカッ
プリング反応によって，図に示されるような２量体が得
られる。この２量体のサブユニットは，それゆえ,E−N1
結合を介してカップリングされている。上記のように，
両方のサブユニットは，活性化反応およびカップリング
反応の間に，適切に塩基保護されなければならない。 このポリマーは，上記の階段をくり返して伸長し得
る。この階段は，（ａ）第２のサブユニット中の遊離の
Ｅ求電子基を活性化すること，（ｂ）この活性化剤から
活性化された種を分離すること，および（ｃ）この活性
化された化合物と，次の配列中のサブユニット（これ
は，バックボーンが保護されていない）とをカップリン
グさせることである。 この第２のカップリング方法は，第7B図に例示され
る。この方法は，第5B図に関連して上記に記述の方法
と，直接的に類似している。ここでは,E−保護されたバ
ックボーンを有する最初のサブユニットが，活性化され
たＥ基および保護されたN1求核基を有する第２のサブユ
ニットとの反応に供され,E−N1結合により連結されかつ
両方の遊離したバックボーン末端基が保護された２量体
が形成される。このポリマーが，固相合成によって形成
される場合には，このP2保護“基”は，固体担体と酸安
定性の連鎖を形成する。このN1−保護されたサブユニッ
トは，上記のように調製されそして活性化される。カッ
プリングの条件は，一般に，上記の環状サブユニットカ
ップリング反応で用いられる条件に従う。 第7C図に示される第３のカップリング方法では，この
n1−保護されかつＥ−非保護のサブユニット（またはポ
リマーユニット）が，指示されるごとく，カルボジイミ
ドのような適当なＥ−活性化試薬の存在下で，ともに反
応に供される。 第８図は，環状および非環状のバックボーンサブユニ
ット（これらは，それぞれ第３図および第４図のＥ−K,
およびＥ−ＥからＫ−Ｋで示される）をカップリングす
ることにより生成する２量体構造を示す。第３図の構造
Ｆ−Ｆのヌクレオシドサブユニットは，エステル結合で
連結されている。環状バックボーン構造のままで，この
サブユニットＧ−Ｇは，ヒドラジド結合あるいはスルホ
ニルヒドラジド結合を介して連結されている。Ｉ−I,J
−ＪおよびＫ−Ｋに示される非環状バックボーンサブユ
ニットの全ては，アミド結合（Ｅ＝カルボニル）または
スルホンアミド結合（Ｅ＝スルホニル）を介して連結さ
れている。上記に述べられた環状バックボーンサブユニ
ット構造におけるように，すべてのサブユニット連鎖
は，エステル結合，ヒドラジド結合およびアミド結合の
溶液中での公知の安定性から推定されるように，水系媒
質中にてかなり安定である。 本発明の他の重要な特徴によれば，この構造は，ポリ
マーを形成するべく連結されるとき，相補的ポリヌクレ
オチドと，ワトソン／クリック塩基対を示す。 最後に，上に述べたN1−−−−N2バックボーンサブユ
ニットとともに示されているすべてのN1−−−−Ｅバッ
クボーン構造は立体規則性である。これは，（ａ）認識
部分のバックボーン部分への付加のホモモラル（第３図
のＥ〜Ｈおよび第４図のＩとＬ）な性質またはアキラル
（第４図のJ,K,MおよびＮ）な性質，および（ｂ）アキ
ラルなサブユニット連鎖による。 C.サブユニットのカップリング；交互に荷電され荷電さ
れていないアキラルな連鎖 いくらかの応用において，ひとつかあるいはそれ以上
の荷電されたアキラルなサブユニット連鎖をポリマー分
子中に導入することが望ましい。以下でさらに詳述され
るように，このバックボーンの電荷は，多くの溶液への
適用に際しポリマーの溶解度を促進し，あるいはポリマ
ーの標的結合定数を調製するために用いられ得る。荷電
されたアキラルなバックボーン連鎖，例えば,2番目かあ
るいは３番目のサブユニット間に規則的に配置したポリ
マーは，以下に述べるような新規な診察システムに適し
ている。現在議論している目的のために，アキラルな非
荷電連鎖によって内部に連結される２つかそれ以上のサ
ブユニットから構成されるポリマーユニットは，荷電さ
れたアキラルな連鎖により連結されうる。これらの非荷
電ユニットは，上記のＡ節およびＢ節に記述の方法の１
つにより形成される。 連結されうる２量体サブユニットは次のように選択さ
れる。ひとつの２量体の遊離したN2基が，もうひとつの
２量体の遊離のN1基と，適当に荷電されたアキラルな連
鎖を介して，カップリングされ得る。この望ましい連鎖
は，ひとつのサブユニットの遊離N2基と，もうひとつの
サブユニットの遊離のN1基がともに水酸基であることを
必要とするホスホジエステル結合である。第３図を見れ
ばわかるように，この条件では，構造Ａおよび構造Ｂの
いずれかのサブユニットから形成される２量体（その両
方は遊離のN2水酸基を有する）が，構造A,C,またはＤの
サブユニットから形成された２量体（これらは，全て遊
離のN1水酸基を有する）と結合するならば適当である。 典型的なカップリング方法では,N1位を保護した２量
体Ａは，第９図に示されるように，ホスホエステル結合
を介してN2水酸基と連結された反応性ホスホエステルカ
ップリング種に誘導される一連の反応の間保たれる。よ
り好ましいカップリング方法は，米国特許出願“ポリヌ
クレオチド測定試薬と方法”連続番号712,396（1985年
３月15日出願）に詳述されている。この方法は，塩基保
護されたヌクレオシドまたはヌクレオシド類似物サブユ
ニット間にホスホジエステル結合を形成するための文献
方法に従う。この方法は,N1−保護された反応性のN2−
（ｐ−クロロフェニル−２−シアノエチル）−ホスフェ
ートを形成することを包含する。この活性化された２量
体は，次いで，第２の２量体との反応に供され，非荷電
で立体異性型の連鎖および荷電されたアキラルなサブユ
ニット間連鎖により交互に連結される４量体を形成す
る。 このホスホジエステル連結方法は，アキラルではある
が荷電されていない連鎖を含むポリマーのカップリング
反応に関し，上記に概説の一般手順に従って，溶液タイ
プのポリマー合成方法または担体タイプのポリマー合成
方法のいずれかが組み合わされてもよい。 診断のためには，荷電された結合と非荷電のアキラル
な結合とを交互に有するポリマーが適当であるものの，
診断用途および特に治療用途では，水系媒質中で充分な
ポリマー溶解度を得るために必要な連鎖と同程度にほと
んど荷電されていない連鎖を導入することが，一般によ
り好ましい。この溶解性の促進は，一般に，約20個のサ
ブユニットのポリマーあたり１〜３個の荷電されたバッ
クボーン連鎖，好ましくは,4個のサブユニットあたり約
１個を越えない荷電された連鎖を用いて達成される。こ
こで限定されるように，アキラルなバックボーン連鎖
は,2量体ユニットあたり約１個以下の荷電されたバック
ボーン連鎖を含み，好ましくは,4量体ユニットあたり約
１個かまたは２〜３個のバックボーン連鎖を含むなら，
実質的に非荷電と考えられる。 IV.ポリマー標的化の考察 A.診断への応用 本発明の非荷電のポリマーまたは実質的に非荷電のポ
リマーの重要な応用には，ヌクレオチド分析物の存在お
よび／またはその量の決定に用いる新規な固体担体診断
システムがある。この検定システムは，固体担体に連結
されている多数のポリヌクレオチド結合ポリマー（これ
は本発明に従って構成される）からなる固体担体試薬を
含む。このポリマーは，下記に詳述の標的戦略に従い，
選択された融解温度（Tm）で標的ポリヌクレオチド分析
物に特異的に結合させるために構成されている。このシ
ステムは，また，ポリカチオン性レポーター分子を含ん
でいる。このレポーター分子は，完全に荷電された分析
物バックボーンには結合するが，しかし，非荷電かある
いはごく一部しか荷電されていないポリマーバックボー
ンには結合しないように設計されている。各レポーター
分子は,1つまたはそれ以上のレポーター基を有し，各ポ
リヌクレオチドは，典型的には，数千またはそれ以上の
レポーター分子の結合を調節し得る。それゆえ，このシ
ステムは，結合された分析物分子あたりのレポーターシ
グナルによって，数オーダーまたは数マグニチュードの
増幅要因を有する。この検定システムおよびその実施方
法は，共有の米国特許出願“ポリヌクレオチド検定試薬
およびその方法",連続番号No.712,396,（1985年３月15
日出願），さらに完全に記述されている。 アキラルで主として非荷電のサブユニット間連鎖を有
する配列特異的なポリヌクレオチド結合ポリマーを診断
上の応用に用いる特定の長所は,2つの要因から生じる。
１つには，これらの標的結合が相対的に塩に感度がな
く，それゆえ，このポリマー／標的アニーリング段階
は，低塩条件下で実行され得る。ここで，この標的と，
溶液中の相補的な核酸配列との間には競争的なアニーリ
ンはない。２番目には，このポリマーの還元された荷電
または非荷電のバックボーンにより，上記レポーター分
子（これは，標的分析物のポリアニオンバックボーンに
対し，高密度で設計されている）の使用が可能となる。 診断試薬としての使用に対し，本発明に用いられるポ
リヌクレオチド結合ポリマーを調製する際に適用される
設計上の考察は，標的分析物の性質およびこの分析物が
検定され得る反応条件に支配される。 最初の考察としては，選択された非単独重合性の標的
塩基配列（これに対し，ポリマーが指示されている）が
ある。この標的配列は，好ましくは，検定される分析物
に対して特有である。すなわち，この配列は，既知の多
数の配列塩基を含む検定混合物中にて，ある限定された
わずかの確率（例えば１％またはそれ以下）でのみ生じ
るべく算出される。既知のｎ−塩基標的配列の出現確率
は，およそ1/4nである。すなわち，既知のｎ−塩基標的
配列は,4n個の塩基を含むポリマー中において，約１回
出現すると推測されるだろう。それゆえ，既知のｎ−塩
基配列が,n個の特有の配列全体を含むポリヌクレオチド
で生じる確率Ｐは，およそＰ＝N/4nである。例示のため
に,9−塩基標的配列が20キロベースのヌクレオチド内に
見出される確率Ｐは，約20×103/2×105すなわち0.08で
あり,16−塩基標的配列が存在する確率は約20×103/4.3
×109すなわち0.0000047である。これらの計算から,9〜
16個の一定の塩基標的配列に対し特異的な９〜16個の認
識部分を有するポリマーは，ウイルス性ゲノムだけを含
む検定混合物（この最大の複合体は，約400Kの特有の配
列塩基に対応している）中の標的配列に対し，高い特異
性を有するべきことが見出されている。 類似のタイプの計算では,12〜16個のサブユニットポ
リマーが，ウイルス性およびバクテリア性のゲノム物質
（最大のゲノムサイズは約5000キロベース）だけを含む
検定混合物中にて，ウイルス性またはバクテリア性の標
的配列に対し充分な特異性を提供し得ることが示されて
いる。また,16〜22個のサブユニットポリマーは，動物
性のゲノミックDNA物質（ゲノムサイズは，特有の配列D
NAの約50億塩基対である）を含むポリヌクレオチド混合
物中にて，標的配列に対し充分な特異性を提供し得るこ
とも示されている。 このポリマー／分析物の結合親和性，および特にこの
ポリマーが標的配列とうまく結合する温度（融解温度す
なわちTm）は，（ａ）ポリマーの長さ，（ｂ）認識部分
とそれに対応する分析物の標的配列の配列内塩基との間
に形成されうる水素結合の数，（ｃ）バックボーンの荷
電密度，によって選択的に変化させ得る。モデルホモポ
リマー二本鎖における多くの研究から，オリゴヌクレオ
チド二本鎖の融点温度は10〜20bpの範囲で，この相補的
な塩基が水素結合を２つ形成し得る場合には，添加され
る塩基対あたり，およそ３℃，この塩基が水素結合を３
つ形成し得る場合には，約６℃上昇する事が知られてい
る。それゆえ，最初にこのポリマーとの高い結合特異性
を保証するべく選択された標的配列の長さは，選択され
た検定条件での相補的な塩基ポリマーとの所望の融解温
度を得るために伸長されてもよい。また。上記に例示の
ように，このポリマーを構成する際に用いられる認識部
分が標準的な核酸塩基であるなら，この標的配列は，比
較的高いポリマー／分析物の融解温度を達成するため
に，グアニン塩基にシトシン塩基を加えた割合を高くよ
うに選択されてもよい。または，この標的配列は，比較
的低い融解温度を達成するために，アデニン塩基にチミ
ン塩基を加えた割合を高くするよう選択されてもよい。 このポリマーはバックボーンの荷電密度は，このポリ
ヌクレオチド分析物の荷電密度より実質的に低くなけれ
ばならない。それは，レポーターのポリマーへの結合が
おこらない条件下で，ポリカチオン性レポーター分子を
分析物に優先的に結合させるためである。この必要条件
は，ポリマーバックボーンの隣接する負電荷の間隔が，
分析物の隣接するホスホジエステル結合の負電荷の間隔
の少なくとも２倍あれば満たされる。このバックボーン
の荷電密度もまた，ポリマー／分析物の融解温度に重要
な影響を与える。特に，塩濃度が低い条件では，分析物
とポリマーバックボーンとの電荷間の反発も,2つがマニ
ールできる温度を低下させるように作用し得る。それゆ
え，一般に，電荷のより少ないバックボーンを有するポ
リマーは，（１）分析物／ポリマーの融解温度がより高
くなること，および（２）この融解温度の塩濃度への依
存がより低くなること，を示すと期待されるだろう。こ
のような考察に基づいて，非荷電のポリマー（例えば，
すべてカルバミン酸塩で連結されているかまたはすべて
アミドで連結されているポリマー）は，診断方法におけ
る分析物／ポリマーアニーリング反応を，一部荷電され
たポリマーにより広範囲の塩濃度で実行可能にさせるだ
ろう。ここで，この連鎖のいくつかは，アキラルではあ
るが荷電されたホスホジエステル連鎖を構成する。 B.治療上の応用 充分な特異性のための必要条件 1.情報上の必要条件 理想的な治療には，発病状態に特有の標的化構造は効
果的に不活性化するが，患者の正常な構造には有害な影
響を及ぼさない治療がある。それゆえ，配列特異的な遺
伝子不活性化試薬は，標的化された遺伝子配列の不活性
化にのみ効果があるべきである。この遺伝子配列は，発
病状態に特有の標的配列を高確率で確保するための充分
な量の配列情報を含んでいる。例えば，標的配列の３つ
または４つの連続的な塩基にのみ結合して標的の不活性
化を生じ得る試薬ならば，正常な細胞機能に要する多く
のmRNAも常に攻撃するだろう。対照的には，標的の不活
性化を生じるために,30またはそれ以上の塩基と結合す
る必要がある試薬では，正常な細胞機能を含む非標的メ
ッセンジャーを攻撃する確率も，非常に小さくなるだろ
う。 所望量の配列情報の正しい評価は，以下のように算出
され得る。この配列情報は，病気に特有のmRNAに対し遺
伝子不活性化試薬が標的化するとき，この試薬が認識す
るべき情報である。このヒトゲノムは，およそ50億塩基
対の特有な配列DNAを含んでいる。しかしながら，この
物質はすべて本質的に二本鎖状態で存在し，そこで，一
本鎖を指向するポリヌクレオチド結合試薬への結合には
あまり利用できない。それゆえ，ポリマーの結合は，ゲ
ノムDNAのRNA転写に大きく制限される。このゲノムDNA
のうち,1％のオーダーのいくらかは，ある与えられた細
胞タイプで転写される。さらに，患者の中のすべての細
胞タイプが考慮されるなら，完全なゲノムの４％以上の
成分が，大人のヒト（すなわち不定胚形成後）中で転写
されることは起こりえない。それゆえ，大人のヒト中の
すべてのRNA配列の配列の複雑性により，約２億を越え
ない塩基，およびたぶんそれよりずっと少ない塩基が構
成されるだろう。 特有の配列の遺伝性物質の２億の塩基の細胞プール中
において，標的配列を認識しないことを予期するための
遺伝子不活性試薬に対し，少なくともｎ個の塩基が標的
中で認識されるべきである。ここで,nは２×108＝4nと
して算出され，これは，最小の標的認識の必要条件とし
ては,14個の塩基を与える。このことから，標的中にお
いて14個を越える塩基を認識する遺伝子不活性化試薬
は，正常なRNAの細胞プール内におそらく標的を有しな
いことが示唆される。明らかに，標的配列中で認識され
る塩基の総数はこの値より増えるので，この試薬が固有
の細胞RNA配列を認識しない確率も増加する。この標的
中で認識される塩基の数が直線的に増加するとき，この
“安全要因”が指数関数的に増すことは，注目すべきで
ある。例えば，以下には，標的配列中で認識される塩基
の数，および特有配列の一本鎖遺伝子物質の２億の塩基
プール中において，予期された対応する標的数が表にさ
れている： 認識された塩基の数 予期される標識の数 12 12.0 14 .75 16 .047 18 .0029 20 .00018 上記から,1つには以下のことが結論づけられ得る。診
断上の応用に用いられる予定の配列特異的な遺伝子不活
性化試薬に対し，この試薬は，標的配列中において，少
なくとも14,好ましくは16〜20の塩基を認識すること
が，おそらく安全な考察として取り上げられる。 2.最小の不活性化長（MIL）の概念 配列特異的な遺伝子不活性化試薬により実際に“認識
される”配列情報の量に関して，この点に有用な概念
は，最小不活性化長（MIL）の概念である。この概念
は，インビボ中で遺伝子の不活性化を達成するために試
薬が結合すべき標的配列の連続的な塩基の最小数として
定義される。この試薬が塩基のより長い配列を結合させ
るかどうかに関係なく，その試薬により“認識される”
標的中の塩基数を決定するのはこのMIL値であり，これ
は，試薬の配列特異的なレベルを順々に決定する。 この概念を例示するために，遺伝子不活性化試薬が16
のサブユニット長を有すると仮定すれば,MIL値は10にす
ぎない。このような試薬ならば，成分として10の連続的
な塩基の標的配列をすべて含む遺伝子配列を全部不活性
化すると予想されるだろう。特有配列の一本鎖遺伝子物
質の２億の塩基を含む細胞プール中では，およそ1000の
このような標的配列がある。さらに，この試薬中の塩基
対部分の数は，このMIL値より実質的に大きいので，こ
の試薬もまた，必要な10の連続した塩基の標的配列さえ
ない配列と，一部間違って対になった種々の複合体を形
成することが予想されるだろう。これら間違って対にな
った複合体のいくつかは，関連した標的でない遺伝子配
列を不活性化するのに，充分に安定である。 対照的に，長さが16サブユニットでMIL値が16の試薬
の場合には，定義により，このような試薬は標的でない
配列を不活性化できない。標的でない配列に一部間違っ
て対になったすべての複合体が，遺伝子の不活性化を達
成するのに充分な安定性を有さないからである。完全な
16の塩基対試薬／標的二重構造だけが，遺伝子の不活性
化を達成するのに充分な安定性を有するだろう。 実際のMIL値の決定に関連して，一連の遺伝子不活性
化試薬（これらはすべて同じ遺伝子列に対して標的化さ
れるが，サブユニットの数は変えられる）が，機能して
いる一本鎖標的配列を含むとわかっている生体細胞内で
試験されるとき，この標的化された遺伝子の活性は，こ
のMILに対応するサブユニット長にて著しい減少を示
す。すなわち，このMIL値は，この標的化された遺伝子
配列の活性を妨げるのに充分な数のサブユニットに対応
している。 さらに例示のために，選択されたバックボーン連鎖タ
イプを有するポリヌクレオチド連結ポリマーに対し，最
小の不活性化の長さを決定するために，模範的な方法が
以下に記述される。 まず，選択されたバックボーンタイプを有する一連の
規則正しい結合ポリマーを調製する。このポリマーはmR
NA（５′−GUGCAUCUGUCCAGTGAGGAGAAG−３′）中のウサ
ギβ−グロビンの57〜80の範囲に標的化され，その長さ
を５〜24サブユニットに変動させる。次に,Black,Murak
imiおよびMiller（Biochemistry,24:6132（1985））の
詳細な手順に従って，〔35S〕−メチオニンでラベルさ
れた市販のウサギ網赤血球溶解物の調製物の分割された
一部分に，これらポリマーの各々を加える。その後，ウ
サギグロビンmRNAを加え,37℃で１時間インキュベート
する。各サンプルを準備して，ゲル電気泳動により分画
し，上記のBlakeらによる方法と同様にして，β−グロ
ビンに組み込まれた放射活性の量を測定する。この最小
の不活性化の長さは，新しいβ−グロビン合成を本質的
に完全に妨害する最小のポリマーサブユニット長であ
る。 このMILは標的配列に依存して小量で変えられるが，
一般に，この相対的に簡単な細胞外方法は，与えられた
バックボーンタイプに対し，細胞内MILの全く良好な近
似を生ずるのに役立つことが再び強調されるべきであ
る。選択されたバックボーンタイプに対しこのMIL値が
一旦決定されると,MIL調整に対し下記に記述の方法は，
選択された標的配列に対するMILを最適化するために，
合理的に適用され得る。 3.このMILを調整するための戦術 結果として，受容可能なMIL値を最終的に得るため
に，相対の範囲で試薬の標的結合親和力を変えることが
しばしば必要とされる。この目的のために，試薬／標的
二重構造の安定性を変えるべく，種々の方法およびその
組合せが使用可能である。これには，以下のことが包含
される。 （ｉ）この試薬中の塩基対部分の数を増加させるかまた
は減少させること； （ii）より大きなまたはより小さいスタッキング寄与を
供給するような配列を有する標的を選択すること（二重
の安定性に関する塩基配列効果の詳細な分析に対し,Tno
coら（31）を調べよ）； （iii）弱い結合塩基（ＡおよびＵまたはＴ）に対する
強力な結合塩基（ＧおよびＣ）の比率がより大きいかま
たはより小さい標的配列を選択すること； （iv）１つまたはそれ以上の弱い結合塩基対部分を，同
じワトソン／クリック対特異性を有するより強力な結合
部分で置換すること（例えば,2,6−ジアミノプリン部分
は，この標的配列内のＵまたはＴと実質的により強力な
結合を得るために，アデニンに代えて用いられ得る；こ
の標的配列内のＡと実質的により強力な結合を得るに
は,UまたはＴに代えて５−ブロモウラシル部分が使用可
能である；そして，この標的配列内のＧとある程度より
強力な結合を得るには，シトシンに代えて５−ブロモシ
トシン部分が用いられ得る）；あるいはこの試薬の１つ
またはそれ以上の強力な結合塩基対部分を，同じW/C対
特異性を有するより弱い結合部分で置換すること（例え
ば,2−ピリミジン部分は，この標的配列入内のＧと実質
的により弱い結合を得るために，シトシンに代えて用い
られ得る；そして，この配列内のＣと実質的により弱い
結合を得るには,6−チオグアニン部分またはヒポキサン
チン部分が使用可能である）；および （ｖ）この標的配列に対し，ワトソン／クリック対をあ
る程度阻害するかまたは増大させるために，バックボー
ン構造を選択すること。 上記方法のうち最初の３つには，標的選択手順が含ま
れ，これに対して，後の２方法はこの試薬の合成中に行
われることは，注目されるべきである。 方法（ｉ）には，配列特異性の必要条件では，この試
薬の長さを約14サブユニット以下にまで減少させること
は除外されるという困難性がある。方法（ii）および
（iii）の困難な点は，他のより重要な標的化基準がこ
の最適の標的領域をあまりに厳しく制限しているため，
これら２つのMIL調整方法は，著しい効果を得るにはほ
とんど許容範囲がないことにある。これらの制約のため
に，ほとんどMIL調整は，方法（iv）および（ｖ）によ
り好適に達成される。 V.ポリマー集合戦略 A.幾何学的集合方法 第IV節で考察される要因によれば，所望のポリマー長
および認識部分の配列を選択した後，上記に詳述の一般
的なサブユニットカップリング手順を用いて，このポリ
マーが集められる。ポリマーを集める一つの方法には，
はじめに適当な一組の２量体を調製し，選択された２量
体を連結させて４量体を形成し，それらを連結して８量
体を形成するなど，が含まれる。この方法は溶液中で実
行され，第5A図および第7A図に関連して上記に記述され
る方法に実施的に従う。すべてのカップリングが必ずし
も同じサイズのオリゴマーの間で行われる必要がない事
に注目すべきである。例えば，しばしば，最後のカップ
リングでは,20量体を得るには,16量体と４量体とを連結
させること，あるいは24量体を得るには16量体と８量体
とを連結されることが望ましい。 この集合方法で特に有利な点は，それぞれのカップリ
ング生成物が，その前駆体のおよそ２倍の質量をもつの
で，それぞれのカップリング生成物の生成が簡単な事で
ある。下記の実施例18では,8サブユニットのカルバミン
酸塩が連結されたポリマーのこの方法により形成される
集合体について詳細に述べる。 B.固体担体上での段階的集合 ポリマー合成のための一つの好ましい方法として，固
体担体上での段階的な集合がある。ここでは，ポリマー
中の最初のサブユニットが，そのN2バックボーン基を介
して固体担体に付加される。典型的には，開裂可能であ
り好ましくは酸に安定な長鎖のリンカーによって誘導さ
れたガラスビーズのような固体担体が，この担体材料と
して用いられる。実施例19で記述のごとく，この固体担
体は，ヌクレオシドの５′水酸基のようなN2求核基の付
加のために調製される。このガラスビーズは，好ましく
は酸に不安定なN1保護基，および活性化されたN2基また
はＥバックボーン基を有するサブユニットと，第III節
に詳述のように反応に供される。種々のタイプのサブユ
ニットのガラスビーズ担体へのカップリングは，一般
に，実施例20〜22に記述されている。 この二番目のサブユニット（または，溶液中で集合さ
れうるポリマーユニット）の担体へのカップリングの
後，すべての未反応のリンカー求核基は,p−ニトロフェ
ニル酢酸塩のような適当なキャッピング試薬の付加によ
り，キャップされる。その後，担体は洗浄され濾過され
る。このN1末端サブユニット上の保護基は，典型的には
酸処理により除去される。中和の後，この担体は，次い
で，遊離のN2バックボーン部分で活性化される次の配列
中のサブユニット（またはポリマーユニット）の過剰量
との反応に供される。活性化された過剰のサブユニット
により，鎖を伸長されている多数の担体結合サブユニッ
トの数が最大になる。すなわち，この固体担体の集合方
法の一つの特徴は，各サブユニット付加階段において，
高いカップリング効率が必要なところにある。付加され
活性化されたサブユニットの濃度は，この効率を最大に
するように選択される。鎖の伸長は，各サブユニットの
付加の後，不足配列のキャピングとともに，所望の長さ
および配列のポリマーが得られるまで続けられる。この
一般的な方法は,14サブユニットの炭酸塩が連結された
ポリマーの調製に対し実施例20に,19サブユニットのカ
ルバミン酸塩が連結されたポリマーの合成に対し実施例
21に，そして19サブユニットのアミドが連結されたポリ
マーの集合に対して実施例22に示されている。 この最後の配列中のサブユニットの付加の後，このポ
リマーは，末端のN1基にカップリングされている適当な
荷電または非荷電の基とともにキャップされてもよい。
もしこのバックボーンの集合が非荷電のアキラルな連鎖
ばかりで行われるなら，このキャッピング試薬は，好ま
しくはポリマーに末端の電荷を与える荷電された一群で
ある。ポリマーのキャッピングの後，このポリマーは，
たとえば水酸化アンモニウムのような求核剤を用いた処
理により切り離される。そして，このポリマーは，例え
ば陰イオン交換クロマトグラフィーによる精製される。
これら集合後の操作は，カーボネートで連結されたポリ
マーの合成に関し実施例23で，カルバミン酸塩で連結さ
れたポリマーの合成に関し実施例25で，そしてアミドで
連結されたポリマーの合成に関し実施例27で記述されて
いる。 結合されたポリマー分子とともに上記固体担体試薬を
含む診断上の応用に対し，この集められ精製されたポリ
マーは，公知のカップリング方法（例えば，実施例20に
詳述される方法）により，セルロース担体のような固体
担体に付加される。実施例24,26および28は例証とな
る。 以下の実施例は，本発明に従って作成されそして使用
される種々のサブユニット合成スキーム，ポリマー構成
方法および応用および組成物を例示している。これらの
実施例は，本発明の範囲を何ら限定するつもりはない。 実施例１ リボヌクレオシドおよびデオキイリボヌクレオシドの調
製 次のヌクレオシドは,Sigma Chemical Co.,St.Louis,M
oから得られる：デオキシウリジン，デオイシグアノシ
ン，チミジン，デオキシアデノシン，デオキシシチジ
ン,5−ブロモデオキシウリジン，デオキシイノシン,2,6
−ジアミノ−９−（２−デオキシ−β−Ｄ−エリスロ−
ペントフラノシル）9H−プリン（2,6−ジアミノプリン
デオキシリボシド），ウリジン，グアノシン,5−メチル
ウリジン，アデノシン，シンチジン,5−ブロモウリジ
ン，イノシン。 2,6−ジアミノ−９−（β−Ｄ−リボフラノシル）−9
H−プリン（2,6−ジアミノプリンリボシド）は,Pfaltz
and Bauer,Inc.,division of Aceto Chemical Co.,In
c.,Waterbury,CTから得られる。 次のヌクレオシドは，次に示す文献の方法で調製され
る： １−（２−デオキシ−β−Ｄ−エリスロ−ペントフラ
ノシル−２−ピリミジノン（２−ヒドロキシピリミジン
デオキシリボシド）は,John Wiley and Sons,Inc.のNuc
leic Acid Chemisty;L.B.Townsend and R.S.Tipson,eds
（1976）に記載されたP.Kohler,E.Volz,U.Sequinおよび
C.Tammの方法により調製される。 １−（２−デオキシ−β−Ｄ−エリスロ−ペントフラ
ノシル）−４−メトキシ−２−ピリミジノンは，次の方
法で調製される： １−（３′,5′−ジ−Ｏ−ベンゾイル−２−デオキシ
−β−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシル−４−メチルチ
オ−２−ピリミジノン〔Collection of Czechoslov Che
m Comm（1977）42:2246〕のD.CechおよびA.Holyの方法
により調製〕を,0.2Mナトリウムメトキシド溶液200mLで
処理する。処理後の溶液を一夜室温に放置する。この溶
液を次に，ダウエックス50×８（Dowex 50×8;H+型）で
中和し，濾過する。残渣を水100mLに溶解し，エーテル
2.50mLで抽出し，水相をエバポレートする。その残渣は
アルモファス上の物質であり，直接次の反応に用いられ
る。 ２−アミノ−９−（２−デオキシ−β−Ｄ−エリスロ
−ペントフラノシル）−1,9−ジヒドロ−6H−プリン−
６−チオン（デオキシチオグアノシン）は,J Med Chem
（1963）６:684のR.H.Iwamoto,E.M.Acton,およびL.Good
manの方法により調製される。 １−（β−Ｄ−リボフラノシル）−２−ピリミジノン
（２−ヒドロキシピリミジンリボシド）は,J Org Chem
（1974）39:3668のU.NiedballaおよびH.Vorbruggenの方
法により調製される。 １−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−４
−メトキシ−２−ピリミジノン（２−ヒドロキシピリミ
ジンデオキシリボシド）は,Collection of Czecholov C
hem Comm（1973）38:1381のR.WightmanおよびD.Holyの
方法により調製される。 ２−アミノ−９−（β−Ｄ−リボフラノシル）−1,6
−ジヒドロ−6H−プリン−６−チオン（チオグアノシ
ン）は,J Amer Chem Soc（1958）801669のJ.J.Fox,I.we
mpen,A.HamptonおよびI.L.Doerrの方法で調製される。 実施例２ 塩基保護されたヌクレオチドの調製 ジメトキシトリチルクロリド,N−ベンゾイルアデノシ
ン,N−ベンゾイル−２′−デオキシアデノシン,N−ベン
ゾイルシチジン,N−ベンゾイル−２′−デオキシシチジ
ンおよびＮ−イソブチリル−２′−デオキシグアノシン
は,Sigma Chemicals,St.Louis,Missouriから得られる。
９−フルオレニルメトキシカルボニルクロリド（FMOCク
ロリド），トリメチルクロロシラン，無水イソ酪酸,4−
ニトロベンゾイルクロリド，および有機溶媒のすべて
（反応およびクロマトグラフィー用）は,Aldrich Chemi
cal Co.,Milwaukee,Wisconsinから得られる。シリカゲ
ルは,EM Science,Cherry Hill,New Jerseyから得られ
る。 2.1 グアノシン Ｎ−２ ９−フルオレニルメトキシカルボニル誘導体
は，次に示すヌクレオシドのアミノ基の保護の一般的な
手法により調製される： グアノシン（1mmol）をピリジン（5mL）に懸濁させ，
トリメチルクロロシラン（5mmol）で処理する。この溶
液を15分間攪拌した後,9−フルオレニルメトキシカルボ
ニルクロリド（5mmol）を加え，この溶液を室温に３時
間保持する。反応液を氷浴中で冷却し，水（1mL）を加
える。５分間攪拌後，濃アンモニア（1mL）を加え，反
応液を15分間攪拌する。この溶液をほぼ乾固状態近くに
までエバポレートし，残渣をクロロホルム（10mL）に溶
解させる。この溶液を重炭酸ナトリウム（溶液5mL,10
％）で洗浄し，硫酸ナトリウムで乾燥し，エバポレート
する。残渣をトルエンとともに数回エバポレートし，生
成物をメチレンクロライド中メタノール勾配（０〜50
％）を用いてシリカゲルのクロマトグラフィーにかけ
る。 Ｎ−イコブチリルグアノシンは,J Amer Chem Soc（19
69）91:3356のLetsingerおよびMillerの方法により調製
される。 Ｎ−アセチルグアノシンは,J Chem Soc Perkin Trans
（1972）１:2937のC.B.ReeseおよびR.S.Saffhillの方法
で得られる。 2.2 デオキシグアノシン Ｎ−２ ９−フルオレニルメトキシカルボニル誘導体
は,Acta Chem Scand（1983）B 37:263のJ.Heikklaおよ
びJ.Chattopadhyayaの方法で調製される。 Ｎ−２ アセチル誘導体は,Research Plus Inc.,Bayo
nne,N.J.から得られる。 2.3 デオキシアデノシン Ｎ−６ ２−（４−ニトロフェニル）エトキシカルボ
ニル誘導体は,Tetrahedron Lett（1983）24:3583のF.Hi
mmelsbachおよびW.Pfleidererの方法により調製され
る。 Ｎ−６ ４−ニトロベンゾイル−２′−デオキシアデ
ノシンは,FMOCクロリドの代わりに４−ニトロベンゾイ
ルクロリドを用いたこと以外は上記FMOC−グアノシンの
調製法により調製される。 Ｎ−６ ２ −（フェニルスルホニル）エトキシカル
ボニル誘導体は，アシル化剤として２−（フェニルスル
ホニル）−エチルクロロフォーメート〔Tetrahedron Le
tt（1981）22:3667のN.Balgobin,S.JosephsonおよびB.C
hattopadhyayaの方法により得られる〕を用い，溶媒と
してＮ−メチルイミダゾールまたはピリジンを用いたこ
と以外は,FMOCグアノシンの調製法により調製される。 2.4 アデノシン Ｎ−６ ２−（４−ニトロフェノル）−エトキシカル
ボニル誘導体は,Tetrahedron Lett（1983）24:3583のF.
HimmelsbachおよびW.Pfleidererの方法により調製され
る。 Ｎ−６ ４−ニトロベンゾイルアデノシンは,FMOCク
ロリドの代わりに４−ニトロベンゾイルクロリドを用い
たこと以外はFMOC−グアノシンの調製法により調製され
る。 Ｎ−６ ２−（フェニルスルホニル）エトキシカルボ
ニル誘導体は，アシル化剤として２−（フェニルスルホ
ニル）−エチルクロロフォーメート〔Tetrahedron Lett
（1981）22:3667のN.Balgobin,S.JosephsonおよびB.Cha
ttopadhyayaの方法により得られる〕を用い，溶媒とし
てＮ−メチルイミダゾールまたはピリジンを用いたこと
以外は,FMOCグアノシンの調製法により調製される。 2.5 デオキシシチジン Ｎ−４ ２−（４−ニトロフェニル）−エトキシカル
ボニル誘導体は,Tetrahedron Lett（1983）24:3583のF.
HimmelsbachおよびW.Pfleidererの方法により調製され
る。 Ｎ−６ ２−（フェニルスルホニル）エトキシカルボ
ニル誘導体は，アシル化剤として２−（フェニルスルホ
ニル）−エチルクロロフォーメート〔Tetrahedron Lett
（1981）22:3667のN.Balgobin,S.JosephsonおよびB.Cha
ttopadhyayaの方法により得られる〕を用い，溶媒とし
てＮ−メチルイミダゾールまたはピリジンを用いたこと
以外は,FMOCグアノシンの調製法により調製される。 2.6 シチジン Ｎ−４ ２−（４−ニトロフェノル）−エトキシカル
ボニル誘導体は,Tetrahedron Lett（1983）24:3583のF.
HimmelsbachおよびW.Pfeidererの方法により調製され
る。 Ｎ−６ ２−（フェニルスルホニル）エトキシカルボ
ニル誘導体は，アシル化剤として２−（フェニルスルホ
ニル）−エチルクロロフォーメート〔Tetrahedron Lett
（1981）22:3667のN.Balgobin,S.JosephsonおよびB.Cha
ttopadhyayaの方法により得られる〕を用い，溶媒とし
てはＮ−メチルイミダゾールまたはピリジンを用いたこ
と以外は,FMOCグアノシンの調製法により調製される。 2.7 2,6−ジアミノプリンリボシド 2,6−ジアミノプリンリボシドのＮ−2,N−６ビス（９
−フルオレニルメトキシカルボニル）誘導体は，一般的
な手法で調製される。 Ｎ−2,N−６−ビス（イソブチリル）誘導体は，通常
の手法により調製される。 2.8 2,6−ジアミノプリン−２′−デオキシボシド 2,6−ジアミノプリン−２′−デオキシリボシドのビ
ス N−2,N−６−（９−フルオレニルメトキシカルボニ
ル）誘導体は，通常の手法により調製される。 2.9 チオグアノシン チオグアノシンのＮ−２ ９−フルオレニルメトキシ
カルボニル誘導体は通常の手法により調製される。 2.10 ２′−デオキシチオグアノシン ２′−デオキシチオグアノシンのＮ−２ ９−フルオ
レニルメトキシカルボニル誘導体は，通常の手法により
調製される。 実施例３ ５′−アミノ−２′,5−ジデオキシリボヌクレオシド
サブユニットの調製 四臭化炭素，ナトリウムアジド,p−トルエンスルホニ
ルクロリド（トシルクロリド），トリフェニルホスフィ
ンおよび10％パラジウム−炭は,Aldrich Chem Co.で購
入される。リチウムアジドは,Kodak Laboratory and Sp
ecialty Chemicalsで得られる。 3.1 一般的手法 この実施例で用いられるヌクレオシドは，チミジン,N
6−ベンゾイル−２′−デオキシアデノシン,N4−ベンゾ
イル−２′−デオキシシトジン，および２′−デオキシ
イノシン,2−ヒドロキシ−ピリミジン−２′−デオキシ
リボシドおよび2,6−ジアミノプリン−２′−デオイシ
リボシドのN2−N6−ビスイソブチリル誘導体（実施例１
参照）である。所望の乾燥したヌクレオシド（1mmol）
を計量し，トリフェニルホスフィン（1.01mmol）および
リチウムアジド（5mmol）を入れた反応容器に添加す
る。固形物をDMFに懸濁させた後，四臭化炭素（1.0mmo
l）を容器に加える。この溶液を室温で24時間攪拌す
る。反応をメタノールで止めた後，この溶液をエバポレ
ートして乾固させる。残渣をシリカゲルカラムクロマト
グラフィーにかけ，メタノール／クロロホルム混合液で
溶出すると，所望の５′−アジド−２′,5′−デオキシ
ヌクレオシドが得られる。 この５′−アジドヌクレオシド（1mmol）をエタノー
ルに溶解させる。触媒量の10％パラジウム−炭の存在
下，水素圧35psiで10時間にわたり水素化を行う。この
溶液を濾過し，減圧下でエバポレートすると粗固形物が
得られる。この固形分は適当な溶媒を加えてこねること
により精製される。 3.2 ５′−アジドウリジン誘導体 ５−ブロモ−２′−デオキシウリジンの５′−アジド
誘導体は，上記方法により調製される。５′−アジド−
ｔ−ブロモ−２′−デオキシウリジン（1mmol）は，ト
リフェニルホスフィン（1.5mmol）とピリジン中室温で
２時間にわたり処理される。この反応容器に濃アンモニ
ア（1mL）を加える。14時間後，溶媒を真空下で除去す
る。残渣をTHFに溶解させ，この溶液をヘキサンに加え
る。沈澱物を集め，この固形成分を適当な溶剤でこねる
と,5′−アミノ−５−ブロモ−２′−デオキシウリジン
が得られる。 3.5 ５′−アジドグアノシン ５′−アミノ−２′,5′−ジデオキシグアノシンの他
の調製法は，保護された２′−デオキシグアノシン（Ｎ
−２−アセチルかＮ−２−FMOC誘導体で保護されてい
る）（1mmol）をピリジン中トシルクロリド（1.3mmol）
で０℃にて一夜処理することである。この溶液をエパポ
レートして乾固し，残渣をクロロホルムに溶解させる。
得られた溶液を重炭酸ナトリウム水溶液で洗浄し，硫酸
ナトリウムで乾燥する。この溶液をエバポレートし，残
渣をシリカゲルクロマトグラフィーにかけメタノール／
クロロホルム混合液で溶離する。得られたトシレート
（1mmol）は,DMF中ナトリウムアジド（6mmol）で80〜10
0℃にて数時間処理する。溶媒をロータリーエバポレー
ターで除去し，残渣をシリカゲルクロマトグラフィーに
かけクロロホルム／メタノール混合溶媒で溶離する。こ
のアジドは，上記手法を用いて目的とするアミンに還元
される。 ２′−デオキシシチジン,2′−デオキシアデノシン,
2′−デオキシグアノシン，および2,6−ジアミノプリン
デオキシリボシドの塩基窒素の保護基としては,2′−デ
オキシシチジンおよび２′−デオキシアデノシンに対し
ては２−（フェニルスルホニル）エトキシカルボニル基
が，そして２′−デオキシグアノシンおよび2,6−ジア
ミノプリンデオキシリボシドを保護するためには９′−
フルオレニルメトキシカルボニル（FMOC）基が，実施例
２に示されるように，使用される。 実施例４ ３′−アミノ−２′,3′−ジデオキシリボヌクレオシド
サブユニットの調製 チミジンを５′−Ｏ−アセチル−３′−アジド−
２′,3′−ジデオキシチミジンに変換し，これをJ Org
Chem（1978）43:3044のM.ImazawaおよびF.Ecksteinの方
法により３′−アジド−２′,3′−ジデオキシアデノシ
ンおよび３′−アジド−２′,3′−ジデオキシグアノシ
ンに変換する。３′−アジドアデノシンの塩基部分は，
ベンゾイル誘導体または２−（フェニルスルホニル）エ
トキシカルボニル誘導体（実施例１に示す）として保護
される。３′−アジドグアノシンのＮ−２は，アセチル
誘導体またはFMOC誘導体（実施例１参照）として保護さ
れる。これらの３′−アジド基の３′−アミノ−２′−
３′−ジデオキシリボヌクレオシドへの還元は実施例３
に示されるようになされる。 実施例５ リボヌクレオシドから誘導されるモルホリン型サブユニ
ットの調製 重ホウ酸アンモニウム,m−過ヨウ素酸ナトリウム，ナ
トリウムシアノボロハイドライド，ウリジン,N4−ベン
ゾイルシチジン，およびN6−ベンゾイルアデノシンは,S
igma Chemical Co.で得られる。N2−イソブチリルグア
ノシンは,LetsingerおよびMiller（J Amer Chem Soc（1
969）91:3356）の一般的手法により調製される。２−フ
ェニル−２−プロパノールおよびビス（ｐ−ニトロフェ
ニル）カーボネートは,Aldrich Chemical Co.で得られ
る。 ウリジンのモルフォリン誘導体は，ウリジン1mmolと
重ホウ酸アンモニウム，（NH4）2B2O7 2mmolとを水5ml
に溶解させて調製される。氷浴下で攪拌し直射日光を避
けながら,m−過ヨウ素酸ナトリウム1.2mmolを水5mlに溶
解させた溶液を添加する。90分後に1,2−プロパンジオ
ール0.2mlを加え，室温で10分間攪拌を続ける。その
後，換気の充分なフードの中で充分に攪拌しながらナト
リウムシアノボロハイドライド0.25gを水3mlに溶解した
溶液を添加し，混合物を室温で４時間攪拌する。次に，
反応混合物を温水浴中真空下で濃縮してオイル状とし，
これを最小量のメタノールで再分散してシリカゲルクロ
マトグラフィーカラム上に積層し，メタノール/1％トリ
エチルアミンで溶離する。モルフォリン型生成物はシャ
ープなバンドでカラムから溶離される。この生成物は，
もとのリボヌクレオシドおよびその酸化生成物に比較し
てはるかにゆっくりと移動する。このモルフォリン型生
成物は，もとのリボヌクレオシドとほとんど同一のUVス
ペクトルを有する。しかし，マススペクトルは,17ダル
トンだけ低い（高速原子衝撃活性化によるマススペクト
ル分析により決定）。 次に，生成物を２−フェニルイソプロピルフェニルカ
ーボネートと反応させることによりモルフォリンの窒素
を保護する。所望の活性カーボネートを調製し，これ
を,Int J Peptide Protein Res（1974）６:111のSandbe
rg and Ragmarssonの方法に基本的に従い，モルフォリ
ン型サブユニットと反応させる。最終的に，必要に応じ
て（サブユニット アセンブリーをポリマーへ組み込む
方法に依存する），もとの５′に対する位置の水酸基
は，次の方法により活性化され得る。その方法とは,N−
保護化サブユニットを最小容量の乾燥ジメチルホルムア
ミドに溶解させ，ビス（ｐ−ニトロフェニル）カーボネ
ート２等量とトリエチルアミン,N−メチルイミダゾー
ル，またはN,N−ジメチルアミノピリジン0.2等量とを加
えることである。室温で３時間保持した後，反応混合物
を温浴中で真空濃縮する。この濃厚なシロップを少容量
のジクロロメタンに再懸濁し，シリカゲルカラム上に積
層し,N,N−ジメチルアニリンを0.2容量％の割合で含有
するジクロロメタン／エーテル（容量比1:1）混合物で
溶離する。この溶媒系において，活性化生成物は,p−ニ
トロフェノールおよびビス（ｐ−ニトロフェニル）カー
ボネートよりも実質的にゆっくりと移動するが，未反応
の出発物質よりもはるかに速く移動する。活性化された
生成物は，アンモニアを噴霧することによりシリカゲル
TLCプレート上で簡単に目視観察することができる。ア
ンモニアの噴霧により，黄色のニトロフェノレートイオ
ンが１〜２分間で現れる。 他のリボヌクレオシド（必要に応じて実施例２のよう
に塩基が保護されている）は，基本的には同様の手法
で，対応するモルフォリン型誘導体に変換される。ただ
し，最初の過ヨウ素酸塩による酸化の段階の前の，保護
されたリボヌクレオシドの溶解性に応じて，メタノール
を適当量添加する必要がある。 モルフォリン型サブユニットがチオカーバメート結合
を介して結合されるとき，通常の出発リボヌクレオシド
に対する好適な塩基保護基は次のとおりである：シチジ
ンおよびアデノシンにはフェニルスルホニルエトキシカ
ルボニル基，およびグアノシンには９−フルオレニルメ
トキシカルボニル基。 実施例６ ５′−酢酸−２′,5′−ジデオキシリボヌクレオシド
サブユニットの調製 トリエチルアミン，ピリジン／三酸化イオウ錯体,p−
ニトロフェノール，ジシクロヘキシルカルボジイミド，
および40％ジメチルアミン水溶液はAldrichで得られ
る。 実施例12.1で調製される３′−Ｏ−tert−ブチルジメ
チルシリル−Ｎ−２−（フェニルスルホニル）エトキシ
カルボニルアデノシン（1mmol）をメチレンクロリドお
よびジメチルスルホキシド（1/1,v/v;10mL）に０℃で溶
解させる。これに，トリエチルアミン（3mmol）および
ピリジン／三酸化イオウ錯体（3mmol）を加える。この
混合物をこの温度で１時間攪拌し，水洗する。硫酸ナト
リウムで乾燥し，減圧下でエパポレートする。残渣を乾
燥ピリジン（10mL）に溶解させ，ベンジルオキシカルボ
ニルメチレントリフェニルホスホラン（1.5mmol）と37
℃で24時間処理する。この混合物を，次に，減圧下でエ
バポレートして乾固し，残渣をメチレンクロリドに溶解
させ，希HClでそして水で洗浄する。次に，有機相を硫
酸ナトリウムで乾燥し，溶媒を減圧下で留去する。残渣
をクロロホルム中メタノール勾配（０〜20％）を用いて
シリカクロマトグラフィーにかける。 前段で得られる不飽和エステル（1mmol）をシクロヘ
キサジエン（5mL）および10％パラジウム−炭（100mg）
を含む酢酸エチル／エタノール（40mL,1/1,v/v）に溶解
させ，この懸濁液を窒素気流下５〜24時間にわたり激し
く攪拌する。この混合物を濾過し，溶媒を減圧で留去す
る。残渣をクロロホルム中メタノール勾配（５〜50％）
を用いてシリカゲルクロマトグラフィーにかける。 前段で得られる酸の0.2〜0.5M酢酸エチル（またはエ
チレンクロライド）溶液にｐ−ニトロフェノールを約20
％過剰に加える。この溶液に０℃でジシクロヘキシルカ
ルボジイミドを計算量加える。0.5時間後に，この溶液
を室温に戻し,1時間保持した。分離したジシクロヘキシ
ル尿素を濾過し，溶媒で洗浄する。濾液と洗液とを合わ
せたものを減圧下でエバポレートし乾固する。このエス
テルはそのままカップリング反応に使用され得，また，
クロロホルム中イソプロパノール勾配（０〜50％）を用
いて，シリカの短いカラムで精製することもできる。 適切に保護された他の２′−デオキシヌクレオシドに
ついても類似の一連の反応を行うことができる。 この活性エステル（1mmol）を,40％ジメチルアミン水
溶液（2mmol）とメタノール中で処理すると,N−保護化
３′−Ｏ−tert−ブチルジメチルシリル−２′,5′−ジ
デオキシアデノシン−５′−酢酸のN,N−ジメチルアミ
ドが生成する。溶媒を減圧下でエバポレートして除去
し，残渣を2M HF/1M tert−ブチルアンモニウムフルオ
ライド（TBAF）試薬を用いて脱シリル化する。このTBAF
試薬は,Tetrahedron Lett（1982）23:2257にB.L.Gaffne
yおよびR.A.Jonesにより記載されている。ピリジン中の
2M HF/1M tert−ブチルアンモニウムフルオライド（TB
AF1mmol）に，前段で得られる脱保護化ヌクレオシドを
加える。24時間攪拌後，反応液をメチレンおよび重炭酸
ナトリウム水溶液に分離する。有機層を水洗し，硫酸ナ
トリウムで乾燥し，エバポレートし乾固する。残渣をメ
チレンクロライド中メタノール勾配（５〜25％）を用
い，シリカクロマトグラフィーで精製する。 実施例７ プリンおよびピリミジンピロリドンの調製 カリウムｔ−ブトキシド，アニソイルクロリド,6−ク
ロロプリン,10％パラジウム−炭，フタロイルクロリド,
2−アミノ−６−クロロプリン,20％テトラエチルアンモ
ニウムヒドロキシド水溶液,25％トリメチルアミン水溶
液,2−ピリミジノン,N−ブロモコハク酸イミド，トリフ
ルオロ酢酸,4−ニトロフェノール，およびN,N−ジスク
シイミジルカーボネートはAldrichで得られる。リチウ
ムアジドはEastman Kodak,Rochester,New York,で得ら
れる。C18逆相シリカゲルは,Whatman,Hillsboro,Orego
n,で得られる。 7.1.（Ｓ）−５−〔（４−アミノ−２−ポキソピリミジ
ニル）−メチル〕−ピロリドンの調製（以下，シトシン
ピロリドンとして述べる） シトシン（2.2mmol）を，カリウムtert−ブトキシド
（2mmol）を含むジメチルスルホキシド（2mL）に溶解さ
せる。この溶液を（Ｓ）−５−（トシルオキシメチル）
−２−ピロリドン（1mmol）を含むフラスコに加える。
この（Ｓ）−５−（トシルオキシメチル）−２−ピロリ
ドンは,E.HardeggerおよびH.Ott.の方法（Helv Chim Ac
ta（1955）38:312）により調製される。溶解後，この混
合物を25℃で６時間攪拌する。この混合物を酢酸（2mmo
l）で中和し，減圧下でエバポレートする。残渣をジメ
チルホルムアミド（5mL）中に取り，減圧下でエバポレ
ートする。この工程を３度繰り返す。 7.2.N−４アニソイルシトシンピロリドンの調製 前段で得られる混合物をピリジンまたはＮ−メチルイ
ミダゾール（10mL）に溶解させ，室温にてアニソイルク
ロリド（2.8mmol）と処理する。２時間攪拌後，混合物
を氷（0.5g）で反応を止める。５分後,29％アンモニア1
mLを加える。15分間室温に保持した後，その溶液を酢酸
エチル（15mL）に溶解させ，塩水（15mL）を用いて２度
洗浄する。洗液を合併し，酢酸エチル（２×30mL）で洗
浄する。有機層を合併し，硫酸ナトリウムで乾燥し，減
圧下でエパポレートする。残渣はトルエンとともに数度
エパポレートし，得られた残渣を，メチレンクロリド中
メタノール勾配（０〜20％）でシリカゲルクロマトグラ
フィーにかける。 7.3.6−クロロプリンピロリドンの調製 この化合物は，シトシンのアルキル化の方法により調
製される。シトシンのアルキル化の条件と異なるのは，
アルキル化は６−クロロプリンに対して行い，混合物を
35〜95℃に数時間加熱することである。その混合物を室
温に冷却し，酢酸（2mmol）で中和し，減圧下でエバポ
レートする。これを,20％メタノール／クロロホルムお
よび10％重炭酸ナトリウム混合物とともに振盪する。水
層をクロロホルムで洗浄し，合併した有機層を硫酸ナト
リウムで乾燥し，減圧下でエバポレートする。残渣を，
クロロホルム中メタノール勾配（０〜25％を用いてシリ
カゲルクロマトグラフィーにかける。 7.4.6−アジドプリンピロリドンの調製 ６−クロロプリンピロリドン（1mmol）を，リチウム
アジド（2mmol）を含むジメチルスルホキシド（2mL）中
で30〜100℃にて数時間処理する。処理後，この混合物
を減圧下でエバポレートし，クロロホルムに溶解させ
る。10％重炭酸ナトリウムで洗浄し，有機層を硫酸ナト
リウムで乾燥し，減圧下で濃縮する。残渣を，クロロホ
ルム中メタノール勾配（０〜25％）を用いてシリカクロ
マトグラフィーにかける。 7.5.アデノシンピロリドンの調製 前記実施例で得られるアジドを水素化する。この水素
化は，該アジド（1mmol）のパラジウム−炭（100mg,Pd
10重量％）を含むエタノール（10mL）溶液に30ポンド
の水素圧をかけて24時間振盪することにより行われる。
この溶液をセライトを用いて濾過し，濾液をエバポレー
トする。残渣を直接次のステップに用いる。 7.6.N−６フタロイルアデノシンピロリドンの調製 アデノシンピロリドン（1mmol）をフタロイルクロリ
ド（1.4mmol）でアシル化することによりＮ−６位にフ
タロイル基を導入する。この反応は，反応液中にアンモ
ニアを加えないこと以外は，上記シチジンのアニソイル
化と同様の方法を用いて行われる。 7.7.2−アミノ−６−クロロプリンピロリドンの調製 ピロリドントシレートを,6−クロロプリン誘導体の調
製に示された方法で２−アミノ６−クロロプリンを用い
てアルキル化する。 7.8.グアニンピロリドンの調製 前段で得られるクロロプリンピロリドン（1mmol）を
ジグリム（10mL）および25％トリメチルアミン水溶液
（2mL）中に溶解させる。その溶液を室温で５時間攪拌
し，水（10mL）を加え，その混合物を減圧下で10mLにま
で濃縮する。酢酸（2mL）を加え，その混合液を減圧下
でエバポレートし，オイル状物を得た。酢酸四エチルア
ンモニウムを含む残渣は，直接，次のステップに使用さ
れる。 7.9.N−２アセチルグアニンピロリドンの調製 前段で得られるグアニンピロリドン（1mmol）を無水
酢酸（5mL）と，還流下で２時間反応させる。その溶媒
をエバポレートし，その残渣をジメチルホルムアミドと
共にエバポレートする。その残渣を,0℃にてアンモニア
で飽和させたエタノール（5mL）に溶解させ，溶液をこ
の温度で２時間攪拌する。この溶媒を減圧下でエバポレ
ートし，残渣をクロロホルム中メタノール勾配（５〜50
％）を用い，短いカラムのシリカクロマトグラフィーに
より精製する。 7.10. ２−アミノ−６−アジドリンピロリドンの調製 この化合物は，実施例7.4.の手法を用い,2−アミノ−
６−クロロプリンピロリドンから調製される。実施例7.
4.の方法と異なるのは，反応がより長い時間を必要と
し，かつより高い温度で行われることである。 7.11. 2,6−ジアミノプリンプロリドンの調製 この化合物は,2−アミノ−６−アジド誘導体の還元に
より，アデノシンピロリドンと同様に調製される。 7.12. Ｎ−２アセチルＮ−６ フタロイル2,6−ジアミ
ノプリンピロリドンの調製 メタノール性アンモニア処理を８時間にわたって行う
ことを除き，上記Ｎ−２アセチルグアニンピロリドンの
調製と同様の方法により，アセチル基が導入される。溶
媒をエバポレートし，残渣をアデノシン誘導体の場合と
同様にフタロイル化する。 7.13.イノシンピロリドンの調製 ６−クロロプリンピロリドン（1mmol）は，グアニン
ピロリドン誘導体の調製に用いられる方法によりイノシ
ン誘導体に変換された。その化合物は，クロロホルム中
メタノール勾配（５〜25％）を用いて，シリカクロマト
グラフィーによって精製される。 7.14. ２−ヒドロキシピリミジンピロリドンの調製 この化合物は,6−クロロプリン誘導体の調製に用いら
れる手法により,2−ピリミジノンのアルキル化により得
られる。 実施例８ プリンおよびピリミジンＴ−BOCアミノ酸の調製 シトシンピロリドンの下記一般的手法は，すべての適
切に保護されたピロリドン誘導体に適用することができ
る。ｔ−BOC酸として言及されるその生成物は，ピロリ
ドン環が開裂して酸およびｔ−BOCアミンとなることに
より形成される。 8.1.シトシンｔ−BOC酸の調製 Ｎ−４−アニソイルシトシンピロリドン（1mmol）
を，ジ−tert−ブチルジカーボネート（2mmol），トリ
エチルアミン（1mmol）およびジメチルアミノピリジン
（1mmol）を含むメチレンクロライドに溶解させる（0.5
M溶液）。この溶液を，室温で10時間攪拌する。揮発性
物質を除去し，残渣をクロロホルム中メタノール勾配
（０〜20％）を用いて，シリカで精製する。その残渣を
テトラヒドロフランに溶解させ（0.2M溶液），次に，水
酸化リチウムを加える（3mmol,1M溶液として）。室温で
５時間保持した後，その溶液を10％酢酸（3mmol）を添
加することにより中和し，溶媒を減圧下で除去する。そ
の残渣を9Nアンモニアに溶解させ，室温で１〜10時間攪
拌した。その溶媒を減圧下で除去し，残渣を水およびメ
タノール（またはトリフルオロエタノール）の混合液を
用いて,C18逆相シリカゲルのクロマトグラフィーにより
精製する。 8.2.ウラシルｔ−BOC酸の調製 これは，次の操作によりシトシンｔ−BOC酸から調製
する： シトシンｔ−BOC酸（1mmol）を酢酸水溶液に溶解さ
せ，亜硫酸ナトリウム（1mmol）と４℃で処理する。そ
の混合物を１時間攪拌し，減圧下エバポレート・乾固す
る。その生成物を，水およびメタノール（またはトリフ
ルオロエタノール）混合液を用い,C18逆相シリカゲルの
クロマトグラフィーにより精製する。 8.3.5−ブロモウラシルｔ−BOC酸の調製 この化合物は次の手法により，ウラシルｔ−BOC酸か
ら得る： ウラシルｔ−BOC酸（1mmol）をDMF（3ml）に溶解さ
せ,N−ブロモコハク酸イミド（1.2mmol）で処理する。
その溶液を,16時間室温で放置する。溶媒を減圧下で除
去した後，その生成物を，水およびメタノール（または
トリフルオロエタノール）混合液を用い,C18逆相シリカ
ゲルのクロマトグラフィーにより精製する。 8.4.N−保護化ｔ−BOC酸の調製 認識部分の環外のアミノ基をアシル化するためのこの
一般的な手法もまた，アデノシン誘導体の保護に適用さ
れる。 前段で得られるシトシンｔ−BOC酸（1mmol）をＮ−メ
チルイミダゾールあるいはピリジン（5mL）に溶解させ
て，クロロトリメチルシラン（5mmol）で処理する。室
温で15分間保持した後，その溶液を２−（４−ニトロフ
ェニル）エチルクロロフォーメート3mmol〔F.Himmelsba
chおよびW.Pfleiderer（Tetrahedron Lett（1983）24:3
583）の方法により得られる〕で処理する。その反応液
を室温で８時間保持し，次に氷浴で冷却し，そして水
（1mL）を加えた。５分後，濃アンモニア1mLを加えて，
混合物を室温で15分間攪拌する。その反応液を次に，エ
バポレート・乾固し，その残渣を水に溶解させる。その
溶液を2M塩酸で酸性にして，クロロホルムで抽出する。
合併した有機抽出物を硫酸ナトリウムで乾燥し，減圧下
でエバポレートする。その残渣をクロロホルム中メタノ
ール勾配（５〜50％）を用いてシリカクロマトグラフィ
ーにより精製する。 グアニンおよび2,6−ジアミノプリン誘導体の保護の
ために，上の操作を改変し，反応をピリジン中で行い，
アシル化試薬を９−フルオレニルメチルクロロフォーメ
イトとした。 実施例９ プリンおよびピリミジンアミノ酸の調製 次の手法は，すべての誘導体に適用される。それはｔ
−BOC基を取り除き，バックボーンの第一アミノ基をフ
リーにする。 ｔ−BOC酸（1mmol）を20％のトリフルオロ酢酸を含む
メチレンクロライド5mLに溶解させ，室温で30分間攪拌
した。トルエン（3mL）を加え，溶媒を減圧下でエバポ
レートすると，アミノ酸トリフルオロ酢酸塩が得られ
る。これを直接，カップリング反応に用いる。 実施例10 アキラルな非環状ポリヌクレオチド類似物の組立てのた
めのサブユニットの調製 10.1シチジン類似物の調製 水素化ホウ素リチウム，ジ−tert−ブチルジカーボネ
ートおよびビス（トリフェニルホスフィン）パラジウム
IIクロライドは,Aldrich Chemical Co.,Milwaukee,WI.
から得た。２−アミノ−５−ブロモピリミジンは,T.Nis
hikawa〔Chem.Pharm.Bull.９:38（1961）〕の方法によ
り調製される。 ２−アミノ−５−ブロモピリミジンは，ベンゾイルク
ロライドを用いる実施例２の一般的手法により，環外の
アミノ基がベンゾイル化される。生成物のベンズアミド
（25mmol）を，トリエチルアミン（10mL），ベンゼン
（10mL）およびビス（トリフェニルホスフィン）パラジ
ウムIIクロライド（0.375mmol）を含む45mLの耐圧容器
に加える。その容器にアルゴンを吹き込み，密閉し，そ
して，一酸化炭素で600psiに加圧し，次に，水素で1200
psiにまで加圧する。攪拌しながらその反応容器を油浴
中145℃に加熱する。気体の吸収がすべて終わった後，
その反応物を冷却し，気体をゆっくりと排気する。無水
エーテルの添加後，その反応混合物を濾過し真空下でエ
バポレートする。次に，その生成物を，メチレンクロラ
イド中イソプロパノール勾配（０〜20％）を用いて，シ
リカゲルクロマトグラフィーで単離した。 前段で得られる２−ベンズアミドピリミジン−５−カ
ルボキシアルデヒド（1mmol）をエタノール（5mL）に溶
解させ,4−アミノ酪酸（1mmol）およびトリエチルアミ
ン（1mmol）で処理する。１時間攪拌後，その混合物を1
0％パラジウム−炭（100mg）を用いて30psiで水素化す
る。水素の吸収が終わった後，その反応液を濾過し，溶
媒を減圧下で除去する。その残渣を０℃にてアンモニア
で飽和したメタノールに溶解させ，室温で10時間攪拌す
る。溶媒をエバポレートした後，その残渣を酢酸アンモ
ニウム（0.2M）でpH7に緩衝化したメタノール−水混合
液を用い,C18シリカゲルのクロマトグラフィーにより精
製する。 前段で得られるアミノ酸（1mmol）をジ−tert−ブチ
ルジカーボネート（1mmol）を含むエタノール（3mL）に
溶解させる。トリエチルアミン（1.5mmol）を室温でゆ
っくりと加える。二酸化炭素の発生が終わった後，その
溶媒を真空下で除去し，そして残渣を直接次の反応に用
いる。 前段で得られるｔ−BOCアミノ酸の環外のアミノ基を,
2−（フェニルスルホニル−エトキシカルボニルクロラ
イド）を用いる実施例２の一般的手法により，アシル化
する。その生成物は，クロロホルム中メタノール勾配
（０〜50％）を用い，シリカゲルクロマトグラフィーに
よって精製され得る。 前段で得られる２−（フェニルスルホニル）−エトキ
シカルボニル−保護化BOCアミノ酸を，実施例11.3およ
び11.4中の手法により,p−ニトロフェニルまたはＮ−ヒ
ドロキシサクシイミドイル活性エステルへ変換した。 10.2.ウリジン類似物の調製 ６−ヒドロキシニコチン酸エステルを,H.Gault,J.Gil
bert,およびD.Briaucourt〔C.R.Acad.Sci.,Paris,Ser.
C,266:131（1968）〕の方法により調製する。水酸化ホ
ウ素リチウムはAldrichから得られる。二酸化マンガン
は,Vereshchaginら〔Zhurnal Arganicheskoi Khimil,
８:1129（1972）〕の方法により調製する。Dowex樹脂
は,Bio−Rad Laboratories,Richmond,CAから得られる。 ６−ヒドロキシニコチン酸エチル（49mmol）のテトラ
ヒドロフラン（10mL）溶液を，窒素雰囲気下，窒素で水
素化ホウ素リチウム（100mmol）のテトラヒドロフラン
（THF）（75mL）懸濁液へ滴下する。この粘性の混合物
を25℃で16時間攪拌する。次に,20％酢酸60mlを，冷却
したその懸濁液に加える。THFを減圧下でエバポレート
し，残留した水性溶液を，リチウムイオンを取り除くた
めに，イオン交換カラム（Dowex−50W−X8）にかける。
カラムを注意深く250mLの水で洗浄し，次にエバポレー
トする。メタノールと共に繰り返しエバポレートするこ
とによって，得られた残渣からホウ酸が除去される。生
成物を減圧下で蒸留することにより精製する。 前段で調製されたベンジリックアルコール（66mmol）
をエーテル（250mL）に溶解させ，二酸化マンガン（54
g）のエーテル（100ml）スラリーで，ゆっくりと処理
（発熱を伴う）する。室温で12時間保持した後，その混
合物を濾過し，減圧下で溶媒を除去し，その残渣を真空
で蒸留すると,6−ヒドロキシニコチンアルデヒドを得
る。 前段で得られるアルデヒドを，実施例11.1のシチジン
類似物の調製と同様に,4−アミノ酪酸と反応させる。 前段で得られるアミノ酸を，実施例10.1のシチジン類
似物の調製と同様に，対応するBOC−誘導体へ変換し
た。 前段で得られるBOC−アミノ酸は，実施例11.3および1
1.4中の手法により,p−ニトロフェニルまたは,N−ヒド
ロキシサクシイミドイル活性エステルへ変換する。 実施例11 ５′−保護化,3′−活性化２′−デオキシヌクレオシド
の調製 11.1.2′−デオキシヌクレオシド５′−Ｏ−ジメトキシ
トリチル誘導体 ２′−デオキシヌクレオシド５′−Ｏ−ジメトキシト
リチル誘導体の調製には，次の手法が一般的である。 Ｎ−２ ９−フルオレニルメトキシカルボニル−２′
−デオキシグアノシン（1mmol）を無水ピリジン（2mL）
に溶解させ,0℃に保つ。ジメトキシトリチルクロリド
（1.2mmol）を0.15mmolずつ８時間にわたり添加する。
さらに２時間後，メタノール（0.5mL）を加え，溶液を
減圧下で濃縮する。残渣を重炭酸ナトリウム（2mL,0.5
％）および塩化メチレン（5mL）の混合液で処理する。 水層を塩化メチレン（２×5mL）で抽出し，合併した
有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し，エバポレートする。
残渣をトルエンとともに数回エバポレートし，生成物を
塩化メチレン中メタノール勾配（０〜10％）を用い，シ
リカゲルクロマトグラフィーで精製する。 11.2.5′−ジメトキシトリチル−２′−デオキシヌクレ
オシド３′−０−（４−ニトロフェニル）カーボネート ５′−０−ジメトキシトリチル−２−デオキシシチジ
ン３′−０−（４−ニトロフェニル）カーボネートの調
製法は,4−ニトロフェニルカーボネートの一般的調製法
である以下の操作法の中に記載されている。ビス（４−
ニトロフェニル）カーボネートおよびN,N−ジメチルア
ミノピリジンはSigmaより得られる。 ５′−０−ジメトキシトリチル−Ｎ−２−（４−ニト
ロフェニル）−エトキシカルボニル−２′−デオキシシ
チジン（1mmol）を，無水ジメチルホルムアミド（5mL）
に室温で溶解させ，ビス（４−ニトロフェニル）カーボ
ネート（2mmol）で処理し，次に，減圧下でエバポレー
トする。残渣をジメチルホルムアミド（5mL）に溶解さ
せ,N,N−ジメチルアミノピリジン（0.1mmol）を加え
る。黄色の溶液をエバポレートし,1時間反応させる。反
応混合物をクロロホルム（10mL）に溶かし，塩酸水溶液
（5mL,0.1M）で洗浄する。有機層を水酸化ナトリウム水
溶液（5mL,0.1M），水（2mL）で２度洗浄し，硫酸ナト
リウムで乾燥し，エバポレートする。残渣をシリカゲル
カラムにかけ，クロロホルム中イソプロパノール勾配
（０〜10％）で溶離させる。生成物を含む分画を集め，
エバポレートし，クロロホルム（10mL）に溶かし，痕跡
量の４−ニトロフェノールを除くために水酸化ナトリウ
ム水溶液での洗浄を繰り返す。この有機層を水で洗浄
し，硫酸ナトリウムで乾燥しエバポレートする。生成物
は,TLCによれば均一であり，二量化カーボネートの調製
に直接用いられる。 FMOC基を含むヌクレオシドのカーボネートの調製に
は,N,N−ジメチルアミノピリジンよりもむしろ,N−メチ
ルイミダゾームを触媒として使用するのが時として優れ
ている。 11.3 Ｎ−保護化ｔ−BOC p−ニトロフェニルエステル サブユニット結合用の活性化エステルは，以下の２つ
の操作法により調製される。これは，すべてのｔ−BOC
酸誘導体において一般的なものである。 実施例8.4.で得られるｔ−BOC酸の0.2〜0.5Mの酢酸エ
チル（または塩化メチレン）溶液にｐ−ニトロフェノー
ルを約20％過剰量だけ加える。０℃において，ジシクロ
ヘキシルカルボジイミドを計算量だけその溶液に加え
る。0.5時間後，混合物を室温にもどし,1時間保持す
る。分離したジシクロヘキシル尿素を濾過し，溶媒で洗
う。濾液と洗浄液とを合併し，減圧下でエバポレートし
乾固する。このエステルはカップリング反応に直接使用
され選る。または，シリカの短いカラムでクロロホルム
中イソプロパノール勾配（０〜50％）で精製され得る。 11.4. Ｎ−保護化−ｔ−BOC N−ヒドロキシスクシイミ
ドイルエステル 実施例8.4.で得られるｔ−BOC酸（1mmol）のアセトニ
トリル（5mL）溶液に，ピリジン（1mmol）およびN,N′
−ジスクシイミジルカーボネート（1mmol）を加える。
この溶液を室温で３時間攪拌する。溶媒を減圧下で除
き，残渣をクロロホルムに溶解する。有機相を0.1M HCl
および水で洗浄し，硫酸ナトリウムで乾燥し，エバポレ
ートして乾固する。このエステルは，直接使用し得るだ
け充分に純粋なものである。 実施例12 カーボネート分子間サブユニット結合の形成 シチジニル−（３′−５′）−シチジンカーボネートの
調製法は，次の操作法の中で記載されている。これは，
カーボネート分子間サブユニットの形成およびオリゴカ
ーボネートの脱保護において一般的な操作法である。塩
基を保護している基は,2−（４−ニトロフェニル）エト
キシカルボニル,2−（フェニルスルホニル）エトキシカ
ルボニル，またはFMOCでなければならないことに注意さ
れたい。tert−ブチルジメチルシリルクロライトはAldr
ichから得られる。 12.1 ２′−デオキシヌクレオシド３′−Ｏ−tert−ブ
チルジメチルシリル誘導体の調製 ３′−Ｏ−tert−ブチルジメチルシリル−Ｎ−２−
（４−ニトロフェニル）エトキシカルボニル−２′−デ
オキシシチジンの調製法を以下に示す。これは,2′−デ
オキシヌクレオシド−３′−Ｏ−tert−ブチルジメチル
シリル誘導体の調製のための一般的操作法である。 乾燥ジメチルホルムアミドまたはテトラヒドロフラン
10mLに５′−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ−４−（４−
ニトロフェニル）−エトキシカルボニル−２′−デオキ
シシチジン（1mmol）とイミダゾール（3.5mmol）とを溶
かした溶液に，攪拌しながらtert−ブチルジメチルシリ
ルクロライド（3mmol）の乾燥DMF（10mL）溶液を滴下す
る。反応液を１時間攪拌した後，氷で反応を止め，塩化
メチレンで抽出する。水で洗浄し，硫酸ナトリウムで乾
燥する。有機層を減圧下でエバポレート乾固し，シリカ
ゲルクロマトグラフィーで塩化メチレンを溶離剤として
精製する。 前段で得られる５′−Ｏ−ジメトキシトリチル誘導体
（1mmol）の塩化メチレン（5mmol）溶液に，臭化亜鉛の
メタノール（15％v/v）含有塩化メチレン（10mL,1M）溶
液を加える。反応混合物を30分間攪拌し，氷で反応を止
め，塩化メチレンで抽出する。有機層を水で洗浄し，硫
酸ナトリウムで乾燥し，減圧下でエバポレート乾固す
る。生成物を，塩化メチレン中メタノール勾配（０〜10
％）を用いシリカゲルクロマトグラフィーで精製する。 ５′−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ−２−（４−ニト
ロフェニル）エトキシカルボニル−２′−デオキシシチ
ジン−３′−Ｏ−（４−ニトロフェニル）カーボネート
（1.5mmol）および３′−Ｏ−tert−ブチルジメチルシ
リル−Ｎ−４−（４−ニトロフェニル）エトキシカルボ
ニル−２′−デオキシシチジン（1mmol）をジメチルホ
ルムアミド（5mL）に溶かし，減圧下で溶媒を除去す
る。これを２度繰り返す。残渣を再びジメチルホルムア
ミド（5mL）に溶かし,N,N′−ジメチルアミノピリジン
（0.5mmol）またはＮ−メチルイミダゾール（1mmol）で
処理する。溶媒を減圧下でエバポレートすることにより
除去し，反応物を室温にて終夜放置する。残渣をクロロ
ホルム（20mL）に溶かし,HCl水溶液（2mL,0.1M），水
（2mL）,NaOHナトリウム水溶液（２×2mL,0.2M），水
（2mL）で洗浄し，有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し，
エバポレートする。この残渣を，クロロホルム中イソプ
ロパノール勾配（０〜30％）を用いてシリカゲルで精製
する。単離した生成物は,TLC（および400MHzのNMRにお
いて均一である。 残渣を,B.L.GaffneyおよびR.A.Jones〔Tetrahedron L
ett（1982）23:2257〕の記述に従い,2M HF/1M tert−ブ
チルアンモニウムフルオライド（TBAF）試薬を用いて脱
シリル化する。この2M HF/1M tert−ブチルアンモニウ
ムフルオライドを含むピリジン（TBAF 1mmol）に，前段
で得られる脱保護化ヌクレオシドを加える。24時間攪拌
後，反応液を塩化メチレンと重炭酸ナトリウム水溶液と
の間で分配する。その有機層を水洗し，硫酸ナトリウム
で乾燥し，エバポレートし乾固する。残渣を塩化メチレ
ン中メタノール勾配（５〜25％）を用い，シリカクロマ
トグラフィーで精製する。 ３′−ヒドロキシジヌクレオシドカーボネートを，実
施例11の方法により３′−（４−ニトロフェニル）−カ
ーボネートに変換する。これらの誘導体は，ヌクレオシ
ドまたはオリゴヌクレオシドカーボネートの５′−水酸
基と反応し，より高級のオリゴヌクレオシドカーボネー
トが調製され得る。 実施例13 カーバメート分子間サブユニット結合の形成 ビス（ｐ−ニトロフェニル）カーボネート,p−アニソ
イルジフェニルメチルクロライド,N,N−ジメチルアニリ
ン（DMA），およびトリエチルアミンは,Aldrich Chemic
al Co.で得られる。 上記実施例３で調製される目的とする５′−アミノ−
２′,5′−ジデオキシリボヌクレオシド（必要に応じて
塩基の保護のためにアセチル基またはベンゾイル基を使
用する）を，ピリジン中でｐ−アニソイルジフェニルメ
チルクロライド（1.2mmol）と処理する。12時間後，溶
媒をエバポレートし，残渣を再びクロロホルムに溶解さ
せる。この溶液をNaHCO3水溶液と水とで各々１回洗浄
し,Na2SO4で乾燥する。溶媒をエバポレートし，残渣を
シリカゲルクロマトグラフィーにかけてクロロホルム／
メタノール/1％トリエチルアミン混合液で溶出させる。 ５′−トリチル化アミノヌクレオシド（1mmol）をDMF
から２度エバポレートする。次に，溶媒としてDMFを使
用し，トリエチルアミン（またはN,N−ジメチルアミノ
ピリジン，またはＮ−メチルイミダゾール）の触媒量の
存在下でビス（ｐ−ニトロフェニル）カーボネート（2m
mol）と処理する。３時間後，溶媒をエバポレートし，
残渣をクロロホルムに溶解させる。この溶液を0.01N水
酸化ナトリウム水溶液で２度洗浄し，水で１度洗浄し，
次いでNa2SO4で乾燥する。この溶媒をロータリーエバポ
レートで除去する。残渣をシリカゲルクロマトグラフィ
ーにかけ，まず，クロロホルム/0.1％ DMA混合液で溶出
させ，次いで，クロロホルム／メタノール/0.1％ DMA溶
媒系で溶離させる。適当な分画を集め，エバポレート・
乾固させる。残渣を最小量のTHFに溶かし，この溶液を
過剰量のヘキサンに加える。沈澱した活性化ヌクレオシ
ドを濾過して集め，真空下で乾燥する。 目的とする５′−アミノヌクレオシド（1.1mmol）
は，上記実施例３のように,DMFで２度エバポレートす
る。活性化ヌクレオシド（1mmol）を反応器に加え，固
形物をDMFに溶解させる。溶液を小容量に濃縮し，一晩
放置する。溶媒を真空下で完全に除去し，残渣をクロロ
ホルムに溶解させる。この溶液を0.01N水酸化ナトリウ
ム水溶液で２度洗浄し，水で１度洗浄し，次に，固体の
硫酸ナトリウムで乾燥する。溶媒をロータリーエバポレ
ートで除去し，残渣をシリカゲルのクロマトグラフィー
にかけ，適当なメタノール／クロロホルム/1％トリエチ
ルアミン溶媒系で溶出する。二量体のヌクレオシドを含
む分画を合併し，エバポレート・乾固する。残渣を最小
量のTHFに溶解し，この溶液をヘキサンに加える。沈澱
物を集め，真空下で乾燥させる。 実施例14 チオカーバメートサブユニット間結合の形成 N,N−ジメチルアミノピリジン（DMAP）は,Aldrich ch
emical Co.で購入する。 実施例３で調製した５′−アミノヌクレオシドのサブ
ユニット間結合のチオカルバメートの生成は，上記の実
施例13に記載したのと同様の方法で行なわれる。操作法
において異なる点は次のとおりである。用いられた５′
−アミノヌクレオシドは塩基保護部分として,2−（フェ
ニルスルホニル）エトキシカルボニル（デオキシシチジ
ンおよびデオキシアデノシン用）または９−FMOC（グア
ノシンおよび2,6−ジアミノ−２′−ジオキシリボミド
用）基を有する。これらの分子の調製法は上記（実施例
３）に記載されている。５′−トリチルアミノヌクレオ
シド（1mmol）の活性化は,DMF中，トリエチルアミン（2
mmol）およびDMAP（触媒量）の存在下でｐ−ニトロフェ
ニルクロロチオフォーメート（Monatsber Deut Akad Wi
ss Berlin（1964）６:897のg Hilgetagおよびr.Phillip
psonの方法により調製）によりなされる。カップリング
ステップでは，この活性化モノマー（1mmol）と所望の
５′−アミノヌクレオシド（1.1mmol）とを用いる。触
媒としてはDMAPまたはＮ−メチルイミダゾールを，そし
て，溶媒としてはDMFを使用する。このステップでの水
性の処理物において,0.01N水酸化ナトリウム水溶液によ
る洗浄は省き水で洗浄を行う。 実施例15 モルフォリン型サブユニット間のカーバメートおよびチ
オカーバメート分子間サブユニット結合の形成 Ｎ−メチルイミダゾールはAldrich Chemical Co.から
購入する。 実施例５で調製した目的とする乾燥Ｎ′−保護化,5′
−フリーアルコールモルフォリン型のヌクレオシド（必
要に応じて塩基保護のためにアセチル基またはベンゾイ
ル基を使用）を，無水条件下でDMF中のビス−（ｐ−ニ
トロフェニル）カーボネートおよびトリエチルアミン
（またはDMAPまたはＮ−メチルイミダゾール）（触媒
量）で処理する。この溶液を３時間攪拌し，次にエバポ
レートし乾固する。残渣をクロロホルムに溶かし，その
溶液を0.01N水酸化ナトリウム水溶液で２度，水で１度
洗浄し，次にNa2SO4で乾燥する。溶媒をロータリーエバ
ポレートで除去し，残渣をシリカゲルクロマトグラフィ
ーにかけ，適当なクロロホルム／イソプロパノール/0.1
％DMA混合液で溶出する。目的とする活性化ヌクレオシ
ドを含む分画をあわせて，エバポレートし，得られた固
形物を最小量のTHFに溶解させる。このTHF溶液を過剰量
のヘキサンに加え，得られた沈澱物を採取して乾燥す
る。 DMFで２度エバポレートした後，目的とする５′−フ
リーヒドロキシ,N′−フリーモルフォリン型ヌクレオシ
ド（この実施例の中で挙げたのと同一の塩基保護基を使
用）（1.1mmol）を,5′−（ｐ−ニトロフェノキシカル
ボニル）モルフォリンサブユニット（1mmol）のDMF溶液
で処理する。反応溶液の容量を真空下で減じ，小容量と
する。必要であれば,N−メチルイミダゾールまたはトル
エチルアミンを触媒量反応容器中へ加える。得られた溶
液を室温で終夜放置する。残留した溶媒をエバポレート
し，残渣をクロロホルムに溶かす。クロロホルム溶液を
0.01N水酸化ナトリウム水溶液で２度，水で１度洗浄
し，そしてNa2SO4で乾燥する。この溶媒をロータリーエ
バポレートで除去し，残渣でシリカゲルクロマトグラフ
ィにかけ，クロロホルム／メタノールの混合溶媒で溶出
させる。目的とするダイマーを含む分画をあわせ，エバ
ポレート乾固する。残渣を最小量のTHFに溶かし，この
溶液を過剰量のヘキサンに加える。沈澱物を集め，真空
下で乾燥する。 チオカーバメート部分により結合したモルフォリンサ
ブユニットは，上記この実施例に関連して，次のように
操作を変更して調製する。塩基の保護基は,1−（フェニ
ルスルホニル）エトキシカルボニル基（デオキシシチジ
ンおよびデオキシアデノシン用），または９−FMOC基
（デオキシグアノシンおよび2,6−ジアミノ−２′−デ
オキシリボシド用）である。これらの分子の調製は，上
記（実施例５）に記載されている。Ｎ−保護化モルフォ
リンヌクレオシド（1mmol）は,DMF中で，トリエチルア
ミン（2mmol）とDMAPまたはＮ−メチルイミダゾール
（触媒量）との存在下,p−ニトロフェニルクロロチオフ
ェーメート（1.2mmol）で活性化される。カップリング
ステップには，この活性モノマー（1mmol）および所望
のＮ′−フリーモルフォリンヌクレオシド（1.1mmol）
を用いる。触媒としてDMAPまたはＮ−メチルイミダゾー
ルを，そして，触媒としてDMFを用い，溶液を35〜40℃
に加温して行う。これらのステップの水性の処理物にお
いては,0.01N NaOH水溶液による洗浄を省き，水で洗浄
する方法を採用する。 実施例16 エステルサブユニット結合の調製 N,N−ジメチルアミノピリジンおよびＮ−メチルイミ
ダゾールはAldrichから得られる。 ２つのサブユニットの結合は,5′−N,N−アセトアミ
ド−３′−ヒドロキシ誘導体と３′−シリル化−５′−
活性化エステルとの反応により行う。これらは実施例６
と同様に調製される。その試薬（各1mmol）をジメチル
ホルムアミドと数回にわたり共にエバポレートし，次
に，ジメチルホルムアミド（5mL）に溶かし,N,N−ジメ
チルアミノピリジン（0.2mmol）またはＮ−メチルイミ
ダゾール（1mmol）で処理する。溶媒を減圧下で除き，
反応物を室温で２時間放置する。残渣をクロロホルムに
溶かし，希HCl,水で洗浄し，有機層を硫酸ナトリウムで
乾燥し，そして，溶媒を減圧下でエバポレートする。残
渣をクロロホルム中メタノール勾配を用いてシリカゲル
クロマトグラフィーにより精製する。 その鎖は実施例６のように脱シリル化し，そして，前
段に示すように得られた３′−フリーヒドロキシ化合物
を活性化エステルで処理することにより伸長させてもよ
い。 実施例17 ｔ−BOCアミド結合ダイマーの形成 完全に保護されたｔ−BOC N−ヒドロキシスクシイミ
ドイルエステルまたはｐ−ニトロフェニルエステル（1m
mol）を，実施例11.3および11.4に従って調製し，乾燥
ジメチルホルムアミドで数回，共にエバポレートし乾燥
させる。実施例９で調製した保護化アミノ酸トリフルオ
ロ酢酸塩（1mmol）を同様に処理する。この２つの成分
を，別々に乾燥ジメチルホルムアミド（2mL）に溶解さ
せ，混合し，そして，ジイソプロピルエチルアミン（1.
0mmol）で処理する。この溶液を室温して１時間攪拌
し，次に溶媒を減圧下でエバポレートすることにより除
去する。この残渣をクロロホルムに溶解させ，希塩酸で
洗浄する。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し，減圧下で
エバポレート・乾固する。この残渣をクロロホルム中メ
タノール勾配（15〜50％）を用いてシリカゲルクロマト
グラフィーにより精製する。ｔ−BOCダイマー酸を水−
メタノール（トリフルオロエタノール）混合液を用いて
C18逆相クロマトグラフィーにより精製することもでき
る。 17.1 ｔ−BOCダイマー活性化エステルの調製 前段で得られた酸を，実施例11.3および11.4の一般的
手法を用いてＮ−ヒドロキシスクシイミドイルエステル
またはｐ−ニトロフェニルエステルに変換する。 17.2 ｔ−BOCダイマーアミノ酸トリフルオロ酢酸塩の
調製 実施例９の一般的操作法によりｔ−BOCダイマー酸を
トリフルオロ酢酸塩で処理する。 17.3 ｔ−BOCテトラマー酸の調製 ｔ−BOCダイマー活性化エステルおよびダイマー酸ト
リフルオロ酢酸塩を一般的操作法により結合させ,t−BO
Cテトラマー酸を得る。精製については,C18逆相シリカ
ゲルクロマトグラフィーで，水およびメタノール（また
はトリフルオロエタノール）混合液をトリエチルアンモ
ニウムアセテートによりpHを7.0に調整したものを用い
て溶出させる方法が，最も効果的である。このようにし
て，活性化エステルとフリーのアミン成分とを結合させ
ることによりどのような長さの鎖も調製され得る。 実施例18 ８−サブユニットカーボネート結合ポリマーの幾何的組
み立て DEAEセルロースはSigma Chemical Co.から購入する。
調製TLCプレートはEM Scienceの製品であり,VWR Scient
ificから購入する。HPLC装置，カラムおよび供給装置
は,Beckman Instruments,Inc.で得られる。 実施例12に記載した方法で調製した所望のカーバメー
ト結合ダイマー（0.2mmol）を，メタノール/THF/氷酢酸
（1:1:1）の混合液4mLで室温にて12時間で処理する。溶
媒を真空下で除き，残渣を最小量のTHFに溶解させる。
このTHF溶液を大容量のヘキサンに加え，得られた沈澱
物を採取し乾燥する。この酢酸塩をTHF/エタノール（4/
1）混合物に溶解させ,DEAEセルロース（塩基0.8mmol）
をこの容器に加える。20分間攪拌後，不均一な混合物を
濾過し，濾液をエバポレート・乾固する。残渣を最小量
のTHF/エタノール（4:1）に溶かし，この溶液をヘキサ
ンに加える。固形物を採取し乾燥する。沈澱操作を一度
繰りかえす。 所望のＮ−５′−トリチルダイマー（0.1mmol）（実
施例12で調製される）をDMFで２度エバポレートし，次
いで,DMFを溶媒とし，トリエチルアミン（またはDMAPま
たはＮ−メチルイミダゾール）（触媒量）の存在下で，
ビス（ｐ−ニトロフェニル）カーボーネート（2mmol）
で処理する。３時間後，溶媒をエバポレートし，残渣を
クロロホルムに溶解させる。この溶液を0.01N水酸化ナ
トリウム水溶液で２度，水で１度洗浄し，次に,Na2SO4
で乾燥する。溶媒をロータリーエバポレートで除去し，
残渣をシリカゲルクロマトグラフィーにかけ，クロロホ
ルム／イソプロパノールまたはメタノール/0・１％DMA
混合液で溶出させる。適当な分画を合併し，エバポレー
ト・乾固する。この残渣を最小量のTHFに溶解させ，そ
してこの溶液を過剰量のヘキサンに加える。沈澱した活
性化ダイマーを濾過して集め，真空下で乾燥させる。 上記調製した５′−アミノダイマーヌクレオシド（0.
11mmol）をDMFで２度エバポレートする。この活性化ダ
イマー（0.1mmol）を反応容器に加え，固形物をDMFに溶
解させる。溶液を小容量に濃縮し，終夜放置する。溶媒
を真空下で完全に除去し，得られた残渣をクロロホルム
に溶解させる。この溶液を0.01N水酸化ナトリウム水溶
液で２度，水で１度洗浄し，次に硫酸ナトリウムで乾燥
する。溶媒をロータリーエバポレーターで除去し，残渣
を調製TLCプレートにかけて適当なメタノール／クロロ
ホルム/1％トリエチルアミン溶媒系で溶出させる。テト
ラマーヌクレオシドを含むバンドを溶離させ，溶媒をエ
バポレートする。残渣を最小量のTHFに溶かし，この溶
液をヘキサンに加える。沈澱を集め真空下で乾燥させ
る。 この実施例の中で挙げた操作法を用い，次のような転
換を行う。所望のＮ−５′−トリチルエトラマーヌクレ
オシド（0.06mmol）を,THF/メタノール／氷酢酸（1/1/
1）で処理し精製して５′−アミノテトラマーヌクレオ
シド（0.05mmol）を得る。他のＮ−５′−トリチルテト
ラマーヌクレオシド（0.05mmol）をビス（ｐ−ニトロフ
ェニル）カーボーネートで活性化し，次いで精製する。
この２つのテトラマーを結合させ，処理し，さらに調製
TLCプレートまたはHPLCクロマトグラフィーにより精製
する。クロマトグラフィーで得られる物質を固形物とし
て単離し，最小量のTHFにとかし，ヘキサンにより沈澱
させる。そのオクタマー（８量体）ヌクレオシドを集
め，乾燥させる。 オクタマーを以下で使用するために，次のように形成
する。Ｎ−５′−トリチルオクタマーヌクレオシドをTH
F/メタノール／氷酢酸（1/1/1）で処理し，上に挙げた
条件で精製する。５′−アミノオクタマーヌクレオシド
（0.01mmol）をピリジン中無水コハク酸（0.02mmol）で
室温にて２時間処理する。溶媒をロータリーエバポレー
ターで除去し，残渣をエタノールで数回エバポレートす
る。残渣をTHF/エタノール（3/1）に溶かし，ヘキサン
／ベンゼン混合液（2/1）に加える。固形物を集め乾燥
させる。Ｎ−５′−スクシニル化オクタマーヌクレオシ
ド（0.01mmol）をピリジン／濃アンモニア（1/1）（1m
L）で処理する。終夜放置後，溶媒をロータリーエバポ
レーターで除去し，残渣をエタノールで数回エバポレー
トする。粗固形物を逆相（RP−18）HPLCを用い精製す
る。溶出物をエバポレートし，残渣をDMSOに加え，ヘキ
サン／ベンゼン（1/1）溶液で沈澱させる。固形物を採
取し，乾燥させる。 実施例19 ポリマーの段階的および段階的／ブロック組み立てに適
切な担体に結合した開裂可能なリンカーの調製：担体の
活性化およびリンカーの結合 長鎖アルキルアミン誘導体化制御細孔グラス（Cat.N
o.24875）は,Pierce Chemical Co.から得られる。2,2−
スルホニルジエタノールおよびジシクロヘキシルカルボ
ジイミドはAldrich Chemical Co.から得られる。 グラス担体のアミノ基（担体1gあたり約40mmol）を，
実質的にMatteucciおよびCaruthers（J Amer Chem Soc
（1981）103;3185）の方法により，無水コハク酸と反応
させ，フリーのカルボン酸末端を得る。2,2−スルホニ
ルジエタノール（60重量％水溶液）1/10molを次のよう
にして乾燥させる。まず,3倍容のジメチルホルムアミド
（DMF）と混合し，温水浴中で真空下濃縮して濃いシロ
ップとする。次に同容量のDMFを加えて濃縮し，濃いシ
ロップとし，さらにこの操作をもう１度繰り返す。次
に，乾燥DMFを加え，最終的に2Mのスルホニルジエタノ
ールを得る。スルホニルジエタノール1mlおよびジシク
ロヘキシルカルボジイミド0.2gの混合液を，カルボン酸
残基をもつ乾燥制御多孔グラス担体1gに加え，スラリー
を前後左右に動揺させて（攪拌しない）室温で終夜混合
する。その後，グラス担体をメタノールで充分に洗浄し
乾燥する。 実施例20 エイズ（AIDS）ウイルス染色体における保存された配列
に対する14−サブユニットカーボーネート結合ポリマー
の調製：固体担体上での段階的な組立て：第１サブユニ
ットの付加および鎖の伸長 Ｎ−メチルイミダゾール,4−（N,N−ジメチルアミ
ノ）ピリジン（DMAP），および1,8−ジアザビシクロ
〔5,4,0〕ウンデク−７−エン（DBU）は,Aldrich Chemi
cal Co.で得られる。メチルｐ−ニトロフェニルカーボ
ーネートは，メチルクロロフォーメートとｐ−ニトロフ
ェノールとから調製される。 実施例4.2で調製される２′−デオキシシチジン サ
ブユニット（N4はｐ−ニトロフェネトキシカルボニル部
分を,5′酸素はジ（ｐ−メトキシ）トリチル部分（DM
T）を，そして３′酸素はｐ−ニトロフェノキシカルボ
ニル部分を有する）（0.1mmol）を，最小容量の乾燥テ
トラヒドロフラン（THF）またはジメチルホルムアミド
に溶解させ，実施例19で調製される充分に乾燥した制御
多孔グラス担体（開裂可能なリンカーを有する）0.5gに
加える。触媒（1mmol Ｎ−メチルイミダゾールまたは
0.1mmol DMAPのいずれか）を加え，このスラリーを前後
左右に動揺させて（攪拌しない）２時間にわたり混合す
る。次にこのスラリーを濾過し，固形物をTHFで洗浄す
る。 1Mのメチルｐ−ニトロフェニルカーボーネートと0.5M
のDMAPとを含むTHF2mlを加えて20分間室温で混合するこ
とにより，未反応の水酸基をキャップする。その後，グ
ラス担体をTHFで洗浄し，濾過する。 ジクロロメタンで担体を洗浄して５′末端のジメトキ
シトリチルを除き，次に,0.2Mジクロロ酢酸ジクロロメ
タン溶液5mlで室温にて５分間処理する。次にグラス担
体をジクロロメタンで洗い濾過する。 次に，実施例１で調製され実施例２で活性化したサブ
ユニットを同様にして，次の順序で加える:G,A,T,A,A,
C,A,T,T,T,T,T,C,（ＧはFMOC部分で保護され,AおよびＣ
はｐ−ニトロフェネトキシカルボニル部分で保護されて
いる）。 実施例21 エイズウイルス染色体における保存された配列に対する
19−サブユニットカーバメート結合ポリマーの調製。固
体担体上におけるオリゴマーブロックの段階的組み立
て：第１サブユニットの付加および鎖の伸長。 実施例３で調製した５′−アミノ−２′,5′−ジデオ
キシシチジン サブユニット（0.2mmol）（ここでN4は
ベンゾイル部分を有し,5′−アミンは,p−メトキシトリ
チル部分を有し,3′酸素は,p−ニトロフェノキシカルボ
ニル部分を有する）を最小量の乾燥THFに溶かし，実施
例19で調製した開裂可能なリンカーを有する乾燥制御細
孔グラス担体0.5gに加える。触媒（1mmolのＮ−メチル
イミダゾールまたは0.1mmolのDMAP）を加え，このスラ
リーを前後左右に２時間揺動させて混合する。次にスラ
リーを濾過し，固形物をTHFで充分に洗浄する。 モノ−ｐ−メトキシトリチルをジクロロメタンで洗浄
して除き，続いて,0.2Mジクロロ酢酸のジクロロメタン
溶液5mlで室温にて１分間処理する。次に，担体をジク
ロロメタンで洗浄し，濾過する。１％容量のジイソプロ
ピルエチルアミンを含むTHF3mlで簡単に洗浄し,5′−ア
ミノ末端をフリーのアミンに変換する。これをTHFで洗
浄し，濾過する。 ５′−Ａ−Ｇ−３′配列をもつ３′−ｐ−ニトロフェ
ノキシカルボニル−活性化ダイマー（実施例13で調製さ
れる）0.1mmol（グアニンN2は，アセチル部分で保護さ
れ，アデニンN6はベンゾイルまたはｐ−ニトロベンゾイ
ル部分で保護されている）を最小量の乾燥THFに溶か
し，ガラス担体に加え，混合を２時間にわたり行う（こ
の反応および次のカップリングステップには触媒を加え
ない）。次に，スラリーをTHFで洗浄し濾過する。 ｐ−ニトロフェニル酢酸2Mを含むTHFを2ml加えて20分
間室温で混合することにより未反応のアミン部分をキャ
ップする。その後，ガラス担体をTHFで洗い，濾過す
る。 ５′−末端のモノ−メトキシトリチルを，前述のよう
にジクロロ酢酸により除去する。 実施例17で調製される活性化２量体サブユニット（こ
こでシトシンの環外の窒素はベンゾイル部分で保護され
ており,Aの環外の窒素はベンゾイルまたは,p−ニトロベ
ンゾイル部分で保護されている）を同様にして，次の順
序で加える:A−T,C−A,T−A,T−T,T−T,A−C,A−C,C−
Ａ（５′から３′）。 強い非求核塩基（例えば,AおよびＣにはｐ−ニトロフ
ェネトキシカルボニルまたはフェニルスルホニルエトキ
シカルボニルそしてＧにはFMOC）により除去され得る環
外の塩基性窒素保護基を有するサブユニットも，上記操
作法によりポリマーを組み立てるために作用され得る。
しかし，これらのどちらか一方の保護基を有するポリマ
ーは，通常，水酸化アンモニウムで処理するよりもDBU
で処理することによって脱保護される。 実施例22 エイズウイルス染色体における保存された配列に対する
19−サブユニットアミド結合ポリマーの調製。固体担体
上におけるオリゴマーブロックの段階的組み立て：第１
サブユニットの付加および鎖の伸長 実施例11.3と同様に調製されるシトシン含有非環状バ
ックボーンサブユニット（ここで，シトシンのN4は２
（ｐ−ニトロフェニル）エトキシカルボニル部分を有
し，バックボーンのアミンはｔ−ブトキシカルボニル部
分を有し，そして，カルボキシルは,p−ニトロフェニル
エステルの形態である）を最小容量の乾燥THFに溶解さ
せる。これを，実施例19で調製され，開裂可能なリンカ
ーを有する乾燥制御細孔グラス担体0.5gに加える。触媒
（1mmolのＮ−メチルイミダゾールまたは0.1mmolのDMA
P）を加え，担体を２時間にわたり混合し，濾過し，固
形物をTHFで充分に洗浄する。 担体をジクロロメタンで洗浄し，続いて,20％のトリ
フルオロ酢酸を含む塩化メチレン5mlで室温にて30分間
処理することによりｔ−BOCを除去する。担体をジクロ
ロメタンで洗浄し，濾過する。担体に結合しているアミ
ン末端を,1容量％ジイソプロピルエチルアミンを含むTH
F3mlで簡単に洗浄しフリーのアミンに変換し，さらにTH
Fで洗浄する。 実施例17で調製される（アミノ末端）−Ｇ−Ａ（カル
ボキシ末端）の配列を有する活性化２量体サブユニット
（ここでグアニンのN2のFMOC部分を有し，アデニンのN6
はｐ−ニトロフェネトキシカルボニル部分を有し，バッ
クーボンのアミノ末端はｔ−BOC部分を有し，そして，
カルボキシ末端は,p−ニトロフェニルエステルの形態で
ある）0.1mmolを最小容量の乾燥THFに溶かしてグラス担
体に加え，混合を２時間にわたり行う（この反応および
続くカップリングステップでは触媒を加えない）。その
担体をTHFで洗浄する。 2M p−ニトロフェニルアセテートを含むTHF2mlを加
え，室温で20分間混合することにより未反応のアミン部
分のいずれをもキャップする。その後，グラス担体をTH
Fで洗浄する。 上記のように，末端ｔ−BOC部分をTFAで除去し，そし
て担体を中和する。 続いて，実施例17で調製される２量体サブユニットを
次の順序で加える：（Ｃ末端）Ｔ−A,A−C,A−T,T−T,T
−T,C−A,C−A,A−Ｃ（Ｎ末端）。 環外窒素の保護基〔その保護基は，適切な求核試薬
（例えば,Cに対してはベンゾイル,Aに対してはベンゾイ
ルまたはニトロベンゾイル，そしてＧに対してはアセチ
ルまたはイソブチルにより除去されうる〕を有するサブ
ユニットも，上の操作法によりポリマーを組み立てるた
めに使用され得る。しかし，これらのいずれかの保護基
を有するポリマーは，通常,DBUで処理するよりもむしろ
水酸化アンモニウムで処理することにより脱保護され
る。 実施例23 実施例20のカーボネート結合ポリマーの形成（溶液への
適用） 実施例20の担体結合ポリマーの５′酸素は,1Mの無水
コハク酸およびDMAP 0.1Mを含むTHF溶液5mlで10分間室
温にて処理し,THFで洗浄し，濾過することにより，スク
シニル化される。次に，ポリマーを両者とも担体から遊
離され，その認識部分を脱保護化する。その脱保護化
は,DBU 0.3gを含む乾燥DMSO 3mlで室温にて12時間処理
することにより行われる。無水エーテルで沈澱させ無水
DMSOに再懸濁させる工程を２度繰り返すことにより，ポ
リマーをDBUから遊離させる。その後，このポリマーをD
MSO水溶液に再懸濁させ，陰イオン交換クロマトグラフ
ィーにより精製する。上記DMSO水溶液には，残留するDB
Uを中和するために痕跡量のpH7.5の緩衝液が加えられて
いる。 実施例24 実施例20のカーボネート結合ポリマーの形成（固相への
適用） ６−アミノカプロン酸をSandbergおよびRegmarssonの
方法（Int J peptide prot Res（1974）６:111）により
２−フェニルイソプロピルフェニルカーボネートと反応
させる。このＮ−保護化生成物（10mmol）を，次に，最
小容量のDMF中でDCC 20mmolおよびｐ−ニトロフェノー
ル50mmolと反応させることにより活性化させる。得られ
た生成物をシリカゲルを用いエーテルで展開して精製す
る。 実施例20の担体結合ポリマーを，上記アミノカプロン
酸生成物1mmolおよびDMAP 0.1mmolとTHF（2ml）中で，
室温にて２時間反応させる。次に，グラス担体をTHFで
洗浄し，濾過する。ポリマーを両者とも担体から遊離さ
せ，その認識部位を脱保護化する。この脱保護化は,DBU
0.3gを含む乾燥DMSO3mlと室温で12時間処理することに
よりなされる。無水エーテルで沈澱させ無水DMSOに再懸
濁させる工程を２度繰り返すことにより，ポリマーをDB
Uから遊離させる。 80％酢酸水溶液を添加し室温で２時間インキュベート
することにより，フェニルイソプロポキシカルボニル基
が除去される。この脱保護化ポリマーをエーテルで沈澱
させ,DMSO水溶液に再懸濁させ，次いで陽イオン交換ク
ロマトグラフィーにより精製する。 セルロース（タイプ20,Cat.No.3504,平均粒径20ミク
ロン,Sigma Chemical Co.）1g,ビス（ｐ−ニトロフェニ
ル）カーボネート1g,およびトリエチルアミン0.2mlをDM
F 5mlに加え，室温にて一夜攪拌する。このスラリーを
濾過し,DMF 10mlで１度洗浄し，次にメタノール50mlで
洗浄し，そして真空下で乾燥する。このような操作法に
よる活性化のレベルは,1gのセルロースあたりｐ−ニト
ロフェノキシカルボニル部分が23μmol結合したものが
その典型的なものである。 この活性化セルロース（0.5g）をDMSOで洗浄し，濾過
し，ポリマー10μmol（DMSO 1ml中）を加え，さらにジ
イソプロピレチルアミン30μmolを加える。この混合物
を密封容器内で穏やかに一夜攪拌し，濾過し,DMSOで洗
浄する。次に，担体をピリジン水溶液で洗浄し，メタノ
ールで洗浄し，乾燥する。 実施例25 実施例21のカーバメート結合ポリマーの形成（溶液相へ
の適用） 担体に結合したカーバメート結合ポリマー（実施例2
1）の５′アミノ部分をスクシニル化する。このスクシ
ニル化は,1Mの無水コハク酸および1Mのジイソプロピレ
チルアミンを含むTHF5mlと室温で10分間反応させ,THFで
洗浄することによりなされる。 DBU 0.3gを含有するDMF 3mlで処理することによ
り，ポリマーが担体から遊離する。無水エーテルで沈澱
させ無水DMFに再懸濁させる工程を２度繰り返すことに
より，ポリマーをDBUから遊離させる。 エーテルでポリマーを沈澱させ,DMSO 1mlに際懸濁さ
せ，濃アンモニア水1mlを添加することにより，保護基
が認識部位から除去される。通常，アデニンの保護基が
ベンゾイル部分であるときには，脱保護化は密封容器
中,30℃で12時間行われる。他方，アデニンの保護基が
ニトロベンゾイルであり，グアニンの保護基がアセチル
部分である場合には，脱保護化は，室温で６時間行われ
る。揮発性成分は真空条件下で除去され，ポリマー溶液
はpH 7.5の緩衝液で中和される。最後に，ポリマーをDM
SO水溶液に希釈し，陰イオン交換クロマトグラフィーで
精製する。 実施例26 実施例20のカーバメート結合ポリマーの形成（固相への
適用） 実施例23の活性化６−アミノカプロン酸試薬（1mmo
l）（THF 3ml中）を，担体に結合したカーバメート結合
ポリマー（実施例21）と，室温で20分間反応させる。こ
の担体をTHFで洗浄し，濾過する。この末端のフェニル
イソプロポキシカルボニル部分を除去する。フェニルイ
ソプロポキシカルボニル部分の除去は，ジクロロメタン
で洗浄し，次にトリフルオロ酢酸の0.5％ジクロロメタ
ン溶液5mlと室温にて15分間反応させ,THFで洗浄し，そ
して濾過する工程により行われる。 このポリマーは，実施例25に従い，担体から遊離さ
れ，そして認識部分の保護基が除去される。実施例25と
異なるのは，最後の精製が陽イオン交換カラムクロマト
グラフィーで行われることである。 精製されたポリマーは，実施例20と同様にしてセルロ
ース担体に結合させる。 実施例27 実施例22のアミド結合ポリマーの形成（溶液相への適
用） 担体に結合したアミド結合ポリマー（実施例22）は，
実施例24のようにスクシニル化される。 実施例24に従い，このポリマーを担体から遊離させ，
認識部位の保護基を除去し，そして精製する。 実施例28 実施例22のアミド結合ポリマーの形成（固相への適用） 担体に結合したアミド結合ポリマー（実施例22）を，
実施例24のように，活性化アミノカプロン酸と反応さ
せ，フェニルイソプロポキシカルボニル部分を除去す
る。 実質的に実施例24に従い，このポリマーを担体から遊
離させ，認識部位の保護基を除去し，精製し，そして次
にセルロース担体に結合させる。 実施例29 カルバメート結合を有するシトシン含有オリゴマーの合
成 （ｉ）５′−アミノ−N4−ベンゾイル−２′,5′−ジデ
オキシシチジン（１）の合成 Ti,G,S.、Gaffney,B.L.、Lones,R.A.J.Am.Chem.Soc.1
982,104,1316の方法に従って、２′,5′−ジデオキシシ
チジンの環外アミンを塩化ベンゾイルを用いて保護し、
次いでYamamoto,L、Sekine,M、Hata,T J.Chem.Soc.Park
in Trans,1,1980,306の方法に従って、５′−ヒドロキ
シル基をアジド化した。このアジド（1.980g,5056mmo
l）をエタノール100mLおよびDMF100mLに溶解した。氷酢
酸（10mL）を加水分解容器に加え、続いて10％Pd/C触媒
（260mg）を加えた。この反応容器に水素を充填（35ps
i）し、18.5時間振騰した。不均一な溶液を濾過した
後、ｐ−トルエンスルホン酸１水物（1.060g,5.56mmo
l）をメタノール溶液として反応容器に加えた。濾過物
をやや乾くくらいにエバポレートし、残渣を水にとり、
そして得られた溶液を酢酸エチルで３回抽出した。水溶
液をエバポレートし、残渣をDMFから２回エバポレート
した。通常、アミンを直接使用した。しかし、分析用に
は、少量の粗アミンをTHF/MeOH（3/1）中でDEAEセルロ
ースで処理し、そしてこの溶液を濾過し、そして加熱し
ないでエバポレートして乾固した。この残渣を最少量の
THF（0.5mL中約100mg）に溶解し、そしてTHF溶液を大量
のヘキサン／トルエン（4/1,約50mL）に加えて沈澱させ
た。アミンを回収し真空乾燥して、非結晶性固体（７）
を得た。 （ii）N4−ベンゾイル−２′,5′−ジデオキシ−５′−
（４″−モノメトキシトリチル）アミノシチジン（２）
の合成 ５′−アミノ−N4−ベンゾイル−２′,5′−ジデオキ
シシチジン（１）のトシル化物（反応工程の粗アミン、
約5.3mmol）をピリジンから２回エバポレートした。ア
ミンをピリジン（28mL）に懸濁後、トリエチルアミン
（2.2mL,15.9mmol）を加え、続いてｐ−アニシルクロロ
ジフェニルメタン（3.342g,10.8mmol）を反応容器に加
えた。この溶液を４時間攪拌し、次いでCHCl3で希釈し
て200mLにした。得られた溶液を２％NaHCO3水溶液で、
続いて水で抽出した。有機層を分け、乾燥（Na2SO4）
し、そしてエバポレートして乾固した。５％MeOH/95％C
HCl3を溶出液として、残渣をSiO2（300g）上でクロマト
グラフィーを行った。溶出物をエバポレートして乾固
し、残渣をTHF3mLに溶解し、そしてTHF溶液を大量のヘ
キサン／トルエン（3/1）に加えて沈殿させて生成物
（２）を728g（上記アジド基準で55％）得た。この生成
物は異なる使用に適しているが、分析用サンプルは、上
記沈殿を繰り返して調製した。 （iii）ｐ−ニトロフェニルN4−ベンゾイル−２′,5′
−ジデオキシ−５′−（４″−モノメトキシトリチル）
アミノシチジン３′−カーボネート（３）の合成 ビス（４−ニトロフェニル）カーボネート（1.594g,
5.24mmol）をDMF（20mL）から２回エバポレートした。
このカーボネートをDMF（8mL）に溶解し、これにトリエ
チルアミン（0.4mL,2.9mmol）を加えた。トリチルアミ
ン（２）（1.587g,2.64mmol）（DMF25mLから２回エバポ
レート）をDMF（5mL）溶液として反応容器に加えた。2.
5時間の攪拌後、減圧して容積を減らせた。残渣をCHCl3
に溶解し、得られた溶液を0.01NのNaOH溶液で２回、水
で１回抽出し、次いで乾燥（Na2SO4）した。溶媒をエバ
ポレートし、そして、まず１％MeOH/99％CHCl3（250m
L）、次いで３％MeOH/97％CHCl3を溶出液として、残渣
をSiO2（100g）上でクロマトグラフィーを行った。溶出
物をエバポレートして乾固し、残渣をTHF3mLに溶解し、
そしてTHF溶液を大量のヘキサン／トルエン（3/1）に加
えた。沈殿物を回収し、そして乾燥して（３）を1.383g
（67％）得た。 （iv）N4−ベンゾイル−２′,5′−ジデオキシ−５′−
（４″−モノメトキシトリチル）アミノシチジル−
（３′−５′−カルバモイル）−５′−アミノ−N4−ベ
ンゾイル−２′,5′−ジデオキシシチジン（４）の合成 トリチル化N4−ベンゾイル−２′,5′−ジデオキシ−
５′−（４″−モノメトキシトリチル）アミノシチジン
（２）（930mg,1.54mmol）を、THF（2mL）、氷酢酸（10
mL）およびMeOH（10mL）に加えた。室温で５時間後、ｐ
−トルエンスルホン酸１水物（290mg,1.54mmol）をメタ
ノール溶液として反応容器に加えた。溶媒を減圧下で除
去し、そして残渣をDMF（20mL）から２回エバポレート
した。アミン塩をDMF（5mL）に溶解し、この溶液にトリ
エチルアミン（0.5mL,3.6mmol）を加え、そして活性化
モノマーを得た（837mg,1.09mmol）。溶液を１晩攪拌
し、次いでエバポレートして乾固した。残渣をCHCl3に
溶かし、この溶液を0.01NのNaOHの溶液で２回、水で１
回抽出し、次いで乾燥（Na2SO4）した。溶媒をエバポレ
ートし、そして５％MeOH/95％CHCl3を溶出液として、残
渣をSiO2（50g）上でクロマトグラフィーを行った。溶
出物をエバポレートして乾固し、残渣を最小量のTHFに
溶解し、そしてTHF溶液を大量のヘキサン／トルエン（3
/1）に加えた。沈殿物を回収し、そして乾燥して２量体
（４）を835mg（73％）得た。 （ｖ）４−ニトロフェニルN4−ベンゾイル−２′,5′−
ジデオキシ−５′−（４″−モノメトキシトリチル）ア
ミノシチジル−（３′−５′−カルバモイル）−５′−
アミノ−N4−ベンゾイル−２′,5′−ジデオキシシチジ
ン３′−カルバメート（５）の合成 クロマトグラフィー溶媒を５％MeOH/95％CHCl3とする
以外はモノマー（２）と同様にして、２量体（４）（38
8mg,405μmol）を、ビス（４−ニトロフェニル）カーボ
ネート（365mg,120μmol）およびトリエチルアミン（80
μL,530μmol）で処理して、活性化２量体（５）を343m
g（75％）得た。 （vi）N4−ベンゾイル−２′,5′−ジデオキシ−５′−
（４″−モノメトキシトリチル）アミノシチジル−
（３′−５′−カルバモイル）−［５′−アミノ−N4−
ベンゾイル−２′,5′−ジデオキシシチジル−（３′−
５′−カルバモイル）］２−５′−アミノ−N4−ベンゾ
イル−２′,5′−ジデオキシイチジン（７）の合成 （４）を調製したのと同様の方法を用いて、２量体
（５）（174mg,187μmol）を（２）と同様にして脱トリ
チル化した。アミノ２量体のｐ−トルエンスルホン酸塩
と活性化２量体（５）（199mg,177μmol）をカップリン
グして、４量体（７）183mg（62％）を得た。 （vii）N4−ベンゾイル−２′,5′−ジデオキシ−５′
−（４″−モノメトキシトリチル）アミノシチジル−
（３′−５′−カルバモイル）−［５′−アミノ−N4−
ベンゾイル−２′,5′−ジデオキシシチジル−（３′−
５′−カルバモイル）］４−５′−アミノ−N4−ベンゾ
イル−２′,5′−ジデオキシチジン（９）の合成 ４量体（７）（163mg,97.6μmol）を（２）と同様に
して、氷酢酸/MeOH（4/1,6mL）を用いて脱トリチル化し
た。クロマトグラフィー溶媒を７％MeOH/93％CHCl3とす
る以外はモノマー（４）と同様にして、トリエチルアミ
ン（40μL,289μmol）の存在下で４量体のトシル化物と
活性化２量体（５）（105mg,93.5μmol）をカップリン
グした。この結果、163mg（73％）の６量体（９）を得
た。（viii）５′−アミノ−ベンゾイル−２′,5′−ジデオ
キシ−５′−（４″−モノメトキシトリチル）アミノシ
チジル−（３′−５′−カルバモイル）−［５′−アミ
ノ−N4−ベンゾイル−２′,5′−ジデオキシシチジル−
（３′−５′−カルバモイル）］４−５′−アミノ−N4
−ベンゾイル−２′,5′−ジデオキシシチジン（11）の
合成 ６量体（９）（514mg,21.6mmmol）をDMSOに溶解（4m
L）した。濃アンモニア（4mL）を注意深くDMSO溶液上に
乗せた。反応容器に封をして混合した。反応容器を40℃
で40時間保った。溶媒をエバポレートし、そして残渣を
最小量のトリフルオロエタノール（TFE,0.5mL）に溶解
した。TFE溶液をエーテル（20mL）に加え、そして溶液
をヘキサン（10mL）で希釈した。沈殿物を回収して、定
量的な収率で（10）を得た。 オリゴマー（10）を、氷酢酸/MeOH（2/1）で２時間処
理して脱トリチル化した。溶媒をエバポレートし、そし
て残渣をH2Oから２回エバポレートした。この残渣をTFE
（0.5mL）に溶かし、そしてこの溶液をエーテル（20m
L）に加えた。得られた溶液をヘキサン（10mL）で希釈
し、そして沈殿物を回収した。この固体をHPLCで精製
し、そして溶出液をエバポレートで濃縮した。残渣を0.
01NのHClに溶かし、そしてpH7.4緩衝液に加えることに
よって析出させた。残渣をH2Oで洗浄して乾燥し（11）
を得た。 実施例30 カルバメート結合を有するシトシン含有モルホリノオリ
ゴマーの合成 （ｉ）６−（N4−ベンゾイルシトシン−１イル）−２−
ヒドロキシメチル−４−トリチルモルホリン（７）の調
製 N4−ベンゾイルシトシン（10.065g,29.0mmol）および
アンモニウムビボレート（8.780g,33.3mmol）をメタノ
ールに懸濁し、そして過ヨウ素酸ナトリウム（6.303g,2
9.5mmol）で2.25時間処理した。溶液を濾過し、そして
少量のメタノールで固体を洗浄した。濾過物および濾液
をあわせ、そしてシアノ水素化ホウ素ナトリウム（2.49
7g,39.7mmol）を有するフラスコに加えた。20分後、追
加のハイドライド試薬0.62g（9.87mmol）を加え、そし
て溶液をさらに15分攪拌した。ｐ−トルエンスルホン酸
（5.962g）を反応容器に加え、ガスの発生が収まった
後、追加量のｐ−トルエンスルホン酸（5.883g）をフラ
スコに加えた。２回目のｐ−トルエンスルホン酸を加え
た時に生成物の沈殿が生じた。３回目のｐ−トルエンス
ルホン酸（3.0g）を反応容器に加えた。１晩攪拌後、溶
液を濾過し、固体を水次いでメタノール、最後にエーテ
ルで洗浄した。固体を真空乾燥して、所望のモルホリン
塩8.022g（55％）を得た。 単離した上記固体の一部分（3.996g,7.96mmol）をDMF
からエバポレートして乾燥させた。乾燥固体をDMF（30m
l）およびトリエチルアミン（3.03ml,21.7mmol）に溶解
し、そしてこの溶液にトリチルクロライド（2.762g,9.9
3mmol）を加えた。30分後、溶液をクロロホルムで希釈
し、そして５％炭酸ナトリウム水溶液で洗浄した。有機
相を硫酸ナトリウムで乾燥し、次いでエバポレートして
乾固した。２％メタノール／クロロホルム/0.1％N,N−
ジメチルアニリン続いて４％メタノール／クロロホルム
/0.1％N,N−ジメチルアニリンを溶出液として残渣をシ
リカゲルでクロマトグラフィーを行った。所望のヌクレ
オシドを含む画分をあわせて、そしてエバポレートして
乾固した。固体をCHCl3に溶解し、そして0.1N NaOHで１
回洗浄し、次いで乾燥した（Na2SO4）。溶媒をエバポレ
ートし、そして残渣を最小量のクロロホルムに溶解し
た。クロロホルム溶液を大量のヘキサンに加えて、固体
を得た。濾過によって固体を回収し、残渣を真空乾燥し
てモルホリンヌクレオシド（７）4.069g（89％）を得
た。（ii）６−（N4−ベンゾイルシトシン−１−イル）−２
−（ｐ−ニトロフェノキシカルボニルオキシメチル−４
−トリチルモルホリン（８）の調製 塩基を保護したモルホリンヌクレオシド（７）（789m
g,1.38mmol）をDMFから１回エバポレートした。ビス−
（ｐ−ニトロフェニル）カーボネート（730mg,2.37mmo
l）を反応容器に加え、そして混合物をDMFから１回エバ
ポレートした。残渣をDMF（8ml）に溶解し、この溶液に
トリエチルアミン（0.65ml,5.5mmol）をゆっくり加え
た。この溶液を室温で1.3時間攪拌し、次いでエバポレ
ートして乾固した。残渣をシリカゲル（35g）カラムに
かけ、そして生成物を２％MeOH/CHCl3/0.1％DMA溶液を
用いて溶出した。生成物を含む画分を溜め、0.01N NaOH
水溶液で４回、水で１回洗浄し、得られた溶液をNa2SO4
で乾燥した。溶媒をエバポレートして、残渣を最小量の
クロロホルムに溶解した。クロロホルム溶液を大量のヘ
キサンに加え、そして析出した沈殿物を回収し、真空乾
燥後、活性化モルホリンヌクレオシド（８）を919mg（9
0％）得た。 （iii）モルホリン２量体（９）の調製 モルホリンモノマー（７）（667mg,1.17mmol）を25ml
の80/20酢酸メタノールに溶かした。1.5時間静置後、メ
タノール（4ml）中のｐ−トルエンスルホン酸（222mg,
1.17mmol）を溶液に加えた。溶媒をエバポレートし、そ
して得られた残渣をDMFから２回エバポレートした。固
体をDMF（7ml）に溶解し、そしてこの溶液に活性化モノ
マー（８）（862mg,1.17mmol）を加えた。固体を溶解
し、そしてトリエチルアミン（0.4ml,2.89mmol）を反応
容器に加えた。溶液を室温で１晩攪拌した。溶媒をエバ
ポレートし、そして残渣をシリカゲルクロマトグラフィ
ーした。生成物を４％MeOH/CHCl3で溶出した。クロロホ
ルム溶液を大量のヘキサンに加えた。生成物を濾過によ
って回収し、乾燥して所望の２量体（９）を972mg（90
％）得た。 （iv）２量体（10）の活性化 （８）の調製と同様にして、２量体（９）（491mg,52
9μmol）を、ビス−（４−ニトロフェニル）カーボネー
ト（277mg,898μmol）およびトリエチルアミン（0.25m
l,1.81mmol）で処理した。３％MeOH/CHCl3を抽出液とし
て活性化２量体の精製を行った。（７）と同様にして、
生成物を含む画分を溜め、そして希NaOH水溶液で洗浄し
た。沈殿による単離により活性化２量体（10）を420mg
（71％）得た。 （ｖ）４量体（12）の調製 （７）と同様の方法で２量体（９）の脱トリチル化を
行った。上記のように活性化３量体（10）（175mg,160
μmol）を用いてアミノ２量体ｐ−トルエンスルホン酸
塩（11）にカップリングして、４量体（12）を138mg（5
2％）得た。 （vi）６量体（14）の調製 ２量体（８）の調製と同様にして、４量体（12）（97
mg,59μmol）および活性化２量体（10）（65.2mg,59μm
ol）から６量体（14）の調製を行った。この手順により
モルホリノ６量体（14）を82mg（59％）得た。 （vii）脱保護６量体（15）の調製 ６量体（14）（20mg,6.1mmol）を、2mlの1/1（v/v）
濃NH3/DMSOに溶かし、そして30℃で30時間静置した。溶
媒をエバポレートし、そして残渣を１％酢酸を含むトリ
フルオロエタノールに溶かした。５分後、溶媒をエバポ
レートし、そしてpH2.1リン酸緩衝液中でKCl勾配を用い
てＳ−セファロースで残渣をクロマトグラフィーにより
精製した。６量体（15）を含む画分を溜め、そしてほと
んど乾燥状態になるまでエバポレートした。溶液をまず
水、次に水/CH2CN勾配を用いてポリプロピレン（Pharma
sia）で（15）をクロマトグラフィーにより脱塩した。
６量体（15）を含む画分をあわせ、エバポレートして乾
固した。残渣をトリフルオロエタノールに溶かし、そし
て大量のエーテルに加えた。固体（15）を遠心分離で回
収し、そして真空乾燥した。 （viii）６量体（19）のテーリング ポリエチレングリコール1000（15g,15mmol）を乾燥DM
Fからエバポレーションによって乾燥させ、次いでDMF
（100ml）中ビス−（４−ニトロフェニル）カーボネー
ト（2.28g,7.5mmol）およびトリエチルアミン（4.2ml,3
0mmol）で30℃24時間処理して、（16）のDMF溶液を得
た。この溶液は、次の工程に直接使用した。 4mlトリフルオロエタノール中で、６量体（14）（50m
g,15.2μmol）を室温で３分間酢酸で処理した。エーテ
ル（25ml）およびジイソプロピルアミン（0.3ml）を試
料に加えた。沈殿を遠心分離により集め、そして溶液を
デカンテーションにより分離した。ペレットを、30℃で
１晩、PEG1000 p−ニトロフェニルカーボネート（17）
（10ml）のストック溶液で処理した。この溶液に濃NH3
（10ml）を加え、そしてこの混合物を30℃で24時間静置
した。溶液をエバポレートして乾固し、そして残渣をメ
タノールに溶かし、大量のエーテルに加え、そして沈殿
を遠心分離により集めた。固体（19）をpH2の緩衝液に
溶かし、pH2.1乾燥液中KCl勾配を用いてＳ−セファロー
スのクロマトグラフィーにより脱塩した。６量体（19）
を含む画分を溜め、そしてほとんど乾燥状態になるまで
エバポレートした。溶液をまず水、次に水/CH3CN勾配を
用いてポリプロピレン（Pharmasia）で（15）をクロマ
トグラフィーにより脱塩した。６量体（19）を含む画分
をあわせ、エバポレートして乾固した。残渣をトリフル
オロエタノールに溶かし、そして大量のエタノールに加
えた。固体（19）を遠心分離で回収し、そして真空乾燥
した。 実施例31 実施例30と同様にして、メチルスルファミド結合を有
するシトシン含有モルホリノオリゴマー（13）を合成し
た。図に合成したオリゴマー（12）のマススペクトルを
示す。オリゴマー（13）の分子量は2597であり、マスス
ペクトルは2598.9に最大ピークを有することより、明ら
かにオリゴマー（13）が得られていることがこのスペク
トルからわかる。 実施例32 ハイブリダイゼーションの研究 実施例29のオリゴマー（11）（0.2mg）を、0.1N塩酸
0.1mLに溶かした。この溶液を0.1N pH7.4のリン酸緩衝
液4.0mLで希釈し、次いで0.1Nの水酸化ナトリウム0.1mL
で処理した。オリゴマー（上記溶液の1mL）を0.24mLのp
H7.45緩衝液（溶液の総容量は124mL）中で１当量のｐ
（dG6）で処理した。この溶液は、20℃で273nmにおい
て、23％の混合していない成分に関係する最大のハイポ
クロミックシフトを示した。この溶液および類似のｐ
（dC6）ならびにｐ（dG6）溶液について熱融解試験を行
った。10℃から85℃まで５℃ずつ、各温度で10分間平衡
化しながら昇温した。ｐ（dC6）/p（dG6）二重鎖Tmは30
℃であったが、（18）/p（dG6）二重鎖Tmは71℃であっ
た。 実施例33 下記構造式および図9aで表されるカルバメート結合を
有するシトシンおよびグアニン含有オリゴマー（14）を
実施例29と同様にして合成した。 mT−ｃ（aCBzmaGiBuaCBzaCBzmaGiBuaCBzaCBzaCBza
CBz）−OH ここで、mTはメトキシトリチル基、ｃはカルバメート
結合、maは５′−メチルアミノ、ａは５′−アミノ、Bz
はベンゾイル基、iBuはイソブトキシカルボニル基を示
す。 得られたオリゴマーを実施例30と同様にしてポリヌク
レオチドN88−12とのハイブリダイゼーション実験を行
た。結果を図9b−9dに示す。オリゴマー（12）/N88−12
のTmは36.5℃であり、オリゴマー（12）は標的ポリヌク
レオチドN88−12と特異的に結合することがわかった。 実施例34 実施例30の６量体（19）の熱変性実験 DNA標的ｐ（dG）６（４つの5A260パッケージ、Pharma
sia LKBより入手し、精製しないで使用）を脱イオン水
（50μｌ）に溶解し、そしてこの溶液を200μｌのDMSO
で希釈した。オリゴマー（19）（1.8mg）をDMSO（360μ
ｌ）に溶解した。 これらのストック溶液を、UV分光により実際の溶質濃
度についてアッセイした。（19）（15μｌ）のストック
溶液の吸収を、0.1N HCl中で測定し、そしてｐ（dG）６
ストック溶液の吸収を0.1N NaOH中で測定した。ストッ
ク溶液の濃度を、（19）についてpH1での7.7x104および
ｐ（dG）６についてpH13での6.5x104のモル吸光係数を
用いて算出した。 （19）およびｐ（dG）６のストック溶液を0.001N EDT
Aを含むリン酸衝撃液で希釈して融解アッセイの試料を
調製した。最終的なナトリウムイオン濃度は、0.05Nで
あり、（19）およびｐ（dG）６の濃度は、それぞれ10μ
Ｍであった。参照ビームは、不対状態で２つの成分を有
し、試料ビームは混合した成分を有する。試料を60℃に
暖め、そして数時間放冷した。対成分と不対成分の差ス
ペクトルを約15℃で測定し、最大のハイポクロミシティ
を示す波長を、273nmに固定した。75℃まで約２℃ずつ
昇温しながら273nmでの吸収差対温度プロフィールを得
た。得られた吸収差データを％変性に変換し、温度に対
してプロットして融解曲線を得た。系の２状態間のプロ
ットの中点としてTmを決定し、（19）とｐ（dG）６のTm
は62℃であった。 本発明の好適な実施態様がここに開示されているが，
この発明の内容から離れることなく種々の修飾および変
更がなされうることが当業者にとって明らかである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｐ Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｃ１２Ｎ 15/00 (72)発明者 サマ−トン，ジエ−ムス アメリカ合衆国 オレゴン 97333 コ −バリス，サウスイ−スト マリオン ストリ−ト 990 (72)発明者 ウエラー，ドウイト アメリカ合衆国 オレゴン 97330 コ −バリス，ノースウエスト サテンウツ ド 3392 (72)発明者 スターシヤク，ユージーン アメリカ合衆国 オレゴン 97333 コ −バリス，サウスイースト リリー 840

Claims (1)

  1. (57)【特許請求の範囲】 １．塩基の標的配列を含む一本鎖ポリヌクレオチドに選
    択された結合親和性をもって結合するのに効果的なポリ
    マー構造体であって、該ポリマー構造体は次の構造の非
    単独重合体で実質的に立体規則性ポリマー分子を有す
    る： ここで、 （ａ）R1〜Rnは、該標的配列の対応内部配列塩基に、ワ
    トソン／クリック対により結合するのに効果的なプリ
    ン、プリン類似、ピリミジンおよびピリミジン類似の複
    素環物から選択された認識部分であり、 （ｂ）ｎは、該ポリマー分子と該標的配列との間で形成
    されるワトソン／クリック水素結合の総数であり少なく
    とも約15であり、 （ｃ）Ｂは、化学的に安定、実質的に非荷電でかつ優先
    的なアキラル連鎖により優先的に連結され得る、ホスホ
    ジエステル連鎖を除くバックボーン部分であり、 （ｄ）ユニットバックボーン長は５から７原子の範囲で
    あり、そして該バックボーン部分が次の基から選択され
    る環状構造を有し、そして （ｅ）該バックボーン部分は該認識部分と該標的配列の
    対応する内部配列塩基との間でワトソン／クリック塩基
    対をなしうる位置で該認識部分を支持する。 ２．塩基の標的配列を含む一本鎖ポリヌクレオチドに選
    択された結合親和性をもって結合するのに効果的なポリ
    マー構造体であって、該ポリマー構造体は次の構造の非
    単独重合体で実質的に立体規則性ポリマー分子を有す
    る： ここで、 （ａ）R1〜Rnは、該標的配列の対応内部配列塩基に、ワ
    トソン／クリック対により結合するのに効果的なプリ
    ン、プリン類似、ピリミジンおよびピリミジン類似の複
    素環物から選択された認識部分であり、 （ｂ）ｎは、該ポリマー分子と該標的配列との間で形成
    されるワトソン／クリック水素結合の総数であり少なく
    とも約15であり、 （ｃ）Ｂは、化学的に安定、実質的に非荷電でかつ優先
    的なアキラル連鎖により優先的に連結され得る環状バッ
    クボーン部分であり、そしてB/Bが次の構造の１つを有
    し： そして （ｄ）該バックボーン部分は該認識部分と該標的配列の
    対応する内部配列塩基との間でワトソン／クリック塩基
    対をなしうる位置で該認識部分を支持する、ポリマー構
    造体。 ３．請求の範囲第２項に記載のポリマー構造体であっ
    て、前記認識部位が次の基から選択される、ポリマー構
    造体：４．請求の範囲第１項に記載のポリマー構造体であっ
    て、前記認識部位が次の基から選択される、ポリマー構
    造体： ５．請求の範囲第１項に記載のポリマー構造体であっ
    て、前記認識部位が次の基から選択される、ポリマー構
    造体：６．請求の範囲第１項に記載のポリマー構造体であっ
    て、Ｂ〜Ｂが次の構造の１つを有する、ポリマー構造
    体： ７．細胞内標的配列への結合に用いられる請求の範囲第
    １項に記載のポリマー構造体であって、前記ポリマー分
    子がせいぜい１〜３のイオン電荷を含み、かつ４つのサ
    ブユニット当たり約１つの電荷より多くない電荷を含
    む、ポリマー構造体。 ８．請求の範囲第１項に記載のポリマー構造体であっ
    て、前記ポリマー分子が一方もしくは両方の分子末端に
    おいて荷電された基を含有する、ポリマー構造体。 ９．特異的に、そして実質的に均一な結合親和性をもっ
    て一本鎖ポリヌクレオチドに結合するのに効果的な実質
    的に非荷電のポリマー組成物を調製する方法であって、
    該方法は、 （１）該ポリヌクレオチドの塩基の特異的配列を選択す
    ること、なお、該配列は標的配列を構成している； （２）次の構造の一群のサブユニットを準備すること； Ｂ−Ri、およびＢ−Rj、 ここで、 （ａ）RiおよびRjは、２つおよび３つの水素結合を含む
    ワトソン／クリック対により、該選択された標的特異配
    列中の対応塩基に、結合するのに効果的なプリン、プリ
    ン類似、ピリミジン、およびピリミジン類似の複素環物
    から選択された認識部分であり、 （ｂ）Ｂは、バックボーン部分であり、これは化学的に
    安定で非荷電のアキラル連鎖により別のバックボーン部
    分に連結され得、 （ｃ）ユニットバックボーン長は６原子であり、そして
    該バックボーン部分が次の基から選択される環状構造を
    有し、そして、 （ｄ）連結したときこれらバックボーン部分が、該認識
    部分と該標的配列の対応内部配列塩基との間にワトソン
    ／クリック塩基対を生じさせうる位置において、該認識
    部分を支持するバックボーンを形成し；および （３）該標的特異配列における塩基の配列に対応する特
    定の配列において該サブユニットを連結すること、 を包含する、方法。 １０．請求の範囲第９項に記載の方法であって、該方法
    はさらに両RiおよびRj認識部分を前記標的特異配列にお
    ける少なくとも１つの塩基に供給すること、およびRi/R
    j比を減少させることにより該標的配列用組成物の結合
    親和性を調整し該親和性を増大することそして該比を増
    大させて該結合親和性を減少させることを包含する、方
    法。 １１．請求の範囲第９項に記載の方法であって、該方法
    は、さらに、前記ポリマー分子の一方もしくは両方の末
    端にて、イオン電荷を有するかあるいは中性に近い基を
    導入し水性媒質中の該ポリマーの溶解度を増大させるこ
    とを包含する、方法。 １２．請求の範囲第９項に記載の方法であって、Riが次
    の基から選択される： そしてRjが次の基から選択される： １３．請求の範囲第９項に記載の方法であって、Ｂが環
    状バックボーン部分であり、そして共に連結されたとき
    の隣接バックボーン部分は次の構造のうちの１つを有す
    る：１４．請求の範囲第９項に記載の方法であって、該方法
    は下記の構造を有するモルホリノサブユニットを、１つ
    のサブユニットのモルホリノ窒素を他のサブユニットの
    ５′環外炭素に実質的に非荷電でアキラルな結合によっ
    て結合させることにより、５から７炭素の間のユニット
    バックボーン長を有するポリマー組成物を調製する、方
    法： ここで、認識部位Ｐはプリン、プリン類似、ピリミジン
    およびピリミジン類似のヘテロ環から選択され、そして
    ＴはＨまたはＮ−保護基である。 １５．前記認識部位Ｐが次の基から選択される、請求の
    範囲第14項に記載の方法：１６．前記認識部位ＰがＮ−保護基を有する環外アミン
    を含む、請求の範囲第14項に記載の方法。 １７．選択された活性が発現される系において含まれる
    一本鎖ポリヌクレオチドの発現を阻害する組成物であっ
    て、 （１）該発現に必要な該ポリヌクレオチドにおける標的
    配列を選択すること、 （２）構造Ｂ−Riの一群のサブユニットを準備するこ
    と、ここで、 （ａ）Riは、２つもしくは３つの水素結合を含むワトソ
    ン／クリック対により、該選択された標的特異配列にお
    いて含まれる対応塩基に結合するのに有効なプリン、プ
    リン類似、ピリミジン、およびピリミジン類似の複素環
    物から選択された認識部分であり、 （ｂ）Ｂは１つのバックボーン部分であり、これは化学
    的に安定で非荷電のアキラル連鎖により別のバックボー
    ン部分に連結され得、 （ｃ）ユニットバックボーン長は５から７原子であり、
    そして該バックボーン部分が次の基から選択される環状
    構造を有し、 そして （ｄ）これらバックボーン部分が連結されたとき、該認
    識部分と該標的配列の対応内部塩基配列との間にワトソ
    ン／クリック塩基対を生じさせうる位置において該認識
    部分を支持するバックボーンを形成し； （３）特定の配列において該サブユニットを連結して該
    標的配列に特異的に結合するよう設計された優先的に非
    荷電で立体異性体のポリマーを形成すること、 （４）該ポリマーを該系に加えそして該ポリヌクレオチ
    ド発現の阻害の程度を観察すること、 （５）観察されるポリヌクレオチド発現の阻害の程度に
    依存して次の工程の１つもしくは両方により該標的配列
    用の該ポリマーの結合親和性を調整すること、該工程は
    （ｉ）該標的配列の長さおよび対応ポリマー長を変化さ
    せること（ii）対応内部配列ポリヌクレオチド塩基でも
    って３つおよび２つの水素結合を形成する認識部分の比
    を変化させること；および （６）該調整により、ポリマーを生成すること、該ポリ
    マーの結合親和性はポリヌクレオチド発現の該阻害をも
    たらすのに必要な実質的に最低親和性である、を包含す
    る方法により調製される、組成物。
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