JPH08506093A - ２本鎖核酸の塩基配列特異結合ポリマー - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、少なくとも２つの異なる方向を向いたワトソン／クリック塩基対を標的配列の選択された位置に含む二重鎖ポリヌクレオチドの標的配列に配列特異的に結合することに効果的なポリマーの組成物を記載する。この組成物は、５または６員環バックボーン構造を有する非荷電性のバックバーン、および、該バックボーン構造に結合していて、標的配列中の異なる方向を向いた塩基対と特異的に水素結合を形成することに効果的な選択された塩基を含む。本発明はまた、ポリマー組成物を構築することに有用なサブユニットもまた開示する。本発明は、さらに、（i）第一の遊離またはポリマー末端サブユニットをカップリングする方法、および（ii）選択された塩基対配列を有する標的二重鎖核酸フラグメントを液体試料から単離する方法を包含する。

Description

【発明の詳細な説明】 ２本鎖核酸の塩基配列特異結合ポリマー 発明の分野 本発明は、選択された塩基対配列を有する２本鎖核酸と配列特異性で結合可能 な非電荷ポリマーに関する。 引用文献 発明の背景 標的病原体に独特の選択された一本鎖遺伝子配列を不活性化するオリゴヌクレ オチド（複数）またはオリゴヌクレオチドアナログ（複数）は、1960年代終盤、 Belikova，1967によって最初に報告され、続いて、Pitha，1970；Summerton，19 78a，b，1979a，ｂ；Zamecnik，1978；Jones，1979；Karpova，1980；Miller，1 979，1980，1985；Toulme，1986；およびStirchak，1987，1989によって報告さ れた。このタイプのポリマー性薬剤は、それらの配列特異性を、薬剤とその相補 的一本鎖標的遺伝子配列との間のワトソン／クリック塩基対形成を利用すること によって達成する。このようなポリマーは、一本鎖標的遺伝子配列のみを結合す るので、不活性化しようとする遺伝情報が主に二本鎖状態で存在する場合は、僅 かな価値しかない。 多くの病原体および疾患状態について、二重鎖の遺伝子配列は、遺伝活性をブ ロックすることに関して適切な状態を提供する。配列特異的な二重鎖特異性核酸 結合試薬が、Kundu、Heidelbergerおよび共同研究者によって、1974年から1980 年の間に報告されている（Kundu 1974；Kundu 1975；Kundu 1980）。このグルー プは、２つの単分子試薬を報告した。これ らはそれぞれ、二重鎖核酸の特定の塩基対に水素結合するように設計された。し かし、これらの試薬は効果がなかった。これは、多分、次の２つの理由による。 第一は、リジッドでなくしかも不確かな水素結合をする基（アミド）、これは水 素供与体または受容体として作用し得る（水素結合の場合において）、が用いら るれためである。第二は、それらが水溶媒中で複合体が安定するためには不充分 な数の水素結合（２個）しか提供しなかったためである。種々の系から得られた 実験結果は、水素結合している複合体は、次の場合のみ水溶媒中で安定であるこ とを示唆している。これは、充分な数（おそらく少なくとも12個）の協同的分子 間水素結合がある場合、またはさらに安定性を増す相互作用（静電的相互作用、 疎水性相互作用など）がある場合である。 他の初期の試みは、YaleのDattaguptaおよびCrothers、ならびにドイツの共同 研究者によって報告された（Kosturko 1979；Bunemann 1981）。これらの研究者 は、Ｇ：Ｃ塩基対が多い二重鎖DNAにインターカレートすることが知られている 色素とＡ：Ｔ塩基対が多い二重鎖DNAに優先的に、多分、小さい溝部位を通して 結合する他の色素とから調製されたポリマーを使用した。ポリマーの調製は、２ つの色素にアクリルモイエティーを加えて改変し、次いで改変した色素の混合物 を決まった配列を有するDNA（テンプレート）の存在下で重合することによって 行われた。得られたポリマーはテンプレートDNAと同じ配列を有する二重鎖DNAに 対して特異的な親和性を有する ことが期待された。しかし、このような物質は、ほんの僅かな配列特異性しか示 さないことがわかった。二重鎖DNAの特定配列に結合するように設計された種々 のビスインターカレーティング試薬もまた、報告された（Pelaprat，1980）。し かし、そのような試薬は、生来的に最低限の配列特異性しか示さない。 さらに最近では、Dervanは、天然のＢ型に特異的な小さい溝結合性抗生物質（ Distamycin）を得、そしてこれを系統的に伸長して充分なレベルの配列特異性を 達成した（Schlutz1982；Schlutz 1983；Youngquist 1985）。彼はまた、このオ リゴマーにEDTA/Fe錯体を付けた。この錯体は、ある条件下で試薬が結合した部 位近傍の二重鎖標的配列を切断するように作用する。しかし、この特異なアプロ ーチでは、治療に適用するために必要な高いレベルの特異性は得られない。なぜ なら、小さい溝中の水素結合部位の生来的対称性は、ほんの僅かの配列情報しか 提供しないからである。 さらに最近、Dervanおよび共同研究者は、結合試薬を報告した。この試薬は、 標的遺伝子二重鎖の大きい溝部位（これは情報量が多くそして極性を有する）を 配列特異的認識に利用する（Sluka 1987）。これは、二重鎖DNA上のタンパク質 結合部位でDNAを切断するために、合成ポリペプチド（これはＤNA結合タンパク 質のDNA配列認識部分を含む）を応用することを伴っている。この切断活性は、 合成ペプチドのアミノ末端にEDTA/Fe錯体を結合し、そしてこの錯体が元のタン パク質の 本来の標的配列の位置で、またはその近辺で二重鎖DNAを選択的に切断するとい うことを証明することによって達成された。 二重鎖を標的とする他のアプローチは、1950年代終盤に最初に報告された研究 に端を発した。この研究は、Ｘ線回折により、高塩下で全てがチミンまたは全て がウラシルのポリヌクレオチドは、１つの鎖が全てアデニン、もう１つの鎖が全 てチミンまたはウラシルであるワトソン／クリック遺伝子二重鎖上の特定の極性 を有する大きい溝部位に結合し得ることを示した（Hoogsteen結合；Hoogsteen 1 959）。これに続いて、これと同様に、高塩濃度および７より低いpHで、全てシ トシンのポリヌクレオチド（これはシトシンモイエティがプロトン化されている ）は１つの鎖が全てグアニン、もう１つの鎖が全てシトシンであるワトソン／ク リック二重鎖に結合し得ることが報告された。 この後、高塩濃度および７より低いpHで、シトシンとチミン（またはウラシル ）の両方を含むポリヌクレオチドが、１つの鎖にプリン、そしてもう１つの鎖に ピリミジンの適切な配列を有するワトソン／クリック二重鎖に結合し得ることが 示された（Morgan，1968）。 1970年代に、このHoogsteen結合メカニズムが、１つの鎖に一続きのプリン、 そしてもう１つの鎖に一続きのピリミジンを含む二重鎖遺伝子フラグメントのア フィニティークロマトグラフィー精製に利用された（Flavell，1975；Zuidema， 1978）。1987年に、Dervanおよび共同研究者は、このHoogsteen結合メ カニズムを利用して、全てピリミジンのポリヌクレオチド（これはEDTA/Fe切断 モイエティを有する）を、１つの鎖にプリン、そしてもう１つの鎖にピリミジン の特定配列を有する標的遺伝子二重鎖上に結合させた（Moser，1987）。 Hoogsteenモードと異なる大きい溝結合モードが、1960年半ばに報告され、そ してそれには全てプリンのポリヌクレオチド、ポリ（dI）がポリ（dI）/ポリ（r C）二重鎖に結合すること（Inamn l964）およびポリ（dI）/ポリ（dC）二重鎖に 結合すること（Chamberlin 1965）が含まれる。同様に、大部分がプリンのポリ ヌクレオチドが、最近、Hoganおよび共同研究者によって、選択された天然の二 重鎖遺伝子配列の活性をブロックするために用いられた（Cooney，1988）。これ らの研究者は、６mMMg⁺⁺の存在下で、大部分がプリンであるという特異的配列の ポリヌクレオチド（24プリン、３ピリミジン）が、無細胞系中のヒトC-myc遺伝 子の転写を阻害することを報告した。 現在に至るまで、報告された遺伝子二重鎖に結合するために使用されるポリヌ クレオチドは、生命体内で効果的に用いるために重要な１つ以上の基準を満足し ていない。これらの基準のいくつかを以下に挙げる： １つは、シトシンを含むHoogsteen結合ポリヌクレオチド（ポリピリミジン） は、効果的な結合を達成するために生理学的pHより低いpHを必要とする（これは 、シトシンモイエティをプロトン化するのに必要性なため）。しかし、最近、De rvanおよび共同研究者によって、シトシンの代わりに５-メチ ルシトシンを用いると生理学的pHにいくぶん近いpHでHoogsteen結合が可能にな ること（Mahler，1989）、およびシトシンの代わりに５-メチルシトシン、そし てチミン（またはウラシル）の代わりに５-ブロモウラシルを用いるとさらに結 合が改善されること（Povsic，1989）が示された。 ２つめとして、ポリプリンポリヌクレオチドの場合、イノシン（ハイポキサン チン）モイエティとアデニンモイエティとの両方が、細胞内の適用において効果 的な大きい溝結合に対する十分な配列特異性および結合親和性を欠いている。イ ノシンモイエティ（Inman，1964）およびアデニンモイエティ（Cooney，1988） についての不十分な配列特異性は、イノシンがＣ：Ｉ（またはＣ：Ｇ）塩基対（ すなわち、ＣのNH4およびＧまたはＩのＯ6）とＡ:ＴまたはＡ:Ｕ塩基対（すなわ ち、ＡのNH6およびＴまたはＵのＯ4）との両方の中央の極性を有する大きい溝部 位に類似の親和性をもって結合し得るという事実に由来し、そして、以下に議論 するように、アデニンがＴ:ＡまたはＵ:Ａ塩基対（すなわち、ＴまたはＵのＯ4 およびＡのNH6とＧ:Ｃ塩基対（すなわち、ＧのＯ6およびＣのNH4）との両方の中 央の極性を有する大きい溝部位に類似の親和性をもって結合し得るからである。 イノシンの標的塩基対およびアデニンの標的塩基対に対する低い結合親和性は 、これらのプリンが、最適の水素結合よりも少ないたった２個の水素結合しかそ れぞれの標的塩基対の大きい溝に対して形成し得ないという事実による。 ３つめとして、ポリピリミジンポリヌクレオチドとポリプリンポリヌクレオチ ドとの両方が、それらの標的遺伝子二重鎖に生理学的条件下で効果的な結合を形 成しないことがある。これは、３本鎖複合体の３つの密接に充填されたポリアニ オンバックボーン間の実質的な静電的反発による。この反発は、高塩濃度（Morg an，1968）、二価カチオン（Cooney，1988）、またはポリアミン（Moser，1987 ）によって弱められるが、それでもなお、生細胞、そして特に損なわれていない 生物内の細胞に適用するためには、細胞内のカチオン濃度を制御することは、一 般に適切でない。 ４つめとして、治療的適用について、ポリヌクレオチドは最適とはいえない。 なぜなら、（i）それらは毛細管の網内内面によって速やかに留め置かれる、（i i）それらは、容易に生体膜を通過しない、そして（iii）それらは、血液内およ び細胞内でヌクレアーゼによって分解されやすいからである。 配列特異的な二重鎖特異性核酸結合試薬の多くのインビボ適用に関しては、基 本的な標的はDNAである。これは、元から細胞内にＢまたはＢ類似コンホメーシ ョンで存在しているらしい。このような関係において、遺伝子二重鎖の大きい溝 結合に使用されたポリヌクレオチド（Moser、1987；Cooney、1988）は、Ｂ型コ ンホメーションに存在する二重鎖遺伝子配列に結合するのに最適な長さよりも短 いユニットバックボーン長を有している。 発明の要旨 本発明は、配列特異的に、二重鎖ポリヌクレオチドの標的配列に結合するのに 効果的なポリマー組成物を包含する。このポリヌクレオチドは、標的配列の選択 された位置で少なくとも２つの異なった方向に向いたワトソン／クリック塩基対 を含む。このポリマーは、以下の構造から選択されるサブユニットの特定の配列 から形成される： ここで、Ｙは、２または３原子長の、非荷電性サブユニット間結合基であり；Ｒ ’は、Ｈ、ＯＨ、またはＯ−アルキルであり；５’−メチレンは、５員環ではβ 立体化学的配向、そして６員環では均一な立体化学的配向を有し；Ｒ_iは、β立 体化学的配向を有し；そして該ポリマー中のＲ_i基の少なくとも約70%は、以下の 塩基対特異性基の２つ以上から選択される： Ａ．Ｔ:ＡまたはＵ:Ａ配向塩基対においては、Ｒ_iは、以下の環状骨格構造お よび水素結合配置を有する平面性塩基からなる群より選択される（ここでＢはポ リマーバックボーンを示す）： ここで、環上の位置＊は、アミンのような水素結合供与性基を有し得；そして、 Ｘは、モイエティであり、これに基づいて標的塩基対のピリミジンの５位で識別 的結合を供することに効果的なモイエティであり； Ｂ．Ｃ:Ｇ配向塩基対においては、Ｒ_iは、以下の環状骨格構造および水素結合 配置を有する平面性塩基からなる群より選択される（ここでＢはポリマーバック ボーンを示す）： ここで、環上の位置＊は、カルボニル酸素のような水素結合受容性基を有し得； そして、Ｘは、モイエティであり、これに基づいて標的塩基対のピリミジンの５ 位で識別的結合を供することに効果的なモイエティであり；そしてＺは、酸素ま たはイオウであり； Ｃ．Ｇ:Ｃ配向塩基対においては、Ｒ_iは、以下の環状骨格 構造および水素結合配置を有する平面性塩基からなる群より選択される（ここで Ｂはポリマーバックボーンを示す）： ここで、環上の位置＊は、カルボニル酸素のような水素結合受容性基を有し得； そして、Ｘは、モイエティであり、これに基づいて標的塩基対のピリミジンの５ 位で識別的結合を供することに効果的なモイエティであり；そして Ｄ．Ａ:ＴまたはＡ:Ｕ配向塩基対においては、Ｒ_iは、以下の環状骨格構造お よび水素結合配置を有する平面性塩基からなる群より選択される（ここでＢはポ リマーバックボーンを示す）： ここで、環上の位置＊は、NH₂のような水素結合供与性基を有し得；そして、Ｘ は、モイエティであり、これに基づいて標的塩基対のピリミジンの５位で識別的 結合を供することに効果的なモイエティである。 １つの実施態様において、Ａ立体配置での二重鎖核酸への配列特異的結合に使 用するためには、Ｙ連結基は２原子長を有する。他の実施態様においては、Ｂ形 態DNA-DNA二重鎖核酸配列への配列特異的結合に用いるためには、上記Ｙ連結基 は３原子長を有する。 他の実施態様において、本発明は、いくつかのメチル識別塩基を含むポリマー を包含する。このメチル識別塩基は、標的配列が選択された塩基対のピリミジン の５位に水素を含む場合、二重鎖標的配列への良好な標的結合親和性をもたらす が、標的配列が選択された塩基対のピリミジンの５位にメチルを含む場合、標的 配列への標的結合を実質的に低減させる。 他の局面において、本発明は、次のサブユニット構造： ここで、Ｒ_iは、２つまたはそれ以上の水素結合部位を有する平面環状構造であ る構造のうちの１つを有する、第一の遊離またはポリマー末端サブユニットを、 次のサブユニット構造 のうちの１つを有する、第二の遊離またはポリマー末端サブユニットとカップリ ングする方法を包含する： ここで、Ｚは、２原子または３原子の長さモイエティである。この方法は、i） 第一のサブユニットを酸化してジアルデヒド中間体を生成させる工程；ii）第１ 級アミンをジアルデヒドとカップリングさせるのに効果的な条件下で該ジアルデ ヒド中間体を第二のサブユニットと接触させる工程；およびiii）以下の構造か ら選択される結合構造を生成させるのに効果的な還元剤を添加する工程： を包含する。 さらに他の局面において、本発明は、選択された塩基対配列を有する標的二重 鎖核酸フラグメントを液体試料から単離 する方法を提供する。この方法では、まず、ポリマー試薬と試料とを接触させる 。ここで、ポリマー試薬は、溶液からのポリマー試薬自身の単離を可能にする構 造体と、該構造体に結合した上記記載のタイプのポリマーの組成物とを含み、こ のポリマーの組成物は、選択された塩基対配列と配列特異的に結合することに効 果的なサブユニット配列を有する。この接触は、選択された標的塩基対配列への ポリマーの組成物の配列特異的結合に効果的な条件下で行われる。 さらに、本発明のポリマーは、標的核酸配列の存在を検出することに使用され 得る。例えば、支持体に結合したポリマー組成物が、選択された標的塩基対配列 への該ポリマーの組成物の配列特異的結合に効果的な条件下で、選択された二重 鎖遺伝子配列を含むテスト溶液と接触され得る。次いで、結合した選択された二 重鎖遺伝子配列を有する支持体に結合したポリマーが、テスト溶液から分離され る。続いて、ポリマー／標的二重鎖配列の存在が検出される。選択された遺伝子 配列の検出は、例えば、次のうちの１つを用いて行い得る：エチジウムブロミド およびプロピジウムヨージドのような二重鎖遺伝子配列にインターカレートする のに効果的な蛍光性物質；または、核酸のポリアニオン性バックボーンに結合す るのに効果的であり、オリゴカチオン性モイエティに結合されたレポーターモイ エティ。 また、本発明の一部は、二重鎖ポリヌクレオチド中の標的配列を配列特異的に 結合することに効果的なポリマーの組成 物の形成に用いるためのサブユニット組成物である。この組成物は、次のサブユ ニット構造のうちの１つを有する： ここで、Ｒ’はＨ、ＯＨ、またはＯ−アルキルであり；５’−メチレンは、（a ）、（c）および（d）サブユニット構造ではβ立体化学的配向を有し、そして（ b）サブユニット構造では均一の立体化学的配向を有し；Ｘは、水素または保護 基、またはサブユニットを線状ポリマーにあらゆる選択された順序で結合させる ことに適した連結基であり；Ｙは、該サブユニットを線状ポリマーにあらゆる選 択された順序で結合させることに適した求核性または求電子性の連結基であり； そしてＸとＹはともに、サブユニットセットのうちの２つのサブユニットが連結 された場合、得られるサブユニット間の結合の長さが２または３原子長でありか つ非荷電性であるような連結基であり；Ｚは、２または３原子長であり；そして 、保護状態であり得かつβ立体化学的配向を有するＲ_iは、以下の環状骨格構造 および水素結合配置を有する平面性塩基からなる群より選択され、ここでＢは脂 肪族バックボーンモイエティを示す： ここで、環上の位置＊には水素結合受容性基を有し得；そして、Ｘは、モイエテ ィであり、これに基づいて標的塩基対のピリミジンの５位で識別的結合を供する ことに効果的なモイエティであり得；または、Ｒ_iは、以下の環状骨格構造およ び水素結合配置を有する平面性塩基からなる群より選択され、ここでＢは脂肪族 バックボーンモイエティを示す： ここで、環上の位置＊には水素結合供与性基を有し得；そして、Ｘは、モイエテ ィであり、これに基づいて標的塩基対のピリミジンの５位で識別的結合を供する ことに効果的なモイエティであり得る。 本発明のさらなる部分は、二重鎖ポリヌクレオチド中の標的配列を配列特異的 に結合することに効果的なポリマーの組成物の形成に用いるためのサブユニット 組成物である。この組成物は、次のサブユニット構造のうちの１つを有する： ここで、５’−メチレンは、（b）および（c）サブユニット構造ではβ立体化学 的配向を有し、そして（a）サブユニット構造では均一の立体化学的配向を有し ；Ｘは、水素または保護基、またはサブユニットを線状ポリマーにあらゆる選択 された順序で結合することに適した連結基であり；Ｙは、サブユニット を線状ポリマーにあらゆる選択された順序で結合することに適した求核性または 求電子性の連結基であり；そしてＸとＹはともに、サブユニットセットのうちの ２つのサブユニットが連結された場合、得られるサブユニット間の結合の長さが ２または３原子長でありかつ非荷電性であるような連結基であり；Ｚは、２原子 または３原子の長さのモイエティであり；そして、保護状態であり得かつβ立体 化学的配向を有するＲ_iは、以下の環状骨格構造および水素結合配置を有する平 面性塩基からなる群より選択され、ここでＢは脂肪族バックボーンモイエティを 示し、＊で指示される原子は水素結合受容基ではなく、そしてＷは酸素またはイ オウである： 本発明はまた、結合親和性に基づいて、（a）標的配列中の選択された位置に 少なくとも１つのピリミジン−プリン塩基対を含む二重鎖ポリヌクレオチド中の 選択された標的配列であって、該ピリミジン塩基の環の５位が水素である標的配 列と、（b）選択された位置の塩基対のピリミジンのピリミジン環の５位がメチ ル基であることの他は同一の配列と、を識別し得るポリマーの組成物を包含する 。このポリマーの組成物は、次 の繰り返し単位を有するポリマーを含む（ここで、Ｂはバックボーンモイエティ である）。 この組成物において、少なくとも１つのＲ_iは以下の構造からなる群より選択さ れる： ここで、Ｘは、ピリミジン環の５位にメチル基を有する塩基 対に対する該Ｒ_iの結合を選択的に低減させることに効果的な大きさと形状を有 する。 本発明の他の実施態様は、選択された二重鎖遺伝子配列の生物学的活性を阻害 する方法を包含する。この方法では、適切な標的塩基対配列が、活性が阻害され るべき選択された二重鎖遺伝子配列の中から選択される。上記のように標的配列 に配列特異的に結合することに効果的なポリマーの組成物が提供される。このポ リマーの組成物が、実質的に生理学的条件下で、選択された二重鎖遺伝子配列と 接触させられる。 この方法は、さらに、上記ポリマーの組成物と選択された遺伝子配列とを接触 させ、これにより、不活性化されるべき選択された遺伝子配列を含む組織または 部位を、ポリマーの組成物が標的とすることを包含し得る。いくらかの送達方法 は、ポリマーの組成物をエアゾールの形態で患者の呼吸器系に送達することおよ び／またはポリマーの組成物を水溶液で患者に注射することを包含する。 本発明のこれらおよび他の目的および特徴は、以下の本発明の詳細な説明を添 付の図面と合わせて読むことでより明らかになる。 図面の簡単な説明 図１Ａ−１Ｄは、塩基対の大きな溝の水素結合部位を示す（矢印）、Ｔ:Ａ（ １Ａ）、Ａ:Ｔ（１Ｂ）、Ｃ:Ｇ（１Ｃ）およびＧ:Ｃ（１Ｄ）配向ワトソン-クリ ック塩基対を図示する。 図２Ａおよび２Ｂは、２-アミノピリミジン（２Ａ）、および２-ピリミジノン （２Ｂ）の互変異性形態を図示し、図２Ｃおよ２Ｄは、剛直（２Ｃ）および非剛 直（２Ｄ）な水素結合配置を図示する。 図３Ａ-３Ｄは、以下を図示する。ＡコンホメーションでのＵ：Ａ塩基対の標 準位およびＡ形態２重鎖の螺旋軸の近似位置（図３Ａ）、Ａのコンホメーション におけるＵ:Ａ塩基対の極性の大きな溝部位に水素結合したサブユニット塩基に ついて、Ｒ_a、Θ_a、およびＡ値を評価するためのこの位置図式の使用（図３Ｂ） 、ＢコンホメーションでのＴ:Ａ塩基対の標準位およびＢ形態２重鎖の螺旋軸の 近似位置（図３Ｃ）、ならびに、ＢのコンホメーションにおけるＴ:Ａ塩基対の 極性の大きな溝部位に水素結合したサブユニット塩基について、Ｒ_b、Θ_b、およ びＡ値を評価するためのこの位置図式の使用（図３Ｄ）。 図４Ａおよび４Ｂは、対応するメチル識別塩基により提供される正常な結合（ 図４Ａ）および実質的に還元された結合（図４Ｂ）を図示する。図４Ｃは一般的 な骨格環状構造、水素結合配置、およびピリミジンの５位に水素を有するそれぞ れの標的塩基対に結合するが、上記塩基対がピリミジンの５位にメチルを有する とき、それぞれの標的塩基対は結合しないように設計された、好ましい塩基のメ チル識別モイエティの位置を図示する。 図５Ａ-５Ｃは、本発明のポリマー形成への使用に適している代表的な２’-デ オキシリボース（図５Ａ）、リボース（図５Ｂ）、 およびリボース由来のバックボーン構造（図５Ｃ）を示す。 図６Ａ-６Ｆは、本発明のポリマー形成への使用に適している代表的なモルホ リノバックボーン構造を示す。 図７Ａ-７Ｆは、本発明のポリマー形成に適している代表的な非環状バックボ ーン構造を示す。 図８Ａは、４原子単位のバックボーン長を有する代表的な結合した非環状バッ クボーン構造を示し、図８Ｂ-８Ｃは、５原子単位のバックボーンの長を有する 結合した非環状バックボーン構造を示し、そして図８Ｄ-８Ｆは、６原子単位の バックボーン長を有する結合した非環状バックボーン構造を示す。 図９Ａ-９Ｄは、６原子単位のバックボーン長を有する代表的な結合した環状 バックボーン構造を示し、そして図９Ｅ-９Ｆは、７原子単位のバックボーン長 を有する代表的な結合した環状バックボーン構造を示す。 図１０Ａおよび１０Ｂは、グアニン塩基およびＣ:Ｇ配向ワトソン-クリック塩 基対に対するその結合（図１０Ａ）、ならびにジアミノプリンおよびＴ:Ａ配向 ワトソン-クリック塩基対に対するその結合（図１０Ｂ）を図示する。図１０Ｃ は、グアニン塩基でテトラマー形成を示す。図１０Ｄは、ジアミノプリン塩基で 水素結合を示す。図１０Ｅは、７位に水素結合受容体を欠くいくつかのグアニン アナログを示す。 図１１Ａおよび１１Ｂは、Ｃ:Ｇ（図１１Ａ）およびＴ:Ａ（図１１Ｂ）配向塩 基対に対するシトシン塩基の水素結合を図示する。 図１２Ａおよび１２Ｂは、Ａ:Ｔ（図１２Ａ）およびＣ:Ｇ（図１２Ｂ）配向塩 基対に対するウラシル塩基の水素結合を図示する。 図１３Ａ-１３Ｄは、一般的な骨格環状構造、水素結合配置、およびＧ:Ｃまた はＡ:Ｔワトソン-クリック塩基対に結合するように設計された互変異性塩基のバ ックボーン付着部位（図１３Ａ）および１３Ａの構造の３つの特異的な実施態様 （図１３Ｂ-１３Ｄ）を図示する。 図１４Ａおよび１４Ｂは、Ｇ:Ｃ（図１４Ａ）およびＡ:Ｔ（図１４Ｂ）配向塩 基対に対する図１３Ｂの構造の水素結合を示す。 図１５Ａ-１５Ｄは、一般的な骨格環状構造、水素結合配置、およびＧ:Ｃワト ソン-クリック塩基対に結合するように設計された塩基のバックボーン付着部位 （図１５Ａ）および図１５Ａの構造の３つの特異的な実施態様（図１５Ｂ-１５ Ｄ）を図示する。 図１６は、Ｇ:Ｃ配向塩基対に対する図１５Ｄの構造の水素結合を示す。 図１７Ａは、一般的な骨格環状構造、水素結合配置、およびＧ:Ｃワトソン-ク リック塩基対に結合するように設計された塩基のバックボーン付着部位を図示し 、そして図１７Ｃは、Ｇ:Ｃ配向塩基対に水素結合した図１７Ａの構造の特異的 な実施態様を示す；図１７Ｂは、一般的な骨格環状構造、水素結合配置、および Ａ:ＴまたはＡ:Ｕワトソン-クリック塩基対に結合するように設計された関連す る塩基のバックボーン付 着部位図示し、そして図１７Ｄは、Ａ:Ｔ塩基対に水素結合した１７Ｂの構造の 特異的な実施態様を示す。 図１８Ａ-１８Ｄは、一般的な骨格環状構造、水素結合配置、およびＧ:Ｃワト ソン-クリック塩基対に結合するように設計された塩基のバックボーン付着部位 （図１８Ａ）、および図１８Ａの構造の３つの特異的な実施態様（図１８Ｂ-１ ８Ｄ）を図示する。 図１９は、Ｇ:Ｃ配向塩基対に対する図１８Ｂの構造の水素結合を示す。 図２０Ａ-２０Ｄは、一般的な骨格環状構造、水素結合配置、およびＡ:Ｔまた はＡ:Ｕワトソン-クリック塩基対に結合するように設計された塩基のバックボー ン付着部位（図２０Ａ）、および２０Ａの構造の３つの特異的な実施態様（図２ ０Ｂ-２０Ｄ）を図示する。 図２１は、Ａ:Ｔ配向塩基対に対する図２０Ｄの構造の水素結合を示す。 図２２Ａ-２２Ｄは、一般的な骨格環状構造、水素結合配置、およびＡ:Ｔまた はＡ:Ｕワトソン-クリック塩基対に結合するように設計された塩基のバックボー ン付着部位（図２２Ａ）、および２２Ａの構造の３つの特異的な実施態様（図２ ２Ｂ-２２Ｄ）を図示する。 図２３は、Ａ:Ｔ配向塩基対に対する図２２Ｂの構造の水素結合を示す； 図２４Ａは、一般的な骨格環状構造、水素結合配置、およ びＧ：Ｃワトソン-クリック塩基対に結合するように設計された塩基のバックボ ーン付着部位を図示し、そして図２４Ｃは、図２４Ａの構造の特異的な実施態様 を示す；図２４Ｂは、一般的な骨格環状構造、水素結合配置、およびＣ:Ｇワト ソン-クリック塩基対に結合するようにも設計された関連する塩基のバックボー ン付着部位を図示し、そして図２４Ｄは、図２４Ｂの構造の特異的な実施態様を 図示する。 図２５は、Ｃ:Ｇ配向塩基対に対する図２２Ｃの構造の水素結合を示す。 図２６Ａは、一般的な骨格環状構造、水素結合配置、およびＴ:ＡまたはＵ:Ａ ワトソン-クリック塩基対に結合するように設計された塩基のバックボーン付着 部位を図示し、そして図２６Ｃ-２６Ｄは、図２６Ａの構造の２つの特異的な実 施態様を図示する；図２６Ｂは、一般的な骨格環状構造、水素結合配置、および Ｔ:ＡまたはＵ:Ａワトソン-クリック塩基対に結合するようにも設計された関連 する塩基のバックボーン付着部位を図示し、そして図２６Ｅは、図２６Ｂの構造 の特異的な実施態様を図示する。 図２７は、Ｔ:Ａ配向塩基対に対する図２６Ｃの構造の水素結合を示す。 図２８Ａは、一般的な骨格環状構造、水素結合配置、およびＴ:ＡまたはＵ:Ａ ワトソン-クリック塩基対に結合するように設計された塩基のバックボーン付着 部位を図示し、そして図２８Ｂは、図２８Ａの構造の特異的な実施態様を図示す る。 図２９Ａは、一般的な骨格環状構造、水素結合配置、およびＣ:Ｇワトソン-ク リック塩基対に結合するように設計された塩基のバックボーン付着部位を図示し 、そして図２９Ｂは、図２９Ａの構造の特異的な実施態様を図示する。 図３０Ａは、一般的な骨格環状構造、水素結合配置、およびＡ:ＴまたはＡ:Ｕ ワトソン-クリック塩基対に結合するように設計された塩基のバックボーン付着 部位を図示し、そして図３０Ｃ-３０Ｅは、図３０Ａの構造の３つの特異的な実 施態様を図示する；図３０Ｂは、一般的な骨格環状構造、水素結合配置、および Ａ:ＴまたはＡ:Ｕワトソン-クリック塩基対に結合するようにも設計された関連 する塩基のバックボーン付着部位を図示し、そして図３０Fは、図３０Ｂの構造 の特異的な実施態様を図示する。 図３１Ａは、一般的な骨格環状構造、水素結合配置、およびＧ:Ｃワトソン-ク リック塩基対に結合するように設計された塩基のバックボーン付着部位を図示し 、そして図３１Ｃは、図３１Ａの構造の特異的な実施態様を示す；図３１Ｂは、 一般的な骨格環状構造、水素結合配置、およびＧ:Ｃワトソン-クリック塩基対に 結合するようにも設計された関連する塩基のバックボーン付着部位を図示し、そ して図３１Ｄは、図３１Ｂの構造の特異的な実施態様を図示する。 図３２Ａは、Ｕ:Ａ配向塩基対に対する図２８Ｂの構造の水素結合を示す；図 ３２Ｂは、Ｃ:Ｇ配向塩基対に対する図２９ Ｂの構造の水素結合を示す；図３２Ｃは、Ａ:Ｔ配向塩基対に対する図３０Ｄの 構造の水素結合を示す；図３２Ｄは、Ｇ:Ｃ配向塩基対に対する図３１Ｃの構造 の水素結合を示す。 図３３は、本発明の結合ポリマーの１つの実施態様の模式的な固相合成で用い るカップリングサイクルを図示する。 図３４、３５、および３６は、本発明により構築された３つのポリマーのセグ メントを図示する。それは、塩基対配列（Ｃ:Ｇ、Ａ:Ｔ、Ｔ:Ａ、およびＧ:Ｃ） を有するＡ形態遺伝子２重鎖核酸の領域と結合するようそれぞれ設計されている 。 図３７は、本発明により構築され、そして塩基対配列（Ｃ:Ｇ、Ａ:Ｕ、Ｕ:Ａ 、およびＧ:Ｃ）を有するＡ形態RNA/RNA２重鎖の領域と結合するようそれぞれ設 計されたポリマーのセグメントを図示する。 図３８は、本発明により構築され、そして転写活性遺伝子の転写制御領域中の Ｂコンホメーションにおいて、２重鎖DNAのセグメントと結合するように設計さ れたポリマーのセグメント（２重鎖標的配列は塩基対配列（Ｔ:Ａ、Ｇ:５ｍＣ、 ５ｍＣ:Ｇ、およびＡ:Ｔ）を有する）を図示する。 図３９は、核酸結合ポリマーのアセンブルのための新規の方法におけるカップ リングサイクルを図示する。 発明の詳細な説明 Ｉ．ポリマーサブユニット構築 本発明のポリマーは、二重核酸鎖中の選択された配列（標 的配列）に対する塩基対特異性により結合するように設計されている。本明細書 に使用されているように、二重鎖配列とは、連続配向ワトソン-クリック塩基対 配列のことであり、４つの配向塩基対が、Ａ:Ｔ（またはＡ:Ｕ）、Ｔ:Ａ（また はＵ:Ａ）、Ｇ:Ｃ、およびＣ:Ｇである。ここで、Ａ、Ｔ、Ｕ、Ｇ、およびＣは 、それぞれアデニン、チミン、ウラシル、グアニン、およびシトシン核酸塩基の ことである。 このポリマーは、サブユニットから形成され、各サブユニットは、バックボー ン構造および結合基（これらは一緒に荷電していないバックボーンを形成する） 、および、バックボーン構造に結合した塩基（これは、標的に対し、塩基対に対 して特異的な水素結合を形成する）を有する。ポリマーサブユニット中のバック ボーン構造、結合基、および結合塩基の必要条件を以下に記載する。 本発明の二重結合ポリマーに関しては、用語「塩基」とは、平面的な塩基対に 対して特異的な水素結合モイエティのことである。 Ａ．サブユニット塩基の必要条件 ワトソン-クリック塩基対中の、極性の小さい溝部位の対称性および極性の大 きい溝部位の非対称性により、特定レベルの配列特異性を得るために、小さい溝 結合剤は、対応する大きい溝結合剤よりも２倍多く塩基対を認識しなければなら ない。従って、サブユニット塩基の水素結合は、標的二重鎖の大きい溝中の極性 部位に対するものである。 図１Ａ〜１Ｄは、Ｔ:Ａ、Ａ:Ｔ、Ｃ:Ｇ、およびＧ:Ｃの配向されたワトソン- クリック塩基対を示す（図中の矢印により、大きい溝水素結合部位を示す）。Ｔ :ＡおよびＡ:Ｔ配向塩基対については、極性の大きい溝部位は、N7とアデニンの N6上の水素とチミン（またはウラシル）の04とを含む。Ｃ:ＧおよびＧ:Ｃ配向塩 基対については、極性の大きい溝部位は、グアニンの06およびN7とシトシンのN4 上の水素とを含む。 結合の自由エネルギーに十分に寄与し、十分な塩基対特異性を提供するために 、サブユニット塩基は、標的塩基対に対して少なくとも２つの水素結合を形成す るべきである。すなわち、ポリマー中の各サブユニットは、生理学的pHにおいて 、各配向された標的塩基対上の２つまたは３つの極性の大きい溝部位への結合に 適した水素結合配置を含有すべきである。表１は、４つの配向ワトソン-クリッ ク塩基対の各々に対する極性の大きい溝部位を有する水素結合配置、および、そ の極性の大きい溝部位への水素結合に適したサブユニット塩基の対応水素結合配 置を示す。 表中では、Xは、一般的にN原子、O原子、またはS原子であるが、しかし、水素 結合に適した非結合電子対を有するF、Cl、またはBrでもあり得、そして、**は 、水素結合に適した非結合電子対を表す。 上記に示されているように、ポリマーサブユニット塩基は、典型的には、生理 学的pHでの特定の水素結合配置を有する（フーグスティーン（Hoogsteen）型の 大きい溝結合に使用されるシトシンモイエティと対照的である）。このことによ り、生理学的pHでは、サブユニット塩基の結合は、ポリマーとその標的二重鎖と 間の結合の自由エネルギーに実質的に寄与することが確証される。 生理学的pHでは、サブユニット塩基は、主に非イオン化されるべきである。さ らに詳細には、塩基性モイエティは、少なくとも7.5またはそれ以上のpKb値を有 するべきであり、そして酸性モイエティは少なくとも7.7またはそれ以上のpKa値 を有するべきである。このように実質的なイオン電荷がないことにより、２つの 利点が得られる。第一には、生細胞での適用で、結合ポリマー上にイオン基がな いことにより、生体 膜を通してのポリマーの移動が促進される。第二には、負電荷がないことにより 、結合ポリマーと、その標的二重鎖の負に荷電したリン酸基との間の電荷反発の 問題が回避される。 ４つの配向ワトソン-クリック塩基対の大きい溝水素結合配置を表２に示す。 表２では、Hは、窒素に対する水素結合であり、そして**は、水素結合し得る 窒素または酸素の電子対である。 表２に示されている塩基対H-結合配置の各々の位置（これにより二重鎖遺伝子 配列の大きい溝中の相対的な位置が推定される）は、Ｃ:Ｇ塩基対のH-結合部位 のうちの２つ（NH4およびＯ6）が、Ａ:Ｔ（Ｕ）塩基対のH-結合部位のうちの２ つ（NH6およびＯ4）とほぼ同じに位置することを示す。同様に、Ｇ:Ｃ塩基対の 水素結合部位のうちの２つ（Ｏ6およびNH4）は、Ｔ（Ｕ）:Ａ塩基対の水素結合 部位のうちの２つ（Ｏ4およびNH6）とほぼ同じところに位置する。配向塩基対の 中心水素結合部位間に位置するこれらの類似性のため、大きい溝の中心近くの極 性部位にのみ水素結合するサブユニット塩基（上記の表中で下線を付けたもの） には、特定の塩基対に対する十分 な特異性がない。従って、サブユニット塩基が単一の配向塩基対に対して高い特 異性を有するためには、塩基は、各標的塩基対のN7に水素結合するべきである。 サブユニット塩基が、４つの配向ワトソン-クリック塩基対の１つにのみ結合 するように標的されるなら、サブユニット塩基の互変異性状態は、塩基対結合の ために位置する水素結合基の少なくとも２つが互変異性せず、標的塩基対以外の 塩基対に対して同等の親和性を有する、H-結合し得る構造を与えるように、使用 条件下で十分に固定されるべきである。例示のために、図2Ａに、適切に固定さ れた構造（2-アミノピリミジン、これは、2-アミノ互変異性形態である）を示す 。図2Bに、生理学的条件下で容易に互変異性化することにより、単一の塩基対に 対する特異性がない第二の構造を示す（2-ピリミジノン）。種々の代表的なヘテ ロ環状構造の支配的な互変異性形態は、Elguero，Marzin，Katritzky、およびLi nda（1976）により編集された書籍において、表にされている。 サブユニットは、典型的には、塩基対結合のために位置した少なくとも２つの 塩基対H-結合基の比較的堅固な位置を与える構造を有する。このような堅固さは 、標的塩基対へのH-結合に関与する少なくとも２つの極性ヘテロ原子が、環の一 部であるかまたは環に直接結合しているかのいずれかである環状構造によって最 もよく与えられる。例示のために、図２Ｃに、この堅固さの必要条件を満たして いる構造（2-アミノ-3-シアノピロール）を示す。図2Dに、この必要条件を満た して いない構造（2-カルボキサミドピロール）を示す。 最も単純な配列特異的結合ポリマーは、ポリヌクレオチド二重鎖中の連続塩基 対から構成される標的に結合するポリマーである。これは、次に、結合ポリマー のサブユニット塩基が、それらが結合しようとする標的塩基対よりも厚くないこ とを必要とする。従って、各サブユニット構造は平面であるべきである。これは 、芳香族性を有する、および／または、ほとんどのまたは全ての環原子に対して 平面的な三角形の結合を有するサブユニット塩基を用いることによって、最もよ く達成される。 Ｂ．塩基のバックボーンへの結合位置および角度の制限 ポリマーサブユニットの幾何学的必要条件を考慮すると、ほとんどの二重核酸 は、２つの一般的なコンホメーションのいずれかをとる。RNA/RNAおよびRNA/DNA 二重鎖は、Ａ型コオフォメーションをとる。DNA/DNA二重鎖は、B型コンホメーシ ョンをとるが、高濃度塩溶媒または極性の低い溶媒のような特定の条件下では容 易にＡ型コンホメーションに転換し得る。 二重核酸では、各ワトソン-クリック塩基対の極性の大きい溝部位は、軸方向 の位置、軸方向の勾配、および軸方向の回転という螺旋コンホメーションパラメ ーターにより定義されてる相対的な位置で、隣接の塩基対上の大きい溝部位の対 応配置に関して、かなり規則正しく位置している。 原則的には、異なるサブユニット塩基のバックボーンへの 結合位置は、それらの塩基が各々の標的塩基対に水素結合しているときには、標 的塩基対に関して規則的な方法で位置する必要はない。しかし、標的塩基対に関 連し、異なるサブユニット塩基の相対的なバックボーン結合位置に顕著な可変性 が存在するときには、ポリマー中の構成要素サブユニットのバックボーン構造は それぞれ、バックボーンの長さおよびサブユニット塩基の結合の位置に関して調 整される。それにより、開発コストおよび生産コストが極端に高くなる。 しかし、特定のサブユニットセットの全サブユニット塩基が、各々の標的塩基 対に関して、同様のバックボーン結合位置および角度を有する場合、そのセット の全サブユニットは、同一のバックボーン構造を有し得、ポリマー構築に要求さ れる合成上の努力が非常に簡略化される。この目的のために、本発明に使用され るポリマーサブユニットは、以下に記載の基準に従って、同様のバックボーン結 合位置および角度を有するように選択される。 同様のバックボーン結合位置および角度により何が意味されるのかを理解する ために、参考を図3Aに示す。これは、Ａ型遺伝子二重鎖、すなわち（Ａ、12、0. 326）RNAの螺旋軸（H_aで示す）に関して位置するワトソン-クリック塩基対（W/C bp）を示す。図中の下部の水平線は、ワトソン-クリック塩基対の２つのリボー スCl'原子を結び、垂直線（PBで示す）は、上記の線の垂直二等分線である。 次いで、この標準化された位置に、対応する標的塩基対上 のサブユニット塩基を位置させることにより、サブユニット塩基のバックボーン 結合位置および角度が決定される。このサブユニット塩基は、図3Bの2,6-ジアミ ノトリアジンサブユニットについて示されているように、ワトソン-クリック塩 基対の適切な極性の大きい溝に水素結合している。 次に、Ａ型標的二重鎖に対するサブユニット塩基のバックボーン結合位置は、 R_aおよびΘ_a値によって記述され得る。ここで、R_aは、Ａ型標的二重鎖の螺旋軸 からサブユニット塩基が結合しているバックボーン原子（図3BではBで示す）の 中心までの半径距離（オングストローム）であり、Θ_aは、垂直二等分線から上 記バックボーン原子の中心まで右回りに測定した、この螺旋軸についての角度（ 度）である。結合角度Ａは、サブユニット塩基とバックボーンモイエティとの間 の結合に対する平行線との間の垂直二等分線から右回りに測定した角度（度）と して定義される。 図3Bは、ＡコンホメーションのＵ:Ａ塩基対に水素結合した2,6-ジアミノトリ アジンサブユニット塩基についての、R_a、Θ_a、およびＡパラメーターを示す。 図3Cは、B型二重鎖の対応的に位置した塩基対を示し、そして図3Dは、Bコンホメ ーションのＴ:Ａ塩基対に水素結合したこの2,6-ジアミノトリアジンサブユニッ ト塩基についての、R_b、Θ_b、およびＡパラメーターを示す。 特定のバックボーン結合部位を有する選択されたサブユニット塩基に対する標 的塩基対を明確に定義するために、標的 二重鎖中の各ワトソン-クリック塩基対についての２つの配向が考慮されなけれ ばならない。得られた４配向塩基対は、Ａ:Ｔ、Ｔ:Ａ、Ｃ:Ｇ、およびＧ:Ｃ（お よび、ＵがＴと置換した対応する塩基対）として示される。これらの塩基対の配 向は表３に定義されている。 原則として、標的塩基対上の位置での、任意のサブユニットのバックボーン結 合位置は、0°から180°の範囲のΘ値、X°を有し得る。標的塩基対を動かすこ とにより、同じ標的に結合したサブユニット塩基のΘ値は、360°−X°まで変化 する。以下の考察に使用される規定は、結合ポリマーの各サブユニットについて のΘ値は180°未満であることである。 従って、本明細書に開示されている結合ポリマーを組み立てるのに適したサブ ユニットを選択することに関して、特定の塩基対のどの配向が特定のサブユニッ ト塩基に対する標的を構成するかを明確に定義するために、塩基対結合サブユニ ットのバックボーン結合位置が180°未満のΘ値を有するような、標的塩基対の 配向を選ぶことが重要である。説明のために、トリアジンのC4を介して結合した バックボーンモイエテ ィを有する2,6-ジアミノトリアジンサブユニット塩基（図3B）は、Ａコンホメー ションのＵ:Ａ塩基対に結合して、Θ値28°を与え得る。この同じサブユニット 塩基が、塩基対の逆配向（すなわち、Ａ：Ｕ）でその同じ塩基対に水素結合して いるときには、そのサブユニット塩基のΘ値は332°（すなわち、360°-28°） である。本明細書に使用されている規定は、このサブユニット塩基に対する標的 塩基対はＵ：Ａであり（ここでΘは180°未満である）、Ａ:Ｕではない（ここで Θは180°を超える）ことを示す。 予想認識モイエティについてのR、Θ、およびＡの許容値は、CPK分子モデル（ The Ealing Corp.，South Natick，Mass.，USA）を用いて容易に得られ得る。よ り正確な値は、市販されているようなコンピューター分子力学プログラムにより 、サブユニット塩基／塩基対三重構造中の水素結合の最適化によって推定され得 る。サブユニット塩基は、特定のサブユニットセット（特定のポリマーを組み立 てるのに使用されるサブユニットのセット）全てが、互いに約2オングストロー ム以内のR値、互いに約20°以内のΘ値、および互いに約30°以内のＡ値を有す るように選択されるべきである。 サブユニット塩基が、配向塩基対の１つのみに対して高い特異性を有するため には、そのサブユニット塩基は、単にバックボーン構造への結合に関してサブユ ニット塩基が回転することによって、両配向（例えば、Ｇ:ＣおよびＣ:Ｇ）の特 定塩基対に結合し得ないことが重要である。従って、上記の バックボーン結合位置または角度は、標的塩基対のCl'位置に関して非対称であ るべきである。詳細には、サブユニット塩基のΘ_aは、約10°を超える値、また はサブュニット塩基の結合角度Ａは、約25°を超える値を有するべきである。 Ｃ．標的塩基対のピリミジンの５位モイエティに基づく結合識別に適切な塩基 この配列がいくつかの特定塩基対のピリミジンの５位に水素を有するときに、 二重鎖の標的遺伝子配列に結合し得るポリマーを調製するために使用され得るサ ブユニットが考案されたが、これは、この配列がこの特定塩基対のピリミジンの ５位にメチルを有するときには、対応の二重鎖標的遺伝子配列に結合し得ない。 このメチル識別特性を有するポリマーの１つの応用は、対応する二重鎖DNA配 列（例えば、患者固有の細胞DNA中の同一配列）を付随的に不活性化しないで、 二重鎖RNA配列（例えば、RNAウイルスの複製中間体）を選択的に不活性化するこ とである。このようなメチル識別ポリマーのその他の応用は、正常細胞中の対応 する転写不活性プロトオンコジーン（転写制御領域に5mＣ:Ｇ配列のクラスター を含有する）を付随的に攻撃することなく、癌細胞中の転写活性オンコジーン（ 転写制御領域にCpG配列のクラスターを有する）を選択的に攻撃することである 。 これらのメチル識別塩基の必須特性は、適切な大きさおよ び形状を有し、そして塩基が標的塩基対に水素結合しているときに、識別モイエ ティが、標的塩基対のピリミジンの５位にメチルにより占められる空間の一部を 占めるが、標的塩基対のピリミジンの５位の、水素により占められる空間を占め ないように位置する、特別の識別モイエティをそれらメチル識別塩基が有するこ とである。その結果、このようなメチル識別塩基は、非メチル化標的塩基対に対 して通常の結合親和性を示すが、立体排除のため、ピリミジンの５位にメチルを 有する対応の標的塩基対に対する結合親和性が実質的に低下する。 図４は、このようなメチル識別結合を説明する。図4Aは、このような塩基の非 メチル化標的塩基対（Ｃ:Ｇ）への通常の結合を示し、そして図4Bは、同じ塩基 の対応するメチル化標的塩基対（5mＣ:Ｇ）への結合が、実質的に破壊されるこ とを示す。図4Cは、ピリミジンの５位に水素を有する各標的塩基対に結合するよ うに設計され、かつ、この塩基対がピリミジンの５位にメチルを有するときには 各標的塩基対に結合しないように設計された好ましい塩基の、一般的な骨格環状 構造、水素結合配置、バックボーン結合位置、およびメチル識別モイエティ R_d を示す。 5-6-5融合環状塩基（図4Cの構造iからvi）に関しては、それぞれのメチル化標 的塩基対への結合を有効に制限するために、R_dモイエティは、水素、酸素、また はフッ素より大きいべきである。これらの塩基中のR_dがメチルであるときには、 それは、メチル化標的塩基対に対する塩基の結合親和性を適 度に低下させるのみである。イオウ、塩素、塩素、臭素、シアノ、アジド、およ び同様の大きさのモイエティのようなより大きなモイエティは、依然として対応 の非メチル化塩基対への有効な結合を生じるが、メチル化塩基対への結合の破壊 は一層大きくなる。さらに良好な結合識別は、ジフルオロメチルモイエティおよ びトリフルオロメチルモイエティにより与えられる。これらは、依然として対応 の非メチル化塩基対への有効な結合を生じ得る。これに関しては、ジフルオロメ チルモイエティは、図4Cの構造iiiおよびviでのように、バックボーン結合がR_d モイエティを有する環上に存在するときに好ましく、そして、トリフルオロメチ ルモイエティは、図4Cの構造i、ii、ivおよびvでのように、バックボーン結合が R_dモイエティを有する環上に存在しないときに好ましい。 イソプロピル、t-ブチル、ジクロロメチル、およびトリクロロメチルのような より一層大きなR_dモイエティは、依然としてメチル識別結合も生じ得るが、それ にもかかわらず、それらは望ましくない。なぜなら、それらはまた、ポリマーが その標的二重鎖配列の位置に存在するとき、ポリマーの連続塩基の有効な積み重 ねを妨害するからである。 6-5-5融合環状塩基（図４Ｃの構造viiおよびviii）に関して、各メチル化塩基 対への結合を有効に制限するためには、R_dモイエティは水素より大きいべきであ る。メチル識別モイエティは、それが酸素、フッ素、またはメチルであるときに は、メチル化標的塩基対への結合を実質的に低下させるが、依然 として、非メチル化標的塩基対への良好な結合親和性を与える。6-5-5型塩基上 のより大きなR_dモイエティは、非メチル化標的塩基対への結合を折衷する（comp romise）傾向があるので、望ましくない。 その他のR_dモイエティは、上記の塩基に対するメチル識別性結合を与えるよう に選択され得る。これらのモイエティの選択は、上記に示した指針およびその他 の構造−機能相関分析（例えば、Dehlinger，1992）に基づき得る。 Ｄ．バックボーン構造制限 この章では、選択されたサブユニットセットについてのバックボーン構造の制 限を検討する。原則的に、サブユニットは、任意の選択順位で、以下のE章で考 察される一般的な特性を有する荷電していない結合（「サブユニット間結合」） により、その他のサブユニットに結合可能であるべきである。さらに、サブユニ ットバックボーン構造および結合は、サブユニット塩基が標的二重鎖配列中の各 配向塩基対に有効に結合するために、適切な間隔を与え、各サブユニット塩基を 正確に配向しそして位置させなければならない。 サブユニットバックボーン構造および結合についての原則的な必要条件は、本 質的に任意の特定順位でサブユニットを結合するための手段を提供することであ る。この必要条件は、異種または同種結合基のいずれかを有する構造によって満 たされ得る。異種型バックボーンモイエティは、以下に示すよ うに、１つの末端に求核性基（N）を、そして他の末端に求電子性基（E）を有す る。 N------E N構成要素に関して好ましい官能基は、一級および二級アミン、ヒドラジン、 ヒドロキシル、スルフィジル、およびヒドロキシルアミンを包含する。E構成要 素に関して好ましい官能基は、以下の酸およびそれらの誘導体を包含する：カル ボン酸、チオカルボン酸、リン酸、チオリン酸、リン酸およびチオリン酸のエス テル、チオエステル、およびアミド、ホスホン酸およびチオホスホン酸、ならび に硫酸。他の適切なE基には、アルデヒド、ジアルデヒド（または、ジアルデヒ ドへの転換に適したビシナルヒドロキシル）、アルキルハライド、およびアルキ ルトシレートが包含される。 同種型バックボーンモイエティは、２つの型であり得、１つの型は求核性末端 基を有し、もう１つの型は求電子性末端基を有する；または、単一の同種バック ボーンモイエティは、適切なリンカーで代替され得る。これらの代替物を以下に 示す： E-------E で代替された N-------N E：リンカーで代替された N-------N E-------E で代替された Nリンカー NおよびEに関して好ましい官能基は、異種バックボーンモイエティにおけるよ うなものである。好ましいEリンカーには、カルボニル；チオカルボニル；ホス ホリルおよびチオホスホリルのアルキル、エステル、チオエステル、ならびにア ミド；ホスホニルおよびチオホスホニル；スルホニル；ならびにシュウ酸が包含 される。好ましいＮリンカーは、l,2-ジメチルヒドラジンである。 本発明は、以下の図５〜９に示すように、環状および非環状の両方の種々のバ ックボーン構造を企図する。非環状構造の１つの制限は、ポリマー組立のために 備えた求電子性結合基の活性化が、サブユニット塩基の部位への望ましくない分 子内攻撃の量を変化させ得ることである。これに対比して、適切な構造の環状バ ックボーンモイエティでは、活性化された求電子剤は、サブユニット塩基上の反 応部位から効果的に解離され得、それによって、望ましくない分子内反応は低減 する。 しかし、脂肪族環状バックボーンモイエティの使用には、各バックボーン構造 中の複数のキラル中心の存在が伴う。環状バックボーン構造の適切な選択により 、バックボーンモイエティとしてまたは好ましくはサブユニット全体としてまた はそれらに至る基部に近い前駆体として容易に入手可能な天然産物を利用するこ とによって、このような複数のキラル中心に関連する合成上の問題は、大モイエ ティ回避され得る。 天然源由来のバックボーン構造またはサブユニット全体が 好ましいことは、複数のキラル中心を有する脂肪族環状構造のデノボ調製の困難 さおよびそれに対応する多大なコストを反映している。従って、環状バックボー ンモイエティの好ましいカテゴリーは、デオキシリボースまたはリボースを有す るか、または、それらから容易に誘導されるものである。さらに、単一の鏡像異 性体が入手可能であるか、あるいは容易に調製または単離され得る特定の他の天 然の環状バックボーン構造もまた好ましい。図5A〜5Cは、デオキシリボシドまた はリボシドを有するかまたはそれらから誘導される、例示的な環状バックボーン 構造を示す。図5のR'は、Hまたはアルキルを示し、R_iは、サブユニット塩基を示 す（理解されるように、これは天然ヌクレオシドと同様のβ配向を有する）。図 6A〜6Fは、5'-メチレン（親リボースにおいてと同様に番号を付けた）に対して 、β配向（図6A〜6C）またはα配向（図6D〜6F）を有し、やはりR_i塩基のβ配向 を有する、リボシドから誘導される例示的な環状モルホリノバックボーン構造を 示す。このようなサブユニットの合成を、以下および実施例１〜５に記載する。 図7A〜7Fは、非環状バックボーン構造の代表的な型を示す。 Ｅ．サブユニット間結合 この章では、本発明のポリマーを形成するためのサブユニットの結合に使用さ れる、サブユニット間結合の数種の型および特性を考察する。第一に、バックボ ーンは中性水溶液中 で安定である。結合ポリマーは、生理学的条件下での使用のために設計されてい るので、サブユニット間結合は、このような条件下で安定であることが必要であ る。結合はまた、ポリマーの組立、脱保護、および精製のために要求される条件 下で安定ある。この安定性の必要条件を実例で示すと、アルキルスルホネート（ R-(SO₂)-O-CH₂-R'）は、得られる構造がCH₂への求核的攻撃に敏感すぎるので除 かれる。さらに、カーボネート（R-O-(C=O)-O-R'）およびエステル（R-(C=O)-0- R'）はうまく調製され得るが、生理学的条件下での不安定性により実際の価値は ほとんどない。 第二に、バックボーンは、標的結合に適したコンホメーションに適応可能であ る。サブユニット間結合が特異的な回転コンホメーションを示すときには（アミ ド、チオアミド、尿素、チオ尿素、カルバメート、チオカルバメート、カルバゼ ート（carbazate）、ヒドラジド、チオヒドラジド、スルホンアミド、スルファ ミド、およびスルホニルヒドラジドである場合のように）、標的結合に適合する 回転異性体が最もエネルギーが低いコンホメーションであるか、または、コンホ メーション間の回転障壁が比較的低いか（すなわち、コンホメーションが、生理 学的温度で迅速に相互変換し得る）、いずれかであることがが重要である。従っ て、二級アミド（N-アルキルアミド。これはトランスコンホメーションに適応し やすい）は、トランスコンホメーションが標的二重鎖と対をなすのに適している ときに好ましい。対照的に、三級アミドおよ び関連するN,N-ジアルキル構造は、概して、２つのほぼ等しい低エネルギーコン ホメーションを有し、そのため結合ポリマーに有用であり、その結合は、２つの コンホメーション間の相互変換に関して比較的低いエネルギー障壁を有する。 ２つのコンフォーマー間の回転に対する障壁は、NMRによって本質的には以下 のように評価され得る：２つのコンフォーマーがNMRタイムスケール（10^-8秒台 ）に比べて、ゆっくりと相互変換する温度で、２つの別々のシグナルがしばしば 認められ、各シグナルが各々１つのコンフォーマーを示す。だんだん高い温度で NMRスペクトルを測定するにつれ、２つのコンフォーマーのシグナルは合体し、 これは迅速な相互転換を示唆する。従って、合体温度（Tc）は、種々の結合型の 回転自由度の有用な尺度を提供する。例えば、N,N-ジメチルホルムアミドは、約 114℃のTcを示し（Bassindale，1984）、そしてアナログの三級アミドのコンフ ォマーは、生物学的高分子中でゆっくりと相互変換することが認められた。これ に対比すると、本発明で支持される実施された実験は、N,N-ジアルキルカルバメ ート含有構造は、44℃のすぐ下のTcを示し、これは生理学的温度における妥当な コンホメーション自由度を示す。 N,N-ジアルキルスルフィンアミド（スルホンアミドおよび関連物質と同様の回 転エネルギー障壁を有するはずである）は、マイナス60℃未満のTcを有すること が報告されている（Tet．Let．10 509(1964)）。これらの考察に基づくと、N, N-ジアルキル型のカルバメート、チオカルバメート、カルバゼート、および種々 のリン酸および硫酸のアミデートを含むバックボーン結合が好ましく、一方、N, N-ジアルキル型のアミド、チオアミド、尿素、チオ尿素、ヒドラジン、およびチ オヒドラジン結合は、概して好ましくない。 第三に、バックボーンは荷電しているべきではない。治療上の応用のために、 これらの結合ポリマーは、i）毛細血管の細網内皮内層により隠ぺい（sequester ed）されず；ii）容易に細胞膜を通過し；iii）ヌクレアーゼによる分解に耐性 であり、そして、iv）標的二重鎖のバックボーン上の高密度の負電荷に反発され ない；ように設計されることが望ましい。これらの設計目標は、生理学的pHでほ とんど荷電していない（非イオン性）、サブユニット間結合およびバックボーン モイエティの両方を使用して、最もよく達成される。 サブユニット塩基が、水素結合により、標的配列の連続塩基対上に位置すると きに、そして、サブユニットセットの全認識モイエティが、良く適合したＲ、Θ 、およびＡ値を有すると、１つのバックボーンモイエティのサブユニット塩基結 合位置から、次のバックボーンモイエティの結合位置までの距離は、下記式の平 方根である。 （Ｒ sin(rot)）²＋（Ｒ cos(rot)-Ｒ）²＋（rise）² ここで、Ｒは、螺旋軸からサブユニット塩基が結合するバッ クボーン原子の中心までの距離であり、rotは、標的二重鎖についての軸回転値 （典型的には、Ａ型二重鎖については約30°から33°、そしてＢ型二重鎖につい ては36°である）であり、riseは、標的二重鎖についての軸の立ち上がり値（典 型的には、Ａ型二重鎖については約2.8から3.3A、Ｂ型二重結合については3.4A である）である。それは、結合ポリマーのユニットバックボーン長、すなわち、 １つのバックボーン構造長にバックボーン構造間のサブユニット間結合を加えた 長さにより、測定されるべき距離である。しかし、Ａ型（RNA/RNAおよびRNA/DNA 二重鎖）およびＢ型（DNA/DNA）標的二重鎖は、両方とも多少フレキシブルであ る。従って、これらの二重鎖は、概して、算出された必要長さよりごくわずかの オングストローム短いかあるいは長いユニットバックボーン長を有する結合ポリ マーを許容し得る。さらに、ＢコンホメーションであるDNA/DNAは、特定の条件 下でＡコンホメーションに転換され得る。 特定のバックボーン構造の選択には、以下のファクターが、必要な長さに関係 するので考慮されるべきである：第一は、アミドおよびカルバメートのような結 合のまわりの妨げられた回転により課されたあらゆるコンホメーション制限；第 二は、サブユニット塩基が、その標的塩基対の位置に存在するときの、これらの 塩基と標的二重鎖との間、および塩基とポリマーバックボーンとの間の立体相互 作用；第三は、バックボーン構造の異なる成分間の立体相互作用；および、第四 は、 環状バックボーンモイエティについての、サブユニットバックボーン構造の成分 環状構造の好ましいコンホメーション。 予想されるポリマーバックボーンが、特定の標的コンホメーション（例えば、 Ａ型またはＢ型）に対する使用に適するかどうかを決定する１つの方法は、CPK 分子モデルにより、所望のコンホメーションの代表的な標的遺伝子二重鎖を、そ れにH結合するサブユニット塩基と共に、組み立てることである。次に、予想ポ リマーバックボーンを、そのモデルに付加する。二重結合ポリマーとしてのバッ クボーンの使用可能性の評価の基準は、以下を包含する：（i）予想ポリマーバ ックボーンが、エネルギー的に好ましくないコンホメーションを選択することな く、容易に結合し得ること、および（ii）許容できない立体相互作用が存在しな いとしても、ポリマーバックボーンの結合が、標的構造の顕著な混乱を引き起こ さないこと。予想バックボーン構造の適合性のさらなる支持は、エネルギーを最 少化する方法によって、最適化された結合構造を得るための分子構造プログラム を使用したコンピュータでの、ポリマー／標的三重構造をモデル化することによ り得られ得る。このようなモデル化は、最初のCPKモデル化で見落とされたかも しれない、重要な望ましくない相互作用（例えば、双極子−双極子反発）の同定 を補助し得る。 上記のように、特定のサブユニットセットのサブユニット塩基についてのＲ、 Θ、およびＡ値のようなファクター、特定のサブユニット構造の立体および回転 制限、およびサブユ ニット間結合は、特定のコンホメーションにある標的二重鎖に結合するための、 サブユニット塩基の適切な間隔を提供するために、ユニットバックボーンがどの 程度の長さであるべきかに関係する。しかし、規則として、セットのサブユニッ ト塩基が、約７オングストローム未満のＲ_a値および互いに約15°以内に集まっ たΘ値、および約30°以内に集まったＡ値を有するサブユニットセットは、概し て、Ａ型コンホメーションの標的二重鎖に結合するために、図8A〜8Cに示されて いるような、４原子または５原子ユニット長の非環状型バックボーン、または図 9A〜9Dに示されているような、６原子ユニット長の環状型バックボーンを必要と する。 約11オングストローム未満のＲ_b値、互いに約15°以内のΘ_b値、および互いに 約30°以内に集まったＡ値を有するサブユニット塩基セットは、概して、Ｂ型コ ンホメーションの標的二重鎖に結合するために、図8D〜8Fに示されているような 、６原子ユニット長の非環状型バックボーン、または図9E〜9Fに示されているよ うな、７原子ユニット長の環状型バックボーンを必要とする。 しかし、一般にＢ型コンホメーションとして存在するDNA/DNA二重鎖は、容易 にＡ型コンホメーションに転換し得ることに注目するべきである。ＢからＡへの 転移を起こす、２つの条件は、高い塩濃度、および低極性の溶媒である。標的二 重鎖のＢからＡコンホメーション転移は、Ｂ型二重鎖に結合するための最適長よ り短いバックボーンユニット長を有する、 二重鎖に従う（duplex-directed）結合ポリマーにより誘導され得る。しかし、 このようなコンホメーション転移は、結合自由エネルギーに失費を招くので、補 うために、標的に対する結合ポリマーの親和性が、それに応じて増加する。標的 二重鎖のＢからＡへのコンホメーション転移の実行可能性の理由により、いくつ かの応用には、Ａ型標的二重鎖に適した、より短いユニット長のバックボーンも また、通常はＢコンホメーションを示す遺伝子配列を標的するために使用され得 る。 Ｆ．サブユニットセット （i）１セットのサブユニット塩基が、許容可能に適合したＲ、Θ、およびＡ の値を有し、（ii）サブユニットの骨格構造の長さが同一であるかまたは類似し 、そして（iii）同一あるいは類似のサブユニット塩基の結合位置および配向が 、そのセットの全てのサブユニットに対して用いられる場合、選択された二重鎖 配列を標的にするために、１セットのサブユニットは、あらゆる所望の順序で組 み立てられる。 このような適合したセットの各サブユニットは、標準的な長さの骨格構造の標 準的な位置に結合したサブユニット塩基からなる。そのセットの各サブユニット のサブユニット塩基は、そのセットの他のサブユニットのサブユニット塩基のＲ 、Θ、およびＡの値と非常に近いＲ、Θ、およびＡの値を有する。 本発明の１つの特徴によれば、１セット中のポリマーサブ ユニットは、少なくとも２つの異なるサブユニットのタイプを含み、それぞれは 異なって配向した塩基対に対し特異的である。特に、このセットの少なくとも２ つの異なるサブユニットのそれぞれの塩基は、それぞれの標的塩基対の広い溝の 部位と少なくとも２つの水素結合を形成するのに有効であり、ここで、上記のよ うに、それらの水素結合の一つは標的塩基対のプリンＮ７窒素に対する。 このセット中の他のサブユニット（単数）あるいは他のサブユニット（複数） は、標的配列中の配向した塩基対に対し高い特異性を持って結合し得るが、必ず しも結合する必要はない。従って、このセットの別のサブユニットは、以下に見 られるように、２つの異種の配向した塩基対に十分に結合し得る。このような特 異性の低いあるいは非特異的なサブユニットは、（ａ）ポリマー中の特異性の高 いサブユニット間の必要なスペース、および（ｂ）ポリマー／二重鎖複合体中の 平面の塩基間のスタッキング相互作用への寄与を提供するのに役立つ。 さらに、ポリマー中のサブユニットは、標的配列中の配向した塩基対の少なく とも約70％に結合する高い特異性の塩基を与える。従って、サブユニットセット がわずか２つの高い特異性の塩基しか含まなくても、標的二重鎖配列は、それら の２つの高い特異性の塩基により特異的に結合される配向した塩基対を少なくと も70％含む。 １．Ｃ：ＧおよびＴ：ＡまたはＵ：Ａ配向塩基対のための基本的なサブユニッ トセット 最も基本的なサブユニットセットは、Ｃ:ＧおよびＴ:ＡあるいはＵ:Ａ配向塩 基対のみを有する標的二重鎖遺伝子配列に適している。 この基本的サブユニットセットの第１のメンバーは、グアニン、6-チオグアニ ン、またはそのアナログ、Ｃ:Ｇ配向塩基対に特に対する水素結合に有効なサブ ユニット塩基を含む高い特異性のサブユニットである。図10Ａで図示されるよう に、グアニン（または6-チオグアニン）は、その標的塩基対のグアニンＮ７を包 含する、Ｃ:Ｇ配向塩基対の極性の広い溝の部位と３つの水素結合を形成する。 このサブユニットは、実施例２で示されるように、種々のデオキシリボース、リ ボース、またはモルホリノ骨格構造のいずれかと共に、β-立体化学的配向で骨 格構造に結合した塩基と共に形成される。 基本的セットの第２のメンバーは、2,6-ジアミノプリン、またはそのアナログ 、Ｔ:ＡまたはＵ:Ａ配向塩基対に特に対する水素結合に有効なサブユニット塩基 を含む高い特異性のサブユニットである。図10Bで図示されるように、2,6-ジア ミノプリン塩基は、その標的塩基対のアデニンＮ７を包含する、Ｔ:ＡまたはＵ: Ａ配向塩基対の極性の広い溝の部位と３つの水素結合を形成する。グアニンサブ ユニットのように、やはり実施例２で示されるように、種々のジアミノプリンサ ブユニット、およびそのアナログは、デオキシリボース、リボー スおよびモルホリノ骨格構造を伴い、そして骨格構造への塩基の所望のβ−立体 化学的結合を有し、利用可能なヌクレオシドの変性により調製され得る。 CPK分子モデルは、グアニンおよびジアミノプリン部分は、効果的かつ特異的 にそれらの標的塩基対に結合すべきことを示した。この広い溝の水素結合モード に対するさらなる支持は、これらの２つの３分子複合体、Ｃ:Ｇ:ＧおよびＵ:Ａ: Ｄに対して行われた最適合（best fit）分析から得られた。VoetおよびRich（19 70）は、プリンおよびピリミジンの結晶複合体のＸ線回折研究から水素結合の長 さおよび角度を表にした。それらの表において、ＮＨ:Ｎ結合は、2.75Aから3.15 Aの範囲の長さで、それらの角度は、115°から145°の範囲である。ＮＨ:Ｏ結合 は、2.60Aから3.20Aの範囲の長さで、それらの角度は110°から145°の範囲であ る。 最適合計算において、ワトソン-クリック型塩基対におけるプリンおよびピリ ミジンに対して用いられる構造パラメータは、RichおよびSeeman（1975）により 与えられたパラメータである。これらのパラメータは、ApUおよびGpC結晶（右巻 きの逆平行（anti-parallel）ワトソン−クリック型）のＸ線回折から得られ、 それらは原子的解像度（atomic resolution）で求められた。上記で引用された グアニンの構造パラメータは、また図10Aのサブユニット塩基にも用いられた。 図10Bの2,6-ジアミノプリンサブユニット塩基は、9-エチル-2,6-ジアミノプリン のパラメータと本質的に同じ構造パラメータを有する と想定された。この9-エチル-2,6-ジアミノプリンは、Sakoreら（1969）によっ て報告されたように、9-エチル-2,6-ジアミノプリンが２つの1-メチルチミン（ １つのチミンはワトソン−クリック型で結合し、他方は逆フーグスティーン型で 結合した）に水素結合した結晶性の３分子複合体のＸ線回折研究から得られた。 分析を単純にするために、全ての原子が同一平面上にあることとした。表４は 、この分析の結果を示す。本表中で、標準のプリンおよびピリミジンの番号付け の方式が全体を通じて用いられ、サブユニット塩基-Ｇは、図10Aのサブユニット 塩基（グアニン）を意味し、そしてサブユニット塩基Ｄは、図10Bのサブユニッ ト塩基（2,6-ジアミノプリン）を意味する。角度はVoetおよびRich（1970）のよ うに測定された。 この表からわかるように、サブユニット塩基／塩基対複合体中の全ての水素結 合の角度および長さは、水素結合に関する確立された角度および長さの制限内に ある 全てあるいはほぼ全てグアニンおよびジアミノプリンからなるポリマーに関す る実際的な困難は、中性の水溶液中でそれらが自身で凝集し、そのことにより、 それらの選択した二重鎖標的配列に結合するためにそれらを利用する可能性が減 少する。この自己凝集はおそらく、テトラマー形成を包含し、ここで、図10Cで 示される方式によって、グアニン塩基が水素結合し、そして、ジアミノプリン塩 基は、図10Dで示される方式によって、水素結合し得る。 この自己凝集の問題は、グアニンおよび／またはジアミノプリン塩基のいくつ か（好ましくは少なくとも20％）を、７位に水素結合アクセプター部位を持たな いグアニンおよび／またはジアミノプリンのアナログで置き換えることにより軽 減され得る。このことは、グアニンおよび／またはジアミノプリン塩基の７位の 炭素（7-デアザグアニン含有サブユニット；Seela 1981；Winkeler 1983におい てのように）またはメチル化窒素の使用を包含する種々の方法において行われ得 る。図10Eに、７位に水素結合アクセプター部位を欠いたいくつかの好ましいグ アニンのアナログを示す。関連するジアミノプリンも自己凝集を防ぐために使用 される。 ２．Ａ：ＴおよびＧ：Ｃ配向塩基対のためのスペーサーサ ブユニット 基本的な「グアニンおよびジアミノプリン」セットは、グアノシン、またはデ オキシグアノシン、および7-デアザグアノシンのような７位に水素結合アクセプ ター部位を欠くそれらのアナログから容易に調製され得る。しかし、これらたっ た２つのサブュニットから組み立てられ、そして少なくとも16個の連続する塩基 対の配列を標的とする結合ポリマーは、およそ65,000塩基対またはそれ以上のゲ ノムサイズを有する大きなウイルス中のみにある標的を有することが予想される 。 しかし、ゲノムサイズがわずか3,200塩基対であるＢ型肝炎のような小さいウ イルスさえも含むかなり広い範囲のウイルスに対して標的とされ得る結合ポリマ ーを有することが望ましい。これらの結合ポリマーの標的範囲を広げるための１ つの効果的なアプローチは、グアニンおよびジアミノプリン（およびそれらのア ナログ）に高い特異性を示すサブユニット塩基に対する標的塩基対（すなわち、 配向塩基対Ｃ:ＧおよびＴ:ＡまたはＵ:Ａ）から、主として（少なくとも約７０ ％）なる配列を標的とすることである。標的配列中の残りの塩基対（すなわち約 30％より少ないＧ:Ｃおよび／またはＡ:ＴまたはＡ:Ｕ）は、結合ポリマー中の 低い特異性の「スペーサー」塩基によって適合され得る。これは、結合ポリマー がその標的二重鎖上の位置にある場合、結合ポリマーの連続するサブユニット塩 基間のスタッキング相互作用に連続性を与えるために主として働く。 従って、１つの実施態様において、セクションＦ１に記載された、基本的サブ ユニットから組み立てられるポリマーは、さらに１つまたはそれより多くの低い 特異性のスペーサーサブユニット塩基を含む。 結合ポリマーが、サブユニット塩基をスタックさせながらその標的二重構造上 の位置にある場合、スペーサーサブユニット塩基（それらは必すしもそれらのそ れぞれの塩基対に水素結合する必要はない）は、高い特異性のサブユニット塩基 のＲ、Θ、およびＡの値と非常に近いＲ、Θ、およびＡの値を有するべきである 。特に、全サブユニットセットに関しては、Ｒ値は全て約２Å以内でなければな らず、Θ値は全て約20°以内でなければならず、そしてＡ値は全て約30°以内で なければならない。好ましくは、スペーサーサブユニット塩基もまたそれらのそ れぞれの標的塩基対に対する緩やかな水素結合を提供するべきであり、その結果 、標的への結合特異性および親和性にいくらか寄与することになる。 標的配列がＧ:Ｃ配向塩基対を含む場合、サブユニットセット中の１つの好ま しいスペーサーサブユニットは、シトシン塩基を含み、このシトシン塩基は、Ｇ :ＣおよびＴ:Ａ配向塩基対に弱く水素結合し得る。図11Aは、Ｇ:Ｃ塩基対の広い 溝の部位に水素結合したシトシンを示し、図11Bは、Ｔ:Ａ塩基対に水素結合した シトシンを示す。どちらの場合も標的塩基対のプリンのＮ７への水素結合は含ま ない。 標的配列がＡ：ＴまたはＡ：Ｕ配向塩基対を含む場合、サブ ユニットセット中の１つの好ましいスペーサーサブユニットは、ウラシル（また はチミン）塩基を含み、これらの塩基は、Ａ:ＴおよびＣ:Ｇ配向塩基対に弱く水 素結合し得る。図12Aは、Ａ:Ｔ塩基対の広い溝の部位に水素結合したウラシルを 示し、図12Bは、Ｃ:Ｇ塩基対に水素結合したウラシルを示す。シトシンスペーサ ーに関しては、これらの両水素結合相互作用は、標的塩基対のプリンのＮ７を含 まない。 これら２つののサブユニットスペーサー塩基は、それらの標的塩基対に対し、 低い特異性および低い親和性の結合のみを与えるが、にもかかわらず：i）それ らは標的に結合した結合ポリマー中でサブユニット塩基のスタッキングの連続性 のために効果的に備え；ii）それらは、サブユニットセットの高い特異性のグア ニンおよびジアミノプリンサブユニット塩基のＲ、Θ、およびＡの値と許容可能 に適合するＲ、Θ、およびＡの値を有し；そしてiii）スペーサーサブユニット 、またはそれに近い前駆体は、市販されており、そして比較的安価である。 グアニン、ジアミノプリン、シトシン、およびウラシル（またはチミン）の４ つのサブユニット塩基を含み、そして種々のデオキシリボース、リボース、およ びモルホリノ骨格構造を有するサブユニットセットの合成は、実施例２に記載さ れている。この実施例に記載されたセットは、次の骨格構造を有する： Ａ．図5A、実施例2Aに示される2'-デオキシリボース； Ｂ．図5B（R=メチル）、実施例2Bに示される2'-Ｏ-メチルリボース； Ｃ．図6A、実施例2Cに示されるモルホリノ； Ｄ．図6C、実施例2Dに示されるN-カルボキシメチルモルホリノ-5'-アミノ； Ｅ．図6F、実施例2Eに示されるN-カルボキシメチルモルホリノ-（α）5'-ア ミノ； Ｆ．図5C、実施例2Fに示される5'カルバゼートを有するリボース； Ｇ．図5CCに示される5'スルホニルヒドラジドを有するリボースだが、そこ では実施例2Gのように、カルボニル基がスルホニル基によって置換されている； Ｈ．図5Cに示される5'グリシンアミドを有するリボースだが、そこでは実施 例2HのようにOCONHNH₂基がNHCOCH₂NH₂によって置換されている；および Ｉ．図5CCに示される5'（アミノメチル）（エチル）リン酸を有するリボー スだが、そこでは実施例2IのようにOCONHNH₂基がOPO₂EtCH₂NH₂によって置換され ている； 表５は、このグアニン、ジアミノプリン、シトシン、およびウラシル（または チミン）のサブユニットセットのサブユニット塩基の塩基対特異性およびＲ、Θ 、およびＡの値を示す。 上記Ｇ、Ｄ、ＣおよびＵまたはＴサブユニットで調製された結合ポリマーはま た、一本鎖遺伝子配列へ結合可能性も有する。特に、このポリマーはワトソン／ クリック型ペアリング方式によって適切な塩基配列の一本鎖ポリヌクレオチドに 結合し得る。 ポリマー中のスペーサーサブユニットＣおよびＵまたはＴは、結合特異性が縮 重（degenerate）するので、これらの特異性の低いスペーサーサブユニットの少 なくとも２つは、１つの特異性の高いサブユニットが与えるのと同等の標的特異 性のレベルを与えるために必要とされる。従って、16個の特異性の高いサブユニ ット塩基を含む結合ポリマーは、12個の特異性の高いサブユニット塩基および８ 個の特異性の低いサブユニット塩基を含む結合ポリマーとほぼ同じレベルの標的 特異性を与える。 ３．Ａ：ＴおよびＧ：Ｃ配向塩基対のための互変異性サブユニット特異性を 有するサブユニットセット 別の実施態様では、セクションＦ１に記載された 「グアニンおよびジア ミノプリン」サブユニットは、Ｇ:ＣまたはＡ:Ｔ配向塩基対のいずれかに水素結 合し得る互変異性サブユニット塩基を有するさらなるサブユニットを包含する。 １つの好ましい塩基タイプの一般化された骨格の環状構造および水素結合配列を 、図13Aに示す。ここでX₁はHまたはNH₂であり；X₂はH、F、またはClである；そ してＢはポリマー骨格を示す。図13B〜図13Dは、後に論じるこの互変異性塩基の ３つの好ましい実施態様を示す。 図13Dの塩基の異なる互変異性体による標的塩基対への水素結合を、図14Aおよ び図14BにそれぞれＧ:ＣおよびＡ:Ｔ配向塩基対に関して示す。図14に示される ように、X₂は、互変異性体がＧ:Ｃ塩基対に水素結合する場合、水素結合のアク セプターであり得、塩基対に３つの水素結合を提供する。同様に、X₁は、互変異 性体がＡ:Ｔ塩基対に水素結合する場合、水素結合のドナーであり得、塩基対に ３つの水素結合を提供する。 表６は、グアニン、ジアミノプリン、および図14のサブユニット塩基のサブユ ニット塩基に関する塩基対特異性およびＲ、Θ、およびＡの値、を示す： 互変異性サブユニットの多くの特定の実施態様の合成は実施例３に記載されて いる。図13Bおよび図13Cに示される構造の合成は、2'デオキシリボース骨格構造 に関しては実施例3Aに；2'Ｏ-メチルリボース骨格に関しては実施例3Bに；そし てモルホリノ骨格に関しては実施例3Cに記載されている。 ４．Ａ：ＴおよびＧ：Ｃ配向の塩基対に対して特異性の高いサブユニットを有 するサブユニットセット 他の実施態様において、セクションF-1で記載した「グアニンプラスジアミノ プリン」サブユニットセットは、塩基がＧ:Ｃ配向塩基対の水素結合に特異的で あるさらなるサブユニットを含むか、または塩基がＡ:Ｔ（またはＡ:Ｕ）配向塩 基対の水素結合に特異的であるさらなるサブユニットを含むか、あるいは、この セットは、塩基がＧ:Ｃ配向塩基対およびＡ:ＴまたはＡ:Ｕ配向塩基対の水素結 合に各々特異的であるさらなる２つのサブユニットを含む。 図15Aは、Ｇ:Ｃ配向塩基対を結合するために有効な一般タ イプの塩基の骨格環構造および水素結合の位置を示している。このタイプの構造 の３種の好ましい実施態様を、図15B〜15Dに示す。図16は、Ｇ:Ｃ標的塩基対と 水素結合した図15Dの構造物を示す。図15Aおよび図16から理解されるように、図 15Aの構造のX₂位は水素結合受容体（例えば、Ｏ）であり得、この塩基と標的Ｇ: Ｃ塩基対との間には３つの水素結合が形成される。 モルホリノバックボーン構造物、ならびに図15Bおよび15CのＧ:Ｃ特異的塩基 を有するサブユニットの合成を実施例４Dに記載する。 図17Aは、Ｇ:Ｃ配向塩基対を結合するために有効な他の一般的なタイプの塩基 の骨格環構造および水素結合の位置を示している。Ｇ:Ｃ標的塩基対に水素結合 したこのタイプの構造の好ましい実施態様を、図17Cに示す。 モルホリノバックボーン構造物、および図17BのＧ:Ｃ特異的塩基を有するサブ ユニットの合成を実施例４Ｄに記載する。 図18Aは、Ｇ:Ｃ配向塩基対を結合するために有効な、さらに他の一般的なタイ プの塩基の骨格環構造、水素結合の位置、およびバックボーンの結合箇所を示し ている。この構造物のいくつかの好ましい実施態様を図18B〜18Dに示す。図19は 、Ｇ:Ｃ標的塩基対に水素結合した18A構造物（18B）の一実施態様を示している 。 モルホリノバックボーン構造物、および図18BのＧ:Ｃ特異的塩基を有するサブ ユニットの合成を実施例４Ｄに記載する。 図20Aは、Ａ:ＴまたはＡ:Ｕ配向塩基対を結合するために有効な一般タイプの 塩基の骨格環構造、水素結合の位置、およびバックボーンの結合箇所を示してい る。この構造タイプの３つの好ましい実施態様を図20B〜20Dに示す。図21は、Ａ :Ｔ標的塩基対に水素結合した図20Dの構造物を示している。 モルホリノバックボーン構造物、ならびに図20Bおよび20CのＡ:ＴまたはＡ:Ｕ 特異的塩基を有するサブユニットの合成を実施例４Ｃに記載する。 図22Aは、Ａ:ＴまたはＡ:Ｕ配向塩基対を結合するために有効な、さらに他の 一般的なタイプの塩基の骨格環構造、水素結合の位置、およびバックボーンの結 合箇所を示している。この構造物のいくつかの好ましい実施態様を図22B〜22Dに 示す。図23は、Ａ:Ｔ標的塩基対に水素結合した22Aの構造物（22B）の一実施態 様を示している。 モルホリノバックボーン構造物、および図22BのＡ:Ｔ特異的塩基を有するサブ ユニットの合成を実施例４Ｃに記載する。 塩基がＧ:Ｃ、Ａ:ＴおよびＡ:Ｕ配向塩基対に特異的である、このセクション に記載されるサブユニットは、セクションF1に記載されるグアニンおよびジアミ ノプリンのサブユニットと共に、サブユニットの完全なセットを提供し、これに より、二重鎖核酸における４つの可能な配向塩基対の各々について特異性が非常 に高い水素結合が提供される。本発明の一局面に従って形成されるサブユニット セットは、二重鎖標的配列における３つの異なる配向塩基対と結合するために有 効な、 これらの非常に特異性が高いサブユニットの任意の３つを含み得る。例えば、Ｔ :Ａ、Ｃ:Ｇ、およびＧ:Ｃ塩基対を含む標的配列では、選択されるサブユニット セットは、３つの異なるサブユニット、すなわち共通または類似のバックボーン 構造とジアミノプリン、グアニン（またはチオグアニン）、および上記のＧ:Ｃ 特異的塩基の一つを含み得る。４つの配向塩基対の全てを含む標的配列に適する サブユニットセットは、塩基がＡ:ＴまたはＡ:Ｕ配向塩基対に非常に特異的な上 記の塩基のうちの一つであるサブユニットをさらに含み得る。 表７は、グアニン、ジアミノプリン、ならびに図15、17A、17B、18、20および 22の高特異性塩基を含めたサブユニット塩基の塩基対特異性、ならびにR_b、Θ_b 、およびＡの概算値を示している。 この表は、R、Θ、およびＡ値に関して、上記一連の塩基の一般的適合性を示 している。 ５．グアニンおよびジアミノプリンの置換を有する高特異性のサブユニットセ ット グアニンおよびジアミノプリン塩基が、Ｂコンホメーションで存在する二重鎖 DNA配列中の各標的塩基対の極性の主溝部位と水素結合する場合、これらの２つ の塩基は、結合性ポリマーの隣接する塩基間の最適なスタッキング相互作用を与 えない。スタッキング相互作用は、一般に、二重鎖遺伝子標的に対するこれらポ リマーの結合親和力に著しく寄与するので、スタッキング相互作用を改良する塩 基を使用すると、標的結合性親和力が増大したポリマーが得られ得る。 従って、他の実施態様において、結合性ポリマーは、Ｃ:Ｇおよび／あるいは Ｔ:ＡまたはＵ:Ａに特異的な塩基を有する１種またはそれ以上のサブユニットを 含み、これにより、グアニンおよび／またはジアミノプリンにより提供されるよ りも良好なスタッキング相互作用が提供され、特に、ポリマーが、ＢまたはＢ様 コンホメーションの標的遺伝子二重鎖と結合する場合に良好である。 Ｂ形態の遺伝子二重鎖を標的とする場合に、スタッキング相互作用が改良され たポリマーを調製するために使用され得る１つの好ましいサブユニットセットは 、以下から選択される２つまたはそれ以上のサブユニットを含む：図18に例示し たＧ:Ｃ特異的塩基；図22に例示したＡ:ＴまたはＡ:Ｕ特異的塩基；塩基がＣ:Ｇ 配向塩基対との水素結合に特異的であり、かつグアニンよりも良好なスタッキン グ相互作用を提供する、追加の（Ｒ、ΘおよびＡ値に関して）受容可能に適合す るサブユニット；および、塩基がＡ:ＴまたはＡ:Ｕ配向塩基対との水素結合に特 異的であり、かつジアミノプリンよりも良好なスタッキング相互作用を提供する 、追加の受容可能に適合するサブユニット。 図24Aは、Ｃ:Ｇ配向塩基対と結合するように設計された上記の受容可能に適合 する塩基の、一般的な骨格環構造、水素結合位置、およびバックボーン結合箇所 を示しており、そして図24Cは、24Aの構造物の特定の実施態様を示している。図 24Bもまた、Ｃ:Ｇ配向塩基対と結合するように設計された関連塩基の一般的な骨 格環構造、水素結合位置、およびバックボーン結合箇所を示しており、そして図 24Dは、24Bの構造物の特定の実施態様を示している。 モルホリノバックボーン構造物、ならびに図24Cおよび24DのＣ:Ｇ特異的塩基 を有するサブユニットの合成を実施例４Ａに記載する。 図25は、24Cの構造物とＣ:Ｇ配向塩基対との水素結合を示している。 図26Aは、Ｔ:ＡまたはＵ:Ａ配向塩基対と結合するように設計された上記の受 容可能に適合する塩基の一般的な骨格環構造、水素結合位置、およびバックボー ン結合箇所を示して おり、そして図26Cおよび26Dは、26Aの構造物の２つの特定の実施態様を示して いる。図26Bもまた、Ｔ:ＡまたはＵ:Ａ配向塩基対と結合するように設計された 関連塩基の一般的な骨格環構造、水素結合位置、およびバックボーン結合箇所を 示しており、そして図26Eは、26Bの構造物の特定の実施態様を示している。 モルホリノバックボーン構造物、ならびに図26Dおよび26EのＴ:ＡまたはＵ:Ａ 特異的塩基を有するサブユニットの合成を実施例４Ｂに記載する。 図27は、26Cの構造物とＴ:Ａ配向塩基対との水素結合を示している。 このセクションに記載されるサブユニットは、二重鎖核酸中の４種の可能な配 向塩基対の各々に高い特異性で水素結合するサブユニットの完全なセットを提供 し、そして結合性ポリマーが標的の遺伝子二重鎖上で所定の位置にある場合、特 に、その標的二重鎖がＢまたはＢ様のコンホメーションにある場合、隣接する塩 基間のスタッキング相互作用を向上させる。 上記セットのサブユニットを含有する結合性ポリマーはまた、１つまたはそれ 以上のグアニンおよび／またはジアミノプリン塩基、あるいはそのアナログを含 み得る。 表８は、グアニン、ジアミノプリン、ならびに図18、22、24、および26の塩基 を含めたサブユニット塩基の塩基対特異性、ならびにR_b、Θ_b、およびＡの概算 値を示している。 ６．グアニンおよびジアミノプリンの置換を有する、別の高特異性のサブユニ ットセット Ｂ形態の遺伝子二重鎖を標的する場合、スタッキング相互作用が向上したポリ マーを調製するために使用され得る他の好ましいサブユニットセットには以下が 挙げられる。 図28Aは、Ｔ:ＡまたはＵ:Ａ配向塩基対と結合するように設計された塩基の一 般的な骨格環構造、水素結合位置、およびバックボーン結合箇所を示しており、 そして図28Bは、28Aの構造物の特定の実施態様を示している。 モルホリノバックボーン構造物、および図28BのＴ:ＡまたはＵ:Ａ特異的塩基 を有するサブユニットの合成を実施例４Ｂに記載する。 図29Aは、Ｃ:Ｇ配向塩基対と結合するように設計された塩基の一般的な骨格環 構造、水素結合位置、およびバックボーン結合箇所を示しており、そして図29B は、29Aの構造物の 特定の実施態様を示している。 モルホリノバックボーン構造物、および図29BのＣ:Ｇ特異的塩基を有するサブ ユニットの合成を実施例４Ａに記載する。 図30Aは、Ａ:ＴまたはＡ:Ｕ配向塩基対と結合するように設計された受容可能 に適合する塩基の一般的な骨格環構造、水素結合位置、およびバックボーン結合 箇所を示しており、そして図30C〜30Eは、30Aの構造物の３つの特定の実施態様 を示している。図30Bもまた、Ａ:ＴまたはＡ:Ｕ配向塩基対と結合するように設 計された関連塩基の一般的な骨格環構造、水素結合位置、およびバックボーン結 合箇所を示しており、そして図30Fは、30Bの構造物の特定の実施態様を示してい る。 モルホリノバックボーン構造物、ならびに図30Cおよび30FのＡ:ＴまたはＡ:Ｕ 特異的塩基を有するサブユニットの合成を実施例４Cに記載する。 図31Aは、Ｇ:Ｃ配向塩基対と結合するように設計された受容可能に適合する塩 基の一般的な骨格環構造、水素結合位置、およびバックボーン結合箇所を示して おり、そして図31Cは、31Aの構造物の特定の実施態様を示している。図31Bもま た、Ｇ:Ｃ配向塩基対と結合するように設計された関連塩基の一般的な骨格環構 造、水素結合位置、およびバックボーン結合箇所を示しており、そして図31Dは 、31Bの構造物の特定の実施態様を示している。 モルホリノバックボーン構造物、ならびに図31Cおよび31 DのＧ:Ｃ特異的塩基を有するサブユニットの合成を実施例４Ｄに記載する。 図32は、上記サブユニットセットの代表的な塩基と、それらの各標的塩基対と の結合を示しており、以下を包含する:Ｕ:Ａ配向塩基対と水素結合した図28Ｂの 構造物；Ｃ:Ｇ配向塩基対と水素結合した図29Ｂの構造物；Ａ:Ｔ配向塩基対と水 素結合した図30Dの構造物；およびＧ:Ｃ配向塩基対と水素結合した図31Cの構造 物。 このセクションに記載されるサブユニットは、二重鎖核酸中の４種の可能な配 向塩基対の各々に高い特異性で水素結合するサブユニットの完全なセットを提供 し、そして結合性ポリマーが標的の遺伝子二重鎖上で所定の位置にある場合、特 に、その標的二重鎖がＢまたはＢ様のコンホメーションにある場合、隣接する塩 基間のスタッキング相互作用を向上させる。 表９は、図28、29、30、および31の塩基を含めたサブユニット塩基の塩基対特 異性、ならびにR_b、Θ_b、およびＡの概算値を示している。 II．ポリマーの調製 このセクションは、上記のサブユニットの、配列特異的な二重鎖結合性ポリマ ー中へのアセンブリを記載する。 Ａ．ポリマーの配列および長さ 本発明のポリマーの１つの使用は、正常な宿主の遺伝子配列を不活性化するこ となく、標的二重鎖配列（例えば、病因となる病原性に必須の配列）に結合させ 、そして不活性化することである。従って、ポリマーにより認識される配列情報 は、病原配列と正常宿主配列とを区別すべきである。 二重鎖核酸結合性ポリマーが、正常細胞配列への同時攻撃を回避するために、 病原特異配列中に認識すべき配列情報の量の評価は、以下のようにして計算され 得る。ヒトゲノムは、約30億塩基対の独特の配列DNAを含む。30億塩基対の独特 の配列遺伝子物質の細胞内プール中に偶然の標的配列を有さない可能性のある遺 伝子不活性化因子について、それは、その標的中の少なくともｎ個の塩基対を認 識すべきである。ここで、ｎは４ⁿ＝３×10⁹と計算される。この計算により、予 想される最小の標的認識配列が約16塩基対であることが示される。従って、その 標的配列中の16塩基対を超えて認識する遺伝子不活性化ポリマーは、固有のDNA の細胞内プール中に偶然の標的を有さない可能性は低い。明らかに、標的配列中 に認識される塩基対の数がこの値を超えて増加すると、ポリマーが固有の細胞配 列を攻撃し得る可能性は減少し続ける：遺伝子不 活性化ポリマーにより認識される塩基対の数が直線的に増加するとき、この「安 全因子（safety factor）」は指数的に増加する。 表８は、標的配列中で認識される塩基対の数、および30億塩基対の独特な配列 遺伝子物質のプール中の偶然の標的の対応する予想される数を例示のために一覧 にしている。 表10中の数は、病原または病状に対する特異性を達成するために、二重鎖核酸 に標的される結合性因子は、少なくとも16個、そして好ましくは18個またはそれ 以上の塩基対の標的配列を認識することにより、偶然の配列との結合が回避され ることを示している。 標的配列の長さに加えて、種々のウイルス病原の実用的な 標的を可能にするために、二重鎖核酸中の４種の可能な配向塩基対（すなわち、 Ａ:Ｔ、Ｃ:Ｇ、Ｇ:Ｃ、およびＴ:Ａ）のうち何個がポリマー塩基により特異的に 認識されなければならないかを考察することは重要である。表９は、比較的小さ な（HIVプロウイルスのサイズとほぼ同じ）ウイルスゲノム中に期待される標的 の概数を、16個のサブユニットポリマー中の異なる塩基対結合性特異物の数の関 数として示している。表中の値は、病原ゲノムの与えられた鎖中のプリンとピリ ミジンとの比が約1.0であり、塩基が効果的にランダムに並んでいるという前提 のもとに計算された。 表中の値は、代表的には、ホモポリマー（すなわち、ただ１つの配向塩基対に 対する特異性を有するサブユニットからアセンブルされるポリマー）が天然の二 重鎖遺伝子配列中に標的を有することがありそうにないことを示している。２つ のサブユニットタイプのコポリマー（４種の配向塩基対のうち２種だけに対して 特異性を有する）は、大きなウイルス（例えば、Ｉ型単純ヘルペスウイルス）中 の隣接した16塩基対の標的を有すると予想される。対照的に、３または４種の配 向塩基対に対して特異性を有するサブユニットセットからアセンブルされる結合 性ポリマーは、最小のDNAウイルス（例えば、3200塩基対だけのゲノムサイズを 有するＢ型肝炎ウイルス）でさえ、その中に適当数の標的を有する。 セクションIに記載するように、本発明に従って形成される塩基性の２つのサ ブユニットセットは、２つの異なる配向塩基対、Ｃ:ＧおよびＴ:ＡまたはＵ:Ａ に特異的である２つのサブユニットを含む。標的する多様性を増強するために、 ポリマーは、特定のサブユニットに加えて１つまたは２つのスペーサーサブユニ ットを含む拡張されたサブユニットセットからアセンブルされ得る。 ポリマーは、塩基性の２つのサブユニットセット、および追加の半特異的サブ ユニット（この塩基は２種の異なる配向塩基対のどちらかに水素結合し得る）（ 例えば、図13の塩基は、Ａ:ＴまたはＡ:ＵおよびＧ:Ｃを伴う）からアセンブル され得る。上述のように、この半特異性サブユニット塩基は、高特異性サブユニ ット塩基により認識される配列情報の半分しか認識せず、従ってこれを使用する には、その標的に対する適切な特異性を達成するために、相当分長いポリマーが 必要である。 さらに、ポリマーは、３または４種の異なるサブユニット（これらの高特異性 塩基は、各々、４種の配向塩基対のうちのただ一つと水素結合し得る）からアセ ンブルされ得る。４つの可能な配向塩基対のそれぞれに対して特異的なサブユニ ット塩基を含有する上記のようなサブユニットセットは、本質的に任意の所望の 二重鎖遺伝子配列を標的し得るポリマーの構築を可能にする。 さらに別の実施態様は、特定のメチル識別性サブユニットを含有するポリマー を包含する。二重鎖核酸中の塩基対のピリミジンの５位にあるモイエティは、さ らなるレベルの標的特異性をもたらす利用可能な構造上の差違を提供する。例え ば、（i）二重鎖DNAは、Ａ:ＴおよびＴ:Ａ塩基対中のチミンの５位にメチルを含 有し、二重鎖RNAは、Ａ:ＵおよびＵ:Ａ塩基対中のウラシルの対応する位置にメ チルを欠き、そして（ii）転写的に不活性な遺伝子のコントロール領域中の5’- CpG配列のクラスターは、シトシンの５位にメチルを含有し、そして対応する転 写的に活性な遺伝子は一般にこれらのシトシンの５位にメチルを欠いている。二 重鎖核酸中のピリミジンの５位にあるモイエティはもとより標的識別部として利 用されている（例えば、細菌中の制限ヌクレアーゼによる開裂の制御）。本発明 のポリマー（セクションI-Cを参照のこと）は、これらの構造的差違を利用する 手段を提供し、新しいレベルの二重鎖標的識別能を提供する。このようなポリマ ーは、標的配列中の特定の塩基対のうちピリミジンの５位に水素を含有する 二重鎖標的配列にのみ有効な結合を与えることにより、さらなるレベルの標的識 別能を提供する。 Ｂ．サブユニットの活性化およびポリマーアセンブリ 実施例１〜５のようにして調製したサブユニットは活性化され得、次いで制御 された逐次様式でカップリングすることにより所望の結合性ポリマーが得られ得 る。デオキシリボースを含有し、かつ2'-Ｏ-メチルリボースを含有するサブユニ ットに対する代表的なポリマーアセンブリ手順は、実施例６に記載される。モル ホリノ含有サブユニットに対する代表的な活性化の手順は、実施例７に記載され る；実施例８は、これらの活性化したサブユニットを固相段階的添加によりアセ ンブルし、所望の結合性ポリマーを得る例示の手順を記載している；そして実施 例９はそれらの精製を記載している。図33は、実施例２Ｃのように調製しそして 実施例７Ａのように活性化した代表的なモルホリノサブユニットを用い、上記段 階的アセンブリ手順の１つのサブユニットの添加サイクルを例示している。 図34および35は、セクション５．I．F4に記載された（実施例４のように調製 し、そして実施例７Ａのように活性化した）サブユニットセットからアセンブル される４サブユニット長セグメントの代表的なポリマーを例示している。 図36は、セクションF-5に記載された（実施例４のように調製し、そして実施 例７Ａのように活性化した）サブユニット セットからアセンブルされる４サブユニット長セグメントの代表的なポリマーを 例示している。 図37は、RNA／RNA標的配列に結合するが、対応するDNA／DNA標的配列への結合 を阻止する２つのメチル識別性サブユニットを含有する、４サブユニット長セグ メントの対応するポリマーを例示している。 図38は、セクションF-5に記載されたサブユニットセットからアセンブルされ る４サブユニット長セグメントの代表的なポリマー（Ｂコンホメーションの標的 二重鎖を結合するために適した７原子ユニット長のバックボーンを含有し、そし てさらに、CpG/GpCサブ配列を含有する標的配列と結合するが、対応する（5mC） pG/Gp（5mC）配列への結合を阻止する２つのメチル識別性サブユニットを含有す る）を例示している。 Ｃ．酸化／閉環／還元を包含する新規なポリマーアセンブリ 上記に加えて、以下の例示のカップリング方法もまた、所望の核酸結合性ポリ マーをアセンブルするために使用され得る（図39）。このアセンブリ手順は以下 の工程を包含する：（i）接近した脂肪族ヒドロキシルを含有するが、遊離の第 一級アミンを含有しない（例えば、図39の構造１）サブユニットまたはサブユニ ットが連結したブロックを提供する工程、（ii）これらの接近したヒドロキシル を酸化してジアルデヒド成分（例えば、図39の構造２）を得る工程、（iii）遊 離の第一級 脂肪族アミンを含有する（例えば、図39の構造３、および実施例２Ｆ〜２Ｉのよ うにして調製されるサブユニット）、サブユニットまたはサブユニットのブロッ クを提供する工程、（iv）該ジアルデヒド成分と該第一級アミン成分とを接触さ せて２成分のカップリングを行い、モルホリノ窒素に近接した炭素上にヒドロキ シルを有する環式モルホリノ構造物（例えば、図39の構造４）を形成する工程、 および（v）カップリング反応の間または後に、あるいはポリマーアセンブリの 完結後に、還元剤を添加してモルホリノ窒素に近接した炭素上のヒドロキシルを 除去し、所望のモルホリノ環構造物（例えば、図39の構造５）を得る工程。 接近ヒドロキシル含有モイエティはリボース以外（例えば、ガラクトースまた はグルコース）であり得る。さらに、このカップリング方法は、ポリマーアセン ブリのために液相または固相様式のいずれかで使用され得る。また、酸化工程お よび次のカップリング工程は、好ましくは、アルコールまたは水、あるいはそれ らの混合物中で、中性付近のｐＨで行われる。還元はカップリングの間または後 に行われ得るが、最良の結果は、還元剤（例えば、NaCNBH₄）がカップリング工 程の間に存在するときに得られる。ホウ酸塩錯体（NaCNBH₄が還元のために使用 される場合に生成する）の完全な減少および分解は、３〜５の範囲のｐＨを有す る最終の酸洗浄により最も良く達成され、これは各カップリング工程後に、また は全てのカップリング工程が完結した後に行われ得る。 実施例10は、結合性ポリマーの段階的固相アセンブリのためのこの「酸化／閉 環／還元」カップリング方法の代表的な使用を記載する。 Ｄ．ポリマーの改変 必要または所望であれば、ポリマーの溶解性は、親水性モイエティ（例えば、 ポリエチレングリコール（PEG）鎖）を追加することにより増強され得る。これ は、あるアプローチに従えば、ポリマー末端を脱保護し、そして、このポリマー と、過剰の活性化した親水性化合物（例えば、炭酸ビス（ｐ-ニトロフェニル） により活性化したPEG）とを反応させることにより達成され得る。その後、結合 性ポリマーを合成用支持体から切断し、そして水酸化アンモニウムで処理し、塩 基保護基を除去する。次いで、好ましくはｐＨ10.5でイオン交換クロマトグラフ ィーにより精製する。１つの好ましい親水性分子は、約1000ダルトンの平均分子 量を有するPEGである（Polysciences，Inc.およびAldrich Chem．Co.から市販さ れている）。 いくつかの適用において、エンドサイトーシスを介した細胞の摂取に有利とな るように、ポリマーを改変することが望ましい。これは、例えば、ポリマーをポ リカチオン性の分子（例えば、ポリリジン）で誘導体化することにより行われ得 る。１つまたはそれ以上の第一級アミンモイエティを有するそのようなポリカチ オン性分子のカップリングは、塩基で保護されたポリマーと、２官能性のカップ リング剤（例えば、 スベリン酸ジスクシンイミジル、または他の市販の試薬（例えば、Pierce Chemi cal Company））とを反応させ、次いでアミンを含有するポリカチオン性分子を 添加することにより達成され得る。 ポリマー分子が固体支持体と結合している場合（例えば、診断システムにおい て）、末端のN-保護基は切断され得（塩基をなお、保護された状態で残している ）、そして適切な架橋剤（例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル）と反応し得 る。次いで、この調製物は支持体材料（例えば、第一級アミンモイエティで終結 している適切なリンカーアームを含有するラテックス微粒子）に添加される。 あるいは、支持体に結合する前に結合性ポリマーを精製することを所望であれ ば、メトキシトリチル保護した6-アミノカプロン酸が、ジシクロヘキシルカルボ ジイミド（DCC）を用いて、結合性ポリマーの保護されていないN-末端に結合さ れ得る。次いで、結合性ポリマーは、塩基を脱保護するために水酸化アンモニウ ムで処理され、通常の方法により精製され、そして末端のメトキシトリチルがア ミノカプロン酸モイエティから切断される。最後に、精製したポリマーを、ｐ- ニトロフェニルエステルモイエティで終結する適切なリンカーアームを有する支 持体材料と混合し、ポリマー分子と支持体との共有カップリングが得られる。 環状バックボーンモイエティを有するサブユニットから構築される結合性ポリ マーは、標準的なホスホジエステル結合 のポリヌクレオチドが示す5'から3'の鎖極性と類似した鎖極性を有する。本発明 の結合性ポリマーは、２つの配向のいずれか、または両方において、それらの標 的二重鎖を結合する能力を有する。従って、与えられた異側性（heteromeric） 標的塩基配列について、２つの結合性ポリマーが構築され得、１つは5'から3'に 並んだ適切な塩基配列を有し、他は3'から5'に並んだ同じ塩基配列を有する。次 いで、これらの２つのポリマーを、選択した二重鎖標的配列に対して、それら各 々の結合親和性について試験し得る。標準的なポリヌクレオチドに対する適切な 結合配向を決定するための同様のアプローチは、当該分野において周知である。 Ｅ．ポリマー構造の特徴付け ポリマーが任意の顕著な長さを有する場合（例えば、12個のサブユニットより も長いポリマー）、NMR、２次元NMR、および元素分析では、本発明のヘテロポリ マーに関する有用な構造情報は殆ど得られないようである。 実施例８のように調製し、そして固体支持体から切断されたポリマー（しかし 、水酸化アンモニウムではまだ処理されていない）は、代表的には、陽性高速原 子衝撃質量分光測定によると、長さが約16〜18個のサブユニットまでのポリマー については、比較的きれいな親イオンを示す。より長いポリマー、および実施例 10で調製したような、塩基上の保護基を欠くポリマーについて、 有効な質量分 析には、レーザー脱離 またはエレクトロスプレーのような方法が必要である。 III． 有用性 Ａ．診断：二重鎖型における配列の検出 １つの適用において、本発明のポリマーは、分析物中の二重鎖標的核酸配列の 検出のための診断方法において用いられる。標的配列は代表的には病原体特異的 配列であり（例えば、ウイルスまたは細菌のゲノム配列）、それは生物学的サン プル（例えば血液サンプル）において検出される。 標的配列は、好ましくは15〜25のサブユニットの長さであり、先に議論したよ うに、必要な配列特異性を与える。１つのアッセイの形式において、診断薬は固 体の支持体（例えばミクロビーズ）であり、二重鎖標的配列に特異的に結合する ために有効な共有結合的に結合したポリマーによりコートされている。分析物二 重鎖を細菌またはウイルスから放出させてフリーな形態にするためにサンプルを 処理した後、もし必要なら、分析物二重鎖を支持体結合ポリマーに塩基対特異的 に結合させるに充分な条件下で、このサンプルを固体支持体に接触させる。代表 的には、この結合反応は、20°〜37℃で、10分から２時間行う。固体支持体を洗 浄して結合しなかった物質を除いた後、前記二重鎖の検出をするために、捕獲さ れた標的二重鎖に結合するために有効なリポーター試薬を支持体と接触させる。 このリポーターは、可溶性二重鎖結合性ポリマーであり、本発明に従って形成さ れ、分析物二重鎖中の 第２の分析物特異的標的配列に対し塩基対特異的であり、シグナル検出のために 適切なシグナル基（例えば蛍光物質）で標識する。このシグナル基は、標準的な 結合方法（例えばセクションIIで述べたような）によりポリマーに結合する。 支持体を洗浄した後、支持体に結合したリポーターについて試験し、このリポ ーターは、配列特異的結合性ポリマーを介して支持体に結合した分析物の量に比 例する。 あるいは、結合した分析物二重鎖を有する洗浄支持体を、核酸と特異的にイン ターカレートする蛍光薬剤（例えばエチジウムブロミド）と反応させ、その後ポ リマーに結合した分析物をその蛍光発光により評価する。他の代替法は、共有さ れ、公開されたPCT出願第PCT/US86/00545号（WO86/05519）で記載されたように 、結合した分析物二重鎖を有する洗浄支持体をリポーターで標識したポリカチオ ン性分子（例えば蛍光標識したオリゴカチオン）と反応させることである。リポ ーター分子は静電的相互作用により、負に帯電した分析物二重鎖骨格と結合する が、固体支持体上の帯電していないポリマー分子には実質的に結合しない。支持 体を洗浄して結合しなかった物質を除いた後、配列特異的分析物／ポリマー複合 体を介して固体支持体に結合したリポーターを定量した。 Ｂ．インサイチュハイブリダイゼーション 多くの適用において、インサイチュハイブリダイゼーションは、二重鎖で二重 鎖の核酸、代表的には、病原体と、あるいは染色体DNA内の選択された配列と関 係のある二重鎖DNA中 の標的配列に向けて行う。現在までのところ、インサイチュハイブリダイゼーシ ョンは、代表的には、透過性にされた細胞構造に、標識された核酸プローブを添 加することを包含し、この構造を標的二重鎖核酸を変性するために充分な温度ま で加熱し、そしてこのプローブおよび変性した核酸を適切なハイブリダイゼーシ ョン条件下で反応させる。結合しなかった（ハイブリダイズしなかった）プロー ブを除去した後、リポーターラベルの存在についてこの構造を試験し、生物学的 構造内に配置された標的核酸に結合しているプローブの部位を探す。 この方法は、特定の遺伝子配列の位置のマッピングおよび既知の遺伝子配列間 の距離の決定、サテライトまたは反復DNAの染色体内の分布の研究、核組織の試 験、染色体異常の分析、および単一細胞または組織におけるDNA損傷の配置に関 して、広く染色体DNAに適用されている。いくつかの研究は、宿主細胞の染色体 中に組み込まれたウイルス配列の配置について報告している。この方法はまた、 切片化された核の三次元再構築により、および水銀で処理しそしてビオチン化し たプローブと二重のインサイチュハイブリダイゼーションにより、間期の染色体 形状の研究のためデジタルイメージ分析を用いて染色体の位置の研究に用いる（ Emmerlch）。インサイチュハイブリダイゼーション法の他の一般的な適用は、診 断用の手段として、宿主細胞内のウイルスの存在の検出に関する。 本出願においては、本発明のポリマーは、目的の細胞構造 または細胞内構造（subcellular）（例えば染色体の調製物）にある特異的な二 重鎖の遺伝的配列を標的にするために設計されている。このポリマーは、蛍光タ グのような適切な標識を用いて誘導体化される。このポリマーは、好ましくは最 初に物質を透過性にすることなく、研究される構造を有する細胞または組織に直 接添加する。なぜなら、このポリマーは帯電しておらず、透過処理の必要性なし に生きている細胞によりたやすく浸透し得るからである。このポリマーはさらに 、ヌクレアーゼ分解に対して耐性であるという利点も提供する。 一旦目的の二重鎖標的物質と接触すると、塩基対特異的結合が通常の生理学的 温度で生じ得、通常の細胞が活性な条件下で二重鎖標的の検出を再度可能にし、 そして研究する物質の熱分解もない。標的二重鎖への結合に充分な時間の後、結 合しなかったポリマーを洗浄し、研究する構造を直接、例えば蛍光顕微鏡により 試験し、二重鎖標的配列の部位特異的配置およびそれらの可能な動きを観察する 。あるいは、蛍光性のバックグラウンドを減少させるため、材料を固定化し得（ 例えばエタノール処理により）、結合しなかったリポーターを洗浄して除き、そ して顕微鏡によって固定化した形態を調べる。 Ｃ．標的配列を有する二重鎖の単離 本ポリマーの発明の他の一般的な適用は、二重鎖核酸構造を核酸混合物（例え ば、ゲノム断片の混合物、選択されたウイルス二重鎖を含有する血液サンプル、 または異なる配向の 異なる二重鎖挿入物を有するプラスミドの混合物）から単離することに関する。 この方法で用いられる結合性ポリマーは、（ａ）選択された標的二重鎖配列に 対して塩基対特異的に結合するように設計され、（ｂ）標的二重鎖を捕獲した後 液体サンプルから単離され得る。この目的のため、このポリマーは、上記のよう に固体支持体に結合し、またはビオチンのようなリガンドモイエティを用いて誘 導体化され、このリガンドモイエティは、標的二重鎖に結合した後、固体支持体 上の捕捉、または免疫沈降を可能にする。 このポリマーをサンプル物質に加え、そしてポリマーがその標的配列に結合で きる条件下、代表的には、10分間から２時間、20°〜37℃でインキュベートする 。結合が生じた後、ポリマーおよび結合した物質をサンプルから単離する。単離 した物質は、加熱、またはカオトロピック剤によりポリマーから放出され得、そ して必要ならポリメラーゼ連鎖反応法、および／または適切なクローニングベク ー中でのクローン増殖によりさらに増幅され得る。 Ｄ．部位特異的DNA改変 本発明のポリマーは、インビトロでの、二重鎖DNAの選択された部位特異的改 変物を生成するためにも有用である。これらは、選択された部位での二重鎖種の 切断、または制限酵素あるいはメチル化酵素に対し選択された領域の保護を包含 する。後者の適用は、組換えDNA技術において特に有用である。 そこでは、選択された制限エンドヌクレアーゼによる切断からベクターまたは異 質のDNA配列を保護し得ることがしばしは利点であり、あるいは、そこでは、与 えられた制限部位で選択的にメチル化を妨げることが望ましい。 選択された塩基配列内で部位特異的な開裂を生成するために、このポリマーは 結合状態にあるポリマー中で、二重鎖DNAを開裂し得るキレート化された鉄基の ような開裂物質を用いて誘導体化される（Dreyerら、1985；Dervan、1986；Mose rら、1987；Maherら、1989）。このポリマー配列は、開裂基を開裂される部位に 近接して配置するために選択する。これらの開裂基は代表的にはポリマーの一端 に結合する。制限酵素またはメチラーゼ酵素から二重鎖標的配列の選択された部 位を保護するために、このポリマーは４〜８塩基対配列に結合するための配列を 有する。この塩基対配列は、選択された制限酵素配列、さらに独特の標的配列に 対して増加した特異性を与えるために有効な任意の付加的な近接塩基を特定する 。二重鎖物質にポリマーを添加した後、この物質を選択された制限酵素またはメ チル化酵素で処理する。酵素処理後、処理した二重鎖は、加熱により「脱保護化 される」。 Ｅ．治療への適用 本発明のポリマーは、それらの二重鎖標的配列への結合能力により、疾病に関 係する病原体、またはガン遺伝子のような選択されたゲノム配列を不活化あるい は阻害する能力を有する。複製起点およびエンハンサーおよびプロモーター配列 は二重鎖指向結合性物質による不活化に対し特に感受性である。なぜなら、この 物質は、標的遺伝子の複製または転写の開始に必要な標的部位を塞ぐからである 。このような遺伝子制御配列は、多くの病原体遺伝子、そしてまたヒトで特徴付 けられた種々のガン遺伝子で知られている。 いくつかの治療への適用にとって、結合性ポリマーが特定の細胞または組織に 送達されるように、あるいは核のような特定の細胞内小器官に送達されるように そのポリマーを改変することが望ましい（Chelsky）。このことは、例えば、結 合性ポリマーを適切なシグナル構造（例えば、脱シリル化（desialylated）ガラ クトシル含有タンパク質（Gregoriadis,1975）、あるいはガラクトース部分のク ラスター、それらは肝細胞により取り込まれ；あるいはＤ−マンノースまたはＬ −フコースで、それらはクッパー細胞およびマクロファージにより取り込まれ； あるいはインスリンまたは関連ペプチドで、それらは次いで血液／脳バリアーを 越えて活性に輸送される）に連結することにより達成し得る。さらに結合性ポリ マーは、脳特異的抗体とともにあるいはそれを伴わすに界面活性ミセル中に取り 込まれ得、血液／脳バリアーを横切る送達を促進する（Kabanov）。 上記で議論した理由によって、このポリマーは、意図した標的配列以外の配列 に好ましくない結合をする可能性を最少にするために、少なくとも16個の塩基対 特異的サブユニットを一般に含有すべきである。候補となる標的構造は、それら は種々の配列データベースにおいて入手可能であるように、ゲノム配列の分析か ら決定され得る。好ましい標的構造は、（ａ）株を越えてよく保存されており、 そして（ｂ）ポリマー形成に利用し得るサブユニットのセットに適合する塩基対 配列を有する。例えば、もしこのサブユニットセットが、グアニン、ジアミノプ リン、およびセクションＩで詳述したように１個または２個のスペーサーサブユ ニットを有するなら、この標的配列は好ましくは少なくとも約70％のＣ:Ｇおよ びＴ:Ａ配向塩基対を有し、そして残りがＧ:Ｃおよび／またはＴ:Ａである。 本発明のポリマーに対する１つの治療上の標的は、HIV-Iゲノムである。二重 鎖のプロウイルスステージにおけるHIV-Iゲノムの配列検索は、（i）株を越えて よく保存されており、そして（ii）グアニンおよび2,6-ジアミノプリン含有サブ ユニットから優先的にアセンブルした適切なポリマー結合性標的である配列に対 して行う。表12は、いくつかのこのように選択された配列、およびそれら上の位 置、セクションＩ、Ｅ−２で述べられた「２つのサブユニットとスペーサー」セ ットのタイプからアセンブルされた結合性ポリマーを示す。 以下の実施例により、本発明に従って種々のサブユニット、サブユニットセット 、およびポリマーを調製する合成方法を詳述する。この実施例は例示を意図し、 本発明を限定しない。 実施例１ サブユニット保護方法 Ａ．サブユニットの塩基上の第１アミノ基を保護する一 般的な手順 指示のない限り、化学薬品はAldrich Chemical Co.，Milwaukee,WIより購入し た。 サブユニットは、一般にヌクレオシドまたはヌクレオシドのアナログで（10mm ol、ピリジンを用いて数回共蒸発することにより乾燥した）、ピリジン（50〜10 0mL）に溶解または懸濁し、そしてクロロトリメチルシラン（基質中に１水酸基 に対し２〜３当量のシラン）で処理する。この溶液を１時間または溶液が完全に なるまで撹拌する（難溶な基質の場合音波処理を用い得る）。アルキルクロロホ ルメート、酸塩化物、または無水物、または他の適切な活性化したカルボン酸誘 導体を加える（基質中の１アミノ基に対し１．０５〜４．０当量）。室温で１〜 24時間撹拌した後、０℃に冷却し、次いでピリジン／水の１：１の混合物（20mL ）でゆっくりと処理する。10分後、濃縮水酸化アンモニウム（20mL）を添加し、 そして15分間撹拌を続ける。この溶液を真空下で濃縮して酢酸エチル（またはエ ーテルまたはクロロホルム）に溶解し、水と一緒に振る。 有機相を除去し、生成物を結晶化する。もし結晶化が起こらない場合、溶媒を除 去し、残渣をシリカのクロマトグラフィーにかけ、Ｎ−アシル化物を生成する。 有用である代表的なクロロホルメートは、９−フルオレニルメトキシカルボニル 塩化物、２−（ｐ−ニトロフェニル）エトキシカルボニル塩化物（Himmelsbach ）、および２−（フェニルスルホニル）エトキシカルボニル塩化物（Balgobin） を含む。代表的な酸塩化物は、ベンゾイル、イソブチリル、およびトリクロロア セチルを含む。代表的な無水物は、無水酢酸、無水イソ酪酸、および無水トリフ ルオロ酢酸を含む。他の酸誘導体はアシル、ヒドロキシベンゾトリアゾライド（ アセトニトリル中で酸塩化物と乾燥ヒドロキシベンゾトリアゾールから調製する ）を含む。後者は、フェニルアセチル基を導入するために好都合に用いられる。 あるいは、McBrideらの手順により第１アミノ基をアミジンとして保護する。 Ｂ．塩基対認識部分上の第１ジアミンを差別的に保護する手順 2,6-ジアミノプリンリボシド（Pfaltz and Bauer，Inc.）を、実施例１Ａの一 般的な手順によりN-2,N-6ビス−（フェニルアセチル）アミドに転化する。N-6位 のアシル基は、ヌクレオシドをピリジン／エタノール中の１Ｎの水酸化リチウム を用いて０℃で処理することにより選択的に開裂される。反応混合液を塩酸水溶 液で中和し、そして溶媒を蒸発させる。残 渣は酢酸エチル／エタノールから再結晶させ得るか、またはシリカゲルクロマト グラフィーで精製され得る。粗製の生成物、または精製ヌクレオシドは、N-6ベ イゾイル基を導入するために塩化ベンゾイルを用いる一般的な手順により再びア シル化の対象となる。この第２のアシル化には、僅かに過剰のアシル化剤（1.05 〜1.2当量）を用いる。 Ｃ．認識部分中のオキソ基を保護する手順 2',3',5'-トリ-Ｏ-イソブチリルN2-イソブチリルデオキシグアノシンをTricht ingerらの方法により06 2-（p-ニトロフェニル）エチル誘導体に転化する。ある いは、グアノシンをKamimuraらの方法により06ジフェニルカルバモイル誘導体に 転化する。アンモニア処理（１：１ 濃水酸化アンモニウム／ＤＭＦ）または０ ℃でピリジン／エタノール中の１ＮLi0H処理に続いて、N2-プロピオニル06-ジフ ェニルカルバモイルグアノシンが生成する。これらの方法は、N-2がアシル化さ れ0-4が保護された2-アミノ-4（3H）-キナゾリノン誘導体およびN-7がアシル化 され0-9が保護された7-アミノ-9（8H）-イミダゾ［4,5-f］キナゾリノン誘導体 を調製するために適用し得る。 Ｄ．第１級アルコールでジメトキシトリチル置換基を 導入する一般的な手法 アルコールを有する基質（10mmol）をピリジン（50〜100mL）に溶解または懸 濁し、次いで4,4'-ジメトキシトリチル塩 化物、トリエチルアミン（20mmol）および4-ジメチルアミノピリジン（0.5mmol ）で処理する。室温に数時間おいた後、混合液を水（5mL）で処理し、その後冷 飽和炭酸水素ナトリウム水溶液に注ぐ。この混合液を酢酸エチル（またはクロロ ホルム）で抽出し、次いで合わせた有機層を乾燥し（硫酸ナトリウム）そして蒸 発させる。残渣をシリカのクロマトグラフィーにかけ、純粋なジメトキシトリチ ル化化合物を得る。 実施例２ 「２−サブユニットおよびスペーサー」セットの調製 Ａ．2'-デオキシリボース部分を含有するサブユ ニット図５Ａ） 以下の化合物の5'-Ｏ-ジメトキシトリチル保護誘導体は、Sigma（St.Louis,MO ,USA）から入手し得る：N-4ベンゾイルデオキシシチジン、N-2イソブチリルデオ キシグアノシン、チミジン。2,6-ジアミノプリン-2'-デオキシリボシドはSigma から入手可能であり、そして第１アミノ基および第１水酸基で実施例１の方法に より保護される。 Ｂ．2'-Ｏ-メチルリボース部分を有するサブユニ ット（図５Ｂ） ウラシル、シトシン、グアニン、アデニン、および7-デアザアデニンの2'-Ｏ- メチルリボヌクレオシドは、Robinsら（1974）、またはSekineらの方法により得 られ得る。グアノシン および2-アミノアデノシン2'-Ｏ-メチルエーテルもまた、Roblnsら（1981）の方 法により有利に調製される。それらは実施例１の一般方法によりそれらの塩基が 保護されたアナログに転化し得る（例えば、グアノシン誘導体に対してはN-２イ ソブチリル、2-アミノアデノシン誘導体に対してはN-2フェニルアセチル、N-6ベ ンゾイル、シチジン誘導体に対してはN-4ベンゾイル）。第１水酸基は実施例１ のように保護される。 Ｃ．モルホリン部分を有するサブユニット（図６Ａ） リボース含有サブユニットは、保護形態の塩基を有し、過ヨウ素酸塩により2' -3'ジアルデヒドに酸化される。ジアルデヒドは、アンモニアまたは第１アミン に結合し、そして2'および3'水酸基（親のリボースのように番号付けした）は、 シアノボロハイドライドを用いた還元により除去する。 この一般的な合成スキームの例は、塩基保護シトシン（Ｒ_i、^*）のモルホリン サブユニットの合成を参考にして以下に述べる。100mlの水に溶解した0.1モルの N4-ベンゾイルシチジンと0.105モルの過ヨウ素酸ナトリウムを1.6Lのメタノール に撹拌しながら添加する。５分後、0.12モルのアンモニウムビボレートを添加し 、その混合液を室温で１時間撹拌し、次いで冷却し濾過する。濾過液に0.12モル のシアノボロハイドライドのナトリウム塩を添加する。10分後、0.2モルのトル エンスルホン酸を添加する。さらに30分後、さらに0.2モルのトルエ ンスルホン酸を添加し、そしてその混合液を冷却し濾過する。固体の沈澱物を真 空下で乾燥し、アミンのないトシラート塩を得る。適度に強い（pKa<3）芳香族 の酸（例えば、トルエンスルホン酸、または2-ナフタレンスルホン酸）の使用は 、取り扱いを容易にし、収率を有意に改善し、そして生成物の精製度を高くする 。 2,6-ジアミノプリン含有モルホリノサブユニットのトシラート塩を濾過するこ ともまた有効である。しかし、グアニン含有およびウラシル含有サブユニットの トシラート塩は、一般にメタノールにより可溶性である。従って、ＧおよびＵの サブユニットに対しては、メタノールを減圧下で除去し、残渣はブラインとイソ プロパノールとの間に分配し、所望の生成物は有機相へ移行する。 塩基保護モルホリノサブユニットは、その後トリチル塩化物を用いてモルホリ ノ環の環状窒素で保護され得る。 トリチル化段階の例として、上記から0.1モルのトシラート塩を撹拌しながら ２リットルのアセトニトリルに添加し、次いで0.26モルのトリエチルアミン、お よび0.15モルのトリチル塩化物を添加する。混合液を覆い、室温で１時間撹拌す る。その後100mlのメタノールを添加して引き続き15分間撹拌する。減圧下で溶 媒を除去し、次いで400m1のメタノールを添加する。固体を入念に懸濁してスラ リーとし、５リットルの水を添加する。混合物を30分間撹拌し、そして濾過する 。固体を１リットルの水で洗浄し、濾過して真空下で乾燥する。固体を50 0mlのジクロロメタンに再懸濁し、濾過し、そして沈澱が丁度始まるまで回転蒸 発（rotovaped）し、その後１リットルのヘキサンを添加して15分間撹拌する。 固体を濾過により除去し、真空下で乾燥する。 上記の手順により、モルホリノ窒素上でトリチル化され、そして遊離の５’水 酸基（親のリボース中のように番号付けした）を有する、塩基保護モルホリノサ ブユニットを生成する。 Ｄ．Ｎ−カルボキシメチルモルホリン−５’−アミノ部 分（図６Ｃ） リボース含有サブユニットは、保護形態の塩基対認識部分を有し、Stirchak、 Summerton、およびWeller（1987）のように、または下記の実施例２Ｅに記載の 方法により、５’アミンおよびその５’トリチル化アミンに転化される。上記実 施例２Ｃの一般的手順に続き、リボースの隣接する２’および３’水酸基を、次 いで過ヨウ素酸塩で酸化し、２’−３’ジアルデヒドを得る。このジアルデヒド をトリエチルアミン存在下でグリシンに結合する。２’および３’の水酸基（親 のリボースのように番号付けした）を、シアノボロハイドライドで還元すること により引き続き除去する。 あるいは、実施例２Ｃのようにジアルデヒドはアンモニアに結合しそして還元 され、そして次いでモルホリノ窒素を、N,N-ジエチルアニリンで緩衝されたブロ モ酢酸によりアルキ ル化し得る。 これらの方法により、トリチル化された５’アミンおよびモルホリノ窒素上に カルボキシメチル基を有する塩基保護モルホリノサブユニットを生成する。 Ｅ．Ｎ−カルボキシメチルモルホリン−α（５’ −アミノ）部分（図６Ｆ）を有するサブユニット 実施例２Ｃおよび２Ｄはモルホリノ含有サブユニットの調製を説明し、そこで は5'メチレンがβ配向し、すなわちそれは親のリボースにおける配向と同じであ る。類似のモルホリノ含有サブユニットは、5'メチレンがα配向しており、以下 の一般的方法で調製され得る。 リボース含有サブユニットの５’水酸基は、保護された形の塩基対認識部分を 有し、確立した方法により第２アミンに転化する（上記実施例２Ｄ参照）。その 後、上記実施例２Ｃの一般的な方法の後で、リボースの隣接する２’および３’ 水酸基を過ヨウ素酸塩で酸化し、２’−３’ジアルデヒドを得る。この２’アル デヒドは５’位で第２アミンに急速に結合する（親のリボースのように番号付け した）。シアノボロハイドライドによる還元により、環状のモルホリノ窒素が第 ３級であるモルホリノ環、およびα配向の５’アルデヒドを有する構造を生成す る。次いで過剰なシアノボロハイドライド存在下で、アンモニアまたは１級アミ ンを添加して、α配向の５’アミンを生成する（それぞれ１級または２級）。 上記の一般的な戦略は、Ｎ−カルボキシメチルモルホリノ−α（５’−アミノ ）部分を有するサブユニット、および多くの他の有用な変種の調製に適用し得る 。リボース部分の５’位に所望の第２アミンを導入する１つの方法は：ａ）2',3 '水酸基を、Smit、Rammler）GoldbergおよびKhoranaの方法（1961）のように、 アセタールに転化する；ｂ）DMSO／ピリジン／トリフルオロ酢酸／ジイソプロピ ルカルボジイミドを用いて５’水酸基をアルデヒドに酸化する（モファット酸化 ）；ｃ）シアノボロハイドライド存在下でこの５’アルデヒドをグリシン（また はグリシンの第３ブチルエステル）と反応させる；そしてアセタールの酸開裂に より2',3'水酸基を再生成する、ことを必要とする。 Ｆ．５’カルバゼートを有するリボースを含むサブユニ ット（図５Ｃ） リボース含有サブユニットは以下のように５’カルバゼートに転化し得る。10 mMolのリボース含有サブユニットは、保護状態の塩基対認識部分の環外アミンを 有し、そこに100mlのアニシルアルデヒドおよび0.5g（1）p-トルエンスルホン酸 （tosic acid）を添加する。室温で48時間撹拌する。反応混合液を500mlのヘキ サンに加え沈澱を回収する。エーテルを用いて展開したシリカゲルクロマトグラ フィーで生成物を精製する。得られた生成物を２当量の炭酸ビス（ｐ−ニトロフ ェニル）および２当量のトリエチルアミンとアセトニトリル中で８時 間30℃で反応させる。生成物を５％から15％のアセトン／クロロホルム混合液で 展開したシリカゲルクロマトグラフィーにより精製する。生成物を４当量のｔ− ブチルカルバゼートとＤＭＦ中で４時間50℃で反応させる。反応混合液を水に加 え、沈澱を回収し、次いでＤＭＦ／濃NH₄OH（体積比１：１）中に一晩30℃で懸 濁する。このアンモニウム溶液をブラインに添加し、不溶性の生成物を回収し、 真空下で乾燥する。乾燥生成物をトリフルオロ酢酸に溶解し、５分後にエーテル を添加して生成物を沈澱させ、それをエーテルで２回処理する。その生成物を全 ての残留トリフルオロ酢酸を中和するに充分なＮ−エチルモルホリンを含むメタ ノールに溶解し、次いで生成物をエーテルの添加により再度沈澱させ、そしてそ の生成物を真空下で乾燥する。所望の５’カルバゼート生成物は、一般にＮ−エ チルモルホリン／メタノール／クロロホルム（体積比１：４：６）で展開したシ リカゲルクロマトグラフィーで精製し得、あるいは好ましくは、適切な水／有機 混合液から再結晶化することにより精製し得る。 Ｇ．５’−スルホニルヒドラジドを有するリボースを含 むサブユニット リボース含有サブユニットを、以下のように５’−スルホニルヒドラジドに転 化し得る。10mMolのリボース含有サブユニットは、保護状態の塩基対認識部分の 環外アミンを有し、上記実施例２Ｆで記載されたようにアニシルアセタール誘導 体に転化させる。 ドライアイス上で冷却されたジクロロメタン中の10mMolの塩化スルホニルに、 15mMolのN,N-ジエチルアニリンを添加する。次に、ジクロロメタン中の10mMolの N-アミノフタルイミドの希釈溶液を、急速に撹拌しながらゆっくりと添加する。 20分後、アニシルアセタールサブユニット誘導体をこのクロロスルホニルヒド ラジド溶液に添加する。30mlのジクロロメタン中の30mMolのジイソプロピルエチ ルアミンを急速に撹拌しながらゆっくりと添加する。室温で１時間撹拌した後、 減圧下で溶媒を除去し、生成物をアセトン／クロロホルムで展開したシリカゲル クロマトグラフィーにより精製する。 次いで生成物をメタノール中のヒドラジンアセテートで処理し、溶媒を減圧下 で除去し、そしてＤＭＦ／濃NH₄OH（体積比１：１）を添加し、その調製物を30 ℃で一晩インキュベートした。最後に生成物をトリフルオロ酢酸で処理し、そし て実施例２Ｆのように実施した。 Ｈ．５’−グリシンアミドを有するリボースを含むサブ ユニット アンモニアがグリシンの代わりに用いられることを除き、実施例２Ｅで記載し たように、酸化／還元的アルキル化手順に続いて、第１アミンをリボース含有サ ブユニットの５’位に導入する。この５’第１アミンを、次いでN-第３ブトキシ カルボニルグリシン、p-ニトロフェニルエステルを用いてア シル化する。精製後、保護基をＤＭＦ／濃NH₄OH、次いでトリフルオロ酢酸で処 理して除去し、そして最終的に5'-グリシンアミド誘導体が実施例２Ｆのように 得られた。 Ｉ．５’酸素に連結したアミノメチルエチルホスフェー ト基を有するリボースを含むサブユニット アミノメチルホスホン酸（Aldrich Chem．Co.）を、トリエチルアミン存在下 でトリチルクロリドと反応させる。ジアニオン性のホスホン酸塩生成物（その対 イオンがトリエチルアンモニウムである）をエタノール中に懸濁し、次いでジシ クロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）のようなカルボジイミドを添加する。得 られたモノアニオン性生成物を、ピリジニウム塩酸塩を含む水とクロロホルムの 混合液を用いて振とうする。この方法によりピリジニウムの対イオンを有するモ ノイオン性のホスホン酸を得る。この生成物をクロロホルムに添加し、続いて塩 基の環外アミンが保護形態で、そして2'および3'水酸基がアニシルアセタールと して保護されたリボース含有サブユニットを添加する。ＤＣＣを添加してホスホ ン酸塩をサブユニットの5'酸素に結合する。生成物を乾燥し、メタノール／クロ ロホルム混合液を用いてシリカのクロマトグラフィーにかける。純粋な生成物は 、次にＤＭＦ／濃NH₄OH（体積比１：１）を用いて塩基を脱保護化し、次いでト リフルオロ酢酸中に懸濁してトリチルおよびアニシル保護基を除去する。 実施例３ 互換塩基を用いるサブユニットの調製 Ａ．２’-デオキシリボースモイエティを含むサブユニット（図５Ａ） １．図１３の塩基を含むサブユニット 4-アセチルアミノ-2-メチル安息香酸（Peltier）を、冷発煙硝酸で処理するこ とにより、5-ニトロ化合物に変換する。反応混合物を、砕いた氷に注ぎ、そして 固体生成物を濾過により集め、そしてDMF/水からの再結晶により、またはシリカ クロマトグラフィーにより精製した。90％のエタノール中の１〜10％のNaOH溶液 でアルカリ加水分解することにより、アセトアミドを除去する。反応混合物を過 剰の希HClに添加し、そして溶媒をエバポレートした。粗酸を、室温で数日間、H Cl飽和メタノールでエステル化する。溶媒を除去した後、生成物を、酢酸エチル と飽和炭酸水素ナトリウム水との間で分配する。水で洗浄後、有機相をエバポレ ートし、そして残渣をシリカクロマトグラフィーにより精製する。エタノールま たはDMF中で水素および炭素担持パラジウムを用いて、ニトロ基をアミノに還元 する。セライトを通して濾過し、そしてエバポレートした後、還流メタノール中 で臭化シアンを用いて、粗ジアミンを、2-アミノ-6-メチルベンズイミダゾール- 5-カルボン酸メチルに変換する。混合物を冷却し、飽和炭酸水素ナトリウム水に 注ぎ、そして固体生成物を濾過し、再結晶により精製する。環外アミノ基を、ピ リジン中でフタロイルジク ロリドとの還流によりアシル化し、その後、Katritzkyの方法に従って、ジアゼ ピン（diazepine）を還流アセトニトリル中でピラゾールと反応させる。高強度 の太陽燈のおよび／または過酸化ベンゾイルを用いて、この化合物を、臭素また はN-ブロモスクシンイミドまたは1,3-ジブロモ-5,5-ジメチルヒダントインとそ のままで、あるいは四塩化炭素またはクロロホルムまたは1,1,1-トリクロロエタ ン中で反応させ、ベンジリックブロミド（benzylic bromide）を生成する。ジア ゼピンをピリジン中でイソブチルクロリドを用いてさらにアシル化し、３カ所ア シル化したベンズイミダゾール種を生成することは可能である。これは、通常臭 素化に先立ち行われる。 粗ベンジリックブロミドを、乾燥DMF中でアジ化ナトリウムと反応させ、そし て白金またはパラジウム上で水素を用いて還元し、ラクタムを生成する。これを 、１当量のトリフルオロメタンスルホン酸トリメチルシリルまたはトリフルオメ タンスルホン酸tert-ブチルジメチルシリルを用いてＯ-シリル化し、Ｏ-シリル 化ラクチムエーテル/ベンズイミダゾールトリフルオロメタンスルホネート塩を 生成する。これを、Aoyamaの方法により、p-ニトロフェノール存在下で、THFま たはアセトニトリル中の3,5-ジ-Ｏ-トルイル-α-D-エリスロペントフラノシル（ fuanosyl）クロリド（Hoffer）と反応させ、保護化ヌクレオシドを生成し、これ をシリカクロマトグラフィーにより精製する。アシル基を、以下の２工程により 全て除去する。先ず、室温でヒドラジン/エタノールとヒドラジン分解し、 次いで、溶媒をエバポレートし、そして還流エタノール中で粗残渣を加熱してフ タロイル残基を完全に切断する。アミノベンズイミダゾールを、メタノール中で 4-（ジメトキシメチル）-モルホリン（Bredereckらの一般的な手順により4-ホル ミルモルホリンから調製）と反応させて保護し、アミジンを生成する。ベンズイ ミダゾールの残っている反応性部位を、実施例１の条件下で、ピバロイルクロリ ドとの反応により保護する。あるいは、最後のアシル化を、（ジメチルアミノ） ベンゾイルクロリドを用いて行い得る。非保護ベンズイミダゾールを、ピペリジ ン（10モル％）およびメタンスルホン酸（５モル％）の存在下で、メタノール中 で4-（ジメチルアミノ）ベンズアルデヒドと反応させて、代替アミノ保護基を形 成し得る。得られたイミンを、アミジンと同様にアシル化する。第一級ヒドロキ シル基を、実施例１のようにジメトキシトリチル基で保護する。 ２．図１３Ｃの塩基を含むサブユニット 3-アセトアミドフェノール（Aldrich Chemical Co.）をニトロ化し、2-ニトロ -5-アセトアミドフェノールを得る。水素およびパラジウム/炭素で還元し、そし てトリフルオロ酢酸無水物またはトリクロロ酢酸無水物と反応させて、2-トリハ ロアセトアミド誘導体を得る。これをニトロ化し、4-ニトロ種を得、そして簡単 な加安分解によりトリハロアセチル基を除去し、5-アセトアミド-2-アミノ-4-ニ トロフェノールを得る。 2,5-アンヒドロ-3,4,6-トリ-Ｏ-ベンゾイル-D-アロノチオアミド（Pickering ら）を、ヨウ化メチルおよび水素化ナトリウムを用いて処理し、対応するメチル チオイミデートを得る。あるいは、チオアミドを、ジクロロメタン中でジ-tert- ブチルジカルボネート（Aldrich）および4-ジメチルアミノピリジンと反応させ 、イミドを生成する。あるいは、イミドを、ジイソプロピルエチルアミンの存在 下で、ヨウ化メチルまたはメチルトリフレートで処理し、N-tert-ブトキシカル ボニルメチルチオイミデートを得る。これらのいずれもが、芳香族1,2-ジアミン またはオルトアミノフェノールと反応させて、デオキシリボシドのベンズイミダ ゾールまたはベンゾオキサゾール誘導体をそれぞれ生成することに適している。 アミノフェノールを、前の段落で得られた適切な活性化チオアミドと反応させ て、2-（トリ-Ｏ-ベンゾイル-β-デオキシリボシル）ベンゾオキサゾールを得る 。N-アセチルおよびＯ-ベンゾイル基を、加安分解またはヒドラジン分解により 除去し、そしてニトロ基を、水素およびパラジウム/炭素で還元する。芳香族ジ アミンを、還流メタノール中で臭化シアンと反応させ、そして、実施例３Ａ１に 記載のように保護され、そして実施例１に示したように第１級ヒドロキシルが保 護された、6-アミノ-2-（トリ-Ｏ-ベンゾイルーβ-デオキシリボシル）イミダゾ ［4,5-f］ベンゾオキサゾール誘導体を生成する。 Ｂ．リボースモイエティを含むサブユニット（図５Ｂ） １．図１３Ｂの塩基を含むサブュニット リボースヌクレオシドを、実施例３Ａ１でデオキシリボヌクレオシドについて 調製したように調製する。ただし、Ｏ-シリル化ラクタムを、臭化水銀またはト リフルオロメタンスルホン酸銀の存在下でMaebaらの手順のように、1-Ｏ-アセチ ル-2,3,5-トリ-Ｏ-ベンゾイル-D-リボフラノースをベンゼン中のHBrで処理する ことにより調製したリボシルブロミドと反応させることが異なる。 ２．図１３Ｃの塩基を含むサブユニット 実施例３Ａ２のように、2,5-アンヒドロ-3-デオキシ-4,6-ジ-Ｏ-トルオイル-D -リボ-ヘキサノチオアミド（Pickeringら）を、メチルチオイミデート、イミド 、またはN-tert-ブトキシカルボニルメチルチオイミデートに変換する。これら のいずれもが、芳香族1,2-ジアミンまたはオルトアミノフェノールと反応させて 、リボシドのベンズイミダゾールまたはベンゾオキサゾール誘導体をそれぞれ生 成することに適している。 実施例３Ａ２と同様の手順により、アミノフェノールを、前段で得られた活性 化チオアミドと反応させて、ベンゾオキサゾールを生成し、これを、実施例３Ａ ２の手順により、さらに保護化ヌクレオシドに変換する。 Ｃ．モルホリンモイエティを含むサブユニット（図６Ａ） １．図１３Ｂの塩基を含むサブユニット 実施例３Ａ１で得られたＯ-シリル化ラクタムを、テトラアセチルα-D-グルコ ピラノシルブロミド（Sigma）と（臭化水銀またはトリフルオロメタンスルホン 酸銀の存在下または非存在下で）反応させることにより、モルホリンヌクレオシ ドを調製する。グリコシドを、通常の方法でモルホリノヌクレオシドに変換する 。ただし、過ヨウ素酸ナトリウムを通常量の２倍を用いることが異なる。塩基保 護基のN-トリチル化（実施例２Ｃ）およびヒドラジン分解に続いて、塩基を実施 例３Ａ１のように再保護する。 あるいは、実施例３Ａ１で得られたベンジリックブロミドをβ-D-グルコピラ ノシルアミン（Tamuraら）と反応させて、グリコシルラクタムを直接得ることに よりモルホリノヌクレオシドを調製する。これを通常の方法によりモルホリノヌ クレオシドに変換する。ただし、酸化工程において過ヨウ素酸ナトリウムの量を ２倍用いることが異なる。塩基のN-トリチル化（実施例２Ｃ）およびヒドラジン 分解に続いて、実施例３Ａ１のように再保護する。 あるいは、実施例３Ａ１で得られた4-アセトアミド-2-メチル-5-ニトロ安息香 酸メチルを、実施例３Ａ１のように臭素化し、そしてβ-D-グルコピラノシルア ミンと反応させる。N-アセチルを、90％エタノール中の１〜10％NaOHを用いて除 去し、ニトロを、パラジウム/炭素および水素を用いて還元し、そしてアミノベ ンズイジダゾールを、還流下のエタノール中 で臭化シアンを用いる還元により形成する。アミノベンズイミダゾールを、実施 例３Ａ１のように保護する。 あるいは、実施例３Ｂ１で調製したリボシドを、実施例２Ｃの手順に従ってモ ルホリンを含むサブユニットに変換する。この手順を、アミノベンズイミダゾー ル由来のフタロイル基の脱アシル化の前に行う。モルホリン形成し、およびN-ト リチル種のような保護の後、フタロイル基を、実施例３Ａ１のように除去する。 モルホリン窒素を、N-トリチルのように、トリエチルアミンを含むアセトニト リル中で遊離アミンまたはトシレート塩とトリチルクロリドとを反応させること により、保護する。反応混合物を水中に注ぎ、そして固体生成物を濾過により単 離し、そしてシリカゲルクロマトグラフィーにより精製する。 ２．図１３Ｃの塩基を含むサブユニット Myersらにより記載された手順により、2,3,4,6-テトラ-Ｏ-アセチル-α-D-ガ ラクトピラノシルブロミドを、2,3,4,6-テトラ-Ｏ-アセチル-α-D-ガラクトピラ ノシルシアニドに変換し、そしてPickeringらの方法により関連するチオアミド に変換し、次いで、実施例３Ａ２のように活性化チオアミド誘導体に変換する。 これらは、l,2-ジアミンまたはオルトアミノフェノールと反応させて、ガラクト シドのベンズイミダゾールまたはベンゾオキサゾール誘導体をそれぞれ生成する ことに適している。同様の手順を用いて、他のヘキソースニトリ ルと開始し得る（Myersら）。 実施例３Ｂ２の同じ手順により、アミノフェノールを、上段得られた活性化チ オアミドと反応させ、ベンゾオキサゾールを生成する。このベンゾオキサゾール を、実施例３Ｂ２の手順により、さらにN-保護ガラクトシドに変換する。これを 、通常の手順により、モルホリンヌクレオシドに変換する。ただし、酸化工程に おいて、過ヨウ素酸塩を通常量の２倍用いることが異なる。N-トリチル基を、実 施例３Ｃ１の方法により導入する。 実施例４ モルホリノバックボーンモイエティを含む４員環高特異性サブユニットセットの 調製（図６Ａ） Ａ．Ｃ:Ｇ特異的サブユニット １．グアニン塩基を含むサブユニット（図１０Ａ） グアノシンを、実施例１の方法により、2-フェニルアセチル誘導体に変換する 。これを、実施例２Ｃの方法により、モルホリンヌクレオシドトシレート塩に変 換する。それを、トリエチルアミンを含むアセトニトリル中でトリフェニルメチ ルクロリドとの反応によりトリチル化し得る。反応混合物を水中に注ぎ、そして 生成物を濾過する。生成物を、アセトニトリルから再結晶により精製する。 ２．図２４Ｃの塩基を含むサブユニット 3-ブロモフェノールをニトロ化して、5-ブロモ-2-ニトロフェノールを得た。 次いで、ニトロ基を、ラネーニッケル（または硫化水素／ピリジン）で還元し、 そしてアミンをギ酸酢酸無水物でホルミル化した。これを再びニトロ化し、次い で、熱分解によりオキサゾールを形成した。置換されていないオキサゾール環を 形成する代替法は、加安分解によるホルムアミドの除去、および、アミノフェノ ールを、リンオキシクロリド/ジメチルホルムアミドから誘導したホルミル化剤 で処理することを包含する。ギ酸以外のアミドを、ニトロ化の間、このアミノ基 を保護するために用い得、そしてこれらの種を用いたオキサゾール合成は、置換 されたベンゾオキサゾール（benxoxazole）を生成する。例えば、トリフルオロ 酢酸無水物を用いて形成されるトリフルオロアセトアミドは、トリフルオロメチ ルベンゾオキサゾールを生成する。最終的に、ニトロ基を還元し、そして糖類と のカップリングの前に、2-（トリメチルシリル）エチルカルバメートとしてアミ ンを保護する。この生成物は、糖モイエティの導入のためのカギとなる中間体で ある。 用いたグリコシル化手順は、ビニルスズを芳香族ハライドとカップリングする ためのZimmermannおよびStilleの一般的な方法、および、Hanessianらの方法に よるピラノイドグリカールをグルコシル誘導体に変換する方法を手本とした。上 記の臭素（または適切な一般的な芳香族ハライド）を、テトラキス（トリフェニ ルホスフィン）パラジウム（O）の存在下で、パー シリル化、C-1スズ化ピラノイドグリカール（Hanessianら）と反応させた。エノ ールエーテルを、テトラヒドロフラン中でボラン-ジメチルスルフィド複合体で ヒドロホウ素化し、そして得られたボロン種を、塩基性過酸化水素を添加するこ とにより、アルコールに分解した。全てのシリル化アルコールおよびβ（トリメ チルシリル）エチルカルバメートを、フッ化物（flouride）イオンで脱保護した 。 この実施例では、アミノ基を、実施例１と同じくトリフルオロアセトアミドと して再び保護し得る。分子を酢酸中でニトロ化し、不安定なアミドを加安分解に より切断し、そしてニトロ基を硫化水素/ピリジンまたは塩化スズ（II）と臭化 シアンとで還元して、アミノベンズイミダゾールを調製した。実施例３Ａまたは 実施例４Ｃiiiの方法によるアミノベンズイミダゾールの保護に続いて、モルホ リンモイエティを実施例２Ｃのように構築した。ただし、酸化工程において、過 ヨウ素酸ナトリウムを２倍等量を用いることが異なる。 ３．図２４Ｄの塩基を含むサブユニット 2-ブロモ-4-メチルフェノールをニトロ化し、６-ニトロ種を生成した。ピリジ ン中の硫化水素での還元に続いて、アミノフェノールを臭化シアンで処理し、ア ミノベンゾオキサゾールを生成した。2-（トリメチルシリル）エチルカルバメー トへの変換に続いて、実施例４Ａiiのように、ピラノイドグリカールでカップリ ングすることにより、臭素を適切なグリコシ ルユニットに置き換え得る。連続したカップリングが完了し、分子を完全に脱シ リル化した後、アミノ基を、トリフルオロアセトアミドまたはトリクロロアセト アミドとして保護し、そして、分子をニトロ化して、４-ニトロ種を生成した。5 -メチル基を、通常の方法（Mulzerら）により、ジメチルホルムアミドジメチル アセタールとの反応により官能基化し、エナミンを得た。ニトロ基を、硫化水素 /ピリジンまたは水素およびPd/炭素を用いて還元し、インドールを得た。連続的 インドール形成を行う間に、アミノベンゾオキサゾール上の保護基を、全てまた は部分的に除去され得るので、任意のアミジン基を除去するための加安分解に続 いて、トリフルオロアセトアミドまたはトリクロロアセトアミドを、実施例１の ように再び導入した。さらに、インドールを、リンオキシクロリド/ジメチルホ ルムアミドとの反応により、官能基化した（Smith（1954））。得られたホルミ ルインドールを、ヒドロキシルアミンとの反応によりニトリルに変換し、オキシ ムを得た後、トリフルオロ酢酸無水物で処理した。グルコースを含むサブユニッ トを、実施例２Ｃの手順により、モルホリノサブユニットに変換し得る。ただし 、過ヨウ素酸ナトリウムを２倍当量用いることが異なる。 Ｂ．Ｔ:ＡまたはＵ:Ａ特異的サブユニット １．2,6-ジアミノプリン塩基を含むサブユニット（図１０Ｂ） 2,6-ジアミノプリンリボシドを、実施例１の方法により、 N2-フェニルアセチルN6-ベンゾイル誘導体に変換する。これを、実施例２Ｃの方 法により、モルホリンヌクレオシドに変換する。それを、実施例５Ａの手順によ りトリチル化する。 ２．図２６Ｄの塩基を含むサブユニット 2-ブロモ-4-メチルフェノールを、ニトロ化して6-ニトロ種を生成した。ピリ ジン中の硫化水素での還元に続いて、アミノフェノールを臭化シアンで処理し、 アミノベンゾオキサゾールを生成した。2-（トリメチルシリル）エチルカルバメ ートへの変換に続いて、実施例４Ａiiのように、ピラノイドグリカールとのカッ プリングにより、臭素を適切なグリコシルユニットに置き換え得る。連続的カッ プリングが完了し、分子を完全に脱シリル化後、アミノ基を、トリフルオロアセ トアミドまたはトリクロロアセトアミドとして保護し、そして、分子をニトロ化 して、4-ニトロ種を生成した。5-メチル基を、通常の方法（Mulzerら）により、 ジメチルホルムアミドジメチルアセタールとの反応により官能基化し、エナミン を得た。ニトロ基を、硫化水素/ピリジンまたは水素およびPd/炭素を用いて還元 し、インドールを得た。連続的インドール形成の間、アミノベンゾオキサゾール 上の保護基は、全てまたは部分的に除去され得るので、任意のアミジン基を除去 するための加安分解に続いて、トリフルオロアセトアミドまたはトリクロロアセ トアミドを、実施例１のように再び導入した。さらに、インドールを、リンオキ シクロリド/ジメチルホルムア ミドとの反応により、官能基化を行った（Smith（1954））。得られたホルミル インドールを、ヒドロキシルアミンとの反応によりニトリルに変換し、オキシム を得た後、トリフルオロ酢酸無水物で処理した。グルコースを含むサブユニット を、実施例２Ｃの手順により、モルホリノサブユニットに変換し得る。ただし、 過ヨウ素酸ナトリウムを２倍当量用いることが異なる。 ３．図26Ｅの塩基を含むサブユニット 2-ブロモ-4-クロロフェノールをニトロ化して、6-ニトロ種を得た。ピリジン 中の硫化水素を用いた還元に続いて、アミノフェノールを臭化シアンで処理し、 アミノベンゾオキサゾールを生成した。2-（トリメチルシリル）エチルカルバメ ートへの変換に続いて、実施例４Ａiiのように、ピラノイドグリカールとのカッ プリングにより、臭素を適切なグリコシルユニットに置き換え得る。連続的カッ プリングが完了し、分子を完全に脱シリル化した後、アミノ基を、実施例１のよ うに、トリフルオロアセトアミドまたはトリクロロアセトアミドとして保護し、 そして、塩素をトリフェニルスズハイドライドまたはトリブチルスズハイドライ ド、およびキシレン中のラジカル開始剤との処理により除去する。グルコースを を含むするサブユニットを、実施例２Ｃの手順によりモルホリノサブユニットに 変換し得る。ただし、過ヨウ素酸ナトリウムの２倍当量用いることが異なる。 Ｃ．Ａ:ＴまたはＡ:Ｕ-特異的サブユニット １．図20Ｂの塩基を含有するサブユニット 5-ヒドロキシ-2（3H）-ベンゾオキサゾロン（Ozdowska）を無水酢酸でアセチ ル化し、続いて、冷たい発煙硝酸で6-ニトロ-5-アセトキシ種にニトロ化する。 これをエタノールに溶解し、そして炭酸カリウムで処理し、続いて、パラジウム 上で水素化して、ニトロ基をアミノ基に還元する。分離したアミノフェノールを 、実施例３Ｃからの活性なチオアミド誘導体と反応させ、6-（2,3,4,6-テトラ- Ｏ-アセチル-ガラクトシル）-オキサゾロ［4,5-f］-2（3H）-ベンゾオキサゾロ ンを得る。塩化ホスホリルとの反応に続き、アンモノリシスにより、2-アミノベ ンゾオキサゾールを得る。これを、ベンゾイル、イソブチリル、アセチル、メト キシアセチル、フェノキシアセチルまたはトリクロロアセチルアミドを調製する 通常の手法により、N-保護を行う。 還元的アミノ化に使用するジアルデヒドを形成するために、酸化の工程で過ヨ ウ素酸ナトリウムの通常量を２倍にすること以外、実施例２Ｃの手法により、モ ルホリンヌクレオシドを上記のガラクトシル種から調製する。後の工程を通常の 方法により行う。このモルホリンを実施例５Ａと同じようにトリチル化し、そし てシリカゲルクロマトグラフィーにより精製する。 ２．図20Ｃの塩基を含有するサブユニット 2-メチル-4-ヒドロキシ安息香酸（King）を冷たい発煙硝酸でニトロ化し、5- ニトロ誘導体を得る。このニトロ誘導体を水素雰囲気にてパラジウム触媒を用い て5-アミノ種に還元する。この5-アミノ種を実施例３Ａｌの手法でメチルエステ ルに変換する。これを臭化シアンを用いて2-アミノベンゾオキサゾールに変換し 、そして環外アミノ基をアセチル、メトキシアセチル、トリクロロアセチル、イ ソブチリルまたはベンゾイルで実施例１の方法によりアセチル化する。この化合 物を実施例３Ａｌの方法でベンジリックブロミドに変換する。 モルホリンヌクレオシドを、まず実施例３Ｃのように、ベンジリックブロミド をβ-D-グルコピラノシルアミンと反応させることにより調製する。続いて、通 常量の２倍の過ヨウ素酸ナトリウムを用いたメタノール性過ヨウ素酸塩による開 裂、および還元的アミノ化により、モルホリンヌクレオシドを得る。これを実施 例５Ａの手法でトリチル化し、そしてシリカゲルクロマトグラフィーにより精製 する。 他方、ベンジリックブロミドをアンモニアと反応させ、ラクタムを生成する。 このラクタムは、トリメチルシリルトリフルオロメタンスルホネートまたはtert -ブチルジメチルシリルトリフルオロメタンスルホネートおよび2,6-ジ-tert-ブ チルピリジンでＯ-シリル化される。このＯ−シリル化されたラクタムを、テト ラアセチルα-D-グルコピラノシルブロミド（トリフルオロメタンスルホン酸銀 または臭化水銀の存在下 または非存在下で）と反応させ、続いて、アンモノリシスおよび実施例５Ｃ１の ような第一級アミノ基の再保護を行う。通常量の２倍の過ヨウ素酸ナトリウムを 使用すること以外、グリコシドを通常の方法でモルホリンヌクレオシドに変換す る。モルホリンを実施例５Ａのようにトリチル化し、そしてシリカゲルクロマト グラフィーにより精製する。 ３．図22Ｂの塩基を含有するサブユニット アルコールをジケテンと反応させることにより、アルキル3-オキソブタノエー トを調製した。これらを、エチルエステルに関する一般の手法（Touster、 1975 ）に基づき、対応するアルキル2-（ヒドロキシイミノ）-3-オキソブタノエート に変換した。これを還元し、そして対応するアルキルクロロホルメート（または 類似のアシル化種、例えば、アジドホルメートもしくはp-ニトロフェニルカーボ ネート）で、エチルエステルについて記載される一般の手法（Fernandez-Resaら 、1989）を用いてアシル化し、アルキル2-（アルキルオキシカルボニルアミノ） -3-オキソブタノエートを得た。これらの手法により、2-アミノ-3-オキソブタノ エートのカルバメート誘導体が得られ、ここで、エステルおよびカルバメートは 同じアルキル置換基を有する。このデザインによって、カルバメート基およびエ ステル基の開裂が同時に行われ得る。使用可能なアルキル基の例には、（水素化 分解によって除去される）ベンジル、（フッ化水素／ピリジンによって除去され る）2- （トリメチルシリル）エチル、（光分解によって除去される）o-ニトロベンジル が挙げられる。 ジメチルホルムアミド（10mL）中のベンジル2-（ベンジルオキシカルボニルア ミノ）-3-オキソブタノエート（3.6mmol）を、アルゴン下にて、DMF（20mL）中 の水素化ナトリウム（3.0mmol）の撹拌懸濁液に添加した。このアニオンの溶液 を、6-クロロ-9-（2',3',5'-トリ-Ｏ-ベンゾイル-D-リボフラノシル）プリン（3 mmol、Satodaらに記載のように調製した）で、HamamiciおよびMiyasakaの一般の 方法により処理した。この付加物（1mmol）を、酢酸（1ml）および５％Pd／カー ボン（200mg）を含有するエチルアセテート／エタノール（20mL）に溶解した。 この混合物を、45psi水素ガス下でパール装置（Paarapparatus）中で振とうした 。シーライトでの濾過の後、溶液をトルエンスルホン酸（1mmol）で処理し、そ して乾燥まで蒸発させた。生成物を、エチルアセテート／エタノールに溶解し、 そしてエーテル／ヘキサン混合物に注ぐことにより沈澱させた。この生成物はま た、2-アミノ-3-オキソブタノエートとクロロプリンとの他の付加物（ここで、 エステル／カルバメートは異なるアルキル基で保護されている）からも得られ、 その幾つかは前の段落に例示されている。例えば、2-（トリメチルシリル）エチ ル基が使用される場合、これは、フッ化水素および／またはフッ化テトラブチル アンモニウムを含有するピリジン中での反応により開裂され得る。後者の試薬は 、テトラヒドロフラン中でも充分使用され得る。 アミントシレート（1mmol）をジメチルホルムアミド（15mL）に溶解し、そし てジイソプロピルアミン（3mmol）および臭化シアン（1mmol）で処理した。溶媒 を蒸発させ、残留物をジクロロメタンに溶解し、そして重炭酸ナトリウム溶液、 水および食塩水で洗浄した。溶媒を除去した後、残留物を再びジメチルホルムア ミドに溶解し、そして1,8-ジアザビシクロ［5.4.0］ウンデク-7-エンで処理した 。溶媒を蒸発させ、残留物をジクロロメタンに溶解し、そしてpH＝７のリン酸緩 衝液、水で洗浄し、続いて、硫酸ナトリウムで乾燥した。蒸発により、イミダゾ ［5,1-i］プリンを生成し、これは、クロロホルム／メタノール混合物を用いた クロマトグラフィーで精製し得る。 イミダゾ［5,1-i］プリン（1mmol）をメタノール／ジメチルホルムアミド混合 物に溶解し、そして室温にて1,3-ジアミノプロパン（20mmol）で処理する。外界 温度で数時間の後、安息香酸エステルの除去を完全にするために、この混合物を 密封した容器中で加熱した。他方、ピリド［2,3-d:4,5-d'］ジイミダゾールへの 転位および加水分解は、ジメチルスルホキシド中にて2Mの水酸化ナトリウムで行 われ得る。 C-8オキソ基を、IkeharaおよびKanekoの一般の方法により導入した。この方法 は、ベンゾイミダゾールの臭素化に続き、アセテート水溶液による穏やかな加水 分解を包含する。このおよびその他の互変異性のアミノベンゾイミダゾールモイ エティは、実施例３Ａで行われたように、反応性アミノ窒素お よびベンゾイミダゾールタイプの窒素において保護され得る。他方、実施例１（ 塩化トリメチルシリルおよびピリジン）からのアルコールに対する一時的な保護 の手法を用いること、およびシリル化種を無水トリフルオロ酢酸と反応させて環 外アミノ基をアシル化することにより、トリフルオロアセトアミドを調製した。 同様の反応スキームにより、トリクロロアセトアミドが生じる。続いて、ベンゾ イミダゾールタイプの環窒素は、ピリジン中の塩化p-トルエンスルホニルとの反 応、すなわち、再び一時的な保護の手法を用いることにより保護され得る。後者 の反応では、２つの互変異性のスルホン化生成物が得られ得るが、それらの分離 は必須ではない。 非互変異性のアミノベンゾイミダゾールは、適切な時間でアミノベンゾイミダ ゾール部をメチル化することにより調製され得る。例えば、前の段で生成したこ れらの種をDMSOに溶解し、そしてヨウ化メチルおよび水酸化カリウムで処理し、 メチル化種を得る。この生成物はまた、オキソ基を導入する前にアミノベンゾイ ミダゾールモイエティをアルキル化することにより得られ得る。 QBからのリボース結合種は、実施例２Ｃの手法によりモルホリンヌクレオシド へ変換され得る。 最初に使用したクロロプリンをデオキシリボースに結合する場合、デオキシリ ボースモイエティを含有するサブユニットが調製され得る。従って、この6-クロ ロプリンデオキシリボシドのトリ-Ｏ-ベンゾイル誘導体（遊離のヒドロキシル種 のベンゾイル化により調製される；Robins and Basom（1978））は、アミノアセ トアセテートとの反応に使用される。 ４．図30Ｃの塩基を含有するサブユニット 3-ブロモフェノールをニトロ化して、5-ブロモ-2-ニトロフェノールを生成し た。これを硫化水素／ピリジンでアミノフェノールに還元し、そしてこのアミノ 基をトリフルオロアセトアミドとしてマスクした。第２のニトロ化により、4-ニ トロフェノール種が生成した。これをアンモニア処理してトリフルオロアセトア ミドを開裂した。これを臭化シアンと反応させ、アミノベンゾオキサゾールを生 成した。これは、トリフルオロアセトアミドとして保護される。ニトロ基を硫化 水素／ピリジンで還元し、そしてアミンをクロロギ酸エチルで処理して、カルバ メートを生じた。ニトロ化、ニトロ還元、および加熱により、縮合イミダゾロン を得た。トリフルオロアセトアミドのアンモノリシスにより、β（トリメチルシ リル）エチルカルバメートとして保護されるアミノベンゾオキザゾールを得た。 これを実施例４Ａiiのようにピラノイドグリカールとカップリングし、グルコー スモイエティを有するサブユニットを生成した。完全な脱シリル化に続き、アミ ノ基を実施例１のようにトリフルオロアセトアミドまたはトリクロロアセトアミ ドとして保護した。酸化の工程で２当量の過ヨウ素酸ナトリウムを使用すること 以外、実施例２Ｃの方法により、グルコシルサブユニットをモルホリンを含有す る サブユニットに変換し得る。 ５．図30Ｆの塩基を含有するサブユニット 3-ブロモフェノールをニトロ化して、5-ブロモ-2-ニトロフェノールを生成し た。これを硫化水素／ピリジンまたは塩化スズでアミノフェノールに還元した。 これを臭化シアンと反応させ、アミノベンゾオキサゾールを生成した。これは、 2-（トリメチルシリル）エチルカルバメートとして保護された。これを実施例４ Ａiiのようにピラノイドグリカールとカップリングし、グルコースモイエティを 有するサブユニットを生成した。分子の完全な脱シリル化に続き、アミノ基を実 施例１のようにトリフルオロアセトアミドまたはトリクロロアセトアミドとして 保護した。酸化の工程で２当量の過ヨウ素酸ナトリウムを使用すること以外、実 施例２Ｃの方法により、グルコシルサブユニットをモルホリンを含有するサブユ ニットに変換し得る。 Ｄ．Ｇ:Ｃ−特異的サブユニット １．図15Ｃの塩基を含有するサブユニット 5-クロロ-2,4-ジニトロフェノール（Carnelleyら）をクロロメチルベンジルエ ーテルおよびジイソプロピルエチルアミンで処理し、そしてこのエーテルをメチ ルシアノアセテート（またはマロノニトリル）のナトリウム塩で処理し、続いて 、酢酸中にて鉄で還元する。アセタールの開裂（水素／カーボ ン上のパラジウム）および実施例３Ｃからの活性化チオイミド誘導体との反応に より、ピロロベンゾオキサゾールを生じ、これは、アンモノリシスの後、ベンゾ イル、イソブチリル、アセチル、メトキシアセチル、フェノキシアセチルまたは トリクロロアセチルアミドを調製する実施例１の手法により、塩基保護され得る 。 ガラクトシドと通常量の２倍の過ヨウ素酸ナトリウムとの反応により、モルホ リンヌクレオシドを調製し、そして還元的アミノ化に使用するジアルデヒドを形 成する。後者の工程を通常の方法で行う。この分子を実施例５Ａの方法でトリチ ル化し、そしてシリカゲルクロマトグラフィーにより精製する。 ２．図15Ｂの塩基を含有するサブユニット 4-クロロ-2-メチル安息香酸（PfaltzおよびBauer Chemical Co．）をそのメチ ルエステルに変換し（HCl／メタノール）、そしてさらに実施例３Ｃの手法でベ ンジリックブロミドに変換する。２当量のアンモニアとの反応によりラクタムを 得る。これを発煙硝酸中でニトロ化して、4-ニトロ-5-クロロ-2-オキソイソイン ドールを得る。 上記のラクタムを実施例５Ｃ２のようにＯ-シリル化する。このラクタムエー テルをテトラアセチルα-D-グルコピラノシルブロミド（トリフルオロメタンス ルホン酸銀または臭化水銀の存在下または非存在下で）と反応させる。これをメ チル シアノアセテート（またはマロノニトリル）のナトリウム塩と反応させ、続いて 、酢酸中にて鉄で還元する。アンモノリシスによりアシル基を全て除去し、そし てこの塩基を、通常の手法により、ベンゾイル、イソブチリル、アセチル、メト キシアセチル、フェノキシアセチルまたはトリクロロアセチルアミドとして再保 護する。 他方、4-クロロ-2-メチル安息香酸を濃硫酸中にて発煙硝酸でニトロ化し、5- ニトロ誘導体を得る。実施例３Ａの方法によるエステル化の後、これをメチルシ アノアセテート（またはマロノニトリル）のナトリウム塩と反応させ、続いて、 酢酸中にて鉄で還元する。このアミンは、無水トリクロロ酢酸、無水メトキシ酢 酸、無水酢酸、塩化イソブチリルまたは塩化ベンゾイルとの反応により保護され る。これを実施例３Ｃの方法によりベンジリックブロミドに変換する。このベン ジリックブロミドを、β-D-グルコピラノシルアミンで処理することにより、ラ クタムグルコシドに変換する。 上記のグルコシドを、通常量の２倍の過ヨウ素酸ナトリウムを用いたメタノー ル性過ヨウ素酸塩と反応させ、還元的アミノ化に続き、モルホリノヌクレオシド を得る。これを実施例５Ａの方法でトリチル化し、そしてシリカゲルクロマトグ ラフィーにより精製する。 ３．図17Ｃの塩基を含有するサブユニット 5-ホルミル-2'-デオキシウリジン（BarwolffおよびLangen） をメタノールに溶解し、そしてCoreyらの一般的手法に基づき、シアン化ナトリ ウムおよび酢酸の存在下にて二酸化マンガンで処理し、メチルエステルを得る。 このエステルを、ジイソプロピルエチルアミンの存在下にてジクロロメタン中で tert-ブチルジメチルシリルトリフレートと反応させ、アルコールを保護する。 この複素環をBlschofbergerの方法（NaH、塩化トリイソプロピルベンゼンスルホ ニル、THF）で活性化する。この4-Ｏ-スルホン化複素環を、DMF中のジイソプロ ピルエチルアミンの存在下にて、ベンズヒドリルアラニンのトシラート塩（Abod erinら）で処理し、シトシン誘導体を得る。このシトシニルアラニン誘導体を、 PoiselおよびSchmidtの一般的手法（THF中の次亜塩素酸tert-ブチル、次いでTHF 中１当量のカリウムtert-ブトキシド）によりデヒドロアミノ酸に酸化する。生 成物を、熱THF中にて触媒量のカリウムtert-ブトキシドで処理し、ピリミドピリ ジンを得る。ベンズヒドリルエステルを、パラジウム／カーボン上で水素を用い る水素化分解により除去する。酸を、Shioiriらに従い、トリエチルアミンを含 有するベンジルアルコール（またはベンジルアルコール／ジオキサン）中にてジ フェニルホスホリルアジドで処理する。水素化分解によるカルバメートの開裂、 およびHF-ピリジンによるシリル基の除去の後、分子を、通常の方法により、ト リクロロアセトアミドまたはフェニルアセトアミドとしてN-保護する。 同様の方法で、BarwolffおよびLangenの手法による5-メチ ルウリジンから調製した5'-ホルミルウリジンを、対応するピリミドピリジンリ ボシドに変換する。このリボシドを通常の手法によりモルホリンヌクレオシドに 変換し、そしてN-トリチル誘導体として保護する。 ５．図18Bの塩基を含有するサブユニット イミダゾ［5,1-i］プリン（1mmol）を実施例４Ｃiiiのように調製し、メタノ ール／ジメチルホルムアミド混合物に溶解し、そして室温にて1,3-ジアミノプロ パン（20mmol）で処理した。外界温度で数時間の後、この混合物を密封した容器 中で加熱し、安息香酸エステルの除去を完全にした。他方、転位および加水分解 は、ジメチルスルホキシド中で2Mの水酸化ナトリウムで行われ得る。 本明細書中に開示される上記およびその他の互変異性のアミノベンゾイミダゾ ールモイエティは、実施例３Ａで行われたように、反応性アミノ窒素およびベン ゾイミダゾール窒素で保護され得る。他方、実施例１（塩化トリメチルシリルお よびピリジン）からのアルコールに対する一時的な保護の手法を用いること、お よびシリル化された種を無水トリフルオロ酢酸と反応させて環外アミノ基をアシ ル化することにより、トリフルオロアセトアミドを調製し得る。同様の反応スキ ームにより、トリクロロアセトアミドが生成する。続いて、ベンゾイミダゾール タイプの窒素は、ピリジン中の塩化p-トルエンスルホニルとの反応、すなわち、 再び一時的な保護の手 法を用いることにより保護され得る。後者の反応では、２つの互変異性のスルホ ン化生成物が得られ得るが、それらの分離は必須ではない。 上記のリボースは、実施例２Ｃの手法によりモルホリンヌクレオシドに変換さ れ得る。 最初に使用したクロロプリンがデオキシリボースを含有する場合、デオキシリ ボースモイエティを含有するサブユニットの調製を達成し得る。従って、この6- クロロプリンデオキシリボシドのトリ-Ｏ-ベンゾイル誘導体（RobinsおよびBaso mから得られる遊離のヒドロキシル種のベンゾイル化により調製した）は、アミ ノアセトアセテート誘導体とのカップリングに使用される。 この構造タイプの化合物を得る他の経路（ベンゾイミダゾール炭素に水素以外 の置換基の配置が可能である）は以下のとおりである。4,6-ジクロロ-5-ニトロ ピリミジンを、β-1-アミノ-2,3,4,6-テトラ-Ｏ-ピバロイル-D-ガラクトース（K unzおよびPfrengle）と反応させた。このモノ付加物をラネーニッケルおよび水 素ガスで5-アミノピリミジン種に還元した。これを、ピリジン中で対応する酸無 水物または酸塩化物、あるいは他の酸誘導体と反応させることによって、5-アシ ルアミノ種に変換した。アミドの熱分解により（30-200）、6-クロロ-8-置換-9- ガラクトシルプリンを得た。例えば、このアミンとジフルオロチオアセチルフル オリド（Martin）との反応により、チオアミド中間体を生成し、これは、速やか にジ フルオロメチルベンゾイミダゾールモイエティへ環化される。 次いで、これらの種をアルキル2-（アルキルオキシカルボニルアミノ）-3-オ キソブタノエートで処理し、そして上記のように進行させ、ガラクトシル置換シ リーズを調製し得る。ピバロイル基を、リボシルシリーズ中のベンゾイル基と同 じように、イミダゾ［5,1-i］プリンからピリド［2,3-d:4,5-d'］ジイミダゾー ルへの転位の工程で除去した。２当量の過ヨウ素酸ナトリウムを使用すること以 外、実施例２Ｃのように、最終のガラクトシル置換サブユニットからモルホリン サブユニットへの変換を行った。 他のグルコシルアミンを、ジクロロニトロピリミジンとの反応に使用し得る。 その例には、β-D-グルコシルアミンおよびβ-D-ガラクトシルアミンの両方のテ トラベンゾエート（Caballeroら）が挙げられる。 ５．図31Ｃの塩基を含有するサブユニット 4-クロロ-3-ニトロフェノールを臭素化して、6-ブロモ種を生成させ、そしてY ardleyおよびFletcherの方法によってジクロロメタン中でジメトキシメタンおよ びトシル酸（tosic acid）と反応させ、メトキシメチルエーテルを生成させた。 次に、このエーテルをエタノール中でエチルシアノアセテートのナトリウム塩で 処理し、そして生成物を酢酸中で鉄くずで還元して、アミノインドールエステル を得た。80％酢酸混合物となるように水を添加し、そして懸濁液を加熱した。鉄 の濾過お よび溶媒の除去後、アミノ基を実施例１の手順により2-（トリメチルシリル）エ チルカルバメートとして保護した（一時的な保護）。フェノールを硝酸／無水酢 酸でニトロ化し、ニトロ基を硫化水素／ピリジンで還元し、そしてオキサゾール を（実施例４Ａiiのようにして）形成させた。オキサゾール炭素上に組み込まれ 得る置換基の例は、水素、メチル基、ジフルオロメチル基、およびトリフルオロ メチル基である。臭化芳香族をピラノイド（pyranoid）グリカールとカップリン グさせ、グルコースモイエティを有するサブユニットを生成させた。分子の完全 な脱シリル化の後、アミノピロールを実施例１と同様にトリフルオロ−またはト リクロロアセタミドとして保護した。グルコシルサブユニットを、２当量の過ヨ ウ素酸ナトリウムを酸化工程で使用すること以外は、実施例２Ｃの方法により、 モルホリンを含有するサブユニットに変換し得る。 ６．図31 Dの塩基を含有するサブユニット 3-フルオロ-4-ニトロフェノールをYardleyおよびFletcherの方法によってジク ロロメタン中でジメトキシメタンおよびトシル酸で反応させ、メトキシメチルエ ーテルを生成させた。このエーテルをエタノール中でエチルシアノアセテートの ナトリウム塩で処理し、そして生成物を酢酸中で鉄くずで還元して、アミノイン ドールエステルを生成させた。80％酢酸混合物となるように水を添加し、そして 懸濁液を加熱する。鉄の 濾過および溶媒の除去後、アミノ基を実施例１の手順により2-（トリメチルシリ ル）エチルカルバメートとして保護した（一時的な保護）。フェノールを無水ト リフルオロメタンスルホン酸で反応させ、そしてトリフレートを実施例４Ａiiの 方法によりピラノイドグリカールとカップリングし、グルコースモイエティを有 するサブユニットを生成させた。分子の完全な脱シリル化に続いて、アミノピロ ールを実施例１のようにトリフルオローまたはトリクロロアセタミドとして保護 した。グリコシルサブユニットを、２当量の過ヨウ素酸ナトリウムを酸化工程で 使用すること以外は、実施例２Ｃの方法により、モルホリンを含有するサブユニ ットに変換し得る。 実施例５ N-カルボキシメチルモルホリノ-5'-アミノバックボーン（図６Ｃ）を含有する４ -メンバード（membered）高特異性サブユニットセットの調製 リボース、ガラクトース、またはグルコースモイエティを含有するサブユニッ トを実施例４と同じように調製し、そしてこれらのそれぞれの糖モイエティを、 実施例２Ｄに記載される方法によりN-カルボキシメチルモルホリノ-5'-トリチル 化アミンの形態に変換させる。 実施例６ 2'-Ｏ-メチルリボース（図５Ｂ）および2'-デオキシリボース （図５Ａ）を含有するサブユニットについての代表的なポリマーアセンブリ手順 保護された2'-デオキシリボシドを含有するサブユニットおよび保護された2'- Ｏ-メチルリボシドを含有するサブユニットを、Sakataumeらで与えられた方法に よってそれらの対応する3'-Ｈ-ホスホネート塩に変換し、そしてこのソース中で この方法によって固体支持体上で重合体化する。ポリマー鎖のアセンブリが完成 するとき、支持された分子を、ヨウ素または四塩化炭素いずれかの存在下でFroe hlerの方法のごとく一級アミンまたは二級アミンで処理する。ホスホルアミデー ト（phorphoramidate）連結ポリマーを支持体から除去し、そしてアンモノリシ スを含む通常の方法（Froehler）によって脱保護する。 実施例７ モルホリノを含有するサブユニットについての代表的な活性化手順 Ａ．モルホリノサブユニットの5'-ヒドロキシルの活性化 ジメチルアミノジクロロホスフェートを以下に従って調製する：0.2molのオキ シ塩化リン中で0.1molのジメチルアミン塩酸塩を含有する懸濁液を12時間還流し 、次いで蒸留する（沸点は0.5mmHgで36℃）。 実施例２Ｃと同様に調製したモルホリノを含有するサブユニットの5'ヒドロキ シルの活性化には、1mmolの5'ヒドロキ シルサブユニット（モルホリノ窒素上で塩基保護およびトリチル化されている） を20mlのジクロロメタン中に溶解することが必要である。この溶液に４mmolのN, N-ジエチルアニリンおよび1mmolの4-メトキシピリジン-Ｎ-オキシドを添加する 。溶解後、2mmolのジメチルアミノジクロロホスフェートを添加する。２時間後 、生成物を、10％アセトン／90％クロロホルムで展開されるシリカゲルクロマト グラフィにより単離する。同じ手順により（ジメチルアミノジクロロホスフェー トの代わりにエチルジクロロチオホスフェートを置換することを除いて）、同様 の有用性を有する活性化されたサブユニットが得られる。 Ｂ．モルホリノ含有サブユニットの5'-アミンの活性化 実施例２Ｃと同様に調製されるモルホリノ含有サブユニット（保護された形態 で、塩基対認識モイエティの環外アミノ基を有する）の5'ヒドロキシルを、以下 に従ってアミンに変換し得る。500mlのDMSOに、1.0molのピリジン（Pyr）、0.5m olのトリフルオロ酢酸（TFA）、および0.1molのモルホリノサブユニットを添加 する。混合物を溶解するまで撹拌し、次に0.5molのジイソプロピルカルボジイミ ド（DIC）またはジシクロヘキシルカルボジイミド（DCC）を添加する。２時間後 、反応混合物を８リットルの激しく撹拌された食塩水に添加し、これを30分間撹 拌して濾過する。固形物を簡単に乾燥し、１リットルの氷冷ヘキサンで洗浄し、 濾過し、そしてこの固形物を１リ ットルのメタノール中の0.2molのナトリウムシアノボロハイドライドに添加し、 10分間撹拌し、0.4molのベンゾトリアゾールまたはｐ-ニトロフェノールを添加 し、続いて、0.2molのメチルアミン（H₂O中40％）を添加し、そしてこの調製物 を室温で４時間撹拌する［注：ベンゾトリアゾールまたはp-ニトロフェノールは 反応混合物を緩衝し、還元的アルキル化のイミニウム工程におけるサブユニット の4'炭素でのラセミ化を防ぐ］。最後に、反応混合物を５リットルの水に注ぎ、 良好沈澱物形態になるまで撹拌し、そして固形物を回収し、そして乾燥する。次 にこの乾燥した生成物をDMF中に懸濁し、そして４当量のSO₃／ピリジン錯体を添 加する。数時間の期間にわたって、８当量のトリエチルアミンを撹拌しながら滴 下する。さらに２時間後、調製物を大容量の食塩水中にダンプ（dump）し、そし て固形物を濾過により回収し、そして乾燥させる。次に、このスルファミン酸調 製物をシリカゲルクロマトグラフィで精製する。 認識モイエティ上およびモルホリノ環の窒素上で保護された硫酸化したサブユ ニットのトリエチルアミン塩の10mmolを、10mlのジクロロメタン中に溶解し、次 に40mmolのピリジンを添加する。この溶液をドライアイスのベット上で15分間冷 却し、次に、溶液を激しく撹拌しながら、1.1mmolのホスゲン（トルエン中20％ ）をゆっくり添加する。添加後、溶液を室温まで戻し、次にNaHCO₃水溶液で洗浄 し、乾燥し、そしてクロロホルムおよびアセトンの混合物で溶出されるシリカゲ ルでク ロマトグラフし、所望のスルファモイルクロリドを得る。 Ｃ．環状モルホリノ窒素の活性化 本実施例は、5'酸素で保護され、かつモルホリノ環窒素で硫酸化したモルホリ ノサブユニットの調製を説明している。実施例２Ｃのようにして調製した（しか し、最後のトリチル化工程を行わない）モルホリノ含有サブユニットを、t-ブチ ルジメチルシリルクロリドにより5'ヒドロキシル上でシリル化する。次に、この 生成物を、ジメチルホルムアミド（DMF）中のSO₃／ピリジン錯体（過剰のピリジ ン）で処理し、環内モルホリノ窒素上にスルファミン酸を得る。 シリカをクロロホルム中の２%トリエチルアミンで最初にプレ溶出（pre-elute ）する場合、スルファミン酸の塩を、トリエチルアミン／メタノール／クロロホ ルム混合物を使用してシリカゲルでクロマトグラフし得ることが言及されるべき である。 モルホリノ窒素上のスルファミン酸をスルファモイルクロリドに変換し、そし て上記実施例７Ｂのようにして精製する。 Ｄ．モルホリノのN-カルボキシメチルの活性化 実施例２Ｄおよび２Ｅで調製されるようなカルボキシレート含有サブユニット を、以下に従い活性化させる。10mmolのサブユニットを、20mmolのp-ニトロフェ ノールおよび15mmolのジシクロヘキシルカルボジイミドを含有するDMF中に溶解 す る。１時間後、生成物を撹拌蒸発させ（rotovape）、次にアセトンおよびクロロ ホルムの混合物で展開されるシリカゲルクロマトグラフィにより精製する。 実施例８ モルホリノ含有サブユニット（図33）の代表的な固相ポリマーアセンブリ 本実施例は、活性化サブユニット（実施例７Ａおよび７Ｂと同様に調製される ）のアセンブリに対して一般的に適用可能な方法を記載し、ホスホロジアミデー ト連結、エチルチオホスホルアミデート連結、およびスルファメート連結した結 合ポリマーを得る。類似のスキーム（ここで、カップリング工程は、トリフルオ ロメタンスルホン酸銀の添加、およびジイソプロピルエタノールアミンの代わり のN,N-ジイソプロピル-2-メトキシエチルアミンの使用を包含する）は、実施例 ７Ｃのように調製したサブユニットのアセンブリに対して適切であり、スルファ メート連結ポリマーを得る。類似のスキーム（ここで、カップリング工程は、ジ クロロメタンの代わりにジメチルホルムアミド中で行われる）は、実施例７Ｄの ように活性化したサブユニットのアセンブリに対して適切であり、アミド連結ポ リマーを得る。 Ａ．リンカー １%ジビニルベンゼンで架橋したアミノメチルポリスチレン 樹脂（カタログ番号A1160、Sigma Chemical Co.から入手）（200〜400メッシュ 、１グラムあたりＮが1.1mMol）を、ジクロロメタン中に懸濁し、そして底部に フリット（frit）を有する１cm直径のカラムに移し、2.5mlの樹脂床体積（resin bedvolume）を与える。 １mMolのビス［2-（スクシンイミドオキシカルボニルオキシ）-エチル］スル ホン（Pierce Chemical Co.、Rockford.．Illinois,，USA）を、1mMolのN-トリ チル化ピペラジンを含有するジクロロメタン溶液に添加する。２時間後、反応混 合物をアセトン／クロロホルム混合物で展開されるシリカゲルでクロマトグラフ し、モノ活性化したβ-脱離開裂可能なリンカーを得る。 134μMolの上記リンカーを１mlのジクロロメタン中に溶解し、合成カラム中の 樹脂に添加し、そして樹脂懸濁液を30℃で３時間かき混ぜる。次に、1mMolのジ イソプロピルアミノエタノールおよび1mMolの無水酢酸を添加し、そして撹拌を1 0分間行い、続いて２mMolのベンジルメチルアミンを添加し、そして20分間撹拌 する。カラムを30mlジクロロメタンで洗浄する。トリチル基の放出に基づいて、 上述の手順は典型的には100〜110μmolのオーダーで結合リンカーを与える。 Ｂ．カップリングサイクル（脱トリチル化／カップリング／キャッピング） 以下に述べるカップリングサイクルを、サブユニットの所望の配列を有するポ リマーを得るのに適切な順序で、各サブ ユニットを加えるために使用する。 １．脱トリチル化 53mlのジクロロメタン、6mlのトリフルオロエタノール、 および１グラムのシアノ酢酸を含有する溶液を加える。この溶液が通過した後、 40mlのジクロロメタン、続いて4mMolのジイソプロピルアミノエタノールを含有 する２0mlのジクロロメタンでカラムを洗浄する。10mlのジクロロメタンでカラ ムを洗浄する。 ２．カップリング 120μlのジイソプロピルアミノエタノールを含有する１ml のジクロロメタンを、0.25mMolの活性化サブユニット（実施例７Ａまたは７Ｂの ように調製）に加え、そしてこれをカラムに加え、37℃で１時間かき混ぜる。カ ラムを30mlのジクロロメタンで洗浄する。注：過剰の未反応活性化サブユニット は、好都合には、４容積のヘキサンをこの溶出液に加え、濾過することにより簡 単に回収され得る。 ３．キャッピング １mMo1のジイソプロピルアミノエタノールおよび１mMolの 無水酢酸を含有する２mlのジクロロメタンをカラムに加えて、そして37℃で10分 間かき混ぜる。１mMolのベンジルメチルアミンを含有する10mlのジクロロメタン をカラムに加え、そして樹脂床を37℃で20分間かき混ぜる。カラムを30mlのジク ロロメタンで洗浄する。 Ｃ．支持体からの切断および脱保護 全てのサブユニットを上述のカップリング手順により加えた後、2.5mlのジエ チルマロネート、５mlの1,8-ジアザビシクロ［5.4.0］ウンデカ-7-エン、および 43mlのジクロロメタンからなる溶液でカラムを溶出することにより、完全な長さ のポリマーを支持体から切断する。次に、エーテルを加えることによってポリマ ーをこの溶出液から沈澱させる。 水溶性を高めるため、または標的の結合親和性を高めるため、あるいは特定の 細胞または組織タイプによる取り込みを促進するためのモイエティを加えること を所望するならば、ポリスチレン支持体からの切断により生成した二級脂肪族ア ミンは、ポリマー調製のこの工程で、このようなモイエティを結合するための部 位を提供する。 次に、ポリマー生成物をDMF中に溶解させ、そして等容積のconNH₄OHを加え、 この調製物をしっかりキャップし、そして37℃で18時間インキュベートする。次 に、調製物を減圧下で乾燥させて、ポリマー調製物（ここで、塩基対認識モイエ ティは脱保護されており、そしてポリマーの一端はトリチルモイエティであり、 そしてもう一方の端は、上に示されたように、アンモニア処理の前に誘導体化さ れ得る二級脂肪族アミンである）を得る。 実施例９ ポリマー精製方法 代表的には24サブユニット長のポリマーの調製物の全質量の50%より大きい末 端トリチルモイエティを有する完全な長さのポリマーを、キャップ欠失（failur e）配列から、クロマトグラフィックグレードのポリプロピレン（カタログ番号4 342、PolySciences Inc.から入手）のカラムで、アセトニトリル／水勾配で展開 される低圧クロマトグラフィにより分離し得る。このとき、溶出液を測光学的に 254nmでモニターする。精製を、代表的には以下の条件を使用して行う：ポリマ ーを水に懸濁し、この液をジメチルアミンでpH11に調節し、そして溶出溶媒もま たジメチルアミンでpH11に調節する。この系において、トリチル化した完全な長 さのポリマーは、トリチルを含有しないキャップ欠損配列よりもより遅く溶出す る。 完全な長さのポリマーを含有する画分を回収し、そして減圧下で十分乾燥させ る。次に、ポリマー調製物をトリフルオロエタノールに懸濁することにより脱ト リチル化し（25mlのTFE中に１ｇのポリマー）、そして1.5mlのメルカプト酢酸を 添加する。10分後、100mlのエーテルを加え、そして最終精製生成物を遠心分離 または濾過によって回収する。 実施例10 新規な酸化／閉環／還元方法（図39）によるポリマーアセンブリ Ａ．合成支持体 この合成で使用される固体支持物は、親水性であるべきだ が、近接した（vicinyl）複数のヒドロキシル基を含有するべきではない。「MAC RO-PREP 50 CM」（カタログ番号156-0070、Bio-Rad Laboratories、Richmond、C alif.、USA）の水性スラリーをフリットしたカラムに加え、5mlのパック床容積 （packedbed volume）とする（約１mMolのカルボキシレートを含有する）。この 合成支持体を100mlの0.1N HClで、次に50mlの水で洗浄する。50mlのDMF（ジメチ ルホルムアミド）をカラムに通し、そして排出する。5mMolのジイソプロピルカ ルボジイミドおよび5mMolのp-ニトロフェノールを含有する5mlのDMFを加え、そ して30℃で３時間撹拌しながらインキュベートする。カラムを100mlのDMFで洗浄 し、次に10mlのDMF中の20mMolのピペラジンを加え、そして15分間かき混ぜる。 カラムを50mlのDMFで洗浄し、そして排出する。 Ｂ．リンカーおよび第１サブユニットの添加 5mlのDMF中で、リボースの5'にカルバゼートモイエティを有する1mMolのリボ ース含有サブユニット（実施例２Ｆのように調製）に、3mMolのビス［2-（スク シンイミドオキシカルボニルオキシ）-エチル］スルホン（Pierce Chemical Co ．of Rockford、Illinois、USA）を加え、そして30℃で３時間インキュベートす る。反応混合物にエーテルを加え、そして沈澱物をを回収する。沈澱したリンカ ーサブユニットをエーテルで洗浄し、5mlのDMF中に再懸濁し、合成支持体に加え 、そして30℃で３時間撹拌しながらインキュベートする。支持体を50ml のDMFで洗浄し、次に100mlの水で洗浄する。 Ｃ．カップリングサイクル １．近接したヒドロキシル基の酸化 5mMolの過ヨウ素酸ナトリウムを10mlの 水に溶解し、カラムに加え、そして10分間かき混ぜる。カラムを50mlの水で洗浄 し、そして排出する。 ２．モルホリノ閉環／還元 2mMolのナトリウムシアノボロハイドライドを5ml の水に溶解し、トリメチル酢酸でpHを７と８との間に調節し、1.5mMolの第２の リボース含有5'-カルバゼートサブュニットを加え、そして合成支持体を含有す るカラムに加える。30℃で30分間撹拌しながらインキュベートする。ギ酸を加え 、pHを３と４との間に低下させ、そして30℃で10分間インキュベートする。カラ ムを100mlの水で洗浄する。 このカップリングサイクルを、全てのサブユニットを加えて所望の完全な長さ のポリマーを得るまで繰り返す。 ３．末端モイエティの付加 水溶性を高めるため、または標的の結合親和性を 高めるため、あるいは特定の細胞または組織タイプによる取り込みを促進するた めのモイエティを結合ポリマーに加えることを所望するならば、これは、この工 程で、ポリマーの末端サブユニットの近接したヒドロキシル基を酸化することに より、および上述のモルホリノ閉環／還元手順の際に一級脂肪族アミンを含有す る該モイエティを加 えることにより都合良く達成され得る。 ４．支持体からの切断 ポリマーの全てのサブユニット、および任意の所望の 付加基を上記カップリング手順により加えた後、50mlのDMFでカラムを洗浄し、 次に、2.5mlのジエチルマロネート、5mlの1,8-ジアザビシクロ［5.4.0］ウンデ カ-7-エン、および43mlのDMFからなる溶液でカラムを溶出させることにより、ポ リマーを支持体から切断する。次に、ポリマーを、エーテルを加えることにより この溶出液から沈澱させる。 完全な長さのポリマーを、クロマトグラフィックグレードのポリプロピレン（ カタログ番号4342、PolySciences Inc．から入手）のカラムで、アセトニトリル ／水勾配で展開される低圧クロマトグラフィにより精製し得る。このとき、溶出 液を測光学的に254nmでモニターする。精製は、ポリマーを水中に懸濁し、次に 溶液をジメチルアミンでpH11に調節し、そして溶出溶媒もまたジメチルアミンで pH11に調節する場合、一般的にさらに良好となる。 本発明を、特定のポリマーサブユニット、サブユニットを調製する方法、およ びポリマーアセンブリに関して述べてきたが、種々の変更および変化が、本発明 から逸脱することなくなされ得ることが理解される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ， ＣＡ，ＣＨ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，Ｈ Ｕ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＵ，ＭＧ，ＭＮ ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ， ＳＤ，ＳＥ，ＳＫ，ＵＡ，ＶＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．少なくとも２つの異なる方向を向いたワトソン／クリック塩基対を標的配 列の選択された位置に含む二重鎖ポリヌクレオチドの標的配列に配列特異的に結 合することに効果的なポリマーの組成物であって、以下の構造を有するサブユニ ットを含む特異的配列を含む、ポリマーの組成物： ここで、Ｙは、２または３原子長の、非荷電性サブユニット間結合基であり；Ｒ ’は、Ｈ、ＯＨ、またはＯ−アルキルであり；５’−メチレンは、５員環ではβ 立体化学的配向、そして６員環では均一な立体化学的配向を有し；Ｒ_iは、β立 体化学的配向を有し；そして該ポリマー中のＲ_i基の少なくとも約70％は、以下 の塩基対特異性基の２つまたはそれ以上から選択される： （a）Ｔ:ＡまたはＵ:Ａ配向塩基対においては、該Ｒ_iは、以下の環状骨格構造 および水素結合配置を有する平面性塩基からなる群より選択され、ここでＢはポ リマーバックボーンを示す： ここで、環上の位置＊には、アミンのような水素結合供与性基を有し得；そして 、Ｘは、モイエティであり、これに基づいて標的塩基対のピリミジンの５位で識 別的結合を供することに効果的なモイエティであり得； （b）Ｃ：Ｇ配向塩基対においては、該Ｒ_iは、以下の環状骨格構造および水素 結合配置を有する平面性塩基からなる群より選択され、ここでＢはポリマーバッ クボーンを示す： ここで、環上の位置＊は、カルボニル酸素のような水素結合受容性基を有し得； Ｘは、モイエティであり、これに基づいて標的塩基対のピリミジンの５位で識別 的結合を供することに効果的なモイエティであり得；そしてＺは、酸素またはイ オウであり； （c）Ｇ：Ｃ配向塩基対においては、該Ｒ_iは、以下の環状骨格構造および水素 結合配置を有する平面性塩基からなる群より 選択され、ここでＢはポリマーバックボーンを示す： ここで、環上の位置＊には、カルボニル酸素のような水素結合受容性基を有し得 ；そして、Ｘは、モイエティであり、これに基づいて標的塩基対のピリミジンの ５位で識別的結合を供することに効果的なモイエティであり得；そして （d）Ａ:ＴまたはＡ:Ｕ配向塩基対においては、該Ｒ_iは、以下の環状骨格構造 および水素結合配置を有する平面性塩基からなる群より選択され、ここでＢはポ リマーバックボーンを示す： ここで、環上の位置＊には、NH₂のような水素結合供与性基を有し得；そして、 Ｘは、モイエティであり、これに基づいて標的塩基対のピリミジンの５位で識別 的結合を供することに効果的なモイエティであり得る。 ２．次の構造を有するサブユニットを１つまたはそれ以上含む、請求項１に記 載のポリマーの組成物： ３．次の構造を有するサブユニットを１つまたはそれ以上含む、請求項１に記 載のポリマーの組成物： ４．次の構造を有するサブユニットを１つまたはそれ以上含む、請求項３に記 載のポリマーの組成物： ５．Ｂ形態DNA-DNA二重鎖核酸への配列特異的結合に用いるための請求項１に 記載のポリマーの組成物であって、前記Ｙ連結基が３原子長を有する、組成物。 ６．前記ポリマーのサブユニットの１つまたはそれ以上が次の構造： からなる群より選択される、請求項５に記載のポリマーの組成物。 ７．前記ポリマーのサブユニットの１つまたはそれ以上が次の構造： からなる群より選択される、請求項６に記載のポリマーの組成物。 ８．Ａ形態二重鎖核酸への配列特異的結合に用いるための請求項１に記載のポ リマーの組成物であって、前記Ｙ連結基が２原子長を有する、組成物。 ９．前記ポリマーのサブユニットの１つまたはそれ以上が次の構造： からなる群より選択される、請求項８に記載のポリマーの組成物。 １０．前記ポリマーのサブユニットの１つまたはそれ以上が次の構造： からなる群より選択される、請求項８に記載のポリマーの組成物。 １１．以下の構造からなる群： から選択される少なくとも１つのＲ_i構造を有する、請求項１に記載のポリマー 組成物。 １２．前記Ｇ:Ｃ配向塩基対に特異的なＲ_i構造の少なくとも１つが以下の塩基 ： からなる群より選択される、請求項１に記載のポリマー組成物。 １３．前記Ａ:ＴまたはＡ:Ｕ配向塩基対に特異的なＲ_i構造の少なくとも１つ が以下の塩基： からなる群より選択される、請求項１に記載のポリマー組成物。 １４．前記Ｃ:Ｇ配向塩基対に特異的なＲ_i構造の少なくとも１つが以下の塩基 ： からなる群より選択される、請求項１に記載のポリマー組成物。 １５．前記Ｔ:ＡまたはＵ:Ａ配向塩基対に特異的なＲ_i構造の少なくとも１つ が以下の塩基： からなる群より選択される、請求項１に記載のポリマー組成 物。 １６．前記ポリマー中のＲ_i基の約30％までが、前記標的配列中のＧ:Ｃ配向塩 基対に関連するポリマーサブユニットではシトシンであり、そして前記標的配列 中のＡ:ＴまたはＡ:Ｕ配向塩基対に関連するポリマーサブユニットではチミンま たはウラシルである、請求項１に記載のポリマーの組成物。 １７．前記ポリマーの水性媒体への溶解性を促進することに有効な付属モイエ ティを１つまたはそれ以上含む、請求項１に記載のポリマーの組成物。 １８．次のサブユニット構造： ここで、Ｒ_iは、２つまたはそれ以上の水素結合部位を有する平面環状構造であ る構造のうちの１つを有する、第一の遊離またはポリマー末端サブユニットを、 次のサブユニット構造： ここで、Ｚは、２原子または３原子の長さモイエティである構造のうちの１つを 有する、第二の遊離またはポリマー末端サブユニットとカップリングする方法で あって； 以下の工程： i）該第一のサブユニットを酸化してジアルデヒド中間体を生成する工程、 ii）第１級アミンをジアルデヒドとカップリングさせるのに効果的な条件下で 該ジアルデヒド中間体を該第二のサブユニットと接触させる工程、および iii）以下の構造： から選択される結合構造を生成させるのに効果的な還元剤を 添加する工程、 を包含する、方法。 １９．選択された標的塩基対配列を有する二重鎖核酸を液体試料から単離する 方法であって、以下の工程： i）ポリマー試薬と該試料とを接触させる工程であって、該ポリマー試薬が、 溶液からの該ポリマー試薬自身の単離を可能にする構造体と、該構造体に結合し た請求項１に記載のポリマーの組成物とを含み、該ポリマーの組成物が選択され た標的塩基対配列に該ポリマーの組成物が配列特異的結合に効果的な条件下で、 該選択された塩基対配列と配列特異的に結合することに効果的なサブユニット配 列を有する工程；および ii）該液体試料から該ポリマー試薬を分離する工程； を包含する、方法。 ２０．液体試料中の標的フラグメントの存在を検出するために用いる請求項１ ９に記載の方法であって、結合した二重鎖核酸の存在について分離されたポリマ ー試薬をテストする工程をさらに含む、方法。 ２１．前記ポリマー試薬が、結合したポリマーの組成物を有する固体支持体を 含み、そして前記テストが、二重鎖DNAに効果的にインターカレートする蛍光性 化合物を二重鎖核酸に 添加する工程を含む、請求項２０に記載の方法。 ２２．二重鎖ポリヌクレオチド中の標的配列に配列特異的に結合することに効 果的なポリマーの組成物を形成することに用いられるサブユニット組成物であっ て、以下の構造： のうちの１つを含む、組成物：ここで、Ｒ’はＨ、ＯＨ、またはＯ−アルキルで あり；５’−メチレンは、（a）、（c）および（d）サブユニット構造ではβ立 体化学的配向を有し、そして（b）サブユニット構造では均一の立体化学的配向 を有し；Ｘは、水素または保護基またはサブユニットを線状ポリマーにあらゆる 選択された順序で結合させることに適した連結基であり；Ｙは、該サブユニット を線状ポリマーにあらゆる選択された順序で結合させることに適した求核性また は求電子性の連結基であり；そしてＸとＹとはともに、サブユニットセットのう ちの２つのサブユニットが連結された場合、得られるサブユニット間の結合の長 さが２または３原子長でありかつ非荷電性であるような連結基であり；Ｚは、２ 原子または３原子 の長さのモイエティであり；そして、保護状態であり得かつβ立体化学的配向を 有するＲ_iは、以下の環状骨格構造および水素結合配置を有する平面性塩基から なる群より選択され、ここでＢは脂肪族バックボーンモイエティを示す： ここで、環上の位置＊には水素結合受容性基を有し得；そして、Ｘは、モイエテ ィであり、これに基づいて標的塩基対のピリミジンの５位で識別的結合を供する ことに効果的なモイ エティであり得；または、Ｒ_iは、以下の環状骨格構造および水素結合配置を有 する平面性塩基からなる群より選択され、ここでＢは脂肪族バックボーンモイエ ティを示す： ここで、環上の位置＊には水素結合供与性基を有し得；そして、Ｘは、モイエテ ィであり、これに基づいて標的塩基対のピリミジンの５位で識別的結合を供する ことに効果的なモイエティであり得る。 ２３．二重鎖ポリヌクレオチド中の標的配列に配列特異的に結合することに効 果的なポリマーの組成物を形成すること に用いられるサブユニット組成物であって、以下の構造のうちの１つを含む、組 成物： ここで、５’−メチレンは、（b）および（c）サブユニット構造ではβ立体化学 的配向を有し、そして（a）サブユニット構造では均一の立体化学的配向を有し ；Ｘは、水素または保護基、またはサブユニットを線状ポリマーにあらゆる選択 された順序で結合することに適した連結基であり；Ｙは、サブユニットを線状ポ リマーにあらゆる選択された順序で結合することに適した求核性または求電子性 の連結基であり；そしてＸとＹはともに、サブユニットセットのうちの２つのサ ブユニットが連結された場合、得られるサブユニット間の結合の長さが２または ３原子長でありかつ非荷電性であるような連結基であり；Ｚは、２原子または３ 原子の長さのモイエティであり；そして、保護状態であり得かつβ立体化学的配 向を有するＲ_iは、以下の環状骨格構造および水素結合配置を有する平面性塩基 からなる群より選択され、ここでＢは脂肪族バック ボーンモイエティを示し、＊で指示される原子は水素結合受容基ではなく、そし てＷは酸素またはイオウである： ２４．結合親和性に基づいて、（a）標的配列中の選択された位置に少なくと も１つのピリミジン−プリン塩基対を含む二重鎖核酸中の選択された標的配列で あって、該ピリミジン塩基の環の５位が水素である標的配列と、（b）選択され た位置の塩基対のピリミジンのピリミジン環の５位がメチル基であることの他は 同一の配列と、を識別し得るポリマーの組成物であって、次の繰り返し単位を有 するポリマーを含む、組成物： ここで、Ｂはバックボーンモイエティであり、そして少なくとも１つのＲ_iは以 下の構造： からなる群より選択され、ここで、Ｘは、ピリミジン環の５位にメチルを有する 塩基対に対する該Ｒ_iの結合を選択的に低減させることに効果的な大きさと形状 を有する。 ２５．少なくとも１つの前記Ｒ_iが、前記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（d）、（ e）および（f）からなる群より選択され、そして、前記Ｘがイオウ、塩素、臭素 、シアノ、アジド、ジフルオロメチルおよびトリフルオロメチルからなる群より 選択される、請求項２４に記載のポリマー。 ２６．少なくとも１つの前記Ｒ_iが、前記（g）および（h）からなる群より選 択され、そして、前記Ｘが酸素、フッ素およびメチルからなる群より選択される 、請求項２４に記載のポリマー。