CN104011210B - 神经退行性病症中的microRNA - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一系列的方法，用于：诊断受试者体内神经退行性病症(例如肌萎缩性侧索硬化和多发性硬化)，鉴定具有发生神经退行性病症风险的受试者，预测患有神经退行性病症的受试者体内的疾病进展速度，选择用于治疗神经退行性病症的受试者，选择受试者参与临床研究，和确定神经退行性病症治疗功效。这些方法包括确定来自受试者的单核细胞(例如CD14+CD16‑或CD14+CD16‑单核细胞)或脑脊液(CSF)中一种或多种microRNA和/或一种或多种炎症标志物的水平，并将该一种或多种microRNA的水平和/或一种或多种炎症标志物的水平与参考水平进行比较。还提供了用于治疗神经退行性病症的方法，包括向受试者施用至少一种可以降低或增加受试者单核细胞(例如CD14+CD16‑或CD14+CD16‑单核细胞)或脑脊液(CSF)中一种或多种microRNA和/或一种或多种炎症标志物的水平或活性的作用剂。

Description

神经退行性病症中的microRNA
相关申请交叉引用
本专利申请要求获得于2011年10月11日递交的在先美国临时专利申请No.61/545,968和于2012年2月21日递交的美国临时专利申请No.61/601,205的优先权，本文引用其每一个的全部内容作为参考。
发明背景
炎症与多种神经退行性病症(例如肌萎缩性侧索硬化(ALS)和多发性硬化)密切相关。例如，在人ALS患者和ALS动物模型中均发现炎症应答增加(McGreer et al.,MuscleNerve26:459-470,2002；Beers et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.105:15558-15563,2008；Banerjee et al.,PLoS ONE3:e2740,2008；Chiu et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.105:17913-17918,2008；Chiu et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.106:20960-20965,2009；Beers et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.103:16021-16026,2006；Henkel et al.,Ann.Neurol.55:221-235,2004；Meissner et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.107:13046-13050,2010)。已经有报道，在家族性ALS小鼠模型中，中枢神经系统的小胶质细胞和星形胶质细胞均被激活(Alexianu et al.,Neurology57:1282-1289,2001；Hall et al.,Glia23:249-256,1998)，并且在ALS小鼠模型中，自然杀伤细胞和外周T细胞在神经退行性病症演进期间浸润脊索(Chiu et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.105:17913-17918,2008)。
在外周神经系统中，外周运动神经元的退化是ALS患者和ALS动物模型中的一个早期而显著的病理特征，并且发生于巨噬细胞招募和激活之前(Chiu et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.106:20960-20965,2009)。在多发性硬化小鼠模型中，小鼠体内一种特殊的单核细胞子集合(Ly6CHi)参与组织损伤和疾病发病机理(King et al.,Blood113:3190-3197,2009)，并且这些单核细胞被CCL2招募到发炎的组织(Kim et al.,Immunity34:769-780,2011；Getts et al.,J.Exp.Med.205:2319-2337,2008)。
发明概要
本发明至少部分地基于如下的发现，即在来自患有神经退行性疾病的受试者的脑脊液(CSF)和CD14+CD16-和CD14+CD16+单核细胞中，特定microRNA和炎症标志物基因相比于来自健康受试者的CSF和CD14+CD16-和/或CD14+CD16+单核细胞中的这些microRNA和这些炎症标志物基因的表达水平升高或降低。表1-21中列出了被鉴定出在患有神经退行性病症的受试者的CSF和/或CD14+CD16-和/或CD14+CD16+单核细胞中升高或降低的特定microRNA和炎症标志物基因。本文中所述的炎症标记物基因在表20和21中列出。
本文提供了诊断受试者体内神经退行性病症(例如肌萎缩性侧索硬化或多发性硬化)的方法，其包括确定表1-21中任何一个或多个表中列出的一种或多种microRNA和/或一种或多种炎症标志物在来自受试者的单核细胞(例如CD14+CD16-和CD14+CD16+单核细胞)或CSF中的水平，并将该一种或多种microRNA和/或一种或多种炎症标志物的水平与该一种或多种microRNA和/或一种或多种炎症标志物的参考水平(例如阈值水平或在来自健康受试者的CSF或CD14+CD16-或CD14+CD16+单核细胞中存在的水平)进行比较。在这些方法中，一种或多种microRNA和/或一种或多种炎症标志物的水平相对于参考水平升高或降低，表明受试者患有神经退行性病症。
还提供了用于鉴定具有发生神经退行性病症(例如肌萎缩性侧索硬化或多发性硬化)风险的受试者的方法，包括确定表1-21中的任何一个或多个表中列出的一种或多种microRNA和/或一种或多种炎症标志物在来自受试者的单核细胞(例如CD14+CD16-和CD14+CD16+单核细胞(例如外周或血液来源的单核细胞))或CSF中的水平，并将该一种或多种microRNA和/或一种或多种炎症标志物的水平与该一种或多种microRNA和/或一种或多种炎症标志物的参考水平(例如阈值水平或在来自健康受试者的CSF或CD14+CD16-或CD14+CD16+单核细胞(例如外周或血液来源的单核细胞)中存在的水平)进行比较。在这些方法中，一种或多种microRNA和/或一种或多种炎症标志物的水平相对于参考水平升高或降低，表明受试者具有增加或降低的发生神经退行性病症的风险(例如相对于没有显示该一种或多种microRNA和/或一种或多种炎症标志物的水平相对参考水平升高或降低的人)。
还提供了用于预测患有神经退行性病症(例如肌萎缩性侧索硬化或多发性硬化)的受试者体内疾病进展速度的方法，其包括确定表1-21中的任何一个或多个表中列出的一种或多种microRNA和/或一种或多种炎症标志物在来自受试者的单核细胞(例如CD14+CD16-和CD14+CD16+单核细胞(例如外周或血液来源的单核细胞))或CSF中的水平，并将该一种或多种microRNA和/或一种或多种炎症标志物的水平与该一种或多种microRNA和/或一种或多种炎症标志物的参考水平(例如阈值水平或在来自健康受试者的CSF或CD14+CD16-或CD14+CD16+单核细胞(例如外周或血来源的单核细胞)中存在的水平)进行比较。在这些方法中，一种或多种microRNA和/或一种或多种炎症标志物的水平相对于参考水平升高或降低，表明受试者具有增加或降低的疾病进展速度(例如相对于没有显示该一种或多种microRNA和/或一种或多种炎症标志物的水平比参考水平升高或降低的人)。
还提供了选择受试者进行神经退行性病症(例如肌萎缩性侧索硬化或多发性硬化)治疗的方法，其包括确定表1-21中的任何一个或多个表中列出的一种或多种microRNA和/或一种或多种炎症标志物在来自受试者的单核细胞(例如CD14+CD16-和CD14+CD16+单核细胞(例如外周或血液来源的单核细胞))或CSF中的水平；将该一种或多种microRNA和/或一种或多种炎症标志物的水平与该一种或多种microRNA和/或一种或多种炎症标志物的参考水平(例如阈值水平或在来自健康受试者的CSF或CD14+CD16-或CD14+CD16+单核细胞(例如外周或血液来源的单核细胞)中存在的水平)进行比较；和选择与参考水平相比，一种或多种microRNA和/或一种或多种炎症标志物的水平升高或降低的受试者用于治疗神经退行性病症。
还提供了确定受试者体内神经退行性病症(例如肌萎缩性侧索硬化或多发性硬化)治疗的功效的方法，其包括在第一时间点确定表1-21中的任何一个或多个表中列出的一种或多种microRNA和/或一种或多种炎症标志物在来自受试者的单核细胞(例如CD14+CD16-和CD14+CD16+单核细胞(例如外周或血液来源的单核细胞))或CSF中的水平；在经过施用至少一剂治疗之后的第二时间点确定该一种或多种microRNA和/或一种或多种炎症标志物在来自受试者的单核细胞(例如CD14+CD16-和CD14+CD16+单核细胞(例如外周或血液来源的单核细胞))或CSF中的水平；和将所述第一时间点的一种或多种microRNA和/或一种或多种炎症标志物的水平与所述第二时间点的该一种或多种microRNA和/或一种或多种炎症标志物的水平进行比较。在这些方法中，在第二时间点回复到或接近健康受试者的水平(例如与如本文中所述的第一时间点的水平相比，第二时间点的一种或多种microRNA和/或一种或多种炎症标志物的水平降低或增加)，表明治疗在受试者体内有效(例如相对于患有相同神经退行性病症并接受相同治疗，但是在第二时间点没有显示回复到或接近健康受试者的水平(例如一种或多种microRNA和/或一种或多种炎症标志物的水平与本文中所述的参考值相比增加或降低)，或者显示的一种或多种microRNA和/或一种或多种炎症标志物的水平与本文中所述的参考值相比增加或降低不够显著)的受试者而言，治疗是有效的)。
还提供了选择参与临床研究的受试者的方法。这些方法包括确定表1-21中的任何一个或多个表中列出的一种或多种microRNA和/或一种或多种炎症标志物在来自受试者的单核细胞(例如CD14+CD16-和CD14+CD16+单核细胞(例如外周或血液来源的单核细胞))或CSF中的水平；将所述一种或多种microRNA和/或一种或多种炎症标志物的水平与该一种或多种microRNA和/或一种或多种炎症标志物的参考水平(例如阈值水平或在来自健康受试者的CSF或CD14+CD16-或CD14+CD16+单核细胞(例如外周或血液来源的单核细胞)中存在的水平)进行比较；并选择与参考水平相比一种或多种microRNA和/或一种或多种炎症标志物的水平升高或降低的受试者参与临床研究。
还提供了用于治疗受试者体内神经退行性病症(例如肌萎缩性侧索硬化或多发性硬化)的方法，其包括向受试者施用至少一种可以降低表1,3,5,7,9,11,12,14,16,或18中列出的一种或多种microRNA，或者表21中列出的一种或多种炎症标志物的表达或活性的作用剂(例如抑制性核酸，如antagomir)。还提供了用于治疗受试者体内神经退行性病症(例如肌萎缩性侧索硬化或多发性硬化)的方法，其包括向受试者施用至少一种可以增加表2,4,6,8,10,13,15,17,或19中列出的一种或多种microRNA和/或表20中列出的一种或多种炎症标志物的表达或活性的作用剂(例如抑制性核酸，如antagomir)。
还提供了用于治疗受试者体内神经退行性病症(例如ALS，如散发性ALS或家族性ALS，或多发性硬化)的方法，其包括向患有神经退行性病症(例如ALS，如散发性ALS或家族性ALS，或多发性硬化)的受试者施用至少一种抑制性核酸(例如siRNA、反义寡核苷酸、antagomir、和/或核酶)，所述抑制性核酸包含与hsa-miR-155中存在的连贯序列(例如在hsa-miR-155的前体或成熟形式中存在的连贯序列)互补的序列。
还提供了一种抑制性核酸，其包含与hsa-miR-155,hsa-miR-19b,hsa-miR-106b,hsa-miR-30b,hsa-miR-21,hsa-miR-142-5p,hsa-miR-27a,hsa-miR-16,hsa-miR-374a,hsa-miR-374b,hsa-miR-101,hsa-miR-340,hsa-miR-30e,hsa-miR-29c,hsa-miR-29a,hsa-miR-223,hsa-miR-26a,hsa-miR-26b,hsa-miR-24,hsa-miR-181a,hsa-miR-103,hsa-miR-532-3p,hsa-miR-27b,hsa-miR-99b,hsa-miR-146a,hsa-miR-150,hsa-miR-328,hsa-miR-15b,或hsa-miR-19a中存在的连贯序列，例如至少5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,或25个核苷酸的连贯序列互补的序列，用于治疗受试者体内的肌萎缩性侧索硬化(ALS)。优选地，该序列与hsa-miR-155中存在的至少7或8个核苷酸的连贯序列互补。
本文提供了用于诊断受试者体内肌萎缩性侧索硬化(ALS)的方法，其包括：确定来自受试者的CD14+CD16-单核细胞中选自下组的一种或多种microRNA的水平：hsa-miR-19b,hsa-miR-106b,hsa-miR-30b,hsa-miR-21,hsa-miR-142-5p,hsa-miR-27a,hsa-miR-16,hsa-miR-374a,hsa-miR-374b,hsa-miR-101,hsa-miR-340,hsa-miR-30e,hsa-miR-29c,hsa-miR-29a,hsa-miR-223,hsa-miR-26a,hsa-miR-26b,hsa-miR-24,hsa-miR-181a,hsa-miR-103,hsa-miR-155,hsa-miR-532-3p,hsa-miR-518f,hsa-miR-206,hsa-miR-204,hsa-miR-137,hsa-miR-453,hsa-miR-146a,hsa-miR-603,hsa-miR-1297,hsa-miR-192,hsa-miR-526a,hsa-miR-615-5p,hsa-miR-655,hsa-miR-450b-5p,hsa-miR-548b-3p,hsa-miR-584,hsa-miR-548f,hsa-miR-300,hsa-miR-302c,hsa-miR-328,hsa-miR-421,和hsa-miR-580；将来自该受试者的CD14+CD16-单核细胞中的所述至少一种microRNA的水平与该一种或多种microRNA的参考水平进行比较；其中与所述参考水平相比，来自该受试者的CD14+CD16-单核细胞中hsa-miR-19b,hsa-miR-106b,hsa-miR-30b,hsa-miR-21,hsa-miR-142-5p,hsa-miR-27a,hsa-miR-16,hsa-miR-374a,hsa-miR-374b,hsa-miR-101,hsa-miR-340,hsa-miR-30e,hsa-miR-29c,hsa-miR-29a,hsa-miR-223,hsa-miR-26a,hsa-miR-26b,hsa-miR-24,hsa-miR-181a,hsa-miR-103,hsa-miR-155,和hsa-miR-532-3p中的一种或多种的水平增加，和/或hsa-miR-518f,hsa-miR-206,hsa-miR-204,hsa-miR-137,hsa-miR-453,hsa-miR-146a,hsa-miR-603,hsa-miR-1297,hsa-miR-192,hsa-miR-526a,hsa-miR-615-5p,hsa-miR-655,hsa-miR-450b-5p,hsa-miR-548b-3p,hsa-miR-584,hsa-miR-548f,hsa-miR-300,hsa-miR-302c,hsa-miR-328,hsa-miR-421,和hsa-miR-580中的一种或多种的水平降低，表明受试者患有ALS。
还提供了诊断受试者体内肌萎缩性侧索硬化(ALS)的方法，其包括：确定来自受试者的脑脊液(CSF)中hsa-miR-27b,hsa-miR-99b,hsa-miR-146a,hsa-miR-150,hsa-miR-328,和hsa-miR-532-3p中的一种或多种的水平；和将该受试者的CSF中的hsa-miR-27b,hsa-miR-99b,hsa-miR-146a,hsa-miR-150,hsa-miR-328,和hsa-miR-532-3p中一种或多种的水平与hsa-miR-27b,hsa-miR-99b,hsa-miR-146a,hsa-miR-150,hsa-miR-328,和hsa-miR-532-3p中的所述一种或多种的参考水平进行比较，其中与所述参考水平相比，受试者的CSF中hsa-miR-27b,hsa-miR-99b,hsa-miR-146a,hsa-miR-150,hsa-miR-328,和hsa-miR-532-3p中的所述一种或多种的水平增加，表明受试者患有ALS。
还提供了诊断受试者体内家族性肌萎缩性侧索硬化(ALS)的方法，其包括：确定受试者的脑脊液(CSF)中hsa-miR-27b的水平及hsa-miR-99b,hsa-miR-146a,hsa-miR-150,hsa-miR-328和hsa-miR-532-3p中一种或多种的水平；和将所述受试者的CSF中hsa-miR-27b水平与hsa-miR-27b的参考水平进行比较，并将所述受试者的CSF中hsa-miR-99b,hsa-miR-146a,hsa-miR-150,hsa-miR-328,和hsa-miR-532-3p中一种或多种的水平与hsa-miR-99b,hsa-miR-146a,hsa-miR-150,hsa-miR-328,和hsa-miR-532-3p中一种或多种的参考水平进行比较；其中与hsa-miR-27b的参考水平相比受试者的CSF中hsa-miR-27b的水平增加，以及与hsa-miR-99b,hsa-miR-146a,hsa-miR-150,hsa-miR-328,和hsa-miR-532-3p中的一种或多种的参考水平相比受试者的CSF中hsa-miR-99b,hsa-miR-146a,hsa-miR-150,hsa-miR-328,和hsa-miR-532-3p中的一种或多种的水平降低或没有显著变化，表明受试者患有家族性ALS。
还提供了诊断受试者体内散发性肌萎缩性侧索硬化(ALS)的方法，其包括：确定受试者的脑脊液(CSF)中选自下组的两种或更多种microRNA的水平：hsa-miR-27b,hsa-miR-99b,hsa-miR-146a,hsa-miR-150,hsa-miR-328和hsa-miR-532-3p；和将所述受试者的CSF中两种或更多种microRNA的水平与该两种或更多种microRNA的参考水平进行比较；其中与所述参考水平相比受试者的CSF中两种或更多种microRNA的水平增加表明受试者患有散发性ALS。
还提供了鉴定具有发生肌萎缩性侧索硬化(ALS)风险的受试者的方法，其包括：确定来自受试者的CD14+CD16-单核细胞中一种或多种选自下组的microRNA的水平：hsa-miR-19b,hsa-miR-106b,hsa-miR-30b,hsa-miR-21,hsa-miR-142-5p,hsa-miR-27a,hsa-miR-16,hsa-miR-374a,hsa-miR-374b,hsa-miR-101,hsa-miR-340,hsa-miR-30e,hsa-miR-29c,hsa-miR-29a,hsa-miR-223,hsa-miR-26a,hsa-miR-26b,hsa-miR-24,hsa-miR-181a,hsa-miR-103,hsa-miR-155,hsa-miR-532-3p,hsa-miR-518f,hsa-miR-206,hsa-miR-204,hsa-miR-137,hsa-miR-453,hsa-miR-146a,hsa-miR-603,hsa-miR-1297,hsa-miR-192,hsa-miR-526a,hsa-miR-615-5p,hsa-miR-655,hsa-miR-450b-5p,hsa-miR-548b-3p,hsa-miR-584,hsa-miR-548f,hsa-miR-300,hsa-miR-302c,hsa-miR-328,hsa-miR-421,和hsa-miR-580；和将来自受试者的CD14+CD16-单核细胞中一种或多种microRNA的水平与该一种或多种microRNA的参考水平进行比较；其中与所述参考水平相比，来自受试者的CD14+CD16-单核细胞中hsa-miR-19b,hsa-miR-106b,hsa-miR-30b,hsa-miR-21,hsa-miR-142-5p,hsa-miR-27a,hsa-miR-16,hsa-miR-374a,hsa-miR-374b,hsa-miR-101,hsa-miR-340,hsa-miR-30e,hsa-miR-29c,hsa-miR-29a,hsa-miR-223,hsa-miR-26a,hsa-miR-26b,hsa-miR-24,hsa-miR-181a,hsa-miR-103,hsa-miR-155,和hsa-miR-532-3p中的一种或多种的水平增加，和/或hsa-miR-518f,hsa-miR-206,hsa-miR-204,hsa-miR-137,hsa-miR-453,hsa-miR-146a,hsa-miR-603,hsa-miR-1297,hsa-miR-192,hsa-miR-526a,hsa-miR-615-5p,hsa-miR-655,hsa-miR-450b-5p,hsa-miR-548b-3p,hsa-miR-584,hsa-miR-548f,hsa-miR-300,hsa-miR-302c,hsa-miR-328,hsa-miR-421,和hsa-miR-580中的一种或多种的水平降低，表明受试者具有升高的发生ALS的风险。
还提供了鉴定具有发生肌萎缩性侧索硬化(ALS)风险的受试者的方法，其包括：确定受试者的脑脊液(CSF)中hsa-miR-27b、hsa-miR-99b、hsa-miR-146a、hsa-miR-150、hsa-miR-328、和hsa-miR-532-3p中的一种或多种的水平；和将受试者的CSF中hsa-miR-27b、hsa-miR-99b、hsa-miR-146a、hsa-miR-150、hsa-miR-328、和hsa-miR-532-3p中的一种或多种的水平与hsa-miR-27b、hsa-miR-99b、hsa-miR-146a、hsa-miR-150、hsa-miR-328、和hsa-miR-532-3p中的一种或多种的参考水平进行比较；其中与所述参考水平相比，受试者的CSF中hsa-miR-27b、hsa-miR-99b、hsa-miR-146a、hsa-miR-150、hsa-miR-328、和hsa-miR-532-3p中的一种或多种的水平增加，表明受试者具有升高的发生ALS的风险。
还提供了鉴定具有发生家族性肌萎缩性侧索硬化(ALS)风险的受试者的方法，其包括：确定受试者的脑脊液(CSF)中hsa-miR-27b的水平和hsa-miR-99b、hsa-miR-146a、hsa-miR-150、hsa-miR-328、和hsa-miR-532-3p中的一种或多种的水平；和将受试者的CSF中hsa-miR-27b的水平与hsa-miR-27b的参考水平进行比较，并将受试者的CSF中hsa-miR-99b、hsa-miR-146a、hsa-miR-150、hsa-miR-328和hsa-miR-532-3p中的一种或多种的水平与hsa-miR-99b、hsa-miR-146a、hsa-miR-150、hsa-miR-328、和hsa-miR-532-3p中的一种或多种的参考水平进行比较；其中受试者的CSF中hsa-miR-27b的水平比hsa-miR-27b的参考水平增加，并且受试者的CSF中hsa-miR-99b、hsa-miR-146a、hsa-miR-150、hsa-miR-328、和hsa-miR-532-3p中的一种或多种的水平比hsa-miR-99b、hsa-miR-146a、hsa-miR-150、hsa-miR-328、和hsa-miR-532-3p中的一种或多种的参考水平降低或没有显著变化，表明受试者具有升高的发生家族性ALS的风险。
还提供了鉴定具有发生散发性肌萎缩性侧索硬化(ALS)风险的受试者的方法，其包括：确定受试者的脑脊液(CSF)中两种或更多种选自下组的microRNA的水平：hsa-miR-27b,hsa-miR-99b,hsa-miR-146a,hsa-miR-150,hsa-miR-328,和hsa-miR-532-3p；和将所述受试者的CSF中两种或更多种microRNA的水平与该两种或更多种microRNA的参考水平进行比较；其中受试者的CSF中两种或更多种microRNA的水平比参考水平增加，表明受试者具有升高的发生散发性ALS的风险。
还提供了预测患有肌萎缩性侧索硬化(ALS)的受试者体内疾病进展速度的方法，其包括：确定来自受试者的CD14+CD16-单核细胞中一种或多种选自下组的microRNA的水平：hsa-miR-19b,hsa-miR-106b,hsa-miR-30b,hsa-miR-21,hsa-miR-142-5p,hsa-miR-27a,hsa-miR-16,hsa-miR-374a,hsa-miR-374b,hsa-miR-101,hsa-miR-340,hsa-miR-30e,hsa-miR-29c,hsa-miR-29a,hsa-miR-223,hsa-miR-26a,hsa-miR-26b,hsa-miR-24,hsa-miR-181a,hsa-miR-103,hsa-miR-155,hsa-miR-532-3p,hsa-miR-518f,hsa-miR-206,hsa-miR-204,hsa-miR-137,hsa-miR-453,hsa-miR-146a,hsa-miR-603,hsa-miR-1297,hsa-miR-192,hsa-miR-526a,hsa-miR-615-5p,hsa-miR-655,hsa-miR-450b-5p,hsa-miR-548b-3p,hsa-miR-584,hsa-miR-548f,hsa-miR-300,hsa-miR-302c,hsa-miR-328,hsa-miR-421,hsa-miR-580,hsa-miR-15b,和hsa-miR-19a；和将来自受试者的CD14+CD16-单核细胞中所述一种或多种microRNA的水平与该一种或多种microRNA的参考水平进行比较；其中与所述参考水平相比，来自患者的CD14+CD16-单核细胞中hsa-miR-19b,hsa-miR-106b,hsa-miR-30b,hsa-miR-21,hsa-miR-142-5p,hsa-miR-27a,hsa-miR-16,hsa-miR-374a,hsa-miR-374b,hsa-miR-101,hsa-miR-340,hsa-miR-30e,hsa-miR-29c,hsa-miR-29a,hsa-miR-223,hsa-miR-26a,hsa-miR-26b,hsa-miR-24,hsa-miR-181a,hsa-miR-103,hsa-miR-155,hsa-miR-532-3p,hsa-miR-15b,和miR-19a中的一种或多种的水平增加，和/或hsa-miR-518f,hsa-miR-206,hsa-miR-204,hsa-miR-137,hsa-miR-453,hsa-miR-146a,hsa-miR-603,hsa-miR-1297,hsa-miR-192,hsa-miR-526a,hsa-miR-615-5p,hsa-miR-655,hsa-miR-450b-5p,hsa-miR-548b-3p,hsa-miR-584,hsa-miR-548f,hsa-miR-300,hsa-miR-302c,hsa-miR-328,hsa-miR-421,和hsa-miR-580中的一种或多种的水平降低，表明受试者将具有增加的疾病进展速度。
还提供了预测患有肌萎缩性侧索硬化(ALS)的患者体内疾病进展速度的方法，其包括：确定受试者的脑脊液(CSF)中hsa-miR-27b,hsa-miR-99b,hsa-miR-146a,hsa-miR-150,hsa-miR-328,和hsa-miR-532-3p中的一种或多种的水平；和将受试者的CSF中hsa-miR-27b,hsa-miR-99b,hsa-miR-146a,hsa-miR-150,hsa-miR-328,和hsa-miR-532-3p中的一种或多种的水平与hsa-miR-27b,hsa-miR-99b,hsa-miR-146a,hsa-miR-150,hsa-miR-328,和hsa-miR-532-3p中的一种或多种的参考水平进行比较，其中受试者的CSF中hsa-miR-27b,hsa-miR-99b,hsa-miR-146a,hsa-miR-150,hsa-miR-328,和hsa-miR-532-3p中的一种或多种的水平比参考水平增加表明受试者将具有增加的疾病进展速度。在一些实施方案中，疾病进展速度的增加是指ALS的一种或多种症状发生的速度增加，ALS的一种或多种症状的恶化增加，ALS的一种或多种症状的频率增加，ALS的一种或多种症状的持续时间增加，或受试者的寿命降低。
还提供了选择受试者以进行治疗肌萎缩性侧索硬化(ALS)的方法，其包括：确定来自受试者的CD14+CD16-单核细胞中一种或多种选自下组的microRNA的水平：hsa-miR-19b,hsa-miR-106b,hsa-miR-30b,hsa-miR-21,hsa-miR-142-5p,hsa-miR-27a,hsa-miR-16,hsa-miR-374a,hsa-miR-374b,hsa-miR-101,hsa-miR-340,hsa-miR-30e,hsa-miR-29c,hsa-miR-29a,hsa-miR-223,hsa-miR-26a,hsa-miR-26b,hsa-miR-24,hsa-miR-181a,hsa-miR-103,hsa-miR-155,hsa-miR-532-3p,hsa-miR-518f,hsa-miR-206,hsa-miR-204,hsa-miR-137,hsa-miR-453,hsa-miR-146a,hsa-miR-603,hsa-miR-1297,hsa-miR-192,hsa-miR-526a,hsa-miR-615-5p,hsa-miR-655,hsa-miR-450b-5p,hsa-miR-548b-3p,hsa-miR-584,hsa-miR-548f,hsa-miR-300,hsa-miR-302c,hsa-miR-328,hsa-miR-421,hsa-miR-580,hsa-miR-15b,和hsa-miR-19a；将所述来自受试者的CD14+CD16-单核细胞中一种或多种microRNA的水平与该一种或多种microRNA的参考水平进行比较；和选择与参考水平相比，CD14+CD16-单核细胞中hsa-miR-19b,hsa-miR-106b,hsa-miR-30b,hsa-miR-21,hsa-miR-142-5p,hsa-miR-27a,hsa-miR-16,hsa-miR-374a,hsa-miR-374b,hsa-miR-101,hsa-miR-340,hsa-miR-30e,hsa-miR-29c,hsa-miR-29a,hsa-miR-223,hsa-miR-26a,hsa-miR-26b,hsa-miR-24,hsa-miR-181a,hsa-miR-103,hsa-miR-155,hsa-miR-532-3p,hsa-miR-15b,和hsa-miR-19a的一种或多种的水平增加，和/或hsa-miR-518f,hsa-miR-206,hsa-miR-204,hsa-miR-137,hsa-miR-453,hsa-miR-146a,hsa-miR-603,hsa-miR-1297,hsa-miR-192,hsa-miR-526a,hsa-miR-615-5p,hsa-miR-655,hsa-miR-450b-5p,hsa-miR-548b-3p,hsa-miR-584,hsa-miR-548f,hsa-miR-300,hsa-miR-302c,hsa-miR-328,hsa-miR-421,和hsa-miR-580的一种或多种的水平降低的受试者以进行ALS治疗。
还提供了选择受试者以治疗治疗肌萎缩性侧索硬化(ALS)的方法，其包括：确定受试者的脑脊液(CSF)中hsa-miR-27b,hsa-miR-99b,hsa-miR-146a,hsa-miR-150,hsa-miR-328,和hsa-miR-532-3p的一种或多种的水平；和将受试者的CSF中hsa-miR-27b,hsa-miR-99b,hsa-miR-146a,hsa-miR-150,hsa-miR-328,和hsa-miR-532-3p中的一种或多种的水平与hsa-miR-27b,hsa-miR-99b,hsa-miR-146a,hsa-miR-150,hsa-miR-328,和hsa-miR-532-3p中的一种或多种的参考水平进行比较；和选择与参考水平相比，hsa-miR-27b,hsa-miR-99b,hsa-miR-146a,hsa-miR-150,hsa-miR-328,和hsa-miR-532-3p中的一种或多种的水平比参考水平增加的受试者用于治疗ALS。
还提供了选择受试者以进行家族性肌萎缩性侧索硬化(ALS)的治疗的方法，其包括：确定受试者的脑脊液(CSF)中hsa-miR-27b的水平和hsa-miR-99b,hsa-miR-146a,hsa-miR-150,hsa-miR-328,及hsa-miR-532-3p中的一种或多种的水平；和将受试者的CSF中hsa-miR-27b的水平与hsa-miR-27b的参考水平进行比较，并将受试者的CSF中hsa-miR-99b,hsa-miR-146a,hsa-miR-150,hsa-miR-328,和hsa-miR-532-3p中的一种或多种的水平与hsa-miR-99b,hsa-miR-146a,hsa-miR-150,hsa-miR-328,和hsa-miR-532-3p的参考水平进行比较；和选择CSF中hsa-miR-27b的水平比hsa-miR-27b的参考水平增加，并且CSF中hsa-miR-99b,hsa-miR-146a,hsa-miR-150,hsa-miR-328,和hsa-miR-532-3p中的一种或多种的水平比hsa-miR-99b,hsa-miR-146a,hsa-miR-150,hsa-miR-328,和hsa-miR-532-3p中的一种或多种的参考水平降低或没有显著变化的受试者用于治疗家族性ALS。
还提供了选择受试者用于治疗散发性肌萎缩性侧索硬化(ALS)的方法，其包括：确定受试者的脑脊液(CSF)中两种或更多种选自下组的microRNAs的水平：hsa-miR-27b,hsa-miR-99b,hsa-miR-146a,hsa-miR-150,hsa-miR-328,和hsa-miR-532-3p；将受试者的CSF中两种或更多种microRNA的水平与该两种或更多种microRNA的参考水平进行比较；和选择受试者的CSF中两种或更多种microRNA的水平比参考水平增加的受试者用于治疗散发性ALS。
在本文中所述方法的一些实施方案中，进一步对所选受试者施用ALS治疗。
还提供选择用于参与临床研究的受试者的方法，其包括：确定来自受试者的CD14+CD16-单核细胞中一种或多种选自下组的microRNA的水平：hsa-miR-19b,hsa-miR-106b,hsa-miR-30b,hsa-miR-21,hsa-miR-142-5p,hsa-miR-27a,hsa-miR-16,hsa-miR-374a,hsa-miR-374b,hsa-miR-101,hsa-miR-340,hsa-miR-30e,hsa-miR-29c,hsa-miR-29a,hsa-miR-223,hsa-miR-26a,hsa-miR-26b,hsa-miR-24,hsa-miR-181a,hsa-miR-103,hsa-miR-155,hsa-miR-532-3p,hsa-miR-518f,hsa-miR-206,hsa-miR-204,hsa-miR-137,hsa-miR-453,hsa-miR-146a,hsa-miR-603,hsa-miR-1297,hsa-miR-192,hsa-miR-526a,hsa-miR-615-5p,hsa-miR-655,hsa-miR-450b-5p,hsa-miR-548b-3p,hsa-miR-584,hsa-miR-548f,hsa-miR-300,hsa-miR-302c,hsa-miR-328,hsa-miR-421,hsa-miR-580,hsa-miR-15b,和hsa-miR-19a；将来自受试者的CD14+CD16-单核细胞中一种或多种microRNA的水平与该一种或多种microRNA的参考水平进行比较；和选择与参考水平相比，CD14+CD16-单核细胞中hsa-miR-19b,hsa-miR-106b,hsa-miR-30b,hsa-miR-21,hsa-miR-142-5p,hsa-miR-27a,hsa-miR-16,hsa-miR-374a,hsa-miR-374b,hsa-miR-101,hsa-miR-340,hsa-miR-30e,hsa-miR-29c,hsa-miR-29a,hsa-miR-223,hsa-miR-26a,hsa-miR-26b,hsa-miR-24,hsa-miR-181a,hsa-miR-103,hsa-miR-155,hsa-miR-532-3p,hsa-miR-15b,和hsa-miR-19a中的一种或多种的水平增加，和/或hsa-miR-518f,hsa-miR-206,hsa-miR-204,hsa-miR-137,hsa-miR-453,hsa-miR-146a,hsa-miR-603,hsa-miR-1297,hsa-miR-192,hsa-miR-526a,hsa-miR-615-5p,hsa-miR-655,hsa-miR-450b-5p,hsa-miR-548b-3p,hsa-miR-584,hsa-miR-548f,hsa-miR-300,hsa-miR-302c,hsa-miR-328,hsa-miR-421,和hsa-miR-580中的一种或多种的水平降低的受试者参与临床研究。
还提供了选择参与临床研究的受试者的方法，其包括：确定受试者的脑脊液(CSF)中一种或多种选自下组的microRNA的水平：hsa-miR-27b,hsa-miR-99b,hsa-miR-146a,hsa-miR-150,hsa-miR-328,和hsa-miR-532-3p；将受试者的CSF中一种或多种microRNA的水平与该一种或多种microRNA的参考水平进行比较；和选择CSF中一种或多种microRNA的水平比参考水平增加的受试者用于参与临床研究。
还提供了用于确定受试者体内肌萎缩性侧索硬化(ALS)治疗功效的方法，其包括：在第一时间点确定受试者CD14+CD16-单核细胞中一种或多种选自下组的microRNA的水平：hsa-miR-19b,hsa-miR-106b,hsa-miR-30b,hsa-miR-21,hsa-miR-142-5p,hsa-miR-27a,hsa-miR-16,hsa-miR-374a,hsa-miR-374b,hsa-miR-101,hsa-miR-340,hsa-miR-30e,hsa-miR-29c,hsa-miR-29a,hsa-miR-223,hsa-miR-26a,hsa-miR-26b,hsa-miR-24,hsa-miR-181a,hsa-miR-103,hsa-miR-155,hsa-miR-532-3p,hsa-miR-518f,hsa-miR-206,hsa-miR-204,hsa-miR-137,hsa-miR-453,hsa-miR-146a,hsa-miR-603,hsa-miR-1297,hsa-miR-192,hsa-miR-526a,hsa-miR-615-5p,hsa-miR-655,hsa-miR-450b-5p,hsa-miR-548b-3p,hsa-miR-584,hsa-miR-548f,hsa-miR-300,hsa-miR-302c,hsa-miR-328,hsa-miR-421,hsa-miR-580,hsa-miR-15b,和hsa-miR-19a；在施用至少一剂治疗后的第二时间点，确定受试者CD14+CD16-单核细胞中一种或多种microRNA的水平；和将一种或多种microRNA在第一时间点的水平与该一种或多种microRNA在第二时间点的水平进行比较；其中与第一时间点的水平相比，第二时间点时hsa-miR-19b,hsa-miR-106b,hsa-miR-30b,hsa-miR-21,hsa-miR-142-5p,hsa-miR-27a,hsa-miR-16,hsa-miR-374a,hsa-miR-374b,hsa-miR-101,hsa-miR-340,hsa-miR-30e,hsa-miR-29c,hsa-miR-29a,hsa-miR-223,hsa-miR-26a,hsa-miR-26b,hsa-miR-24,hsa-miR-181a,hsa-miR-103,hsa-miR-155,hsa-miR-532-3p,hsa-miR-15b,和hsa-miR-19a中的一种或多种的水平降低，和/或hsa-miR-518f,hsa-miR-206,hsa-miR-204,hsa-miR-137,hsa-miR-453,hsa-miR-146a,hsa-miR-603,hsa-miR-1297,hsa-miR-192,hsa-miR-526a,hsa-miR-615-5p,hsa-miR-655,hsa-miR-450b-5p,hsa-miR-548b-3p,hsa-miR-584,hsa-miR-548f,hsa-miR-300,hsa-miR-302c,hsa-miR-328,hsa-miR-421,和hsa-miR-580中的一种或多种的水平增加，表明治疗在受试者体内有效。
还提供了用于确定受试者体内肌萎缩性侧索硬化(ALS)治疗功效的方法，其包括：在第一时间点确定受试者的脑脊液中hsa-miR-27b,hsa-miR-99b,hsa-miR-146a,hsa-miR-150,hsa-miR-328,和hsa-miR-532-3p中的一种或多种的水平：在施用至少一剂治疗后的第二时间点确定受试者的CSF中hsa-miR-27b,hsa-miR-99b,hsa-miR-146a,hsa-miR-150,hsa-miR-328,和hsa-miR-532-3p中的一种或多种的水平；和将所述第一时间点的hsa-miR-27b,hsa-miR-99b,hsa-miR-146a,hsa-miR-150,hsa-miR-328,和hsa-miR-532-3p中的一种或多种的水平与所述第二时间点的hsa-miR-27b,hsa-miR-99b,hsa-miR-146a,hsa-miR-150,hsa-miR-328,和hsa-miR-532-3p中的一种或多种的水平进行比较；其中与第一时间点的水平相比，第二时间点时hsa-miR-27b,hsa-miR-99b,hsa-miR-146a,hsa-miR-150,hsa-miR-328,和hsa-miR-532-3p中的一种或多种的水平降低，表明治疗在受试者体内有效。
在本文中所述方法的一些实施方案中，参考水平是阈值水平。在一些实施方案中，参考水平是在对照受试者CD14+CD16-单核细胞(例如外周或血液来源的单核细胞)中发现的水平。在一些实施方案中，参考水平是在对照受试者的CSF中发现的水平。
在本文中所述方法的一些实施方案进一步包括从受试者获得含有CD14+CD16-单核细胞的生物样品(例如含有血液、血浆、血清或脑脊液的样品)。在一些实施方案中，该方法进一步包括从生物样品纯化CD14+CD16-单核细胞。
在本文中所述方法的一些实施方案进一步包括从受试者获得含有CSF的样品。
在本文中所述任何方法的一些实施方案中，microRNA或一种或多种microRNA是前体microRNA。在本文中所述任何方法的一些实施方案中，microRNA或一种或多种microRNA是成熟microRNA。
还提供了用于治疗受试者体内肌萎缩性侧索硬化(ALS)的方法，其包括向患有ALS的受试者施用至少一种antagomir，其包含与hsa-miR-19b,hsa-miR-106b,hsa-miR-30b,hsa-miR-21,hsa-miR-142-5p,hsa-miR-27a,hsa-miR-16,hsa-miR-374a,hsa-miR-374b,hsa-miR-101,hsa-miR-340,hsa-miR-30e,hsa-miR-29c,hsa-miR-29a,hsa-miR-223,hsa-miR-26a,hsa-miR-26b,hsa-miR-24,hsa-miR-181a,hsa-miR-103,hsa-miR-155,hsa-miR-532-3p,hsa-miR-27b,hsa-miR-99b,hsa-miR-146a,hsa-miR-150hsa-miR-328,has-miR-19a,hsa-miR-15b,hsa-miR-15b,和hsa-miR-19a中的任何一个中存在的连贯序列(例如至少5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,或25个核苷酸，优选地7或8个核苷酸的连贯序列)互补的序列。
还提供了用于治疗受试者体内肌萎缩性侧索硬化(ALS)的方法，其包括向患有ALS的受试者施用至少一种包含与hsa-miR-155中存在的连贯序列互补的序列的抑制性核酸。在一些实施方案中，所述至少一种抑制性核酸是antagomir(例如含有或具有SEQ ID NO:262的序列的antagomir)。在一些实施方案中，所述至少一种抑制性核酸是反义寡核苷酸。在一些实施方案中，所述至少一种抑制性核酸是核酶。在一些实施方案中，所述至少一种抑制性核酸被注射到受试者的脑脊液中(例如颅骨内注射或鞘内注射)。在一些实施方案中，所述至少一种抑制性核酸与一种或多种阳离子聚合物和/或阳离子脂质复合。在一些实施方案中，所述抑制性核酸用慢病毒载体递送。
还提供了使用至少一种antagomir制造用于治疗受试者体内肌萎缩性侧索硬化的药物的方法，其中所述antagomir包含与hsa-miR-155,hsa-miR-19b,hsa-miR-106b,hsa-miR-30b,hsa-miR-21,hsa-miR-142-5p,hsa-miR-27a,hsa-miR-16,hsa-miR-374a,hsa-miR-374b,hsa-miR-101,hsa-miR-340,hsa-miR-30e,hsa-miR-29c,hsa-miR-29a,hsa-miR-223,hsa-miR-26a,hsa-miR-26b,hsa-miR-24,hsa-miR-181a,hsa-miR-103,hsa-miR-532-3p,hsa-miR-27b,hsa-miR-99b,hsa-miR-146a,hsa-miR-150,hsa-miR-328,hsa-miR-15b,和hsa-miR-19a中的任何一个中存在的连贯序列互补的序列。本文中还提供了用于治疗受试者体内的肌萎缩性侧索硬化的antagomir，其中该antagomir包含与hsa-miR-155,hsa-miR-19b,hsa-miR-106b,hsa-miR-30b,hsa-miR-21,hsa-miR-142-5p,hsa-miR-27a,hsa-miR-16,hsa-miR-374a,hsa-miR-374b,hsa-miR-101,hsa-miR-340,hsa-miR-30e,hsa-miR-29c,hsa-miR-29a,hsa-miR-223,hsa-miR-26a,hsa-miR-26b,hsa-miR-24,hsa-miR-181a,hsa-miR-103,hsa-miR-532-3p,hsa-miR-27b,hsa-miR-99b,hsa-miR-146a,hsa-miR-150,hsa-miR-328,hsa-miR-15b,和hsa-miR-19a中的任何一个中存在的连贯序列互补的序列。
还提供了使用至少一种包含与hsa-miR-155中存在的连贯序列互补的序列的抑制性核酸(例如antagomir)制造用于治疗受试者体内肌萎缩性侧索硬化的药物的方法。本文中还提供了用于治疗受试者体内的肌萎缩性侧索硬化的抑制性核酸(例如antagomir)，其中该抑制性核酸包含与hsa-miR-155中存在的连贯序列互补的序列。
如本文中所使用的，“RNA”是指包含至少一个或多个核糖核苷酸残基的分子。“核糖核苷酸”是指在β-D-呋喃核糖部分的2'位具有一个羟基的核苷酸。如本文中所使用的，术语“RNA”包括双链RNA、单链RNA、分离的RNA，例如部分纯化的RNA、基本上纯的RNA、合成RNA、重组产生的RNA，以及通过添加、删除、取代和/或改变一个或多个核苷酸而不同于天然存在的RNA的改变的RNA。RNA分子的核苷酸还可以包含非常规核苷酸，例如非天然存在的核苷酸或化学合成的核苷酸或脱氧核苷酸。
“成熟的microRNA”(成熟miRNA)通常是指长度大约为21-23个核苷酸的单链RNA分子，其调节基因的表达。miRNA是由基因编码的，并从该基因的DNA转录，但是miRNA并不被翻译成蛋白，而是每条初始转录本(pri-miRNA)被加工成一个短茎-环结构(前体microRNA)，随后经过进一步加工成为有功能的成熟miRNA。成熟的miRNA分子与一种或多种信使RNA(mRNA)分子互补，它们的主要功能是下调基因表达。如全文中所使用的，术语“microRNA”或“miRNA”同时包括成熟microRNA和前体microRNA。
如本文中所使用的，术语“炎症标志物”是指表20和21中列出的任何蛋白质或mRNA。表20和21中列出的蛋白质或mRNA已被发现在炎症中发挥作用。用于检测炎症标志物水平或活性的方法是本领域已知的。在本文中也描述了其他的用于检测炎症标志物水平或活性的方法。
术语“参考水平”的意思是，表1-19中列出的microRNA之一或表20和21中列出的炎症标志物之一的对照水平。参考水平可以代表特定的microRNA或炎症标志物的阈值水平。参考水平还可以是来自健康受试者(例如不存在两种或更多种神经退行性病症症状的受试者，从未被诊断有神经退行性病症的受试者，和/或没有性神经退行性病症家族史的受试者)的脑脊液或单核细胞(例如CD14+CD16-或CD14+CD16+单核细胞(如外周或血液来源的单核细胞))中存在的特定microRNA或炎症标志物的水平。
术语“增加”的意思是，与参考水平或与相同受试者在更早或更晚时间点测得的水平相比，水平的可观察到的、可检测到的、或显著的增加。
术语“降低”的意思是，与参考水平或与相同受试者在更早或更晚时间点测得的水平相比，水平的可观察到的、可检测到的、或显著的降低。
术语“神经退行性病症”的意思是，以神经功能和结构的渐进性丧失和神经元死亡为特征的神经疾病。神经退行性病症的非限制性实例包括帕金森病(PD)、阿尔茨海默病(AD)、亨廷顿氏病(HD)、脑卒中、脑肿瘤、心肌缺血、老年性黄斑变性(AMD)、视网膜色素变性(RP)、肌萎缩性侧索硬化症(ALS，例如，家族性ALS和散发性ALS)，和多发性硬化症(MS)。本文中描述了用于诊断神经退行性病症的方法。用于诊断神经退行性病症的其它方法是本领域已知的。
术语“抑制性RNA”的意思是指如下的核酸分子，其含有与靶核酸(例如靶microRNA或靶炎症标志物，如表1,3,5,7,9,11,12,14,16,或18中列出的任何microRNA，或表21中列出的任何炎症标志物)互补的序列，介导靶核酸水平或活性(例如在CD14+CD16-或CD14+CD16+单核细胞中的活性)的降低。抑制性RNA的非限制实例包括干扰RNA,shRNA,siRNA,核酶,antagomir，和反义寡核苷酸。本文中描述了抑制性RNA的制作方法。制作抑制性RNA的其它方法是本领域已知的。
如本文中所使用的，“干扰RNA”是指任何能够(直接或间接地(即在转换时))通过介导RNA干扰来抑制或下调基因表达的任何双链或单链RNA序列。干扰RNA包括，但不仅限于，小干扰RNA(“siRNA”)和小发夹RNA(“shRNA”)。“RNA干扰”是指对序列相容(sequence-compatible)的信使RNA转录本的选择性降解。
如本文中所使用的，“shRNA”(小发夹RNA)是指包含反义区、环区和有义区的RNA分子，其中有义区具有互补核苷酸，互补核苷酸与反义区进行碱基配对从而形成双链体茎(duplex stem)。在经过转录后加工之后，小发夹RNA通过由Dicer酶介导的剪切事件被转换成小干扰RNA，Dicer酶是RNA酶家族III的一个成员。
如本文中所使用的，“小干扰RNA”或“siRNA”是指任何能够通过以序列特异性的方式介导RNA干扰，从而抑制或下调基因表达的小RNA分子。小RNA的长度可以是，例如，大约18-21个核苷酸。
如本文中所使用的，“antagomir”是指与特定microRNA靶标具有互补性的小合成RNA，其任选地在剪切位点具有错配或者具有一个或多个碱基修饰，以抑制剪切。
如本文中所使用的，词语“转录后加工”是指在转录后发生的mRNA加工，其是由例如Dicer和/或Drosha酶介导的。
词语“发生疾病的风险”是指与对照受试者或群体(例如健康受试者或群体)相比，受试者在未来发生神经退行性病症的相对盖然性。本文中提供了用于确定受试者在未来发生神经退行性病症的风险的方法，其包括确定表1-19所列一种或多种microRNA的水平和/或表20-21所列一种或多种炎症标志物的水平。
词语“疾病进展速度”的意思是指如下中的一种或多种：受试者体内神经退行性病症症状发病的速度，受试者体内神经退行性病症症状强度增加(恶化)的速度，受试者体内神经退行性病症一种或多种症状的频率，受试者体内神经退行性病症的一种或多种症状的持续时间，或者受试者的寿命。例如，疾病进展速度增加可以包括如下一种或多种：受试者体内神经退行性病症症状发病的速度增加，受试者体内神经退行性病症一种或多种症状的频率增加，受试者体内神经退行性病症的一种或多种症状的持续时间增加，或者受试者的寿命减少。本文中提供了用于预测患有神经退行性病症的受试者体内疾病进展速度的方法。
术语“纯化”的意思是将物质从其自然环境部分分离(例如部分除去污染性生物分子或细胞)。例如，单核细胞(例如CD14+CD16-或CD14+CD16+单核细胞)可以从外周血样品中存在的其它细胞类型中被纯化出来(例如使用荧光辅助细胞分选)。
术语“治疗”包括降低受试者体内症状的数量或降低疾病(例如神经退行性病症)的一种或多种症状的严重程度、持续时间或频率。术语治疗还可以包括降低受试者发生神经退行性病症的风险，延迟受试者体内神经退行性病症症状的出现，或增加患有神经退行性病症的患者的寿命。
术语“阳离子聚合物”的意思是如下的聚合物材料，其在生理pH(例如大约6.5-8.0的pH)下带有正电荷，并能够将核酸缩合为纳米颗粒。阳离子聚合物的非限制实例包括多聚-L-赖氨酸和聚(乙烯亚胺)。阳离子聚合物的其它实例是本领域已知的。
术语“阳离子脂质”的意思是如下的脂质，其在生理pH(例如大约6.5-8.0的pH)下带有至少一个正电荷，并能够与核酸形成复合物。阳离子脂质的非限制实例包括1,2-二油酰氧丙基-N,N,N-三甲基溴化铵(1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium propone(DOTAP))、N-甲基-4-(二油酰)甲基吡啶(N-methyl-4-(dioleyl)methylpyridinium)、和3β-[N-N’,N’-二甲基氨基乙基)-氨基甲酰基]胆固醇(3β-[N-(N’,N’-dimethylaminoethane)-carbamoyl]cholesterol)。阳离子脂质的其它实例是本领域已知的，并有市售(例如LipofectamineTM2000；Life Technologies Corporation,Carlsbad,CA)。
本公开全文中出现的其它定义。除非另外指出，否则本文中所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员所公知的相同的意思。本文中描述了用于在本发明中使用的方法和材料；其它本领域已知的合适的方法和材料也可以使用。这些材料、方法和实例仅作为举例，并不意图具有限制意义。本文引用本文中所提到的所有公开、专利申请、专利、序列、数据库列表和其它参考文献的全部内容作为参考。当发生矛盾时，以本专利说明书，包括定义，为准。
通过下面的详细说明书和附图以及权利要求，本发明的其它特征和优点将不言自明。
附图简述
图1A是火山图(volcano plot)，显示与来自非转基因同窝小鼠的CD39+小胶质细胞中microRNA的表达相比，SODG93A小鼠的CD39+小胶质细胞中microRNA的表达在症状出现前(60天)时间点(“症状发生前”)、在症状出现时(“发病”)和在疾病的末期(“终末期”)显著失调。x轴代表表达的变化(基于ddCT值的log2-倍数变化)，y轴显示了对数发生率(log odds)的变化的统计学显著性。
图1B是维恩图(Venn diagram)，显示与来自非转基因同窝小鼠的CD39+小胶质细胞中microRNA的表达相比，SODG93A小鼠CD39+小胶质细胞中在所有疾病阶段均显著失调的microRNA。数字代表每个疾病阶段发生显著失调的microRNA。
图1C是与来自非转基因同窝小鼠的CD39+小胶质细胞中的microRNA的表达相比，SODG93A小鼠CD39+小胶质细胞中显著失调的microRNA的汇总。这些数据经过了单重TaqManPCR的验证。
图2A是火山图，显示与来自非转基因同窝小鼠的Ly6CHi单核细胞中的microRNA的表达相比，SODG93A小鼠Ly6CHi中的单核细胞中在症状出现前(60天)时间点(“症状发生前”)、在症状出现时(“发病”)和在疾病末期(“终末期”)显著失调的microRNA。x轴代表表达的变化(基于ddCT值的log2-倍数变化)，y轴显示了对数发生率变化的统计学显著性。
图2B是维恩图，显示与来自非转基因同窝小鼠的Ly6CHi单核细胞中的microRNA的表达相比，在SODG93A小鼠Ly6CHi单核细胞中在所有疾病阶段(症状发生前、发病、疾病终末期)均显著失调的microRNA。数字代表每个疾病阶段发生显著失调的microRNA。
图2C是与来自非转基因同窝小鼠的Ly6C高单核细胞中的microRNA的表达相比，在SODG93A小鼠的Ly6CHi单核细胞中显著失调的microRNA的汇总。这些数据经过了单重TaqManPCR的确认。
图3A是火山图，显示与来自非转基因同窝小鼠的Ly6C低单核细胞中的microRNA的表达相比，SODG93A小鼠Ly6C低单核细胞中在症状出现前(60天)时间点(症状前)、在症状出现时(“发病”)和在疾病末期(“终末期”)显著失调的microRNA。x轴代表表达变化(基于ddCT值的log2-倍数变化)，y轴显示了对数发生率变化的统计学显著性。
图3B是维恩图，显示与非转基因同窝小鼠的Ly6C低单核细胞中的microRNA的表达相比，在SODG93A小鼠的Ly6C低单核细胞中在所有疾病阶段均显著失调的microRNA。数字代表每个疾病阶段发生显著失调的microRNA。
图3C是与来自非转基因同窝小鼠的Ly6C低单核细胞中的microRNA的表达相比，在SODG93A小鼠的Ly6C低单核细胞中发生显著失调的microRNA的汇总。这些数据经过了单重TaqMan PCR的确认。
图4是显示在SOD1小鼠所有疾病阶段的Ly6CHi单核细胞中32个发生表达失调(与非转基因同窝小鼠对照相比)的microRNA的Ingenuity通路分析(Ingenuity pathwayanalysis)结果的曲线图和表格。
图5是热图(heatmap)，显示了在散发性ALS(8个受试者)和复发缓解型多发性硬化(8个受试者)中，对血液来源的CD14+CD16-单核细胞中的664种microRNA的nCounter表达概貌分析(nCounter expression profiling)，与这些microRNA在健康对照(8个受试者)的CD14+CD16-单核细胞中的表达进行比较。热图显示了采用Dunnett事后检验(Dunnett’spost hoc test)的方差分析(ANOVA)的结果(P<0.01)。标明了来自ALS受试者的CD14+CD16-单核细胞中被上调或下调(相比于这些microRNA在来自健康对照的CD14+CD16-单核细胞中的表达)的microRNA。热图的每一行代表一个基因，每一列代表一个个体。
图6是热图，显示了在散发性ALS(8个受试者)和复发缓解型多发性硬化(8个受试者)中对血液来源的CD14+CD16-单核细胞中664种microRNA的nCounter表达概貌分析，与这些microRNA在来自健康对照(8个受试者)的CD14+CD16-单核细胞中的表达进行比较。该热图显示了采用Dunnett事后检验(Dunnett’s post hoc test)的ANOVA分析结果(P<0.01)。标明了MS受试者的CD14+CD16-单核细胞中被上调或下调(相比于这些microRNA在健康对照的CD14+CD16-单核细胞中的表达)的microRNA。热图的每一行代表一个基因，每一列代表一个个体。
图7A是维恩图，显示与健康对照的CD14+CD16-单核细胞中microRNA的表达相比，来自ALS和MS受试者的CD14+CD16-单核细胞中发生独特或相似的失调(上调或下调)的microRNA。
图7B是火山图，显示与来自健康对照的CD14+CD16-单核细胞中microRNA的表达相比，在来自ALS受试者的CD14+CD16-单核细胞中显著失调的microRNA。
图7C是火山图，显示与来自健康对照的CD14+CD16-单核细胞中microRNA的表达相比，来自MS受试者的CD14+CD16-单核细胞中发生显著失调的microRNA。
图8是与来自健康对照的CD14+CD16-单核细胞中microRNA的表达相比，在来自ALS和MS受试者的CD14+CD16-单核细胞中发生显著失调的microRNA的汇总。条形显示了来自ALS和MS受试者的CD14+CD16-单核细胞中失调的microRNA相比于来自健康对照的CD14+CD16-单核细胞中microRNA的表达的相对表达。
图9是一组6个图，显示了来自健康受试者(8个受试者)和患有ALS的受试者(11个受试者)的CD14+CD16-单核细胞中6个不同microRNA的表达(通过实时PCR确定)。采用双尾Mann-Whitney t-检验计算P值(*,P<0.05；**,P<0.01；***,P<0.001)。
图10A的2个图显示了8位不同ALS患者的临床评分(最大肺活量(FVC)分值和功能评定量表(FRS))。图10C显示了来自这8位患者的CD14+CD16-单核细胞中microRNA表达与来自健康对照和MS受试者的CD14+CD16-单核细胞中microRNA表达的比较结果。
图10B是图10A和10C所示的8位不同ALS患者的列表。
图10C的20个图显示了来自散发性ALS受试者(8个受试者)、健康受试者和患有MS的受试者的CD14+CD16-单核细胞中20种被上调的microRNA的表达(通过实时PCR确定)。采用双尾Mann-Whitney t-检验计算P值。
图11的4个图显示了来自散发性ALS(n＝11)受试者的CD14+CD16-单核细胞中4种被上调的microRNA的表达的实时PCR分析，与健康对照(n＝8)和患有MS的受试者(n＝8)进行比较。所示的数据是采用单因素方差分析(one-way ANOVA)和Dunett多重比较检验(Dunett’s multiple comparison test)生成的(***,p<0.001)。
图12A的2个图显示了8位不同ALS患者的临床评分(最大肺活量(FVC)分值和功能评定量表(FRS))。图10C显示了来自这8位患者的CD14+CD16-单核细胞中microRNA表达与来自健康对照和MS受试者的CD14+CD16-单核细胞中microRNA表达的比较结果。
图12B是图12A和12C所示的8位不同ALS患者的列表。
图12C的20个图显示了来自散发性ALS受试者的CD14+CD16-单核细胞中20种被下调的microRNA的表达，与健康受试者和患有MS-复发缓解型(MS-RR)的受试者进行比较(通过实时PCR确定)。采用双尾Mann-Whitneyt-检验计算P值(*,P<0.05；**,P<0.01；***,P<0.001)。
图13的8个图显示了来自散发性ALS和MS-RR的CD14+CD16-单核细胞中8种被上调的microRNA的表达，与健康受试者进行比较(通过实时PCR确定)(每组8个受试者)。所示数据采用单因素方差分析和Dunett多重比较检验生成(**,P<0.01；***,p<0.001)。
图14的5个不同的图显示了来自MS-RR受试者的CD14+CD16-单核细胞中5种被上调的microRNA的表达，与健康受试者和患有ALS的受试者(8个受试者)进行比较(通过实时PCR确定)。采用双尾Mann-Whitney t-检验计算P值(*,P<0.05；**,P<0.01；***,P<0.001)。
图15的5个图显示了来自MS-RR受试者的CD14+CD16-单核细胞中5种被下调的microRNA的表达，与健康受试者和患有ALS的受试者进行比较(通过实时PCR确定)。采用双尾Mann-Whitney t-检验计算P值(*,P<0.05；**,P<0.01；***,P<0.001)。
图16的6个图显示了健康受试者、患有家族性ALS的受试者(n＝5)和患有散发性ALS的受试者(n＝10)的脑脊液(FCS)中6种被上调的microRNA的表达。数据用采用Bonfferoni多重比较检验的ANOVA进行分析。*,p<0.05；**,p<0.01；***,p<0.001。
图17的热图显示了来自ALS受试者(n＝8)和MS受试者(n＝11)的CD14+CD16-单核细胞中179种炎症相关基因(“炎症标志物基因”)的nCounter表达谱，与这些炎症标志物基因在来自健康对照(n＝10)的CD14+CD16-单核细胞中的水平进行比较。数据用采用Dunnett事后检验的ANOVA进行分析(p<0.01)。热图的每一行代表一个基因，每一列代表一个受试者。
图18A的2个火山图显示了来自ALS受试者(左图)和MS受试者(右图)的CD14+CD16-单核细胞中与这些炎症标志物基因在来自健康对照的CD14+CD16-单核细胞中的水平相比显著失调的炎症标志物基因。
图18B是来自ALS和MS受试者的CD14+CD16-单核细胞中与这些炎症标志物基因在来自健康对照的CD14+CD16-单核细胞中的水平相比有显著失调的炎症标志物基因的汇总。柱形图显示了ALS和MS受试者的CD14+CD16-单核细胞中发生变化的炎症标志物基因的相对表达，与这些基因在来自健康对照的CD14+CD16-单核细胞中的表达进行比较。
图19的8个图显示了在来自健康对照(n＝8)和ALS受试者(n＝11)的CD14+CD16+单核细胞中8种不同microRNA的表达(用实时PCR确定)。数据采用双尾Mann-Whitney t-检验进行分析(*,P<0.05)。
图20A的热图显示了来自ALS受试者(n＝8)和MS受试者(n＝8)的CD14+CD16+单核细胞中microRNA的nCounter表达概貌分析，与这些microRNA在来自健康对照(n＝8)的CD14+CD16+单核细胞中的表达进行比较。数据用采用Dunnett事后检验的ANOVA进行分析(p<0.01)。热图的每一行代表一个基因，每一列代表一个受试者。指示了在来自ALS受试者的CD14+CD16+单核细胞中与在来自健康受试者的CD14+CD16+单核细胞中相比被上调或下调的MicroRNA。
图20B的热图显示了来自ALS受试者(n＝8)和MS受试者(n＝8)的CD14+CD16+单核细胞中microRNA的nCounter表达概貌分析，与这些microRNA在来自健康对照(n＝8)的CD14+CD16+单核细胞中的表达进行比较。数据用采用Dunnett事后检验的ANOVA进行分析(p<0.01)。热图的每一行代表一个基因，每一列代表一个受试者。指示了在来自MS受试者的CD14+CD16+单核细胞中与在来自健康受试者的CD14+CD16+单核细胞中microRNA的表达相比被上调或下调的MicroRNA。
图20C是在来自ALS和MS受试者的CD14+CD16+单核细胞中与来自健康对照的CD14+CD16+单核细胞中microRNA的表达相比有显著失调的microRNA的汇总。柱形图显示了在来自ALS和MS受试者的CD14+CD16+单核细胞中与这些microRNA在来自健康对照的CD14+CD16+单核细胞中的表达相比，有显著失调的microRNA的相对表达。
图21A是与非转基因(Tg)同窝小鼠的相同细胞相比，来自SODG93A小鼠的Ly6C高脾来源单核细胞子集合中179种炎症标志物基因在在症状出现前(60天)、发病时(以体重降低界定)和在疾病终末期的nCounter表达概貌。示出了一幅结合Dunett事后检验(P<0.01)的ANOVA分析结果热图，其显示了转录水平改变了至少2倍的基因。热图的每一行代表一个单基因，每一列代表一个具有三个生物重复的单组(在每时间点，4-5只小鼠的每组n＝3阵列)。在每个疾病阶段进行的非转基因重复被打散(collapsed)并进行基因分层聚类(geneshierarchically clustered)。基因表达水平已相对于6种管家基因(CLTC,GAPDH,GUSB,HPRT1,PGK1,和TUBB5)的几何平均值标准化。
图21B是显示与非转基因(Tg)同窝小鼠中相同的细胞相比，SODG93A小鼠Ly6C高脾来源的单核细胞子集合中在症状出现前(60天)、发病时(由体重降低界定)和在疾病终末期发生显著下调的炎症标志物基因的nCounter表达概貌。
图21C是SOD1G93A小鼠在疾病发病前1个月在Ly6CHi脾来源的单核细胞中被激活的主要生物网络的列表。
图21D显示了与非转基因同窝小鼠中相同的细胞相比，SODG93A小鼠脊髓来源的CD39+小胶质细胞中被上调的基因的nCounter表达概貌数据。
图21E显示了与非转基因同窝小鼠中相同的细胞相比，SODG93A小鼠脊髓来源的CD39+小胶质细胞中被下调的基因的nCounter表达概貌数据。
图21F是SOD1小鼠在疾病发病时脊髓的CD39+小胶质细胞中被激活的主要生物网络的列表。
图21G是与从相同SOD1小鼠的大脑分离的CD39+小胶质细胞相比，在疾病发病时，来自SOD1小鼠脊髓的CD39+小胶质细胞中被显著上调的基因的比较分析。
图22A是来自散发性ALS(n＝11)和MS(n＝8)受试者的CD14+CD16-血液单核细胞中184种炎症相关基因的nCounter表达概貌，与健康对照(n＝10)进行比较。
图22B显示了与健康对照相比，散发性ALS和MS受试者中被显著下调的基因的倍数表达差异。基因表达水平已相对于6种内参管家基因(CLTC,GAPDH,GUSB,PGK1,和TUBB5)的几何平均值标准化。
图22C显示了在具有空间(spatial)基因分布的散发性ALS受试者和MS受试者之间被鉴定有表达差异的基因的主成分分析(PCA)。
图23A是散发性ALS(10个受试者)和家族性SOD1ALS(4个受试者)的血液分选CD14+CD16-单核细胞中511种免疫相关基因和184种炎症相关基因的nCounter表达概貌，与健康对照(10个受试者)进行比较。该概貌(热图)是一个非监督分层聚类(unsupervisedhierarchial clustering)(Pearson相关)(非参数Kruskal-Wallis检验；显著性基于通过Benjamini-Hochberg法确定的错误发现率(FDR)；选用的FDR极限：0.05；P<0.01)。热图的每一行代表一个基因，每一列代表一个受试者。
图23B显示了与健康对照相比，来自散发性ALS和家族性ALS受试者的血液分选的CD14+CD16-单核细胞中表达发生显著失调的基因的倍数差异。基因表达水平相对于15种内参管家基因(ABCF1,ALAS1,EEF1G,G6PD,GAPDH,GUSB,HPRT1,OAZ1,POLR1B,POLR2A,PPIA,RPL19,DSHA,TBP,和TUBB)的几何平均值进行标准化。
图23C显示了具有空间基因分布的散发性ALS和家族性ALS受试者与健康对照相比，血液分选的CD14+CD16-单核细胞中被鉴定表达发生变化的基因的PCA分析。
图24的一组8个图显示了对在家族性和/或散发性ALS受试者的血液分选CD14+CD16-单核细胞相中对于在来自健康对照的血液分选CD14+CD16-单核细胞中发生最显著失调的8种基因的实时PCR验证。散发性ALS和家族性ALS相对于健康对照的相对表达用比较Ct(2-ΔΔCt)法计算。基因表达水平已相对于3种管家基因(GAPDH,TUBB,和GRB2)的几何平均值标准化。对每个受试者一式二份进行聚合酶链式反应。图上呈现了ALS受试者中发生显著失调的基因的单因素方差分析(ANOVA)和Dunett多重比较检验。
图25显示了根据来自ALS受试者CD14+CD16-血液单核细胞中鉴定的显著失调的miRNA和mRNA进行的Ingenuity目标过滤分析(Ingenuity target filter analysis)，显示了最高的10个miRNA-mRNA相互作用。
图26是显示对从ALS受试者的CD14+CD16-血液单核细胞收集的数据实施的microRNA-mRNA靶分析的结果(IPA；Ingenuity)的表格。结果显示32种miRNA靶定27种mRNA。
图27是描述ALS中血液分选的CD14+CD16-单核细胞中的microRNA-mRNA相互作用的图。图中描述了在来自ALS受试者的血液分选CD14+CD16-单核细胞中发生显著失调的miRNA和免疫相关基因的结果。总共显示32种miRNA靶定27种mRNA。
图28的2个图显示了1000个随机的、未被调节的miRNA-mRNA配对之间可能的随机相互作用的分布，与在SOD1小鼠脾脏Lys6C高单核细胞中发现的41种未被调节的高表达miRNA和47种被调节的基因(图28A)、以及在ALS受试者的CD14+CD16-外周血单核细胞中发现的64种未被调节的高表达miRNA和59种被调节的基因(图28B)中观察到的假定miRNA-mRNA配对进行比较(Targetscan4.1)。
图29是显示来自ALS受试者的血液分选CD14+CD16-单核细胞中失调最高的20种转录因子和靶基因(用GeneGo通路分析确定)的表格，和显示ALS受试者中的血液分选CD14+CD16-单核细胞中特化蛋白-1(specificity protein-1)(SP1)转录因子及其靶基因的图。
图30是显示了SOD1/miR-155-/-和SOD1/miR-155+/-小鼠的存活概率的Kaplan-Meir分析的图。在SOD1/miR-155-/-与SOD1/miR-155+/-小鼠组之间进行Mantel-Cox’s F-检验比较(P<0.0001)。
图31是显示神经疾病发生(神经功能评分2)的事件发生时间(time-to-event)分析的图。SOD1/miR-155-/-小鼠与SOD1/miR-155+/-小鼠相比，显示显著的疾病发生(P<0.0001)。
图32是显示SOD1/miR-155-/-和SOD1/miR-155+/-小鼠的旋转(rotarod)行为与年龄的函数的图。**P<0.01；***P<0.001；通过多因子方差分析和Fisher LSD事后检验。
图33是显示SOD1/miR-155-/-和SOD1/miR-155+/-小鼠体重降低的图。统计分析用双因素方差分析，Bonferri事后检验实施。***P<0.001。
图34的2个图显示了SOD1/miR-155-/-和SOD1/miR-155+/-小鼠的一个早期疾病期的持续时间(从发病到5％体重降低)(左图)和随后的一个疾病期的持续时间(从5％体重降低到终末期)。
图35A显示了野生型、SOD1/miR155+/+、SOD1/miR155-/+和SOD1/miR155-/-小鼠中用4D4(驻留于小胶质细胞)和CD11b(骨髓细胞)染色的脊髓来源单核细胞的荧光活化细胞分选(FACS)分析数据。
图35B显示了野生型、SOD1/miR155+/+、SOD1/miR155-/+和SOD1/miR155-/-小鼠的每条脊髓中小胶质细胞(4D4阳性)和单核细胞(CD11b阳性)的绝对数目。
图36的一组4个热图显示了WT,SOD1/miR155-/+和SOD1/miR155-/-小鼠的脊髓小胶质细胞和Ly6C高脾脏单核细胞中炎症相关基因的表达。标记为(a)的热图来自终末期的动物。(注意，SOD1/miR155-/-小鼠在研究结束时仍然存活并在繁殖，而SOD1/miR-/+小鼠经历了症状发生(“终末期”))。所有的小鼠均为雄性C57/BI6-SOD1背景。标记为(b)的热图指示SOD1小鼠中被miR155显著影响的基因。
图37是显示野生型、SOD1/miR155-/+、SOD1/miR155-/-小鼠的Ly6Chi脾来源单核细胞子集合中数种小鼠microRNA的表达的nCounter表达概貌数据。
图38的热图和柱状图显示了在散发性ALS(8个受试者)和缓解-复发型多发性硬化(8个受试者)的血液来源CD14+CD16-单核细胞中，与健康对照(8个受试者)的CD14+CD16-单核细胞中的microRNA的表达相比，microRNA的nCounter表达概貌。热图显示了采用Dunnett事后检验的ANOVA分析结果(P<0.01)。指示了ALS受试者的CD14+CD16-单核细胞中被上调或下调的microRNA(与这些microRNA在健康对照的CD14+CD16-单核细胞中的表达相比)。热图的每一行代表一个基因，每一列代表一个个体。
发明详细说明
本发明至少部分地基于如下的发现，即与健康个体相比，来自患有神经退行性病症的患者的CD14+CD16-单核细胞和/或CD14+CD16+单核细胞(例如外周或血液来源的单核细胞)中特定的microRNA和炎症标志物的表达失调，在患有神经退行性病症(例如ALS(如散发性ALS和家族性ALS)和MS)的患者的脑脊液中特定的microRNA以增加或降低的水平存在。本发明还基于如下的发现，即hsa-miR-155在ALS小鼠模型的疾病发展中发挥显著作用。根据这些发现，本文提供了用于诊断神经退行性病症，鉴定具有发生神经退行性病症风险(例如增加或降低的风险)的受试者，预测患有神经退行性病症的受试者体内的疾病进展速度，选择受试者以进行神经退行性病症的治疗，选择受试者以进行神经疾病的治疗，确定神经退行性病症治疗的功效，和选择参与临床研究的受试者的方法。这些方法包括确定表1-19的一个或多个中列出的一种或多种(例如至少2,3,4,5,6,7,8,9,或10种)microRNA和/或表20-21中列出的一种或多种炎症标志物的水平。
还提供了用于治疗神经退行性病症(例如ALS或MS)的方法，其包括向受试者施用可降低表1,3,5,7,9,11,12,14,16,或18中列出的一种或多种microRNA(例如hsa-miR-155)的水平或活性，和/或增加表2,4,6,8,10,13,15,17,或19中列出的一种或多种microRNA的水平或活性的作用剂(例如核酸)。还提供了用于治疗神经退行性病症(例如ALS或MS)的方法，其包括向受试者施用一种可以降低表21中列出的一种或多种炎症标志物的表达(例如蛋白或mRNA)和/或活性，和/或增加表20中列出的一种或多种炎症标志物的表达(例如蛋白或mRNA)和/或活性作用剂(例如核酸)。
还提供了含有与在表1-19中列出的任一种microRNA中存在的序列互补的序列、或者与编码表20和21中列出的任一个基因的mRNA中的序列互补的序列的核酸(例如引物或探针)。还提供了含有与表1、3、5、7、9、11、12、14、16、或18中列出的任何一个microRNA(靶microRNA)中存在的序列互补的序列、或者与由表21中列出的任何一个基因编码的mRNA(靶mRNA)中存在的序列互补的序列的核酸，其可以降低靶microRNA或靶mRNA的表达或活性(例如抑制性RNA，例如本文中所述的任何一种抑制性核酸)。还提供了组合物，其含有包含表2,4,6,8,10,13,15,17,和19中列出的任何一个microRNA(靶microRNA)的序列的核酸，或者包含由表20中列出的任何一个基因编码的mRNA(靶mRNA)中存在的序列的核酸，其可以增加所述靶microRNA或靶mRNA的表达或活性。还包括组合物，其含有至少一种可以特异结合表20和表21中列出的任何一种蛋白质的抗体。还包括组合物，其含有表20和表21中列出的至少一种蛋白质。还提供了试剂盒，其含有一种或多种上述的核酸、蛋白质或抗体(以任何组合)。
疾病退行性病症
神经退行性病症是一类神经疾病，其特征是神经元的结构和功能的进行性丧失和神经元细胞死亡。已经证明多种神经退行性病症中有炎症的参与。在不同种类的神经退行性病症中，运动和感觉神经元的进行性丧失以及意识将感觉信息指向外部物体的能力均受到影响。神经退行性病症的非限制性实例包括帕金森病、阿尔茨海默病、亨廷顿氏病、肌萎缩性侧索硬化症(ALS，例如，家族性ALS和散发性ALS)，和多发性硬化症(MS)。
医疗专业人员可以通过评估受试者体内神经退行性病症的一种或多种症状诊断患者是否患有神经退行性病症。受试者体内神经退行性病症的非限制性症状包括，足前部和足趾提升困难；手臂、腿、足或踝无力；手无力或笨拙；言语含糊不清；吞咽困难；肌肉痉挛；手臂、肩膀和舌抽动；咀嚼困难；呼吸困难；肌肉麻痹；视力部分或完全丧失；重视；身体部分刺痛或疼痛；头部运动时产生电击感觉；震颤；步态不稳；疲劳；头晕；记忆丧失；方向障碍；空间关系误解；阅读或书写困难；难以集中注意力和思考；难以做出判断和决策；难以进行规划和执行熟悉的任务；抑郁；焦虑；社交退缩；情绪波动；易怒；攻击性；睡眠习惯改变；神智恍惚(wandering)；痴呆；自主运动丧失；身体姿势和平衡障碍；肌肉僵硬；运动迟缓；眼球运动缓慢或失调；不由自主的抽搐或扭动(舞蹈病)；肌肉不自主地、持续地收缩(肌张力不全)；缺乏灵活性；缺乏冲动控制；和食欲改变。医疗专业人员还可以，部分地，根据受试者的神经退行性病症的家族史做出诊断。医疗专业人员可以在受试者到医疗保健部门(例如诊所或医院)就诊时诊断受试者患有神经退行性病症。在一些情况下，医疗专业人员可以在辅助医疗保健部门收治受试者时诊断受试者患有神经退行性病症。典型地，医生在受试者出现一种或多种症状之后诊断受试者患有神经退行性病症。
本文中提供了其他的用于诊断受试者体内神经退行性病症的方法(例如出现一种或多种神经退行性病症的症状的受试者或者不存在神经退行性病症的症状的受试者(例如未确诊和/或无症状的受试者))。本文中还提供了预后方法和治疗受试者体内神经退行性病症的方法(例如降低受试者体内神经退行性病症症状(例如共济失调)的发病率或进展的方法)。
标志物
本文中所述的一种或多种标志物的任意组合可以用于本文中所述的任何方法中，例如在用于诊断受试者体内神经退行性病症的方法、鉴定具有发生神经性退行性疾病的风险(例如风险增加或降低)的受试者的方法、预测患有神经退行性病症的受试者体内疾病进展速度的方法、选择受试者以进行神经退行性病症治疗的方法、确定患有神经退行性病症的受试者体内的治疗功效的方法、或选择参与临床研究的受试者的方法中使用。
表1列出了与健康对照(健康对照中的CD14+CD16-或CD14+CD16+单核细胞或CSF)相比，在患有神经退行性病症的受试者的单核细胞(CD14+CD16-或CD14+CD16+单核细胞)或CSF中增加的microRNA标志物。
表1.在来自患有神经退行性病症的患者的CD14+CD16-单核细胞、CD14+CD16+单核细胞或CSF中与健康对照相比增加的microRNA的列表
表2中列出了与健康对照(健康对照中的CD14+CD16-或CD14+CD16+单核细胞)相比，在来自患有神经退行性病症的受试者的CD14+CD16-或CD14+CD16+单核细胞中降低的microRNA标志物。
表2.在来自患有神经退行性病症的患者的CD14+CD16-单核细胞、CD14+CD16+单核细胞或CSF中与健康对照相比降低的microRNA的列表
表3列出了与健康对照(健康对照中的CD14+CD16-或CD14+CD16+单核细胞或CSF)相比，在患有ALS的受试者的单核细胞(CD14+CD16-或CD14+CD16+单核细胞)或CSF中增加的microRNA标志物。
表3.患有ALS的受试者的CD14+CD16-或CD14+CD16+单核细胞或CSF中与健康对照相比增加的microRNA的列表
表4列出了与健康对照(健康对照中的CD14+CD16-或CD14+CD16+核细胞)相比，在来自患有ALS的受试者的单核细胞(CD14+CD16-或CD14+CD16+单核细胞)或CSF中降低的microRNA标志物。
表4.患有ALS的受试者的CD14+CD16-或CD14+CD16+单核细胞中与健康对照相比降低的microRNA的列表
表5列出了与来自健康对照的CD14+CD16-单核细胞相比，在来自ALS患者的CD14+CD16-单核细胞中增加的microRNA标志物。
表5.在来自患有ALS的受试者的CD14+CD16-单核细胞中与健康对照相比增加的microRNA的列表
表6列出了与来自健康对照的CD14+CD16-单核细胞相比，在来自ALS患者的CD14+CD16-单核细胞中降低的microRNA标志物。
表6.在来自患有ALS的受试者的CD14+CD16-单核细胞中与来自健康对照的CD14+CD16-单核细胞相比降低的microRNA列表
表7列出了与来自MS受试者和健康对照的CD14+CD16-单核细胞相比，在来自ALS患者的CD14+CD16-单核细胞中独特地增加的microRNA标志物。
表7.在来自ALS患者的CD14+CD16-单核细胞中与MS受试者和健康对照的CD14+CD16-单核细胞相比独特地增加的microRNA的列表
表8列出了与来自MS受试者和健康对照的CD14+CD16-单核细胞相比，在来自ALS患者的CD14+CD16-单核细胞中独特地降低的microRNA标志物。
表8.在来自ALS患者的CD14+CD16-单核细胞中与MS受试者和健康对照的CD14+CD16-单核细胞相比独特地降低的microRNA的列表
hsa-miR-518f hsa-miR-603 hsa-miR-655 hsa-miR-300
hsa-miR-206 hsa-miR-1297 hsa-miR-450b-5p hsa-miR-302c
hsa-miR-204 hsa-miR-192 hsa-miR-548b-3p hsa-miR-328
hsa-miR-137 hsa-miR-526a hsa-miR-584 hsa-miR-421
hsa-miR-453 hsa-miR-615-5p hsa-miR-548f hsa-miR-580
表9列出了与来自健康对照的CD14+CD16+单核细胞相比，在来自ALS患者的CD14+CD16+单核细胞中增加的microRNA标志物。
表9.在来自ALS患者的CD14+CD16+单核细胞中与来自健康对照的CD14+CD16+单核细胞相比增加的microRNA的列表
hsa-miR-708 hsa-miR-24 hsa-miR-26a hsa-miR-21
hsa-miR-142-5p hsa-miR-103 hsa-miR-30b hsa-miR-142-3p
hsa-miR-15b hsa-miR-23a hsa-miR-16 hsa-miR-340
hsa-miR-223 hsa-miR-29a hsa-miR-15a hsa-let-7i
表10列出了与来自健康对照的CD14+CD16+单核细胞相比，在来自ALS患者的CD14+CD16+单核细胞中降低的microRNA标志物。
表10.在来自ALS患者的CD14+CD16+单核细胞中与来自健康对照的CD14+CD16+单核细胞相比降低的microRNA的列表
hsa-miR-598
hsa-miR-494
hsa-miR-142-3p
表11列出了与来自健康对照的CSF相比，在来自患有散发性或家族性ALS的受试者的CSF中独特地增加的microRNA标志物。
表11.在来自患有散发性ALS的受试者的CSF中与来自健康对照的CSF相比独特地增加的microRNA的列表
miRNA ALS形式
hsa-miR-27b 家族性和散发性ALS
hsa-miR-99b 散发性ALS
hsa-miR-146a 散发性ALS
hsa-miR-150 散发性ALS
hsa-miR-328 家族性和散发性ALS
hsa-miR-532-3p 家族性和散发性ALS
表12列出了与健康对照(健康对照的CD14+CD16-或CD14+CD16+)相比，患有MS的受试者的单核细胞(CD14+CD16-或CD14+CD16+单核细胞)中增加的microRNA标志物。
表12.在患有MS的受试者的CD14+CD16-或CD14+CD16+单核细胞中与健康对照CD14+CD16-或CD14+CD16+单核细胞相比增加的microRNA的列表
表13列出了与健康对照(健康对照的CD14+CD16-或CD14+CD16+)相比，患有MS的受试者的单核细胞(CD14+CD16-或CD14+CD16+单核细胞)中降低的microRNA标志物。
表13.在患有MS的受试者的CD14+CD16-或CD14+CD16+单核细胞中与健康对照CD14+CD16-或CD14+CD16+单核细胞相比降低的microRNA的列表
表14列出了与来自健康对照的CD14+CD16-单核细胞相比，在来自MS患者的CD14+CD16-单核细胞中增加的microRNA标志物。
表14.患有MS的受试者的CD14+CD16-单核细胞中与来自健康对照的CD14+CD16-单核细胞相比增加的microRNA的列表
表15列出了与来自健康对照的CD14+CD16-单核细胞相比，在来自MS患者的CD14+CD16-单核细胞中降低的microRNA标志物。
表15.在来自患有MS的受试者的CD14+CD16-单核细胞中与来自健康对照的CD14+CD16-单核细胞相比降低的microRNA的列表
hsa-miR-649 hsa-miR-193a-3p hsa-miR-615-5p hsa-miR-206
hsa-miR-383 hsa-miR-450a hsa-miR-137 hsa-miR-192
hsa-miR-1206 hsa-miR-362-3p hsa-miR-300 hsa-miR-566
hsa-miR-548g hsa-miR-450b-5p hsa-miR-603 hsa-miR-142-3p
hsa-miR-640 hsa-miR-302c hsa-miR-584 hsa-miR-15a
hsa-miR-592 hsa-miR-548f hsa-miR-204 hsa-miR-1537
hsa-miR-598 hsa-miR-328 hsa-miR-526a hsa-miR-148b
hsa-miR-515-3p hsa-miR-580 hsa-miR-453 hsa-miR-379
hsa-miR-513a-5p hsa-miR-421 hsa-miR-2054 hsa-miR-548b-3p
hsa-miR-651 hsa-miR-1297 hsa-miR-655 hsa-miR-518f
表16列出了与来自ALS受试者和健康对照的CD14+CD16-单核细胞相比，在来自MS患者的CD14+CD16-单核细胞中独特地增加的microRNA标志物。
表16.在来自MS患者的CD14+CD16-单核细胞中与来自ALS受试者和健康对照的CD14+CD16-单核细胞相比独特地增加的microRNA的列表
表17列出了与来自ALS受试者和健康对照的CD14+CD16-单核细胞相比，在来自MS患者的CD14+CD16-单核细胞中独特地降低的microRNA标志物。
表17.在来自MS患者的CD14+CD16-单核细胞中与来自ALS受试者和健康对照的CD14+CD16-单核细胞相比独特降低的microRNA的列表
表18列出了与来自健康对照的CD14+CD16+单核细胞相比，在来自MS患者的CD14+CD16+单核细胞中增加的microRNA标志物。
表18.在来自MS患者的CD14+CD16+单核细胞中与来自健康对照的CD14+CD16+单核细胞相比增加的microRNA的列表
表19列出了与来自健康对照的CD14+CD16+单核细胞相比，MS患者的CD14+CD16+单核细胞中降低的microRNA标志物。
表19.在来自MS患者的CD14+CD16+单核细胞中与来自健康对照的CD14+CD16+单核细胞相比降低的microRNA的列表
hsa-miR-369-3p hsa-miR-10a hsa-miR-598
hsa-miR-615-5p hsa-miR-30d hsa-miR-494
表20列出了与来自健康对照的CD14+CD16-单核细胞相比，在来自患有神经退行性病症的患者CD14+CD16-单核细胞中降低的炎症标志物。
表20.在来自患有神经退行性病症的患者的CD14+CD16-单核细胞中与来自健康对照的CD14+CD16-单核细胞相比降低的炎症标志物的列表
表21列出了与来自健康对照的CD14+CD16-单核细胞相比，在来自患有神经退行性病症的患者CD14+CD16-单核细胞中独特地增加的炎症标志物。
表21.在来自患有神经退行性病症的患者的CD14+CD16-单核细胞中与来自健康对照的CD14+CD16-单核细胞相比增加的炎症标志物的列表
诊断方法
本文中提供了诊断神经退行性病症的方法。这些方法包括确定表1-19中列出的一种或多种(例如至少2、3、4、5或6种)microRNA和表20-21中列出的一种或多种(例如至少2、3、4、5或6种)炎症标志物在来自受试者的CD14+CD16-或CD14+CD16+单核细胞(例如外周或血液来源的单核细胞)中的水平，和将该一种或多种microRNA和/或一种或多种炎症标志物的水平与该一种或多种microRNA和/或一种或多种炎症标志物的参考水平进行比较。与参考水平相比，该一种或多种microRNA和/或一种或多种炎症标志物的水平增加或降低，表明受试者患有一种在下文中详细列出的神经退行性病症。
在一些实施方案中，如果与表1中列出的一种或多种microRNA的参考水平相比，表1中列出的一种或多种(例如至少2、3、4、5或6种)microRNA在来自受试者的CSF或CD14+CD16-或CD14+CD16+单核细胞(例如外周或血液来源的单核细胞)中的水平增加，和/或如果与表2中列出的一种或多种microRNA的参考水平相比，表2中列出的一种或多种(例如至少2、3、4、5或6种)microRNA在来自受试者的CSF或CD14+CD16-或CD14+CD16+单核细胞(例如外周或血液来源的单核细胞)中的水平降低，则可以诊断受试者患有神经退行性病症。
在一些实施方案中，如果与表3和12中列出的一种或多种(例如至少2、3、4、5或6种)microRNA的参考水平相比，来自受试者的CD14+CD16-或CD14+CD16+单核细胞中的表3和12中列出的一种或多种(例如至少2、3、4、5或6种)microRNA的水平增加，和/或如果与表4和13中列出的一种或多种(例如至少2、3、4、5或6种)microRNA的参考水平相比，来自受试者的CD14+CD16-或CD14+CD16+单核细胞中的表4和13中列出的一种或多种(例如至少2、3、4、5或6种)microRNA的水平降低，则可以诊断受试者患有神经退行性病症。
在一些实施方案中，如果与表5和14中列出的一种或多种microRNA的参考水平相比，和/或与表21中列出的一种或多种炎症标志物的参考水平相比，来自受试者的CD14+CD16-单核细胞中的表5和14中列出的一种或多种(例如至少2、3、4、5或6种)microRNA的水平和/或表21中列出的一种或多种(例如至少2、3、4、5或6种)炎症标志物的水平增加；和/或如果与表6和15中列出的一种或多种microRNA的参考水平相比，和/或与表20中列出的一种或多种炎症标志物的参考水平相比，来自受试者的CD14+CD16-单核细胞中的表6和15中列出的一种或多种(例如至少2、3、4、5或6种)microRNA的水平和/或表20中列出的一种或多种(例如至少2、3、4、5或6种)炎症标志物的水平降低，则可以诊断受试者患有神经退行性病症。
在一些实施方案中，如果与表5和7中列出的一种或多种microRNA的参考水平相比，和/或与表21中列出的一种或多种炎症标志物的参考水平相比，来自受试者的CD14+CD16-单核细胞中的表5和7中列出的一种或多种(例如至少2、3、4、5或6种)microRNA的水平和/或表21中列出的一种或多种(例如至少2、3、4、5或6种)炎症标志物的水平增加；和/或如果与表6和8中列出的一种或多种microRNA的参考水平相比，和/或与表20中列出的一种或多种炎症标志物的参考水平相比，来自受试者的CD14+CD16-单核细胞中的表6和8中列出的一种或多种(例如至少2、3、4、5或6种)microRNA的水平和/或表20中列出的一种或多种(例如至少2、3、4、5或6种)炎症标志物的水平降低，则可以诊断受试者患有肌萎缩性侧索硬化。
在一些实施方案中，如果与表9中列出的一种或多种microRNA的参考水平相比，来自受试者的CD14+CD16+单核细胞中的表9中列出的一种或多种(例如至少2、3、4、5或6种)microRNA的水平增加，和/或如果与表10中列出的一种或多种microRNA的参考水平相比，受试者CD14+CD16+单核细胞中的表10中列出的一种或多种(例如至少2、3、4、5或6种)microRNA的水平降低，则可以诊断受试者患有肌萎缩性侧索硬化。
在一些实施方案中，如果与hsa-miR-27b,hsa-miR-99b,hsa-miR-146a,hsa-miR-150,hsa-miR-328,和hsa-miR-532-3p的参考水平相比，来自受试者的脑脊液中hsa-miR-27b,hsa-miR-99b,hsa-miR-146a,hsa-miR-150,hsa-miR-328,和hsa-miR-532-3p的一种或多种(例如至少2、3、4、5或6种)的水平增加，则可以诊断受试者患有肌萎缩性侧索硬化。
在一些实施方案中，如果与hsa-miR-27b的参考水平相比，来自受试者的脑脊液中hsa-miR-27b的水平增加，并且与hsa-miR-99b,hsa-miR-146a,hsa-miR-150,hsa-miR-328,和hsa-miR-532-3p的一种或多种的参考水平相比，受试者的脑脊液中hsa-miR-99b,hsa-miR-146a,hsa-miR-150,hsa-miR-328,和hsa-miR-532-3p的一种或多种(例如至少2、3、4、5或6种)的水平降低或没有显著变化，则可以诊断受试者患有家族性ALS。
在一些实施方案中，如果与一种或多种microRNA的参考水平相比，来自受试者的脑脊液中hsa-27b,hsa-miR-99b,hsa-miR-146a,hsa-miR-150,hsa-miR-328,和hsa-miR-532-3p的两种或更多种(例如2、3、4、5或6种)microRNA的水平增加，则可以诊断受试者患有散发性ALS。在一些实施方案中，如果与一种或多种microRNA的参考水平相比，受试者的脑脊液中hsa-miR-99b,hsa-miR-146a,hsa-miR-150,hsa-miR-328,和hsa-miR-532-3p的一种或多种(例如2、3、4、5或6种)microRNA的水平增加，则可以诊断受试者患有散发性ALS。
在一些实施方案中，如果与表14和表16中列出的一种或多种microRNA的参考水平相比，和/或与表21中列出的一种或多种炎症标志物的参考水平相比，受试者CD14+CD16-单核细胞中表14和表16中列出的一种或多种(例如至少2、3、4、5或6种)microRNA的水平增加，和/或与表21中列出的一种或多种(例如至少2、3、4、5或6种)炎症标志物的水平增加；和/或如果与表15和表17中列出的一种或多种microRNA的参考水平相比，和/或与表20中列出的一种或多种炎症标志物的参考水平相比，受试者CD14+CD16-单核细胞中表15和表17中列出的一种或多种(例如至少2、3、4、5或6种)microRNA的水平降低，和/或与表20中列出的一种或多种(例如至少2、3、4、5或6种)炎症标志物的水平降低，则可以诊断受试者患有多发性硬化。
在一些实施方案中，如果与表18中列出的一种或多种microRNA的参考水平相比，受试者CD14+CD16+单核细胞中表18中列出的一种或多种(例如至少2、3、4、5或6种)microRNA的水平增加，和/或如果与表19中列出的一种或多种microRNA的参考水平相比，受试者CD14+CD16+单核细胞中表19中列出的一种或多种(例如至少2、3、4、5或6种)microRNA的水平降低，则可以诊断受试者患有多发性硬化。
表1-19中描述的一种或多种microRNA(包括成熟和前体microRNA)的水平可以使用本领域已知的分子生物学方法加以确定。例如，本文中所述的任何microRNA的水平可以用包含使用聚合酶链式反应(PCR)和合适引物的技术，例如定量实时PCR(qRT-PCR)进行测量。每一个本文中描述的成熟和前体microRNA的引物都可以使用本领域已知的方法进行设计。类似地，编码表20和21中任一炎症标志物的mRNA的水平可以使用包含PCR和合适引物的技术加以确定。例如，引物可以含有与靶microRNA或靶炎症标志物mRNA中存在的序列互补的至少7个(例如至少8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,或20个)连续核苷酸。引物可以包含本文中所述的一种或多种修饰(例如主链内的一种或多种修饰，核碱基中的一种或多种修饰，和糖中的一种或多种修饰)。引物还可以包含标记物(例如放射性同位素或荧光团)。引物还可以和第二分子或作用剂偶联，以提高引物的稳定性(如本文中所述的)。
由表20和21中列出的炎症标志物基因编码的蛋白的水平可以使用多种本领域已知的采用特异结合表20和21中列出的蛋白质的抗体技术(例如免疫印迹)加以检测。
本文中所述的任何方法可以进一步包括从受试者获得或收集样品(例如含有脑脊液或外周血的生物样品)。在一些实施方案中，该方法(例如本文中所述的任何方法)进一步包括纯化单核细胞(例如来自患者生物样品的CD14+CD16-单核细胞或CD14+CD16+单核细胞)。纯化CD14+CD16-单核细胞或CD14+CD16+单核细胞的方法可以用多种本领域已知的方法实施，例如基于抗体的方法，例如荧光辅助细胞分选(FACS)。
本文中所述的任何方法可以对到医疗部门(例如医院、门诊部或辅助医疗部门)就诊的患者进行。受试者就诊时可以有一种或多种神经退行性病症症状(例如本文中所述的任何神经退行性病症症状)。受试者就诊时也可以没有症状(无症状受试者)，或者仅有一种神经退行性病症症状。受试者可以具有神经退行性病症的家族史(例如家族性ALS)。
本文中所述的诊断方法可以由任何医疗专业人员(例如医师、实验技术人员、护士、医师助理、护士助理)实施。本文中所述的诊断方法可以与本领域已知的任何其它诊断测试方法(例如观察或评估受试者体内神经退行性病症的一种或多种症状)组合使用。
选择受试者进行治疗的方法
还提供了选择用于治疗神经退行性病症的受试者的方法。这些方法包括确定来自受试者的脑脊液或CD14+CD16-或CD14+CD16+单核细胞中表1-19中列出的一种或多种(例如至少2、3、4、5或6种)microRNA的水平和/或表20和21中列出的一种或多种(例如至少2、3、4、5或6种)炎症标志物的水平；将来自受试者的脑脊液或CD14+CD16-或CD14+CD16+单核细胞中一种或多种microRNA的水平和/或一种或多种炎症标志物的水平与一种或多种microRNA的参考水平和/或一种或多种炎症标志物的参考水平进行比较；和选择与表1,3,5,7,9,11,12,14,16,或18中列出的一种或多种microRNA的参考水平，和/或表21中列出的一种或多种炎症标志物的参考水平相比，脑脊液或CD14+CD16-或CD14+CD16+单核细胞中表1,3,5,7,9,11,12,14,16,或18中列出的一种或多种(例如至少2、3、4、5或6种)microRNA的水平，和或表21中列出的一种或多种(例如至少2、3、4、5或6种)炎症标志物的水平增加的受试者；和/或选择与表2,4,6,8,10,13,15,17,和19中列出的一种或多种microRNA的参考水平，和/或表20中列出的一种或多种炎症标志物的参考水平相比，脑脊液或CD14+CD16-或CD14+CD16+单核细胞中表2,4,6,8,10,13,15,17,和19中列出的一种或多种(例如至少2、3、4、5或6种)microRNA的水平，和或表20中列出的一种或多种(例如至少2、3、4、5或6种)炎症标志物的水平降低的受试者，用于治疗神经退行性病症。
可以根据表1-19中列出的一种或多种(例如至少2、3、4、5或6种)microRNA和/或表20和21中列出的一种或多种(例如至少2、3、4、5或6种)炎症标志物的相对表达选择用于治疗的受试者，如上文在描述诊断方法的部分中所描述的。例如，在诊断患有神经退行性病症的受试者中所使用的表1,3,5,7,9,11,12,14,16,或18中列出的一种或多种(例如至少2、3、4、5或6种)microRNA的水平和/或表21中列出的一种或多种(例如至少2、3、4、5或6种)炎症标志物的水平的增加可同样地用来选择用于治疗神经退行性病症的受试者。类似地，在诊断患有神经退行性病症的受试者中所使用的表2,4,6,8,10,13,15,17,和19中列出的一种或多种(例如至少2、3、4、5或6种)microRNA的水平和/或表20中列出的一种或多种(例如至少2、3、4、5或6种)炎症标志物的水平的降低可同样地用来选择用于治疗神经退行性病症的受试者。
表1-19中描述的一种或多种microRNA(成熟和前体microRNA)的水平可以用本领域已知的分子生物学方法确定。例如，本文中所述的任何microRNA的水平可以使用包含使用聚合酶链式反应(PCR)和合适引物的技术，例如定量实时PCR(qRT-PCR)，进行测量。本文中所描述的每一个成熟和前体microRNA的引物可以用本领域已知的方法设计。类似地，编码表20和21中任何炎症标志物的mRNA的水平可以用包含使用PCR和合适引物的技术加以确定。例如，引物可以含有至少7个(例如至少8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,或20个)与靶microRNA或靶炎症标志物mRNA中存在序列互补的连续核苷酸。引物可以包括一种或多种修饰(例如主链内的一种或多种修饰，核碱基中的一种或多种修饰，和糖基中的一种或多种修饰)。引物还可以包含标记物(例如放射性同位素或荧光团)。引物还可以和第二种分子或作用剂偶联，以提高引物的稳定性(如本文中所述)。该方法可以由任何医疗专业人员(例如医师、护士、医师助理、实验技术人员、或护士助理)实施。
受试者在就诊时可以有神经退行性病症的一种或多种(例如至少2、3或4种)症状(例如本文中所述的任何神经退行性病症症状)。受试者在就诊时也可以没有或仅有一种神经退行性病症症状。受试者可以具有神经退行性病症家族史(例如家族性ALS)。受试者可以既往被诊断为患有神经退行性病症。
可以施用给受试者的神经退行性病症的治疗包括利鲁唑、糖皮质激素、β-干扰素、格拉默(glatiramer)、芬戈莫德(fingolimod)、natalizumab、米托蒽醌(mitoxantrone)、肌肉松弛剂，和金刚烷。其他神经退行性病症的治疗包括物理疗法和血浆除去法(plasmapheresis)。
鉴定具有发生神经退行性病症的风险的受试者的方法
还提供了鉴定具有发生神经退行性病症的风险的受试者的方法。这些方法包括确定来自受试者的脑脊液或CD14+CD16-或CD14+CD16+单核细胞中表1-19所列一种或多种(例如2、3、4、5或6种)microRNA的水平和/或表20和21所列一种或多种(例如2、3、4、5或6种)炎症标志物的水平；将来自受试者的脑脊液或CD14+CD16-或CD14+CD16+单核细胞中一种或多种microRNA的水平和/或一种或多种炎症标志物的水平与该一种或多种microRNA的参考水平和/或该一种或多种炎症标志物的参考水平比较。如果与表1,3,5,7,9,11,12,14,16,或18中列出的一种或多种microRNA的参考水平，和/或与表21中列出的一种或多种炎症标志物的参考水平相比，来自受试者的脑脊液或CD14+CD16-或CD14+CD16+单核细胞中表1,3,5,7,9,11,12,14,16,或18中列出的一种或多种(例如至少2、3、4、5或6种)microRNA的水平增加，和/或表21中列出的一种或多种(例如至少2、3、4、5或6种)炎症标志物的水平增加，和/或如果与表2,4,6,8,10,13,15,17,和19中列出的一种或多种microRNA的参考水平，和/或表20中列出的一种或多种炎症标志物的参考水平相比，来自受试者的脑脊液或CD14+CD16-或CD14+CD16+单核细胞中表2,4,6,8,10,13,15,17,和19中列出的一种或多种(例如至少2、3、4、5或6种)microRNA的水平降低，和/或表20中列出的一种或多种(例如至少2、3、4、5或6种)炎症标志物的水平降低，则鉴定受试者具有增加的发生神经退行性病症的风险。
在一些实施方案中，如果与表1,3,5,7,9,11,12,14,16,或18中列出的一种或多种microRNA的参考水平，和/或与表21中列出的一种或多种炎症标志物的参考水平相比，来自受试者的脑脊液或CD14+CD16-或CD14+CD16+单核细胞中表1,3,5,7,9,11,12,14,16,或18中列出的一种或多种(例如至少2、3、4、5或6种)microRNA的水平，和/或表21中列出的一种或多种(例如至少2、3、4、5或6种)炎症标志物的水平降低或没有显著改变，和/或如果与表2,4,6,8,10,13,15,17,和19中列出的一种或多种microRNA的参考水平，和/或表20中列出的一种或多种炎症标志物的参考水平相比，来自受试者的脑脊液或CD14+CD16-或CD14+CD16+单核细胞中表2,4,6,8,10,13,15,17,和19中列出的一种或多种(例如至少2、3、4、5或6种)microRNA的水平，和/或表20中列出的一种或多种(例如至少2、3、4、5或6种)炎症标志物的水平增加或没有显著改变，则鉴定受试者具有降低的发生神经退行性病症的风险。
在一些实施方案中，根据与如上文描述诊断方法的部分中所述的参考值相比受试者的脑脊液或CD14+CD16-或CD14+CD16+单核细胞中表1-19中列出的一种或多种(例如至少2、3、4、5或6种)microRNA和/或表20和21中列出的一种或多种(例如至少2、3、4、5或6种)炎症标志物的相对水平，可以鉴定受试者具有增加的或降低的发生神经退行性病症的风险。例如，如用于诊断患有神经退行性病症的受试者中所述的受试者的脑脊液或CD14+CD16-或CD14+CD16+单核细胞中表1,3,5,7,9.11,12,14,16,和18中列出的一种或多种(例如至少2、3、4、5或6种)microRNA和/或表21中列出的一种或多种(例如至少2、3、4、5或6种)炎症标志物的水平的增加(与参考水平相比)，可以同样地用来鉴定具有增加的发生神经退行性病症的风险的受试者。类似地，如用于诊断患有神经退行性病症的受试者中所述的受试者的脑脊液或CD14+CD16-或CD14+CD16+单核细胞中表2,4,6,8,10,13,15,17,和19中列出的一种或多种(例如至少2、3、4、5或6种)microRNA和/或表20中列出的一种或多种(例如至少2、3、4、5或6种)炎症标志物的水平的降低(与参考水平相比)，可以同样地用来鉴定具有增加的发生神经退行性病症的风险的受试者。
在一些实施方案中，当一种或多种microRNA水平的降低或一种或多种炎症标志物水平的降低表明应当做出神经退行性病症的诊断(详情请见上文描述诊断方法的部分)时，来自受试者的脑脊液或CD14+CD16-或CD14+CD16+单核细胞中表2,4,6,8,10,13,15,17,或19中列出的一种或多种(例如至少2、3、4、5或6种)microRNA的水平和/或表20中列出的一种或多种(例如至少2、3、4、5或6种)炎症标志物的水平增加(与参考水平相比)，表明受试者具有降低的发生神经退行性病症的风险。在一些实施方案中，当一种或多种microRNA水平的增加或一种或多种炎症标志物水平的增加表明应当做出神经退行性病症的诊断(详情请见上文描述诊断方法的部分)时，受试者的脑脊液或CD14+CD16-或CD14+CD16+单核细胞中表1,3,5,7,9,11,12,14,16,和18中列出的一种或多种(例如至少2、3、4、5或6种)microRNA的水平和/或表21中列出的一种或多种(例如至少2、3、4、5或6种)炎症标志物的水平降低(与参考水平相比)，表明受试者具有降低的发生神经退行性病症的风险。
在本文中所述的任何方法中，风险增加或降低是相对于在表1-19中列出的一种或多种(例如至少2、3、4、5或6种)microRNA的水平中没有增加或降低，和/或在表20和21中列出的一种或多种(例如至少2、3、4、5或6种)炎症标志物的水平中没有增加或降低的受试者(例如使用本文中所述的任何方法没有诊断出患有神经退行性病症的受试者)而言的。
表1-19中列出的任何microRNA的水平和表20和21中列出的任何炎症标志物的水平可以用标准分子生物学方法(例如本文中所述的基于PCR和基于抗体的方法)实施。这些方法可以由任何医疗专业人员(例如医师、护士、医师助理、实验室人员、或护士助理)实施。
受试者在就诊时可以有一种或多种神经退行性病症的症状(例如本文中所述的任何神经退行性病症的症状)。受试者在就诊时也可以没有或仅有一种神经退行性病症的症状。受试者可以具有神经退行性病症的家族史(例如家族性ALS)。
对于被鉴定具有增加的发生神经退行性病症的风险的受试者可以施用治疗神经退行性病症的方法，或者可以施用新的或替代的神经退行性病症治疗方法。被鉴定具有增加的发生神经退行性病症的风险的受试者还可以接受更加激进的治疗处理(例如提高去诊所或医院的频度(periodicity))。
预测疾病进展速度的方法
还提供了用于预测患有神经退行性病症的受试者体内疾病进展速度的方法。这些方法包括确定来自受试者的脑脊液或CD14+CD16-或CD14+CD16+单核细胞中表1-19中列出的一种或多种(例如至少2、3、4、5或6种)microRNA和/或表20和21中列出的一种或多种(例如至少2、3、4、5或6种)炎症标志物的水平；将该一种或多种microRNA和/或一种或多种炎症标志物的水平与该一种或多种microRNA和/或一种或多种炎症标志物的参考水平进行比较。如果与表1,3,5,7,9,11,12,14,16,或18中列出的一种或多种microRNA的参考水平和/或与表21中列出的一种或多种炎症标志物的参考水平相比，来自受试者的脑脊液或CD14+CD16-或CD14+CD16+单核细胞中表1,3,5,7,9,11,12,14,16,或18中列出的一种或多种(例如至少2、3、4、5或6种)microRNA的水平增加，和/或表21中列出的一种或多种炎症标志物的水平增加；和/或如果与表2,4,6,8,10,13,15,17,和19中列出的一种或多种microRNA的参考水平和/或表20中列出的一种或多种炎症标志物的参考水平相比，来自受试者的脑脊液或CD14+CD16-或CD14+CD16+单核细胞中表2,4,6,8,10,13,15,17,和19中列出的一种或多种(例如至少2、3、4、5或6种)microRNA的水平和/或表20中列出的一种或多种(例如至少2、3、4、5或6种)炎症标志物的水平降低，则预测受试者具有增加的疾病进展速度。
在一些实施方案中，如果与表1,3,5,7,9,11,12,14,16,或18中列出的一种或多种microRNA的参考水平和/或与表21中列出的一种或多种炎症标志物的参考水平相比，来自受试者的脑脊液或CD14+CD16-或CD14+CD16+单核细胞中表1,3,5,7,9,11,12,14,16,或18中列出的一种或多种(例如至少2、3、4、5或6种)microRNA的水平，和/或表21中列出的一种或多种炎症标志物的水平降低或没有显著变化；和/或如果与表2,4,6,8,10,13,15,17,和19中列出的一种或多种microRNA的参考水平和/或表20中列出的一种或多种炎症标志物的参考水平相比，来自受试者的脑脊液或CD14+CD16-或CD14+CD16+单核细胞中表2,4,6,8,10,13,15,17,和19中列出的一种或多种(例如至少2、3、4、5或6种)microRNA的水平和/或表20中列出的一种或多种(例如至少2、3、4、5或6种)炎症标志物的水平增加或没有显著变化，则预测受试者具有降低的或平均速度的疾病进展速度。
在一些实施方案中，可以根据受试者的脑脊液或CD14+CD16-或CD14+CD16+单核细胞中表1-19中列出的一种或多种(例如至少2、3、4、5或6种)microRNA和/或表20和21中列出的一种或多种(例如至少2、3、4、5或6种)炎症标志物相对于如上文描述诊断方法的部分中所描述的参考值的相对表达，来预测受试者具有增加或降低的疾病进展速度。例如，在用于诊断患有神经退行性病症的受试者中所使用的来自受试者的脑脊液或CD14+CD16-或CD14+CD16+单核细胞中表1,3,5,7,9,11,12,14,16,和18中列出的一种或多种(例如至少2、3、4、5或6种)microRNA和/或表21中列出的一种或多种(例如至少2、3、4、5或6种)炎症标志物的水平的增加(与参考水平相比)可以同样地用来预测具有增加的疾病进展速度。类似地，在用于诊断患有神经退行性病症的受试者中所使用的受试者的脑脊液或CD14+CD16-或CD14+CD16+单核细胞中表2,4,6,8,10,13,15,17,和19中列出的一种或多种(例如至少2、3、4、5或6种)microRNA和/或表20中列出的一种或多种(例如至少2、3、4、5或6种)炎症标志物的水平的降低(与参考水平相比)可以同样地用于预测具有增加的疾病进展速度。
在一些实施方案中，当一种或多种microRNA水平的降低或一种或多种炎症标志物水平的降低表明应当做出神经退行性病症的诊断(详情请见上文描述诊断方法的部分)时，来自受试者的脑脊液或CD14+CD16-或CD14+CD16+单核细胞中表2,4,6,8,10,13,15,17,或19中列出的一种或多种(例如至少2、3、4、5或6种)microRNA的水平和/或表20中列出的一种或多种(例如至少2、3、4、5或6种)炎症标志物的水平增加(与参考水平相比)，可以用于预测更低或平均水平的疾病进展速度。在一些实施方案中，当一种或多种microRNA水平的增加或一种或多种炎症标志物水平的增加表明应当做出神经退行性病症的诊断(详情请见上文描述诊断方法的部分)时，来自受试者的脑脊液或CD14+CD16-或CD14+CD16+单核细胞中表1,3,5,7,9,11,12,14,16,和18中列出的一种或多种(例如至少2、3、4、5或6种)microRNA的水平和/或表21中列出的一种或多种(例如至少2、3、4、5或6种)炎症标志物的水平降低(与参考水平相比)，可以用于预测降低的水平的或平均水平的疾病进展速度。
在一些实施方案中，疾病进展的速度是神经退行性病症一种或多种(例如1、2、3或4种)症状(例如共济失调)出现的速度、神经退行性病症症状强度增加(恶化)的速度、神经退行性病症的一种或多种症状的频率，神经退行性病症的一种或多种症状的持续时间、或受试者的寿命。例如，疾病进展速度增加可以表现为：神经退行性病症的一种或多种(新)症状的出现速度的增加，神经退行性病症一种或多种症状强度增加(恶化)的速度的增加，神经退行性病症的一种或多种症状的持续时间的增加，或受试者寿命的降低。
可以把使用本文中所描述的方法确定的疾病进展速度与CSF或CD14+CD16-或CD14+CD16+单核细胞中表1-19中列出的一种或多种(例如至少2、3、4、5或6种)microRNA的水平和/或表20和21中列出的一种或多种(例如至少2、3、4、5或6种)炎症标志物的水平没有增加或降低的受试者的疾病进展速度进行比较。在一些实施方案中，可以将疾病进展速度与所有被诊断患有相同神经退行性病症的受试者的疾病进展平均速度进行比较。
表1-19中的任何一种microRNA的水平和表20和21中的任何一种炎症标志物的水平可以用标准分子生物学方法(例如本文中所述的基于PCR和基于抗体的方法)实施。这些方法可以由任何医疗专业人员(例如医师、护士、医师助理、实验室人员、或护士助理)实施。
受试者在就诊时可以有神经退行性病症的一种或多种(例如1、2、3或4种)症状(例如本文中所述的神经退行性病症的任何症状)。受试者在就诊时也可以没有症状或者仅有神经退行性病症的一种症状。受试者可以具有神经退行性病症的家族史(例如家族性ALS)。在一些方案中，受试者可以已经被诊断患有神经退行性病症。
这些方法的一些实施方案进一步包括向被预测具有增加的疾病进展速度的受试者施用治疗。在一些实施方案中，对被预测具有增加的疾病进展速度的受试者施用更积极的治疗(例如增加临床访问的频度)。
选择受试者参与临床研究的方法
还提供了选择受试者参与临床研究的方法。这些方法包括确定来自受试者的脑脊液或CD14+CD16-或CD14+CD16+单核细胞中表1-19中列出的一种或多种(例如至少2、3、4、5或6种)microRNA和/或表20和21中列出的一种或多种(例如至少2、3、4、5或6种)炎症标志物的水平；将该一种或多种microRNA的水平和/或该一种或多种炎症标志物的水平与该一种或多种microRNA的参考水平和/或该一种或多种炎症标志物的参考水平进行比较，并选择与参考水平相比，受试者的脑脊液或CD14+CD16-或CD14+CD16+单核细胞中一种或多种microRNA和/或一种或多种炎症标志物的水平增加或降低的受试者(如下文中详细说明的)参与临床研究。在一些实施方案中，如果与表1,3,5,7,9,11,12,14,16,或18中列出的一种或多种microRNA的参考水平和/或表21中列出的一种或多种炎症标志物的参考水平相比，来自受试者的脑脊液或CD14+CD16-或CD14+CD16+单核细胞中表1,3,5,7,9,11,12,14,16,或18中列出的一种或多种microRNA的水平和/或表21中列出的一种或多种炎症标志物的水平增加；和/或如果与表2,4,6,8,10,13,15,17,和19中列出的一种或多种microRNA的参考水平和/或表20中列出的一种或多种炎症标志物的参考水平相比，来自受试者的脑脊液或CD14+CD16-或CD14+CD16+单核细胞中表2,4,6,8,10,13,15,17,和19中列出的一种或多种microRNA的水平和/或表20中列出的一种或多种炎症标志物的水平降低，则选择该受试者参与临床研究。
在一些实施方案中，如果与表1,3,5,7,9,11,12,14,16,或18中列出的一种或多种microRNA的参考水平和/或表21中列出的一种或多种炎症标志物的参考水平相比，来自受试者的脑脊液或CD14+CD16-或CD14+CD16+单核细胞中表1,3,5,7,9,11,12,14,16,或18中列出的一种或多种(例如至少2、3、4、5或6种)microRNA的水平和/或表21中列出的一种或多种(例如至少2、3、4、5或6种)炎症标志物的水平降低或没有显著变化；和/或如果与表2,4,6,8,10,13,15,17,和19中列出的一种或多种microRNA的参考水平和/或表20中列出的一种或多种炎症标志物的参考水平相比，来自受试者的脑脊液或CD14+CD16-或CD14+CD16+单核细胞中表2,4,6,8,10,13,15,17,和19中列出的一种或多种microRNA的水平和/或表20中列出的一种或多种炎症标志物的水平增加或没有显著变化，则选择该受试者用于参与临床研究。
在一些实施方案中，可以根据受试者的脑脊液或CD14+CD16-或CD14+CD16+单核细胞中表1-19中列出的一种或多种(例如至少2、3、4、5或6种)microRNA和/或表20和21中列出的一种或多种(例如至少2、3、4、5或6种)炎症标志物相对于如上文描述诊断方法的部分中所述的参考值的相对表达，选择受试者参与临床研究。例如，在诊断患有神经退行性病症的受试者中所使用的来自受试者的脑脊液或CD14+CD16-或CD14+CD16+单核细胞中的表1,3,5,7,9,11,12,14,16,和18中列出的一种或多种(例如至少2、3、4、5或6种)microRNA和/或表21中列出的一种或多种(例如至少2、3、4、5或6种)炎症标志物的水平的增加(与参考水平相比)，可以同样地用于选择受试者参与临床研究。类似地，诊断患有神经退行性病症的受试者中所使用的来自受试者的脑脊液或CD14+CD16-或CD14+CD16+单核细胞中表2,4,6,8,10,13,15,17,或19中列出的一种或多种(例如至少2、3、4、5或6种)microRNA和/或表20中列出的一种或多种(例如至少2、3、4、5或6种)炎症标志物的水平的降低(与参考水平相比)，可以同样地用于选择受试者参与临床研究。
在一些实施方案中，当一种或多种microRNA水平的降低或一种或多种炎症标志物水平的降低表明应当做出神经退行性病症的诊断(详情请见上文描述诊断方法的部分)时，来自受试者的脑脊液或CD14+CD16-或CD14+CD16+单核细胞中表2,4,6,8,10,13,15,17,或19中列出的一种或多种(例如至少2、3、4、5或6种)microRNA的水平和/或表20中列出的一种或多种(例如至少2、3、4、5或6种)炎症标志物的水平增加或没有显著变化(与参考水平相比)，可以用于选择受试者参与临床研究(例如作为对照受试者)。在一些实施方案中，当一种或多种microRNA水平的增加或一种或多种炎症标志物水平的增加表明应当做出神经退行性病症的诊断(详情请见上文描述诊断方法的部分)时，来自受试者的脑脊液或CD14+CD16-或CD14+CD16+单核细胞中表1,3,5,7,9,11,12,14,16,和18中列出的一种或多种(例如至少2、3、4、5或6种)microRNA的水平和/或表21中列出的一种或多种(例如至少2、3、4、5或6种)炎症标志物的水平降低或没有显著变化(与参考水平相比)，可以用于选择受试者参与临床研究。
表1-19中列出的任何microRNA的水平和表20和21中列出的任何炎症标志物的水平可以用标准分子生物学方法(例如本文中所述的基于PCR和基于抗体的方法)实施。这些方法可以由任何医疗专业人员(例如医师、护士、医师助理、实验室人员、或护士助理)实施。
在一些实施方案中，受试者就诊时可以有一种或多种神经退行性病症的症状(例如本文中所述的任何神经退行性病症的症状)。受试者在就诊时也可以没有或仅有一种神经退行性病症的症状。受试者可以具有神经退行性病症的家族史(例如家族性ALS)。在一些实施方案中，受试者可以已经被诊断患有神经退行性病症。
治疗方法
还提供了用于治疗神经退行性病症的方法，其包括向受试者施用至少一种(例如至少2、3、4、5或6种)作用剂(例如核酸)，其可以降低表1,3,5,7,9,11,12,14,16,或18中列出的一种或多种(例如至少2、3、4、5或6种)microRNA的水平或活性(例如抑制性核酸，如antagomir)，和/或增加表2,4,6,8,10,13,15,17,或19中列出的一种或多种(例如至少2、3、4、5或6种)microRNA的水平或活性(例如有义核酸)。还提供了用于治疗神经退行性病症(例如ALS或MS)的方法，其包括向受试者施用至少一种(例如至少2、3、4、5或6种)作用剂(例如核酸)，其可以降低表21中列出的一种或多种(例如至少2、3、4、5或6种)炎症标志物的表达(例如蛋白或mRNA)或活性(例如抑制性核酸或抗体)，和/或增加表20中列出的一种或多种(例如至少2、3、4、5或6种)基因的表达(例如蛋白或mRNA)或活性(例如有义核酸)。在一些实施方案中，进一步用本文中所述的任何诊断方法或本文中所述的任何预测具有发生神经退行性病症的风险的受试者的方法鉴定或选择受试者进行治疗。
在一些实施方案中，对受试者施用至少一种包含与hsa-miR-155中存在的连贯序列(例如在成熟或前体hsa-miR-155中存在的连贯序列)互补的序列的抑制性核酸。在非限制性实施方案中，抑制性核酸可以是反义核苷酸、核酶、siRNA或antagomir。在一些实施方案中，所述至少一种抑制性核酸被注射到受试者的脑脊液中。在一些实施方案中，所述注射是颅内注射或鞘内注射。在一些实施方案中，所述至少一种抑制性核酸与一种或多种阳离子聚合物和/或阳离子脂质体(例如本文中所述的或本领域已知的任何阳离子聚合物)复合。降低特定靶miRNA(例如hsa-miR-155)表达和/或活性的antagomir可以用本领域已知的方法设计(见例如Krutzfeld et al.,Nature438:685-689,2005)。本文中描述了用于设计和制作antagomir和其它类型的抑制性核酸的其它示例方法。
在一些实施方案中，可降低miR-155水平的抑制性核酸是antogmir-155LNA序列+TC+AC+A+A+TTA+G+C+AT+T+A(SEQ ID NO:262)(其中+指示存在LNA部分)。用于设计靶向microRNA分子的antagomir的方法在Obad et al.,Nature Genetics43:371-378,2011中有描述。用于降低hsa-miR-155的表达水平的其它抑制性核酸在Worm et al.,Nucleic AcidsRes.37:5784-5792,2009,和Murugaiyan et al.,J.Immunol.187:2213-2221,2011中有描述。
可以对受试者施用至少一种(例如至少2、3、4或5种)剂量的作用剂(例如一种或多种抑制性核酸)。作用剂(例如一种或多种抑制性核酸)可以每天至少1次(例如每天2次，每天3次，和每天4次)，每周至少1次(例如每周2次，每周3次，每周4次)，和/或每月至少1次施用给受试者。受试者的治疗(例如周期性施用作用剂)可以持续一个较长的时间段(例如至少1个月、2个月、6个月、1年、2年、3年、4年或5年)。如本文中详细描述的，施用给受试者的作用剂剂量可以由医师考虑到多种生理因素加以确定，包括但不仅限于，受试者的性别、受试者的体重、受试者的年龄、和其它医学条件的存在。作用剂可以经口、静脉内、动脉内、皮下、肌肉内、颅骨内、或通过注射到脑脊液中施用给受试者。类似地，作用剂可以被配制成固体(例如用于口服)或生理可接受的液体载体(例如盐水)(例如用于静脉内、动脉内、皮下、肌肉内、脑脊髓(鞘内)或颅骨内给药)。在一些实施方案中，作用剂(例如一种或多种抑制性核酸)可以通过注射给药或通过输注一段时间给药。
下文描述待施用给受试者用于治疗神经退行性病症的作用剂，并且它们可以任何组合使用(例如下文所述作用剂或作用剂类型组合中的至少1、2、3、4、或5种)。
抑制性核酸
可用于本文中描述的方法的抑制性作用剂包括抑制性核酸分子，其可以降低表1,3,5,7,9,11,12,14,16,或18中列出的任何microRNA(例如成熟microRNA或前体microRNA)(例如hsa-miR-155)的表达或活性，或降低任何编码表21列出的炎症标志物的mRNA的表达或活性。
可用于本方法和组合物的抑制性核酸包括反义寡核苷酸、核酶、外部引导序列(EGS)寡核苷酸、siRNA化合物、单链或双链RNA干扰(RNAi)化合物，例如siRNA化合物、经过修饰的碱基/锁核酸(LNA)、antagomir、肽核酸(PNAs)和其它与靶核酸的至少一部分杂交并调节其功能的寡聚体化合物或寡核苷酸模拟物。在一些实施方案中，抑制性核酸包括反义RNA、反义DNA、嵌合反义寡核苷酸、包含经过修饰的接头的反义寡核苷酸、干扰RNA(RNAi)、短干扰RNA(siRNA)；微干扰RNA(miRNA)；小时序RNA(stRNA)；或短发夹RNA(shRNA)；小RNA诱导的基因活化(RNAa)；小活化RNA(saRNAs)；或其组合。见例如WO2010/040112。
在一些实施方案中，抑制性核酸的长度为10-50,13-50,或13-30个核苷酸。本领域的普通技术人员会意识到，这代表具有长度为10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,或50个核苷酸或其中任意范围的反义部分的寡核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸的长度为15个核苷酸。在一些实施方案中，本发明的反义或寡核苷酸化合物的长度为12或13-30个核苷酸。本领域的普通技术任意会意识到，这代表了具有长度为12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,或30个核苷酸或其中任意范围的反义部分的核苷酸。
在一些实施方案中，抑制性核酸是嵌合寡核苷酸，其含有两个或多个化学上不同的区域，每一个部分由至少一个核苷酸构成。这些寡核苷酸通常含有至少一个经过修饰的核苷酸区域，该区域提供一种或多种有益性质(例如增加核酶耐受性、增加细胞的摄取、增加与靶的亲和力)和充当能够切割RNA:DNA或RNA:RNA杂交体的酶的底物的区域。本发明的嵌合抑制性核酸可以被形成为两个或多个如上文所述的寡核苷酸、经过修饰的寡核苷酸、寡核苷和/或寡核苷酸模拟物的复合结构。这些化合物在本领域也被称作杂交体或gapmer。教导这些杂交体结构的制备的代表性美国专利包括，但不仅限于，美国专利Nos.5,013,830；5,149,797；5,220,007；5,256,775；5,366,878；5,403,711；5,491,133；5,565,350；5,623,065；5,652,355；5,652,356；和5,700,922，本文援引并入其内容。
在一些实施方案中，抑制性核酸包含至少一个在糖的2'位被修饰的核苷酸，最优选的是2'-O-烷基、2'-O-烷基-O-烷基或2'-氟-修饰的核苷酸。在其它优选实施方案中，RNA修饰包括嘧啶核糖上的2'-氟、2'-氨基、和2'O-甲基修饰，非碱性残基，或RNA3'端的倒置碱基。这些修饰通常被整合到寡核苷酸中，并且这些寡核苷酸已经显示对给定靶标具有比2'-脱氧寡核苷酸更高的Tm(即更高的靶结合亲和力)。
已经显示，许多核苷酸和核苷修饰可以使得包含它们的寡核苷酸比原始寡核苷酸对核酸酶消化的更有抗性——经过修饰的寡聚体保持完整的时间可以比未经修饰的寡核苷酸更长。经过修饰的寡核苷酸的具体实例包括含有修饰主链的寡核苷酸，例如硫代磷酸酯、磷酸三酯、甲基膦酸酯、短链烷基或环烷基糖间键(intersugar linkage)、或短链杂原子或杂环糖间键。更优选的是具有硫代磷酸酯主链的寡核苷酸和具有杂原子主链的寡核苷酸，特别是CH2-NH-O-CH2,CH,～N(CH3)～O～CH2(称作亚甲基(甲亚氨基)或称MMI主链],CH2--O--N(CH3)-CH2,CH2-N(CH3)-N(CH3)-CH2和O-N(CH3)-CH2-CH2主链(其中天然的磷酸二酯主链用O-P--O-CH代表)；酰胺主链(见DeMesmaeker et al.,Ace.Chem.Res.28:366-374,1995)；吗啉代(morpholino)主链结构(见美国专利No.5,034,506)；肽核酸(PNA)主链(其中寡核苷酸的磷酸二酯主链被聚酰胺主链代替，核苷酸直接或间接与聚酰胺主链的氮杂氮(aza nitrogen)原子结合，见Nielsen et al.,Science254:1497,1991)。含磷键包括，但不仅限于，硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基和其它烷基膦酸酯，包括3'-亚烷基膦酸酯和手性膦酸酯、亚膦酸酯、氨基磷酸酯，包括3'-氨基氨基磷酸酯和氨基烷基氨基磷酸酯、硫羰基氨基磷酸酯(thionophosphoramidate)、硫羰基烷基膦酸酯、硫羰基烷基磷酸三酯,和具有正常3'-5'键的硼烷磷酸酯，以及这些的2'-5'连接模拟物，和具有相反极性的那些，其中相邻的核苷单元配对为3'-5'到5'-3'或2'-5'到5'-2'连接；见美国专利Nos.3,687,808；4,469,863；4,476,301；5,023,243；5,177,196；5,188,897；5,264,423；5,276,019；5,278,302；5,286,717；5,321,131；5,399,676；5,405,939；5,453,496；5,455,233；5,466,677；5,476,925；5,519,126；5,536,821；5,541,306；5,550,111；5,563,253；5,571,799；5,587,361；和5,625,050(本文援引并入其中每一个的内容)。
基于吗啉代(Morpholino)的寡聚体化合物在下列文献中有描述：Braasch etal.,Biochemistry41(14):4503-4510,2002；Genesis,volume30,issue3,2001；Heasman,J.,Dev.Biol.,243:209-214,2002；Nasevicius et al.,Nat.Genet.26:216-220,2000；Lacerra et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.97:9591-9596,2000；和美国专利No.5,034,506。环己烯核酸寡核苷酸模拟物在Wang et al.,J.Am.Chem.Soc.122,8595-8602,2000中有描述。
其中不含磷原子的经修饰的寡核苷酸主链具有通过下述核苷间连接形成的主链：短链烷基或环烷基核苷间连接，混合的杂原子和烷基或环烷基核苷间连接，或一个或多个短链杂原子的或杂环的核苷间连接。这些包括具有吗啉代连接(部分地由核苷的糖部分形成)的那些主链；硅氧烷主链；硫化物、亚砜和砜主链；formacetyl和thioformacetyl主链；亚甲基formacetyl和thioformacetyl主链；核糖乙酰基主链；含烯烃的主链；氨基磺酸酯主链；亚甲基亚氨基和亚甲基肼基主链；磺酸酯和磺酰胺主链；酰胺主链；及具有混合的N、O、S和CH2组成部分的其它主链；见美国专利Nos.5,034,506；5,166,315；5,185,444；5,214,134；5,216,141；5,235,033；5,264,562；5,264,564；5,405,938；5,434,257；5,466,677；5,470,967；5,489,677；5,541,307；5,561,225；5,596,086；5,602,240；5,610,289；5,602,240；5,608,046；5,610,289；5,618,704；5,623,070；5,663,312；5,633,360；5,677,437；和5,677,439(本文援引并入其中每一个的内容)。
还可以在2'位包括一个或多个被取代的糖部分，例如如下面的一个：OH,SH,SCH3,F,OCN,OCH3OCH3,OCH3O(CH2)n CH3,O(CH2)n NH2或O(CH2)n CH3，其中n是1-大约10；Ci-C10低级烷基、烷氧基烷氧基、取代的低级烷基、烷芳基或芳烷基；Cl；Br；CN；CF3；OCF3；O-、S-或N-烷基；O-、S-或N-烯基；SOCH3；SO2CH3；ONO2；NO2；N3；NH2；杂环烷基；杂环烷芳基；氨基烷基氨基；聚烷基氨基；取代的甲硅烷基；RNA切割基团；报告基团；插层剂；用于提高寡核苷酸的药代动力学性质的基团；或用于提高寡核苷酸的药效动力学性质的基团以及具有相似性质的其它取代基。优选的修饰包括2'-甲氧基乙氧基[2'-0-CH2CH2OCH3,也称作2'-O-(2-甲氧乙基)](Martin et al.,HeIv.Chim.Acta78:486,1995)。其它优选的修饰包括2'-甲氧基(2'-0-CH3),2'-丙氧基(2'-OCH2CH2CH3)和2'-氟(2'-F)。类似的修饰还可以在寡核苷酸的其它位置处进行，特别是3'端核苷酸糖的3'位和5'端核苷酸的5'位。寡核苷酸还可以具有糖模拟物，例如环丁基代替戊呋喃糖基。
并且/或者，抑制性核酸还可以包括核碱基(本领域通常简称为“碱基”)修饰或取代。如本文中所使用的，“未修饰的”或“天然的”核碱基包括腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。经过修饰的核碱基包括在天然核酸中仅不常见或短暂出现的核碱基，例如次黄嘌呤，6–甲基腺嘌呤，5–甲基嘧啶，特别是5–甲基胞嘧啶(也称作5-甲基-2脱氧胞嘧啶并且经常被称作5-Me-C)、5–羟甲基胞嘧啶(HMC)，糖基HMC和龙胆二糖基HMC，以及合成的核碱基，例如，2-氨基腺嘌呤，2-(甲氨基)腺嘌呤，2-(咪唑烷基)腺嘌呤，2-(氨基烷基氨基)腺嘌呤或或其他杂取代的烷基腺嘌呤，2-硫尿嘧啶，2–硫胸腺嘧啶，5-溴尿嘧啶，5-羟甲基尿嘧啶，8-氮鸟嘌呤，7-去氮鸟嘌呤，N6(6-氨基己基)腺嘌呤，和2,6-二氨基嘌呤。见Kornberg,A.,DNA Replication,W.H.Freeman&Co.,San Francisco,1980,pp75-77；和Gebeyehu et al.,Nucl.Acids Res.15:4513,1987。也可以包含本领域已知的“通用”碱基，例如肌苷。5-Me-C取代已经显示可增加核酸二聚体稳定性达0.6-1.2<0>C(Sanghvi,Y.S.,in Crooke,S.T.and Lebleu,B.,Eds.,Antisense Research and Applications,CRCPress,Boca Raton,1993,pp.276-278)，并且是目前优选的碱基取代。
对于给定寡核苷酸的而言，其所有位置上不一定是一致的，实际上，在单个寡核苷酸中甚至在寡核苷酸的单个核苷中，可以存在多于一种前述的修饰。
在一些实施方案中，核苷酸单位的糖和核苷间连接，即主链，均被新基团代替。碱基单位则被保留以便与合适的核酸靶化合物杂交。一种这样的寡聚体化合物被称作肽核酸(PNA)，它是一种已经显示具有优良杂交性质的寡核苷酸模拟物。在PNA化合物中，寡核苷酸的糖主链被含酰胺的主链，例如氨乙基甘氨酸主链所替代。核碱基被保留，并直接或间接与主链酰胺部分的氮杂氮原子结合。教导制备PNA化合物的代表性美国专利包括，但不仅限于，美国专利Nos.5,539,082；5,714,331；和5,719,262，本文援引并入其中每一个的内容。PNA化合物的进一步的教导可以在Nielsen et al,Science254:1497-1500,1991中找到。
抑制性核酸还可以包含一种或多种核碱基(在本领域中经常简称作“碱基”)修饰或取代。如本文中所使用的，“未修饰的”或“天然的”核碱基包括腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)等嘌呤碱基，和胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)等嘧啶碱基。经过修饰的核碱基包括其它合成和天然的核碱基，例如5-甲基胞嘧啶(5-Me-C)、5-羟甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基和其它烷基衍生物，腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其它烷基衍生物，2-硫尿嘧啶、2-硫胸腺嘧啶和2-硫胞嘧啶，5-卤代尿嘧啶和胞嘧啶，5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶，6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶，5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、5-硫尿嘧啶，8-卤代、8-氨基、8-硫、8-硫烷基、8-羟基和其它8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤，5-卤代特别是5-溴、5-三氟甲基和其它5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶，7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤，8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤，7-脱氮鸟嘌呤和7-脱氮腺嘌呤，和3脱氮鸟嘌呤和3-脱氮腺嘌呤。
进一步，核碱基包括在美国专利No.3,687,808中公开的那些，在'The ConciseEncyclopedia of Polymer Science And Engineering',858-859页,Kroschwitz,J.I.编辑，John Wiley&Sons,1990中公开的那些，在Englisch et al.,Angewandle Chemie,International Edition',1991,30,第613页中公开的那些，在Sanghvi,Y.S.,第15章,Antisense Research and Applications',289-302页,Crooke,S.T.and Lebleu,B.ea.,CRC Press,1993中公开的那些。这些核碱基中的某一些可特别用于增加本发明寡聚化合物的结合亲和性。这些包括5-取代的嘧啶、6-氮杂嘧啶和N-2、N-6和0-6取代的嘌呤，包括2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。5-甲基胞嘧啶取代已经显示可提高合适二聚体稳定性达0.6-1.2<0>C(Sanghvi,Y.S.,Crooke,S.T.and Lebleu,B.,Eds,'Antisense Research and Applications',CRC Press,Boca Raton,1993,276-278页)，是目前优选的碱基取代，当与2'-O-甲氧基乙基糖修饰组合使用时则更加是特别优选的。经过修饰的核碱基在下列文献中有描述：美国专利Nos.3,687,808,以及4,845,205；5,130,302；5,134,066；5,175,273；5,367,066；5,432,272；5,457,187；5,459,255；5,484,908；5,502,177；5,525,711；5,552,540；5,587,469；5,596,091；5,614,617；5,750,692,和5,681,941(本文援引并入其中每一个的内容)。
在一些实施方案中，抑制性核酸与一个或多个可提高寡核苷酸活性、细胞分布或细胞摄取的部分或偶联物化学连接。这样的部分包括，但不仅限于，脂质部分如胆固醇部分(Letsinger et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86:6553-6556,1989),胆酸(Manoharanet al.,Bioorg.Med.Chem.Lett.4:1053-1060,1994),硫酯例如己基-S-三苯甲基硫醇(Manoharan et al,Ann.N.Y.Acad.Sci.660:306-309,1992；Manoharan et al.,Bioorg.Med.Chem.Lett.3:2765-2770,1993),硫胆固醇(Oberhauser et al.,Nucl.AcidsRes.20,533-538,1992),脂肪链，例如十二烷二醇(dodecandiol)或十一烷基残基(Kabanovet al.,FEBS Lett.259:327-330,1990；Svinarchuk et al.,Biochimie75:49-54,1993),磷脂例如二-(十六烷基)-消旋-甘油(di-hexadecyl-消旋-glycerol)或三乙基氨1,2-二-O-十六烷基-消旋-甘油-3-H-磷酸酯(triethylammonium1,2-di-O-hexadecyl-rac-glycero-3-H-phosphonate)(Manoharan et al.,Tetrahedron Lett.36:3651-3654,1995；Shea et al.,Nucl.Acids Res.18:3777-3783,1990),聚胺或聚乙二醇链(Mancharan etal.,Nucleosides&Nucleotides14:969-973,1995)，或金刚烷乙酸(Manoharan et al.,Tetrahedron Lett.36:3651-3654,1995)，棕榈酰基部分(Mishra et al.,Biochim.Biophys.Acta1264:229-237,1995)，或十八胺或己胺-羰基-t氧代胆固醇部分(hexylamino-carbonyl-t oxycholesterol moiety)(Crooke et al.,J.Pharmacol.Exp.Ther.277:923-937,1996)。另见美国专利Nos.4,828,979；4,948,882；5,218,105；5,525,465；5,541,313；5,545,730；5,552,538；5,578,717,5,580,731；5,580,731；5,591,584；5,109,124；5,118,802；5,138,045；5,414,077；5,486,603；5,512,439；5,578,718；5,608,046；4,587,044；4,605,735；4,667,025；4,762,779；4,789,737；4,824,941；4,835,263；4,876,335；4,904,582；4,958,013；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,245,022；5,254,469；5,258,506；5,262,536；5,272,250；5,292,873；5,317,098；5,371,241,5,391,723；5,416,203,5,451,463；5,510,475；5,512,667；5,514,785；5,565,552；5,567,810；5,574,142；5,585,481；5,587,371；5,595,726；5,597,696；5,599,923；5,599,928和5,688,941(本文援引并入其中每一个的内容)。
这些部分或缀合物可以包含与功能基团，如伯羟基或仲羟基，共价连接的缀合基团。本发明的缀合基团包括插层剂、报告分子、聚胺、聚酰胺、聚乙二醇、聚酯，可提高寡聚体药效学性质的基团，和可提高寡聚体药代动力学性质的基团。典型的缀合基团包括胆固醇、脂质、磷脂、生物素、酚嗪、叶酸、菲啶、蒽醌、吖啶、荧光素、若丹明、香豆素和染料。在本发明内容中，可提高药效学性质的基团包括提高摄取、增强对降解的耐受性、和/或加强与靶核酸序列的特异性杂交的基团。在本发明内容中，可提高药代动力学性质的基团包括提高本发明化合物的摄取、分布、代谢或排泄的基团。代表性的缀合基团在1992年10月23日递交的国际专利申请No.PCT/US92/09196，以及美国专利No.6,287,860中有公开，本文援引并入其内容。缀合基团包括，但不仅限于，脂质部分如胆固醇部分、胆酸、硫酯例如己基-5-三苯甲硫醇、硫胆固醇，脂肪链例如十二烷二醇(dodecandiol)或十一基残基，磷脂例如二-(十六烷基)-消旋-甘油(di-hexadecyl-rac-glycerol)或三乙基氨1,2-二-O-十六烷基-消旋-甘油-3-H-磷酸酯(triethylammonium1,2-di-O-hexadecyl-rac-glycero-3-H-phosphonate)，聚胺或聚乙二醇链，或金刚烷乙酸、棕榈酰基部分，或十八胺或己胺-羰基-氧代胆固醇部分。见例如美国专利Nos.4,828,979；4,948,882；5,218,105；5,525,465；5,541,313；5,545,730；5,552,538；5,578,717,5,580,731；5,580,731；5,591,584；5,109,124；5,118,802；5,138,045；5,414,077；5,486,603；5,512,439；5,578,718；5,608,046；4,587,044；4,605,735；4,667,025；4,762,779；4,789,737；4,824,941；4,835,263；4,876,335；4,904,582；4,958,013；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,245,022；5,254,469；5,258,506；5,262,536；5,272,250；5,292,873；5,317,098；5,371,241,5,391,723；5,416,203,5,451,463；5,510,475；5,512,667；5,514,785；5,565,552；5,567,810；5,574,142；5,585,481；5,587,371；5,595,726；5,597,696；5,599,923；5,599,928和5,688,941(本文援引并入其中每一个的内容)。
可用于本发明的抑制性核酸与靶miRNA互补充分互补，即充分良好地杂交并具有充分的特异性，以给出期望的效果。“互补”是指两条包含天然或非天然存在的碱基或其类似物的序列之间通过氢键配对的能力。例如，如果抑制性核酸某一位置处的碱基能够与miRNA相应位置处的碱基形成氢键键合，那么这些碱基被认为在该位置彼此互补。在一些实施方案中，不需要100％互补。在一些实施方案中，需要100％互补。可以使用常规方法设计以充分的特异性结合靶序列的抑制性核酸。
尽管在本文中公开了某些示例性靶片段的具体序列，本领域的技术人员会意识到这些只是出于举例说明和描述本发明范围之内的特定实施方案。本领域的普通技术人员考虑本公开可以容易地鉴定其他的靶片段。包含种子序列内(或紧邻种子序列)的至少5个连贯核苷酸片段、长度为5,6,7,8,9,10或更多个核苷酸的靶区段也被认为适合于靶定。在一些实施方案中，靶区段可以包括如下的序列，其包含种子序列之一的自5'端起的至少5个连贯核苷酸(其余的核苷酸是同一RNA中的连续序列段，其从种子序列5'端直接上游开始延伸，至抑制性核酸含有5至约30个核苷酸为止)。在一些实施方案中，靶片段以这样的RNA序列为代表，其包含自种子序列之一的3'末端开始的至少5个连贯核苷酸(其余的核苷酸是同一RNA的连续序列段，从靶区段的3'端直接下游延伸，至抑制性核酸含有约5个至30个核苷酸为止)。本领域技术人员在掌握了本文中所提供的序列的基础上，能够在无需过度实验的情况下鉴定更优选的用于靶定的区域。在一些实施方案中，抑制性核酸含有与靶(例如靶miRNA，例如成熟或前体hsa-miR-155，或靶mRNA)中存在的至少5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,或25个连贯核苷酸互补的序列。
一旦鉴定了一个或多个靶区、区段或位点，便可以选择与靶充分互补的抑制性核酸，即充分良好地杂交并具有充分的特异性(即不会与其它非靶RNA实质性杂交)，从而给出期望效果。
在本发明的内容中，“杂交”意思是互补核苷或核苷酸碱基之间的氢键键合，其可以是Watson-Crick,Hoogsteen或反Hoogsteen氢键键合。例如，腺嘌呤和胸腺嘧啶是互补核碱基，二者通过形成氢键配对。如本文中所使用的，“互补”是指两个核苷酸之间精确配对的能力。例如，如果寡核苷酸某个位置处的核苷酸能够与miRNA或mRNA分子相同位置处的核苷酸氢键结合，则认为抑制性核酸和该miRNA或mRNA在该位置处彼此互补。当每个分子有足够数量的相应位置被彼此以氢键键合的核苷酸占据时，则抑制性核酸和miRNA或mRNA是彼此互补的。因此，“能特异性杂交”和“互补”系用于指示充分程度的互补性或精确配对，从而在抑制性核酸和miRNA靶之间发生稳定且特异的结合的术语。例如，如果抑制性核酸的一个位置处的碱基能够与miRNA或mRNA的相应位置处的碱基氢键键合，则认为这些碱基在该位置彼此互补。并不要求100％的互补性。
本领域中理解，互补核酸序列不需要与其靶核酸序列100％互补才能特异性杂交。出于本发明目的的互补核酸序列能够在与靶miRNA或mRNA分子特异性杂交结合时干扰靶miRNA或mRNA的正常功能，导致其表达或活性丧失，并且在期望特异性结合的条件下(例如在体内测定或治疗性处理的场合，在生理条件下；或者在体外测定的场合，在这些测定以合适的严格度进行的条件下)，它们具有足够程度的互补性，以避免该序列与非靶RNA序列发生非特异性结合。例如，严格的盐条件一般低于大约750mM NaCl和75mM柠檬酸三钠，优选地低于大约500mM NaCl和50mM柠檬酸三钠，更优选地低于大约250mM NaCl和25mM柠檬酸三钠。低严格度杂交可以在不存在有机溶剂，例如甲酰胺的情况下获得，而高严格度杂交可以在存在至少大约35％甲酰胺，更优选地至少大约50％甲酰胺的情况下获得。严格的温度条件一般包括至少大约30℃的温度，更优选地至少大约37℃，最优选地至少大约42℃。改变其他的参数，例如杂交时间、去污剂如十二烷基磺酸钠(SDS)的浓度，和包含或排除载体DNA，是本领域技术人员周知的。通过根据需要组合这些不同的条件而实现不同水平的严格度。在一个优选实施方案中，杂交在30℃，750mM NaCl,75mM柠檬酸三钠和1％SDS下发生。在一个更优选的实施方案中，杂交在37℃，500mM NaCl,50mM柠檬酸三钠,1％SDS,35％甲酰胺和100μg/ml变性鲑鱼精DNA(ssDNA)下发生。在一个最优选的实施方案中，杂交可以在42℃，250mM NaCl,25mM柠檬酸三钠,1％SDS,50％甲酰胺,和200μg/ml ssDNA下发生。本领域技术人员容易想到对这些条件的有用的改变。
对于大多数应用，杂交后的清洗步骤的严格度也有所变化。清洗严格度条件可以由盐浓度和温度限定。如上所述，可以通过降低盐浓度或提高温度而增加清洗严格度。例如，用于清洗步骤的严格的盐浓度优选地小于大约30mM NaCl和3mM柠檬酸三钠，最优选地小于大约15mM NaCl和1.5mM柠檬酸三钠。用于清洗步骤的严格的温度条件一般包括至少大约25℃的温度，更优选地至少大约42℃，再更优选地至少大约68℃。在一个优选实施方案中，清洗步骤在25℃，30mM NaCl,3mM柠檬酸三钠,0.1％SDS的条件下进行。在一个更优选的实施方案中，清洗步骤在42℃，15mM NaCl,1.5mM柠檬酸三钠,0.1％SDS的条件下进行。在一个更优选的实施方案中，清洗步骤在68℃，15mM NaCl,1.5mM柠檬酸三钠,和0.1％SDS的条件下进行。本领域技术人员容易想到对这些条件的其他改变，这些改变在例如下列文献中有描述：Benton and Davis(Science196:180,1977)；Grunstein and Hogness(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.72:3961,1975)；Ausubel et al.(Current Protocols inMolecular Biology,Wiley Interscience,New York,2001)；Berger and Kimmel(Guideto Molecular Cloning Techniques,1987,Academic Press,New York)；和Sambrook etal.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor LaboratoryPress,New York。
一般地，可用于本文中所述方法的抑制性核酸与靶核酸内的靶区域具有至少80％序列互补性，例如与miRNA内的靶区域有90％,95％,或100％序列互补性。例如，在反义化合物的20个核碱基中有18个与靶区域互补，因此可以与靶区域特异性杂交，这样的反义化合物代表90％的互补性。抑制性核酸与靶核酸中某个区域的百分比互补性可以使用基本局部比对搜索工具(BLAST程序)(Altschul et al.,J.Mol.Biol.215:403-410,1990；Zhang andMadden,Genome Res.7:649-656,1997)常规地加以确定。与miRNA或mRNA杂交的本发明反义化合物和其它化合物通过常规实验鉴定。一般地，抑制性核酸必须保持对其靶的特异性，即不得直接结合除意图的靶之外的转录本或者直接显著影响除意图的靶之外的转录本的表达水平。
关于抑制性核酸进一步的公开，请见US2010/0317718(反义寡聚体)；US2010/0249052(双链核糖核酸(dsRNA))；US2009/0181914和US2010/0234451(LNAs)；US2007/0191294(siRNA模拟物)；US2008/0249039(经修饰的siRNA)；和WO2010/129746和WO2010/040112(抑制性核酸)。
反义物
反义寡核苷酸通常被设计用于通过与靶结合并在转录、翻译或剪接水平上抑制表达而阻断DNA或RNA靶的表达。本发明的反义寡核苷酸是被设计成在严格条件下与靶microRNA或靶炎症标志物mRNA杂交的互补核酸序列。因此，选用与靶充分互补，即充分良好地杂交并具有足够特异性的寡核苷酸，以便给出期望的效果。
修饰碱基/锁定核酸(LNA)
在一些实施方案中，本文中所述方法中使用的抑制性核酸包含一个或多个经过修饰的键或碱基。修饰的碱基包括硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、肽核酸，或锁定核酸(LNA)分子。优选地，经过修饰的核苷酸是锁定核酸分子，包括[α]-L-LNA。LNA包括核糖核酸类似物，其中核糖环被2’-氧和4’-碳之间的亚甲基桥“锁住”—即含有至少一个LNA单体，即，一个2'-O,4'-C-亚甲基-β-D-呋喃核糖基核苷酸的寡核苷酸。LNA碱基形成标准的Watson-Crick碱基对，但是锁构型增加了碱基配对反应的速度和稳定性(Jepsen et al.,Oligonucleotides14:130-146,2004)。LNA具有与RNA碱基配对高于DNA的亲和性。这些性质使得LNA作为荧光原位杂交(FISH)和比较基因组杂交中的探针，用作miRNA的敲低(knockdown)工具，和用作靶mRNA或其它RNA(如本文中所述的miRNA和mRNA)的反义寡核苷酸特别有用。
LNA分子可以包括每条链含有10-30个，例如12-24个，例如12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,或30个核苷酸的分子，其中一条链与miRNA或mRNA中的靶区域基本上相同，例如至少80％(或更高，例如85％,90％,95％,或100％)相同，例如具有3、2、1或0个错配核苷酸。LNA分子可以用本领域已知的方法化学合成。
LNA分子可以使用任何本领域已知的方法设计；已知有大量的算法并且在市售(例如在互联网上，例如在exiqon.com)。见例如You et al.,Nuc.Acids.Res.34:e60,2006；McTigue et al.,Biochemistry43:5388-405,2004；和Levin et al.,Nucl.Acids.Res.34:e142,2006。例如，可以使用与用于设计反义寡聚体的方法相似的“基因步移(gene walk)”法优化LNA的抑制活性；例如，可以制备一系列跨越靶miRNA或mRNA长度的10-30个核苷酸的寡核苷酸，随后测试活性。任选地，在LNA之间可以留下缺口，例如5-10个寡核苷酸或更长的缺口，以减少合成和测试的寡核苷酸的数目。GC含量优选为大约30-60％。关于设计LNA的一般性指导是本领域已知的；例如，因为LNA序列会非常强地与其它LNA序列结合，因此优选地避免在LNA内有显著的互补性。应当尽可能避免出现连续三个或更多个G或C，或超过4个LNA残基(例如在非常短的(例如大约9-10nt)寡核苷酸中可能是不可能的)。在一些实施方案中，LNA是木糖(xylo)-LNA。
在一些实施方案中，LNA分子可以设计为靶定miRNA的特定区域。例如，可以靶定特定的功能区域，例如包含种子序列的区域。并且/或者，可以靶定高度保守的区域，例如通过比对完全不同的物种如灵长动物(如人)和啮齿动物(如小鼠)的序列并寻找高度相同的区域而鉴定的区域。百分比同一性可以使用碱基局部比对搜索工具(BLAST程序)(Altschulet al.,J.Mol.Biol.215:403-410,1990；Zhang and Madden,Genome Res.7:649-656,1997)常规地加以确定，例如使用默认参数。
关于LNA的额外的信息见美国专利Nos.6,268,490；6,734,291；6,770,748；6,794,499；7,034,133；7,053,207；7,060,809；7,084,125；和7,572,582；和美国授权前公开(Pre-Grant Pub)Nos.2010/0267018；2010/0261175；和2010/0035968；Koshkin et al.,Tetrahedron54:3607–3630,1998；Obika et al.,Tetrahedron Lett.39:5401–5404,1998；Jepsen et al.,Oligonucleotides14:130–146,2004；Kauppinen et al.,DrugDisc.Today2(3):287-290,2005；和Ponting et al.,Cell136(4):629–641,2009，及其中引用的参考文献。
另见USSN61/412,862，本文中援引并入其全部内容。
Antagomir
在一些实施方案中，反义物是antagomir。Antagomir是化学修饰的反义寡核苷酸，其靶定microRNA(例如，靶hsa-miR-155)。例如，本文中所述方法中使用的antagomir可以包含与大约12-25个核苷酸，优选地大约15-23个核苷酸的miRNA靶序列充分互补从而杂交的核苷酸序列。
一般地，antagomir包含胆固醇部分，例如位于3'-端。在一些实施方案中，antagomir具有以RNA酶保护和药理性质(如提高组织和细胞摄取)为目的的各种修饰。例如，除了上文关于反义寡聚体讨论的修饰之外，antagomir可以具有一个或多个糖和/或硫代磷酸酯主链的完全或部分2'-O-甲基化。硫代磷酸酯修饰提供针对RNA酶活性的保护，而且它们的亲脂性有助于提高组织摄取。在一些实施方案中，antagomir可以包含6个硫代磷酸酯主链修饰；2个硫代磷酸酯位于5'-端，4个位于3'-端。见例如Krutzfeldt et al.,Nature438:685-689,2005；Czech,N.Engl.J.Med.354:1194-1195,2006；Robertson etal.,Silence1:10,2010；Marquez and McCaffrey,Human Gene Ther.19(1):27–38,2008；van Rooij et al.,Circ.Res.103(9):919–928,2008；和Liu et al.,Int.J.Mol.Sci.9:978-999,2008。
可用于本发明的antagomir还可以在其长度或者构成该antagomir的核苷酸的数目上进行修饰。一般地，最佳功能的antagomir的长度为大约20-21个核苷酸，因为这个大小与大多数成熟microRNA的大小匹配。antagomir必须保持对其靶的特异性，即不得直接结合除意图的靶之外的转录本或直接显著影响除意图的靶之外的转录本的表达水平。
在一些实施方案中，抑制性核酸是锁定的并包含胆固醇部分(例如锁定antagomir)。
siRNA
在一些实施方案中，与靶miRNA或靶mRNA互补的核酸序列可以是干扰RNA，包括但不仅限于，小干扰RNA(“siRNA”)或小发夹RNA(“shRNA”)。用于构建干扰RNA的方法是本领域众所周知的。例如，干扰RNA可以用两个分离的寡核苷酸组装，其中一条链是有义链，另一条是反义链，其中反义链和有义链自我互补(即每条链包含与另一条链的核苷酸序列互补的核苷酸序列；例如反义链和有义链形成二聚体或双链结构)；反义链包含与靶核酸分子或其一部分(即不想要的基因)中核苷酸序列互补的核苷酸序列，有义链包含与靶核酸序列或其一部分对应的核苷酸序列。或者，干扰RNA是从单一寡核苷酸组装的，其中自我互补的有义和反义区域通过基于核酸或非基于核酸的接头连接。干扰RNA可以是具有双链体、不对称双链体、发夹或不对称发夹二级结构、并自我互补的有义和反义区的多核苷酸，其中反义区包含与另外的靶核酸分子或其一部分的核苷酸序列互补的核苷酸序列，有义区具有与靶核酸序列或其一部分对应的核苷酸序列。干扰可以是具有两个或多个环结构和含有自我互补的有义和反义区的茎的环状单链多核苷酸，其中反义区包含与靶核酸分子或其一部分的核苷酸序列互补的核苷酸序列，有义区具有与靶核酸序列或其一部分对应的核苷酸序列，并且其中环状多核苷酸可以在体内或体外被加工，从而产生能够介导RNA干扰的活性siRNA分子。
在一些实施方案中，干扰RNA编码区编码具有有义区、反义区和环区的自我互补的RNA分子。这种RNA分子在理想地表达时会形成“发夹”结构，并在本文中被称作“shRNA”。环区的长度一般为大约2-大约10个核苷酸。在一些实施方案中，环区长度为大约6-大约9个核苷酸。在一些实施方案中，有义区和反义区之间长度为大约15-大约20个核苷酸。翻译后加工之后，小发夹RNA通过Dicer酶介导的剪切事件被转变成siRNA，Dicer酶是RNA酶III家族的一个成员。然后siRNA便能够抑制与之具有同源性的基因的表达。具体细节见Brummelkamp et al.,Science296:550-553,2002；Lee et al.,Nature Biotechnol.,20,500-505,2002；Miyagishi and Taira,Nature Biotechnol.20:497-500,2002；Paddisonet al.,Genes&Dev.16:948-958,2002；Paul,Nature Biotechnol.20,505-508,2002；Sui,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,99(6):5515-5520,2002；Yu et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99:6047-6052,2002。
由siRNA指导的靶RNA剪切反应是高度序列特异性的。一般地，含有与靶核酸一部分(即包含靶miRNA或mRNA种子序列的靶区域)相同的核酸序列的siRNA被优选用于抑制。然而，在实践本发明时，不需要siRNA与靶基因之间具有100％序列同一性。因此，本发明的优点是能够耐受可能由于基因突变、菌株多态性或进化分歧而产生的序列变异。例如，与靶序列相比具有插入、缺失和单点突变的siRNA序列也被发现可有效用于抑制。或者，具有核苷酸类似物取代或插入的siRNA序列也能够有效用于抑制。一般地，siRNA必须保持对其靶的特异性，即不得直接结合除意图的靶之外的转录本或直接显著影响除意图的靶之外的转录本的表达水平。
核酶
也可以使用反式剪切性酶性核酸分子；它们已经显示有望成为人类疾病的治疗剂(Usman&McSwiggen,Ann.Rep.Med.Chem.30:285-294,1995；Christoffersen and Marr,J.Med.Chem.38:2023-2037,1995。酶性核酸分子可以被设计用于剪切细胞RNA背景中的特定miRNA或mRNA靶。这种剪切事件会使miRNA或mRNA无功能。
一般地，具有RNA剪切活性的酶性核酸通过首先与靶RNA结合发挥作用。这种结合藉由酶性核酸的靶结合部分发生，靶结合部分被保持在分子中负责剪切靶RNA的酶性部分的附近。因此，酶性核酸首先识别靶RNA，然后通过互补碱基配对与靶RNA结合，一旦结合到正确的位点，便发挥酶的作用，切割靶RNA。这种对靶RNA的战略性切割(Strategiccleavage)会破坏其活性。在酶性核酸结合并切割其RNA靶之后，它便从该RNA上释放出来以搜索另一个靶标，并能够重复地结合和切割新的靶标。
有若干种方法，例如体外选择(进化)策略(Orgel,Proc.R.Soc.London,B205:435,1979)，已经被用来演化能够催化各种反应，例如切割和连接磷酸二酯键和酰胺键的新核酸催化剂(Joyce,Gene,82,83-87,1989；Beaudry et al.,Science257,635-641,1992；Joyce,Scientific American267,90-97,1992；Breaker et al.,TIBTECH12:268,1994；Bartel etal.,Science261:1411-1418,1993；Szostak,TIBS17,89-93,1993；Kumar et al.,FASEBJ.,9:1183,1995；Breaker,Curr.Op.Biotech.,1:442,1996)。具有最佳催化活性的核酶的开发将对任何采用RNA剪切核酶调节基因表达的策略产生显著的贡献。例如，锤头核酶在饱和浓度(10mM)的Mg2+辅因子的存在下可以大约1min-1的催化速度(kcat)发挥功能。一种人工“RNA连接酶”核酶已经显示可以大约100min-1的速度催化相应的自我修饰反应。此外，已知某些经过修饰的锤头核酶具有由DNA形成的底物结合臂，可以以接近100min-1的多重转化数(multiple turn-over rate)催化RNA剪切。
有义核酸
可用于本文中所述治疗方法的作用剂包括有义核酸分子，其可增加表2,4,6,8,10,13,15,17,和19中列出的任何microRNA(例如成熟microRNA或前体microRNA)的表达或活性，或增加编码表21中列出的任何炎症标志物的mRNA的表达或活性。有义核酸可以含有与表2,4,6,8,10,13,15,17,和19中列出的任何一种microRNA(例如成熟microRNA或前体microRNA)的序列或表21中列出的任何一种mRNA的序列至少80％(例如至少90％,95％,96％,97％,98％,99％,或100％)相同的序列。不构成限制，有义核酸可以含有本文中所述的任何修饰中的一种或多种(例如主链修饰、核碱基修饰、糖修饰，或一个或多个缀合分子)。制作和施用有义核酸的方法是本领域已知的。本文中描述了其它制作和使用有义核酸的方法。
制作和使用抑制性核酸和有义核酸
用于实践本文中所述方法的核酸序列，无论是RNA、cDNA、基因组DNA、载体、病毒还是其杂交体，可以从各种来源分离，基因工程改造、扩增、和/或重组表达/产生。重组核酸序列能够被单独分离或克隆，并测试其期望的活性。可以使用任何重组表达系统，包括例如体外、细菌、真菌、哺乳动物、酵母、昆虫或植物细胞表达系统。
本发明的核酸序列(例如本文中所述的任何抑制性核酸或有义核酸)可以被插入到递送载体中，并从载体内的转录单位表达。重组载体可以是DNA质粒或病毒载体。载体构建体的产生可以用本领域众所周知的任何合适的基因工程技术实现，包括但不仅限于，标准的PCR技术、寡核苷酸合成、限制性内切酶消化、连接、转化、质粒纯化和DNA测序，例如在Sambrook et al.Molecular Cloning:A Laboratory Manual.(1989)),Coffin et al.(Retroviruses.(1997))和“RNA Viruses:A Practical Approach”(Alan J.Cann,Ed.,Oxford University Press,(2000))中所述。
本领域的普通技术人员容易想到，有多种多样的合适载体可以用于将本发明的核酸转染进入细胞。用于递送核酸的合适载体的选择和用于将所选表达载体插入到细胞内的条件的优化，属于本领域普通技术人员的能力范围之内，而无需大量的试验。病毒载体包含具有用于在包装细胞中产生重组病毒的序列的核苷酸序列。表达本发明核酸的病毒载体可以基于病毒骨架加以构建，病毒骨架包括但不仅限于，逆转录病毒、慢病毒、疱疹病毒、腺病毒、腺伴随病毒、痘病毒或阿尔法病毒。能够表达本发明核酸的重组载体(例如病毒载体)能够如本文中所述地被递送，并在靶细胞内持久保持(例如稳定转化子)。例如，这些重组载体(例如可表达与hsa-miR-155互补的反义寡聚体的重组载体)可以施用到(例如注射或输注进入)受试者的脑脊液中(例如颅内注射、脑实质内注射、心室内注射、和鞘内注射，见例如Bergen et al.,Pharmaceutical Res.25:983-998,2007)。在Bergen等(前文)中还描述了若干可以用于表达本文中所述的任何核酸的重组病毒载体实例。重组病毒载体的其它实例是本领域已知的。
本文中提供的核酸(例如抑制性核酸)在施用给受试者(例如注射或输注到受试者的脑脊液中)之前，还可以与一种或多种阳离子聚合物(例如多聚赖氨酸和聚(乙烯亚胺))、阳离子脂质体(例如，1,2-二油酰氧丙基-N,N,N-三甲基溴化铵(1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium propone(DOTAP))、N-甲基-4-(二油酰)甲基吡啶(N-methyl-4-(dioleyl)methylpyridinium)、和3β-[N-N’,N’-二甲基氨基乙基)-氨基甲酰基]胆固醇(3β-[N-(N’,N’-dimethylaminoethane)-carbamoyl]cholesterol))，和/或纳米颗粒(例如，阳离子聚氰基丙烯酸正丁酯纳米颗粒，纳米二氧化硅，或聚乙二醇基纳米粒)复合。用于治疗性递送核酸的阳离子聚合物、阳离子脂质体和纳米颗粒的其它实例是本领域已知的。还显示在鞘内注射聚乙烯亚胺/DNA复合体之后实现了核酸的治疗性递送(Wang et al.,Mol.Ther.12:314-320,2005)。用于递送本文中所述的核酸的方法没有限制。用于向受试者治疗性递送核酸的其它方法是本领域已知的。
在一些实施方案中，抑制性核酸(例如一种或多种靶定hsa-miR-155的抑制性核酸)可以系统给药(例如静脉内、动脉内、肌肉内、皮下或腹腔内)或鞘内给药(例如硬膜外给药)。在一些实施方案中，抑制性核酸在组合物(例如与一种或多种阳离子脂质体复合)中施用。可用于施用一种或多种抑制性核酸(例如本文中所述的任何抑制性核酸)的阳离子脂质体的非限制性实例包括：Lipofectamine，在WO97/045069,和美国专利申请公开Nos.2012/0021044,2012/0015865,2011/0305769,2011/0262527,2011/0229581,2010/0305198,2010/0203112,和2010/0104629(本文中援引并入其中每一个的内容)中描述的阳离子脂质体。用于实践本发明的核酸序列可以通过众所周知的化学合成技术在体外合成，如在例如Adams,J.Am.Chem.Soc.105:661,1983；Belousov,Nucleic Acids Res.25:3440-3444,1997；Frenkel,Free Radic.Biol.Med.19:373-380,1995；Blommers,Biochemistry33:7886-7896,1994；Narang,Meth.Enzymol.68:90,1994；Brown,Meth.Enzymol.68:109,1979；Beaucage,Tetra.Lett.22:1859,1981；和美国专利No.4,458,066中所述。
可以将本发明的核酸序列针对核酸降解进行稳定化，例如通过引入修饰，如核苷酸修饰。例如，本发明的核酸序列在核苷酸序列的5'或3'端的至少第一、第二或第三核苷酸间连接键中包含硫代磷酸酯。作为另一个实例，核酸序列可以包含2'-修饰的核苷酸，例如2'-脱氧,2'-脱氧-2'-氟,2'-O-甲基,2'-O-甲氧基乙基(2'-O-MOE),2'-O-氨基丙基(2'-O-AP),2'-O-二甲基氨基乙基(2'-O-DMAOE),2'-O-二甲基氨基丙基(2'-O-DMAP),2'-O-二甲基氨基乙氧基乙基(2'-O-DMAEOE),或2'-O--N-乙酰氨基(2'-O--NMA)。作为另一个实例，核酸序列可以包括至少一个2'-O-甲基修饰的核苷酸，并且在一些实施方案中，所有的核苷酸均包含2'-O-甲基修饰。在一些实施方案中，核酸是“锁定”的，即包含这样的核酸类似物，其中核糖环被2’-O原子和4’-C原子之间的亚甲基桥所“锁定”(见例如Kaupinnen et al.,Drug Disc.Today2(3):287-290,2005；Koshkin et al.,J.Am.Chem.Soc.,120(50):13252–13253,1998)。关于额外的修饰见US2010/0004320,US2009/0298916,和US2009/0143326(本文援引并入其中每一个的内容)。
用于操作核酸以实施本发明的技术，例如亚克隆、标记探针(如使用Klenow聚合酶的随机引物标记、切口平移、扩增)、测序、杂交等，在科学和专利文献中有很好描述，见例如Sambrook等,Molecular Cloning；A Laboratory Manual3d ed.(2001)；Current Protocols in Molecular Biology,Ausubel等编辑(John Wiley&Sons,Inc.,NewYork2010)；Kriegler,Gene Transfer and Expression:A Laboratory Manual(1990)； Laboratory Techniques In Biochemistry And Molecular Biology:Hybridization With Nucleic Acid Probes,Part I.Theory and Nucleic Acid Preparation,Tijssen编辑.Elsevier,N.Y.(1993)。
抗体和重组蛋白
也可以向受试者施用与由表21中列出的任何炎症标志物基因编码的蛋白特异性杂交的一种或多种抗体以治疗神经退行性病症。特异性结合表21中列出的蛋白的抗体是市售的，或者可以用本领域已知的标准方法产生。例如，特异性结合表21中列出的蛋白的多克隆抗体可以通过用纯化的蛋白免疫哺乳动物，并从该哺乳动物中分离特异性结合该纯化蛋白的抗体来产生。所用的抗体可以是单克隆或多克隆抗体。所施用的抗体可以是免疫球蛋白G或免疫球蛋白M。所施用的抗体可以是嵌合抗体(例如人源化抗体)或人抗体。所用抗体还可以是抗体片段(例如Fab,F(ab’)2,Fv,和单链Fv(scFv)片段)。
还可以向受试者施用表20中列出的一种或多种炎症标志物蛋白以治疗神经退行性病症。本领域已知有多种方法使用分子生物学和细胞培养技术产生重组蛋白。例如，可以将由表20中列出的mRNA序列编码的炎症标志物蛋白转染进入细菌、酵母或哺乳动物细胞(使用蛋白表达质粒或病毒载体)，其允许被转染的细胞表达炎症标志物蛋白。收集被转染的细胞或培养基，并使用本领域已知的方法纯化重组炎症标志物蛋白。施用给受试者的炎症标志物蛋白可以含有与表20中列出的任何氨基酸序列具有至少80％(例如至少85％,90％,95％,96％,97％,98％,99％,或100％)同一性的序列。施用给受试者的炎症标志物蛋白可以进一步含有修饰(例如聚乙二醇或HIV tat蛋白，或任何可提高炎症标志物蛋白细胞渗透性的其它部分)。
药物组合物
本文中所述的方法可以包括施用包含任何一种或多种(例如2、3、4、或5种)本文中所述的抑制性核酸(例如一种或多种靶定hsa-miR-155的抑制性核酸)、有义核酸、炎症标志物蛋白或抗体的药物组合物和药物制剂。
在一些实施方案中，组合物用可药用的载体配制。药物组合物和制剂可以胃肠外给药、外用给药、口服或局部给药，如通过气溶胶或经皮。药物组合物可以用任何方式配制，并可以用多种单位剂量形式施用，这取决于病症或疾病及患病程度，每位患者的一般医学状况，最终的优选给药方法等。关于配制和施用药物的技术的细节在科学文献和专利文献中广有记载，见例如Remington:The Science and Practice of Pharmacy,21版,2005。
抑制性核酸可以单独施用或作为药物制剂(组合物)的一个组分施用。化合物可以被配制成用于通过任何方便的方式施用，供人或兽医用。组合物中还可以存在润湿剂、乳化剂和润滑剂，如十二烷基月桂酸钠和硬脂酸镁，以及染色剂，脱模剂，涂层剂，甜味剂，香料和芳香剂，防腐剂，抗氧化剂。在一些实施方案中，在含有一种或多种抑制性核酸的组合物(例如含有一种或多种靶定hsa-miR-155的抑制性核酸的组合物)中可以包含一种或多种阳离子脂质体、阳离子聚合物或纳米颗粒。
本发明组合物的制剂包括适合于皮内，吸入，口/鼻，表面，胃肠外，直肠，和/或阴道给药的制剂。制剂可以方便地以单位剂量形式存在，并可以通过药物领域中众所周知的任何方法制备。可以与载体材料组合产生单个剂型的活性成分(例如本发明的核酸序列)的量可以根据下列因素改变：所处理的宿主、特定的给药方式，例如皮内或吸入。可以和载体材料组合产生单个剂型的活性成分的量一般是可产生治疗效果的化合物的量。
本发明的药物制剂能够根据本领域已知的任何用于制造药物的方法制备。这些药物可以含有润湿剂、调味剂、着色剂和防腐剂。制剂可以和适合于制造的无毒的可药用的赋形剂混合。制剂可以包含一种或多种稀释剂、乳化剂、防腐剂、缓冲剂、赋形剂等，并可以液体、粉末、乳剂、冻干粉、喷雾剂、乳膏、洗液、可控释放剂型、药片、药丸、凝胶、贴剂(onpatch)、植入物等形式提供。
用于口服给药的药物制剂可以用恰当并且合适的剂量的、本领域众所周知的可药用载体加以配制。利用这些载体可以将药物配制成适合于患者消化的单位剂量形式如药片、药丸、粉末、糖衣片、胶囊、液体、锭剂、凝胶、糖浆、浆、悬液等。用于口服的药物制备物可以被配制成固体赋形剂，任意地将由此获得的混合物粉碎，和如果需要，在添加合适的额外混合物之后加工该颗粒混合物，获得药片或糖衣片核。合适的固体赋形剂是碳水化合物或蛋白填充剂，包括例如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露醇、或山梨醇；来自玉米、小麦、大米、马铃薯或其它植物的淀粉；纤维素如甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素，或羧甲基纤维素钠；和树胶，包括阿拉伯胶和黄芪胶；和蛋白质，例如明胶和胶原。可以添加崩解剂或增溶剂，例如交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂、海藻酸或其钠盐，如海藻酸钠。推进式(Push-fit)胶囊可以包含与填充剂或结合剂，例如乳糖或淀粉、润滑剂如滑石粉或硬脂酸镁，和任意地，稳定剂混合的活性成分。在软胶囊中，活性成分可以溶解或悬浮在合适的液体中，例如含有或没有稳定剂的脂肪油、液体石蜡、或液体聚乙二醇中。
水性悬液可以含有与适合于制造水性悬液、例如用于皮内注射的赋形剂混合的活性成分(例如本文中描述的抑制性核酸或有义核酸)。这些赋形剂包括悬浮剂，如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、褐藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、黄芪胶和阿拉伯胶，和分散或润湿剂，例如天然存在的磷脂(例如卵磷脂)，氧化乙烯与脂肪酸的缩合产物(例如聚氧乙烯硬脂酸酯)，氧化乙烯与长链脂肪醇的缩合产物(例如十七碳亚乙基氧基鲸蜡醇(heptadecaethylene oxycetanol))，氧化乙烯与由脂肪酸和己糖醇衍生的偏酯的缩合产物(例如聚氧乙烯山梨醇单油酸酯)，或氧化乙烯与由脂肪酸和己糖醇酐衍生的偏酯的缩合产物(例如聚氧乙烯山梨醇单油酸酯)。水性悬液还可以含有一种或多种防腐剂，例如对羟基苯甲酸正丙酯，一种或多种着色剂，一种或多种调味剂，和一种或多种甜味剂，例如蔗糖、阿斯巴甜或糖精。可以对制剂的渗透压进行调节。
在一些实施方案中，使用油基药物施用本发明的核酸序列。油基悬浮液可以通过将活性成分悬浮在植物油，例如花生油，橄榄油，芝麻油，或椰子油，或矿物油如液体石蜡；或这些的混合物中加以制备。见例如美国专利No.5,716,928描述了使用精油(essentialoil)或精油成分提高口服给药的疏水药物混合物的生物利用度和降低个体间和个体内差异性(另见美国专利No.5,858,401)。油悬浮液可以含有稠化剂，例如蜂蜡，硬石蜡，或十六醇。可以添加甜味剂以提供可口的口服制备物，例如甘油、山梨醇或蔗糖。这些制剂可以通过添加抗氧化剂如抗坏血酸进行防腐。作为可注射的油溶媒的一个实例，见Minto,J.Pharmacol.Exp.Ther.281:93-102,1997。
药物制剂还可以处于水包油乳剂的形式。油相可以是如上所述的植物油或矿物油，或者这些的混合。合适的乳化剂包括天然存在的树脂，例如阿拉伯胶和黄芪胶，天然存在的磷脂，例如大豆卵磷脂，由脂肪酸和己糖醇酐衍生的酯或偏酯，例如山梨醇单油酸脂，和这些偏酯与氧化乙烯的缩合产物，例如聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯。乳液也可以含有甜味剂和调味剂，与在制备糖浆和酏剂时一样。这些制剂还可以含有缓和剂(demulcent)、防腐剂或着色剂。在可选择的实施方案中，本发明的这些可注射的水包油乳剂包括石蜡油、失水山梨糖醇单油酸酯、聚氧乙烯失水山梨醇单油酸酯，和/或乙氧基化失水山梨醇油酸酯。
药物化合物还可以通过鼻内、眼内和阴道内途径施用，包括栓剂、吸入剂、粉末和喷雾制剂(见例如类固醇吸入剂，见例如Rohatagi,J.Clin.Pharmacol.35:1187-1193,1995；Tjwa,Ann.Allergy Asthma Immunol.75:107-111,1995)。栓剂可以通过将药物与合适的非刺激性赋形剂混合加以制备，该赋形剂在通常温度下是固体，但在体温下是液体，因此在体内会熔解释放药物。这些材料是可可脂和聚乙二醇。
在一些实施方案中，药物化合物可以透皮递送，通过外用途径，制备成涂抹棒(applicator stick)、溶液、悬浮液、乳液、凝胶、乳膏、软膏、糊、果冻、涂料、粉末，和气溶胶。
在一些实施方案中，药物化合物还可以作为微球递送，用于在体内缓慢释放。例如，微球可以通过药物的皮内注射施用，其在皮下缓慢释放；见Rao,J.BiomaterSci.Polym.Ed.7:623-645,1995；作为生物可降解和可注射的凝胶制剂，见例如Gao,Pharm.Res.12:857-863,1995；或作为用于口服的微球，见例如Eyles,J.Pharm.Pharmacol.49:669-674,1997。
在一些实施方案中，药物化合物可以肠胃外给药，例如通过静脉内(IV)给药或施用到受试者的体腔、脏器腔或头骨(例如颅内注射或输注)或脑脊液中。这些制剂可以包含溶解在可药用的载体中的活性剂溶液。可以使用的可接受溶媒和溶剂是水和林格氏溶液(一种等张氯化钠)。此外，可以使用无菌的不挥发性油作为溶剂或悬浮介质。出于这个目的，可以采用任何温和的不挥发性油，包括合成的单或二甘油酯。此外，在可注射制备物中，可以类似地使用脂肪酸，例如油酸。这些溶液是无菌的并且一般不含非期望的材料。这些制剂可以通过常规的众所周知的灭菌技术灭菌。制剂可以根据需要含有可药用的辅助物质以接近生理条件，例如pH调节剂和缓冲剂、毒性调节剂如乙酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、乳酸钠等。活性剂在这些制剂中的浓度可以广泛的变化，并可以根据所选定的特定给药模式和患者的需要，主要基于液体体积、粘性、体重等加以选择。对于IV给药，制剂可以是无菌的可注射制备物，例如无菌的可注射水性或油性悬液。该悬液可以使用合适的分散剂或润湿剂和悬浮剂加以配制。无菌的可注射制备物还可以是无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂(例如1,3-丁二醇溶液)的悬液。给药可以通过推注或连续输注(例如基本上无中断地引入到血管中达特定的时间周期)。
在一些实施方案中，药物化合物和制剂可以是冻干的。包含抑制性核酸或有义核酸的合适冻干制剂可以通过将含有本发明药物和填充剂(bulking agent)如甘露醇、海藻糖、棉子糖和蔗糖、或其混合物的溶液冻干加以制备。用于制备稳定的冻干制剂的处理过程包括冻干含有大约2.5mg/mL蛋白、大约15mg/mL蔗糖、大约19mg/mL NaCl和pH大于5.5但小于6.5的柠檬酸钠缓冲液的溶液。见例如US2004/0028670。
组合物和制剂可以通过使用脂质体递送。通过使用脂质体，特别是在脂质体表面携带对靶细胞特异性的配体，或者以其他方式优先地指向特定器官的场合，可以将活性剂的递送在体内聚焦到靶细胞中。见例如美国专利Nos.6,063,400；6,007,839；Al-Muhammed,J.Microencapsul.13:293-306,1996；Chonn,Curr.Opin.Biotechnol.6:698-708,1995；Ostro,Am.J.Hosp.Pharm.46:1576-1587,1989。
本发明的制剂可以为了预防性和/或治疗性处理而施用。在一些实施方案中，出于治疗目的，向有风险患有或患有本文中所述的疾病的受试者施用足以治愈、减轻或部分阻止疾病或其并发症的临床征候的量的组合物；这可以称作治疗有效量。例如，在一些实施方案中，本发明的药物组合物以足以降低受试者体内的症状数目或减轻神经退行性病症一种或多种症状的严重程度、持续时间或频率的量施用。
足以实现此目的的药物组合物的量即为治疗有效量。可有效用于此目的的给药时间表和量，即剂量方案，会取决于各种因素，包括疾病或病症的阶段、疾病或病症的严重程度、患者的一般健康状况、患者的身体状况、年龄等。在计算对于患者的剂量方案时，还需要考虑施用模式。
剂量方案还考虑本领域众所周知的药代动力学参数，即活性剂的吸收速度、生物利用度、代谢、清除等(见例如Hidalgo-Aragones,J.Steroid Biochem.Mol.Biol.58:611-617,1996；Groning,Pharmazie51:337-341,1996；Fotherby,Contraception54:59-69,1996；Johnson,J.Pharm.Sci.84:1144-1146,1995；Rohatagi,Pharmazie50:610-613,1995；Brophy,Eur.J.Clin.Pharmacol.24:103-108,1983；Remington:The Science andPractice of Pharmacy,21版,2005)。现有技术的水平允许医师为每位患者、每种活性剂和每种所治疗疾病或病症确定剂量方案。可以利用现有的相似组合物的药用指导作为指导来正确且适当地用实施本发明的方法，用于确定剂量方案，即给药时间表和剂量水平。
制剂可以单次或多次给药，这取决于例如：所需的且患者可以耐受的剂量和频率等。制剂应当提供足够量的活性剂以有效地治疗、预防或减轻病症、疾病或症状。
在备选的实施方案中，用于口服的药物组合物的每日用量为大约1-100mg/kg体重/天，或者更多。与口服相比，用于进入血流、进入体腔或脏器管腔的剂量可以更低。在外用或口服给药或通过粉末、喷雾或吸入给药时，可以使用高得多的剂量。用于制备肠胃外或非肠胃外给药制剂的实际方法是本领域技术人员已知或显而易见的，在下列出版文献中有更详细的描述：Remington:The Science and Practice of Pharmacy,21版,2005。
各种研究已经报道了使用互补核酸序列的成功的哺乳动物给药。例如，Esau C.,et al.,Cell Metabolism,3(2):87-98,2006报道了miR-122反义寡核苷酸在正常小鼠腹腔内的给药剂量范围是12.5-75mg/kg，每周2次，给药4周。小鼠在处理结束时表现得健康且正常，没有发生体重减轻或摄食减少。对于所有剂量而言，血浆转氨酶水平均在正常范围内(AST 3/4 45,ALT 3/4 35)，只是5mg/kg剂量的miR-122ASO下ALT和AST水平显示非常微弱的升高。他们得出结论，50mg/kg是有效而无毒的剂量。在Krützfeldt J.,et al.,Nature438,685-689,2005实施的另一项研究中，在小鼠中注射80,160或240mg/kg体重的anatgomir用于沉默miR-122。最高剂量导致miR-122信号完全消失。在另外一项研究中，在灵长动物中成功使用锁定核酸(“LNAs”)沉默miR-122。Elmen et al.,Nature452,896-899,2008报道，在灵长动物中通过三次剂量的10mg kg-1LNA-antimiR有效沉默了miR-122，导致研究动物血浆胆固醇长期而无反复地降低，没有显示任何LNA相关的毒性或组织病理学改变。
在一些实施方案中，本文中所述的方法可以包括与其它药物或药剂例如本文中所述神经退行性病症的任何治疗方法共同施用。
试剂盒
本文中还提供了含有一种或多种(例如至少2,3,4,5,6,7,8,9,10,12,14,16,18,或20种)本文中所述的任何探针、抑制性核酸、有义核酸、炎症标志物蛋白或抗体(以任意组合)的试剂盒。在一些实施方案中，试剂盒可以包含用于实施本文中所述的任何方法的使用说明书。
在一些实施方案中，试剂盒可以包含至少两个(例如至少4,6,8,10,12,14,16,18,20,22,24,26,28,30,32,36,38,或40个)引物，用于扩增表1-19中列出的任何microRNA中存在的序列(例如成熟microRNA或前体microRNA)，或用于扩增表20和21中列出的任何mRNA中存在的序列。
在一些实施方案中，试剂盒含有两组或更多组引物(例如3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66,67,68,69,70,71,72,73,74,75,76,77,78,79,80,81,82,83,84,85,86,87,88,89,90,91,92,93,94,95,96,97,98,99,100,101,102,103,104,105,106,107,108,或109对引物)，所述引物组扩增在表1-11的任何一个中列出的microRNA(例如来自表1和2；表3和4；表5和6；表7和8；表9和10；和表11的一种或多种(例如3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66,67,68,69,70,71,72,73,74,75,76,77,78,79,80,81,82,83,84,85,86,87,88,89,90,91,92,93,94,95,96,97,98,99,100,101,102,103,104,105,106,107,108,或109种)microRNA)中的一种或多种(例如3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66,67,68,69,70,71,72,73,74,75,76,77,78,79,80,81,82,83,84,85,86,87,88,89,90,91,92,93,94,95,96,97,98,99,100,101,102,103,104,105,106,107,108,或109对引物)中存在的序列；和/或用于扩增表20和/或表21中列出的一种或多种(例如3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66,67,68,69,70,71,72,73,74,75,76,77,78,79,80,81,82,83,84,85,86,87,88,89,90,91,92,93,94,或95种)mRNA中存在的序列(例如ALS诊断试剂盒)。
在一些实施方案中，试剂盒含有两组或更多组引物(例如3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66,67,68,69,70,71,72,73,74,75,76,77,78,79,80,81,82,83,84,85,86,87,88,89,90,91,92,93,94,95,96,97,98,99,100,101,102,103,104,105,106,107,108,或109对引物)，所述引物组扩增表1-11的任一个中列出的microRNA(例如来自表1和2；表3和4；表5和6；表7和8；表9和10；和表11的一种或多种(例如3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66,67,68,69,70,71,72,73,74,75,76,77,78,79,80,81,82,83,84,85,86,87,88,89,90,91,92,93,94,95,96,97,98,99,100,101,102,103,104,105,106,107,108,或109种)microRNA)中的一种或多种(例如3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66,67,68,69,70,71,72,73,74,75,76,77,78,79,80,81,82,83,84,85,86,87,88,89,90,91,92,93,94,95,96,97,98,99,100,101,102,103,104,105,106,107,108,或109对引物)中存在的序列，和/或用于扩增表20和/或表21中列出的一种或多种(例如3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66,67,68,69,70,71,72,73,74,75,76,77,78,79,80,81,82,83,84,85,86,87,88,89,90,91,92,93,94,或95种)mRNA中存在的序列(例如ALS诊断试剂盒)。
在一些实施方案中，试剂盒含有两种或更多种反义寡核苷酸(例如3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66,67,68,69,70,71,72,73,74,75,76,77,78,79,80,81,82,83,84,85,86,87,88,89,90,91,92,93,94,95,96,97,98,99,100,101,102,103,104,105,106,107,108,或109对引物)，它们合起来能够与表1、2和12-19的任一个中列出的microRNA(例如来自表1和2；表12和13；表14和15；表16和17；和表18和19的一种或多种(例如3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66,67,68,69,70,71,72,73,74,75,76,77,78,79,80,81,82,83,84,85,86,87,88,89,90,91,92,93,94,95,96,97,98,99,100,101,102,103,104,105,106,107,108,或109种)microRNA)中的一种或多种(例如3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66,67,68,69,70,71,72,73,74,75,76,77,78,79,80,81,82,83,84,85,86,87,88,89,90,91,92,93,94,95,96,97,98,99,100,101,102,103,104,105,106,107,108,或109种)杂交，和/或它们合起来能够与表20和/或表21中列出的一种或多种(例如3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66,67,68,69,70,71,72,73,74,75,76,77,78,79,80,81,82,83,84,85,86,87,88,89,90,91,92,93,94,或95种)mRNA杂交(例如MS诊断试剂盒)。
在一些实施方案中，试剂盒含有两种或更多种反义寡核苷酸(例如3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66,67,68,69,70,71,72,73,74,75,76,77,78,79,80,81,82,83,84,85,86,87,88,89,90,91,92,93,94,95,96,97,98,99,100,101,102,103,104,105,106,107,108,或109种反义寡核苷酸)，它们合起来能够与表1,2和12-19的任一个中列出的microRNA(例如来自表1和2；表12和13；表14和15；表16和17；和表18和19的一种或多种(例如3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66,67,68,69,70,71,72,73,74,75,76,77,78,79,80,81,82,83,84,85,86,87,88,89,90,91,92,93,94,95,96,97,98,99,100,101,102,103,104,105,106,107,108,或109种)microRNA)中的一种或多种(例如3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66,67,68,69,70,71,72,73,74,75,76,77,78,79,80,81,82,83,84,85,86,87,88,89,90,91,92,93,94,95,96,97,98,99,100,101,102,103,104,105,106,107,108,或109种)杂交，和/或它们合起来能够与表20和/或表21中列出的一种或多种(例如3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66,67,68,69,70,71,72,73,74,75,76,77,78,79,80,81,82,83,84,85,86,87,88,89,90,91,92,93,94,或95种)mRNA杂交(例如MS诊断试剂盒)。
在一些实施方案中，试剂盒可以包含至少两种反义分子(例如至少4,6,8,10,12,14,16,20,22,24,26,28,30,32,34,36,38,或40种)，用于和表1-19中列出的任何microRNA中存在的序列杂交(例如成熟microRNA或前体microRNA)或与表20和21中列出的任何mRNA中存在的序列杂交。
在一些实施方案中，试剂盒可以包含至少一种抑制性核酸和/或至少一种有义核酸(例如本文中所述的任何抑制性核酸或有义核酸)。在一些实施方案中，试剂盒含有至少一种抑制性核酸(例如至少一种靶定hsa-miR-155的抑制性核酸)，其被配制成鞘内或颅骨内注射或输注。
在一些实施方案中，试剂盒可以含有至少一种(例如至少2、3、4、5或6种)抗体，其特异性结合由表20或表21中列出的任何炎症标志物基因编码的任何一种蛋白(例如本文中所述的多种抗体或抗体片段中的任意种)。在一些实施方案中，抗体可以是标记的(例如用荧光团、放射性同位素、酶、生物素或亲和素标记的)。
在一些实施方案中，试剂盒进一步含有至少一种额外的治疗剂(例如KNS760704,SB509,头孢三嗪,米诺环素,力如太(rilutek)和利鲁唑(riluzole)中的一种或多种)。在一些实施方案中，试剂盒进一步含有用于向患有或者被诊断患有神经退行性病症(例如散发性ALS和/或家族性ALS或MS)的受试者施用至少一种作用剂(例如一种或多种抑制性核酸)的使用说明书。
本发明进一步在下面的实施例中进行描述，其不会对由权利要求所述的本发明范围构成限制。
实施例
实施例1.MicroRNA在小鼠ALS模型(SOD1G93A小鼠)的Ly6C高单核细胞、Ly6C低单核细胞和CD39+小胶质细胞中的失调
Lys6C高/CCR2+单核细胞在多种病患，包括MS的动物模型中，参与组织破坏和疾病发病机理(King et al.,Blood 113:3190-3197,2009)。实施了实验以比较SOD1G93A小鼠ALS模型中在症状出现前阶段(60天)、症状发病时、和疾病终末期的CD39+小胶质细胞(图1A-1C)、Ly6C高单核细胞(图2A-2C)和Ly6C低单核细胞(图3A-3C)中的microRNA表达概貌，并与非转基因同窝小鼠的相同细胞中的表达进行比较。
用啮齿动物TaqMan低密度阵列(rodent TaqMan Low Density Arrays)(含有364个小鼠microRNA阵列的TaqMan MicroRNA阵列(每组n＝2阵列；每组5-6只小鼠的池))收集这些数据。微阵列数据用分位数(R软件)标准化以除去样品间的变异。MicroRNA表达水平用dCT针对U6miRNA(内参)的和所有样品的几何平均值标准化。标准化步骤后，使用组间方差分析(ANOVA)确定SOD1小鼠的所有疾病阶段中发生了显著改变的microRNA(使用≤0.1的错误发现率)。
SOD1小鼠脾来源的Lys6C高和Ly6C低单核细胞在所有疾病阶段的MicroRNA表达概貌显示，在Lys6C高脾单核细胞中有32个显著失调的microRNA，在Ly6C低脾单核细胞中有23个显著失调的microRNA。单核细胞子集合中所有失调的microRNA均在临床发病前一个月和疾病进展过程中被观察到。这些microRNA中大部分在Lys6C高单核细胞和Ly6C低单核细胞之间没有重叠，提示这些不同的单核细胞子集合在疾病进展期间发挥不同的功能。炎症相关的microRNA例如let-7a,miR-27a,miR-34a,miR-132,miR-146a,miR-451,和miR-155在SOD1小鼠中在疾病进展期间的脾脏Lys6C高单核细胞中被显著上调(图2)。SOD1小鼠中的Lys6C高单核细胞microRNA表达概貌的Ingenuity通路分析(Ingenuity Pathway Analysis)识别出了在原发(primary)肌肉病症中观察到的microRNA表达模式(图4)。
对SOD1小鼠中CD39+小胶质细胞的microRNA表达概貌分析的数据显示，与非转基因同窝小鼠的相同细胞相比，有24种microRNA被上调，2种microRNA被下调。这些microRNA与Lys6C高单核细胞中发生失调的microRNA不同，但有6种microRNA除外(let-7a,miR-27a,miR-34a,miR-132,miR-146a,和miR-155)。这些数据证明，由CD39标识的驻留(resident)小胶质细胞与浸润性Ly6C单核细胞之间存在差异，并鉴定了SOD1小鼠的小胶质细胞中独特的microRNA表达概貌。
实施例2.在患有ALS和MS的受试者的CD14+CD16-单核细胞中发生失调的microRNA
鉴于在小鼠单核细胞中观察到了独特的microRNA表达概貌，对来自ALS受试者和MS受试者的人血液来源的CD14+CD16-单核细胞(Lys6C高类似物)进行了microRNA表达概貌分析。在这些实验中，对来自患有散发性ALS(n＝8)、患有复发-缓解型MS(n＝8)和健康对照(n＝8)的受试者的血液来源的CD14+CD16-单核细胞进行了664种microRNA的nCounter表达概貌分析。microRNA表达水平用5种管家基因(ACTB,B2M,GAPDH,RPL19和RPLP0)的几何平均值进行标准化。使用采用Dunnett事后检验的ANOVA生成了比较来自ALS或MS受试者的单核细胞中microRNA表达与健康对照中表达的热图(p<0.01)(分别为图5,6,和33)。图7A描绘了在来自ALS和MS受试者CD14+CD16-单核细胞中独特地上调的microRNA的数目，以及在来自ALS和MS受试者二者的CD14+CD16-单核细胞中都被上调的microRNA的数目。图7A还描绘了在来自ALS和MS受试者CD14+CD16-单核细胞中独特地下调的microRNA的数目，以及在来自ALS和MS受试者二者的CD14+CD16-单核细胞中都被下调的microRNA的数目。图7B是火山图，显示了与来自健康对照CD14+CD16-单核细胞的microRNA表达相比，在来自ALS受试者的CD14+CD16-单核细胞中显著失调的microRNA。图7C是火山图，显示了与来自健康对照的CD14+CD16-单核细胞的microRNA表达相比，在来自MS受试者CD14+CD16-单核细胞中显著失调的microRNA。图8提供了与健康对照CD14+CD16-单核细胞的microRNA表达相比，在来自ALS和MS受试者的CD14+CD16-单核细胞中显著失调的microRNA的汇总。
用实时PCR确认在来自ALS和MS受试者CD14+CD16-单核细胞中特定microRNA的失调(健康对照相比)。例如，使用实时PCR确认hsa-miR-27a,hsa-miR-190,hsa-miR-500,hsa-miR-155,和hsa-miR-532-3p在来自ALS受试者(n＝11)的CD14+CD16-单核细胞中与这些microRNA在健康对照(n＝8)的CD14+CD16-单核细胞中的表达相比的上调(双尾Mann-Whitney t-检验)(图9)。实施额外的实时PCR实验以确认与这些microRNA在来自MS受试者和健康对照的CD14+CD16-单核细胞中的表达相比，在来自ALS受试者(n＝8；这些受试者的临床得分在图10A和10B中显示)的CD14+CD16-单核细胞中独特上调的microRNA(图10C)。图10C的数据显示，与这些microRNA在来自MS受试者和健康对照的CD14+CD16-单核细胞中的表达相比，有20种不同的microRNA在来自ALS受试者的CD14+CD16-单核细胞中被独特上调：hsa-miR-19b,hsa-miR-106b,hsa-miR-30b,hsa-miR-21,hsa-miR-142-5p,hsa-miR-27a,hsa-miR-16,hsa-miR-374a,hsa-miR-374b,hsa-miR-101,hsa-miR-340,hsa-miR-30e,hsa-miR-29c,hsa-miR-29a,hsa-miR-223,hsa-miR-26a,hsa-miR-26b,hsa-miR-24,hsa-miR-181a,和hsa-miR-103。同时在另一个系列的实时PCR实验中确认了hsa-miR-27a,hsa-miR-155,hsa-miR-146a,和hsa-miR-532-3p在来自ALS受试者的CD14+CD16-单核细胞中与这些microRNA在来自MS受试者和健康对照的CD14+CD16-单核细胞中的表达相比的独特上调(图11)(microRNA表达利用dCT相对于U6miRNA进行标准化)。实施了额外的实时PCR实验以确认hsa-miR-518f,hsa-miR-206,hsa-miR-204,hsa-miR-137,hsa-miR-453,hsa-miR-603,hsa-miR-1297,hsa-miR-192,hsa-miR-526a,hsa-miR-615-5p,hsa-miR-655,hsa-miR-450b-5p,hsa-miR-548b-3p,hsa-miR-584,hsa-miR-548f,hsa-miR-300,hsa-miR-302c,hsa-miR-328,hsa-miR-421,和hsa-miR-580在来自ALS受试者的CD14+CD16+单核细胞中与这些microRNA同时在MS受试者和健康对照的CD14+CD16+单核细胞中的表达相比被独特下调(图12)。
实施了另一组实时PCR实验以验证hsa-miR-24,hsa-miR-93,hsa-miR-20a,hsa-let-7a,hsa-miR-30c,hsa-miR-181a,hsa-miR-432-3p,和hsa-miR-1260在来自ALS和MS受试者的CD14+CD16-单核细胞中与这些microRNA在健康对照的CD14+CD16-单核细胞中的表达相比被上调(图13)。实施了又一系列的实时PCR实验以验证hsa-miR-320c,hsa-miR-27b,hsa-miR-664,hsa-miR-423-5p,和hsa-miR-92a在来自MS受试者的CD14+CD16-单核细胞中与健康对照相比被上调(图14)。这些数据还显示确认了hsa-miR-664在来自MS受试者的CD14+CD16-单核细胞中与该microRNA在来自ALS受试者和健康对照的CD14+CD16-单核细胞中的表达相比独特上调(图14)。
此外，使用实时PCR确认了hsa-miR-142-3p,hsa-miR-15a,hsa-miR-1537,hsa-miR-362-3p,和hsa-miR-148b在来自MS受试者的CD14+CD16-单核细胞中与这些microRNA在ALS受试者和健康对照的CD14+CD16-单核细胞中的表达相比有独特下调(图15)。
实施例3.来自患有散发性ALS和家族性ALS的受试者的脑脊液中异常的MicroRNA水平
还使用来自患有散发性ALS和家族性ALS的受试者的脑脊液(CSF)实施了MicroRNA表达概貌分析。将来自散发性ALS(n＝10)和家族性ALS(n＝5)受试者的CSF中MicroRNA的水平与健康对照(n＝10)CSF中MicroRNA的水平进行比较。所得的数据显示，与hsa-miR-27b在健康对照的CSF中相比，该microRNA在散发性和家族性ALS受试者的CSF中均增加，另外hsa-miR-99b,hsa-miR-146a,hsa-miR-150,hsa-miR-328,和hsa-miR-532-3p在来自患有散发性ALS的受试者的CSF中与来自健康对照或患有家族性ALS的受试者的CSF中的这些microRNA的水平相比被独特上调(图16)。
实施例4.炎症相关基因在来自患有ALS和MS的受试者的CD14+CD16-单核细胞中也失调
使用来自ALS受试者(n＝8)、MS受试者(n＝11)和健康对照(n＝10)的CD14+CD16-单核细胞进行了179种炎症相关基因(“炎症标志物基因”)的表达概貌分析。图17的热图显示了不同炎症标志物基因在来自ALS和MS受试者的CD14+CD16-单核细胞中的表达与这些基因在来自健康对照的CD14+CD16-单核细胞中的表达相比的变化。图18A所示的火山图显示了在来自ALS和MS受试者的CD14+CD16-单核细胞中与这些基因在健康对照的CD14+CD16-单核细胞中的表达相比失调的炎症标志物基因(分别为左图和右图)。图18B列出了与这些基因在健康对照的CD14+CD16-单核细胞中的表达相比，在来自ALS和MS受试者的CD14+CD16-单核细胞中被上调或下调的炎症标志物基因。
实施例5.MicroRNA在来自ALS受试者的CD14+CD16+单核细胞中也失调
使用来自ALS受试者(n＝11)和健康对照(n＝8)的CD14+CD16+单核细胞也进行了MicroRNA表达概貌分析(图19)。这些数据显示，与该microRNA在来自健康对照的CD14+CD16+单核细胞中的表达相比，hsa-miR-708在来自ALS受试者的CD14+CD16+单核细胞中增加。
进行nCounter表达概貌分析以鉴定其它在ALS(n＝8)和MS受试者(n＝8)的CD14+CD16+单核细胞中与该microRNA在健康受试者(n＝8)CD14+CD16+单核细胞中的表达相比失调的microRNA。将这些实验的数据相对于5种不同管家基因(ACTB,B2M,GAPDH,RPL19,和RPL10)的几何平均值进行标准化。在这些实验中，分析了664种microRNA的表达。图21A和图21B分别显示了microRNA在来自ALS受试者和MS受试者的CD14+CD16+单核细胞中与这些microRNA在健康对照的CD14+CD16+单核细胞中的表达相比的相对表达的热图。图20C显示了在来自ALS和MS受试者的CD14+CD16+单核细胞中与这些microRNA在来自健康对照的CD14+CD16+单核细胞中的表达相比显著失调的microRNA的汇总。
实施例6.在来自SOD1G93A小鼠的Lys6C高单核细胞和CD39+小胶质细胞中表达的促炎症标志物
在临床疾病发病之前1个月和疾病进展期间从SOD1小鼠脾脏分离的Lys6C高单核细胞的基因表达概貌。促炎症基因在两个时间点均有表达(图21A)。在179种通过nCounter测量的促炎症标志物基因中，97种被检出具有表达变化(与来自非转基因同窝小鼠的Lys6C高单核细胞相比)：40种基因在来自SOD1小鼠Lys6C高单核细胞中的至少在一个疾病阶段被上调(与非转基因同窝小鼠相比)。与来自非转基因同窝小鼠的Lys6C高单核细胞相比，7种基因在SOD1小鼠的Lys6C高单核细胞中被下调，包括TGFβ1和TGFβ1受体(图21B)。生物网络分析证明，在本分析中，受到最显著影响的炎症相关通路包括CREB1,NF-kB,PU.1,和PPARΚ(图21C)。这些通路已经显示在单核细胞活化和分化中均发挥重要作用。基因表达概貌分析证明，在SOD1小鼠的外周免疫区隔中有活化的促炎症Lys6C高单核细胞群体。
在疾病的不同阶段，对从SOD1小鼠脊髓和大脑分离的CD11b+/CD39+小胶质细胞进行了表达概貌分析。在179种炎症标志物基因中，检测到了120种：20种基因在SOD1小鼠的CD11b+/CD39+小胶质细胞中被上调(与非转基因同窝小鼠的CD11b+/CD39+小胶质细胞相比)(图21D)，38种基因在来自SOD1小鼠的CD11b+/CD39+小胶质细胞中被下调(与来自非转基因同窝小鼠的CD11b+/CD39+小胶质细胞相比)(图21E)。来自SOD1小鼠的CD11b+/CD39+小胶质细胞与非转基因同窝小鼠的相同细胞相比，具有趋化作用相关基因的突出表达(例如CCL2,CCL3,CCL4,CCL5,CXCR4,和CXCR10)。有趣的是，被下调的基因当中包括TGFβ1和TGFβ1受体。生物网络分析证明了炎症通路的活化，其中最显著的是趋化作用(图21F)。这些基因的表达在症状发病之前，并且在脊髓中而不是在大脑中观察到(图21G)。
实施例7.在ALS受试者的CD14+CD16-单核细胞中表达的促炎症标志物
来自ALS受试者的CD14+CD16-单核细胞的免疫相关基因表达分析如实施例6所述。与健康对照相比，数种炎症相关基因在ALS受试者的CD14+CD16-单核细胞中被上调。尽管来自ALS受试者的CD14+CD16-单核细胞与来自MS受试者的CD14+CD16-单核细胞之间在免疫相关基因的表达上存在一些差异，但是来自ALS受试者的CD14+CD16-单核细胞和来自MS受试者的CD14+CD16-单核细胞中的免疫相关基因表达概貌是相似的(图22A-C)。
在另一系列的实验中，对在患有ALS(散发性和家族性ALS)的受试者的CD14+CD16-单核细胞中的511种免疫相关基因的表达进行了分析。这些实验用定量NanoStringnCounter技术实施。用GeneGo和通路分析对从这些实验收集的数据和实施例6中所述的数据进行了进一步的分析。
用GeneGo Metacore通路分析(GeneGO,St.Joseph,MI)对在来自SOD1小鼠的脊髓CD39+小胶质细胞和脾Lys6C高单核细胞中、与在来自ALS受试者以及健康对照的血液来源CD14+CD16-单核细胞中差异上调的基因进行分析。该方法可鉴定在限定的本体(ontologies)中超比例(overpresented)的转录本。用q-值计算，对初步的P值应用错误发现率(FDR)过滤器。富集之后，为给定本体中的所有项目(term)计算P值，将每一个项目作为单独的假设进行检验。所得的q值代表了经过修正的P值，并具有该给定本体中所有项目和特定项目的等级序(rank order)的记录。对鉴定为显著失调的基因进一步进行分析，以鉴定SOD1小鼠和人ALS中的生物/疾病过程和参与的通路/网络。将来自SOD1小鼠脊髓的CD39+小胶质细胞中的58种失调基因和Lys6C高脾单核细胞中的47种失调基因的整个数据组导入到MetaCore中，以使用GeneGo过程、GeneGo疾病过程、经典通路图和网络建立功能本体(functionally ontology)的分析。在整个MetaCore中对图、网络和过程的统计学显著性的计算是基于P值，P值是根据超几何分布计算的。P值代表了偶然产生某一特定图的概率，考虑到图/网络/过程中存在的所有基因的集合中基因的数目，特定图/网络/过程上的基因的数目，和实验中的基因的数目。使用0.01的P值用于截止。上传数据集合的不同类别的相关程度由P值定义，因此P值越低表明优先度越高。输入实验数据构建网络。用于对通过网络构建算法(network building algorithm)产生的小型子网络进行分级的三种不同打分函数是：z分数(zScore)、g分数(gScore)和p值。Z分数以子网络被来自实验的基因饱和的情况对子网络(所分析的网络中的)进行分级。Z分数高表示网络被实验中鉴定的失调基因高度饱和。换言之，亲戚意味着特定网络中相对更多的基因/分析物存在于水性样品中。每个网络由用于构建该网络的经典途径构成。如果一个网络具有高g分数，则它被被表达的基因(来自z分数)饱和，且它含有许多经典途径。通过估计错误发现率为多重测试提供对照。在所测量的664种microRNA中，确信检测到了56种，并且有20种在至少一个疾病组中有差异表达。
使用Targetscan14.1研究miRNA-mRNA相互作用的统计显著性。
Targetscan14.1用于预测862044个保守的具有非零内容分数(non-zero contextscore)(其是一种保守度量)的miRNA结合位点，。在SOD1小鼠数据系列中：使用通路分析(IPA)的miRNA靶过滤分析产生了34个miRNA家族，预测它们靶定10797个mRNA。对这些数据进行过滤，以便仅包含那些参与IPA经典途径类别，代表参与细胞免疫应答、体液免疫应答和细胞因子信号传导的信号通路的基因。结果过滤出了34种microRNA，其靶定971种可能参与免疫应答信号传导的mRNA。用Nanostring平台将mRNA表达研究整合到该分析中。971种过滤的靶标中含有47个在SOD1小鼠中表达失调的基因，考虑了miRNA-mRNA调节的相反特性。这产生了最终的87对miRNA-mRNA相互作用，代表27个miRNA家族和33种mRNA。在ALS受试者研究的miRNA表达中，发现56种miRNA在ALS受试者中有显著失调。将预测的862044个位点过滤到仅含有这56种miRNA靶标的那些，导致预测的位点减少(减少到34118个位点)。通过将数据限制为被发现在免疫组(panel)nanostring阵列中倍数变化>1.4的基因，进一步减少了位点数目。最终的数据指示了68个独特的miRNA-mRNA相互作用对，其中mRNA和miRNA被相反地调节。对由56个失调表达的miRNA形成的这68个miRNA-mRNA相互作用的统计学显著性进行如下的进一步评估：1)1000个随机网络，其中使用来自研究中的56种随机选择的未被调节的miRNA发现了含有用于其结合的3’-UTR基序的mRNA，和2)将miRNA-mRNA对进一步过滤到仅含有在ALS受试者中表达失调的那59种mRNA。观察到了平均44.88个相互作用(SD＝9.99)。在表达研究中确定的真实相互作用为68个，并对应显著的P值(<1.1x10-15)。SOD1小鼠中被调节的miRNA-mRNA对的相似分析显示，平均值为15.26(SD＝4.03)的相互作用分布，而实验确定的真实miRNA-mRNA相互作用为41，并具有<5.7x10-9的显著P值。
数据显示，ALS受试者的CD14+CD16-单核细胞与健康受试者的CD14+CD16-单核细胞相比，具有独特的免疫相关基因表达。此外，少数免疫相关基因在来自散发性ALS受试者的CD14+CD16-单核细胞中与来自家族性ALS受试者的CD14+CD16-单核细胞相比有差异表达(图23A-C)。这些结果在独立组别的ALS患者和健康受试者中用单重(singleplex)qPCR进行了验证(验证了CCL2,AHR,PTAFR,NF-PB,TRAF3,FCER1A,CXCR4,和SOCS1的表达变化)(图24)。这些数据确认，与来自健康对照的CD14+CD16-单核细胞相比，CCL2,AHR,PTAFR,NF-PB,和TRAF3在ALS受试者的CD14+CD16-单核细胞中被上调，与来自健康对照的CD14+CD16-单核细胞相比，CXCR4和SOCS1在来自ALS受试者的CD14+CD16-单核细胞中被下调。
Ingenuity microRNA-mRNA靶过滤分析进一步显示，来自SOD1小鼠的Lys6C高细胞中最高的10个microRNA-miRNA相互作用与来自ALS受试者的CD14+CD16-单核细胞中最显著失调的基因相关联(图25)。
对miRNA和mRNA在来自ALS受试者CD14+CD16-单核细胞中的表达概貌的进一步分析显示，CD14+CD16-单核细胞中miRNA和基因表达相关的异常与炎症相关和免疫相关基因有关(图26和图27)。当对CD14+CD16-单核细胞中的这些microRNA-miRNA相互作用进行分析时，在SOD1小鼠和ALS受试者中，使用Targetscan4.1预测分析显示这些相互作用均是统计学显著的(图28)。而且，GeneGo通路分析鉴定了9个炎症相关网络(图29)。这些炎症网络与在SOD1小鼠Lys6C高单核细胞中观察到有失调的网络(在本文中所述的研究中)相同。
实施例8.miR-155在SOD1G93A模型中的治疗作用
在临床发病之前，miR-155在脾来源的Lys6C高单核细胞和脊髓来源的小胶质细胞中发生显著上调，这种上调在SOD1G93A小鼠的所有疾病进展阶段中均增加(见上文数据)。实施了进一步的实验以确定miR-155是否在ALS发生/发病机理中发挥作用。在这些实验中，进一步遗传操作SOD1小鼠(ALS模型)以敲低或敲除miR-155的表达。
动物和行为分析
B6/SJL-SOD1G93A Tg和SOD1-野生型(WT)由Prize4Life提供或从JacksonLaboratories购买。在30天和60天(症状发生前)、90-100天(早期症状)，和120-140天(晚期症状/末期)等时间点对ALS小鼠进行分析。症状的出现用体重曲线的峰值和可见的肌肉虚弱征象来定义。早期疾病根据症状演进和动物护理指导(因此其相对于135时间点有±5天变化)确定。疾病进展根据Prize4Life和Jackson Laboratory提供的确立方法学进行记录。每天进行监视，并从第80天开始每3-4天测量一次体重，来进行症状分析。症状出现定义为动物体重开始下降时的年龄。从50日龄开始，每天为每只小鼠评估双后肢的神经学得分。神经学得分使用由ALS治疗开发研究所(ALS Therapy Development Institute)(ALSTDI)创立的0-4级别。评定每个得分水平的标准为：0＝当用尾巴倒悬小鼠时，后肢从侧中线完全伸展，并且小鼠能够保持此体位2秒钟，倒悬2-3次；2＝尾部倒悬时，腿伸展向侧中线折叠(collapse)或部分折叠(虚弱)或后肢发抖；2＝在行走中，趾卷曲及至少一肢拖行；3＝僵硬瘫痪或关节运动极小，向前运动时不使用足；4＝小鼠在30秒内不能从任一侧卧状态恢复正常体位，安乐死。
SOD1G93A/miR-155-/-的制作
雄性SOD1G93A[B6.Cg-Tg(SOD1G93A)1Gur/J]小鼠与非转基因C57Bl/6miR155-/-雌性交配。非转基因的miR155-/-与F1-SOD1G93A/miR155-/+回交，从而产生缺失miR155的F2-SOD1G93A/miR155-/-。通过神经行为测试(小鼠转杠行为(rotarod performance)和神经学打分)对小鼠进行临床评估，对三个具有不同miR-155表达水平的SOD1小鼠实验组的生存进行了评估：1)SOD1G93A/miR155+/+；2)SOD1G93A/miR155-/+；和3)SOD1G93A/miR155-/-。
SOD1小鼠中miR-155的靶定
为了证明miRNA与其靶标之间的直接相互作用，使用携带具有潜在miRNA结合位点的3’UTR的荧光素酶报告物。miRNA结合位点的定点突变使得荧光素酶报告物对miRNA调节的应答性丧失，这将为直接靶定提供证明。
流式细胞术
如Cardona et al.(Nat.Protoc.1:1947-1951,2006)所述直接从小鼠脊髓分离单核细胞，只是没有使用分散酶(dispase)，因为我们发现分散酶会切割数种表面分子，并可能减少表面分子的表达的检出。小鼠用冰冷的磷酸缓冲盐水(PBS)透心脏灌流(transcardially perfused)，分别切出脊髓和脑。制备单细胞悬液，并在37％/70％不连续Percoll梯度(GE Healthcare)上进行离心，从界面分离单核细胞，并确定总细胞计数。细胞用抗-CD16/CD32(Fc Block BD Biosciences)预封闭，在冰上用抗-Ly6C-FITC,CD11b-PE-CyTM7,和4D4-APC(独特小胶质细胞抗体)的组合染色30分钟。使用7AAD-PerCP(BDBiosciences)检测或排除早期凋亡的细胞和死细胞。对所有细胞株使用合适的抗体IgG同种型对照(BD Biosciences)。在LSR仪器(BD Biosciences)上进行荧光活化细胞分选(FACS)分析，随后用FlowJo软件(TreeStar Software)对数据进行分析。
定量NanoString nCounter miRNA/基因表达分析
使用NanoString nCounter技术研究多达800个炎症相关基因的表达。同样如上所述地进行179种炎症相关转录本(由在炎症和免疫应答期间差异表达的基因构成)的多重靶表达概貌分析。
结果数据显示，SOD1G93A/miR155-/-动物与SOD1G93A动物相比在疾病发病和存活方面有显著延迟(表22和23，图30-34)。从80天开始，每3-4天评估一次小鼠的体重，每天评估小鼠的临床神经学得分，每周评估3次转杠(rotarod)行为。数据显示，miR-155基因敲除可延长生存51天(P<0.0001；图30)，将神经学得分达到2所经历的时间(time to reachneurologic score of2)延长了49天(P<0.0001；图31)，提高了旋转杠表现(图32)，降低了体重减轻(图33)，和延迟早期(P＝0.0003)和晚期(P＝0.0004)疾病发病(图34)。
表22.在SOD1/miR155-/-中发病的延迟和存活的提高(初步结果总结)
SOD1.miR155+/+ SOD1/miR155-/-
终末期145天 在162天，仍然在繁殖(breading)
表23.SOD1/miR155+/-和SOD1/miR155-/-小鼠的统计分析的累计结果
与SOD1G93A小鼠相比，SOD1G93A/miR155-/-动物的脊髓中与小胶质细胞保护相关的外周单核细胞招募也显著降低(图35)，与SOD1G93A小鼠相比，脊髓小胶质细胞和Lys6C高单核细胞中炎症相关基因的表达显著降低(图36)。然而，在脾T细胞中受到影响的炎症相关基因更少，抗炎基因(IL4和IL10)的表达回复到非转基因小鼠的水平，提示miR-155可能主要影响SOD1G93A小鼠Lys6C高单核细胞中M1-相关特征(signature)的活化。
这些数据表明，miR-155在ALS发展(发病机制)中发挥重要作用，通过向患有神经退行性病症(例如ALS，如家族性ALS和/或散发性ALS)的受试者施用至少一种靶定hsa-miR-155(例如前体或成熟hsa-miR-155)的抑制性核酸，可以治疗患有神经退行性病症(例如ALS，如家族性ALS和/或散发性ALS)的受试者。可以施用给患有神经退行性病症的受试者的靶定hsa-miR-155(例如前体或成熟hsa-miR-155)的抑制性核酸的实例在本文中描述。
实施例9.miR-155antagomir治疗SOD1G93A小鼠的功效
在家族性ALS的SOD1G93A模型中实施第一组实验，以确定靶定miR-155的antagomir是否会改变脊髓来源的小胶质细胞和脾Lys6C高单核细胞中miRNA的表达和/或炎症基因的表达。在这些实验中，研究如下5组实验组。
组I.对照乱序miR-155(腹膜内注射，2mg/次注射，每3天一次)(n＝3)。对照乱序miR-155：+TC+AA+C+A+TTA+G+A+CT+T+A(SEQ ID NO:263)(“+”表示存在LNA部分)。
组II.Antagomir miR-155低剂量(静脉内注射，0.2mg/次注射，每3天一次)(n＝3)。Antogomir miR-155:+TC+AC+A+A+TTA+G+C+AT+T+A(SEQ ID NO:262)(“+”表示存在LNA部分)。
组III.Antagomir miR-155高剂量静脉内注射，2mg/次注射，每3天一次)(n＝3)。
组IV.Antagomir miR-155低剂量(腹膜内注射，0.2mg/次注射，每3天一次)(n＝3)。
组V.Antagomir miR-155高剂量(腹膜内注射，2mg/次注射，每3天一次)(n＝3)。
在脊髓来源的小胶质细胞和脾Lys6C高单核细胞中进行Nanostring炎症基因和miRNA表达分析，如上所述。
对来自每三天1次(通过i.p.或i.v.)给予低(0.2mg/kg体重/注射)和高(2mg/kg体重/注射)剂量的SOD1小鼠的小胶质细胞和脾Ly6C单核细胞的数据比较显示，低剂量不影响脾Lys6C高单核细胞M1表型(与未处理的SOD1小鼠相比，在这些小鼠中观察到相同的miRNA和炎症基因表达)。然而，如炎症相关基因的定量nCounter技术测量显示的，高剂量(通过i.p.或i.v.给药)抑制促炎症细胞因子的表达。数据还显示，脊髓来源的小胶质细胞不受系统性antagomir miR-155处理的影响。
实施第二组实验，确定antagomir miR-155对SOD1小鼠行为和生存的影响。在这些实验中，SOD1小鼠被腹膜内注射施用乱序miR-155(n＝10)或antogomir miR-155，2mg/kg体重/次注射，每三天1次(n＝10)。治疗在疾病发病(由体重降低和神经学得分定义)时开始。小鼠被连续处理直至实验结束或终末期。确定小鼠的行为，例如通过转杠表现，并监视小鼠的体重和生存。
设计第三组实验，研究是否可以利用慢病毒介导的miR-155抑制来对SOD1小鼠中枢神经系统中的miR-155打靶。在这些实验中，通过慢病毒感染递送antigomer miR155。为了抑制miR-155，将编码突变体miR-155或其特异抑制物的序列克隆到慢病毒(Genecopoeia)中。根据使用说明感染靶细胞来产生病毒。通过脑立体定位仪(stereotaxic)进行注射向SOD1小鼠CSF或侧索递送大约2x107转化单位的重组慢病毒。处理组如下：
组I.施用高剂量对照慢病毒-乱序miR-155-GFP标签的小鼠(n＝10)。(见SEQ IDNO:263的对照乱序antagomir序列)
组II.施用高剂量antigomer慢病毒miR-155-GFP标签的小鼠(n＝10)。(见SEQ IDNO:262的antagomir miR-155序列)
跟踪小鼠的行为，例如通过转杠行为，并监视小鼠的体重和生存。还对来自这些小鼠的细胞(例如外周Lys6C高细胞)进行先天免疫系统的Nanostring miRNA和免疫相关基因表达概貌分析和T细胞炎症相关基因表达概貌分析。
还实施了nCounter表达分析以确定多种microRNA在来自野生型、SOD1/miR155-/+、SOD1/miR155-/-小鼠的Lys6C高脾来源单核细胞中的表达。数据显示，数种microRNA在野生型小鼠中与SOD1/miR155-/+小鼠相比差异表达，以及在SOD1/miR155-/+小鼠和SOD1/miR155-/-小鼠之间有差异表达(图37)。
还进行了来自散发性ALS(8个人类受试者)和复发缓解型多发性硬化(8个人类受试者)的血液来源CD14+CD16-单核细胞的microRNA的nCounter表达概貌分析，并与来自健康对照(8个人类受试者)的CD14+CD16-单核细胞的microRNA的表达进行比较。所得的图38的热图显示了采用Dunnett事后检验的方差分析(ANOVA)的结果(P<0.01)。标明了在来自ALS受试者的CD14+CD16-单核细胞中被上调或下调的microRNA(与这些microRNA在健康对照的CD14+CD16-单核细胞中的表达相比)。
其它实施方案
应当理解，尽管本发明是联系其详细说明书进行了描述，但是前述描述仅出于例证，并不限制本发明的范围，其范围由附加权利要求的范围限定。其它方面、优点和修改也在下文权利要求的范围之内。

Claims (32)

1.抑制性核酸在制备用于治疗患有肌萎缩性侧索硬化(ALS)的受试者体内ALS的药物中的用途，其中所述抑制性核酸包含12-15个核苷酸的序列，其与hsa-miR-155中存在的至少12个核苷酸的连贯序列互补，其中所述至少12个核苷酸的至少5个存在于hsa-miR-155的种子序列中。
2.权利要求1的用途，其中所述抑制性核酸的至少一种是antagomir。
3.权利要求2的用途，其中所述antagomir由SEQ ID NO:262组成。
4.权利要求1的用途，其中所述抑制性核酸的至少一种是反义寡核苷酸。
5.权利要求1的用途，其中所述抑制性核酸的至少一种是核酶。
6.权利要求1的用途，其中所述抑制性核酸的至少一种被注射到受试者的脑脊液中。
7.权利要求6的用途，其中所述注射是颅内注射。
8.权利要求6的用途，其中所述注射是鞘内注射。
9.权利要求1的用途，其中所述抑制性核酸与一种或多种阳离子聚合物和/或阳离子脂质络合。
10.hsa-miR-155在制备用于诊断受试者体内的肌萎缩性侧索硬化(ALS)的试剂盒中的用途，该诊断包括：
确定来自受试者的CD14+CD16-单核细胞中hsa-miR-155的水平；和
将来自受试者的CD14+CD16-单核细胞中的hsa-miR-155水平与hsa-miR-155的参考水平进行比较；
其中与所述参考水平相比，来自受试者的CD14+CD16-单核细胞中hsa-miR-155的水平增加表明受试者患有ALS。
11.权利要求10的用途，其中该诊断进一步包括：
确定来自受试者的CD14+CD16-单核细胞中选自下组的一种或多种microRNA的水平：hsa-miR-19b,hsa-miR-106b,hsa-miR-30b,hsa-miR-21,hsa-miR-142-5p,hsa-miR-27a,hsa-miR-16,hsa-miR-374a,hsa-miR-374b,hsa-miR-101,hsa-miR-340,hsa-miR-30e,hsa-miR-29c,hsa-miR-29a,hsa-miR-223,hsa-miR-26a,hsa-miR-26b,hsa-miR-24,hsa-miR-181a,hsa-miR-103,hsa-miR-532-3p,hsa-miR-518f,hsa-miR-206,hsa-miR-204,hsa-miR-137,hsa-miR-453,hsa-miR-146a,hsa-miR-603,hsa-miR-1297,hsa-miR-192,hsa-miR-526a,hsa-miR-615-5p,hsa-miR-655,hsa-miR-450b-5p,hsa-miR-548b-3p,hsa-miR-584,hsa-miR-548f,hsa-miR-300,hsa-miR-302c,hsa-miR-328,hsa-miR-421,hsa-miR-580,hsa-miR-15b,和hsa-miR-19a；和
将来自受试者的CD14+CD16-单核细胞中的所述至少一种microRNA的水平与该一种或多种microRNA的参考水平进行比较；
其中与所述参考水平相比，来自受试者的CD14+CD16-单核细胞中hsa-miR-19b,hsa-miR-106b,hsa-miR-30b,hsa-miR-21,hsa-miR-142-5p,hsa-miR-27a,hsa-miR-16,hsa-miR-374a,hsa-miR-374b,hsa-miR-101,hsa-miR-340,hsa-miR-30e,hsa-miR-29c,hsa-miR-29a,hsa-miR-223,hsa-miR-26a,hsa-miR-26b,hsa-miR-24,hsa-miR-181a,hsa-miR-103,hsa-miR-532-3p,hsa-miR-15b,和has-miR-19a中的所述一种或多种的水平增加，和/或hsa-miR-518f,hsa-miR-206,hsa-miR-204,hsa-miR-137,hsa-miR-453,hsa-miR-146a,hsa-miR-603,hsa-miR-1297,hsa-miR-192,hsa-miR-526a,hsa-miR-615-5p,hsa-miR-655,hsa-miR-450b-5p,hsa-miR-548b-3p,hsa-miR-584,hsa-miR-548f,hsa-miR-300,hsa-miR-302c,hsa-miR-328,hsa-miR-421,hsa-miR-580中的所述一种或多种的水平降低，表明受试者患有ALS。
12.hsa-miR-155在制备用于鉴定有发生肌萎缩性侧索硬化(ALS)风险的受试者的试剂盒中的用途，该鉴定包括：
确定来自受试者的CD14+CD16-单核细胞中hsa-miR-155的水平；和
将来自受试者的CD14+CD16-单核细胞中的hsa-miR-155水平与hsa-miR-155的参考水平进行比较；
其中与所述参考水平相比，来自受试者的CD14+CD16-单核细胞中hsa-miR-155的水平增加表明该受试者有增加的发生ALS的风险。
13.权利要求12的用途，其中该鉴定进一步包括：
确定来自受试者的CD14+CD16-单核细胞中一种或多种选自下组的microRNA的水平：hsa-miR-19b,hsa-miR-106b,hsa-miR-30b,hsa-miR-21,hsa-miR-142-5p,hsa-miR-27a,hsa-miR-16,hsa-miR-374a,hsa-miR-374b,hsa-miR-101,hsa-miR-340,hsa-miR-30e,hsa-miR-29c,hsa-miR-29a,hsa-miR-223,hsa-miR-26a,hsa-miR-26b,hsa-miR-24,hsa-miR-181a,hsa-miR-103,hsa-miR-532-3p,hsa-miR-518f,hsa-miR-206,hsa-miR-204,hsa-miR-137,hsa-miR-453,hsa-miR-146a,hsa-miR-603,hsa-miR-1297,hsa-miR-192,hsa-miR-526a,hsa-miR-615-5p,hsa-miR-655,hsa-miR-450b-5p,hsa-miR-548b-3p,hsa-miR-584,hsa-miR-548f,hsa-miR-300,hsa-miR-302c,hsa-miR-328,hsa-miR-421,hsa-miR-580,hsa-miR-15b,和hsa-miR-19a；和
将来自受试者的CD14+CD16-单核细胞中的所述一种或多种microRNA的水平与该一种或多种microRNA的参考水平进行比较；
其中与所述参考水平相比，来自受试者的CD14+CD16-单核细胞中hsa-miR-19b,hsa-miR-106b,hsa-miR-30b,hsa-miR-21,hsa-miR-142-5p,hsa-miR-27a,hsa-miR-16,hsa-miR-374a,hsa-miR-374b,hsa-miR-101,hsa-miR-340,hsa-miR-30e,hsa-miR-29c,hsa-miR-29a,hsa-miR-223,hsa-miR-26a,hsa-miR-26b,hsa-miR-24,hsa-miR-181a,hsa-miR-103,hsa-miR-532-3p,hsa-miR-15b,和hsa-miR-19a中的一种或多种的水平增加，和/或hsa-miR-518f,hsa-miR-206,hsa-miR-204,hsa-miR-137,hsa-miR-453,hsa-miR-146a,hsa-miR-603,hsa-miR-1297,hsa-miR-192,hsa-miR-526a,hsa-miR-615-5p,hsa-miR-655,hsa-miR-450b-5p,hsa-miR-548b-3p,hsa-miR-584,hsa-miR-548f,hsa-miR-300,hsa-miR-302c,hsa-miR-328,hsa-miR-421,和hsa-miR-580中的一种或多种的水平降低，表明该受试者有增加的发生ALS的风险。
14.hsa-miR-155在制备用于预测患有肌萎缩性侧索硬化(ALS)的受试者体内疾病进展速度的试剂盒中的用途，该预测包括：
确定来自受试者的CD14+CD16-单核细胞中hsa-miR-155的水平；和
将受试者CD14+CD16-单核细胞中的hsa-miR-155水平与hsa-miR-155的参考水平进行比较；
其中与所述参考水平相比，来自受试者的CD14+CD16-单核细胞中hsa-miR-155的水平增加，表明受试者将具有增加的疾病进展速度。
15.权利要求14的用途，其中该预测进一步包括：
确定来自受试者的CD14+CD16-单核细胞中选自下组的一种或多种microRNA的水平：hsa-miR-19b,hsa-miR-106b,hsa-miR-30b,hsa-miR-21,hsa-miR-142-5p,hsa-miR-27a,hsa-miR-16,hsa-miR-374a,hsa-miR-374b,hsa-miR-101,hsa-miR-340,hsa-miR-30e,hsa-miR-29c,hsa-miR-29a,hsa-miR-223,hsa-miR-26a,hsa-miR-26b,hsa-miR-24,hsa-miR-181a,hsa-miR-103,hsa-miR-532-3p,hsa-miR-518f,hsa-miR-206,hsa-miR-204,hsa-miR-137,hsa-miR-453,hsa-miR-146a,hsa-miR-603,hsa-miR-1297,hsa-miR-192,hsa-miR-526a,hsa-miR-615-5p,hsa-miR-655,hsa-miR-450b-5p,hsa-miR-548b-3p,hsa-miR-584,hsa-miR-548f,hsa-miR-300,hsa-miR-302c,hsa-miR-328,hsa-miR-421,hsa-miR-580,hsa-miR-15b,和hsa-miR-19a；和
将受试者CD14+CD16-单核细胞中的所述一种或多种microRNA的水平与该一种或多种microRNA的参考水平进行比较；
其中与所述参考水平相比，来自受试者的CD14+CD16-单核细胞中hsa-miR-19b,hsa-miR-106b,hsa-miR-30b,hsa-miR-21,hsa-miR-142-5p,hsa-miR-27a,hsa-miR-16,hsa-miR-374a,hsa-miR-374b,hsa-miR-101,hsa-miR-340,hsa-miR-30e,hsa-miR-29c,hsa-miR-29a,hsa-miR-223,hsa-miR-26a,hsa-miR-26b,hsa-miR-24,hsa-miR-181a,hsa-miR-103,hsa-miR-532-3p,hsa-miR-15b,和hsa-miR-19a中的一种或多种的水平增加，和/或hsa-miR-518f,hsa-miR-206,hsa-miR-204,hsa-miR-137,hsa-miR-453,hsa-miR-146a,hsa-miR-603,hsa-miR-1297,hsa-miR-192,hsa-miR-526a,hsa-miR-615-5p,hsa-miR-655,hsa-miR-450b-5p,hsa-miR-548b-3p,hsa-miR-584,hsa-miR-548f,hsa-miR-300,hsa-miR-302c,hsa-miR-328,hsa-miR-421,和hsa-miR-580中的一种或多种的水平降低，表明受试者将具有增加的疾病进展速度。
16.权利要求14的用途，其中疾病进展速度的增加是指ALS的一种或多种症状发病的速度增加，ALS的一种或多种症状的恶化增加，ALS的一种或多种症状的频率增加，ALS的一种或多种症状的持续时间增加，或受试者的寿命减少。
17.hsa-miR-155在制造用于选择受试者进行肌萎缩性侧索硬化(ALS)治疗的试剂盒中的用途，该选择包括：
确定来自受试者的CD14+CD16-单核细胞中hsa-miR-155的水平；
将来自受试者的CD14+CD16-单核细胞中hsa-miR-155的水平与hsa-miR-155的参考水平进行比较；和
选择与所述参考水平相比CD14+CD16-单核细胞中hsa-miR-155的水平增加的受试者进行ALS治疗。
18.权利要求17的用途，其中该选择进一步包括：
确定来自受试者的CD14+CD16-单核细胞中选自下组的一种或多种microRNA的水平：hsa-miR-19b,hsa-miR-106b,hsa-miR-30b,hsa-miR-21,hsa-miR-142-5p,hsa-miR-27a,hsa-miR-16,hsa-miR-374a,hsa-miR-374b,hsa-miR-101,hsa-miR-340,hsa-miR-30e,hsa-miR-29c,hsa-miR-29a,hsa-miR-223,hsa-miR-26a,hsa-miR-26b,hsa-miR-24,hsa-miR-181a,hsa-miR-103,hsa-miR-532-3p,hsa-miR-518f,hsa-miR-206,hsa-miR-204,hsa-miR-137,hsa-miR-453,hsa-miR-146a,hsa-miR-603,hsa-miR-1297,hsa-miR-192,hsa-miR-526a,hsa-miR-615-5p,hsa-miR-655,hsa-miR-450b-5p,hsa-miR-548b-3p,hsa-miR-584,hsa-miR-548f,hsa-miR-300,hsa-miR-302c,hsa-miR-328,hsa-miR-421,hsa-miR-580,hsa-miR-15b,和hsa-miR-19a；
将来自受试者的CD14+CD16-单核细胞中所述一种或多种microRNA的水平与该一种或多种microRNA的参考水平进行比较；和
选择与所述参考水平相比，CD14+CD16-单核细胞中hsa-miR-19b,hsa-miR-106b,hsa-miR-30b,hsa-miR-21,hsa-miR-142-5p,hsa-miR-27a,hsa-miR-16,hsa-miR-374a,hsa-miR-374b,hsa-miR-101,hsa-miR-340,hsa-miR-30e,hsa-miR-29c,hsa-miR-29a,hsa-miR-223,hsa-miR-26a,hsa-miR-26b,hsa-miR-24,hsa-miR-181a,hsa-miR-103,hsa-miR-532-3p,hsa-miR-15b,和hsa-miR-19a中的一种或多种的水平增加，和/或hsa-miR-518f,hsa-miR-206,hsa-miR-204,hsa-miR-137,hsa-miR-453,hsa-miR-146a,hsa-miR-603,hsa-miR-1297,hsa-miR-192,hsa-miR-526a,hsa-miR-615-5p,hsa-miR-655,hsa-miR-450b-5p,hsa-miR-548b-3p,hsa-miR-584,hsa-miR-548f,hsa-miR-300,hsa-miR-302c,hsa-miR-328,hsa-miR-421,和hsa-miR-580中的一种或多种的水平降低的受试者进行ALS治疗。
19.权利要求17的用途，其中对所选受试者进一步施用ALS治疗。
20.hsa-miR-155在制备用于选择受试者参与临床研究的试剂盒中的用途，该选择包括：
确定来自受试者的CD14+CD16-单核细胞中hsa-miR-155的水平；
将来自受试者的CD14+CD16-单核细胞中hsa-miR-155的水平与hsa-miR-155的参考水平进行比较；和
选择与所述参考水平相比，CD14+CD16-单核细胞中hsa-miR-155的水平增加的受试者参与临床研究。
21.权利要求20的用途，其中该选择进一步包括：
确定来自受试者的CD14+CD16-单核细胞中选自下组的一种或多种microRNA的水平：hsa-miR-19b,hsa-miR-106b,hsa-miR-30b,hsa-miR-21,hsa-miR-142-5p,hsa-miR-27a,hsa-miR-16,hsa-miR-374a,hsa-miR-374b,hsa-miR-101,hsa-miR-340,hsa-miR-30e,hsa-miR-29c,hsa-miR-29a,hsa-miR-223,hsa-miR-26a,hsa-miR-26b,hsa-miR-24,hsa-miR-181a,hsa-miR-103,hsa-miR-532-3p,hsa-miR-518f,hsa-miR-206,hsa-miR-204,hsa-miR-137,hsa-miR-453,hsa-miR-146a,hsa-miR-603,hsa-miR-1297,hsa-miR-192,hsa-miR-526a,hsa-miR-615-5p,hsa-miR-655,hsa-miR-450b-5p,hsa-miR-548b-3p,hsa-miR-584,hsa-miR-548f,hsa-miR-300,hsa-miR-302c,hsa-miR-328,hsa-miR-421,hsa-miR-580,hsa-miR-15b,和hsa-miR-19a；
将来自受试者的CD14+CD16-单核细胞中所述一种或多种microRNA的水平与该一种或多种microRNA的参考水平进行比较；和
选择与所述参考水平相比，CD14+CD16-单核细胞中hsa-miR-19b,hsa-miR-106b,hsa-miR-30b,hsa-miR-21,hsa-miR-142-5p,hsa-miR-27a,hsa-miR-16,hsa-miR-374a,hsa-miR-374b,hsa-miR-101,hsa-miR-340,hsa-miR-30e,hsa-miR-29c,hsa-miR-29a,hsa-miR-223,hsa-miR-26a,hsa-miR-26b,hsa-miR-24,hsa-miR-181a,hsa-miR-103,hsa-miR-532-3p,hsa-miR-15b,和hsa-miR-19a中的一种或多种的水平增加，和/或hsa-miR-518f,hsa-miR-206,hsa-miR-204,hsa-miR-137,hsa-miR-453,hsa-miR-146a,hsa-miR-603,hsa-miR-1297,hsa-miR-192,hsa-miR-526a,hsa-miR-615-5p,hsa-miR-655,hsa-miR-450b-5p,hsa-miR-548b-3p,hsa-miR-584,hsa-miR-548f,hsa-miR-300,hsa-miR-302c,hsa-miR-328,hsa-miR-421,和hsa-miR-580中的一种或多种的水平降低的受试者参与临床研究。
22.hsa-miR-155在制备用于确定受试者体内肌萎缩性侧索硬化(ALS)治疗的功效的试剂盒中的用途，该确定包括：
在第一时间点确定来自受试者的CD14+CD16-单核细胞中hsa-miR-155的水平；
在施用至少一剂治疗后的第二时间点，确定来自该受试者的CD14+CD16-单核细胞中的hsa-miR-155的水平；和
将该hsa-miR-155在所述第一时间点的水平与该hsa-miR-155在所述第二时间点的水平进行比较；
其中与第一时间点的水平相比，第二时间点时hsa-miR-155的水平降低，表明治疗在受试者体内有效。
23.权利要求22的用途，其中该确定进一步包括：
在第一时间点确定来自受试者的CD14+CD16-单核细胞中选自下组的一种或多种microRNA的水平：hsa-miR-19b,hsa-miR-106b,hsa-miR-30b,hsa-miR-21,hsa-miR-142-5p,hsa-miR-27a,hsa-miR-16,hsa-miR-374a,hsa-miR-374b,hsa-miR-101,hsa-miR-340,hsa-miR-30e,hsa-miR-29c,hsa-miR-29a,hsa-miR-223,hsa-miR-26a,hsa-miR-26b,hsa-miR-24,hsa-miR-181a,hsa-miR-103,hsa-miR-532-3p,hsa-miR-518f,hsa-miR-206,hsa-miR-204,hsa-miR-137,hsa-miR-453,hsa-miR-146a,hsa-miR-603,hsa-miR-1297,hsa-miR-192,hsa-miR-526a,hsa-miR-615-5p,hsa-miR-655,hsa-miR-450b-5p,hsa-miR-548b-3p,hsa-miR-584,hsa-miR-548f,hsa-miR-300,hsa-miR-302c,hsa-miR-328,hsa-miR-421,hsa-miR-580,hsa-miR-15b,和hsa-miR-19a；
在施用至少一剂治疗后的第二时间点，确定来自该受试者的CD14+CD16-单核细胞中的所述一种或多种microRNA的水平；和
将该一种或多种microRNA在所述第一时间点的水平与该一种或多种microRNA在所述第二时间点的水平进行比较；
其中与第一时间点的水平相比，第二时间点时hsa-miR-19b,hsa-miR-106b,hsa-miR-30b,hsa-miR-21,hsa-miR-142-5p,hsa-miR-27a,hsa-miR-16,hsa-miR-374a,hsa-miR-374b,hsa-miR-101,hsa-miR-340,hsa-miR-30e,hsa-miR-29c,hsa-miR-29a,hsa-miR-223,hsa-miR-26a,hsa-miR-26b,hsa-miR-24,hsa-miR-181a,hsa-miR-103,hsa-miR-532-3p,hsa-miR-15b,和hsa-miR-19a中的一种或多种的水平降低，和/或hsa-miR-518f,hsa-miR-206,hsa-miR-204,hsa-miR-137,hsa-miR-453,hsa-miR-146a,hsa-miR-603,hsa-miR-1297,hsa-miR-192,hsa-miR-526a,hsa-miR-615-5p,hsa-miR-655,hsa-miR-450b-5p,hsa-miR-548b-3p,hsa-miR-584,hsa-miR-548f,hsa-miR-300,hsa-miR-302c,hsa-miR-328,hsa-miR-421,和hsa-miR-580中的一种或多种的水平增加，表明治疗在受试者体内有效。
24.权利要求10-21中任一项的用途，其中所述参考水平是阈值水平。
25.权利要求10-21中任一项的用途，其中所述参考水平是在来自对照受试者的CD14+CD16-单核细胞中发现的水平。
26.权利要求10-23中任一项的用途，还包括从所述受试者获得含有CD14+CD16-单核细胞的生物样品。
27.权利要求26的用途，进一步包括从生物样品纯化CD14+CD16-单核细胞。
28.权利要求10-23中任一项的用途，其中hsa-miR-155或一种或多种microRNA是前体microRNA。
29.权利要求10-23中任一项的用途，其中hsa-miR-155或一种或多种microRNA是成熟microRNA。
30.权利要求1-9中任一项的用途，其中hsa-miR-155中存在的至少7个核苷酸的连贯序列包含种子序列内的至少5个连贯的核苷酸。
31.权利要求1-9中任一项的用途，其中所述抑制性核酸包含与hsa-miR-155中存在的至少12个核苷酸的连贯序列互补的序列。
32.权利要求31的用途，其中hsa-miR-155中存在的至少12个核苷酸的连贯序列包含种子序列内的至少5个连贯的核苷酸。
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