JP3019994B2 - 新規なオリゴデオキシヌクレオチド、それを使用した標的遺伝子の発現をブロックする方法、及び新規なオリゴデオキシヌクレオチド並びにそれを使用した標的遺伝子の発現を阻止する方法 - Google Patents

新規なオリゴデオキシヌクレオチド、それを使用した標的遺伝子の発現をブロックする方法、及び新規なオリゴデオキシヌクレオチド並びにそれを使用した標的遺伝子の発現を阻止する方法

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Description

【発明の詳細な説明】 補助金 本発明は、国立予防衛生研究所（National Institute
s of Health）からの補助金で進めていた研究過程で発
明されたものである。補助金番号HL−33555及びAM−252
95。
発明の背景 核酸、即ちデオキシリボ核酸（DNA）とリボ核酸（RN
A）は、生体細胞に不可欠な構成ブロックであることは
よく知られている。これらの化合物は、多くの「ヌクレ
オチド」単位から構成される高分子量ポリマーで、各ヌ
クレオチド単位は塩基（プリン又はピリミジン）、糖
（リボース又はデオキシリボース）、及びリン酸分子か
ら構成されている。DNAは糖集団としてのデオキシリボ
ースと塩基のアデニン、グアニン、シトシン及びチミン
（これらはそれぞれＡ、Ｇ、Ｃ及びＴと表される）を含
んでいる。RANはデオキシリボースの代わりにリボース
と、チミンの代わりにウラシル（Ｕ）を含んでいる。
DNA及びRNA内のヌクレオチド単位は一定の直線シーケ
ンスで組み立てられ、そのシーケンスが生物学的機能を
決定する。正常の哺乳類動物の細胞では、DNAは自己複
製し、またRNA分子を合成する際の鋳型としても機能す
る。このRNA分子のヌクレオチド・シーケンスはDNAによ
って符号化された情報を伝える。RNA分子は細胞内で様
々な機能を持っている。メッセンジャーRNA（mRNA）は
タンパク質合成を指令する。
有名なワトソン−クリック・モデルによると、DNA分
子は共通軸の回りに巻かれた２本のポリヌクレオチド連
鎖から構成されている。この二重らせんは、各連鎖の相
補塩基対の間の水素結合によって維持されている。水素
結合はアデニン（Ａ）とチミン（Ｔ）の間、及びグアニ
ン（Ｇ）とシトシン（Ｃ）の間にしかない。したがっ
て、二重らせん内ではアデニン（Ａ）とチミン（Ｔ）は
Ａ−Ｔとして互いに結合している相補塩基のように見え
る。同じ事はグアニン（Ｇ）とシトシン（Ｃ）にも言え
る（Ｇ−Ｃ）。
１本のポリヌクレオチド連鎖では任意のシーケンスの
ヌクレオチドが可能である。しかし、DNA分子の１本の
連鎖内の塩基の順序が一旦決定されると、前述の塩基ペ
アリングのためにその他の鎖のシーケンスも同時に決定
する。従って、DNA分子の各連鎖はもう一方の補足であ
る。DNA複製の過程では、２本の連鎖が相補ヌクレオチ
ドシーケンスをもつ新しい２本の鎖を合成する際の鋳型
として機能する。その結果、それぞれが元々の連鎖１本
とそれを相補する新しく合成された連鎖１本をもつ新し
いDNA分子が２個生成される。この過程は半保守的複製
と呼ばれ、ヌクレオチドシーケンスによって決定するDN
A内に符号化された遺伝情報は、一つの世代から次の世
代へと伝達される。
生物の遺伝情報はまとめてゲノムと呼ばれる。バクテ
リアやそれより高等な全ての種のゲノムはDNAから構成
されている。ウイルムのゲノムはDNA又はRNAのいずれか
である。いずれにせよ、ウイルスであれ、バクテリアで
あれ、またはより高等な生物であれ、特定の種のゲノム
は特徴的なヌクレオチドシーケンスを持っており、それ
は簡単に言えば、その種の「指紋」として見ることが出
来る。
転写の過程でDNAはRNAにコピー即ち転写される。合成
されるRNA分子は１本鎖である。そのヌクレオチドシー
ケンスはDNA分子の２本の連鎖の内１本のセグメントを
補足するもので、従って、チミンがウラシルと代わる以
外は対応する連鎖の正確なコピーである。１個のRNA分
子を形成するようにコピーされるDNAの長さが１個の遺
伝子である。人間のゲノムには約５万個の遺伝子が含ま
れている。
メッセンジャーRAN（mRAN）はタンパク質合成に必要
なコーティング情報を運ぶ。mRNa分子内のヌクレオチド
シーケンスは、そのmRNAが指令する合成で出来上がるタ
ンパク質のアミノ酸配列を指令する。ヌクレオチドが３
個配列したコドンと呼ばれる単位は、特定のアミノ酸を
指定する。mRNAがタンパク質合成を指令する過程は翻訳
と呼ばれる。mRNAの翻訳は、細胞の細胞室内にあるリボ
ソームで起こる。
遺伝子からタンパク質への情報の流れは次の図で表す
ことが出来る： 生体で作られるそれぞれのタンパク質にはそれに対応
する遺伝子が１個存在する。
分子生物学分野では、オリゴデオキシリボヌクレオチ
ド、即ち指定されたmRNAの一部を補足するヌクレオチド
シーケンスを持つ短い１本鎖DNAのフラグメントを、対
応する遺伝子の表現を抑制するために使用出来ることは
良く知られている。これは前述の塩基ペアリングの規則
に従えば、オリゴヌクレオチドのmRNAへの雑種形成（結
合）によって起こり、mRNAの翻訳を防止する。この翻訳
の抑制は、オリゴヌクレオチドで形成されたRNA−DNA二
重らせんにある酵素RNase HがmRNAを裂開することによ
って起こることが最近発見された（第１図参照）。オリ
ゴヌクレオチドのmRNAとの雑種形成は、一般に、それ自
体では翻訳を有意に抑制するには不十分である。翻訳の
過程でmRNAに結合しているオリゴヌクレオチドをはぎ取
れることは明らかである。この結果から、修正したオリ
ゴヌクレオチドが遺伝子の表現を有効にブロックするに
は、選択したmRNAで形成された雑種がRNase Hによって
識別され、酵素によって裂開されなければならないこと
は推論できる。
第１図に概略した雑種で抑制された翻訳の過程は、治
療剤としてオリゴヌクレオチドを使用できることを明ら
かに示唆している。オリゴヌクレオチドはあるウイルス
又はバクテリアの複数に不可欠な特定の遺伝子の表現を
選択的にブロックすることによって、抗菌剤として作用
するであろう。同時に、コントロール出来ない癌細胞の
増殖に責任がある又は増殖に必要な遺伝子にターゲット
を合わせたヌクレオチドは、抗癌剤として有用となるだ
ろう。また現在適切な治療法が存在しない鎌状赤血球貧
血やセラセミアといった遺伝子病の治療にも利用でき
る。このアプローチではどの遺伝子でもターゲットにす
ることが出来る。従来の化学治療薬の開発で大きな障害
となっている薬剤特異性の問題は、選択したmRNAを補足
する適当なオリゴヌクレオチドシーケンスを選択するこ
とによってすぐに解決出来る。これによって薬剤の特異
性が無いために起こる、現在ある全ての抗ウイルス剤及
び抗癌剤において深刻な限界となっている毒性の問題を
回避することが出来る。
ヒトの病気を治療するために、選択した遺伝子の表現
をブロックするオリゴヌクレオチドを使用することの他
に、その他のアプリケーションも認識されている。その
中には、獣医学において殺虫剤又は殺菌剤としてこれら
のオリゴヌクレオチドを使用することや、工業又は農業
プロセスにおいてそのプロセスで使用する生物によって
特定の遺伝子の表現を抑制することなどがある。
治療剤としてオリゴヌクレオチドを使用することにお
ける大きな問題点は、血液及び細胞内でオリゴヌクレオ
チドが迅速に減成することである。DNA又はRNAを減成す
る酵素はヌクレアーゼと呼ばれる。この酵素は、DNA又
はRNA鎖内でヌクレオチドを結合しているホスホジエス
テル結合を加水分解し、分子を小さいフラグメントに裂
開する。
過去にもヌクレアーゼの分解に抵抗性であるオリゴヌ
クレオチド類似体の開発において少しの進歩があった
が、特定の遺伝子の表現をブロックするためにこのよう
な誘導体を使用することは成功しなかった。例えば、19
84年９月４日発効のTs'oらの米国特許第4,469,863号;19
85年３月27日発効のMillerらの米国特許第4,507,433号;
1985年４月16日発号のMillerらの米国特許第4,511,713
号を参照されたい。以上の特許は、選択した遺伝子の表
現をブロックするという目的は共通であるが、高濃度の
オリゴヌクレオチドが必要であり、それと比べては選択
性に欠けることから判断して、取られたアプローチは成
功とは呼べないものであった。以上３点の特許で説明さ
れている研究では、全てのリン酸塩基がメチルリン酸塩
の形に修正されたオリゴヌクレオチドを使用している： ここでB1及びB2は核酸塩基である（Ａ、Ｇ、Ｃ、又は
Ｔ）。
米国特許第4,469,863号は、とりわけオリゴヌクレオ
チドのメチルリン酸塩修正を使用している。米国特許第
4,507,433号ではポリスチレン・サポート上にデオキシ
リボ核酸メチルリン酸塩を合成するというプロセスを使
用している。また、米国特許第4,511,713号は、核酸の
塩基シーケンスを判定し、その機能に干渉するために適
切に合成したオリゴヌクレオチド・メチルリン酸塩にそ
れを雑種形成するというものである。
これらの完全に修正したメチルリン酸塩類似体を使用
した場合、その活性は低く、mRNAと雑種形成した場合、
RNase Hに対して有効な基質を形成するかは疑わしい。
第２例に示した結果はこれを表している。
治療剤としてもっと利用できる新しいオリゴヌクレオ
チド類似体を考案しようという努力の中で、我々はオリ
ゴヌクレオチドが血液及び細胞内で減成する経路を研究
した。その結果、血液中における唯一の減成経路（第３
例）及び細胞内における優勢な減成経路（第４図）は、
DNA鎖の３′−及び５′−末端からの連続減成であり、
１度に１個のヌクレオチドが除去されることが分かっ
た。この減成経路は第２図に示した。この結果は初め
て、RNase Hに対する基質形成能力を損なうことなくそ
の減成を抑制するように修正されたオリゴヌクレオチド
類似体の考案の合理的基本となった。
その後、３′−最高（most）ヌクレオチド間結合のみ
を修正したオリゴヌクレオチドが血液及び細胞内の減成
から顕著に保護されることが分かった（第５例５第６
例）。更に、この誘導体は正常の雑種形成特性を持って
おり、RNase Hによって認識・裂開されるmRNAと基質を
形成し、それによって目標遺伝子の表現を防止すること
を我々は発見した（第７例）。
減成しにくく従って治療利用時により有効となるオリ
ゴヌクレオチドによって、選択した遺伝子の表現を抑制
することが、この発明の主要目的である。
その他の目的としては、３′−ホスホジエステル結合
を修正したオリゴヌクレオチドの調製と、治療に適した
方法で修正オリゴヌクレオチドを処方することが上げら
れる。また、このように修正したDNA又はRNA分子は、診
断アプリケーションにおいて雑種形成プローブとして有
用であろうことも明らかである。この場合、３′−ヌク
レオチド間結合の修正によって、検体内に存在するかも
しれないヌクレアーゼによるプローブの減成が抑制され
るであろう。
図面の簡単な説明 第１図は、この発明のプロセスにより、mRNA内でオリ
ゴヌクレオチドをその相補配列とハイブリッド形成し、
RNA−DNA二重らせんにおいて酵素RNase HによりmRNAを
開裂することによって、選択した遺伝子の表現がどのよ
うにブロックされるかを示す模式図である。
第２図は、鎖の３′−〜５′−末端から一度に１個の
ヌクレオチドを順々に除去するヌクレアーゼの作用によ
る、１本鎖DNA分子の分解を示す図である。
第３図は、ヒト血液内のDNAフラグメントの唯一の分
解経路が、DNA鎖の３′−〜５′−末端からの外仁（exo
nucleolytic）開裂によるものであることを示す放射能
写真の図である。この実験で使用したオリゴヌクレオチ
ドMA−15は、５′−GAGCACCATGGTTTCという配列を持っ
ている。レーン１〜５では32Pによってオリゴヌクレオ
チド分子の５′−末端を放射能標識した。レーン６〜10
では、３′−端末のヌクレオチド間結合を32Pで標識し
た。標識したオリゴヌクレオチドを37℃のヒト血液内で
培養した。示した時間にアリコットを取り出し、ポリア
クリルアミドゲル電気泳動によって分析した。ゲル内の
標識した帯は、放射能写真によって視覚化した。
第４図は、３′−最高ヌクレオチド間結合のみが修正
されたオリゴヌクレオチドが、ヒト血液中における減成
に完全に耐性があることを実証する放射能写真の図であ
る。オリゴヌクレオチドは、３′−末端ヌクレオチド間
結合が2,2,2−トリクロロ−1,1−ジメチルエチルホスホ
トリエステルであるMA−15の誘導体である。レーン１は
培養前のオリゴヌクレオチドである。レーン２〜５はオ
リゴヌクレオチドをそれぞれ15分、１時間、４時間、及
び18時間血液中で培養した後に取り出したアリコットで
ある。元の帯の強度が減少したのは、オリゴヌクレオチ
ドが分解したためと言うよりも、単に５′−末端の標識
が除去されたことによるものである。Piは無機リン酸塩
である。
第５図は、３′−ヌクレオチド間結合が修正されたオ
リゴヌクレオチドが、RNase Hによって作用するmRNAと
基質を形成し、その結果RNA−DNAの二重らせんにおいて
mRNAが開裂することを実証したノザン（Northern）法の
放射能写真の図である。レーン１は単なるマウスのグロ
ビンmRNAである。レーン２はオリゴヌクレオチドが存在
しない条件下でRNase Hによって培養したマウスのグロ
ビンmRNAである。レーン３はMA−15とハイブリッド形成
を行うRNase Hによって開裂したグロビンmRNAである。
レーン４では、RNase Hの基質が、３′−末端ヌクレオ
チド間結合がトリクロロジメチルエチル・ホスホトリエ
ステルであるMA−15の誘導体によって形成されている。
レーン５では、使用したオリゴヌクレオチドが分子の
５′−OH基においてナフチルイソシアン酸塩によってさ
らに修飾された。サンプルは1.5％アガロースゲルで電
気泳動した。電気泳動後、ゲルを遺伝子スクリーンプラ
ス（DuPont）の上にブロットし、α−グロビンmRNAのプ
ローブとして32Pで標識したMA−15を用いて帯の位置を
つきとめた。
発明の要約 本発明は、少なくとも三つの構造要素、即ち、（ａ）
オリゴデオキシヌクレオチドに対するエキソヌクレアー
ゼ抵抗性を付与する３′−末端インターヌクレオチド結
合への修飾；（ｂ）インターヌクレオチド結合に接続さ
れていて、オリゴデオキシヌクレオチドが相補的RNA分
子にハイブリッドされた時RNase Hの活性を妨害しない
少なくとも５個のヌクレオチドのストレッチ；及び
（ｃ）ヌクレアーゼ抵抗性を付与する及び／又は細胞中
へのオリゴデオキシヌクレオチドの転移を促進する少な
くとも１個の他の化学修飾を有する新規なオリゴデオキ
シヌクレオチド、それを用いた遺伝子の発現をブロック
する方法、及び新規なオリゴヌクレオチド並びにそれを
使用した標的遺伝子の発現を阻止する方法に関する。
発明の詳細な説明 大まかに言えば、本発明の目的は、３′−末端ホスホ
ジエステル結合において修飾したオリゴヌクレオチドに
よって達成されている。これが達成される時、オリゴヌ
クレオチドは細胞及び血液内のヌクレアーゼによる分解
に対し顕著な耐性があることが発見された。このように
修飾されたオリゴヌクレオチドは、通常、相補核酸配列
とハイブリッド形成し、RNase Hによって識別・開裂さ
れるmRNAと基質を形成することも同様に重要である。mR
NAの開裂の結果、対応する遺伝子の表現が選択的にブロ
ックされる。これは様々な治療法にとって望ましいこと
である。
DNA組換え技術を採用した分子生物学の最近の進歩に
よって、新しい診断法及び治療法が登場している。DNA
診断では、DNA又はRNAプローブが相補核酸（DNA又はRN
A）配列の検出に使用されている。この過程ではプロー
ブの相補配列がサンプル内に存在すれば、プローブはそ
れと雑種形成する。標的配列はバクテリア又はウィルス
のDNA又はRNA分子であるかもしれないし、或いは鎌状赤
血球貧血のような遺伝子異常を引き起こす変形遺伝子で
あるかもしれない。分析するサンプルはしばしばニトロ
セルロースやナイロンメンブランといった固体のサポー
ト上に固定される。プローブは放射能、蛍光又は酵素マ
ーカーといった標識を持っており、検出を可能にする。
DNA診断の分野は現在非常に積極的に研究されている最
中であり、感染症、癌、及び遺伝子異常の診断に用途を
持っている。しかし、また臨床で広く使用されている物
質はない。現在ある方法は研究ツールとしては極めて有
用であるが、多くの実際のアプリケーションに対しては
感受性を欠いており、臨床の場でルーチンに信頼性高く
実行するにはしばしば余りに複雑である。
DNA治療においては、対応するmRNA内の相補配列とハ
イブリッド形成を行い、mRNAが翻訳されるのを防止する
ことによって標的遺伝子の表現をブロックするためにオ
リゴヌクレオチドが使用されている。このようにして、
その遺伝子によって符号化されたタンパク質の合成がブ
ロックされる。前述の特許３件で採用されている基本的
概念はこのようなものである。しかし、この発明の核心
を形成している最近の研究では、標的遺伝子の表現のブ
ロックは、オリゴヌクレオチドのmRNAへのハイブリッド
形成のみによっておこるのではなく、このようにして形
成されたRNA−DNA二重らせんが酵素RNase Hに対する基
質として機能することも必要であることが分かった。DN
A複製に必要な偏在酵素であるRNase Hは、RNA−DNA二本
鎖においてmRNAを消化する。開裂するのはmRNAのみであ
る。オリゴヌクレオチドは無傷で解放され、第１図の点
線で表したようにその他のmRNA分子と繰り返し反応する
ことができる。その際、オリゴヌクレオチドの各分子の
効果は増強され、標的遺伝子の発現がブロックされる効
率が高まる。
RNase HはRNA−DNA二重らせんでしか作用しないが、R
NA−DNA二本鎖は酵素に対する基質として機能しない。
従って、治療にはRNA分子よりもオリゴデオキシリボヌ
クレオチド（短い一本鎖のDNAフラグメント）の方が好
ましい。診断用のプローブとしてはRNA又はDNA分子のい
ずれかを使用することができる。
DNA診断及びDNA治療において直面する唯一の問題は、
プローブ又は治療剤として使用されるDNA又はRNA分子
が、体液及び組織に存在するヌクレアーゼという加水分
解酵素によって分解することである。この問題はDNA治
療では特に大きな問題である。オリゴヌクレオチドは血
液内で分解し、細胞内ではさらに速い速度で分解する。
その減成速度は薬剤の効果を完全になくすのに充分な程
である。DNA診断検査用の臨床サンプルを調製すると
き、混濁しているヌクオチドを除去する努力が行われて
いる。しかし、低レベルではあるがまだ活性は残ってい
ることがある。ある場合には、特に遺伝子検査に応用す
る場合には、検出方法は標的配列にハイブリッド形成さ
れるときのプローブの特異的開裂に基づく。プローブの
非特異的減正はバックグラウンド信号を増加し、プロー
ブが標的を開裂したかどうかが曖昧になる。
ヌクレアーゼは鎖内でヌクレオチド単位を結合させて
いるホスホジエステル結合を加水分解することによっ
て、DNA又はRNA連鎖の減成に触媒作用を及ぼし、その際
分子を小さいフラグメントに開裂する。ハイブリッド形
成プローグとして有用なDNA又はRNA分子の長さは、ヌク
レオチド約15個分から数千個以上まで様々である。治療
剤として有用なDNAフラグメントの長さは、ヌクレオチ
ド約10個分から約75個分まであり、特に15から35個分の
ものが好ましい。このように、プローブ又は治療剤とし
て使用されるDNA又はRNA分子は、ヌクレアーゼによる開
裂が起こるかもしれないいくつかの滞在部分を持ってい
るといえる。
分子生物学の分野では、ヌクレアーゼによる酵素開裂
が通常起こるホスホジエステル結合は、リン酸基を補正
することによって保護できることが一般に知られてい
る。前述の特許３件のような今までの努力は、連鎖内の
全てのリン酸基が修正されている誘導体、又はオリゴヌ
クレオチドの合成後にリン酸基が無作為に大規模に補正
された誘導体に焦点を合わせたものであった〔ツリス
（Tullis,R.H.）:P.C.T.WO83/01451、1983年〕。しか
し、このような修飾はしばしばDNAが標的配列とハイブ
リッド形成することに干渉し、その結果、診断及び治療
アプリケーションのどちらにおいてもその有用性が限ら
れたものになる。更に、リン酸基が大規模に修飾された
DNAフラグメントはRNase Hに対する基質を形成しないこ
とが分かった（第２図）。これでは治療剤としてこれを
使用することが出来ない。
どの理論にも拘束されないことを望みながらこの発明
の基本にした重要な発見は、（１）治療剤として使用さ
れるオリゴヌクレオチドが標的遺伝子の表現をブロック
するメカニズムは、対応するmRNAとハイブリッド形成
し、RNase Hに対する基質を形成し、次にmRNAを開裂す
るというものである；（２）血液内のオリゴヌクレオチ
ドの減成の唯一の経路及び細胞内の減成の優勢経路は、
第２図に示したように鎖の３′−から５′−末端への順
次減成であるということである。このように、DNA分子
の３′−末端から最初のヌクレオチド間結合のみを修飾
することによって、DNAフラグメントの安定性をかなり
高めることが出来ることが証明された。これを行うこと
によって、最初のヌクレオチド単位の開裂がブロックさ
れ、それ以上の減成は起こらない。以下で説明するよう
に、３′−末端ヌクレオチド間結合における様々な置換
がこの目的を果たし、修飾する位置が重要な要素とな
る。第７例で実証されているように、このように修飾さ
れた誘導体は正常のハイブリッド形成特性を持ってお
り、RNase Hによって識別及び開裂されるmRNAと基質を
形成する。従って、このように修飾されたオリゴヌクレ
オチドは診断にも治療にも有用である。
オリゴヌクレオチドはかなりマイナスに荷電した分子
であるが、測定可能速度で細胞内に入る。これは最初ザ
メクニックとスティーブンソン（Zamecnik、Stephenso
n）が実施した試験によって示唆された（米国科学アカ
ゼミーの議事録（1978年）75、280〜284ページ及び285
〜288頁）。この試験では、ラウス肉腫のウイルスの
５′−及び３′−反復シーケンスに相補のオリゴヌクレ
オチドが、ウイルスの複製及びひよこ胎芽線維芽におけ
る細胞ウイルスタンパク質の合成を抑制することが分か
った。これらの試験では、オリゴヌクレオチドの作用メ
カニズムは確立されず、また観察された効果がオリゴヌ
クレオチドの産物の減成によるものである可能性が除外
されていない。それにもかかわらず、この試験やヘイキ
ラ（Hekkila）らが最近行った試験（ネイチャー（1987
年）328、445〜449ページ）では、オリゴヌクレオチド
は細胞内に入ることが示唆された。また、ザメクニック
とスティーブンソンは、３′−OH及び５′−OH基を非極
性置換基、例えばフェルニ基、及びナフチル基で修飾す
ることによって、オリゴヌクレオチドの活性をかなり高
めることができることを示した。これらの大型の非極性
基は細胞膜とオリゴヌクレオチドとの結合力を高め、細
胞への輸送を高める。これらの基を導入すれば、エクソ
ヌクレアーゼによるオリゴヌクレオチドの減成を抑制し
たかもしれない。しかし、ホスホジエステル基を直接修
飾することによってしか、DNA又はRNA連鎖内のヌクレオ
チド間結合の開裂を除外することができない。天然ヌク
レオチドの減成も、修飾した誘導体の減成も、この試験
では研究されていない。オリゴヌクレオチドの減成を研
究した最近の試験でさえも、減成が起こる経路について
は全く触れていない〔ウィックストローム（Wickstrom,
E.（1986年）ジャーナル・オブ・バイオケミカル・アン
ド・バイオフィジカル・メゾッド、13、97〜102ペー
ジ〕。
このように、人間やその他の哺乳類動物の組織内に存
在する内生的ヌクレアーゼによるDNA及びRNAの減成の研
究は過去にもあったが、一本鎖DNA分子の減成が主に
３′−〜５′の外仁メカニズムによって起こることは今
まで認識されていなかった。従って、ここで請求するよ
うな修飾誘導体のユニークな価値については予想できな
かった。減成の経路が確立されなかったため、鎖内の選
択したリン酸塩基のみを修飾して安定性を高め、しかも
その結果のオリゴヌクレオチドがRNase Hによって識別
・開裂される基質を形成するようにmRNAとハイブリッド
形成するというDNA分子設計の基礎が存在しなかった。
以上は治療アプリケーションにおいてオリゴヌクレオチ
ドを使用する上で必要とされていることである。
前述のように、３′−ホスホジエステル結合を正確に
化学的に修飾することは、正確にこの位置で修飾するこ
とほど重要ではない。分子のその他少数の位置も、この
発明の意図から外れることなく修飾できるかもしれな
い。DNA診断の場合、検出出来るようにするために、核
酸プローブに標識を付ける必要がある。これには放射
能、蛍光、電気化学、化学ルミネセント又は酵素マーカ
ーを使用できる。長さがヌクレオチド約15個分から35個
分のオリゴヌクレオチドの場合、分子には僅か１個の標
識が付けられる。プローブとして使用されるより長いDN
A又はRNA分子は、長さがヌクレオチド数千個分となるこ
ともある。このような場合、標識は鎖内のヌクレオチド
15個毎に最高１個の割合で付けることができるであろ
う。
DNA治療におけるアプリケーションでは、安定性を更
に高め又細胞内への輸送を容易にするために、３′−ホ
スホジエステル結合以外の位置でもオリゴヌクレオチド
を修飾することが出来るであろう。血漿中の鉄結合タン
パク質であるトランスフェリン、又は表皮成長ファクタ
といった細胞によって通常取り込まれるキャリア分子を
付けることによって、標的細胞へのオリゴヌクレオチド
の輸送が増大する。又は、所謂免疫毒素の場合のよう
に、標的細胞の表面タンパク質に対する抗体にオリゴヌ
クレオチドを付けることも出来る。或いは、オリゴヌク
レオチドの追加リン酸塩基を修飾して分子の負の荷電を
減らし、それによって細胞膜の脂肪バイレイヤーを通過
する輸送を容易にすることも出来る。このような修飾を
行うと、炭化水素鎖又は芳香基といった非極性置換基も
分子内に組み込まれ、細胞内への取り込みを更に高める
ことが出来る。鎖内の追加リン酸塩基を修飾すると、一
部の細胞内に存在する５′−〜３′−エクソヌクレアー
ゼ及びエンドヌクレアーゼの活性がブロックされてオリ
ゴヌクレオチドの安定性が更に高まるであろう（第４図
参照）。これらの経路による減成は鎖の３′−末端から
の減成よりも遅いが、これらの活性をブロックするとい
う追加効果、特に５′−〜３′−外仁開裂は、多くの場
合利益となるかもしれない。しかし、これら様々はアプ
リケーションでは、修飾を限られた数のホスホジエステ
ル基に限定することが重要である。鎖内にあるホスホジ
エステル結合の殆ど又は全てを修飾した場合、しばしば
オリゴヌクレオチドのハイブリッド形成特性に干渉し、
さらに重要なことには、治療剤としてこのような誘導体
を使用できなくなる。何故ならば、RNase Hによって作
用する標的mRNAと基質を形成しなくなるからである。鎖
の未修飾部分の長さは最低でもヌクレオチド４個分、出
来ればヌクレオチド７個分の長さにすることが好まし
い。このようにすれば、３′−末端ホスホジエステル結
合が修飾されているためにオリゴヌクレオチドは減成せ
ず、また、mRNAとハイブリッド形成して、RNase Hに対
する基質を形成する。そのRNase Hはオリゴヌクレオチ
ドの未修飾部分からmRNAを開裂する。このように、この
ような誘導体は選択した遺伝子の発現をブロックする治
療剤として利用することができる。次に３′−ホスホジ
エステル結合を修飾する方法を説明する。
修飾の一部（moiety）は厳密ではない。次の機能性か
ら選択することができる。
これらの構造ではＲは長さが１個〜20個分の炭素原子
であり、ハロゲン置換基（第５例及び第６例のように）
又はその他のヘテロ原子、例えばＮ、Ｏ又はＳが鎖に付
くことがある。これらの誘導体を調製する方法は、熟練
した技術を持っている人はよく知っている簡単な反応で
ある。例えば以下の文献を参考されたい。これらにはこ
こで説明するタイプの修飾について記載されている：レ
シンガ（Letsinger）ら、ジャーナル・オブ・ジ・アメ
リカン・ケミカル・ソサイエティ、（1982年）、104、6
805〜6806ページ；ステック（Stec）ら、ジャーナル・
オブ・ジ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティ、（19
84年）、106、6077〜6079ページ；ミラー（Miller）
ら、バイオケミストリー（1986年）、25、5092〜5097ペ
ージ;Vフローラー（Froehler）ら、テトラヒドロン・レ
ターズ、（1986年）、27、469〜472ページ。
最も都合のいい修飾はホスホトリエステルである。何
故ならば、合成が簡単で、しかもリン原子に付く機能基
が様々であるからである。この位置に大きい疎水性置換
基を付けると、細胞内摂取を容易にするのに利用できる
であろう。この研究で実証されているように、ホスホト
リエステルはヌクレアーゼによる加水分解にも耐性があ
り、オリゴヌクレオチド鎖内の限られた数の場所に付け
るだけで、分子はmRNAと正常にハイブリッド形成を行
い、mRNAによって開裂される基質を形成する。
現在一般に使用されているどの方法でも、オリゴヌク
レオチドは鎖の３′−〜５′−末端から合成されてい
る。最初の残基は３′−OH基を通じて、孔径がコントロ
ールされたポアガラスのような固体サポートに結合され
る。合成を固体のサポート上でなく溶液中で行うと、最
初の残基の３′−OHは、合成が最高潮に達した時に除去
される保護基によってブロックされる。通常は一度に１
個のヌクレオチド単位を、成長する鎖の５′−OH基に追
加する。或いは、いくつかの残基のブロック１個を１回
の反応で追加することもできる。５′−OH基へのヌクレ
オチド間結合を形成する方法はいくつかある。この手続
きは次の研究論文の中で説明されている「オリゴヌレオ
チドの合成：実際のアプローチ」〔ゲイト（Gait,M.
J.）ら、IRLプレス・オックスフォード（1984年）〕。
これは参考としてここに上げてある。以下の反応図は、
現在好まれている化学作用であるリンアミド酸塩方法を
図示している。
DMTはジメトキシトリチル保護基であり、S.S.は合成
を行う固体サポートである。B1及びB2は核酸の塩基であ
る（Ａ、Ｇ、Ｃ又はＴ）。
この反応の直接の生成物はホスホトリエステルであ
る。合成の終わりには、ホスホジエステル結合を作るた
めに保護基Ｒが除去される。一般に、この目的にはβ−
シアノエチル基が使用される。或いは、Ｒは除去されな
い基とすることも出来る。この場合、最終生成物はホス
ホトリエステルで、基Ｒはリン原子は永久的についたま
まとなる。修飾されたホスホトリエステルが鎖の３′−
末端から最初のヌクレオチド間結合に取り込まれるのは
このようにしてである。本質的に同じ化学作用によっ
て、アルキル又はアリルリン酸塩もこの位置に特異的に
導入される。この場合、基Ｒは酵素を通してでなく直接
リン原子に付けられる。同様に、リン酸水素塩もこの位
置に付けえられるかもしれない。このような誘導体を直
接使用するか又は酸化して、ホスホトリエステル又はリ
ンアミド酸塩を３′−末端ヌクレオチド間結合に組み込
むことが出来る。以下の文献には、リン酸水素塩基の修
飾について記載されている：フローラー（Froehler B.
C）、テトラヘドロン・レターズ、（1986年）、27、557
5〜5578ページ。リンチオン酸塩基又はリンセレン酸塩
基は、リンアミド酸塩の方法で行った酸化をそれぞれ硫
酸又はKSeCNを用いて行うことによって、３′−末端ヌ
クレオチド間結合に組み込むことが出来る。これについ
ては、ステック（Stec）ら、ジャーナル・オブ・ジ・ア
メリカン・ケミカル・ソサイエティ、（1984年）、10
6、6077〜6079ページを参照されたい。合成の終わりに
は全ての保護基を除去するが、そうして出来た最終産物
は直接使用することも、或いは熟練者が良く知っている
クロマトグラフィーによって精製することも出来る。こ
れについては、「オリゴヌクレオチドの合成：実際のア
プローチ」〔ゲイト（Gait,M.J.）ら、IRLプレス、オッ
クスフォード（1984年）〕を参照されたい。ここで説明
した手続きは、一般に長さが最高残基約100個分のオリ
ゴヌクレオチドの合成に応用できる。診断においてハイ
ブリッド形成プローブとして使用するために必要とされ
るような、３′−末端ホスホジエステル基が修飾された
これより長いDNA又はRNA分子を合成するには、化学的方
法と酵素方法の組合せを使用する。このようなシーケン
スの合成を実施するには、化学的方法によって調製した
３′−末端ホスホジエステル結合が修飾された短いオリ
ゴヌクレオチドを、長いDNA又はRNA鎖の３′−OH基の上
に酵素によって結び付ける。
ここで説明した修飾オリゴヌクレオチドの処方及び投
与は医学者ならば誰でも明らかなはずである。例えば、
エイビス（Avis,K）、（1985年）、レミングトンズ・フ
ァーマスーティカル・サイエンス、（編集者Gennaro,A.
R.）、1518〜1541ページ、ペンシルベニア州イースト
ン、マック・パブリッシング・カンパニー（Mack Publi
shing Company）を参照されたい。これは参考のためこ
こに上げてある。このような投与法としては、病気の状
態により局所、経口、非経口などがある。非経口投与の
場合の適切な賦形剤としては、５％デキストロース、通
常の生理食塩水、リンゲル液、及びリンゲル乳酸塩があ
る。材料も過程も無菌状態でなければならず、エンドト
キシンが含まれていてはならない。ある場合には、生成
物を凍結乾燥粉末として保管し、必要時に適当な塩溶液
を追加して元に戻すこともできる。
以下の実施例は、本発明の過程、生成物、及び医学的
方法をさらに説明し、本発明がこの分野のこれまでの方
法の限界を克服したユニークなものであることを示して
いる。
第１例 相補オリゴヌクレオチドによる標的mRNAの翻訳制御がRN
ase HによるmRNAの開裂に依存していることの実証 この実験では５′−GAGCACCATGGTTTC（MA−15）及び
５′−TGTCCAAGTGATTCAGGCCATCGTT（CODMB−25）という
２種類のオリゴヌクレオチドを合成した。どちらもリン
アミド酸塩の方法を用いてベックマン自動DNA合成器で
調製した。MA−15はイニシエーション・コドンをつなぐ
マウスα−グロビンmRNA内のシーケンスと相補である。
CODMB−25はマウスβ−グロビンmRANのコード化領域内
シーケンスとハイブリッド形成をする。マウスのグロビ
ンmRNAは、グーセンズとカン（Goosens、Kan）が説明し
た方法に従って、フェニルヒドラジン処置によって貧血
状態にしたマウスの網状赤血球から単離した〔酵素学に
おける方法、アントニーニ、ロシ−ベルナジ、チアンコ
ン（Antonini,E.、Rossi−Bernadi,L.、及びChiancone,
E.）76、805〜817ページ、1981年〕。in vitroでの翻訳
反応は、ウサギの網状赤血球の溶解物システム内で行っ
た。使用した網状赤血球はプロメガ・バイオテック社
（ProMega Biotec）から購入したもので、RNase Hを含
んでいる。翻訳反応は１μｇの総マウス網状赤血球RNA
でプログラムした。反応は30℃で１時間行わせた。各サ
ンプルには総量25μ中に45μCiの〔35S〕メチオニン
（Amersham社）が含まれていた。タンパク質合成は、10
％のトリクロロ酢酸に沈澱する材料内に〔35S〕メチオ
ニンを含めることによって測定した。オリゴヌクレオチ
ドを含めない対照反応では、βグロビンの合成はタンパ
ク質内に取り込まれた放射能の60％であり、またαグロ
ビンの合成は40％であった。反応はポリrA/オリゴdTは
（500μg/ml）が存在する場合と存在しない場合の両方
で行った。ポリrA/オリゴdTはRNase Hの拮抗抑制因子
で、使用される濃度では酵素の活性をほぼ完全にブロッ
クする。MA−15もCODMB−25も目標mRNAの翻訳を非常に
効果的に抑制した（表１参照）。MA−15はβグロビンmR
NAの対応するシーケンスにある15個の残基の内12個に相
補であり、従って、βグロビンの合成もある程度は抑制
する。ポリrA/オリゴdTはオリゴヌクレオチドの抑制効
果を完全にブロックする。これは翻訳の抑制が完全にRN
ase HによるmRNAの開裂を媒介にしていることを示唆し
ている。
第１表 ハイブリッド抑制翻訳におけるRNase Hの役割 グロビン合成の抑制％ オリゴヌクレオチド −ポリrA/オリゴdT ＋ポリrA/オリゴdT MA−15（8M） 51 ３ CODMB−25（４μＭ） 61 ５ 第２例 メチルリン酸オリゴヌクレオチドはRNase Hに対する基
質を形成しない RNase Hに対する関連する２種類の基質を比較した。
それはポリrA/オリゴdT12〜18とポリrA/オリゴdT18メチ
ルリン酸塩（MP）である。オリゴdT12〜18はファルマシ
ア（Pharmacia PL Biochemicals）社から購入した。鎖
の長さは12〜18個の残基であった。オリゴdT18MPはリン
アミド酸塩方法を用いてベックマン社の自動DNA合成器
で合成した。５′−末端ヌクレオチド間結合は通常のホ
スホジエステルであり、鎖内の残り16個のリン酸塩基は
メチルリン酸塩である。トリチウムで標識したポリrAは
アマーシャム（Amersham）社から購入した。
各反応は、pH8.0の50mMトリス−HCl緩衝液、20mMのKC
l、9mMのMgCl2、1mMの２−メルカプトエタノール、及び
25μｇのウシ血清アルブミン中に、3H−ポリrA/オリゴd
T12〜18又は3H−ポリrA/オリゴdT18MPのいずれかの基質
44ピコモルを含んだ最終量100μで実施した。反応は
2.3ユニットの大腸菌RNase H、ベゼスダ・リサーチ・ラ
ボラトリーズ（Bethesda Research Laboratories）社を
追加することによって開始し、37℃で30分間持続した。
反応後、各サンプルに0.2mlのキャリアDNA液（サケ精製
DNA0.5mg/ml、0.1Mピロリン酸ナトリウム、及び1mMのエ
チレンジアミンテトラ酢酸）プラス0.3mlの10％トリク
ロロ酢酸を加えた。次に20分間試験管を氷の上で培養
し、その後16,000Xgで15分間遠心分離した。RNase Hに
よるポリrA連鎖の開裂によって、トリクロロ酢酸に沈澱
しない小さいフラグメントが生じ、従って上澄み液に残
る。上澄み液を注意深く除去し、液体シンチレーション
・カクテルと混合し、放射能を測定した。ポリrA/オリ
ゴdTとの反応は100％近く進行し、放射能計数の85％が
可溶化された。これとは対象的に、ポリrA/オリゴdT18M
Pは１％未満しか酵素によって消化されなかった。この
ように、オリゴデオキシリボヌクレオチド類似体のリン
酸塩バックボーンの多く又は全てが修飾された場合、こ
れはRNase Hが認識し開裂する相補RNA配列と基質を形成
しない。
第３例 オリゴヌクレオチドは血液内で専ら３′−〜５′−外仁
活性によって減成する この試験の目的は、オリゴヌクレオチドが血液内で減
成する経路を確立することであった。驚いたことに、経
路は一つしかないことが分かった。それはDNA分子の
３′−〜５′−末端からの連続減成であった。
第１例で説明したオルゴヌクレオチドMA−15は、γ32
P−トリリン酸アデノシン（γ32P−ATP、（マーシャム
社）及びT4ポリヌクレオチド・キナーゼ（ベセスダ・リ
サーチ・ラボラトリーズ社）を用いて、分子の５′−末
端部分で32Pの放射能標識を付けた： ここでアスタリスクは放射能標識を表す。それとは別
に、α32P−トリリン酸デオキシシチジン（dCTP）及びD
NAポリメラーゼＩ（ベセスダ・リサーチ・ラボラトリー
ズ）を用いて３′−最高ヌクレオチド間結合に32P−を
導入した放射能標識誘導体も準備した： DNAポリメラーゼＩが触媒となる反応は、５′−GAGCA
CCATGGTTTとdCTPの間で起こり、鋳型として相補DNA連鎖
を必要とする。標識した誘導体が一本鎖であることを確
実にするため、反応後に標識しないMA−15を50倍も余分
に追加した。これらの手続きはDNAフラグメントの放射
能標識方法として標準的である。例えば、ここに例とし
て上げてあるマニアティス、フリッチュ、及びサンブル
ック（Maniatis,T.、Fritsch,E.F.、及びSambrook,J.）
の分子クローニング：実験室手引、ニューヨーク、ゴー
ルド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー、114〜115
ページ及び122〜126ページ、1982年を参照されたい。
ヘパリンを加えて抗凝固処理をした48μの新鮮なヒ
ト血液に、放射能標識をしたオリゴヌクレオチド（５×
105カウント／分）プラス2.5ナノモルの標識しないMA−
15を追加した。サンプルを体温と同じ37℃で培養した。
６μのアリコットを15分後、30分後、１時間後、及び
２時間後に取り出し、各アリコットの一部をポリアクリ
ルアミドゲル上に乗せて、電気泳動でサイズを基準に生
成物を分離した。放射能標識した生成物が見えるように
するために、ゲルを一晩Ｘ線フィルムに露出した。放射
能写真の図は第３に示してある。
分子の５′−末端が標識されたオリゴヌクレオチド
（レーン１〜５）が減成すると、サイズが段々小さくな
る別々の生成物が生じる。これは鎖の３′−から５′−
末端にかけての連鎖が順次外仁開裂することを示唆して
いる。開裂が連鎖の中程で起こった場合、反応時間全体
を通じて中くらいの長さの生成物が生じるであろう。MA
−15の分子の３′−末端で標識した場合、その結果の放
射能写真（レーン６〜10）では、時間がたつに従って完
全な長さの15−merが消滅し、それに対応してモノヌク
レオチドpCが増加した。この結果は、同様に、３′−〜
５′−外仁活性を実証してもいる。中間サイズの生成物
がないことは、５′−〜３′−外仁活性、又は外仁（内
部）開裂活性が存在しないことを示している。
ここで説明したのと同じ方法によって、その他の哺乳
類種の血液、特にマウス、ウサギ、及びラットの血液で
もオリゴヌクレオチドは鎖の３′−末端からのモノヌク
レオチドの順次裂開のみによって減成することが分かっ
た。
第４例 人間の細胞におけるオリゴヌクレオチド減成の主要経路
は、鎖の３′−〜５′−末端からの連鎖の順次外仁開裂
によるものである。
この試験の目的は、オリゴヌクレオチドが人間の細胞
中に存在するヌクレアーゼによって減少する経路を知る
ことであった。第３例ではMA−15の放射能標識誘導体を
準備した。オリゴヌクレオチドの減成は、人間の赤白血
病細胞ラインK562から調製した抽出物で調べた。K562細
胞ラインは、２人のロッチオ（Lozzio,C.B.、及びLozzi
o,B.B.、血液（1975年）45、321〜334ページ）が初めて
単離し、赤血球分化のモデルとして徹底的に研究した。
細胞を10mMのトリスバッファ（pH7.4）、並びに5mM MgC
l2、1mM CaCl2、100mM NaCl、及び0.1％トリトンＸ−10
0の中に懸濁し、モーター駆動の低温テフロン乳棒ホモ
ジェナイザーで30秒間均質化した。細胞膜及び細胞小器
官は、さらにバイオソニック超音波処理装置をフルパワ
ーで使用して15秒間のバースト５回による超音波処理を
行いさらに分裂させた。残った細胞破片は５分間12,000
Xgの遠心分離を行って除去した。
放射能標識したオリゴヌクレオチドは、第３例で説明
したのと同じ条件でK562細胞抽出物内で培養し、減成生
成物がポリアクリルアミドゲルの電気泳動で分析した。
オリゴヌクレオチドの減成は血液内よりもかなり速かっ
た。減成の主要経路は、やはり３′−〜５′−外仁活性
であった。３′−末端ヌクレオチド間結合の裂開の半減
期は２分であった。それより遅い５′−〜３′−外仁活
性も観察された。このメカニズムによる鎖からの５′−
末端ヌクレオチド単位の裂開の半減期は20分であった。
前述と同じ方法を用いて、その他の哺乳類細胞から調
製した抽出物内でもオリゴヌクレオチドの減成経路を調
べた。それにはアフリカミドリザルの腎臓細胞（COS細
胞）やマウスの肝臓細胞がある。その結果、外仁活性
（連鎖の中程での裂開）や５′−〜３′−エクソヌクレ
アーゼも低レベルではあるが存在することがわかった
が、これらの細胞においてもオリゴヌクレオチドの減成
の主要経路は３′−〜５′−エクソヌクレアーゼによる
ものであった。
第５例 ３′−末端ヌクレオチド間結合部分を修飾したオリゴヌ
クレオチドは、人間の血液内での減成を完全にブロック
する 分子の３′−末端から最初のヌクレオチド間結合を2,
2,2−トリクロロ−1,1−ジメチルエチルホスホトリエス
テルとして修飾したオリゴヌクレオチドMA−15の誘導体
を調製した。ホスホトリエステルは対応する二塩化リン
を用いて鎖内に導入した： 1ccの10％ピリジン−アセトニトリル液に溶解した20
マイクロモルの５′−デオキシチミジンを19マイクロモ
ルの二塩化リンに追加した。反応は室温で５分間行わせ
た。その結果の一塩化物を、孔の口径をコントロールし
てあるポアガラスビーズ（American Bionetics社）に付
けた１マイクロモルのデオキシシチジンに追加した。ジ
ヌクレオチドホスホトリエステルを産出するための結合
反応は、室温で15分間行わせた。余分な試薬及び反応の
副生成物は、無水アセトニトリルで洗い流した。DNA連
鎖の残った部分は、ベックマン自動DNA合成器を用いて
βシアノエチルホスホアミド法によって合成した。３′
−末端ヌクレオチド間結合のみを修飾した。鎖の中の残
った13個のリン酸基は正常のホスホジエステルである。
修飾オリゴヌクレオチドは、第３例で説明したよう
に、γ32P−ATP及びT4ポリヌクレオチドキナーゼを用い
て５′−末端OH基を32Pで標識した。放射能標識したオ
リゴヌクレオチドを37℃のヒト血液内で培養した。アリ
コットを様々な時間に取り出して、ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動によって分析した。ゲルの放射能写真の図
を第４図に示した。18時間中にオリゴヌクレオチドの減
成は全く起こらなかった。完全な長さの分子による帯強
度の逓減は、血液内に存在するホスファターゼによって
オリゴヌクレオチドから32P標識が除去されたためであ
り、連鎖が開裂したためではない。
修飾オリゴヌクレオチドをマウスの血液で培養する同
様の試験も行った。ここでもオリゴヌクレオチドの減成
は観察されなかった。
第６例 ３′−末端ヌクレオチド間結合を修飾したオリゴヌクレ
オチドは、ヒト細胞に存在するヌクレアーゼによる減成
を顕著に抑制する。
この試験でも、第５例で説明したのと同じMA−15の誘
導体、即ち３′−末端ヌクレオチド間結合を2,2,2−ト
リクロロ−1,1−ジメチルエチルホスホトリエステルと
して修飾した誘導体を使用した。K652細胞からの抽出物
は、第４例と同じように調製した。修飾オリゴヌクレオ
チドを37℃において細胞抽出物内で培養した。アリコッ
トを様々な時間に取り出し、減成生成物をポリアクリル
アミドゲル電気泳動によって分析した。
細胞抽出物内に存在する速い３′−〜５′−エクソヌ
クレアーゼによるこの修飾オリゴヌクレオチドの減成
は、完全にブロックされた。また、天然オリゴヌクレオ
チドと比較して、修飾した誘導体は安全性が顕著に高く
なっていた。半減期は10倍であった。減成はK562細胞抽
出物内に存在する遅い５′−〜３′−外仁活性によって
起った（第４例を参照）。鎖からの５′−末端ヌクレオ
チドの開裂の半減期は、約20分間であった。
COS細胞（アフリカミドリザルの腎臓）及びマウスの
肝臓細胞から調製した抽出物でも、同様に修飾オリゴヌ
クレオチドを培養した。どちらの場合も、３′−末端ヌ
クレオチド間結合を修飾した誘導体の半減期は、未修飾
オリゴヌクレオチドと比較して10倍から15倍であった。
第７例 ３′−末端ヌクレオチド間結合を修飾しオリゴヌクレオ
チドはRNase Hによって開裂されるmRNAと基質を形成す
る マウスのグロビンmRNAは、第１例で説明したように、
フェニルヒドラジンで処置した貧血のマウスから単離し
た。この試験では、MA−15、第５例及び第６例で使用し
たMA−15の誘導体、即ち３′−末端ヌクレオチド間結合
がトリクロロジメチルエチルホスホトリエステルとして
修飾された誘導体（MA−15−TCDM）、及び５′−末端OH
基をさらにナフチルイソシアン酸塩で修飾した誘導体
（NPH−MA−15−TCDM）という３種類のオリゴヌクレオ
チドを比較した。マウスのグロビンmRNA（２マイクログ
ラム）を1.1ナノモルのオリゴヌクレオチドに追加し、1
0mMのトリス−HClバッファ（pH7.5）、5mM MgCl2、25mM
NaCl、及び1mMジチオスレイトールを含めて最終溶液が
22マイクロリットルになるようにした。反応は大腸菌RN
ase Hを２単位追加することによって開始し、37℃で30
分間行った。反応はフェノールとクロロホルムの1:1混
合物によってサンプルを抽出して終了させた。RNase H
による消化後に残ったmRNA種は、エタノールによって沈
澱させて単離し、Northernブロックで分析した。
RNAサンプルを、10mMのリン酸ナトリウム・バッファ
（pH6.5）とジメチルスルフォキシドとの1:1（体積：体
積）混合物内で1Mのグリオキサルによって50℃で１時間
反応させ、次に1.5％アガロースゲルで電気泳動した。R
NAはメーカーが説明している方法に従った毛管吸収によ
って、ゲルから遺伝子スクリーンプラスフィルタ（DuPo
nt−NEW社）に移動した。１％硫酸ドデシルナトリウ
ム、1M NaCl、10％硫酸デキストラン、50mMリン酸ナト
リウム（pH6.5）の中で35℃で２時間、フィルターへの
予備ハイブリッド形成を行った。ハイブリッド形成は、
200μg/ml変性サケ精液DNAプラス５′−末端を32Pで放
射能標識した２×106カウント／分のMA−15を含む予備
ハイブリッド形成したバッファ5ml内で、35℃で24時間
行った。ハイブリッド形成後、次の順番でフィルターを
洗った:2×SSC（0.15M NaCl0.015Mクエン酸ナトリウ
ム）、室温で５分間を１回、２×SSCプラス１％ドデシ
ル硫酸ナトリウム、35℃で30分間を２回、0.1×SSC、室
温で５分間を１回。フィルターをブロットして乾燥さ
せ、放射能写真を撮るためにコダックXAR−５フィルム
に露出した。放射能写真の図は第５図に示した。
プローブとして放射能標識したMA−15を用いたとこ
ろ、NorthernブロットにαグロビンmRNAによる一本の帯
が検出された。オリゴヌクレオチドが存在しない場合、
RNase Hの培養中にmRNAの開裂は起こらなかった（レー
ン２）。MA−15が存在する場合の反応に関しては（レー
ン３）、プローブとのハイブリッド形成部分のRNase H
によるmRNAの開裂のために、αグロビンmRNAの帯の強度
が顕著に低下するのが観察される。修飾したオリゴヌク
レオチドの各々との反応についても（レーン４及び５）
αグロビンmRNA強度の同じような低下が観察された。こ
れは、これらもmRNAとハイブリッド形成し、RNase Hに
よって識別・開裂される基質を形成することを示唆して
いる。
第８例 ３′−末端ヌクレオチド間結合が修飾された相補オリゴ
ヌクレオチドによるネズミのプラズマ細胞腫細胞ライン
MOPC315のＣ−MYC腫瘍遺伝子発現の抑制 ｃ−mycはin vivo培養と細胞内培養の両方において多
くのヒト及び動物腫瘍細胞によって異常発現される細胞
腫瘍遺伝子である。ネズミのプラズマ細胞腫瘍細胞ライ
ンMOPC315の場合、ｃ−myc遺伝子は染色体15上の正常位
置から染色体12上の免疫グロブリン座に移動しており、
異常に高いレベルで発現される。
アミノ酸残基191〜198をコード化するｃ−mycm RNAの
シーケンスと相補である２種類のオリゴヌクレオチド類
似体を合成した： ここで（＾）はトリクロロジメチルエチルホスホトリ
エステルを表し、（PN）は＝ TCDMホスホトリエステルは例５で説明した手続きによ
って鎖内に組み込んだ。未修飾ホスホジエステル基を含
むシーケンスの残りの部分は、ホスホアミド法で合成し
た。５′−末端基（PN）はアプライド・バイオシステム
ズ（Applied Biosystems）社の試薬Aminolinkを用いて
メーカーが説明した手続きに従って導入した。比較のた
めに、同じ塩基シーケンスを持つ未修飾オリゴヌクレオ
チド、及びヒトアルブミンmRNAの相補であるオリゴヌク
レオチドも調製した： ここで（＾）はやはりTCDM基を表す。
MOPC315細胞は、10％胎児ウシ血清を含むRPMI1640培
養基内で７％CO2状態37℃で維持した。対数期のMOPC315
細胞を遠心分離（250×ｇ、19分間、23℃）によって収
穫し、密度５×106/mlのHB101無血清培養基（DuPont
社）に再度懸濁させた。この細胞懸濁液の1mlのアリコ
ットをオリゴヌクレオチドなしで付随して培養した。次
に各グループの細胞を遠心分離によって収集した。総細
胞RNAは、チャーグイン〔Chirgwinら、バイオケミスト
リー18、5294〜5299ページ（1979年〕が説明したとおり
に調製し、第７例で説明したようにNorthernブロットに
よって分析した。フィルターは前述の例と同様、ポリヌ
クレオチドキナーゼとγ32P−ATPを用いて32Pで標識し
たｃ−myc mRNAに相補のオリゴヌクレオチドによって厳
密に調べた。
３′−末端ヌクレオチド間結合をTCDM基で修正したど
ちらの抗ｃ−mycオリゴヌクレオチドも、濃度１マイク
ロモルにおいて、ｃ−myc mRNAレベルが75％低下した。
一方、オリゴヌクレオチドなしで培養したMOPC315細胞
では、mRNAレベルは一定であった。ｃ−myc及び抗アル
ブミンオリゴヌクレオチドに対する未修飾オリゴヌクレ
オチドは、１又は５マイクロモルの濃度では、ｃ−myc
mRNAレベルに影響がなかった。この結果は別のリンパ細
胞ラインの最近の研究結果とも一致している。この研究
では、ｃ−myc遺伝子の発現は、未修飾抗ｃ−mycオリゴ
ヌクレオチドの濃度が15マイクロモル以下では抑制され
ないことが分かった〔ヘイキラ（Heiikkila）ら、（198
7年）、ネーチャー328、445〜449ページ〕。ここで説明
した修正誘導体は、対応する未修飾オリゴヌクレオチド
と比べて、無傷の細胞内での標的遺伝子の発現抑制にお
いて、20倍から50倍も効果的である。
以上をまとめると、ここで示した結果は、３′−末端
ホスホジエステル結合が修飾されたオリゴヌクレオチド
は、細胞及び体液内でのヌクレアーゼ消化に対し耐性が
あり、相補核酸シーケンスとの正常なハイブリッド形成
特性を維持し、特別に目標を付けたmRNA種とハイブリッ
ド形成すると酵素RNase Hが識別・開裂する基質を形成
するため、オリゴヌクレオチドは様ざまな治療アプリケ
ーションで望まれている対応する遺伝子発現にブロック
に使用することが出来ることを示している。
本発明の目的や精神から外れることなくオリゴヌクレ
オチドのその他の修飾を作ることが出来るかもしれな
い。重要なことは、３′−末端ホスホジエステル結合を
修飾するだけでオリゴヌクレオチドの減成に対する耐性
が顕著に増加し、又そのような誘導体はRNase Hによっ
て識別・開裂されるRNAと基質を形成できるという発見
である。オリゴヌクレオチドの減成に対する安定性を高
めたり、細胞内輸送を容易にしたり、又は診断における
ハイブリッド形成プローブとしてオリゴヌクレオチドを
使用するために放射能、経口、又は酵素マーカーといっ
た標識を付けるために、置換基を追加してもよい。その
ような修飾は限られた数の分子位置に制限することが重
要である。鎖にあるリン酸基の殆ど又は全部を修飾する
と、オリゴヌクレオチドのハイブリッド形成特性に悪影
響があるかもしれず、RNase Hによって作用するmRNAと
基質を形成しない。後者の事実は、修飾しすぎたオリゴ
ヌクレオチド類似体が標的遺伝子の表現をブロックする
ための治療剤として利用できないことを意味する。
従って、本発明は少なくとも上で述べた目的の全てを
達成しうると考えることができる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 エダー，ポール エス アメリカ合衆国 アイオワ州 52240 アイオワシティ オーククレスト 945 ナンバー４エイ (72)発明者 デイグル，ジョン エム アメリカ合衆国 アイオワ州 52240 アイオワシティ キャリッジヒル 710 ナンバー２ (56)参考文献 Ｐｒｏｃ．Ｎｕｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ，84（1987）ｐ．7706−7710 Ｐｒｏｃ．Ｎｕｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ，78（1981）ｐ．7350−7354 Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ｅａｒｃｈ，15（1987）ｐ．5749−5763 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/00 C12Q 1/68

Claims (29)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】ヌクレオチド配列に対して相補性を有し且
    つ標的遺伝子から転写されるmRNA内においてヌクレオチ
    ド配列にハイブリッドされる分子配列を有するオリゴデ
    オキシヌクレオチドであって、 （ａ） ３′→５′エキソヌクレアーゼに対して抵抗性
    がある修飾３′−末端インターヌクレオチドホスホジエ
    ステル結合と、 （ｂ） ヌクレアーゼ分解に対して抵抗性がある１個以
    上の附加的修飾インターヌクレオチドホスホジエステル
    結合と、 （ｃ） 未修飾のインターヌクレオチドホスホジエステ
    ル結合を少なくとも４個有する連続配列とを有するオリ
    ゴデオキシヌクレオチド。
  2. 【請求項２】前記オリゴデオキシヌクレオチドが、長さ
    内に約10乃至約75個のヌクレオチドを有する請求項１に
    記載のオリゴデオキシヌクレオチド。
  3. 【請求項３】前記オリゴデオキシヌクレオチドが、細胞
    によって吸収され得る担体分子に結合している請求項１
    に記載のオリゴデオキシヌクレオチド。
  4. 【請求項４】附加的修飾インターヌクレオチドホスホジ
    エステル結合が、５′−末端インターヌクレオチドホス
    ホジエステル結合である請求項１に記載のオリゴデオキ
    シヌクレオチド。
  5. 【請求項５】未修飾のインターヌクレオチドホスホジエ
    ステル結合の連続配列が、約４乃至約７個のインターヌ
    クレオチドホスホジエステル結合である請求項１に記載
    のオリゴデオキシヌクレオチド。
  6. 【請求項６】未修飾のインターヌクレオチドホスホジエ
    ステル結合の連続配列が、約７個のホスホジエステル結
    合である請求項１に記載のオリゴデオキシヌクレオチ
    ド。
  7. 【請求項７】連続配列の外側の全てのホスホジエステル
    結合が、修飾されている請求項１に記載のオリゴデオキ
    シヌクレオチド。
  8. 【請求項８】修飾３′−末端インターヌクレオチドホス
    ホジエステル結合が、ホスホトリエステル結合、ホスホ
    ネート結合、ホスホルアミデート結合、ホスホロチオエ
    ート結合、或いはホスホセレネート結合である請求項１
    に記載のオリゴデオキシヌクレオチド。
  9. 【請求項９】５′−末端インターヌクレオチドホスホジ
    エステル結合が、ホスホトリエステル結合、ホスホネー
    ト結合、ホスホルアミデート結合、ホスホロチオエート
    結合、或いはホスホセレネート結合である請求項４に記
    載のオリゴデオキシヌクレオチド。
  10. 【請求項１０】３′−末端インターヌクレオチド位置と
    ５′−末端インターヌクレオチド位置にホスホトリエス
    テル結合を有する請求項１に記載のオリゴデオキシヌク
    レオチド。
  11. 【請求項１１】３′−末端インターヌクレオチド位置と
    ５′−末端インターヌクレオチド位置にホスホラミデー
    ト結合を有する請求項１に記載のオリゴデオキシヌクレ
    オチド。
  12. 【請求項１２】標的遺伝子を発現する真核細胞内の標的
    遺伝子の発現をブロックする方法であって；標的遺伝子
    の発現をブロックするのに十分な量のオリゴデオキシヌ
    クレオチドが細胞内に入るようなインビトロ条件下で、
    該細胞を請求項１〜11のオリゴデオキシヌクレオチドと
    接触させることを含む標的遺伝子を発現する真核細胞内
    の標的遺伝子の発現をブロックする方法。
  13. 【請求項１３】標的遺伝子の発現をブロックする方法
    が、産業或いは農業的方法を改良する請求項12の方法。
  14. 【請求項１４】インビトロ条件が、細胞培養条件である
    請求項12の方法。
  15. 【請求項１５】ヌクレオチド配列に対して相補性を有し
    且つ標的遺伝子から転写されるmRNA内でヌクレオチド配
    列にハイブリッドされる分子配列を有するオリゴデオキ
    シヌクレオチドであって、 （ａ） 相補性を有しているRNA分子にハイブリッドさ
    れた場合、RNase H活性を有する酵素によって切断され
    る基質を形成する少なくとも５個のヌクレオチド残部の
    第１連続ストレッチと、 （ｂ） 第１連続ストレッチに対してヌクレオチド残部
    ３′の第２連続ストレッチであって、（１）３′→５′
    エキソヌクレアーゼ分解に対して抵抗性がある３′−末
    端インターヌクレオチド結合を有し、そして（２）相補
    性を有しているRNA分子にハイブリッドされた場合、RNa
    se Hによって切断される基質を形成しない第２連続スト
    レッチと、 （ｃ） 第１連続ストレッチに対してヌクレオチド残部
    ５′の第３連続ストレッチであって、ヌクレアーゼ分解
    に対して抵抗性がある１個以上のインターヌクレオチド
    結合を有している第３連続ストレッチとを有するオリゴ
    デオキシヌクレオチド。
  16. 【請求項１６】第３連続ストレッチが、相補性を有する
    RNA分子にハイブリッドされた場合、RNase Hで切断され
    る基質を形成しない請求項15のヌクレオチド。
  17. 【請求項１７】前記オリゴヌクレオチドが、長さ内に約
    10乃至約75個のヌクレオチドを有している請求項15のヌ
    クレオチド。
  18. 【請求項１８】前記オリゴデオキシヌクレオチドが、細
    胞によって吸収され得る担体分子に結合している請求項
    15に記載のオリゴデオキシヌクレオチド。
  19. 【請求項１９】５′−末端インターヌクレオチド結合
    が、ヌクレアーゼ分解に対して抵抗性がある請求項15に
    記載のオリゴデオキシヌクレオチド。
  20. 【請求項２０】第１連続ストレッチが、約４乃至約７個
    のインターヌクレオチドホスホジエステル結合を有する
    請求項15に記載のオリゴデオキシヌクレオチド。
  21. 【請求項２１】第１連続ストレッチが、約７個のインタ
    ーヌクレオチドホスホジエステル結合を有している請求
    項15に記載のオリゴデオキシヌクレオチド。
  22. 【請求項２２】第２及び第３連続ストレッチの全てのイ
    ンターヌクレオチド結合が、ヌクレアーゼ抵抗性を有す
    る請求項15に記載のオリゴデオキシヌクレオチド。
  23. 【請求項２３】３′−末端インターヌクレオチド結合
    が、ホスホトリエステル結合、ホスホネート結合、ホス
    ホルアミデート結合、ホスホロチオエート結合、或いは
    ホスホロセレネート結合である請求項15のオリゴヌクレ
    オチド。
  24. 【請求項２４】５′−末端インターヌクレオチド結合
    が、ホスホトリエステル結合、ホスホネート結合、ホス
    ホルアミデート結合、ホスホロチオエート結合、或いは
    ホスホロセレネート結合である請求項19のオリゴヌクレ
    オチド。
  25. 【請求項２５】３′−末端インターヌクレオチド位置及
    び５′−インターヌクレオチド位置にホスホトリエステ
    ル結合を有している請求項15のオリゴヌクレオチド。
  26. 【請求項２６】３′−末端インターヌクレオチド位置及
    び５′−末端インターヌクレオチド位置にホスホトリエ
    ステル結合を有している請求項15のオリゴヌクレオチ
    ド。
  27. 【請求項２７】標的遺伝子を発現する真核細胞中の標的
    遺伝子の発現をブロックする方法であって、標的遺伝子
    の発現をブロックするのに十分な量のオリゴヌクレオチ
    ドが該細胞中に入るようなインビトロ条件下で、該細胞
    を請求項１乃至25項のオリゴヌクレオチドと接触させる
    ことを含む標的遺伝子を発現する真核細胞中の標的遺伝
    子の発現をブロックする方法。
  28. 【請求項２８】標的遺伝子の発現をブロックする方法
    が、産業或いは農業的方法を改良する請求項27の方法。
  29. 【請求項２９】インビトロ条件が、細胞培養条件である
    請求項27の方法。
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