KR100257972B1

KR100257972B1 - 높은 키랄 순도의 포스포로티오에이트 결합기를 가지는 올리고뉴클레오티드

Info

Publication number: KR100257972B1
Application number: KR1019970709017A
Authority: KR
Inventors: 필립 댄 쿡; 글렌 호크
Original assignee: 파샬 비. 린네; 아이시스 파마수티컬즈 인코포레이티드
Priority date: 1995-06-06
Filing date: 1996-06-05
Publication date: 2000-08-01
Also published as: KR19990022536A

Abstract

본 발명의 서열-특이적 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드는 실질적으로 모두 Sp 이거나 실질적으로 모두 Rp인 포스포로티오에이트 당간 결합기 중의 하나에 의하여 연결된 뉴클레오시드 단위로 이루어진다. 실질적으로 순수한 키랄성 당간 결합기를 가지는 그러한 서열-특이적 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드는 효소적 또는 화학적 합성에 의하여 제조될 수 있다.

Description

[발명의 명칭]

높은 키랄 순도의 포스포로티오에이트 결합기를 가지는 올리고뉴클레오티드

[관련된 출원에 관한 참조사항]

본 출원은 1991. 10. 16자 출원된(현재 포기됨) 미국 특허출원 제07/777,007호의 계속출원인 1994. 8. 29자 출원된 미국특허출원 제08/297,703호의 일부 계속 출원이다. 본 출원은 또한 미국 특허출원 제07/777,007호의 일부 계속 출원인 1991, 10, 15자 출원된 미국 특허출원 제07/777,670호의 분할 출원인 1993. 5. 5자 미국 특허출원 제08/058,023호의 일부 계속 출원이다. 상기 언급된 출원은 각각 본 출원과 함꼐 양도되었으며 각각의 개시된 전체 내용은 본 명세서에 참고로 언급되어 있다.

[발명의 분야]

본 발명은 당간 결합기에 의하여 결합된 뉴클레오시드로 이루어진 서열-특이적 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드 및 그 제조방법과 용도에 관한 것이다. 보다 구체적으로 본 발명의 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오시드를 연결하는 당간 결합기는 실질적으로 순수하게 모두 Sp 또는 Rp인 키랄 포스포로티오에이트 결합기인 포스포로티오에이트 결합기이다. 그러한 올리고뉴클레오티드는 화학적 또는 효소적 합성에 의하여 제조된다. 그것들은 특히 진단, 치료 및 연구시약으로서 적합하다.

[발명의 배경]

올리고뉴클레오티드는 단일-가닥 RNA 또는 단일-가닥 DNA에 혼성화하는 것으로 알려져 있다. 혼성화는 표적 RNA 또는 DNA의 염기와 올리고뉴클레오티드의 염기의 서열-특이적 염기쌍 수소 결합이다. 그러한 염기쌍은 서로에 대하여 상보적이라 한다.

상보적 핵산에 대한 올리고뉴클레오티드의 혼성과 정도를 결정함에 있어서 상보적 핵산에 결합하는 올리고뉴클레오티드의 상대적 성능은 특정 혼성화 복합체의 용융 온도를 결정함으로써 비교되어질 수 있다. 용융 온도(T_m), 이중 나선의 특징적 물리적 성질은 50%의 나선(혼성화된) 대 코일(혼성화되지 않은) 형태가 나타나는 온도를 나타낸다. T_m은 혼성화 복합체의 형성 및 붕괴(용융)를 결정하는 UV 스펙트럼을 사용함으로써 측정된다. 혼성화시 발생되는 염기 중첩은 UV 흡광도의 감소(hypochromicity)와 동시에 일어난다. 결국 UV 흡광도의 감소는 더 높은 T_m을 나타낸다. T_m이 더 높을수록 가닥사이의 결합강도는 더 커진다.

올리고뉴클레오티드는 세포내 효소 RNase H를 사용함으로써 표적 RNA의 효소적 분해를 효과적이게 하는 데 사용될 수 있다. 그러한 RNase H 분해 메카니즘은 2'-디옥시리보푸란노실 올리고뉴클레오티드가 표적 RAN에 혼성화하는 것을 필요로 한다. 그 결과 형성된 DNA-RNA 이중구조는 RNase H 효소를 활성화시키고 활성화된 효소는 RNA 가닥을 분해시킨다. RNA 가닥의 분해는 표적 RNA의 정상적인 기능을 파괴시킨다. 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드는 이런 형태의 메카니즘에 의하여 작동한다. 그러나 RNase H의 세포 활성화에 유용한 DNA 올리고뉴클레오티드에 대하여, 그 올리고뉴클레오티는 RNase H 활성화에 충분한 시간동안 세포에서 살아남기 위하여 뉴클레아제에 상당히 안정적임에 틀림없다. 연구시약으로서 올리고뉴클레오티드의 용도와 같은 비-세포적 용도에 대해서 그러한 뉴클레아제 안정성은 꼭 필요한 것은 아니다. Walder et al.의 몇몇 간행물들은 RNase H 및 올리고뉴클레오티드의 상호 작용에 대하여 기재하고 있다. 그것들 중 특히 관심을 모으는 것은 (1) Dagle et al., Nucleic Acids Research 1990, 18, 4751; (2) Dagle et al., Antisense Research And Development 1991, 1, 11; (3) Eder et al., J. Biol, Chem. 1991, 266, 6472; 및 (4) Dagle et al., Nucleic Acids Research 1991, 19, 1805가 있다. 이들 간행물에 따르면 수식되지 아니한 포스포디에스테르 뉴클레오시드간 결합기 및 수식된 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 결합기를 모두 가지는 DNA 올리고뉴클레오티드는 세포내 RNase H에 대한 기질이 된다. 그것들은 기질이기 때문에 RNase H에 의한 표적 RNA의 분해를 활성화시킨다. 그러나 저자들은 포스포디에스테르 결합기와 포스포로티오에이트 결합기 모두가 Xenopus 배(embryos)에서 엑소뉴클레아제 분열에 민감하다는 사실을 더 주지시키고 있다. 그러한 뉴클레아제 분열은 RNase H 활성에 사용될 수 있는 올리고뉴클레오티드를 빠르게 고갈시키기 때문에 유해하다.

상기 참고자료 (1), (2) 및 (4)에 기재된 바와 같이, 뉴클레아제 분열에 대항하는 올리고뉴클레오티드를 안정화시키는 반면에 RNase H 활성화를 제공하기 위하여 포스포르아미데이트, 알킬 포스포네이트 또는 포스포트리에스테르 부분사이에 위치한 짧은 부분의 포스포디에스테르 연결된 뉴클레오티드를 포함하는 2'-디옥시 올리고뉴클레오티드가 제조되었다. 포스포르아미데이트-함유 올리고뉴클레오티드가 엑소뉴클레아제에 대하여 안정된 반면에 각각의 포스포르아미데이트 결합기는 포스포르아미데이트 함유 올리고뉴클레오티드의 측정된 T_m수치에서 1.6℃의 손실이 있었다고 상기 참고자료(4)에 기재되어 있다. 그러한 T_m수치의 감소는 올리고뉴클레오티드 및 그것의 표적 핵산 가닥사이에 혼성화의 감소를 나타낸다.

진단, 연구시약 및 치료제로서의 올리고뉴클레오티드의 적용은 올리고뉴클레오티드가 세포막을 통하여 수송되거나 세포에 의하여 포작되어 표적 RNA 또는 DNA에 적당히 혼성화된 후 핵산 기능을 종료시키거나 파괴시키는 것이 필요하다. 이러한 결정적 기능은 부분적으로 뉴클레아제 분열에 대한 올리고뉴클레오티드의 초기 안정성에 부분적으로 의존한다. 더욱이 이들 기능들은 표적 RNA 또는 DNA 분자에 대한 올리고뉴클레오티드의 특이성에 의존한다.

이들 목적에 대한 올리고뉴클레오티드의 심각한 결핍성은 세포내에 그리고 세포외에 위치할 수 있는 다양하게 산재하여 있는 뉴클레아제에 의한 효소적 분해에 대한 민감성이다. 수식되지 아니한 야생형(wild type) 올리고뉴클레오티드는 뉴클레아제에 의해 쉽게 분해되기 때문에 치료제로서 유용하지 못하다. 그러므로 그것들에 뉴클레아제 내성을 부여하기 위한 올리고뉴클레오티드의 수식은 올리고뉴클레오티드 치료 및 진단의 개발 지향적인 연구중에서 1차적인 관심사가 되어 왔다.

뉴클레아제 내성을 향상시키기 위한 올리고뉴클레오티드의 수식은 일반적으로 당-인산 골격 특히 인산 원자에서 일어난다. 포스포로티오에이트는 뉴클레아제에 대한 내성을 나타낸다고 알려져 있다. 또한 포스포로티오에이트 뉴클레아제에 대한 내성을 나타낸다고 알려져 있다. 또한 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드는 일반적으로 천연의 포스포디에스테르 올리고뉴클레오티드보다 화학적으로 더 안정하다. 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드는 또한 수용성 매질(media)에서 용해성을 나타낸다. 더욱이 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드-RNA 헤테로듀콜렉스는 내인성 RNase H에 대한 기질로서 제공될 수 있다. 또한 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드는 높은 열역학적 안정성을 나타낸다. 그러나 높은 충실도로 표적 RNA 또는 DNA에 결합하는 올리고뉴클레오티드의 성능이 표적 RNA 또는 DNA에 결합하는 올리고뉴클레오티드의 성능이 표적 RNA 또는 DNA에 때한 혼성화에 중요하기는 하지만 올리고뉴클레오티드의 인 원자에서의 수식은 다양한 정도의 뉴클레아제 내성을 나타내는 반면 일반적으로 더 열등한 혼성화 특성을 나타내게 된다. [Cohen, J.S., Ed., oligonucleotides: Antisense Inhiditors of Gene Expression CRC Press, Inc., Boca Raton, FL, 1989].

이 열등한 혼성화의 한가지 이유는 인 원자의 친키랄(prochiral) 성질이 될 수 있다. 수식된 인 올리고뉴클레오티드의 내부 인 원자에서 수식이 일어나면 Rp 및 Sp 광학이성질체가 되게 된다.

결과적으로 분자가 비대칭적인 치환체를 가지는 상기에서와 같이 얻어진 수식된 인 올리고뉴클레오티드는 2ⁿ의 이성체를 가지는 라세미 혼합물이 될 수 있고 n은 올리고뉴클레오트드내의 포스포로티오에이트 당간 결합기 수와 동일하다. 이와 같이 14 비대칭 중심(center)을 가지는 15-mer 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드는 2¹⁴즉 16,384의 디아스테레오머(diasteromer)를 가진다. 이런 관점에서 라세미 혼합물내의 단지 작은 백분율의 올리고뉴클레오티드가 충분한 친화성으로 표적 mRNA 또는 DNA에 특이적으로 혼성화되는 것 같다.

그 동안은 순수한 키랄 당간 결합기를 가지는 화학적으로 합성된 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드는 단지 하나 또는 두 개의 디아스테레오머 당간 결합기를 가지는 분자에 한정되어 있다. 최근에는 서열-특이적 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드의 화학적으로 합성된 라세미 혼합물의 유도된 키랄성의 영향은 순수한 키랄 당간 결합기를 가지는 올리고뉴클레오티드의 합성이 자동적 합성에 의해서 이루어지지 못하였기 때문에 평가되지 못하였었다. 이것은 자동적으로 합성되는 동안 황의 비-입체특이적 통합 때문이었다. 예를 들어 Stec et al., J. Chromatography, 326:263 (1985)는 라세미 당간 결합기를 가지는 일정 올리고뉴클레오티드 포스포로티오에이트를 합성하였으나 하나 또는 대부분 두 개의 디아스테레오머성 인 당간 결합기를 가지는 일정의 작은 올리고머의 디아스테레오머만을 분석할 수 있었다.

그러나 Stec et al. [Nucleic Acids Res., 19:5883(1991)]은 올리고뉴클레오티드의 자동화된 입체조절 합성을 발표하였다. 상기 언급된 참고자료에 기재된 절차는 5가 포스포로티올 중심에서 염기-촉매된 친핵성 치환을 이용한다.

효소적 방법을 이용한 모두 Rp 당간 결합기를 가지는 포스포로티오에이트의 합성법은 몇몇 과학자에 의하여 개발되었다 [Burgers and Eckstein, J. Biological Chemistry, 254:6889 (1979); Gupta et al., J. Biol. Chem. 256:7689(1982): Brody and Frey, Biochemistry, 20:1245 (1981); 및 Eckstein and Jovin, Biochemistry, 2:4546 (1983)]. Brody et al. [Biochemistry, 21:2570(1982)] 및 Romaniuk and Eckstein, [J. Biol. Chem, 257:7684(1982)]는 폴리 TpA 및 폴리 ApT 포스포로티오에이트를 효소적으로 합성한 반면 Burgers and Eckstein [Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 75:4798 (1978)]은 천연 포스포디에스테르 결합에 의하여 세 개의 디아스테레오머성 RpGpC 포스포로티오에이트 다이머를 헥사머에 연결하였다.

상보적 핵산에 결합하는 올리고뉴클레오티드의 상대적 능력은 특정 혼성 복합체의 용융 온도를 결정함으로써 비교될 수 있다. 용융 온도(T_m)은 이중 나선의 특징적 물리적 성질로서 50%의 나선 대 코일(혼성화되지 않은) 형태가 나타나는 온도(℃)를 의미한다. T_m은 혼성화의 형성 및 붕괴(용융)을 결정하기 위해 UV 스펙트럼을 이용함으로써 측정된다. 혼성화시에 발생되는 염기 중첩은 UV 흡광도의 감소(hypochromicity)와 동시에 나타난다. 따라서 UV 흡광도의 감소는 더 높은 T_m을 나타낸다. T_m이 높을수록 가닥의 결합강도가 더 커진다. 비-왓슨-크릭 염기쌍은 T_m에 강력한 불안정화 효과를 가져온다.

기초적 보고서 [Stec, J. W., Oligonucleoticle as Antisense Inhibitors of Gene Expression: Therapeutic Implications, Meeting abstracts, June 18-21, 1989]에서는 당간 결합기에서 하나의 결합기를 제외하고 모두 수식된 포스페이트 결합기인 ("all except one" 이라함) Rp 입체배열(stereoconfiguration) 또는 "all except one" Sp 입체배열을 가지는 티미딘 호모폴리머 옥타머가 천연의 포스포디에스테르 결합에 의해 연결된 두 개의 티미딘 메틸포스포네이트 테트라머성 디아스테레오머로부터 형성되었다. 하나를 제외하고 모두 Rp 당간 결합기를 가지는 Rp "all except one" 메틸포스포네이트 비-서열-특이적 티미딘 호모옥타머, 즉(dT)₈이 "all except one" Sp 배열 메틸포스포네이트 결합기를 가지는 유사한 티미딘 호모폴리머에 의해서 형성된 하이브리드(hybrid) 및 하나를 제외하고 모두 Sp 당간 결합기를 가지는 d(A)₁₅(〈0℃) 즉 d(T)₁₅의 하이브리드 보다 15-mer 디옥시아데노신 호모폴리머 즉 (dA)₁₅와 열역학적으로 더 안정된 하이브리드를 형성시킨다는 사실은 주목할 만하다. 천연의 포스포디에스테르 결합기를 가지는 d(T)₈, 즉 옥타티미딘산 및 d(A)₁₅사이의 하이브리드는 14℃의 T_m을 가진다고 보고되었다.

더 최근에는, Ueda et al. [Nucleic Acids Research, 19:547 (1991)]은 해독계에서 사용하기 위하여 Rp 디아스테레오머성 포스포로티오에이트를 간헐적으로 통합시킨 mRNA를 효소적으로 합성하였다.

Ueda et al.은 T7 RNA 폴리머라제에 대한 17개의 프로모터 및 한 개의 종결자리를 가지는 T7 콜리판(coliphane) DNA를 이용하였다. T7 RNA 폴리머라제에 의한 시험관내(in uitro) 합성은 수백에서 수만의 뉴클레오티드를 가지는 mRNA를 생성시켰다.

주쇄의 키랄 특성(chirality)은 또한 RNase H 활성에 대한 포스포로티어에이트 올리고뉴클레오티드-RNA 헤테로듀플렉스의 민감성에 영향을 미칠 수 있다. RNase H에 대하여 주형으로서 제공될 수 있는 성능은 RNase H가 RNA-DNA 올리고뉴클레오티드 헤테로듀플렉스에서 RNA 성분의 분해를 야기시키는 것으로 제안되고 있기 때문에 중요한 치료적 용도를 가진다. 올리고뉴클레오티드가 Rp 및 Sp 당간 결합기의 라세미 혼합물을 포함하고 있어서, 모든 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드는 RNase H에 대하여 기질로서 동등하게 기능할 수 있는가는 알려져 있지 않다. 다양한 촉매 반응을 위하여 핵산의 포스포로디에스테르 주쇄의 가수분해는 입체 특이적 메카니즘(in-line mechanism) 및 배열(configuration)의 역전(inversion)에 의하여 진행된다. 그러므로 최대의 혼성화 효율 및 해독 종결에 대한 올바른 키랄 특성을 포함하는 단지 적은 백분율의 올리고뉴클레오티드가 라세미 혼합물에 있을 수 있다. 이와 같이 헤테로듀플렉스내에서 RNase H에 대한 기질로서 제공될 수 있는 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드의 백분율을 증가시키게 되면 안티센스 치료제를 위한 더 효과적인 화합물로 될 수 있을 것이다.

혼성화 충실도를 향상시키기 위하여 실질적으로 순수한 키랄성 당간 결합기를 가지는 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드가 매우 바람직하다. 나아가서 실질적으로 순수한 키랄성 당간 결합기를 가지는 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드는 더 효율적인 치료적 화합물이 될 수 있다. 그러나 지금까지는 그러한 분자를 합성하는 데 성공하지 못하였다. 그러므로 실질적으로 순수한 키랄성 당간 결합기를 가지는 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드를 합성하는 간단한 방법이 더욱 요구된다.

올리고뉴클레오티드의 뉴클레아제 내성 및 혼성화 충실도는 올리고뉴클레오티드 치료학의 개발에서 매우 중요하다는 것은 잘 인식되어 있다. 뉴클레아제 내성을 가지는 올리고뉴클레오티드는 또한 치료제 및 진단제로서 바람직하다.

[발명의 요약]

본 발명에 따르면, 실질적으로 모든 Sp 포스포로티오에이트 당간 결합기 또는 실질적으로 모든 Rp 포스포로티오에이트 당간 결합기중 하나에 의하여 모든 뉴클레오시드가 연결된 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드가 제공된다. 바람직하게는 본 발명의 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드는 표적 RNA 또는 DNA의 적어도 일부분 이상의 서열에 상보적이다.

더욱이 본 발명에서는 실질적으로 순수한 키랄성 당간 결합기를 가지는 서열-특이적 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드를 합성하는 화학적 및 효소적 방법을 제공하는데 상기 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드는 실질적으로 모두 Rp 또는 실질적으로 모두 Sp 중 하나의 당간 결합기에 의하여 연결된 적어도 10개 이상의 뉴클레오시드 단위로 구성된다. 바람직하게는 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드는 실질적으로 순수한 키랄성 당간 결합기에 의하여 연결된 약 10 내지 약 50개의 뉴클레오시드 단위로 구성되어 있다. 더욱 바람직하게는 상기 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드는 실질적으로 순수한 키랄성 당간 결합기에 의하여 연결된 약 15 내지 약 30 뉴클레오티시드 단위로 구성된다. 가장 바람직하게는 상기 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드는 실질적으로 순수한 키랄성 당간 결합기에 의하여 연결된 약 17 내지 21 뉴클레오시드 단위로 구성된다. 상기 방법은 프라이머, 주형 및 과량의 4개의 순수한 키랄성 뉴클레오시드 5'-O-(1-티오트리포스페이트를 결합시는 것으로 이루어진다. 나아가서 상기 방법은 폴리머라제를 첨가하고 상보적 올리고뉴클레오티드에서 프라이머를 제거함으로써 상보적 올리고뉴클레오티드를 합성하는 것을 더 포함한다. 또한 상기 방법은 상기 주형으로부터 상기 상보적 올리고뉴클레오티드를 분리시키는 것으로 구성된다. 실질적으로 순수한 키랄성 당간 결합기를 가지는 서열-특이적 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드를 합성하는 본 발명의 방법 중 다른 구체예에서 염기서열 프라이머, 주형 및 뉴클레오시드 5'-O-(1-티오트리포스페이트)의 라세미 혼합물이 통합된다. 실질적으로 순수한 키랄성 당간 결합기를 가지고 주형에 상보적인 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드는 폴리머라제와 선택된 금속 이온을 첨가함으로써 합성된다. 이와같이 합성된 올리고뉴클레오티드는 주형과 프라이머로부터 분리된다.

실질적으로 순수한 키랄성 당간 결합기를 가지는 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드는 표적 RNA 및 DNA와 형성된 헤테로듀플렉스의 열역학적 안정성을 증가시키고 RNase H 활성을 이끌어내는 데 유용하다. 나아가서 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 RNA의 활성을 조절하는 데 유용하다.

[발명의 상세한 설명]

올리고뉴클레오티드의 포스포디에스테르 결합기에서의 인 원자는 "친-키랄성(pro-chiral)"이 된다고 기재될 수 있다. 포스포디에스테르 결합기의 비-결합산소 원자가 일단 교체되거나 수식되면 키랄성 당-포스페이트 결합기가 생성된다. 그 결과 생성되는 당간 결합기는 Sp 당간 결합기 또는 Rp 당간 결합기중의 하나가 될 수 있다. 포스포로티오에이트 결합기를 얻기 위해 천연의 포스포디에스테르 결합기의 비-결합 산소 원자를 황 원자로 치화시키게 되면 키랄성 중심이 형성되고 Sp와 Rp 디아스테레오머가 되도록 한다. 당간 주쇄에서 실질적으로 모든 원자가 Sp 또는 Rp 중 하나인 분자는 본 명세서에서 순수하게 키랄성인 것으로 언급된다.

리보뉴클레오시드-(NTPαS) 및 2'-디옥시리보뉴클레오시드-5'-O-(1-티오트리포스페이트) (dNTPαS)는 Ludwig and Eckstein [J. Org. Chem., 631(1989)]의 방법을 이용하여 Sp 및 Rp 라세미 혼합물로서 합성되었다. 이 예시적인 합성법에서 보호되지 않은 뉴클레오시드는 5'-히드록실기를 포스피틸레이트시키는(phosphitylate) 2-클로로-4H-1,3,2-벤조디옥사포스포린-4-온과 반응될 수 있다. 피로포스페이트와 연이어 반응시키게 되면 황에 반응성 있는 시클릭 트리포스페이트 유도체를 생성시키며 Rp 및 Sp 뉴클레오시드 5'-O-(1-티오트리포스페이트), 즉 α-티오트리포스페이트의 혼합물을 생성시키게 된다. 이 생성물은 DEAE-세파덱스 크로마토그래피에 의하여 정제 가능하고 NMR 스펙트로스코피에 의하여(특징적인 Rp 또는 Sp 화학적 전이(shift)에 의하여) 구별할 수 있다.

하기 예에서 보는 바와 같이 순수한 Rp 및 Sp 뉴클레오시드-5'-O(1-티오트리포스페이트) 디아스테레오머는 역상 HPLC 크로마토그래피와 같은 방법을 이용하여 예비 단계로 쉽게 분리될 수 있다. 그러한 HPLC-분리된 뉴클레오티드 디아스테레오머는 그러한 Rp 및 Sp 뉴클레오시드 5'-O-(1-티오트리포스페이트) 디아스테레오머의 상업적 표본과 분석적 HPLC 비교함으로써 더 특정화 될 수 있다.

서열-특이적 천연 올리고뉴클레오티드, 예를 들어 천연 포스포디에스테르 올리고뉴클레오티드의 효소적 합성은 주형과 프라이머의 존재하에서 적당한 뉴클레아제의 사용에 의하여 영향을 받을 수 있다. 유사한 방법으로 혼합된 키랄성당간 결합기를 가지는 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드의 라세미 혼합물이 합성되어 질 수 있다. 본 발명에 따르면 그러한 효소적인 합성은 또한 서열-특이적 주형과 프라이머의 존재하에서 적당한 뉴클레아제에 대한 기질로서 에난시오머적으로(enantiomerically) 순수한 모든-Sp 또는 모든-Rp 뉴클레오시드 5'-O-(1-티오트리포스페이트)를 이용함으로써 실질적으로 순수한 키랄성 당간 결합기를 가지는 서열 특이적 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드의 합성을 포함하도록 확장되어질 수 있다. 예를 들어 화학적으로 사용가능한 DNA 폴리머라제 시쿼나제(sequenase^TM) (U.S. Biochemical, Inc., Cleveland, OH)는 포스포디에스테르 올리고뉴클레오티드 주형 및 라세미 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드를 합성하는 데 이용될 수 있다. 이 폴리머라제를 이용하게 되면 포스로디에스테르 및 포스포로티오에이트 프라이머 모두가 신장되어질 수 있다.

효소적으로 합성된 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드의 수율은 주형과 프라이머를 반복적으로 첨가시키거나, 폴리머라제를 반복적으로 첨가시키거나, 뉴클레오시드 트리포스페이트를 반복적으로 첨가시키거나, 이런 방법들을 모두 또는 몇몇 조합하여 최적화될 수 있다. 예를 들어 주형과 프라이머의 반복적 첨가는 효소적 증폭(cascade)을 통하여 수율을 최대화할 수 있게 된다. 더 나아가서 시스템 버퍼(buffer)에서 주형과 프라이머의 예비적-혼성화 그리고 냉각후 뉴클레아제 트리포스페이트 및 폴리머라제의 첨가에 의하여 최적화가 이루어질 수 있다.

적당한 폴리머라제는 DNA 또는 RNA 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드 중 하나를 생성시키도록 선택될 수 있다. 그러한 폴리머라제는 T7 DNA 폴리머라제, 상기 언급된 sequenase^TM과 같은 수식된 T7 DNA 폴리머라제, E.coli DNA 폴리머라제, DNA 폴리 클레노우 단편 폴리머라제, M. luteus 폴리머라제, T4 박테리오파아지 폴리머라제, 수식된 T4 DNA 폴리머라제, T7 RNA 폴리머라제 및 E. coli RNA 폴리머라제를 포함하나 여기에 한정되는 것은 아니다.

효소적 합성은 인 원자의 키랄성 중심에 대하여 배열의 역전으로 진행된다. 이와 같이 모든 Sp α-티오트리포스페이트를 사용하게 되면 실질적으로 모두 Rp 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드를 생성시키게 되고 모든 Rp α-티오트리포스페이트를 사용하게 되면 실질적으로 모두 Sp 포스포로티오에이트 올리고규클레오티드를 생성시키게 된다. 본 발명의 다른 구체예에서 포스포로티에이트 키랄성 α-티오트리포스페이트 중 하나 또는 다른 것이 우세하게 들어 갈 수 있도록 반응 용액에 메탈 이온을 사용하여 뉴클레오시드-5'-O-(1-티오트리포스페이트)의 라세미 혼합물로부터 합성될 수 있다. 상기 언급된 바와 같이 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드의 폴리머라제 합성은 프라이머 뉴클레오시드-α-티오트리포스페이트의 키랄성 중심에 대하여 배열의 역전과 함께 수행된다. 특정 이론에 구속되는 것은 아니지만 모든 Rp 배열의 최적화는 예를 들어 E. coli 폴리머라제를 사용하여 반응 버퍼에서 고농도의 마그네슘 이온을 첨가시킴으로써 이루어질 수 있다고 여겨지고 있다. 유사한 방법으로 이론에 속박되고자 하는 것은 아니나 모든 Sp 배열이 반응 버퍼에서 고농도의 망간 이온을 사용함으로써 얻어질 수 있다.

본 발명에 따르면 "실질적으로 모두(substantially all)"는 적어도 75% 이상의 당간 결합기가 순수한 키랄성인 모든 올리고뉴크레오티드를 포함하는 것을 의미한다. 더 바람직하게는 약 85% 내지 약 100% 순수한 키랄성인 당간 결합을 가지는 올리고뉴클레오티드가 실질적으로 순수한 키랄성이 된다. 가장 바람직하게는 약 95% 내지 약 100% 순수한 키랄성인 당간 결합기를 가지는 올리고뉴클레오티드가 실질적으로 순수한 키랄성이 된다.

본 발명의 명세서에서 "포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드"라는 용어는 천연 생성된 염기, 당 및 포스포로티오에이트 결합기로부터 형성된다. 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 천연 생성된 염기는 아데닌, 구아닌, 시토신, 티민 및 우라실을 포함한다. 천연 당은 β-D-리보푸란노실 및 β-D-2'-디옥시-에리쓰로-펜토푸란노실을 포함한다. 뉴클레오시드-5'-O-(1-티오트리포스페이트) 유사체가 적당한 폴리머라제에 대한 기질이 되는 정도로 "포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드"는 또한 올리고뉴클레오티드의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드내에 통합된 수식된 염기 또는 수식된 당을 포함한다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드의 수식된 염기는 아데닌, 구아닌, 시토신; 우라실, 티민, 크산틴, 히포크산틴, 2-아미노아데닌, 6-메틸, 2-프로필 및 다른 알킬 아데닌, 5-할로 우라실, 5-할로 시토신, 6-아자 우라실, 6-아자 시토신 및 6-아자 티민, 유사(pseudo) 우라실, 4-티오우라실, 8-할로 아데닌, 8-아미노아데닌, 8-티올 아데닌, 8-티오알킬 아데닌, 8-히드록실 아데닌 및 다른 8-치환된 아데닌, 8-할로 구아닌, 8-아미노 구아닌, 8-티올 구아닌, 8-티올알킬 구아닌, 8-히드록실 구아닌 및 다른 8-치환된 구아닌, 다른 아자 및 디아자 우라실, 다른 아자 및 디아자 티미딘, 다른 아자 및 디아자 시토신, 다른 아자 또는 디아자 아데닌, 다른 아지 및 디아자 구아닌, 5-트리플루로오메틸 우라실 및 5-트리플루오로 시토신을 포함한다. 당 부(moiety)는 디옥시리보오스 또는 리보오스일 수 있다. 본 발명의 올리고뉴클레오티트는 또한 수식된 핵염기 또는 본 발명의 사상과 일치하는 다른 수식을 가지는 수식된 핵염기 및 치료, 진단 또는 연구 시약으로서 사용될 수 있도록 뉴클레아제 내성을 증가시키는 특별한 수식 상태의 핵염기로 이루어질 수 있다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 진단, 치료 및 연구시약으로서 이용될 수 있다. 그것들은 효과적인 양의 본 발명의 올리고뉴클레오티트를 적당한 약제학적으로 수용가능한 희석제 또는 담체에 첨가시킴으로써 제약적 조성물로 이용될 수 있다. 나아가서 그것들은 바람직하지 못한 단백질의 생성에 의하여 특징되어지는 질병을 가지는 유기체를 치료하기 위하여 사용될 수 있다. 유기체는 바람직하지 못한 단백질을 코드하는 표적 핵산의 가닥과 특이적으로 혼성화될 수 있는 서열을 가지는 본 발명의 올리고뉴클레오티드와 접촉될 수 있다.

치료적 조성물 및 그 이후의 투여 형태는 이 분야의 통상의 지식의 범위내에 있다. 일반적으로 치료를 위해 그러한 치료의 필요성이 있는 환자에게 대개 약제학적으로 수용가능한 담체내에 존재하는 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드를 환자의 나이 및 치료되는 질병 상태의 심각도에 따라 체중 kg당 0.01㎍ 내지 100g의 양으로 투여한다. 나아가서 치료법은 특정 질병의 속성, 심각성 및 환자의 전체적 상태에 따라 변할 수 있는 기간동안 지속될 수 있고 하루에 한번식에서 몇 년에 한번씩까지 연장될 수 있다. 치료한 다음 환자 상태 변화 및 질병상태의 징후 완화를 조사하였다. 올리고뉴클레오티드의 투여량은 환자가 현재 투여량 수준에 대하여 반응하지 않는 경우에 증가될 수 있고 또는 질병상태의 완화가 관찰되거나 질병 상태가 제거된다면 투여량은 감소될 것이다.

몇몇 경우에 다른 전형적인 치료적 방법과 동시에 본 발명의 올리고뉴클레오티드로 환자를 치료하는데 더 효과적일 수 있다.

투약은 치료되어야 할 질병 상태의 심각성 및 감응성에 의존하며, 치료과정은 몇일 내지 몇달까지 지속되거나 치료 효과가 나타나거나 질병 상태의 감소가 이루어질 때까지 지속되어진다. 최적 투여계획도 환자의 몸에 약물 축적량을 측정하여 계산되어 질 수 있다. 이 분야의 통상의 지식을 가진 자라면 최적 투여량, 투여법 및 반복 등급(rate)을 쉽게 결정할 수 있다. 최적 투여량은 개개의 올리고뉴클레오티드의 상대적 성능에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로 시험관내 및 생체내 동물 모델에서 효과적인 것으로 밝혀진 EC₅₀에 기초하여 계산될 수 있다. 일반적으로 투여량은 체중 kg당 0.01㎍ 내지 100g이며 한번 또는 날마다, 주마다, 달마다 또는 년마다 또는 몇년에 한번씩 투여될 수 있다. 성공적인 치료에 이어서 질병 상태의 재발을 방지하기 위해서 환자가 지속적인 치료를 받도록 하는 것이 바람직하고, 올리고뉴클레오티드는 한번 또는 날마다 내지는 몇년마다 한번씩 체중 kg당 0.01㎍ 내지 100g 범위의 지속적 투여량으로 투여하였다.

본 발명의 약제학적 조성물은 국소적 또는 조직적 치료가 바람직한가 그리고 치료되는 면적에 따라 여러 방법으로 투여될 수 있다. 투여법은 국부적(눈, 질(膣), 직장, 코, 피부), 경구 또는 비경구 투여가 될 수 있다. 비경구 투여는 혈관내 적하, 피하, 복막(腹膜)내 또는 근육내 주사 또는 포막(intrathecal) 또는 심장내 투여를 포함한다.

국소적 투여 형태는 피부투하 패치(patch), 연고, 로션, 크림, 겔, 드롭, 좌약 스프레이, 액체 및 분말을 포함할 수 있다. 종래의 약제학적 담체, 수성(aqueous), 분말 또는 오일성 염기, 식크너(thickner) 등등이 필요하고 또 바람직한 형태이다. 피복된 콘돔, 글러브(gloves) 등등도 또한 유용하다.

경구 투여하기 위한 조성물은 분말 또는 과립, 현탁액 또는 수용액 또는 비-수성 매질, 캡슐, 주머니(sachet) 또는 정제(tablet)를 포함한다. 식크너, 풍미제, 희석제, 유화제, 분산 조제 또는 고착제로 바람직할 수 있다.

포막내 또는 심장내 투여하기 위한 조성물은 버퍼, 희석제 및 다른 적당한 첨가제를 포함할 수도 있다. 무균의 수용액을 포함할 수 있다.

비경구 투여 형태는 버퍼, 희석제 또는 다른 적당한 첨가제를 포함할 수 도 있다. 무균의 수용액을 포함할 수 있다.

본 발명의 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드는 혼성화, 뉴클레아제 내성 및 RNase H 활성에 대한 효과에 대하여 천연의 포스포디에스테르 올리고뉴클레오티드 및 라세미 포스포로티오에이트 뉴클레오티드와 대조적일 수 있다. 유사하게 실질적으로 순수한 키랄성인 당간 결합기를 가지는 순수한 포스포로티오에이트 올리고뉴클레이티드는 생체내 시험 시스템에서 치료의 효율성을 증가 시키는 성능에 대하여 시험 시스템에서 치료의 효율성을 증가시키는 성능에 대하여 평가될 수 있다. 치료의 효율성의 그러한 증가는 약동력학 또는 대사, 독물학(toxicology), 배치(예를 들어 흡착 및 분포), 및 종(species) 비교와 같은 속성을 포함하는 것이다.

모두 Rp 또는 모두 Sp 당간 결합기를 가지는 호모폴리머는 안정성 및 다른 특성에 대한 기초적 연구에 유용하게 사용되고 있다. 그러나 이들 올리고뉴클레오티드는 표적 분자에 대해 특이적이지 못하기 때문에 치료학적으로 사용되지 못한다. 특이적 서열을 가지는 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드는 표적핵산에 특이적으로 혼성화하기 위해 필요하다.

실질적으로 순수하게 키랄성인 당간 결합기를 가지는 서열-특이적 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드는 표적 RNA 및 DNA와의 헤테로듀플렉스의 열역학적 안정성을 증가시키고 RNase H의 활성을 유도하는 데 유용하다.

방사성 표지화는 실질적으로 순수하게 키랄성인 당간 결합기를 가지는 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드를 동정(identification)하는 데 도움이 될 수 있다. 자동화된 합성기에서 합성된 라세미 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드에 대하여 [³⁵S](방사성표시된 원소 황)가 합성기로부터 얻어진 수소-포스페이트 올리고머의 산화에 사용되어질 수 있다. 효소적으로 합성된 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드의 라벨화는 폴리머라제 반응성 [α-³²P]ATP 및 리가아제 또는 [α-³⁵S]ATPs를 이용하여 수행될 수도 있다. 또한 방사성 표시된 뉴클레오시드 트리포스페이트는 프로브 및 서열분석에서도 사용될 수 있다. 자동방사선이 표준 방법으로 만들어질 수 있다.

본 발명의 주형은 질병-강화성 단백질의 합성을 유도하는 핵산 서열의 가장 바람직한 영역이다. 상기 주형 올리고뉴클레오티드의 영역에 염기쌍을 형성하는 짧은 올리고뉴클레오티드는 폴리머라제에 의한 올로고뉴클레오티드 합성에 대한 시발점을 형성하는 프라이머로서 작용한다.

실질적으로 순수한 키랄성인 당간 결합기를 가지는 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드는 뉴클레아제 분해, 예를 들어 제한 엔도뉴클레아제 분해에 민감한 자리를 가지도록 선택될 수 있는 프라이머를 사용하여 합성될 수 있다. 상기 분해 자리는 상기 프라이머의 3' 말단에 위치할 수 있다. 적당한 제한 엔도뉴클레아제에 의한 분해는 상기 프라이머로부터 첫번째 5' 말단 뉴클레오시드가 제거된 올리고뉴클레오티드가 된다. 본 발명의 상기 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드가 된다. 본 발명의 상기 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드의 부가적 뉴클레오시드는 효소적 수단에 의하여 첨가된 뉴클레오시드 키랄티오트리포스페이트이다.

선택된 프라이머와 함께 적당한 제한 뉴클레아제를 선택함으로써 바람직한 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드의 다양한 5'-말단 뉴클레오시드는 포스포로티오에이트 뉴클레오티드의 5' 말단에 적당하게 위치한다. 이와 같이 프라이머로부터 하나의 뉴클레오시드가 본 발명의 신규 합성된 서열 특이적 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드의 첫번째 5' 뉴클레오시드가 되도록 스태거된(staggered) 절단이 되는 한 어떠한 엔도뉴클레아제 인식 자리라도 디자인될 수 있다.

바람직한 서열의 적당한 주형에 상기 프라이머를 효소적으로 연장시키는 것이 완성될 때에 본 발명의 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드는 적당한 뉴클레아제를 사용하여 상기 프라이머에서 이탈될 수 있다. 예를 들어 바람직한 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에서 구아노신 뉴클레오시드를 통합시키기 위하여 그것의 3' 말단에 CTGCAG 서열을 가지는 프라이머가 사용될 수 있다. Pst 1 제한 뉴클레아제를 그 다음 사용하게 되면 A-G 연결을 분해시킬 수 있다. A-G 연결의 구아노신 뉴클레오시드 성분은 바람직한 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드의 5' 말단 뉴클레오시드로서 통합되어 질 수 있다. 다른 제한 엔도뉴클레아제로는 BamH1, Smal 및 HinD Ⅲ 제한 엔도뉴클레아제가 사용될 수 있고 여기에 한정되는 것을 아니다.

상기 주형과 결합된 상태로 있는 올리고뉴클레오티드는 상기 주형으로부터 분리될 수 있고 그런 다음 겔 전기영동 및/또는 크로마토그래피에 의하여 정제된다. 예를 들어 적당한 정제는 SepPac(Millipore, Mifiord, MA) 크로마토그래피와 연계된 표준 폴리아크릴아미드/우레아 겔 전기영동을 이용하여 수행될 수 있다. 사용될 수 있는 다른 유용한 크로마토그래피 기술은 HPLC 크로마토그래피이다.

본 발명의 키랄 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드는 Stec et al. [Nucleic Acids Res, 19: 5883 (1991) 및 Stec 및 Lesnikowski [Methods in Molecular Biology, S. Agrawal, Ed., Volume 20, P.285, 1993]에 기재된 바와 같은 1,3,2-옥사티아포스폴란 중간체에 의하여 화학적으로 합성되어 질 수 있다.

본 발명의 방법에 따라 합성된 실질적으로 순수한 키랄성 당간 결합기를 가지는 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드는 다양한 방법에 의하여 분석되여 질 수 있다. 예를 들어 실질적으로 순수하게 키랄성인 모두 Sp 또는 모두 Rp인 당간 결합기를 가지는 결과적으로 생성된 서열-특이적 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드는 [³¹P]NMR 화학적 전이(shift)를 이용하여 결정될 수 있다. 그러한 화학적 이동은 포스포로티오에이트 디뉴클레오티드의 Rp 에피머를 동정하는 데 사용될 수 있다(Luclwig and Eckstein, J. Org. Chem., 631-635(1989).

본 발명의 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드의 서열의 충실도는 S1 뉴클레아제에 대한 헤테로튜플렉스의 민감성을 이용하여 결정할 수 있다.

포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드의 서열은 [알파-³²P] 코르디세핀(cordycepin) 트리포스페이트, 즉 3'-디옥시아데노신-5-'트리포스페이트로 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드의 3'-히드록실기를 라벨화함으로써 더 구체화되어 질 수 있다. 그 결과 올리고뉴클레오티드는 효소적 분해에 민감하게 된다.

상보적 가닥에 결합하는 실질적으로 순수한 키랄성인 당간 결합기를 가지는 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드의 상대적 성능은 실질적으로 순수하게 키랄성인 당간 결합기를 가지는 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드 및 그것의 상보적 가닥의 혼성화 복합체의 용융 온도를 결정함으로써 비교된다. 용융온도(T_m), 이중가닥의 특징적 물리적 성질은 50% 나선 대 코일(혼성화되지 않음) 형태가 나타나는 섭씨 온도를 의미한다. T_m은 혼성화의 형성 및 붕괴(용융)을 결정하기 위해 UV 스펙트럼을 이용하여 측정된다. 혼성화 동안에 일어나는 염기 중첩은 UV 흡광도 감소(hypochromicity)와 동시에 나타난다. 따라서 UV 흡광도의 감소는 더 높은 T_m을 나타낸다. T_m이 더 높을수록 가닥의 결합강도는 더 커진다. 비 왓슨-크릭 염기쌍은 T_m에 강하게 불안정화 영향을 미친다. 따라서 가능한 한 염기쌍이 최적 충실도에 가깝게 되는 것은 그것의 표적 RNA에 올리고뉴클레오티드의 최적 결합을 가지는 것이 바람직하다.

본 발명의 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드는 또한 다양한 액수뉴클레아제 및 엔도뉴클레아제의 분열 성능에 대한 내성에 대하여 평가될 수 있다. 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드는 뉴클레아제로 처리될 수 있고 그런 다음 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(PAGE)과 같은 방법으로 분석되고 Stains All^TM(Sigma Chem. Co., St. Louis, MO)와 같은 적당한 색소로 착색시킨다. 분해 생성물은 레이저 밀도계를 사용하여 정량할 수 있다.

소 태아 및 인간 혈청이 실질적으로 순수한 키랄성 당간 결합기를 가지는 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드에 대한 세포핵성 활성을 평가하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어 실질적으로 모두 Rp 당간 결합기를 가지는 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드도 이 방법으로 평가되어 질 수 있다. 3' 또는 5 말단 캡된(캡(cap)당 하나 또는 몇 개의 포스포로티오에이트 결합기를 가지는) 분자의 조합에 관한 시험은 가장 큰 뉴클레아제 안정성을 생성시키는 조합을 만들어내는 데 사용될 수 있다. 캡핑은 정제된 Rp 모노머를 사용하여 서열의 캡 부분을 화학적으로 합성하고 DNA 합성기상의 올리고뉴클레오티드에 상기 캡을 통합시킴으로써 유효하게 이루어질 수 있다. 캡핑에 관한 분석법에 의하여 세포핵성 안정성에 대한 키랄성의 중요성 및 최대의 안정성을 얻기 위해 필요한 결합기의 수를 결정할 수 있다.

RNase H의 촉매 활성에 대한 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드-RNA 헤테로듀플렉스의 민감성도 또한 평가될 수 있다. 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드는 혼성화하기 위한 다양한 온도에서 방사성 표지된 표적 mRNA(예를 들어 T7 RNA 폴리머라제에 의해 합성된 것)와 배양될 수 있다. 그런 다음 헤테로듀플렉스는 Minshull 및 Hunt [Nuc. Acid Res., 6433 (1986)]의 절차에 따라 E. coli의 RNase H와 함께 37℃에서 배양될 수 있다. 그 다음 생성물에 대하여 노던 블럿 분석에 의하여 RNase H 활성을 평가할 수 있고 이것은 생성물을 1.2% 아가로스/포름알데히드 겔에서 전기영동하고 니트로셀룰로오스에 옮기는 방법이다. 그런 후 여과분을 표적 mRNA에 상보적인 랜덤 프라이머 [³²P]-표시된 cDNA를 사용하여 탐침하고 자동방사선에 의하여 정량하였다. RNA와 복합체를 형성할 때 RNase H에 대한 기질로서 작용하는 능력에 대한 키랄성의 영향을 결정하는 것으로서 서로 다른 포스포로티오에이트 유사체를 비교할 수 있다.

E. coli RNase H 및 포유류 RNase H의 촉매 활성에 대한 헤테로듀플렉스의 민감성에 대한 비교가 행하여질 수도 있다. 헤테로듀플렉스는 해독 조건하에서 토끼의 적혁구 용해물(lysate)에서 배양할 수 있고 외인성 RNase H에 의하여 mRNA를 촉매적으로 분열시키기 위한 노던 블롯 분석을 통하여 평가될 수 있다. 이것은 포유류 RNase H 활성에 대한 키랄성의 영향을 결정하도록 하여준다.

실질적으로 순수하게 키랄성인 당간 결합기를 가지는 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드는 또한 세포 배양 모델 시스템에서의 유전자 발현의 억제에 대하여 평가될 수도 있다. 실질적으로 순수하게 키랄성인 당간 결합기를 가지는 포스포로티오에이트가 더 강하거나 더 특이적인 유전자 발현의 억제자인가를 결정하기 위하여 리포터 유전자에 표적시키기 위하여 디자인된 실질적으로 순수한 키랄성 당간 결합기를 가지는 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드가 합성될 수 있고 유전자 발현의 세포 배양 모델에서 시험될 수 있다.

유전자 발현에 대한 안티센스 효과를 측정하기 위한 벡터 pSV2CAT의 용도는 종전에 알려져 있다. [Henthorn et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85: 6342 (1988)]. 이 벡터는 SV40 프로모터의 조절하에서 박테리아 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제 유전자를 포함한다. CAT mRNA의 해독 개시에 상보적인 서열의 모두 Rp인 당간 결합기를 가지는 15-mer 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드를 이용하여 pSV2CAT는 HeLa 세포에 형질전환 될 수 있고 세포를 48시간 동안 모두 Rp 당간 결합기를 가지는 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드로 처리한 후에 CAT 활성을 세포에서 분석할 수 있다. 실질적으로 순수하게 키랄인 당간 결합기를 가지는 포스포로티오에이트이 유전자 발현 억제활성은 디아스테레오머성 당간 결합기를 가지는 화학적으로 합성된 랜덤 포스포로티오에이트 및 동일 서열을 가지는 천연의 포스포디에스테르 올리고뉴클레오티드와 직접 비교될 수 있다.

벡터 pSV2APAP [Marcus-Sekura et al., Nucleic Acids Research, 15:5749 (1987)]는 포유류 태반의 알칼리 포스파타제 유전자(PAP)를 포함한다. 이것은 유전자 발현에 대한 안티센스 효과를 측정하기 위한 리포터로서 사용될 수 있다. PAP는 인트론과 다른 RNA 가공(processing) 신호를 포함하는 박테리아 유전자라기 보다 포유류 유전자라는 점에서 리포터 유전자로서 CAT 보다 이점이 있다. 현재 PAP 발현은 자연적인 포유류 유전자 발현에서 현상에 더 가깝게 모방하고 있다고 여겨진다. CAT mRNA에 대하여 상기 기재된 바와 같이 실질적으로 순수하게 키랄인 당간 결합기를 가지는 15-mer 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드는 화학적으로 합성된 라세미 포스포로티오에이트 및 유사한 서열을 가지는 천연의 포스포디에스테르 올리고뉴클레오티드와 병행하여 실험될 수 있다. PAP 및 CAT 리포터 구조물은 유전자 발현에 비-특이적 효과에 대하여 시험하는 상호적 실험에서 대조부로서 사용된다.

또한 실질적으로 순수한 키랄성인 당간 결합기를 가지는 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드는 생체내에서 RNA 해독의 억제자로서 작용하는 능력에 대하여 평가될 수 있다. 다양한 치료적 분야는 본 발명의 올리고뉴클레오티드에 의한 그러한 조작에 대한 목표가 될 수 있다. 하나의 치료적 분야는 C형 간염 바이러스(HCV)에 의해 야기되는 간염이다. 다음의 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티는 HCV 간염치료에 적용된다: Oligo # 259, CCTTTCGCGACCCAACACTA (SEQ ID NO: 1), Oligo # 260, GCCTTTCGCGACCCAACACT (SQ ID NO: 2), Oligo # 270, GTACCACAAGGCCTTTCGCG (SEQ ID NO: 3), Oligo # 330, GTGCTCATGGTG CACGGTCT (SEQ ID NO: 4) 및 Oligo # 340, TTTAGGATTCGTGC TCATGG (SEQ ID NO: 5). 또 다른 치료분야인 염증성 질병은 세포간 세포 부착 분자 (ICAM-1)에 의하여 매개된다. 염증성 질병의 치료에 적용되는 올리고뉴클레오티드는 ISIS-2302, GCCCAAGCTGGCATCCGTCA (SEQ ID NO: 6)를 포함한다. 또 다른 치료적 분야는 시토메갈로바이러스(CMV)에 의해서 야기되는 간염을 포함한다. ISIS-2922는 CMV 망막염 치료에 적용되는 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드이며 GCGTTTGCTCT TCTTCTTGCG (SEQ IN NO: 7)의 서열을 가진다. 또 다른 치료적 분야는 단백질 키나아제 C-α(PKC-α)에 의해 매개되는 암을 포함한다. ISIS-3521은 그러한 암의 치료에 적용될 수 있는 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드이며 GTTCTCGTGGTGAGTTTCA (SEQ ID NO: 8)의 서열을 가진다. 또한 이 치료적 분야는 C-raf 키나아제-매개된 암을 포함한다. ISIS-5132는 그러한 암의 치료에 적용될 수 있는 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드이며 TCCCGCCTGTGACATGCATT (SEQ ID NO: 9)의 서열을 가진다. 더욱이 이 치료적 분야는 Ha-ras 또는 Ki-ras에 의하여 매개되는 암을 포함한다. 하기의 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드는 그러한 암의 치료에 적용될 수 있다: ISIS-2503, TCCGTCATCGCTCCTCAGGG (SEQ ID NO: 10), ISIS-2570, CCACACCGACGGCGCCC (SEQ ID NO: 11) 및 ISIS-6957, CAGTGCCTGCGCCGCGCTCG (SEQ ID NO: 12). 또 다른 치료적 분야는 AIDS를 포함하며 HIV에 의해 매개되는 다른 관련 질병도 포함한다. ISIS-5320은 AIDS의 치료에 적용될 수 있는 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드이며 TTGGGGTT (SEQ ID NO: 17)의 서열을 가진다. 상기 서열에서 올리고뉴클레오티드의 각각의 뉴클레오티드 단위는 5'에서 3' 방향으로 왼쪽에서 오른쪽으로 나열되어 있다.

본 발명의 명세서에서 "혼성화(hybridizastion)"는 상보적 뉴클레오티드 단위 사이에 왓슨-크릭, 훅스틴 또는 역(reversed) 훅스틴 수소 결합일 수 있다. 수소 결합을 의미한다. 예를 들어 아데닌과 티민은 수소 결합의 형성에 의하여 결합하는 상보적 핵염기이다. 본 명세서에 사용된 바와 같이 "상보적"이란 것은 두 개의 뉴클레오티드 단위간에 서열 상보성에 관한 것을 의미한다. 예를 들어 올리고뉴클레오티드의 일정 위치에서의 뉴클레오티드 단위가 DNA 또는 RNA 분자의 동일 위치에서의 뉴클레오티드 단위와 수소 결합할 수 있다면 올리고뉴클레오티드 및 DNA 또는 RNA는 그 위치에서 서로 상보적인 것으로 여겨진다. 올리고뉴클레오티드 및 DNA 또는 RNA는 각 분자내의 충분한 수의 대응하는 위치가 서로 수소결합할 수 있는 뉴클레오티드 단위에 의하여 차지될 때 서로 상보적이게 된다. 이와 같이 "특이적으로 혼성화하는" 및 "상보적인"은 올리고뉴클레오티드 및 표적 RNA 또는 DNA 사이에 생기는 안정되고 특이적인 결합이 되도록 충분한 정도의 상보성을 나타내는 데 사용되는 용어이다. 특이적으로 혼성화하기 위하여 올리고뉴클레오티드가 그것의 표적 DNA 서열에 100% 상동성을 가질 필요는 없는 것으로 여겨진다. 올리고뉴클레오티드의 표적 RNA 또는 DNA 분자에 대한 결합기 표적 RNA 또는 DNA의 정상적 기능을 방해할 때 올리고뉴클레오티드가 충분히 혼성화 가능한 것이고, 특이적 결합에 바람직한 조건, 즉 생체내 또는 치료학적 처리의 경우 생리적 조건에서 또는 시험관내 분석의 경우 분석이 행하여지는 조건하에서 비-표적 서열에 대한 올리고뉴클레오티드의 비-특이적 결합을 피하기 위한 충분한 정도의 상보성이 있게 된다.

특히 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 진단제로서 치료용으로 상용될 수도 있고 본 발명의 양수인에게 양도된 하기 미합중국 특허출원에서 특정화된 바와 같이 연구하기 위해 사용될 수도 있다. 이 출원들의 발명의 명칭은 다음과 같다: RNA 활성을 조절하기 위한 조성물 및 방법, 제463,358호, 1/11/90 출원; 파필로마 바이러스의 안티센스 올리고뉴클레오티드 억제자, 제445,196호 12/4/89출원; 헤르페스 바이러스의 효과를 조절하기 위한 올리고뉴클레오티드 치료, 제485,297호, 2/26/90 출원: RNA 의태를 통하여 유전자 발현을 조절하기 위한 시약 및 방법, 제497,090호, 3/21/90 출원; 지질 대사의 올리고뉴클레오티드 조절, 제516,969호, 4/30/90 출원; 시토메갈로바이러스 감염의 효과를 조절하기 위한 올리고뉴클레오티드, 제568,366호, 8/16/90 출원; 인간 면역결핍 바이러스의 안티센스 억제자, 제521,907호, 5/11/90 출원; 유전자 발현을 조절하기 위한 노클레아제 내성 피리미딘 수식된 올리고뉴클레오티드, 제558,806호, 7/27/90 출원; 신규의 폴리아민 컨쥬게이트된 올리고뉴클레오티드, 제558,663호 7/27/90 출원; RNA이차 구조로 저해하는 유전자 발현의 조절, 제518,929호, 5/4/90 출원; 세포부착의 올리고뉴클레오티드 조절, 제567,289호, 8/14/90 출원; 인플루엔자 바이러스의 저해, 제567,287호, 8/14/90 출원; 칸디다균의 저해, 제568,672호, 8/16/90 출원; 및 파필로마 바이러스의 안티센스 올리고뉴클레오티드 억제자, PCT/US 90/07067, 12/3/90 출원. 이들 출원들은 올리고뉴클레오티드 상호작용을 통하여 RNA 및 DNA의 활성의 향상된 조절이 이루어질 수 있는 다수의 방법을 개시하고 있다. 여기에서 개시된 특이적 서열이 본 발명과 관련하여 사용될 수 있다는 점에서 상기 미국 특허출원들의 개시 내용들은 본 명세서에 참고로 통합되어 있다.

하기의 실시예는 예시적이며 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것이 아니다.

[실시예 1]

모든 Sp 또는 모든 Rp 5'-O-(1-티오트리포스페이트)뉴클레오티드의 분리

5'-O-(1-티오트리포스페이트)데옥시뉴클레오시드 및 리보뉴클레오시드는 ODS Hypersil(Shandon Southern, Runcon, UK)로 층진되고 A 용매(5mM 테트라부틸암모늄 이온을 포함하는 3mM 포타슘 포스페이트, pH 7.0) 및 B 용매(메탄올에 있는 5mM 테트라부틸암모늄 하이드록사이드))의 아이소크래틱 혼합물로 용리되는 칼럼을 사용하는 C-18 역상 고성능 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromarogtaphy(HPLC))를 이용하여 분리된다. 또는 0% 내지 5% 아세토니트릴의 선형 기울기(linear gradient)를 포함하는 pH 7.5, 100mM 트리에틸암모늄 비카보네이트를 이용하여 20분간에 걸친 효과적인 분리가 수행된다.

이러한 HPLC 분리된 에난티오머(enantiomers)의 순도를 확립하기 위해서 상기 HPLC 분리된 Sp 및 Rp 에난티오머는 상업적으로 사용할 수 있는 E.I. Dupont, Wilmington, DE.로부터 얻을 수 있는 데옥시뉴클레오티드 5'-O-(1-티오트리포스페이트)에 비교된다.

[실시예 2]

라세미 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드의 실질적으로 모두 Rp 당간 결합기를 갖는 포스포로티오에이트 연장체(extension)의 합성

라세미 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드 연장체의 모든 Rp 포스포로티오에이트의 효소적 합성은 변형된 T7 DNA 폴리머라제, I, Sequenase^TM(U.S. Biochemicals Corp., Cleveland, OH)를 사용함에 영향을 받는다. 상기 T7 DNA 폴리머라제는 18-mer 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드 프라이머를 혼성하여 21-mer 천연 포스포로에스테르 올리고뉴클레오티드로 연장시키는 데 사용된다. 1×Sequenase^TM반응 버퍼(U.S. Biochemicals Corp., Cleveland, OH)내의 30 picomoles(pmol)의 프라이머 및 주형(최종 vol 10㎕)은 5분동안 95℃로 가열 되고 서서히 상온으로 냉각된다. 180pmol의 데옥시 5'-[α-³⁵S] 시티딘 트리포스페이트 및 Sequenase^TM효소(U.S. Biochemicals Corp., Cleveland, OH)가 첨가되고 27℃에서 약 20분간 배양된다. 그 생성물은 20% 폴리아크릴아미드/7M 우레아 변성 겔을 이용하는 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(PAGE)을 통해 분석 된다. 상기 생성물의 자동방사선 사진은 프라이머/주형이 부재하는 대조부 반응과 비교된다. 그 최종 생성물은 예를 들어 효소적 분해에 의하여 더 특징화 된다. 하나의 이러한 분해는 뱀 독성 포스파타제(snake venom phoshatase) 분해이다. E. coli DNA 폴리모라제 I을 사용하여 합성된 디뉴클레오시드 모노 포스포로티오에이트의 뱀 독성 포스파타제 분해는 상기 뉴클레오시드가 Rp 배열로 된다는 것을 보여준다.

[실시예 3]

실질적으로 순수한 Rp 당간 결합기를 갖는 포스포로티오에이트 CGACTATGCAAGTAC (SEQ ID NO: 13)의 합성

서열 특이적인 모든 Rp 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드의 대규모의 효소적 합성은 55-mer 천연 포스포디에스테르 주형 및 41-mer 천연 포스포디에스테르 프라이머를 사용하는 것에 영향을 받는다. 상기 주형의 서열은 GTACTTGCATAGTCGATCGGAAAATAGGGTTCTCATCTCCCGGGATTTGGTTGAG (SEQ ID NO: 14)이고: 상기 프라이머의 서열은 CTCAACCAAATCCCGGGAGATGAGAACCCTATTTTCCGATC (SEQ ID NO: 15)이다.

상기 주형은 요구되는 특수한 CGACTATGCAAGTAC (SEQ ID NO: 13)에 상보적인 서열을 갖도록 선택되었다. Sequenase^TM버퍼(U.S. Biochemicals Corp., Cleveland, OH)는 5×에서 1×로 희석되어 사용된다. 상기 주형 및 프라이머는, 둘다 20nM의 농도에서 상기 버퍼 40㎕를 첨가한다. 상기 주형 및 프라이머는 95℃에서 5분간 혼성되고 상온으로 냉각된다. 1:8로 희석된 Sequenace^TM효소 20㎕ 및 Sp GTP αS, CTPαS, ATPαS TTPαS를 각각 320μM을 첨가한다. 상기 반응용액은 물로 140㎕로 조정한다. 37℃에서 18시간 동안 배양한다. 상기 반응용액은 표준방법에 따라 페놀과 같은 부피로 2× 추출되고 -20℃에서 100% 에탄올 2.5 부피로 처리하는 표준방법으로 침전시키고, 펠트화하여(peltize), 70% 에탄올 50㎕로 세척하고, 다시 펠트화한 후 건조시킨다. 상기 침전물은 20㎕ 물에서 30분 동안 현탁시킨 후 40㎕ 물에 1mM CaCl₂, 25mM 트리스 HCl pH 8.0으로 조절된다. 상기 용액은 5분동안 95℃로 유지되고 얼음으로 급격히 냉각된다.

상기 주형 및 프라이머는 4.6μM DNase의 첨가하고 37℃에서 10분간 배양함에 의해서 합성된 뉴클레오티드로부터 제거된다. 상기 반응 혼합물은 2번 페놀 추출시키고 상기와 같이 에탄올로 침전시켰다. 상기 침전물을 물에서 재현탁시키고 SepPak^TM크로마토그래피(Millipore, Milford MA)와 결합하여 20% 폴리아크릴아미드/7M 우레아 겔을 사용하여 정제시킨다.

다른 합성에 있어서, Pst 1 제한 뉴클레아제(Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD)는 제한부분의 프라이머-결합된 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드를 분해시키는 데 사용된다. 요구되는 CGACTATGCAAGTAC (SEQ ID NO: 13) 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드는 폴리아크릴아미드 /SepPak^TM크로마토그래피(Millipore Milford, MA)와 연계된 7M 우레아 전기영동법을 사용하여 정제된다. 수득률은 상기 반응동안 주형-프라이머의 반복적 첨가에 의해 영향을 받는 효소적 증폭법(cascade)을 이용하여 최적화된다. 상기 증폭적으로 증가된 합성은 상기 20㎖ 반응으로부터의 모두 Rp 배열인 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드의 단위 75 A₂₆₀을 생성한다.

[실시예 4]

자동화된 DNA 합성을 이용하는 당간 결합기의 라세미 혼합물을 갖는 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드의 합성

올리고뉴클레오티드는 표준방법 [Agrawal et al., Proc. Natl. Acad. Sco. U.S.A, 85:7079(1988)]인 하이드로겐 포스포네이트 화학법을 이용하는 자동화된 DNA 합성기(Applied Biosystems model 380B)에서 합성된다. 상기 최종적인 결합단계 후에, 상기 포스포로티오에이트 결합기는 카본 디설파이드/트리에틸아민/피리딘의 황으로 결합 올리고머를 산화시킴으로서 생성된다. 황산화 후에, 지지체로부터 올리고뉴클레오티드를 이탈시키고 염기 차단 그룹을 제거하기 위해서는 암모늄 하이드록시드를 사용하는 표준 탈보호 방법이 사용된다. 상기 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드 정제 칼럼(OPC; ABI, Foster City, CA) 크로마토그래피 및 Beckman System Gold HPLC를 사용하여 HPLC에 의하여 정제된다. 상기 HPLC-정제된 올리고뉴클레오티드는 에탄올로 침전시키고 20% 아크릴아미드/7M 우레아에서의 겔 전기영동법 또는 분석적인 HPLC에 의하여 최종적 순도가 평가된다. 상기 튜클레오티드 서열의 신빙성은 피리딘/물 내의 요오드에 의한 산화 및 표준 시퀀싱 방법에 의해서 평가된다. 이들 뉴클레오티드는 각각의 포스포러스 결합기에서 Rp 및 Sp 이성질체의 모든 가능한 조합의 혼합물을 포함한다.

[실시예 5]

열역학적 및 동력학적 혼성화 분석을 위해 T7 RNA 폴리머라제를 사용하는 상보적 DNA 또는 RNA 서열의 합성

천연 포스포디에스테르 결합기의 짧은 상보적 DNA 올리고뉴클레오티드의 합성은 ABI model 380B DNA 합성기에서 표준 자동화 합성을 이용하여 수행된다. 정확한 길이의 상기 뉴클레오티드는 HPLC에 의해서 정제되고 표준기술에 의해서 서열분석된다.

혼성분석을 위한 짧은, 상보적 RNA 뉴클레오티드의 합성을 위해 T7 RNA 폴리머라제가 사용된다. 고농도에서는 많은 양의 T7 RNA 폴리머라제가 짧은 RNA를 합성하는 데 요구되는 많은 개시 싸이클이 필요하다. 이러한 요구에 의하면, 상기 RNA 폴리머라제는 Brookhaven National Laboratory(Upton, NY)로 부터 구할 수 있는 BL21/pAR1219, T7 RNA 폴리머라제 발현 벡터를 포함하는 E. coli의 균주(strain)로부터 제거된다. 상기의 떨어진 부분은 2ℓ의 세포로부터 대략 300,000 내지 500,000 T7 RNA 폴리머라제 단위, 흡광도=1.2 A₆₀₀생성 된다. 이것은 짧은 (10-30 뉴클레오티드) RNA 종(species)의 합성을 위해서 충분히 농축된다. 합성에 있어서, 상보적 표적 서열 및 T7 프로모터 혼성화 서열을 포함하는 T7 프로모터 및 주형은 ABI 합성기(ABI, Foster City, CA)를 사용하여 합성된다. 주형 및 프로모터는 효소적 합성을 위해 올바른 종(species)이 존재함을 확실히 하기 위해서 HPLC로 정제된다. 합성된 생성물은 20% 폴리아크릴아미드/8M 우레아 겔에서 정제되고 표준과정에 의해서 서열분석된다.

[실시예 6]

열적 변성

올리고뉴클레오티드(본 발명 또는 그밖의 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드)는 10mM 이온 강도 버퍼(89.8mM NaCl, 10mM Na-phosphate, pH 7.0, 0.2mM EDTA)내의 각각의 올리고뉴클레오티드를 위한 4μM 표준농도에서 상보적 DNA 또는 RNA 올리고뉴클레오티드와 배양된다. 시료들은 90℃로 가열되고 Guilford Response Ⅱ 스펙트로포토미터(Corning)를 사용하여 초기 흡수된다. 그 후 시료들은 서서히 15℃로 냉각되고 상기 변화는 열변성 과정동안 260nm에서의 흡수가 모니터된다. 상기 온도가 1도 상승되면/흡수 판독 및 변성 측면은 용융곡선의 최초 유도체를 분석한다. 데이타 또한 상기 T_m및 델타 G를 구분하기 위한 2-단계 선형 역행 분석을 이용하여 분석된다. 이들 시험의 결과는 표 1에 나타내었다.

[실시예 7]

방사성표지된 올리고뉴클레오티드의 합성

필터 결합 분석(filter binding assay)은 여러 가지 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드의 결합 엄격성(stringency), 즉 그것들의 혼성화되고 DNA 또는 RNA와 헤테로듀플렉스를 형성하는 경향성을 정량하기 위해서 사용된다. 이들 분석은 방사성표지된 올리고뉴클레오티드를 필요로 한다.

모든 Rp 당간 결합기들을 갖는 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드들은 Sp 모노머들로부터 정제되어진 [³⁵S]-모노머들로부터 효소적 방법에 의해 합성된다. 혼합된 키랄성 당간 결합기들을 포함하는 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드의 자동화된 합성을 위하여, 올리고뉴클레오티드는 하이드로겐 포스포네이트를 포함하도록 합성된 후 피리딘/카본 디설파이드 혼합물에서 원소 [³⁵S]의 존재하에 황화된다. 그 결과 방사성표지된 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드는 OPC 크로마토그래피 및 HPLC에 의해서 정제될 수 있다. 표적 mRNA는 니트로셀룰로오스 필터에 이용되고 80℃에서 2분간 구어진 후, 차단되고 방사성표지된 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드와 혼성화된다. 결합의 엄격성은 온도의 증가후 또는 Tris NaCl 버퍼와 같은 용리용(eluting)버퍼의 이온력이 증가한 후에 필터로부터 용리되는 방사성표지된 올리고뉴클레오티드를 정량함으로써 평가된다. 용리된 올리고뉴클레오티드는 포스페이트 버퍼를 동등하게 이용하는 음이온 교환 HPLC 프로토콜에서의 이동성에 대하여 분석된다. 그 결과는 조합한 당간 결합기의 라세미 혼합물을 갖는 표준 올리고뉴클레오티드의 이동성과 비교된다.

[실시예 8]

뉴클레아제 분해

10% 소 태아 혈청(FCS)를 포함하는 배양액에서 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드의 뉴클레아제 분열의 속도의 결정은 10%의 열불활성 FCS를 포함하는 Dulbecco's Modified Essntial Medium(DMEM)에서 수행된다. 상기 FCS의 열불활성은 배양액에 첨가되기 전에 55℃에서 1시간 동안 실행된다. 라세미 및 순수한 키랄성 당간 결합기를 갖는 올리고뉴클레오티드는 뉴클레아제 절단에 대한 저항에 대하여 따로따로 평가된다. 각 66㎍/㎖의 올리고뉴클레오티드는 각각 배양액에 첨가되고 37℃에서 배양되며, 그 때의 시간 간격은 표 2에 나타낸 바와 같다. 15㎕의 앨리큇(Aliquots)을 제거하고 0.1M Tris-HCl(pH 8.3), 0.1M 붕산 및 2mM EDTA 중의 9M 우레아 15㎕에 첨가하였다. 앨리큇은 와동(vortex)시켜 혼합하고 -20℃에서 보관하였다. 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(PAGE) 분석은 20% 폴리아클릴아미드/7M 우레아 슬랩 겔을 사용하였다. 하기의 전기 영동법에서 겔은 "Stains All"(Sigma Chem. CO., St. Louis, MO)을 사용하여 착색되었다. 탈착색시킨 다음, 겔은 UltraScan XL 장치(Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala, Sweden)를 사용하는 레이저 밀도계로 분석되었다.

집적이 이루어지면 배양 전의 총길이(n)로부터 n-1까지의 감소를 퍼센트로 나타낸다. Rp 순수한 키랄성 당간 결합기들을 갖는 올리고뉴클레오티드 서열 CGACTATGCAAGTAC(SEQ ID NO: 6)에 대한 결과는 표 2에 나타내었다.

표 2에서 나타난 바와 같이 실질적으로 순수한 키랄성 당간 결합기들을 갖는 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드의 뉴클레아제 분해에 대한 내성은 라세미 당간 결합기들을 갖는 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드의 내성보다 우수했다는 것을 보여준다.

[실시예 9]

RNASE H 분석

라세미 및 실질적으로 순수한 키랄성 당간 결합기를 갖는 포스포로티오에이트는 RNase H에 대한 민감성에 대해 분석된다. 올리고뉴클레오티드(RNA에 대해 2-배 초과된 물 함량) 및 시험관 내에서 합성된 mRNA(T7 RNA 폴리머라제 프로모터를 사용하는)는 5㎕(3.1Kb) RNase H 혼성화 버퍼에서 60℃로 30분 동안 배양되었다. 시료들은 서서히 상온으로 냉각되었고 3.7mg/㎖ BSA, 20 단위 E. coli RNase H(Promega), 142mM DTT, 150mM KCl, 및 3mM MgCl₂로 조절된다. 시료들은 37℃에서 30분간 배양된다. 그리고 나서 시료들은 폐놀로 추출되고, 에탄올로 침전시키고, 그리고 하기 에티듐 브로마이드 착색한 1.2% 아가로스 겔에서 전기 영동법에 의해 분석하였다. RNA 시료들의 대략적인 길이를 결정하기 위해서 시료들과 함께 마커(marker)가 겔에서 동시에 이동한다.

[실시예 10]

HCV가 원인이 되는 간염을 앓고 있는 환자는 Oligo #259(SEQ ID NO: 1), Oligo #260(SEQ ID NO: 2), Oligo #270(SEQ ID NO: 3), Oligo #330(SEQ ID NO: 4), 또는 Oligo #340(SEQ ID NO: 5)로 치효하며, 이들 각각은 실시예 3 또는 실시예 19의 과정에 따라 합성된다. 올리고뉴클레오티드의 1-1000㎕/㎏ 체중량은 제약학적으로 수용가능한 담체에 첨가되어 정맥을 통해서 또는 근육을 통해서 투입되었다. 치료는 질병이 제거될 때까지 필요에 따라 반복될 수도 있다.

[실시예 11]

ICAM-1에 의해 조절되는 염증성 질병을 앓고 있는 환자들은 실시예 3 또는 실시예 19에 의해서 합성되는 올리고뉴클레오티드, 및 그 서열 GCCCAAGCTGGCATCCGTCA(SEQ ID NO: 6)를 갖는 올리고뉴클레오티드 ISIS-2302로 치료된다. 올리고뉴클레오티드의 1-1000㎕/㎏ 체중량은 약제학적으로 수용가능한 담체에 첨가되어 정맥 또는 근육을 통해서 투입되었다. 치료는 질병이 제거될 때까지 반복될 수도 있다.

[실시예 12]

사이토메갈로 바이러스에 의한 망막염을 앓고 있는 환자는 실시예 3 또는 실시예 9에 의해 합성되고 GCGTTTGCTCTTCTTCTTGCG(SEQ ID NO: 7)서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 ISIS-2922로 치료된다. 올리고뉴클레오티드의 1-1000㎕/㎏ 체중량은 약제학적으로 수용가능한 담체에 첨가되어 정맥 또는 근육을 통해서 투입되었다. 치료는 질병이 제거될 때까지 반복될 수도 있다.

[실시예 13]

PKC-α-조절되는 암을 앓고 있는 환자는 실시예 3 또는 실시예 9에 의해 합성된 올리고뉴클레오티드, 및 GTTCTCGCTGGTGAGTTTCA(SEQ ID NO: 8) 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드, ISIS-2922로 치료된다. 올리고뉴클레오티드 1-1000㎕/㎏ 체중량은 약제학적으로 수용가능한 담체에 첨가되어 정맥 또는 근육을 통해서 투입되었다. 치료는 질병이 제거될 때까지 반복될 수도 있다.

[실시예 14]

C-raf 키나아제-조절되는 암을 앓고 있는 환자는 실시예 3 또는 실시예 19에 의해 합성된 올리고뉴클레오티드, 및 TCCCGCCTGTGACATGCATT(SEQ ID NO: 9) 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 ISIS-5132로 치료되었다. 올리고뉴클레오티드의 1-1000㎕/㎏ 체중량은 약제학적으로 수용가능한 담체에 첨가되어 정맥 또는 근육을 통해서 투입되었다. 치료는 질병이 제거될 때까지 반복될 수도 있다.

[실시예 15]

C-raf 키나아제-조절되는 암을 앓고 있는 환자는 실시예 3 또는 실시예 19에 의해 각각 합성된 ISIS-2503(SEQ ID NO: 10), ISIS-2570(SEQ ID NO: 11) 또는 ISIS-6957(SEQ ID NO: 12)로 치료되었다. 올리고뉴클레오티드 1-1000㎕/㎏ 체중량은 약제학적으로 수용가능한 담체에 첨가되어 정맥 또는 근육을 통해서 투입되었다. 치료는 질병이 제거될 때까지 반복될 수도 있다.

실시예 16, 17 및 18의 화합물 1, 2 및 3은 Stec et al. [Nucleic Acids Res., 19:5883(1991)] 및 Stec and Lesnikowski [Methods in Molecular Biology, S.Agrawal, Ed., Volume 20, p. 285, 1993]에 의해 합성된다.

[실시예 16]

2-클로로-1,3,2-옥사티아포스폴렌의 합성(1)

피리딘(1mol), 벤젠(400㎖), 2-머캅토에탄올(0.5 mol) 및 포스포러스 트리클로라이드(0.5mol)의 혼합물은 상온에서 30분 동안 교반된다. 피리디늄 클로라이드는 여과되어 제거되고, 용매는 감압하게 증기화되고 조(crude) 생성물은 감압하에 증류되어 정제된다. 70-72℃-20mmHg에서 끓는 분액들은 수집하여³¹P NMR에 의하여 특성화하였다.

[실시예 17]

N,N-디이소프로필아미노-1,3,2-옥사티아포스폴렌의 합성(2)

화합물 1(0.2 mol)은 n-펜탄(300mol)에 용해되고 디이소프로필아민이 적하하여 첨가된다. 그 반응물은 상온에서 30분간 교반되고, 그 후 디이소프로필아민 하이드로클로라이드는 여과되고, 용매는 감압하에 증기화되고, 그 조 생성물은 진공 증류에 의해서 정제된다. 생성물 2는 70℃/0.1mmHg에서 끓는 분액으로서 얻어졌고³¹P NMR 및 질량 분석기에 의해서 특성화하였다.

[실시예 18]

5'-O-디메톡시트리틸티미딘-3'-0[2-티오노-1,3,2-옥사티아포스폴렌]의 합성(3)

5'-O-디메톡시트리틸티미딘(10mmol) 및 1H-테트라졸(11mmol)은 진공 건조되고 디클로로메탄(25㎖)에 용해시켰다. 화합물 2(11mmol)는 그 용액에 첨가되고 그 반응물은 상온에서 2시간 동안 교반되었다. 건조된 황원소(15mmol)가 첨가되고 그 반응물은 상온에서 16시간 동안 교반되었다. 미반응 황은 여과되고 그 여과물은 감압하에서 농축된다. 잔여물은 클로로포름(3㎖)에 용해되고 우선 클로로포름으로 용리시키고, 그 다음에 클로로포름:메탄올(97:3)로 용리시키는 실리카 겔(230-400 메쉬) 칼럼 크로마토그래피에 의해서 정제된다. 화합물 3의 개개의 디아스테레오머성 종류는 실리카 겔상의 칼럼 크로마토그래피에 의하여 얻어진다. 화합물 3은 에틸 아세테이트에 용해되고 실리카 겔 60H 칼럼상에 적용된다. 에틸 아세테이트는 용리 용매로 사용되고, 용리(elution)는 HPTLC(실리카 겔 60, 전개 용매로서 에틸아세테이트를 사용)에 의하여 관찰된다. 화합물 3의 분리된 디아스테레오머를 포함하는 분액들은 감압하에서 농축되고 그 잔여물은³¹P NMR 및 HPLC(Lichrospher Si 100, 5μM, 용리제로서 에틸 아세테이트를 사용, 3㎖/min의 유량속도)에 의해서 특성화된다. 빠르게 용리되는 분액은 Sp 디아스테레오머에 해당하고, 느리게 용리되는 분액은 Rp 디아스테레오머에 해당된다.

[실시예 19]

고체상 자동화 합성에서 5'-OH 뉴클레오시드 및 순수한 디아스테레오머성 3 사이에서의 반응의 입체특이성 조절

Stec et al.의 절차는 적합한 Biosystems(Foster City, CA) model 380B 자동화 DNA 합성기를 사용하여 진행하였다. 상기 5'-OH 뉴클레오시드 및 3과 같은 순수한 디아스테레오머성 뉴클레오시드 옥사티아포스폴란 사이의 반응은 촉매로 1,8-디아자바이시클로(5.4.0)운데크-7-엔(DBU)의 사용을 필요로 한다. 자동화된 DNA 합성기내의 지지체 매트릭스에 올리고뉴클레오티드를 부착시키기 위해 사용하는 상업적으로 구입가능한 결합제는 DBU에 대해 불안정하기 때문에, 결합제의 변형이 필요하다. 옥사티아포스폴란 방법을 통한 올리고뉴클레오티드의 합성에 적합한 결합제는 DBU에 대한 내성이 있는 "숙시닉-사코시닐(succinic-sarcosinyl)" 결합제이고, 상온에서 1시간 이하로 농축된 암모늄 하이드록사이드에 의해서 가수분해될 수 있다.

(A) "숙시닉-사코시닐" 결합제는 통한 고체 매트릭스에 결합되는 5'-O-디메톡시트리틸뉴클레오시드의 합성:

(1) N-Fmoc-사코신(sarcosine)(Bachem Bioscience, Ine., Philadelphia, PA)(1.6mmol)이 긴 사슬 알킬 아민-CPG(LCA-CPG, Sigma, St. Louis, MO)(2g)에 첨가되고 진공하에서 건조되었다. 무수 DMF(5㎖), 피리딘(0.5㎖) 및 DCC(2.4mmol)이 첨가되고 그 반응물은 상온에서 12시간 동안 교반된다. 상기 용매는 여과되고 그 지지체는 메탄올:아세토니트릴:피리딘(1:1:1, 3×20㎖)으로 세척된다. 상기 N-Fmoc 보호 그룹은 피리딘내의 10% 피페리딘 용액 10㎖로 지지체를 다룸으로써 제거된다. N-사코시닐화된(sarcosinylated) LCA-CPG는 메탄올:아세토니트릴:피리딘(1:1:1, 3×20㎖)로 세척되고 진공하에서 건조된다.

(2) 5'-O-디메톡시트리틸뉴클레오시드는 (1)에서 설명한 바와 같이 DMF(2㎖), 피리딘(0.2㎖) 및 DCC(50mg)의 존재하에서 얻어진 그 반응물은 상온에서 12시간동안 혼합된 후 메탄올:아세토니트릴:피리딘(1:1:1, 3×20㎖)로 세척되고, 진공에서 건조된다. 건조 후, 상기 지지체는 N-메틸이미다졸:THF(1㎖) 및 아세틱 무수물/루티딘(1 ㎖)에서 15분간 처리된다. 그후 상기 지지체는 메탄올:아세토니트릴:피리딘(1:1:1, 3×10㎖)로 세척된 후, 진공하에서 건조된다.

(B) 순수한 디아스테레오머성 활성화된 뉴클레오시드는 그후 300-배 과량인 몰 함량의 DBU 존재하에서 사코시닐 LCA-CPG 지지체에 부착된 올리고뉴클레오티드에 첨가된다. 상기 활성화된 뉴클레오시드의 디아스테레오머는 커플링 반응에 사용되기 전에 칼럼 크로마토그래피 [실리카 겔 60H, 에틸 아세테이트는 용리 용매로 사용되고 용리는 HPTLC(실리카 겔 60, 전개 용매로서 에틸 아세테이트를 사용)에 관찰된다]에 의해서 분리된다. 그 합성 프로토콜은 표 3에 나타내었다.

상기 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드의 디아스테레오머성 순도는³¹P NMR 에 의해서, HPLC (Lichrospher Siloo, SμM, 용리제로서 에틸 아세테이트, 유량속도 3㎖/min), 효소적 또는 전기영동적 방법에 의해서 결정될 수 있다.

[실시예 20]

인간 환자에 있어서 질병 상태의 치료

본 발명의 올리고뉴클레오티드는 다양한 질병상태의 치료를 위해서 사용된다. 특별한 질병으로 진단받은 환자의 치료는 적절한 방법으로 환자에게 약학적으로 수용되는 형식으로, 올리고뉴클레오티드의 효과적인 복용을 조절하는 것으로 이루어진다.

효과적인 올리고뉴클레오티드의 양은 치료되는 질병의 상태, 질병상태의 심각성 및 치료를 받는 환자의 나이에 의존한다. 올리고뉴클레오티드의 유효량은 IC₅0에 기초하여 결정되고 이는 당분야의 기술자에게는 일반적인 절차이다. 상대적으로 올리고머의 유효량은 약물동태학적 소프트웨어 프로그램 TopFit을 이용하여 결정된다. 예를 들어 올리고뉴클레오티드의 사용량은 질병상태에 따라 체중 kg당 0.01 ㎍(아이들)부터 100g(성인)까지 다양하다. 유사하게, 그 사용빈도는 질병의 상태에 의존하고 하루에 한번 또는 그 이상에서 매해 20년에 한번까지 다양하다.

올리고뉴클레오티드 투여경로는 치료되는 질병상태에 의존한다. 예를 들면, 염증성 질환에 대한 치료를 받는 환자에 대한 올리고뉴클레오티드의 투여는 경구 또는 직장을 통하여 이루어진다. AIDS에 감염된 환자의 치료에 있어서, 올리고뉴클레오티드 투여의 가장 효과적인 방법은 경구투여 또는 피하주사이다. 유방암과 같은 암은 피하주사를 통해서 치료되는 반면, 결장암은 올리고뉴클레오티드의 경구 또는 직장투여로 치료된다. 중추신경계의 질병 또는 장애는 환자의 척추나 뇌에 대한 올리고뉴클레오티의 운반을 위하여 포막 또는 심실을 통하여 치료된다. 올리고뉴클레오티드의 투여에 이어서, 그 환자는 질병의 상태와 관련된 증상의 경감에 대해 관찰된다. 그 후 치료를 위한 질병상태의 심각성 및 순용매 따라 (증가 또는 감소) 그 사용량이 조정된다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드를 바람직하게 투여하기 위해서 다른 일반적인 요법과 결합될 수 있다. 상기 뉴클레오티드는 AIDS에 걸린 환자의 치료를 위한 AZT, 궤양성 대장염과 같은 염증성 장애의 치료를 위한 설파살라진(sulfasalazine), 및 결장암의 치료를 위한 5-플루오로우라실 등을 포함하는 약물과 함께 투여될 수 있으나 여기에 한정되는 것은 아니다.

또한, 환자의 질병상태의 성공적인 치료를 위해서 투여 지속 요법이 바람직하다. 지속요법의 일부로써 올리고뉴클레오티드 투여의 빈도 및 사용량은 체중 kg 당 0.01㎍에서, 100g까지, 하루에 한번 또는 그 이상에서 매 몇 년에 한번까지 범위가 다양하다.

[실시예 21]

올리고뉴클레오티드의 심실내 투여

환자의 뇌에 대한 약물의 직접적인 운반을 위한 내심실의 약물 투여는 질병이 뇌에 감염된 환자의 치료에 바람직하다. 올리고뉴클레오티드 투여의 이러한 유형을 효과적이도록 하기 위해서, 실리콘 카테테르(catheter)가 환자뇌의 뇌실(ventricle)에 외과적으로 삽입되고, 복부에 외과적으로 이식된 피하주입 펌프(Medtronic Inc., Minneapolis, MN)에 연결된다 [Cancer Research, 44:1698(1984)]. 상기 펌프는 올리고뉴클레오티드를 투입하는데 사용되고 사용량 조절을 정확히 하며 내부적 프로그래밍 장치의 목적에 따른 사용량 계획의 범위를 정확하게 한다. 상기 펌프의 부유 능력은 18-20㎖이고 주입속도는 0.1㎖/h에서 1㎖/h의 범위이다. 매일에서 매달에 이르는 투여의 빈도에 의존하여 약물의 양이 체중 kg당 0.01㎍에서 100g까지 조절되고, 펌프의 보유고가 3-10주의 간격으로 다시 채워진다. 펌프의 재충진은 펌프의 자가 봉합 격벽(septum)의 단일 구멍을 통해서 이루어진다.

[실시예 22]

올리고뉴클레오티드의 포막내 투여

환자의 척추의 칼럼에 약물의 삽입을 위한 관부적 약물조절은 중추신경계의 질환을 앓고 있는 환자에게 바람직하다. 올리고뉴클레오티드는 조절의 이러한 경로를 효과적이도록 하기 위해 환자의 L3-4 요추의 내면에 실리콘 카테터가 외과적으로 주입되고, 이것은 상복부에 외과적으로 주입된 피하주입 펌프에 연결된다[The Annals of Pharmacotherapy, 27:912(1993) and Cancer, 41:1270(1993)] 상기 펌프는 올리고뉴클레오티드를 투입하는 데 사용되고 사용량 조절을 정확히 하며 내부적 프로그래밍 장치의 목적에 따른 사용량 계획의 범위를 정확하게 한다. 상기 펌프의 보유 능력은 18-20㎖이고 주입 속도는 0.1㎖/h에서 1㎖/h의 범위이다. 매일에서 매달에 이르는 투여의 빈도에 의존하여 약물의 양이 체중 kg당 0.01㎍에서 100g까지 조절되고, 펌프의 보유고가 3-10주의 간격으로 다시 채워진다. 펌프의 재충진은 펌프의 자가 봉합 격벽(septum)의 단일 경피 구멍을 통해서 이루어진다.

[실시예 23]

AIDS를 앓고 있는 환자는 실시예3 또는 실시예19에 의해 합성된 올리고뉴클레오티드 ISIS-5320으로 치료되고, TTGGGGTT(SEQ ID NO:17) 서열을 갖는다. 올리고뉴클레오티드의 체중량 1∼1000㎍/kg은 약학적으로 수용가능한 담체내에 있게 되고 유리체내로(intravitreally) 조절된다. 감염이 제거될 때까지 필요에 따라 치료가 반복된다.

Claims

SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 또는 SEQ ID NO: 5에 의하여 나타내어지고, 75% 이상의 뉴클레오시드 단위들이 Sp 또는 Rp 포스포로티오에이트 3'-5' 결합기에 의하여 연결된 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
SEQ ID NO: 6에 의하여 나타내어지고, 75% 이상의 뉴클레오시드 단위 들이 Sp 또는 Rp 포스포로티오에이트 3'-5' 결합기에 의하여 연결된 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
SEQ ID NO: 7에 의하여 나타내어지고, 75% 이상의 뉴클레오시드 단위 들이 Sp 또는 Rp 포스포로티오에이트 3'-5' 결합기에 의하여 연결된 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
SEQ ID NO: 8에 의하여 나타내어지고, 75% 이상의 뉴클레오시드 단위 들이 Sp 또는 Rp 포스포로티오에이트 3'-5' 결합기에 의하여 연결된 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
SEQ ID NO: 9에 의하여 나타내어지고, 75% 이상의 뉴클레오시드 단위 들이 Sp 또는 Rp 포스포로티오에이트 3'-5' 결합기에 의하여 연결된 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 또는 SEQ ID NO: 12에 의하여 나타내어지고, 75% 이상의 뉴클레오시드 단위들이 Sp 또는 Rp 포스포로티오에이트 3'-5' 결합기에 의하여 연결된 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
SEQ ID NO: 17에 의하여 나타내어지고, 75% 이상의 뉴클레오시드 단위들이 Sp 또는 Rp 포스포로티오에이트 3'-5' 결합기에 의하여 연결된 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.