MX2011002143A - Oligonucleotidos antisentido dirigidos contra el factor de crecimiento del tejido conectivo y usos de los mismos. - Google Patents

Oligonucleotidos antisentido dirigidos contra el factor de crecimiento del tejido conectivo y usos de los mismos.

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MX2011002143A
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Nicholas M Dean
J Gordon Foulkes
Niall O'donnell
C Frank Bennett
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Abstract

La presente invención se refiere a compuestos los cuales comprenden oligonucleótidos modificados capaces de inhibir la expresión del factor de crecimiento del tejido conectivo y composiciones que contienen los mismos así como también métodos para tratar trastornos hiperprolíficos y enfermedades fibróticas, y de reducir la cicatrización que resulta de la curación de heridas usando tales compuestos.

Description

OLIGONUCLEOTIDOS ANTISENTIDO DIRIGIDOS CONTRA EL FACTOR DE CRECIMIENTO DEL TEJIDO CONECTIVO Y USOS DE LOS MISMOS CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a nuevos oligonucleótidos antisentido (ASOs) útiles para tratar trastornos hiperprolificos y enfermedades fibróticas, y para reducir cicatrices que resultan de la curación de heridas.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La tecnología antisentido es emergente como un medio efectivo para reducir la expresión de productos de gen específicos y puede por lo tanto demostrar ser de forma inequívoca útil en un número de aplicaciones terapéuticas, diagnósticas y de investigación para la modulación de la expresión del factor de crecimiento del tejido conectivo (CTGF) (Véase Patente Estadounidense No. 6,965,025B2 por Gaarde et al . ) Un compuesto antisentido es un compuesto oligomérico que es capaz de sufrir hibridación a un ácido nucleico objetivo (por ejemplo, una molécula de ARNm objetivo) .
Compuestos antisentido, composiciones y métodos para modular la expresión del CTGF y para tratar enfermedades asociadas con la expresión del CTGF se describen en la Patente Estadounidense No. 6,965,025B2, mencionada anteriormente, incorporada en la presente por referencia. Sin embargo, permanece una necesidad de tales compuestos adicionales capaces de proporcionar inhibición intensificada de expresión y funciones del CTGF asi como también otras propiedades ventajosas.
En una modalidad, esta invención específicamente proporciona oligonucleótidos antisentido modificados preferidos para inhibir la expresión del CTGF. Estos se han demostrado por ser significantemente, e inesperadamente más potentes que los CTGF objetivos a ASOs descritos previamente .
El factor de crecimiento del tejido conectivo (CTGF; también conocido como ctgrofact, proteína secretada inducible de fibroblasto, fisp-12, N0V2, proteína 2 relacionada con la proteína de enlace al factor de crecimiento similar a insulina, IGFBP-rP2, IGFBP-8, HBGF-0.8, Hcs24, y ecogenína) es un miembro de la familia CNN (CTGF/CYR61/N0V) de proteínas modulares, nombrados por los primeros miembros de la familia identificados, factor de crecimiento del tejido conectivo, rico en cisteína (CYR61), y sobreexpresado en nefroblastoma (NOV) , pero la familia también incluye las proteínas ELM-1 (expresadas en células metastásicas bajas) , WISP-3 (proteína secretada inducida por Wnt-1), y COP-1 (WISP-2). Las proteínas de CCN se han encontrado por ser proteínas asociadas a la matriz extracelular secretadas, que regulan los procesos celulares tales como adhesión, migración, mitogénesis, diferenciación, supervivencia, angiogénesis, aterosclerosis, condrogénesis, cicatrización de heridas, tumorigénesis , y enfermedades fibróticas y vasculares como escleroderma (Lau and Lam, Exp. Cell Res., 1999, 248, 44-57). La proteína del factor de crecimiento del tejido conectivo se muestra por estimular la síntesis de ADN y promover la quimiotaxis de fibroblastos (Bradham et al., J. Cell Biol., 1991, 114, 1285-1294).
En muchos casos, se ha reportado un transcripto del CTGF de 2.4-kilobases único en estudios de expresión, aunque se han reportado transcriptos de 3.5 y 7-kilobases en células de glioblastoma . El factor de crecimiento del tejido conectivo es expresado en fibroblastos durante procesos de diferenciación normal que involucran producción y remodelación de matriz extracelular (ECM) , tal como embriogénesis y decidualización uterina después del implante. El factor de crecimiento del tejido conectivo también es frecuentemente sobreexpresado en trastornos fibróticos de la piel tales como esclerosis sistémica, esclerosis localizada en piel, queloides, tejido cicatrizante, fascitis eosinofílica, fascitis nodular y contractura de Dupuytren. El ARNm del factor de crecimiento del tejido conectivo o niveles de proteina son elevados en lesiones fibróticas de órganos y tejidos principales que incluyen el hígado, riñon, pulmón, sistema cardiovascular, páncreas, intestino, ojos y encía. En tumores mamarios, pancreáticos y fibrohistiocíticos caracterizados por significante participación del tejido conectivo, el factor de crecimiento del tejido conectivo es sobreexpresado en el compartimiento estromal. En muchos casos, la expresión del factor de crecimiento del tejido conectivo es probablemente espacialmente y temporalmente a factor beta de crecimiento de transformación de citocina profibrogénica (TGF-beta) (Moussad and Brigstock, Mol. Genet . Metab. , 2000, 71, 276-292) .
El factor de crecimiento del tejido conectivo ha sido mapeado a la región cromosomal humana 6q23.1, próxima al gen c-myb, y anormalidades cromosomales que involucran esta región han sido asociadas con tumores humanos, tales como tumor de Wilms (Martinerie et al., Oncogene, 1992, 7, 2529-2534).
Tumores con componentes vasculares y fibróticos significantes exhiben expresión incrementada del CTGF, y el CTGF puede estar involucrado en la patogénesis de tumores miofibroblásticos pediátricos. De 12 tumores pediátricos examinados, todos mostraron moderada a intensa expresión del CTGF en células tumorales y/o células endoteliales de la vasculatura asociada (Kasaragod et al., Pediatr. Dev. Pathol. , 2001, 4, 37-45) .
El ARNm del factor de crecimiento del tejido conectivo también es específicamente regulado ascendentemente en linfoblastos leucémicos humanos malignos de niños con leucemia linfoblástica aguda (ALL) (Vorwerk et al., Br. J. Cáncer, 2000, 83, 756-760) , y niveles tanto de ARNm como de proteína son regulados ascendentemente por TGF-beta en células de cáncer de mama humano Hs578T en una manera dependiente de la dosis, indicando que el CTGF es un factor neuroendocrino importante y un efector corriente abajo crítico de TGF-beta (Yang et al., J. Clin. Endocrinol. etab., 1998, 83, 2593-2596).
En un modelo de fibrosis pulmonar murina, un incremento en la expresión de ARNm del factor de crecimiento del tejido conectivo es también inducido por bleomicina, un agente fibrogenético pulmonar conocido (Lasky et al., Am. J. Physiol., 1998, 275, L365-371), así como también en células de lavado broncoalveolar de pacientes con fibrosis pulmonar idiopática y sarcoidosis pulmonar, en comparación con sujetos de control no fumadores sanos, indicando que el factor de crecimiento del tejido conectivo está involucrado en la respuesta fibroproliferativa a la lesión (Alien et al., Am. J. Respir. Cell Molí. Biol., 1999, 21, 693-700). De manera similar, en un modelo experimental de glomerulonefritis proliferativa, la expresión de ARNm del factor de crecimiento del tejido conectivo se incrementó fuertemente en lesiones proliferativas mesangiales y extracapilares y en áreas de fibrosis periglomérula . La sobre expresión del factor de crecimiento del tejido conectivo glomerular temprano coincide con una regulación ascendente sorprendente de proteínas TGF-beta, y las cinéticas de expresión del factor de crecimiento del tejido conectivo sorprendentemente sugiere un papel en la reparación glomérula, posiblemente corriente a bajo de TGF-beta en este modelo de lesión renal temporal (Ito et al., J. Am. Soc. Nephrol., 2001, 12, 472-484).
Descrito y reivindicado en la Patente Estadounidense No. 5,876,730 está un polipéptido aislado o sustancialmente puro caracterizado porque tiene una secuencia de aminoácido que corresponde a los aminoácidos carboxiterminal de una proteína del factor de crecimiento del tejido conectivo (CTGF) , en donde el polipéptido tiene una secuencia de aminoácido que pertenece a los residuos de aminoácido 247 a 248 del N-término del factor de crecimiento del tejido conectivo, una secuencia aislada de polinucleótido que codifica el polipéptido del factor de crecimiento del tejido conectivo, un vector de expresión recombinante el cual contiene el polinucleótido, una célula hospedera que contiene el vector de expresión, y una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de polipéptido del factor de crecimiento del tejido conectivo en un portador farmacéuticamente aceptable. Los oligonucleótidos antisentido son en general, descritos (Brigstock and Harding, 1999) .
Descritos y reivindicados en las Patentes Estadounidenses Nos. 5,783,187; 5,585,270; 6,232,064; 6,150,101; 6,069,006 y Publicación de PCT WO 00/35936 están un polinucleótido aislado que codifica el polipéptido del factor de crecimiento del tejido conectivo, vectores de expresión, células hospederas establemente transformadas o transíectadas con los vectores; un polinucleótido aislado que comprende secuencias de nucleótido reguladoras no traducidas al 5' aisladas corriente arriba del factor de crecimiento del tejido conectivo, en donde las secuencias de nucleótido regulador no traducidas comprenden una región de iniciación transduccional y transcripcional y en donde la secuencia es un elemento de respuesta de TGF-beta; un constructo de ácido nucleico aislado que comprende una secuencia reguladora no codificante aislada corriente arriba de un gen del factor de crecimiento del tejido conectivo (CTGF) , en donde la secuencia reguladora no codificante está operablemente asociada con una secuencia de ácido nucleico la cual expresa una proteina de interés o ARN antisentido, en donde la secuencia de ácido nucleico es heteróloga a la secuencia no codificante; y un fragmento de polipéptido del factor de crecimiento del tejido conectivo (CTGF) que tiene la capacidad para inducir la síntesis de ECM, síntesis de colágeno y/o diferenciación de miofibroblasto, que comprende una secuencia de aminoácido codificada por al menos el exón 2 o exón 3 del polipéptido. Además reivindicado está un método para identificar una composición la cual afecta la expresión del factor de crecimiento del tejido conectivo inducido por TGF-beta, y un método para diagnosticar un estado patológico en un sujeto sospechoso de tener una patología seleccionada del grupo que consiste de enfermedad fibrótica y aterosclerosis, el método comprende obtener una muestra sospechosa de contener el factor de crecimiento del tejido conectivo, con ello detectar una diferencia en el nivel del factor de crecimiento del tejido conectivo en la muestra del sujeto comparada con el nivel del factor de crecimiento del tejido conectivo en la muestra estándar normal es diagnóstico de una patología caracterizada por un trastorno proliferativo celular asociado con el factor de crecimiento del tejido conectivo en el sujeto. Además reivindicado está un método para aliviar un trastorno proliferativo celular asociado con el factor de crecimiento del tejido conectivo, que comprende administrar a un sujeto que tiene el trastorno, en el sitio del trastorno, una composición que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo o fragmento del mismo que se une al factor de crecimiento del tejido conectivo, en donde el anticuerpo o fragmento del mismo no se une a PDGF. Los oligonucleótidos antisentido son en general descritos (Grotendorst , 2000; Grotendorst and Bradham, 2001; Grotendorst and Bradham, 2000; Grotendorst and Bradham, 1996; Grotendorst and Bradham, 1998; Grotendorst and Bradham, 2000) .
Descrito y reivindicado en la Publicación de PCT WO 00/27868 está un polipéptido del factor de crecimiento del tejido conectivo sustancialmente puro o fragmentos funcionales de los mismos, una secuencia aislada de polinucleótido que codifica el polipéptido, la secuencia de polinucleótido en donde T puede también ser U, una secuencia complementaria de ácido nucleico a la secuencia de polinucleótido, y fragmentos de la secuencia que son al menos de 15 bases en longitud y que hibridizarán al ADN el cual codifica la secuencia de aminoácido de la proteina del factor de crecimiento del tejido conectivo bajo condiciones moderadas a altamente rigurosas. Además reivindicado está un vector de expresión que incluye el polinucleótido, una célula hospedera establemente transformada con el vector, un anticuerpo que se une al polipéptido, y un método para producir el polipéptido. Además reivindicado está un método para inhibir la expresión del factor de crecimiento del tejido conectivo en una célula que comprende poner en contacto la célula con un polinucleótido el cual se une a un ácido nucleico objetivo en la célula, en donde el polinucleótido inhibe la expresión del factor de crecimiento del tejido conectivo en la célula, en donde el polinucleótido es un polinucleótido antisentido, asi como también un kit para la detección de la expresión del factor de crecimiento del tejido conectivo que comprende medios portadores siendo formado en compartimentos para recibir uno o más contenedores, que comprende al menos un contenedor que contiene al menos un oligonucleótido antisentido que se une al factor de crecimiento del tejido conectivo (Schmidt et al. , 2000) .
Descrito y reivindicado en la Publicación de PCT O 00/13706 está un método para tratar o prevenir fibrosis, el método comprende administrar a, un sujeto en necesidad de una cantidad efectiva de un agente que modula, regula o inhibe la expresión o actividad del factor de crecimiento del tejido conectivo o fragmentos de los mismos, y en donde el agente es un anticuerpo, un oligonucleótido antisentido, o una molécula pequeña. El método se dirige al tratamiento de fibrosis renal y trastornos renales asociados, en particular, complicaciones asociadas con diabetes e hipertensión (Riser and Denichili, 2000).
Descrita y reivindicada en la Publicación de PCT WO 01/29217 está una molécula aislada de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácido seleccionada de un grupo que comprende NOV1, NOV2 (factor de crecimiento del tejido conectivo), y NOV3, una forma madura o variante de una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo, asi como también una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo asi como también formas variantes y maduras o fragmentos de los polipéptidos , y el complemento de la molécula de ácido nucleico. Los oligonucleótidos antisentido son en general descritos (Prayaga et al., 2001).
La formación de cicatriz hipertrófica, en particular, es un problema clínico principal en la resolución de quemaduras severas y puede dar origen a cicatrización exuberante que resulta en pérdida funcional permanente y el estigma de desfiguración. Anualmente, más de 1 millón de personas requieren tratamiento para quemaduras en los Estados ?nidos. La incidencia de cicatrización hipertrófica después de quemaduras es un resultado común que crea un problema de magnitud enorme. Por lo tanto, un inhibidor del CTGF tal como un oligonucleótido antisentido (ASO) debe ser altamente efectivo en prevenir la severidad de cicatrizaciones hipertróficas subsecuentes a quemaduras. Esta actividad podría ser evaluada aplicando ASO formulado tópicamente y monitoreando la severidad de la cicatriz desarrollada subsecuente a que ocurra la quemadura.
El CTGF puede ser un objetivo atractivo para modular la cicatrización hipertrófica por varias razones. Como un cofactor y mediador corriente abajo del TGF-ß? o TGF-ß2, el CTGF puede representar un objetivo más específico que el TGF-ß? o TGF-p2 para terapias moleculares dirigidas al gen destinadas a la cicatrización, particularmente puesto que el TGF-ß? o TGF-ßS tiene efectos pluripotentes no relacionados con la formación de cicatriz. Además, el CTGF puede tener funciones independientes del TGF-ß? o TGF-02 en el mantenimiento de un fenotipo fibrótico que podría ser descuidado por estrategias anti-TGF-ß? o TGF^2. Debido a avances en el entendimiento de los papeles del CTGF en el aumento de la fibrosis en sistemas de órganos múltiples y en enfermedades dermales crónicas tales como escleroderma, los papeles del CTGF en cicatrización aguda y curación de heridas permanece ampliamente en observación.
Actualmente, no existen agentes terapéuticos conocidos los cuales inhiban efectivamente la síntesis del factor de crecimiento del tejido conectivo y a la fecha, estrategias investigadas dirigidas a la modulación de la función del factor de crecimiento del tejido conectivo han involucrado el uso de butirato de sodio (NaB) , anticuerpos de bloqueo de función y oligonucleótidos antisentido.
Los factores de dieta se cree juegan un papel importante en tanto el desarrollo como prevención de cánceres humanos, que incluyen carcinoma de mama. El micronutriente de dieta NaB es un producto final principal para digestión de almidón y fibra de la dieta, y es un potente inhibidor de crecimiento que inicia la diferenciación celular de muchos tipos de células in vitro. El NaB ejerce sus efectos biológicos, en parte, como un inhibidor de desacetilasa histona en células epiteliales mamarias, induce la muerte celular apoptótica en células de cáncer de mama humano no responsables del estrógeno Hs578T, y pueden activar diferentes genes involucrados en la detención del ciclo celular dependiente del tipo de células. El NaB específicamente regula ascendentemente la expresión del factor de crecimiento del tejido conectivo de una manera dependiente de la dosis, estimulando un incremento en niveles tanto de ARNm como de proteina en ambas células mamarias cancerosas y no cancerosas (Tsubaki et al., J. Endocrinol . , 2001, 169, 97-110).
El TGF-beta tiene la capacidad única para estimular el crecimiento de fibroblastos normales en agar blando, una propiedad de células transformadas. El factor de crecimiento del tejido conectivo no puede inducir estos fibroblastos de riñon de ratón normal de crecimiento independiente del anclaje (NRK) , pero la síntesis y acción del factor de crecimiento del tejido conectivo son esenciales para la independencia de anclaje inducida por TGF-beta. Los anticuerpos al factor de crecimiento del tejido conectivo específicamente bloquean el crecimiento independiente del anclaje inducido por TGF, y fibroblastos de NRK transformado con un constructo que expresa el gen del factor de crecimiento del tejido conectivo gene en la orientación antisentido en donde no fue responsable a TGF-beta en el ensayo de crecimiento independiente del anclaje (Kothapalli et al., Cell Growth. Differ., 1997, 8, 61-68). Las células de NRK que expresan CTGF-antisentido se usaron también para mostrar que la síntesis de colágeno estimulada con TGF-beta es mediada por el factor de crecimiento del tejido conectivo, indicando que el factor de crecimiento del tejido conectivo puede ser un objetivo útil para terapias antifibróticas (Duncan et al., Faseb J. , 1999, 13, 1774-1786) .
La región no traducida al 3' (UTR) del ADNc del factor de crecimiento del tejido conectivo humano porta varias secuencias consenso para elementos reguladores. Cuando la 3' -UTR se fusionó corriente abajo de un gen reportero, se encontró actuar como un elemento represivo cis-actuante fuerte, y la 3' -UTR antisentido tiene un efecto similar, pero más fuerte. (Kubota et al., FEBS Lett., 1999, 450, 84-88). La comparación de la 3' -UTR del factor de crecimiento del tejido conectivo humano y de ratón reveló un segmento pequeño conservado de 91 bases. Esta región se amplificó por RT-PCR de fibroblastos de ratón NIH3T3 y usó para hacer un constructo de fusión quimérica para análisis de sus efectos represivos. La 3' -UTR del factor de crecimiento del tejido conectivo de ratón en ya sea la orientación sentido o antisentido, tiene un fuerte efecto represivo en la transcripción del gen reportero, indicando una independencia de orientación de este elemento regulador (Kondo et al., Biochem. Biophys. Res. Comraun . , 2000, 278, 119-124) .
Un oligonucleotido antisentido de fosforotioato, de 16 nucleótidos en longitud y dirigido al sitio de comienzo de inicio de traducción, se usó para inhibir la expresión del factor de crecimiento del tejido conectivo y suprime la proliferación y migración de células endoteliales vasculares de aorta bovina en cultivo (Shimo et al., J. Biochem. (Tokyo) , 1998, 124, 130-140). Este oligonucleótido antisentido se usó también para mostrar que el factor de crecimiento del tejido conectivo induce la apoptosis en células de cáncer de mama humano MCF-7 y que la apoptosis inducida por TGF-beta es mediada, en parte, por el factor de crecimiento del tejido conectivo (Hishikawa et al., J. Biol. Chem., 1999, 274, 37461-37466). El mismo oligonucleótido antisentido se encontró también por inhibir la activación mediada por TGF-beta de capsasa 3 y de este modo inhibe la inducción de apoptosis mediada por TGF-beta en células del músculo blando aórticas humanas (HASC) (Hishikawa et al., Eur. J. Pharmacol., 1999, 385, 287-290). Este oligonucleótido antisentido también se usó para bloquear la expresión del factor de crecimiento del tejido conectivo y demostrar que la apta presión en sangre regula ascendentemente la expresión del factor de crecimiento del tejido conectivo en células mesangiales, las cuales en cambio intensifican la producción de proteina ECM e inducen apoptosis, contribuyendo a la remodelación del mesangio y finalmente a glomeruloesclerosis (Hishikawa et al . , J. Biol. Chem. , 2001, 276, 16797-16803) .
Consecuentemente, permanece una amplia necesidad de sentido para agentes adicionales capaces de inhibir efectivamente la función del factor de crecimiento del tejido conectivo .
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Esta invención proporciona compuestos los cuales comprenden oligonucleótidos modificados que comprenden 12-30 nucleósidos ligados, preferiblemente que comprenden 20 o al menos 12 nucleósidos ligados, más preferiblemente al menos 14 nucleósidos ligados, los cuales son capaces de inhibir la expresión del factor del tejido conectivo. Composiciones farmacéuticas y otras que comprenden los compuestos antisentido de la invención también se proporcionan.
Además se proporcionan métodos para tratar un animal, particularmente un humano, que tiene una enfermedad o condición asociada con CTGF administrando una cantidad de tales compuestos efectiva para inhibir la expresión del CTGF, en donde la enfermedad o condición es un trastorno hiperprolifico, tal como cáncer y enfermedades fibróticas. Además se proporciona un método para reducir la cicatrización que resulta de curación de heridas administrando una cantidad de tales compuestos efectiva para inhibir la expresión del CTGF.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La FIGURA 1 muestra las regiones o segmentos objetivo en la secuencia genómica del CTGF, principalmente segmentos objetivo de exón, contra los cuales se hicieron oligonucleótidos antisentido a CTGF.
La FIGURA 2 muestra las regiones o segmentos objetivo en la secuencia de ARNm del CTGF contra las cuales se hicieron oligonucleótidos antisentido a CTGF.
La FIGURA 3 proporciona una representación gráfica de las pruebas de oligonucleótidos antisentido que se dirigen a secuencias de exón en la secuencia de ARNm del CTGF para inhibición de la expresión del CTGF.
La FIGURA 4 muestra las regiones o segmentos objetivo en la secuencia genómica del CTGF, principalmente segmentos objetivo de intrón, contra los cuales se hicieron oligonucleótidos antisentido a CTGF.
La FIGURA 5 muestra las regiones o segmentos objetivo en la secuencia de ARNm del CTGF contra los cuales se hicieron oligonucleótidos antisentido a CTGF.
La FIGURA 6 proporciona una representación gráfica del resultado de las pruebas de oligonucleótidos antisentido que se dirigen principalmente a secuencias de intrón en la secuencia de ARNm del CTGF para inhibición contra la expresión del CTGF.
La FIGURA 7 muestra los oligonucleótidos antisentido altamente activos contra CTGF y compara su actividad con aquella de dos oligonucleótidos antisentido previamente diseñados (ISIS 124238 e ISIS 124212) descritos en la Patente Estadounidense No. 6,965, 025 B2.
La Figura 7A que identifica los 8 oligonucleótidos antisentido que se dirigen al exón y la Figura 7B proporciona secuencias preferidas de los oligonucleótidos antisentido.
La FIGURA 8 proporciona una representación gráfica de la respuesta de dosis obtenida para las nueve secuencias antisentido principales novedosas altamente activas del CTGF humano para inhibir la expresión del CTGF en células endoteliales de vena umbilical humana cultivadas. La secuencia 141923 es un control negativo, y las Secuencias 124238 y 124212 son dos secuencias previamente diseñadas.
La FIGURA 9 proporciona una representación gráfica de los niveles de alanina aminotransferasa (ALT) (FIGURA 9A) y aspartato aminotransferasa (AST) (FIGURA 9B) de plasma en ratones después de cuatro semanas de tratamiento con 25 mg/kg o 50 mg/kg de oligonucleótido antisentido ISIS 412294 (SEC ID NO: 39), ISIS 412295 (SEC ID NO: 40), o ISIS 418899 (SEC ID NO: 166) . Los resultados muestran que los niveles de ALT y AST en plasma en ratones dosificados con 25 mg/kg o 50 mg/kg de ISIS 412294 (SEC ID NO: 39) o ISIS 412295 (SEC ID NO: 40), o dosificados con 25 mg/kg de ISIS 418899 (SEC ID NO: 166) fueron similares a los niveles en el grupo de control con salina (vehículo) ; sin embargo ratones dosificados con 50 mg/kg de ISIS 418899 (SEC ID NO: 166) mostraron niveles de ALT y AST significantemente incrementados, arriba de los valores observados en el grupo de control.
La FIGURA 10 proporciona una representación gráfica de los resultados después de cuatro semanas de tratamiento con oligonucleótidos antisentido que muestran que la ganancia de peso para el grupo tratado con 50 mg/kg de 412295 fue significantemente inferior que la ganancia de peso en el grupo de control.
La FIGURA 11 muestra que el tratamiento intradermal de heridas de piel en ratas con 3.0, 1.0, 0.3 o 0.1 mg de oligonucleótido antisentido CTGF resulta en una reducción estadísticamente significativa en la expresión de ARNm tanto del CTGF como CollA2 para todas las dosis. Estos resultados demuestran claramente que la inhibición de la expresión del CTGF con un oligonucleótido antisentido modificado 2' OE reducirá la deposición de colágeno en la piel.
La FIGURA 12 proporciona una representación gráfica que muestra los niveles significativos del oligonucleótido antisentido CTGF presentes hasta al menos 14 días después de la dosificación intradermal de 50 mg/ml (5 mg de dosis total) en conejos.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN En una modalidad, esta invención proporciona un compuesto el cual comprende un oligonucleótido modificado que consiste de 12-30 nucleósidos ligados, al menos una porción de secuencia de 12 nucleobases la cual está presente dentro de la región seleccionada de los nucleótidos 718-751, 1388-1423, 1457-1689, 2040-2069, 2120- 2147, 2728-2797, 2267-2301, 553-611, 1394-1423, 1469-1508, 1559-1605, 1659-1689, 2100-2129 y 1399-1423 de la SEC ID NO: 9.
En otra modalidad, esta invención proporciona un compuesto el cual comprende un oligonucleótido modificado que consiste de 12-30 nucleósidos ligados, al menos una porción de secuencia de 12 nucleobases la cual está presente dentro de la región seleccionada de los nucleótidos 2540-2559, 2568-2587, 2623-2647 y 2623-2642 de la SEC ID NO: 10.
En una modalidad, esta invención proporciona un compuesto el cual comprende un oligonucleótido modificado que comprende 12-30 nucleósidos ligados, al menos una porción de secuencia de 12 nucleobases la cual está presente dentro de las secuencias de nucleobases expuestas en las SEC ID NOs: 28, 30, 39, 40, 43, 44, 45, 50, 51, 52, 56, 78, 125 y 166.
En una modalidad preferida de la invención, el compuesto comprende 20 o al menos 12 nucleósidos ligados, más preferiblemente al menos 14 nucleósidos ligados, el cual está presente dentro de las secuencias de nucleobases expuestas en las SEC ID NOs: 28, 30, 39, 40, 43, 44, 45, 50, 51, 52, 56, 78, 125 y 166.
La selección de estas secuencias se determinó seleccionando resultados presentados en las Figuras 1 a 7, asi como también resultados de un estudio de respuesta de dosis en células endoteliales de la vena umbilical humana (HuVEC) (Figura 8) . Detalles y datos del experimento se proporcionan en el Ejemplo 8 en la Sección de Ejemplos abajo.
Las secuencias objetivo presentadas en las Figuras 1 a 6 incluyen secuencias objetivo tanto de intrón como exón. Una región objetivo es una región estructuralmente definida del ácido nucleico. Por ejemplo, una región objetivo puede abarcar una 3' UTR, una 5' UTR, un exón, un intrón, una región codificante, una región de inicio de traducción, región de terminación de traducción, u otra región de ácido nucleico definida. Dirigir incluye la determinación de al menos un segmento objetivo al cual un compuesto antisentido ibridiza, de manera que ocurre un efecto deseado. En esta modalidad, el efecto deseado es una reducción en los niveles de ácido nucleico objetivo de ARNm.
Secuencias múltiples con mayor actividad aparente que secuencias previamente diseñadas tales como la SEC ID 15 (Isis 124238), se identificaron en secuencias tanto exónicas como intrónicas. Un número de nuevos oligonucléotidos intrónicos (SEC NO. 125) y exónicos (SEC NOs . 28, 30, 40, 45, 52, 50 y 78) parecen ser significantemente más activos que otras secuencias.
Las SEC ID NOs. 39 y 40 se mostraron por ser inhibidores altamente efectivos de la expresión del CTGF en la selección ASO original para actividad (datos mostrados aquí). Para examinar además si esta área en el ARNm del CTGF representa una "mancha de calor" dirigida a ASOs, se designó una secuencia ASO adicional (SEC ID NO 166) , la cual es diseñada para hibridizar la secuencia solo corriente arriba de aquella dirigida por las SEC NOs. 39 y 40. Esta ASO (SEC ID NO. 166) también se encontró por ser un inhibidor altamente potente de la expresión de ARNm del CTGF, demostrando que esta sección del ARNm del CTGF es una región atractiva objetivo a inhibidores de ASO.
En una cierta modalidad el compuesto antisentido es complementario a una porción de la región del CTGF elegida como objetivo por oligonucleótidos activos los cuales se estiran de sitios objetivo 1396 hasta 1424. Este es el espacio de secuencia objetivo por Isis 418899, 412295 y 412294 (SEC ID NOs : 166, 40 y 39, respectivamente).
Esta invención también proporciona un compuesto el cual comprende un oligonucleótido modificado que comprende al menos 12, preferiblemente al menos 14, nucleósidos ligados, la secuencia de nucleobase la cual es una porción de una de la secuencia de nucleobases expuesta en las SEC ID NOs: 28, 30, 39, 40, 43, 44, 45, 50, 51, 52, 56, 78, 125 y 166.
Los compuestos antisentido descritos en la presente pueden comprender un oligonucleótido que tiene 12 a 30, 12 a 20, y preferiblemente 14 a 20 nucleósidos ligados.
En una modalidad de la invención, el oligonucleótido modificado es un oligonucleótido de hebra única o de hebra doble.
La presente invención emplea compuestos oligoméricos , particularmente oligonucleótidos antisentido, para uso en la modulación de la función de moléculas de ácido nucleico que codifican el factor de crecimiento del tejido conectivo, finalmente modulando la cantidad del factor de crecimiento del tejido conectivo producida. Esto se realiza proporcionando compuestos antisentido los cuales hibridizan específicamente con uno o más ácidos nucleicos que codifican el factor de crecimiento del tejido conectivo. Como se usa en la presente, los términos "ácido nucleico objetivo" y "ácido nucleico que codifica al factor de crecimiento del tejido conectivo" abarcan ADN que codifica al factor de crecimiento del tejido conectivo, ARN (que incluye pre-ARNm y ARNm) transcritos de tal ADN, y también ADNc derivado de tal ARN. La hibridización específica de un compuesto oligomérico con su ácido nucleico objetivo interfiere con la función normal del ácido nucleico. Esta modulación de la función de un ácido nucleico objetivo por compuestos los cuales específicamente hibridizan a este es en general referida como "antisentido". Las funciones de ADN a ser interferido incluyen replicación y transcripción. Las funciones de ARN a ser interferido incluyen todas las funciones vitales, tales como, por ejemplo, translocación del ARN al sitio de traducción de proteína, traducción de proteína del ARN, empalme del ARN para proporcionar una o más especies de ARNm, y actividad catalítica la cual puede ser acoplada en o facilitada por el ARN. El efecto total de tal interferencia con la función de ácido nucleico objetivo es la modulación de la expresión del factor de crecimiento del tejido conectivo. En el contexto de la presente invención, "modulación" significa ya sea un incremento (estimulación) o una reducción (inhibición) en la expresión de un gen. En el contexto de la presente invención, la inhibición es la forma preferida de modulación de expresión del gen y el ARNm es un objetivo preferido . Ácidos nucleicos objetivos, Regiones objetivo y Secuencias de Nucleótido Se prefiere elegir como objetivo ácidos nucleicos específicos para antisentido. "Dirigir" un compuesto antisentido a un ácido nucleico particular, en el contexto de esta invención, es un proceso de etapas múltiples.
Se entiende que la secuencia expuesta en cada una de las SEC ID NO en los Ejemplos contenidos aquí es independiente de cualquier modificación a una porción de azúcar, un enlace internucleósido, o una nucleobase. Como tal, compuestos antisentido definidos por una SEC ID NO pueden comprender, independientemente, una o más modificaciones a una porción de azúcar, un enlace internucleósido, o una nucleobase. Los compuestos antisentido descritos por el Número Isis (Isis No) indican una combinación de secuencia de nucleobase y porción.
En una modalidad, una región objetivo es una región estructuralmente definida del ácido nucleico. Por ejemplo, una región objetivo puede abarcar una 3' UTR, una 5' UTR, un exón, un intrón, una región codificante, una región de inicio de traducción, región de terminación de traducción, u otra región de ácido nucleico definida. Las regiones estructuralmente definidas para el ácido nucleico se pueden obtener por el número de acceso de las bases de datos de la secuencia tales como NCBI y tal información se incorpora en la presente por referencia. En otras modalidades, una región objetivo puede abarcar la secuencia de un sitio objetivo al 5' de un segmento objetivo dentro de la región objetivo al sitio objetivo al 3' de otro segmento objetivo dentro de la región objetivo.
Dirigir incluye la determinación de al menos un segmento objetivo al cual un compuesto antisentido hibridiza, de manera tal que ocurre un efecto deseado. En ciertas modalidades, el efecto deseado es una reducción en los niveles de ácido nucleico objetivo al ARNm. En otras modalidades, el efecto deseado es reducción de niveles de proteina codificada por el ácido nucleico objetivo o un cambio fenotipico asociado con el ácido nucleico objetivo.
Una región objetivo puede contener uno o más segmentos objetivo. Segmentos objetivo múltiples dentro de una región objetivo pueden ser traslapantes. Alternativamente, pueden no ser traslapantes. En una modalidad, segmentos objetivo dentro de una región objetivo se separan por no más de aproximadamente 300 nucleótidos. En otras modalidades, segmentos objetivo dentro de una región objetivo se separan por no más de aproximadamente, 250, 200, 150, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, o 10 nucleótidos en el ácido nucleico objetivo. En otra modalidad, segmentos objetivo dentro de una región objetivo se separan por no más de aproximadamente 5 nucleótidos en el ácido nucleico objetivo. En modalidades adicionales, segmentos objetivo son contiguos .
Segmentos objetivo adecuados se pueden encontrar dentro de una 5' UTR, una región codificante, una 3' UTR, un intrón, o un exón. Segmentos objetivo que contienen un codón de inicio o un codón de detección también son segmentos objetivo adecuados. Un segmento objetivo adecuado puede excluir específicamente una cierta región estructuralmente definida tal como el codón de inicio o codón de detección.
La determinación de segmentos objetivo adecuados puede incluir una comparación de la secuencia de un ácido nucleico objetivo a otras secuencias a través del genoma. Por ejemplo, el algoritmo BLAST puede ser usado para identificar regiones de similitud entre diferentes ácido nucleicos. Esta comparación puede prevenir la selección de secuencias de compuesto antisentido que puede hibridizar en una manera no específica a secuencias distintas de un ácido nucleico objetivo seleccionado (es decir, secuencias objetivo y no objetivo) .
Puede haber variación en actividad (por ejemplo, como se define por el porcentaje de reducción de niveles de ácido nucleico objetivo) de los compuestos antisentido dentro de una región objetivo activa. En una modalidad, reducciones en niveles de ARNm del CTGF son indicativas de inhibición de la expresión del CTGF. Reducciones en niveles de una proteina del CTGF también son indicativas de inhibición de la expresión de ARNm objetivo. Además, cambios fenotipicos son indicativos de inhibición de la expresión del CTGF. Por ejemplo, un incremento en medición del CTGF es indicativo de inhibición de la expresión del CTGF.
En detalle, el proceso de dirigir usualmente comienza con la identificación de una secuencia de ácido nucleico cuya función es modulada. Esto puede ser, por ejemplo, un gen celular (o ARNm transcrito del gen) cuya expresión está asociada con un estado de enfermedad o trastorno particular, una molécula de ácido nucleico de un gen infeccioso. En la presente invención, el objetivo es una molécula de ácido nucleico que codifica al factor de crecimiento del tejido conectivo. El proceso de dirigir también incluye determinación de un sitio o sitios dentro de este gen para que ocurra la interacción antisentido de manera que el efecto deseado, por ejemplo, detección o modulación de la expresión de la proteina resultará. Dentro del contexto de la presente invención, un sitio intragénico preferido es la región que abarca el codón de terminación o inicio de la traducción de la estructura lectora abierta (ORF) del gen. Puesto que, como se conoce en la técnica, el codón de inicio de la traducción es típicamente 5'-AUG (en moléculas de ARNm transcritas; 5'-ATG en la molécula de ADN correspondiente), el codón de inicio de la traducción también es referido como el "codón AUG", "el codón de inicio" o el "codón de inicio AUG" . Una mayoría de genes tiene un codón de inicio de traducción que tiene la secuencia de ARN 5'-GUG, 5'-UUG o 5'-CUG, y 5'-AUA, 5'-ACG y 5'-CUG se han mostrado por funcionar in vivo. De este modo, los términos "codón de inicio de la traducción" y "codón de partida" pueden abarcar muchas secuencias de codón, aún aunque el aminoácido iniciador en cada caso sea típicamente metionina (en eucariotas) o formilmetionina (en procariotas) . También se conoce en la técnica que genes eucarióticos y procarióticos pueden tener dos o más codones de partida alternativos, cualquiera de los cuales puede ser preferencialmente utilizado para inicio de la traducción en un tipo de célula particular o tejido, o bajo una serie particular de condiciones. En el contexto de la invención, "codón de partida" y "codón de inicio de la traducción" se refiere al codón o codones que son usados in vivo para iniciar la traducción de una molécula de ARNm transcrita de un gen que codifica al factor de crecimiento del tejido conectivo, con respecto de la(s) secuencia (s) de tales codones.
También se conoce en la técnica que un codón de terminación de la traducción (o "codón de detención") de un gen puede tener una de las tres secuencias, es decir, 5'-UAA, 5'-UAG y 5'-UGA (las secuencias de ADN correspondientes son 5'-TAA, 5'-TAG y 5'-TGA, respectivamente) . Los términos "región de codón de partida" y "región de codón de inicio de la traducción" se refieren a una porción de tal ARNm o gen que abarca desde aproximadamente 25 hasta aproximadamente 50 nucleótidos contiguos en cualquier dirección (es decir, 5' o 3') de un codón de inicio de la traducción. De manera similar, los términos "región de codón de detención" y "región de codón de terminación de la traducción" se refieren a una porción de tal ARNm o gen que abarca desde aproximadamente 25 a aproximadamente 50 nucleótidos contiguos en cualquier dirección (es decir, 5' o 3' ) de un codón de terminación de la traducción.
La estructura lectora abierta (ORF) o "región codificante, la cual se conoce en la técnica para referirse a la región entre el codón de inicio de la traducción y el codón de terminación de la traducción, es también una región la cual pude ser dirigida efectivamente. Otras regiones objetivo incluyen la región no traducida al 5' (5' UTR) , conocida en la técnica para referirse a la porción de un ARNm en la dirección 5' del codón de inicio de la traducción, y de este modo incluyendo nucleótidos entre el sitio de cubierta 5' y el codón de inicio de la traducción de un ARNm o nucleótidos correspondientes en el gen, y la región no traducida al 3' (3' UTR), conocida en la técnica por referirse a la porción de un ARNm en la dirección al 3' del codón de terminación de la traducción, y de este modo incluyendo nucleótidos entre el codón de terminación de la traducción y el extremo 3' de un ARNm o nucleótidos correspondientes del gen. La cubierta 5' de un ARNm comprende un residuo de guanosina N7-metilado unido al mayor residuo 5' del ARNm vía un enlace trifosfato 5' -5'. La región de cubierta al 5' de un ARNm se considera por incluir la estructura de cubierta al 5' misma asi como también los primeros 50 nucleótidos adyacentes a la cubierta. La región de cubierta al 5' puede también ser una región objetivo preferida .
Aunque algunos transcriptos de ARNm eucarióticos son directamente traducidos, muchos contienen una o más regiones, conocidas como "intrones", las cuales son ejercidas de un transcripto antes de ser traducidas. Las regiones restantes (y por lo tanto reducidas) son conocidas cono "exones" y son empalmadas en conjunto para formar una secuencia de ARN continua. Los sitios de empalme de ARNm, es decir, uniones intrón-exón, también pueden ser regiones objetivo preferidas, y son particularmente útiles en situaciones en donde el empalme aberrante está implicado en la enfermedad, o en donde una sobreproducción de un producto de empalme de ARN particular está implicada en la enfermedad. Las uniones de fusión aberrante debido a reacomodos o deleciones también son objetivos preferidos. Se ha encontrado también que intrones pueden también ser efectivos, y por lo tanto regiones objetivo preferidas, para compuestos dirigidos, por ejemplo, a ADN o pre-ARNm.
También se conoce en la técnica que transcriptos de ARN alternativos pueden ser producidos a partir de la misma región genómica de ADN. Estos transcriptos alternativos son en general conocidos como "variantes". Más específicamente, "variantes de pre-ARNm" son transcriptos producidos del mismo ADN genómico que difiere de otros transcriptos producidos a partir del mismo ADN genómico en ya sea su posición de inicio o detención y contienen regiones tanto intrónicas cono extrónicas .
Después de la escisión de una o más regiones de exón o intrón o porciones de las mismas durante el empalme, variantes pre-ARNm producen "variantes de ARNm" más pequeñas. Consecuentemente, variantes de ARNm son variantes pre-ARNm procesadas y cada variante pre-ARNm única debe siempre producir una variante de ARNm única como un resultado del empalme. Estas variantes de ARNm también son conocidas como "variantes de empalme alternativas". Si no ocurre empalme de la variante de pre-ARNm entonces la variante de pre-ARNm es idéntica a la variante de ARNm.
También se conoce en la técnica que se pueden producir variantes a través del uso de señales alternativas para iniciar o detener la transcripción y que los pre-ARNms y ARNms pueden poseer más de un codón de partida o codón de detención. Variantes que se originan de un pre-ARNm o ARNm que usan codones de partida alternativos se conocen como "variantes de inicio alternativas" de tal pre-ARNm o ARNm. Estos transcriptos que usan un codón de detención alternativo se conocen como "variantes de detención alternativa" de tal pre-ARNm o ARNm. Un tipo especifico de variante de detención alternativa es la "variante poliA" en la cual los transcriptos múltiples producen resultados de la selección alternativa de una de las "señales de detención poliA" por la maquinaria de transcripción, con ello produciendo transcriptos que terminan en sitios poliA únicos.
Compuestos antisentido son comúnmente usados como reactivos y diagnósticos de búsqueda. Por ejemplo, oligonucleótidos antisentido, los cuales son capaces de inhibir la expresión del gen con especificidad exquisita, son a menudo usados por aquellos de habilidad ordinaria para evitar la función de genes particulares. Compuestos antisentido también son usados, por ejemplo, para distinguir entre funciones de varios miembros de una trayectoria biológica. La modulación antisentido, por lo tanto, ha sido aprovechada para uso de investigación.
Para uso en kits y diagnósticos, los compuestos antisentido de la presente invención, ya sea solos o en combinación con otros compuestos antisentido o terapéuticos, pueden ser usados como herramientas en análisis diferenciales y/o combinatoriales para evitar patrones de expresión de una porción del complemento completo de genes expresados dentro de células y tejidos.
Los patrones de expresión dentro de células o tejidos tratados con uno o más compuestos antisentido son comparados para controlar células o tejidos no tratados con compuestos antisentido y los patrones producidos son analizados para determinar niveles diferenciales de la expresión del gen ya que pertenecen, por ejemplo, a asociación de enfermedad, trayectoria de señalización, localización celular, nivel de expresión, tamaño, estructura o función de los genes examinados. Estos análisis pueden ser realizados en células estimuladas o no estimuladas y en la presencia o ausencia de otros compuestos los cuales afectan los patrones de expresión.
Ejemplos de métodos de análisis de expresión de gen conocidos en la técnica incluyen arreglos o microarreglos de ADN (Brazma and Vilo, FEDS Lett., 2000, 480, 17-24; Cells, et al., FEBS Lett., 2000, 480, 2-16), SAGE (análisis serial de expresión de gen) (Madden, et al., Drug Discov. Today, 2000, 5, 415-425) , READS (amplificación de enzima de restricción de ADNcs digeridos) (Prashar and Weissman, Methods Enzymol., 1999, 303, 258-72), TOGA (análisis de expresión de gen total) (Sutcliffe, et al., Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. A., 2000, 97, 1976-81), arreglos de proteina y proteomicos (Cells, et al., FEBS Lett., 2000, 480, 2-16; Jungblut, et al., Electrophoresis, 1999, 20, 2100-10), secuenciamiento de etiqueta de secuencia expresada (EST) (Cells, et al., FEBS Lett., 2000, 480, 2-16; Larsson, et al., J. Biotechnol., 2000, 80, 143-57), huella de ARN sustractivo (SuRF) (Fuchs, et al., Anal. Biochem. , 2000, 286, 91-98; Larson, et al., Cytometry, 2000, 41, 203-208), clonación sustractiva, despliegue diferencial (DD) (Jurecic and Belmont, Curr. Opin. Microbiol., 2000, 3, 316-21), técnicas de hibridi zación genómica comparativa (Carulli, et al., J. Cell Biochem. Suppl., 1998, 31, 286-96), FISH (hibridización in situ fluorescente) (Going and Gusterson, Eur. J. Cáncer, 1999, 35, 1895-904) y métodos de espectrometría de masas (revisado en (To, Comb. Chem. High Throughput Screen, 2000, 3, 235-41) .
Compuestos Antisentido En el contexto de esta invención, el término "oligonucleótido" se refiere a un oligómero o polímero de ácido ribonucleico (RNA) o ácido desoxirribonucleico (DNA) o miméticos de los mismos. Este término incluye oligonucleótidos compuestos de nucleobases que se originan naturalmente, azúcares y enlaces internucleósidos covalentes (armazón) así como también oligonucleótidos que tienen porciones que no se originan naturalmente las cuales funcionan de manera similar. Tales oligonucleótidos modificados o sustituidos son a menudo preferidos sobre formas nativas debido a propiedades deseables tales como, por ejemplo, absorción celular intensificada, afinidad intensificada para ácido nucleico objetivo y estabilidad incrementada en la presencia de nucleasas .
Mientras los oligonucleótidos antisentido son una forma preferida de compuesto antisentido, la presente invención comprende otros compuestos antisentido oligoméricos, que incluyen pero no se limitan a miméticos de oligonucleótido .
Compuesto antisentido significa un compuesto oligomérico capaz de sufrir hibridización a un ácido nucleico objetivo a través de unión de hidrógeno. Compuestos antisentido incluyen, pero no se limitan a oligonucleótidos, oligonucleósidos , análogos de oligonucleótidos, miméticos de oligonucleótidos, oligonucleótidos antisentido, ARNsi, RNAi, ribozimas, oligonucleótidos de secuencias guia externas (EGS) (oligozimas) , y otros nucleótidos los cuales hibridizan al ácido nucleico objetivo y modulan su expresión.
En ciertas modalidades, un compuesto antisentido tiene una secuencia de nucleobase que, cuando se escribe en la dirección 5' a 3' , comprende el complemente inverso del segmento objetivo de un ácido nucleico objetivo al cual se dirige. En ciertas de tales modalidades, un oligonucleótido antisentido tiene una secuencia de nucleobase que, cuando se escribe en la dirección 5' a 3' , comprende el complemento inverso del segmento objetivo de un ácido nucleico objetivo al cual se dirige.
En ciertas modalidades, un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico es de 12 a 30 subunidades en longitud. En otras palabras, compuestos antisentido son de 12 a 30 subunidades ligadas. En otras modalidades, el compuesto antisentido es 8 a 80, 12 a 50, 15 a 30, 18 a 24, 19 a 22, o 20 subunidades ligadas. En ciertas de tales modalidades, los compuestos antisentido son 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, u 80 subunidades ligadas en longitud, o un intervalo definido por cualesquiera dos de los valores anteriores. En algunas modalidades el compuesto antisentido es un oligonucleótido antisentido, y las subunidades ligadas son nucleótidos.
En una modalidad preferida de la invención, el compuesto comprende 20 o al menos 14 nucleósidos ligados, en donde el oligonucleótido modificado tiene una secuencia la cual es 100% idéntica a una de las secuencias expuestas en las SEC ID NOs : 28, 30, 39, 40, 45, 52, 56, 78, 125 y 166. En otra modalidad preferida, el compuesto principal de interés tiene la secuencia expuesta en la SEC ID NO: 39 (ISIS 412294) .
En ciertas modalidades, un compuesto antisentido acortado o truncado dirigido a un ácido nucleico tiene una subunidad única suprimida del extremo 5' (truncación al 5'), o alternativamente del extremo 3' (truncación al 3') .
Un compuesto antisentido acortado o truncado dirigido a un ácido nucleico puede tener dos subunidades suprimidas del extremo 5' , o alternativamente puede tener dos subunidades suprimidas del extremo 3', del compuesto antisentido. Alternativamente, los nucleósidos suprimidos pueden ser dispersados a través del compuesto antisentido, por ejemplo, en un compuesto antisentido que tiene un nucleósido suprimido del extremo 5' y un nucleósido suprimido del extremo 3' .
Cuando una subunidad adicional única está presente en un compuesto antisentido alargado, la subunidad adicional puede ser localizada al extremo 5' o 3' del compuesto antisentido. Cuando dos o más subunidades adicionales están presentes, las unidades agregadas pueden ser adyacentes entre si, por ejemplo, en un compuesto antisentido que tiene dos subunidades agregadas al extremo 5' (adición al 5' ) , o alternativamente al extremo 3' (adición al 3'), del compuesto antisentido. Alternativamente, las subunidades agregadas pueden ser dispersadas a través del compuesto antisentido, por ejemplo, en un compuesto antisentido que tiene una subunidad agregadas al extremo 5' y una subunidad agregada al extremo 3 ' .
Es posible incrementar o reducir la longitud de un compuesto antisentido, tal como un oligonucleótido antisentido, y/o introducir bases desapareadas sin eliminar la actividad. Por ejemplo, en Woolf et al. (Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89:7305-7309, 1992), se probaron una serie de oligonucleótidos antisentido de 13-25 nucleobases en longitud por su habilidad para inducir desdoblamiento a un ARN objetivo en un modelo de inyección de oocito. Los oligonucleótidos antisentido de 25 nucleobases en longitud con 8 u 11 bases desapareadas cerca de los extremos de los oligonucleótidos antisentido fueron capaces de dirigir el desdoblamiento especifico del ARNm objetivo, ya sea a una extensión menor que los oligonucleótidos antisentido que no contienen desapareamientos. De manera similar, el desdoblamiento especifico objetivo se logró usando oligonucleótidos antisentido de 13 nucleobases, que incluyen aquellos con 1 o 3 desapareamientos.
Gautschi et al (J. Nati. Cáncer Inst. 93:463-471, March 2001) demostró la habilidad de un oligonucleótido que tiene 100% de complementariedad al ARNm bcl-2 y que tiene 3 desapareamientos al ARNm bcl-xL para reducir la expresión de tanto bcl-2 como bcl-xL in vitro e in vivo. Además, este oligonucleótido demostró potente actividad anti-tumoral in vivo.
Maher y Dolnick (Nuc. Acid. Res. 16:3341-3358, 1988) probaron una serie de oligonucleotidos antisentido de 14 nucleobases de uno tras otro, y oligonucleótidos antisentido de 28 y 42 nucleobases comprendidas de la secuencia de dos o tres de los oligonucleótidos antisentido en serie, respectivamente por su habilidad para detener la traducción de DHFR humano en un ensayo de reticulocito de conejo. Cada uno de los tres oligonucleótidos antisentido de 14 nucleobases solo fue capaz de inhibir la traducción, ya sea a un nivel más modesto que los oligonucleótidos antisentido de 28 o 42 nucleobases.
Bhanot et al. (PCT/US2007/068401) proporciona compuestos antisentido cortos, que incluyen compuestos que comprenden monómeros de alta afinidad químicamente modificados de 8 a 16 monómeros en longitud. Estos compuestos antisentido cortos se mostraron por ser útiles para reducir ácidos nucleicos objetivos y/o proteínas en células, tejidos y animales con potencia incrementada e índice terapéutico mejorado. Compuestos antisentido cortos fueron efectivos a dosis inferiores que compuestos antisentido descritos previamente, permitiendo una reducción en toxicidad y costo de tratamiento. Además, los compuestos antisentido cortos descritos tienen mayor potencial para dosificación oral.
Hibridizaciones Uno o más sitios objetivos han sido identificados, se eligen oligonucleótidos los cuales son suficientemente complementarios al objetivo, es decir, hibridizan suficientemente bien y con suficiente especificidad, para dar el efecto deseado.
En el contexto de esta invención, "hibridi zación" significa unión de hidrógeno, la cual puede ser de Watson-Crick, Hoogsteen o unión de hidrógeno Hoogsteen inversa, entre nucleósidos complementarios o bases de nucleótidos. Por ejemplo, adenina y timina son nucleobases complementarias las cuales se aparean a través de la formación de enlaces de hidrógeno.
En algunas modalidades, ocurre hibridi zación entre un compuesto antisentido descrito en la presente y un ácido nucleico. El mecanismo más común de hibridización involucra unión de hidrógeno entre nucleobases complementarias de las moléculas de ácido nucleico.
La hibridización puede ocurrir bajo condiciones variantes. Condiciones rigurosas son dependientes de la secuencia y se determinan por la composición y naturaleza de las moléculas de ácido nucleico a ser hibridi zadas .
Los métodos para determinar si una secuencia es específicamente hibridizable a un ácido nucleico objetivo son bien conocidos en la técnica. En una modalidad, los compuestos antisentido proporcionados en la presente son específicamente hibridizables con un ácido nucleico.
Complementariedad "Complementariedad", como se usa en la presente, se refiere a la capacidad para apareamiento preciso entre dos nucleótidos. Por ejemplo, si un nucleótido en una cierta posición de un oligonucleótido es capaz de unión de hidrógeno con un nucleótido a la misma posición de una molécula de ADN o ARN, entonces el oligonucleótido y el ADN o ARN son considerados por ser complementarios entre sí en tal posición. El oligonucleótido y el ADN o ARNA son complementarios entre sí cuando un número suficiente de posiciones correspondientes en cada molécula están ocupados por nucleótidos los cuales pueden unir hidrógeno entre sí. De este modo, "específicamente hibridi zable" y "complementariedad" son términos los cuales son usados para indicar un grado suficiente de complementariedad o apareamiento preciso de manera que ocurre enlace estable y específico entre el oligonucleótido y el ADN o ARN objetivo. Se entiende en la técnica que la secuencia de un compuesto antisentido no necesita ser 100% complementaria a aquella de su ácido nucleico objetivo a ser específicamente hibridizable . Un compuesto antisentido es específicamente hibridizable cuando la unión del compuesto a la molécula de ADN o ARN objetivo interfiere con la función normal del ADN o ARN objetivo para provocar una pérdida de utilidad, y existe un grado suficiente de complementariedad para evitar enlace no específico del compuesto antisentido a secuencias no objetivo bajo condiciones en las cuales se desea el enlace específico, es decir, bajo condiciones fisiológicas en el caso de ensayos in vivo o tratamiento terapéutico, y en el caso de ensayos in vitro, bajo condiciones en las cuales se realizan los ensayos.
Los compuestos antisentido y otros de la invención los cuales hibridizan al objetivo e inhiben la expresión del objetivo son identificados a través de la experimentación, y las secuencias de estos compuestos son identificadas aquí abajo como modalidades preferidas de la invención. Los sitios objetivos a los cuales estas secuencias preferidas son complementarias son aquí abajo referidos como "sitios activos" y son por lo tanto sitios preferidos para tratamiento. Por lo tanto, otra modalidad de la invención abarca compuestos los cuales hibridizan a estos sitios activos.
Un compuesto antisentido y un ácido nucleico objetivo son complementarios entre sí cuando un número suficiente de nucleobases del compuesto antisentido puede unir el hidrógeno con las nucleobases correspondientes del ácido nucleico objetivo, de manera que ocurrirá un efecto deseado (por ejemplo, la inhibición antisentido de un ácido nucleico objetivo, tal como un ácido nucleico del CTGF) .
Non-nucleobases complementarias entre un compuesto antisentido y un ácido nucleico del CTGF pueden ser toleradas siempre que el compuesto antisentido permanezca capaz de hibridizar específicamente a un ácido nucleico objetivo. Sin embargo, un compuesto antisentido puede hibridizar más de uno o más segmentos de un ácido nucleico del CTGF de manera que segmentos adyacentes o de intervención no están involucrados en el evento de hibridi zación (por ejemplo, una estructura de bucle, estructura de desapareamiento o hairpina) .
En algunas modalidades, los compuestos antisentido proporcionados en la presente son al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98% o al menos 99% complementarios a un ácido nucleico del CTGF. El porcentaje de complementariedad de un compuesto antisentido con un ácido nucleico objetivo se puede determinar usando métodos de rutina.
Por ejemplo, un compuesto antisentido en el cual 18 de 20 nucleobases del compuesto antisentido son complementarias con una región objetivo, y podrían por lo tanto hibridizar específicamente, podrían representar 90 porciento de complementariedad. En este ejemplo, las nucleobases no complementarias restantes pueden ser agrupadas o esparcidas con nucleobases complementarias y no necesitan ser contiguas entre sí o a nucleobases complementarias. Como tal, un compuesto antisentido el cual es de 18 nucleobases en longitud que tiene 4 (cuatro) nucleobases no complementarias las cuales son flanqueadas por dos regiones de completa complementariedad con el ácido nucleico objetivo podría tener 77.8% de complementariedad total con el ácido nucleico objetivo y podría de este modo caer dentro del alcance de la presente invención. Porcentaje de complementariedad de un compuesto antisentido con una región de un ácido nucleico objetivo se puede determinar rutinariamente usando programas BLAST (herramientas de búsqueda de alineación local básica) y programas PowerBLAST conocidos en la técnica (Altschul et al., J. Mol. Biol., 1990, 215, 403 410; Zhang y Madden, Genome Res., 1997, 7, 649 656) . El porcentaje de homología, identidad de secuencia o complementariedad, se puede determinar mediante, por ejemplo, el programa Gap (Wisconsin Sequence Analysis Package, Versión 8 por Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, Madison Wis.), usando ajustes por defecto, los cuales usan el algoritmo de Smith y Waterman (Adv. Appl. Math., 1981, 2, 482 489) .
En otras modalidades, los compuestos antisentido proporcionados en la presente son completamente complementarios (es decir, 100% complementario) a un ácido nucleico objetivo. Por ejemplo, el compuesto antisentido puede ser completamente complementario a un ácido nucleico del CTGF, o una región objetivo, o un segmento objetivo o secuencia objetivo del mismo. Como se usa en la presente, "completamente complementario" significa que cada nucleobase de un compuesto antisentido es capaz de apareamiento de base preciso con las nucleobases correspondientes de un ácido nucleico objetivo.
La ubicación de una nucleobase no complementaria puede estar en el extremo 5' y/o 3' del compuesto antisentido. Alternativamente, la nucleobase o nucleobases no complementarias pueden estar en una posición interna del compuesto antisentido. Cuando dos o más nucleobases no complementarias están presentes, pueden estar contiguas (es decir, ligadas) o no contiguas. En una modalidad, una nucleobase no complementaria se localiza en el segmento de ala de un oligonucleótido antisentido gapmer.
En una modalidad, compuestos antisentido de hasta 20 nucleobases en longitud comprenden no más de 4, no más de 3, no más de 2 o no más de 1 nucleobase ( s ) complementaria ( s ) con relación a un ácido nucleico objetivo, tal como un ácido nucleico del CTGF.
En otra modalidad, compuestos antisentido de hasta 30 nucleobases en longitud comprenden no más de 6, no más de 5, no más de 4, no más de 3, no más de 2 o no más de 1 nucleobase ( s ) no complementaria (s ) con relación a un ácido nucleico objetivo, tal como un ácido nucleico del CTGF.
Los compuestos antisentido proporcionados aquí también incluyen aquellos los cuales son complementarios con una porción de un ácido nucleico objetivo. Como se usa en la presente, "porción" se refiere a un número definido de nucleobases contiguas (es decir, ligados) dentro de una región o segmento de un ácido nucleico objetivo. Una "porción" puede también referirse a un número definido de nucleobases contiguas de un compuesto antisentido. En una modalidad, los compuestos antisentido son complementarios con al menos una porción de 8 nucleobases de un segmento objetivo. En otra modalidad, los compuestos antisentido son complementarios con al menos una porción de 12 nucleobases de un segmento objetivo. En aún otra modalidad, los compuestos antisentido son complementarios con al menos una porción de 15 nucleobases de un segmento objetivo. También contemplados están compuestos antisentido que son complementarios con al menos una porción de 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, o más nucleobases de un segmento objetivo, o un intervalo definido por cualesquiera dos de estos valores.
Identidad Los compuestos antisentido proporcionados en la presente también pueden tener un porcentaje de identidad definido con una secuencia de nucleotido particular, SEC ID NO, o compuesto representado por un número Isis especifico. Como se usa en la presente, un compuesto antisentido es idéntico a la secuencia descrita en la presente si tiene la misma capacidad de apareamiento de nucleobase. Por ejemplo, un ARN el cual contiene uracilo en lugar de timidina en una secuencia de ADN descrita podrá ser considerado idéntico a la secuencia de ADN puesto que tanto uracilo como timidina se aparean con adenina. Versiones acortadas y alargadas de los compuestos antisentido descritos en la presente así como también compuestos que tienen bases no idénticas con relación a los compuestos antisentido proporcionados en la presente también están contempladas. Las bases no idénticas pueden ser adyacentes entre si o dispersadas a través del compuesto antisentido. El porcentaje de identidad de un compuesto antisentido se calcula de conformidad con el número de bases que tienen idéntico apareamiento de base con relación a la secuencia a la cual está siendo comparada .
En una modalidad, los compuestos antisentido son al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idénticos a uno o más de los compuestos antisentido o SEC ID NOs, o una porción de los mismos, descritos en la presente .
Modificaciones En una cierta modalidad de la invención, modificaciones a compuestos antisentido abarcan sustituciones o cambios a enlaces internucleosidos, porciones de azúcar, o nucleobases.
En una modalidad de la invención el compuesto comprende al menos una modificación seleccionada del grupo que consiste de un enlace internucleósido modificado, un azúcar modificada, y una nucleobase modificada.
Aunque los oligonucleótidos antisentido que contienen una variedad de enlaces internucleosidos modificados pueden ser empleados, el enlace de nucleósido modificado actualmente preferido es un enlace de fosfotioato entre uno o más de los nucleósidos o en donde todos los enlaces de internucleósidos son enlaces internucleósidos de fosfotioato. En general, también se prefiere que el oligonucleótido antisentido contenga al menos uno y típicamente más de un azúcar modificado, en donde el azúcar es un azúcar bicíclico. Aunque varios azúcares modificados pueden ser empleados se prefiere actualmente emplear un azúcar de 2 ' -O-metoxietilo .
Además, al menos una y típicamente más de una de las nucleobases contenidas en el oligonucleótido antisentido será un nucleótido modificado tal como una 5-metilcitocina .
Un nucleósido es una combinación de base-azúcar. La porción de nucleobase (también conocida con base) del nucleósido es normalmente una porción de base heterocíclica . Los nucleótidos son nucleósidos que además incluyen un grupo fosfato covalentemente unido a la porción azúcar del nucleósido. Para aquellos nucleósidos que incluyen un azúcar pentafuranosilo, el grupo fosfato puede estar ligado a la porción 2', 3' o 5' hidroxilo del azúcar. Los oligonucleótidos se forman a través del enlace covalente de nucleósidos adyacentes entre sí, para formar un oligonucleótido polimérico lineal. Dentro de la estructura de oligonucleótido, los grupos fosfato son comúnmente referidos para formar los enlaces internucleósidos del oligonucleótido.
Modificaciones a compuestos antisentido abarcan sustituciones o cambios a enlaces internucleósidos, porciones de azúcar, o nucleobases. Compuestos antisentido modificados son a menudo preferidos sobre formas nativas debido a propiedades deseables tales como, por ejemplo, absorción celular intensificada, afinidad intensificada para ácido nucleico objetivo, estabilidad incrementada en la presencia de nucleasas, o actividad inhibidora incrementada .
Nucleósidos químicamente modificados también se pueden emplear para incrementar la afinidad de enlace de un oligonucleótido antisentido acortado o truncado por su ácido nucleico objetivo. Consecuentemente, resultados comparables se pueden obtener a menudo con compuestos antisentido más cortos que tienen tales nucleósidos químicamente modificados.
Enlaces de Internucleótidos Modificados El enlace de internucleósido que se origina naturalmente de RNA y DNA es un enlace fosfodiéster al 3' a 5' . Compuestos antisentido que tienen uno o más enlaces de internucleósidos modificados, es decir que no se originan naturalmente, son a menudo seleccionados sobre compuestos antisentido que tienen enlaces de internucleósidos que se originan naturalmente debido a las propiedades deseables tales como, por ejemplo, absorción celular intensificada, afinidad intensificada para ácidos nucleicos objetivos, y estabilidad incrementada en la presencia de nucleasas.
Oligonucleótidos que tienen enlaces de internucleósidos modificados incluyen enlaces de internucleósidos que retienen un átomo de fósforo asi como también enlaces de internucleósidos que no tienen un átomo de fósforo. Fósforos representativos que contienen enlaces de internucleósidos incluyen, pero no se limitan a, fosfodiésteres , fosfotriésteres , metilfosfonatos , fosforamidato, y fosforotioatos . Métodos para la preparación de enlaces que contienen fósforo y que no contienen fósforo son bien conocidos.
En una modalidad, compuestos antisentido dirigidos a un ácido nucleico del CTGF comprenden uno o más enlaces de internucleósidos modificados. En algunas modalidades, los enlaces de internucleósidos modificados son enlaces de fosforotioato . En otras modalidades, cada enlace de internucleósido de un compuesto antisentido es un enlace internucleósido de fosforotioato .
Como se conoce en la técnica, un nucleósido es una combinación de base-azúcar. La porción base del nucleósido es normalmente una base heterociclica . Las dos clases más comunes de tales bases heterociclicas son las purinas y pirimidinas. Los Nucleótidos son nucleósidos que además incluyen un grupo fosfato covalentemente ligado a la porción azúcar del nucleósido. Para aquellos nucleósidos que incluyen un azúcar pentofuranosilo , el grupo fosfato puede ser ligado a ya sea la porción hidroxilo al 2', 3' o 5' del azúcar. En la formación de oligonucleótidos , los grupos fosfato covalentemente enlazan nucleósidos adyacentes a otros para formar un compuesto polimérico lineal. A su vez los extremos respectivos de esta estructura polimérica lineal pueden ser además unidas para formar una estructura circular, sin embargo, las estructuras lineales abiertas son en general preferidas. Dentro de la estructura de oligonucleótido, los grupos fosfato son comúnmente referidos para formar el armazón internucleósido del oligonucleótido. El enlace o armazón normal de ARN y ADN es un enlace fosfodiéster al 3' a 5' .
Ejemplos específicos de compuestos antisentido preferidos útiles en esta invención incluyen oligonucleótidos que contienen armazones modificadas o enlaces de internucleósidos no naturales. Como se define en esta especificación, oligonucleótidos que tienen armazones modificadas incluyen aquellos que retienen un átomo de fósforo en el armazón y aquellos que no tienen un átomo de fósforo en el armazón. Para propósitos de esta especificación, y como algunas veces es referencia en la técnica, oligonucleótidos modificados que no tienen un átomo de fósforo en su armazón internucleósido también pueden ser considerados por ser oligonucleósidos .
Armazones de oligonucleótidos modificadas preferidas incluyen, por ejemplo, fosforotioatos , fosforotioatos quirales, fosforoditioatos , fosfotriésteres , aminoalquilfosfotri-ésteres , metil y otros alquil fosfonatos que incluyen 3' -alquilen fosfonatos, 5' -alquilen fosfonatos y fosfonatos quirales, fosfinatos, fosforamidatos que incluyen 3'-amino fosforamidato y aminoalquilfosforamidatos , tiono-fosforamidatos , tionoalquilfosfonatos , tionoalquilfosfo-triésteres , selenofosfatos y boranofosfatos que tienen enlaces normales al 3' -5', análogos ligados al 2 ' - ' de estos, y aquellos que tienen polaridad invertida en donde uno o más enlaces internucleót idos son un enlace en 3 ' a 3 ' , 5 ' a 5 ' o 2 ' a 2'. Oligonucleótidos preferidos que tienen polaridad invertida comprenden un enlace único 3' a 3' en el enlace más internucleótido al 3' es decir, un residuo de nucleósido invertido único el cual puede ser abásico (la nucleobase se pierde o tiene un grupo hidroxilo en lugar del mismo) . Varias sales, sales combinadas y formas de ácido libre también están incluidas.
Patentes Estadounidenses Representativas que muestran la preparación de los enlaces que contiene fósforo anteriores incluyen, pero no se limitan a, Patentes Estadounidenses Nos . : 3, 687, 808; 4, 469, 863; 4, 476, 301; 5, 023, 243; 5,177, 196; 5, 188, 897; 5, 264, 423; 5, 276, 019; 5, 278, 302; 5, 286, 717; 5, 321, 131; 5,399, 676; 5,405, 939; 5, 453, 496; 5, 455, 233; 5, 466, 677; 5, 476, 925; 5, 519, 126; 5, 536, 821; 5, 541,306; 5, 550, 111; 5, 563, 253; 5, 5 1, 799; 5,587, 361; 5, 194, 599; 5, 565, 555; 5, 527, 899; 5,721,218; 5, 672, 697 y 5,625,050, algunas de los cuales son de su propiedad con esta solicitud, y cada una de las cuales se incorpora en la presente por referencia.
Armazones de oligonucleótido modificadas preferidas que no incluyen un átomo de fósforo ahí tienen armazones que se forman por alquilo o cicloalquilo de cadena corta, heteroátomo combinado y enlaces de internucleósidos de alquilo o cicloalquilo, o uno o más enlaces de internucleósidos heteroatómicos o heterociclicos de cadena corta. Estos incluyen aquellos que tienen enlaces morfolino (formados en parte de la porción de azúcar de un nucleósido) ; armazones de siloxano; armazones de sulfuro, sulfóxido y sulfona; armazones de formacetilo y tioformacetilo; armazones de metilenformacetilo y tioformacetilo; armazones de riboacetilo; armazones que contienen alqueno; armazones de sulfamato; armazones de metilenimino y metilenhidrazino; armazones de sulfonato y sulfonamida; armazones de amida; y otras que tienen partes componentes combinadas de N, 0, S y CH2.
Patentes Estadounidenses Representativas que muestran la preparación de los oligonucleósidos anteriores incluyen, pero no se limitan a, Patentes Estadounidenses Nos . : 5 , 034, 506; 5, 166, 315; 5, 185,444; 5, 214, 134; 5,216, 141; 5, 235, 033; 5, 264, 562; 5, 264, 564; 5, 405, 938; 5, 434, 257; 5,466, 677; 5, 470, 967 ; 5, 489, 677; 5, 541, 307; 5, 561,225; 5, 596, 086; 5, 602, 240; 5, 610,289; 5, 602, 240; 5, 608, 046; 5, 610,289; 5, 618, 704; 5, 623, 070; 5, 663, 312; 5, 633, 360; 5, 677, 437; 5, 792, 608; 5,646,269 y 5, 677, 439, algunas de los cuales son de su propiedad con esta solicitud, y cada una de las cuales se incorpora en la presente por referencia.
En otros miméticos de oligonucleótido preferido, tanto el azúcar como el enlace de internucleósido , es decir, el armazón, de las unidades de nucleótidos son reemplazados con nuevos grupos. Las unidades base se mantienen para hibridi zación con un compuesto dirigido al ácido nucleico apropiado. Uno de tal compuesto oligomérico, un mimético de oligonucleótido que ha sido mostrado por tener excelentes propiedades de hibridación, es referido como un ácido nucleico peptidico (PNA) . En compuestos de PNA, el armazón de azúcar de un oligonucleótido se reemplaza con un armazón que contiene amida, en particular un armazón de aminoetilglicina . Las nucleobases son retenidas y son unidas directamente o indirectamente a átomos de nitrógeno aza de la porción amida del armazón. Patentes Estadounidenses Representativas que muestran la preparación de compuestos de PNA incluyen, pero no se limitan a, Patentes Estadounidenses Nos.: 5,539,082; 5,714,331; y 5,719,262, cada una de las cuales se incorpora en la presente por referencia. Enseñanzas adicionales de compuestos de PNA se pueden encontrar en Nielsen et al., Science, 1991, 254, 1497-1500.
Modalidades más preferidas de la invención son oligonucleótidos con armazones de fosforotioato y oligonucleósidos con armazones de heteroátomos , y en particular -CH2-NH-0-CH2- , -CH2-N ( CH3 ) -0-CH2- [conocidos como armazón de metileno (metilimino) o MMI ] , -CH2-0-N (CH3) -CH2- , -CH2-N (CH3) --N (CH3) -CH2- y -O-N (CH3 ) -CH2-CH2- [en donde el armazón de fosfodiéster nativo se representa como -O-P-O-CH2-] de la Patente Estadounidense referenciada anteriormente No. 5,489,677, y los armazones amida de la Patente Estadounidense referenciada anteriormente No. 5,602,240. También son preferidos oligonucleótidos que tienen estructuras de armazón de morfolino de la Patente Estadounidense referenciada anteriormente No. 5, 034, 506.
Porciones de Azúcar Modificadas Oligonucleótidos modificados también pueden contener una o más porciones de azúcar sustituidas. Por ejemplo, el anillo de azúcar furanosilo puede ser modificado en un número de formas que incluyen sustitución con un grupo sustituyente, puenteado para formar un ácido nucleico biciclico "BNA2 y sustitución del ' -O con un heteroátomo tal como S o N(R) como se describe en la Patente Estadounidense No.: 7, 399, 845 por Seth et al., con ello incorporada por referencia en la presente en su totalidad. Otros ejemplos de BNAs se describen en la Solicitud de Patente Internacional publicada No. WO 2007/146511, con ello incorporada por referencia en la presente en su totalidad.
Compuestos antisentido de la invención pueden contener opcionalmente uno o más nucleótidos que tienen porciones de azúcar modificadas. Las modificaciones de azúcar pueden impartir estabilidad de nucleasa, afinidad de enlace o algunas otras propiedades biológicas benéficas a los compuestos antisentido. El anillo de azúcar furanosilo de un nucleósido puede ser modificado en un número de formas que incluyen, pero no se limitan a: adición de un grupo sustituyente , particularmente en la posición 2'; puenteo de dos átomos del anillo no gemínales para formar un ácido nucleico bicíclico (BNA) ; y sustitución de un átomo o grupo tal como -S-, -N(R)- o -C(R1) (R2) para el oxígeno del anillo en la posición 4'. Azúcares modificados incluyen, pero no se limitan a: azúcares sustituidos, especialmente azúcares sustituidos al 2' que tienen un grupo sustituyente 2'-F, 2'-OCH2 (2'-OMe) o 2 ' -O (CH2 ) 2-OCH3 ( 2 ' -O-metoxietilo o 2'-M0E); y azúcares modificados bicíclicos (BNAs), que tienen un puente al ' - (CH2) n-O-2 ' , en donde n=l o n=2. Métodos para las preparaciones de azúcares modificados son bien conocidos por aquellos de habilidad en la técnica.
En ciertas modalidades, un nucleósido 2'-modificado tiene una porción de azúcar bicíclico. En ciertas de tales modalidades, la porción de azúcar bicíclico es un azúcar D en la configuración alfa. En ciertas de tales modalidades, la porción de azúcar bicíclico es un azúcar D en la configuración beta. En ciertas de tales modalidades, la porción de azúcar bicíclico es un azúcar L en la configuración alfa. En ciertas de tales modalidades, la porción de azúcar bicíclico es un azúcar L en la configuración beta.
En ciertas modalidades, la porción de azúcar bicíclico comprende un grupo puente entre los átomos de carbono 2' y 4'. En ciertas de tales modalidades, el grupo puente comprende de 1 a 8 grupos biradicales ligados. En ciertas modalidades, la porción de azúcar bicíclico comprende de 1 a 4 grupos biradicales ligados. En ciertas modalidades, la porción de azúcar bicíclico comprende 2 o 3 grupos biradicales ligados. En ciertas modalidades, la porción de azúcar bicíclico comprende 2 grupos biradicales ligados. En ciertas modalidades, un grupo biradical ligado se selecciona de -O-, -S-, -N(R1)-, -C(R1) (R2)-, C (Rl) =C (Rl) -, -C(R1)=N-, -C(=NR1)-, -Si ( Rl ) ( R2 ) - , -S(=0)2-, -S(=0)-, -C(=0)- y -C(=S)-; en donde cada Rl y R2 es, independientemente, H, hidroxilo, alquilo C1-C12, alquilo C1-C12 sustituido, alquenilo C2-C12, alquenilo C2-C12 sustituido, alquinilo C2-C12, alquinilo C2-C12 sustituido, arilo C5-C20, arilo C5-C20 sustituido, un radical heterociclo, un radical heterociclo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, radical aliciclico C5-C7, radical aliciclico C6-C7 sustituido, halógeno, oxi (-0-) sustituido, amino, amino sustituido, azido, carboxilo, carboxilo sustituido, acilo, acilo sustituido, CN, tiol, tiol sustituido, sulfonilo (S(=0)2-H), sulfonilo sustituido, sulfoxi (S(=0)-H) o sulfoxi sustituido; y cada grupo sustituyente es, independientemente, halógeno, alquilo C1-C12, alquilo C1-C12 sustituido, alquenilo C2-C12, alquenilo C2-C12 sustituido, alquinilo C2-C12, alquinilo C2-C12 sustituido, amino, amino sustituido, acilo, acilo sustituido, aminoalquilo C1-C12, aminoalcoxi C1-C12, aminoalquilo C1-C12 sustituido, aminoalcoxi C1-C12 sustituido o un grupo protector.
En algunas modalidades, la porción de azúcar biciclico es puenteada entre los átomos de carbono 2' y 4' con un grupo biradical seleccionado de -0-(CH2)p-, -0-CH2-, -0-CH2CH2-, -0-CH (alquilo) -, -NH-(CH2)P-, -N ( alquilo )-( CH2 ) p-, -O-CH(alquilo) -, -( CH ( alquilo ))-( CH2 ) P- , -NH-O- (CH2 ) P- , -N (alquilo) -O- (CH2) P-, o -O-N (alquilo) - (CH2) P-, en donde p es 1, 2, 3, 4 o 5 y cada grupo alquilo puede ser sustituido adicionalmente . En ciertas modalidades, p es 1, 2 ó 3.
En un aspecto, cada uno de los puentes es, independientemente, [C (Rl ) (R2 ) ] n-, - [C (Rl ) ( R2 ) ] n-O- , -C (R1R2) -N (Rl) -O- o C ( R1R2 ) -0-N ( Rl ) - . En otro aspecto, cada uno de los puentes es, independientemente, 4' - (CH2) 3-2' , 4'-(CH2)2-2', 4'-CH2-0-2', 4' - (CH2) 2-0-2' , 4 ' -CH2-0-N ( Rl ) -2 ' y 4 ' -CH2-N ( Rl ) -0-2 ' - en donde cada Rl es, independientemente, H, un grupo protector o alquilo Ci-Ci2.
En nucleótidos que tienen porciones de azúcar modificadas, las porciones de núcleobase (naturales, modificadas o una combinación de las mismas) se mantienen para hibridi zación con un ácido nucleico objetivo apropiado .
En una modalidad, compuestos antisentido dirigidos a un ácido nucleico comprenden uno o más nucleótidos que tienen porciones de azúcar modificadas. En una modalidad preferida, la porción de azúcar modificada es 2'- 0E. En otras modalidades, los nucleótidos modificados 2'-M0E son arreglados en una porción de gapmer.
Oligonucleót idos actualmente preferidos comprenden uno de los siguientes en la posición 2' : OH; F; 0-, S-, o N-alquilo; 0-, S-, o N-alquenilo; 0-, S- o N-alquinilo; o O-alquil-0-alquilo, en donde el alquilo, alquenilo y alquinilo pueden ser alquilo Ci a Cío o alquenilo y alquinilo C2 a Cío sustituido o insustituido . Particularmente preferidos son 0[(CH2)n0]n, CH3, 0(CH2)n0CH3, 0(CH2)nNH2, 0(CH2)nCH3, 0(CH2)nONH2, y 0 ( CH2 ) n0N [ ( CH2 ) nCH3 ) ] 2 , en donde n y m son de 1 a aproximadamente 10. Otros oligonucleót idos preferidos comprenden uno de los siguientes en la posición 2': alquilo inferior Ci a Cío, alquilo inferior sustituido, alquenilo, alquinilo, alcarilo, aralquilo, O-alcarilo u O-aralquilo, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, SOCH3, S02CH3, ON02, N02, N3, NH2, heterocicloalquilo, heterocicloalcarilo, aminoalquilamino , polialquilamino, sililo sustituido, un grupo desdoblante de ARN, un grupo reportero, un intercalador , un grupo para mejorar las propiedades farmacocinéticas de un oligonucleótido, o un grupo para mejorar las propiedades farmacodinámicas de un oligonucleótido, y otros sustituyentes que tienen propiedades similares. Una modificación preferida incluye 2 ' -metoxietoxi (2'-0-CH2CH2OCH3, también conocido como 2 ' -O- (2-metoxietilo) o 2'-MOE) (Martin et al., Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504) es decir, un grupo alcoxialcoxi . Una modificación preferida adicional incluye 2 ' -dimetilaminooxietoxi , es decir, un grupo O (CH2) 2ON (CH3) 2, también conocido como 2'-DMAOE, y 2'-dimetilaminoetoxietcxi (también conocido en la técnica como 2' -O-dimetilaminoetcxietilo o 2 ' -DMAEOE) , es decir, 2'-0--CH2—0-CH2 -N(CH2)2. Una modificación preferida adicional incluye ácido nucleico biciclico (también referido como ácidos nucleicos bloqueados (LNAs) ) en el cual el grupo 2'-hidroxilo está ligado al átomo de carbono 3' o 4' del anillo azúcar con ello formando una porción de azúcar biciclico. El enlace es preferiblemente un grupo metileno (-CH2-)n que puentea el átomo de oxigeno al 2 ' y el átomo de carbono al 4' en donde n es 1 ó 2 que incluye a-L-Metilenoxi ( ' -CH2-0-2' ) BNA, ß-D-Metilenoxi ( ' -CH2-0-2' ) BNA y Etilenoxi ( 4 ' - (CH2 ) 2-0-2 ' ) BNA. Azúcares modificados biciclicos también incluyen ( 6' S) -6' metil BNA, Aminooxi (4' -CH2-0- (R) -2' ) BNA, Oxiamino ( 4 ' -CH2-N (R) -0-2 ' ) BNA en donde, R es, independientemente, H, un grupo protector, o alquilo C1-C12. LNAs también forman duplos con ADN, ARN o LNA complementario con altas afinidades térmicas. El espectro de dicroismo circular (CD) muestra que los duplos que involucran LNA completamente modificado (esp. LNA:ARN) estructuralmente se parecen a un duplo de forma-A ANR:ARN. La examinación por resonancia magnética nuclear (NMR) de un duplo LNA: ADN confirmó la conformación 3'-endo de un monómero de LNA. El reconocimiento de ADN de doble hebra también ha demostrado sugerir invasión de hebra por LNA. Estudios de secuencias desapareadas muestran que los LNAs obedecen las reglas de apareamiento de base atson-Crick con selectividad en general mejorada comparada con las hebras de referencia no modificadas correspondientes .
Los LNAs en los cuales el grupo 2'-hidroxilo está ligado al átomo de carbono 4' del anillo azúcar de este modo forman un enlace 2'-C, 4 ' -C-oximetileno de este modo formando una porción de azúcar biciclico. El enlace puede ser un grupo metileno (-CH2-)n que puentea el átomo de oxigeno 2' y el átomo de carbono 4' en donde n es 1 ó 2 (Singh et al., Chem. Commun., 1998, 4, 455-456). LNA y análogos de LNA exhiben estabilidades térmicas dúplex muy altas de ADN y ARN complementario (Tm=+3 a +10 °C) , estabilidad hacia la degradación 3 ' -exonucleolitica y buenas propiedades de solubilidad. Otros grupos puente preferidos incluyen el puente 2 ' -desoxi-2 ' -CH2OCH2-4 ' . Los LNAs y preparación de los mismos se describen en las Solicitudes de Patente Internacional publicadas Nos. O 98/39352 y WO 99/14226.
Otras modificaciones preferidas incluyen 2'-metoxi (2'-0-CH3), 2' -aminopropoxi (2' -OCH2CH2CH2NH2 ) , 2'-alilo (2'-CH2-CH=CH2), 2'-0-alilo ( 2 ' -0-CH2-CH=CH2 ) y 2'-fluoro (2'-F) . La modificación 2'- puede estar en la posición arabino (arriba) o posición ribo (abajo). Una modificación 2'-arabino preferida es 2'-F. También se pueden hacer modificaciones similares a otras posiciones en el oligonucleotido, particularmente la posición 3' del azúcar en el nucleótido terminal 3' o en los oligonucleot idos 2'- 5' ligados y la posición 5' del nucleótido terminal 5' . Los oligonucleótidos también pueden tener miméticos o sustitutos de azúcar (algunas veces referidos como análogos de ADN) tales como porciones de ciclobutilo en lugar del azúcar pentofuranosilo . Patentes Estadounidenses Representativas que muestran la preparación de tales estructuras modificadas de azúcar incluyen, pero no se limitan a, Patentes Estadounidenses Nos.: 4,981,957; 5,118,800; 5,319,080; 5,359,044; 5,393,878; 5,446,137; 5,466,786; 5,514,785; 5,519,134; 5,567,811; 5,576,427; 5,591,722; 5,597,909; 5,610,300; 5,627,053; 5,639,873; 5,646,265; 5,658,873; 5,670,633; 5,792,747; y 5,700,920, algunas de las cuales son de su propiedad con la presente solicitud, y cada una de las cuales se incorpora en la presente por referencia en su totalidad. En ciertas modalidades, los nucleósidos son modificados por recolocación del anillo ribosilo con un sistema de anillo sustituto tal como un anillo morfolino, un anillo ciclohexenilo, un anillo ciclohexilo o un anillo tetrahidropiranilo tal como uno que tiene uno de la fórmula : Muchos otros sistemas de anillo sustitutos de azúcar biciclo y triciclo también son conocidos en la técnica, que pueden ser usados para modificar nucleósidos para incorporación en compuestos antisentido (véase por ejemplo el articulo revisado: Leumann, Christian J. , ) . Tales sistemas de anillo pueden sufrir varias sustituciones adicionales para intensificar la actividad.
En una modalidad de la invención, el compuesto comprende al menos un nucleósido modificado por tetrahidropirano en donde un anillo de tetrahidropirano reemplaza el anillo de furanosa.
En otra modalidad de la invención, en donde cada uno de al menos un nucleósido modificado por tetrahidropirano tiene la estructura: en donde Bx es una porción de base heterociclica opcionalmente protegida.
Nucleobases Modificadas Los oligonucleótidos pueden incluir también modificaciones o sustituciones de nucleobases (a menudo referidas en la técnica simplemente como "base") . Las modificaciones o sustituciones de núcleos base son estructuralmente distinguibles de, aún funcionalmente intercambiables con, nucleobases que se originan naturalmente o sintéticas no modificadas. Ambas nucleobases naturales y modificadas son capaces de participar en la unión de hidrógeno. Tales modificaciones de nucleobase pueden impartir estabilidad de nucleasa, afinidad de enlace o alguna otra propiedad biológica benéfica a compuestos antisentido. Nucleobases modificadas incluyen nucleobases sintéticas y naturales tales como, por ejemplo, 5-metilcitocina (5-me-C). Ciertas sustituciones de nucleobase, que incluyen sustituciones de 5-metilcitocina , son particularmente útiles para incrementar la afinidad de enlace de un compuesto antisentido para un ácido nucleico objetivo. Por ejemplo, sustituciones de 5-metilcitocina se han mostrado por incrementar la estabilidad doble del ácido nucleico por 0.6-1.2°C (Sanghvi, Y. S., Crooke, S. T. and Lebleu, B., eds . , Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Ratón, 1993, pp. 276-278).
Nucleobases no modificadas adicionales incluyen 5-hidroximetil citocina, xantina, hipoxantina, 2-aminoadenina , 6-metil y otros derivados alquilo de adenina y guanina, 2-propilo y otros derivados alquilo de adenina y guanina, 2-tiouracilo, 2-tiotimina y 2-tiocitocina , 5- halouracilo y citocina, 5-propinil ( -C=C-CH3 ) uracilo y citocina y otros derivados alquinilo de bases de pirimidina, ß-azo uracilo, citocina y timina, 5-uracilo (pseudouracilo) , 4-tiouracilo, 8-halo, 8-amino, 8-tiol, 8-tioalquilo, 8-hidroxilo y otras 8-adeninas y guaninas sustituidas, 5-halo particularmente 5-bromo, 5-trifluorometilo y otros 5-uracilos y citocinas sustituidos, 7-metilguanina y 7 -metiladenina , 2-F-adenina, 2-amino-adenina, 8-azaguanina y 8-azaadenina, 7-desazaguanina y 7-desazaadenina y 3-desazaguanina y 3-desazaadenina.
Porciones de base heterociclicas pueden incluir también aquellas en las cuales la base purina o pirimidina se reemplaza con otros heterociclos , por ejemplo 7-desaza-adenina, 7-desazaguanosina, 2-aminopiridina y 2-piridona. Nucleobases que son particularmente útiles para incrementar la afinidad de enlace de compuestos antisentido incluyen pirimidinas 5-susituidas , 6-azapirimidinas y N-2, N-6 y 0-6 purinas sustituidas, que incluyen 2 aminopropiladenina , 5-propiniluracilo y 5-propinilcitocina.
En una modalidad, compuestos antisentido dirigidos a un ácido nucleico del CTGF comprenden una o más nucleobases modificadas. En una modalidad adicional, oligonucleótidos antisentido de apertura amplia dirigidos a un ácido nucleico del CTGF comprenden una o más nucleobases modificadas. En algunas modalidades, la nucleobase modificada es 5-metilcitocina . En modalidades adicionales, cada citocina es una 5-metilcitocina.
Como se usa en la presente, nucleobases "no modificadas" o "naturales" incluyen las bases de purina adenina (A) y guanina (G) , y las bases de pirimidina timina (T), citocina (C) y uracilo (U) .
Nucleobases modificadas incluyen otras nucleobases sintéticas y naturales tales como 5-metilcitocina (5-me-C) , 5-hidroximetil citocina, xantina, hipoxantina, 2-aminoadenina , 6-metilo y otros derivados alquilo de adenina y guanina, 2-propilo y otros derivados alquilo de adenina y guanina, 2-tiouracilo, 2-tiotimina y 2-tiocitocina , 5-halouracilo y citocina, 5-propinilo (-C=C-CH3) uracilo y citocina y otros derivados alquinilo de bases de pirimidina, 6-azo uracilo, citocina y timina, 5-uracilo (pseudouracilo) , -tiouracilo , 8-halo, 8-amino, 8-tiol, 8-tioalquilo, 8-hidroxilo y otras 8-adeninas sustituidas y guaninas, 5-halo particularmente 5-bromo, 5-trifluorometilo y otros 5-uracilos sustituidos y citocinas, 7 -metilguanina y 7-metiladenina, 2-F-adenina, 2-amino-adenina, 8-azaguanina y 8-azaadenina, 7-desazaguanina y 7-desazaadenina y 3-desazaguanina y 3-desazaadenina . Nucleobases modificadas adicionales incluyen pirimidinas triciclicas tales como fenoxazina citidina (1H-pirimido [5, 4-b] [1, ] benzoxazin-2 (3H) -ona) , fenotiazina citidina ( IH-pirimido [5, 4-b] [l,4]benzotiazin-2(3H)-ona) , abrazaderas-G tales como una fenoxazina citidina sustituida (por ejemplo, 9- ( 2-aminoetoxi ) -H-pirimido [5, 4-b] [ 1 , 4 ] enzoxazin-2 ( 3H) -ona ) , carbazol citidina (2H-pirimido [ 4 , 5-b] indol-2-ona ) , piridoindol citidina (H-pirido [3',2' :4,5]pirrolo[2,3-d] pirimidin-2-ona ) . Nucleobases modificadas pueden incluir también aquellas en las cuales la base purina o pirimidina es reemplazada con otros heterociclos , por ejemplo 7-desaza-adenina, 7-desazaguanosina , 2-aminopiridina y 2-piridona. Nucleobases adicionales incluyen aquellas descritas en la Patente Estadounidense No. 3,687,808, aquellas descritas en la The Concise Enciclopedia Of Polimer Science and Engineering, páginas 858-859, Kroschwitz, J. I., ed. John Wiley & Sons, 1990, aquellas descritas por Englisch et al., Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613, y aquellas descritas por Sanghvi, Y. S., Chapter 15, Antisense Research and Applications, páginas 289- 302, Crooke, S. T. y Lebleu, B. ed. , CRC Press, 1993.
Ciertas de estas nucleobases son particularmente útiles para incrementar la afinidad de enlace de los compuestos oligoméricos de la invención. Estas incluyen pirimidinas 5-susituidas , ß-azapirimidinas y N-2, N-6 y 0-6 purinas sustituidas, que incluyen 2-aminopropiladenina, 5-propiniluracilo y 5-propinilcitocina . Sustituciones de 5-metilcitocina se han mostrado por incrementar la estabilidad doble del ácido nucleico por 0.6-1.2°C. (Sanghvi, Y. S., Crooke, S. T. and Lebleu, B., eds . , Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Ratón, 1993, pp . 276-278) y son sustituciones base actualmente preferidas, aún más particularmente cuando se combinan con modificaciones de azúcar de 2 ' -0-metoxietilo .
Patentes Estadounidenses Representativas que muestran la preparación de ciertas de las nucleobases modificadas indicadas anteriormente asi como también otras nucleobases modificadas incluyen, pero no se limitan a, la Patente Estadounidense indicada anteriormente No. 3,687,808, asi como también Patentes Estadounidenses Nos.: 4,845,205; 5,130,302; 5,134,066; 5,175,273; 5,367,066; 5,432,272; 5,457,187; 5,459,255; 5,484,908; 5,502,177; 5,525,711; 5,552,540; 5,587,469; 5,594,121, 5,596,091; 5,614,617; 5,645,985; 5,830,653; 5,763,588; 6,005,096; y 5,681,941, algunas de las cuales son de su propiedad con la presente solicitud, y cada una de las cuales se incorpora en la presente por referencia, y Patente Estadounidense No. 5,750,692, la cual tiene un propietario en común con los propietarios de la presente solicitud y también se incorpora en la presente por referencia.
Porciones de Compuestos Antisentido En cierta modalidad de la invención, el compuesto comprende un oligonucleótido modificado comprendido de (a) un segmento de apertura que consiste de desoxinucleosidos ligados, preferiblemente consiste de trece desoxinucleosidos modificados ligados; (b) un segmento de ala al 5' que consiste de nucleósidos modificados ligados, preferiblemente consiste de dos nucleósidos modificados ligados; y (c) un segmento de ala al 3' que consiste de nucleósidos modificados ligados, preferiblemente consiste de cinco nucleósidos ligados; en donde el segmento de apertura se posiciona entre el segmento de ala al 5' y el segmento de ala al 3' , y en donde cada nucleósido modificado dentro de cada segmento de ala comprende un azúcar modificado, preferiblemente comprende un azúcar 2'-O-metoxietilo ; y en donde cada enlace de internucleósido es un enlace de fosfotioato. Estos patrones de nucleótidos modificados en un compuesto antisentido son llamados porciones. Estas porciones, confieren a los compuestos antisentido propiedades tales como para intensificar la actividad inhibidora, incrementar la afinidad de enlace para un ácido nucleico objetivo, o incrementar la resistencia a la degradación por nucleasas in vivo.
En ciertas modalidades, compuestos antisentido dirigidos a un ácido nucleico del CTGF tienen subunidades químicamente modificadas arregladas en patrones, o porciones, para conferir a los compuestos antisentido propiedades tales como actividad inhibidora intensificada, afinidad de enlace incrementada para un ácido nucleico objetivo, o resistencia a la degradación por nucleasas in vivo.
Compuestos antisentido quiméricos típicamente contienen al menos una región modificada para conferir resistencia incrementada a la degradación de nucleasa, absorción celular incrementada, afinidad de enlace incrementada para el ácido nucleico objetivo, y/o actividad inhibidora incrementada. Una segunda región de un compuesto antisentido quimérico puede opcionalmente servir como un sustrato para la endonucleasa celular RNase H, la cual desdobla la hebra de ARN de un duplo de AR : ADN .
Compuestos antisentido que tienen una porción de gapmer se consideran compuestos antisentido quiméricos. En un gapmer una región interna que tiene una pluralidad de nucleótidos que soporta el desdoblamiento de RNaseH se posiciona entre regiones externas que tienen una pluralidad de nucleótidos que son químicamente distintos de los nucleósidos de la región interna. En el caso de un oligonucleót ido antisentido que tiene una porción de gapmer, el segmento de apertura en general sirve como el sustrato para el desdoblamiento de endonucleasa, mientras los segmentos de ala comprenden nucleósidos modificados. En una modalidad preferida, las regiones de un gapmer son diferenciadas por los tipos de porciones de azúcar que comprenden cada región distinta. Los tipos de porciones de azúcar que se usan para diferenciar las regiones de un gapmer pueden en algunas modalidades incluir ß-D-ribonucleósidos , ß-D-desoxi-ribonucleósidos , 2' -nucleósidos modificados (tales 2 ' -nucleósidos modificados pueden incluir 2'-MOE, y 2'-0-CH3, entre otros), y nucleósidos modificados de azúcar bicíclicos (tales nucleósidos modificados de azúcar bicíclicos pueden incluir aquellos que tienen un puente 4 ' - (CH2 ) n-O-2 ' , en donde n=l o n=2 ) . Preferiblemente, cada región distinta comprende porciones de azúcar uniformes. La porción ala-apertura-ala es frecuentemente descrita como "X-Y-Z", en donde "X" representa la longitud de la región de ala al 5' , "Y" representa la longitud de la región de apertura, y "Z" representa la longitud de la región de ala al 3' . Cualquiera de los compuestos antisentido descritos en la presente puede tener una porción de gapmer. En algunas modalidades, X y Z son los mismos, en otras modalidades son diferentes. En una modalidad preferida, Y es entre 8 y 15 nucleótidos. X, Y o Z pueden ser cualquiera de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30 o más nucleótidos. De este modo, gapmers de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo 2-13-5, 5-10-5, 4-8-4, 4-12-3, 4-12-4, 3-14-3, 2-16-2, 1-18-1, 3-10-3, 2-10-2, 1-10-1 ó 2 -8-2.
En algunas modalidades, el compuesto antisentido como una porción de "wingmer" ("ala mer"), que tiene una configuración de ala-apertura o apertura-ala, es decir, una configuración X- Y o Y-Z como se describe anteriormente para la configuración de gapmer. De este modo, configuraciones de wingmer de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo 5-10, 8-4, 4-12, 12-4, 3-14, 16-2, 18-1, 10-3, 2-10, 1-10 o 8-2.
En una modalidad, compuestos antisentido dirigidos a un ácido nucleico poseen una porción gapmer 5-10-5.
En algunas modalidades, un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico tiene una porción de apertura-amplia. En otras modalidades, un oligonucleótido antisentido dirigido a un ácido nucleico tiene una porción de apertura-amplia.
En una modalidad, un oligonucleót ido antisentido de apertura-amplia dirigido a un ácido nucleico tiene un segmento de apertura de catorce 2 ' -desoxirribonucleótidos posicionados entre segmentos ala de tres nucleósidos químicamente modificados. En una modalidad, la modificación química comprende una modificación de 2' -azúcar. En otra modalidad, la modificación química comprende una modificación de azúcar 2'-M0E.
Compuestos antisentido que tienen una porción de gapmer se consideran compuestos antisentido "quiméricos" o "quimeras," las cuales contienen dos o más regiones químicamente distintas, cada una hecha de al menos una unidad monomérica, es decir, un nucleótido en el caso de un compuesto oligonucleótido . Estos oligonucleótidos típicamente contienen al menos una región modificada para conferir resistencia incrementada a la degradación de nucleasa, absorción celular incrementada, afinidad de enlace incrementada para el ácido nucleico objetivo, y/o actividad inhibidora incrementada. No es necesario para todas las posiciones en un compuesto dado ser uniformemente modificadas, y en efecto más de una de las modificaciones mencionadas anteriormente puede ser incorporada en un compuesto único o aún en un nucleósido único dentro de un oligonucleótido .
Una región adicional del oligonucleótido puede servir como un sustrato para enzimas capaces de desdoblar híbridos de ARN : ADN o ARN: ARN. Por medio del ejemplo, RNase H es una endonucleasa celular la cual desdobla la hebra de ARN de un duplo ARN: ADN. La activación de RNase H, por lo tanto, resulta en desdoblamiento del ARN objetivo, con ello intensificando mayormente la eficiencia de inhibición de oligonucleótido de la expresión del gen. Consecuentemente, resultados comparables se pueden obtener a menudo con oligonucleótidos más cortos cuando se usan oligonucleótidos quiméricos, comparados con desxosioligonucleótidos de fosforotioato hibridizando a la misma región objetivo. El desdoblamiento de ARN objetivo puede ser rutinariamente detectado por electroforesis en gel y, si es necesario, asociado a las técnicas de hibridi zación de ácido nucleico conocidas en el arte.
Compuestos antisentido quiméricos de la invención se pueden formar como estructuras compuestas de dos o más oligonucleótidos , oligonucleótidos modificados, oligonucleósidos y/o oligonucleótido miméticos como se describe anteriormente. Tales compuestos también han sido referidos en la técnica como híbridos o gapmeros. Patentes Estadounidenses Representativas que muestran la preparación de tales estructuras híbridas incluyen, pero no se limitan a, Patentes Estadounidenses Nos.: 5,013,830; 5,149,797; 5,220,007; 5,256,775; 5,366,878; 5,403,711; 5,491,133; 5,565,350; 5,623,065; 5,652,355; 5,652,356; y 5,700,922, algunas de las cuales son de su propiedad con la presente solicitud, y cada una de las cuales se incorpora en la presente por referencia en su totalidad.
En el caso de un oligonucleótido antisentido que tienen una porción de gapmer, el segmento de apertura en general sirve como el sustrato para desdoblamiento de endonucleasa , mientras los segmentos de ala comprenden nucleósidos modificados. En una modalidad preferida, las regiones de un gapmer son diferenciadas por los tipos de porciones de azúcar que comprenden cada región distinta. Los tipos de porciones de azúcar que se usan para diferenciar las regiones de un gapmer pueden incluir ß-D-ribonucleósidos , ß-D-desoxirribonucleósidos , 2'-nucleósidos modificados (tales 2 ' -nucleósidos modificados pueden incluir 2'-MOE), y nucleósidos modificados de azúcar biciclicos .
Otra modificación de oligonucleótidos de la invención involucra enlazar químicamente al oligonucleótido uno o más porciones o conjugados los cuales intensifican la actividad, distribución celular o absorción celular del oligonucleótido. Los compuestos de la invención pueden incluir grupos conjugados covalentemente unidos a grupos funcionales tales como grupos hidroxilo primarios o secundarios. Grupos conjugados de la invención incluyen intercaladores , moléculas reporteras, poliaminas, poliamidas, polietilen glicoles, poliéteres, grupos que intensifican las propiedades farmacodinámicas de oligómeros, y grupos que intensifican las propiedades farmacocinéticas de oligómeros. Grupos de conjugados típicos incluyen colesteroles, lípidos, fosfolípidos , biotina, fenazina, folato, fenantridina , antraquinona , acridina, fluoresceínas , rodaminas, cumarinas y tintes. Grupos que intensifican las propiedades farmacodinámicas , en el contexto de esta invención, incluyen grupos que mejoran la absorción de oligómeros, intensifican la resistencia del oligómero a degradación y/o refuerzan la hibridización específica de la secuencia con ARN . Grupos que intensifican las propiedades farmacocinéticas , en el contexto de esta invención, incluyen grupos que mejoran la absorción, distribución, metabolismo o excreción del oligómero. Grupos conjugados representativos son descritos en la Solicitud de Patente Internacional PCT/US92/09196, presentada el 23 de Oct . de 1992, la descripción completa de la cual se incorpora en la presente por referencia. Porciones de conjugados incluyen pero no se limitan a porciones lipidas tales como una porción de colesterol (Letsinger et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 1989, 86, 6553-6556), ácido cólico ( anoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let . , 1994, 4, 1053-1060), un tioéter, por ejemplo, hexil-S-tritiltiol (Manoharan et al., Ann . N. Y. Acad. Sci., 1992, 660, 306-309; Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1993, 3, 2765-2770), un tiocolesterol (Oberhauser et al., Nucí. Acids Res., 1992, 20, 533-538), una cadena alifática, por ejemplo, residuos dodecandiol o undecilo ( Saison-Behmoaras et al., EMBO J., 1991, 10, 1111-1118; Kabanov et al., FEBS Lett . , 1990, 259, 327-330; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75, 49-54), un fosfolipido, por ejemplo, di-hexadecil-rac-glicerol o 1,2-di-O-hexadecil-rac-glicero-3-H-fosfonato de trietil-amonio (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654; Shea et al., Nucí. Acids Res., 1990, 18, 3777-3783), una poliamina o una cadena de polietilenglicol (Manoharan et al., Nucleósidos & Nucleótidos, 1995, 14, 969-973), o ácido adamantanacético (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654), una porción de palmitilo (Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264, 229-237), o una porción de octadecilamina u hexilamino-carbonil-oxicolesterol (Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277, 923-937). Los oligonucleótidos de la invención también pueden ser conjugados a sustancias de fármacos activos, por ejemplo, aspirina, warfarina, fenilbutazona , ibuprofeno, suprofeno, fenbufeno, cetoprofeno, (S)-(+)-pranoprofeno, carprofeno, dansilsarcosina, ácido 2,3,5-triyodobenzoico, ácido flufenámico, ácido folinico, una benzotiadiazida, clorotiazida , una diazepina, indometacina , un barbiturato, una cefalosporina , un fármaco sulfa, un antidiabético, un antibacteriano o un antibiótico. Conjugados de oligonucleótido-fármaco y su preparación se describen en la Solicitud de Patente Estadounidense Ser. No. 09/334,130 (presentada el 15 de Junio de 1999) la cual se incorpora en la presente por referencia en su totalidad.
Patentes Estadounidenses Representativas que muestran la preparación de tales conjugados de oligonucleótido incluyen, pero no se limitan a, Patentes Estadounidenses Nos.: 4, 828, 979; 4, 948, 882; 5,218, 105; 5, 525, 465; 5, 541, 313; 5, 545, 730; 5, 552, 538; 5, 578, 717, 5,580,731; 5, 580, 731; 5, 591, 584; 5, 109, 124; 5, 118, 802; 5, 138, 045; 5,414,077; 5,486, 603; 5, 512, 439; 5,578,718; 5, 608, 046; 4, 587, 044; 4, 605, 735; 4, 667, 025; 4, 762, 779; 4,789, 737; 4, 824, 941; 4, 835, 263; 4,876, 335; 4, 904, 582; 4, 958, 013; 5, 082, 830; 5, 112, 963; 5,214, 136; 5, 082, 830; 5, 112, 963; 5,214, 136; 5,245, 022; 5,254, 469; 5, 258, 506; 5,262,536; 5,272,250; 5,292,873; 5,317,098; 5,371,241, 5,391,723; 5,416,203, 5,451,463; 5,510,475; 5,512,667; 5,514,785; 5,565,552; 5,567,810; 5,574,142; 5,585,481; 5,587,371; 5,595,726; 5,597,696; 5,599,923; 5,599,928 y 5,688,941, algunas de las cuales son de su propiedad con la presente solicitud, y cada una de las cuales se incorpora en la presente por referencia.
En otra modalidad de la invención, el compuesto comprende el oligonucleótido modificado consiste de 20 nucleósidos ligados.
En una modalidad preferida de la invención, el compuesto que comprende la secuencia de nucleobase es la secuencias expuesta en las SEC ID NOs: 39, 40, 45, 52 y 166.
En una modalidad de la invención la composición comprende un oligonucleótido modificado que comprende nucleósidos ligados, la secuencia de nucleobase la cual es una secuencia expuesta en una de las SEC ID NOs: 28, 30, 39, 40, 43, 44, 45, 50, 51, 52, 56, 78, 125 y 166 o una sal de la misma, y un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable. Ejemplos de sales farmacéuticamente aceptables son bien conocidos por aquellos expertos en la técnica.
En una modalidad de la invención, el compuesto antisentido es complementario dentro de un intervalo de nucleótidos en la secuencia del CTGF. En ciertas modalidades el compuesto antisentido es complementario dentro del intervalo de nucleótidos 718-751, 1388-1423, 1457-1689, 2040-2069, 2120-2147, o 2267-2301 de la SEC ID NO: 9. En una cierta modalidad el compuesto antisentido es complementario dentro del intervalo de nucleótidos 2728-2797 de la SEC ID NO: 10. Compuestos dirigidos a estos intervalos demuestran al menos 50% de inhibición (es decir, SEC ID NOs: 15, 29, 31, 42, 46-49, 53, 72, 81, 82, 152-154, 164, y 165) . Ciertos sitios objetivos listados en la Tabla 1 también demuestran al menos 50% de inhibición (es decir, SEC ID NOs: 12, 20, 33, 34, 76, 107, 129, 132, 134, 136, y 146). En ciertas modalidades el compuesto antisentido es complementario dentro del intervalo de nucleótidos 553-611, 1394-1423, 1469-1508, 1559-1605, 1659-1689 o 2100-2129 de la SEC ID NO: 9 y 2623-2647 de la SEC ID NO: 10. Compuestos dirigidos aquí demuestran al menos 60% de inhibición (es decir, SEC ID NOs: 27, 28, 38, 39, 40, 43, 44, 45, 50, 51, 52, 54, 55, 56, 77, 78, 79, 138 y 139) . Ciertos sitios objetivos adicionales listados en la Tabla 1 también demuestran al menos 60% de inhibición (es decir, SEC ID NOs: 24, 30, 61, 63, 67, 69, 73, 86, 125, 128, y 161). En ciertas modalidades el compuesto antisentido es complementario dentro del intervalo de nucleótidos 1399-1423. Compuestos dirigidos aquí demuestran al menos 70% de inhibición (es decir, SEC ID NOs : 39 y 40) . Ciertos sitios objetivos listados en la Tabla 1 también demuestran al menos 70% de inhibición (es decir, SEC ID NOs: 28, 30, 44, 45, 51, 56, 78, 128, y 138). Un sitio objetivo listado en la Tabla 1 también demuestra al menos 80% de inhibición (es decir, SEC ID NO: 44) . En ciertas modalidades, el porcentaje de inhibición se logra cuando el compuesto antisentido se suministra a células HuVec a una concentración de 50nm. Para más detalles se proporciona en la presente referencia al Ejemplo 8.
En una modalidad de la composición, el oligonucleotido modificado es un oligonucleotido de hebra única o hebra doble. En otra modalidad de la invención, comprende un oligonucleotido modificado, en donde el oligonucleotido modificado consiste de 20 nucleósidos ligados .
En otra modalidad de la invención, se proporciona un método para inhibir la expresión del factor de crecimiento del tejido conectivo en una célula o un tejido el cual comprende poner en contacto la célula o tejido con el compuesto de interés bajo condiciones de manera que la expresión del factor de crecimiento del tejido conectivo se inhibe .
Composiciones y Métodos para Formular Composiciones Farmacéuticas Los oligonucleótidos antisentido pueden ser mezclados con sustancias inertes y/o activas farmacéuticamente aceptables para la preparación de composiciones o formulaciones farmacéuticas. Composiciones y métodos para la formulación de composiciones farmacéuticas son dependientes de un número de criterios, que incluyen, pero no se limitan a, ruta de administración, extensión de la enfermedad o dosis a ser administrada.
Compuestos antisentido dirigidos a un ácido nucleico pueden ser utilizados en composiciones farmacéuticas combinando el compuesto antisentido con un diluyente o portador farmacéuticamente aceptable adecuado. Un diluyente farmacéuticamente aceptable incluye salina amortiguada con fosfato (PBS) . El PBS es un diluyente adecuado para uso en composiciones a ser suministradas parenteralmente . Por consiguiente, en una modalidad, empleado en los métodos descritos en la presente está una composición farmacéutica que comprende un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico y un diluyente farmacéuticamente aceptable. En una modalidad, el diluyente farmacéuticamente aceptable es PBS. En otra modalidad, el diluyente farmacéuticamente aceptable es salina de grado farmacéutico o PBS de grado farmacéutico. En otras modalidades, el compuesto antisentido es un oligonucleótido antisentido .
Composiciones farmacéuticas que comprenden compuestos antisentido abarcan algunas sales farmacéuticamente aceptables, ésteres, o sales de tales ésteres, o cualquier otro oligonucleótido el cual, después de la administración a un animal, que incluye un humano, es capaz de proporcionar (directamente o indirectamente) el residuo o metabolito del mismo biológicamente activo. Por consiguiente, por ejemplo, la descripción también se dirige a sales farmacéuticamente aceptables de compuestos antisentido, profármacos, sales farmacéuticamente aceptables de tales profármacos, y otros bioequivalentes . Sales farmacéuticamente aceptables adecuadas incluyen, pero no se limitan a, sales de sodio y potasio.
Un profármaco puede incluir la incorporación de nucleósidos adicionales en uno o ambos extremos de un compuesto antisentido los cuales son desdoblados por nucleasas endógenas dentro del cuerpo, para formar el compuesto antisentido activo. En particular, versiones de profármaco de los oligonucleótidos de la invención se preparan como derivados de SATE [ ( S-acetil-2-tioetil ) fosfato] de conformidad con los métodos descritos en O 93/24510 por Gosselin et al., publicado el 9 de Dic. de 1993 o en el documento W094/26764 y Patente Estadounidense No. 5,770,713 por Imbach et al.
El término "sales farmacéuticamente aceptables" se refiere a sales farmacéuticamente y fisiológicamente aceptables de los compuestos de la invención: es decir, sales que retienen la actividad biológica deseada del compuesto precursor y no imparten efectos toxicológicos indeseados a estos.
Sales de adición de base farmacéuticamente aceptables se forman con metales o aminas, tales como álcalis y metales alcalinotérreos o aminas orgánicas. Ejemplos de metales usados como cationes son sodio, potasio, magnesio, calcio y similares. Ejemplos de aminas adecuadas son N, N' -dibenciletilendiamina, cloroprocaina, colina, dietanolamina , diciclohexilamina , etilendiamina, N-metilglucamina, y procaina (véase, por ejemplo, Berge et al., "Pharmaceutical Salts," J. of Pharma Sci., 1977, 66, 1-19) . Las sales de adición de base de los compuestos acidicos se preparan poniendo en contacto la forma de ácido libre con una cantidad suficiente de la base deseada para producir la sal en una manera convencional. La forma de ácido libre puede ser regenerada poniendo en contacto la forma de sal con un ácido y aislar el ácido libre en la manera convencional. La forma de ácido libre difiere de sus formas de sal respectivas un poco en ciertas propiedades fisiológicas tales como solubilidad en solventes polares, pero de otro modo las sales son equivalentes a su ácido libre respectivo para propósitos de la presente invención. Como se usa en la presente, una "sal de adición farmacéutica" incluye una sal farmacéuticamente aceptable de una forma de ácido de uno de los componentes de las composiciones de la invención. Estas incluyen sales de ácido orgánico o inorgánico de las aminas. Sales de ácido preferidas son los clorhidratos, acetatos, salicilatos, nitratos y fosfatos. Otras sales farmacéuticamente aceptables adecuadas son bien conocidas por aquellos expertos en la técnica e incluyen sales básicas de una variedad de ácidos orgánicos e inorgánicos, tales como, por ejemplo, con ácidos inorgánicos, tales como por ejemplo ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico o ácido fosfórico; con ácidos sulfo o fosfo, sulfónico, carboxílico orgánicos, o ácido sulfámicos N-sustituidos , por ejemplo ácido acético, ácido propiónico, ácido glicólico, ácido succínico, ácido maleico, ácido hidroximaleico , ácido metilmaleico , ácido fumárico, ácido mélico, ácido tartárico, ácido láctico, ácido oxálico, ácido glucónico, ácido glucárico, ácido glucurónico, ácido cítrico, ácido benzoico, ácido cinámico, ácido mandélico, ácido salicílico, ácido 4-aminosalicilico, ácido 2-fenoxibenzoico , ácido 2-acetoxibenzoico, ácido embónico, ácido nicotínico o ácido isonicotínico; y con aminoácidos, tales como los 20 alfa-aminoácidos involucrados en la síntesis de proteínas en la naturaleza, por ejemplo ácido glutámico o ácido aspártico, y también con ácido fenilacético , ácido metansulfónico, ácido etansulfónico, ácido 2-hidroxietansulfónico, ácido etan-1 , 2-disulfónico, ácido bencensulfónico, ácido 4 -metilbencensulfónico, ácido naftalen-2-sulfónico, ácido naftalen-1, 5-disulfónico, 2- o 3-fosoglicerato, glucosa-6-fosfato, ácido N-ciclohexilsulfámico (con la formación de ciclamatos), o con otros compuestos orgánicos de ácido, tales como ácido ascórbico. Sales farmacéuticamente aceptables de compuestos también se pueden preparar con un catión farmacéuticamente aceptable. Cationes farmacéuticamente aceptables adecuados son bien conocidos por aquellos expertos en la técnica e incluyen cationes alcalinos, alcalinotérreos , amonio y amonio cuaternario. Carbonatos o carbonatos de hidrógeno también son posibles.
Para oligonucleótidos , ejemplos preferidos de sales farmacéuticamente aceptables incluyen per no se limitan a (a) sales formadas con cationes tales como sodio, potasio, amonio, magnesio, calcio, poliaminas tales como espermina y espermidina, etc.; (b) sales de adición de ácido formadas con ácidos inorgánicos, por ejemplo ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico, ácido nítrico y similares; (c) sales formadas con ácidos orgánicos tales como, por ejemplo, ácido acético, ácido oxálico, ácido tartárico, ácido succínico, ácido maleico, ácido fumárico, ácido glucónico, ácido cítrico, ácido málico, ácido ascórbico, ácido benzoico, ácido tánico, ácido palmítico, ácido algínico, ácido poliglutámico, ácido naftalensulfónico, ácido metansulfónico, ácido p-toluensulfónico, ácido naftalendisulfónico, ácido poligalacturónico , y similares; y (d) sales formadas de aniones elementales tales como cloro, bromo y yodo.
En cierta modalidad de la invención, un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable es un ingrediente en una composición que carece de actividad farmacológica, pero es farmacéuticamente necesaria o deseable como un solvente, agente de suspensión o cualquier otro vehículo farmacéuticamente inerte para suministro de uno o más ácido nucleicos a un humano o animal no humano. Portadores farmacéuticos son bien conocidos por aquellos expertos en la técnica.
Portadores Ciertas composiciones de la presente invención también incorporan compuestos portadores en la formulación. Como se usa en la presente, "compuesto portador" o "portador" puede referirse a un ácido nucleico, o análogo del mismo, el cual es inerte (es decir, no posee actividad biológica per se) pero es reconocido como un ácido nucleico por procesos in vivo que reducen la biodisponibilidad de un ácido nucleico que tiene actividad biológica mediante, por ejemplo, degradando el ácido nucleico biológicamente activo o promoviendo su remoción de la circulación. La coadministración de un ácido nucleico y un compuesto portador, típicamente con un exceso de la última sustancia, puede resultar en una reducción sustancial de la cantidad de ácido nucleico recuperado en el hígado, riñon u otros reservorios extracirculatorios , presumiblemente debido a competición entre el compuesto portador y el ácido nucleico para un receptor común. Por ejemplo, la recuperación de un oligonucleótido parcialmente fosforotioato en tejido hepático puede ser reducida cuando se coadministra con ácido poliinosínico, sulfato de dextrano, ácido policitídico o ácido 4-acetamido-4 ' isotiociano-estilben-2 , 2 ' -disulfónico (Miyao et al., Antisense Res. Dev., 1995, 5, 115-121; Takakura et al., Antisense & Nucí. Acid Drug Dev. , 1996, 6, 177-183) .
Excipientes Contrario a un compuesto portador, un "excipiente" o "portador farmacéutico" es un solvente farmacéuticamente aceptable, agente de suspensión o cualquier otro vehículo farmacológicamente inerte para suministrar uno o más ácido nucleicos a un animal. El excipiente puede ser líquido o sólido y se selecciona, con la manera de administración planeada en mente, para proporcionar el volumen deseado, consistencia, etc., cuando se combina con un ácido nucleico y los otros componentes de una composición farmacéutica dada. Farmacéuticos portadores típicos incluyen, pero no se limitan a, agentes enlazantes (por ejemplo, almidón de maíz pregelatinizado, polivinilpirrolidona o hidroxipropilmetilcelulosa, etc.); rellenadores (por ejemplo, lactosa y otros azúcares, celulosa microcristalina, pectina, gelatina, sulfato de calcio, etilcelulosa, poliacrilatos o fosfato hidrógeno de calcio, etc.); lubricantes (por ejemplo, estearato de magnesio, talco, sílice, dióxido de silicio coloidal, ácido esteárico, estearatos metálicos, aceites vegetales hidrogenados, almidón de maíz, polietilenglicoles , benzoato de sodio, acetato de sodio, etc.); desintegrantes (por ejemplo, almidón, glicolato almidón sódico, etc.); y agentes humectantes (por ejemplo, laurilsulfato de sodio, etc . ) .
Excipientes orgánicos o inorgánicos farmacéuticamente aceptables adecuados para administración no parenteral los cuales no reacciona deletéreamente con ácidos nucleicos también pueden ser usados para formular las composiciones de la presente invención. Portadores farmacéuticamente aceptables adecuados incluyen, pero no se limitan a, agua, soluciones de sal, alcoholes, polietilenglicoles, gelatina, lactosa, amilosa, estearato de magnesio, talco, ácido silícico, parafina viscosa, hidroximetilcelulosa, polivinilpirrolidona y similares.
Formulaciones para administración tópica de ácidos nucleicos pueden incluir soluciones acuosas estériles y no estériles, soluciones no acuosas en solventes comunes tales como alcoholes, o soluciones de los ácidos nucleicos en bases aceitosas líquidas o sólidas. Las soluciones también pueden contener amortiguadores, diluyentes y otros aditivos adecuados. También se pueden usar excipientes orgánicos o inorgánicos farmacéuticamente aceptables adecuados para administración no parenteral los cuales no reaccionan deletéreamente con ácido nucleicos .
En una modalidad de la invención, la composición comprende un oligonucleótido modificado que comprende un oligonucleótido de hebra única o de doble hebra, y en donde el oligonucleótido modificado consiste de 20 nucleósidos ligados .
En otra modalidad de la invención involucra un método para inhibir la expresión del factor de crecimiento del tejido conectivo en una célula o un tejido el cual comprende poner en contacto la célula o tejido con cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente bajo condiciones de manera que la expresión del factor de crecimiento del tejido conectivo se inhibe.
En cierta modalidad de la invención involucra un método para tratar un animal que tiene una enfermedad o condición asociada con la expresión del factor de crecimiento del tejido conectivo el cual comprende administrar al animal una cantidad del compuesto descrito en la presente anteriormente, efectiva para inhibir la expresión del factor de crecimiento del tejido conectivo para con ello tratar al animal.
En la práctica del método de esta invención, un animal incluye un humano asi como también un animal no humano, preferiblemente humano.
La presente invención también incluye composiciones farmacéuticas y formulaciones las cuales incluyen los compuestos antisentido de la invención. Las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden ser administradas en un número de formas que dependen de si el tratamiento local o sistémico se desea y sobre el área a ser tratada. La administración puede ser tópica (que incluye membranas oftálmica y/o mucosas que incluyen suministro vaginal y rectal), pulmonar, por ejemplo, por inhalación o insuflación de polvos o aerosoles, que incluyen nebuli zador ; intratraqueal , intranasal, epidermal y transdérmico) , oral o parenteral. La administración parenteral incluye inyección o infusión intravenosa, intraarterial , subcutánea, intraperitoneal o intramuscular; o intracraneal, por ejemplo, administración intratecal o intraventricular . Oligonucleótidos con al menos una modificación 2 ' -O-metoxietilo se cree son particularmente útiles para administración oral.
Composiciones farmacéuticas y formulaciones para administración tópica pueden incluir parches transdérmicos , ungüentos, lociones, cremas, geles, gotas, supositorios, atomizadores, líquidos y polvos. Farmacéuticos portadores convencionales, bases acuosas, en polvo o aceitosas, espesantes y similares pueden ser necesarias o deseables. Condones revestidos, guantes similares también pueden ser útiles. Formulaciones tópicas preferidas incluyen aquellas en las cuales los oligonucleótidos de la invención están en mezcla con un agente de suministro tópico tales como lipidos, liposomas, ácidos grasos, ésteres de ácido graso, esteroides, agentes quelantes y tensoactivos . Lipidos y liposomas preferidos incluyen neutral (por ejemplo, dioleoilfosfatidil DOPE etanolamina, dimiristoilfosfatidil colina DMPC, diestearoilfosfatidil colina) negativo (por ejemplo, dimiristoilfosfatidil glicerol DMPG) y catiónico (por ejemplo, dioleoiltetramet ilaminopropilo DOTAP y dioleoilfosfatidil etanolamina DOTMA) . Oligonucleótidos de la invención se pueden encapsular dentro de liposomas o pueden formar complejos de estos, en particular a liposomas catiónicos. Alternativamente, los oligonucleótidos se pueden formar en complejos a lipidos, en particular a lipidos catiónicos. Ácidos grasos y ésteres preferidos incluyen pero no se limitan a ácido araquidónico, ácido oleico, ácido eicosanoico, ácido láurico, ácido caprilico, ácido cáprico, ácido mirístico, ácido palmitico, ácido esteárico, ácido linoleico, ácido linolénico, dicaprato, tricaprato, monooleina, dilaurina, 1-monocaprato de glicerilo, l-dodecilazacicloheptan-2-ona, una acilcarnitina , una acilcolina, o un alquiléster C1-C10 (por ejemplo, isopropilmiristato IPM) , monoglicérido , diglicérido o sal del mismo farmacéuticamente aceptable. Formulaciones tópicas se describen en detalle en la Solicitud de Patente Estadounidense Serie No. 09/315,298 presentada el 20 de Mayo de 1999 la cual se incorpora en la presente por referencia en su totalidad.
Composiciones y formulaciones para administración oral incluyen polvos o gránulos, microparticulas , nanoparticulas , suspensiones o suspensiones en medio acuoso o no acuoso, cápsulas, cápsulas de gel, saquillos, tabletas o minitabletas . Espesantes, agentes saborizantes , diluyentes, emulsificantes , auxiliares dispersantes o aglutinantes pueden ser deseables. Formulaciones orales preferidas son aquellas en las cuales los oligonucleótidos de la invención se administran en conjunto con uno o más intensificadores de penetración, tensoactivos y quelantes. Tensoactivos preferidos incluyen ácidos grasos y/o ésteres o sales de los mismos, ácidos biliares y/o sales de los mismos. Ácidos/sales biliares preferidos incluyen ácido quenodesoxicólico (CDCA) y ácido ursodesoxiquenodesoxicólico (UDCA) , ácido cólico, ácido deshidrocólico , ácido desoxicólico, ácido glucólico, ácido glicólico, ácido glicodesoxicólico, ácido taurocólico, ácido taurodesoxicólico, tauro-24 sódico, 25-dihidro-fusidato, glicodihidrofusidato sódico. Ácidos grasos preferidos incluyen ácido araquidónico , ácido undecanoico, ácido oleico, ácido láurico, ácido caprilico, ácido cáprico, ácido miristico, ácido palmitico, ácido esteárico, ácido linoleico, ácido linolénico, dicaprato, tricaprato, monooleina, dilaurina, 1-monocaprato de glicerilo, 1-dodecilazacicloheptan-2-ona, una acilcarnitina, una acilcolina, o un monoglicérido, un diglicérido o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable (por ejemplo, sodio). También son preferidas combinaciones de intensificadores de penetración, por ejemplo, ácidos grasos/sales en combinación con ácidos/sales biliares. Una combinación particularmente preferida es la sal sódica de ácido láurico, ácido cáprico y UDCA. Intensificadores adicionales de la penetración incluyen polioxietilen- 9-lauril éter, polioxiet ilene-20-cetil éter. Oligonucleótidos de la invención pueden ser suministrados oralmente en forma granular que incluye partículas secadas por atomización, o en complejo para formar micro o nanoparticulas . Agentes que forman complejos de oligonucleótidos incluyen poli-amino ácidos; poliiminas; poliacrilatos ; polialquilacrilatos , polioxetanos , polialquilcianoacrilatos; gelatinas cationizadas , albúminas, almidones, acrilatos, polietileneglicoles (PEG) y almidones; polialquilcianoacrilatos; poliiminas derivadas de DEAE, pululanos, celulosas y almidones. Agentes formadores de complejos particularmente preferidos incluyen quitosán, N-trimetilquitosán, poli-L-lisina , polihistidina , poliornitina, poliesperminas , protamina, polivinilpiridina , politiodietilaminometil-etileno P(TDAE), poliaminoestireno (por ejemplo, p-amino) , poli (metilcianoacrilato) , poli (etilcianoacrilato) , poli (butilcianoacrilato) , poli (isobutilcianoacrilato) , poli ( iso-hexilcianoacrilato) , DEAE-metacrilato, DEAE-hexilacrilato, DEAE-acrilamida , DEAE-albúmina y DEAE-dextrano, polimetil-acrilato, polihexilacrilato, poli (ácido D, L-láctico) , poli (ácido DL-láctico-co-glicólico) (PLGA), alginato, y polietilenglicol (PEG) . Formulaciones orales para oligonucleótidos y su preparación se describen en detalle en las Solicitudes Estadounidenses Serie No. 08/886,829 (presentada el 1 de Julio de 1997), Serie No. 09/108,673 (presentada el 1 de Julio de 1998), Serie No. 09/256,515 (presentada el 23 de Febrero de 1999), Serie No. 09/082,624 (presentada el 21 de Mayo de 1998) y Serie No. 09/315,298 (presentada el 20 de Mayo de 1999) cada una de las cuales se incorpora en la presente por referencia en su totalidad.
Composiciones y formulaciones para administración parenteral, intratecal o intraventricular pueden incluir soluciones acuosas estériles las cuales también pueden contener amortiguadores, diluyentes y otros aditivos adecuados tales como, pero no se limitan a, intensificadores de la penetración, compuestos portadores y otros portadores o excipientes farmacéuticamente aceptables .
Las composiciones de la presente invención, incluyen, pero no se limitan a, formulaciones que contienen soluciones, emulsiones y liposomas. Estas composiciones se pueden generar de una variedad de componentes que incluyen, pero no se limitan a, líquidos preformados, sólidos auto-emulsificantes y semisólidos auto-emulsificantes .
Las formulaciones farmacéuticas de la presente invención, las cuales pueden convenientemente ser presentados en forma de dosificación unitaria, pueden ser preparadas de conformidad con las técnicas convencionales bien conocidas en la industria farmacéutica. Las técnicas incluyen la etapa de llevar en asociación con los ingredientes activos con los portadores o excipientes farmacéuticos. En general, las formulaciones se preparan uniformemente o íntimamente llevando en asociación los ingredientes activos con portadores líquidos o portadores sólidos finamente divididos o ambos, y entonces, si es necesario, formar el producto.
Las composiciones de la presente invención se puede formular en cualquiera de muchas de las formas de dosificación posibles tales como, pero no se limitan a, tabletas, cápsulas, cápsulas de gel, jarabes líquidos, geles suaves, supositorios y enemas. Las composiciones de la presente invención también se pueden formular como suspensiones en medio acuoso, no acuoso o mixto. Las suspensiones además contener sustancias las cuales incrementan la viscosidad de la suspensión que incluye, por ejemplo, carboximetil-celulosa de sodio, sorbitol y/o dextrano. La suspensión puede también contener estábili zadores .
En una modalidad de la presente invención, las composiciones farmacéuticas se pueden formular y usar como espumas. Espumas farmacéuticas incluyen formulaciones tales como, pero no se limitan a, emulsiones, microemulsiones , cremas, jaleas y liposomas. Mientras básicamente de forma similar en la naturaleza, estas formulaciones varían en los componentes y la consistencia del producto final. La preparación de las composiciones y formulaciones es generalmente conocida por aquellos expertos en las técnicas farmacéuticas y de formulación, y se pueden aplicar a la formulación de las composiciones de la presente invención.
Emulsiones Las composiciones de la presente invención, se pueden preparar y formular como emulsiones. Las emulsiones son sistemas típicamente heterogéneos de un líquido dispersado en otro en la forma de gotas usualmente que exceden 0.1 µp? de diámetro. (Idson, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volumen 1, p. 199; Rosoff, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Volumen 1, p. 245; Block in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volumen 2, p. 335; Higuchi et al., en Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co . , Easton, Pa . , 1985, p. 301) . Las emulsiones son a menudo sistemas bifásicos que comprenden dos fases líquidas inmiscibles íntimamente mezcladas y dispersadas entre sí. En general, las emulsiones pueden ser ya sea agua en aceite (a/ac) o de la variedad aceite en agua (ac/a). Cuando la fase acuosa es finamente dividida en y dispersada como gotas diminutas en una fase aceitosa en volumen, la composición resultante es llamada una emulsión agua en aceite (a/ac) . Alternativamente, cuando una fase aceitosa es finamente dividida en y dispersada como gotas diminutas en una fase acuosa en volumen, la composición resultante es llamada una emulsión aceite en agua (ac/a) . Las emulsiones pueden contener componentes adicionales en adición a las fases dispersadas y el fármaco activo el cual puede estar presente como una solución en ya sea fase acuosa, fase aceitosa o por si misma como una fase separada. Los excipientes farmacéuticos tales como emulsificadores , estabilizadores, tintes y anti-oxidantes pueden también estar presentes en emulsiones como se necesiten. Las emulsiones farmacéuticas pueden también ser emulsiones múltiples que están comprendidas de más de dos fases tales como, por ejemplo, en el caso de emulsiones aceite en agua en aceite (ac/a/ac) y agua en aceite en agua (a/ac/a) . Estas formulaciones en complejo a menudo proporcionan ciertas ventajas que las emulsiones binarias simples no. Las emulsiones múltiples en las cuales las gotas de aceite individuales de una emulsión ac/a adjunta gotas de agua pequeñas que constituyen una emulsión a/ac/a. Igualmente un sistema de gotas de aceite adjuntadas en glóbulos de agua estabilizada en uno aceitoso continuo, proporciona una emulsión ac/a/ac.
Las emulsiones se caracterizan por poca o nada de estabilidad termodinámica. A menudo, la fase dispersada o discontinua de la emulsión es asi dispersada en la fase externa o continua y mantenida en esta forma a través de los medios de emulsificadores o la viscosidad de la formulación. Cualquiera de las fases de la emulsión puede ser un semisólido o un sólido, como es el caso de bases para ungüentos de tipo emulsión y cremas. Otros medios para emulsiones estabilizantes implican el uso de emulsificadores que pueden ser incorporados en cualquier fase de la emulsión. Los emulsificadores pueden ampliamente ser clasificados en cuatro categorías: tensoactivos sintéticos, emulsificadores que se originan naturalmente, bases de absorción y sólidos finamente dispersadas (Idson, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volumen 1, p. 199) .
Tensoactivos sintéticos, también conocidos como agentes activos de superficie, han encontrado amplia aplicabilidad en la formulación de emulsiones y se han revisado en la literatura (Rieger, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volumen 1, p. 285; Idson, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (EDs.), Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, volumen 1, p. 199). Los tensoactivos son típicamente anfifilicos y comprenden una porción hidrofílica y una porción hidrofóbica. La proporción de la naturaleza hidrofílica a la hidrofóbica del tensoactivo se ha denominado el balance hidrofílico/lipofílico (HLB) y es una herramienta valiosa para categorizar y seleccionar tensoactivos en la preparación de formulaciones. Los tensoactivos se puede clasificar en diferentes clases en base a la naturaleza del grupo hidrofílico: no iónico, aniónico, catiónico y anfotérico (Rieger, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volumen 1, p. 285).
Emulsificadores que se originan naturalmente usados en formulaciones de emulsión incluyen lanolina, cera de abeja, fosfátidos, lecitina y acacia. Las bases de absorción poseen propiedades hidrofílicas tales que pueden absorber agua para formar emulsiones a/ac, aún retener sus consistencias de semisólido, tal como lanolina anhidra y petrolato hidrofílico. También se han usado sólidos finamente divididos como buenos emulsificadores , especialmente en combinación con tensoactivos y en preparaciones viscosas. Estas incluyen sólidos inorgánicos polares, tales como hidróxidos de metal pesado, arcillas sin abultamiento tales como bentonita, atapulgita, hectorita, caolín, montmorillonita, silicato de aluminio coloidal y silicato de aluminio de magnesio coloidal, pigmentos y sólidos no polares tales como triestearato de carbono o glicerilo.
También se incluyen una amplia variedad de materiales no emulsificantes en formulaciones de emulsión y contribuyen a las propiedades de emulsiones. Estas incluyen grasas, aceites, ceras, ácidos grasos, alcoholes grasos, ésteres grasos, humectantes, coloides hidrofílieos , preservativos y antioxidantes (Block, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volumen 1, p. 335; Idson, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N. Y. , volumen 1, p. 199) .
Coloides o hidrocoloides hidrofílicos incluyen gomas que se originan naturalmente y polímeros sintéticos tales como polisacáridos (por ejemplo, acacia, agar, ácido algínico, carragenano, goma guar, goma de karaya y tragacanto) , derivados de celulosa (por ejemplo, carboximetilcelulosa y carboxipropilcelulosa), y polímeros sintéticos (por ejemplo, carbómeros, éteres de celulosa y polímeros de carboxivinilo) . Estos desaparecen o se hinchan en agua para formar soluciones coloidales que estabilizan emulsiones formando películas ínterfaciales fuertes alrededor de las gotas de fase dispersada e incrementando la viscosidad de la fase externa.
Ya que las emulsiones a menudo contienen un número de ingredientes tales como carbohidratos, proteínas, esteróles y fosfáticos que pueden fácilmente soportar el crecimiento de microbios, estas formulaciones a menudo incorporan preservativos. Preservativos comúnmente usados incluidos en las formulaciones de emulsión incluyen metil parabeno, propil parabeno, sales de amonio cuaternario, cloruro de benzalconio, ésteres de ácido p-hidroxibenzoico y ácido bórico. Los antioxidantes también son comúnmente agregados a formulaciones de emulsión para prevenir el deterioro de la formulación. Los antioxidantes usados pueden ser depuradores de radical libre tales como tocoferoles, alquil galatos, hidroxianisol butilado, hidroxitolueno butilado, o agentes de reducción tal como ácido ascórbico y metabisulfito de sodio, y antioxidantes sinergísticos tal como ácido cítrico, ácido tartárico y lecitina .
La aplicación de formulaciones de emulsión vía ruta dermatológica, oral y parenteral y métodos para su manufactura, se han revisado en la literatura (Idson, en Pharmaceeut ical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, arcel Dekker, INc, New York, N.Y., volumen 1, p. 199). Las formulaciones de emulsión para suministro oral han sido muy ampliamente usadas debido a las razones de fácil formulación, eficacia de un punto de vista de absorción y biodisponibilidad. (Rosoff, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volumen 1, p. 245; Idson, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volumen 1, p. 199). Laxantes a base de aceite mineral, vitaminas solubles en agua y preparaciones nutritivas altas en grasa están entre los materiales gue se han comúnmente administrados oralmente como emulsiones ac/a.
En una modalidad de la presente invención, las composiciones de oligonucleotidos y ácidos nucleicos se formulan como microemulsiones . Una microemulsión puede ser definida como un sistema de agua, aceite y anfifilico el cual es una solución liquida ópticamente isotrópica y termodinámicamente estable única (Rosoff, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volumen 1, p. 245) . Típicamente las microemulsiones son sistemas que se preparan primero dispersando un aceite en una solución de tensoactivo acuoso y después agregando una cantidad suficiente de un cuarto componente, generalmente un alcohol de cadena larga intermediario para formar un sistema transparente. Por lo tanto, las microemulsiones se han descrito como dispersiones termodinámicamente estables, isotrópicamente claras de dos líquidos inmiscibles que son estabilizados por películas interfaciales de moléculas de superficie activa (Leung and Shah, en: Controlled Reléase of Drugs: Polymers and Aggregate Systems, Rosoff, M., Ed . , 1989, VCH Publishers, New York, páginas 185-215) . Las microemulsiones comúnmente se preparan vía una combinación de tres a cinco componentes que incluyen aceite, agua, tensoactivo, cotensoactivo y electrolito. Si la microemulsión es del tipo agua en aceite (a/ac) o aceite en agua (ac/a) depende de las propiedades del aceite y tensoactivo usado y en la estructura y empaque geométrico de las cabezas polares y colas de hidrocarburo de las moléculas de tensoactivo (Schott, en Remington' s Pharmaceuticals Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa . , 1985, p. 271) .
Los diagramas de fase que utilizan procedimiento fenomenológico se han estudiado extensivamente y ha proporcionado un conocimiento comprensivo, a un experto en la técnica, de cómo formular microemulsiones (Rosoff, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volumen 1, p. 245; Block, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volumen 1, p. 335). Comparado a emulsiones, microemulsiones convencionales ofrecen la ventaja de solubilizar fármacos insolubles en agua en una formulación de gotas termodinámicamente estables que se forman espontáneamente.
Los tensoactivos usados en la preparación de microemulsiones incluyen, pero no se limitan a, tensoactivos iónicos, tensoactivos no iónicos, Brij 96, éteres de polioxietilen oleilo, ésteres de ácido graso de poliglicerol , monolaurato de tetraglicerol (ML310), monooleato de tetraglicerol (MO310) , monooleato de hexaglicerol (PO310), pentaoleato de hexaglicerol (PO500), monocaprato de decaglicerol (MCA750), monooleato de decaglicerol (MO750), sesquioleato de decaglicerol (SO750), decaoleato de decaglicerol (DAO750) , solo o en combinación con cotensoact ivos . El cotensoactivo, usualmente un alcohol de cadena corta tal como etanol, 1-propanol y 1-butanol, sirve para incrementar la fluidez interfacial penetrando en la película de tensoactivo y consecuentemente crea una película desordenada debido al espacio vacío generado entre las moléculas de tensoactivo. Las microemulsiones pueden, sin embargo, ser preparados son el uso de cotensoactivos y sistemas de microemulsión auto-emulsificables libres de alcohol conocidos en la técnica. La fase acuosa puede típicamente ser, pero no se limita a, agua, una solución acuosa del fármaco, glicerol, PEG300, PEG400, poligliceroles , propilen glicoles y derivados de etilen glicol. La fase aceitosa puede incluir, pero no se limita a, materiales tales como Captex 300, Captex 355, Capmul CM, ésteres de ácido graso, mono, di y tri-glicéridos de cadena media (C8-C12), ésteres de ácido graso de glicerilo polioxietilados , alcoholes grasos, glicéridos poliglicolizados , glicéridos C8-C10 poliglicolizados saturados, aceites vegetales y aceite de silicona.
Las microemulsiones son particularmente de interés del punto de vista de solubili zación de fármaco y la absorción intensificada de fármacos. Las microemulsiones a base de lípido (tanto ac/a como a/ac) se han propuesto para intensificar la biodisponibilidad oral de fármacos, que incluyen péptidos ( Constantinides et al., Pharmaceutical Research, 1994, 11, 1385-1390; Ritschel, Metch. Find. Exp . Clin. Pharmacol., 1993, 13, 205). Las microemulsiones proporcionan ventajas para mejorar la solubilización del fármaco, protección de fármaco de la hidrólisis enzimática, posible intensificación de absorción del fármaco debido a alteraciones inducidas por tensoactivo en fluidez y permeabilidad de membrana, facilidad de preparación, facilidad de administración oral sobre formas de dosificación sólida, potencia clínica mejorada y toxicidad disminuida ( Constantinides et al., Pharmaceutical Research, 1994, 11, 1385; Ho et al., J. Pharm. Sci . , 1996, 85, 138-143). A menudo las microemulsiones se pueden formar espontáneamente cuando sus componentes se mezclan a temperatura ambiente. Esto puede ser particularmente ventajoso cuando se formulan fármacos, péptidos u oligonucleót idos termolábiles . Las microemulsiones también son efectivas en el suministro transdérmico de componentes activos en aplicaciones tanto cosméticas como farmacéuticas. Se espera que las composiciones y formulaciones de microemulsión de la presente invención puedan facilitar la absorción sistémica incrementada de oligonucleótidos y ácidos nucleicos del tracto gastrointestinal, así como también mejora la absorción celular local de oligonucleótidos y ácidos nucleicos dentro del tracto gastrointestinal, vagina, cavidad bucal y otras áreas de administración.
Las microemulsiones de la presente invención también pueden contener componentes y aditivos adicionales tales como monoestearato de sorbitán (Grill 3) , Labrasol, e intensificadores de penetración para mejorar las propiedades de la formulación y para intensificar la absorción de los oligonucleótidos y ácidos nucleicos de la presente invención. Los intensificadores de penetración usados en las microemulsiones de la presente invención pueden ser clasificados por pertenecer a uno de cinco tensoactivos de categoría amplia, ácidos grasos, sales biliares, agentes quelantes y no tensoactivos no quelantes (Lee et al., Critical Reviewa in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p. 92). Cada una de estas clases se han discutido anteriormente.
Liposomas Existen muchas estructuras de tensoactivo organizadas además de microemulsiones que se ha estudiado y usado para la formulación de fármacos. Estas incluyen monocapas, micelas, bicapas y vesículas. Las vesículas, tales como liposomas, tienen mayor interés atraído debido a su especificidad y la duración de acción que ofrecen desde el punto de vista de suministro del fármaco. Como se usa en la presente invención, el término "liposoma" significa una vesícula compuesta de lípidos anfifílicos ordenados en una bicapa o bicapas esféricas.
Los liposomas son vesículas unilaminares o multilaminares las cuales tienen una membrana formada de un material lipofílico y un interior acuoso. La porción acuosa contiene la composición a ser suministrada. Los liposomas catiónicos poseen la ventaja de ser capaces de fusionarse a la pared celular. Los liposomas no catiónicos, aunque no son capaces de fusionarse eficientemente con la pared celular, son captados por macrofagos in vivo.
Para atravesar la piel de mamífero intacta, las vesículas de lípido pueden pasar a través de una serie de poros finos, cada uno con un diámetro menor de 50 nm, bajo la influencia de un gradiente transdérmico adecuado. Por lo tanto, es deseable usar un liposoma el cual es muy deformable y capaz de pasar a través de los poros finos.
Ventajas adicionales de liposomas incluyen; liposomas obtenidos de fosfolípidos naturales son biocompatibles y biodegradables ; los liposomas pueden incorporar un amplio intervalo de fármacos solubles en agua y lípido; los liposomas pueden proteger fármacos encapsulados en sus compartimientos internos del metabolismo y degradación (Rosoff, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volumen 1, p. 245) .
Consideraciones importantes en la preparación de formulaciones de liposoma son la carga de superficie del lipido, tamaño de vesícula y el volumen acuoso de los liposomas .
Los liposomas son útiles para la transferencia y suministro de los ingredientes activos al sitio de acción. Debido a la membrana liposomal es estructuralmente similar a las membranas biológicas, cuando los liposomas se aplican a un tejido, los liposomas inician a combinarse con las membranas celulares. Con forme la combinación de los liposomas y célula progresa, los contenidos liposomales se vacían en la célula en donde el agente activo puede actuar .
Las formulaciones liposomales han sido el foco de investigaciones extensivas como la forma de suministro para muchos fármacos. Existen evidencias de crecimiento para administración tópica, los liposomas presentan varias ventajas sobre otras formulaciones. Estas ventajas incluyen efectos secundarios reducidos relacionados a alta absorción sistémica del fármaco administrado, acumulación incrementada del fármaco administrado en el objetivo deseado y la capacidad para administrar una amplia variedad de fármacos, tanto hidrofílico como hidrofóbico, en la piel .
Varios reportes han detallado la capacidad de liposomas para suministrar agentes que incluyen ADN de peso molecular alto en la piel. Los compuestos que incluyen analgésicos, anticuerpos, hormonas y ADNs de peso molecular alto se han administrado a la piel. La mayoría de las aplicaciones resultan en el objetivo de la epidermis superior .
Los liposomas caen en dos clases amplias. Liposomas catiónicos son liposomas positivamente cargados los cuales interactúan con las moléculas de ADN negativamente cargadas para formar un complejo estable. El complejo ADN/liposoma positivamente cargado se une a la superficie celular negativamente cargada y se internaliza en un endosoma. Debido al pH acídico dentro del endosoma, los liposomas se rompen, liberando sus contenidos en el citoplasma celular (Wang et al., Biochem. Biophys . Res. Commun., 1987, 147, 980-985) .
Los liposomas los cuales son sensibles al pH o negativamente cargados, atrapan ADN en lugar del complejo. Ya que tanto el ADN como el lípido están similarmente cargados, ocurre la repulsión en lugar de la formación del complejo. Sin embargo, algo de ADN es atrapado dentro del interior acuoso de estos liposomas. Los liposomas sensibles al pH se han usado para suministrar ADN que codifica el gen timidina cinasa a monocapas celulares en el cultivo. Se detecta la expresión del gen exógeno en las células objetivo (Zhou et al., Journal of Controlled Reléase, 1992, 19, 269-274) .
Un tipo principal de composición liposomal incluye fosfolipidos diferentes de fosfatidilcolina naturalmente derivados. Las composiciones de liposoma neutral, por ejemplo, se puede formar de dimiristoil fosfatidilcolina (DMPC) o dipalmitoil fosfatidilcolina (DPPC) . Las composiciones de liposoma aniónico generalmente se forman de dimiristol fosfatidilglicerol , mientras los liposomas fusogénicos aniónicos se forman principalmente de dioleoil fosfatidiletanolamina (DOPE). Otro tipo de composición liposomal se forma de fosfatidilcolina (PC) tal como, por ejemplo, PC de frijol de soya y PC de huevo. Otro tipo es formado de mezclas de fosfolipido y/o fosfatidilcolina y/o colesterol .
Varios estudios han valorado el suministro tópico de formulaciones de fármaco liposomal a la piel. La aplicación de liposomas que contienen interferona a piel de cobayos resulta en una reducción de llagas de herpes en la piel mientras se suministra la interferona vía otros medios (por ejemplo, como una solución o como una emulsión) son inefectivos ( einer et al., Journal of Drug Targeting, 1992, 2, 405-410). Además, un estudio adicional probó la eficacia de interferona administrada como parte de una formulación liposomal para la administración de interferona usando un sistema acuoso, y concluye que la formulación liposomal es superior a la administración acuosa (du Plessis et al., Antiviral Research, 1992, 18, 259-265) .
También se han examinado sistemas liposomales no iónicos para determinar su utilidad en el suministro de fármacos a la piel, en sistemas particulares que comprenden tensoactivo no iónico y colesterol. Formulaciones liposomales no iónicos que comprenden Novasome™ I (dilaurato de glicerilo/colesterol/éter de polioxietilen-10-estearilo) y Novasome™ II (diestearato de glicerilo/colesterol/éter de polioxietilen-10-estearilo) se usan para suministrar ciclosporina-A en la dermis de piel de ratón. Los resultados indican que los sistemas liposomales no iónicos son efectivos facilitando la deposición de ciclosporina-A en diferentes capas de la piel (Hu et al. S . T . P . Pharma . Sci., 1994, 4, 6, 466).
Los liposomas también incluyen liposomas "esféricamente estabilizados", un término el cual, como se usa en la presente, se refiere a liposomas que comprenden uno o más de lipidos especializados que, cuando se incorporan en liposomas, resulta en la vita completa de circulación intensificada en relación a liposomas que carecen de lipidos especializados. Ejemplos de liposomas esféricamente estabilizados son aquellos en la cual parte de la porción de lipido que forma vesícula del liposoma (A) comprende uno o más glicolípidos , tales como monosialogangliósido GMi, o (B) su derivado con uno o más polímeros hidrofílieos , tal como una porción de polietilen glicol (PEG). Mientras que no se desee estar unido por cualquier teoría, se piensa en la técnica anterior que, al menos para liposomas esféricamente estabilizadas que contienen gangliósidos , es fingomielina o lipidos derivados de PEG, la vida media de circulación intensificada de los liposomas esféricamente estabilizados derivados de una captación reducida en células del sistema reticuloendotelial (RES) (Alien et al., FEBS Letters, 1987, 223, 42; Wu et al., Cáncer Research, 1993, 53, 3765).
Se conocen en la técnica varios liposomas que comprenden uno o más glicolípidos. Papahadj opoulos et al. (Ann. N.Y. Acad. Sci., 1987, 507, 64) reporta la capacidad de monosialogangliósido GMi, sulfato de galactocerebrósido y fosfatidilinositol para mejorar la vida media de la sangre de liposomas. Estos hallazgos se exponen por Gabizon et al.
(Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. A., 1988, 85, 6949). Patente Estadounidense No. 4,837,028 y WO 88/04924, ambos de Alien et al., describen liposomas que comprenden (1) esfingomielina y (2) el gangliósido GMi o un éster de sulfato galactocerebrósido . La Patente Estadounidense No. 5,543,152 ( ebb et al.) describe liposomas que comprenden esfingomielina . Liposomas que comprenden 1,2-sn-dimiristoilfosfatidilcolina se describen en WO 97/13499 (Lim et al . ) .
Muchos liposomas que comprenden lipidos derivados con uno o más polímeros hidrofílicos, y métodos de preparación de los mismos, se conocen en la técnica. Sunamoto et al. (Bull. Chem. Soc. Jpn., 1980, 53, 2778) describe liposomas que comprenden un detergente no iónico, 2Ci2 15G, que contiene una porción PEG. Illum et al. (FEBS Lett., 1984, 167, 79) nota que el recubrimiento hidrofílico de partículas poliestireno con glicoles poliméricos resulta en vida media de sangre significantemente intensificada. Fosfolípidos sintéticos modificados por la unión de grupos carboxílicos de polialquilen glicoles (por ejemplo, PEG) se describen por Sears (Patentes Estadounidenses Nos. 4,426,330 y 4,534,899). Klibanov et al. (FEBS Lett., 1990, 268, 235) describe experimentos que demuestran que los liposomas que comprenden fosfatidiletanol-amina (PE) derivado con PEG o estearato de PEG tienen incremento significante en vida media de circulación de sangre. Blume et al. (Biochimica et Biophysica Acta, 1990, 1029, 91) ha ampliado las observaciones a otros fosfolipidos derivados de PEG, por ejemplo, DSPE-PEG, formados de la combinación de diestearoilfosfatidiletanolamina (DSPE) y PEG. Los liposomas que tienen porciones PEG covalentemente unidas en su superficie externa, se describen en la Patente Europea No. EP 0 445 131 Bl y WO 90/04384 por Fisher. Las composiciones de liposoma que contienen 1-20 por ciento en mole de PE derivado con PEG, y métodos de uso de las mismas, se describen por Woodle et al. (Patentes Estadounidenses Nos. 5,013,556 y 5,356,633) y Martin et al. (Patente Estadounidense No. 5,213,804 y Patente Europea No. EP 0 496 813 Bl) . Los liposomas que comprenden un número de otros conjugados lipido-polimero se describen en WO 91/05545 y Patente Estadounidense No. 5,225,212 (ambos por Martin et al.) y en WO 94/20073 (Zalipsky et al.) . Se describen liposomas que comprenden lipidos de ceramida modificados con PEG en WO 96/10391 (Choi et al.). Las Patentes Estadounidenses Nos. 5,540,935 (Miyazaki et al.) y 5,556,948 (Tagawa et al.) describe liposomas que contienen PEG que pueden ser derivados adicionalmente con porciones funcionales en sus superficies.
Se conocen en la técnica un número limitado de liposomas que comprenden ácidos nucleicos. WO 96/40062 por Thierry et al., describe métodos para encapsular ácidos nucleicos de peso molecular alto en liposomas. La Patente Estadounidense No. 5,264,221 por Tagawa et al., describe liposomas unidas a proteina y afirma que los contenidos de los liposomas pueden incluir un ARN antisentido. La Patente Estadounidense No. 5,665,710 por Rahman et al., describe ciertos métodos para encapsular oligodesoxinucleótidos en liposomas. WO 97/04787 por Love et al., describe liposomas que comprenden oligonucleótidos antisentido dirigidos al gen raf.
Las transfersomas son aún otro tipo de liposomas, y son agregados de lipido muy deformables los cuales son candidatos atractivos para vehículos de suministro del fármaco. Las transfersomas se pueden describir como gotas de lipido las cuales son muy deformables de forma que son fácilmente capaces de penetrar a través de poros los cuales son más pequeños que la gota. Las transfersomas son adaptables al ambiente en el cual se usan, por ejemplo, son auto-optimizables (adaptado a la . forma de poros en la piel), auto-reparables, frecuentemente alcanzan sus objetivos son fragmentación, y a menudo auto-cargables . Para elaborar transfersomas es posible agregar activadores de borde de superficie, usualmente tensoactivos , a una composición liposomal estándar. Las transíersomas se han usado para suministrar albúmina de suero a la piel. El suministro mediado por transfersoma de albúmina de suero se ha mostrado por ser efectivo como inyección subcutánea de una solución que contiene albúmina de suero.
Los tensoactivos encuentran amplia aplicación en formulaciones tales como emulsiones (que incluyen microemulsiones) y liposomas. La forma más común para clasificar y categorizar las propiedades de muchos tipos diferentes de tensoactivos, tanto natural como sintético, es por el uso del balance hidrofilico/lipofilico (HLB) . La naturaleza del grupo hidrofilico (también conocido como la "cabeza") proporciona los medios más útiles para categorizar los diferentes tensoactivos usados en formulaciones (Rieger, en Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, p. 285) .
Si la molécula de tensoactivo no es ionizada, se clasifica como un tensoactivo no iónico. Los tensoactivos no iónicos encuentran amplia aplicación en productos farmacéuticos y cosméticos, y son utilizables en un amplio intervalo de valores de pH. En general, sus valores HLB varían de 2 hasta aproximadamente 18 dependiendo de su estructura. Tensoactivos no iónicos incluyen ésteres no iónicos tales como ásteres de etilen glicol, ésteres de propilen glicol, ésteres de glicerilo, ésteres de poliglicerilo, ésteres de sorbitán, ésteres de sacarosa y ésteres etoxilados. También se incluyen alcanolamidas y éteres no iónicos tales como alcohol graso etoxilados, alcoholes propoxilados y polímeros en bloque etoxilados/propoxilados en esta clase. Los tensoactivos polioxietileno son los miembros más populares de la clase de tensoactivo no iónico.
Si la molécula de tensoactivo porta una carga negativa cuando se disuelve o dispersa en agua, el tensoactivo se clasifica como aniónico. Los tensoactivos aniónicos incluyen carboxilados tales como jabones, acil lactilatos, acil amidas de aminoácidos, ésteres de ácido sulfúrico tales como sulfatos de alquilo y sulfatos de alquilo etoxilados, sulfonatos tales como sulfonatos de alquil benceno, acil isetionatos, acil tauratos y sulfosuccinatos, y fosfatos. Los miembros más importantes de la clase de tensoactivo aniónico son los sulfatos de alquilo y los jabones.
Si la molécula de tensoactivo porta una carga positiva cuando se disuelve o dispersa en agua, el tensoactivo se clasifica como catiónico. Los tensoactivos catiónicos incluyen sales de amonio cuaternario y aminas etoxiladas. Las sales de amonio cuaternario son los miembros más usados de esta clase.
Si la molécula de tensoactivo tiene la capacidad para portar ya sea una carga positiva o negativa, el tensoactivo se clasifica como anfotérico. Los tensoactivos anfotéricos incluyen derivados de ácido acrilico, alquilamidas sustituidas, N-alquilbetainas y fosfátidos.
Se ha revisado el uso de tensoactivos en productos fármacos, formulaciones y en emulsiones (Rieger, en Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Dekker, Inc., New York, N. Y. , 1988, p. 285) .
Intensificadores de Penetración En una modalidad, la presente invención emplea varios intensificadores de penetración para efectuar el suministro eficiente de ácido nucleicos, particularmente oligonucleótidos , a la piel de animales. Muchos fármacos se presentan en solución en formas tanto ionizada como no ionizada. Sin embargo, usualmente únicamente lipidos solubles o fármacos lipofilicos fácilmente atraviesan las membranas celulares. Se ha descubierto que aún fármacos no lipofilicos pueden atravesar membranas celulares si la membrana a ser atravesada se trata con un intensificador de penetración. Además, ayuda a la difusión de fármacos no lipofílicos a través de las membranas celulares, los intensificadores de penetración también intensifican la permeabilidad de fármacos lipofílicos.
Los intensificadores de penetración pueden ser clasificados como pertenecientes a una de las cinco categorías amplias, es decir, tensoactivos , ácidos grasos, sales biliares, agentes quelantes y no tensoactivos no quelantes (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p. 92) . Cada una de las clases mencionadas anteriormente de intensificadores de penetración se describe posteriormente en mayor detalle.
Tensoactivos: En conexión con la presente invención, los tensoactivos (o "agentes de superficie activa") son entidades químicas las cuales, cuando se disuelven en una solución acuosa, reduce la tensión de superficie de la solución o la tensión interfacial entre la solución acuosa y otro líquido, con el que resulta de la absorción de oligonucleótidos a través de la mucosa es intensificado. Además a sales biliares y ácidos grasos, estos intensificadores de penetración incluyen, por ejemplo, lauril sulfato de sodio, éter de polioxietilen-9-lauril y éter de polioxietilen-20-cetilo) (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p. 92); y emulsiones perfluoroquímicas , tales como FC-43.
Takahashi et al., J. Pharm. Pharmacol., 1988, 40, 252). Ácidos grasos: Varios ácidos grasos y sus derivados los cuales actúan como intensificadores de penetración incluyen, por ejemplo, ácido oleico, ácido láurico, ácido cáprico (ácido n-decanoico) , ácido miristico, ácido palmitico, ácido esteárico, ácido linoleico, ácido linolénico, dicaprato, tricaprato, monooleina ( l-monooleoil-rac-glicerol ) , dilaurin, ácido caprilico, ácido araquidónico, 1-monocaprato de glicerol, l-dodecilazacicloheptan-2-ona, acilcarnitinas , acilcolinas, ásteres de alquilo Ci_io del mismo (por ejemplo, metilo, isopropilo y t-butilo) , y mono- y di-glicéridos del mismo (es decir, oleato, laurato, caprato, miristato, palmitato, estearato, linoleato, etc.) (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutics Drug Carrier Systems, 1991, p. 92; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; El Hariri et al., J. Pharm. Pharmacol., 1992, 44, 651-654).
Sales Biliares: El papel fisiológico de la bilis incluye la facilitación de dispersión y absorción de lipidos y vitaminas solubles en grasa (Brunton, Capitulo 38 en: Goodman & Gilman' s The Pharmacological Basis of Therapeutics , 9va Ed., Hardman et al. Eds . , McGraw-Hill , New York, 1996, pp . 934-935). Varias sales biliares naturales, y sus derivados sintéticos, actúa como intensificadores de penetración. De esta forma el término "sales biliares" incluyen cualquiera de los componentes que se originan naturalmente de la bilis, asi como también cualquiera de sus derivados. Las sales biliares de la invención incluyen, por ejemplo, ácido cólico (o su sal de sodio farmacéuticamente aceptable, colato de sodio), ácido deshidrocólico ( deshidrocolato de sodio), ácido desoxicólico (desoxicolato de sodio) , ácido glucólico (glucolato de sodio) , ácido glicólico (glicolato de sodio) , ácido glicodesoxicólico (glicodesoxicolato de sodio) , ácido taurocólico (taurocolato de sodio), ácido taurodesoxicólico (taurodesoxi colato de sodio) , ácido quenodesoxicólico (quenodesoxicolato de sodio) , ácido ursodesoxicólico (ÜDCA) , tauro-24, 25-dihidro-fusidato de sodio (STDHF) , glicohidrofusidato de sodio y éter polioxietilen-9-lauril (POE) (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, página 92; Swinyard, Capitulo 39 en: Remigton's Pharmaceutical Sciences, 18ava Ed., Gennaro, ed., Mack Publishing Co . , Easton, Pa . , 1990, páginas 782-783; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; Yamamoto et al., J. Pharm. Exp. Ther., 1992, 263, 25; Yamashita et al., J. Pharm. Sci . , 1990, 79, 579-583) .
Agentes Quelantes: Los agentes quelantes, como se usa en conexión con la presente invención, se pueden definir como compuestos que remueven iones metálicos de la solución formando complejos con ellos, con el resultado que la absorción de oligonucleótidos a través de la mucosa es intensificada. Con respecto a su uso como intesificadores de penetración en la presente invención, los agente quelantes tienen la ventaja adicional de también servir como inhibidores de ADNase, como nucleasas de ADN más caracterizadas requieren un ión de metal divalente para catálisis y son de esta forma inhibidos por agentes quelantes (Jarrett, J. Chromatogr., 1993, 618, 315-339). Los agentes quelantes de la invención incluyen, pero no se limitan a etilendiaminatetraacetato de disodio (EDTA) , ácido cítrico, salicilatos (por ejemplo, salicilato de sodio, 5-metoxisalicilato y homovanilato ) , derivados N-acilo de colágeno, derivados laureth-9 y N-amino acilo de beta-dicetonas (enaminas) (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutics Drug Carrier Systems, 1991, página 92; uranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; Buur et al., J. Control Reí., 1990, 14, 43-51) .
No tensoactivos no quelantes: Como se usa en la presente compuestos intensificadores de penetración no tensoactivos no quelantes se pueden definir como compuestos que demuestran actividad insignificante como agentes quelantes o como tensoactivos pero que sin embargo la absorción intensificada de oligonucleótidos a través de la mucosa alimentaria (Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33) . Esta clase de intensificadores de penetración incluye, por ejemplo, ureas cíclicas insaturadas, derivados de 1-alquilo y 1-alquenilazacilo-alcanona (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, página 92), y agentes anti-inflamatorios no esferoidales tales como diclofenaco sódico, indometacina y fenilbutazona (Yamashita et al., J. Pharm. Pharmacol., 1987, 39, 621-626).
Agentes que intensifican la captación de oligonucleótidos a nivel celular, también se pueden agregar al farmacéutico u otras composiciones de la presente invención. Por ejemplo, lípidos catiónicos, tales como lipofectina (Junichi et al., Patente Estadounidense No. 5,705,188), derivados de glicerol catiónico y moléculas policatiónicas , tales como polilisina (Lollo et a., Solicitud PCT WO 97/30731), también se conocen por intensificar la captación celular de oligonucleótidos.
Otros agentes que se pueden utilizar para intensificar la penetración de los ácidos nucleicos administrados, que incluyen glicoles tales como etilen glicol y propilen glicol, pirróles tales como 2-pirrolo, azonas y terpenos tales como limoneno y mentona.
Otros compuestos Las composiciones de la presente invención pueden adicionalmente contener otros componentes adjuntos convencionalmente encontrados en composiciones farmacéuticas, en sus niveles de uso establecidos en la técnica. De esta forma, por ejemplo, las composiciones pueden contener materiales farmacéuticamente activos, adicionales, compatibles tales como, por ejemplo, antipruritricos, astringentes, anestésicos locales o agentes ant i-inflamatorios , o pueden contener materiales adicionales útiles en físicamente formulación de varias formas de dosificación de las composiciones de la presente invención, tales como tintes, agentes sabori zantes , preservativos, antioxidantes, opacificadores , agentes espesantes y estabilizadores. Sin embargo, los materiales cuando se agregan, no deben indebidamente interferir con las actividades biológicas de los componentes de las composiciones de la presente invención. Las formulaciones pueden ser esterilizadas y, si se desea mezcladas con agentes auxiliares, por ejemplo, lubricantes, preservativos, estabilizadores, agentes humectantes, emulsificadores , sales para influenciar la presión osmótica, amortiguadores, colorantes, saborizantes y/o sustancias aromáticas y similares, las cuales no interactúa per udicialmente con los ácidos nucleicos de la formulación .
Suspensiones acuosas pueden contener sustancias las cuales incrementan la viscosidad de la suspensión incluyendo, por ejemplo, carboximetilcelulosa de sodio, sorbitol y/o dextrano. La suspensión puede también contener estabili zadores .
Ciertas modalidades de la invención, proporcionan composiciones farmacéuticas que contienen (a) uno o más compuestos antisentido y (b) uno o más de otros agentes quimioterapéuticos los cuales funcionan por un mecanismo no antisentido. Ejemplos de los agentes quimioterapéuticos incluyen, pero no se limitan a daunorubicina , daunomicina, dactinomicina, doxorubicina , epurubicina, idarubicina, esorubicina, bleomicina, mafosfamida, ifosfamida, citocina arabinósido, bis-cloroetilnitrosurea, busulfan, mitomicina C, actinomicina D, mitramicina, prednisona, hidroxiprogesterona, testosterona, tamoxifeno, dacarbazina, procarbazina, hexametilmelamina , pentametilmelamina , mitoxantrona , amsacrina, clorambucilo , metilciclohexilnitrosurea, nitrógeno, mostaza, melfalano, ciclofosfamida, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina , citarabina, 5-azacitidina , hidroxiurea, desoxicoformicina , 4-hidroxiperoxiciclofosforamida, 5-fluorouracilo (5-FU), 5-fluorodesoxiuridina (5-FUdR), metotrexato (MTX), colquicina, taxol, vincristina, vinblastina, etopósido (VP-16), trimetrexato, irinotecano, topotecano, gemcitabina, tenipósido, cisplatino y dietilestilbestrol (DES). Véase, generalmente, The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 15ava Ed., 1987, pp . 1206-1228, Berkow et al., Eds . , Rahway, N.J. Cuando se usan con los compuestos de la invención, estos agentes quimioterapéuticos se pueden usar individualmente (por ejemplo, 5-FU y oligonucleótido) , secuencialmente (por ejemplo, 5-FU y oligonucleótido por un periodo de tiempo seguido por MTX y oligonucleótido) , o en combinación con uno o más de otros agentes quimioterapéuticos (por ejemplo, 5-FU, MTX y oligonucleótido, o 5-FU, radioterapia y oligonucleótido) . Fármacos anti-inflamatorios , que incluyen pero no se limitan a fármacos anti-inflamatorios no esteroidales y corticoesteroides , y fármacos antivirales, que incluyen pero no se limitan a ribivirina, vidarabina, aciclovir y ganciclovir, pueden también ser combinados en composiciones de la invención. Véase, generalmente, The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 15ava Ed., Berkoe et al., eds., 1987, Rahway, N.J., páginas 2499-2506 y 46-49, respectivamente) . Otros agentes quimioterapéuticos no antisentido también están dentro del alcance de esta invención. También se pueden usar juntos o secuencialmente dos o más compuestos combinados. En otra modalidad relacionada, las composiciones de la invención pueden contener uno o más compuestos antisentido, particularmente oligonucleotidos, dirigidos a un primer ácido nucleico y uno o más compuestos antisentido adicionales dirigidos a un segundo ácido nucleico objetivo. Numerosos ejemplos de compuestos antisentido se conocen en la técnica. Dos o más compuestos combinados se pueden usar juntos o secuencialmente .
Los compuestos antisentido usados de conformidad con esta invención, pueden ser convenientemente y rutinariamente hechos a través de la técnica bien conocida de síntesis de fase sólida. El equipamiento para esta síntesis se vende por varios proveedores que incluyen, por ejemplo, Applied Biosystems (Foster City, CA) . Cualquier otro medio para esta síntesis conocida en la técnica puede adicionalmente o alternativamente ser empleado. Se conoce bien el uso de técnicas similares para preparar oligonucleotidos tales como los fosforotioatos y derivados alquilados .
Los compuestos antisentido de la invención se sintetizan in vitro y no incluyen composiciones antisentido de origen biológico, o constructos del vector genético diseñados para dirigir la síntesis in vivo de moléculas antisentido. Los compuestos de la invención pueden también ser mezclados, encapsulados , conjugados o de otra forma asociados con otras moléculas, estructuras moleculares o mezclas de compuestos, como por ejemplo, liposomas, receptores dirigidos a moléculas, formulaciones orales, rectales, tópicos u otras, para ayudar a la captación, distribución y/o absorción. Patentes de Estados Unidos representativas que enseñan la preparación de la captación, distribución y/o absorción que ayudan a las formulaciones incluyen, pero no se limitan a, Patentes Estadounidenses Nos. 5, 108, 921; 5, 354, 844; 5,416,016; 5,459, 127; 5, 521, 291; 5, 543, 158; 5,547, 932; 5, 583, 020; 5, 591, 721; 4,426, 330; 4, 534, 899; 5, 013, 556; 5, 108, 921; 5, 213, 804 ; 5, 227, 170; 5, 264, 221; 5,356, 633; 5, 395, 619; 5,416, 016; 5, 417, 978; 5, 462, 854; 5, 469, 854; 5, 512, 295; 5, 527, 528; 5, 534, 259; 5, 543, 152; 5, 556, 948; 5,580,575 y 5,595,756, cada una de las cuales se incorpora en la presente por referencia.
Ciertas Indicaciones La especificidad y sensibilidad de antisentido también se aprovecha por aquellos expertos en la técnica para usos terapéuticos. Oligonucleótidos antisentido se han empleado como porciones terapéuticas en el tratamiento de estados de enfermedad en animales y humanos . Fármacos de oligonucleót ido antisentido, que incluyen ribozimas, han sido seguramente y efectivamente administrados a humanos y numerosos ensayos clínicos están actualmente en curso. Por lo que se establece que los oligonucleótidos pueden ser modalidades terapéuticas útiles que pueden ser configuradas para ser útiles en regímenes de tratamiento para el tratamiento de células, tejidos y animales, especialmente humanos .
En cierta modalidad de la invención proporciona un método para tratar una enfermedad o condición asociada con expresión del CTGF, en donde la enfermedad es un trastorno hiperproliferativo el cual incluye cáncer, en donde el cáncer es de mama, próstata, renal, pancreático, cabeza y cuello, gástrico, y cáncer de mieloma múltiple (Véase, Pickles M and Leask A, J Cell Commun Signal. 2007 Sep; l(2):85-90. Epub 2007 Jul 17; Mullís T.C., Tang X., Chong K.T., J Clin Pathol. 2008 Mayo; 61 ( 5) : 606-10 ; Liu L.Y., et al. World J Gastroenterol . 2008 Abril 7; 14 (13) : 2110-4 ; Chintalapudi M.R., et al., Carcinogenesis . 2008 Abril; 29 (4) : 696-703. Epub 2008 Enero 22; Numemasa S., et al., Br J Haematol. 2007 Oct; 139 ( 1 ) : 1-50 ; Shimo T . , et al. J Bone Miner Res. 2006 Jul; 21 (7 ): 1045-59; y Yang F. , et al., Cáncer Res. 2005 Oct 1 ; 65 ( 19 ) : 8887 -95 ) .
En una modalidad de la invención, el método comprende tratar una enfermedad o condición, en donde la enfermedad o trastorno es una enfermedad fibrótica. En una modalidad del método de la invención, la enfermedad fibrótica es una cicatriz hipertrófica, queloides, cicatriz de la piel, fibrosis de hígado, fibrosis pulmonar, fibrosis renal, fibrosis cardiaca o restenosis.
En otra modalidad de la invención, el método además comprende tratar la enfermedad o condición antes mencionada, en donde la enfermedad o trastorno es fibrosis de articulación (que incluye síndrome de hombro congelado, lesión del nervio periférico y tendón) , lesión de la médula espinal, derivación coronaria, adhesiones abdominales y perifonéales (que incluyen endometriosis , leiomiomata uterina y fibroides), queratotomía radial y queratectomía fotorefractaria, cirugía de reinserción retinal, fibrosis mediada por dispositivo (en por ejemplo, diabetes), adhesiones de tendón, contractura Dupuytren, o escleroderma .
En otra modalidad de la invención también proporciona un método para reducir cicatriz hipertrófica que resulta de curación de herida dérmica en un sujeto en necesidad del mismo, el cual comprende administrar al sujeto una cantidad del compuesto de un oligonucleótido antisentido efectivo para inhibir la expresión del factor de crecimiento del tejido conectivo (CTGF) en el sujeto de forma que se reduce la cicatriz de la curación de herida en el sujeto. El sujeto puede incluir un humano o un animal no humano.
La formulación de composiciones terapéuticas y su administración subsecuente se cree estar dentro de la experiencia de aquellos en la técnica. La dosificación es dependiente de la severidad y respuesta del estado de enfermedad a ser tratado, con el curso del tratamiento que dura por varios días a varios meses, o hasta que se efectúa una cura o se logra una disminución del estado de enfermedad. Esquemas de dosificación óptima pueden ser calculados de mediciones de acumulación de fármaco en el cuerpo del paciente. Las personas de experiencia ordinaria pueden fácilmente determinar dosificaciones óptimas, metodologías de dosificación y proporciones de repetición. Las dosificaciones óptimas pueden variar dependiendo de la potencia relativa de oligonucleótidos individuales, y pueden generalmente ser estimadas en base a EC50 encontrados por ser efectivos en modelos animales in vitro o in vivo. En general, la dosificación es de 0.01 µ? hasta 100 g por kg de peso corporal, y puede ser proporcionado una o más veces diariamente, semanalmente, mensualmente o anualmente, o aún una vez cada 2 hasta 20 años. Las personas de experiencia ordinaria en la técnica pueden fácilmente estimar proporciones de repetición para dosificación en base a tiempos de residencia medidos y concentraciones del fármaco en fluidos o tejidos corporales. Después del tratamiento exitoso, puede ser deseable que el paciente se someta a terapia de mantenimiento para prevenir la recurrencia del estado de enfermedad, en donde el oligonucleótido se administra en dosis de mantenimiento, que varia de 0.01 yiq hasta 100 g por kg del peso corporal, una o más veces diariamente, hasta una vez cada 20 años.
En otra modalidad de esta invención, el método además comprende reducir las cicatrices hipertróficas que resultan de curación de herida dérmica, en donde la curación de herida es cicatrización en una herida seleccionada del grupo que consiste de ruptura de la piel, incisiones quirúrgicas y quemaduras.
En ciertas modalidades, la invención proporciona métodos para tratar un individuo que comprende administrar uno o más composiciones farmacéuticas de la presente invención. En ciertas modalidades, el individuo tiene uno de los trastornos mencionados anteriormente. En ciertas modalidades, el individuo está en riesgo de uno de los trastornos mencionados anteriormente. En ciertas modalidades, el individuo ha sido identificado por estar en necesidad de la terapia. En ciertas modalidades, la invención proporciona métodos para reducir profilácticamente expresión del CTGF en un individuo.
Ciertas modalidades incluyen tratar un individuo en necesidad del mismo administrando a un individuo una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico del CTGF.
En una modalidad, la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico del CTGF es acompañado por monitoreo de niveles del CTGF en el suero de un individuo, para determinar una respuesta del individuo a la administración del compuesto antisentido. Una respuesta del individuo a la administración del compuesto antisentido se usa por un médico para determinar la cantidad y duración de la intervención terapéutica.
En una modalidad, la administración de un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico del CTGF resulta en la reducción de expresión del CTGF por al menos 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 99%, o un intervalo definido por cualquiera de dos de estos valores. En una modalidad, la administración de un compuesto antisentido diriqido a un ácido nucleico del CTGF resulta en un cambio en una medición del CTGF como se mide por una prueba estándar, por ejemplo, pero no se limita a, CTGF. En algunas modalidades, la administración de un compuesto antisentido del CTGF incrementa la medición por al menos 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 99%, o un intervalo definido por cualquiera de dos de estos valores. En algunas modalidades, la administración de un compuesto antisentido del CTGF disminuye la medición por al menos 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 99%, o un intervalo definido por cualquiera de dos de estos valores .
En ciertas modalidades, la composición farmacéutica comprende un compuesto antisentido dirigido al CTGF se usa para la preparación de un medicamento para tratar un paciente que sufre o es susceptible a cualquiera de una de los trastornos antes mencionados.
Ciertas Terapias de Combinación En ciertas modalidades, una o más de las composiciones farmacéuticas de la presente invención se coadministran con uno o más de otros agentes farmacéuticos. En ciertas modalidades, uno o más de otros agentes farmacéuticos se diseñan para tratar la misma enfermedad o condición como una o más de las composiciones farmacéuticas de la presente invención. En ciertas modalidades, uno o más de otros agentes farmacéuticos diseñados para tratar una enfermedad o condición diferente a una o más de las composiciones farmacéuticas de la presente invención. En ciertas modalidades, uno o más de otros agentes farmacéuticos se diseñan para tratar un efecto indeseado de una o más composiciones farmacéuticas de la presente invención. En ciertas modalidades, una o más de las composiciones farmacéuticas de la presente invención se coadministran con otro agente farmacéutico para tratar un efecto indeseado de otro agente farmacéutico. En ciertas modalidades, una o más composiciones farmacéuticas de la presente invención y uno o más de otros agentes farmacéuticos se administran al mismo tiempo. En ciertas modalidades, una o más composiciones farmacéuticas de la presente invención y uno o más de otros agentes farmacéuticos se administran a tiempos diferentes. En ciertas modalidades, una o más composiciones farmacéuticas de la presente invención y uno o más de otros agentes farmacéuticos se preparan juntos en una formulación única. En ciertas modalidades, una o más composiciones farmacéuticas de la presente invención y uno o más de otros agentes farmacéuticos se preparan separadamente.
En ciertas modalidades, los agentes farmacéuticos que pueden ser co-administrados con una composición farmacéutica de la presente invención incluyen un segundo agente terapéutico. En ciertas modalidades, los agentes farmacéuticos que se pueden co-administrar con una composición farmacéutica de la presente invención incluye, pero no se limitan a un segundo agente terapéutico. En ciertas modalidades, el segundo agente terapéutico se administra antes de la administración de una composición farmacéutica de la presente invención. En ciertas modalidades, el segundo agente terapéutico se administra después de la administración de una composición farmacéutica de la presente invención. En ciertas modalidades, el segundo agente terapéutico se administra al mismo tiempo que la composición farmacéutica de la presente invención. En ciertas modalidades, la dosis de un segundo agente terapéutico co-administrado es la misma que dosis que puede ser administrada si el segundo agente terapéutico se administra solo. En ciertas modalidades, la dosis de un segundo agente terapéutico co-administrado es menor que la dosis que puede ser administrada si el segundo agente terapéutico se administra solo. En ciertas modalidades, la dosis de un segundo agente terapéutico co-administrado es mayor que la dosis que puede ser administrada si el segundo agente terapéutico se administra solo.
En ciertas modalidades, la co-administración de un segundo compuesto intensifica el efecto terapéutico de un primer compuesto, de forma que la co-administración de los compuestos resulta en un efecto terapéutico que es mayor que el efecto de administrar el primer compuesto solo, un efecto sinergistico . En otras modalidades, la coadministración resulta en efectos terapéuticos que son adicionales a los efectos de los compuestos cuando se administran solos. En otras modalidades, la coadministración resulta en efectos terapéuticos que son supra-adicionales de los efectos de los compuestos cuando se administran solos. En algunas modalidades, el primer compuesto es un compuesto antisentido. En algunas modalidades, el segundo compuesto es un compuesto antisentido .
Esta invención se ilustra en la Sección Detallada Experimental que sigue. Esta sección se establece para ayudar en un entendimiento de la invención pero no se pretende, y no debe ser construida para limitar en cualquier forma la invención como se establece en las reivindicaciones las cuales siguen posteriormente.
Ejemplos EJEMPLO 1 : Cultivo celular y tratamiento de compuestos antisentido Los efectos de compuestos antisentido en el nivel, actividad o expresión de ácidos nucleicos del CTGF se pueden probar in vitro en una variedad de tipos celulares. Los tipos celulares usados para los análisis están disponibles por proveedores comerciales (por ejemplo, American Type Culture Collection, Manasus, VA; Zen-Bio, Inc., Research Triangle Park, NC; Clonetics Corporation, Walkersville, MD) y las células se cultivan de conformidad con las instrucciones del proveedor usando reactivos comercialmente disponibles (por ejemplo, Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) . Tipos celulares ilustrativos incluyen, pero no se limitan a, células HepG2 , células Hep3B y hepatocitos primarios.
Ejemplo 2 : Pruebas in vitro de oligonucleotidos antisentido Descritos en la presente están métodos para el tratamiento de células con oligonucleótidos antisentido, los cuales pueden ser modificados apropiadamente para el tratamiento con otros compuestos antisentido.
En general, las células se tratan con oligonucleótidos antisentido cuando las células alcanzan aproximadamente 60-80% de confluencia en cultivo.
Un reactivo comúnmente usado para introducir oligonucleótidos antisentido en cultivos celulares incluye el reactivo de transfección de lipido catiónico LIPOFECTIN® (Invitrogen, Carlsbad, CA) . Los oligonucleótidos antisentido se mezclan con LIPOFECTIN® en OPTI-MEM® 1 (Invitrogen, Carlsbad, CA) para lograr la concentración final deseada de oligonucleotido antisentido y una concentración de LIPOFECTIN® que típicamente varía de 2 hasta 12 µg/ml por 100 nM de oligonucleotido antisentido.
Otro reactivo usado para introducir oligonucleótidos antisentido en células cultivadas incluye LIPOFECTAMINE® (Invitrogen, Carlsbad, CA) . El oligonucleotido antisentido se mezcla con LIPOFECTAMINE® en OPTI-MEM® 1 reduce el medio de suero (Invitrogen, Carlsbad, CA) para lograr la concentración deseada de oligonucleotido antisentido y una concentración de LIPOFECTAMINA® que típicamente varía de 2 hasta 12 yg/ml por 100 nM de oligonucleotido antisentido.
Las células se tratan con oligonucleotidos antisentido por métodos de rutina. Las células son típicamente recolectadas 16-24 horas después del tratamiento con oligonucleótido antisentido, tiempo en el cual los niveles de ARN o proteína de ácidos nucleicos objetivos se miden por métodos conocidos en la técnica y se describen en la presente. En general, cuando se realizan los tratamientos en replicas múltiples, los datos se presentan como el promedio de los tratamientos replicados .
La concentración del oligonucleótido antisentido usado varía de línea celular a línea celular. Métodos para determinar la concentración de oligonucleótido antisentido óptima para una línea celular particular son bien conocidos en la técnica. Los oligonucleotidos antisentido son típicamente usados a concentraciones que varía de 1 nM hasta 300 nM.
EJEMPLO 3 : Aislamiento de ARN El análisis ARN se puede realizar en ARN celular total o ARNm poli(A)+. Métodos de aislamiento de ARN son bien conocidos en la técnica. El ARN se prepara usando métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, usando el Reactivo TRIZOLO (Invitrogen, Carlsbad, CA) de conformidad con los protocolos recomendados por el fabricante.
EJEMPLO 4 : Análisis de inhibición de niveles o expresión dirigidos La inhibición de niveles o expresión de un ácido nucleico del CTGF puede ser sometida a ensayo en una variedad de formas conocidas en la técnica. Por ejemplo, se pueden cuantificar niveles de ácido nucleico objetivo por, por ejemplo, análisis de manchado Northern, reacción en cadena de polimerasa competitiva (PCR) o PCR en tiempo real cuantitativo. El análisis de ARN se puede realizar en ARN celular total o ARNm poli(A)+. Los métodos para aislar ARN son bien conocidos en la técnica. El análisis de manchado Northern también es de rutina en la técnica. El PCR en tiempo real cuantitativo puede ser convencionalmente logrado usando el Sistema de Detección de Secuencia ABI PRISM® 7600, 7700 o 7900 comercialmente disponible, disponible de PE-Applied Biosystems, Foster City, CA y usado de conformidad con las instrucciones del fabricante.
Ejemplo 5: Análisis por PCR en tiempo real Cuantitativo de Niveles de ARN objetivos La cuantificación de niveles de ARN objetivo se puede lograr por PCR en tiempo real cuantitativo usando el Sistema de Detección de Secuencia ABI PRISM® 7600, 7700 o 7900 (PE-Applied Biosystems, Foster City, CA) de conformidad con las instrucciones del fabricante. Los métodos de PCR en tiempo real cuantitativo son bien conocidos en la técnica.
Antes del PCR en tiempo real, el ARN aislado se somete a reacción de transcriptasa inversa (RT) , la cual produce ADN complementario (ADNc) que después se usa como el sustrato para amplificación PCR en tiempo real. Las reacciones RT y PCR en tiempo real se realizan secuencialmente en la misma muestra. Los reactivos RT y PCR en tiempo real se obtienen de Invitrogen (Carlsbad, CA) . Las reacciones RT, PCR en tiempo real se llevan a cabo por métodos bien conocidos por aquellos expertos en la técnica .
Las cantidades dirigidas del gen (o ARN) obtenidas por PCR en tiempo real se normalizan usando ya sea el nivel de expresión de un gen cuya expresión es constante, tal como ciclofilina A, o cuantificando el ARN total usando RIBOGREEN® (Invitrogen, Inc. Carlsbad, CA) . La expresión de ciclofilina A se cuantifica por PCR en tiempo real, siendo corrida simultáneamente con el objetivo, multiplexado o separadamente. El ARN total se cuantifica usando el reactivo de cuantificación de ARN RIBOGREEN® (Invitrogen, Inc. Eugene, OR) . Los métodos de cuantificación de ARN por RIBOGREEN® se enseñan en Jones, L.J., et al., (Analytical Biochemistry, 1988, 265, 368-374). Se usa un instrumento CYTOFLUOR® 4000 (PE Applied Biosystems) para medir la fluorescencia RIBOGREEN®.
Sondas y cebadores se diseñan para hibridizar a un ácido nucleico del CTGF. Métodos para diseñar sondas y cebadores PCR en tiempo real son bien conocidos en la técnica, y pueden incluir el uso del software tal como el Software PRIMER EXPRESS® (Applied Biosystems, Foster City, CA) .
Ejemplo 6: Análisis de Niveles de Proteina La inhibición antisentido de ácidos nucleicos del CTGF se puede valorar midiendo los niveles de proteina del CTGF. Los niveles de proteína del CTGF se pueden evaluar o cuantificar en una variedad de formas bien conocidas en la técnica, tal como inmunoprecipitación, análisis de manchado Western ( inmunomanchado ) como se describe en el Ejemplo 9 posterior, ensayo inmunosorbente enlazado a la enzima (ELISA) , ensayos de proteína cuantitativa, ensayos de actividad de proteína (por ejemplo, ensayos de actividad de caspasa) , inmunohistoquímica , inmunocitoquímica o clasificación celular activada por fluorescencia (FACS). Anticuerpos dirigidos a un objetivo se pueden identificar y obtener a partir de una variedad de fuentes, tales como el catálogo MSRS de anticuerpos (Aerie Corporation, Birmingham, MI) o se pueden preparar vía métodos de generación de anticuerpo monoclonal o policlonal convencionales bien conocido en la técnica. Anticuerpos útiles para la dirección del CTGF humano y rata están comercialmente disponibles.
Ejemplo 7 : Prueba in vivo de Compuestos Antisentido Compuestos antisentido, por ejemplo oligonucleótidos antisentido, se prueban en animales para valorar su capacidad para inhibir la expresión del CTGF y produce cambios fenotipicos. La prueba se puede realizar en animales normales, o en modelos de enfermedad experimentales. Para administración a animales, se formulan oligonucleótidos antisentido en un diluyente farmacéuticamente aceptable, tal como salina amortiguada de fosfato. La administración incluye rutas parenterales de administración, tal como intraperitoneal , intravenosa y subcutánea. El cálculo de dosificación de oligonucleótido antisentido y frecuencia de dosificación están dentro de las capacidades de aquellos expertos en la técnica, y depende de factores tales como ruta de administración y peso corporal del animal. Después de un periodo de tratamiento con oligonucleótidos antisentido, se aisla el ARN de tejido de hígado y se miden cambios en expresión de ácido nucleico del CTGF. También se miden cambios en niveles de proteína del CTGF usando los métodos descritos antes en el Ejemplo 6.
Ejemplo 8: Selección de Candidato de Oligonucleótido Antisentido (CTGF) de Factores de Crecimiento del Tejido Conectivo Humano Principal Introducción De conformidad con la presente invención, se diseñan una serie de oligonucleótidos para dirigirse a diferentes regiones del ARN del factor de crecimiento del tejido conectivo humano, usando secuencias publicadas (Número de acceso a GenBank: NM_001901.2 , incorporada en la presente como SEC ID NO: 9 y número de acceso al GenBank NT_025741.14 , incorporada en la presente como SEC ID NO: 10) .
Este estudio analiza el espacio de secuencia disponible y oligonucleótidos antisentido modificados dirigidos a espacio tanto exónico como intrónico del CTGF. Se sintetizan y evalúan aproximadamente 150 nuevas secuencias objetivo por actividad contra el CTGF en cultivo celular. Los oligonucleótidos se muestran en la Tabla 1. Todos los compuestos en la Tabla 1 son oligonucleótidos quiméricos ("gapmeros") de 20 nucleótidos en longitud, compuestos de una región "gap" central que consiste de ya sea diez 2 ' -desoxinucleotidos , el cual es flanqueado en ambos lados (direcciones 5' y 3' ) por cinco nucleótidos "alas" o 13 2 ' -desoxinucleótidos , el cual es flanqueado en ambos lados (direcciones 5' y 3' ) por dos y cinco nucleótidos "alas", respectivamente. Los alas se componen de nucleótidos 2 ' -metoxietilo (2'-MOE) . Los linajes de internucleósido (armazón) son fosforotioato (P=S) por todo el oligonucleótido . Todos los residuales de cistidina son 5-meticit idinas . Los compuestos se analizan por su efecto en niveles de ARNm del factor de crecimiento del tejido conectivo humano por PCR en tiempo real cuantitativo como se describe en otros ejemplos en la presente. Los datos son promedios de dos experimentos. Si está presente, "N.D" indica "no datos".
Tabla 1 Inhibición de niveles de ARNm del factor de crecimiento del tejido conectivo humano por oligonucleótidos de fosforotioato quimérico que tiene alas 2' -MOE y una apertura desoxi SEC ID SITIO % SEC ID ISIS # REGIÓN NO SECUENCIA *ND - es decir, no determinado en el experimento, pero es muy activo en otro ensayo.
Como se muestra en la Tabla 1, las SEC ID NOs : 11-15, 17-20, 24, 26-34, 36-57, 59, 61, 63-82, 84-86, 88, 95, 97, 99, 102, 103, 105, 107, 108, 122, 125, 127-140, 145, 146, 149, 151-154, 156, 159, 161-165 demuestran al menos 24% de inhibición de expresión del factor de crecimiento del tejido conectivo humano en este ensayo y por lo tanto son preferidos. Los sitios objetivos a los cuales estas secuencias preferidas son complementarias son referidos en la presente como "sitios activos" y son por lo tanto sitios preferidos para ser objetivos por compuestos de la presente invención .
El compuesto antisentido es complementario dentro del intervalo de nucleótidos en la secuencia del CTGF, es decir, dentro del intervalo de nucleótidos 718-751, 1388-1423, 1457-1689, 2040-2069, 2120-2147 o 2267-2301 de la SEC ID NO: 9. En cierta modalidad, el compuesto antisentido es complementario dentro del intervalo de nucleótidos 2728-2797 de la SEC ID NO: 10. Los compuestos dirigidos a estos intervalos demuestran al menos 50% de inhibición (es decir, SEC ID NOs: 15, 29, 31, 42, 46-49, 53, 72, 81, 82, 152-154, 164 y 165). Ciertos sitios objetivos listados en la Tabla 1 también demuestran al menos 50% de inhibición (es decir, SEC ID NOs: 12, 20, 33, 34, 6, 107, 129, 132, 134, 136 y 146) .
En ciertas modalidades, el compuesto antisentido es complementario dentro del intervalo de nucleótidos 553-611, 1394-1423, 1469-1508, 1559-1605, 1659-1689 o 2100-2129. Los compuestos dirigidos en este sentido demuestran al menos 60% de inhibición (es decir, SEC ID NOs: 27, 38, 43, 50, 52, 54, 55, 77, 79 y 86) . Ciertos sitios objetivos listados en la Tabla 1 también demuestran al menos 60% de inhibición (es decir, SEC ID NOs: 24, 61, 63, 67, 69, 73, 125, 139 y 161) .
El compuesto antisentido también es complementario dentro del intervalo de nucleótidos 1399-1423. Los compuestos dirigidos en este sentido demuestran al menos 70% de inhibición (es decir, SEC ID NOs: 39 y 40) . Ciertos sitios objetivos listados en la Tabla 1 también demuestran al menos 70% de inhibición (es decir, SEC ID NOs: 28, 30, 45, 51, 56, 78, 128 y 138) . Un sitio objetivo listado en la Tabla 1 también demuestra al menos 80% de inhibición (es decir, SEC ID NO: 44) . En ciertas modalidades, el porcentaje de inhibición se logra cuando el compuesto antisentido se suministra a células HuVec a una concentración de 50 nm.
Conductores múltiples con aparente actividad mayor que la secuencia principal ASO histórica, SEC ID NO: 15 (ISIS 124238), se identifican en secuencias tanto exónicas como intrónicas.
Estudios de respuesta a la dosis en nueve secuencias muy activas (SEC ID NOs: 28, 30, 39, 40, 45, 52, 56, 78, 125) se completaron (véase Figura 8). SEC ID NO: 13 y 15 (ISIS 124212 y 124238) son los oligonucleótidos previamente designados y SEC ID NO: 167 (ISIS 141923, secuencia CCTTCCCTGA AGGTTCCTCC) es el control negativo. ' Materiales y Métodos Se seleccionan y confirman oligonucleótidos a una concentración de 50 nM en células endoteliales de vena umbilical (HuVEC) usando transfección mediada por Lipofectina. Las células HuVEC de Cascade Biologics (Portland, OR) mantenidas en Medio 200 suplementado con Suplemento de Crecimiento Bajo en Suero (de Cascade Biologics) se colocan en placas de 96 cavidades a 5,000 células por cavidad y se incuban durante la noche a 37°C en la presencia de C02 al 5%. Al siguiente día el medio se aspira y reemplaza con Opti-MEM I precalentado (Invitrogen) que contiene mezcla Oligo-Lipofectamina 2000 (Invitrogen) (3 mg de Lipofectamina 2000 por 1 mi de medio Opti-MEM) .
Después de 4 horas, la mezcla de transfección se intercambia por Medio 200 fresco suplementado con Suplemento de Crecimiento Bajo en Suero y se incuba a 37°C en la presencia de C02 al 5%. Después de 16-24 horas, a aproximadamente 80% de confluencia, las células se lavan con salina amortiguada de fosfato (PBS) y se lisan por purificación de ARN con el Kit RNeasy de Qiagen. Se mide el mensaje del CTGF por reacción en cadena de polimerasa en tiempo real cuantitativa (RT-PCR) (series de Cebador/Sonda mostradas a continuación) y los resultados se normalizan a ARN total.
Análisis Estadístico Cada una de las muestras se analiza por duplicado, y las barras verticales representan el espaciado entre las dos mediciones.
Resultados y Discusión De las aproximadamente 150 nuevas secuencias objetivo sintetizadas y evaluadas por actividad contra el CTGF en cultivo celular, los nuevos oligonucleótidos del CTGF (SEC ID NOs: 28, 30, 39, 40, 45, 52, 56, 78, 125 y 166) muestran excelente inhibición de expresión ARNm del CTGF. Los oligonucleótidos muy activos identificados se proporcionan en la Figura 7.
Un número de nuevos oligonucleótidos intrónicos (Figuras 4, 5 y 6) y exónicos (Figuras 1, 2 y 3) sorprendentemente son significantemente más activos que los compuestos previamente seleccionados históricos, que incluyen ISIS 124238.
La eficiencia de exones objetivo antisentido es generalmente mayor que aquellos intrones objetivo (Figura 7A) . Se proporcionan un listado de estas secuencias de nucleótido exónico en la Figura 7B.
Los oligonucleótidos antisentido más activos 10 de la parte superior se confirman en experimentos de respuesta a la dosis en células HuVEC usando el método descrito anteriormente .
Ejemplo 9: Análisis de Manchado Western de Niveles de Proteina del Factor de Crecimiento del Tejido Conectivo El análisis de mancado Western (análisis de inmunomanchado) se llevan a cabo usando métodos estándar. Las células se recolectan 16-20 horas después del tratamiento con oligonucleótido, se lavan una vez con PBS, se suspenden en amortiguador Laemmli (100 µ?/cavidad) , se hierven por 5 minutos y se cargan en un gel SDS-PAGE al 16%. Los geles se corren por 1.5 horas a 150 V, y se transfieren a la membrana para manchado western. Se usa el anticuerpo primario apropiado dirigido al factor de crecimiento del tejido conectivo, con un anticuerpo secundario radioetiquetado o fluorescentemente etiquetado dirigido contra las especies de anticuerpo primario. Se visualizan bandas usando un PHOSPHORIMAGER™ (Molecular Dynamics, Sunnyvale CA) .
Ejemplo 10: Estudio Piloto de Toxicologia de Oligonucleótido Antisentido del CTGF de Ratón Objetivo del Estudio El propósito de este estudio toxicológico piloto es para evaluar tres oligonucleót idos dirigidos al CTGF humano para potencial toxicidad en ratones BALB/c machos normales. Los oligonucleótidos probados son secuencias ISIS 412294 (SEC ID NO: 39), 412295 (SEC ID NO: 40), y 418899 (SEC ID NO: 166) .
Métodos Ratones BALB/c machos (aproximadamente 8 semanas de edad) que pesan aproximadamente 25 gramos, se alimentaron con una dieta de alimento para laboratorio normal durante el estudio. Los ratones se dosificaron subcutáneamente (SQ) dos veces por semana con 25 o 50 mg/kg de oligonucleótidos antisentido por 4 semanas (n=6) . Se midieron los siguientes criterios de valoración: - Pesos Corporales Semanalmente; - Químicas de Plasma Sanguíneo durante 4 semanas; - Peso del órgano, peso corporal en la necropsia; y - Cepa H&E de Hígado y Riñon.
Resultados Los resultados después de 4 semanas de dosificación con 25 mg/kg o 50 mg/kg de oligonucleótido antisentido ISIS 412294 (SEC ID NO: 39), ISIS 412295 (SEC ID NO: 40) o ISIS 418899 (SEC ID NO: 166) indican un número de criterios de valoración que difieren significantemente del grupo control de ratones tratado con salina. Estos incluyen : 1) Niveles de alanina aminotransferasa (ALT) y aspartato aminotransferasa (AST) en plasma después de 4 semanas de tratamiento con 25 mg/kg o 50 mg/kg de ISIS 412295 (SEC ID NO: 39) o ISIS 412295 (SEC ID NO: 40) o con 25 mg/kg de ISIS 418899 (SEC ID NO: 166) son similares a los niveles en el control de salina (vehículo) , sin embargo los ratones dosificados con 50 mg/kg de ISIS 418899 (SEC ID NO: 166), muestran niveles de ALT/AST significantemente incrementados por arriba de los valores observados en el grupo control (véase Figuras 9A y 9B) . Esto es un resultado sorprendente que no se pronostica en estudios previos o por los ensayos a base de célula. 2) La ganancia de peso para el grupo tratado con 50 mg/kg de 412295 es significantemente menor que la ganancia de peso en el grupo control (véase Figura 10).
Conclusión La SEC ID NO: 39 (ISIS 412294) no exhibe muchas característica toxicológica indeseables como la SEC ID NO: 40 (ISIS 412295) y SEC ID NO: 166 (ISIS 41899). Este resultado es completamente inesperado, y no se pronostica por el comportamiento del cultivo celular de estas secuencias de oligonucleótido .
Ejemplo 11: Efecto de un Oligonucleótido Antisentido del CTGF de Rata (SEC ID NO: 163) en Expresión de ARNm del CTGF y Colágeno en Ratas Heridas Objetivo Se usa el oligonucleótido antisentido del CTGF de SEC ID NO: 163 (ISIS 412442) para examinar la capacidad de un oligonucleotido antisentido del CTGF para reducir la expresión de tanto del CTGF como de CollA2 (un biomarcador de cicatrización) en un modelo animal de cicatrización e rata. Este oligonucleotido antisentido tiene una estructura química idéntica como la SEC ID NO: 39 (ISIS 412294), sin embargo la secuencia se ha modificado ligeramente para ser 100% complementaria a la secuencia de ARNm del CTGF de rata .
Herida Se introducen cuatro punzones para biopsia de 0.8 centímetros de espesor total en las espaldas de ratas sin pelo de 10 semanas de edad (día 1 de estudio) , dos en cada lado de la línea media de la espina. Las heridas se dejan abiertas, pero se cubren con un vendaje oclusivo estéril .
Dosificación de Oligonucleotido Antisentido Los dos sitios de biopsia en el lado derecho del animal se tratan intra-dérmicamente con oligonucleotido antisentido del CTGF en los días 1, 5, 9 y 13 después de la biopsia en cualquiera de 3.0, 1.0, 0.3 o 0.1 mg del nucleótido antisentido. Los sitios de biopsia en el lado izquierdo del animal se tratan intra-dérmicamente con salina amortiguada de fosfato (PBS). Los animales se sacrificaron en el Día 15 después de la biopsia. Se suministra un volumen total de 200 µ? de oligonucleótido antisentido o PBS a cada sitio de biopsia perforado. Estos 200 µ? de volumen se divide en cuatro alícuotas de 50 µ? las cuales se inyectan alrededor de la periférica de la herida, a aproximadamente 0.25 cm hasta 0.5 cm de los lados izquierdo, derecho, superior e inferior de la herida.
Muestra Recolectada/Sacrificio En la fecha del sacrificio, los animales se sometieron a eutanasia y se obtiene una muestra de la piel del centro de la herida con una perforación de biopsia de 0.5 cm, y se extrae el ARNm de estas muestras usando procedimientos estándar. Se realiza el análisis de ARNm por RT-PCR del CTGF y CollA2 de rata usando la metodología de curva estándar para análisis de datos y RiboGreen como el gen de mantenimiento/normalización.
Resultados El tratamiento de las ratas en todas las dosis resulta en una reducción estadísticamente significante en expresión de ARNm tanto de CTGF como de CollA2 (véase Figura 11). Estos resultados claramente demuestran que la inhibición de expresión del CTGF con un oligonucleótido antisentido modificado 2'MOE puede disminuir la deposición de colágeno en la piel, lo cual puede resultar en una reducción en la severidad de formación de cicatriz en la piel .
Ejemplo 12: Estudio de Farmacocinética Intra-dérmica en una Dosis única de Oligonucleótido Antisentido del CT6F en Conejos Objetivo del Estudio El propósito de este estudio de farmacocinética en conejo es para evaluar la concentración de un oligonucleótido antisentido del CTGF (SEC ID NO: 39, ISIS 412294) en la piel del conejo en diferentes tiempos subsecuente a una inyección intra-dérmica única.
Diseño del Estudio En el dia 0 del estudio, todos los animales se dosificaron intra-dérmicamente (ID) con una inyección de 10 µ? única del oligonucleótido antisentido del CTGF de SEC ID NO: 39 a una concentración de 50 mg/ml (5 mg de dosis total) . Los animales se dosificaron con el oligonucleótido antisentido en un sitio de la parte izquierda de la linea media espinal, casi en paralelo a los hombros del conejo. La aguja se inserta de forma que el material de prueba se inyecta en forma descendente hacia la base del cuerpo del animal. En los días 1, 3, 7 o 14, los conejos se someten a eutanasia y se obtienen dos perforaciones para biopsia de 1.0 cm de espesor total, una centrada sobre el sitio de inyección original y la otra verticalmente por debajo a 0.5 cm separada. Las muestras se congelan por completo y se almacenan a -80°C antes del análisis de los niveles del fármaco de oligonucleótido antisentido. Los resultados representan los niveles medios de oligonucleótido antisentido de ambas biopsias en el tiempo indicado.
Resultados y Conclusiones Niveles significantes del oligonucleótido antisentido se representa hasta por al menos el dia 14 después de la dosificación intradérmica (véase Figura 12). Las concentraciones terapéuticas del fármaco están entre 1 y 100 g/gramo de tejido. Estos resultados demuestran que para este primer tiempo existe una residencia de tiempo prolongada de un oligonucleótido antisentido de 2'MOE con esta configuración química en la piel, y estos resultados claramente muestran el potencial terapéutico de esta clase de compuesto en la piel.
EJEMPLO 13: Búsqueda del Genoma El potencial para la SEC ID NO: 39 para inducir efectos antisentido no deseados que pude ser traducido en toxicidad "fuera de objetivo" se valora conduciendo una búsqueda de la base de datos del genoma humano para secuencias que tienen homología o complementariedad completa o parcial con la secuencia de nucleótido SEC ID NO: 39.
Se conduce una búsqueda comprehensiva en la base de datos de secuencia de ADN humano publicada para evaluar si las secuencias que comprenden SEC ID NO: 39 tienen suficiente homología con el arreglo conocido de genes humanos, de forma que el antisentido u otra actividad inhibitoria no buscada pueda ser ejercida contra la expresión de productos del gen humano diferente a la del CTGF objetivo (factor de crecimiento del tejido conectivo) y con ello inducir efectos "fuera de objetivo". La búsqueda implica selección para secuencias homologas que varían de 20 nucleótidos (es decir, la longitud completa de la SEC ID NO: 39 descendiendo a 12 nucleótidos .
No se detectaron sitios fuera de objetivo en el genoma humano con 20, 19 o 18 bases de homología con la SEC ID NO: 39. La ausencia completa de sitios fuera de objetivo con 18, 19 o 20 bases indica que la probabilidad de cualquier actividad fuera de objetivo consecuencial es mínima. Se identifican tres homologías de 17 base con la SEC ID NO: 39. Una de estas está dentro del intrón del gen LRFN2. Los intrones están típicamente empalmados con el transcripto antes que el ARNm llegue al citoplasma, el sitio de acción de la SEC ID NO: 39. Por esta razón, la SEC ID NO: 39 no se espera que afecte la expresión de LRFN2. Las otras dos homologías de 17 base se localizan dentro de las regiones del espaciador inter-gen. Los espaciadores inter-gen generalmente no se transcriben pero existen como ADN de hebra doble en el compartimiento nuclear, separado del sitio de acción de la SEC ID NO: 39. Por lo tanto, no existen homologías de 17 base de interés.
Entre las homologías de 16 base, 15 base y 14 base encontradas, únicamente una se localiza dentro de un trascripto conocido o esperado (es decir, FRMD5, el cual codifica un activo de transferasa de biosíntesis de lípido en el hígado) . Sin embargo, la homología de la SEC ID NO: 39 de 16 base con un transcripto de sentido de ARNm no puede ser conductivo a actividad antisentido (es decir, la hibridi zación puede únicamente ser posible si una porción de la secuencia de la SEC ID NO: 39 es complementaria, no homologa, a la secuencia del transcripto de ARNm) . Por lo tanto, la SEC ID NO: 39 puede no afectar este transcripto. Todas las otras homologías de 16 base hasta 14 base corresponden a intrones o espaciadores inter-gen sin transcriptos traslapados, transcriptos pronosticados o etiquetas de secuencia expresadas. No existen homologías en 13 base. Cualquiera de los transcriptos a base de únicamente la homología de 12 nucleótidos o más corta puede presentar un objetivo termodinámicamente desfavorable, comparado a la unión de un oligonucleótido de 20 base similar a la SEC ID NO: 39 con su objetivo planeado. Por lo tanto, homologías de 12 base o más corta no presenta un potencial significante para actividad antisentido fuera de obj etivo .
Por lo tanto, la búsqueda en la base de datos del genoma humano muestra que la SEC ID NO: 39 tiene un alto grado de especificidad para el objetivo planeado con potencial mínimo para efectos fuera de obj etivo .
Ejemplo 14: Estudio Clínico Intra-dérmico de dosis única de Fase 1 para Valorar la Seguridad y Tolerancia de un Oligonucleótido Antisentido del CTGF (SEC ID NO: 39) Objetivo del Estudio El oligonucleótido antisentido del CTGF humano de SEC ID NO: 39 (ISIS No. 412294) se administra a seis pacientes por dosificación intra-dérmica (80 mg de dosis total) como parte de un protocolo de estudio de Fase 1 para valorar la seguridad y tolerancia de una dosis única del fármaco .
Resultados No se reportaron eventos adversos diferentes a reacciones en el sitio de inyección local como eritema, inflamación, comezón y endurecimiento. Se reportan eventos adversos listados en aproximadamente 50% de los sujetos a un nivel de severidad de "mínimo". No se notaron cambios en la química del suero, hematología, análisis de orina, ECGs, signos vitales, examen físico y activación del complemento .
Conclusiones La administración del oligonucleótido antisentido del CTGF a dosis anticipada para estar dentro del intervalo terapéutico, asi como también tolerancia en humanos, que demuestra la seguridad de este compuesto para tratar cicatrización de la piel.
EJEMPLO 15 : Niveles de Fármaco de Oligonucleótido Antisentido de la SEC ID NO: 39 en Piel Humana después de la Dosificación Intra-dérmica Se evalúan niveles del fármaco en la piel es un grupo de pacientes en un estudio clínico inicial, en donde 5 pacientes cada uno recibe 40 mg del oligonucleótido antisentido (ASO) (administrado como 10 dosis iguales de 4 mg cada una) . Se obtienen biopsias de la piel en el día 21 después de la administración de dosis única del ASO al Día 1 en el sitio de la herida quirúrgica simulada (línea dibujada en la piel como una referencia para a los lugares de las dosificaciones). La perforación para biopsia consiste de un centro cilindrico de 4 mm de muestra de tejido. Se determinan los niveles del ASO usando electroforesis capilar y sondas específicas a la secuencia fluorescentemente etiquetadas y son 84.2 µg gramo de tejido. Las concentraciones terapéuticas proyectadas del fármaco ASO se anticipan por estar entre 1 y 100 µg/ gramo de tejido.
Estos resultados demuestran que por primera vez existe un tiempo de residencia prolongado de un oligonucleótido antisentido 2 ' MOE con esta configuración química en piel humana después de la administración intradérmica , y estos resultados claramente muestran el potencial terapéutico de esta clase de compuesto en la piel .
Ejemplo 16: Un Estudio de Eficacia y Seguridad Clínica Controlada dentro del Sujeto, de Doble ciego, Aleatorizado de Fase 2 de la SEC ID NO: 39 en Reducción de la Severidad de Cicatriz en Sujetos que Sufren una Abdominoplastia Electiva Este estudio es un estudio controlado dentro del sujeto, de Doble Ciego, aleatorizado que evalúa la eficacia y seguridad del oligonucleótido antisentido del CTGF de la SEC ID NO: 39 (es decir, el producto del fármaco). El producto del fármaco se administra adyacente a ambos lados de la incisión de abdominoplastia vía inyecciones intradérmicas en sujetos que son sometidos a abdominoplastia electiva.
Una sección de la incisión de abdominoplastia en cualquiera de los lados de la mitad, solo el lateral al vello púbico, se trata con el producto del fármaco o placebo, después la incisión quirúrgica se cierra.
La duración del estudio es de aproximadamente 24 semanas. Los sujetos recibieron la abdominoplastia en el Día 1, seguido por dosificación del producto del fármaco y placebo durante un periodo de 10 semanas. Se realizaron observación y valoración de la cicatriz durante 4 semanas hasta 12 semanas, y nuevamente a la semana 24.
Se determina la eficacia variando cada par apareado de incisiones.
Se evalúa la eficacia a las semanas 12 y 14 después de la cirugía de abdominoplastia usando los dos siguientes métodos variando la severidad de cicatrices incisionales : - Valoración del Panel Experto de fotografías ciegas usando escala análoga visual (VAS) ; - Escala de Valoración de Cicatriz Sometida a Escala de Valoración de Cicatriz del Investigador; SEC ID NO: 39 es eficaz por este criterio.
Ejemplo 17: Estudio de Eficacia y Seguridad Clinica Controlada Dentro del Sujeto, de Doble Ciego, Aleatorizado de Fase 2 de la SEC ID NO: 39 en la Reducción de Cicatrización de la Piel en Sujetos sometidos a una Revisión Electiva de Cicatrices Centrales de la Reducción de Mama Previa o Cirugía de Mastope ia Este estudio es un estudio controlado dentro del sujeto, de doble ciego, aleatorizado para evaluar la eficacia y seguridad de oligonucleótido antisentido del CTGF de la SEC ID NO: 39 (es decir, el producto del fármaco) . El producto del fármaco se administra a la porción media de las cicatrices de reducción de mama revisadas vía inyecciones intradérmicas . Una sección de cualquier lado de la porción media de la herida/cicatriz de mama revisada se trata con producto del fármaco o placebo, después la incisión quirúrgica se cierra.
Hasta 40 sujetos son contratados en este estudio. La duración del estudio es aproximadamente de 24 semanas. Los sujetos reciben las revisiones de cicatriz en el Día 1, seguido por dosificación del producto del fármaco y placebo durante un periodo de 10 semanas. Se realizan la observación y valoración de cicatriz cada 4 semanas hasta la semana 12, y nuevamente en la semana 24.
La eficacia de determina variando cada par apareado de incisiones. Se evalúa la eficacia a las semanas 12 y 24 después de la revisión de las porciones médicas de la cicatriz de reducción de mama usando dos métodos que varían la severidad de cicatrices incisionales : - Valoración del Panel Experto de fotografías ciegas usando escala análoga visual (VAS); - Escala de Valoración de Cicatriz Sometida a Escala de Valoración de Cicatriz del Investigador; SEC ID NO: 39 es eficaz por este criterio.

Claims (40)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiéndose descrito la presente se considera como novedad, y por lo tanto, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes: REIVINDICACIONES
1. Un compuesto caracterizado porque comprende un oligonucleótido modificado que consiste de 12-30 nucleósidos ligados, al menos una porción de secuencia de 12 nucleobases la cual está presente dentro de la región seleccionada de los nucleótidos 718-751, 1388-1423, 1457-1689, 2040-2069, 2120-2147, 2728-2797, 2267-2301, 553-611, 1394-1423, 1469-1508, 1559-1605, 1659-1689, 2100-2129 y 1399-1423 de la SEC ID NO: 9.
2. Un compuesto caracterizado porque comprende un oligonucleótido modificado que consiste de 12-30 nucleósidos ligados, al menos una porción de secuencia de 12 nucleobases la cual está presente dentro de las secuencias de nucleobase expuestas en las SEC ID NOs: 28, 30, 39, 40, 43, 44, 45, 50, 51, 52, 56, 78, 125 y 166.
3. Un compuesto de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el oligonucleótido modificado consiste de 20 nucleósidos ligados.
4. Un compuesto caracterizado porque comprende un oligonucleótido modificado que comprende al menos 12 nucleósidos ligados, la secuencia de nucleobase la cual está presente dentro de las secuencias de nucleobase expuestas en las SEC ID NOs : 28, 30, 39, 40, 43, 44, 45, 50, 51, 52, 56, 78, 125 y 166.
5. Un compuesto de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque el oligonucleótido modificado comprende al menos 14 nucleósidos ligados.
6. El compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, caracterizado porque el oligonucleótido modificado es un oligonucleótido de hebra única .
7. El compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, caracterizado porque el oligonucleótido modificado es un oligonucleótido de hebra doble .
8. El compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque el oligonucleótido modificado tiene una secuencia la cual es 100% idéntica sobre su longitud a una porción de una de las secuencias expuestas en las SEC ID NOs: 28, 30, 39, 40, 43, 44, 45, 50, 51, 52, 56, 78, 125 y 166.
9. El compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque el oligonucleótido modificado comprende al menos un enlace de internucleósido modificado.
10. El compuesto de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque al menos un enlace de internucleósido modificado es un enlace internucleósido de fosfotioato.
11. El compuesto de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque todos los enlaces internucleósidos son enlaces internucleósidos de fosfotioato .
12. El compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-7, caracterizado porque al menos un nucleósido comprende un azúcar modificado.
13. El compuesto de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque el azúcar modificado es un azúcar biciclico.
14. El compuesto de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque al menos uno del azúcar modificado comprende un 2' -O-metoxietilo .
15. El compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-7, caracterizado porque comprende al menos un nucleósido modificado por tetrahidropirano en donde un anillo de tetrahidropirano reemplaza el anillo de furanosa .
16. El compuesto de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque cada uno de al menos un nucleósido modificado por tetrahidropirano tiene la estructura: en donde Bx es una porción de base heterociclica opcionalmente protegida.
17. El compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-7, caracterizado porque al menos un nucleósido comprende una nucleobase modificada.
18. El compuesto de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque la nucleobase modificada es una 5 ' -metilcitocina .
19. El compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-7, caracterizado porque el oligonucleótido modificado comprende: (a) un segmento de apertura que consiste de desoxinucleósidos ligados; (b) un segmento de ala al 5' que consiste de nucleosidos modificados ligados; y (c) un segmento de ala al 3' que consiste de nucleosidos modificados ligados; en donde el segmento de apertura se posiciona entre el segmento de ala al 5' y el segmento de ala al 3' y en donde cada nucleósido modificado dentro de cada segmento de ala comprende un azúcar modificado.
20. El compuesto de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque el oligonucleótido modificado comprende: (a) un segmento de apertura que consiste de trece desoxinucleósidos ligados; (b) un segmento de ala al 5' que consiste de dos nucleosidos modificados ligados; y (c) un segmento de ala al 3' que consiste de cinco nucleosidos modificados ligados; en donde el segmento de apertura se posiciona entre el segmento de ala al 5' y el segmento de ala al 3' , en donde cada nucleósido modificado dentro de cada segmento de ala comprende un azúcar de 2 ' -O-metoxietilo ; y en donde cada enlace de internucleósido es un enlace de fosfotioato .
21. El compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, caracterizado porque el oligonucleót ido modificado consiste de 20 nucleósidos ligados .
22. El compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, caracterizado porque la secuencia de nucleobase es la secuencia expuesta en la SEC ID NO: 39.
23. El compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, caracterizado porque la secuencia de nucleobase es la secuencia expuesta en la SEC ID NO: 40.
24. El compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, caracterizado porque la secuencia de nucleobase es la secuencia expuesta en la SEC ID NO: 45.
25. El compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, caracterizado porque la secuencia de nucleobase es la secuencia expuesta en la SEC ID NO: 52.
26. El compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, caracterizado porque la secuencia de nucleobase es la secuencia expuesta en la SEC ID NO: 166.
27. Una composición caracterizada porque comprende un oligonucleótido modificado que comprende nucleósidos ligados, la secuencia de nucleobase la cual es una secuencia expuesta en una de las SEC ID NOs: 28, 30, 39, 40, 43, 44, 45, 50, 51, 52, 56, 78, 125 y 166, o una sal de la misma, y un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable .
28. El compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, caracterizado porque la secuencia de nucleobase es 100% complementaria dentro del intervalo de nucleótidos (por ejemplo, 1388-1423, A-B, C-D, y E-F) de la SEC ID NO: 9 mientras un oligonucleót ido previamente diseñado no caiga dentro del intervalo .
29. El compuesto de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque el oligonucleótido modificado es un oligonucleótido de hebra única.
30. El compuesto de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque el oligonucleótido modificado es un oligonucleótido de hebra doble.
31. El compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 28 a 30, caracterizado porque el oligonucleótido modificado consiste de 20 nucleósidos ligados .
32. Un método para inhibir la expresión del factor de crecimiento del tejido conectivo en una célula o tejido, caracterizado porque comprende poner en contacto la célula o tejido con el compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 31, bajo condiciones tales que la expresión del factor de crecimiento del tejido conectivo se inhibe .
33. Un método para tratar un animal que tiene una enfermedad o condición asociada con la expresión del factor de crecimiento del tejido conectivo caracterizado porque comprende administrar al animal una cantidad del compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 31 efectiva para inhibir la expresión del factor de crecimiento del tejido conectivo para con ello tratar el animal .
34. El método de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque la enfermedad o condición es un trastorno hiperproliferativo.
35. El método de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado porque el trastorno hiperproliferativo es un cáncer.
36. El método de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque la enfermedad o trastorno es una enfermedad fibrótica.
37. El método de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado porque la enfermedad fibrótica es cicatrización hipertrófica, queloides, cicatrización de piel, fibrosis hepática, fibrosis pulmonar, fibrosis renal, fibrosis cardiaca o restenosis.
38. El método de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque la enfermedad o trastorno es fibrosis de articulación (que incluye síndrome de hombro congelado, tendón y nervio periférico dañado) , daño a la médula espinal, derivación coronaria, adhesiones abdominales y perifonéales (que incluyen endometriosis , leiomiomata uterino y fibroides), queratotomía radial y queratectomía fotorefractiva, cirugía de reinserción retinal, fibrosis mediada por dispositivo (en por ejemplo diabetes) , adhesiones de tendón, contractura de Dupuytren, o escleroderma .
39. Un método para reducir la cicatrización que resulta de curación de heridas en un sujeto en necesidad del mismo, caracterizado porque comprende administrar al sujeto una cantidad del compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 32 efectiva para inhibir la expresión del factor de crecimiento del tejido conectivo en el sujeto para así con ello reducir la cicatrización que resulta de la curación de herida en el suj eto .
40. El método de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado porque la cicatrización de herida es curación en una herida seleccionada del grupo que consiste de rompimiento de piel, incisiones quirúrgicas, y quemaduras .
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