EA022207B1 - Антисмысловые олигонуклеотиды против фактора роста соединительной ткани и способы их применения - Google Patents

Антисмысловые олигонуклеотиды против фактора роста соединительной ткани и способы их применения Download PDF

Info

Publication number
EA022207B1
EA022207B1 EA201170345A EA201170345A EA022207B1 EA 022207 B1 EA022207 B1 EA 022207B1 EA 201170345 A EA201170345 A EA 201170345A EA 201170345 A EA201170345 A EA 201170345A EA 022207 B1 EA022207 B1 EA 022207B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
dna
artificial sequence
oligonucleotide
connective tissue
antisense
Prior art date
Application number
EA201170345A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201170345A1 (ru
Inventor
Николас М. Дин
Дж. Гордон Фолкс
Нилл О`Доннелл
К. Фрэнк Беннетт
Сьюзан М. Фрейер
Original Assignee
Экскалиард Фармасьютикалз, Инк.
АйЭсАйЭс ФАРМАСЬЮТИКАЛЗ, ИНК.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Экскалиард Фармасьютикалз, Инк., АйЭсАйЭс ФАРМАСЬЮТИКАЛЗ, ИНК. filed Critical Экскалиард Фармасьютикалз, Инк.
Publication of EA201170345A1 publication Critical patent/EA201170345A1/ru
Publication of EA022207B1 publication Critical patent/EA022207B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/7115—Nucleic acids or oligonucleotides having modified bases, i.e. other than adenine, guanine, cytosine, uracil or thymine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/712—Nucleic acids or oligonucleotides having modified sugars, i.e. other than ribose or 2'-deoxyribose
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/04—Drugs for skeletal disorders for non-specific disorders of the connective tissue
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/02—Drugs for disorders of the nervous system for peripheral neuropathies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P41/00—Drugs used in surgical methods, e.g. surgery adjuvants for preventing adhesion or for vitreum substitution
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1136—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against growth factors, growth regulators, cytokines, lymphokines or hormones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/11—Antisense
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/315—Phosphorothioates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/321—2'-O-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/323—Chemical structure of the sugar modified ring structure
    • C12N2310/3231—Chemical structure of the sugar modified ring structure having an additional ring, e.g. LNA, ENA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/33—Chemical structure of the base
    • C12N2310/334—Modified C
    • C12N2310/3341—5-Methylcytosine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/34—Spatial arrangement of the modifications
    • C12N2310/341—Gapmers, i.e. of the type ===---===
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/34—Spatial arrangement of the modifications
    • C12N2310/346—Spatial arrangement of the modifications having a combination of backbone and sugar modifications
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Surgery (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)

Abstract

Настоящее изобретение относится к соединениям, включающим модифицированные олигонуклеотиды, способные ингибировать экспрессию фактора роста соединительной ткани, и к композиции, содержащей указанные соединения, а также к способам лечения гиперпролиферативных нарушений и фиброзных заболеваний и способам уменьшения рубцевания в процессе заживления раны с использованием таких соединений.

Description

Настоящее изобретение относится к новым антисмысловым олигонуклеотидам (ΑδΟ), предназначенным для лечения гиперпролиферативных нарушений и фиброзных заболеваний, а также для уменьшения рубцевания при заживлении раны.
Уровень техники
Метод антисмысловых соединений является эффективным способом уменьшения экспрессии специфических генных продуктов и поэтому может быть единственно полезным в целом ряде терапевтических, диагностических и научно-исследовательских применений с целью модуляции экспрессии фактора роста соединительной ткани (СТОР). (См. патент США № 6965025В2, принадлежащий Оаагбе с1 а1.).
Антисмысловое соединение является олигомерным соединением, способным гибридизировать с нуклеиновой кислотой-мишенью (например, молекулой мРНК-мишени).
Антисмысловые соединения, композиции и способы модуляции экспрессии СТОР и лечения заболеваний, ассоциированных с экспрессией СТОР, описаны в вышеуказанном патенте США № 6965025В2, который включен в настоящее описание изобретения в качестве ссылки. Однако существует потребность в дополнительных соединениях, способных лучше ингибировать экспрессию и функции СТОР, а также обладающих другими полезными свойствами.
Один вариант осуществления настоящего изобретения относится к предпочтительным модифицированным антисмысловым олигонуклеотидам, предназначенным для ингибирования экспрессии СТОР. Установлено, что указанные антисмысловые олигонуклеотиды являются более эффективными по сравнению с ранее описанными ΑδΟ, направленно воздействующими на СТОР.
Фактор роста соединительной ткани (СТОР; известный также как с!дго£ас1, секретируемый белок, индуцируемый фибробластами, йзр-12, ΝΟν-2, белок, связывающий инсулиноподобный фактор роста и родственный белку 2, 1ОРВР-гР2, ΙΟΡΒΡ-8, НВСР-0.8, Нсз24 и экогенин) является членом семейства ССN (СТОР/СУК61^О'У) модульных белков, получившего название по первым идентифицированным членам семейства, включающим фактор роста соединительной ткани, белок с высоким содержанием цистеина (СУР61) и белок, сверхэкспрессированный в аденосаркоме почки (ΝΟν), но данное семейство включает также белки РЬМ-1 (экспрессированные в слабометастазирующих клетках), \νΐδΡ-3 (^Мп1-1индуцируемый секретируемый белок) и СОР-1 (\νΐδΡ-2). Установлено, что белки ССN являются секретируемыми белками, ассоциированными с внеклеточным матриксом, которые регулируют клеточные процессы, такие как адгезия, миграция, митогенез, дифференцировка, выживание, развитие кровеносных сосудов, атеросклероз, хондрогенез, заживление ран, онкогенез, сосудистые и фиброзные заболевания, такие как склеродермия (Ьаи апб Ьат, Ехр. Се11 Кез., 1999, 248, 44-57). Установлено, что белок фактора роста соединительной ткани стимулирует синтез ДНК и вызывает хемотаксис фибробластов (ВгабЬат е1 а1., I. Се11 Βΐο1., 1991, 114, 1285-1294).
В большинстве исследований экспрессии в клетках глиобластомы был обнаружен один транскрипт СТОР длиной 2,4 т.п.о., хотя сообщалось также о транскриптах длиной 3,5 и 7 т.п.о. Фактор роста соединительной ткани экспрессирован в фибробластах при осуществлении нормальных процессов дифференцировки, включающих образование и изменение внеклеточного матрикса, таких как эмбриогенез и выделение децидуальной оболочки после имплантации. Фактор роста соединительной ткани также часто сверхэкспрессирован в случае фиброзных заболеваний кожи, таких как системный склероз, локализованный склероз кожи, келоиды, рубцевание ткани, эозинофильный фасцит, узелковый фасцит и контрактура Дюпюитрена. Уровни мРНК или белка фактора роста соединительной ткани повышены в фиброзных поражениях основных органов и тканей, включающих печень, почку, легкое, сердечно-сосудистую систему, поджелудочную железу, кишечник, глаз и десну. В опухолях молочной железы, поджелудочной железы и фиброгистиоцитарных опухолях, которые в значительной степени состоят из соединительной ткани, фактор роста соединительной ткани сверхэкспрессирован в стромальном компартменте. Во многих случаях экспрессия фактора роста соединительной ткани в пространственном и временном отношении связана с профиброгенным цитокинтрансформирующим бета-фактором роста (ТОР-бета) (Моиззаб апб ВпдзЮск, Мо1. Оепек Ме!аЬ., 2000, 71, 276-292).
Фактор роста соединительной ткани картирован в хромосомной области человека 6с|23.1. расположенной рядом с геном с-туЬ, и нарушения в хромосоме, включающшие данную область, ассоциированы с опухолями человека, такими как опухоль Вильмса (Магйпейе е1 а1., Опсодепе, 1992, 7, 2529-2534).
Опухоли со значительными фиброзными и сосудистыми компонентами характеризуются повышенной экспрессией СТОР, и СТОР может иметь отношение к патогенезу миофибробластом у детей. Во всех 12 исследованных опухолях у детей наблюдалась экспрессия СТОР от умеренной до сильной в опухолевых клетках и/или эндотелиальных клетках сосудистой сети (Казагадоб е1 а1., Реб1а1г. Эеу. РабюС 2001, 4, 37-45).
Уровень мРНК фактора роста соединительной ткани также повышен в злокачественных лейкозных
- 1 022207 лимфобластах у детей с острым лимфобластным лейкозом (ЛЬЬ) (Уопуегк с! а1., Вг. 1. Сапсег, 2000, 83, 756-760), и уровни мРНК и белка повышены под воздействием ТСР-бета в раковых клетках молочной железы человека Н§578Т в зависимости от дозы, из чего следует, что СТСР является важным нейроэндокринным фактором и важным эффектором ТСР-бета в нижней области (Уапд е! а1., 1. СИп. Епбосгшой Ме!аЬ., 1998, 83, 2593-2596).
Увеличение экспрессии мРНК фактора роста соединительной ткани происходит в мышиной модели фиброза легкого под воздействием блеомицина, известного агента, вызывающего фиброз легкого (Ьакку е! а1., Ат. 1. Рйумок. 1998, 275, Ь365-371), а также имеет место в клетках бронхоальвеолярного лаважа, полученных у субъектов, страдающих идиопатическим фиброзом легкого и саркоидозом легкого, по сравнению со здоровыми некурящими контрольными субъектами, из чего следует, что фактор роста соединительной ткани участвует в фибропролиферативной реакции, возникающей при повреждении (А11еп е! а1., Ат. 1. Кекрт Се11 Мо11. Вю1., 1999, 21, 693-700). Аналогичным образом в экспериментальной модели пролиферативного гломерулонефрита экспрессия мРНК фактора роста соединительной ткани была сильно повышена в случае внекапиллярных и мезангиальных пролиферативных поражений, а также в области перигломерулярного фиброза. Ранняя стадия сверхэкспрессии фактора роста соединительной ткани почечных клубочков совпадала с сильным повышением уровня белков ТСР-бета, и кинетика экспрессии фактора роста соединительной ткани предполагает его участие в репарации почечных клубочков, возможно, внизу от ТСР-бета в указанной модели временного поражения почки (1!о е! а1., 1. Ат. §ос. №рйго1., 2001, 12, 472-484).
В патенте США № 5876730 описаны и заявлены по существу чистый или выделенный полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, соответствующую карбоксиконцевым аминокислотам белка фактора роста соединительной ткани (СТСР), которая начинается у аминокислотного остатка 247 или 248 от Ν-конца фактора роста соединительной ткани, выделенная полинуклеотидная последовательность, кодирующая полипептид фактора роста соединительной ткани, рекомбинантный экспрессирующий вектор, содержащий указанный полинуклеотид, клетка-хозяин, содержащая указанный экспрессирующий вектор, и фармацевтическая композиция, включающая трапевтически эффективное количество полипептида фактора роста соединительной ткани в фармацевтически приемлемом носителе. В научной литературе описаны антисмысловые олигонуклеотиды (Впд^оск апб Нагбшд, 1999).
В патентах США №№ 5783187, 5585270, 6232064, 6150101, 6069006 и публикации РСТ АО 00/35936 описаны и заявлены выделенный полинуклеотид, кодирующий полипептид фактора роста соединительной ткани, экспрессирующие векторы, клетки-хозяева, устойчиво трансформированные или трансфицированные указанными векторами, выделенный полинуклеотид, включающий 5'-концевые нетранслированные регуляторные нуклеотидные последовательности, выделенные вверху от фактора роста соединительной ткани, которые включают область инициации транскрипции и трансляции и реагируют на воздействие ТСР-бета, конструкция выделенной нуклеиновой кислоты, включающая некодирующую регуляторную последовательность, выделенную вверху от гена фактора роста соединительной ткани (СТСР), причем указанная некодирующая регуляторная последовательность функционально связана с последовательностью нуклеиновой кислоты, экспрессирующей представляющий интерес белок или антисмысловую РНК, которая гетерологична указанной некодирующей последовательности, и фрагмент полипептида фактора роста соединительной ткани (СТСР), способный индуцировать синтез ЕСМ, синтез коллагена и/или дифференцировку миофибдробластов, который включает аминокислотную последовательность, кодированную по меньшей мере экзоном 2 или экзоном 3 указанного полипептида. Кроме того, в указанных патентах заявлен способ идентификации композиции, влияющей на индуцируемую ТСР-бета экспрессию фактора роста соединительной ткани, и способ диагностики патологического состояния у субъекта с подозрением на патологию, выбираемую из группы, состоящей из фиброзного заболевания и атеросклероза, который включает получение образца, предположительно содержащего фактор роста соединительной ткани, при этом отличие уровня фактора роста соединительной ткани в образце, полученном у субъекта, от уровня фактора роста соединительной ткани в нормальном стандартном образце является показателем патологии у субъекта, характеризующейся нарушением пролиферации клеток, ассоциированным с фактором роста соединительной ткани. Далее в указанных патентах заявлен способ уменьшения интенсивности нарушения пролиферации клеток, ассоциированного с фактором роста соединительной ткани, который включает введение субъекту в место поражения композиции, включающей терапевтически эффективное количество антитела или его фрагмента, которое связывается с фактором роста соединительной ткани, при этом указанное антитело или его фрагмент не связывается с РЭСР. В научной литературе описаны антисмысловые олигонуклеотиды (Сго!епбог§!, 2000; Сго!епбог§! апб Вгабйат, 2001; Сго!епбог§! апб Вгабйат, 2000; Сго!епбог§! апб Вгабйат, 1996; Сго!епбог§! апб Вгабйат, 1998; Сго!епбог§! апб Вгабйат, 2000).
В публикации РСТ АО 00/27868 описаны и заявлены, по существу, чистый полипептид фактора роста соединительной ткани или его функциональные фрагменты, выделенная полинуклеотидная последовательность, кодирующая указанный полипептид, в которой остаток Т может быть также остатком и, последовательность нуклеиновой кислоты, комплементарная указанной полинуклеотидной последовательности, и фрагменты указанных последовательностей, состоящие по меньшей мере из 15 оснований и
- 2 022207 гибридизирующие с ДНК, кодирующей аминокислотную последовательность белка фактора роста соединительной ткани, в условиях гибридизации от умеренных до строгих. Кроме того, в указанной публикации заявлены экспрессирующий вектор, включающий указанный полинуклеотид, клетка-хозяин, устойчиво трансформированная указанным вектором, антитело, связывающееся с указанным полипептидом, и способ получения указанного полипептида. Далее в указанной публикации заявлен способ ингибирования экспрессии фактора роста соединительной ткани в клетке, который включает контактирование клетки с полинуклеотидом, связывающимся с нуклеиновой кислотой-мишенью в данной клетке, при этом полинуклеотид ингибирует экспрессию фактора роста соединительной ткани в клетке и является антисмысловым полинуклеотидом, а также набор для обнаружения экспрессии фактора роста соединительной ткани, который включает футляр с несколькими отделениями для одной или нескольких емкостей, содержащих по меньшей мере один антисмысловой олигонуклеотид, связывающийся с фактором роста соединительной ткани (8еЬт1б1 с1 а1., 2000).
В публикации РСТ \УО 00/13706 описан и заявлен способ лечения или профилактики фиброза, который включает введение нуждающемуся субъекту эффективного количества агента, модулирующего, регулирующего или ингибирующего экспрессию или активность фактора роста соединительной ткани, или его фрагментов, при этом указанный агент является антителом, антисмысловым олигонуклеотидом или мелкой молекулой. Указанный способ предназначен для лечения фиброза почки и ассоциированных с ним почечных заболеваний, в частности, осложнений, обусовленных диабетом и гипертензией (Рйсг апб НетсЫй, 2000).
В публикации РСТ \УО 01/29217 описана и заявлена выделенная молекула нуклеиновой кислоты, включающая последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид, включающий аминокислотную последовательность, выбираемую из группы, состоящей из ΝΟνί, Ν0ν2 (фактор роста соединительной ткани) и Ν0ν3, зрелую форму или вариант аминокислотной последовательности, выбираемой из указанной группы; молекула нуклеиновой кислоты, включающая последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид, включающий акминокислотную последовательность, выбираемую из указанной группы, а также зрелые и вариантые формы или фрагменты указанных полипептидов, и комплемент указанной молекулы нуклеиновой кислоты. В научной литературе описаны антисмысловые олигонуклеотиды (Ргауада е! а1., 2001).
Гипертрофическое образование рубцов является, в частности, главной клинической проблемой в устранении серьезных ожогов и может стать причиной избыточного рубцевания, вызывающего необратимую утрату функции и физический недостаток. В США ежегодно более 1 миллиона человек нуждаются в лечении ожогов. Вероятность гипертрофического рубцевания после ожогов является обычным исходом, представляющим собой огромную проблему. Поэтому ингибитор СТСР, такой как антисмысловой олигонуклеотид (ΑδΟ), позволит эффективно предотвращать образование гипертрофических рубцов, образующихся после ожогов. Активность антисмыслового олигонуклеотида можно оценить путем местного нанесения препарата, содержащего ΑδΟ, и слежения за образованием рубца после ожога.
СТСР может быть привлекательной мишенью для модуляции гипертрофического рубцевания по нескольким причинам. В качестве кофактора и медиатора ТСР-β 1 или ΤΗΡ-β2 в нижней области фактор роста соединительной ткани может представлять собой более специфическую мишень по сравнению с ТСР-β 1 или ТСР-βΣ для генонаправленной молекулярной терапии, целью которой является предотвращение рубцевания, в частности, потому, что ТСР-β 1 или ТСР-βΣ оказывает множественное воздействие, не имеющее отношения к образованию рубцов. Кроме того, СТСР может выполнять функции, не зависящие от ТСР-β 1 или ТСР-(12. по сохранению фиброзного фенотипа, которые не поддаются воздействию при лечении методами, направленными против ТСР-β 1 или ТСР^2. Несмотря на успехи, достигнутые в понимании роли СТСР в усилении фиброза в системах многих органов и хронических кожных заболеваниях, таких как склеродермия, роль СТСР в рубцевании и заживлении ран все еще в значительной степени является предметом наблюдения.
В настоящее время нет известных терапевтических средств, эффективно ингибирующих синтез фактора роста соединительной ткани, и до сих пор в исследованиях, направленных на модуляцию функции фактора роста соединительной ткани, используется бутират натрия (ΝίΒ), антитела, блокирующие функции, и антисмысловые олигонуклеотиды.
Считается, что питание играет важную роль в развитии и предотвращении возникновения рака у человека, в том числе рака молочной железы. Микроэлемент ΝηΒ в пище является главным конечным продуктом расщепления пищевого крахмала и клетчатки и представляет собой сильнодействующий ингибитор роста, который инициирует дифференцировку клеток многих типов ίη νίίτο. №ιΒ оказывает биологическое воздействие частично в качестве ингибитора гистондеацетилазы в эпителиальных клетках молочной железы, вызывает апоптоз раковых клеток Н§578Т молочной железы человека, не реагирующих на воздействие эстрогена, и активирует разные гены, имеющие отношение к прекращению клеточного цикла в зависимости от типа клеток. Ν·ιΒ специфически повышает экспрессию фактора роста соединительной ткани в зависимости от дозы, вызывая повышение уровней мРНК и белка в раковых и нераковых клетках молочной железы (ТкиЬак! е! а1., 1. ЕпбостшоР, 2001, 169, 97-110).
- 3 022207
ТСР-бета обладает уникальной способностью стимулировать рост нормальных фибробластов в мягком агаре, что является свойством трансформированных клеток. Фактор роста соединительной ткани не может индуцировать рост нормальных фибробластов почки крысы (ΝΚΚ) без якорной подложки, но синтез и действие фактора роста соединительной ткани имеет важное значение для индуцируемого ТСРбета роста без якорной подложки. Антитела к фактору роста соединительной ткани специфически блокировали индуцируемый ТСР-бета рост без якорной подложки, и фибробласты ΝΚΚ, трансформированные конструкцией, экспрессирующей ген фактора роста соединительной ткани в антисмысловой ориентации, не реагировали на ТСР-бета при выполнении анализа роста клеток без якорной подложки (Ко!1араШ е! а1., Се11 Сго\\11т О|ГГсг.. 1997, 8, 61-68). Указанные клетки ΝΚΚ, экспрессирующие антисмысловой СТСР, были также использованы для демонстрации того, что синтез коллагена, стимулированный ТСРбета, опосредован фактором роста соединительной ткани, из чего следует, что фактор роста соединительной ткани может быть полезной мишенью для антифиброзной терапии (Энпсап е! а1., РакеЬ 1., 1999, 13, 1774-1786).
В З'-концевой нетранслированной области (ИТК) кДНК фактора роста соединительной ткани человека находятся несколько консенсусных последовательностей реруляторных элементов. Было установлено, что З'-ИТК, присоединенная внизу от гена-репортера, действует в качестве сильного цис-репрессора, и антисмысловая З'-ИТК обладает аналогичным, но более сильным действием (КиЬо!а е! а1., РЕВ8 Ьей., 1999, 450, 84-88). При сравнении З'-ИТК фактора роста соединительной ткани человека и мыши был обнаружен небольшой консервативный сегмент из 91 основания. Указанная область была амплифицирована при помощи КТ-ПЦР из фибробластов мыши И1НЗТЗ и использована для получения химерной слитой конструкции для анализа ее репрессивных свойств. З'-ИТК фактора роста соединительной ткани мыши в смысловой или антисмысловой ориентации оказывала сильное репрессивное воздействие на транскрипцию гена-репортера, что указывает на независимость от ориентации данного регуляторного элемента (Коийо е! а1., Вюсйет. Вюрйук. Кек. Соттип., 2000, 278, 119-124).
Антисмысловой олигонуклеотид с фосфортиоатными связями, состоящий из 16 нуклеотидов, который направленно воздействовал на сайт инициации трансляции, был использован для ингибирования экспрессии фактора роста соединительной ткани и подавления пролиферации и миграции эндотелиальных клеток сосудов аорты быка в культуре (8Ыто е! а1., 1. Вюсйет. (Токуо), 1998, 124, 1З0-140). Указанный антисмысловой олигонуклеотид был также использован для демонстрации того, что фактор роста соединительной ткани вызывает апоптоз раковых клеток молочной железы человека МСР-7 и что индуцируемый ТСР-бета апоптоз частично опосредован фактором роста соединительной ткани (НС1йка\уа е! а1., 1. Вю1. Сйет., 1999, 274, З7461-З7466). Кроме того, было обнаружено, что такой же антисмысловой олигонуклеотид ингибирует опосредуемую ТСР-бета активацию каспазы З и, таким образом, ингибирует индукцию опосредуемого ТСР-бета апоптоза в гладкомышечных клетках аорты человека (НА8С) (ΗίκΦка\уа е! а1., Еиг. 1. РНагтасоИ 1999, З85, 287-290). Указанный антисмысловой олигонуклеотид был также использован для блокирования экспрессии фактора роста соединительной ткани, при этом было продемонстрировано, что высокое кровяное давление повышает экспрессию фактора роста соединительной ткани в мезангиальных клетках, что в свою очередь увеличивает продуцирование белка ЕСМ и индуцирует апоптоз, способствуя изменению мезангия и вызывая в конечном счете гломерулосклероз (ΗίκΗίкама е! а1., 1. Вю1. СНет., 2001, 276, 16797-1680З).
Таким образом, давно существует потребность в дополнительных агентах, способных эффективно ингибировать функцию фактора роста соединительной ткани.
Сущность изобретения
Настоящее изобретение относится к соединениям, включающим модифицированные олигонуклеотиды, состоящие из 12-З0 связанных нуклеозидов, предпочтительно из 20 или по меньшей мере из 12 связанных нуклеозидов, более предпочтительно по меньшей мере из 14 связанных нуклеозидов, которые способны ингибировать экспрессию фактора роста соединительной ткани. В объем настоящего изобретения входят также фармацевтические и другие композиции, содержащие антисмысловые соединения по настоящему изобретению.
Настоящее изобретение далее относится к способам лечения животного, в частности, человека, имеющего заболевание или нарушение, ассоциированное с СТСР, которые включают введение таких соединений в количестве, позволяющем эффективно ингибировать экспрессию СТСР, при этом указанное заболевание или нарушение является гиперпролиферативным нарушением, таким как рак и фиброзные заболевания. Настоящее изобретение далее относится к способу уменьшения рубцевания в процессе заживления раны, который включает введение таких соединений в количестве, позволяющем эффективно ингибировать экспрессию СТСР.
Краткое описание чертежей
На фиг. 1 показаны подвергаемые направленному воздействию сегменты или области геномной последовательности СТСР, главным образом сегменты, в которых направленному воздействию подвергается экзон, против которых были созданы антисмысловые олигонуклеотиды к СТСР.
На фиг. 2 показаны подвергаемые направленному воздействию сегменты или области последовательности мРНК СТСР, против которых были созданы антисмысловые олигонуклеотиды к СТСР.
- 4 022207
На фиг. 3 графически изображено исследование антисмысловых олигонуклеотидов, направленно воздействующих на последовательности экзонов в последовательности мРНК СТСР, в отношении ингибирования экспрессии СТСР.
На фиг. 4 показаны сегменты или области-мишени геномной последовательности СТСР, главным образом сегменты, в которых направленному воздействию подвергается интрон, против которых были созданы антисмысловые олигонуклеотиды к СТСР.
На фиг. 5 показаны сегменты или области-мишени последовательности мРНК СТСР, против которых были созданы антисмысловые олигонуклеотиды к СТСР.
На фиг. 6 графически изображен результат исследования антисмысловых олигонуклеотидов, направленно воздействующих главным образом на последовательности интронов в последовательности мРНК СТСР, в отношении ингибирования экспрессии СТСР.
На фиг. 7 показаны высокоактивные антисмысловые олигонуклеотиды против СТСР и дано сравнение их активности с активностью двух ранее созданных антисмысловых олигонуклеотидов (ΙδΙδ 124238 и ΙδΙδ 124212), описанных в патенте США № 6965025 В2. На фиг. 7А показаны антисмысловые олигонуклеотиды, направленно воздействующие на экзон 8, и на фиг. 7В показаны предпочтительные последовательности антисмысловых олигонуклеотидов.
На фиг. 8 графически изображена зависимость между дозой и эффектом, полученная для девяти высокоактивных основных новых антисмысловых последовательностей против СТСР человека, при ингибировании экспрессии СТСР в культивируемых эндотелиальных клетках пупочной вены человека. Последовательность 141923 является отрицательным контрольным образцом, и последовательности 124238 и 124212 являются двумя ранее созданными последовательностями.
На фиг. 9 графически изображены уровни аланинаминотрансферазы (ЛЬТ) (фиг. 9А) и аспартатаминотрансферазы (А8Т) (фиг. 9В) в плазме мышей после введения в течение четырех недель 25 мг/кг или 50 мг/кг антисмыслового олигонуклеотида ΙδΙδ 412294 (δΕΟ ГО N0:39), ΙδΙδ 412295 (δΕΟ ГО N0:40) или ΙδΙδ 418899 (δΕΟ ΙΌ N0:166). Результаты показывают, что уровни ЛЬТ и ΑδТ в плазме мышей, которым вводили 25 мг/кг или 50 мг/кг ΙδΙδ 412294 (δΕΟ ΙΌ N0:39) или ΙδΙδ 412295 (δΕΟ ΙΌ N0:40) либо 25 мг/кг ΙδΙδ 418899 (δΕΟ ΙΌ N0:166) были аналогичны уровням в контрольной группе, которой вводили физиологический раствор (наполнитель); однако у мышей, которым вводили 50 мг/кг ΙδΙδ 418899 (δΕΟ ΙΌ N0:166), наблюдалось значительное увеличение уровней ЛЬТ и ΑδТ выше значений, имевших место в контрольной группе.
На фиг. 10 графически изображен результат введения в течение четырех недель антисмысловых олигонуклеотидов, свидетельствующий о том, что прирост массы в группе, которой вводили 50 мг/кг 412295, был значительно ниже прироста массы в контрольной группе.
На фиг. 11 показано, что внутрикожное введение в раны кожи у крыс 3,0, 1,0, 0,3 или 0,1 мг антисмыслового олигонуклеотида против СТСР вызвало статистически значимое уменьшение экспрессии мРНК СТСР и Со11А2 при введении всех доз. Полученные результаты ясно показывают, что ингибирование экспрессии СТСР 2'-МОЕ модифицированным антисмысловым олигонуклеотидом уменьшает отложение коллагена в коже.
На фиг. 12 графически изображены значительные уровни антисмыслового олигонуклеотида против СТСР, сохраняющиеся у кроликов по меньшей мере до 14-го дня после внутрикожного введения 50 мг/мл (общая доза 5 мг).
Подробное описание изобретения
Один вариант осуществления настоящего изобретения относится к соединению, включающему модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 12-30 связанных нуклеозидов, в котором по меньшей мере часть последовательности из 12 гетероциклических оснований находится в области, выбираемой из нуклеотидов 718-751, 1388-1423, 1457-1689, 2040-2069, 2120-2147, 2728-2797, 2267-2301, 553-611, 13941423, 1469-1508, 1559-1605, 1659-1689, 2100-2129 и 1399-1423 δΙΡ) ΙΌ N0:9.
Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к соединению, включающему модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 12-30 связанных нуклеозидов, в котором по меньшей мере часть последовательности из 12 гетероциклических оснований находится в области, выбираемой из нуклеотидов 2540-2559, 2568-2587, 2623-2647 и 2623-2642 δΙΡ) ΙΌ N0:10.
Один вариант осуществления настоящего изобретения относится к соединению, включающему модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 12-30 связанных нуклеозидов, в котором по меньшей мере часть последовательности из 12 гетероциклических оснований находится в последовательностях гетероциклических оснований, представленных в δΕΟ ΙΌ N0: 28, 30, 39, 40, 43, 44, 45, 50, 51, 52, 56, 78, 125 и 166.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения соединение включает 20 или по меньшей мере 12 связанных нуклеозидов, более предпочтительно по меньшей мере 14 связанных нуклеозидов, которые находятся в последовательностях гетероциклических оснований, представленных в δΕΟ ΙΌ N0: 28, 30, 39, 40, 43, 44, 45, 50, 51, 52, 56, 78, 125 и 166.
Выбор указанных последовательностей определяется достижением результатов, представленных на фиг. 1-7, а также результатов, полученных в исследовании зависимости между дозой и эффектом с ис- 5 022207 пользованием эндотелиальных клеток пупочной вены человека (НиУЕС) (фиг. 8). Подробное описание указанного эксперимента и данные приведены в примере 8 нижеследующего раздела Примеры.
Последовательности-мишени, показанные на фиг. 1-6, включают последовательности интронов и экзонов. Область-мишень является областью нуклеиновой кислоты с определенной структурой. Например, область-мишень может включать 3'-ИТК, 5'-ИТК, экзон, интрон, кодирующую область, область инициации трансляции, область терминации трансляции или другую определенную область нуклеиновой кислоты. Направленное воздействие включает определение по меньшей мере одного сегмента-мишени, с которым гибридизирует антисмысловое соединение с достижением требуемого эффекта. В данном варианте осуществления изобретения требуемым эффектом является снижение уровней мРНК нуклеиновой кислоты-мишени.
В последовательностях экзонов и интронов было идентифицировано несколько последовательностей, активность которых выше, чем у ранее созданных последовательностей, таких как 8ЕС ГО N0:15 (1818 124238). Ряд новых олигонуклеотидов против интронов (8ЕС ГО N0:125) и экзонов (8ЕС ГО N0: 28, 30, 40, 45, 52, 50 и 78) являются значительно более активными, чем другие последовательности.
В первоначальном исследовании активности А80 (данные приведены в настоящем описании изобретения) было установлено, что 8ЕС ГО N0:39 и 40, являются высокоэффективными ингибиторами экспрессии СТОР. Для дальнейшего исследования того, что данная область мРНК СТОР является горячей точкой для направленного воздействия А80, была создана дополнительная последовательность А80 (8ЕС ГО N0:166), которая гибридизирует с последовательностью вверху от областей, подвергаемых направленному воздействию 8ЕС ГО N039 и 40. Кроме того, было установлено, что указанный А80 (8ЕС ГО N0:166) является сильнодействующим ингибитором экспрессии мРНК СТОР, из чего следует, что данный участок мРНК СТОР является привлекательной областью для направленного воздействия ингибиторов А80.
В определенном варианте осуществления изобретения антисмысловое соединение комплементарно части области СТОР, подвергаемой воздействию активных олигонуклеотидов, которая охватывает сайты-мишени 1396-1424. Именно этот участок последовательности подвергается направленному воздействию 1818 418899, 412295 и 412294 (соответственно 8ЕС ГО N0:166, 40 и 39).
Настоящее изобретение относится также к соединению, включающему модифицированный олигонуклеотид, состоящий по меньшей мере из 12, предпочтительно по меньшей мере из 14 связанных нуклеозидов, последовательность гетероциклических оснований которого является частью одной из последовательностей гетероциклических оснований, представленных в 8ЕС ГО N0: 28, 30, 39, 40, 43, 44, 45, 50, 51, 52, 56, 78, 125 и 166.
Антисмысловые соединения по настоящему изобретению могут включать олигонуклеотид, содержащий 12-30, 12-20 и предпочтительно 14-20 связанных нуклеозидов.
В одном варианте осуществления изобретения модифицированный олигонуклеотид является одноцепочечным или двухцепочечным олигонуклеотидом.
Настоящее изобретение относится к олигомерным соединениям, в частности к антисмысловым олигонуклеотидам, предназначенным для модуляции функции молекул нуклеиновой кислоты, кодирующих фактор роста соединительной ткани, в частности, для модуляции количества продуцируемого фактора роста соединительной ткани. Модуляция достигается благодаря созданию антисмысловых соединений, которые специфически гибридизируют с одной или несколькими нуклеиновыми кислотами, кодирующими фактор роста соединительной ткани. В использованном здесь значении термины нуклеиновая кислота-мишень и нуклеиновая кислота, кодирующая фактор роста соединительной ткани означают ДНК, кодирующую фактор роста соединительной ткани, РНК (в том числе пре-мРНК и мРНК), транскрибированную из такой ДНК, и кДНК, полученную из такой РНК. Специфическая гибридизация олигомерного соединения с нуклеиновой кислотой-мишенью препятствует нормальному функционированию указанной нуклеиновой кислоты. Такая модуляция функции нуклеиновой кислоты-мишени соединениями, которые специфически гибридизируют с указанной нуклеиновой кислотой, обычно определяется как антисмысловая. Подавляемые функции ДНК включают репликацию и транскрипцию. Подавляемые функции РНК включают все жизненные функции, такие как, например, транслокация РНК к сайту трансляции белка, трансляцию белка из РНК, сплайсинг РНК с образованием мРНК одного или нескольких видов и каталитическая активность, которая может определяться или облегчаться данной РНК. Общим эффектом такого подавления функции нуклеиновой кислоты-мишени является модуляция экспрессии фактора роста соединительной ткани. В контексте настоящего изобретения модуляция означает увеличение (стимуляцию) или уменьшение (ингибирование) экспрессии гена. В контексте настоящего изобретения ингибирование является предпочтительной формой модуляции экспрессии гена и мРНК является предпочтительной мишенью.
Нуклеиновые кислоты-мишени, области-мишени и нуклеотидные последовательности
Направленному воздействию антисмысловых соединений предпочтительно подвергают конкретные нуклеиновые кислоты. В контексте настоящего изобретения направленное воздействие антисмыслового соединения на определенную нуклеиновую кислоту представляет многостадийный процесс.
Очевидно, что последовательность, представленная в каждой 8ЕС ГО N0 в примерах, приведенных
- 6 022207 в настоящем описании изобретения, может включать любую модификацию сахарной части, межнуклеозидной связи или гетероциклического основания. Таким образом, антисмысловые соединения, определяемые 8ЕО ГО N0, могут независимо включать одну или несколько модификаций сахарной части, межнуклеозидной связи или гетероциклического основания. Антисмысловые содинения, определяемые номером 1818 (№ 1818), представляют собой комбинацию последовательности гетероциклических оснований и повторяющегося фрагмента.
В одном варианте осуществления изобретения область-мишень является областью нуклеиновой кислоты с определенной структурой. Например, область-мишень может включать З'-ИТК, 5'-ИТК, экзон, интрон, кодирующую область, область инициации трансляции, область терминации трансляции или другую определенную область нуклеиновой кислоты. Области нуклеиновой кислоты с определенной структурой могут быть получены на основании номера доступа из баз данных последовательностей, таких как ΝΟΒΙ, и такая информация включена в настоящее описание изобретения в качестве ссылки. В других вариантах осуществления изобретения область-мишень может включать последовательность от 5'концевого сайта-мишени одного сегмента-мишени в области-мишени до З'-концевого сайта-мишени другого сегмента-мишени в области-мишени.
Направленное воздействие включает определение по меньшей мере одного сегмента-мишени, с которым может гибридизировать антисмысловое соединение с достижением требуемого эффекта. В определенных вариантах осществления изобретения требуемым эффектом является снижение уровней мРНК нуклеиновой кислоты-мишени. В других вариантах осуществления изобретения требуемым эффектом является снижение уровней белка, кодированного нуклеиновой кислотой-мишенью, или фенотипическое изменение, ассоциированное с нуклеиновой кислотой-мишенью.
Область-мишень может содержать один или несколько сегментов-мишеней. Несколько сегментовмишеней в области-мишени могут перекрывать друг друга. Альтернативно указанные сегменты-мишени могут не перекрывать друг друга. В одном варианте осуществления изобретения сегменты-мишени в области-мишени отделены не более, чем примерно 300 нуклеотидами. В других вариантах осуществления изобретения сегменты-мишени в области-мишени отделены не более, чем примерно 250, 200, 150, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20 или 10 нуклеотидами нуклеиновой кислоты-мишени. В другом варианте осуществления изобретения сегменты-мишени в области-мишени отделены не более, чем примерно 5 нуклеотидами нуклеиновой кислоты-мишени. В дополнительных вариантах осуществления изобретения сегменты-мишени являются смежными.
Приемлемые сегменты-мишени могут быть найдены в 5'-ИТК, кодирующей области, З'-ИТК, интроне или экзоне. Сегменты-мишени, содержащие инициирующий кодон или терминирующий кодон, также являются приемлемыми сегментами-мишенями. Приемлемый сегмент-мишень может специфически исключать некоторую область с определенной структурой, такую как инициирующий кодон или терминирующий кодон.
Определение приемлемых сегментов-мишеней может включать сравнение последовательности нуклеиновой кислоты-мишени с другими последовательностями в геноме. Например, для идентификации сходных областей в разных нуклеиновых кислотах может быть использован алгоритм ВЬА8Т. Такое сравнение позволит предотвратить выбор последовательностей антисмыслового соединения, которые могут неспецифически гибридизировать с последовательностями, не являющимися выбранной нуклеиновой кислотой-мишенью (то есть с последовательностями, не являющимися мишенями, или в стороне от последовательности-мишени).
Антисмысловые соединения могут характеризоваться разной активностью (например, определяемой по процентному снижению уровней нуклеиновой кислоты-мишени) в активной области-мишени. В одном варианте осуществления изобретения снижение уровней мРНК СТОР является показателем ингибирования экспрессии СТОР. Снижение уровней белка СТОР также является показателем ингибирования экспрессии мРНК мишени. Кроме того, фенотипические изменения являются показателями ингибирования экспрессии СТОР. Например, увеличение измеренных значений СТОР свидетельствует об ингибировании экспрессии СТОР.
Процесс направленного воздействия обычно начинается с идентификации последовательности нуклеиновой кислоты, функция которой должна быть модулирована. Такой последовательностью может быть, например, клеточный ген (или мРНК, транскрибированная из данного гена), экспрессия которого ассоциирована с определенным нарушением или заболеванием, или молекула нуклеиновой кислоты, выделенная из инфекционного агента. В настоящем изобретении мишенью является молекула нуклеиновой кислоты, кодирующей фактор роста соединительной ткани. Процесс направленного воздействия также включает определение сайта или сайтов в указанном гене для взаимодействия с антисмысловым соединением с достижением требуемого эффекта, такого как, например, обнаружение или модуляция экспрессии белка. В контексте настоящего изобретения предпочтительный внутригенный сайт является областью, включающей кодон инициации или терминации трансляции открытой рамки считывания (0КР) гена. Поскольку, как известно в данной области, кодон инициации трансляции обычно является 5'-АИО (в молекулах транскрибированной мРНК; 5'-АТО в соответствующей молекуле ДНК), кодон инициации трансляции также определяется как кодон АИО, инициирующий кодон или инициирующий кодон
- 7 022207
ЛиО. Установлено, что меньшая часть генов, содержащих кодон инициации трансляции, имеющий последовательность РНК 5'-ОиО, 5'-ииО или 5'-СиО и 5'-АиА, 5'-АСО и 5'-СиО, функционирует ίη νίνο. Таким образом, в определение терминов кодон инициации трансляции и инициирующий кодон могут входить последовательности многих кодонов, даже если инициирующая аминокислота в каждом случае обычно является метионином (в эукариотах) или формилметионином (в прокариотах). В данной области также известно, что гены эукариотов и прокариотов могут иметь два или более альтернативных инициирующих кодонов, любой из которых может быть предпочтительно использован для инициации трансляции в клетке или ткани определенного типа либо в определенных условиях. В контексте настоящего изобретения термины инициирующий кодон и кодон инициации трансляции означают кодон или кодоны, используемые ίη νίνο для инициации трансляции молекулы мРНК, транскрибированной из гена, кодирующего фактор роста соединительной ткани, независимо от последовательностей таких кодонов.
В данной области также известно, что кодон терминации трансляции (или терминирующий кодон) гена может иметь одну из трех последовательностей, то есть 5'-ΥΑΑ, 5'-ИАО и 5'-ИОА (соответствующими последовательностями ДНК являются соответственно 5'-ТАА, 5'-ТАО и 5'-ТОА). Термины область инициирующего кодона и область кодона инициации трансляции означают часть такой мРНК или гена, охватывающую от около 25 до около 50 смежных нуклеотидов в любом направлении (то есть 5' или 3') от кодона инициации трансляции. Аналогичным образом термины область терминирующего кодона и область кодона терминации трансляции означают часть такой мРНК или гена, охватывающую от около 25 до около 50 смежных нуклеотидов в любом направлении (то есть 5' или 3') от кодона терминации трансляции.
Открытая рамка считывания (ΘΚΡ) или кодирующая область, которая, как известно в данной области, означает область между кодоном инициации трансляции и кодоном терминации трансляции, также является областью, которая может быть эффективно подвергнута направленному воздействию. Другие области-мишени включают 5'-концевую нетранслированную область (5'-ИТК), которая, как известно в данной области, является частью мРНК в 5'-направлении от кодона инициации трансляции и, таким образом, включает нуклеотиды между 5'-концевым сайтом кэпирования и кодоном инициации трансляции мРНК или соответствующими нуклеотидами гена и З'-концевой нетранслированной областью (3'ИТК), которая, как известно в данной области, является частью мРНК в З'-направлении от кодона терминации трансляции и, таким образом, включает нуклеотиды между кодоном терминации трансляции и 3'концом мРНК или соответствующими нуклеотидами гена. 5'-Концевой сайт кэпирования мРНК включает остаток Ы7-метилированного гуанозина, присоединенный к наиболее удаленному 5'-концевому остатку мРНК при помощи 5'-5'-трифосфатной связи. Считается, что 5'-концевая область кэпирования мРНК включает саму 5'-концевую структуру сайта кзпирования, а также первые 50 нуклеотидов, смежных с сайтом кэпирования. 5'-Концевая область кэпирования также может быть предпочтительной областьюмишенью.
Несмотря на то, что некоторые эукариотические транскрипты мРНК транслированы, многие транскрипты содержат одну или несколько областей, известных как интроны, выделенные из транскрипта до его трансляции. Оставшиеся (и поэтому транслированные) области известны как экзоны и сплайсированы вместе с образованием смежной последовательности мРНК. Сайты сплайсинга мРНК, то есть экзон-интронные сочленения, также могут быть предпочтительными областями-мишенями и являются особенно полезными в случае аберрантного сплайсинга или сверхпродуцирования определенного продукта сплайсинга мРНК, происходящего во время болезни. Аберрантные гибридные сочленения, образующиеся в результате реаранжировки или делеции, также являются предпочтительными мишенями. Кроме того, установлено, что интроны также могут быть эффективными и поэтому предпочтительными областями-мишенями для направленного воздействия антисмысловых соединений, например, на ДНК или пре-мРНК.
В данной области также известно, что из одной геномной области ДНК могут быть получены альтернативные транскрипты РНК. Указанные альтернативные транскрипты известны как варианты. В частности, варианты пре-мРНК являются транскриптами, полученными из одной геномной ДНК, которые отличаются от других транскриптов, полученных из той же геномной ДНК в инициирующем или терминирующем положении, и содержат области интронов и экзонов.
В результате иссечения одной или нескольких областей экзонов или интронов или их частей во время сплайсинга варианты пре-мрНК образуют меньшие варианты мРНК. Поэтому варианты мРНК являются процессированными вариантами пре-мРНК, и каждый однозначный вариант пре-мрНК всегда должен продуцировать однозначный вариант мРНК в результате сплайсинга. Указанные варианты мРНК известны также как альтернативные сплайсированные варианты. Вариант пре-мРНК, который не был подвергнут сплайсингу, идентичен варианту мРНК.
В данной области также известно, что варианты могут быть получены в результате использования альтернативных сигналов для инициации или терминации транскрипции и что пре-мРНК и мРНК могут содержать более одного инициирующего кодона или терминирующего кодона. Варианты, полученные из пре-мРНК или мРНК, которые используют альтернативные инициирующие кодоны, известны как альтернативные инициирующие варианты указанной пре-мРНК или мРНК. Транскрипты, использующие
- 8 022207 альтернативный терминирующий кодон, известны как альтернативные терминирующие варианты премРНК или мРНК. Одним конкретным типом альтернативного терминирующего варианта является полиА вариант, в котором несколько продуцированных транскриптов получают в результате альтернативного выбора механизмом транскрипции одного из полиА терминирующих сигналов, благодаря чему образуются транскрипты, терминирующие транскрипцию на однозначно определяемых полиА сайтах.
Антисмысловые соединения обычно используют в качестве реагентов для научных исследований и диагностики. Например, антисмысловые олигонуклеотиды, способные ингибировать экспрессию гена с исключительной специфичностью, специалисты в данной области часто используют для определения функции конкретных генов. Антисмысловые соединения также используют, например, для определения различий между функциями разных членов биологического пути. Поэтому антисмысловая модуляция используется в научных целях.
Антисмысловые соединения по настоящему изобретению, применяемые в наборах и для диагностики, отдельно или в комбинации с другими антисмысловыми соединениями или лекарственными средствами, могут быть использованы в качестве средств при выполнении дифференцированных и/или комбинаторных анализов с целью определения паттернов экспрессии части или всего набора генов, экспрессированных в клетках и тканях.
Паттерны экспрессии в клетках или тканях, подвергаемых воздействию одного или нескольких антисмысловых соединений, сравнивают с контрольными клетками или тканями, которые не были подвергнуты воздействию антисмысловых соединений, и полученные паттерны анализируют в отношении дифференцированных уровней экспрессии генов, относящихся, например, к возникновению заболевания, сигнальному пути, локализации клеток, уровню экспрессии, величине, структуре или функции исследуемых генов. Указанные анализы могут быть выполнены с использованием стимулированных или нестимулированных клеток и в присутствии или отсутствии других соединений, влияющих на паттерны экспрессии.
Примеры методов анализа экспрессии генов, известных в даной области, включают матрицы или микроматрицы ДНК (Вга/та апб Убо, ΡΕΌδ Ьей., 2000, 480, 17-24; Се11§ е1 а1., РЕВ8 Ьей., 2000, 480, 216), 8АОЕ (серийный анализ экспрессии генов) (Маббеп е1 а1., Эгид Όίδεον. Тобау, 2000, 5, 415-425), РЕАО8 (амплификация рестрикционных ферментов гидрированных кДНК) (Ргакйат апб ХУе^тап, Ме1йоб§ Епгуто1., 1999, 303, 258-72), ТООЛ (общий анализ экспрессии генов) (8и1сбббе е1 а1., Ргос. Ыаб. Асаб. 8с1. И.8.А., 2000, 97, 1976-81), белковые матрицы и протеомию (СеЙ5 е1 а1., РЕВ8 Ьей., 2000, 480, 2-16; 1ипдЫи1 е1 а1., Е1ес1торйоге515, 1999, 20, 2100-10), секвенирование метки экспрессированной последовательности (Е8Т) (Себ5 е1 а1., РЕВ8 Ьей., 2000, 480, 2-16; ЬатББоп е1 а1., 1. Вю1есйпо1., 2000, 80, 143-57), разностный фингерпринтинг РНК (8иКЕ) (Рисйб е1 а1., Апа1. Вюсйет., 2000, 286, 91-98; Ьагеоп е1 а1., Су1оте1ту, 2000, 41, 203-208), разностное клонирование, дифференцированное отображение (ЭЭ) Дитесю апб Ве1топ1, Сигг. Орш. Мютойюй, 2000, 3, 316-21), сравнительную гибридизацию генома (СатиШ е1 а1., 1. Се11 Вюсйет. 8ирр1., 1998, 31, 286-96), методы ΡΙ8Η (флуоресцентная гибридизация ш бйи) (Оошд апб Ои51ег5оп, Еиг. 1. Сапсег, 1999, 35, 1895-904) и методы масс-спектрометрии (рассмотренные в публикации (То, Сотй. Сйет. Шдй Тйгодйри! 8сгееп, 2000, 3, 235-41).
Антисмысловые соединения
В контексте настоящего изобретения термин олигонуклеотид означает олигомер или полимер рибонуклеиновой кислоты (РНК) или дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) либо их миметики. В определение данного термина входят олигонуклеотиды, состоящие из природных гетероциклических оснований, Сахаров и ковалентных межнуклеозидных (остовных) связей, а также олигонуклеотиды, содержащие искусственные части, функционирующие аналогичным образом. Такие модифицированные или замещенные олигонуклеотиды часто являются более предпочтительными по сравнению с природными формами благодаря наличию требуемых свойств, таких как, например, более высокое поглощение клеткой, более высокое сродство к нуклеиновой кислоте-мишени и более высокая устойчивость в присутствии нуклеаз.
Хотя антисмысловые олигонуклеотиды являются предпочтительной формой антисмыслового соединения, в объем настоящего изобретения входят другие олигомерные антисмысловые соединения, которые включают, не ограничиваясь ими, миметики олигонуклеотидов.
Антисмысловое соединение является олигомерным соединением, способным гибридизировать с нуклеиновой кислотой-мишенью по водородной связи. Антисмысловые соединения включают, не ограничиваясь ими, олигонуклеотиды, олигонуклеозиды, аналоги олигонуклеотидов, миметики олигонуклеотидов, антисмысловые олигонуклеотиды, миРНК, РНКи, рибозимы, олигонуклеотиды с внешней направляющей последовательностью (олигозимы) и другие олигонуклеотиды, которые гибридизируют с нуклеиновой кислотой-мишенью и модулируют ее экспрессию.
В определенных вариантах осуществления изобретения антисмысловое соединение имеет последовательность гетероциклических оснований, которая при записи в 5'-3' направлении включает обратный комплемент сегмента-мишени нуклеиновой кислоты-мишени, на который оказывает направленное воздействие. В таких определенных вариантах осуществления изобретения антисмысловой олигонуклеотид имеет последовательность гетероциклических оснований, которая при записи в 5'-3' направлении вклю- 9 022207 чает обратный комплемент сегмента-мишени нуклеиновой кислоты-мишени, на который оказывает направленное воздействие.
В определенных вариантах осуществления изобретения антисмысловое соединение, направленно воздействующее на нуклеиновую кислоту, состоит из 12-30 субъединиц. Другими словами, антисмысловые соединения состоят из 12-30 связанных сбъединиц. В других вариантах осуществления изобретения антисмысловое соединение состоит из 8-80, 12-50, 15-30, 18-24, 19-22 или 20 связанных субъединиц. В таких определенных вариантах осуществления изобретения антисмысловые соединения состоят из 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 или 80 связанных субъединиц или имеют длину в интервале, определяемом любыми двумя вышеуказанными значениями. В некоторых вариантах осуществления изобретения антисмысловое соединение является антисмысловым олигонуклеотидом, и связанные субъединицы являются нуклеотидами.
В одном предпочтительном варианте осуществления изобретения соединение включает 20 или по меньшей мере 14 связанных нуклеозидов, при этом модифицированный олигонуклеотид имеет последовательность, которая на 100% идентична одной из последовательностей, представленных в 8ЕО ГО N0:28, 30, 39, 40, 45, 52, 56, 78, 125 и 166. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения представляющее интерес основное соединение имеет последовательность, представленную в 8ЕО ГО N0:39 (1818 412294).
В определенных вариантах осуществления изобретения укороченное или усеченное антисмысловое соединение, направленно воздействующее на нуклеиновую кислоту, имеет одну субъединицу, удаленную из 5'-конца (усечение 5'-конца) или альтернативно из 3'-конца (усечение 3'-конца). Укороченное или усеченное антисмысловое соединение, направленно воздействующее на нуклеиновую кислоту, может иметь две субъединицы, удаленные из 5'-конца или альтернативно может иметь две субъединицы, удаленные из 3'-конца антисмыслового соединения. Альтернативно удаленные нуклеозиды могут быть распределены по всей длине антисмыслового соединения, например, в антисмысловом соединении, имеющем один нуклеозид, удаленный из 5'-конца, и один нуклеозид, удаленный из 3'-конца.
Одна дополнительная субъединица, присутствующая в удлиненном антисмысловом соединении, может находиться у 5'- или 3'-конца антисмыслового соединения. Две или более дополнительные субъединицы могут быть расположены рядом друг с другом, например, могут быть добавлены к 5'-концу (добавление к 5'-концу), или альтернативно к 3'-концу (добавление к 3'-концу) антисмыслового соединения, имеющего две субъединицы. Альтернативно добавленные субъединицы могут быть распределены по всей длине антисмыслового соединения, например, одна субъединица может быть добавлена 5'-концу и одна субъединица может быть добавлена к 3'-концу антисмыслового соединения.
Можно увеличить или уменьшить длину антисмыслового соединения, такого как антисмысловой олигонуклеотид, и/или ввести ошибочно спаривающиеся основания без утраты активности. Например, в публикации \Уоо1Г с1 а1. (Ргос. ΝαΙΙ. Асаб. 8ст И8А 89:7305-7309, 1992) описана серия антисмысловых олигонуклеотидов, состоящих из 13-25 гетероциклических оснований, которая была исследована в отношении способности индуцировать расщепление РНК-мишени в модели введения ооцитов. Антисмысловые олигонуклеотиды, состоящие из 25 гетероциклических оснований и имеющие 8 или 11 ошибочно спаривающихся оснований у концов антисмысловых олигонуклеотидов, были способны специфически расщеплять мРНК-мишень, хотя и в меньшей степени, чем антисмысловые олигонуклеотиды, не содержащие ошибочно спаривающихся оснований. Аналогичным образом целенаправленное специфическое расщепление было достигнуто при использовании антисмысловых олигонуклеотидов, состоящих из 13 гетероциклических оснований, включающих 1 или 3 ошибочно спаривающихся основания.
В публикации СаийсЫ с1 а1. (1. ΝαΙΙ. Сапсег ίηκΐ. 93:463-471, Магсй 2001) продемонстрирована способность олигонуклеотида, на 100% комплементарного мРНК Ьс1-2 и имеющего 3 основания, ошибочно спаривающихся с мРНК Ьс1-хЬ, уменьшать экспрессию Ьс1-2 и Ьс1-хЬ ίη νίίτο и ίη νίνο. Кроме того, указанный олигонуклеотид демонстрировал сильную противоопухолевую активность ίη νίνο.
В публикации Майег апб Оо1шск Шис. Ааб Кек. 16:3341-3358, 1988) описано исследование серии антисмысловых олигонуклеотидов, состоящих из 14 последовательно соединенных гетероциклических оснований, и антисмысловых олигонуклеотидов, состоящих из 28 и 42 гетероциклических оснований, образующих последовательность из двух или трех последовательно соединенных антисмысловых олигонуклеотидов, в отношении их способности останавливать трансляцию ΌΗΡΚ человека при выполнении анализа ретикулоцитов кролика. Каждый из трех антисмысловых олигонуклеотидов, состоящих из 14 гетероциклических оснований, используемый отдельно, был способен ингибировать трансляцию, хотя и на более низком уровне, чем антисмысловые олигонуклеотиды, состоящие из 28 или 42 гетероциклических оснований.
В публикации Вйаио! е1 а1. (РСТ/и82007/068401) представлены короткие антисмысловые соединения, в том числе соединения, включающие 8-16 химически модифицированных высокоаффинных мономеров. Было показано, что указанные короткие антисмысловые соединения могут снижать уровни нуклеиновых кислот-мишеней и/или белков в клетках, тканях и у животных с более высокой эффективно- 10 022207 стью и лучшим терапевтическим индексом. Короткие антисмысловые соединения оказывали эффективное воздействие при использовании в более низких дозах по сравнению с ранее описанными антисмысловыми соединениями, что позволяет уменьшить токсичность и затраты на лечение. Кроме того, описанные короткие антисмысловые соединения в большей степени пригодны для перорального введения.
Г ибридизация
После идентификации одного или нескольких сайтов-мишеней выбирают олигонуклеотиды, которые являются достаточно комплементарными данной мишени, то есть достаточно хорошо и с достаточной специфичностью гибридизируют с достижением требуемого эффекта.
В контексте настоящего изобретения термин гибридизация означает образование водородной связи, которая может быть связью Ватсона-Крика, Хугстина или обратной водородной связью Хугстина, между комплементарными нуклеозидными или нуклеотидными основаниями. Наример, аденин и тимин являются комплементарными гетероциклическими основаниями, которые спариваются в результате образования водородных связей.
В некоторых вариантах осуществления изобретения гибридизация происходит между антисмысловым соединением по настоящему изобретению и нуклеиновой кислотой. Наиболее общий механизм гибридизациии включает образование водородной связи между комплементарными гетероциклическими основаниями молекул нуклеиновой кислоты.
Гибридизация может происходить в разных условиях. Строгие условия зависят от последовательности и определяются характером и составом гибридизируемых молекул нуклеиновой кислоты.
В данной области хорошо известны методы определения способности последовательности специфически гибридизировать с нуклеиновой кислотой-мишенью. В одном варианте осуществления изобретения антисмысловые соединения по настоящему изобретению специфически гибридизируют с нуклеиновой кислотой.
Комплементарность
Термин комплементарность в использованном здесь значении означает способность точного спаривания двух нуклеотидов. Например, если нуклеотид в определенном положении олигонуклеотида может образовывать водородную связь с нуклеотидом в том же положении молекулы ДНК или РНК, такой олигонуклеотид и ДНК или РНК считаются комплементарными друг другу в данном положении. Олигонуклеотид и ДНК или РНК являются комплементарными друг другу в том случае, когда достаточное число соответствующих положений в каждой молекуле занимают нуклеотиды, способные образовывать водородную связь друг с другом. Таким образом, термины специфически гибридизируемый и комплементарный служат для обозначения достаточной степени комплементарности или точного спаривания, в результате которого происходит устойчивое и специфическое связывание олигонуклеотида и ДНК или РНК-мишени. Как хорошо известно в данной области, последовательность антисмыслового соединения не должна быть на 100% комплементарна последовательности нуклеиновой кислоты-мишени для достижения специфической гибридизации. Антисмысловое соединение является специфически гибридизируемым, если связывание данного соединения с молекулой ДНК или РНК-мишени препятствует нормальному функционированию ДНК или РНК-мишени, в результате чего такая мишень становится бесполезной, при этом существует достаточная степень комплементарности, позволяющая избежать неспецифического связывания антисмыслового соединения с последовательностями, не являющимися мишенями, в условиях, в которых желательно специфическое связывание, то есть в физиологических условиях в случае выполнения анализов ίη νίνο или терапевтического лечения и в случае выполнения анализов ίη νίίτο.
Антисмысловые и другие соединения по настоящему изобретению, гибридизирующие с мишенью и ингибирующие экспрессию мишени, были идентифицированы в результате экспериментальных исследований, и последовательности указанных соединений приведены в качестве предпочтительных вариантов осуществления настоящего изобретения. Сайты-мишени, которым комплементарны указанные предпочтигельные последовательности, определяются далее в описании изобретения как активные центры и поэтому являются предпочтительными сайтами для направленного воздействия. Поэтому другой вариант осуществления изобретения относится к соединениям, которые гибридизируют с такими активными центрами.
Антисмысловое соединение и нуклеиновая кислота-мишень являются комплементарными друг другу в том случае, когда достаточное число гетероциклических оснований антисмыслового соединения могут образовывать водородную связь с соответствующими гетероциклическими основаниями нуклеиновой кислоты-мишени, в результате чего достигается требуемый эффект (например, антисмысловое ингибирование нуклеиновой кислоты-мишени, такой как нуклеиновая кислота СТСР).
Некомплементарные гетероциклические основания в антисмысловом соединении и нуклеиновой кислоте СТСР являются допустимыми при условии, что антисмысловое соединение сохраняет способность специфически гибридизировать с нуклеиновой кислотой-мишенью. Кроме того, антисмысловое соединение может гибридизировать с одним или несколькими сегментами нуклеиновой кислоты СТСР таким образом, чтобы мешающие или смежные сегменты не участвовали в гибридизации (например, петлеобразная структура, ошибочно спаривающаяся или шпилькообразная структура).
- 11 022207
В некоторых вриантах осуществления изобретения антисмысловые соединения по настоящему изобретению по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% комплементарны нуклеиновой кислоте СТСР. Процентное значение комплементарности антисмыслового соединения с нуклеиновой кислотоймишенью можно определить стандартными методами.
Например, антисмысловое соединение, в котором 18 из 20 гетероциклических оснований антисмыслового соединения комплементарны области-мишени и которое поэтому должно специфически гибридизировать, является комплементарным на 90%. В данном примере остальные некомплементарные гетероциклические основания могут быть сгруппированы или распределены между комплементарными гетероциклическими основаниями и не обязательно должны располагаться рядом друг с другом или с комплементарными гетероциклическими основаниями. Таким образом, антисмысловое соединение, состоящее из 18 гетероциклических оснований и имеющее 4 (четыре) некомплементарных гетероциклических основания, которые фланкированы двумя областями, полностью комплементарными нуклеиновой кислоте-мишени, характеризуется 77,8% общей комплементарностью с нуклеиновой кислотой-мишенью и, следовательно, входит в объем настоящего изобретения. Процентное значение комплементарности антисмыслового соединения с областью нуклеиновой кислоты-мишени можно определить стандартными методами при помощи программ ВЬА8Т (основные инструментальные средства поиска локального соответствия) и программ Ро^егВЬАЗТ, известных в данной области (Л115сйи1 е! а1., 1. Μοί. ΒίοΙ., 1990, 215, 403 410; Ζΐιαηβ аиб Маббеп, Сепоте Век., 1997, 7, 649 656). Процентное значение гомологии, идентичности или комплементарности последовательностей можно определить, например, при помощи программы Сар (^15соп51п 8ециепсе АпаВПк Раскаде, Уегзюп 8 йог Ишх, СепеИсз Сотри1ег Сгоир, Итуегзйу Везеагсй Рагк, МабРоп \У15.)„ с использованием установок по умолчанию, в которой использован алгоритм Смита и Вотермена (Α6ν. Арр1. Ма1й, 1981, 2, 482 489).
В других вариантах осуществления изобретения антисмысловые соединения по настоящему изобретению являются полностью комплементарными (то есть комплементарными на 100%) нуклеиновой кислоте-мишени. Например, антисмысловое соединение может быть полностью комплементарным нуклеиновой кислоте СТСР, ее области-мишени, сегменту-мишени или последовательности-мишени. В использованном здесь значении термин полностью комплементарный означает, что каждое гетероциклическое основание антисмыслового соединения может точно спариваться с соответствующими гетероциклическими основаниями нуклеиновой кислоты-мишени.
Некомплементарное гетероциклическое основание может находиться у 5'-конца или З'-конца антисмыслового соединения. Альтернативно, одно или несколько некоплементарных гетероциклических оснований могут находиться внутри антисмыслового соединения. Два или более некомплементарных гетероциклических оснований могут быть смежными (то есть связанными) или несмежными. В одном варианте осуществления изобретения некомплементарное гетероциклическое основание расположено в боковом сегменте антисмыслового олигонуклеотида с разрывом.
В одном варианте осуществления изобретения антисмысловые соединения, включающие до 20 гетероциклических оснований, содержат не более 4, не более 3, не более 2 или не более 1 некомплементарного гетероциклического основания по отношению к нуклеиновой кислоте-мишени, такой как нуклеиновая кислота СТСР.
В другом варианте осуществления изобретения антисмысловые соединения, включающие до 30 гетероциклических оснований, содержат не более 6, не более 5, не более 4, не более 3, не более 2 или не более 1 некомплементарного гетероциклического основания по отношению к нуклеиновой кислотемишени, такой как нуклеиновая кислота СТСР.
Антисмысловыми соединениями по настоящему изобретению также являются такие соединения, которые комплементарны части нуклеиновой кислоты-мишени. В использованном здесь значении термин часть означает определенное число смежных (то есть связанных) гетероциклических оснований в области или сегменте нуклеиновой кислоты-мишени. Термин часть может также означать определенное число смежных гетероциклических оснований антисмыслового соединения. В одном варианте осуществления изоборетения антисмысловые соединения являются комплементарными по меньшей мере части сегмента-мишени, состоящей из 8 гетероциклических оснований. В другом варианте осуществления изобретения антисмысловые соединения являются комплементарными по меньшей мере части сегмента-мишени, состоящей из 12 гетероциклических оснований. В еще одном варианте осуществления изобретения антисмысловые соединения являются комплементарными по меньшей мере части сегментамишени, состоящей из 15 гетероциклических оснований. Комплементарными также являются антисмысловые соединения, которые комплементарны по меньшей мере части сегмента-мишени, состоящей из 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или более гетероциклических оснований или охватывающей интервал, определяемый любыми двумя из указанных значений.
- 12 022207
Идентичность
Антисмысловые соединения по настоящему изобретению могут также обладать определенным процентным значением идентичности с конкретной нуклеотидной последовательностью, δΕΟ ГО N0, или соединением, представленным определенным номером Ιδίδ. В использованном здесь значении антисмысловое соединение является идентичным последовательности по настоящему изобретению, если данное соединение обладает такой же способностью спаривания гетероциклических оснований. Например, РНК, содержащая урацил вместо тимидина в рассмотренной последовательности ДНК, считается идентичной последовательности ДНК, поскольку как урацил, так и тимидин спариваются с аденином. Укороченные и удлиненные варианты антисмысловых соединений по настоящему изобретению, а также соединения, содержащие неидентичные основания по отношению к антисмысловым соединениям по настоящему изобретению, также входят в объем настоящего изобретения. Неидентичные основания могут быть смежными или распределенными по всей длине антисмыслового соединения. Процентное значение идентичности антисмыслового соединения вычисляют с учетом числа идентично спаривающихся оснований по отношению к сравниваемой последовательности.
В одном варианте осуществления изобретения антисмысловые соединения по меньшей мере на 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентичны одному или нескольким антисмысловым соединениям, δΕΟ ГО N0 или их части по настоящему изобретению.
Модификации
В определенном варианте осуществления изобретения модификации антисмысловых соединений включают замены или изменения межнуклеозидных связей, сахарных частей или гетероциклических оснований.
В одном варианте осуществления изобретения соединение включает по меньшей мере одну модификацию, выбираемую из группы, включающей модифицированную межнуклеозидную связь, модифицированный сахар и модифицированное гетероциклическое основание.
Несмотря на то, что могут быть использованы антисмысловые олигонуклеотиды, содержащие разные модифицированные межнуклеозидные связи, в настоящее время предпочтительной модифицированной межнуклеозидной связью является фосфотиоатная связь между одним или несколькими нуклеозидами или наличие всех фосфотиоатных межнуклеозидных связей. Как правило, также желательно, чтобы антисмысловой олигонуклеотид содержал по меньшей мере один и обычно несколько модифицированных Сахаров, при этом сахар является бициклическим сахаром. Хотя могут быть использованы разные модифицированные сахара, предпочтительным сахаром является 2'-О-метоксиэтилсахар.
Кроме того, по меньшей мере одно и обычно несколько гетероциклических оснований в антисмысловом олигонуклеотиде являются модифицированным нуклеотидом, таким как 5-метилцитозин.
Нуклеозид представляет собой комбинацию основания с сахаром. Гетероциклическое основание (известное также как основание) нуклеозида обычно является гетероциклической частью. Нуклеотиды являются нуклеозидами, которые далее включают фосфатную группу, ковалентно связанную с сахарной частью нуклеозида. В нуклеозидах, включающих пентофуранозилсахар, фосфатная группа может быть связана с 2', 3' или 5'-гидроксильной частью сахара. Олигонуклеотиды образуются в результате ковалентного связывания смежных нуклеозидов друг с другом с образованием линейного полимерного олигонуклеотида. В структуре олигонуклеотида фосфатные группы обычно определяются как группы, образующие межнуклеозидные связи олигонуклеотида.
Модификации антисмысловых соединений включают замены или изменения межнуклеозидных связей, сахарных частей или гетероциклических оснований. Модифицированные антисмысловые соединения часто являются более предпочтительными по сравнению с природными формами благодаря наличию требуемых свойств, таких как, например, более высокое поглощение клеткой, более высокое сродство к нуклеиновой кислоте-мишени, более высокая устойчивость в присутствии нуклеаз или более высокая ингибирующая активность.
Химически модифицированные нуклеозиды также могут быть использованы для увеличения сродства связывания укороченного или усеченного антисмыслового олигонуклеотида с нуклеиновой кислотой-мишенью. Поэтому сравнимые результаты часто могут быть получены при использовании более коротких антисмысловых соединений, содержащих такие химически модифицированные нуклеозиды.
Модифицированные межнуклеотидные связи
Природная межнуклеозидная связь РНК и ДНК является 3'-5' фосфодиэфирной связью. Антисмысловые соединения, содержащие одну или несколько модифицированных, то есть неприродных, межнуклеозидных связей, часто выбирают вместо антисмысловых соединений, имеющих природные межнуклеозидные связи благодаря наличию требуемых свойств, таких как, например, более высокое поглощение клеткой, более высокое сродство к нуклеиновым кислотам-мишеням и более высокая устойчивость в присутствии нуклеаз.
Олигонуклеотиды, имеющие модифицированные межнуклеозидные связи, включают межнуклеозидные связи, содержащие атом фосфора, а также межнуклеозидные связи, не содержащие атом фосфора. Типичные фосфорсодержащие межнуклеозидные связи включают, не ограничиваясь ими, фосфодиэфиры, фосфотриэфиры, метилфосфонаты, фосфорамидаты и фосфортиоаты. Методы получения содер- 13 022207 жащих фосфор и не содержащих фосфор связей хорошо известны.
В одном варианте осуществления изобретения антисмысловые соединения, направленно воздействующие на нуклеиновую кислоту СТОР, включают одну или несколько модифицированных межнуклеозидных связей. В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированные межнуклеозидные связи являются фосфортиоатными связями. В других вариантах осуществления изобретения все межнуклеозидные связи антисмыслового соединения являются фосфортиоатными межнуклеозидными связями.
Как известно в данной области, нуклеозид представляет собой комбинацию основания с сахаром. Основание нуклеозида обычно является гетероциклическим основанием. Двумя наиболее распространенными классами таких гетероциклических оснований являются пурины и пиримидины. Нуклеотиды являются нуклеозидами, которые далее включают фосфатную группу, ковалентно связанную с сахарной частью нуклеозида. В нуклеозидах, включающих пентофуранозилсахар, фосфатная группа может быть связана с 2', 3' или 5'-гидроксильной частью сахара. В процессе образования олигонуклеотидов фосфатные группы ковалентно связывают смежные нуклеозиды друг с другом с образованием линейного полимерного соединения. Соответствующие концы такой линейной полимерной структуры в свою очередь могут быть соединены с образованием кольцевой структуры, однако, открытые линейные структуры обычно являются более предпочтительными. В структуре олигонуклеотида фосфатные группы обычно определяются как группы, образующие межнуклеозидный остов олигонуклеотида. Нормальная связь или остов РНК и ДНК является 3'-5' фосфодиэфирной связью.
Конкретные примеры предпочтительных антисмысловых соединений, пригодных для использования в настоящем изобретении, включают олигонуклеотиды, содержащие модифицированные остовы или неприродные межнуклеозидные связи. Как указано в настоящем описании изобретения, олигонуклеотиды, имеющие модифицированные остовы, включают соединения, содержащие атом фосфора в остове, и соединения, не содержащие атом фосфора в остове. В соответствии с целями настоящего описания изобретения и определением, иногда используемым в данной области техники, модифицированные олигонуклеотиды, не содержащие атом фосфора в межнуклеозидном остове, также могут считаться олигонуклеозидами.
Предпочтительные модифицированные остовы олигонуклеотидов включают, например, фосфортиоаты, хиральные фосфортиоаты, фосфордитиоаты, фосфотриэфиры, аминоалкилфосфотриэфиры, метилфосфонаты и другие алкилфосфонаты, включающие З'-алкиленфосфонаты, 5'-алкиленфосфонаты и хиральные фосфонаты, фосфинаты, фосфорамидаты, включающие З'-аминофосфорамидаты и аминоалкилфосфорамидаты, тионофосфорамидаты, тионоалкилфосфонаты, тионоалкилфосфотриэфиры, селенофосфонаты и боранофосфонаты, имеющие нормальные 3'-5' связи, 2'-5' связанные аналоги и остовы с обратной полярностью, в которых одна или несколько межнуклеозидных связей являются 3'-3', 5'-5' или 2'-2' связями. Предпочтительные олигонуклеотиды, имеющие обратную полярность, включают одну З'-З' связь в положении 3'-концевой межнуклеотидной связи, то есть один обратный нуклеозидный остаток, который может не быть основанием (гетероциклическое основание отсутствует или вместо него присутствует гидроксильная группа). В объем настоящего изобретения также входят разные соли, смешанные соли и свободные кислоты.
Репрезентативные патенты США, в которых описано получение вышеуказанных фосфорсодержащих связей, включают, не ограничиваясь ими, патенты США №№ 3687808, 4469863, 4476301, 5023243, 5177196, 5188897, 5264423, 5276019, 5278302, 5286717, 5321131, 5399676, 5405939, 5453496, 5455233, 5466677, 5476925, 5519126, 5536821, 5541306, 5550111, 5563253, 5571799, 5587361, 5194599, 5565555, 5527899, 5721218, 5672697 и 5625050, некоторые из которых принадлежат владельцам настоящей заявки и все включены в настоящее описание изобретения в качестве ссылки.
Предпочтительные модифицированные олигонуклеотиды, которые не содержат в остове атом фосфора, имеют остовы, образованные короткоцепными алкильными или циклоалкильными межнуклеозидными связями, смешанными гетероатомными и алкильными или циклоалкильными межнуклеозидными связями или одной или несколькими короткоцепными гетероатомными или гетероциклическими межнуклеозидными связями. Такие остовы включают морфолиносвязи (частично образованные из сахарной части нуклеозида); силоксановые остовы, сульфидные, сульфоксидные и сульфоновые остовы; формацетильные и тиоформацетильные остовы; метиленформацетильные и тиоформацетильные остовы; рибоацетильные остовы; алкенсодержащие остовы; сульфаматные остовы; метиленимино и метиленгидразиностовы; сульфонатные и сульфонамидные остовы; амидные остовы и другие, содержащие смешанные компоненты Ν, О, δ и СН2.
Репрезентативные патенты США, в которых описано получение вышеуказанных олигонуклеозидов, включают, не ограничиваясь ими, патенты США №№ 5034506, 5166315, 5185444, 5214134, 5216141, 5235033, 5264562, 5264564, 5405938, 5434257, 5466677, 5470967, 5489677, 5541307, 5561225, 5596086, 5602240, 5610289, 5602240, 5608046, 5610289, 5618704, 5623070, 5663312, 5633360, 5677437, 5792608, 5646269 и 5677439, некоторые из которых принадлежат владельцам настоящей заявки и все включены в настоящее описание изобретения в качестве ссылки.
В других передпочтительных миметиках олигонуклеотидов сахар и межнуклеозидная связь нуклео- 14 022207 тидных звеньев, то есть остов, заменены новыми группами. Структурные единицы сохранены для гибридизации с соответствующей нуклеиновой кислотой-мишенью. Одно такое олигомерное соединение, миметик олигонуклеотида, которое, как установлено, обладает великолепными свойствами гибридизации, определяется как нуклеиновая кислота пептида (ΡΝΑ). В соединениях ΡΝΑ сахарный остов олигонуклеотида заменен амидсодержащим остовом, в частности, аминоэтилглициновым остовом. Гетероциклические основания сохранены и связаны прямой или непрямой связью с азаатомами азота амидной части остова. Репрезентативные патенты США, в которых описано получение соединений ΡΝΑ, включают, не ограничиваясь ими, патенты США №№ 5539082, 5714331 и 5719262, которые включены в настоящее описание изобретения в качестве ссылки. С другим описанием соединений ΡΝΑ можно ознакомиться в публикации №ейеи е! а1., 8е1еиее, 1991, 254, 1497-1500.
Наиболее предпочтительные варианты осуществления изобретения относятся к олигонуклеотидам с фосфортиоатными остовами и к олигонуклеотидам с гетероатомными остовами, в частности, -ΟΗ2-ΝΗО-СН2-, -СН2-Ы(СН3)-О-СН2- (известный как метиленовый (метилимино) или ΜΜΙ остов), -0Η2-Ο-Ν (СН3)-СН2, СН2-Н(СН3)-Ы(СН3)-СН2- и -О-Ы(СН3)-СН2-СН2 (где природный фосфодиэфирный остов представлен как -О-Р-О-СН2-), описанным в приведенном выше патенте США № 5489677, и к амидным остовам, описанным в приведенном выше патенте США № 5602240. Предпочтительными также являются олигонуклеотиды, имеющие морфолиноостов, описанный в приведенном выше патенте США № 5034506.
Модифицированные сахарные части
Модифицированные олигонуклеотиды могут также содержать одну или несколько замещенных сахарных частей. Например, фуранозилсахарное кольцо может быть модифицировано рядом способов, включающих замещение замещающей группой, соединение мостиковой связью с образованием бициклической нуклеиновой кислоты (ΒΝΑ), замещение группы 4'-О гетероатомом, таким как 8 или Ν(Κ), как описано в патенте США № 7399845, принадлежащем 8е1й е! а1., который полностью включен в настоящее описание изобретения в качестве ссылки. Другие примеры ΒΝΑ приведены в опубликованной международной заявке на патент № \УО 2007/146511, которая полностью включена в настоящее описание изобретения в качестве ссылки.
Антисмысловые соединения по настоящему изобретению могут необязательно содержать один и несколько нуклеотидов, имеющих модифицированные сахарные части. Модификации сахара могут сообщать антисмысловым соединениям устойчивость к нуклеазам, сродство связывания или некоторые другие полезные биологические свойства. Фуранозилсахарное кольцо нуклеозида может быть модифицировано рядом способов, которые включают, не ограничиваясь ими, добавление замещающей группы, в частности, в 2'-положение; соединение мостиковой связью двух непарных атомов в кольце с образованием бициклической нуклеиновой кислоты (ΒΝΑ) и замещение атома кислорода в кольце в 4'-положении таким атомом или группой как -8-, -Ν(Κ)- или -С(К1)(К2). Модифицированные сахара включают, не ограничиваясь ими, замещенные сахара, особенно 2'-замещенные сахара, содержащие замещающую группу 2'-Р, 2'-ОСН2 (2'-ОМе) или 2'-О(СН2)2-ОСН3 (2'-О-метоксиэтил или 2'-МОЕ), и бициклические модифицированные сахара (ΒΝΑ), имеющие мостиковую связь 4'-(СН2)и-О-2', где и=1 или и=2. Методы получения модифицированных Сахаров хорошо известны специалистам в данной области.
В определенных вариантах осуществления изобретения 2'-модифицированный нуклеозид имеет бициклическую сахарную часть. В таких определенных вариантах осуществления изобретения бициклическая сахарная часть является Ό-сахаром в альфа-конфигурации. В таких определенных вариантах осуществления изобретения бициклическая сахарная часть является Ό-сахаром в бета-конфигурации. В таких определенных вариантах осуществления изобретения бициклическая сахарная часть является Ь-сахаром в альфа-конфигурации. В таких определенных вариантах осуществления изобретения бициклическая сахарная часть является Ь-сахаром в бета-конфигурации.
В определенных вариантах осуществления изобретения бициклическая сахарная часть включает мостиковую группу между 2'- и 4'-атомами углерода. В таких определенных вариантах осуществления изобретения мостиковая группа включает от 1 до 8 связанных бирадикальных групп. В определенных вариантах осуществления изобретения бициклическая сахарная часть включает от 1 до 4 связанных бирадикальных групп. В определенных вариантах осуществления изобретения бициклическая сахарная часть включает 2 или 3 связанные бирадикальные группы. В определенных вариантах осуществления изобретения бициклическая сахарная часть включает 2 связанные бирадикальные группы. В определенных вариантах осуществления изобретения связанную бирадикальную группу выбирают из -О-, -8-, -Ν(Κ1)-, -С(К1)(К2)-, -С(К1)=С(К1)-, -ΟΚ1)=Ν-, -Ο(=ΝΚ1)-, -8ί(Κ1)(Κ2)-, -8(=О)2-, -8(=О)-, -С(=О)- и -С(=8)-, где каждый К1 и К2 независимо означает Н, гидроксил, С1-С12 алкил, замещенный С1-С12 алкил, С2-С12 алкенил, замещенный С2-Ц2 алкенил, С2-Ц2 алкинил, замещенный С2-С12 алкинил, С5-С20 арил, замещенный С5-С20 арил, гетероциклический радикал, замещенный гетероциклический радикал, гетероарил, замещенный гетероарил, С5-С7 алициклический радикал, замещенный С5-С7 алициклический радикал, галоген, замещенную оксигруппу (-О-), аминогруппу, замещенную аминогруппу, азидогруппу, карбоксил, замещенный карбоксил, ацил, замещенный ацил, ΟΝ, тиол, замещенный тиол, сульфонил (8(=О)2-Н), замещенный сульфонил, сульфоксил (8(=О)-Н) или замещенный сульфоксил; и каждая заме- 15 022207 щающая группа независимо является галогеном, С1-С12 алкилом, замещенным С1-С12 алкилом, С2-Ц2 алкенилом, замещенным С2-Ц2 алкенилом, С2-Ц2 алкинилом, замещенным С2-Ц2 алкинилом, аминогруппой, замещенной аминогруппой, ацилом, замещенным ацилом, С1-С2 аминоалкилом, С1-С12 аминоалкокси, замещенным С1-С12 аминоалкилом, замещенным С1-С12 аминоалкокси или защитной группой.
В некоторых вариантах осуществения изобретения бициклическая сахарная часть соединена мостиковой связью между 2'- и 4'-атомами углерода с бирадикальной группой, выбираемой из -О-(СН2)р-, -ОСН2-, -О-СН2СН2-, -О-СН(алкил)-, -ЦН-(СН2)р-, -Ы(алкил)-(СН2)р-, -О-СН(алкил)-, -(СН(алкил))-(СН2)р-, -МН-0-(СН2)Р-, -И (алкил)-О-(СН2)р- или -0-И(алкил)-(СН2)р-, где р равно 1, 2, 3, 4 или 5 и каждая алкильная группа может быть далее замещена. В определенных вариантах осуществления изобретения р равно 1, 2 или 3.
В одном варианте осуществления изобретения каждый из указанных мостиков независимо является -[С(К1)(К2)]п-, [С(К1)(К2)]п-0-, -С(К1К2)-К(К1)-0- или -С(К1К2)-0-Ы(К1)-. В другом варианте осуществления изобретения каждый из указанных мостиков независимо является 4'-(СН2)3-2', 4'-(СН2)2-2', 4'СН2-0-2', 4'-(СН2)2-О-2', 4'-СН2-0-Ы(К1)2' и 4'-СН2-Ы(К1)-0-2'-, где каждый К1 независимо означает Н, защитную группу или С1-С12 алкил.
В нуклеотидах, содержащих модифицированные сахарные части, части гетероциклических оснований (природные, модифицированные или их комбинация) сохранены для гибридизации с соответствующей нуклеиновой кислотой-мишенью.
В одном варианте осуществления изобретения антисмысловые соединения, направленно воздействующие на нуклеиновую кислоту, включают один или несколько нуклеотидов, имеющих модифицированные сахарные части. В предпочтительном варианте осуществления изобретения модифицированная сахарная часть является 2'-МОЕ. В других вариантах осуществления изобретения модифицированные нуклеотиды, содержащие 2'-МОЕ, представляют собой повторяющийся фрагмент соединения с разрывом.
Олигонуклеотиды, являющиеся предпочтительными в настоящее время, включают одну из нижеследующих групп в 2'-положении: ОН; Р, 0-, δ- или ^алкил; 0-, δ- или ^алкенил; 0-, δ- или ^алкинил либо О-алкил-0-алкил, где алкил, алкенил и алкинил могут представлять собой замещенный или незамещенный С1-С10 алкил или С2-С10 алкенил и алкинил. Особенно предпочтительными являются группы 0[(СН2)п-0]т-СН3, О(СН2)П-0СН3, 0(СН2)п-ПН2, 0(СН2)п-СН3, 0(СН2)п-0Ж2 и О(СН2)П-0ЖСН2)ПСН3)]2, где п и т имеют значения от 1 около 10. Другие предпочтительные олигонуклеотиды включают одну из нижеследующих групп в 2'-положении: С1-С10 низший алкил, замещенный низший алкил, алкенил, алкинил, алкарил, аралкил, 0-алкарил или О-аралкил, δΚ δί.Ή3. 0СК С1, Вг, СК, СР3, 0СР3, δ0ί.Ή3. δ02^3, 0N02, N0;, N3, КН2, гетероциклоалкил, гетероциклоалкарил, аминоалкиламино, полиалкиламино, замещенный силил, РНК-расщепляющую группу, репортерную группу, интеркалятор, группу, улучшающую фармакокинетические свойства олигонуклеотида, или группу, улучшающую фармакодинамические свойства олигонуклеотида, и другие заместители, обладающие подобными свойствами.
Предпочтительная модификация ключает 2'-метоксиэтокси (2'-О-СН2СН2ОСН3, известный также как 2'-О-(2-метоксиэтил) или 2'-МОЕ) (МагЪп с1 а1., Не1у. ССт. Ас1а, 1995, 78, 486-504), то есть алкоксиалкоксильную группу. Другая предпочтительная модификация включает 2'-диметиламинооксиэтокси, то есть группу 0(СН2)2-0N(СН3)2, известную также как 2'-ΌΜΆ0Ε, и 2'-диметиламиноэтоксиэтокси (известную в данной области также как 2'-О-диметиламиноэтоксиэтил или 2'-ΌΜΛΕ0Ε), то есть 2'-О-СН2О-СН2-Ы(СН2)2. Другая предпочтительная модификация включает бициклическую нуклеиновую кислоту (именуемую также замкнутой нуклеиновой кислотой (^NА)), в которой 2'-гидроксильная группа связана с 3'- или 4'-атомом углерода сахарного кольца с образованием бициклической сахарной части. Указанная связь предпочтительно представляет собой метиленовую (-СН2-)п группу, соединяющую мостиковой связью 2'-атом кислорода и 4'-атом углерода, где п равно 1 или 2, в том числе а-Ь-метиленокси (4'-СН2-О-2') ВNΑ, β-Ό-метиленокси (4'-СН2-О-2') ВNΑ и этиленокси (4'-(СН2)2-0-2') ВNΑ. Бициклические модифицированные сахара также включают (6'-δ)-6'-метил-ВNΑ, аминокси (4'-СН2-0-Ы(К)-2') ВNΑ, оксиамино (4'СН2-Ы(К)-0-2') ВNΑ, где К независмо означает Н, защитную группу или С1-С12 алкил. БНА также образуют дуплексы с комплементарной ДНК, РНК или БНА с высоким тепловым сродством. Спектр кругового дихроизма (СО) показывает, что дуплексы, включающие полностью модифицированную БКА (в частности, ^NА:ΡНΚ), в структурном отношении напоминают дуплекс А-формы РНК:РНК. Исследование дуплекса ЕКА:ДНК при помощи спектроскопии ядерного магнитного резонанса (ΜΗΚ) подтвердило наличие 3'-эндоконформации мономера БКА. Было также продемонстрировано узнавание двухцепочечной ДНК, что свидетельствует об инвазии БКА в цепь. Исследования ошибочно спаренных последовательностей показывает, что БКА подчиняются правилам спаривания оснований Ватсона-Крика обычно с более высокой избирательностью по сравнению с соответствующими немодифицированными эталонными цепями.
БКА, в которых 2'-гидроксильная группа связана с 4'-атомом углерода сахарного кольца с образованием 2'-С,4'-С-оксиметиленовой связи, содержат бициклическую сахарную часть. Связующей группой может быть метиленовая (-СН2-)п группа, соединяющая мостиковой связью 2'-атом кислорода и 4'-атом углерода, где п равно 1 или 2 (δίπ^ΐι е1 а1., СЬет. Соттип., 1998, 4, 455-456). ^NА и аналоги БКА харак- 16 022207 теризуются очень высокой теплостойкостью дуплекса с комплементиарной ДНК и РНК (Тт=от +3°С до +10°С), устойчивостью к расщеплению 3'-экзонуклеазами и хорошей растворимостью. Другие предпочтительные мостиковые группы включают 2'-дезокси-2'-СН2ОСН2-4'. ΕΝΑ и содержащие их препараты описаны в опубликованных международных заявках на патент №№ АО 98/39352 и АО 99/14226.
Другие предпочтительные модификации включают 2'-метокси (2'-О-СН3), 2'-аминопропокси (2'ОСН-СН-СНЛЩ. 2'-аллил (2'-СН2-СН=СН2), 2'-О-аллил (2'-О-СН2-СН=СН2) и 2'-фтор (2'-Р). 2'Модификация может быть произведена в арабино (верхнем) положении или рибо (нижнем) положении. Предпочтительной 2'-арабиномодификацией является 2'-Р. Подобные модификации могут быть также произведены в других положениях олигонуклеотида, в частности, в 3'-положении сахара в 3'-концевом нуклеотиде или в 2'-5' связанных олигонуклеотидах и в 5'-положении 5'-концевого нуклеотида. Олигонуклеотиды могут также содержать миметики или заменители сахара (иногда определяемые как аналоги ДНК), такие как циклобутильные части, вместо пентофуранозилсахара. Репрезентативные патенты США, в которых описано получение таких модифицированных Сахаров, включают, не ограничиваясь ими, патенты США №№ 4981957, 5118800, 5319080, 5359044, 5393878, 5446137, 5466786, 5514785, 5519134, 5567811, 5576427, 5591722, 5597909, 5610300, 5627053, 5639873, 5646265, 5658873, 5670633, 5792747 и 5700920, некоторые из которых принадлежат владельцам настоящей заявки и все полностью включены в настоящее описание изобретения в качестве ссылки. В определенных вариантах осуществления изобретения нуклеозиды модифицируют путем замены рибозильного кольца заменяющей кольцевой системой, такой как морфолиновое кольцо, циклогексенильное кольцо, циклогексильное кольцо или тетрагидропиранильное кольцо, имеющей одну из формул:
В данной области известны многие другие заменяющие кольцевые системы бициклического и трициклического сахара, которые могут быть использованы для модификации нуклеозидов, предназначенных для введения в антисмысловые соединения (см., например, обзорную статью: Ьеитапи, Сйпкйап 1.). Такие кольцевые системы могут быть подвергнуты разным дополнительным замещениям для усиления активности.
В одном варианте осуществления изобретения соединение включает по меньшей мере один нуклеозид, модифицированный тетрагидропираном, в котором фуранозовое кольцо заменено тетрагидропирановым кольцом.
В другом варианте осуществления изобретения по меньшей мере один нуклеозид, модифицированный тетрагидропираном, имеет структуру уО' где Вх означает необязательно защищенное гетероциклическое основание.
Модифицированные гетероциклические основания
Олигонуклеотиды могут также включать модификации или замещения гетероциклических оснований (часто именуемых в данной области просто основанием). Гетероциклические основания, включающие модификации или замещения, в структурном отношении отличаются от природных и синтетических немодифицированных гетероциклических оснований, хотя являются функционально взаимозаменяемыми. Как природные, так и модифицированные гетероциклические основания могут участвовать в образовании водородной связи. Такие модификации гетероциклических оснований могут сообщать антисмысловым соединениями устойчивость к нуклеазам, сродство связывания или некоторые другие полезные биологические свойства. Модифицированные гетероциклические основания включают синтетические и природные гетероциклические основания, такие как, например, 5-метилцитозин (5-Ме-С). Определенные замещения гетероциклических оснований, включающие замещения 5-метилцитозина, особенно полезны для увеличения сродства связывания антисмыслового соединения с нуклеиновой кислотоймишенью. Например, установлено, что замещения 5-метилцитозина повышают устойчивость дуплекса нуклеиновой кислоты на 0,6-1,2°С (8апдйу1, Υ.8., Сгооке, 8.Т. апб ЬеЬ1еи, В., еб§., Апйкепке Кекеагсй апб Аррйсайопк, СКС Рге88, Воса Ка!оп, 1993, рр. 276-278).
Дополнительные немодифицированные гетероциклические основания включают 5гидроксиметилцитозин, ксантин, гипоксантин, 2-аминоаденин, 6-метильные и другие алкильные производные аденина и гуанина, 2-пропильные и другие алкильные производные аденина и гуанина, 2тиоурацил, 2-тиотимин и 2-тиоцитозин, 5-галогенурацил и цитозин, 5-пропинил (-С^С-СН3) урацил, цитозин и другие алкинильные производные пиримидиновых оснований, 6-азоурацил, цитозин и тимин, 5урацил (псевдоурацил), 4-тиолурацил, 8-галоген, 8-амино, 8-тиол, 8-тиоалкил, 8-гидроксил и другие 8замещенные аденины и гуанины, 5-галоген, в частности, 5-бром, 5-трифторметил и другие 5-замещенные урацилы и цитозины, 7-метилгуанин и 7-метиладенин, 2-Р-аденин, 2-аминоаденин, 8-азагуанин и 8- 17 022207 азааденин, 7-деазагуанин и 7-деазааденин, 3-деазагуанин и 3-деазааденин.
Гетероциклические основания могут также включать такие основания, в которых пуриновое или пиримидиновое основание заменено другими гетероциклами, например, 7-деазааденин, 7-деазагуанозин, 2-аминопиридин и 2-пиридон. Гетероциклические основания, особенно пригодные для увеличения сродства связывания антисмысловых соединений, включают 5-замещенные пиримидины, 6-азапиримидины и Ν-2, Ν-6 и О-6 замещенные пурины, включающие 2-аминопропиладенин, 5-пропинилурацил и 5пропинилцитозин.
В одном варианте осуществления изобретения антисмысловые соединения, направленно воздействующие на нуклеиновую кислоту СТСР, включают одно или несколько модифицированных гетероциклических оснований. В дополнительном варианте осуществления изобретения антисмысловые олигонуклеотиды с расширенным разрывом, направленно воздействующие на нуклеиновую кислоту СТСР, включают одно или несколько модифицированных гетероциклических оснований. В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированное гетероциклическое основание является 5метилцитозином. В других вариантах осуществления изобретения все цитозины являются 5метилцитозинами.
В использованном здесь значении немодифицированные или природные гетероциклические основания включают пуриновые основания аденин (А) и гуанин (С) и пиримидиновые основания тимин (Т), цитозин (С) и урацил (И). Модифицированные гетероциклические основания включают другие синтетические и природные гетероциклические основания, такие как 5-метилцитозин (5-Ме-С), 5гидроксиметилцитозин, ксантин, гипоксантин, 2-аминоаденин, 6-метильные и другие алкильные производные аденина и гуанина, 2-пропильные и другие алкильные производные аденина и гуанина, 2тиоурацил, 2-тиотимин и 2-тиоцитозин, 5-галогенурацил и цитозин, 5-пропинил (-С^С-СН3) урацил, цитозин и другие алкинильные производные пиримидиновых оснований, 6-азоурацил, цитозин и тимин, 5урацил (псевдоурацил), 4-тиоурацил, 8-галоген, 8-амино, 8-тиол, 8-тиоалкил, 8-гидроксил и другие 8замещенные аденины и гуанины, 5-галоген, в частности, 5-бром, 5-трифторметил и другие 5-замещенные урацилы и цитозины, 7-метилгуанин и 7-метиладенин, 2-Р-аденин, 2-аминоаденин, 8-азагуанин и 8азааденин, 7-деазагуанин и 7-деазааденин, 3-деазагуанин и 3-деазааденин. Предпочтительные модифицированные гетероциклические основания включают трициклические пиримидины, такие как феноксазинцитидин (1Н-пиримидо[5,4-Ь] [1,4]бензоксазин-2(3Н)-он), фенотиазинцитидин (1Н-пиримидо[5,4Ь][1,4]бензотиазин-2(3Н)-он), С-кластеры, такие как замещенный феноксазинцитидин (например, 9-(2аминоэтокси)-Н-пиримидо[5,4-Ь][1,4]бензоксазин-2(3Н)-он), карбазолцитидин (2Н-пиримидо[4,5Ь]индол-2-он), пиридоиндолцитидин (Н-пиридо[3',2':4,5]пирроло[2,3-б]пиримидин-2-он). Модифицированные гетероциклические основания могут также включать основания, в которых пуриновое или пиримидиновое основание заменено другими гетероциклами, например 7-деазааденин, 7-деазагуанозин, 2аминопиридин и 2-пиридон. Другие гетероциклические основания включают основания, описанные в патенте США № 3687808, основания, описанные в публикации Тйе Сопс1ке Епсус1ореб1а О£ Ро1утег δαепсе Апб Епдшеетшд, радек 858-859, КгоксйхуПх, II., еб. 1ойп \УПеу & δοη8, 1990, основания, описанные в публикации Епдйксй е! а1., Апдеадапб1е Сйет1е, 1п!егпа1юпа1 Ебйюп, 1991, 30, 613, и основания, описанные в публикации δη^ΐη! Υ.δ., Сйар!ег 15, Апйкепке Кекеагсй апб Аррйсайопк, радек 289-302, Сгооке, δ.Έ апб ЬеЫеи, Β. еб., СКС Ргекк, 1993. Некоторые из указанных гетероциклических оснований являются особенно полезными для увеличения сродства связывания олигомерных соединений по настоящему изобретению. Указанные гетероциклические основания включают 5-замещенные пиримидины, 6азапиримидины и Ν-2, Ν-6 и 0-6 замещенные пурины, включающие 2-аминопропиладенин, 5пропинилурацил и 5-пропинилцитозин. Установлено, что замещения 5-метилцитозина повышают устойчивость дуплекса нуклеиновой кислоты на 0,6-1,2°С (ЪапдЫз Υ.δ., Сгооке, δ.Έ апб ЬеЫеи, В., ебк., Апйкепке Кекеагсй апб Аррйсайопк, СКС Ргекк, Воса Ка!оп, 1993, рр. 276-278) и в настоящее время являются предпочтительными замещениями оснований, особенно в случае объединения с модификациями 2'-Ометоксиэтилсахара.
Репрезентативные патенты США, в которых описано получение определенных вышеуказанных модифицированных гетероциклических оснований, а также других модифицированных гетероциклических оснований, включают, не ограничиваясь ими, приведенный выше патент США № 3687808, патенты США №№ 4845205, 5130302, 5134066, 5175273, 5367066, 5432272, 5457187, 5459255, 5484908, 5502177, 5525711, 5552540, 5587469, 5594121, 5596091, 5614617, 5645985, 5830653, 5763588, 6005096 и 5681941, некоторые из которых принадлежат владельцам настоящей заявки и все включены в настоящее описание изобретения в качестве ссылки, и патент США № 5750692, который принадлежит владельцам настоящей заявки и также включен в настоящее описание изобретения в качестве ссылки.
Повторяющиеся фрагменты антисмысловых соединений
В определенном варианте осуществления изобретения соединение включает модифицированный олигонуклеотид, состоящий из (а) сегмента разрыва, включающего связанные дезоксинуклеозиды, предпочтительно тринадцать связанных модифицированных дезоксинуклеозидов; (Ь) 5'-концевой боковой сегмент, включающий связанные модифицированные нуклеозиды, предпочтительно два связанных модифицированных нуклеозида; и (с) 3'-концевой боковой сегмент, включающий связанные модифициро- 18 022207 ванные нуклеозиды, предпочтительно пять связанных нуклеозидов, в котором сегмент разрыва расположен между 5'-концевым боковым сегментом и 3'-концевым боковым сегментом, все модифицированные нуклеозиды в каждом боковом сегменте включают модифицированный сахар, предпочтительно 2'-Ометоксиэтилсахар, и все межнуклеозидные связи являются фосфотиоатными связями. Указанные паттерны модифицированных нуклеотидов в антисмысловом соединении именуются повторяющимся фрагментом. Такие повторяющиеся фрагменты сообщают антисмысловым соединениям свойства, повышающие ингибирующую активность, сродство связывания с нуклеиновой кислотой-мишенью или устойчивость к расщеплению нуклеазами ίη νίνο.
В определенных вариантах осуществления изобретения антисмысловые соединения, направленно воздействующие на нуклеиновую кислоту СТОР, имеют химически модифицированные субъединицы в паттернах или повторяющихся фрагментах, которые сообщают антисмысловым соединениям такие свойства как более высокая ингибирующая активность, более высокое сродство связывания с нуклеиновой кислотой-мишенью или устойчивость к расщеплению нуклеазами ίη νίνο.
Химерные антисмысловые соединения обычно содержат по меньшей мере одну модифицированную область, которая сообщает более высокую устойчивость к расщеплению нуклеазами, более высокое поглощение клеткой, более высокое сродство связывания с нуклеиновой кислотой-мишенью и/или более высокую ингибирующую активность. Вторая область химерного антисмыслового соединения может необязательно служить в качестве субстрата для клеточной эндонуклеазы РНКазы Н, которая расщепляет РНК-цепь дуплекса РНК:ДНК.
Антисмысловые соединения, содержащие повторяющийся фрагмент соединения с разрывом, считаются химерными антисмысловыми соединениями. В соединении с разрывом внутренняя область, включающая множество нуклеотидов, способствующих расщеплению РНКазой Н, расположена между внешними областями, включающими множество нуклеотидов, которые по химическому составу отличаются от нуклеозидов внутренней области. В случае антисмыслового олигонуклеотида, содержащего повторяющийся фрагмент соединения с разрывом, сегмент разрыва обычно служит в качестве субстрата для расщепления эндонуклеазой, в то время как боковые сегменты включают модифицированные нуклеозиды. В предпочтительном варианте осуществления изобретения области соединения с разрывом дифференцированы по типам сахарных частей, присутствующих в каждой отдельной области. Типы сахарных частей, используемых для дифференцирования областей соединения с разрывом, в некоторых вариантах осуществления могут включать β-Ό-рибонуклеозиды, β-Ό-дезоксирибонуклеозиды, 2'модифицированные нуклеозиды (такие 2'-модифицированные нуклеозиды могут включать наряду с прочими 2'-МОЕ и 2'-О-СН3) и нуклеозиды, модифицированные бициклическим сахаром (такие нуклеозиды, модифицированные бициклическим сахаром, могут включать нуклеозиды, содержащие мостик 4'-(СН2)п0-2', где п=1 или п=2). Каждая отдельная область предпочтительно включает однородные сахарные части. Повторяющийся фрагмент, включающий боковой сегмент - разрыв - боковой сегмент, часто определяется как Х-Υ-Ζ, где X означает длину 5'-концевой боковой области, Υ означает длину области разрыва и Ζ означает длину 3'-концевой боковой области. Любые антисмысловые соединения по настоящему изобретению могут содержать повторяющийся фрагмент соединения с разрывом. В некоторых вариантах осуществления изобретения X и Ζ являются одинаковыми, в других вариантах осуществления изобретения указанные элементы являются различными. В предпочтительном варианте осуществления изобретения Υ включает от 8 до 15 нуклеотидов. X, Υ или Ζ могут включать 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30 или более нуклеотидов. Таким образом, соединения с разрывом по настоящему изобретению включают, не ограничиваясь ими, например, 2-13-5, 5-10-5, 4-8-4, 4-12-3, 4-124, 3-14-3, 2-16-2, 1-18-1, 3-10-3, 2-10-2, 1-10-1 или 2-8-2.
В некоторых вариантах осуществления изобретения антисмысловое соединение определяется как повторяющийся фрагмент соединения с боковым сегментом, имеющий конфигурацию боковой сегмент - разрыв или разрыв - боковой сегмент, то есть конфигурацию Х-Υ или Υ -Ζ, рассмотренную выше для соединения с разрывом. Таким образом, конфигурации соединения с боковым сегментом по настоящему изобретению включают, не ограничиваясь ими, например, 5-10, 8-4, 4-12, 12-4, 3-14, 16-2, 18-1, 10-3, 2-10, 1-10 или 8-2.
В одном варианте осуществления изобретения антисмысловые соединения, направленно воздействующие на нуклеиновую кислоту, содержат повторяющийся фрагмент соединения с разрывом 5-10-5.
В некоторых вариантах осуществления изобретения антисмысловое соединение, направленно воздействующее на нуклеиновую кислоту, содержит повторяющийся фрагмент с расширенным разрывом. В других вариантах осуществления изобретения антисмысловой олигонуклеотид, направленно воздействующий на нуклеиновую кислоту, содержит повторяющийся фрагмент с расширенным разрывом.
В одном варианте осуществления изобретения антисмысловой олигонуклеотид с расширенным разрывом, направленно воздействующий на нуклеиновую кислоту, содержит сегмент разрыва из четырнадцати 2'-дезоксирибонуклеотидов, расположенных между боковыми сегментами трех химически модифицированных нуклеозидов. В одном варианте осуществления изобретения химическая модификация включает модификацию 2'-сахара. В другом варианте осуществления изобретения химическая модификация включает модификацию 2'-МОЕ сахара.
Антисмысловые соединения, включающие повторяющийся фрагмент разрыва, считаются химер- 19 022207 ными антисмысловыми соединениями или химерами, которые содержат две или более области, отличающиеся по химическому составу, каждая из которых состоит по меньшей мере из одного мономера, то есть нуклеотида в случае олигонуклеотидного соединения. Указанные олигонуклеотиды обычно содержат по меньшей мере одну модифицированную область, которая сообщает более высокую устойчивость к расщеплению нуклеазами, более высокое поглощение клеткой, более высокое сродство связывания с нуклеиновой кислотой-мишенью и/или более высокую ингибирующую активность. Все положения в данном соединении не обязательно должны быть одинаково модифицированы, при этом одно соединение или даже один нуклеозид олигонуклеозида может включать несколько вышеуказанных модификаций.
Дополнительная область олигонуклеотида может служить в качестве субстрата для ферментов, способных расщеплять гибриды РНК:ДНК или РНК:РНК. В качестве примера можно привести РНКазу Н, являющуюся клеточной эндонуклеазой, которая расщепляет РНК-цепь дуплекса РНК:ДНК. Поэтому активация РНКазы Н вызывает расщепление РНК-мишени, в результате чего значительно повышается эффективность ингибирования олигонуклеотидом экспрессии гена. Сравнимые результаты часто могут быть получены для более коротких олигонуклеотидов при использовании химерных олигонуклеотидов по сравнению с гибридизацией дезоксиолигонуклеотидов с фосфортиоатными связями с такой же областью-мишенью. Расщепление РНК-мишени можно обнаружить при помощи гель-электрофореза и при необходимости другими методами гибридизации нуклеиновой кислоты, известными в данной области.
Химерные антисмысловые соединения по настоящему изобретению могут быть получены в виде сложных структур, состоящих из двух или более олигонуклеотидов, модифицированных олигонуклеотидов, олигонуклеозидов и/или миметиков олигонуклеотидов, описанных выше. Такие соединения также определяются в данной области как гибриды или соединения с разрывом. Репрезентативные патенты США, в которых описано получение таких гибридных структур, включают, не ограничиваясь ими, патенты США №№ 5013830, 5149797, 5220007, 5256775, 5366878, 5403711, 5491133, 5565350, 5623065, 5652355, 5652356 и 57 00 922, некоторые из которых принадлежат владельцам настоящей заявки и все полностью включены в настоящее описание изобретения в качестве ссылки.
В случае антисмыслового олигонуклеотида, содержащего повторяющийся фрагмент соединения с разрывом, сегмент разрыва обычно служит в качестве субстрата для расщепления эндонуклеазой, в то время как боковые сегменты включают модифицированные нуклеозиды. В предпочтительном варианте осуществления изобретения области соединения с разрывом дифференцированы по типам сахарных частей, присутствующих в каждой отдельной области. Типы сахарных частей, используемых для дифференцирования областей соединения с разрывом, могут включать β-Ό-рибонуклеозиды, β-Όдезоксирибонуклеозиды, 2'-модифицированные нуклеозиды (такие 2'-модифицированные нуклеозиды могут включать 2'-МОЕ) и нуклеозиды, модифицированные бициклическим сахаром.
Другая модификация олигонуклеотидов по настоящему изобретению включает химическое связывание с олигонуклеотидом одной или нескольких частей или конъюгатов, которые повышают активность, распределение в клетках или поглощение олигонуклеотида клеткой. Соединения по настоящему изобретению могут включать конъюгатные группы, ковалентно связанные с функциональными группами, такими как первичные или вторичные гидроксильные группы. Конъюгатные группы по настоящему изобретению включают интеркаляторы, репортерные молекулы, полиамины, полиамиды, полиэтиленгликоли, простые полиэфиры, группы, усиливающие фармакодинамические свойства олигомеров, и группы, усиливающие фармакокинетические свойства олигомеров. Типичные конъюгатные группы включают холестерины, липиды, фосфолипиды, биотин, феназин, фолат, фенантридин, антрахинон, акридин, флуоресцеины, родамины, кумарины и красители. Группы, усиливающие фармакодинамические свойства, в контексте настоящего изобретения включают группы, которые улучшают поглощение олигомера, повышают устойчивость олигомера к расщеплению и/или усиливают специфичную к последовательности гибридизацию с РНК. Группы, усиливающие фармакокинетические свойства, в контексте настоящего изобретения включают группы, которые улучшают поглощение, распределение, метаболиз или экскрецию олигомера. Типичные конъюгатные группы описаны в международной заявке на патент РСТ/и892/09196, поданной 23 октября 1992 г., которая полностью включена в настоящее описание изобретения в качестве ссылки. Конъюгатные части включают, не ограничиваясь ими, липидные части, такие как холестерин (Ье!зтдег е! а1., Ргос. №И. Асаб. 8ск И8А, 1989, 86, 6553-6556), холевая кислота (МапоЬагап е! а1., Вюогд. Меб. СЬет. Ье!., 1994, 4, 1053-1060), простой тиоэфир, например гексил-δтритилтиол (МапоЬагап е! а1., Апп. Ν.Υ. Асаб. δοΐ., 1992, 660, 306-309; МапоЬагап е! а1., Вюогд. Меб. СЬет. Ье!., 1993, 3, 2765-2770), тиохолестерин (ОЬегЬаизег е! а1., Νϋθ1. Ас1бз Кез., 1992, 20, 533-538), алифатическую цепь, например, додекандиол или остатки ундецила (Ъа1зоп-ВеЬтоагаз е! а1., ЕМВО ί., 1991, 10, 1111-1118; КаЬапоу е! а1., РЕΒδ Ье!!., 1990, 259, 327-330; ЗушагсЬик е! а1., ВюсЫтк, 1993, 75, 49-54), фосфолипид, например, дигексадецил-рац-глицерин или 1,2-ди-О-гексадецил-рац-глицеро-3-Нфосфонат триэтиламмония (МапоЬагап е! а1., Те!гаЬебгоп Ье!!., 1995, 36, 3651-3654; δЬеа е! а1., №с1. Ас1бз Кез., 1990, 18, 3777-3783), полиамин или полиэтиленгликолевую цепь (МапоЬагап е! а1., №с1еоз1без & №с1еойбез, 1995, 14, 969-973), адамантануксусную кислоту (МапоЬагап е! а1., Те!гаЬебгоп Ье!!., 1995, 36, 3651-3654), пальмитильную часть (МгзЬга е! а1., ВюсЬгт. ВюрЬуз. Ас!а, 1995, 1264, 229-237), октадеци- 20 022207 ламин или гексиламинокарбонилоксихолестерин (Сгооке с1 а1., 1. Ркагтасок Ехр. Ткег., 1996, 277, 923937). Олигонуклеотиды по настоящему изобретению могут быть также конъюгированы с активными лекарственными веществами, такими как, например, аспирин, варфарин, фенилбутазон, ибупрофен, супрофен, фенбуфен, кетопрофен, (8)-(+)-пранопрофен, карпрофен, данзилсаркозин, 2,3,5-трииодбензойная кислота, флуфенамовая кислота, фолиновая кислота, бензотиадиазид, хлортиазид, диазепин, индометицин, барбитурат, цефалоспорин, сульфасодержащее лекарственное средство, антидиабетическое средство, антибактериальное средство или антибиотик. Конъюгаты олигонуклеотида с лекарственным средством и способы их получения описаны в заявке на патент США № 09/334130 (поданной 15 июня 1999 г.), которая полностью включена в настоящее описание изобретения в качестве ссылки.
Репрезентативные патенты США, в которых описано получение таких конъюгатов олигонуклеотидов включают, не ограничиваясь ими, патенты США №№ 4828979, 4948882, 5218105, 5525465, 5541313, 5545730, 5552538, 5578717, 5580731, 5580731, 5591584, 5109124, 5118802, 5138045, 5414077, 5486603,
5512439, 5578718, 5608046, 4587044, 4605735, 4667025, 4762779, 4789737, 4824941, 4835263, 4876335,
4904582, 4958013, 5082830, 5112963, 5214136, 5082830, 5112963, 5214136, 5245022, 5254469, 5258506,
5262536, 5272250, 5292873, 5317098, 5371241, 5391723, 5416203, 5451463, 5510475, 5512667, 5514785,
5565552, 5567810, 5574142, 5585481, 5587371, 5595726, 5597696, 5599923, 5599928 и 5688941, некоторые из которых принадлежат владельцам настоящей заявки и все включены в настоящее описание изобретения в качестве ссылки.
В другом варианте осуществления изобретения соединение включает модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 20 связанных нуклеозидов.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения соединение включает последовательность гетероциклических оснований, которая является последовательностью, представленной в 8ЕЦ ГО N0:39, 40, 45, 52 и 166.
В одном варианте осуществления изобретения композиция включает модифицированный олигонуклеотид, включающий связанные нуклеозиды, в котором последовательность гетероциклических оснований является последовательностью, представленной в одной из 8ЕЦ ГО N0:28, 30, 39, 40, 43, 44, 45, 50, 51, 52, 56, 78, 125 и 166, или его соль и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель. Примеры фармацевтически приемлемых солей хорошо известны специалистам в данной области.
В одном варианте осуществления изобретения антисмысловое соединение является комплементарным всем нуклеотидам последовательности СТОР. В определенных вариантах осуществления изобретения актисмысловое соединение является комплементарным нуклеотидам в интервале 718-751, 1388-1423, 1457-1689, 2040-2069, 2120-2147 или 2267-2301 8ЕЦ ГО N0:9. В определенном варианте осуществления изобретения антисмысловое соединение является комплементарным нуклеотидам в интервале 2728-2797 8Е0 ГО N0:10. Соединения, направленно воздействующие на нуклеотиды в указанных интервалах, характеризуются по меньшей мере 50% ингибированием (то есть 8ЕЦ ГО N0:15, 29, 31, 42, 46-49, 53, 72, 81, 82, 152-154, 164 и 165). Определенные сайты-мишени, приведенные в таблице 1, также характеризуются по меньшей мере 50% ингибированием (то есть 8ЕЦ ГО N0:12, 20, 33, 34, 76, 107, 129, 132, 134, 136 и 146). В определенных вариантах осуществления изобретения антисмысловое соединение является комплементарным нуклеотидам в интервале 553-611, 1394-1423, 1469-1508, 1559-1605, 1659-1689 или 21002129 8Е0 ГО N0:9 и 2623-2647 8ЕЦ ГО N0:10. Соединения, направленно воздействующие на нуклеотиды в указанных интервалах, характеризуются по меньшей мере 60% ингибированием (то есть 8ЕЦ ГО N0: 27, 28, 38, 40, 43, 44, 45, 50, 51, 52, 54, 55, 56, 77, 78, 79, 138 и 139). Определенные дополнительные сайты-мишени, приведенные в таблице 1, также характеризуются по меньшей мере 60% ингибированием (то есть 8ЕЦ ГО N0: 24, 30, 61, 63, 67, 69, 73, 86, 125, 128 и 161). В определенных вариантах осуществления изобретения антисмысловое соединение является комплементарным нуклеотидам в интервале 13991423. Соединения, направленно воздействующие на нуклеотиды в указанном интервале, характеризуются по меньшей мере 70% ингибированием (то есть 8ЕЦ ГО N0: 39 и 40). Определенные сайты-мишени, приведенные в таблице 1, также характеризуются по меньшей мере 70% ингибированием (то есть 8ЕЦ ГО N0: 28, 30, 44, 45, 51, 56, 78, 128 и 138). Один сайт-мишень, указанный в табл. 1, также характеризуется по меньшей мере 80% ингибированием (то есть 8ЕЦ ГО N0:44). В определенных вариантах осществления изобретения процентное значение ингибирования достигается при введении антисмыслового соединения в клетки НиУес в конентрации 50 нм. Более подробное описание приведено в нижеследующем примере 8.
Один вариант осуществления изобретения относится к композиции, в которой модифицированный олигонуклеотид является одноцепочечным или двухцепочечным олигонуклеотидом. Другой вариант осуществления изобретения относится к модифицированному олигонуклеотиду, состоящему из 20 связанных нуклеозидов.
Другой вариант осуществления изобретения относится к способу ингибирования экспрессии фактора роста соединительной ткани в клетке или ткани, который включает контактирование указанной клетки или ткани с представляющим интерес соединением в условиях, обеспечивающих ингибирование экспрессии фактора роста соединительной ткани.
- 21 022207
Композиции и способы получения фармацевтических композиций
Антисмысловые олигонуклеотиды могут быть смешаны с фармацевтически приемлемыми активными и/или инертными веществами с целью получения фармацевтических композиций или препаратов. Композиции и способы получения фармацевтических композиций зависят от ряда факторов, которые включают, не ограничиваясь ими, способ введения, тяжесть заболевания или вводимую дозу.
Антисмысловое соединение, направленно воздействующее на нуклеиновую кислоту, может быть использовано в фармацевтических композициях вместе с фармацевтически приемлемым разбавителем или носителем. Фармацевтически приемлемый разбавитель включает физиологический раствор с фосфатным буфером (ΡΒδ). ΡΒδ является разбавителем, пригодным для использования в композициях, предназначенных для парентерального введения. Таким образом, один вариант осуществления изобретения, применяемый в способах по настоящему изобретению, относится к фармацевтической композиции, включающей антисмысловое соединение, направленно воздействующее на нуклеиновую кислоту, и фармацевтически приемлемый разбавитель. В одном варианте осуществления изобретения фармацевтически приемлемым разбавителем является ΡΒδ. В другом варианте осуществления изобретения фармацевтически приемлемым разбавителем является физиологический раствор фармацевтического сорта или ΡΒδ фармацевтического сорта. В других вариантах осуществления изобретения антисмысловое соединение является антисмысловым олигонуклеотидом.
Фармацевтические композиции, включающие антисмысловые соединения, содержат любые фармацевтически приемлемые соли, сложные эфиры или соли таких сложных эфиров или любой другой олигонуклеотид, которые при введении животному, включая человека, могут образовывать (прямо или непрямо) биологически активный метаболит или его остаток. Таким образом, настоящее изобретение относится также к фармацевтически приемлемым солям антисмысловых соединений, пролекарствам, фармацевтически приемлемым солям таких пролекарств и другим биологическим эквивалентам. Фармацевтически приемлемые соли включают, не ограничиваясь ими, соли натрия и калия.
Пролекарство может включать дополнительные нуклеозиды у одного или обоих концов антисмыслового соединения, которые расщепляются эндогенными нуклеазами в организме с образованием активного антисмыслового соединения. В частности, варианты пролекарств олигонуклеотидов по настоящему изобретению получают в виде производных δΑТΕ [^-ацетил-2-тиоэтил)фосфат] способами, описанными в публикации \УО 93/24510, Оо55е1ш е! а1., опубликованной 9 декабря 1993 г., или в публикации \УО 94/26764 и патенте США № 577 0713, принадлежащем 1тЬасН е! а1.
Термин фармацевтически приемлемые соли означает физиологически и фармацевтически приемлемые соли соединений по настоящему изобретению, то есть соли, которые сохраняют требуемую биологическую активность исходного соединения и не оказывают нежелательного токсикологического действия. Фармацевтически приемлемые основно-аддитивные соли образуются с металлами или аминами, такими как щелочные и щелочноземельные металлы или органические амины. Примеры металлов, используемых в виде катионов, включают натрий, калий, магний, кальций и тому подобные. Примеры приемлемых аминов включают Ν,Ν'-дибензилэтилендиамин, хлорпрокаин, холин, диэтаноламин, дициклогексиламин, этилендиамин, Ν-метилглюкамин и прокаин (см., например, публикацию Вегде е! а1., РЬагтасеиЬса1 δа1!5, 1. о£ РЬагта δΰ., 1977, 66, 1-19). Основно-аддитивные соли указанных кислотных соединений получают, осуществляя контактирование свободной кислоты с достаточным количеством требуемого основания, в результате чего стандартным методом получают соль. Свободная кислота может быть восстановлена в результате контактирования соли с кислотой и выделения свободной кислоты стандартным методом. Свободные кислоты отличаются от соответствующих солей определенными физическими свойствами, такими как растворимость в полярных растворителях, но в других отношениях соли эвивалентны соответствующим свободным кислотам в соответствии с целями настоящего изобретения. В использованном здесь значении термин фармацевтическая аддитивная соль означает фармацевтически приемлемую соль кислоты одного из компонентов композиций по настоящему изобретению. Указанные соли включают соли органических или неорганических кислот и аминов.
Предпочтительными кислыми солями являются гидрохлориды, ацетаты, салицилаты, нитраты и фосфаты. Специалистам в данной области хорошо известны другие фармацевтически приемлемые соли, которые включают основные соли разных неорганических и органических кислот, в частности, соли с неорганическими кислотами, такими как, например, хлористоводородная кислота, бромистоводородная кислота, серная кислота или фосфорная кислота; соли с органическими карбоновыми, сульфоновыми кислотами, сульфокислотами или фосфокислотами, Ν-замещенными сульфаминовыми кислотами, например, уксусной кислотой, пропионовой кислотой, гликолевой кислотой, янтарной кислотой, малеиновой кислотой, гидроксималеиновой кислотой, метилмалеиновой кислотой, фумаровой кислотой, яблочной кислотой, винной кислотой, молочной кислотой, щавелевой кислотой, глюконовой кислотой, глюкаровой кислотой, глюкуроновой кислотой, лимонной кислотой, бензойной кислотой, коричной кислотой, миндальной кислотой, салициловой кислотой, 4-аминосалициловой кислотой, 2-феноксибензойной кислотой, 2-ацетоксибензойной кислотой, эмбоновой кислотой, никотиновой кислотой или изоникотиновой кислотой; и соли с аминокислотами, такими как 20 альфа-аминокислоты, участвующие в синтезе белков в природе, например, глутаминовая кислота или аспарагиновая кислота, а также соли с фенилук- 22 022207 сусной кислотой, метансульфоновой кислотой, этансульфоновой кислотой, 2-гидроксиэтансульфоновой кислотой, этан-1,2-дисульфоновой кислотой, бензолсульфоновой кислотой, 4-метилбензолсульфоновой кислотой, нафталин-2-сульфоновой кислотой, нафталин-1,5-дисульфоновой кислотой, 2- или 3фосфоглицератом, глюкоза-6-фосфатом, Ν-циклогексилсульфаминовой кислотой (с образованием цикламатов) или с другими кислотными органическими соединениями, такими как аскорбиновая кислота. Фармацевтически приемлемые соли соединений могут быть также получены с фармацевтически приемлемым катионом. Специалистам в данной области хорошо известны фармацевтически приемлемые катионы, которые включают катионы щелочных металлов, щелочно-земельных металлов, аммония и четвертичного аммония. Также могут быть использованы карбонаты или гидрокарбонаты.
Предпочтительные примеры фармацевтически приемлемых солей для олигонуклеотидов включают, не ограничиваясь ими, (а) соли, образованные с такими катионами как натрий, калий, аммоний, магний, кальций, полиамины, такие как спермин, спермидин, и т.д.; (Ь) кислотно-аддитивные соли, образованные с неорганическими кислотами, такими как, например, хлористо-водородная кислота, бромистоводородная кислота, серная кислота, фосфорная кислота, азотная кислота и тому подобные; (с) соли, образованные с органическими кислотами, такими как, например, уксусная кислота, щавелевая кислота, винная кислота, янтарная кислота, малеиновая кислота, фумаровая кислота, глюконовая кислота, лимонная кислота, яблочная кислота, аскорбиновая кислота, бензойная кислота, дубильная кислота, пальмитиновая кислота, альгиновая кислота, полиглутаминовая кислота, нафталинсульфоновая кислота, метансульфоновая кислота, паратолуолсульфоновая кислота, нафталиндисульфоновая кислота, полигалактуроновая кислота и тому подобные; и (б) соли, образованные с анионами элементов, такими как хлор, бром и иод.
В определенном варианте осуществления изобретения фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель является компонентом композиции, который не обладает фармакологической активностью, но является фармацевтически необходимым или желательным в качестве растворителя, суспендирующего агента или любой другой фармацевтически инертной среды для доставки одной или нескольких нуклеиновых кислот в организм человека или животного, отличного от человека. Фармацевтические носители хорошо известны специалистам в данной области.
Носители
Определенные композиции по настоящему изобретению также включают соединения, являющиеся носителями препарата. В использованном здесь значении термин несущее соединение или носитель означает нуклеиновую кислоту или ее аналог, который является инертным (то есть не обладает биологической активностью), но узнаваемым в качестве нуклеиновой кислоты в процессах, происходящих ίη νίνο, которые уменьшают биологическую доступность нуклеиновой кислоты, обладающей биологической активностью, например, в результате расщепления биологически активной нуклеиновой кислоты или стимуляции ее удаления из кровотока. Совместное введение нуклеиновой кислоты и носителя обычно при использовании избытка указанного последним вещества, может привести к значительному уменьшению количества нуклеиновой кислоты, выделяемой в печени, почке или других внеклеточных резервуарах, главным образом благодаря конкуренции между носителем и нуклеиновой кислотой за связывание с общим рецептором. Например, выделение олигонуклеотида с частичными фосфортиоатными связями в ткани печени можно уменьшить при совместном введении с полиинозиновой кислотой, декстрансульфатом, полицитидиновой кислотой или 4-ацетамидо-4'-изотиоцианостильбен-2,2'-дисульфоновой кислотой (М1уао е1 а1., АпШепке Кек. Όβν., 1995, 5, 115-121; Такакига е1 а1., Апбкепке & Νϋοΐ. Άεί6 Эгид Όβν., 1996, 6, 177-183).
Наполнители
В отличие от несущего соединения фармацевтический носитель или наполнитель является фармацевтически приемлемым растворителем, суспендирующим агентом или другой фармацевтически инертной средой для доставки одной или нескольких нуклеиновых кислот в организм животного. Наполнитель может быть жидким или твердым, выбираемым с учетом способа введения для достижения требуемого объема, консистенции и т.д. при объединении с нуклеиновой кислотой и другими компонентами данной фармацевтической композиции. Типичные фармацевтические носители включают, не ограничиваясь ими, связывающие агенты (например, предварительно желатинированный кукурузный крахмал, поливинилпирролидон или гидроксипропилметилцеллюлозу и т.д.); наполнители (например, лактозу и другие сахара, микрокристаллическую целлюлозу, пектин, желатин, сульфат кальция, этилцеллюлозу, полиакрилаты или гидрофосфат кальция и т.д.); смазывающие вещества (например, стеарат магния, тальк, диоксид кремния, коллоидный диоксид кремния, стеариновую кислоту, стеараты металлов, гидрированные растительные масла, кукурузный крахмал, полиэтиленгликоли, бензоат натрия, ацетат натрия и т.д.); дезинтеграторы (например, крахмал, гликолят натриевого крахмала и т.д.) и смачивающие вещества (например, лаурилсульфат натрия и т.д.).
Фармацевтически приемлемые органические или неорганические наполнители, пригодные для непарентерального введения, которые не оказывают вредного влияния при взаимодействии с нуклеиновыми кислотами, также могут быть использованы для получения композиций по настоящему изобретению. Фармацевтически приемлемые носители включают, не ограничиваясь ими, воду, солевые растворы,
- 23 022207 спирты, полиэтиленгликоли, желатин, лактозу, амилозу, стеарат магния, тальк, кремниевую кислоту, вязкий парафин, гидроксиметилцеллюлозу, поливинилпирролидон и тому подобные. Препараты, предназначенные для местного введения нуклеиновых кислот, могут включать стерильные и нестерильные водные растворы, неводные растворы в обычных растворителях, таких как спирты, или растворы нуклеиновых кислот в жидких или твердых масляных основах. Растворы могут также содержать буферы, разбавители и другие приемлемые добавки. Могут быть использованы фармацевтически приемлемые органические или неорганические наполнители, пригодные для непарентерального введения, которые не оказывают вредного влияния при взаимодействии с нуклеиновыми кислотами.
В одном варианте осуществления изобретения композиция включает модифицированный олигонуклеотид, являющийся одноцепочечным или двухцепочечным олигонуклеотидом, состоящим из 20 связанных нуклеозидов.
Другой вариант осуществления изобретения относится к способу ингибирования экспрессии фактора роста соединительной ткани в клетке или ткани, который включает контактирование указанной клетки или ткани с любым из вышеуказанных соединений в условиях, обеспечивающих ингибирование экспрессии фактора роста соединительной ткани.
Определенный вариант осуществления изобретения относится к способу лечения животного, страдающего заболеванием или нарушением, ассоциированным с экспрессией фактора роста соединительной ткани, который включает введение указанному животному описанного выше соединения в количестве, обеспечивающем эффективное ингибирование экспрессии фактора роста соединительной ткани, с целью лечения данного животного.
При осуществлении способа по настоящему изобретению животное является человеком, а также животным, отличным от человека, предпочтительно человеком.
Настоящее изобретение также относится к фармацевтическим композициям и препаратам, включающим антисмысловые соединения по настоящему изобретению. Фармацевтические композиции по настоящему изобретению можно вводить разными способами в зависимости от местного или системного лечения или подлежащей лечению области тела. Введение может быть местным (включающим введение в глаза и нанесение на слизистые оболочки, в том числе вагинальное и ректальное введение), в легкие, например, путем ингаляции или инсуффляции порошков или аэрозолей, в том числе при помощи распылителей; интратрахеальным, назальным, эпидермальным и внутрикожным); пероральным или парентеральным. Парентеральное введение включает внутривенные, внутриартериальные, подкожные, внутрибрюшинные или внутримышечные инъекции или вливания; либо внутричерепное, например интратекальное или интравентрикулярное введение. Олигонуклеотиды, включающие по меньшей мере одну 2'О-метоксиэтильную модификацию, считаются особенно пригодными для перорального введения.
Фармацевтические композиции и препараты для местного применения могут включать чрескожные пластыри, мази, лосьоны, кремы, гели, капли, суппозитории, распыляемые растворы, жидкости и порошки. Может быть необходимо или желательно использовать стандартные фармацевтические носители, водные, порошкообразные или масляные основы, загустители и тому подобное. Могут быть также использованы презервативы, перчатки и подобные средства с нанесенным на них покрытием. Предпочтительные препараты для местного применения включают такие препараты, в которых олигонуклеотиды по настоящему изобретению находятся в смеси с агентом для местного введения, таким как липиды, липосомы, жирные кислоты, сложные эфиры жирных кислот, стероиды, хелатообразователи и поверхностно-активные вещества. Предпочтительные липиды и липосомы включают нейтральные вещества (например, диолеоилфосфатидилэтаноламин (ΌΟΡΕ), димиристоилфосфатидилхолин (ЭМРС), дистеароилфосфатидилхолин), отрицательно заряженные вещества (например, димиристоилфосфатидилглицерин (ΌΜΡΟ)) и катионные вещества (например, диолеоилтетраметиламинопропил (ЭОТАР) и диолеоилфосфатидилэтаноламин (ЭОТМА)). Олигонуклеотиды по настоящему изобретению могут быть инкапсулированы в липосомы или могут образовывать комплекс с липосомами, в частности, с катионными липосомами. Альтернативно, олигонуклеотиды могут образовывать комплекс с липидами, в частности, с катионными липидами. Предпочтительные жирные кислоты и сложные эфиры включают, не ограничиваясь ими, арахидоновую кислоту, олеиновую кислоту, эйкозановую кислоту, лауриловую кислоту, каприловую кислоту, каприновую кислоту, миристиновую кислоту, пальмитиновую кислоту, стеариновую кислоту, линоленовую кислоту, линолевую кислоту, дикапрат, трикапрат, моноолеин, дилаурин, глицерил-1-монокапрат, 1-додецилазациклогептан-2-он, ацилкарнитин, ацилхолин или сложный С1-10 алкиловый эфир (например, изопропилмиристат (ΙΡΜ)), моноглицерид, диглицерид или его фармацевтически приемлемую соль. Препараты для местного применения подробно описаны в заявке на патент США № 09/З15298, поданной 20 мая 1999 г., которая полностью включена в настоящее описание изобретения в качестве ссылки.
Композиции и препараты для перорального введения включают порошки или гранулы, микрочастицы, наночастицы, суспензии или растворы в водных или неводных средах, капсулы, желатиновые капсулы, саше, таблетки или минитаблетки. Может быть желательно использовать загустители, ароматизаторы, разбавители, эмульгаторы, диспергирующие агенты или связывающие вещества. Предпочтительными препаратами для перорального введения являются препараты, в которых олигонуклеотиды по на- 24 022207 стоящему изобретению вводят вместе с одним или несколькими усилителями проникновения, поверхностно-активными веществами и хелаторами. Предпочтительные поверхностно-активные вещества включают жирные кислоты и/или их сложные эфиры или соли, желчные кислоты и/или их соли. Предпочтительные желчные кислоты/соли включают хенодезоксихолевую кислоту (СОСА) и урсодезоксихенодезоксихолевую кислоту (ΌΌί'Ά), холевую кислоту, дегидрохолевую кислоту, дезоксихолевую кислоту, глюхолевую кислоту, глихолевую кислоту, гликодезоксихолевую кислоту, таурохолевую кислоту, тауродезоксихолевую кислоту, тауро-24,25-дигидрофузидат натрия, гликодигидрофузидат натрия.
Предпочтительные жирные кислоты включают арахидоновую кислоту, ундекановую кислоту, олеиновую кислоту, лауриловую кислоту, каприловую кислоту, каприновую кислоту, миристиновую кислоту, пальмитиновую кислоту, стеариновую кислоту, линолевую кислоту, линоленовую кислоту, дикапрат, трикапрат, моноолеин, дилаурин, глицерил-1-молнокапрат, 1-додецилазациклогептан-2-он, ацилкарнитин, ацилхолин, моноглицерид, диглицерид или их фармацевтически приемлемую соль (например, соль натрия). Предпочтительными также являются комбинации усилителей проникновения, например, жирных кислот/солей, с желчными кислотами/солями. Особенно предпочтительной комбинацией является натриевая соль лауриновой кислоты, каприновой кислоты и иЭСА. Другие усилители проникновения включают полиоксиэтилен-9-лауриловый эфир, полиоксиэтилен-20-цетиловый эфир.
Олигонуклеотиды по настоящему изобретению можно вводить перорально в гранулированной форме, включающей высушенные распылением частицы, или в виде комплекса с образованием микроили наночастиц. Агенты, образующие комплекс с олигонуклеотидами, включают полиаминокислоты, полиимины, полиакрилаты, полиалкилакрилаты, полиоксетаны, полиалкилцианоакрилаты, катионированные желатины, альбумины, крахмалы, акрилаты, полиэтиленгликоли (РЕС), полиалкилцианоакрилаты, полиимины с присоединенным ΌΕΑΕ, поллуланы, целлюлозы и крахмалы. Особенно предпочтительные комплексообразующие агенты включают хитозан, Ν-триметилхитозан, поли-Ь-лизин, полигистидин, полиорнитин, полиспермины, протамин, поливинилпиридин, политиодиэтиламинометилэтилен (РТЭАЕ), полиаминостирол (например, п-амино), полиметилцианоакрилат, полиэтилцианоакрилат, полибутилцианоакрилат, полиизобутилцианоакрилат, полиизогексилцианоакрилат, ΌΕΑΕ-метакрилат, ΌΕΑΕ-гексилакрилат, ΌΕΑΕ-акриламид, ΌΕΑΕ-альбумин и ΌΕΑΕ-декстран, полиметилакрилат, полигексилакрилат, полимер Ό,Ό-молочной кислоты, сополимер Ό,Ό-молочной кислоты и гликолевой кислоты (ΓΕΟΑ), альгинат и полиэтиленгликоль (ΓΕΟ). Препараты для перорального введения, содержащие олигонуклеотиды, и способы их получения подробно описаны в заявках на патент США № 08/886829 (подана 1 июля 1997 г.), № 09/108673 (подана 1 июля 1998 г.), № 09/256515 (подана 23 февраля 1999 г.), № 09/082624 (подана 21 мая 1998 г.) и № 09/315298 (подана 20 мая 1999 г.), которые полностью включены в настоящее описание изобретения в качестве ссылки.
Композиции и препараты для парентерального, интратекального или интравентрикулярного введения могут включать стерильные водные растворы, которые могут также содержать буферы, разбавители и другие приемлемые добавки, которые включают, не ограничиваясь ими, усилители проникновения, несущие соединения и другие фармацевтически приемлемые носители или наполнители.
Фармацевтические композиции по настоящему изобретению включают, не ограничиваясь ими, растворы, эмульсии и липосомные препараты. Указанные композиции могут быть получены из разных компонентов, которые включают, не ограничиваясь ими, предварительно полученные жидкости, самоэмульгирующиеся твердые вещества и самоэмульгирующиеся полутвердые вещества.
Фармацевтические препараты по настоящему изобретению, которые обычно представляют собой стандартную лекарственную форму, могут быть получены стандартными методами, хорошо известными в фармацевтической промышленности. Такие методы включают стадию смешивания активных ингредиентов с фармацевтическими носителями или наполнителями. Как правило, такие препараты получают путем однородного смешивания активных ингредиентов с жидкими носителями или тонко измельченными твердыми носителями, либо теми и другими вместе с последующим формованием продукта в случае необходимости.
Композиции по настоящему изобретению могут быть получены в виде любых возможных лекарственных форм, которые включают, не ограничиваясь ими, таблетки, капсулы, желатиновые капсулы, жидкие сиропы, мягкие гели, суппозитории и клизмы. Композиции по настоящему изобретению могут быть также получены в виде суспензий в водных, неводных или смешанных средах. Водные суспензии могут далее содержать вещества, увеличивающие вязкость суспензии, которые включают, например, натрийкарбоксиметилцеллюлозу, сорбит и/или декстран. Суспензия может также содержать стабилизаторы.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения фармацевтические композиции могут быть получены и использованы в виде пены. Фармацевтические пены включают, не ограничиваясь ими, эмульсии, микроэмульсии, кремы, желе и липосомы. Несмотря на в основном сходную природу, указанные препараты отличаются по составу компонентов и консистенции конечного продукта. Специалистам в области фармацевтики и приготовления лекарственных средств хорошо известны методы получения таких композиций и препаратов, которые могут быть использованы для получения композиций по настоящему изобретению.
Эмульсии
- 25 022207
Композиции по настоящему изобретению могут быть получены в виде эмульсий. Эмульсии обычно представляют собой гетерогенные системы одной жидкости, диспергированной в другой жидкости в форме капель, диаметр которых обычно больше 0,1 мкм (1бкоп, ίη Ркагтасеибса1 Эокаде Рогтк, ПеЪегтап, Кгедег апб Вапкег (Ебк.), 1988, Магсе1 Эеккег. 1пс., Νον Уогк, Ν.Υ., уо1ите 1, р. 199; РокоГГ, ίη Ркагтасеибса1 Эокаде Рогтк, ЫеЪегтап, Юедег апб Вапкег (Ебк.), 1988, Магсе1 Эеккег, 1пс., №ν Υо^к. Ν.Υ., Уо1ите 1, р. 245; В1оск ш РЬагтасеибса1 Эокаде Рогтк, ЫеЪегтап, Юедег апб Вапкег (Ебк.), 1988, Магсе1 Эеккег, 1пс., Υо^к. Ν.Υ., уо1ите 2, р. 335; ШдисЫ е! а1., т Реттфоп'к РЬагтасеибса1 δ^ι^κ, Маск РиЪНкЫпд Со., Еак!оп, Ра., 1985, р. 301). Эмульсии часто являются двухфазными системами, включающими две несмешивающиеся жидкие фазы, которые в конечном счете смешиваются и диспергируют друг в друге. Как правило, эмульсии могут быть водомасляными эмульсиями (ν/о) или эмульсиями масла в воде (о/ν). Когда водную фазу тонко распыляют и диспергируют в виде мелких капель в основной масляной фазе, полученная композиция именуется водомасляной (ν/о) эмульсией. Альтернативно, когда масляную фазу тонко распыляют и диспергируют в виде мелких капель в основной водной фазе, полученная композиция именуется эмульсией масла в воде (о/ν). Эмульсии могут содержать дополнительные компоненты, помимо диспергированных фаз, и активное лекарственное средство, которое может присутствовать в виде раствора в водной фазе, масляной фазе или в виде отдельной фазы. При необходимости в эмульсиях могут также присутствовать фармацевтические наполнители, такие как эмульгаторы, стабилизаторы, красители и антиоксиданты. Фармацевтические эмульсии также могут быть множественными эмульсиями, состоящими более, чем из двух фаз, как, например, в случае эмульсии масла в воде в масле (о/\у/о) и водомасляной эмульсии в воде (ν/θ/ν). Такие сложные препараты часто обладают определенными преимуществами, которых не имеют простые бинарные эмульсии. Множественные эмульсии, в которых отдельные капли масла эмульсии о/ν заключают в себе мелкие капли воды, образуют эмульсию νΦ/ν. Аналогичным образом система капель масла, заключенных в капли воды, стабилизированные в масляной непрерывной фазе, образует эмульсию о/\у/о.
Эмульсии характеризуются слабой термодинамической устойчивостью или ее отсутствием. Дисперсная фаза эмульсии хорошо диспергируется в непрерывной фазе и сохраняется в указанной форме благодаря эмульгаторам или вязкости препарата. Любая фаза эмульсии может быть полутвердой или твердой как в случае мазей и кремов эмульсионного типа. Другие способы стабилизации эмульсий предполагают использование эмульгаторов, которые могут быть введены в любую фазу эмульсии. Эмульгаторы могут быть классифицированы в четыре категории: синтетические поверхностно-активные вещества, природные эмульгаторы, абсорбирующие основы и тонко измельченные твердые вещества (1бкоп, ш РЬагтасеибса1 Эокаде Рогтк, ЫеЪегтап, Кгедег апб Вапкег (Ебк.), 1988, Магсе1 Эеккег, 1пс., №ν Уогк, Ν.Υ., уо1. 1, р. 199).
Синтетические поверхностно-активные вещества широко применяются в эмульсионных препаратах и описаны в научной литературе (Ктедег, ш РЬагтасеибса1 Эокаде Рогтк, ЫеЪегтап, Юедег апб Вапкег (Ебк.), 1988, Магсе1 Эеккег, 1пс., №ν Υо^к. Ν.Υ., уо1ите 1, р. 285; 1бкоп, т Ркагтасеибса1 Эокаде Рогтк, ЫеЪегтап, Кгедег апб Вапкег (Ебк.), Магсе1 Эеккег, 1пс., №ν Υо^к. Ν.Υ., 1988, уо1ите 1, р. 199). Поверхностно-активные вещества обычно являются амфифильными веществами и включают гидрофильную и гидрофобную части. Соотношение гидрофильной части и гидрофобной части поверхностно-активного вещества именуется балансом гидрофильного вещества/липофильного вещества (НЬВ) и является важным показателем для классификации и выбора поверхностно-активных веществ при получении препаратов. Поверхностно-активные вещества можно классифицировать по типу гидрофильной группы как неионогенные, анионогенные, катионогенные и амфотерные (Ктедег, ш Ркагтасеибса1 Эокаде Рогтк, ЫеЪегтап, Кгедег апб Вапкег (Ебк.), 1988, Магсе1 Эеккег, 1пс., №ν Υо^к. Ν.Υ., уо1. 1, р. 285).
Природные эмульгаторы, используемые в эмульсионных препаратах, включают ланолин, пчелиный воск, фосфатиды, лецитин и аравийскую камедь. Абсорбирующие основы обладают гидрофильными свойствами, благодаря чему они могут поглощать воду с образованием водомасляной (ν/о) эмульсии, сохраняя при этом полутвердую консистенцию, подобную безводному ланолину и гидрофильному вазелину. Тонко измельченные твердые вещества также являются хорошими эмульгаторами, особенно в комбинации с поверхностно-активными веществами и в вязких препаратах. Указанные вещества включают полярные неорганические твердые вещества, такие как гидроксиды тяжелых металлов, неразбухающие глины, такие как бентонит, аттапульгит, гекторит, каолин, монтмориллонит, коллоидный алюмосиликат и коллоидный алюмосиликат магния, пигменты и неполярные твердые вещества, такие как уголь или глицерилтристеарат.
В эмульсионные препараты вводят также разные неэмульгирующие вещества, которые сообщают эмульсиям определенные свойства. Указанные вещества включают жиры, масла, воски, жирные кислоты, жирные спирты, сложные эфиры жирных кислот, увлажнители, гидрофильные коллоиды, консерванты и антиоксиданты (В1оск, ш Ркагтасеибса1 Эокаде Рогтк, ЫеЪегтап, Юедег апб Вапкег (Ебк.), 1988, Магсе1 Эеккег, 1пс., №ν Υо^к. Ν.Υ., уо1. 1, р. 335; 1бкоп, ш Ркагтасеибса1 Эокаде Рогтк, ЫеЪегтап, Кгедег апб Вапкег (Ебк.), 1988, Магсе1 Эеккег, 1пс., №ν Υо^к. Ν.Υ., уо1. 1, р. 199).
Гидрофильные коллоиды или гидроколлоиды включают природные камеди и синтетические полимеры, такие как полисахариды (например, аравийскую камедь, агар, альгиновую кислоту, каррагенан,
- 26 022207 гуаровую камедь, карайя и трагант), производные целлюлозы (например, карбоксиметилцеллюлозу и карбоксипропилцеллюлозу) и синтетические полимеры (например, карбомеры, простые эфиры целлюлозы и карбоксивиниловые полимеры). Указанные вещества диспергируются или разбухают в воде с образованием коллоидных растворов, которые стабилизируют эмульсии благодаря образованию прочных межфазных пленок вокруг капель диспергированной фазы и увеличению вязкости наружной фазы.
Так как эмульсии часто содержат ряд ингредиентов, таких как углеводы, белки, стеролы и фосфатиды, которые могут способствовать росту микробов, в указанные препараты часто вводят консерванты. Консерванты, обычно используемые в эмульсионных препаратах, включают метилпарабен, пропилпарабен, соли четвертичного аммония, хлорид бензалкония, сложные эфиры парагидроксибензойной кислоты и борную кислоту. В эмульсионные препараты также обычно добавляют антиоксиданты для предотвращения ухудшения качества препарата. Используемые антиоксиданты могут быть акцепторами свободных радикалов, такими как токоферолы, алкилгаллаты, бутилированный гидроксианизол, бутилированный гидрокситолуол, или восстановителями, такими как аскорбиновая кислота и метабисульфит натрия, и синергистами антиоксидантов, такими как лимонная кислота, винная кислота и лецитин.
В научной литературе описаны эмульсионные перепараты, предназначенные для кожного, перорального и парентерального введения, и способы их получения (1бкоп, ίη Рйагтасеийса1 Иокаде Рогтк, ЫеЬегтап, Шедег апб Ваикег (Ебк.), 1988, Магсе1 Эеккег, 1пс., Νον Уогк, Ν.Υ., νο1. 1, р. 199). Эмульсионные препараты, предназначенные для перорального введения, широко используются благодаря простоте получения и эффективности с точки зрения абсорбции и биологической доступности. (КокоГГ, ш Рйагтасеийса1 Иокаде Рогтк, ЫеЬегтап, Юедег апб Вапкег (Ебк.), 1988, Магсе1 Иеккег, 1пс., №ν Υο^к, Ν.Υ., νο1. 1, р. 245; 1бкоп, ш Рйагтасеийса1 Иокаде Рогтк, ЫеЬегтап, Шедег апб Вапкег (Ебк.), 1988, Магсе1 Эеккег. 1пс., №ν Υο^к, Ν.Υ., νο1. 1, р. 199). Слабительные средства на онове минерального масла, растворимые в масле витамины и пищевые препараты с высоким содержанием жира относятся к веществам, которые обычно вводят перорально в виде эмульсий масла в воде (о/ν).
В одном варианте осуществления настоящего изобретения композиции, включающие олиго нуклеотиды и нуклеиновые кислоты, получают в виде микроэмульсий. Микроэмульсию можно определить как систему, состоящую из воды, масла и амфифильного вещества, которая является единственным оптически изотропным и термодинамически устойчивым жидким раствором (КокоГГ, ш Рйагтасеийса1 Иокаде Рогтк, ЫеЬегтап, Шедег апб Вапкег (Ебк.), 1988, Магсе1 Эеккег, 1пс., №ν Уогк, Ν.Υ. νο1. 1, р. 245). Типичные микроэмульсии являются системами, при получении которых сначала диспергируют масло в водном растворе поверхностно-активного вещества и затем добавляют достаточное количество четвертого компонента, обычно среднецепного спирта, с образованием прозрачной системы. Поэтому микроэмульсии также описаны в научной литературе как термодинамически устойчивые, изотропно прозрачные дисперсии двух несмешивающихся жидкостей, стабилизированных межфазными пленками молекул поверхностно-активных веществ (Ьеипд апб 8йай, ш: СойгоПеб Ке1еаке оГ Эгидк: Ро1утегк апб Аддгеда1е 8ук1етк, КокоГГ, М., Еб., 1989, УСН РиЬйкйегк, №ν Υο^к. радек 185-215). Микроэмульсии обычно получают, объединяя три-пять компонентов, включающих масло, воду, поверхностно-активное вещество, вторичное поверхностно-активное вещество и электролит. Выбор типа микроэмульсии, включающего воду в масле (ν/о) или масло в воде (о/ν), зависит от свойств используемого масла и поверхностноактивного вещества, от структуры и геометрической упаковки полярных головных частей и углеводных концов молекул поверхностно-активного вещества (8сйой, ш КепипдЮп'к Рйагтасеийса1 8аепсек, Маск РиЬНкЫпд Со., ЕакЮп, Ра., 1985, р. 271).
Был использован феноменологический метод на основе фазовых диаграмм, благодаря которому специалисты в данной области получили обширную информацию, относящуюся к получению микроэмульсий (КокоГГ, ш РНагтасеиНса1 Иокаде Рогтк, ЫеЬегтап, Юедег апб Вапкег (Ебк.), 1988, Магсе1 Эеккег, 1пс., №ν Υο^к. Ν.Υ., νο1ите 1, р. 245; В1оск, ш РНагтасеийса1 Иокаде Рогтк, ЫеЬегтап, Шедег апб Вапкег (Ебк.), 1988, Магсе1 Эеккег, 1пс., №ν Υο^к. Ν.Υ., νο1ите 1, р. 335). По сравнению с обычными эмульсиями преимуществом микроэмульсий часто является растворение не растворимых в воде лекарственных средств в препарате, включающем спонтанно образующиеся термодинамически устойчивые капли.
Поверхностно-активные вещества, используемые при получении микроэмульсий, включают, не ограничиваясь ими, ионогенные поверхностно-активные вещества, неионогенные поверхностно-активные вещества, Вгу 96, полиоксиэтиленолеиловые эфиры, сложные эфиры жирных кислот полиглицерина, монолаурат тетраглицерина (МЬ310), моноолеат тетраглицерина (МО310), моноолеат гексаглицерина (РО310), пентаолеат гексаглицерина (РО500), монокапрат декаглицерина (МСА750), моноолеат декаглицерина (МО750), секвиолеат декаглицерина (80750), декаолеат декаглицерина (ИА0750), которые могут быть использованы отдельно или в комбинации со вторичными поверхностно-активными веществами. Вторичное поверхностно-активное вещество, которое обычно является короткоцепным спиртом, таким как этанол, 1-пропанол и 1-бутанол, служит для увеличения межфазной текучести в результате проникновения в пленку поверхностно-активного вещества и образования разупорядоченной пленки вследствие возникновения пустого пространства между молекулами поверхностно-активного вещества. Однако микроэмульсии могут быть получены без использования вторичных поверхностно-активных веществ, и в
- 27 022207 данной области известны самоэмульгирующиеся микроэмульсионные системы, не содержащие спирта. Водная фаза обычно является, не ограничиваясь ими, водой, водным раствором лекарственного средства, глицерином, РЕО300, РЕО400, полиглицеринами, пропиленгликолями и производными этиленгликоля. Масляная фаза может включать, не ограничиваясь ими, такие вещества как каптекс 300, каптекс 355, капмул МСМ, сложные эфиры жирных кислот, среднецепные (С8-С12) моно-, ди- и триглицериды, полиоксиэтилированные глицериловые эфиры жирных кислот, жирные спирты, полигликолизированные глицериды, насыщенные полигликолизированные С8-С10 глицериды, растительные масла и силиконовое масло.
Микроэмульсии представляют особый интерес с точки зрения растворимости и повышенной абсорбции лекарственных средств. Микроэмульсии на липидной основе (как о/те, так и те/о) были предложены для повышения биологической доступности лекарственных средств, включающих пептиды, при пероральном введении (Сопз1ап1ийбсз с! а1., РЬагтассийса1 КсзсагсЬ, 1994, 11, 1385-1390; КЬзсЬск Мс!Ь. Ршб. Ехр. СЬп. РЬагтасо1., 1993, 13, 205). Преимуществом микроэмульсии является лучшая растворимость лекарственного средства, защита лекарственного средства от ферментативного гидролиза, возможное увеличение абсорбции лекарственного средства благодаря изменению текучести и проницаемости мембраны, вызываемому поверхностно-активными веществами, простота получения, легкость перорального введения по сравнению с твердыми лекарственными формами, более высокую клиническую эфективность и меньшую токсичность (СопзНпбтбсз с! а1., РЬагтассибса1 КсзсагсЬ, 1994, 11, 1385; Но с! а1., 1. РЬагт. δοΐ., 1996, 85, 138-143). Микроэмульсии часто могут образовываться спонтанно при объединении входящих в их состав компонентов при комнатной температуре. Данное качество может быть особенно полезным при получении термолабильных лекарственных средств, пептидов или олигонуклеотидов. Микроэмульсии также обеспечивают эффективную чрескожную доставку активных компонентов в косметических и фармацевтических применениях. Микроэмульсионные композиции и препараты по настоящему изобретению предположительно должны обеспечить более высокую системную абсорбцию олигонуклеотидов и нуклеиновых кислот из желудочно-кишечного тракта, а также локальное поглощения клетками олигонуклеотидов и нуклеиновых кислот в желудочно-кишечном тракте, влагалище, щечном кармане и других областях.
Микроэмульсии по настоящему изобретению могут также содержать дополнительные компоненты и добавки, такие как моностеарат сорбита (ОгШ 3), лабразол и усилители проникновения, для улучшения свойств препарата и повышения абсорбции олигонуклеотидов и нуклеиновых кислот по настоящему изобретения. Усилители проникновения, используемые в микроэмульсиях по настоящему изобретению, можно отнести к одной из пяти широких категорий: поверхностно-активные вещества, жирные кислоты, соли желчных кислот, хелатообразователи и не образующие хелатов вещества, не являющиеся поверхностно-активными веществами (Ьсс с! а1., СгШса1 Ксуютез ίη ТЬсгарсийс Эгид Сатсг §у51стз, 1991, р. 92). Все указанные категории были рассмотрены выше.
Липосомы
Существует много организованных поверхностно-активных структур помимо микроэмульсий, которые изучены и используются при получении лекарственных средств. Такие структуры включают монослои, мицеллы, бислои и пузырьки. Пузырьки, такие как липосомы, представляют большой интерес благодаря их специфичности и продолжительности действия с точки зрения доставки лекарственного средства. В значении, использованном в настоящем описании изобретения, термин липосома означает пузырек, состоящий из амфифильных липидов, расположенных в виде одного или нескольких сферических бислоев.
Липосомы представляют собой однослойные или многослойные пузырьки, имеющие мембрану, образованную липофильным веществом, и внутреннюю полость. Водная часть содержит доставляемую композицию. Преимуществом катионных липосом является их способность сливаться с оболочкой клетки. Некатионные липосомы, хотя и не могут так же эффективно сливаться с оболочной клетки, поглощаются макрофагами ίη угсо.
Чтобы проникнуть через интактную кожу млекопитающего, липидные пузырьки должны пройти через ряд мелких пор с диаметром менее 50 нм под влиянием приемлемого чрескожного градиента. Поэтому желательно использовать липосому, которая хорошо деформируется и может проникать через такие мелкие поры.
Липосомы имеют ряд других преимуществ: липосомы, полученные из природных фосфолипидов, являются биологически совместимыми и биологически разлагающимися; липосомы могут включать большое разнообразие водорастворимых и липидорастворимых лекарственных средств; липосомы могут защищать лекарственные средства, инкапсулированные во внутренних компартментах, от метаболизма и разложения (РозоГГ, ίη РЬагтассийса1 Эозадс Рогтз, ЬаЬсгтап, Кюдсг апб Вапксг (Ебз.), 1988, Магсс1 Оскксг, 1пс., №те Уогк, Ν.Υ., уо1. 1, р. 245). Важное значение при получении липосомных препаратов имеет поверхностный заряд липидов, размер пузырьков и водный объем липосом.
Липосомы предназначены для переноса и доставки активных ингредиентов к месту действия. Поскольку мембрана липосомы в структурном отношении подобна биологическим мембранам, то при попадании на ткань липосомы начинают сливаться с клеточными мембранами. По мере слияния липосомы
- 28 022207 с клеткой содержимое липосомы поступает в клетку, где активный агент может оказывать требуемое действие.
Липосомные препараты являются предметом всестороннего исследования в качестве способа доставки многих лекарственных средств. Все большее число данных сидетельствует о том, что в случае местного введения липосомы обладают несколькими преимуществами по сравнению с другими препаратами. Такие преимущества включают менее выраженные побочные эффекты в сравнении с высокой системной абсорбцией вводимого лекарственного средства, более высокую аккумуляцию введенного лекарственного средства в требуемой мишени и возможность вводить в кожу различные лекарственные средства, как гидрофильные, так и гидрофобные.
В нескольких научных публикациях была подробно описана способность липосом доставлять в кожу агенты, включая высокомолекулярную ДНК. В кожу вводили соединения, включающие аналгетики, антитела, гормоны и высокомолекулярные ДНК. В большинстве применений было достигнуто направленное воздействие на верхний слой эпидермиса.
Липосомы делятся на два больших класса. Катионные липосомы являются положительно заряженными липосомами, которые взаимодействуют с отрицательно заряженными молекулами ДНК с образованием устойчивого комплекса. Положительно заряженный комплекс ДНК/липосомы связывается с отрицательно заряженной поверхностью клетки и интернализируется в эндосому. Благодаря кислотному значению рН в эндосоме липосомы разрушаются, высвобождая содержимое в цитоплазму клетки (Аапд е! а1., Вюсйет. Вюрйук. Ке8. Соттип., 1987, 147, 980-985).
Чувствительные к значению рН или отрицательно заряженные липосомы захватывают ДНК, а не образуют с ней комплекс. Так как ДНК и липид имеют одинаковый заряд, происходит отталкивание, а не образование комплекса. Тем не менее, некоторая ДНК захватывается внутренней водной полостью указанных липосом. Липосомы, чувствительные к значению рН, используются для доставки ДНК, кодирующей ген тимидинкиназы в монослои клетки в культуре. В клетках-мишенях была обнаружена экспрессия экзогенного гена (2йои е! а1., 1оигпа1 о£ Соп!го11еб Ке1еаке, 1992, 19, 269-274).
Липосомная композиция одного главного типа включает фосфолипиды, отличные от природного фосфатидилхолина. Нейтральные липосомные композиции, например, могут быть образованы из димиристоилфосфатидилхолина (ЭМРС) или дипальмитоилфосфатидилхолина (ЭРРС). Анионные липосомные композиции обычно получают из димиристоилфосфатидилглицерина, в то время как анионные сливающиеся липосомы получают главным образом из диолеоилфосфатидилэтаноламина (ПОРЕ). Липосомную композицию другого типа получают из фосфатидилхолина (РС), такого как, например, соевый РС и яичный РС. Липосомную композицию другого типа получают из смесей фосфолипида, фосфатидилхолина и/или холестерина.
Было выполнено несколько исследований по оценке местной доставки в кожу лекарственного средства липосомными препаратами. Нанесение липосом, содержащих интерферон, на кожу морских свинок вызвало уменьшение поражений кожи герпесом, в то время как доставка интерферона другими средствами (например, в виде раствора или эмульсии) была неэффективной (Аешег е! а1., 1оигпа1 о£ Эгид Тагдейпд. 1992, 2, 405-410). Кроме того, при выполнении дополнительного эксперимента была исследована эффективность интерферона, вводимого в составе липосомного препарата, по сравнению с введением интерферона при помощи водной системы, при этом был сделан вывод о том, что липосомный препарат является более эффективным, чем водная система (би Р1ек515 е! а1., Ап1Мга1 Кекеагсй, 1992, 18, 259-265).
Были также исследованы неионные липосомные системы с целью определения их полезности для доставки лекарственных средств в кожу, в частности, системы, включающие неионогенное поверхностно-активное вещество и холестерин. Неионные липосомные препараты, включающие №уакоте™ I (глицерилдилаурат/холестерин/полиоксиэтилен-10-стеариловый эфир) и №уакоте™ II (глицерилдистеарат/холестерин/полиоксиэтилен-10-стеариловый эфир) использовали для доставки циклоспорина-А в дерму кожи мышей. Результаты показали, что такие неионные липосомные системы эффективно облегчают отложение циклоспорина-А в разных слоях кожи (Ни е! а1., 8.Т.Р. Рйагта. δοΐ., 1994, 4, 6, 466).
В определение липосом, приведенное в настоящем описании изобретения, также входят стерически стабилизированные липосомы, включающие один или несколько специализированных липидов, которые при введении в липосомы увеличивают время жизни в кровотоке по сравнению с липосомами, не содержащими таких специализированных липидов. Примерами стерически стабилизированных липосом являются такие липосомы, в которых образующая пузырек часть липида липосомы (А) включает один или несколько гликолипидов, таких как моносиалоганглиозид СМ1 или (В) связана с одним или несколькими гидрофильными полимерами, такими как полиэтиленгликоль (РЕС). В данной области существует мнение, не ограниченное какой-либо конкретной теорией, что время полужизни в кровотоке стерически стабилизированных липосом, содержащих ганглиозиды, сфингомиелин или липиды, связанные с РЕС, является более продолжительным вследствие меньшего поглощения клетками ретикулоэндотелиальной системы (ΚΕδ) (А11еп е! а1., РЕВ8 Ье!!егк, 1987, 223, 42; Аи е! а1., Сапсег Кекеагсй, 1993, 53, 3765).
В данной области известны разные липосомы, содержащие один или несколько гликолипидов. В публикации Рарайаб.)орои1о5 е! а1. (Апп. Ν.Υ. Асаб. δοΐ., 1987, 507, 64) отмечена способность моносиало- 29 022207 ганглиозида ОМ1, сульфата галактоцереброзида и фосфатидилинозита увеличивать время полужизни липосом в кровотоке. Указанные результаты получили дальнейшее подтверждение в публикации ОаЫ/оп е! а1. (Ргос. Наб. Асаб. 8сь И.8.А., 1988, 85, 6949). В патенте США № 4837028 и заявке на патент \УО 99/04 924, принадлежащих Аллену и др. (А11еп е! а1.), описаны липосомы, включающие (1) сфингомиелин и (2) ганглиозид ОМ1 или сложный эфир сульфата галактоцереброзида. В патенте США № 5543152 (\УеЬЬ е! а1.) описаны липосомы, включающие сфингомиелин. Липосомы, включающие 1,2-бпдимиристоилфосфатидилхолин, описаны в заявке на патент \УО 97/13499 (Ет е! а1.).
В данной области известны многие липосомы, включающие липиды, связанные с одним или несколькими гидрофильными полимерами, и способы их получения. В публикации 8ипато!о е! а1. (Ви11. Сйет. 8ос. 1рп., 1980, 53, 2778) описаны липосомы, включающие неиногенный детергент, 2С12 15О, содержащий РЕО. В публикации 111ит е! а1. (ЕЕВ8 Ьей., 1984, 167, 79) указано, что гидрофильное покрытие из частиц полистирола с полигликолями значительно увеличивает время полужизни в кровотоке. Синтетические фосфолипиды, модифицированные путем присоединения гидроксильных групп полиалкиленгликолей (например, РЕО), описаны в публикации 8еат§ (патенты США №№ 4426330 и 4534899). В публикации Клибанова и др. (РЕВ8 Ьей., 1990, 268, 235) описаны эксперименты, показывающие, что липосомы, включающие фосфатидилэтаноламин (РЕ), связанный с РЕО или стеаратом РЕО, характеризуются значительно более продолжительным временем полужизни в кровотоке. В публикации В1ите е! а1. (ВюсЫтюа е! Вюрйукюа Ас!а, 1990, 102 9, 91) указанные наблюдения были распространены на другие РЕОсвязанные фосфолипиды, например, О8РЕ-РЕО, полученные в результате объединения дистеароилфосфатидилэтаноламина (Э8РЕ) и РЕО. Липосомы, содержащие ковалентно связанный РЕО на наружной поверхности, описаны в европейском патенте № ЕР 0445131 В1 и заявке на патент \УО 90/04384, принадлежащих Фишеру. Липосомные композиции, содержащие 1-20 молярных процентов РЕ, связанного с РЕО, и способы их применения описаны в патентах США №№ 5013556 и 5356633, принадлежащих Вудлу и др. (АУооб1е е! а1.), в патенте США № 5213804 и европейском патенте № ЕР 0496813 В1, принадлежащих Мартину и др. (Матйп е! а1.). Липосомы, включающие ряд других полимер-липидных конъюгатов, описаны в заявке на патент \УО 91/05545 и патенте США № 5225212 (принадлежащих Мартину и др.) и в заявке на патент \УО 94/20073 (2айр§ку е! а1.). Липосомы, включающие РЕО-модифицированные керамидные липиды, описаны в заявке на патент \УО 98/10391 (Сйо1 е! а1.). В патентах США №№ 5540935 (М1уа/ак1 е! а1.) и 5556948 (Тада\\а е! а1.) описаны РЕО-содержащие липосомы, которые могут быть далее связаны с функциональными частями на своей поверхности.
В данной области известно ограниченное число липосом, включающих нуклеиновые кислоты. В заявке на патент \УО 96/40062, принадлежащей Тьерри и др. (ТЫетту е! а1.), описаны способы инкапсулирования высокомолекулярных нуклеиновых кислот в липосомы. В патенте США № 5264221, принадлежащем Тада\\а е! а1., описаны липосомы, связанные с белком, и отмечено, что такие липосомы могут содержать антисмысловую РНК. В патенте США № 5665710, принадежащем Кайтап е! а1., описаны определенные способы инкапсулирования олигодезоксинуклеотидов в липосомы. В заявке на патент \УО 97/04787, принадлежащей йо\'е е! а1., описаны липосомы, включающие антисмысловые олигонуклеотиды, направленно воздействующие на ген габ.
Трансферсомы являются еще одним типом липосом и представляют собой высокодеформируемые липидные агрегаты, являющиеся весьма привлекательными в качестве носителей для доставки лекарственных средств. Трансферсомы можно охарактеризовать как липидные капли, которые настолько хорошо деформируются, что могут легко проникать через поры меньшего размера, чем сама капля. Трансферсомы адаптируются к окружающей среде, например, они самооптимизируются (адаптируются к форме пор в коже), самовосстанавливаются, часто достигают мишеней без фрагментации и часто самозагружаются. При получении трансферсом в стандартную липосомную композицию могут быть добавлены активаторы поверхности, обычно поверхностно-активные вещества. Трансферсомы были использованы для доставки в кожу сывороточного альбумина. Было установлено, что доставка сывороточного альбумина с помощью трансферсом является такой же эффективной, что и подкожная инъекция раствора, содержащего сывороточный альбумин.
Поверхностно-активные вещества широко применяются в таких препаратах как эмульсии (включая микроэмульсии) и липосомы. Наиболее обычным способом классификации свойств поверхностноактивных веществ многих разных типов, как природных, так и синтетических, является баланс гидрофильного вещества/липофильного вещества (НЬВ). Характер гидрофильной группы (известной также как головная группа) является наиболее пригодным средством классификации разных поверхностноактивных веществ, используемых в препаратах (Ктедет, ш Рйаттасеийса1 Эо^аде Еогпъ, Магсе1 Эеккег, 1пс., \ем Уогк, Ν.Υ., 1988, р. 285).
Неионизированная молекула поверхностно-активного вещества классифицируется как неионогенное поверхностно-активное вещество. Неионогенные поверхностно-активные вещества широко применяются в фармацевтических и косметических продуктах и могут быть использованы в широком диапазоне значений рН. Как правило, значения НЬВ таких поверхностно-активных веществ находятся в пределах от 2 до около 18 в зависимости от их структуры. Неионогенные поверхностно-активные вещества включают неионные сложные эфиры, такие как сложные эфиры этиленгликоля, сложные эфиры пропи- 30 022207 ленгликоля, глицериловые сложные эфиры, полиглицериловые сложные эфиры, сложные эфиры сорбита, сложные эфиры сахарозы и этоксилированные сложные эфиры. К данному классу также относятся неионные алканоламиды и простые эфиры, такие как этоксилаты жирных спиртов, пропоксилированные спирты и этоксилированные/пропоксилированные блок-сополимеры. Полиоксиэтиленовые поверхностно-активные вещества являются наиболее известными членами класса неионогенных поверхностноактивных веществ.
Если молекула поверхностно-активного вещества имеет отрицательный заряд при расстворении или диспергировании в воде, такое поверхностно-активное вещество классифицируется как анионогенное. Анионогенные поверхностно-активные вещества включают карбоксилаты, такие как мыла, ациллактилаты, ациламиды аминокислот, сложные эфиры серной кислоты, такие как алкилсульфаты и этоксилированные алкилсульфаты, сульфонаты, такие как алкилбензолсульфонаты, ацилизотионаты, ацилтаураты, сульфосукцинаты и фосфаты. Наиболее важными членами класса анионогенных поверхностноактивных веществ являются алкильсульфаты и мыла.
Если молекула поверхностно-активного вещества имеет положительный заряд при растворении или диспергировании в воде, такое поверхностно-активное вещество классифицируется как катионогенное. Катионогенные поверхностно-активные вещества включают соли четвертичного аммония и этоксилированные амины. Соли четвертичного аммония являются наиболее известными членами данного класса.
Если молекула поверхностно-активного вещества обладает способностью нести положительный или отрицательный заряд, такое поверхностно-активное вещество классифицируется как амфотерное. Амфотерные поверхностно-активные вещества включают производные акриловой кислоты, замещенные алкиламиды, Ν-алкилбетаины и фосфатиды.
В научной литературе описано применение поверхностно-активных веществ в лекарственных продуктах, препаратах и эмульсиях (Ктедет, ίη РЬаттасеиЬса1 Эо^аде Рогт§, Магсе1 Эеккег. 1пс., №ν ΥοιΈ Ν.Υ., 1988, ρ. 285).
Усилители проникновения
Один вариант осуществления настоящего изобретения относится к разным усилителям проникновения, обеспечивающим эффективную доставку нуклеиновых кислот, в частности, олигонуклеотидов, в кожу животных. Большинство лекарственных средств присутствует в растворе в ионизированной и неионизированной формах. Однако обычно только липидрастворимые или липофильные лекарственные средства легко проникают через клеточные мембраны. Установлено, что даже нелипофильные лекарственные средства могут проникать через клеточные мембраны, если обработать указанную мембрану усилителем проникновения. Помимо увеличения диффузии нелипофильных лекарственных средств через клеточные мембраны, усилители проникновения также повышают способность проникновения липофильных лекарственных средств.
Усилители проникновения могут быть отнесены к одной из пяти больших категорий, таких как поверхностно-активные вещества, жирные кислоты, соли желчных кислот, хелатообразователи и не образующие хелатов вещества, не являющиеся поверхностно-активными веществами (Ьее е! а1., СЬЬса1 Кеν^еν5 ίη ТЬетареиЬс Эгид Сатег δу5!ет5, 1991, ρ. 92). Все вышеуказанные классы усилителей проникновения более подробно описаны ниже.
Поверхностно-активные вещества
В соответствии с целями настоящего изобретения поверхностно-активные вещества (или поверхностно-активные агенты) являются химическими веществами, которые при растворении в водном растворе уменьшают поверхностное натяжение раствора или межфазное натяжение между водным раствором и другой жидкостью, в результате чего увеличивается абсорбция олигонуклеотидов через слизистую оболочку. Помимо солей желчных кислот и жирных кислот, указанные усилители проникновения включают, например, лаурилсульфат натрия, полиоксиэтилен-9-лауриловый эфир, полиоксиэтилен-20цетиловый эфир (Ьее е! а1., СпЬса1 Ке\ае\\ъ ίη ТЬетареиЬс Эгид Сатег δу5!ет5, 1991, р. 92) и перфторхимические эмульсии, такие как РС-43 (ТакаИакЫ е! а1., 1. РЬагт. РЬагтасо1., 1988, 40, 252).
Жирные кислоты
Разные жирные кислоты и их производные, которые действуют в качестве усилителей проникновения, включают, например, олеиновую кислоту, лауриновую кислоту, каприновую кислоту (н-декановую кислоту), миристиновую кислоту, пальмитиновую кислоту, стеариновую кислоту, линолевую кислоту, линоленовую кислоту, дикапрат, трикапрат, моноолеин (1-моноолеоил-рац-глицерин), дилаурин, каприловую кислоту, арахидоновую кислоту, 1-монокапрат глицерина, 1-додецилазациклогептан-2-он, ацилкарнитины, ацилхолины, их сложные С1-10 алкиловые эфиры (например, метиловый, изопропиловый и трет-бутиловый), моно- и диглицериды (то есть олеат, лаурат, капрат, миристат, пальмитат, стеарат, линолеат и т.д.) (Ьее е! а1., СтШса1 Ке\ае\У5 ίη ТЬетареиЬс Эгид Сатег δу5!ет5, 1991, р. 92; МиганЫй, СгШса1 Ке\ае\У5 ίη ТЬетареиЬса1 Эгид Сатег δу5!ет5, 1990, 7, 1-33; Е1 Натт е! а1., 1. РЬагт. РЬагтасо1., 1992, 44, 651-654).
Соли желчных кислот
Физиологической функцией желчи является облегчение диспергирования и абсорбции липидов и жирорастворимых витаминов (Втип!оп, СЬар!ег 38 ίη: Оοοάтаη & ОПтагШ ТЬе РЬагтасо1од1са1 Ва515 о£
- 31 022207
ТЬегареийсз, 9411 Ей., Нагйтап е! а1. Ейз., МсОппу-НШ, №\у Уогк. 1996, рр. 934-935). Разные природные соли желчных кислот и их синтетические производные действуют в качестве усилителей проникновения. Таким образом, термин соли желчных кислот означает любые природные компоненты желчи, а также их синтетические производные. Соли желчных кислот по настоящему изобретению включают, например, холевую кислоту (или ее фармацевтически приемлемую соль натрия, холат натрия), дегидрохолевую кислоту (дегидрохолат натрия), дезоксихолевую кислоту (дезоксихолат натрия), глюхолевую кислоту (глюхолат натрия), глихолевую кислоту (гликохолат натрия), гликодезоксихолевую кислоту (гликодезоксихолат натрия), таурохолевую кислоту (таурохолат натрия), тауродезоксихолевую кислоту (тауродезоксихолат натрия), хенодезоксихолевую кислоту (хенодезоксихолат натрия), урсодезоксихолевую кислоту (иЭСА), тауро-24,25-дигидрофузидат натрия (8ТЭНР), гликодигидрофузидат натрия и полиоксиэтилен-9-лауриловый эфир (РОЕ) (Ьее е! а1., СгШса1 Ксу1С\уз ίη ТЬегареиЬс Эгид Сатег 8уз!етз, 1991, раде 92; 8тпуагй, СЬар!ег 39 Ιη: КеттдЮп'з РЬагтасеи!юа1 8с1епсез, 181Н Ей., Оеппаго, ей., Маск РиЬЬзЬьпд Со., ЕазЮп, Ра., 1990, радез 782-783; МигатзЫ, СгШса1 Ре\ае\уз ίη ТЬегареиЬс Эгид Сатег 8уз!етз,
1990, 7, 1-33; Υататοΐο е! а1., ί. РЬагт. Ехр. ТЬег., 1992, 263, 25; ΥатазЬ^ίа е! а1., ί. РЬагт. 8ск, 1990, 79, 579-583).
Хелатообразователи
Хелатообразователи, используемые в соответствии с целями настоящего изобретения, можно определить как соединения, удаляющие ионы металлов из раствора путем образования комплексов с указанными ионами металлов, в результате чего увеличивается абсорбция олигонуклеотидов через слизистую оболочку. Дополнительным преимуществом хелатообразователей, используемых в качестве усилителей проникновения в настоящем изобретении, является их воздействие в качестве ингибиторов ДНКазы, так как большинству исследованных ДНК-нуклеаз необходим ион двухвалентного металла для катализа, поэтому хелатообразователи ингибируют указанные нуклеизы Цагге!!, ί. СЬгота!одг., 1993, 618, 315-339). Хелатообразователи по настоящему изобретению включают, не ограничиваясь ими, динатрийэтилендиаминотетраацетат (ТЭТА), лимонную кислоту, салицилаты (например, салицилат натрия, 5метоксисалицилат и гомованилат), ^ацильные производные коллагена, лаурет-9 и ^аминоацильные производные бета-дикетонов (энамины) (Ьее е! а1., СгШса1 Ке\ае\уз ίη ТЬегареиЬс Эгид Сатег 8уз!етз,
1991, р. 92; МигатзЫ, СЬЬса1 Ке\ае\уз ίη ТЬегареиЬс Эгид Сатег 8уз!етз, 1990, 7, 1-33; Вииг е! а1., ί. Соп!го1 Ке1., 1990, 14, 43-51).
Не образующие хелатов вещества, не являющиеся поверхностно-активными веществами
Соединения, усиливающие проникновение, которые не образуют хелатов и не являются поверхностно-активными веществами, можно определить как соединения, которые обладают незначительной активностью в качестве хелатообразователей или поверхностно-активных веществ, но тем не менее увеличивают абсорбцию олигонуклеотидов через слизистую оболочку пищеварительного тракта (МигатзЫ, СЬЬса1 Ре\ае\уз ίη ТЬегареиЬс Эгид Сатег 8уз!етз, 1990, 7, 1-33). Усилители проникновения данного класса включают, например, ненасыщенные циклические мочевины, производные 1-алкил- и 1алкенилазациклоалканонов (Ьее е! а1., СЬЬса1 Ре\ае\уз ίη ТЬегареиЬс Эгид Сатег 8уз!етз, 1991, раде 92) и нестероидные противовоспалительные агенты, такие как диклофенак-натрий, индометацин и фенилбутазон (ΥатазЬ^!а е! а1. ί. РЬагт. РЬагтасо1., 1987, 39, 621-626).
Агенты, усиливающие поглощение олигонуклеотидов на клеточном уровне, также могут быть добавлены в фармацевтические и другие композиции по настоящему изобретению. Например, известно, что катионные липиды, такие как липофектин ЦитсЫ е! а1., патент США № 5705188), катионные производные глицерина и поликатионные молекулы, такие как полилизин (Ьо11о е! а1., заявка РСТ \У0 97/30731), также усиливают поглощение олигонуклеотидов клеткой.
Для усиления проникновения вводимых нуклеиновых кислот могут быть использованы другие агенты, включающие гликоли, такие как этиленгликоль и пропиленгликоль, пирролы, такие как 2пиррол, азоны и терпены, такие как лимонен и ментон.
Другие компоненты
Композиции по настоящему изобретению могут дополнительно содержать другие вспомогательные компоненты, обычно используемые в фармацевтических композициях, в количестве, установленном в данной области. Так, например, композиции могут содержать дополнительные совместимые фармацевтически активные вещества, такие как, например, противозудные средства, вяжущие средства, местные анестетики или противовоспалительные средства, либо могут содержать дополнительные вещества, используемые в получаемых физическими методами разных лекарственных формах, включающих композиции по настоящему изобретению, такие как красители, ароматизаторы, консерванты, антиоксиданты, контрастные вещества, загустители и стабилизаторы. Однако такие вещества не должны отрицательно влиять на биологическую активность компонентов композиций по настоящему изобретению. Препараты могут быть стерилизованы и при желании смешаны с вспомогательными агентами, такими как, например, смазывающие вещества, консерванты, стабилизаторы, смачивающие вещества, эмульгаторы, соли, влияющие на осмотическое давление, буферы, красители, ароматизаторы и/или ароматические вещества и тому подоблные, которые не оказывают вредного влияния при взаимодействии с нуклеиновыми кислотами препарата.
- 32 022207
Водные суспензии могут содержать вещества, повышающие вязкость суспензии, которые, например, включают натрий-карбоксиметилцеллюзу, сорбит и/или декстран. Суспензия может также содержать стабилизаторы.
Определенные варианты осуществления изобретения относятся к фармацевтическим композициям, содержащим: (а) одно или несколько антисмысловых соединений и (Ь) одно или несколько других химиотерапевтических средств, действующих по принципу антисмыслового механизма. Примеры таких химиотерапевтических средств включают, не ограничиваясь ими, даунорубицин, дауномицин, дактиномицин, доксорубицин, эпирубицин, идарубицин, эзорубицин, блеомицин, мафосфамид, ифосфамид, цитозинарабинозид, бисхлорэтилнитромочевину, бусульфан, митомицин С, актиномицин Ό, митрамицин, преднизон, гидроксипрогестерон, тестостерон, тамоксифен, дакарбазин, прокарбазин, гексаметилмеламин, пентаметилмеламин, митоксантрон, амсакрин, хлорамбуцил, метилциклогексилнитромочевину, азотистый иприт, мелфалан, циклофосфамид, 6-меркаптопурин, 6-тиогуанин, цитарабин, 5-азацитидин, гидроксимочевину, дезоксикоформицин, 4-гидроксипероксициклофосфорамид, 5-фторурацил (5-РИ), 5фтордезоксиуридин (5-ΡυάΚ), метотрексат (МТХ), колхицин, таксол, винкристин, винбластин, этопозид (УР-16), триметрексат, иринотекан, топотекан, гемцитабин, тенипозид, цисплатин и диэтилстилбестрол (ΌΕ8). См., например, публикацию ТЬе Мегск Маииа1 οί Όίαβηοδίδ аиЬ ТЬегару, 15ΐΗ Εά., 1987, рр. 12061228, Вегкоте е! а1., еЙ8., КаЬтеау, Ν.Τ При использовании с соединениями по настоящему изобретению такие химиотерапевтические средства можно вводить отдельно (например, 5-Ρυ и олигонуклеотид), последовательно (например, 5-Ρυ и олигонуклеотид с последующим введением через определенный период времени МТХ и олигонуклеотида) или в комбинации с одним или несколькими другими такими химиотерапевтическими средствами (например, 5-Ρυ, МТХ и олигонуклеотид или 5-Ρυ, лучевая терапия и олигонуклеотид). В композиции по настоящему изобретению могут быть также объединены противовоспалительные средства, которые включают, не ограничиваясь ими, нестероидные противовоспалительные средства и кортикостероиды, и антивирусные средства, которые включают, не ограничиваясь ими, рибивирин, видарабин, ацикловир и ганцикловир. См., например, публикацию ТЬе Мегск Маииа1 οί П1адио818 аий ТЬегару, 15!Ь Εά., Вегкоте е! а1., еά8., 1987, КаЬтеау, Ν.Τ, раде8 2499-2506 ηπά 46-49). В объем настоящего изобретения также входят другие неантисмысловые химиотерапевтические средства. Два или более объединенных соединений могут быть использованы вместе или последовательно. В другом родственном варианте осуществления изобретения композиции по настоящему изобретению могут содержать одно или несколько антисмысловых соединений, в частности, олигонуклеотидов, направленно воздействующих на первую нуклеиновую кислоту, и одно или несколько дополнительных антисмысловых соединений, направленно воздействующих на вторую нуклеиновую кислоту-мишень. В данной области известны многочисленные примеры антисмысловых соединений. Два или более объединенных соединений могут быть использованы вместе или последовательно.
Антисмысловые соединения, используемые в соответствии с настоящим изобретением, могут быть получены стандартным хорошо известным методом твердофазного синтеза. Оборудование для такого синтеза продают несколько поставщиков, в том числе, например, компания Αрр1^еά Вю8у8!ет8 (Ро8!ег СЬу, СаПГ.). Могут быть дополнительно или альтернативно использованы любые другие средства для такого синтеза, известные в данной области. Хорошо известно применение подобных методов для получения олигонуклеотидов с использованием таких веществ как фосфортиоаты и алкилированные производные.
Антисмысловые соединения по настоящему изобретению синтезируют ш νίίτο. и они не включают антисмысловые композиции биологического происхождения или генетические векторные конструкции, предназначенные для направления синтеза антисмысловых молекул ш νίνο. Соединения по настоящему изобретению могут быть также смешаны, инкапсулированы, конъюгированы или каким-либо другим способом связаны с другими молекулами, молекулярными структурами или смесями соединений, такими как, например, липосомы, молекулы, направленно воздействующие на рецепторы, препараты для перорального, ректального, местного введения или другие препараты, препараты для активации поглощения, распределения и/или абсорбции. Репрезентативные патенты США, в которых описано получения таких препаратов, способствующих поглощению, распределению и/или абсорбции, включают, не ограничиваясь ими, патенты США №№ 5108921, 5354844, 5416016, 5459127, 5521291, 5543158, 5547932, 5583020, 5591721, 4426330, 4534899, 5013556, 5108921, 5213804, 5227170, 5264221, 5356633, 5395619, 5416016, 5417978, 5462854, 5469854, 5512295, 5527528, 5534259, 5543152, 5556948, 5580575 и 5595756, которые включены в настоящее описание изобретения в качестве ссылки.
Определенные показания
Специалисты в данной области используют специфичность и чувствительность антисмысловых соединений в терапевтических целях. Антисмысловые олигонуклеотиды используются при лечении заболеваний у животных и человека. Лекарственные средства на основе антисмысловых олигонуклеотидов, включающие рибозимы, которые предназначены для безопасного и эффективного введения людям, в настоящее время проходят клинические исследования. Таким образом установлено, что олигонуклеотиды являются полезными терапевтическими средствами, которые могут быть сконфигурированы в соответствии со схемами лечения для лечебного воздействия на клетки, ткани и животных, в частности, че- 33 022207 ловека.
Определенный вариант осуществления изобретения относится к способу лечения заболевания или состояния, ассоциированного с экспрессией СТОР, которое является гиперпролиферативным нарушением, включающим рак молочной железы, предстательной железы, почки, поджелудочной железы, головы и шеи, желудка и множественную миелому (см. публикации Рюк1е5 М апй Ьеакк А, 1 Се11 Соттип 81дпа1. 2007 8ер; 1 (2): 85-90. Ерик 2007 Йи1 17; Ми1к5 Т.С., Тапд X., Скопу К.Т., 1 Скп Ра1ко1. 2008 Мау; 61(5) :606-10; Ни НУ., е1 а1. \Уог1й 1 СаШгоеШегок 2008 Арг 7; 14(13) :2110-4; Скт1а1арий1 М.К., е1 а1., Сагстодепе818. 2008 Арг;29 (4) : 696-703. Ерик 2008 1ап 22; Мипетаза 8., е1 а1. Вг 1 НаетаЮк 2007 0с1; 139 (1):4150; 8Ыто Т., е! а1. 1 Вопе Мшег Ке8. 2006 1и1; 21 (7):1045-59 и Уапу Р., е! а1. Сапсег Ке8. 2005 0с1 1; 65(19): 8887-95 .)
В одном варианте осуществления изобретения указанный способ включает лечение заболевания или состояния, являющегося фиброзным заболеванием. В одном варианте осуществления способа по настоящему изобретению фиброзное заболевание является гипертрофическим рубцеванием, келоидами, рубцеванием кожи, фиброзом печени, фиброзом легких, фиброзом почки, фиброзом сердца или рестенозом.
В другом варианте осуществления изобретения указанный способ далее включает лечение вышеуказанного заболевания или состояния, являющегося фиброзом сустава (включая плечелопаточный периартрит, повреждение сухожилия и периферического нерва), повреждением спинного мозга, коронарным шунтированием, спайками в животе и брюшине (включая эндометриоз, лейомиоматоз и фибромы матки), радиальной кератотомией и фоторефрактивной кератектомием, операцией по реплантации сетчатки, фиброзом, вызванным устройством (как, например, в случае диабета), сращением сухожилий, контрактурой Дюпюитрена или склеродермией.
Другой вариант осуществления изобретения относится также к способу уменьшения гипертрофического рубцевания в процессе заживления раны кожи у нуждающегося субъекта, который включает введение указанному субъекту соединения антисмыслового олигонуклеотида в количестве, достаточном для ингибирования экспрессии фактора роста соединительной ткани (СТОР) у субъекта. Указанным субъектом может быть человек или животное, отличное от человека.
Специалистам в данной области должны быть известны способы получения терапевтических композиций и их последующего введения. Величина дозы зависит от тяжести и восприимчивости подлежащего лечению заболеванию, при этом продолжительность курса лечения составляет от нескольких дней до нескольких месяцев либо до полного выздоровления или ослабления симптомов заболевания. Оптимальные схемы введения можно определить на основании измерений накопления лекарственного средства в организме субъекта. Специалисты могут легко определить оптимальную дозу, способы дозирования и частоту повторного введения. Оптимальные дозы могут изменяться в зависимости от относительной эффективности отдельных олигонуклеотидов и могут быть определены с учетом значения ЕС50, оказывающего эффективное воздействие ш νίΙΐΌ и в животных моделях ш νί\Ό. Как правило, доза составляет от 0,01 мкг до 100 г/кг массы тела и может быть введена один или несколько раз в день, неделю, месяц или год или даже один раз в период от 2 до 20 лет. Специалисты в данной области могут легко определить частоту повторного введения на основании измеренного времени пребывания и концентраций лекарственного средства в жидкостях или тканях организма. После успешного лечения может быть желательно, чтобы субъект прошел курс поддерживающей терапии для предотвращения рецидива заболевания, при выполнении которого олигонуклеотид вводят в поддерживающих дозах, сотавляющих от 0,01 мкг до 100 г/кг массы тела, вводимых один или несколько раз в день или один раз каждые 20 лет.
В другом варианте осуществления изобретения указанный способ далее включает уменьшение гипертрофического рубцевания в процессе заживления раны кожи, выбираемой из группы, состоящей из повреждения кожи, хирургических разрезов и ожогов.
Определенные варианты осуществления изобретения относятся к способам лечения субъекта, которые включают введение одной или нескольких фармацевтических композиций по настоящему изобретению. В определенных вариантах осуществления изобретения субъект имеет одно из вышеуказанных нарушений. В определенных вариантах осуществления изобретения субъект подвержен риску возникновения одного из вышеуказанных нарушений. В определенных вариантах осуществления изобретения субъект признан нуждающимся в лечении. Определенные варианты осуществления изобретения относятся к способам профилактического уменьшения экспрессии СТОР у субъекта.
Определенные варианты осуществления изобретения относятся к лечению нуждающегося субъекта путем введения указанному субъекту терапевтически эффективного количества антисмыслового соединения, направленно воздействующего на нуклеиновую кислоту СТОР.
В одном варианте осуществления изобретения введение терапевтически эффективного количества антисмыслового соединения, направленно воздействующего на нуклеиновую кислоту СТОР, сопровождается контролированием уровней СТОР в сыворотке субъекта для определения реакции субъекта на введение антисмыслового соединения. На основании реакции субъекта на введение антисмыслового соединения лечащий врач определяет количество вводимого лекарственного средства и продолжительность терапевтического воздействия.
- 34 022207
В одном варианте осуществления изобретения введение антисмыслового соединения, направленно воздействующего на нуклеиновую кислоту СТСР, вызывает уменьшение экспрессии СТСР по меньшей мере на 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 99% либо в интервале, определяемом любыми двумя указанными значениями. В одном варианте осуществления изобретения введение антисмыслового соединения, направленно воздействующего на нуклеиновую кислоту СТСР, вызывает изменение уровня СТСР, измеренного стандартным методом. В некоторых вариантах осуществления изобретения антисмысловое соединение против СТСР вызывает увеличение уровня по меньшей мере на 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 90, 95 или 99% либо в интервале, определяемом любыми двумя указанными значениями. В некоторых вариантах осуществления изобретения введение антисмыслового соединения против СТСР уменьшает уровень по меньшей мере на 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 99% либо в интервале, определяемом любыми двумя указанными значениями.
В определенных вариантах осуществления изобретения фармацевтическую композицию, включающую антисмысловое соединение, направленно воздействующее на СТСР, используют для получения лекарственного средства, предназначенного для лечения субъекта, страдающего или подверженного возникновению любого из вышеуказанных нарушений.
Определенные методы комбинированной терапии
В определенных вариантах осуществления изобретения одну или несколько фармацевтических композиций по настоящему изобретению вводят вместе с одним или несколькими другими фармацевтическими агентами. В определенных вариантах осуществления изобретения такие один или несколько других фармацевтических агентов предназначены для лечения того же заболевания или состояния, что и одна или несколько фармацевтических композиций по настоящему изобретению. В определенных вариантах осуществления изобретения такие один или несколько других фармацевтических агентов предназначены для лечения другого заболевания или состояния, отличного от заболевания, на которое воздействуют одна или несколько фармацевтических композиций по настоящему изобретению. В определенных вариантах осуществления изобретения такие один или несколько других фармацевтических агентов предназначены для лечения нежелательного эффекта одной или нескольких фармацевтических композиций по настоящему изобретению. В определенных вариантах осуществления изобретения одну или несколько фармацевтических композиций по настоящему изобретению вводят вместе с другим фармацевтическим агентом для лечения нежелательного эффекта указанного другого фармацевтического агента. В определенных вариантах осуществления изобретения одну или несколько фармацевтических композиций по настоящему изобретению и один или несколько других фармацевтических агентов вводят одновременно. В определенных вариантах осуществления изобретения одну или неколько фармацетических композиций по настоящему изобретению и один или несколько других фармацевтических агентов вводят в разное время. В определенных вариантах осуществления изобретения одну или несколько фармацевтических композиций по настоящему изобретению и один или несколько других фармацевтических агентов получают вместе в одном препарате. В определенных вариантах осуществления изобретения одну или несколько фармацевтических композиций по настоящему изобретению и один или несколько других фармацевтических агентов получают отдельно.
В определенных вариантах осуществления изобретения фармацевтические агенты, которые могут быть введены вместе с фармацевтической композицией по настоящему изобретению, включают второе лекарственное средство. В таких определенных вариантах осуществления изобретения фармацевтические агенты, которые могут быть введены вместе с фармацевтической композицией по настоящему изобретению, включают, не ограничиваясь им, второе лекарственное средство. В таких определенных вариантах осуществления изобретения второе лекарственное средство вводят до введения фармацевтической композиции по настоящему изобретению. В таких определенных вариантах осуществления изобретения второе лекарственное средство вводят после введения фармацевтической композиции по настоящему изобретению. В таких определенных вариантах осуществления изобретения второе лекарственное средство вводят одновременно с фармацевтической композицией по настоящему изобретению. В таких определенных вариантах осуществления изобретения доза совместно вводимого второго лекарственного средства равнозначна дозе, вводимой при отдельном использовании второго лекарственного средства. В таких определенных вариантах осуществления изобретения доза совместно вводимого второго лекарственного средства меньше дозы, вводимой при отдельном использовании второго лекарственного средства. В таких определенных вариантах осуществления изобретения доза совместно вводимого второго лекарственного средства больше дозы, вводимой при отдельном использовании второго лекарстенного средства.
В определенных вариантах осуществления изобретения совместное введение второго соединения усиливает терапевтический эффект первого соединения, поэтому совместное введение указанных соединений вызывает более сильный терапевтический эффект по сравнению с отдельным введением первого соединения, именуемый синергическим эффектом. В других вариантах осуществления изобретения совместное введение вызывает терапевтический эффект, который является аддитивным по сравнению с эффектами, достигаемыми при отдельном введении указанных соединений. В других вариантах осуще- 35 022207 ствления изобретения совместное введение вызывает терапевтический эффект, который является сверхаддитивным по сравнению с эффектами, достигаемыми при отдельном введении указанных соединений. В некоторых вариантах осуществления изобретения первое соединение является антисмысловым соединением. В некоторых вариантах осуществления изобретения второе соединение является антисмысловым соединением.
Настоящее изобретение проиллюстрировано нижеследующим экспериментальным разделом. Указанный раздел служит для лучшего понимания изобретения, но не ограничивает объем изобретения, представленного в формуле изобретения, приведенной далее в настоящем описании изобретения.
Примеры
Пример 1. Культура клеток и воздействие антисмысловыми соединениями
Воздействие антисмысловых соединений на уровень, активность или экспрессию нуклеиновых кислот СТСР можно исследовать ίη νίίΐΌ в клетках разных типов. Клетки разных типов, используемые для таких анализов, можно приобрести у коммерческих поставщиков (например, в Американской коллекции типовых культур, Мапаккик, УА; 2еп-Вю, 1пс., КекетсН Тпапд1е Рагк, N0’; С1опейск Согрогайоп, ^а1кеткуШе, МО); клетки культивируют в соответствии с инструкциями поставщика, используя коммерчески доступные реагенты (например, 1пуйтодеп ЫГе ТесЬпо1од1ек, Саг1кЬай, СА). Иллюстративные типы клеток включают, не ограничиваясь ими, клетки НерС2, клетки НерЗВ и первичные гепатоциты.
Пример 2. Исследование антисмысловых олигонуклеотидов ш νίΙΐΌ
В данном примере описаны способы обработки клеток антисмысловыми олигонуклеотидами, которые могут быть модифицированы соответствующим образом для обработки другими антисмысловыми соединениями.
Как правило, клетки обрабатывают антисмысловыми олигонуклеотидами после достижения клетками примерно 60-80% слияния в культуре.
Одним реагентом, обычно используемым для введения антисмысловых олигонуклеотидов в культивируемые клетки, является реагент для трансфекции катионных липидов липофектин® (Ыуйтодеп, Сат1кЬай, СА). Антисмысловые олигонуклеотиды смешивают с липофектином® в среде ОРТ1-МЕМ® 1 (фуйтодеп, Сат1кЬай, СА) до достижения требуемой конечной концентрации антисмыслового олигонуклеотида и концентрации липофектина®, которая обычно находится в пределах от 2 до 12 мкг/мл на 100 нМ антисмыслового олигонуклеотида.
Другим реагентом, используемым для введения антисмысловых олигонуклеотидов в культивируемые клетки, является липофектамин® (1пуПгодеп, Сат1кЬай, СА). Антисмысловой олигонуклеотид смешивают с липофектамином® в восстановленной сывороточной среде ОРТ1-МЕМ® 1 (Ыуйтодеп, Сат1кЬай, СА) до достижения требуемой концентрации антисмыслового олигонуклеотида и концентрации липофектамина®, которая обычно находится в пределах от 2 до 12 мкг/мл на 100 нМ антисмыслового олигонуклеотида.
Клетки обрабатывают антисмысловыми олигонуклеотидами стандартными методами. Клетки обычно собирают через 16-24 ч после обработки антисмысловым олигонуклеотидом и измеряют уровни РНК или белка нуклеиновых кислот-мишеней методами, известными в данной области и расмотренными в настоящем описании изобретения. Как правило, если обработку производят в нескольких репликах, то данные выражают в виде среднего значения обработанных реплик.
Используемая концентрация антисмыслового олигонуклеотида может быть различной в разных линиях клеток. В данной области хорошо известны методы определения оптимальной концентрации антисмысловых олигонуклеотидов для конкретной линии клеток. Антисмысловые олигонуклеотиды обычно используют в концентрациях от 1 до З00 нМ.
Пример З. Выделение РНК
Анализы РНК могут быть выполнены с использованием полной клеточной РНК или поли(А)+ мРНК. Методы выделения РНК хорошо известны в данной области. РНК получают методами, хорошо известными в данной области, например, при помоци реагента тризол® (Фуйтодеп, Сат1кЬай, СА) в соответствии с рекомендациями производителя.
Пример 4. Анализ ингибирования уровней или экспрессии мишени
Ингибирование уровней или экспрессии нуклеиновой кислоты СТСР можно исследовать разными способами, известными в данной области. Например, можно произвести количественное определение уровней нуклеиновой кислоты-мишени при помощи анализа методом нозерн-блоттинга, конкурентной полимеразной цепной реакции (ПЦР) или количественной ПЦР в реальном времени. Анализ РНК может быть выполнен с использованием полной клеточной РНК или поли(А)+ мРНК. Методы выделения РНК хорошо известны в данной области. Анализ методом нозерн-блоттинга также является стандартным в данной области. Количественную ПЦР в реальном времени можно выполнить, используя коммерчески доступную систему обнаружения последовательностей АВ1 РК18М® 7600, 7700 или 7900, поставляемую компанией РЕ-АррНей Вюкук!етк, Рок!ег СПу, СА, в соответствии с инструкциями производителя.
Пример 5. Анализ уровней РНК-мишени методом количественной ПЦР в реальном времени
Количественное определение уровней РНК-мишени можно произвести методом количественной
- З6 022207
ПЦР в реальном времени с использованием системы обнаружения последовательностей ΑΒΙ РВ18М® 7600, 7700 или 7900 (РΕ-Αрр1^еб ВккукЮтк, Рок1ег Сйу, СΑ) в соответствии с инструкциями производителя. Методы количественной ПЦР в реальном времени хорошо известны в данной области.
До выполнения ПЦР в реальном времении выделенную РНК подвергают взаимодействию с обратной транскриптазой (ВТ), в результате которого образуется комплементарная ДНК (кДНК), которую затем используют в качестве субстрата для амплификации с помощью ПЦР в реальном времени. Взаимодействие с ВТ и ПЦР в реальном времени выполняют последовательно в одной лунке для образца. Реагенты для ВТ и ПЦР в реальном времени предоставляет компания йлйгодеп (СагкЪаб, СΑ). Взаимодействие с ВТ и ПЦР в реальном времени выполняют методами, хорошо известными специалистам в данной области.
Количество гена-мишени (или РНК), полученное в результате выполения ПЦР в реальном времени, нормализуют относительно уровня экспрессии гена с постоянной экспрессией, такого как циклофилин А, или путем количественного определения полной РНК с использованием рибогрина® (1п\а1годеп, 1пс., СагкЪаб, СΑ). Количественное определение экспрессии циклофилина А производят при помощи ПЦР в реальном времени, выполняемой одновременно с анализом мишени в виде многоканального анализа, или отдельно. Количественное определение полной РНК производят, используя реагент для количественного определения РНК рибогрин® (1п\а1годеп, 1пс., Εидепе, ОВ). Методы количественного определения РНК с помощью рибогрина® описаны в публикации 1опек, Ь.Р е! а1. (Αпа1уйса1 В|осНет151гу, 1998, 265, 368374). Флуоресценцию рибогрина® измеряют при помощи устройства Су1оПиог® 4000 (РЕ Αрр1^еб ВюкукЮтк).
Создают зонды и затравки, предназначенные для гибридизации с нуклеиновой кислотой СТСР. Методы создания зондов и затравок для ПЦР в реальном времени хорошо известны в данной области, и для их создания может быть использовано такое программное обеспечение как Рйтег Εxр^е55® ^ррйеб ВюкукЮтк, Рок1ег Сйу, СΑ).
Пример 6. Анализ уровней белка
Ингибирование нуклеиновых кислот СТСР антисмысловыми соединениями можно определить, измеряя уровни белка СТСР. Количественное определение уровней белка СТСР можно выполнить разными способами, хорошо известными в данной области, такими как иммунопреципитация, анализ методом вестерн-блоттинга (иммуноблоттинг), описанный в приведенном ниже примере 9, твердофазный иммуноферментный анализ (ΕΜ8Α), количественные анализы белка, анализы активности белка (например, анализы активности каспазы), иммуногистохимия, иммуноцитохимия или сортировка клеток с возбуждением флуоресценции (РΑС8). Можно выявить антитела против мишени и приобрести их из разных источников, таких как каталог антител М8В8 ^ейе Согрогайоп, ВйттдНат, ΜΙ), или получить стандартными методами создания моноклональных или поликлональных антител, хорошо известными в данной области. Антитела, пригодные для обнаружения СТСР человека и крысы, можно приобрести коммерческим путем.
Пример 7. Испытание антисмысловых соединений ш νί\Ό
Антисмысловые соединения, например, антисмысловые олигонуклеотиды, испытывают на животных для оценки их способности ингибировать экспрессию СТСР и вызывать фенотипические изменения. Испытание может быть произведено с использованием здоровых животных или в экспериментальных моделях заболеваний. Антисмысловые олигонуколеотиды, предназначенные для введения животным, получают в фармацевтически приемлемом разбавителе, таком как физиологический раствор с фосфатным буфером. Препарат вводят парентерально в виде внутрибрюшинной, внутривенной и подкожной инъекции. Доза и частота введения антисмыслового олигонуклеотида должна быть определена специалистами в данной области с учетом таких факторов как способ введения и масса тела животного. После окончания введения антисмысловых олигонуколеотидов из ткани печени выделяют РНК и определяют изменения в экспрессии нуклеиновой кислоты СТСР. Изменения уровней белка СТСР также определяют методами, описанными в приведенном выше примере 6.
Пример 8. Выбор наиболее эффективных антисмысловых олигонуклеотидов-кандидатов против фактора роста соединительной ткани человека
Введение
В соответствии с настоящим изобретением был создан ряд олигонуклеотидов, направленно воздействующих на разные области РНК фактора роста соединительной ткани человека, с использованием опубликованных последовательностей (последовательность под номером доступа в СепВапк NΜ_001901.2, которая включена в настоящее описание изобретения как 8ΕΟ ГО N0:9, и последовательность под номером доступа в СепВапк ΝΓ_025741.14, которая включена в настоящее описание изобретения как 8ΕΟ ГО N0:10).
Целью данного исследования является определение соответствующей области последовательности и модифицированных антисмысловых олигонуклеотидов, направленно воздействующих на области экзонов и интронов СТСР. Для каждой мишени было синтезировано примерно 150 новых последовательностей, которые оценивали в отношении активности против СТСР в культуре клеток. Указанные олиго- 37 022207 нуклеотиды приведены в табл. 1. Все соединения, приведенные в табл. 1, являются химерными олигонуклеотидами (соединениями с разрывом), состоящими из 20 нуклеотидов, которые включают центральную область разрыва, состоящую соответственно из десяти 2'-дезоксинуклеотидов, фланкированных с обеих сторон (5' и 3' направления) боковыми сегментами из пяти нуклеотидов, или из 13 2'дезоксинуклеотидов, фланкированных с обеих сторон (5' и 3' направления) боковыми сегментами из двух и пяти нуклеотидов. Боковые сегменты состоят из 2'-метоксиэтильных (2'-МОЕ) нуклеотидов. Межнуклеозидные (остовные) связи являются фосфортиоатными связями (Р=8) во всем олигонуклеотиде. Все остатки цистидина являются 5-метилцистидинами. Соединения анализировали в отношении их воздействия на уровни мРНК фактора роста соединительной ткани человека при помощи количественной ПЦР в реальном времени, описанной в других примерах, приведенных в настоящем описании изобретения. Полученные данные представляют собой средние значения для двух экспериментов. Аббревиатура Ν.Ό. означает данных нет.
Таблица 1
Ингибирование уровней мРНК фактора роста соединительной ткани человека химерными олигонуклеотидами с фосфортиоатными связями, имеющими 2'-М0Е боковые оегменты и разрыв из дезоксинуклеотидов
1315 # ОБЛАСТЬ бЕОЮМО иишени САЙТ МИШЕНИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ % ИНГИБИРОВАНИЯ 5ЕЗ ΙΟ ΝΟ.
124173 СОЗ 9 380 ССАЗСТССТТСЗОСОСАСАСС 35 11 ί
124189 СОЗ , 9 , 1003 СССАСАААССТСАААСТТСА 57 12 г
124212 з-итк 9 1783 ССАСААССТСТССАСТСТАА 47 13 ί
124235 З'-ОТК 9 2267 , ССТСАСАСТСТСААСАААТА 47 ......14 ί
124238 З’-итк 9 2282 АААСАТСТААСТТТТСаТСА 53 15
412271 5’ШТК 9 4 СООААСАСТГТСТГСТОТСАО 0 16 ί
412272 5·-υτκ 9 ' 38 АСССТССАСТСССАСТСССТ 46 . 17 ;
412273 СОЗ 9 228 АССААССССАСССССАСССС 35 18 ;
412274 СОЗ 9 265 ССССАСССССЙОССОССТСС 40 . 19
412275 СОЗ 9 475 ССТССАСАСОСССАТСТТСС . 52 ; 20 ί
: 412276 СОЗ 9 483 ТСТТТСССССТССАСАСССС . 0 21 ί
412277 СОЗ 9 489 ССАССАТСТТТСССССТЭСА 0 ' 22 -
- 38 022207
' 412278 СБЗ 9 496 (
412279 СОЗ 9 501 1
412280 СОЗ 9 507 <
, 412281 . СО5 9 512 (
; 412282 СОЗ ‘ 9 553 1 <
412283 СОЗ I 9 592 ( <
ι 412284 Соб 9 718
, 412285 СОЗ 9 723
412286 СОЗ 9 732
412287 СОЗ ’ 9 829 (
' 412288 Соз 9 ‘ 839
412289 З’-ита 9 1273 <
”412290 • З'-ита 9 1281
412291 З’-ОТЙ 9 1361
412292 3·-υτκ 9 ' 1388 < —N
412293 З'-ита 9 1394
412294 ι З’-ита 1 9 . 1399 <
1 412295 ί З'-итя • 9 1404
З’-ита З’-ита З'-ита’ 3· -итк з· -ига з'-ΰτκ _3';итк_ З’-ита
: 412304 “ ”’з'· -ига ' 'э - . 1554 '
412305 3'-итн 9 1559 .
412306 , З’-итя . 9 ι 1577 .
412307 з'-ита 9 1586
412308 З’-ита 9 1591 '
412309 З'-итя 9 . 1659 :
412310 З’-итя 9 1665
412311 З'-ита 9 1670
Γ 412312 з-ига э : 1729
412313 З'-ита , 9 1946
• 412314 З’-ита 9 1952 ·
, 412315 э1 -ига 9 1958 ·
/412316 З’-ита 9 , 1965 ,
412317 З’-ита 9 1971
412318 З’-ита 9 1976
412319 з-итк 9 1982
412320 З'-итя 9 1991
412321 з'-итк 9 1996
412322 З’-ОТЙ 9 2007
412323 З’-итк 9 2012
412324 з·-итк 9 2018
412325 з1-итк 9 : 2026
412326 з’-итк 9 2032 1
412327 з’-итя 9 2040 ?
412328 з г-итн 9 2050
412329 з1-итк 9 2060
412330 з1-итк 9 2070
412331 з'-итк 9 2086
412332 З'-ита 9 2100 1
412333 3-итк 9 2105
412334 З'-ОТК 9 . 2110
412335 . з1-итк 9 - 2115
; 412336 З'-итк 9 2120 1
412337 з1-итк 9 2128
412338 З'-итк 9 ’ 2134 1
бСАОССАОСАССАТСТТТОС аасатссасссассассатс ССАСССААСАТССАОООАСС _ СССТАССАСССААСАТ5СА0 СТАСТТССАССТССТСТС^А СЙЗОСАТвСАССССАСССССС АСССССААССАССОТТТССТ АООССАСССССААССАССОТ ТААЗССССОАОМСАОЗССС СССАСАОСТСТПЗСААСАОС ‘ АОАТССССАТСССАСАСОТС ’ ССАОТСТААТСАСТТААТСТ ТТСААСТТССАОТСТААТСА ТТТТСССССАбТТАОААААА САСААТОТТтаСААТТаСОТ АСАТСХ^АСААТСТТТТСАА СТТтеАСАТОССАСААТСТТ-’ ТАТТООТСАС^ОДОАСА 1412 ТСАТАОАСТАТТТ«ЗТТТСАС 145? ' · сттс<^тстсмстсттаа2 1469 ’ ^’ТОТАСТААТСТАетТССАСТ 1482_ ] СА^ТСТ^ТОСТСТСТЙСТА 1489 Т^ТАТАСМ^ТОСТССТС ' 14952 асассггаагатасаттсто _1_502_г ТАААСССАСАССТТААТАТА
1520 ’ ОТАСССТСССАСТОСТССТА Г ААСАТССТАТСТОАТСАТАС “ ССТАТААСАТССТАТСТСАТ ' ААТАССАСбСАТАТТАСТСС ^ТАСАСТТСАЛАТАОСАСЗОСА ' ТСААТТАСАСТТСАААТАОС ; СИАСААТОСАСАТССТАССТ атссзстссасздатссасатсГ' * ТС^АТСОСТССАСААТСС ' СААТСАСААСбТСАСАЗСТС^ САТТСАААТАТСАААОСАТТ
СССТАкСАТТОАААТАТСАА
ААТГбАбОСТААСАТТбААА _
6ТТСАСАААТТСАСССТААС
ТАТССТаТГСАОЛААТТСАС
СТАССТАТСОТОТТСАСААА
ТАСАТТСТАССТАТССТСТТ
ОАСААдсТТТАСАТТСТАСС ~
САГСАСАСААОСТТТАСАТТ '
АТССТТТОААССАТСАеАСА
АТТТСАТССТТТСААСОАТС
СТАТССАТТГСАТОСТТТОА
2ссататаастатссатттса’“ оаатг*гссататаастатсс ’тстсассасаатттссатат
ТСТСАТТСТАТСТОАОСАСА ТТТСАСССаС^ТСАТТСТА ’^СМТСТСТТТОАСОСАС 2 _ тддТОСС'ГССССТТТССААА' ϊ ТгёСААОСАСАСТСАТСССг/ ' саосстсс'саасоасастса 1 ОАААТСАдССТСССААСЗСАС ” асстаоааатсаосстосса ; ТТССТАССТАСАААТСАССС ТАССАСА'ГЙССТАССТАСА 1 ТСАСССТАССАСАТТТССТА
16 ' 23 1
63 24 '1
0 25 1
47 . 26 [
68 ! 27 1
72 28
59 ' 29 !
79 30
55 31 1
30 32 ;
55 33
56 34 ,
10 35
38 36 ί
50 ’ 67 37 | ~'38’~]
73 ” 74 35 39 ”40' ’ ϊ 41 Ί
55 42 ί
69 43 1
86 44
76 45 Ε
54 ι 46 (
54 ι 47 ,
53 «
52 49
69 50
74 , 5Ϊ ί
37 66 1
64 , ~(Л ’
44 68 ·
60 70 ;
48
28 71 >
58 72 '
61 73 ί
47 74 '
48 75 ,
53 76 ·
68 77
75 78 *
60 79 1
46 80 1
51 81 1
59 82 ι
0 83 ;
- 39 022207
, 412339 З’-ϋΤΚ 9 2 2140 ! тааааотсассстассасат ’ 48 84
412340 З'-итк 9 2213 САААТССТТССАССТбАААА ΐ 49 85
412341 ' з'-итк 9 2219 ТАСАААСАААТбСТТССАбб бб 86
412342 з-итк 9 2230 ТСАТАТСАААбТАбАААСАА 12 87
412343 З'-υτκ 9 2242 ТССОАААААСАбТСАТАТСА 24 88
' 412368 ШСгоп 1 10 1308 АсссаостасАсдсскзсйАО 0 89
412369 ШИвй 1 10 1313 СОСТТАСССОССТССАбАбО 0 90
412370 ТпСгоп 1 , 10 1410 бАСАббССССТСАбСбССбС ! 0 91
412371 : ШЬгоп 2 10 1730 АбТСССАбСббТТТСТТТТТ 0 , 92
412372 шсгоп 2 10 1735 ААСТСАСТССОАССббТТТС 19 , 93
412373 . ШСгоп 2 10 1740 АААСАААСТСАОТССОАССС ю ; 94
, 412374 ГпЬгоп 2 10 1745 ТббАОАААОАААСТСАбТСС . 45 95
: 412375 ШЬгоп 2 1 10 1750 бСАССТОбАСАААСАААСТС 14 96
, 412376 Шсгоп 2 10 1755 ТбОСАОСАОСТбСАбАААбА ί 46 97
412377 шсгоп 2 10 1887 АОаС-АССАССАТСГТТСССТ 20 93
412378 1 шсгоп 3 10 2125 ТСАСССбССАббССАббССС ' 33 99
412379 1 1пСГОП 3 10 2137 : <ЗОААСАСТС«ЗАСТСАСССОС ' о , 100
412380 • шсгоп 3 10 2142 ТТАСАСОААОАСТСбАСТСА 0 101
• 412381 ШСГОП 3 10 2150 ассстоасттаоаооааоас 47 · 102
ί 412382 Шьгоп 3 10 2155 ТСАССАСССТСАСТТАОАбб 3Ϊ 103
' 412383 шсгоп 3 . 10 2160 ОАЗААТСАСОАСССТбАСТТ 2 104
; 412384 1псгоп 3 10 , 2165 ТСССАбАСААТСАСОАСССТ 31 105
412385 ШСгоп 3 1 10 2170 СТСССТОббАСАСААТСАСб ; 0 106
412386 ; 1пьгоп 3 10 2191 сетсазсАСАаттАООАСтс ! 53 . 107
412387 Шсгоп 3 10 2196 СбТТСбОТСООСАСАбТТАб . 30 ; 108
412388 1ПСГОП 3 10 2216 ССТОЗАТААОСТАТТТСССС 0 109
412389 ШСгоп 3 10 2235 АСАААСАССАТОТААААССС 11 110
412390 1пСгоп 3 10 2241 6А6САСАСАААСАССАТСТА 0 _.ιη ..
• 412391 Шсгоп 3 10 2251 , ТСССАСАССАбАОСАСАСАА 0 ; 112
412392 ШСгоп 3 10 2256 ΐ ТААОСТОСбАОАОСАбАССА 2 113
, 412393 Шьгоп 3 10 2261 , бТСббТААОСТбСбАОАбСА • 23 114
' 412394 ГпЁГОП 3 10 2266 ТТССАбТСбОТААОСТбССА 15 115
412395 Шсгоп 4 10 2472 АСАТОТАССТТААТОТТСТС ' 0 116
412396 . Шсгоп 4 10 2477 ССАбААСАТСТАССТТААТб ' 0 117
412397 1пСгоп 4 10 2482 ТАбСАССАСААСАТбТАССТ 9 118
412398 : ШЬгоп 4 10 2487 ОТТААТАббАбСАбААСАТб 1 Ϊ9 119
412399 : Шьгоп 4 10 2496 • ТСАААААТАОТТААТА06А6 0 120
‘ 412400 ! 1пСгоп 4 10 2511 , ССАСТОТТГТТССТаТбААА 10 121
412401 1псгоп 4 10 2525 ААСТТСбСТССТАТССАСТб . 28 122
412402 ШСГОП 4 10 2530 □СССТААОТТОбСТССТАТС 20 123
412403 ШСгоп 4 10 2535 СААОАОСССТААЗТТССбТС 0 124
412404 ХпЬгоп 4 1 10 2540 ' ССТСОСААОАбСССТААОТТ 64 ΐ 125
412405 Шсгоп 4 10 2558 СООССТТАТАСТААСААОСО 6 1?6„
ί 412406 ШСГОП 4 10 2563 САТААСОООСТТАТАСТААС 33 127 7
412407 ШСГОП 4 10 2568 ТТОСАСАТААСССОСТТАТА 1 73 128
412408 Шсгоп 4 10 2573 ТАСТТТТООАОАТААССССС 51 129
412409 Шсгоп 4 10 2578 ТТАбАТЛЗТТТТСОАЗАТАА 24 130
412410 ШСгоп 4 10 2584 СААТССТТАСАТАСТТТТСС 36 ' 131
412411 Шсгоп 4 10 2589 САССТСААТСОТТАЙАТАСТ 53 132
412412 Шсгоп 4 10 2594 СААААСАССТСААТОСТТАО . 34 133
412413 ΐ Шсгоп 4 10 2599 ТССАССААААСАССТСААТС 59 134
, 412414 1 ШСгоп 4 10 2604 СТСА'ГТССАССААААСАбС? 42 135
412415 ШСГОП 4 10 2809 ААбСТСТСАТТССАбСАААА ’ 57 136
412416 ШСгоп 4 10 2614 тасасааостстсаттссас ' 44 ' 137 1
. 412417 . Шсгоп 4 10 2623 ССТТбСТАТТАСАСААбСТС 72 138
412418 ШСгоп 4 10 2628 СТОбТОСТТССТАТТАСАСА 61 139 ,
412419 1пСгоп 4 10 2633 СААААСТббТббТТбСТАТТ 29 140
412420 Шсгоп 4 10 2638 ТАСТСбААААСТСбТСбТТб 5 141
412421 ХпСгоа 4 10 2663 ТТААСТААСССТСТббААОА 15 ' 142 ;
412422 ШСгоа 4 10 2672 ТСТСТТСААТТААСТААССС 4 143 5
412423 ХпСгоп 4 10 2677 ТббААтетСТТОААТТААСТ 0 144 ί
412424 Шсгоп 4 10 2691 СССАСАОССТСТСТТСОААТ 36 145 *
412425 ШСгоп 4 10 2698 АААААТАСССАСАСССТСТС 59 146 I
. 412426 шсгоп 4 10 ! 2703 : ТбТССАААААТАОССАСАСС 28 147 )
412427 ШЬгоп 4 10 2708 ; ТССТАТОТССАААААТАССС ; 15 148 1
412428 • ШСгоп 4 10 2713 ТСАТТТОСТАТОТССААААА 28 149 1
412429 ШЬгоп 4 10 2718 6А6ТСТСАТТТССТАТ6ТСС 20 150
412430 ШСгоп 4 10 2723 АбТТТбАОТСТСАТТТССТА 30 151
, 412431 ШСгоп 4 10 2728 САССААСТТТОАбТСТСАТТ 55 152
412432 шсгоп 4 10 , 2763 СТТСТСТТСТСТОАСТТСТО 55 153 ’
. 412433 Шсгоп 4 10 I 2778 ί ССТСТбТбТТТТАбТСТТСТ 56 154
412434 . Шсгоп 4 10 2788 ТТТСТТСААСССТСТОТбТТ 15 155
412435 ШСгоп 4 10 2796 • бОАбТООСТТТСТТСААССС 43 156 1
412436 ХпСгоп 4 10 2849 АООААОАСААОССААААОАО 20 157
412437 ШЬгоп 4 10 2854 ТТСТААССААОАСААСОСАА , 0 : 158
412438 1пСгоп 4 10 2859 ТбСССТТСТААООААСАСАА 31 > 159
' 412439 ХпСгоп 2 10 1791 ССАТОССАбТТСОСАТСТОО 0 160
412440 СВ5 9 ' 380 ί ССАбСТССТТОССбСАОАСО 64 , 161
412441 ' СОВ 9 1003 : СССАОАААбСТСАААСТТСА 37 162
412442 З’-итк 9 ' 1783 ССАСААОСТбТССАбТСТАА 32 163 1
412443 З'-ύτί 9 2267 ОбТСАСАСТСТСААСАААТА 59 164
412444 З'-итк 9 2282 АААСАТбТААСТТТТООТСА 55 165
418899 З’-итк 9 1391 ТСАСАТСССАСААТСТТТТС НО* ' 166 ’
*ΚΌ означает отсутствие данных, то есть в данном эксперименте определение не производилось, но при выполнении другого анализа указанное соединение было высокоактивным;
3'-ИТК - 3'-концевая нетранслированная область; 5-ИТК - 5'-концевая нетранслированная область; ΙπΙιόπ 1,2,3,4 - интрон 1,2,3, 4.
Как показано в табл. 1, δΙΤ) ΙΌ N0: 11-15, 17-20, 24, 26-34, 36-57, 59, 61, 63-82, 84-86, 88, 95, 97, 99, 102, 103, 105, 107, 108, 122, 125, 127-140, 145, 146, 149, 151-154, 156, 159, 161-165 характеризуются по меньшей мере 24% ингибированием экспрессии фактора роста соединительной ткани человека в данном анализе, и поэтому являются предпочтительными соединениями. Сайты-мишени, которым комплементарны указанные предпочтительные последовательности, определяются в настоящем описании изобретения как активные центры и поэтому являются предпочтительными сайтами для направленного воздействия соединениями по настоящему изобретению.
Антисмысловое соединение является комплементарным ряду нуклеотидов в последовательности СТСР, то есть нуклеотидам в интервале 718-751, 1388-1423, 1457-1689, 2040-2069, 2120-2147 или 2267- 40 022207
2301 5ЕО ΙΌ N0:9. В определенном варианте осуществления изобретения антисмысловое соединение является комплементарным нуклеотидам в интервале 2728-2797 5Е0 ГО N0:10. Соединения, направленно воздействующие на указанные области, характеризуются по меньшей мере 50% ингибированием (то есть §Ер ГО N0: 15, 29, 31, 42, 46-49, 53, 72, 81, 82, 152-154, 164 и 165). Определенные сайты-мишени, указанные в табл. 1, также характеризуются по меньшей мере 50% ингибированием (то есть 5Е0 ГО N0: 12, 20, 33, 34, 76, 107, 129, 132, 134, 136 и 146).
В определенных вариантах осуществления изобретения антисмысловое соединение является комплементарным нуклеотидам в интервале 553-611, 1394-1423, 1469-1508, 1559-1605, 1659-1689 или 2100212 9. Соединения, направленно воздействующие на указанные области, характеризуются по меньшей мере 60% ингибированием (то есть §Ер ГО N0: 27, 38, 43, 50, 52, 54, 55, 77, 79 и 86). Определенные сайты-мишени, указанные в табл. 1, также характеризуются по меньшей мере 60% ингибированием (то есть δΗΟ ГО N0: 24, 61, 63, 67, 69, 73, 125, 139 и 161).
Антисмысловое соединение также является комплементарным нуклеотидам в интервале 1399-1423. Соединения, направленно воздействующие на указанные области, характеризуются по меньшей мере 70% ингибированием (то есть 5Е0 ГО N0: 39 и 40). Определенные сайты-мишени, указанные в табл. 1, также характеризуются по меньшей мере 70% ингибированием (то есть 5Е0 ГО N0: 28, 30, 45, 51, 56, 78, 128 и 138). Один сайт-мишень, указанный в таблице 1, также характеризуется по меньшей мере 80% ингибированием (то есть 5Е0 ГО N0:44). В определенных вариантах осуществления изобретения процентное значение ингибирования достигается при введении антисмыслового соединения в клетки НиУсс в концентрации, равной 50 нм.
В последовательностях экзонов и интронов было идентифицировано несколько наиболее эффективных последовательностей, активность которых была выше, чем у ранее зарегистрированной последовательности Αδ0, δΗΟ ГО N0:15 (ΙδΙδ 124238).
Были выполнены исследования зависимости между дозой и эффектом (8Е0 ГО N0: 28, 30, 39, 40, 45, 52, 56, 78, 125) (см. фиг. 8). 8Ер ГО N0:13 и 15 (ΙδΙδ 124212 и 124238) являются ранее созданными олигонуклеотидами, и δЕ^ ГО N0:167 (ΙδΙδ 141923) последовательность ССТТСССТОА АООТТССТСС) является отрицательной контрольной последовательностью.
Материалы и методы
Отобранные олигонуклеотиды вводили в концентрации 50 нМ в эндотелиальные клетки пупочной вены человека (НиУЕС) путем трансфекции, опосредованной липофектином. Клетки НиУЕС компании Сазсабс Вю1одю5 (РоШапб, 0Р), находившиеся в среде 200, содержащей добавку с низким ростостимулирующим потенциалом в сыворотке (компании Сазсабс ВШодюз), культивировали на 96-луночных планшетах в количестве 5000 клеток/лунку и инкубировали в течение ночи при 37°С в присутствии 5% СО2. На следующий день среду отсасывали и заменяли предварительно подогретой средой 0рй-МЕМ Ι Дпуйгодсп), содержащей смесь олигонуклеотида и липофектамина 2000 (йпуНгодсп) (3 мг липофектамина 2000 на 1 мл среды 0рй-МЕМ Ι). Через 4 ч трансфицирующую смесь заменяли свежей средой 200, содержащей добавку с низким ростостимулирующим потенциалом в сыворотке, и инкубировали при 37°С в присутствии 5% СО2. Через 16-24 часа клетки, достигшие примерно 80% слияния, промывали физиологическим раствором с фосфатным буфером ^Βδ) и лизировали для очистки РНК, используя набор ρίадсп Р№азу. мРНК СТОР измеряли при помощи количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени (РТ-ПЦР) (наборы затравок/зондов показаны ниже) и полученные результаты нормализовали в отношении полной РНК.
Статистический анализ
Каждый образец анализировали в двух копиях; вертикальные полосы показывают расхождение между двумя измерениями.
Результаты и их обсуждение
Примерно из 150 новых последовательностей для одной мишени, которые были синтезированы и исследованы в отношении активности против СТОР в культуре клеток, новые олигонуклеотиды против СТОР (^ЕО ГО N0: 28, 30, 40, 45, 52, 56, 78, 125 и 166) характеризуются великолепным ингибированием экспрессии мРНК СТОР человека. Выявленные высокоактивные олигонуклеотиды показаны на фиг. 7.
Несколько новых олигонуклеотидов, воздействующих на области интронов (фиг. 4, 5 и 6) и области экзонов (фиг. 1, 2 и 3), являются значительно более активными по сравнению с ранее зарегистрированными исследованными соединениями, включая ΙδΙδ 124238.
Эффективность антисмысловых олигонуклеотидов, направленно воздействующих на экзоны, обычно выше, чем у антисмысловых олигонуклеотидов, направленно воздействующих на интроны (фиг. 7А). Список указанных нуклеотидных последовательностей экзонов приведен на фиг. 7В.
Эффективность 10 наиболее активных антисмысловых олигонуклеотидов была подтверждена в исследованиях зависимости между дозой и эффектом с использованием клеток НиУЕС при помощи вышеописанного метода.
Пример 9. Анализ уровней белка фактора роста соединительной ткани методом вестерн-блоттинга
Анализ методом вестерн-блоттинга (иммуноблоттинг) выполняют стандартными методами. Клетки собирают через 16-20 ч после обработки олигонуклеотидом, один раз промывают РΒδ, суспендируют в
- 41 022207 буфере Лаеммли (100 мкл/лунку), кипятят в течение 5 мин и помещают на 16% гель для δΌδ-РАСЕ. Гели выдерживают в течение 1,5 ч под напряжением 150 В и переносят на мембрану для выполнения вестернблоттинга. Соответствующее первичное антитело против фактора роста соединительной ткани используют вместе со вторичным антителом, меченным радиоактивным изотопом или флуоресцентным красителем, против первичного антитела. Полосы визуализируют при помощи устройства РБокрБоптадег™ (Мо1еси1аг Иупатюк, 8иηηуνа1е, СаИГ.).
Пример 10. Предварительное токсикологическое исследование антисмысловых олигонуклеотидов против СТСР с использованием мышей
Цель исследования
Целью указанного предварительного токсикологического исследования была оценка трех олигонуклеотидов, направленно воздействующих на СТСР человека, в отношении возможной токсичности для здоровых самцов мышей ВАЬВ/с. Были исследованы олигонуклеотиды, имеющие последовательности 1818 412294 (81 У) ГО N0:39), 412295 (81 (С) ГО N0:40) и 418899 (8ЕЦ ГО N0:166).
Методы
Самцов мышей ВАЬВ/с (в возрасте примерно 8 недель) с массой тела около 25 г в течение всего исследования кормили обычным лабораторным кормом. Указанным мышам в течение 4 недель подкожно (8Ц) вводили два раза в неделю 25 или 50 мг/кг антисмысловых олигонуклеотидов (п=6). Измеряли следующие показатели:
массу тела каждую неделю; химический состав плазмы крови через 4 недели; массу органов, массу тела после умерщвления и окрашивание Н&Е печени и почки.
Результаты
Результаты, полученные после введения в течение 4 недель 25 или 50 мг/кг антисмыслового олигонуклеотида 1818 412294 (8ЕЦ ГО N0:39), 1818 412295 (8ЕЦ ГО N0:40) или 1818 418899 (8ЕЦ ГО N0:166), свидетельствуют о значительном изменении конечных показателей по сравнению с контрольной группой мышей, которым вводили физиологический раствор. Указанные изменения включают:
1) Уровни аланинаминотрансферазы (АЬТ) и аспартатаминотрансферазы (А8Т) в плазме после введения в течение 4 недель 25 или 50 мг/кг 1818 412294 (8ЕЦ ГО N0:39) или 1818 412295 (8ЕЦ ГО N0:40) или 25 мг/кг 1818 418899 (8ЕЦ ГО N0:166) были аналогичны уровням у мышей в контрольной группе, которым вводили физиологический раствор (наполнитель), однако у мышей, которым вводили 50 мг/кг 1818 418899 (8ЕЦ ГО N0:166), были обнаружены значительно более высокие уровни АЬТ/А8Т по сравнению с контрольной группой (см. фиг. 9А и 9В). Такой результат является весьма удивительным, и не был прогнозирован на основании предшествующих исследований или клеточных анализов.
2) Прирост массы в группе мышей, которым вводили 50 мг/кг 4122 95, был значительно ниже прироста массы в контрольной группе (см. фиг. 10).
Заключение
8ЕЦ ГО N0:39 (1818 412294) характеризовалась менее выраженными нежелательными токсикологическими показателями, чем 8ЕЦ ГО N0:40 (1818 412295) и 8ЕЦ ГО N0:166 (1818 418899). Полученный результат был совершенно неожиданным и не был прогнозирован на основании поведения указанных олигонуклеотидных последовательностей в культуре клеток.
Пример 11. Воздействие антисмысловых олигонуклеотидов против СТСР крысы (8ЕЦ ГО N0:163) на экспрессию мРНК коллагена и СТСР у раненых крыс
Цель исследования
Антисмысловой олигонуклеотид 8ЕЦ ГО N0:163 (1818 412442) против СТСР был использован для исследования способности антисмыслового олигонуклеотида против СТСР уменьшать экспрессию СТСР и Со11А2 (биомаркер рубцевания) в животной модели рубцевания с использованием крыс. Химическая структура указанного антисмыслового олигонуклеотида идентична 8ЕЦ ГО N0:39 (1818 412294), однако, данная последовательность была немного модифицирована для достижения 100% комплементарности с последовательностью мРНК СТСР крысы.
Ранение
На спинах лишенных шерсти крыс в возрасте 10 недель 0,8 см дерматомами были сделаны четыре надреза (1-й день исследования), по два с каждой стороны средней линии позвоночника. Раны были оставлены открытыми с наложением стерильной окклюзивной повязки.
Введение антисмыслового олигонуклеотида
В два биопсийных участка с правой стороны спины животного внутрикожно вводили антисмысловой олигонуклеотид против СТСР в 1-й, 5-й, 9-й и 13-й день после биопсии в количестве 3,0, 1,0, 0,3 или 0,1 мг. В биопсийные участки с левой стороны спины животного внутрикожно вводили физиологический раствор с фосфатным буфером (РВ8). Животных умерщвляли на 15-й день после биопсии. В каждый биопсийный участок было введено в общей сложности 200 мкл антисмыслового олигонуклеотида или РВ8. Указанный 200 мкл объем был разделен на четыре 50 мкл аликвоты, которые инъецировали по периферии раны на расстоянии примерно от 0,25 до 0,5 см с левой, правой, верхей и нижней сторон раны.
- 42 022207
Взятие образцов и умерщвление
Животных умерщвляли в указанную дату и из центральной части раны при помощи 0,5 см дерматома брали образец кожи, из которого экстрагировали мРНК стандартными методами. Анализ мРНК СТСР и Со11А2 крыс выполняли при помощи КТ-ПЦР с использованием стандартной кривой для анализа данных и рибогрина в качестве обязательного/нормализующего гена.
Результаты
Введение крысам указанного антисмыслового олигонуклеотида во всех дозах вызвало статистически значимое уменьшение экспрессии мРНК СТСР и Со11А2 (см. фиг. 11). Полученные результаты ясно показывают, что ингибирование экспрессии СТСР при помощи 2'-МОЕ модифицированного антимыслового олигонуклеотида уменьшает отложение коллагена в коже, что вызывает образование менее выраженного рубца на коже.
Пример 12. Фармакокинетическое исследование антисмыслового олигонуклеотида против СТСР у кроликов при внутрикожном введении одной дозы
Цель исследования
Целью данного фармакокинетического исследования с использованием кроликов является определение концентрации антисмыслового олигонуклеотида против СТСР (δΕΟ ΙΌ NО:39, ΙδΙδ 412294) в коже кролика в разные периоды времени после одной внутрикожной инъекции.
План исследования
В 0-й день исследования всем животным внутрикожно (ГО) инъецировали одну 100 мкл дозу антисмыслового олигонуклеотида против СТСР δΕΟ ΙΌ NО:39 в концентрации 50 мг/мл (общая доза равна 5 мг). Антисмысловой олигонуклеотид вводили животным слева от средней линии позвоночника параллельно плечам кролика. Иглу вводили таким образом, чтобы испытуемое вещество было инъецировано в направлении нижней части тела животного. Кроликов умерщвляли в 1-й, 3-й, 7-й или 14-й день и получали два биопсийных образца размером 1,0 см: один образец был взят над центральной частью места первоначальной инъекции и другой образец был взят вертикально под ним на расстоянии 0,5 см. Образцы мгновенно замораживали и хранили при -80°С до выполнения анализа уровней антисмыслового олигонуклеотида. Полученные результаты представляют средние уровни антисмыслового олигонуклеотида в двух биопсийных образцах в указанный период времени.
Результаты и заключение
Значительные уровни антисмыслового олигонуклеотида присутствуют в коже по меньшей мере на 14-й день после внутрикожного введения (см. фиг. 12). Терапевтические концентрации лекарственного средства составляют от 1 до 100 мкг/г тканей. Полученные результаты показали, что впервые имеет место пролонгированное нахождение в коже 2'-МОЕ антисмыслового олигонуклеотида, имеющего указанную химическую конфигурацию, кроме того результаты ясно свидетельствуют о лечебном потенциале соединения данного класса в коже.
Пример 13. Исследование генома
Возможность возникновения нежелательных эффектов под воздействием антисмыслового олигонуклеотида δΕΟ ΙΌ NО:39, который может быть токсичным не только для мишени, оценивали, исследуя базу данных генома человека в отношении последовательностей, обладающих полной или частичной гомологией или комплементарностью с нуклеотидной последовательностью δΕΟ ΙΌ NО:39.
Опубликованные базы данных последовательностей ДНК человека всесторонне исследовали с целью выявления последовательностей, включающих δΕΟ ΙΌ NО:39, которые обладают достаточной гомологией с известным набором генов человека, и определения вероятности того, что нежелательная антисмысловая или другая ингибирующая активность может быть направлена против экспрессии генных продуктов человека, не являющихся СТСР-мишенью (фактор роста соединительной ткани), в результате чего воздействию могут быть подвергнуты другие гены. Исследование включало поиск гомологичных последовательностей длиной от 20 нуклеотидов (то есть полная длина δΕΟ ΙΌ NО:39) до 12 нуклеотидов.
В геноме человека не было обнаружено подвергшихся воздействию сайтов, не являющихся мишенью, которые содержали 20, 19 или 18 оснований, гомологичных δΕΟ ΙΌ NО:39. Полное отсутствие сайтов, не являющихся мишенью, с 18, 19 или 20 основаниями показывает, что вероятность любой активности, направленной на другие сайты, является минимальной. Были идентифицированы три последовательности, состоящие из 17 оснований, гомологичные δΕΟ ΙΌ NО:39. Одна из указанных последовательностей находится в интроне гена ЬКР№. Интроны обычно сплайсируются из транскрипта до того, как мРНК попадает в цитоплазму, место воздействия δΕΟ ΙΌ NО:39. По указанной причине можно предположить, что δΕΟ ΙΌ NО:39 не должна влиять на экспрессию ЬКРШ. Две другие гомологичные последовательности, состоящие из 17 оснований, расположены в межгенных спейсерных областях. Межгенные спейсеры обычно не транскрибируются, а существуют в виде двухцепочечной ДНК в ядерном компартменте и отделены от места действия δΕΟ ΙΌ NО:39. Следовательно, внушающие опасение гомологичные последовательности, состоящие из 17 оснований, отсутствуют.
Среди обнаруженных гомологичных последовательностей, состоящих из 16, 15 и 14 оснований, только одна последовательность расположена в известном или предполагаемом транскрипте (то есть ген РКМО5, кодирующий трансферазу биосинтеза липидов, действующую в печени). Однако гомология 14
- 43 022207 оснований 8ЕО ΙΌ Ν0:39 со смысловым транскриптом мРНК не должна стимулировать антисмысловую активность (то есть гибридизация возможна только в том случае, если часть последовательности 8ЕЦ ГО Ν0:39 комплементарна, а не гомологична последовательности транскрипта мРНК). Поэтому 8ЕЦ ГО Ν0:39 не будет влиять на указанный транскрипт. Все другие гомологичные последовательности, включающие от 16 до 14 оснований, соответствовали интронам или межгенным спейсерам при отсутствии перекрывающихся транскриптов, прогнозируемых транскриптов или меток экспрессированных последовательностей. Гомологичные последовательности, состоящие из 13 оснований, отсутствовали.
Любые транскрипты на основе гомологии только 12 нуклеотидов или более коротких последовательностей, представляют термодинамически неблагоприятную мишень по сравнению со связыванием олигонуклеотида, состоящего из 20 оснований, такого как 8ЕЦ ГО Ν0:39, с предполагаемой мишенью. Поэтому гомологичные последовательности, состоящие из 12 оснований, и более короткие последовательности не обладают достаточным потенциалом для антисмысловой активности в отношении сайтов, не являющихся мишенью.
Таким образом, исследование базы данных генома человека показало, что 8ЕЦ ГО Ν0:39 обладает высокой степенью специфичности в отношении предполагаемой мишени при минимальном возможном воздействии на другие объекты, не являющиеся мишенью.
Пример 14. Клиническое исследование внутрикожного введения одной дозы для оценки безопасности и переносимости антисмыслового олигонуклеотида (8ЕЦ ГО Ν0:39) на стадии 1 клинического испытания
Цели исследования
Антисмысловой олигонуклеотид против СТОР человека 8ЕЦ ГО Ν0:39 (Ι8Ι8 № 412294) вводили шести субъектам в виде внутрикожной дозы (общая доза равна 80 мг) на стадии 1 протокола исследования для оценки безопасности и переносимости одной дозы лекарственного средства.
Результаты
При выполнении исследования не было обнаружено побочных явлений, за исключением местных реакцией в месте инъекции, таких как эритема, воспаление, зуд и уплотнение. Вышеуказанные побочные явления были отмечены примерно у 50% субъектов в виде минимальных проявлений. Не было обнаружено изменений в химическом составе сыворотки, гематологии, анализе мочи, ЭКГ, признаках жизни, объективном обследовании и активации комплемента.
Заключение
Введение антисмыслового олигонуклеотида против СТОР в дозах, находящихся в терапевтическом диапазоне, хорошо переносится людьми, что свидетельствует о безопасности данного соединения для лечения рубцевания кожи.
Пример 15. Уровни антисмыслового олигонуклеотида 8ЕЦ ГО Ν0:39 в коже человека после внутрикожного введения
Уровни лекарстенного средства в коже определяли в группе субъектов, принимавших участие в первоначальном клиническом исследовании, в котором 5 субъектам вводили 40 мг антисмыслового олигонуклеотида (А80) (в виде 10 одинаковых доз по 4 мг каждая). Биопсийные образцы кожи получали через 21 день после введения одной дозы А80 в 1-й день в место имитированной хирургической раны (линия, прочерченная на коже, определяющая место введения дозы). Пункционная биопсия состояла из 4 мм цилиндрической массы образца ткани. Уровни А80 определяли при помощи капиллярного электрофореза и зондов, специфичных к последовательности и меченых флуоресцентным красителем, при этом было обнаружено 84,2 мкг/г ткани. Терапевтические концентрации лекарственного средства, содержащего А80, предположительно составляют от 1 до 100 мкг/г тканей.
Полученные результаты показали, что впервые имеет место пролонгированное нахождение в коже человека после внутрикожного введения 2'-МОЕ антисмыслового олигонуклеотида, имеющего указанную химическую конфигурацию, кроме того результаты ясно свидетельствуют о лечебном потенциале соединения данного класса в коже.
Пример 16. Рандомизированное контролируемое клиническое исследование двойным слепым методом эффективности и безопасности 8ЕЦ ГО Ν0:39 при уменьшении выраженности рубцевания у субъектов, подвергаемых избирательной абдоминопластике, на стадии 2 клинического испытания
Данное исследование является рандомизированным контролируемым исследованием двойным слепым методом, целью которого является определение эффективности и безопасности антисмыслового олигонуклеотида против СТОР 8ЕЦ ГО Ν0:39 (то есть лекарственного продукта). Лекарственный продукт вводят с обеих сторон разреза, сделанного во время абдоминопластики, путем внутрикожных инъекций субъектам, подвергаемым избирательной абдоминопластике.
Хирургический разрез, сделанный во время абдоминопластики, после его закрытия обрабатывают лекарственным продуктом или плацебо с обеих сторон от средней линии, в непосредственной близости от лобковых волос.
Продолжительность исследования равна примерно 24 неделям. После абдоминопластики, сделанной в 1-й день, субъектам в течение 10 недель вводят лекарственный продукт и плацебо. Осмотр и оценку рубцевания производят каждые 4 недели до 12-й недели и еще раз через 24 недели.
- 44 022207
Эффективность определяют по оценкам каждой совместимой пары разрезов.
Эффективность оценивают через 12 недель и 24 недели после операции по абдоминопластике, используя два следующих метода оценки выраженности рубцевания разрезов:
оценка экспертом фотографий, сделанных слепым методом, с использованием визуальной аналоговой шкалы (νΑ8);
оценка рубца исследователем по шкале оценки рубцов. Эффективность 8Ε0 ГО NΟ:39 удовлетворяет указанным критериям.
Пример 17. Рандомизированное контролируемое клиническое исследование двойным слепым методом эффективности и безопасности 8Ε0 ГО NΟ:39 при уменьшении рубцевания кожи у субъектов, подвергаемых избирательной коррекции медицинских рубцов, образовавшихся в результате ранее выполненной пластической операции уменьшения молочной железы или мастопексии, на стадии 2 клинического испытания.
Данное исследование является рандомизированным контролируемым исследованием двойным слепым методом, целью которого является определение эффективности и безопасности антисмыслового олигонуклеотида против СТОР 8Ε0 ГО NΟ:39 (то есть лекарственного продукта). Лекарственный продукт вводят путем внутрикожных инъекций в среднюю часть корректированных рубцов, образовавшихся в результате пластической операции уменьшения молочной железы. Каждую сторону средней части корректированной раны/рубца молочной железы после закрытия хирургического разреза обрабатывают лекарственным продуктом или плацебо.
В данном исследовании приняли участие до 40 субъектов. Продолжительность исследования равна примерно 24 неделям. После коррекции рубцов, сделанной в 1-й день, субъектам в течение 10 недель вводят лекарственный продукт и плацебо. Осмотр и оценку рубцевания производят каждые 4 недели до 12-й недели и еще раз через 24 недели.
Эффективность определяют по оценкам каждой совместимой пары разрезов. Эффективность оценивают через 12 и 24 недели после коррекции средней части рубца, образовавшегося в результате пластической операции уменьшения молочной железы, используя два метода оценки выраженности рубцевания разрезов:
оценка экспертом фотографий, сделанных слепым методом, с использованием визуальной аналоговой шкалы (νΑ8);
оценка рубца исследователем по шкале оценки рубцов. Эффективность 8Ε0 ГО NΟ:39 удовлетворяет указанным критериям.

Claims (64)

1. Соединение, включающее модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 12-30 связанных нуклеозидов, у которого часть, состоящая из последовательности из по меньшей мере 12 гетероциклических оснований, комплементарна нуклеотидам в области, выбираемой из нуклеотидов 1399-1423, 13941423, 1388-1423, 718-751, 2728-2797, 1659-1689 и 2100-2129 8ΕΟ ГО Ш:9, где указанный модифицированный олигонуклеотид включает:
(a) сегмент разрыва, состоящий из связанных дезоксинуклеозидов;
(b) 5'-концевой боковой сегмент, состоящий из связанных модифицированных нуклеозидов; и (c) 3'-концевой боковой сегмент, состоящий из связанных модифицированных нуклеозидов;
где указанный сегмент разрыва расположен между 5'-концевым боковым сегментом и 3'-концевым боковым сегментом, и где каждый модифицированный нуклеозид в каждом боковом сегменте включает модифицированный сахар.
2. Соединение по п.1, где указанная часть, состоящая из последовательности из по меньшей мере 12 гетероциклических оснований, комплементарна нуклеотидам в области, выбираемой из нуклеотидов 1399-1423, 1394-1423 и 1388-1423 8ΕΟ ГО Ш:9.
3. Соединение по п.2, где указанная часть, состоящая из последовательности из по меньшей мере 12 гетероциклических оснований, является комплементарной нуклеотидам в области 1399-1423.
4. Соединение по п.2, где указанная часть, состоящая из последовательности из по меньшей мере 12 гетероциклических оснований, является комплементарной нуклеотидам в области 1388-1423.
5. Соединение по п.2, где указанная часть, состоящая из последовательности из по меньшей мере 12 гетероциклических оснований, является комплементарной нуклеотидам в области 1394-1423.
6. Соединение по п.2, где указанная часть, состоящая из последовательности из по меньшей мере 12 гетероциклических оснований, находится в последовательности гетероциклических оснований, представленной в 8ΕΟ ГО NΟ: 37, 38, 39, 40 или 166.
7. Соединение по п.2, где указанная часть, состоящая из последовательности из по меньшей мере 12 гетероциклических оснований, находится в последовательности гетероциклических оснований, представленной в 8ΕΟ ГО NΟ: 39.
8. Соединение по п.2, где указанная часть, состоящая из последовательности из по меньшей мере 12 гетероциклических оснований, находится в последовательности гетероциклических оснований, пред- 45 022207 ставленной в δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 40.
9. Соединение по п.2, где указанная часть, состоящая из последовательности из по меньшей мере 12 гетероциклических оснований, находится в последовательности гетероциклических оснований, представленной в δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 166.
10. Соединение по п.1, где указанная часть, состоящая из последовательности из по меньшей мере 12 гетероциклических оснований, комплементарна нуклеотидам в области нуклеотидов 718-751 δΕΟ ΙΌ ΝΟ:9.
11. Соединение по п.10, где указанная часть, состоящая из последовательности из по меньшей мере 12 гетероциклических оснований, находится в последовательности гетероциклических оснований, представленной в δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 29, 30 или 31.
12. Соединение по п.1, где указанная часть, состоящая из последовательности из по меньшей мере 12 гетероциклических оснований, комплементарна нуклеотидам в области нуклеотидов 2728-2797 δΕΟ ΙΌ ΝΟ:9.
13. Соединение по п.12, где указанная часть, состоящая из последовательности из по меньшей мере 12 гетероциклических оснований, находится в последовательности гетероциклических оснований, представленной в δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 151, 152, 153 или 154.
14. Соединение по п.1, где указанная часть, состоящая из последовательности из по меньшей мере 12 гетероциклических оснований, комплементарна нуклеотидам в области нуклеотидов 1659-1689 δΕΟ ΙΌ ΝΟ:9.
15. Соединение по п.14, где указанная часть, состоящая из последовательности из по меньшей мере 12 гетероциклических оснований, находится в последовательности гетероциклических оснований, представленной в δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 54, 55 или 56.
16. Соединение по п.1, где указанная часть, состоящая из последовательности из по меньшей мере 12 гетероциклических оснований, комплементарна нуклеотидам в области нуклеотидов 2100-2129 δΕΟ ΙΌ ΝΟ:9.
17. Соединение по п.16, где указанная часть, состоящая из последовательности из по меньшей мере 12 гетероциклических оснований, находится в последовательности гетероциклических оснований, представленной в δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 77, 78, 79, 80 или 81.
18. Соединение по любому из пп.1-17, в котором модифицированный олигонуклеотид включает по меньшей мере 14 связанных нуклеозидов.
19. Соединение по любому из пп.1-17, в котором модифицированный олигонуклеотид состоит из 20 связанных нуклеозидов.
20. Соединение по любому из пп.1-19, в котором модифицированный олигонуклеотид является одноцепочечным олигонуклеотидом.
21. Соединение по любому из пп.1-19, в котором модифицированный олигонуклеотид является двухцепочечным олигонуклеотидом.
22. Соединение по любому из пп.1-21, в котором модифицированный олигонуклеотид включает по меньшей мере одну модифицированную межнуклеозидную связь.
23. Соединение по п.22, в котором по меньшей мере одна модифицированная межнуклеозидная связь является фосфоротиоатной межнуклеозидной связью.
24. Соединение по п.23, в котором все межнуклеозидные связи являются фосфоротиоатными межнуклеозидными связями.
25. Соединение по п.23, в котором остальные межнуклеозидные связи являются фосфодиэфирной связью.
26. Соединение по любому из пп.1-21, в котором по меньшей мере один нуклеозид включает модифицированный сахар.
27. Соединение по п.26, в котором модифицированный сахар является бициклическим сахаром.
28. Соединение по п.26, в котором по меньшей мере один модифицированный сахар содержит 2'-Ометоксиэтилсахар.
29. Соединение по любому из пп.1-21, включающее по меньшей мере один нуклеозид, модифицированный тетрагидропираном, в котором тетрагидропирановое кольцо замещает фуранозное кольцо.
30. Соединение по п.29, в котором по меньшей мере один нуклеозид, модифицированный тетрагидропираном, имеет структуру где Вх означает необязательно защищенное гетероциклическое основание.
31. Соединение по любому из пп.1-21, в котором по меньшей мере один нуклеозид включает модифицированное гетероциклическое основание.
32. Соединение по любому из пп.1-21, в котором по меньшей мере один содержит модифицирован- 46 022207 ное цитозиновое гетероциклическое основание.
33. Соединение по п.32, в котором модифицированное цитозиновое гетероциклическое основание является 5'-метилцитозином.
34. Соединение по п.32, в котором каждое модифицированное цитозиновое гетероциклическое основание является 5'-метилцитозином.
35. Соединение по п.32, в котором каждый цитозин в последовательности гетероциклических оснований модифицированного олигонуклеотида является 5'-метилцитозином.
36. Соединение по любому из пп.1-17, в котором модифицированный олигонуклеотид включает:
(а) сегмент разрыва, состоящий из тринадцати связанных дезоксинуклеозидов;
(к) 5'-концевой боковой сегмент, состоящий из двух связанных модифицированных нуклеозидов; и (с) 3'-концевой боковой сегмент, состоящий из пяти связанных модифицированных нуклеозидов; где сегмент разрыва расположен между 5'-концевым боковым сегментом и 3'-концевым боковым сегментом, каждый модифицированный нуклеозид в каждом боковом сегменте включает 2'-Ометоксиэтилсахар и где каждая межнуклеозидная связь является фосфоротиоатной связью.
37. Способ по любому из пп.1-36, где последовательность гетероциклических оснований представляет собой последовательность, представленную в 8ЕЦ ГО N0: 39.
38. Способ по любому из пп.1-36, где последовательность гетероциклических оснований представляет собой последовательность, представленную в 8ЕЦ ГО N0: 40.
39. Способ по любому из пп.1-36, где последовательность гетероциклических оснований представляет собой последовательность, представленную в 8ЕЦ ГО N0: 166.
40. Соединение, которое содержит модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 20 связанных нуклеозидов, имеющих последовательность гетероциклических оснований, указанную в 8ЕЦ ГО N0:39, где указанный модифицированный олигонуклеотид включает:
(а) сегмент разрыва, состоящий из тринадцати связанных дезоксинуклеозидов;
(к) 5'-концевой боковой сегмент, состоящий из двух связанных модифицированных нуклеозидов; и (с) 3'-концевой боковой сегмент, состоящий из пяти связанных модифицированных нуклеозидов; где указанный сегмент разрыва расположен между 5'-концевым боковым сегментом и 3'-концевым боковым сегментом, где каждый модифицированный нуклеозид в каждом боковом сегменте включает 2'О-метоксиэтилсахар, где каждая межнуклеозидная связь является фосфоротиоатной межнуклеозидной связью и где каждое цитозиновое гетероциклическое основание является 5'-метилцитозином.
41. Антисмысловой олигонуклеотид, состоящий из 20-30 связанных нуклеозидов, у которого часть, состоящая из последовательности из по меньшей мере 12 гетероциклических оснований, комплементарна нуклеотидам в области, выбираемой из нуклеотидов 1399-1423, 1394-1423, 1388-1423, 718-751, 27282797, 1659-1689 и 2100-2129 8ЕЦ ГО N0:9, где указанный антисмысловой олигонуклеотид дополнительно характеризуется как имеющий в направлении от 5'-конца к 3'-концу 5'-концевой боковой сегмент, состоящий из двух нуклеотидов; сегмент разрыва, состоящий из 13 нуклеотидов, и 3'-концевой боковой сегмент, состоящий из пяти нуклеотидов;
где каждый нуклеотид указанных 5'-концевого и 3'-концевого боковых сегментов включает 2'-Ометоксиэтилсахар, где каждый нуклеотид указанного сегмента разрыва включает дезоксирибозный сахар, где каждое цитозиновое основание указанного антисмыслового олигонуклеотида является 5'метилцитозином и где межнуклеотидные связи между каждым нуклеотидом указанного антисмыслового олигонуклеотида являются фосфоротиоатными связями.
42. Антисмысловой олигонуклеотид по п.41, где указанная часть, состоящая из последовательности из по меньшей мере 12 гетероциклических оснований, комплементарна нуклеотидам в области, выбираемой из нуклеотидов 1399-1423, 1394-1423 и 1388-1423 8ЕЦ ГО N0:9.
43. Антисмысловой олигонуклеотид по п.42, где указанная часть, состоящая из последовательности из по меньшей мере 12 гетероциклических оснований, является комплементарной нуклеотидам в области 1399-1423.
44. Антисмысловой олигонуклеотид по п.41, где указанная часть, состоящая из последовательности из по меньшей мере 12 гетероциклических оснований, является комплементарной нуклеотидам в области 1388-1423.
45. Антисмысловой олигонуклеотид по п.41, где указанная часть, состоящая из последовательности из по меньшей мере 12 гетероциклических оснований, является комплементарной нуклеотидам в области 1394-1423.
46. Антисмысловой олигонуклеотид по п.42, где указанная часть, состоящая из последовательности из по меньшей мере 12 гетероциклических оснований, находится в последовательности гетероциклических оснований, представленной в 8ЕЦ ГО N0: 37, 38, 39, 40 или 166.
47. Антисмысловой олигонуклеотид по п.46, где указанная часть, состоящая из последовательности из по меньшей мере 12 гетероциклических оснований, находится в последовательности гетероциклических оснований, представленной в 8ЕЦ ГО N0: 39.
- 47 022207
48. Антисмысловой олигонуклеотид по п.46, где указанная часть, состоящая из последовательности из по меньшей мере 12 гетероциклических оснований, находится в последовательности гетероциклических оснований, представленной в 8ЕО ГО NΟ: 40.
49. Антисмысловой олигонуклеотид по п.42, где указанная часть, состоящая из последовательности из по меньшей мере 12 гетероциклических оснований, находится в последовательности гетероциклических оснований, представленной в 8ЕО ГО NΟ: 166.
50. Антисмысловой олигонуклеотид, состоящий из нуклеотидной последовательности 8ЕО ГО NΟ:39, где указанный антисмысловой олигонуклеотид дополнительно характеризуется как имеющий в направлении от 5'-конца к З'-концу 5'-концевой боковой сегмент, состоящий из двух связанных нуклеозидов; сегмент разрыва, состоящий из 1З связанных нуклеозидов, и З'-концевой боковой сегмент, состоящий из пяти связанных нуклеозидов, где каждый связанный нуклеозид указанных 5'-концевого и З'концевого боковых сегментов включает 2'-О-метоксиэтилсахар, где каждый связанный нуклеозид указанного сегмента разрыва включает дезоксирибозный сахар, где каждое цитозиновое основание указанного антисмыслового олигонуклеотида является 5'-метилцитозином и где межнуклеотидные связи между каждым связанным нуклеозидом указанного антисмыслового олигонуклеотида являются фосфоротиоатными связями.
51. Соединение, включающее модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 12-З0 связанных нуклеозидов, у которого часть, состоящая из последовательности из по меньшей мере 12 гетероциклических оснований, комплементарна нуклеотидам в области, выбираемой из нуклеотидов 1457-1689, 21202147, 2267-2З01, 55З-611, 1469-1508 и 1559-1605 8ЕО ГО NΟ:9, где указанный модифицированный олигонуклеотид включает:
(a) сегмент разрыва, состоящий из связанных дезоксинуклеозидов;
(b) 5'-концевой боковой сегмент, состоящий из связанных модифицированных нуклеозидов; и (c) З'-концевой боковой сегмент, состоящий из связанных модифицированных нуклеозидов;
где указанный сегмент разрыва расположен между 5'-концевым боковым сегментом и З'-концевым боковым сегментом и где каждый модифицированный нуклеозид в каждом боковом сегменте включает модифицированный сахар, и где указанное соединение демонстрирует по меньшей мере 60% ингибирование в анализе экспрессии фактора роста соединительной ткани человека.
52. Соединение, включающее модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 14-З0 связанных нуклеозидов, у которого часть, состоящая из последовательности из по меньшей мере 14 гетероциклических оснований, комплементарна нуклеотидам в области, выбираемой из нуклеотидов 2040-2069 8ЕО ГО NΟ:9, где указанный модифицированный олигонуклеотид включает:
(a) сегмент разрыва, состоящий из связанных дезоксинуклеозидов;
(b) 5'-концевой боковой сегмент, состоящий из связанных модифицированных нуклеозидов; и (c) З'-концевой боковой сегмент, состоящий из связанных модифицированных нуклеозидов;
где указанный сегмент разрыва расположен между 5'-концевым боковым сегментом и З'-концевым боковым сегментом, и где каждый модифицированный нуклеозид в каждом боковом сегменте включает модифицированный сахар.
53. Соединение по любому из пп.1-40 или 51 или антисмысловой олигонуклеотид по любому из пп.41-50, где указанное соединение или указанный антисмысловой олигонуклеотид демонстрируют по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60% или по меньшей мере 70% ингибирование в анализе фактора роста соединительной ткани человека.
54. Композиция, содержащая соединение по любому из пп.1-40 или 51-5З или антисмысловой олигонуклеотид по любому из пп.41-50 или их соль и фармацевтически приемлемые носитель или разбавитель.
55. Композиция, содержащая соединение по любому из пп.1-40 или 51-5З или антисмысловой олигонуклеотид по любому из пп.41-50 или их соль, составленная для местного введения.
56. Композиция, содержащая соединение по любому из пп.1-40 или 51-5З или антисмысловой олигонуклеотид по любому из пп.41-50 или их соль, составленная для подкожного введения.
57. Композиция, содержащая соединение по любому из пп.1-40 или 51-5З или антисмысловой олигонуклеотид по любому из пп.41-50 или их соль, составленная для внутрикожного введения.
58. Композиция, содержащая соединение по любому из пп.1-40 или 51-5З или антисмысловой олигонуклеотид по любому из пп.41-50 или их соль, составленная для местного введения в фиброзную ткань.
59. Применение соединения по любому из пп.1-40 или 51-5З или антисмыслового олигонуклеотида по любому из пп.41-50 или композиции по любому из пп.54-58 в производстве лекарственного средства для лечения заболевания или состояния, связанных с экспрессией фактора роста соединительной ткани человека.
60. Применение по п.59, в котором заболевание или состояние являются гиперпролиферативным нарушением, раком, фиброзным заболеванием, гипертрофическим рубцеванием, келоидами, рубцеванием кожи, фиброзом печени, фиброзом легких, фиброзом почки, фиброзом сердца, рестенозом, фиброзом
- 48 022207 сустава, плечелопаточным периартритом, повреждением сухожилия и периферического нерва, повреждением спинного мозга, коронарным шунтированием, спайками в животе и брюшине, эндометриозом, лейомиоматозом и фибромами матки, радиальной кератотомией и фоторефрактивной кератектомией, операцией по реплантации сетчатки, фиброзом, опосредованным устройством, сращением сухожилий, контрактурой Дюпюитрена или склеродермией.
61. Применение соединения по любому из пп.1-40 или 51-53 или антисмыслового олигонуклеотида по любому из пп.41-50 или композиции по любому из пп.54-58 в производстве лекарственного средства для уменьшения рубцевания при заживлении раны.
62. Применение по п.61, в котором рану, находящуюся в процессе заживления, выбирают из группы, состоящей из повреждения кожи, хирургических разрезов и ожогов.
63. Применение по п.61, где субъект испытывает улучшение в плане тяжести рубца по меньшей мере на количество, выбранное из группы, состоящей из 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 и 99%.
64. Применение соединения по любому из пп.1-40 или 51-53 или антисмыслового олигонуклеотида по любому из пп.41-50 или композиции по любому из пп.53-58 в производстве лекарственного средства для ингибирования экспрессии фактора роста соединительной ткани в клетке или ткани.
Фиг. 1
Фиг. 2
- 49 022207
Фиг. 3
СОЗ:
Энэоны
птктвевв ГНПвтзвег ШОктззэд СЕН КТ 5031 Р-ОНстор 0412442 0 124239;412444 И 412443 Р412440 В 412441 : 1037430 (М М_0010012) ΐδ'-υτρ 1 . .. .. ., СОЗ I ^· ι μ ) ; 1 эюев 1 эюон 2 |’«м»Э Нвонд! ’ экзон 5 1 ~ 1
Фиг. 5
- 50 022207 № нуклеотида Фиг. 6 . 0412307
И 412300
0412285 0 412205 0124212 0124238
0412283_0 412204 0412311_0412333 ! | ’ 3__Ζ »57430 (ΝΜ.0010012)
Ϊ__СОбЯ СОЗ I- ' Зигондеюя иетранслированиая область
Экаэны; | *экэон1 | 1 экзон2 | *^зст^^^*эказн 4 | экзон5 |
Повторы ] П 1 ΓΊ_00_[]
Другие сегмнтыЗ | | || [|| Η М | |Дф) | | 5ТЭ I |ЗТ5| I 5Т5|Ц||ВТЗ Ш | ВТ5 [ ||
5' |-г-1-1-1-1-1--1-1-1-,-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-п-3’
О 500 1000 1500 2000
Фиг. 7Α
№ олигонуклеотида Последовательность 412404 ССТОССААОАССССТААСТТ (ИНТРОН) 412283 ССССАТОСАОСССАСССССС (эКЗОН 3) 412285 АССССАОССССААССАСОСТ (ЭКЗОН 3) 412294 ОПТОАСАТСССАСААТСТТ (ЭКЗОН 5) 412295 ТАГГТаТТГОАСАТООСАСА (ЭКЗОН 5) 412300 ТААТАТАСАТТСТСОТССТС (ЭКЗОН 5) 412307 ТАСАСТТСАААТАОСАСССА (ЭКЗОН 5) 412311 , ТСГТСАТОССТСОАСААТСС (ЭКЗОН 5) 412333 сассстсссаасоасастса (экзон 5) 124238 ааасатстаасгптсстса (Старые лидерные) 124212 ссасаасстстсСАСТстаа (Старые лидерные)
Фиг. 7В
N2 нуклеотида
Фиг. 8
- 51 022207
Граммы
Доза (мг/кг)
Экспериментальная группа
Фиг. 10
Фиг. 11
- 52 022207
250
День 1 День 3 День 7 День 14
Фиг. 12
- 53 022207
Список последовательностей <110> ЕхсаЫадв РЬартпасеиРЬса1з, 1пс.
1315 РЬагтасеирЬсаЬз, 1пс, <120> Антисмысловые олигонуклеотиды против фактора роста соединительной ткани и способы их применения <130> 79241-А-РСТ/дРИ/СЗ <140> РСТ/и52009/054973 <141> 2009-08-25 <150> 61/190,121 <151> 2008-08-25 <160> 167 <170> РаРепРШ уегзЬоп 3.5 <21ΰ> 1 <211> 20 <212> ДНК <2ЬЗ> Искусственная последовательность <220>
<223> Положительный контрольный олигонуклеотид к Н'газ человека <4ΰΰ> 1
РссдРсаРсд сРссРсаддд 20 <210> 2 <211> 2075 <212> ДНК <213> Нолю зарЬепз <220>
<221> экзон <222> (130)..{118ΰ^ <400> 2 сссддссдас адссссдада сдасадсссд дсдсдРсссд дРссссассР ссдассассд 60 ссадедсРсс аддссссдсд сРссссдсРе дссдссассд сдсссРссдс Рссдессдса 120 дРдссаасс аРд асе дсс дсс адР аРд ддс сое дРс сде дРс дсс РРс дРд 171
Мер ТЬг АЬа АЬа Зег Мер СЬу Рго УаЬ Агд УаЬ АЬа РЬе УаЬ 15 10
дРс УаЬ 15 срс Ьеи сРс дсс Ьеи АЬа сРс Ьеи Рдс Суз 20 аде Зег едд Агд ссд дсс дХс ддс сад аас Рдс аде 219 Рго АЬа УаЬ 25 СЬу СЬп Азп Суз Зег 30 ддд ссд Рдс едд Рдс ссд дас дад ссд дед ссд сдс Рдс ссд дед ддс 267 СЬу Рго Суз Агд Суз Рго Азр <31и Рго АЬа Рго Агд Суз Рго АЬа ОЬу 35 40 45 дРд аде срс дЕд сРд дас ддс Рдс ддс Рдс Рдс сдс дРс Рдс дсс аад 315 УаЬ Зег Ьеи Уа1 Ьеи Азр <31у Суз ОЬу Суз Суз Агд УаЬ Суз АЬа Ьуз 50 55 60 сад сРд ддс дад сРд Рдс асе дад сдс дас ССС Рдс дас ссд сас аад 363
- 54 022207
σΐη Ьеи <31у 65 ОЬи ьеи Суз ТЬг 01и 70 Агд Азр Рго Суз Азр 75 Рго НЬз Ьуз ддс обе ЬЬе бдб дас ЬЬе ддс Ьсс сед дсс аас сдс аад аЬс ддс дбд 411 С1у Ьеи 80 РЬе Суз Азр РЬе СЬу 85 Зег Рго А1а Азп Агд 90 Ьуз Не СЬу УаЬ ьдс асе дсс ааа даь ддь дсб ссс Ьдс аЬс ЬЬе ддь ддь асд дбд бас 459 Суз 95 ТЬг А1а Ьуз Азр С1у 100 АЬа Рго Суз 11с РЬе 105 ОЬу ОЬу ТЬг УаЬ Туг 110 сдс аде дда дад Ьсс ььс сад аде аде Ьдс аад Ьас сад Ьдс асд бде 507 Агд Эег 91у СЬи Зег 115 РЬе СЬп Зег Зег Суз 120 Ьуз туг ОЬп Суз ТЬг 125 Суз сЪд дас ддд дед дед ддс бде аЬд ссс сьд Ьдс аде аЬд дас дбб едб 555 Ьеи Авр □1у АЬа 130 Уа1 С1у Суз МеЬ Рго 135 Ьеи Суз Зег МеЬ Азр 140 УаЬ Агд сьд ссс аде ссб дас Ьдс ссс ЬЬе сед адд адд дЬс аад сЬд ссс ддд 603 Ьеи Рго Зег 145 Рго Азр Суз Рго РЬе 150 Рго Агд Агд УаЬ Ьуз 155 Ьеи Рго СЬу ааа бде Ьдс дад дад ьдд дбд Ьдь дас дад ссс аад дас саа асе дбд 651 Ьуз Суз 160 Суз 01и С1и Тгр УаЬ 165 Суз Азр 01и Рго Ьуз 170 Азр ОЬп ТЬг УаЬ дЬЬ ддд ссЬ дсс сЬс дед дсб Ьас еда сЬд даа дас асд ЬЬЬ ддс сса 699 νδΐ 175 ОЬу Рго А1а Ьеи АЬа ιβο АЬа Туг Агд Ьеи О1и 185 Азр ТЬг РЬе СЬу Рго 190 дас сса асЬ абд аЬЬ ада дсс аас Ьдс сЬд дЬс сад асе аса дад бдд 74 7 Азр Рго ТЬг Меб 11е 195 Агд АЬа Азп Суз Ьеи 200 УаЬ С1п ТЬг ТЬг СЬи 205 Тгр аде дсс ЬдЬ бес аад асе едб ддд аЬд ддс аЬс Ьсс асе едд Збб асе 795 Зег А1а Суз Зег 210 Ьуз ТЬг Суз С1у МеЬ 215 О1у 11е Зег ТЬг Агд 220 УаЬ ТЬг аас дас аас дсс Ьсс Ьдс адд сЬа дад аад сад аде еде сЬд бде аЬд 843 Азп Азр Азп 225 А1а Зек Суз Агд Ьеи 230 <31и Ьуз 01п Зег Агд 235 Ьеи Суа МеЬ дЬс адд ссЬ бде даа дсЬ дас сьд даа дад аас аЬЬ аад аад ддс ааа 891 Уа1 Агд 240 Рго Суз С1и А1а Азр 245 Ьеи С1и ОЬи Азп 11е 250 Ьуз Ьуз СЬу Ьуз аад бде аЬс едб асЬ ссс ааа аЬс Ьсс аад ссЬ аЬс аад ЬЬЬ дад сЬЬ 939 Ьуз 255 Суз Не Агд ТЬг Рго 260 Ьуз Не Зег Ьуз Рго 265 Не Ьуз РЬе СЬи Ьеи 270 Ьс£ ддс Сде асе аде аЬд аад аса Ьас еда дсЬ ааа ЬЬе ьдь дда дЬа 987 Зег <31у Суз ТЬг Зег 275 МеЬ Ьуз ТЬг Туг Агд 280 АЬа Ьуз РЬе Суз еьу 285 Уа1 ьдь асе дас ддс еда Ьдс бде асе ссс сас ада асе асе асе сбд ссд 1035 Суй ТЬг Азр О1у 290 Агд Суз Суз ТЬг Рго 295 Нхз Агд ТЬг ТЬг ТЬг 300 Ьеи Рго дбд дад ЬЬе аад Ьдс ссЬ дас ддс дад дЬс аЬд аад аад аас абд аЬд 1033 УаЬ 01 и РЬе 305 Ьуз Суз Рго Азр <31у 310 С1 и Уа1 МеЬ Ьуз Ьуз 315 Азп Меб МеЬ ббс абс аад асе ЬдЬ дсс бде саЬ Ьас аас ЬдЬ ссс дда дас ааб дас 1131
- 55 022207
РНе Не Ьуд 320 ТНг Суз А1а Суз 325 Нхз Туг Азп Суз Рго 330 <31у Азр Азп Аар аьс ддд даа есд сдд Дас Дас адд аад аЬд Дас дда дас аДд дса Ьда а 1180 Не РНе С1и 5ег Ьеи Туг Туг Агд Ьуз МеД Туг О1у Аер МеД А1а
335 340 345
дссадададД дададасаДД аасДсаДДад асДддаасДД даасДдаДДс асаДсДсаДД 1240 ДДДссдДааа ааДдаДДДса дДадсасаад ДДаДДДаааД сДдДДДДДсД аасДддддда 1300 ааадаДДссс асссааДДса ааасаДДдДд ссаДдДсааа саааДадДсД аДсДДсссса 1360 дасасДддДД ДдаадааДдД ДаадасДДда садДддаасД асаДДадДас асадсассад 1420 ааДдДаДаДД ааддедеддс дддаддадса дедддаддде ассддсссдд ДДадДаДсаД 1480 садаДсдасД сееаьасдад ДааДаДдссД дсДаДДДдаа дДдДааДДда дааддааааД 1540 ДДДадсдДдс ПсасЪдассе дссДдДадсс ссадДдасад сДаддаДдДд саДДсДссад 1600 ссаДсаадад аседадесаа дДДдДДссДД аадДсадаас адсадасДса дсДсДдасаД 1660 ДсДдадДсда аЪдасасСдС ДсаддааДсд дааДссДддс даДДадасДд дасадсДДдД 1720 ддсаадДдаа ЪЬСдссЬдЬа асаадссада ддддддаааа ДДДаДаДДдД аааДаДДдДд 1780 ьдДдДдДдДд ЪдСдЬдеаеа ДаДаДаДаДа ДаДдДасадД ДаДсдаадДД ааДДДааадД 1840 ДдДДДдДдсс есеееаеееъ ДдДДДДДааД дсДДДдаДаД ДДсааДдДДа дссДсааДДД 1900 сДдаасасса Ъаддеадаае дДааадсДДд ДсДдаДсдДД сааадсаДда ааДддаДасД 1960 ДаДаДддааа ПСсЬдсЬсад аДадааДдас адДссдДсаа аасадаДДдД ДДдсаааддд 2020 даддсаДсад едесееддса ддсДдаДДДс ДаддДаддаа аДдДддДадс Дсасд 2075
<210> 3 <211> 22 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Верхняя затравка для ПЦР к фактору роста соединительной ткани человека <400> 3 асаадддссД сДДсДдДдас ДД 22 <210> 4 <211> 22 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Нижняя затравка для ПЦР к фактору роста соединительной, ткани человека <400> 4 ддДасассдД ассассдаад аД 22 <210> 5 <211> 23
- 56 022207 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Зонд для ПЦР к фактору роста соединительной ткани человека <400> 5
ЬдЬдсассдс сааадаЪддЬ дсЬ 23 <2Ю> 6 <211> 19 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> верхняя затравка для ПЦР к οαρώη человека <400> 6 дааддЪдаад дГсддадЪс 19 <210> 7 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Нижняя затравка для ПЦР к (ЗАРОН человека <400> 7 даадасддьд аЬдддаЪЪЪс 20 <210> 8 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Зонд для ПЦР к ΟΑΡΏΗ человека <400> 8 саадсъьссс дЪЪсЬсадсс 20 <210> 9 <211> 2358 <212> ДНК <213> Ното зартепз <220>
<221> экзон <222> (207).,(1256) <400> 9
ааасЁсасас аасаасЬсЬЬ ссссдсСдад аддадасадс садЬдсдасй ссасссЬсса 60 дсбсдасддс адссдссссд дссдасадсс ссдадасдас адсссддсдс дСсссддСсс 120 ссассЪссда ссассдссад сдсГссаддс сссдссдсЬс сссдсСсдсс дссассдсдс 180 ссСссдсСсс дсссдсадСд ссаасс асд асе дсс дсс ад С аСд ддс ссс дСс 233
- 57 022207
МеН ТЬг А1а А1а Зег Мее С1у Рго Уа1 1 5 сдс дес дсс еес дЪд дес сес сЪс дсс сес еде аде едд ссд дсс дес 281
Агд Уа1 А1а РЬе Vа1 Уа1 Ьеи Ьеи А1а Ьеи Суз Зег Агд Рго А1а Уа1
10 15 20 25 ддс сад аас еде аде ддд сед еде едд еде ссд дас дад ссд дед ссд 329
С1у Θΐη Азп Суз Зег <31у Рго Суз Агд Суз Рго Азр <31и Рго А1а Рго
30 35 40 сдс еде ссд дед ддс дед аде сес дед сед дас ддс еде ддс еде еде 377
Агд Суз Рго А1а С1у Уа1 Зег Ьеи Уа1 Ьеи Азр <31у Суз С1у Суз Суз
45 50 55 сдс дес Ъдс дсс аад сад сед ддс дад сед еде асе дад сдс дас ссс 425
Агд Уа1 Суз А1а Ьуз <31п Ьеи С1у <31и Ьеи Суз ТЬг <31и Агд Азр Рго
60 65 70 еде дас ссд сас аад ддс сес еес еде дас еес ддс есс ссд дсс аас 473
Суз Азр Рго Н1з Ьуз О1у Ьеи РЬе Суз Азр РЬе <31у бег Рго А1а Азп
75 30 85 сдс аад аес ддс дед Сдс асе дсс ааа даС ддс дсС ссс еде асе еес 521
Агд Ьуз Не О1у Уа1 Суз ТЬг А1а Ьуз Азр <31у А1а Рго Суз 11е РЬе
90 95 100 105 ддС ддС асд дед Сас сдс аде дда дад Ссс ССс сад аде аде Сдс аад 569
С1у С1у ТЬг Уа1 Туг Агд бег С1у С1и бег РЬе <31п бег Зег Суз Ьуз
110 115 120
Сас сад Сдс асд Сдс сСд дас ддд дед дСд ддс Сдс аед ссс сед Сдс 617
Туг <31п Суз ТЬг Суз Ьеи Азр С1у А1а Уа1 С1у Суз МеС Рго Ьеи Суз
125 130 135 аде аСд дас дСС еде сед ссс аде ссС дас Сдс ссс еес ссд адд адд 665 бег МеС Азр Уа1 Агд Ьеи Рго бег Рго Азр Суз Рго РЬе Рго Агд Агд
140 145 150 дСс аад сСд ссс ддд ааа еде еде дад дад едд дед еде дас дад ссс 713
Уа1 Ьуз Ьеи Рго <31у Ьуз Суз Суз С1и С1и Тгр Уа1 Суз Азр О1и Рго
155 160 165 аад дас саа асе дед дее ддд ссе дсс сес дед дсе еас еда сед даа 761
Ьуз Азр С1п ТЬг Уа1 Уа1 С1у Рго А1а Ьеи А1а А1а Туг Агд Ьеи С1и
170 175 180 185 дас асд еее ддс сса дас сса асе аед аее ада дсс аас еде сед дес 809
Азр ТЬг РЬе С1у Рго Азр Рго ТЬг Мее 11е Агд А1а Азп Суз Ьеи 57а 1
190 195 200 сад асе аса дад едд аде дсс еде Ъес аад асе еде ддд аед ддс аес 857 <31п ТЬг ТЬг С1и Тгр бег А1а Суз бег Ьуз ТЬг Суз С1у Мее С1у 11е
205 210 215 есс асе едд дее асе аае дас аас дсс есс еде адд сеа дад аад сад 905 бег ТЬг Агд 57а 1 ТЬг Азп Азр Азп А1а бег Суз Агд Ьеи (31и ьуз <31п
220 225 230 аде сдс сед еде аед дес адд ссе еде даа дсе дас сед даа дад аас 953 бег Агд Ьеи Суз Мее 5/а1 Агд Рго Суз С1и А1а Азр Ьеи <31и С1и Азп
235 240 245 аее аад аад ддс ааа аад еде аес еде асе ссс ааа аес есс аад ссе 1001
- 58 022207
Не 250 Ьуз Ьуз 61у Ьуз Ьуз 255 Суе 11е Агд ТЫ Рго 260 Ьуа 11е йег Ьув Рго 265 аЪс аад ЬЫ дад сЪЬ ГсЬ ддс Ьдс асе аде аЪд аад аса Ъас еда дсь 1049 Не Ьуз РЬе еьи Ьеи Зег <31у Суз ТЬг Зег МеЬ Ьуз ТЬг Туг Агд А1а 270 275 280 ааа Ыс ЬдЬ дда дЬа ЬдЬ асе дас ддс еда Ъдс бде асе ссе сас ада 1097 Ьуз РЬе Суз Й1у Уа1 Суз ТНг Азр 01у Агд Суз Суе ТЬг Рго Нхз Агд 285 290 295 асе асе асе сбд сед д£д дад Ыс аад еде ссЬ дас ддс 9ад дне аСд 1145 ТЬг ТЬг ТЬг Ъеи Рго Уа1 <31и РЬе Ьуз Суз Рго Азр <31у <э1тл νβΐ ИеЬ 300 305 310 аад аад аас абд аЪд ЬЬе абс аад асе ЬдЬ дсс бде саб £ас аас СдЬ 1193 Ьуз Ьуз Азп Меб МеЪ РЬе Не Ьуз ТЬг Суз А1а Суе НЬз Туг Азп Суз 315 320 325 есс дда дас ааб дас аЬс ббб даа бед с£д Ьас бас адд аад аЬд Ёас 1241 Рго С1у Азр Азп Азр Не РЬе 01и Зег Ьеи Туг Туг Агд Ьуз МеЬ Туг 330 335 340 345
дда дас абд дса бда адссададад бдададасаб баасбсабба дасбддаасб 1296
С1у Аар Меб АЬа
ЬдаасЬдаЫ сасаьысаЬ ЫЫссдЬаа аааЬдаЫЬс адЬадсаеаа дЫаЫСааа 1356 ЪсЬдЫЫЬс СаасЬддддд аааадаЫсс сасссааЫс аааасаЫдЬ дссаЬдСсаа 1416 асаааЬадЬс (заЬсаасссс адаеасЪддЬ ЫдаадааЬд ЫаадасЫд асадЬддаао 1476 ЪасаЫадСа сасадсасса дааЪдЪаЪаЬ СааддЬдЪдд сЫСаддадс адгдддаддд 1536 Сассадсада ааддЫадЬа ЫаЪсадаЪа дсаесЫаЪа сдадЬааъаЬ дссЪдсЬаЫ 1596 ЬдаадЬдЬаа Ыдадаадда аааЫЫадс дЬдсЪсасЬд ассЪдссСдЬ адссссадСд 1656 асадсСадда едОдсаЫсЬ ссадссаЬса ададасЪдад ЬсаадЫдЫ ссЫаадЪса 1716 даасадсада сЬсадсЪсСд асаЫсЪдаЬ ЪсдааЪдаса сЪдЫсадда аЬсддааЬсс 1776 ЬдЪсдаЫад асЬддасадс ЫдЪддсаад £дааыс.дсс ЪдЬаасаадс садаЫЫЫ 1836 ааааЪЬЬаС.а ЫдСаааЪаЬ СдЬдЪдЬдЬд СдЬдЬдЬдЪд ЬаЬаЬаЬэЬа ЬаЬаСдЬаса 1896 дЫаЬЫаад ЫааЫЪааа дЫдЫЬдЬд ссшиаи ЫЬдЬЫЫа аЪдсЬЫдаЪ 1956 аЬЫсаа^дЬ ЬадссЪсааЪ ЫсЪдаасас саЪаддЪада аЪдЪааадсИ ЪдЪсСдаЬсд 2016 ЫсааадсаЬ даааЪддаЬа сыаъагдда ааЫсЬдсЪс адаЬадааЬд асадЬссдЬс 2076 аааасадаЫ дЫЬдсааад дддаддсаЫ адЪдЬссЫд дсаддсЬдаЬ ЫсЬаддЬад 2136 даааЪдСддЬ адссЬсасЫ ЫааЬдааса ааЬддссЬЫ аЫааааасЬ дадЬдасЬсЬ 2196 аЬаЪадсЬда ГсадЫЫЫ сассЬддаад саЫЬдЫЬс ЪасЪЫдаЬа ЪдасЬдЫЫ 2256 ЫддасадЫ ЬаЫЬдЫда дадЪд^дасс аааадЫаса ЪдЫЪдсасс ЪЫсЬадЫд 2316 ааааЬааадЬ дЪаЪаЫЪЫ Ъс^аЪааааа аааааааааа аа 2358
- 59 022207 <210> 10 <211> 6001 <212> ДНК <213> Ногпо зарЬепз <400> 10
ДабаДРаССс асСдСсааСс ьеадеьеаеа СссадаСаса асадддбаса сьдсьсььдь 60 ааДддааЬса дасЕЛсЪЬаЬ ЪЬДаасаада сааассаааЪ ссааессаса ССЬдаадаЬС 120 аСаддСЬЬЬа аЬаСаадааа аЬдсасРсаС ЬЬсДсааада сссеадрдаа дсЬдЬдЬЬЬа 1В0 ааЬдсЬссба ддДдаасссс сЬЁЬдсаРсс садДдССссс ассседасас ссададсссс 240 РассРассса асасадааЬс аЬЁЬдсРсрд аЬадаасааЬ ддаЬсссЬЬД ЬЬсЬддааас 300 аьсдаьддсс асДссЬсссР ЬдРссЬЬдсс ДаеаСаааас СссЬасаЬаЬ аЬЬаададаа 360 аасЬаадсаа дадЬЬЬЬдда ааЬсЬдсссс аддадасбдс аЬссЬдадрс асасдсдЬсЬ 420 ЬЬдЬРсЬсЬЬ ЬсЬЬдЬссса ааассдЬРас сЬсаадЬдас аааедаДсаа аЬсЬсаааЬа 480 ЬадааЬЬсад ддЬЪЬЬасад дЬаддсаЬсЬ РдаддаЬЪЬс аааЬддЬЬаа аадсаасЬса 540 сЬссСЪЬЬс!: асРсЬЬЬдда дадЬЬЬсаад адссЬабадс сЪсЬаааасд саааСсаЬЬд 600 сЪаадддЪЪд ддддддадаа ассЬЬЬСсда аЬЬЬЬЬСадд ааеессрдсЬ дЬЬЬдссЬсЬ 660 СсадсДасск асъъссбааа ааддаЬдРаС дЬсадЪддас адаасадддс ааасььаььс 720 дааааадааа ЬаадаааГаа РЬдссадЬдЬ деееаРаааД даЬаОдааОс аддадЬддЬд 780 сдаададдак адддаааааа аааЬЬсСаЬЬ ЬддЬдсЬдда ааСаседсдс СЬЬЬЬСЬСЬС 840 ссЬССРЪЬЬЬ ЬЬЬЪСсЬдЬд адсСддадСд ЬдссадсСЕС СЬсадасдда ддааьдсьда 900 дЪдЬсааддд дЬсаддаЬса аЬссддСдСд адЬЬдаЬдад дсаддаадде ддддаддааб 960 дсдаддааЬд ЬсссЪдЬЬЬд ЬдЬаддасбс саЬСсадсбс аееддсдадс сдсддссдсс 1020 сддадсдЬаЬ аааадссЬсд ддссдсссдс сссаааскса сасаасаасе сЬЬссссдсЬ 1080 дададдадас адссадЬдсд асСссасссР ссадсСсдас ддсадссдсс ссддссдаса 1140 дссссдадас дасадсссдд сдсдЬсссдд ессссассЬс сдассассдс садсдсСсса 1200 ддссссдссд сЪссссдсбс дссдссассд сдсссСссдс ессдсссдса дЬдссаасса 1260 Ъдассдссдс садЪаЪдддс сссдСссдсд ЬсдссСЪсдС ддЬссесскс дсссСсЬдса 1320 дссдддЬаад сдссдддадс ссссдсбдсд дссддсддсЬ дссадддадд дасЬсддддс 1380 сддссдддда дддсдбдсдс дссдассдад сдссдседас сдсссЬдСсс ЬсссЬдсадс 1440 сддссдЬсдд ссадаасЬдс адсдддссдЬ дссддЬдссс ддасдадссд дсдссдсдсЪ 1500 дсссддсддд сдЬдадссСс дЬдсЬддасд дсбдсддсСд сгдссдсдбс Ьдсдссаадс 1560 адсЬдддсда дсьдбдсасс дадсдсдасс саЪдсдассс дсасаадддс сьаььсьдьс 1620 асРЬсддсЬс сссддссаас сдсаадэесд дсдСдЬдсас сддраадасс сдсадссссс 1680 ассдсбаддЪ дЪссддссдс сЬссЬсссЬс асдсссассс дсссдсЬдда аааадааасс 1740
- 60 022207
дсбсддасбд адбббсбббс бссадсбдсб дссадсссдс ссссбдсадс ссадабссса 1800 асбсдсабсс сбдасдсбсб ддабдбдада дбдссссааб дссбдассбс бдсабссссс 1860 ассссбсбсб бсссббссбс ббсбссадсс ааадабддбд сбсссбдсаб сббсддбддб 1920 асддбдбасс дсадсддада дбссббссад адсадсбдса адбассадбд сасдбдссбд 1930 дасддддсдд бдддсбдсаб дссссбдбдс адсабддасд ббсдбсбдсс садсссбдас 2040 бдссссббсс сдаддадддб саадсбдссс дддааабдсб дсдаддадбд ддбдбдбдас 2100 дадсссаадд ассааассдб ддбЬдддссб дсссбсдсдд дбдадбсдад бсббссбсба 2160 адбсадддбс дбдаббсбсб сссадддадд дадбссбаас бдбдссдасс даасддддда 2220 аабассббаб ссаддсдббб басабддбдб ббдбдбдсбс бдсбсбсдса дсббассдас 2280 бддаадасас дбббддссса дасссаасба бдаббададс саасбдссбд дбссадасса 2340 сададбддад сдссбдббсс аадассбдбд ддабдддсаб сбссасссдд дббассаабд 2400 асаасдссбс сбдсаддсба дадаадсада дссдссбдбд сабддбсадд ссббдсдаад 2460 сбдассбдда ададаасабб ааддбасабд ббсбдсбссб аббааобабб бббоасадда 2520 аааасадбдд абаддассса асббадддсб сббдссасдс ббдббадбаб аадсссдбба 2580 бсбссаааас бабсбаасса ббдадсбдбб ббдсбддааб дададсббдб дбаабадсаа 2640 ссассадббб бссасбасда аабсббссас адддббадбб ааббсаадас аббссаадад 2700 аддсбсбддс бабббббдда сабадсаааб дадасбсааа сббссбсссс бсаааабаба 2760 аасадаадбс адасаасада адасбаааас асададддбб даадааадсс асбссбсббд 2820 бададбсдсб дабббббббб бббссбсбсб сббббсссбб дбсббссбба даадддсааа 2880 аадбдсабсс дбасбсссаа аабсбссаад ссбабсаадб ббдадсбббс бддсбдсасс 2940 адсабдаада сабассдадс баааббсбдб ддадбабдба ссдасддссд абдсбдсасс 3000 ссссасадаа ссассасссб дссддбддад ббсаадбдсс сбдасддсда ддбсабдаад 3060 аадаасабда бдббсабсаа дассбдбдос бдссаббаса асбдбсссдд адасаабдас 3120 абсбббдааб сдсбдбасба саддаадабд басддадаса бддсабдаад ссадададбд 3180 ададасабба асбсаббада сбддаасббд аасбдаббса сабсбсаббб ббссдбаааа 3240 абдабббсад бадсасаадб бабббааабс бдбббббсба асбдддддаа аадаббссса 3300 сссааббсаа аасаббдбдс сабдбсааас ааабадбсба бсаассссад асасбддббб 3360 даадаабдбб аадасббдас адбддаасба саббадбаса садсассада абдбабабба 3420 аддбдбддсб ббаддадсад бдддадддба ссадсадааа ддббадбабс абсадабадс 3480 абсббабасд адбаабабдс сбдсбабббд аадбдбаабб дадааддааа аббббадсдб 3540 дсбсасбдас сбдссбдбад ссссадбдас адсбаддабд бдсаббсбсс адссабсаад 3600 адасбдадбс аадббдббсс ббаадбсада асадсадасб садсбсбдас аббсбдаббс 3660
- 61 022207
дааСдасасС дСЬсаддааС сддааСссСд ЬсдаЬЬадас СддасадсЬЬ дСддсаадСд 3720 ааССЬдссЬд Саасаадсса даессссьаа ааССЬаСаЬС дЬаааСаЬСд ЬдСдСдСдСд 3780 ЬдСдЬдСдЬа СаЬаСаСаСа СаЬдЬасадЪ СаСсГаадЬС ааьссааадс СдССЬдСдсс 3340 СЪСССаЬССЪ СдСССЬСааЬ дсСЬСдаСаС ССсааЬдСЬа дссСсааЬСЬ сСдаасасса 3900 ЬаддСадааС дсааадсьСд есЬдаСсдСС сааадсаСда ааЬддаСасС СаСаЪддааа 3960 СЬсСдсСсад аСадааСдас адСссдСсаа аасадаССдС ССдсаааддд даддсаСсад 4020 СдСссЬЬддс аддсСдаЬСС сСаддСадда ааСдСддЬад ссСсасСССЪ ааСдаасааа 4080 СддссЬССаЪ ЬааааасЬда дЬдасЬсЬаЬ аЬадсЬдаСс адЬССЬСЬса ссСддаадса 4140 СССдСГСсСа сССЬдаСаГд асСдСЬСЬСс ддасадЬЬЬа СССдССдада дСдСдассаа 4Ξ00 аадСГасаЬд ЬЬЬдсассСС ЬсСадСЬдаа ааСааадСдЪ аЬаЬЪССССС СаЬааадддс 4260 ЬЬддССаСес аСССаЬссГС сСааасаССЬ сГдадЬЬССс ССдадсаЬаа аСаддаадЫ: 4320 сССаССааСс аСаадаСааС СсассааСаа ССССсСаааС аСсЬССааСС аССсСаСаса 4330 ЬСааСаааЬС даЬЬаЬЬсса СадааЬЪЬСЬ аЬдСааасаЬ асССсасасС дааЬсаадЬа 4440 СсасадасСС дсаддсаСас асассасась дасСаСасад ссаьсесесь СдЫгаСсЬСс 4500 асадаасСЬС аСадасасьс СаааССсааС ЪсЬсьсСада СЬасССсадС сЬссаСЬаас 4560 ссЬдССдЪаС СасасСЪддС ссЬЬГХддса ЬЬСдЬассСс ЬсЬддссдЬЬ аСаддЪЬадС. 4620 ССссаасссг СсасаЬсаса аасСадСсСа СдСдссЬСдс асдСддаааа ЬдЬССасаЫ: 4680 ССССаааааС СССаСдсЬсС аддсссдсъс сСдаасЪСса СЪассССасЬ дССаааЬсЬд 4740 ааааСЪаСда ааЬдаааЬсс СсаЬСЬаааС ддадсСаССС саСаадЬсЬЬ дССССдСаЬа 4800 аССссдсььс ЬддЬСдссаС даСаассааС дасааасада ЬддсаСаааЪ адааааддда 4860 ддасдадсаа аЬсССссаЬС саСЬаасаСС ааСадаааСС СдССССдааа дСааССссЬс 4920 саСССдссса адСсСЬСадс ЬССаСсадас ССссадаЬЬа аСдсаТссСа ссЬСассаад 4980 СддЬСЬаСас аСдадааааС ддааССдССс аадаадссЬс аСдСддааас ааСаСгдСас 5040 сЬасссаддС аддЬСЬСЬас СааададСда ассааадЬда аГддСаааса ааадсааСас 5100 асеаааддса асЬадааГсЬ СсСссасаСд аддаСадсСд аддаЬСсЪад дддааааааа 5160 ааССдсадас адасСаасье ЬЬсссааддЬ ааЬСадсаас дЬЬдЬадЬдс сааСдСсаЬС 5220 Сддасадаса ааааСасасс СдааааГааа дасГадсСсС асааасаасС дЬссасасса 5280 сааассааад ддаааасЬЬс ссдЬдЬСсад ааСдЪдаааа ЬЪСаЬддЬса ааасЬсСддд 5340 сСЬЬааддаЬ асасссасаЬ сСдЬаЬаЬад садЬдсЬдсс аддадсадса ссссассЬсс 5400 ссааасааас дсдсаЬдЬас асаЬасасаС аддсасасас асададЬаса сЬдССадССс 5460 асасСЬссЬС ЪсЬдСсааЪС ааЬСссСаас ЪдсааадаЬд аадддссаьд саЬдаЪааас 5520 дадасСдасС асСдааЬЪад адсаЪЬсСдд аааЬаСадаа дсадсаддаа аадсаЪадаС 5580
- 62 022207
ЕЕсасаСЕСЕ осаааЪассс асаСОааада ааааааааад адЪсасОада СОдсааааса 5640 ааааДсссас аддсаадддс СсСасааааа ъъада^ддса аЪдсасасСЪ Ъсасссссса 5700 ааьадсддад д^адддддЬд ссаааОсаДс аассассдДа адаДсЪдсас сдДдДсадса 5760 саЬдЕдЬдад аааадсадад ааасаасаад дЪаЪсЬдаЪд сСЪс£дадаа сасдададсО 5820 сЬсааасадс садсаддСад ОсасОадаЪа ЪаЪадааддс саддсЬдаса дсадсЬдЬЬд 5880 ааСсСадСад дддЬЬЬддсс ЬадсасЬсса асааадсЬЬа саадссаддд сЬдссЬссса 5940 ддадаадаЪс сЬсаСасДсс ЬддаадЬдда аЬсЬаааЬЬд адсаддЬсас садасадаЬд 6000
о 6001 <210> 11 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Антисмысловой олигонуклеотид к фактору человека роста соединительной ткани <400> 11 ссадсЬдсЬЬ ддсдсадасд 20 <2Ю> 12 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220> <223> Антисмысловой олигонуклеотид к фактору человека роста соединительной ткани <400> 12 дс садааадс ЬсааасЬ Ода 20 <210> 13 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220> <223> Антисмысловой олигонуклеотид к фактору человека роста соединительной ткани <400> 13 ссасаадсДд ЬссадЬсЬаа 20
<210> <211> <212> <213> 14 20 ДНК Искусственная последовательность <220> <223> Антисмысловой олигонуклеотид к фактору роста соединительной ткани
человека
- 63 022207 <4005 14 ддбсасасбс бсаасаааба <210> 15 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Антисмысловой олигонуклеотид к фактору роста соединительной ткани человека <400> 15 ааасабдбаа сббббддбса <210> 16 <2115 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <2205 <223> Антисмысловой олигонуклеотид к фактору роста соединительной ткани человека <400> 16 дддаададбб дббдбдбдад <210> 17 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Антисмысловой олигонуклеотид к фактору роста соединительной ткани человека <400> 17 адддбддадб сдсасбддсб <210> 18 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <2205 <223> Антисмысловой олигонуклеотид к фактору роста соединительной ткани человека <4005 18 асдааддсда сдсддасддд <210>
<211>
<212>
<213>
днк
Искусственная последовательность <220>
- 64 022207 <210> 24 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность
- 65 022207 <210> 29 <211= 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность
- 66 022207 <220 = <22 3> Антисмысловой олигонуклеотид к фактору роста соединительной ткани человека <400= 29 аддсссаасс асддхСХддД <210 = 30 <211 = 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220 = <223= человека
Антисмысловой олигонуклеотид к фактору роста соединительной ткани <400 = 30 адддсаддсс саассасддХ <210= 31 <211 = 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220 = <223> человека
Антисмысловой олигонуклеотид к фактору роста соединительной ткани <400= 31
Ьаадссдсда дддсаддссс
<210 = 32 <211 = 20 <212= ДНК <213> Искусственная последовательность <220 = <223> Антисмысловой олигонуклеотид к фактору человека
<400= 32 сссасаддХс ДЪддаасадд <210= 33 <211= 20 <212 = ДНК <213> Искусственная последовательность <220 = <223> человека
Антисмысловой олигонуклеотид к фактору роста соединительной ткани <400= 33 адаХдсссаХ сссасаддЬс
- 67 022207 <210> 34 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> челове Антисмысловой ка олигонуклеотид к фактору роста соединительной ткани <400> 34 ссадбсбааб дадббаабдб 20 <210> 35 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220> <223> Антисмысловой олигонуклеотид к фактору роста соединительной ткани
человека
<400> 35 ££саад££сс адСсСааЪда 20
<210> <211> <212> <213> 36 20 ДНК Искусственная последовательность <220> <223> Антисмысловой олигонуклеотид к фактору роста соединительной ткани
человека
<400> 36 ббббссссса дббадааааа 20 <210> 37 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220> <223> Антисмысловой олигонуклеотид к фактору роста соединительной ткани человека <400> 37 сасааьд^ЪЪ Ъдаа££ддд£. 20 <210> 38 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220> <223> Антисмысловой олигонуклеотид к фактору роста соединительной ткани
человека
- 68 022207 <400? 38 асаСддсаса аСдЬСССдаа 20 <210? 39 <211? 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220?
<223> челове Антисмысловой ка олигонуклеотид к фактору роста соединительной ткани <400> 39 дССЪдасаСд дсасаабдСЬ <210? 40 <211? 20 <212> днк <213? Искусственная последовательность <220? <223> Антисмысловой олигонуклеотид к фактору роста соединительной ткани
человека <400? 40 йаййЬдСЬЬд асакддсаса 20 <210? 41 <211? 20 <212? ДНК <213> Искусственная последовательность
<220> <223> челове Антисмысловой ка олигонуклеотид к фактору роста соединительной ткани <400> 41 НдаЬадасСа СЪЬдНЬЪдас 20 <210? 42 <211? 20 <212? Днк <213> Искусственная последовательность <220? <223> Антисмысловой олигонуклеотид к фактору роста соединительной ткани
человека <400? 42 дссссаседь саадСсььаа 20 <210? 43 <211? 20
- 69 022207 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> челове Антисмысловой олигонуклеотид ка к фактору роста соединительной ткани <400> 43 ДдГасВааДд СадеессасЬ 20 <2Ю> 44 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220> <223> Антисмысловой олигонуклеотид к фактору роста соединительной ткани
человека
<400> 44 саЛЪсЬддСд с£д£д£асьа 20
<210> <211> <212> <213> 45 20 ДНК Искусственная последовательность <220> <223> Антисмысловой олигонуклеотид к фактору роста соединительной ткани
человека
<400> 45 ЬааЬа^асаД ЬсСддЪдсЪд 20 <2Ю> 46 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220> <223> Антисмысловой олигонуклеотид к фактору роста соединительной ткани человека <400> 46 асасс££ааД аСаса1Хс£д 20 <210> 47 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220> <223> Антисмысловой олигонуклеотид к фактору роста соединительной ткани
человека
- 70 022207 <210> 52 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность
- 71 022207
- 72 022207
<210> 57 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220> <223> Антисмысловой олигонуклеотид к фактору человека
<400> 57 дааОсадааЪ дЬсададсЪд <210> 58 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223>
Антисмысловой олигонуклеотид к фактору роста соединительной ткани человека <400> 58 саХХдаааЬа СсааадсаСС
<210> 59 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220> <223> Антисмысловой олигонуклеотид к фактору человека
<400> 59 ддсСаасаЪС даааСаПсаа <210> 60 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220> <223> человека
Антисмысловой олигонуклеотид к фактору роста соединительной ткани <400> 60 ааЪХдаддсХ аасаХХдааа <210> 61 <211> 20 <212> ДНК <2ХЗ> Искусственная последовательность <220>
- 73 022207
- 74 022207 <210> 66 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220=·
<223> челове Антисмысловой ка олигонуклеотид к фактору роста соединительной ткани <400> 66 даСсадасаа дсСССасаСС <210> 67 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220=· <223> Антисмысловой олигонуклеотид к фактору роста соединительной ткани
человека <400=· 67 аХдсХХСдаа сдаСсадаса 20 <210> 68 <211=· 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Антисмысловой олигонуклеотид к фактору роста соединительной ткани человека <400=· 68 аСЬСсаСдсС ССдаасдаСс 20 <210> 6Э <211=· 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность
<220=· <223> челове Антисмысловой ка олигонуклеотид к фактору роста соединительной ткани <400> 69 дСаСссаССС саСдсСССда <210=· 70 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220=· <223> Антисмысловой олигонуклеотид к фактору роста соединительной ткани
человека
- 75 022207 <400 = 70 ссаСаХаадЬ аХссаХХХса 20 <210= 71 <211= 20 <212= ДНК <213= Искусственная последовательность <220=
<223= челове Антисмысло вой ка олигонуклеотид к фактору роста соединительной ткани <400 = 71 дааХХХссах аХаадХаХсс 20 <210 = 72 <211= 20 <212> днк <213> Искусственная последовательность <220 = <223> Антисмысловой олигонуклеотид к фактору роста соединительной ткани
человека
<400> 72 хсХдадсада аХХХссаХаХ 20 <210 = 73 <211 = 20 <212> днк <213> Искусственная последовательность <220 = <223= Антисмысловой олигонуклеотид к фактору роста соединительной ткани человека <400 = 73 ХдХсаХХсХа ХсХдадсада 20 <210 = 74 <211 = 20 <212> ДНК <213= Искусственная последовательность <220= <223= Антисмысловой олигонуклеотид к фактору роста соединительной ткани
человека <400= 74
ХХХдасддас ХдХсаХХсХа 20 <210= 75 <211= 20
- 76 022207 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность
<220> <223> челове Антисмысловой ка олигонуклеотид к фактору роста соединительной ткани <400> 75 аасааЕсЕдЕ ЕЕЕдасддас <210> 76 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220> <223> Антисмысловой олигонуклеотид к фактору роста соединительной ткани
человека <400> 76
ЬдаЬдссЬсс ссЬЬЬдсааа 20 <210> 77 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Антисмысловой олигонуклеотид к фактору роста соединительной ткани человека <400> 77
Ьдссааддас асЬдаЬдссЬ 20 <2Ю> 78 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность
<220> <223> челове Антисмысловой ка олигонуклеотид к фактору роста соединительной ткани <400> 78 садссЕдсса аддасасЕда <210> 79 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220> <223> Антисмысловой олигонуклеотид к фактору роста соединительной ткани
человека
- 77 022207 <210> 84 <211? 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность
- 78 022207
- 79 022207 <210? 93 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
- 80 022207 <223> Антисмысловой олигонуклеотид к фактору роста соединительной ткани человека <400> 93 аас^садДсс дадсддДДЪс <210> 94 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223>
человека
Антисмысловой олигонуклеотид к фактору роста соединительной ткани <40О> 94 ааадааасДс адДссдадсд <2Ю>
<2И>
<212>
ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223>
человека
Антисмысловой олигонуклеотид к фактору роста соединительной ткани <400> 95
Ьддадааада аасЪсадЬсс
<210> 96 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220> <223> Антисмысловой олигонуклеотид к фактору
<400> 96 дсадсДддад ааадааасДс <210> 97 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223>
Антисмысловой олигонуклеотид к фактору роста соединительной ткани человека <400> 97
Дддсадсадс Дддадааада
- 81 022207 <210? 9Э <211? 20 <212> ДНК <213? Искусственная последовательность <210? 102 <211? 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220?
<223? Антисмысловой олигонуклеотид к фактору роста соединительной ткани человека
- 82 022207 <210> 107 <211> 20
- 83 022207 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <210> 111 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Антисмысловой олигонуклеотид к фактору роста соединительной ткани человека
- 84 022207 <400> 111 дадсасасаа асассаСдба 20 <210> 112 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Антисмысловой олигонуклеотид к фактору роста соединительной ткани человека <400> 112
Сдсдададса дадсасасаа 20 <210> 113 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Антисмысловой олигонуклеотид к фактору роста соединительной ткани человека <400> 113
ЪаадсСдсда дадсададса 20 <210> 114 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> челове Антисмысловой ка олигонуклеотид к фактору роста соединительной ткани <400> 114 дСсддЪаадс Ддсдададса 20 <210> 115 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность е220> <223> Антисмысловой олигонуклеотид к фактору роста соединительной ткани
человека <400> 11В
ДДссадСсдд СаадсДдсда 20 с210> 116 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность
- 85 022207
- 86 022207
- 87 022207
<223> челове Антисмысловой ка олигонуклеотид к фактору роста соединительной ткани <400> 125 сдбддсаада дсссСаадСЬ <210> 126 <211> 20 <212> днк <213> Искусственная последовательность <220> <223> Антисмысловой олигонуклеотид к фактору роста соединительной ткани
человека <400> 126 сдддсВСаСа сСаасаадсд 20 <210=· 127 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Антисмысловой олигонуклеотид к фактору роста соединительной ткани человека <400> 127 даВаасдддс ЬСаВасСаас 20 <210=· 128 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность
<220=· <223> челове Антисмысловой ка олигонуклеотид к фактору роста соединительной ткани <400> 128 РВддадаЬаа сдддсВСаСа <210> 129 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220> <223> Антисмысловой олигонуклеотид к фактору роста соединительной ткани
человека <400> 129 радръеъдда даРаасдддс 20
- 88 022207 <210> 130 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> челове Антисмысловой ка олигонуклеотид к фактору роста соединительной ткани <400> 130 ХХадаХадХХ ХСддадаХаа <210> 131 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220> <223> Антисмысловой олигонуклеотид к фактору роста соединительной ткани
человека <400> 131 сааЪддДДад аДадЬДЬДдд 20 <210> 132 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Антисмысловой олигонуклеотид к фактору роста соединительной ткани человека <400> 132 садсСсаард дЪСадаДадД 20 <210> 133 <2Ц> 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность
<220> <223> челове Анти смысл о в ой ка олигонуклеотид к фактору роста соединительной ткани <400> 133 саааасадсХ сааХддХХад <210> 134 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220> <223> Антисмысловой олигонуклеотид к фактору роста соединительной ткани
человека
- 89 022207 <210> 139 <211> 20
- 90 022207 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Антисмысловой человека олигонуклеотид к фактору роста соединительной ткани <400> 139 сДддСддС^д сС.аЬСасаса 20 <210? 140 <211? 20 <212> днк <213> Искусственная последовательность <220? <223> Антисмысловой олигонуклеотид к фактору роста соединительной ткани
человека
<400? 140 даааасбддь ддДЬдсЬаДД 20
<210? <211? <212> <213> 141 20 ДНК Искусственная последовательность <220? <223> Ан тиомысловой олигонуклеотид к фактору роста соединительной ткани
человека
<400? 141 РадСддаааа сСддСддГСд 20 <210> 142 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220> <223> Антисмысловой олигонуклеотид к фактору роста соединительной ткани человека <400> 142 ДЬаасДаасс срдсддаада 20 <210? 143 <211? 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220? <223? Антисмысловой олигонуклеотид к фактору роста соединительной ткани
человека
- 91 022207 <400? 143 бдбсббдааб баасбаассс 20 <210? 144 <211? 20 <212? ДНК <213> Искусственная последовательность <220?
<223> Антисмысловой олигонуклеотид к фактору роста соединительной ткани человека <400? 144 бддаабдбсб бдааббаасб 20 <210? 145 <211? 20 <212> ДНК <213? Искусственная последовательность <220?
<223> Антисмысловой олигонуклеотид к фактору роста соединительной ткани человека <400? 145 дссададссб сбсббддааб 20 <210? 146 <211? 20 <212? ДНК <213> Искусственная последовательность <220?
<223> Антисмысловой олигонуклеотид к фактору роста соединительной ткани человека <400? 146 ааааабадсс ададссбсбс 20 <210? 147 <211? 20 <212? ДНК <213> Искусственная последовательность <220?
<223> Антисмысловой олигонуклеотид к фактору роста соединительной ткани человека <400? 147 бдбссааааа бадссададс 20 <210? 148 <211? 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность
- 92 022207 <220>
<223> Антисмысловой олигонуклеотид к фактору роста соединительной ткани человека <400> 148
РдсРаРдЪсс аааааРадсс
<210> 149 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220> <223> Антисмысловой олигонуклеотид к фактору человека
<400> 149
РсаРРРдсРа РдРссааааа <2Ю> 150 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220> <223> человека
Антисмысловой олигонуклеотид к фактору роста соединительной ткани <400> 150 дадРсРсаРР РдсРаРдРсс <2Ю> 151 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223>
человека
Антисмысловой олигонуклеотид к фактору роста соединительной ткани <400> 151 адРЬРдадРс РсаРРРдсЬа <210> 152 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220> <223> человека
Антисмысловой олигонуклеотид к фактору роста соединительной <400> 152 даддаадРРР дадРсРсаРр
- 93 022207 <210> 157 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
- 94 022207 <223? Антисмысловой олигонуклеотид к фактору роста соединительной ткани человека <400? 157 аддаадасаа дддаааадад 20 <210? 158 <211? 20 <212? ДНК <213? Искусственная последовательность <220?
<223? Антисмысловой олигонуклеотид к фактору роста соединительной ткани человека <400? 158 ббсбааддаа дасаадддаа 20 <210? 159 <211? 20 <212> ДНК <213? Искусственная последовательность <220?
<223? Антисмысловой олигонуклеотид к фактору роста соединительной ткани человека <400? 159 бдсссббсба аддаадасаа 20 <210? 160 <211? 20 <212? ДНК <213? Искусственная последовательность <220?
<223? Антисмысловой олигонуклеотид к фактору роста соединительной ткани человека <400? 160 ддабдсдадб бдддабсбдд 20 <210? 161 <211? 20 <212? ДНК <213? Искусственная последовательность <220?
<223? Антисмысловой олигонуклеотид к фактору роста соединительной ткани человека <400? 161 ссадсбдсбб ддсдсадасд 20
- 95 022207
<210? <211? <212? <213> 162 20 ДНК Искусственная последовательность <220? <223? Антисмысловой олигонуклеотид к фактору роста соединительной ткани
человека
<400? 162 дссадааадс ПсааасСЬда 20 <210? 163 <211? 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220? <223> Антисмысловой олигонуклеотид к фактору роста соединительной ткани
человека
<400? 163 ссасаадскд ЪссадСсСаа 20
<210? 164 <211? 20 <212> днк <213> Искусственная последовательность <220? <223> Антисмысловой олигонуклеотид к фактору роста соединительной ткани
человека
<400> 164 ддЬсасасЬс ЬсаасаааЬа 20 <210? 165 <211? 20 <212> Днк <213> Искусственная последовательность <220? <223> Антисмысловой олигонуклеотид к фактору роста соединительной ткани человека <400? 165 ааасаСдЬаа скСЬСддСса 20 <210> 166 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220> <223> Антисмысловой олигонуклеотид к фактору роста соединитель ной ткани
человека
- 96 022207 <400? 166
СдасаСддса сааЪдЬСЪЪд 20 <210? 167 <211? 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Антисмысловой олигонуклеотид к фактору роста соединительной ткани человека <400? 167 ссЪЪсссСда аддЬбссДсс 20
EA201170345A 2008-08-25 2009-08-25 Антисмысловые олигонуклеотиды против фактора роста соединительной ткани и способы их применения EA022207B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US19012108P 2008-08-25 2008-08-25
PCT/US2009/054973 WO2010042281A2 (en) 2008-08-25 2009-08-25 Antisense oligonucleotides directed against connective tissue growth factor and uses thereof

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201170345A1 EA201170345A1 (ru) 2012-06-29
EA022207B1 true EA022207B1 (ru) 2015-11-30

Family

ID=41818313

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201170345A EA022207B1 (ru) 2008-08-25 2009-08-25 Антисмысловые олигонуклеотиды против фактора роста соединительной ткани и способы их применения

Country Status (20)

Country Link
US (6) US8252762B2 (ru)
EP (2) EP2331141B1 (ru)
JP (5) JP5420668B2 (ru)
KR (2) KR101877698B1 (ru)
CN (2) CN103429270B (ru)
AU (2) AU2009275387B2 (ru)
BR (1) BRPI0912923A8 (ru)
CA (1) CA2733262C (ru)
CO (1) CO6341577A2 (ru)
DK (1) DK2331141T3 (ru)
EA (1) EA022207B1 (ru)
ES (1) ES2566508T3 (ru)
GB (1) GB2465902B (ru)
HK (2) HK1144908A1 (ru)
IL (3) IL211230A (ru)
MX (2) MX2011002143A (ru)
NZ (2) NZ601660A (ru)
SG (1) SG196769A1 (ru)
WO (1) WO2010042281A2 (ru)
ZA (1) ZA201101549B (ru)

Families Citing this family (38)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2009516823A (ja) * 2005-09-30 2009-04-23 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア Ｓａｔｂ１：形態形成および腫瘍転移の決定因子
EP2247729B1 (en) 2008-02-11 2019-05-01 Phio Pharmaceuticals Corp. Modified rnai polynucleotides and uses thereof
US8815818B2 (en) 2008-07-18 2014-08-26 Rxi Pharmaceuticals Corporation Phagocytic cell delivery of RNAI
US8946172B2 (en) 2008-08-25 2015-02-03 Excaliard Pharmaceuticals, Inc. Method for reducing scarring during wound healing using antisense compounds directed to CTGF
DK2331141T3 (en) * 2008-08-25 2016-04-04 Excaliard Pharmaceuticals Inc Antisense oligonucleotides WHO IS TARGETING connective tissue, AND USES THEREOF
US8796443B2 (en) 2008-09-22 2014-08-05 Rxi Pharmaceuticals Corporation Reduced size self-delivering RNAi compounds
WO2010059226A2 (en) 2008-11-19 2010-05-27 Rxi Pharmaceuticals Corporation Inhibition of map4k4 through rnai
US9493774B2 (en) 2009-01-05 2016-11-15 Rxi Pharmaceuticals Corporation Inhibition of PCSK9 through RNAi
WO2010090762A1 (en) 2009-02-04 2010-08-12 Rxi Pharmaceuticals Corporation Rna duplexes with single stranded phosphorothioate nucleotide regions for additional functionality
KR102453078B1 (ko) 2010-03-24 2022-10-11 피오 파마슈티칼스 코프. 진피 및 섬유증성 적응증에서의 ｒｎａ 간섭
WO2011119871A1 (en) 2010-03-24 2011-09-29 Rxi Phrmaceuticals Corporation Rna interference in ocular indications
EP2550000A4 (en) 2010-03-24 2014-03-26 Advirna Inc RNAI COMPOUNDS OF REDUCED SIZE ADMINISTERING
KR101249041B1 (ko) 2010-04-28 2013-03-29 포항공과대학교 산학협력단 결합조직 성장인자를 이용한 약학적 조성물
TWI593416B (zh) * 2011-02-02 2017-08-01 艾克厘德製藥公司 利用針對結締組織生長因子（ｃｔｇｆ）目標之反義化合物治療瘢痕或肥厚性疤痕之方法
WO2012174470A1 (en) * 2011-06-16 2012-12-20 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of pyruvate carboxylase expression
US8802839B2 (en) 2011-07-15 2014-08-12 Fibrogen, Inc. Connective tissue growth factor antisense oligonucleotides
US20150297629A1 (en) * 2012-07-27 2015-10-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of renin-angiotensin system (ras) related diseases by angiotensinogen
US9175291B2 (en) 2012-10-11 2015-11-03 Isis Pharmaceuticals Inc. Modulation of androgen receptor expression
RU2744194C2 (ru) 2013-12-02 2021-03-03 Фио Фармасьютикалс Корп Иммунотерапия рака
KR20160110370A (ko) * 2013-12-04 2016-09-21 알엑스아이 파마슈티칼스 코포레이션 화학적으로 변형된 올리고뉴클레오티드를 사용한 상처 치유의 치료 방법
EP3137119B1 (en) 2014-04-28 2020-07-01 Phio Pharmaceuticals Corp. Methods for treating cancer using a nucleic acid targeting mdm2
US10900039B2 (en) 2014-09-05 2021-01-26 Phio Pharmaceuticals Corp. Methods for treating aging and skin disorders using nucleic acids targeting Tyr or MMP1
CN104740628B (zh) * 2015-02-12 2017-09-26 西安交通大学医学院第一附属医院 用于治疗肝纤维化的结缔组织生长因子嵌合疫苗及其应用
JP6833705B2 (ja) * 2015-04-03 2021-02-24 アイオーニス ファーマシューティカルズ， インコーポレーテッドＩｏｎｉｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ． Ｔｍｐｒｓｓ６発現を調節するための化合物及び方法
US11001845B2 (en) 2015-07-06 2021-05-11 Phio Pharmaceuticals Corp. Nucleic acid molecules targeting superoxide dismutase 1 (SOD1)
US10808247B2 (en) 2015-07-06 2020-10-20 Phio Pharmaceuticals Corp. Methods for treating neurological disorders using a synergistic small molecule and nucleic acids therapeutic approach
BR112018005223B1 (pt) 2015-10-08 2022-08-09 Ionis Pharmaceuticals, Inc Compostos, uso dos mesmos, e composição farmacêutica
CA3002744A1 (en) 2015-10-19 2017-04-27 Rxi Pharmaceuticals Corporation Reduced size self-delivering nucleic acid compounds targeting long non-coding rna
WO2018102397A1 (en) 2016-11-29 2018-06-07 PureTech Health LLC Exosomes for delivery of therapeutic agents
WO2020027640A1 (ko) * 2018-07-31 2020-02-06 주식회사 레모넥스 Ctgf 발현 억제용 조성물
EP3831392A4 (en) * 2018-07-31 2022-08-17 Lemonex Inc. COMPOSITION FOR INHIBITING CTGF EXPRESSION
US20220162607A1 (en) * 2019-03-14 2022-05-26 Rena Therapeutics Inc. Nucleic acid complex for modulating ihh expression
WO2021045538A1 (ko) 2019-09-03 2021-03-11 소바젠 주식회사 eIF4E 저해제를 포함하는 eIF4E 활성증가와 관련된 상태의 진단 또는 치료용 조성물
TW202227101A (zh) 2020-11-18 2022-07-16 美商Ionis製藥公司 用於調節血管收縮素原表現之化合物及方法
CN114807127A (zh) * 2021-01-19 2022-07-29 陈璞 用于结缔组织生长因子的小干扰rna及其应用
CN112800489B (zh) * 2021-02-07 2023-12-26 北京中电华大电子设计有限责任公司 一种基于se的高安全指纹模块软件实现方法
CN112966441B (zh) * 2021-03-08 2022-04-29 中国人民解放军海军航空大学 一种基于连续Weiner过程损伤的设备剩余寿命评估方法
AU2022377400A1 (en) * 2021-11-01 2024-05-02 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Compounds and methods for reducing psd3 expression

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070299028A1 (en) * 2003-10-07 2007-12-27 Siwkowski Andrew M Backbone modifications to modulate oligonucleotide targeting in vivo
US7335765B2 (en) * 1999-02-12 2008-02-26 Daiichi Sankyo Company, Limited Nucleoside and oligonucleotide analogues
WO2008050329A2 (en) * 2006-10-25 2008-05-02 Quark Pharmaceuticals, Inc. Novel sirnas and methods of use thereof
US7384634B2 (en) * 1991-08-30 2008-06-10 University Of South Florida Connective tissue growth factor

Family Cites Families (250)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3687808A (en) 1969-08-14 1972-08-29 Univ Leland Stanford Junior Synthetic polynucleotides
US4469863A (en) 1980-11-12 1984-09-04 Ts O Paul O P Nonionic nucleic acid alkyl and aryl phosphonates and processes for manufacture and use thereof
US4426330A (en) 1981-07-20 1984-01-17 Lipid Specialties, Inc. Synthetic phospholipid compounds
US4534899A (en) 1981-07-20 1985-08-13 Lipid Specialties, Inc. Synthetic phospholipid compounds
US5023243A (en) 1981-10-23 1991-06-11 Molecular Biosystems, Inc. Oligonucleotide therapeutic agent and method of making same
US4476301A (en) 1982-04-29 1984-10-09 Centre National De La Recherche Scientifique Oligonucleotides, a process for preparing the same and their application as mediators of the action of interferon
JPS5927900A (ja) 1982-08-09 1984-02-14 Wakunaga Seiyaku Kk 固定化オリゴヌクレオチド
FR2540122B1 (fr) 1983-01-27 1985-11-29 Centre Nat Rech Scient Nouveaux composes comportant une sequence d'oligonucleotide liee a un agent d'intercalation, leur procede de synthese et leur application
US4605735A (en) 1983-02-14 1986-08-12 Wakunaga Seiyaku Kabushiki Kaisha Oligonucleotide derivatives
US4948882A (en) 1983-02-22 1990-08-14 Syngene, Inc. Single-stranded labelled oligonucleotides, reactive monomers and methods of synthesis
US4824941A (en) 1983-03-10 1989-04-25 Julian Gordon Specific antibody to the native form of 2'5'-oligonucleotides, the method of preparation and the use as reagents in immunoassays or for binding 2'5'-oligonucleotides in biological systems
US4587044A (en) 1983-09-01 1986-05-06 The Johns Hopkins University Linkage of proteins to nucleic acids
US5118802A (en) 1983-12-20 1992-06-02 California Institute Of Technology DNA-reporter conjugates linked via the 2' or 5'-primary amino group of the 5'-terminal nucleoside
US5118800A (en) 1983-12-20 1992-06-02 California Institute Of Technology Oligonucleotides possessing a primary amino group in the terminal nucleotide
US5550111A (en) 1984-07-11 1996-08-27 Temple University-Of The Commonwealth System Of Higher Education Dual action 2',5'-oligoadenylate antiviral derivatives and uses thereof
FR2567892B1 (fr) 1984-07-19 1989-02-17 Centre Nat Rech Scient Nouveaux oligonucleotides, leur procede de preparation et leurs applications comme mediateurs dans le developpement des effets des interferons
US5430136A (en) 1984-10-16 1995-07-04 Chiron Corporation Oligonucleotides having selectably cleavable and/or abasic sites
US5367066A (en) 1984-10-16 1994-11-22 Chiron Corporation Oligonucleotides with selectably cleavable and/or abasic sites
US5258506A (en) 1984-10-16 1993-11-02 Chiron Corporation Photolabile reagents for incorporation into oligonucleotide chains
US4828979A (en) 1984-11-08 1989-05-09 Life Technologies, Inc. Nucleotide analogs for nucleic acid labeling and detection
FR2575751B1 (fr) 1985-01-08 1987-04-03 Pasteur Institut Nouveaux nucleosides de derives de l'adenosine, leur preparation et leurs applications biologiques
US5166315A (en) 1989-12-20 1992-11-24 Anti-Gene Development Group Sequence-specific binding polymers for duplex nucleic acids
US5034506A (en) 1985-03-15 1991-07-23 Anti-Gene Development Group Uncharged morpholino-based polymers having achiral intersubunit linkages
US5235033A (en) 1985-03-15 1993-08-10 Anti-Gene Development Group Alpha-morpholino ribonucleoside derivatives and polymers thereof
US5185444A (en) 1985-03-15 1993-02-09 Anti-Gene Deveopment Group Uncharged morpolino-based polymers having phosphorous containing chiral intersubunit linkages
US5405938A (en) 1989-12-20 1995-04-11 Anti-Gene Development Group Sequence-specific binding polymers for duplex nucleic acids
US4762779A (en) 1985-06-13 1988-08-09 Amgen Inc. Compositions and methods for functionalizing nucleic acids
US5317098A (en) 1986-03-17 1994-05-31 Hiroaki Shizuya Non-radioisotope tagging of fragments
JPS638396A (ja) 1986-06-30 1988-01-14 Wakunaga Pharmaceut Co Ltd ポリ標識化オリゴヌクレオチド誘導体
EP0260032B1 (en) 1986-09-08 1994-01-26 Ajinomoto Co., Inc. Compounds for the cleavage at a specific position of RNA, oligomers employed for the formation of said compounds, and starting materials for the synthesis of said oligomers
US4837028A (en) 1986-12-24 1989-06-06 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US4920016A (en) 1986-12-24 1990-04-24 Linear Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US5276019A (en) 1987-03-25 1994-01-04 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Inhibitors for replication of retroviruses and for the expression of oncogene products
US5264423A (en) 1987-03-25 1993-11-23 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Inhibitors for replication of retroviruses and for the expression of oncogene products
US4904582A (en) 1987-06-11 1990-02-27 Synthetic Genetics Novel amphiphilic nucleic acid conjugates
EP0366685B1 (en) 1987-06-24 1994-10-19 Howard Florey Institute Of Experimental Physiology And Medicine Nucleoside derivatives
US5585481A (en) 1987-09-21 1996-12-17 Gen-Probe Incorporated Linking reagents for nucleotide probes
US5188897A (en) 1987-10-22 1993-02-23 Temple University Of The Commonwealth System Of Higher Education Encapsulated 2',5'-phosphorothioate oligoadenylates
US4924624A (en) 1987-10-22 1990-05-15 Temple University-Of The Commonwealth System Of Higher Education 2,',5'-phosphorothioate oligoadenylates and plant antiviral uses thereof
US5525465A (en) 1987-10-28 1996-06-11 Howard Florey Institute Of Experimental Physiology And Medicine Oligonucleotide-polyamide conjugates and methods of production and applications of the same
DE3738460A1 (de) 1987-11-12 1989-05-24 Max Planck Gesellschaft Modifizierte oligonukleotide
US5403711A (en) 1987-11-30 1995-04-04 University Of Iowa Research Foundation Nucleic acid hybridization and amplification method for detection of specific sequences in which a complementary labeled nucleic acid probe is cleaved
JP3019994B2 (ja) 1987-11-30 2000-03-15 ユニバーシティ オブ アイオワ リサーチ ファウンデーション 新規なオリゴデオキシヌクレオチド、それを使用した標的遺伝子の発現をブロックする方法、及び新規なオリゴデオキシヌクレオチド並びにそれを使用した標的遺伝子の発現を阻止する方法
US5082830A (en) 1988-02-26 1992-01-21 Enzo Biochem, Inc. End labeled nucleotide probe
EP0406309A4 (en) 1988-03-25 1992-08-19 The University Of Virginia Alumni Patents Foundation Oligonucleotide n-alkylphosphoramidates
US5278302A (en) 1988-05-26 1994-01-11 University Patents, Inc. Polynucleotide phosphorodithioates
US5109124A (en) 1988-06-01 1992-04-28 Biogen, Inc. Nucleic acid probe linked to a label having a terminal cysteine
US5216141A (en) 1988-06-06 1993-06-01 Benner Steven A Oligonucleotide analogs containing sulfur linkages
US5175273A (en) 1988-07-01 1992-12-29 Genentech, Inc. Nucleic acid intercalating agents
US5262536A (en) 1988-09-15 1993-11-16 E. I. Du Pont De Nemours And Company Reagents for the preparation of 5'-tagged oligonucleotides
US5194599A (en) 1988-09-23 1993-03-16 Gilead Sciences, Inc. Hydrogen phosphonodithioate compositions
GB8824593D0 (en) 1988-10-20 1988-11-23 Royal Free Hosp School Med Liposomes
US5512439A (en) 1988-11-21 1996-04-30 Dynal As Oligonucleotide-linked magnetic particles and uses thereof
US5599923A (en) 1989-03-06 1997-02-04 Board Of Regents, University Of Tx Texaphyrin metal complexes having improved functionalization
US5457183A (en) 1989-03-06 1995-10-10 Board Of Regents, The University Of Texas System Hydroxylated texaphyrins
US5354844A (en) 1989-03-16 1994-10-11 Boehringer Ingelheim International Gmbh Protein-polycation conjugates
US5108921A (en) 1989-04-03 1992-04-28 Purdue Research Foundation Method for enhanced transmembrane transport of exogenous molecules
US5391723A (en) 1989-05-31 1995-02-21 Neorx Corporation Oligonucleotide conjugates
US5256775A (en) 1989-06-05 1993-10-26 Gilead Sciences, Inc. Exonuclease-resistant oligonucleotides
US4958013A (en) 1989-06-06 1990-09-18 Northwestern University Cholesteryl modified oligonucleotides
US5227170A (en) 1989-06-22 1993-07-13 Vestar, Inc. Encapsulation process
US5451463A (en) 1989-08-28 1995-09-19 Clontech Laboratories, Inc. Non-nucleoside 1,3-diol reagents for labeling synthetic oligonucleotides
US5134066A (en) 1989-08-29 1992-07-28 Monsanto Company Improved probes using nucleosides containing 3-dezauracil analogs
US5254469A (en) 1989-09-12 1993-10-19 Eastman Kodak Company Oligonucleotide-enzyme conjugate that can be used as a probe in hybridization assays and polymerase chain reaction procedures
US5591722A (en) 1989-09-15 1997-01-07 Southern Research Institute 2'-deoxy-4'-thioribonucleosides and their antiviral activity
US5013556A (en) 1989-10-20 1991-05-07 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US5527528A (en) 1989-10-20 1996-06-18 Sequus Pharmaceuticals, Inc. Solid-tumor treatment method
US5356633A (en) 1989-10-20 1994-10-18 Liposome Technology, Inc. Method of treatment of inflamed tissues
US5225212A (en) 1989-10-20 1993-07-06 Liposome Technology, Inc. Microreservoir liposome composition and method
US5721218A (en) 1989-10-23 1998-02-24 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotides with inverted polarity
US5399676A (en) 1989-10-23 1995-03-21 Gilead Sciences Oligonucleotides with inverted polarity
DE69034150T2 (de) 1989-10-24 2005-08-25 Isis Pharmaceuticals, Inc., Carlsbad 2'-Modifizierte Oligonukleotide
US5264562A (en) 1989-10-24 1993-11-23 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotide analogs with novel linkages
US5264564A (en) 1989-10-24 1993-11-23 Gilead Sciences Oligonucleotide analogs with novel linkages
US5292873A (en) 1989-11-29 1994-03-08 The Research Foundation Of State University Of New York Nucleic acids labeled with naphthoquinone probe
US5177198A (en) 1989-11-30 1993-01-05 University Of N.C. At Chapel Hill Process for preparing oligoribonucleoside and oligodeoxyribonucleoside boranophosphates
US5130302A (en) 1989-12-20 1992-07-14 Boron Bilogicals, Inc. Boronated nucleoside, nucleotide and oligonucleotide compounds, compositions and methods for using same
US5469854A (en) 1989-12-22 1995-11-28 Imarx Pharmaceutical Corp. Methods of preparing gas-filled liposomes
US5580575A (en) 1989-12-22 1996-12-03 Imarx Pharmaceutical Corp. Therapeutic drug delivery systems
US5486603A (en) 1990-01-08 1996-01-23 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotide having enhanced binding affinity
US5670633A (en) 1990-01-11 1997-09-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Sugar modified oligonucleotides that detect and modulate gene expression
US5587361A (en) 1991-10-15 1996-12-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides having phosphorothioate linkages of high chiral purity
US5681941A (en) 1990-01-11 1997-10-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Substituted purines and oligonucleotide cross-linking
US5646265A (en) 1990-01-11 1997-07-08 Isis Pharmceuticals, Inc. Process for the preparation of 2'-O-alkyl purine phosphoramidites
US5578718A (en) 1990-01-11 1996-11-26 Isis Pharmaceuticals, Inc. Thiol-derivatized nucleosides
US5587470A (en) 1990-01-11 1996-12-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. 3-deazapurines
US5623065A (en) 1990-08-13 1997-04-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Gapped 2' modified oligonucleotides
US5459255A (en) 1990-01-11 1995-10-17 Isis Pharmaceuticals, Inc. N-2 substituted purines
US5220007A (en) 1990-02-15 1993-06-15 The Worcester Foundation For Experimental Biology Method of site-specific alteration of RNA and production of encoded polypeptides
US5149797A (en) 1990-02-15 1992-09-22 The Worcester Foundation For Experimental Biology Method of site-specific alteration of rna and production of encoded polypeptides
WO1991013080A1 (en) 1990-02-20 1991-09-05 Gilead Sciences, Inc. Pseudonucleosides and pseudonucleotides and their polymers
US5214136A (en) 1990-02-20 1993-05-25 Gilead Sciences, Inc. Anthraquinone-derivatives oligonucleotides
US5321131A (en) 1990-03-08 1994-06-14 Hybridon, Inc. Site-specific functionalization of oligodeoxynucleotides for non-radioactive labelling
US5470967A (en) 1990-04-10 1995-11-28 The Dupont Merck Pharmaceutical Company Oligonucleotide analogs with sulfamate linkages
US5264618A (en) 1990-04-19 1993-11-23 Vical, Inc. Cationic lipids for intracellular delivery of biologically active molecules
US5665710A (en) 1990-04-30 1997-09-09 Georgetown University Method of making liposomal oligodeoxynucleotide compositions
GB9009980D0 (en) 1990-05-03 1990-06-27 Amersham Int Plc Phosphoramidite derivatives,their preparation and the use thereof in the incorporation of reporter groups on synthetic oligonucleotides
DK0455905T3 (da) 1990-05-11 1998-12-07 Microprobe Corp Dipsticks til nukleinsyrehybridiseringsassays og fremgangsmåde til kovalent immobilisering af oligonukleotider
US5138045A (en) 1990-07-27 1992-08-11 Isis Pharmaceuticals Polyamine conjugated oligonucleotides
US5618704A (en) 1990-07-27 1997-04-08 Isis Pharmacueticals, Inc. Backbone-modified oligonucleotide analogs and preparation thereof through radical coupling
US5602240A (en) 1990-07-27 1997-02-11 Ciba Geigy Ag. Backbone modified oligonucleotide analogs
US5623070A (en) 1990-07-27 1997-04-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Heteroatomic oligonucleoside linkages
US5218105A (en) 1990-07-27 1993-06-08 Isis Pharmaceuticals Polyamine conjugated oligonucleotides
US5688941A (en) 1990-07-27 1997-11-18 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods of making conjugated 4' desmethyl nucleoside analog compounds
ATE154246T1 (de) 1990-07-27 1997-06-15 Isis Pharmaceuticals Inc Nuklease resistente, pyrimidin modifizierte oligonukleotide, die die gen-expression detektieren und modulieren
US5610289A (en) 1990-07-27 1997-03-11 Isis Pharmaceuticals, Inc. Backbone modified oligonucleotide analogues
US5489677A (en) 1990-07-27 1996-02-06 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleoside linkages containing adjacent oxygen and nitrogen atoms
US5608046A (en) 1990-07-27 1997-03-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Conjugated 4'-desmethyl nucleoside analog compounds
US5541307A (en) 1990-07-27 1996-07-30 Isis Pharmaceuticals, Inc. Backbone modified oligonucleotide analogs and solid phase synthesis thereof
US5677437A (en) 1990-07-27 1997-10-14 Isis Pharmaceuticals, Inc. Heteroatomic oligonucleoside linkages
DK0541722T3 (da) 1990-08-03 1996-04-22 Sterling Winthrop Inc Forbindelser og fremgangsmåder til inhibering af genekspression
US5245022A (en) 1990-08-03 1993-09-14 Sterling Drug, Inc. Exonuclease resistant terminally substituted oligonucleotides
US5177196A (en) 1990-08-16 1993-01-05 Microprobe Corporation Oligo (α-arabinofuranosyl nucleotides) and α-arabinofuranosyl precursors thereof
US5512667A (en) 1990-08-28 1996-04-30 Reed; Michael W. Trifunctional intermediates for preparing 3'-tailed oligonucleotides
US5214134A (en) 1990-09-12 1993-05-25 Sterling Winthrop Inc. Process of linking nucleosides with a siloxane bridge
US5561225A (en) 1990-09-19 1996-10-01 Southern Research Institute Polynucleotide analogs containing sulfonate and sulfonamide internucleoside linkages
JPH06505704A (ja) 1990-09-20 1994-06-30 ギリアド　サイエンシズ，インコーポレイテッド 改変ヌクレオシド間結合
US5432272A (en) 1990-10-09 1995-07-11 Benner; Steven A. Method for incorporating into a DNA or RNA oligonucleotide using nucleotides bearing heterocyclic bases
CA2095212A1 (en) 1990-11-08 1992-05-09 Sudhir Agrawal Incorporation of multiple reporter groups on synthetic oligonucleotides
US5672697A (en) 1991-02-08 1997-09-30 Gilead Sciences, Inc. Nucleoside 5'-methylene phosphonates
JP3220180B2 (ja) 1991-05-23 2001-10-22 三菱化学株式会社 薬剤含有タンパク質結合リポソーム
US5539082A (en) 1993-04-26 1996-07-23 Nielsen; Peter E. Peptide nucleic acids
US5714331A (en) 1991-05-24 1998-02-03 Buchardt, Deceased; Ole Peptide nucleic acids having enhanced binding affinity, sequence specificity and solubility
US5719262A (en) 1993-11-22 1998-02-17 Buchardt, Deceased; Ole Peptide nucleic acids having amino acid side chains
US5371241A (en) 1991-07-19 1994-12-06 Pharmacia P-L Biochemicals Inc. Fluorescein labelled phosphoramidites
US5571799A (en) 1991-08-12 1996-11-05 Basco, Ltd. (2'-5') oligoadenylate analogues useful as inhibitors of host-v5.-graft response
US5770209A (en) 1991-08-30 1998-06-23 University Of South Florida Acceleration of wound healing using connective tissue growth factor
US5408040A (en) * 1991-08-30 1995-04-18 University Of South Florida Connective tissue growth factor(CTGF)
NZ244306A (en) 1991-09-30 1995-07-26 Boehringer Ingelheim Int Composition for introducing nucleic acid complexes into eucaryotic cells, complex containing nucleic acid and endosomolytic agent, peptide with endosomolytic domain and nucleic acid binding domain and preparation
US5521291A (en) 1991-09-30 1996-05-28 Boehringer Ingelheim International, Gmbh Conjugates for introducing nucleic acid into higher eucaryotic cells
EP0538194B1 (de) 1991-10-17 1997-06-04 Novartis AG Bicyclische Nukleoside, Oligonukleotide, Verfahren zu deren Herstellung und Zwischenprodukte
US5594121A (en) 1991-11-07 1997-01-14 Gilead Sciences, Inc. Enhanced triple-helix and double-helix formation with oligomers containing modified purines
TW393513B (en) 1991-11-26 2000-06-11 Isis Pharmaceuticals Inc Enhanced triple-helix and double-helix formation with oligomers containing modified pyrimidines
EP0637965B1 (en) 1991-11-26 2002-10-16 Isis Pharmaceuticals, Inc. Enhanced triple-helix and double-helix formation with oligomers containing modified pyrimidines
US5484908A (en) 1991-11-26 1996-01-16 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotides containing 5-propynyl pyrimidines
US5792608A (en) 1991-12-12 1998-08-11 Gilead Sciences, Inc. Nuclease stable and binding competent oligomers and methods for their use
US5359044A (en) 1991-12-13 1994-10-25 Isis Pharmaceuticals Cyclobutyl oligonucleotide surrogates
US5700922A (en) 1991-12-24 1997-12-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. PNA-DNA-PNA chimeric macromolecules
US5565552A (en) 1992-01-21 1996-10-15 Pharmacyclics, Inc. Method of expanded porphyrin-oligonucleotide conjugate synthesis
US5595726A (en) 1992-01-21 1997-01-21 Pharmacyclics, Inc. Chromophore probe for detection of nucleic acid
FR2687679B1 (fr) 1992-02-05 1994-10-28 Centre Nat Rech Scient Oligothionucleotides.
US5633360A (en) 1992-04-14 1997-05-27 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotide analogs capable of passive cell membrane permeation
FR2692265B1 (fr) 1992-05-25 1996-11-08 Centre Nat Rech Scient Composes biologiquement actifs de type phosphotriesters.
US5434257A (en) 1992-06-01 1995-07-18 Gilead Sciences, Inc. Binding compentent oligomers containing unsaturated 3',5' and 2',5' linkages
EP0577558A2 (de) 1992-07-01 1994-01-05 Ciba-Geigy Ag Carbocyclische Nukleoside mit bicyclischen Ringen, Oligonukleotide daraus, Verfahren zu deren Herstellung, deren Verwendung und Zwischenproduckte
US5272250A (en) 1992-07-10 1993-12-21 Spielvogel Bernard F Boronated phosphoramidate compounds
US5652355A (en) 1992-07-23 1997-07-29 Worcester Foundation For Experimental Biology Hybrid oligonucleotide phosphorothioates
US5583020A (en) 1992-11-24 1996-12-10 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Permeability enhancers for negatively charged polynucleotides
US5574142A (en) 1992-12-15 1996-11-12 Microprobe Corporation Peptide linkers for improved oligonucleotide delivery
JP3351476B2 (ja) 1993-01-22 2002-11-25 三菱化学株式会社 リン脂質誘導体及びそれを含有するリポソーム
US5476925A (en) 1993-02-01 1995-12-19 Northwestern University Oligodeoxyribonucleotides including 3'-aminonucleoside-phosphoramidate linkages and terminal 3'-amino groups
WO1994018987A1 (en) 1993-02-19 1994-09-01 Nippon Shinyaku Co., Ltd. Drug composition containing nucleic acid copolymer
US5395619A (en) 1993-03-03 1995-03-07 Liposome Technology, Inc. Lipid-polymer conjugates and liposomes
GB9304618D0 (en) 1993-03-06 1993-04-21 Ciba Geigy Ag Chemical compounds
CA2159631A1 (en) 1993-03-30 1994-10-13 Sanofi Acyclic nucleoside analogs and oligonucleotide sequences containing them
ATE160572T1 (de) 1993-03-31 1997-12-15 Sanofi Sa Oligonucleotide mit amidverkettungen die phosphoesterverkettungen einsetzen
DE4311944A1 (de) 1993-04-10 1994-10-13 Degussa Umhüllte Natriumpercarbonatpartikel, Verfahren zu deren Herstellung und sie enthaltende Wasch-, Reinigungs- und Bleichmittelzusammensetzungen
US5462854A (en) 1993-04-19 1995-10-31 Beckman Instruments, Inc. Inverse linkage oligonucleotides for chemical and enzymatic processes
FR2705099B1 (fr) 1993-05-12 1995-08-04 Centre Nat Rech Scient Oligonucléotides phosphorothioates triesters et procédé de préparation.
US5534259A (en) 1993-07-08 1996-07-09 Liposome Technology, Inc. Polymer compound and coated particle composition
US5543158A (en) 1993-07-23 1996-08-06 Massachusetts Institute Of Technology Biodegradable injectable nanoparticles
US5417978A (en) 1993-07-29 1995-05-23 Board Of Regents, The University Of Texas System Liposomal antisense methyl phosphonate oligonucleotides and methods for their preparation and use
US5502177A (en) 1993-09-17 1996-03-26 Gilead Sciences, Inc. Pyrimidine derivatives for labeled binding partners
US5801154A (en) * 1993-10-18 1998-09-01 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense oligonucleotide modulation of multidrug resistance-associated protein
US5540935A (en) 1993-12-06 1996-07-30 Nof Corporation Reactive vesicle and functional substance-fixed vesicle
US5457187A (en) 1993-12-08 1995-10-10 Board Of Regents University Of Nebraska Oligonucleotides containing 5-fluorouracil
US5446137B1 (en) 1993-12-09 1998-10-06 Behringwerke Ag Oligonucleotides containing 4'-substituted nucleotides
NZ278490A (en) 1993-12-09 1998-03-25 Univ Jefferson Chimeric polynucleotide with both ribo- and deoxyribonucleotides in one strand and deoxyribonucleotides in a second strand
US5595756A (en) 1993-12-22 1997-01-21 Inex Pharmaceuticals Corporation Liposomal compositions for enhanced retention of bioactive agents
US5519134A (en) 1994-01-11 1996-05-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Pyrrolidine-containing monomers and oligomers
US6551618B2 (en) 1994-03-15 2003-04-22 University Of Birmingham Compositions and methods for delivery of agents for neuronal regeneration and survival
US5596091A (en) 1994-03-18 1997-01-21 The Regents Of The University Of California Antisense oligonucleotides comprising 5-aminoalkyl pyrimidine nucleotides
US5627053A (en) 1994-03-29 1997-05-06 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. 2'deoxy-2'-alkylnucleotide containing nucleic acid
US5625050A (en) 1994-03-31 1997-04-29 Amgen Inc. Modified oligonucleotides and intermediates useful in nucleic acid therapeutics
US5646269A (en) 1994-04-28 1997-07-08 Gilead Sciences, Inc. Method for oligonucleotide analog synthesis
US5525711A (en) 1994-05-18 1996-06-11 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Pteridine nucleotide analogs as fluorescent DNA probes
US5543152A (en) 1994-06-20 1996-08-06 Inex Pharmaceuticals Corporation Sphingosomes for enhanced drug delivery
US5597696A (en) 1994-07-18 1997-01-28 Becton Dickinson And Company Covalent cyanine dye oligonucleotide conjugates
US5597909A (en) 1994-08-25 1997-01-28 Chiron Corporation Polynucleotide reagents containing modified deoxyribose moieties, and associated methods of synthesis and use
US5580731A (en) 1994-08-25 1996-12-03 Chiron Corporation N-4 modified pyrimidine deoxynucleotides and oligonucleotide probes synthesized therewith
US5820873A (en) 1994-09-30 1998-10-13 The University Of British Columbia Polyethylene glycol modified ceramide lipids and liposome uses thereof
US5591721A (en) 1994-10-25 1997-01-07 Hybridon, Inc. Method of down-regulating gene expression
US5512295A (en) 1994-11-10 1996-04-30 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Synthetic liposomes for enhanced uptake and delivery
US5792747A (en) 1995-01-24 1998-08-11 The Administrators Of The Tulane Educational Fund Highly potent agonists of growth hormone releasing hormone
US5756122A (en) 1995-06-07 1998-05-26 Georgetown University Liposomally encapsulated nucleic acids having high entrapment efficiencies, method of manufacturer and use thereof for transfection of targeted cells
NZ313264A (en) 1995-08-01 1999-11-29 Novartis Ag Liposomal oligonucleotide compositions
US5652356A (en) 1995-08-17 1997-07-29 Hybridon, Inc. Inverted chimeric and hybrid oligonucleotides
US5858397A (en) 1995-10-11 1999-01-12 University Of British Columbia Liposomal formulations of mitoxantrone
US5994316A (en) 1996-02-21 1999-11-30 The Immune Response Corporation Method of preparing polynucleotide-carrier complexes for delivery to cells
JP3756313B2 (ja) 1997-03-07 2006-03-15 武 今西 新規ビシクロヌクレオシド及びオリゴヌクレオチド類縁体
US5876730A (en) * 1997-08-07 1999-03-02 Childrens Hospital Research Foundation Heparin-binding growth factor (HBGF) polypeptides
NZ503765A (en) 1997-09-12 2002-04-26 Exiqon As Bi-cyclic and tri-cyclic nucleotide analogues
AU4411499A (en) * 1998-06-05 1999-12-20 Human Genome Sciences, Inc. Connective tissue growth factor-4
CN1326361A (zh) 1998-09-08 2001-12-12 亨利福特保健系统公司 通过修饰、调节及抑制结缔组织生长因子来检查、预防和治疗肾脏疾病的方法
US6335194B1 (en) 1998-09-29 2002-01-01 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of survivin expression
CA2350182A1 (en) 1998-11-06 2000-05-18 Fibrogen, Inc. Connective tissue growth factor (ctgf) and methods of use
US6348329B1 (en) * 1998-11-06 2002-02-19 Fibrogen, Inc. Nucleic acids encoding rat connective tissue growth factor (CTGF) and methods of use
AU775391B2 (en) * 1998-12-14 2004-07-29 Fibrogen, Inc. Connective tissue growth factor fragments and methods and uses thereof
US5998148A (en) * 1999-04-08 1999-12-07 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense modulation of microtubule-associated protein 4 expression
US6555322B1 (en) * 1999-08-27 2003-04-29 Fibrogen, Inc. α2-macroglobulin receptor as a receptor for CTGF
CA2381006A1 (en) * 1999-09-17 2001-03-22 Nicholas M. Dean Antisense modulation of transforming growth factor-.beta. expression
EP1222272A2 (en) 1999-10-15 2002-07-17 Curagen Corporation Polypeptides and polynucleotides encoding same
KR20080023768A (ko) * 2000-03-30 2008-03-14 화이트헤드 인스티튜트 포 바이오메디칼 리서치 Ｒｎａ 간섭의 ｒｎａ 서열 특이적인 매개체
JP2004500846A (ja) 2000-05-11 2004-01-15 アカデミス　ジーケンホイス　ベイ　デ　ユニフェルジテイト　ファン　アムステルダム Ｍｙｃ標的
DE60110244T2 (de) 2000-09-06 2006-01-19 Mcgill University, Montreal Chimerische antisense-oligonukleotide aus arabinofuranose-analogen und deoxyribosenukleotide
GB2367378B (en) 2000-09-27 2004-08-25 Krone Gmbh Patch panel
CZ302719B6 (cs) * 2000-12-01 2011-09-21 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Izolovaná molekula dvouretezcové RNA, zpusob její výroby a její použití
US20030119010A1 (en) * 2001-03-01 2003-06-26 University Of Queensland Polynucleotides and polypeptides linked to a disease or condition
US20060148743A1 (en) * 2001-05-18 2006-07-06 Vasant Jadhav RNA interference mediated inhibition of histone deacetylase (HDAC) gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US20030096272A1 (en) 2001-07-30 2003-05-22 Incyte Genomics, Inc. Genes regulated by peroxisome proliferator-activated receptor gamma agonist
WO2003035083A1 (de) * 2001-10-26 2003-05-01 Ribopharma Ag Medikament zur behandlung einer fibrotischen erkrankung durch rna interferenz
US6965025B2 (en) * 2001-12-10 2005-11-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of connective tissue growth factor expression
EP1463531B1 (en) * 2001-12-11 2011-09-28 Fibrogen, Inc. Methods for inhibiting ocular processes
US6738004B2 (en) 2002-08-15 2004-05-18 Cirrus Logic, Inc. Method and system of integrating a mismatch noise shaper into the main loop of a delta-sigma modulator
US8025587B2 (en) 2008-05-16 2011-09-27 Taylor Made Golf Company, Inc. Golf club
WO2006006948A2 (en) * 2002-11-14 2006-01-19 Dharmacon, Inc. METHODS AND COMPOSITIONS FOR SELECTING siRNA OF IMPROVED FUNCTIONALITY
AU2003295600A1 (en) * 2002-11-14 2004-06-15 Dharmacon, Inc. Functional and hyperfunctional sirna
US20050153395A1 (en) * 2003-09-29 2005-07-14 Children's Hospital Inc. Unique integrin binding site in connective tissue growth factor (CTGF)
WO2005049582A1 (en) 2003-11-14 2005-06-02 Auspex Pharmaceuticals, Inc. Method of preparation of novel nucleoside analogs and uses
GB0326780D0 (en) * 2003-11-18 2003-12-24 Imp College Innovations Ltd Biological materials and uses thereof
GB0326778D0 (en) 2003-11-18 2003-12-24 Imp College Innovations Ltd Biological materials and uses thereof
US20050214294A1 (en) 2004-02-11 2005-09-29 Allan Flyvbjerg Diabetic nephropathy therapies
AU2005244154C1 (en) * 2004-04-28 2010-07-01 Fibrogen, Inc. Treatments for pancreatic cancer
MXPA06012446A (es) 2004-04-29 2007-01-17 Genzyme Corp Metodos y composiciones para el tratamiento de enfermedades poliquisticas.
CA2569036A1 (en) 2004-06-03 2005-12-22 Balkrishen Bhat Chimeric gapped oligomeric compositions
WO2005120231A1 (en) 2004-06-08 2005-12-22 Fibrogen, Inc. Connective tissue growth factor regulates intracellular signaling pathways
DE102004062138B3 (de) 2004-12-23 2006-03-30 Benz Gmbh Werkzeug- U. Maschinenbau Kg Verstellbares Werkzeugaggregat
TWI386225B (zh) * 2004-12-23 2013-02-21 Alcon Inc 用於治療眼睛病症的結締組織生長因子（ＣＴＧＦ）ＲＮＡ干擾（ＲＮＡｉ）抑制技術
US20060281668A1 (en) 2005-05-05 2006-12-14 Fibrogen, Inc. Vascular disease therapies
CN101316626A (zh) 2005-09-29 2008-12-03 菲布罗根公司 用于降低血压的方法
US7825099B2 (en) * 2006-01-20 2010-11-02 Quark Pharmaceuticals, Inc. Treatment or prevention of oto-pathologies by inhibition of pro-apoptotic genes
CA2640171C (en) 2006-01-27 2014-10-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. 6-modified bicyclic nucleic acid analogs
ES2471978T3 (es) 2006-05-05 2014-06-27 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compuestos y procedimientos para modular la expresión de ApoB
WO2008005533A2 (en) * 2006-07-06 2008-01-10 Aaron Thomas Tabor Compositions and methods for genetic modification of cells having cosmetic function to enhance cosmetic appearance
ES2383235T3 (es) 2006-10-16 2012-06-19 Bayer Pharma Aktiengesellschaft CTGF como biomarcador , diana terapéutica y diagnóstica
US20080193443A1 (en) * 2006-10-30 2008-08-14 Oxana Beskrovnaya Methods and compositions for the treatment of polycystic diseases
WO2009026428A1 (en) * 2007-08-21 2009-02-26 Virginia Commonwealth University Intellectual Property Foundation Methods and compositions for treatment or prevention of radiation-induced fibrosis
CA2701845A1 (en) 2007-10-03 2009-04-09 Quark Pharmaceuticals, Inc. Novel sirna structures
GB0724231D0 (en) * 2007-12-12 2008-01-30 Renono Ltd Methods for inhibiting scarring
EP2334319B1 (en) * 2008-08-25 2017-12-06 Excaliard Pharmaceuticals, Inc. Method for reducing scarring during wound healing using antisense compounds directed to ctgf
DK2331141T3 (en) 2008-08-25 2016-04-04 Excaliard Pharmaceuticals Inc Antisense oligonucleotides WHO IS TARGETING connective tissue, AND USES THEREOF
WO2010027830A2 (en) 2008-08-25 2010-03-11 Excaliard Pharmaceuticals, Inc. Methods for modulation of connective tissue growth factor expression by administering antisense oligonucleotides through a delivery system so as to reduce scarring from wound healing and threat fibrotic diseases
US8796443B2 (en) 2008-09-22 2014-08-05 Rxi Pharmaceuticals Corporation Reduced size self-delivering RNAi compounds
EP2169059A1 (en) 2008-09-25 2010-03-31 Academisch Medisch Centrum bij de Universiteit van Amsterdam Means and methods for counteracting, preventing and/or determining fibrosis or a risk of fibrosis
WO2010042202A1 (en) 2008-10-07 2010-04-15 Fibrogen, Inc. Methods for treatment of podocyte injury
WO2010042201A1 (en) 2008-10-07 2010-04-15 Fibrogen, Inc. Methods for treatment of focal segmental glomerulosclerosis
US20120016011A1 (en) 2009-03-19 2012-01-19 Merck Sharp & Dohme Corp. RNA Interference Mediated Inhibition of Connective Tissue Growth Factor (CTGF) Gene Expression Using Short Interfering Nucleic Acid (siNA)
WO2011002525A1 (en) 2009-07-02 2011-01-06 Fibrogen, Inc. Methods for treatment of muscular dystrophy
US9209196B2 (en) 2011-11-30 2015-12-08 Sharp Kabushiki Kaisha Memory circuit, method of driving the same, nonvolatile storage device using the same, and liquid crystal display device
US10867398B2 (en) 2017-11-21 2020-12-15 Reliance Core Consulting LLC Methods, systems, apparatuses and devices for facilitating motion analysis in an environment

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7384634B2 (en) * 1991-08-30 2008-06-10 University Of South Florida Connective tissue growth factor
US7335765B2 (en) * 1999-02-12 2008-02-26 Daiichi Sankyo Company, Limited Nucleoside and oligonucleotide analogues
US20070299028A1 (en) * 2003-10-07 2007-12-27 Siwkowski Andrew M Backbone modifications to modulate oligonucleotide targeting in vivo
WO2008050329A2 (en) * 2006-10-25 2008-05-02 Quark Pharmaceuticals, Inc. Novel sirnas and methods of use thereof

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MAZAHERI M.K. et al. "Role of connective tissue growth factor in breast implant elastomer capsular formation", Ann Plast Surg, 2003, 50(3): 263-268, реферат, [найдено 13.02.2012], найдено из PubMed, PMID: 12800902 *

Also Published As

Publication number Publication date
BRPI0912923A8 (pt) 2017-12-12
JP2012508560A (ja) 2012-04-12
KR101762734B1 (ko) 2017-07-28
CO6341577A2 (es) 2011-11-21
JP6058391B2 (ja) 2017-01-11
DK2331141T3 (en) 2016-04-04
CN103429270A (zh) 2013-12-04
WO2010042281A2 (en) 2010-04-15
US20130190380A1 (en) 2013-07-25
GB201002626D0 (en) 2010-03-31
SG196769A1 (en) 2014-02-13
US8772260B2 (en) 2014-07-08
MX2011002143A (es) 2011-07-20
US9688987B2 (en) 2017-06-27
GB2465902B (en) 2010-12-08
JP5420668B2 (ja) 2014-02-19
IL236309A0 (en) 2015-01-29
NZ591416A (en) 2012-11-30
AU2009275387B2 (en) 2010-07-08
ZA201101549B (en) 2012-06-27
US20170335329A1 (en) 2017-11-23
JP2017113007A (ja) 2017-06-29
JP2016041067A (ja) 2016-03-31
NZ601660A (en) 2014-05-30
JP2013099338A (ja) 2013-05-23
HK1158965A1 (zh) 2012-07-27
IL236309A (en) 2016-05-31
ES2566508T3 (es) 2016-04-13
IL211230A0 (en) 2011-04-28
KR101877698B1 (ko) 2018-07-12
EA201170345A1 (ru) 2012-06-29
IL211230A (en) 2015-01-29
JP2019129828A (ja) 2019-08-08
WO2010042281A9 (en) 2011-10-06
EP2331141A2 (en) 2011-06-15
US20130190382A1 (en) 2013-07-25
EP2331141B1 (en) 2016-01-06
CN103429270B (zh) 2016-11-23
MX343397B (es) 2016-11-03
AU2009275387A1 (en) 2010-03-11
US8252762B2 (en) 2012-08-28
EP3081648A1 (en) 2016-10-19
AU2010224447B2 (en) 2017-03-09
HK1144908A1 (en) 2011-03-18
US20150376623A1 (en) 2015-12-31
US20190323013A1 (en) 2019-10-24
US20100130595A1 (en) 2010-05-27
CA2733262A1 (en) 2010-04-15
US9096851B2 (en) 2015-08-04
GB2465902A (en) 2010-06-09
CA2733262C (en) 2019-12-10
EP2331141A4 (en) 2013-01-23
KR20110081154A (ko) 2011-07-13
CN107083386A (zh) 2017-08-22
IL224697A (en) 2016-07-31
BRPI0912923A2 (pt) 2017-10-10
KR20170089946A (ko) 2017-08-04
AU2010224447A1 (en) 2010-10-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA022207B1 (ru) Антисмысловые олигонуклеотиды против фактора роста соединительной ткани и способы их применения
US20200190521A1 (en) Method of treating keloids or hypertrophic scars using antisense compounds targeting connective tissue growth factor (ctgf)
JP2002506659A (ja) Ｐｅｃａｍ−１のアンチセンス・モジュレーション
EA019531B1 (ru) КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ ИНГИБИРОВАНИЯ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ Eg5 И VEGF
CN108271351A (zh) 用于调节血管紧张素原表达的化合物和方法
US20050261226A1 (en) Methods and compositions for the treatment of cancer with oligonucleotides directed against Egr-1

Legal Events

Date Code Title Description
TC4A Change in name of a patent proprietor in a eurasian patent
MA4A Surrender of the eurasian patent at the request of the proprietor in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM RU