CN104740628B - 用于治疗肝纤维化的结缔组织生长因子嵌合疫苗及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于治疗肝纤维化的CTGF嵌合疫苗，通过将CTGF的抗原表位插入乙肝核心抗原的c/e1B细胞表位，构建可以装配成乙肝核心样颗粒的CTGF嵌合疫苗。该嵌合疫苗在无佐剂的辅助下，仍然可以刺激机体产生高效价的抗CTGF中和性抗体。用该嵌合疫苗免疫后的小鼠，经四氯化碳诱导后产生的肝纤维化程度明显减轻。通过实验验证，本发明的CTGF嵌合疫苗免疫可以明显抑制小鼠肝脏中的肝星状细胞的激活程度，同时还可以刺激肝细胞增殖，抑制肝细胞凋亡。另外，免疫后小鼠体内的TGF‑β1及PDGF的水平也明显下降，这极有利于减缓肝纤维化的进程。结果表明，CTGF嵌合疫苗可以成功抑制四氯化碳诱导的小鼠的肝纤维化。因此，CTGF嵌合疫苗有望被开发为治疗肝纤维化的有效手段。

Description

用于治疗肝纤维化的结缔组织生长因子嵌合疫苗及其应用

技术领域

本发明属于肝纤维化治疗药物领域，具体涉及一种用于治疗肝纤维化的结缔组织生长因子嵌合疫苗及其应用。

背景技术

肝纤维化(liver fibrosis)是肝脏对各种原因所致肝损伤的创伤愈合反应，表现为肝内结缔组织增生与沉积。肝纤维化是多种慢性肝病向肝硬化发展必经的病理过程，是决定慢性肝病预后的最主要因素之一。目前，大部分慢性肝病都缺乏有效的病因治疗，而且研究证实部分肝病在病因去除后肝纤维化仍可继续进展，故阻滞或延缓肝纤维化的发生发展，从而防止其进展为肝硬化成为慢性肝病治疗的主要途径之一。但目前尚无真正意义上安全、有效的抗肝纤维化药物或措施，探索安全有效的抗肝纤维化措施是目前肝病学研究领域面临的重要课题。

结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)，是新近发现的一种强力的促进肝纤维化因子，在肝纤维化发生发展过程中起着中心作用。CTGF是分泌型蛋白，是高度保守的CCN家族成员之一，具有促进细胞增殖，促进细胞外基质沉积，介导细胞粘附，刺激细胞迁移，促进软骨形成及骨骼发育等多种生物学作用。CTGF在肝纤维化肝组织中表达上调，其表达水平与肝纤维化程度正相关。

乙肝病毒核心抗原(heptitis B core，HBc)是乙肝病毒(hepatitis B virus，HBV)的重要结构蛋白，免疫原性强，是机体CTL识别的主要靶抗原之一。HBc融合异源表位后在原核和真核细胞内均能高效表达，并且可以装配成球形病毒样颗粒(virus-likeparticle，VLP)。HBc颗粒的TI Ag特性是其再无佐剂时也能诱导Th1应答，且可通过B细胞提呈进而启动T细胞应答，提高HBc免疫原性。融合外源序列的嵌合HBc颗粒可以引起强烈的免疫应答反应，明显提高插入序列的免疫原性。HBc的N端、C端及MIR(major immunodominantregion)区均可供外源短肽插入，并维持正确的构象，增强其免疫原性，但MIR区的免疫原性更强。HBc颗粒载体由于其强力的免疫原性在疫苗研究中具有重要价值。

将自体蛋白的抗原表位插入乙肝病毒核心抗原的MIR表位制备成的嵌合疫苗是一种新型疫苗。这种新型疫苗借助HBc颗粒载体打破机体对自体蛋白质的免疫耐受，使机体发生针对自体蛋白特定的抗原表位的免疫应答。刺激机体产生的抗体可以有效地结合靶蛋白，并且中和该靶蛋白的生物学活性。这些特点使得嵌合疫苗在疾病治疗中极具应用价值。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于治疗肝纤维化的结缔组织生长因子嵌合疫苗及其应用。

本发明是通过以下技术方案来实现：

一种嵌合疫苗，该嵌合疫苗是将结缔组织生长因子的抗原表位插入乙肝核心抗原的c/e1B细胞表位中装配而成；所述结缔组织生长因子的抗原表位的氨基酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。

所述c/e1B细胞表位为乙肝核心抗原的第79至第81位氨基酸。

结缔组织生长因子的抗原表位插入乙肝核心抗原的c/e1B细胞表位中，装配成乙肝核心病毒样颗粒的嵌合疫苗。

所述乙肝核心病毒样颗粒是由180或240个乙肝核心抗原组成的亚单位构成。

所述的乙肝核心抗原是含有第1至第149位氨基酸的截短型分子。

本发明的嵌合疫苗在制备抗肝纤维化的药物中的应用。

所述的药物为抑制肝脏肝星状细胞激活程度的药物。

所述的药物为刺激肝细胞增殖的药物。

所述的药物为抑制肝细胞凋亡的药物。

所述的药物为降低肝组织中TGF-β1、PDGF及TIMP-1蛋白质表达水平的药物。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

本发明公开了一种用于治疗肝纤维化的CTGF嵌合疫苗，通过将CTGF的抗原表位插入乙肝核心抗原的c/e1B细胞表位，构建可以装配成乙肝核心样颗粒的CTGF嵌合疫苗。该嵌合疫苗在无佐剂的辅助下，仍然可以刺激机体产生高效价的抗CTGF中和性抗体。用该嵌合疫苗免疫后的小鼠，经四氯化碳诱导后产生的肝纤维化程度明显减轻。

通过实验验证，本发明的CTGF嵌合疫苗免疫可以明显抑制小鼠肝脏中的肝星状细胞的激活程度，同时还可以刺激肝细胞增殖，抑制肝细胞凋亡。另外，免疫后小鼠体内的转化生长因子β1(transforming growth factorβ1，TGF-β1)及血小板衍生的生长因子(platelet-derived growth factor,PDGF)的水平也明显下降，这极有利于减缓肝纤维化的进程。结果表明，CTGF嵌合疫苗可以成功抑制四氯化碳诱导的小鼠的肝纤维化。因此，CTGF嵌合疫苗有望被开发为治疗肝纤维化的有效手段。

附图说明

图1-1为重组蛋白HBcΔ的原核表达及纯化图；图1-2为重组蛋白HBcΔCTGF_138-159的原核表达及纯化图；

图2-1为重组蛋白HBcΔ在透射电镜下的形态图；图2-2为重组蛋白HBcΔCTGF_138-159在透射电镜下的形态图；

图3为重组蛋白HBcΔ及HBcΔCTGF_138-159刺激机体产生的抗体滴度图；

图4为验证CTGF多克隆抗体的Western blot图；

图5为Western blot法检测体外培养的HSC T6细胞中α-SMA表达水平图；

图6为Real-time法检测体外培养的HSC T6细胞中COL1A2的mRNA水平图；

图7为Real-time法检测体外培养的HSC T6细胞中TIMP-1的mRNA水平图；

图8为免疫及造模时间图；

图9为经肉眼观察的小鼠肝脏形态图；其中，(a)为正常组、(b)为HBcΔCTGF_138-159/CCl₄组、(c)为HBcΔ/CCl₄组、(d)为CCl₄组；

图10为小鼠肝组织天狼猩红染色图；其中，(a)为正常组、(b)为HBcΔCTGF_138-159/CCl₄组、(c)为HBcΔ/CCl₄组、(d)为CCl₄组；

图11为小鼠肝组织羟脯氨酸含量测定分析图；

图12为小鼠肝组织中α-SMA表达的免疫组化染色图；其中，(a)为正常组、(b)为HBcΔCTGF_138-159/CCl₄组、(c)为HBcΔ/CCl₄组、(d)为CCl₄组；

图13为图12中各组小鼠肝组织中α-SMA表达面积的统计分析图；

图14为小鼠肝组织中Desmin表达的免疫组化染色图；其中，(a)为正常组、(b)为HBcΔCTGF_138-159/CCl₄组、(c)为HBcΔ/CCl₄组、(d)为CCl₄组；

图15为图14中各组小鼠肝组织中Desmin表达面积的统计分析图；

图16-1为Western blot法检测各组小鼠肝组织中α-SMA的表达水平图；

图16-2为Western blot法检测各组小鼠肝组织中α-SMA的表达水平的统计分析图；

图17为小鼠肝组织中PCNA染色检测肝实质细胞增殖图；其中，(a)为正常组、(b)为HBcΔCTGF_138-159/CCl₄组、(c)为HBcΔ/CCl₄组、(d)为CCl₄组；

图18为图17中各组小鼠肝组织中PCNA染色检测肝实质细胞增殖的统计分析图；

图19为小鼠肝组织中TUNEL法检测肝实质细胞凋亡图；其中，(a)为正常组、(b)为HBcΔCTGF_138-159/CCl₄组、(c)为HBcΔ/CCl₄组、(d)为CCl₄组；

图20为图19中各组小鼠肝组织中TUNEL法检测肝实质细胞凋亡的统计分析图；

图21为Real-time法检测肝组织中CTGF的mRNA水平图；

图22-1为Western blot法检测各组小鼠肝组织中Smad2信号通路图；

图22-2为各组肝组织中磷酸化的Smad2蛋白在总Smad2蛋白中多占比例的统计分析图；

图23-1为Western blot法检测各组小鼠肝组织中TGF-β1的表达水平图；

图23-2为各组肝组织中TGF-β1的表达水平的统计分析图；

图24-1为Western blot法检测各组小鼠肝组织中PDGF的表达水平图；

图24-2为各组肝组织中PDGF的表达水平的统计分析图；

图25-1为Western blot法检测各组小鼠肝组织中TIMP-1的表达水平图；

图25-2为各组肝组织中TIMP-1的表达水平的统计分析图。

具体实施方式

本发明提供一种用于治疗肝纤维化的CTGF嵌合疫苗，成功将CTGF的抗原表位插入乙肝核心抗原的c/e1B细胞表位，构建可以装配成乙肝核心样颗粒的CTGF嵌合疫苗。针对的CTGF的抗原表位如SEQ.ID.NO.1所示的氨基酸序列为：SMDVRLPSPDCPFPRRVKLPGK。该疫苗在无佐剂的辅助下，仍然可以刺激机体产生高效价的抗CTGF中和性抗体。该疫苗免疫后的小鼠，经四氯化碳诱导后产生的肝纤维化程度明显减轻。在进一步的研究中我们发现CTGF嵌合疫苗免疫可以明显抑制小鼠肝脏中的肝星状细胞的激活程度，同时还可以刺激肝细胞增殖，抑制肝细胞凋亡。另外，免疫后小鼠体内的TGF-β1及PDGF的水平也明显下降，这极有利于减缓肝纤维化的进程。结果表明，CTGF嵌合疫苗可以成功抑制四氯化碳诱导的小鼠的肝纤维化。下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

1、HBcΔ及HBcΔCTGF_138-159原核表达质粒的构建

(1)扩增HBcΔ编码序列

分别以PCR法从携带有HBc(ayw)全长编码区的质粒pYTA1上扩增出编码HBc aa1－78和aa 82－149的DNA片段。引物如下：

1)HBc aa 1－78：

上游引物：5′－

GGGAATTCATGATTACGCCAAGCTTGGCTGCAGAGTTCCATATG－3′

下游引物：5′－

CCGCTCGAGTCCACCTCCACCACTTCCACCTCCACCATCTTCCAAATTAACACCCAC－3′

2)HBc aa 82－149：

上游引物：5′－

CGGGATCCGGTGGAGGTGGATCTGGTGGAGGTGGATCTAGAGACCTAGTAGTCAGT－3′

下游引物：5′－

CCCAAGCTTCTAATGATGATGATGATGATGTCCACCTCCAACAACAGTAGTCTCCGG－3′

其中HBc aa 1－78的5′端引入EcoRⅠ酶切位点，3′端引入XhoⅠ酶切位点和编码氨基酸linker G4SG4序列的DNA片段；HBc aa 82－149的5′端引入BamHⅠ酶切位点和编码氨基酸linker G4SG4序列的DNA片段，3′端引入6×His标签编码序列、终止密码子和HindⅢ酶切位点。

(2)HBcΔ编码序列连接T载体

PCR产物连接pGEM-T easy载体，构建重组质粒pGEM-T-HBc_1－78及pGEM-T-HBc_82－149。经EcoRⅠ单酶切消化鉴定证实重组质粒构建正确。含有重组质粒的菌液送测序，测序结果证实扩增的PCR产物序列正确。

(3)HBcΔ编码区插入pGEMEX-1载体

重组质粒pGEM-T-HBc_1－78及pGEM-T-HBc_82－149分别以相应的限制性内切酶消化。消化后回收的HBc_1－78及HBc_82－149片段插入pGEMEX-1载体的相应多克隆位点，构建重组质粒pGEMEX-HBcΔ。经HindⅢ单酶切消化鉴定证实重组质粒构建正确。

(4)扩增CTGF(aa 138－159)的编码序列

PCR方法以含有hCTGF全长CDS区的质粒pRc/CMV-CTGF(GrotendorstGR博士惠赠)为模板，扩增出CTGF(aa 138－159)的编码序列。引物序列为：

上游引物：5′－CCCTCGAGAGCATGGACGTTCGTCTGC－3′

下游引物：5′－CCCGGATCCTTTCCCGGGCAGCTTGACCC－3′

其中CTGF(aa 138－159)的编码序列5′端引入XhoⅠ酶切位点，3′端引入BamHⅠ酶切位点。

(5)CTGF(aa 138－159)的编码序列连接T载体

CTGF(aa 138－159)PCR产物连接pGEM-T easy载体构建重组质粒pGEM-T-CTGF_138-159。经EcoRⅠ单酶切消化鉴定证实重组质粒构建正确。含有重组质粒的菌液送测序，测序结果证实扩增的PCR产物序列正确。

(6)CTGF(aa 138－159)的编码序列插入重组质粒pGEMEX-HBcΔ

1)重组质粒pGEM-T-CTGF_138-159以XhoⅠ和BamHⅠ双酶切消化。消化后回收CTGF_138-159/XhoⅠ+BamHⅠ片段。

2)重组质粒pGEMEX-HBcΔ以XhoⅠ和BamHⅠ双酶切消化。消化后回收pGEMEX-HBcΔ/XhoⅠ+BamHⅠ载体。

3)将CTGF_138-159/XhoⅠ+BamHⅠ片段连接pGEMEX-HBcΔ/XhoⅠ+BamHⅠ载体，构建重组质粒pGEMEX-HBcΔCTGF_138-159。连接产物转化DH5α，于固体LB培养基上37℃培养过夜。次日，挑取克隆，于液体LB培养基中37℃培养。10小时后，碱裂解法小量提取质粒。经HindⅢ单酶切消化鉴定证实重组质粒构建正确。

(7)HBcΔ和HBcΔCTGF_138-159的编码序列插入pET-28a(+)载体

重组质粒pGEMEX-HBcΔ和pGEMEX-HBcΔCTGF_138-159以EcoRⅠ和HindⅢ酶切消化。消化后回收HBcΔ/EcoRⅠ+HindⅢ和HBcΔCTGF_138-159/EcoRⅠ+HindⅢ片段，然后分别插入pET-28a(+)载体的相应多克隆位点，构建重组质粒pET28-HBcΔ和pET28-HBcΔCTGF_138-159。

2、HBcΔ及HBcΔCTGF_138-159的原核表达及纯化

(1)重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)

(2)IPTG诱导表达

(3)Ni-NTA系统非变性条件下纯化重组蛋白。

(4)分析原核表达及纯化产物

细菌裂解上清及Ni-NTA纯化洗脱产物经12％SDS-PAGE凝胶电泳，考马斯亮蓝染色分析，可见pET28-HBcΔ在大肠杆菌BL21(DE3)中表达出约26kDa的重组蛋白HBcΔ条带，而对照组pET-28a(+)在相应位置无表达条带；经Ni-NTA系统纯化后可见约26kDa的重组蛋白HBcΔ纯化条带(图1-1)。pET28-HBcΔCTGF_138-159在大肠杆菌BL21(DE3)中表达出约28kDa的重组蛋白HBcΔ条带，而对照组pET-28a(+)在相应位置无表达条带；经Ni-NTA系统非变性条件下纯化后可见约28kDa的重组蛋白HBcΔCTGF_138-159纯化条带。参见图1-1及图1-2。

(5)透射电镜下观察重组蛋白形态

1)利用透射电镜经负染方法观察重组蛋白形态，具体步骤如下：分别取纯化后的重组蛋白HBcΔ和HBcΔCTGF_138-15930μL滴于带有支持膜的铜网上，放置10分钟；用滤纸从液珠边缘吸去多余的液体，然后滴上一滴3％磷钨酸，染色5分钟；调整透射电镜的加速电压为75kV，调整放大倍数为100,000倍，观察重组蛋白的形态。

结果显示，重组蛋白HBcΔ及HBcΔCTGF_138-159分别经3％磷钨酸负染后，透射电镜下，放大100,000倍时均呈现出黑色背景上的圆形不染色的颗粒，大小为20－30nm，颗粒中空，中间可见少量染色(图2-1为HBcΔ；图2-2为HBcΔCTGF_138-159)。由于负染是指背景染色而蛋白质不染色，因此我们观察到的不染色的颗粒即为重组蛋白。颗粒大小及形态与乙肝核心颗粒及其相似。重组蛋白形成的多聚体结构是个近球形的20面体，但颗粒并不是密闭结构，染料可以进入颗粒中心，因此在负染条件下，呈现出类似光圈样的形态。以上结果提示我们原核系统表达的重组蛋白HBcΔ及HBcΔCTGF_138-159均可自我装配成乙肝核心样颗粒。对于重组蛋白HBcΔCTGF_138-159来说，CTGF(aa 138–159)片段的插入并没有影响乙肝核心样颗粒的装配。依据装配原理，CTGF(aa138–159)片段可以展示在颗粒表面的棘突位置，这将在极大程度上打破机体对自体蛋白质CTGF的免疫耐受，增强CTGF的免疫原性。

(6)重组蛋白溶液的透析；浓缩；Bradford法测蛋白浓度，调整溶液终浓度为0.5mg/mL。重组蛋白溶液经0.22μm滤膜除菌，并加入30％甘油，－20℃保存。

3、CTGF嵌合疫苗的免疫原性验证

(1)免疫

1)选择6周龄的BALB/c雄性小鼠；2)动物分组(6只/组)

正常组：注射PBS溶液0.1mL；HBcΔ组：注射重组蛋白HBcΔ0.1mL(含50μg重组蛋白)；HBcΔCTGF_138-159组：注射重组蛋白HBcΔCTGF_138-1590.1mL(含50μg重组蛋白)。

3)免疫方法：小鼠腹壁消毒，每只小鼠按上述方法腹腔注射重组蛋白或PBS溶液。由于小鼠腹壁薄，需要“Z”字形进针，以免注射的液体从注射部位漏出。

4)每2周免疫一次，共免疫5次。

(2)制备用于抗体滴度检测的ELISA板

1)人工合成CTGF(aa 138–159)多肽(委托公司合成)；

2)包被：用50mM碳酸盐缓冲液将CTGF(aa 138–159)多肽稀释，并按照20ng/孔包被96孔酶标板。包被后保鲜膜封好，4℃过夜；

3)封闭：向CTGF(aa 138–159)多肽包被后的酶标板微孔中，按照200μL/孔加入封闭液(10％牛血清)，4℃孵育过夜，吸出封闭液，风干后－20℃保存，备用；

(3)间接ELISA法检测免疫小鼠抗体滴度

结果显示：HBcΔCTGF_138-159免疫4次后取小鼠尾血清，用CTGF(aa 138－159)多肽包被的酶标板行ELISA实验检测小鼠抗体滴度。结果表明小鼠均产生高效价抗CTGF(aa138－159)抗体(表1)。HBcΔ免疫4次后取小鼠尾血清，用HBc包被的酶标板进行ELISA实验检测小鼠抗体滴度。结果表明小鼠均产生高效价抗HBc抗体(表2)。抗体滴度以log值对比分析参见图3。

表1抗CTGF(aa 138-159)多克隆抗体滴度测定结果

表2抗HBc多克隆抗体滴度测定结果

(4)Western blot法验证血清中抗体的特异性

购买商品化的重组人CTGF(以色列ProSpec-Tany TechnoGene Ltd公司)，Westernblot法验证HBcΔCTGF_138-159免疫后的小鼠血清中是否含有能特异性识别重组人CTGF(recombinant human CTGF，rhCTGF)的抗CTGF抗体。

结果显示，以rhCTGF为抗原，一抗为PBS为注射后小鼠的血清(1:500)，未见rhCTGF蛋白条带；一抗为HBcΔ多抗血清(1:500)，未见rhCTGF蛋白条带；一抗为HBcΔCTGF_138-159多抗血清(1:500)，可见rhCTGF蛋白条带(参见图4)。因此，HBcΔCTGF_138-159多抗血清中含有抗CTGF抗体，并且可以特异性的结合rhCTGF，可用于下游实验。

(5)观察免疫对小鼠各脏器的影响

首次免疫后5个月，处死小鼠，取心脏、肺脏、脾脏、肾脏、胃、小肠及结肠脏器置于4％多聚甲醛中固定24小时。石蜡包埋后切片，苏木紫&伊红(HE)染色，显微镜下进行组织学观察。结果显示HBcΔCTGF_138-159免疫对小鼠心脏、肺脏、脾脏、肾脏、胃、小肠及结肠脏器无明显影响。

4、CTGF抗体中和重组人CTGF的活性

(1)Western blot法检测CTGF抗体对α-SMA表达水平的影响

1)取对数生长期HSC-T6细胞，0.5％胰酶消化后用DMEM完全培养基调整细胞悬液的浓度；

2)以每孔5×10⁵个细胞接种于6孔板，每孔加2mL，置于37℃、含5％CO2、饱和湿度的细胞培养箱中培养；

3)细胞的分组方法：

空白对照组：DMEM完全培养基培养；

CTGF组：培养基中加重组人CTGF至终浓度为10ng/mL；

CTGF+正常血清组：培养基中加重组人CTGF至终浓度为10ng/mL及正常小鼠血清(1:100稀释)；

CTGF+HBcΔ血清组：培养基中加重组人CTGF至终浓度为10ng/mL及HBcΔ免疫后的小鼠血清(1:100稀释)；

CTGF+HBcΔCTGF138-159血清组：培养基中加重组人CTGF至终浓度为10ng/mL及HBcΔCTGF138-159免疫后的小鼠血清(1:100稀释)；

4)细胞接种24小时后，细胞贴壁，更换细胞培养基为无血清的DMEM培养基，对细胞进行饥饿处理12小时后，按上述分组方法分别对每组细胞进行干预；48小时后，收获各组细胞，提取总蛋白，具体方法如下：弃去各孔培养基，PBS洗涤2遍，刮取细胞，收集入1.5mL EP管中，1000转离心10分钟，弃去上清，保存细胞团块；毎管中加入50μL RIPA裂解液，同时加入PMSF至终浓度为1mM；加入Cocktail至50mM；冰上放置30分钟，反复冻融3次，然后使用超声仪以38％超声强度冰上处理5分钟，充分裂解细胞；4℃、15000转，离心10分钟，取上清。Bradford法测蛋白浓度。

5)Western blot法检测α-SMA表达水平。

结果显示，经Western blot方法分析，CTGF+HBcΔCTGF_138-159/CCl₄血清组的α-SMA的表达水平明显低于CTGF组，CTGF+正常血清组及CTGF+HBcΔ/CCl₄血清组，且差异具有统计学意义(P<0.05)(参见图5)。

(2)CTGF抗体对体外培养的HSC-T6细胞表达Ⅰ型胶原(COL1A2)及基质金属蛋白酶抑制剂(TIMP-1)的影响

1)取对数生长期HSC-T6细胞，0.5％胰酶消化后用DMEM完全培养基调整细胞悬液的浓度；

2)以每孔5×10⁵个细胞接种于6孔板，每孔加2mL，置于37℃、含5％CO2、饱和湿度的细胞培养箱中培养；

3)细胞的分组方法与上一小节所述相同；

4)按上述方法干预48小时后，收获各组细胞，Trizol法提取总RNA；定量；－70℃保存。

(3)逆转录PCR法将组织总RNA逆转录为cDNA，反应产物cDNA定量；以cDNA为模板，进行Realtime PCR。

软件分析数据：COL1A2及TIMP-1为待测基因，β-actin为内参基因；实验每个样本设3个复孔，实验重复3次。取得同一实验组Ct值的平均值；将空白对照组的目的基因(COL1A2或TIMP-1)的Ct平均值减去该样本内参β-actin的Ct平均值，其差值为ΔCt值；在所有实验组中设定空白对照组为实验参照样本，其他的实验组与空白对照组进行比较，其差值为ΔΔCt值，计算2^-ΔΔCt值；再计算每个样本的3次的2^-ΔΔCt值的平均值，即为所需最后结果。可以通过比对这一数值来检测不同样本中目的基因的丰度，其中空白对照组样本为1。

结果显示，经Realtime PCR方法分析，CTGF+HBcΔCTGF_138-159血清组的COL1A2的表达水平明显低于CTGF组，CTGF+正常血清组及CTGF+HBcΔ血清组，且差异具有统计学意义(P<0.05)(参见图6)。

经Realtime PCR方法分析，CTGF+HBcΔCTGF_138-159血清组的TIMP-1的表达水平明显低于CTGF组，CTGF+正常血清组及CTGF+HBcΔ血清组，且差异具有统计学意义(P<0.05)(参见图7)。

5、CTGF嵌合疫苗抑制小鼠肝纤维化

(1)免疫小鼠，动物分组方法及免疫方法同第三节所述；

(2)检测抗体滴度

首次免疫后，第4周开始，以间接ELISA法检测HBcΔ组抗HBc的抗体滴度；HBcΔCTGF_138-159组检测抗CTGF(aa 138–159)抗体滴度。此后每2周检测一次，直至首次免疫后第8周。

HBcΔCTGF_138-159免疫4次后取小鼠尾血清，用CTGF(aa 138–159)多肽包被的酶标板进行ELISA实验检测小鼠抗体滴度。结果表明小鼠均产生高效价抗CTGF(aa 138–159)抗体(表3)。HBcΔ免疫4次后取小鼠尾血清，用HBc全长包被的酶标板进行ELISA实验检测小鼠抗体滴度。结果表明小鼠均产生高效价抗HBc抗体(表4)。

表3 CTGF多克隆抗体滴度测定结果

表4 HBcΔ多克隆抗体滴度测定结果

(3)CCl₄制备小鼠肝纤维化模型

免疫结束后1周，开始制备肝纤维化模型。制备方法为：

1)CCl₄与玉米油以1:5的比例混合，配制成终浓度为20％的CCl₄混合溶液；

2)HBcΔ/CCl₄组、HBcΔCTGF_138-159/CCl₄组及CCl₄组按1mL/kg腹腔注射CCl₄混合溶液。每周2次，共6周；

3)正常组按1mL/kg腹腔注射玉米油。每周2次，共6周。造模结束后1周，处死小鼠(参见图8)，保存血清和组织。

4)小鼠血清及组织处理方法：处死小鼠前，用镊子摘除眼球，采眼动脉血1–2mL；全血离心，2000转，5分钟。吸取上层血清。部分保存于4℃，部分保存于－20℃；处死小鼠。打开腹腔，摘取肝脏，称湿重。

肉眼观察正常小鼠肝脏呈暗红色，边缘锐利，表面光滑，而CCl₄造模后的小鼠肝脏体积增大，边缘圆钝，表面不光滑，出现大量弥散分布的小结节。经HBcΔCTGF_138-159免疫组的小鼠肝脏边缘稍锐利，表面不光滑，但出现的小结节明显小于造模组，而HBcΔ免疫组小鼠肝脏的大体形态与造模组无明显差异(参见图9，其中，(a)为正常组、(b)为HBcΔCTGF_138-159/CCl₄组、(c)为HBcΔ/CCl₄组、(d)为CCl₄组)。

(4)评价小鼠肝纤维化程度

1)天狼星红染色评价肝纤维化程度

a)按Ishak纤维化评分标准对肝脏纤维化程度进行评价(表5)。

表5Ishak纤维化评分标准

b)天狼星红染色(参见图10，其中，(a)为正常组、(b)为HBcΔCTGF_138-159/CCl₄组、(c)为HBcΔ/CCl₄组、(d)为CCl₄组)，按Ishak纤维化评分标准的肝纤维化评分结果显示，正常组小鼠无肝纤维化，均为0分；HBcΔCTGF_138-159免疫组小鼠肝纤维化评分为2–3分；而HBcΔ免疫组与模型组的小鼠肝纤维化评分均为4–5分(表6)。

表6按Ishak纤维化评分标准的肝纤维化评分结果

以Mann-Whitney U检验分析，HBcΔCTGF_138-159/CCl₄组与HBcΔ/CCl₄组或者CCl₄组进行比较，差异具有统计学意义，*p<0.05。

2)使用羟脯氨酸检测试剂盒测定肝组织中的羟脯氨酸含量。

结果显示，HBcΔCTGF_138-159免疫组小鼠肝脏的羟脯氨酸含量明显低于HBcΔ免疫组与模型组，且差异具有统计学意义(P<0.05)。但HBcΔCTGF_138-159免疫组小鼠肝脏的羟脯氨酸含量明显高于正常组，且差异具有统计学意义(P<0.05)(参见图11)。

6、CTGF嵌合疫苗抑制肝纤维化的机制

(1)HBcΔCTGF_138-159疫苗抑制肝纤维化组织中肝星状细胞激活

1)免疫组化检测α-SMA及Desmin表达情况

面积分析：每张切片在光学显微镜下观察，放大400倍时，随机选取10个视野；软件分析每个视野下α-SMA或Desmin阳性表达面积，并计算阳性表达面积与总面积的百分比。

结果显示，HBcΔCTGF_138-159免疫组肝脏的α-SMA的蛋白表达水平明显低于HBcΔ免疫组与模型组，且差异具有统计学意义(P<0.05)；而明显高于正常组，且差异具有统计学意义(P<0.05)。参见图12，其中，(a)为正常组、(b)为HBcΔCTGF_138-159/CCl₄组、(c)为HBcΔ/CCl₄组、(d)为CCl₄组。图13为图12中各组小鼠肝组织中α-SMA表达面积的统计分析图。

HBcΔCTGF_138-159免疫组肝脏的Desmin的蛋白表达水平明显低于HBcΔ免疫组与模型组，且差异具有统计学意义(P<0.05)；而明显高于正常组，且差异具有统计学意义(P<0.05)。参见图14，其中，(a)为正常组、(b)为HBcΔCTGF_138-159/CCl₄组、(c)为HBcΔ/CCl₄组、(d)为CCl₄组；图15为图14中各组小鼠肝组织中Desmin表达面积的统计分析图。

2)Western blot法检测α-SMA表达情况

结果显示，HBcΔCTGF_138-159免疫组肝脏的α-SMA的蛋白表达水平明显低于HBcΔ免疫组与模型组，且差异具有统计学意义(P<0.05)；而明显高于正常组，且差异具有统计学意义(P<0.05)(图16-1–图16-2)。

3)HBcΔCTGF_138-159疫苗对肝脏实质细胞增殖的影响

a)免疫组化法检测PCNA的表达情况：免疫组化的步骤如前所述，切片经正常山羊血清封闭后，滴加一抗工作液为：抗PCNA抗体(以含10％牛血清的PBST混合液稀释成1:400)；

b)PCNA指数(LI)分析：

每张切片在光学显微镜下观察，放大400倍时，随机选取10个视野；软件分析每个视野下含有的PCNA阳性表达的细胞数，并计算PCNA指数(LI)，即每1000个细胞中含有的阳性细胞数。

结果显示，HBcΔCTGF_138-159疫苗促进肝实质细胞增殖，肝实质细胞以肝细胞为主。参见图17，其中，(a)为正常组、(b)为HBcΔCTGF_138-159/CCl₄组、(c)为HBcΔ/CCl₄组、(d)为CCl₄组；图18为图17中各组小鼠肝组织中PCNA染色检测肝实质细胞增殖的统计分析图。

4)HBcΔCTGF_138-159疫苗对肝脏实质细胞凋亡的影响

a)TUNEL凋亡检测试剂盒检测肝脏实质细胞凋亡情况

b)TUNEL指数(LI)分析：

每张切片在光学显微镜下观察，放大400倍时，随机选取10个视野；软件分析每个视野下含有的TUNEL阳性表达的细胞数，并计算TUNEL指数(LI)，即每1000个细胞中含有的阳性细胞数。

结果显示，HBcΔCTGF_138-159疫苗抑制肝实质细胞凋亡。参见图19，其中，(a)为正常组、(b)为HBcΔCTGF_138-159/CCl₄组、(c)为HBcΔ/CCl₄组、(d)为CCl₄组。图20为图19中各组小鼠肝组织中TUNEL法检测肝实质细胞凋亡的统计分析图。

5)Realtime PCR法检测HBcΔCTGF_138-159疫苗对肝脏中CTGF mRNA水平的影响

a)Trizol法提取组织总RNA；定量；－70℃保存；

b)逆转录PCR法将组织总RNA逆转录为cDNA；反应产物cDNA定量；

c)以cDNA为模板，进行Realtime PCR；软件分析数据，分析方法同上；

结果显示，HBcΔCTGF_138-159疫苗降低组织中CTGF mRNA水平(如图21)。

6)HBcΔCTGF_138-159疫苗对肝脏中Smad2信号通路的影响

a)提取组织总蛋白：毎100mg组织加入500μL RIPA裂解液，同时加入PMSF至终浓度为1mM；加入Cocktail至50mM；加入磷酸化酶抑制剂(1:1000)；

b)Western blot法检测各组肝组织中磷酸化的Smad2表达水平。

结果显示，HBcΔCTGF_138-159疫苗降低肝组织中磷酸化的Smad2与Smad2总蛋白的比例明显低于HBcΔ/CCl₄组及CCl₄组(参见22-1及图22-2)。

7)Western blot法检测HBcΔCTGF_138-159疫苗对肝脏中TGF-β1、PDGF及TIMP-1蛋白质表达水平的影响

a)从组织中提取总蛋白的方法同上；

b)Western blot法检测各组肝组织中TGF-β1、PDGF及TIMP-1蛋白质表达水平。

结果显示，HBcΔCTGF_138-159疫苗降低肝组织中TGF-β1(图23-1、23-2)、PDGF(图24-1、24-2)及TIMP-1(图25-1、25-2)蛋白质表达水平。

7、统计学分析

实验结果以均数±标准差(mean±SD)表示，用SPSS 19.0软件进行统计学分析，多组间均数比较采用单因素方差分析和t检验，双侧P<0.05为显著性检验标准。

综合本发明的以上结果表明，将CTGF的抗原表位插入乙肝核心抗原的c/e1B细胞表位，构建可以装配成乙肝核心样颗粒的CTGF嵌合疫苗可以成功刺激机体产生高效价的抗CTGF中和性抗体，明显减轻经四氯化碳诱导后产生的肝纤维化。CTGF嵌合疫苗免疫可以明显抑制小鼠肝脏中的肝星状细胞的激活程度，刺激肝细胞增殖，抑制肝细胞凋亡；同时，还可以降低小鼠体内的TGF-β1及PDGF的表达水平，这些特点都极有利于减缓，甚至逆转肝纤维化的进程。因此，CTGF嵌合疫苗有望被开发成为治疗肝纤维化的有效手段。

Claims (6)

1.一种嵌合疫苗，其特征在于，该嵌合疫苗是将结缔组织生长因子的抗原表位插入乙肝核心抗原的c/e1B细胞表位中装配形成乙肝核心病毒样颗粒的嵌合疫苗；所述c/e1B细胞表位为乙肝核心抗原的第79至第81位氨基酸；所述的乙肝核心抗原是含有第1至第149位氨基酸的截短型分子；所述乙肝核心病毒样颗粒是由180或240个乙肝核心抗原组成的亚单位构成；

所述结缔组织生长因子的抗原表位的氨基酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。

2.权利要求1所述的嵌合疫苗在制备抗肝纤维化的药物中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的药物为抑制肝脏肝星状细胞激活程度的药物。

4.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的药物为刺激肝细胞增殖的药物。

5.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的药物为抑制肝细胞凋亡的药物。

6.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的药物为降低肝组织中TGF-β1、PDGF及TIMP-1蛋白质表达水平的药物。