CN105132376A

CN105132376A - 一个能特异性识别HBsAg多个抗原表位的单克隆抗体及其应用

Info

Publication number: CN105132376A
Application number: CN201510363259.7A
Authority: CN
Inventors: 杨永林; 蔡杰; 许纪玲; 汪林娣; 蔡旭兵
Original assignee: NANJING RED-CROSS BLOOD CENTER
Current assignee: NANJING RED-CROSS BLOOD CENTER
Priority date: 2015-06-26
Filing date: 2015-06-26
Publication date: 2015-12-09
Anticipated expiration: 2035-06-26
Also published as: CN105132376B

Abstract

本发明属于基因工程领域，涉及一个能特异性识别HBsAg多个抗原表位的单克隆抗体及其应用。一株杂交瘤细胞，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2014年9月16日，保藏编号为CCTCC？NO:C2014151。一种能够特异性认别HBsAg第120、122、126、141、147、155位点构成的空间表位的单克隆抗体5H2，由所述的保藏编号为CCTCC？NO:C2014151的杂交瘤细胞分泌。该抗体能够识别多个位点构成的空间表位，可在制备检测HBsAg病毒的试剂中应用。

Description

一个能特异性识别HBsAg多个抗原表位的单克隆抗体及其应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及能特异性识别HBsAg空间表位的单克隆抗体及其应用。

背景技术

乙型肝炎病毒(HepatitisBvirus,HBV)是一种呈广泛性分布、危害较为严重的一种传染性病毒之一，全球已经有将近20亿的人曾经感染过HBV，持续性病毒感染的人达到了3～4亿人。我国是一个HBV感染的大国，持续感染患者达到1亿以上。随着预防免疫接种和高效价免疫球蛋白的应用，在选择压力下，人群中感染HBV变异株的比例越来越高。HBV变异株可能降低抗体检测的敏感性以及预防接种的有效性。因此，病毒变异给HBV预防和治疗带来了很大的困难。鉴于缺少可特异性识别HBsAg空间表位的特异性抗体，针对HBV变异株免疫原性的研究尚不充分。

发明内容

本发明的目的是针对现有不足，提供一株能特异性识别HbsAg特定空间表位的单克隆抗体。

本发明的另一目的是提供能够分泌该单抗的杂交瘤细胞。

本发明的又一目的是提供该单抗的应用。

本发明的目的可通过以下技术方案实现：

一株杂交瘤细胞，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2014年9月16日，保藏编号为CCTCCNO:C2014151。

一种能够特异性认别HBsAg第120、122、126、141、147、155位点构成的空间表位的单克隆抗体，由所述的保藏编号为CCTCCNO:C2014151的杂交瘤细胞分泌。

保藏编号为CCTCCNO:C2014151的杂交瘤细胞在制备乙型肝炎病毒检测试剂中的应用。

本发明所述的单克隆抗体在制备乙型肝炎病毒检测试剂中的应用。

本发明所述的杂交瘤细胞的制备方法：

(1)构建DNA疫苗：密码子优化SEQIDNO.1所示的HBsAg氨基酸序列的编码序列(HBsAg-Wt)，获得基因序列SEQIDNO.2；将SEQIDNO.2所示的优化的HBsAg基因序列克隆入真核表达载体pJW4303的HindIII/BamHI酶切位点间得到DNA疫苗HBsAg-Opt，用于小鼠体内免疫和体外转染293T收集抗原进行单克隆抗体的筛选；

(2)用DNA疫苗免疫小鼠，提取脾细胞与骨髓瘤细胞融合或的杂交瘤细胞；

(3)按照以下方法对上一步获得的杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体进行筛选：

①定点诱变SEQIDNO.2所示的优化的HBsAg基因，将其克隆到真核表达载体pJW4303的HindIII/BamHI酶切位点间，制备HBsAg基因变异表达质粒(22株)；将HBsAg基因变异表达质粒(22株)分别转染293T细胞，进一步在体外进行表达并收集抗原，用于筛选HBsAg特定表位的单克隆抗体；

②HAT选择培养基培养杂交瘤细胞，10天后取上清进行ELISA检测；选择OD值在1.0以上，并且孔内细胞形态及活力好的孔位进行下一步的筛选；

③利用步骤①中制备的HBsAg变异株表达上清对杂交瘤所分泌的单克隆抗体的位点特异性进行检测，筛查识别空间表位的单抗。

其中，定点诱变SEQIDNO.2所示的优化的HBsAg基因的表达产物分别在SEQIDNO.1所示氨基酸序列的第118、120、122、123、126、130、133、141、142、143、145、146、147、154、155、181、204等氨基酸残基处发生了点突变。

有益效果：

按照哺乳动物的密码子偏好原则，本专利优化编码HBsAg基因的DNA序列，并制备DNA疫苗，其益处有二：(一)DNA疫苗在体内转录翻译生成蛋白质，有利于保存抗原空间表位；(二)密码子优化提高了DNA疫苗的蛋白质表达效率，克服了DNA疫苗免疫原性弱的缺陷。

DNA疫苗常规接种方式有皮下注射、肌肉注射等等。不同于常规接种方法，本专利应用大剂量瞬时尾静脉注射方法，DNA疫苗第一时间进入肝脏，目的基因体内转染的靶器官主要是肝脏。本专利的体内转染方式能有效模拟HBV感染肝脏的过程。

为有效获得HBsAg空间表位的单克隆抗体，本发明定点诱变HBsAg表达疫苗，并在体外生产并获得变异蛋白22株，通过对HBsAg特定表位的单克隆抗体检测结果进行比对分析，确定其中一株能特异性认别HBsAg第120、122、126、141、147、155位点氨基酸构成的空间表位，获得特异性识别HBsAg空间表位的单克隆抗体。

识别HBsAg空间表位的单克隆抗体，可用于进一步用于探索HBsAg空间结构以及监控人群HBV感染后HBsAg变异规律。

识别HBsAg空间表位的单克隆抗体，尚可以用于进一步改造成治疗性抗体，如人源化抗体，用于紧急预防和治疗HBV感染。

附图说明

图1优化基因密码子序列偏好性

图2变异株氨基酸序列比对

图3HBsAg-Opt核酸疫苗免疫效价监测结果，M表示免疫接种(第1周、第3周及第5周)；

在每次免疫1周后应用ELISA检测HBsAb滴度

图4单克隆抗体5H2检测HBsAg野生型及突变株检测结果

图5免疫印迹(Westernblot)鉴定抗体5H2

图65H2检测

1:Marker，2:HBsAg-wt转染上清，3:pW4303转染上清

生物材料保藏信息

杂交瘤细胞株HbsAg-5H2，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉，武汉大学，保藏日期为2014年9月16日，保藏编号为CCTCCNO:C2014151。

具体实施方式

实施例1

按照哺乳动物的密码子偏好，利用http://www.jcat.de在线软件对SEQIDNO.1所示的HBsAg氨基酸序列的编码序列(HBsAg-Wt)进行密码子优化，得到优化的HBsAg基因序列SEQIDNO.2，并将其克隆入真核表达载体pJW4303的HindIII/BamHI酶切位点间得到HBsAg的DNA疫苗HBsAg-Opt，应用于小鼠体内免疫和体外转染293T收集抗原进行单克隆抗体的筛选。

同时以HBsAg-Opt序列为模板，通过PCR方法进行定点诱变,并将突变序列克隆入真核表达载体pJW4303的HindIII/BamHI酶切位点间得到HBsAg基因变异表达质粒HBsAg-Mut(表1：引物)；进一步在体外293T细胞中进行表达并收集抗原，用于筛选HBsAg特定表位的单克隆抗体。

表1HBsAg突变株引物

实施例2单抗筛选用抗原的生产

1)转染前一天接种293细胞6x10⁵到六孔板中，每孔3ml完全培养基。

2)在37℃和5％CO₂的孵箱里培养细胞，在转染当天板内的细胞密度在40-80％之间。

3)稀释2μg的待转染质粒(HBsAg-Wt，HBsAg-Opt以及HBsAg-Mut)到100μl培养基中(不含血清、蛋白、抗生素)，上下颠倒混匀。

4)加入20μlPolyFect转染试剂到上一步的质粒溶液中，吹打5次。

5)将转染试剂和质粒的混合物放在室温孵育5-10分钟。

6)在孵育间隙，将培养板内的培养基移去，加入新鲜的培养基1.5ml。

7)加入0.6ml的培养基，到转染混合物种，上下吹打数次后。立刻移入细胞培养板中，轻轻的转动培养板混匀板内的培养基。

8)转染后8小时换成无血清培养基，继续培养72小时，收集所有培养上清，超滤后备用。

实施例3杂交瘤的制备

(1)骨髓细胞来源和维持培养、免疫的动物来源；

SP2/0由江苏省人民医院感染科赠送，常规保种冻存。

免疫鼠选择：免疫种类为:Balb/c，雌性，8周龄：体重：20g；购自扬州大学动物中心。每次免疫6只，2只空白对照。

(2)免疫接种过程；

免疫方案：提取HBsAg-Opt质粒，定量后调整浓度为1mg/ml，10μg/mice瞬时尾静脉注射方法进行免疫，共5次，间隔4周，最后一次免疫两周后取脾细胞融合。每一次免疫接种后一周监测抗原表达水平，可见免疫后小鼠HBsAg抗体滴度逐周升高(图3)；小鼠处死前，免疫小鼠血清滴度≥1：128000(表2)。

免疫方法：

每只小鼠需要总体积(ml)＝鼠体重(g)×0.1+0.1ml(转染试剂)；

10μl体积的质粒到体重为20g的小鼠；

试剂配置如下：

将目的质粒10ul加入到无菌的5ml离心管中，加入需要的体内转染试剂混匀，在三十分钟内快速(20秒)注射入小鼠尾静脉。

(3)两种细胞的融合步骤和条件；

3.1脾细胞制备

1)最后一次免疫两周后，颈椎脱臼处死小鼠。

2)将小鼠放于70％酒精中浸泡消毒，取出固定于板上，在无菌条件下取脾。

3)把脾放入5ml含有1％FCS的1640液中，冰浴下轻轻洗去脾上的红细胞。

4)轻轻挤压脾，形成脾细胞悬液，用毛细管将悬液移入小试管中。

5)200目筛网过滤，去除使大块的结缔组织，把细胞悬液移入离心管中。

6)以1％FCS-1640充满离心管，并以500g离心10min(与此同时应开始制备骨髓细胞)。

7)把沉淀用约10ml的新鲜培养液再悬浮。

8)重复⑹、⑺步骤。

9)计数细胞，以台盼兰染色用相差显微镜检查活细胞数。

3.2骨髓瘤细胞：

1)融合前约一周时复苏、增殖。

2)取约2×10⁷对数生长期的骨髓瘤细胞，在室温离心(400g)10min，

3)沉淀以1％FCS-1640液再悬浮计数。

3.3饲养细胞

1)拉颈处死昆明小白鼠。

2)70％酒精浸泡消毒10min。

3)用手术剪将小鼠腹部剪开一小口，剥开皮肤，露出腹腔。

4)用注射器将4ml完全培养基注入腹腔，用手指轻揉1min仍用该注射器回抽腹腔液体，加入离心管。

5)800g/min离心10min。

6)取上清，以HAT选择培养液将细胞制成悬液。台盼蓝染色计数活细胞，调整细胞密度约4×10⁷/m个细胞。

7)以1ml吸管将细胞种入微量培养皿，每孔0.05ml，放入CO2培养箱培养，即可供细胞融合和克隆化之用。如果在融合后发现在培养孔中饲养细胞数量少，则可以在细胞换液时再加入一些。

3.4细胞融合；

1)取末次免疫后的一周的小鼠脾细胞悬液，将10⁸小鼠脾细胞与1-5×10⁷SP2/0小鼠骨髓瘤细胞混合于50毫升刻度离心管中，经800g/min离心7分钟；

2)弃上清液，尽可能除得干净，用手指轻叩离心管底部，使沉淀混匀如糊状，离心管置37℃水中进行水浴(一小烧杯中)，准备融合；

3)将37℃水浴中保温的50％PEG1.0毫升(实际应用0.7毫升)用滴管缓慢滴入离心管中，在60秒钟内滴完，在37℃水浴中边滴边摇边离心管，使细胞保存在混匀状态；

4)加完PEG后，将细胞悬液放在37℃水浴中静置90秒钟，立即在2-4分钟内加入15毫升无血清的RPMI-1640培养基(37℃)，开始要一滴一滴地加，由于稀释使PEG停止作用。注意尽可能不搅动细胞；

5)再经800g/min离心10分钟。弃去上清液，加25毫升HAT培养液，轻轻混匀，将混悬液分装已有巨噬细胞的两个24孔培养板中，每孔0.5毫升；

6)将培养板放在水蒸汽饱和CO2孵箱中，37℃孵育。CO2含量为5％；

7)每2-3天换一次HAT培养液，连续2周观察杂交瘤细胞是否出现。2周后使用HT培养基。

(4)细胞亚克隆

1)取出抗体阳性孔细胞，用HT培养液制成细胞悬液。并取样进行台盼兰染色，计数。

2)用HT培养液将细胞稀释成200个/ml、40个/ml、20个/ml和的悬液。

3)用吸管将细胞悬液分别种入微量培养盘，每孔0.05ml，细胞含量分别为10个/孔、2个/孔、1个/孔和0.5个/孔。

4)(4)5％CO₂饱和湿度，37℃培养。

5)每天用倒置显微镜观察克隆生长情况，选择只有一个集落生长的孔，弃掉两个以上和没有细胞生长的孔。

6)克隆大量繁殖后，布满孔底的1/3～1/2时，测培养液抗体。

7)抗体阳性孔细胞，移到有饲养层的组织培养瓶中，并传2～4代就可以脱离饲养细胞，建成克隆株。

8)用有限稀释法经过3次克隆化使克隆达到100％阳性。选择阳性的克隆株扩大培养。

表2：抗体效价检测结果

实施例4选择条件、杂交瘤的筛选

实施例3获得的杂交瘤细胞利用HAT选择培养基进行培养，10天后培养上清进行ELISA检测；

(1)检测方法如下：

1)HBsAg野生株(HBsAg-Wt)表达上清，1：10碳酸稀释，4℃过夜包被，常规洗板；

2)5％BSA室温2小时封闭，保存备用；

3)加入100μl培养上清，37℃1小时，常规洗板；

4)加入HRP标记山羊抗小鼠IgG二抗，37℃1小时，常规洗板；

5)加入显色液，15分钟后读板。

(2)位点特异性抗体检测方法

1)羊抗HBsAg多克隆抗体(abnovaCATNO.:PAB14674)，2μg/ml，100μl每孔，4℃过夜包被，常规洗板；

2)5％BSA室温2小时封闭；

3)加入实施例2中制备的HBsAg变异株表达上清，100μl每孔；4℃过夜包被，常规洗板，保存备用；

4)加入所选择抗体(克隆号：5H2，或者新创及科华商品化试剂)，37℃1小时，常规洗板；

5)加入HRP标记山羊抗小鼠IgG二抗，37℃1小时，常规洗板；

6)加入显色液，15分钟后读板。

结果见图4，在HBsAg变异株(120、122、126、141、147、155)中5H2结合能力显著降低，提示5H2结合120、122、126、141、147、155等氨基酸构成的空间表位。将获得的能够分泌特异识别上述HBsAg空间表位的单克隆抗体的杂交瘤细胞送交中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2014年9月16日，保藏编号为CCTCCNO:C2014151。

在图5中，在HBsAg变异株(126、146、147、155)中新创抗体结合HBsAg能力显著降低，在HBsAg变异株(155)中科华抗体结合HBsAg能力显著降低，提示5H2识别的抗原表位与商品化试剂新创以及科华并不相同。5H2可结合在146Ser位点变异HBsAg，商品化试剂新创以及科华不能结合146Ser位点变异HBsAg，提示5H2可以与目前的商品化HBsAg检测试剂互相补充，提供HBsAg的检出率，降低漏检率，提供血液检测安全。

实施例5单抗的分离和滴度测定(效价实验)

(1)腹水制备

腹水制备采用降植烷诱导腹腔法，选择雌性的BABL/c经产小鼠，先给小鼠腹腔注射0.5ml的降植烷或者石蜡，一周之后，每只小鼠腹腔注射实施例4筛选得到的1×10⁶个杂交瘤细胞，待小鼠腹部显著膨胀，取其腹水。

(2)亚类鉴定、纯化及效价测定

采用ELISA方法，按照试剂盒说明书进行抗体纯化及效价检测。腹水的纯化是用ProteinA亲和纯化进行，抗体效价检测取纯化抗体按照1:1000作为稀释浓度，倍比稀释后用间接ELISA方法测抗体滴度，阴性对照为1％BSA，以S/N值最接近2.1的反应孔抗体稀释倍数的倒数为抗体的效价。

(3)Westernblot鉴定

取被检测样本，加Loadingbuffer沸水煮5min；取10ulHBsAg-wt质粒上清进行蛋白电泳，浓缩胶100V，分离胶200V；转膜120V,1hour；转膜后5％的脱脂牛奶37℃封闭1hour；封闭完，TBST洗3次，加从腹水中纯化得到的一抗(5H2)1:10000稀释；37℃孵育1hour；一抗孵育完后，用TBST洗3次，加二抗(goat-anti-mouse，1：10000稀释，Sigmacat:A2554))37℃孵育30min；二抗孵育完后，用TBST洗3次，用supersignalwestpicolumino/enhancersolution(thermocat：1856136)显色，图6可见5H2识别HBsAg-wt单倍体及糖化修饰(～22kD)。

Claims

1.一株杂交瘤细胞，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2014年9月16日，保藏编号为CCTCCNO:C2014151。

2.一种能够特异性认别HBsAg第120、122、126、141、147、155位点构成的空间表位的单克隆抗体，其特征在于由权利要求1所述的杂交瘤细胞分泌。

3.权利要求1所述的杂交瘤细胞在制备乙型肝炎病毒检测试剂中的应用。

4.权利要求2所述的单克隆抗体在制备乙型肝炎病毒检测试剂中的应用。

5.权利要求1所述的杂交瘤细胞的制备方法，其特征在于：

(1)构建DNA疫苗：将SEQIDNO.2所示的优化的HBsAg基因序列克隆入真核表达载体pJW4303的HindIII/BamHI酶切位点间得到DNA疫苗HBsAg-Opt，用于小鼠体内免疫和体外转染293T收集抗原进行单克隆抗体的筛选；

①定点诱变SEQIDNO.2所示的优化的HBsAg基因，将其克隆到真核表达载体pJW4303的HindIII/BamHI酶切位点间，制备若干HBsAg基因变异表达质粒；将HBsAg基因变异表达质粒分别转染293T细胞，进一步在体外进行表达并收集抗原，用于筛选HBsAg特定表位的单克隆抗体；

③利用步骤①中制备的HBsAg变异株表达上清对杂交瘤所分泌的单克隆抗体的位点特异性进行检测，筛查识别第120、122、126、141、147、155氨基酸残基空间表位的单抗。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：定点诱变SEQIDNO.2所示的优化的HBsAg基因的表达产物分别在SEQIDNO.2所示氨基酸序列的第120、122、126、141、147、155氨基酸残基处发生了点突变。