CN101906160A - 一种抗人凝血因子ⅷ单克隆抗体及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种抗人凝血因子VIII单克隆抗体及其制备方法和用途。该单克隆抗体具有与人凝血因子VIII抗原结合的特异性强的特点。本发明还提供了相应的单克隆抗体片段和免疫偶联物。本发明还提供了一种检测人凝血因子VIII的检测试剂盒。

Description

一种抗人凝血因子Ⅷ单克隆抗体及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及基因工程领域。更具体地，本发明涉及一种抗人凝血因子VIII单克隆抗体及其制备方法和用途。

背景技术

血友病其实并不是一种罕见的疾病，它是一种由于凝血因子VIII或IX的缺乏而引起的遗传性出血性疾病，患者几乎均是男性。其中最常见的是因为凝血因子VIII缺乏或功能缺陷导致的甲型血友病，临床表现为关节、肌肉外伤后出血或者自发出血，不及时治疗将会造成关节损坏、残疾，严重出血可致死亡。凝血因子VIII可以治疗血浆凝血因子VIII缺乏的甲型血友病治疗，在纠正或预防出血、急诊或择期手术中，本品起到暂时性替代缺失的凝血因子的作用。

FVIII的生理功能是在内源性凝血系统中，在二价金属离子及磷脂的存在下，以辅酶的形式参与FIXa对FX的激活。FVIII是一种高分子糖蛋白，从血浆和重组细胞培养上清中分离纯化得到活性(或激活后)的FVIII由两条链组成，重链分子量为90-200KD不等，轻链的分子量为80KD，两条链通过二价离子非共价连接。

人凝血因子VIII的抗体可用于人凝血因子VIII的分离纯化和含量检测。然而，目前现有的抗体尚难以令人满意，由于FVIII分子的异质性，故在血浆中的浓度极微(0.1-0.2ug/ml)。因此检测极为困难，故尚缺特异性强的检测人凝血因子VIII的有效方法。

因此，本领域迫切需要开发高特异性和高亲和力的抗人凝血因子VIII单克隆抗体。

发明内容

本发明的目的提供了一种高特异性和高亲和力的抗人凝血因子VIII单克隆抗体，及其制法和用途。

本发明的另一目的是提供一种特异性检测人人凝血因子VIII的试剂盒。

在本发明的第一方面，提供了一种抗人凝血因子VIII的单克隆抗体，它特异性地结合于人凝血因子VIII。

在另一优选例中，所述单克隆抗体的针对人凝血因子VIII的效价大于25600。

在另一优选例中，所述单克隆抗体的针对人凝血因子VIII的效价大于30720。

在另一优选例中，所述的单克隆抗体是IgG类型。

在本发明的第二方面，提供了一种免疫偶联物，该免疫偶联物含有特异性地结合于人凝血因子VIII的本发明第一方面中的单克隆抗体和选自下组的偶联部分：可检测信号、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、酶。

在本发明的第三方面，提供了一种产生本发明第一方面中所述的单克隆抗体的杂交瘤细胞。

在本发明的第四方面，提供了一种检测人凝血因子VIII的试剂盒，它含有本发明第一方面中所述的单克隆抗体或本发明第二方面中所述的免疫偶联物。

在本发明的第四方面，提供了本发明第一方面中所述的单克隆抗体的用途，它被用于制备检测人凝血因子VIII的试剂盒或试剂。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。例如，就某一大范围(如10-100)的上限可以与另一优选的较小范围(如20-80)的下限20进行组合，从而构成另一范围(例如20-100)，反之亦然。限于篇幅，在此不再一一累述。

具体实施方式

本发明人经过多年深入的研究，研制成功一种杂交瘤单克隆抗体，即抗人凝血因子VIII的单克隆抗体F8-3。具体地，本发明以人凝血因子VIII为免疫抗原免疫Balb/C小鼠，将小鼠的致敏脾脏细胞与骨髓瘤细胞Sp2/0融合制备杂交瘤细胞，经ELISA筛选和有限稀释法获得单克隆细胞株，将杂交瘤细胞株注射于小鼠腹腔产生单克隆抗体。本发明的单克隆抗体具有特异性强、灵敏度高的特点，可用于人凝血因子VIII的分离纯化和酶联免疫吸附分析法(ELISA)等。在此基础上完成了本发明。

本发明提供了：具有抗人凝血因子VIII的单抗的相应氨基酸序列的单克隆抗体、具有抗人凝血因子VIII的单抗可变区链的单克隆抗体，以及具有这些链的其他蛋白质或蛋白质偶联物及融合表达产物。具体地，本发明包括具有含超变区(互补决定区，CDR)的轻链和重链的任何蛋白质或蛋白质偶联物及融合表达产物(即免疫偶联物及融合表达产物)，只要该超变区与本发明的轻链和重链的超变区相同或至少90％同源性，较佳地至少95％同源性。

如本领域技术人员所知，免疫偶联物及融合表达产物包括：可检测信号(如荧光分子)、药物、毒素、细胞因子(cytokine)、放射性核素、酶和其他诊断或治疗分子与抗人凝血因子VIII的单抗或其片段结合的而形成的偶联物。本发明还包括与抗人凝血因子VIII的单抗或其片段结合的细胞表面标记物或抗原。

如本文所用，“免疫毒素”指对靶细胞有特异性亲和力和杀伤力的物质，例如免疫偶联物及融合表达产物包括：药物、毒素、细胞因子(cytokine)、放射性核素或其他治疗分子与抗人凝血因子VIII的单抗或其片段结合的而形成的偶联物。以本发明的单抗F8-3为例，具体的例子有例如¹³¹I-F8-3偶联物等。

对于本发明抗人凝血因子VIII的单抗重链和轻链序列，可以用常规方法测定。抗人凝血因子VIII的单抗V链的超变区或互补决定区(complementaritydetermining region，CDR)特别令人感兴趣，因为它们中至少部分涉及结合抗原。因此，本发明包括那些具有带CDR的单克隆抗体轻链和重链可变链的分子，只要其CDR与抗人凝血因子VIII的单抗CDR具有90％以上(较佳地95％以上)的同源性。

本发明不仅包括完整的单克隆抗体，还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab或(Fab′)₂片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子；或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但保留来自人的抗体部分的抗体。

本发明还提供了编码人凝血因子VIII标志性抗原的cDNA。本发明的抗人凝血因子VIII的单抗的抗原的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据人凝血因子VIII标志性抗原的核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，按本领域技术人员已知的常规方法制备模板，通过扩增而得到有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

本发明还提供了上述单克隆抗体或其片段的DNA分子。这些DNA分子的序列可以如上用常规技术，利用小鼠杂交瘤细胞系获得。此外，还可将轻链和重链的编码序列融合在一起，形成单链抗体。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

本发明还涉及包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体。这些载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS7、293细胞、或Bowes黑素瘤细胞的动物细胞等。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔，脂质体包装等。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超声处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

此外，本发明还提供了一种检测人凝血因子VIII的试剂盒，它含有上述的单克隆抗体或免疫偶联物，或其活性片段。

在本发明的一个实例中，本发明人筛选到8株高特异性和高亲和力的杂交瘤细胞株，是骨髓瘤细胞SP2/0与产生人凝血因子VIII抗体的Balb/c小鼠B淋巴细胞融合后筛选获得的细胞株，所述B淋巴细胞来自于人凝血因子VIII免疫的Balb/c小鼠。该单克隆抗体是由上述杂交瘤细胞株产生的，具有对人凝血因子VIII特异性结合的特点，属于IgG类抗体，最高效价达到30720(单克隆抗体F8-3)。所述的单克隆抗体是将杂交瘤细胞株接种Balb/c小鼠腹腔后，从产生的腹水中纯化获得的免疫球蛋白。

本发明的主要优点在于：

(a)本发明的抗凝血因子VIII的单抗具有非常高特异性和极高的亲和力。

(b)本发明的抗凝血因子VIII的单抗适用于定性和定量检测人凝血因子VIII的酶联免疫测定(ELISA)方法并可以用于人凝血因子VIII的纯化过程。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例

材料：

(1)抗原：人凝血因子VIII，上海莱士血制品公司产品，纯度大于95％；Sp2/0细胞株，购自ATCC；DNEM培养基，Gibco公司；HAT，Gibco公司；HT，购自Gibco公司；胎牛血清，购自Gibco；Balb/c小鼠，上海斯莱克实验动物有限公司；PEG4000，Sigma公司；福氏佐剂，Sigma公司；HRP标记抗小鼠IgG，Si gma公司；TMB显色液，MBI公司。

(2)试验材料和设备：96孔板(NUNC，USA)；酶标版(COASTAR，USA)，CO2培养箱(Thermo-fi sher公司)；导致显微镜(Nicon公司)；酶标仪(BIO-RAD公司)；超净工作台(苏州净化设备厂)等。

实施例1：单克隆抗体的制备

(1)免疫动物：

第1天，抗原50μg/只，0.25ml抗原+0.25ml完全福氏佐剂/只，搅拌机6000转/分10分钟，充分混匀，皮下多点注射，5只小鼠/抗原；第28天，抗原50μg/只，0.25ml抗原+0.25ml不完全福氏佐剂/只，搅拌机6000转/分10分钟，充分混匀，皮下多点注射，5只小鼠/抗原；第60天，抗原50μg/只，0.25ml抗原+0.25ml不完全福氏佐剂/只，搅拌机6000转/分10分钟，充分混匀，皮下多点注射，5只小鼠/抗原；第90天，抗原50μg/只，0.25ml抗原+0.25ml不完全福氏佐剂/只，搅拌机6000转/分10分钟，充分混匀，皮下多点注射，5只小鼠/抗原。融合前4天，腹腔注射抗原30μg/只。

(2)细胞融合：

骨髓瘤细胞的准备：

1)细胞的复苏：将冻存在液氮中的细胞管取出，放入37℃水浴中，使迅速融化将细胞转移入10ml离心管内，加入10ml DMEM含15％胎牛血清，离心1000rpm/分10分钟，弃上清，加入5ml的DMEM含15％胎牛血清，转移入75cm的培养瓶中培养

2)在细胞融合前一周，复苏骨髓瘤细胞sp2/0，并扩增传代，保持良好的细胞活力，用0.5％苔朌蓝染色，用显微镜计数，透亮不着色的活细胞应在90％以上。

饲养细胞的制备：

1)取BALB/C小鼠3-5只，用劲椎脱位处死后，浸泡在75％酒精或1∶1000新洁而灭溶液中5分钟。

2)取出小鼠固定在蜡板上，使腹部朝上，用无菌剪刀在小鼠腹部皮肤剪一小口，注意切勿剪破腹膜，以免腹腔液外溢。进而剥离腹部皮肤，暴露腹膜，用灭菌注射器将DMEM培养液5ml注入腹腔中，右手固定注射器，使针头留置在腹腔内，另一手轻轻按摩腹腔约1-2分钟。

3)用原注射器抽取腹腔内液体，每只约可得4-4.5ml，注入50ml离心管中。用含1％HAT 15％胎牛血清的DMEM补满至100ml(2管)。摇匀，放入96孔细胞板中，每孔100μl 37℃，5％CO2培养箱中培养。

免疫小鼠脾脏的制备：

1)免疫小鼠眼眶放血，脱颈处死，放入75％的酒精中消毒，

2)无菌的条件下，分离脾脏，制备脾脏细胞，约1×10⁸个。

细胞融合

1)取sp2/0细胞1×10⁷个放入50ml离心管中离心1000rpm/分10分钟，弃上清，加入5ml DMEM。

2)脾脏细胞，约1×10⁸个放入50ml离心管中离心1000rpm/分10分钟，弃上清，加入5ml DMEM。

3)用移液管分别加入sp2/0细胞和脾脏细胞，放入50ml离心管中充分混合，离心1000rpm/分10分钟，弃上清。

4)加入融合剂PEG 0.7ml一分钟加完，静止90秒，加入DMEM 40ml离心1000rpm/分10分钟，弃上清。

5)加入DMEM含15％胎牛血清1％HAT的培养基100ml混合均匀；

6)放96孔细胞板中(含饲养细胞)，每孔100μl 37℃，5％CO2培养箱中培养。

细胞筛选

用间接ELISA法筛选融合细胞。

1)用pH9.6的碳酸盐缓冲液稀释抗原至10μg/ml，加入酶标板中，每孔100μl，置入4℃冰箱过夜。

2)用pH7.2-7.4的PBS(含0.05％吐温20)洗涤5次，拍干，加入5％的脱脂奶粉溶液(PBST配制)每孔200μl。放入37℃烘箱2小时。

3)拍干。加入样品每孔100μl，放入37℃烘箱1小时。

4)用pH7.2-7.4的PBS(含0.05％吐温20)洗涤5次，拍干。

5)加入酶标记抗体每孔100μl，放入37℃烘箱1小时。

6)用pH7.2-7.4的PBS(含0.05％吐温20)洗涤5次，拍干。

7)加入底物TMB显色，每孔100μl，室温放置5min。

8)加入2mol/L的硫酸每孔50μl终止。

9)酶标仪450nm/630nm双波长读数。

10)取强阳性孔进行克隆。

细胞克隆

1)先制备饲养细胞方法同上。

2)用100μl移液枪将待克隆化细胞孔中的细胞轻轻吹起，用显微镜计数

3)将待克隆的细胞根据计数稀释为100个/ml，共稀释10ml，加入已制备饲养细胞的96孔细胞板中，每孔100l。

4)第一次克隆用含15％胎牛血清1％HT的DMEM稀释细胞。

5)筛选出的阳性孔连续克隆3次，第二第三次用含15％胎牛血清的DMEM稀释细胞。

6)第一次克隆获得10个阳性克隆；第二次克隆获得5个阳性克隆；第三次克隆最终获得8株杂交瘤细胞。

7)8株杂交瘤细胞培养上清效价测定：

杂交瘤细胞A：＞25600

杂交瘤细胞B：＞30720

杂交瘤细胞C：＞12800

杂交瘤细胞D：＞10240

杂交瘤细胞E：＞12800

杂交瘤细胞F：＞25600

杂交瘤细胞G：＞25600

杂交瘤细胞H：＞12800

杂交瘤细胞A-H都被挑选出用于后续试验。其中效价最高的杂交瘤细胞B并重新命名为F8-3。

将选出的阳性杂交瘤细胞F8-3克隆化培养(有限稀释法，以小鼠腹腔巨噬细胞为滋养细胞)。经过2-3轮克隆化培养，获得稳定的能够产生高效价单抗的杂交瘤细胞克隆。将杂交瘤细胞克隆扩大培养，并冻存保种。

细胞扩增

1)将扩增的细胞用100l的移液枪轻轻吹起，移入24孔的细胞培养板扩增

2)24孔细胞培养板长满后移至25cm²的细胞培养瓶中

3)25cm²细胞培养瓶长满后移至75cm²的细胞培养瓶中

细胞冻存

1)收取生长旺盛，形态良好的细胞，加入50ml离心管中，1000rpm/分钟10分钟，弃上清

2)沉淀用90％胎牛血清10％DMSO的冻存液将细胞调整为10⁶/ml

3)将细胞悬液放入冻存管内，每管1ml，放入塑料泡沫盒中-80℃过夜

4)把-80℃细胞放入液氮中，同时记录放置位置及只数。

(3)腹水制备

1)小鼠预处理：接种杂交瘤细胞前10天小鼠腹腔注射液体石蜡油0.5ml/只

2)每只小鼠腹腔注射0.8-1.0×10⁶个杂交瘤细胞

3)接种杂交瘤细胞后约8-10天小鼠腹部明显胀大。

4)脱颈处死小鼠，取腹水，1000rpm离心30min，取上清，分装-20℃保存

实施例2：抗体的纯化和检测

8株杂交瘤细胞制备腹水，用商品化ProteinA纯化，操作方法参照其使用说明，结果获得纯化的单抗。

纯化抗体后进行结合特异性和亲和力测试，结果表明，8种单抗的特异性和亲和力都很好，尤其是单抗F8-3的特异性和亲和力最佳，比其他一般单抗(如杂交瘤细胞H产生的单抗)高一个数量级。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (8)

1.一种抗人凝血因子VIII的单克隆抗体，其特征在于，它特异性地结合于人凝血因子VIII。

2.如权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体的针对人凝血因子VIII的效价大于25600。

3.如权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体的针对人凝血因子VIII的效价大于30720。

4.如权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述的单克隆抗体是IgG类型。

5.一种免疫偶联物，其特征在于，该免疫偶联物含有特异性地结合于人凝血因子VIII的权利要求1所述的单克隆抗体和选自下组的偶联部分：可检测信号、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、酶。

6.一种产生权利要求1所述的单克隆抗体的杂交瘤细胞。

7.一种检测人凝血因子VIII的试剂盒，其特征在于，它含有权利要求1所述的单克隆抗体或权利要求5所述的免疫偶联物。

8.如权利要求1所述的单克隆抗体的用途，其特征在于，用于制备检测人凝血因子VIII的试剂盒或试剂。