CN103224561A

CN103224561A - 葡萄球菌肠毒素小分子抗体及制备方法及用途

Info

Publication number: CN103224561A
Application number: CN2013100161210A
Authority: CN
Inventors: 黄金海; 刘鹏翀; 孙盈
Original assignee: Tianjin University
Current assignee: Tianjin University
Priority date: 2013-01-16
Filing date: 2013-01-16
Publication date: 2013-07-31

Abstract

本发明公开了一种葡萄球菌肠毒素小分子抗体及制备方法及用途，一种葡萄球菌肠毒素小分子抗体是序列表中SEQ ID No.1所示氨基酸序列。本发明设计并构建葡萄球菌肠毒素单抗轻链、重链可变区基因的真核单启动子共表达载体，分别于轻链、重链C-端引入半胱氨酸残基，结合细胞内肽段自组装原理形成链间二硫键，模拟天然抗体的抗原结合域空间构象，获得高效表达稳定分泌哺乳动物细胞系及特异性高、亲和力强的小分子抗体。本发明的葡萄球菌肠毒素小分子抗体可应用于葡萄球菌肠毒素检测，细胞间接免疫荧光检测和流式细胞术检测。

Description

葡萄球菌肠毒素小分子抗体及制备方法及用途

技术领域

本发明涉及基因工程重组抗体，特别涉及一种葡萄球菌肠毒素小分子抗体及制备方法及用途。

背景技术

葡萄球菌肠毒素（Staphylococcal enterotoxins，SEs）是由血浆凝固酶或耐热核酸酶阳性葡萄球菌，如金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，SA）和表皮葡萄球菌（Staphylococcusepidermidis，SE）等产生的一组单肽链可溶性胞外蛋白质毒素。该毒素家族结构相关、毒力相似，但抗原性不同，其中以金黄色葡萄球菌产生的肠毒素致病力最强，是导致食物中毒的常见重要致病因子。迄今，世界诸多国家都曾相继报道金黄色葡萄球菌的暴发流行，其中，美国由金黄色葡萄球菌引起的食物中毒占整个细菌性食物中毒的33％，加拿大则更多，占45％，而我国每年此类中毒事件则占约25%。葡萄球菌的易感染性及其肠毒素的强致病性不仅严重危害人类健康，且直接间接经济损失巨大。除引起急性胃肠炎外，葡萄球菌肠毒素还可引发毒性休克综合症（Toxic shock-like syndrome,STSS），亦与川崎疾病、银屑病等免疫疾病相关，已成为世界性卫生问题。

葡萄球菌肠毒素为分子量较小的简单蛋白，约27.5~30.0kDa，易溶于水及盐溶液，对胃蛋白酶、胰蛋白酶等消化酶有抵抗作用，同时可耐受100℃煮沸30min而不被破坏。自从1959年葡萄球菌肠毒素被证实以来，已获得肠毒素类型共21种，根据血清学特征分类，包括早为人类发现和熟知的五种肠毒素SEA,SEB,SEC（C型又可分为C1、C2和C3三亚型）,SED,SEE和毒性休克综合症毒素I（Toxic shock syndrome toxin-1,TSST-1,既SEF）,以及近几年相继发现的SEG, SEH,SEI,SEJ,SEK,SEL,SEM,SEN,SEO,SEP，SEQ,SER,SET，SEU等多种新型肠毒素。葡萄球菌肠毒素的生物活性以催吐活性和超抗原活性为主，表现在引发类似细菌内毒素诱导的发热反应、致命性休克、增强宿主对内毒素敏感性、细胞因子分泌，以及刺激T细胞快速增殖等。研究表明，并非所有的肠毒素都具有催吐活性，其中以SEA和SED最常见，并以SEA毒力最强，摄入1μg即能引起中毒。虽然已从基因水平对传统及新型肠毒素加以区分，但关于其毒素蛋白及功能的研究甚少，尚无借鉴资料，因此广泛获得不同动物及动物性食品中葡萄球菌株，提纯天然肠毒素蛋白，可为研究葡萄球菌肠毒素检测方法及其功能活性奠定基础，对丰富其认识亦有重要意义。目前，葡萄球菌肠毒素导致食物中毒机制有待于进一步证实，从免疫机制研究，可能与其介导大量细胞因子释放而引起多器官损害有关。与此同时，作为第一个被发现的超抗原，其独特高效的诱导机体免疫机制依旧倍受关注。新生物构建技术与其固有生物特性的结合，葡萄球菌肠毒素研究及应用前景将更为广阔。

对于葡萄球菌肠毒素蛋白的检测方法和治疗手段多基于免疫原理，但均受到传统抗体制备技术的制约，如多克隆抗体特异性差，单克隆抗体分子量大，亲和力弱，免疫原性强，应用于人体时HMAM反应强烈等缺陷。随着分子生物学的进一步发展，抗体技术也逐步由细胞工程抗体(单克隆抗体)向基因工程抗体演替。基因工程抗体，又被称为第三代抗体，主要技术领域包括人源化抗体、小分子抗体、抗体库技术。基因工程抗体具有分子小、免疫原性低、可塑性强及成本低等优点。此技术的基本原理是，首先从杂交瘤或免疫脾细胞、外周血淋巴细胞等中提取mRNA，逆转录成cDNA后，经PCR分别扩增出抗体的轻链及重链可变区基因，按特定方式连接克隆到表达载体后，表达、折叠成功能抗体分子，筛选出高表达的细胞株，再用亲和层析等手段纯化抗体片段。该技术的着眼点在于尽量减少鼠源成分，保留原有抗体的亲和力和特异性，可以对完整抗体及抗体片段进行改造，且不受伦理和技术等因素的制约，发展迅速。

小分子抗体是基因工程抗体技术的重要应用产物，可应用于寄生虫抗原表位、自身免疫疾病、基因治疗、肿瘤印象分析与治疗等方面。小分子抗体分子量约为完整IgG的l/6，有利于穿透肿瘤组织，并避免了传统制备方法中细胞杂交的过程，减少工作量，提高制备成功率。另外，此类抗体保留完整抗原结合位点，并缺失Fc片段，减少了与FcR阳性细胞发生非特异性结合的可能性，最大限度地降低鼠源性蛋白的同时，降低了免疫变态反应的可能性。现阶段，小分子抗体的技术路线普遍采取将轻链可变区和重链可变区基因通过寡聚核苷酸以串联方式连接后，经原核系统表达，折叠后形成只由重链和轻链可变区构成的单链抗体。该传统方法虽宜于基因工程操作及大量制备抗体，但其导致的轻链或重链肽链反向、缺乏糖基化修饰、折叠错误等缺陷，使得所获抗体空间构象有别于天然抗体，进而影响抗体的特异性和亲和力。

基因工程重构抗体技术日趋成熟，但将其应用于葡萄球菌肠毒素抗体的研究，国内外罕有报道，且研究对象仅局限于SEB、SEC等少数传统肠毒素。综述其基本路线为：查找相关IgG抗体的基因序列，分析抗体基因的结构及完整性，利用PCR技术分别扩增其重链可变区和轻链可变区基因序列，再通过Linker(多采用(Gly₄Ser)₃)将二者连接，克隆到表达载体后转入表达系统。2009年，Kalinina等建立抗SEC1基因重构抗体原核表达体系，但受到表达系统蛋白修饰功能缺乏的制约，其蛋白活性表现受阻，该抗体与SEA、SEB、SED、SEE、SEG和SEI均有不同程度交叉反应，特异结合能力有待提高；2010年，Pawan等通过pCANTAB5E载体系统制备出特异性强和亲和力高的抗SEB单链抗体，但研究发现该表达系统随时间推移分泌能力逐渐消失，稳定性缺陷突显。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种应用于葡萄球菌肠毒素检测的葡萄球菌肠毒素小分子抗体。

本发明的第二个目的是提供一种葡萄球菌肠毒素小分子抗体的制备方法。

本发明的第三个目的是提供一种葡萄球菌肠毒素小分子抗体的用途。

本发明的技术方案概述如下：

一种葡萄球菌肠毒素小分子抗体，是序列表中SEQ ID No.1所示氨基酸序列。

一种葡萄球菌肠毒素小分子抗体的制备方法，包括如下步骤：

（1）制备葡萄球菌肠毒素单抗杂交瘤细胞5C12；

（2）采用Trizol法提取葡萄球菌肠毒素单抗杂交瘤细胞5C12总mRNA，以oligo(dT)₁₈为引物，逆转录合成cDNA；

（3）在相对保守的FR1区和FR4区，设计由所述葡萄球菌肠毒素单抗杂交瘤细胞5C12表达的单抗的轻链可变区基因的上、下游简并引物，分别为SEQ ID No.8和SEQ ID No.9所示，以及由所述葡萄球菌肠毒素单抗杂交瘤细胞5C12表达的单抗的重链可变区基因的上、下游简并引物，分别为SEQ ID No.10和SEQ ID No.11所示；以cDNA为模板，PCR扩增获得轻链可变区基因和重链可变区基因，分别克隆至pUC-T simple载体，经测序及IMGT/V-QUEST、BLAST分析，确认所获序列符合鼠源抗体可变区经典结构，均为功能性V（D）J重排模式，其中，轻链可变区基因为SEQ ID No.2所示，其编码的多肽为SEQ ID No.3所示；重链可变区基因为SEQ ID No.4所示，其编码的多肽为SEQ ID No.5所示；

（4）设计轻链可变区基因的上、下游表达引物，分别用SEQ ID No.12和SEQ ID No.13所示，以SEQ ID No.2所示序列为模板，通过PCR扩增，使轻链可变区基因序列C端修饰半胱氨酸及Sma I和Xba I酶切位点；设计重链可变区基因的上、下游表达引物，分别用SEQ IDNo.14和SEQ ID No.15所示，以SEQ ID No.4所示序列为模板，通过PCR扩增，使重链可变区基因序列C端修饰半胱氨酸及Nhe I和Hind III酶切位点，同时在轻链可变区基因序列和重链可变区基因序列的N端引入Kozak序列；

（5）经酶切、连接，将步骤（4）获得的修饰的重链可变区基因序列插入真核表达载体pcDNA3.1(+)，获得pcDNA3.1-V_H过渡载体；

另以pIRESneo质粒为模板，以SEQ ID No.16和SEQ ID No.17所示核苷酸为上、下游引物，通过PCR扩增获得ivs-IRES序列；同时以步骤（4）获得的修饰的轻链可变区基因序列和ivs-IRES序列为模板，以SEQ ID No.12所示核苷酸为上游引物，以SEQ ID No.17所示核苷酸为下游引物，采用两步法重叠PCR方法，扩增获得带有后续重组操作BamHI和Xba I酶切位点的ivs-IRES-V_L融合基因片断，插入所述pcDNA3.1-V_H过渡载体，构建真核单启动子共表达重组载体p5C12HILO，其中，5`-V_H-ivs-IRES-V_L-3`融合序列为SEQ ID No.6所示，p5C12HILO质粒序列为SEQ ID No.7所示；

（6）通过Lipo2000脂质体介导瞬时转染哺乳动物细胞BHK-21细胞系，经PCR鉴定和G418抗性筛选，获得稳定表达分泌细胞系。

上述抗体在葡萄球菌肠毒素检测中的应用。其中检测为细胞间接免疫荧光检测法或流式细胞术检测法。

本发明设计并构建葡萄球菌肠毒素单抗轻链、重链可变区基因的真核单启动子共表达载体，分别于轻链、重链C端引入半胱氨酸残基，结合细胞内肽段自组装原理形成链间二硫键，模拟天然抗体的抗原结合域空间构象，获得高效表达稳定分泌哺乳动物细胞系及特异性高、亲和力强的小分子抗体。

实验证明，本发明的葡萄球菌肠毒素小分子抗体可以应用于葡萄球菌肠毒素检测中，可以应用于细胞间接免疫荧光检测和流式细胞术检测。

本发明中所涉及的葡萄球菌肠毒素为天然的葡萄球菌肠毒素或者通过原核表达获得的重组葡萄球菌肠毒素，该肠毒素优选为葡萄球菌肠毒素A、葡萄球菌肠毒素G、葡萄球菌肠毒素K、葡萄球菌肠毒素O、葡萄球菌肠毒素Q、葡萄球菌肠毒素U型中的一种或多种。

附图说明

图1：葡萄球菌肠毒素单抗可变区基因克隆的电泳图片；图中A为轻链可变区基因扩增电泳图谱，M为DNA Marker2000，1为葡萄球菌肠毒素单抗杂交瘤细胞5C12的轻链可变区基因，2为阴性对照，3为空白对照。B为重链可变区基因扩增电泳图谱，M为DNA Marker2000，1为葡萄球菌肠毒素单抗杂交瘤细胞5C12的重链可变区基因，2为阴性对照，3为空白对照。

图2：真核单启动子共表达重组载体p5C12HILO质粒图谱。

图3：细胞间接免疫荧光（IFA）结果图；图中a-g为SEA、SEA-his、SEG-his、SEK-his、SEO-his、SEQ-his、SEU-his处理组，h为阴性对照细胞系。

图4：稳定表达细胞系识别天然及重组抗原流式细胞术（FCM）结果图。

图5：两步法重叠PCR反应程序。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。

1.葡萄球菌肠毒素单抗杂交瘤细胞5C12的制备

以SEO-GST融合蛋白为免疫抗原，免疫6周龄Balb/c小鼠4次，2周/次：初次免疫采用加入等量弗氏完全佐剂方法颈背部多点皮下注射，免疫抗原剂量为100μg/只；二次免疫采用加入等量弗氏不完全佐剂方法颈背部多点皮下注射，免疫抗原剂量为100μg/只；第三次及终次免疫不加佐剂，采用尾静脉注射，免疫抗原剂量为50μg/只。处死已结束免疫的Balb/c小鼠，无菌取脾，制备免疫脾脏细胞悬浮液备用。通过PEG法体外融合免疫脾细胞与骨髓瘤SP2/0细胞，步骤如下：分别吸取并混匀1×10⁸个免疫脾细胞和5×10⁷个SP2/0细胞，1000r/min离心10min，弃上清；缓缓加入1mL37℃预温的PEG4000融合剂,作用90s后使用DMEM液终止反应，800r/min离心10min，弃上清；加入适量HAT选择培养基，以1000个cell/孔铺于96孔细胞培养板中，每2天更换培养液，持续筛选7d；阳性细胞通过有限稀释法单克隆后，逐步扩大培养，制备得到葡萄球菌肠毒素单抗杂交瘤细胞5C12。

2.单抗杂交瘤轻链、重链可变区基因克隆、测序分析及表达载体的构建

（1）选取稳定分泌抗葡萄球菌肠毒素单克隆抗体的杂交瘤细胞5C12株，采用Trizol法提取葡萄球菌肠毒素单抗杂交瘤细胞5C12的总mRNA，以oligo(dT)₁₈为引物，逆转录合成cDNA。

（2）分别在相对保守的FR1区和FR4区，设计由所述葡萄球菌肠毒素单抗杂交瘤细胞5C12表达的单抗的轻链可变区基因的上、下游简并引物，分别用SEQ ID No.8和SEQ ID No.9所示，以及由所述葡萄球菌肠毒素单抗杂交瘤细胞5C12表达的单抗的重链可变区基因的上、下游简并引物，分别为SEQ ID No.10和SEQ ID No.11所示；以cDNA为模板，通过PCR扩增获得轻链可变区基因V_L和单抗重链可变区基因V_H。

轻链可变区基因PCR反应体系（50μL）：

重链可变区基因PCR反应体系（50μL）：

轻链可变区和重链可变区PCR扩增反应程序相同：

94℃变性3min；

94℃变性30s，59℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环；

72℃延伸10min；4℃冷却2min。

PCR产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳，条件设置为电压120V，时间20min。

（3）纯化回收轻、重链可变区基因，利用Nanodrop2000微量紫外分光光度计分别对目的基因定量，按照经验摩尔比pUC-T simple载体:目的片段=1:3，连接至pUC-T simple载体。将10μL连接产物全部加入至100μL Top10感受态细胞中，冰浴30min后，42℃热击45s，置于冰上孵育1min。加入800μL LB液体培养基，37℃振荡培养60min。菌液室温4000r/min离心5min，留取约200μL基质上清，轻轻振荡与沉淀混匀，涂布于含有X-Gal、IPTG和Amp/LB固体培养基上，37℃培养过夜。通过菌液PCR方法筛选阳性重组质粒，测序后采用碱式裂解法小量抽提质粒。利用IMGT/V-QUEST及BLAST分析比对，确认所获序列符合鼠源抗体可变区经典结构，均为功能性V（D）J重排模式，其中，轻链可变区基因为SEQ ID No.2所示，其编码的多肽为SEQ ID No.3所示；重链可变区基因为SEQ ID No.4所示，其编码的多肽为SEQ ID No.5所示。

轻链可变区TA克隆连接体系（10μL）：

上述体系于22℃孵育30min。

重链可变区TA克隆连接体系（10μL）：

上述体系于22℃孵育30min。

核苷酸序列分析比对涉及的服务器：

http://www.imgt.org/IMGT_vquest/share/textes/index.html

http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi

（4）设计轻链可变区基因的上、下游表达引物，上游表达引物用SEQ ID No.12表示，下游表达引物用SEQ ID No.13所示，以SEQ ID No.2所示序列为模板，通过PCR扩增，使轻链可变区基因序列C端修饰半胱氨酸及Sma I和Xba I酶切位点；设计重链可变区基因的上、下游表达引物，上游表达引物用SEQ ID No.14所示，下游表达引物用和SEQ ID No.15所示；以SEQ ID No.4所示序列为模板，通过PCR扩增，使重链可变区基因序列C端修饰半胱氨酸及Nhe I和HindIII酶切位点，同时在轻链可变区基因序列和重链可变区基因序列的N端引入Kozak序列；

表达引物扩增轻链可变区基因PCR反应体系（50μL）：

表达引物扩增重链可变区基因PCR反应体系（50μL）：

表达引物扩增轻链、重链可变区基因PCR扩增反应程序相同：

94℃变性3min；

94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环；

72℃延伸10min；4℃冷却2min。

（5）纯化回收PCR产物，采用限制性内切酶Nhe I、HindIII双酶切步骤（4）获得的修饰的重链可变区片段和真核表达载体质粒pcDNA3.1(+)。纯化回收酶切产物，通过T4DNALigase连接，产物转化Top10感受态细胞并筛选阳性菌落提取质粒，通过相同条件双酶切及PCR反应对重组质粒进行鉴定，获得过渡载体pcDNA3.1-V_H，具体步骤如下：

修饰的重链可变区基因酶切体系（20μL）：

混合物瞬时离心至于酶切管底部，37℃孵育2h。

pcDNA3.1（+）酶切体系（20μL）：

混合物瞬时离心至于酶切管底部，37℃孵育2h。

连接体系（10μL）：

混合物瞬时离心至于Eppendorf管底部，22℃孵育30min。

（6）另以pIRESneo质粒为模板，以SEQ ID No.16所示核苷酸为上游引物，以SEQ ID No.17所示核苷酸为下游引物，通过PCR扩增获得ivs-IRES序列。纯化回收PCR产物，同时以步骤（4）获得的修饰的轻链可变区（V_L）序列和ivs-IRES序列为模板，以SEQ ID No.12所示核苷酸为上游引物，以SEQ ID No.17所示核苷酸为下游引物，采用两步法重叠PCR方法，扩增获得带有后续重组操作BamH I和Xba I酶切位点的ivs-IRES-V_L融合基因片断。回收ivs-IRES-V_L拼接产物，经酶切、连接，将其插入已制备的pcDNA3.1-V_H过渡载体，以5`V_H-ivs-IRES-V_L-3`模式，构建真核单启动子共表达重组载体p5C12HILO，其中，5`-V_H-ivs-IRES-V_L-3`融合序列为SEQ ID No.6所示，p5C12HILO质粒序列为SEQ ID No.7所示。

ivs-IRES序列的PCR反应体系（50μL）：

ivs-IRES序列的PCR反应程序：

94℃变性3min；

94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环；

72℃延伸10min；4℃冷却2min。

PCR产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳，条件设置为电压100V，时间30min。两步法重叠PCR反应体系（50μL）：

两步法重叠PCR反应程序（见图5）

ivs-IRES-V_L片段酶切体系（20μL）：

混合物瞬时离心至于酶切管底部，37℃孵育2h。

pcDNA3.1-V_H载体酶切体系（20μL）：

混合物瞬时离心至于酶切管底部，37℃孵育2h。

连接体系（10μL）：

混合物瞬时离心至于Eppendorf管底部，22℃孵育30min。

3.蛋白表达及分析

（1）细胞转染：选用脂质体转染方法。使用试剂盒EndoFree Plasmid Midi Kit分别提取高纯、无内毒素质粒p5C12HILO，转染前一天将BHK-21细胞以1×10⁶个cell/孔接种至六孔板内。转染前2h细胞换液，转染时要求细胞汇合度为90%-95%。将5μg质粒p5C12HILO加至250μL无血清DMEM培基中，轻轻混匀。另将10μL Lipo2000加至250μL的无血清DMEM中，轻轻混匀，室温静置5min。将质粒p5C12HILO悬液和Lipo2000悬液混合，总体积500μL，轻轻混匀，室温静置20min，加至六孔板细胞孔内，前后左右晃动孔板混匀，置于培养箱中培养。转染6小时后，更换完全培养基，每孔2mL；

（2）阳性克隆筛选及单克隆：转染24h后，以1:2稀释细胞传代（使用新鲜完全培养基），转染48h后，添加选择培养基（600ng/mLG418）筛选2周，其间换液5次。同时设立空白对照，即未转染的BHK-21细胞，至空白对照细胞全部死亡时，采用有限稀释法对阳性重组子进行单克隆。

（3）稳定表达细胞系的建立：逐步扩大培养，将选择培养基G418浓度降至300ng/mL，培养1个月后收集部分阳性、阴性对照组细胞，通过RT-PCR及直接ELISA方法对阳性重组细胞进行评价，获得稳定表达分泌细胞系。

4.抗体鉴定

（1）细胞间接免疫荧光（IFA）：分别收集p5C12HILO和pcDNA3.1(+)转染45d的BHK-21细胞，制备浓度为1×10⁶个cell/mL悬液，滴在无菌盖玻片上，于37℃，5%CO₂培养24h。吸弃培养基，用PBS清洗2次后，滴加数滴甲醇于爬片上，-20℃静置10min。PBS清洗1次，滴加数滴预冷丙酮液，-20℃静置1min。PBS清洗1次，分别滴加10μg/mL天然葡萄球菌肠毒素SEA，及重组葡萄球菌肠毒素SEA-His，SEG-His，SEK-His，SEO-His，SEQ-His，SEU-His，4℃静置45min。PBS清洗1次，滴加5%FCS封闭液，4℃静置30min。PBS清洗1次，滴加 1：100稀释抗SEs鸡多克隆抗体，4℃静置45min。PBS清洗1次，滴加1：100稀释鼠抗鸡-FITC，避光4℃静置45min，置于荧光倒置显微镜下观察（见图3）。

（2）流式细胞术（FCM）：分别收集p5C12HILO和pcDNA3.1(+)转染45d的BHK-21细胞2×10⁶个，用预冷PBS2mL洗涤细胞1次，1000rpm离心5min。弃上清，用2ml4%多聚甲醛室温固定细胞10min，1000rpm离心5min。2mLPBS重悬细胞，分别加入10μg/mL天然葡萄球菌肠毒素SEA，及重组葡萄球菌肠毒素SEA-His，SEG-His，SEK-His，SEO-His，SEQ-His，SEU-His，冰浴45min。离心弃上清，PBS洗涤，加入5%FCS封闭液冰浴30min。PBS洗涤，加入饱和剂量鸡多克隆抗体，冰上放置45min。离心弃上清，PBS重悬细胞，加入荧光二抗鼠抗鸡-FITC，冰上避光放置40min后，1000r/min离心5min，去上清，PBS洗涤1次。流式细胞仪检测荧光值，每管计数15000个细胞。（见图4）。

Claims

1.一种葡萄球菌肠毒素小分子抗体，是序列表中SEQ ID No.1所示氨基酸序列。

2.一种葡萄球菌肠毒素小分子抗体的制备方法，包括如下步骤：

（1）制备葡萄球菌肠毒素单抗杂交瘤细胞5C12；

（4）设计轻链可变区基因的上、下游表达引物，分别用SEQ ID No.12和SEQ ID No.13所示，以SEQ ID No.2所示序列为模板，通过PCR扩增，使轻链可变区基因序列C端修饰半胱氨酸及Sma I和Xba I酶切位点；设计重链可变区基因的上、下游表达引物，分别用SEQ IDNo.14和SEQ ID No.15所示，以SEQ ID No.4所示序列为模板，通过PCR扩增，使重链可变区基因序列C端修饰半胱氨酸及Nhe I和HindIII酶切位点，同时在轻链可变区基因序列和重链可变区基因序列的N端引入Kozak序列；

3.权利要求1的抗体在葡萄球菌肠毒素检测中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征是所述检测为细胞间接免疫荧光检测法。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征是所述检测为流式细胞术检测法。