CN108517309A - 一种表达prrsv-gp5蛋白的重组乳杆菌及制备方法 - Google Patents
一种表达prrsv-gp5蛋白的重组乳杆菌及制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种表达PRRSV‑GP5蛋白的重组乳杆菌及制备方法，通过优化的PRRSV ORF5抗原基因，连接载体内源信号肽，以乳酸菌作为载体，构建了表达PRRSV‑GP5蛋白的重组乳杆菌，提供一种表达PRRSV‑GP5蛋白的重组乳杆菌，所述重组乳杆菌中包含优化的野生型PRRSV ORF5抗原基因序列，其序列为SEQ ID NO:1。该重组乳杆菌能高效表达GP5蛋白，免疫原性高，传代稳定性好，在保护猪免遭PRRSV感染的疫苗及方法中应用前景广泛。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种表达PRRSV-GP5蛋白的重 组乳杆菌及制备方法。
背景技术
猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)，又名猪蓝耳病，是威胁我国养猪业的 重大传染病，也是目前影响全世界养猪业的最重要的疾病。目前世界上 发生的PRRS有欧洲型和美洲型两个血清型，我国流行的只有美洲型， 猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductiveand respiratory syndrome virus,PRRSV)是导致高致病性蓝耳病的主要病原，通过吸入、摄食、叮 咬伤口等多种传播方式传染，主要危害是引起母猪晚期流产、早产、死 胎、木乃伊胎等繁殖障碍和仔猪严重的呼吸道症状及高死亡率，对世界 养猪业造成了极大的经济损失。
PRRSV属于尼多病毒目，动脉炎病毒科，动脉炎病毒属，是单股正 链有囊膜的RNA病毒，核酸大小约为15kb，含9个开放阅读框(ORFs)。 ORF5基因是其中一个开放阅读框，也是主要的结构蛋白编码基因，编码 的GP5蛋白(糖基化膜蛋白)是PRRSV重要结构蛋白和主要的免疫原 之一，可诱导机体产生中和抗体，如诱导体液免疫，还可诱导细胞免疫， 对于研究基因工程疫苗和诊断抗原具有重要意义。
目前，对于PRRS疾病的控制主要是利用疫苗控制PRRSV病毒的复 制和扩散，防制PRRSV病毒的疫苗主要由灭活疫苗和弱毒疫苗，但目前 的弱毒疫苗和灭活疫苗仍无法有效控制疾病的传播，还存在毒力反强等 危险因素，在免疫原性和安全性方面存在的问题较大，因此，亟待开发 相关安全产品替代现有产品。
发明内容
本发明的目的在于提供一种表达PRRSV-GP5蛋白的重组乳杆菌及 制备方法，用以解决现有防制PRRSV病毒的疫苗免疫原性弱和安全性差 的问题，通过优化野生型PRRSVORF5抗原基因，连接载体内源信号肽， 以乳酸菌作为载体，构建了表达PRRSV-GP5蛋白的重组乳杆菌，该重组 乳杆菌能高效表达GP5蛋白，免疫原性高，在制备用于保护猪免遭PRRSV感染的疫苗中应用前景广阔。
为实现上述目的，本发明的技术方案为：
技术方案一：一种表达PRRSV-GP5蛋白的重组乳杆菌，所述重组乳 杆菌中包含优化的PRRSV ORF5抗原基因序列，其序列为SEQ ID NO:1。
优选的，所述重组乳杆菌中包含抗原分子片段，所述抗原分子片段 的序列中包括依次连接的人工合成片段SynF5-信号肽编码序列-优化的 PRRSV ORF5抗原基因-靶向肽-标签序列，所述人工合成片段SynF5序列 为ATGGAGATTTTAGCC，所述信号肽为乳杆菌内源信号肽，氨基酸序列 为 MNFKTAAKVTVVAGASVLFLAACGSSKSSSSSKQTANWTESAELPTMDISKSTDVVSSNALNNTNEGLYRLGKN。
更优选的，所述乳杆菌为植物乳杆菌CGMCC1.557，所述靶向肽为 Mpep或DCpep，所述标签为HA标签，所述抗原分子片段的序列为 SynF5-1320-O5-Mpep-HA或SynF5-1320-O5-DCpep-HA， SynF5-1320-O5-Mpep-HA序列为SEQ ID NO:2， SynF5-1320-O5-DCpep-HA序列为SEQ ID NO:3。
技术方案二：一种用于保护猪免遭PRRSV感染的疫苗，所述疫苗中 包含上述任一所述的重组乳杆菌。
技术方案三：一种表达PRRSV-GP5蛋白的重组乳杆菌及制备方法， 所述方法包括以下步骤，
①抗原分子设计：
1.1选取PRRSV毒株的ORF 5基因中编码GP5蛋白第32～200位氨基 酸的序列为野生型PRRSV ORF 5抗原基因；
1.2统计载体乳杆菌基因组中编码序列的高频密码子，根据密码子偏 向性对野生型PRRSV ORF 5抗原基因序列进行修饰，得优化的PRRSV ORF5抗原基因序列，修饰原则是当存在前两个高频密码子序列频率相差 小于2％，部分位点选用第二高频密码子序列；
1.3筛选载体乳杆菌内源的信号肽，确定信号肽氨基酸序列及其编码 序列；
1.4设计抗原分子，抗原分子片段中包含依次连接的人工合成片段 SynF5-信号肽氨基酸编码序列-优化的PRRSV ORF5抗原基因序列，所述 优化的PRRSV ORF5抗原基因序列为SEQ ID NO:1，所述人工合成片段 SynF5的序列为ATGGAGATTTTAGCC；
②基因扩增
以PRRSV毒株cDNA为模板，设计引物，PCR扩增获得抗原分子片段 PCR产物；
③扩增产物添加HA标签
设计含有HA标签的引物，对抗原分子片段PCR产物进行PCR扩增， 得到含有HA标签序列的基因产物；
④PCR产物回收和无缝克隆
回收含有HA标签序列的基因产物，同时借助酶切质粒切胶回收线性 化质粒载体片段，进一步将含有HA标签序列的基因产物与线性化质粒载 体片段进行片段连接，得无缝克隆得组装产物；
⑤电转化中间宿主乳酸乳球菌，并提取质粒；
⑥电转化终宿主乳杆菌，得表达PRRSV-GP5蛋白的重组乳杆菌。
优选的，所述乳杆菌为植物乳杆菌CGMCC 1.557，所述乳杆菌内源 的信号肽氨基酸序列为 MNFKTAAKVTVVAGASVLFLAACGSSKSSSSSKQTANWTESAELPTMDISKSTDVVSSNALNNTNEGLYRLGKN。
优选的，所述步骤2中PCR扩增的引物由上游引物TATTACAAGGAGATTTTAGCCATGAATTTCAAAACAGCTGC和下游引 物TTAAGCATAATCTGGAACATCATATGGATATGGCCGACCCCATTG 组成；所述含有HA标签的引物由上游引物 TATTACAAGGAGATTTTAGCCATGAATTTCAAAACAGCTGC和下游引 物GGGGTACCGAATTCCTCGAGTCTAGTTAAGCATAATCTGGAACATCA T组成。
优选的，所述酶切质粒为NcoI/XbaI酶切质粒pSIP411，所述中间宿主 乳酸乳球菌为NZ3900菌株。
优选的，所述方法还包括免疫增强步骤，所述免疫增强步骤包括步 骤1.4在设计抗原分子前，选择Mpep或DCpep两种靶向肽表位连接到GP5 蛋白的C端，形成结构为SynF5-1320-O5-Mpep-HA或 SynF5-1320-O5-DCpep-HA的抗原分子，所述SynF5-1320-O5-Mpep-HA序 列为SEQ ID NO:2，SynF5-1320-O5-DCpep-HA序列为SEQ ID NO:3；和/ 或步骤⑦以含诱导剂SppIP的培养基诱导培养表达PRRSV-GP5蛋白的重 组乳杆菌，得诱导后的重组植物乳杆菌。
技术方案三：一种含有保护猪免遭PRRSV感染抗血清，所述抗血清 中含有抗PRRSV-GP5蛋白的抗体，所述抗血清制备方法包括以下步骤：
①根据抗原分子片段的序列合成抗原多肽，并在抗原多肽C端加入半 胱氨酸残基，得含巯基的肽；将含巯基的肽与预激活的载体蛋白在偶联 缓冲液中偶联，借助纯化柱制备半抗原-载体；所述抗原分子片段中包括 依次连接的人工合成片段SynF5-信号肽编码序列-优化的野生型PRRSV ORF5抗原基因序列，优化的野生型PRRSV ORF5抗原基因序列为SEQ ID NO:1；
②动物免疫制备抗血清。
上述技术方案中，首选选取植物乳杆菌作为载体，乳酸菌是“公认 安全”的微生物群体，植物乳杆菌也属于乳酸菌，更具有多种益生功能。 尤其是益生菌表面的多糖、特殊的代谢产物，具有免疫调节的功效，具 有佐剂功能。益生性植物乳杆菌作为载体表达外源蛋白也成为潜在的口 服疫苗制备手段。选取PRRSV毒株的抗原分子时，考虑到完整的ORF5基因并不适合在原核表达系统中表达，主要因为GP 5蛋白前30位存在真核 生物的信号肽结构域，在原核表达体系中不易于蛋白的形成和定位，影 响蛋白的翻译和分泌效率。此外，抗原的免疫原性也显得至关重要，需 要表达具有表位肽的部分才有可能诱导产生更有效的保护反应。因此， 使用免疫表位肽数据库(IEDB，http://www.iedb.org/home_v3.php)预测PRRSV毒株的GP5蛋白表位肽的位置(图1)。最终选择编码GP5蛋白第 32～200位氨基酸的ORF5作为野生型PRRSV ORF5抗原基因；为提高重组 乳杆菌的表达及翻译效率，选择载体内源的信号肽；进一步的，根据载 体内基因组的高频密码子野生型PRRSV ORF5抗原基因进行优化，同时设 计人工合成片段SynF5-，作为重组乳杆菌中的抗原分子片段，所述抗原 分子片段的序列中包括依次连接的人工合成片段SynF5-信号肽编码序列- 优化的野生型PRRSVORF5抗原基因序列，序列为SEQ ID NO:2。
本发明方法具有如下优点：本发明成功构建了表达PRRSV-GP5蛋白 的重组乳杆菌，其中成功的对野生型PRRSV ORF5抗原基因进行了优化、 快速灵活添加标签蛋白、建立了有效的乳杆菌载体构建方法、借助载体 内源信号肽优化了重组乳杆菌的GP5蛋白表达策略，本发明严谨高效，所 得重组乳杆菌免疫原性强，传代稳定性好，在保护猪免遭PRRSV感染的 疫苗及方法中应用前景广泛。
附图说明
图1、图2为实施例1中PRRSV毒株VR2332的GP5蛋白表位肽位 置预测分析图(IEDB)。
图3实施例1克隆PCR产物的跑胶电泳图。
图4实施例1中步骤1.5所得6种质粒凝胶电泳结果图。
图5实施例1密码子优化对重组乳杆菌GP5蛋白的表达量影响结果 图。
图6实施例3不同浓度诱导肽对重组植物乳杆菌PRRSV-GP5蛋白表 达的影响结果图，图中泳道自左至右依次为阴性对照组Neg、200ng/mL 诱导肽组、100ng/mL诱导肽组、50ng/mL诱导肽组和10ng/mL诱导肽组。
图7实施例4诱导时间对重组植物乳杆菌PRRSV-GP5蛋白表达的影 响结果图，图中泳道自左至右依次为阴性对照组Neg、7h诱导组、6h诱 导组、5h诱导组和4h诱导组。
图8实施例5诱导温度对诱导重组植物乳杆菌PRRSV-GP5蛋白表达 的影响结果图，图中泳道自左至右依次为A板37℃实验组中的诱导组1 号孔、阴性对照组Neg、诱导组2号孔和B板30℃实验组中的诱导组1 号孔、诱导组2号孔、阴性对照组Neg、诱导组3号孔。
图9实施例6中第1-5代重组植物乳杆菌GP5蛋白表达的结果图， 图中泳道自左至右，前两道均为阴性对照组，F5-F1依次为第5代、第4 代、第3代、第2代、第1代的蛋白电泳结果。
图10实施例7中血清抗体滴度检测。
图11实施例7抗血清检测结果。
图12实施例7间接免疫荧光法检测抗原表面展示能力的结果图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例中所涉及的试剂、试剂盒，如无特殊说明，均可从商业途径 获得，所涉及操作及方法，如软件使用方法、引物设计软件操作方法、 凝胶电泳、Western Blot等，均为常规方法。
实施例1表达PRRSV-GP5蛋白的重组乳杆菌的制备方法
本实施例以PRRSV中的VR2332毒株、植物乳杆菌CGMCC1.557的重 组为例，详细说明本发明的制备表达PRRSV-GP5蛋白的重组乳杆菌的方 法，同时，为便于比较本发明方法对抗原分子的优化所带来的高表达 PRRSV-GP5蛋白的优势，同时设置包含未优化的野生型ORF5序列为抗原 分子的对照组，
1.1抗原分子设计
(1)选择PRRSV中VR2332毒株，以GP5蛋白第32～200位氨基酸的 编码序列作为野生型ORF5抗原序列，选择依据是完整的ORF5基因并不 适合在原核表达系统中表达，实验中借助免疫表位肽数据库(IEDB， http://www.iedb.org/home_v3.php)预测VR2332的GP5蛋白表位肽的位置 (参见图1和图2)，GP5蛋白前30位存在真核生物的信号肽结构域，在原 核表达体系中不利于蛋白的形成和定位，影响蛋白的翻译和分泌效率。
(2)载体信号肽选择
将植物乳杆菌CGMCC 1.557编码的氨基酸序列，依次输入SignalP分 析软件中，再根据获得信号肽的氨基酸序列输入LAB-Secreome数据库中， 预测获得6类不同特性的信号肽，和21个未知分类的信号肽，根据预测结 果最终选择标号为1320的脂质体锚定信号肽作为信号肽表达系统，1320 信号肽的氨基酸序列为 MNFKTAAKVTVVAGASVLFLAACGSSKSSSSSKQTANWTESAELPTM DISKSTDVVSSNALNNTNEGLYRLGKN，编码序列为 ATGAATTTCAAAACAGCTGCAAAA GTAACCGTCGTTGCCGGCGCATCCGTACTATTCTTAGCTGCTTGTGGCTCAAGCAAGAGTTCTTCAAGTTCTAAGCA AACGGCCAATTGGACCGAATCAGCCGAATTACCAACGATGGACATTTCTAAGTCCACCGACGTGGTTAGTTCTAATG CGTTGAATAACACCAATGAAGGGTTATACCGTCTCGGTAAGAAC。
(3)密码子优化
首先，培养及保存CGMCC 1.557菌株
取出保存的菌液，使用接种环蘸去少量菌液涂布于固体MRS培养基 中，放入培养箱中，37℃厌氧环境培养24h，取出培养皿，用无菌枪头挑 取单克隆菌落，转接新的MRS液体培养基，继续培养；每隔12h再次以1％ 体积转接，连续传代50次；再次涂布于固体培养基中，挑取单克隆体用 于实验或冷冻保藏。
菌种保存方式如下：保存管和甘油以121℃高温灭菌15min，备用；
每个保存管中加入300uL甘油，并将连续转接3次的菌液加入至甘油 中，使甘油与MRS培养基的体积比达到3:7，混匀后-80℃低温保存。
CGMCC 1.557菌株总DNA的提取、PCR扩增并全基因组测序：
将单个菌落接种于MRS培养基中，37℃厌氧培养至平台期，离心加 入20ug/mL溶菌酶；37℃处理30min，除去溶菌酶，加入SDS，蛋白酶K 等除去杂质蛋白，高盐环境下沉淀获得基因组DNA；利用苯酚：氯仿： 异戊醇法进行抽提；乙酸盐沉淀法获得基因组DNA沉淀，放入70～75％乙 醇洗涤一次，室温晾干；RTE中充分溶解获得总DNA基因组。
进一步以总DNA基因组为模板，采用细菌通用引物和特异性引物、 按照Taq预混液说明书进行PCR扩增，其中，细菌通用引物选择20F(引 物序列为AGAGTTTGATCCTGGCTCAG)/1500R(引物序列为 GGTTACCTTGTTACGACTT)，植物乳杆菌CGMCC 1.557特异性引物选 择F1(引物序列为GCCGCCTAAGGTGGGACAGAT)/R1(引物序列为 TTACCTAACGGTAAATGCGA)，
回收上述PCR扩增产物，进行全基因组测序。
统计分析密码子偏向性：根据上述全基因组测序结果，以NCBI数据 库进行基因注释，结果如表1-A；
表1-A基因注释结果
| 总长度(bp) | 3156839bp |
| 染色质，质粒数量(个) | 1，2 |
| GC含量(％) | 44.61％ |
| 注释基因数目(个) | 3087 |
| tRNA | 70 |
| ncRNA | 4 |
| rRNA(5S,16S,23S) | 6,5,5 |
| CDS | 2997 |
搜集所有编码序列，获得植物乳杆菌26种氨基酸的高频密码子，建 立密码子列表如表1-B所示。
表1–B植物乳杆菌CGMCC 1.557密码子表
此时，对野生型ORF5抗原的密码子进行优化，将几乎所有非高频密 码子更换为高频密码子，避免产生特殊的RNA二级结构，不考虑终止密 码子，对VR2332株GP5蛋白第32～200位氨基酸的编码序列(野生型ORF5 序列，以vO5作为代号标识)进行优化，发现vO5基因包括100个高频密 码子序列，72个非高频序列(结果见表2)，进一步对非高频序列进行修饰，修饰原则是当存在前两个高频密码子序列频率相差小于2％，部分位 点选用第二高频密码子序列，因此最终优化后的vO5序列(即优化的 PRRSV ORF5抗原基因序列，标记为O5)中部分存在非高频密码子。
表2密码子优化统计表
优化的PRRSV ORF5抗原基因序列即O5序列如SEQ ID NO:1所示，具 体为AGTAACGATAGTAGTAGTCATTTACAATTAATTTATAACTTGACGTTATGTGAGTTAAATGGCACTGATTGGTTAGCTAACAAGTTTGATTGGGCGGTGGAGAGTTTTGTCATTTTTCCCGTTTTGACTCATATTGTCAGTTATGGTGCCTTAACTACGAGTCATTTCTTAGATACTGTCGCTTTAGTCACTGTGAGTACGGCCGGTTTTGTTCATGGTCGGTATGTCTTAAGTAGTATTTATGCGGTCTGTGCCTTAGCTGCGTTGACTTGTTTCGTCATTCGGTTTGCGAAGAATTGTATGAGTTGGCGCTATGCGTGTACGCGGTATACGAACTTTTTATTAGATACTAAGGGCCGTTTATATCGGTGGCGGAGTCCAGTCATTATTGAGAAGCGGGGCAAGGTTGAGGTCGAAGGTCATTTAATTGATTTAAAGCGGGTTGTGTTAGATGGTAGTGTGGCGACGCCAATTACGCGGGTTTCAGCGGAACAATGGGGTCGGCCA
(4)靶向肽表位选择
选择Mpep(代谢型谷氨酸受体5拮抗剂，氨基酸序列为 SFHQLPARSPLP)或DCpep(树突状细胞诱导肽，氨基酸序列为 FYPSYHSTPQRP)两种靶向肽表位连接到GP5蛋白的C端。
基于上述步骤，设计合成抗原分子，抗原分子片段包含人工合成片 段SynF5-信号肽1320编码序列-优化后vO5序列-靶向肽编码序列-标签序 列，命名标记为SynF5-1320-O5-Mpep-HA或SynF5-1320-O5-DCpep-HA， 其中，所述人工合成片段SynF5序列为ATGGAGATTTTAGCC，SynF5-1320-O5-Mpep-HA序列为SEQ ID NO:2， SynF5-1320-O5-DCpep-HA序列为SEQ ID NO:3。
1.2基因扩增
以PRRSV VR2332株cDNA为模板，以1320-vO5-F为上游引物，以 vO5-Rv、O5M-R、vO5D-R为下游引物扩增vO5，获得vO5及含有靶向肽 M或D的vO5基因序列(分别记为vO5M、vO5D)。
以PRRSV VR2332株cDNA为模板，以SIP-1320-F为上游引物，O5-R、 O5M-R、O5D-R为下游引物进行PCR扩增，获得抗原分子片段PCR产物， 抗原分子片段PCR产物中均包含信号肽1320编码序列，为包含信号肽 1320编码序列的O5基因序列(记为1320-O5)及包含信号肽1320编码序列 和靶向肽M或D的O5基因序列(分别记为1320-O5M、1320-O5D)。
以植物乳杆菌CGMCC1.557基因组为模板，以SIP-1320-F、1320-Rv 为引物，扩增信号肽1320，获得产物SIP-1320v。
上述引物序列参见表3。
1.3扩增产物添加HA标签及PCR融合
i)对1320-O5M、1320-O5D以SIP-1320-F为上游引物，以 (v)O5M-HA-R01和(v)O5D-HA-R01为下游引物进行8轮PCR扩增，再加入 HA-R02引物进行22轮PCR扩增，得到含有D,M和HA标签序列的基因产 物，分别记为1320-O5MH，1320-O5DH；
ii)对vO5M、vO5D以1320-vO5-F为上游引物，以(v)O5M-HA-R01和 (v)O5D-HA-R01为下游引物进行8轮PCR扩增，再加入HA-R02引物进行22 轮PCR扩增，得到含有D,M和HA标签序列的基因产物，分别记为vO5MH， vO5DH；
iii)对1320-O5以SIP-1320-F为上游引物，HA-R02为下游引物进行30 轮PCR扩增，得到含有HA标签序列的基因产物，记为1320-O5H；
iv)对vO5以SIP-1320-F为上游引物，HA-R02为下游引物进行30轮 PCR扩增，得到含有HA标签序列的基因产物，记为1320-vO5H；
上述涉及的序列参见表3，PCR反应程序及体系组成参见表4。
表3引物序列
表4添加标签所进行PCR反应的程序及体系组成
回收扩增产物SIP-1320v，分别与相应的vO5H，vO5DH，vO5MH等 比例混合，按照表5所示PCR程序和反应体系进行扩增，获得融合后的PCR 产物1320-vO5H、1320-vO5DH和1320-vO5MH。
表5融合PCR程序和反应体系
注：V，V1和V2为体系中的可变因素，其中V1：V2为1，表示体积 比为1，V为22μL-V1-V2。
1.4PCR产物回收和无缝克隆
按Biospin胶回收试剂盒说明书对上述所得1320-vO5MH， 1320-vO5DH，1320-vO5H及1320-O5MH，1320-O5DH，1320-O5H共六种 PCR产物分别进行回收；
使用NcoI/XbaI酶切质粒pSIP411，切胶回收pSIP411载体片段，进一 步按照Gibson Assembly说明书进行片段连接，反应体系和程序如表6，得 Gibson组装产物。
表6Gibson Assembly反应体系和程序
1.5电转化中间宿主乳酸乳球菌NZ3900
(1)NZ3900感受态制备
在30℃温箱中，使用GM17液体培养基培养NZ3900，过夜孵育12h获 得平台期的NZ3900。再以1％体积分数接种含有1-5％Gly的GM17培养基， 培养至OD值为0.3～0.5时，4,000rpm/min水平离心10min，弃上清，收集 Gly刺激培养物；以高压灭菌的洗涤缓冲液重悬菌体，实验中加入量为 1mL/管，8,000rpm/min离心5min，弃上清，重复洗涤1-3次，最后以1-3mL 洗涤缓冲液重悬菌体，50μL/管分装，得到用于电转化的NZ3900感受态细 胞分散液。
(2)电转化
取5μL Gibson组装产物加入至新鲜制备的50μL NZ3900感受态细胞 分散液中，冰上孵育15-30min，转入2mm规格预冷电转杯(BTX)中， 擦干表面水分后2000kV点击3-8ms，迅速加入30℃预热的M17培养基中，30℃培养2-4h，得转化细菌。
(3)克隆筛选及克隆PCR
将转化细菌进行轻微离心，收集所有菌液，均匀涂布于事先准备好 的红霉素平板，30℃静置培养24-48h，红霉素平板上可见清晰菌落出现， 即为疑似阳性克隆体。挑取10个左右的阳性克隆体作为模板进行克隆 PCR反应，PCR反应中primer F为GCTTCCCACACGCATTTCAG，primer R 为ATTCTGCTCCCGCCCTTATG，PCR反应程序及体系组成参见表7，反 应完成后，借助跑胶检测产物，结果参见图3，可见每个克隆均为阳性质 粒。
表7克隆PCR反应程序及体系组成
(4)提取质粒
分别挑取3～5个鉴定正确的阳性克隆体置于含有10μg/mL红霉素的 GM17培养基中，30℃培养培养6～8h。分别离心收集菌体，37℃下10mg/mL 溶菌酶处理30min，离心然后按照磁珠质粒提取试剂盒的方法进行质粒提 取，最后在磁吸附移除废液后真空抽干，加入35μL37℃预热的高纯水， 漩涡震荡混匀，室温静置5min，期间震荡混匀2-3次，再置于磁力架上磁 吸，待溶液澄清后，吸取上清于新的1.5mL离心管中，得重组质粒，对所 得重组质粒进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图4。所得6种重组质粒均 能表达PRRSV-GP5蛋白。
1.6制备表达PRRSV-GP5蛋白的重组植物乳杆菌
(1)CGMCC 1.557菌株的培养及保存
取出保存的菌液，使用接种环蘸去少量菌液涂布于固体MRS培养基 中，放入培养箱中，37℃厌氧环境培养24h，取出培养皿，用无菌枪头挑 取单克隆菌落，转接新的MRS液体培养基，继续培养；每隔12h再次以1％ 体积转接，连续传代50次；再次涂布于固体培养基中，挑取单克隆体用 于实验或冷冻保藏。
菌种保存方式如下：保存管和甘油以121℃高温灭菌15min，备用；
每个保存管中加入300uL甘油，并将连续转接3次的菌液加入至甘油 中，使甘油与MRS培养基的体积比达到3:7，混匀后-80℃低温保存。
(2)植物乳杆菌CGMCC 1.557感受态制备
将复苏的CGMCC 1.557培养至平台期，以1％体积接种含有2％Gly的 MRS培养基中，37℃培养至OD值为0.3～0.5，10,000×g/min离心10min，收 集Gly刺激培养的培养物，弃上清，加入高压灭菌的洗液重悬菌体，离心 弃上清，重复上第二步两次(共清洗三次)，再利用洗液重悬菌体，完成 CGMCC 1.557感受态的制备，分装至各个小管，一般40或者80μL/管， 得电转化用的CGMCC 1.557感受态细胞分散液，备用。
(3)电转化
将6种重组质粒分别加入至制备的CGMCC 1.557感受态细胞分散液 中，冰浴20min，加入预冷的电转杯中，以1750kV电击3-8ms，迅速转移 电击后菌体于37℃温育的无抗性MRS液体培养基中，37℃温箱中培养 2-4h，得6种表达PRRSV-GP5蛋白的重组植物乳杆菌。
实验结果检测
10,000rpm/min离心收集上述所得重组植物乳杆菌，PBS重悬并连续 清洗两次，离心弃去上清，等比例加入PBS，重悬菌体，得6种重组植物 乳杆菌的分散液，分别加入粒径为0.1μm的氧化锆研磨20min后，取出蛋 白质提取液，加入5×的上样缓冲液充分混匀，沸水煮6min后储存于冰箱 4℃中，用于后续的蛋白质Western blot检测实验。
Western blot检测实验方法：配制浓度15％的聚丙烯酰胺凝胶，进行 垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳，跑胶完成后切割凝胶放置于事先浸泡转膜 缓冲液的PVDF膜上，加上滤纸构成“三明治”结构，随后进行半干法转 膜，30min后取出转有蛋白的PVDF膜，加入5％脱脂乳室温封闭2h，剪取 目的条带大小周围的部分，弃去多余的膜，置于包括抗HA标签抗体或者 抗多肽抗血清的一抗液体中，其中的抗HA标签抗体用于检测抗原分子中 的标签HA，抗多肽抗血清用于检测GP5蛋白表达，4℃孵育过夜，经TBST 漂洗4次，每次8min。再加入二抗，液体中室温孵育1h，再次使用TBST 连续漂洗4次，每次8min。其中一抗与二抗组合为:以抗HA标签抗体作为 一抗孵育时，使用辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠二抗；以抗多肽血清作为一抗孵育时，使用辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗。
将洗净的PVDF膜平铺于放置保鲜膜的X线暗盒中，加上ECL显影液， 在暗室中铺上胶片，关闭暗盒压片一定时间，取出胶片依次在显影液、 水、定影液、水中各孵育1min，取出胶片拍照，观察结果。
结果见图5所示，可见以植物乳杆菌内源信号肽1320为信号肽表达系 统，能够有效将GP 5抗原展示在CGMCC 1.557表面。以密码子优化后的 O5序列进行的重组植物乳杆菌与以vO5序列(野生型ORF5序列)进行的 重组植物乳杆菌相比，GP5蛋白的表达量明显高；连接靶向肽可以增强重 组植物乳杆菌的免疫原性，提高其GP5蛋白表达量，说明本发明提供的表 达PRRSV-GP5蛋白的重组乳杆菌的制备方法所制备的重组乳杆菌表达 GP5蛋白量稳定可靠，可以预期的是，具有更好的免疫原性，能更好的用 于刺激机体免疫反应，用于制备减毒活疫苗时免疫效果会更好。
实施例2
在实施例1的基础上，本实施例进行克隆筛选，以纯化筛选以保证阳 性重组植物乳杆菌的纯度，将所得表达PRRSV-GP5蛋白的重组植物乳杆 菌涂布于红霉素抗性平板中，继续培养24-48h，得克隆转化子，挑取阳性 的克隆转化子，进行克隆PCR并鉴定，进一步再挑取鉴定为阳性的克隆 转化子，继续培养12-24h至平台期，即得到纯净的阳性表达PRRSV-GP5 蛋白的重组植物乳杆菌。
实施例3不同浓度诱导肽对重组植物乳杆菌PRRSV-GP5蛋白表达的影 响
在实施例2的基础上，本实施例进一步探究以终浓度10ng/mL，50 ng/mL，100ng/mL，200ng/mL诱导肽对所得表达PRRSV-GP5蛋白的重组 植物乳杆菌进行诱导后，重组植物乳杆菌PRRSV-GP5蛋白表达的变化。 以1％接种量接种实施例2中阳性表达PRRSV-GP5蛋白的重组植物乳杆菌 于红霉素抗性MRS液体培养基中，待其生长至OD值为0.3～0.5时，转移至 48孔板中，分设5组，每组5孔，每孔600μL菌液，以不加诱导剂的为阴 性对照组(图6中Neg标记组)，其它4组分别按照上述设定终浓度加入含 诱导剂SppIP的红霉素抗性MRS液体培养基，继续培养7～8h，获得诱导后 的重组植物乳杆菌。
参照实施例1中Western blot检测实验方法分析各组的蛋白表达量，结 果见图6，可见随着诱导肽浓度升高，GP5蛋白的表达量依次增大，呈现 出浓度依赖性，本实施例说明诱导后的重组植物乳杆菌能更好的表达GP5 蛋白。
实施例4诱导时间对重组植物乳杆菌PRRSV-GP5蛋白表达的影响
在实施例2的基础上，本实施例进一步探究以终浓度50ng/mL诱导肽 对所得表达PRRSV-GP5蛋白的重组植物乳杆菌进行不同时间诱导后，重 组植物乳杆菌PRRSV-GP5蛋白表达的变化。以1％接种量接种实施例2中 阳性表达PRRSV-GP5蛋白的重组植物乳杆菌于红霉素抗性MRS液体培养 基中，待其生长至OD值为0.3～0.5时，均匀分为15份，其中12份分别加入 至小培养皿中，分设为4组，每组3皿作为平行，另外3份作为阴性对照组 (图7中Neg标记组)直接分离提取蛋白，其它4组分别加入含50ng/mL诱 导剂SppIP的红霉素抗性MRS液体培养基，培养4h、5h、6h和7h后，获得 不同诱导时间的诱导重组植物乳杆菌。
参照实施例1中Western blot检测实验方法分析各组的蛋白表达量，结 果见图7，可见诱导时间越长，GP5蛋白的表达量依次增高，呈现出时间 依赖性，说明诱导时间长可提高的重组植物乳杆菌GP5蛋白的表达量。
实施例5诱导温度对诱导重组植物乳杆菌PRRSV-GP5蛋白表达的影响
在实施例2的基础上，本实施例进一步探究以终浓度50ng/mL诱导肽 在不同温度下对所重组植物乳杆菌PRRSV-GP5蛋白表达的变化。以1％接 种量接种实施例2中阳性表达PRRSV-GP5蛋白的重组植物乳杆菌于红霉 素抗性MRS液体培养基中，待其生长至OD值为0.3～0.5时，转移接种至标 记A、B的两个24孔板中，每孔1mL菌液，每板分设阴性对照组(图8中Neg标记组)和诱导组，每组3孔作为平行，A板为37℃实验组，B板为30℃ 实验组，阴性对照组以不含诱导剂SppIP的红霉素抗性MRS液体培养基培 养，诱导组以含50ng/mL诱导剂SppIP的红霉素抗性MRS液体培养基培 养，继续培养7～8h，获得不同工作温度诱导的诱导重组植物乳杆菌。
参照实施例1中Western blot检测实验方法分析各组的蛋白表达量，结 果见图8，可见以37℃和30℃进行诱导，对GP5蛋白的表达量无明显区别。
实施例6表达PRRSV-GP5蛋白的重组植物乳杆菌传代稳定性测试
取实施例2中所得的阳性的表达PRRSV-GP5蛋白的重组植物乳杆菌， 传代1-5次，提取分离各代重组植物乳杆菌进行GP5蛋白量测试，同时以 不重组的空白载体植物乳杆菌CGMCC 1.557为阴性对照组，各组设置3各 平行，结果见图9，发现本发明方法所制备的表达PRRSV-GP5蛋白的重组 植物乳杆菌传代稳定，各代次之间GP5蛋白表达量无显著差异，均高质量 的、稳定表达GP5蛋白。
实施例7体外检测表达PRRSV-GP5蛋白的重组植物乳杆菌的免疫原性
(1)研究阶段以抗血清检测抗原性
首先，制备抗血清：根据实施例1.1中设计的抗原分子O5序列合成抗 原多肽，并在抗原多肽C端加入半胱氨酸残基，得含巯基的肽。将2mg含 巯基的肽溶解到200μL偶联缓冲液中，200μL去离子水溶解2mg预激活的 载体蛋白KLH，上述两溶液混合后室温放置2h，将混合后的内容物溶解 到60mL脱气、去离子水中，排干柱子，用纯化缓冲液洗柱子至少4次， 得半抗原-载体混合物，将半抗原-载体混合物加到顶部，0.5mL纯化缓冲 液收集，得半抗原-载体，通过检测280nm吸光度检测到抗原多肽与载体 已偶联。
进一步进行兔体免疫：免疫前抽取1mL血液，制备前血清。将制备 的半抗原-载体与佐剂混合，首次免疫，以抗原量计200μg，将半抗原-载 体量溶于1mL生理盐水，皮下多点注射，背部皮内大约注射0.5mL，进行 肌肉注射0.3mL，颈部皮下注射0.2mL。七天后再次免疫，抗原量计100μg， 21天进行第三次免疫，第28天取血，制备抗血清，进行ELISA检测，第42天放血获得血清，其中首次免疫时采用的佐剂为弗氏完全佐剂，再次免 疫时采用的佐剂为弗氏不完全佐剂。
ELISA检测方法：2μg BSA偶联多肽4℃包被过夜，含有0.05％吐温20 的PBS洗板两次后脱脂乳室温封闭2h，将按照1:1000，1:5000，1:10000， 1:50000，1:100000稀释的抗血清加入相应孔，室温孵育2h，洗板四次， 加入检测抗体孵育1h，洗板后加入辣根过氧化物酶底物A液+B液，室温 避光观察颜色变化，一般20min加入磷酸盐终止液进行OD值测定，结果见图11，表明利用抗血清能够有效检测具有抗原性的靶向肽表位。
(2)参照实施例1中Western blot检测实验方法，使用抗多肽血清作 为一抗孵育，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体作为二抗，分析各组的 蛋白表达量，利用抗血清检测外源蛋白能够有效获得该蛋白条带，证明 表达抗原具有该位置的表位肽，表现出了抗原性(结果见图10)。
实施例8间接免疫荧光法检测抗原表面展示能力
采用间接免疫荧光法对细菌表面的抗原进行检测，间接免疫荧光法 实验方法如下：
参照实施例3，设置阴性对照组(图11中标记SppIP(-)组)，以MRS培 养基培养；实验组以含终浓度50ng/mL诱导肽的MRS培养基培养(图11 中标记SppIP(+)组)，，培养7h后，分别进行如下操作：加入PBS洗涤两次，8,000rpm/min离心2min，加入含有1％BSA配制的一抗孵育液进行室温孵 育，孵育时间为1h 15min。PBS洗3次后，加入1:200稀释的FITC标记的荧 光二抗，室温孵育1h。PBS洗4次后，进行制片观察。
制片方法：以乙醇清洗盖玻片并室温晾干，暗环境下加入3μL菌液 涂匀晾干，再加入5μL抗荧光猝灭剂(碧云天)，最后将盖玻片反扣于载 玻片上，滴加松柏油在高倍显微镜下仔细观察，结果见图11，发现利用 内源性信号肽1320能够有效将抗原展示在CGMCC1.557表面。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的 描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技 术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的 这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 吉林省凯博生物技术有限公司
<120> 一种表达PRRSV-GP5蛋白的重组乳杆菌及制备方法
<130> 201706
<160> 3
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<210> 1
<211> 507
<212> DNA
<213> O5
<400> 1
agtaacgata gtagtagtca tttacaatta atttataact tgacgttatg tgagttaaat 60
ggcactgatt ggttagctaa caagtttgat tgggcggtgg agagttttgt catttttccc 120
gttttgactc atattgtcag ttatggtgcc ttaactacga gtcatttctt agatactgtc 180
gctttagtca ctgtgagtac ggccggtttt gttcatggtc ggtatgtctt aagtagtatt 240
tatgcggtct gtgccttagc tgcgttgact tgtttcgtca ttcggtttgc gaagaattgt 300
atgagttggc gctatgcgtg tacgcggtat acgaactttt tattagatac taagggccgt 360
ttatatcggt ggcggagtcc agtcattatt gagaagcggg gcaaggttga ggtcgaaggt 420
catttaattg atttaaagcg ggttgtgtta gatggtagtg tggcgacgcc aattacgcgg 480
gtttcagcgg aacaatgggg tcggcca 507
<210> 2
<211> 810
<212> DNA
<213> SynF5-1320-O5-Mpep-HA
<400> 2
atggagattt tagccatgaa tttcaaaaca gctgcaaaag taaccgtcgt tgccggcgca 60
tccgtactat tcttagctgc ttgtggctca agcaagagtt cttcaagttc taagcaaacg 120
gccaattgga ccgaatcagc cgaattacca acgatggaca tttctaagtc caccgacgtg 180
gttagttcta atgcgttgaa taacaccaat gaagggttat accgtctcgg taagaacagt 240
aacgatagta gtagtcattt acaattaatt tataacttga cgttatgtga gttaaatggc 300
actgattggt tagctaacaa gtttgattgg gcggtggaga gttttgtcat ttttcccgtt 360
ttgactcata ttgtcagtta tggtgcctta actacgagtc atttcttaga tactgtcgct 420
ttagtcactg tgagtacggc cggttttgtt catggtcggt atgtcttaag tagtatttat 480
gcggtctgtg ccttagctgc gttgacttgt ttcgtcattc ggtttgcgaa gaattgtatg 540
agttggcgct atgcgtgtac gcggtatacg aactttttat tagatactaa gggccgttta 600
tatcggtggc ggagtccagt cattattgag aagcggggca aggttgaggt cgaaggtcat 660
ttaattgatt taaagcgggt tgtgttagat ggtagtgtgg cgacgccaat tacgcgggtt 720
tcagcggaac aatggggtcg gccaagtttt catcaattac cggcgcggag tccgttaccg 780
tatccatatg atgttccaga ttatgcttaa 810
<210> 3
<211> 810
<212> DNA
<213> SynF5-1320-O5-DCpep-HA
<400> 3
atggagattt tagccatgaa tttcaaaaca gctgcaaaag taaccgtcgt tgccggcgca 60
tccgtactat tcttagctgc ttgtggctca agcaagagtt cttcaagttc taagcaaacg 120
gccaattgga ccgaatcagc cgaattacca acgatggaca tttctaagtc caccgacgtg 180
gttagttcta atgcgttgaa taacaccaat gaagggttat accgtctcgg taagaacagt 240
aacgatagta gtagtcattt acaattaatt tataacttga cgttatgtga gttaaatggc 300
actgattggt tagctaacaa gtttgattgg gcggtggaga gttttgtcat ttttcccgtt 360
ttgactcata ttgtcagtta tggtgcctta actacgagtc atttcttaga tactgtcgct 420
ttagtcactg tgagtacggc cggttttgtt catggtcggt atgtcttaag tagtatttat 480
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tcagcggaac aatggggtcg gccattttat ccgagttatc atagtacgcc gcaacggccg 780
tatccatatg atgttccaga ttatgcttaa 810
Claims (10)
1.一种表达PRRSV-GP5蛋白的重组乳杆菌，其特征在于，所述重组乳杆菌中包含优化的PRRSV ORF5抗原基因序列，其序列为SEQ ID NO:1。
2.根据权利要求1所述的重组乳杆菌，其特征在于，所述重组乳杆菌中包含抗原分子片段，所述抗原分子片段的序列中包括依次连接的人工合成片段SynF5-信号肽编码序列-优化的PRRSV ORF5抗原基因-靶向肽编码序列-标签序列，所述人工合成片段SynF5序列为ATGGAGATTTTAGCC，所述信号肽为乳杆菌内源信号肽，氨基酸序列为MNFKTAAKVTVVAGASVLFLAACGSSKSSSSSKQTANWTESAELPTMDISKSTDVVSSNALNNTNEGLYRLGKN。
3.根据权利要求2所述的重组乳杆菌，其特征在于，所述乳杆菌为植物乳杆菌CGMCC1.557，所述靶向肽为Mpep或DCpep，所述标签为HA标签，所述抗原分子片段标记为SynF5-1320-O5-Mpep-HA或SynF5-1320-O5-DCpep-HA，SynF5-1320-O5-Mpep-HA序列为SEQID NO:2，SynF5-1320-O5-DCpep-HA序列为SEQ ID NO:3。
4.一种用于保护猪免遭PRRSV感染的疫苗，其特征在于，所述疫苗中包含权利要求1或2或3所述的重组乳杆菌。
5.一种表达PRRSV-GP5蛋白的重组乳杆菌制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤，
①抗原分子设计：
1.1选取PRRSV毒株的ORF 5基因中编码GP5蛋白第32～200位氨基酸的序列为野生型PRRSV ORF 5抗原基因；
1.2统计载体乳杆菌基因组中编码序列的高频密码子，根据密码子偏向性对野生型PRRSV ORF 5抗原基因序列进行修饰，得优化的PRRSV ORF5抗原基因序列，修饰原则是当存在前两个高频密码子序列频率相差小于2％，部分位点选用第二高频密码子序列，所述优化的PRRSV ORF5抗原基因序列为SEQ ID NO:1；
1.3筛选载体乳杆菌内源的信号肽，确定信号肽氨基酸序列及其编码序列；
1.4设计抗原分子，抗原分子片段中包含依次连接的人工合成片段SynF5-信号肽氨基酸编码序列-优化的PRRSV ORF5抗原基因序列，所述人工合成片段SynF5的序列为ATGGAGATTTTAGCC；
②基因扩增
以PRRSV毒株cDNA为模板，设计引物，PCR扩增获得抗原分子片段PCR产物；
③扩增产物添加HA标签
设计含有HA标签的引物，对抗原分子片段PCR产物进行PCR扩增，得到含有HA标签序列的基因产物；
④PCR产物回收和无缝克隆
回收含有HA标签序列的基因产物，同时借助酶切质粒切胶回收线性化质粒载体片段，进一步将含有HA标签序列的基因产物与线性化质粒载体片段进行片段连接，得无缝克隆得组装产物；
⑤电转化中间宿主乳酸乳球菌，并提取质粒；
⑥电转化终宿主乳杆菌，得表达PRRSV-GP5蛋白的重组乳杆菌。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述乳杆菌为植物乳杆菌CGMCC1.557，所述乳杆菌内源的信号肽氨基酸序列为MNFKTAAKVTVVAGASVLFLAACGSSKSSSSSKQTANWTESAELPTMDISKSTDVVSSNALNNTNEGLYRLGKN。
7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤②中PCR扩增的引物由上游引物TATTACAAGGAGATTTTAGCCATGAATTTCAAAACAGCTGC和下游引物TTAAGCATAATCTGGAACATCATATGGATATGGCCGACCCCATTG组成；所述含有HA标签的引物由上游引物TATTACAAGGAGATTTTAGCCATGAATTTCAAAACAGCTGC和下游引物GGGGTACCGAATTCCTCGAGTCTAGTTAAGCATAATCTGGAACATCAT组成。
8.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述酶切质粒为NcoI/XbaI酶切质粒pSIP411，所述中间宿主乳酸乳球菌为NZ3900菌株。
9.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述方法还包括免疫增强步骤，所述免疫增强步骤包括步骤1.4在设计抗原分子前，选择Mpep或DCpep两种靶向肽表位连接到GP5蛋白的C端，形成结构为SynF5-1320-O5-Mpep-HA或SynF5-1320-O5-DCpep-HA的抗原分子，所述SynF5-1320-O5-Mpep-HA序列为SEQ ID NO:2，SynF5-1320-O5-DCpep-HA序列为SEQID NO:3；和/或步骤⑦以含诱导剂SppIP的培养基诱导培养表达PRRSV-GP5蛋白的重组乳杆菌，得诱导后的重组植物乳杆菌。
10.一种含有保护猪免遭PRRSV感染抗血清，其特征在于，所述抗血清中含有抗PRRSV-GP5蛋白的抗体，所述抗血清制备方法包括以下步骤：
①根据抗原分子片段的序列合成抗原多肽，并在抗原多肽C端加入半胱氨酸残基，得含巯基的肽；将含巯基的肽与预激活的载体蛋白在偶联缓冲液中偶联，借助纯化柱制备半抗原-载体；所述抗原分子片段中包括依次连接的人工合成片段SynF5-信号肽编码序列-优化的野生型PRRSV ORF5抗原基因序列，优化的野生型PRRSV ORF5抗原基因序列为SEQ ID NO:1；
②动物免疫制备抗血清。
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