CN110959576A - 无指定病原体实验猪的培育方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种无指定病原体实验猪的培育方法及应用，涉及实验动物培育技术领域，本发明提供的无指定病原体实验猪的培育方法，包括使无病原妊娠母猪在无菌环境下自然分娩，将分娩得到的仔猪转移至屏障环境中饲养至多14日后断奶，得到无指定病原体实验猪；其中，所述饲养包括肠道益生、人工乳液喂养及固体饲料采食诱导。本发明提供的无指定病原体实验猪的培育方法既解决了普通法所获取实验猪质量低、时间长的难题，又将接生技术、获取成本控制在了较低的范围内，同时还能够保证培育得到高质量的无指定病原体实验猪。
Description
技术领域
本发明涉及实验动物培育技术领域，尤其是涉及一种无指定病原体实验猪的培育方法及应用。
背景技术
猪病种类繁多且各种疾病间容易相互影响，看似典型的发病或死亡往往是由多种菌毒混合感染或继发感染所致，这给猪病防控带来了巨大的压力。抗生素容易产生耐药性且对病毒病无任何作用，所以生物疫苗就成了解决这一难题的唯一途径。而在实验猪身上开展的动物实验是研发猪用疫苗最主要和最重要的环节，所以实验猪的质量高低就显得尤为重要。
现用实验猪的获取方法主要包括两个方面：一是从具有天然环境隔离优势的小散养殖户处筛选获得，这种方法成本低，但是质量不可控，获取满足实验要求的猪只需要花费大量的筛选时间，且当备选养殖场一旦接种相关疫苗，或因其他途径导致备选猪群相关被测疫病抗体出现阳性时，则必须寻找新的供猪源；二是培育或购置SPF实验猪，此方法虽然可获得高质量的实验猪，具有技术难度大、生产成本高的特点，其获取过程中不但需要经验丰富的母猪剖腹产接生人员，还需要专业的麻醉、接产等手术设备。同时，仔猪出生后既需要专用的隔离饲养的设备和设施，容易给研究者造成较大的经济压力，并且由于SPF实验猪对环境和养殖要求极高，所以在后续的实验中发病、死亡进而导致实验失败的风险也非常高。
因此，开发一种新的实验猪的获取方法尤为重要。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种无指定病原体实验猪的培育方法，以至少缓解现有技术中存在的技术问题之一。
本发明的第二个目的在于提供上述无指定病原体实验猪的培育方法在培育SPF猪中的应用。
本发明提供了一种无指定病原体实验猪的培育方法，包括：
使无指定病原妊娠母猪在屏障环境中经人为无菌操作干预下自然分娩，将分娩得到的仔猪经通体消毒后转移至与母猪分娩区完全独立的屏障环境中饲养至多14日后断奶，得到无指定病原体实验猪；
其中，所述饲养包括肠道益生、人工乳液喂养及固体饲料采食诱导。
进一步的，所述无指定病原妊娠母猪包括非洲猪瘟病毒核酸阴性、口蹄疫病毒核酸阴性、猪瘟病毒核酸阴性、猪圆环病毒2型核酸阴性、猪繁殖与呼吸综合征病毒核酸阴性、猪伪狂犬病毒核酸阴性和猪流行性腹泻病毒核酸阴性、猪传染性胃肠炎病毒核酸阴性、猪冠状病毒核酸阴性、猪肺炎支原体核酸阴性的妊娠母猪；
优选地，在生产前7-15天将所述无指定病原妊娠母猪置于具有屏障环境条件的待产区进行隔离饲养。
进一步的，所述屏障环境满足如下条件：温度20-28℃且最大日温差不大于4℃，相对湿度40-70％，换气次数不小于15次/h，与屏障环境外的最小静压差为10Pa，空气洁净度为7级，噪声为0-60分贝和照度为150-300勒克斯。
进一步的，所述肠道益生包括给所述仔猪喂食益生菌，优选喂食益生菌溶液；
优选地，所述益生菌包括干酪乳杆菌、植物乳杆菌或嗜酸乳杆菌中的一种或多种；
优选地，所述益生菌溶液包括干酪乳杆菌培养液、植物乳杆菌培养液或嗜酸乳杆菌培养液中的一种或多种；
优选地，干酪乳杆菌培养液、植物乳杆菌培养液或嗜酸乳杆菌培养液的OD值均独立地大于600；
优选地，益生菌溶液的饲喂量为人工乳液饲喂量的8-12％v/v；
优选地，干酪乳杆菌、植物乳杆菌和嗜酸乳杆菌的体积比为1:1-2:1-2；
优选地，在仔猪出生后第1-7日进行肠道益生。
进一步的，人工乳液为代乳粉的水溶液，优选为42-47℃的水，所述代乳粉与水的质量体积比优选为1:5-7；
优选地，所述人工乳液中粗蛋白的含量为23-24％w/w、粗脂肪的含量为5-5.5％w/w、钙的含量为1.1-1.5％w/w、磷的含量为0.8-1.0％w/w以及赖氨酸的含量为1.5-1.8％w/w；
优选地，所述代乳粉包括全脂牛奶粉、乳清蛋白、葡萄糖、鱼粉、氯化钠或磷酸钙中的一种或多种。
进一步的，所述人工乳液喂养包括：
仔猪出生后第1日，每1.8-2.2小时饲喂1次人工乳液，饲喂量优选为30-60ml/头；和/或，
仔猪出生后第2-3日，白天每1.8-2.2小时饲喂1次人工乳液，晚上每2.8-3.2小时饲喂1次人工乳液，饲喂量优选为50-100ml/头；和/或，
仔猪出生后第4-7日，白天每2.8-3.2小时饲喂1次人工乳液，晚上每3.8-4.2小时饲喂1次人工乳液，饲喂量优选为80-160ml/头；和/或，
仔猪出生后7日后至断奶前，白天每3.8-4.2小时饲喂1次人工乳液，晚上每5.8-6.2小时饲喂1次人工乳液，饲喂量优选为120-240ml/头。
进一步的，通过在人工乳液中添加开口料诱导固体饲料采食；
其中，代乳粉、开口料和水按质量：质量：体积的比为0-1:0.05-20:0-6。
进一步的，所述固体饲料采食诱导包括：
仔猪出生后第3日，代乳粉、开口料和水按质量：质量：体积的比为1:0.03-0.08:6；和/或，
仔猪出生后第4日，代乳粉、开口料和水按质量：质量：体积的比为1:0.09-0.12:6；和/或，
仔猪出生后第5日，代乳粉、开口料和水按质量：质量：体积的比为1:0.15-0.25:6；和/或，
仔猪出生后第6日，代乳粉、开口料和水按质量：质量：体积的比为1:0.35-0.45:6；和/或，
仔猪出生后第7日，代乳粉、开口料和水按质量：质量：体积的比为1:0.75-0.85:6；和/或，
仔猪出生后第8日，代乳粉、开口料和水按质量：质量：体积的比为1:1-3:6；和/或，
仔猪出生后第9日，代乳粉、开口料和水按质量：质量：体积的比为1:4-6:6；和/或，
仔猪出生后第10日，代乳粉、开口料和水按质量：质量：体积的比为0:1.5-2.5:1；和/或，
仔猪出生后第11日，代乳粉、开口料和水按质量：质量：体积的比为0:4-6:1；和/或，
仔猪出生后第12日，代乳粉、开口料和水按质量：质量：体积的比为0:8-12:1；和/或，
仔猪出生后第13日，代乳粉、开口料和水按质量：质量：体积的比为0:18-22:1；和/或，
仔猪出生后第14日，代乳粉、开口料和水按质量：质量：体积的比为0:1:0。
进一步的，所述培育方法还包括对仔猪进行病原核酸的检测，淘汰感染病原的仔猪，得到无指定病原体实验猪；
优选地，所述病原包括非洲猪瘟病毒、口蹄疫病毒、猪瘟病毒、猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪冠状病毒和猪肺炎支原体。
另外，本发明还提供了上述的无指定病原体实验猪的培育方法在培育无指定病原体实验猪中的应用。
本发明提供的无指定病原体实验猪的培育方法，该培育方法使无指定病原妊娠母猪在屏障环境中经人为无菌操作干预下自然分娩，保证了备用母猪可被重复使用，并且也不需要具备能够熟练运用母猪麻醉、剖腹接生等技术的接生人员和接生设施，极大的降低了技术难度，同时也能够有效节约成本。在本发明提供的培育方法中，仔猪出生后即转移至屏障环境中饲养，母仔分体饲养，避免了仔猪通过母乳获得母源抗体而造成实验猪获取失败的风险，又因其不受母猪免疫情况的影响，也降低了母猪的筛选难度，节约了大量的获取时间。此外，肠道益生能够有效建立仔猪肠道内有益菌群，便于人工乳液及固体饲料的营养吸收；人工乳液能够替代母乳，同时保证营养充足、均衡；合理的固体饲料采食诱导能够帮助仔猪在出生14日内即可断奶，提前断奶一方面降低了后续的人力投入，此外也降低了因实验人员与实验猪频繁接触而导致其被感染相关疾病的风险。
本发明提供的无指定病原体实验猪的培育方法既解决了普通法所获取实验猪质量低、时间长的难题，又将接生技术、获取成本控制在了较低的范围内，同时还能够保证培育得到高质量的无指定病原体实验猪。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
无指定病原体是指无非洲猪瘟病毒、口蹄疫病毒、猪瘟病毒、猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪冠状病毒、猪肺炎支原体等10种病原微生物。随着生命科学研究的飞速发展，为了便于进行国际交流，科学研究对实验动物质量的要求越来越高，但目前的SPF级动物的培育，或技术难度较大，或成本较高。基于此，根据本发明的一个方面，提供了一种无指定病原体实验猪的培育方法，包括：
使无指定病原妊娠母猪在屏障环境中经人为无菌操作干预下自然分娩，将分娩得到的仔猪经通体消毒后转移至与母猪分娩区完全独立的屏障环境中饲养至多14日后断奶，得到无指定病原体实验猪；其中，饲养包括肠道益生、人工乳液喂养及固体饲料采食诱导。
该培育方法提供无指定病原妊娠母猪在屏障环境中经人为无菌操作干预下自然分娩，保证了备用母猪可被重复使用，并且也不需要具备能够熟练运用母猪麻醉、剖腹接生等技术的接生人员和接生设施，极大的降低了技术难度，同时也能够有效节约成本。
在本发明提供的培育方法中，仔猪出生后经通体消毒后转移至与母猪分娩区完全独立的屏障环境中饲养，母仔分体饲养，避免了仔猪通过母乳获得母源抗体而造成实验猪获取失败的风险，又因其不受母猪免疫情况的影响，也降低了母猪的筛选难度，节约了大量的获取时间。
此外，肠道益生能够有效建立仔猪肠道内有益菌群，便于人工乳液及固体饲料的营养吸收；人工乳液能够替代母乳，同时保证营养充足、均衡；合理的固体饲料采食诱导能够帮助仔猪在出生14日内即可断奶，提前断奶一方面降低了后续的人力投入，此外也降低了实验人员与实验猪频繁接触而导致其被感染相关疾病的风险。
综上，本发明提供的无指定病原体实验猪的培育方法，既解决了普通法所获取实验猪质量低、时间长的难题，又将接生技术、获取成本控制在了较低的范围内，同时还能够保证培育得到高质量的实验猪。
需要说明的是，本发明中妊娠母猪，优选采用经B超仪现场确认怀孕状态良好且经产妊娠母猪；
无指定病原，指的是妊娠母猪不携带非洲猪瘟病毒、口蹄疫病毒、猪瘟病毒、猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪冠状病毒、猪肺炎支原体等10种病原微生物；
无菌操作，指的是妊娠母猪的产道、接生区域及可能用到的器械均经消毒和/或灭菌处理。并且，在母猪分娩时，需将已进入产道的仔猪人工取出，避免仔猪落地受到不必要的污染。此外，需要保证转移的环境同样无菌，优选将生产得到的仔猪完成通体消毒后放28℃恒温IVC无菌转运箱进行转移。
为保证生产得到的仔猪不携带主要潜在感染或条件致病和对科学实验干扰大的病原，需保证供体母猪不患有相关疾病或携带相关病原，避免垂直传播。因此优选筛选所述无指定病原妊娠母猪包括非洲猪瘟病毒核酸阴性、口蹄疫病毒核酸阴性、猪瘟病毒核酸阴性、猪圆环病毒2型核酸阴性、猪繁殖与呼吸综合征病毒核酸阴性、猪伪狂犬病毒核酸阴性和猪流行性腹泻病毒核酸阴性、猪传染性胃肠炎病毒核酸阴性、猪冠状病毒核酸阴性、猪肺炎支原体核酸阴性的妊娠母猪。
筛选后的妊娠母猪应尽量减少其与病原接触，优选在生产前7-15天将所述无病原妊娠母猪置于满足屏障环境条件的待产区进行隔离。例如可以为，但不限于在生产前7天进行隔离、在生产前8天进行隔离、在生产前10天进行隔离、在生产前12天进行隔离或在生产前15天进行隔离。
在一些优选的实施方式中，所述屏障环境满足如下条件：温度24-30℃，例如可以为，但不限于24℃、26℃、28℃或30℃，且最大日温差不大于4℃，例如可以为，但不限于4℃、3℃、2℃、1℃或0℃；相对湿度40-70％，例如可以为，但不限于40％、50％、60％或70％；换气次数不小于15次/h；与屏障环境外的最小静压差为10Pa；空气洁净度为7级；噪声小于60分贝，照度为150-300勒克斯。
为了帮助仔猪建立肠道益生菌群，优选给所述仔猪喂食益生菌，所述益生菌包括干酪乳杆菌、植物乳杆菌或嗜酸乳杆菌中的一种或多种；例如可以单独喂食干酪乳杆菌或者植物乳杆菌或者嗜酸乳杆菌，或者喂食上述中任意二者的组合，或者喂食上述三者的组合。
为了更便于仔猪进食，优选地，喂食仔猪益生菌溶液，所述益生菌溶液包括干酪乳杆菌培养液、植物乳杆菌培养液或嗜酸乳杆菌培养液中的一种或多种，例如可以单独喂食干酪乳杆菌培养液或者植物乳杆菌培养液或者嗜酸乳杆菌培养液，或者喂食上述中任意二者的组合，或者喂食上述三者的组合。
优选地，干酪乳杆菌培养液、植物乳杆菌培养液或嗜酸乳杆菌培养液的OD值均独立地大于600。OD值大于600能够保证益生菌的浓度，使仔猪摄入的益生菌能够有效地在肠道中建立菌群。
优选地，益生菌溶液的饲喂量为人工乳液饲喂量的8-12％v/v，例如可以为，但不限于8％v/v、9％v/v、10％v/v、11％v/v或12％v/v。
优选地，干酪乳杆菌、植物乳杆菌和嗜酸乳杆菌的体积比为1:1-2:1-2，例如可以为，但不限于1:1:2、1:2:1、1:2:2、1:1:1，优选为1:1:1。
优选地，在仔猪出生后第1-7日进行肠道益生，例如可以为，但不限于在仔猪出生后第1日、第2日、第3日、第4日、第5日、第6日或第7日进行肠道益生，仔猪出生后即进行肠道益生，能够帮助仔猪快速建立肠道益生菌群，增加营养吸收，降低腹泻发生。
在一些优选的实施方式中，人工乳液为代乳粉的水溶液，优选为42-47℃的水，例如可以为，但不限于42℃、43℃、44℃、45℃、46℃或47℃，上述水温更适合仔猪肠胃，能够避免应激。所述代乳粉与水的质量体积比优选为1:5-7，例如可以为，但不限于1:5、1:6或1:7。
对人工乳液中的具体成分不做限定，只要满足营养需求即可，在一些优选的实施方式中，所述人工乳液中粗蛋白的含量为23-24％w/w、粗脂肪的含量为5-5.5％w/w、钙的含量为1.1-1.5％w/w、磷的含量为0.8-1.0％w/w以及赖氨酸的含量为1.5-1.8％w/w；
优选地，所述代乳粉包括全脂牛奶粉、乳清蛋白、葡萄糖、鱼粉、氯化钠或磷酸钙中的一种或多种。上述各组分可以择一加入也可以组合加入，只要满足上述营养含量即可。优选组合加入。
在一些优选的实施方式中，所述人工乳液喂养包括：
仔猪出生后第1日，每1.8-2.2小时饲喂1次人工乳液，饲喂量优选为30-60ml/头；和/或，
仔猪出生后第2-3日，白天每1.8-2.2小时饲喂1次人工乳液，晚上每2.8-3.2小时饲喂1次人工乳液，饲喂量优选为50-100ml/头；和/或，
仔猪出生后第4-7日，白天每2.8-3.2小时饲喂1次人工乳液，晚上每3.8-4.2小时饲喂1次人工乳液，饲喂量优选为80-160ml/头；和/或，
仔猪出生后7日后至断奶前，白天每3.8-4.2小时饲喂1次人工乳液，晚上每5.8-6.2小时饲喂1次人工乳液，饲喂量优选为120-240ml/头。
其中，可选择其中某个阶段或某些阶段，或者全部阶段按照上述方式进行饲喂。优选全部阶段均按照上述方式进行饲喂。其中，饲喂量可根据仔猪的采食量进行调整，只要能保证基本营养需求即可。
需要说明的是，本实施方式中，“白天”指的是8:00-20:00，“晚上”指的是20:00-次日的8:00。
哺乳工具通常为带有人工奶头的塑料或玻璃奶瓶，或其他可以使仔猪正常采食的工具，如注射器、市售成品哺乳机等。
在一些优选的实施方式中，通过在人工乳液中添加开口料诱导固体饲料采食。对开口料的种类不做限定，本领域常规仔猪适用开口料均可，优选使用由天康生物股份有限公司生产的5500型乳猪开口料。
其中，代乳粉、开口料和水按质量：质量：体积的比为0-1:0.05-20:0-6。
在一些优选的实施方式中，所述固体饲料采食诱导包括：
仔猪出生后第3日，代乳粉、开口料和水按质量：质量：体积的比为1:0.03-0.08:6；和/或，
仔猪出生后第4日，代乳粉、开口料和水按质量：质量：体积的比为1:0.09-0.12:6；和/或，
仔猪出生后第5日，代乳粉、开口料和水按质量：质量：体积的比为1:0.15-0.25:6；和/或，
仔猪出生后第6日，代乳粉、开口料和水按质量：质量：体积的比为1:0.35-0.45:6；和/或，
仔猪出生后第7日，代乳粉、开口料和水按质量：质量：体积的比为1:0.75-0.85:6；和/或，
仔猪出生后第8日，代乳粉、开口料和水按质量：质量：体积的比为1:1-3:6；和/或，
仔猪出生后第9日，代乳粉、开口料和水按质量：质量：体积的比为1:4-6:6；和/或，
仔猪出生后第10日，代乳粉、开口料和水按质量：质量：体积的比为0:1.5-2.5:1；和/或，
仔猪出生后第11日，代乳粉、开口料和水按质量：质量：体积的比为0:4-6:1；和/或，
仔猪出生后第12日，代乳粉、开口料和水按质量：质量：体积的比为0:8-12:1；和/或，
仔猪出生后第13日，代乳粉、开口料和水按质量：质量：体积的比为0:18-22:1；和/或，
仔猪出生后第14日，代乳粉、开口料和水按质量：质量：体积的比为0:1:0。
其中，可选择其中某个阶段或某些阶段，或者全部阶段按照上述方式诱导固体饲料采食。优选全部阶段均按照上述方式诱导固体饲料采食。逐渐增加开口料在日粮中的比重，能够有效诱导仔猪采食固体饲料。
在一些优选的实施方式中，所述培育方法还包括对仔猪进行病原核酸的检测，淘汰感染病原的仔猪。
需要说明的是，在本实施方式中，可选择任一时间点或多个时间点对仔猪进行病原核酸的检测，例如可以在仔猪初生时进行检测、在仔猪出生后第3日进行检测、在仔猪出生后第5日进行检测、在仔猪出生后第7日进行检测、在仔猪出生后第10日进行检测、在仔猪出生后第12日进行检测或在仔猪出生后第14日进行检测，优选在仔猪初生时、出生后第7日和出生后第14日均进行检测。具体地，在仔猪初生时，脐带未脱离母体的状态下快速采集脐带血并送检，出生后第7日和出生后第14日采集静脉血及肛拭子进行检测。
在培育无指定病原体实验猪的过程中，需要对仔猪进行全程监测：仔猪从采集脐带血开始，每隔7日采集静脉血及肛拭子进行相关疾病的核酸、抗体监测，对检测不合格的实验猪依检测情况及时淘汰，以保证培育得到的实验猪的质量。
下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
实施例1
本实施例提供了一种无指定病原体实验猪的培育方法，包括：
a)、妊娠母猪筛选：通过现场B超确认并结合实验室检测技术，筛选非洲猪瘟病毒、口蹄疫病毒、猪瘟病毒、猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪冠状病毒和猪肺炎支原体核酸阴性，且经B超仪现场确认怀孕状态良好的经产妊娠母猪为备用母猪。
b)、备用围产期母猪提前10天进入满足屏障环境条件的待产区进行隔离净化。
c)、仔猪不落地接生及脐血检测：母猪临产前做好产道、接生区域及设施设备的消毒灭菌工作，将已进入产道的仔猪人工取出，在仔猪脐带未脱离母体的状态下快速采集脐带血并送检，接生仔猪迅速进入通体消毒程序。
d)、仔猪无菌转移：实验仔猪完成通体消毒后放28℃恒温IVC无菌转运箱，并迅速转移至温度30℃且最大日温差小于4℃、相对湿度55％、换气次数20次/h、与相同房间最小静压差10Pa、空气洁净度7级、噪声小于60分贝、工作照度200勒克斯的屏障环境进行饲养。
e)、肠道益生：实验仔猪出生后及断奶前全程采食液体人工代乳粉。出生后1-7日，每顿所采食的乳粉中均按10％的比例加入配方益生菌溶液，益生菌溶液由OD值均大于600的干酪乳杆菌新鲜培养液、植物乳杆菌新鲜培养液、嗜酸乳杆菌新鲜培养液按1﹕1﹕1的比例混合而成。
f)、人工喂养：用45℃的温开水按代乳粉：温开水以质量体积比1：6的比例配置成人工乳液。出生后第1日每2小时饲喂1次，每次30-60ml/头；第2至3日白天每2小时饲喂1次，晚上每3小时饲喂1次，每次50-100ml/头；第4至7日白天每3小时饲喂1次，晚上每4小时饲喂1次，每次80-160ml/头；第7日后直至断奶，白天4小时饲喂1次，晚上每6小时饲喂1次，每次120-240ml/头；人工乳液中粗蛋白含量占比23-24％、粗脂肪含量为5-5.5％、钙含量大于等于1.1％、磷含量大于等于0.8％、赖氨酸含量大于等于1.5％。
g)、超前断奶：在人工喂养过程中，出生后第3日，代乳粉﹕开口料﹕温开水按质量﹕质量﹕体积比为1﹕0.05﹕6的比例在人工乳液中添加由天康生物股份有限公司生产的5500型乳猪开口料；第4日将比例调整至1﹕0.1﹕6；第5日调整至1﹕0.2﹕6；第6日调整至1﹕0.4﹕6；第7日调整至1﹕0.8﹕6；第8日调整至1﹕2﹕6；第9日调整至1﹕5﹕6；第10日调整至0﹕2﹕1；第11日调整至0﹕5﹕1；第12日调整至0﹕10﹕1；第13日调整至0﹕20﹕1；第14日调整至0﹕1﹕0，进行固体饲料诱导采食，出生后14日龄时完成断奶。
h)、全程监测：实验仔猪从采集脐带血开始，每隔7日采集静脉血及肛拭子进行相关疾病的核酸、抗体监测，对检测不合格的实验猪依检测情况及时淘汰。
实施例2
本实施例提供了一种无指定病原体实验猪的培育方法，包括：
a)、妊娠母猪筛选：通过现场B超确认并结合实验室检测技术，筛选非洲猪瘟病毒、口蹄疫病毒、猪瘟病毒、猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪冠状病毒和猪肺炎支原体核酸阴性，且经B超仪现场确认怀孕状态良好的经产妊娠母猪为备用母猪。
b)、备用围产期母猪提前7天进入满足屏障环境条件的待产区进行隔离净化。
c)、仔猪不落地接生及脐血检测：母猪临产前做好产道、接生区域及设施设备的消毒灭菌工作，将已进入产道的仔猪人工取出，在仔猪脐带未脱离母体的状态下快速采集脐带血并送检，接生仔猪迅速进入通体消毒程序。
d)、仔猪无菌转移：实验仔猪完成通体消毒后放28℃恒温IVC转运箱，并迅速转移至温度24℃且最大日温差小于4℃、相对湿度40％、换气次数18次/h、与相同房间最小静压差10Pa、空气洁净度7级、噪声小于60分贝、工作照度150勒克斯的屏障环境进行饲养。
e)、肠道益生：实验仔猪出生后及断奶前全程采食液体人工代乳粉。出生后1-7日，每顿所采食的乳粉中均按12％的比例加入配方益生菌溶液，益生菌溶液由OD值均大于600的干酪乳杆菌新鲜培养液、植物乳杆菌新鲜培养液、嗜酸乳杆菌新鲜培养液按1﹕2﹕2的比例混合而成。
f)、人工喂养：用42℃的温开水按代乳粉：温开水以质量体积比1：7的比例配置成人工乳液。出生后第1日每1.8小时饲喂1次，每次30-60ml/头；第2至3日白天每1.8小时饲喂1次，晚上每2.8小时饲喂1次，每次50-100ml/头；第4至7日白天每2.8小时饲喂1次，晚上每3.8小时饲喂1次，每次80-160ml/头；第7日后直至断奶，白天3.8小时饲喂1次，晚上每5.8小时饲喂1次，每次120-240ml/头；人工乳液中粗蛋白含量占比23-24％、粗脂肪含量为5-5.5％、钙含量大于等于1.1％、磷含量大于等于0.8％、赖氨酸含量大于等于1.5％。
g)、超前断奶：在人工喂养过程中，出生后第3日，代乳粉﹕开口料﹕温开水按质量﹕质量﹕体积比为1﹕0.03﹕6的比例在人工乳液中添加由天康生物股份有限公司生产的5500型乳猪开口料；第4日将比例调整至1﹕0.09﹕6；第5日调整至1﹕0.15﹕6；第6日调整至1﹕0.35﹕6；第7日调整至1﹕0.75﹕6；第8日调整至1﹕1﹕6；第9日调整至1﹕4﹕6；第10日调整至0﹕1.5﹕1；第11日调整至0﹕4﹕1；第12日调整至0﹕8﹕1；第13日调整至0﹕18﹕1；第14日调整至0﹕1﹕0，进行固体饲料诱导采食，出生后14日龄时完成断奶。
h)、全程监测：实验仔猪从采集脐带血开始，每隔7日采集静脉血及肛拭子进行相关疾病的核酸、抗体监测，对检测不合格的实验猪依检测情况及时淘汰。
实施例3
本实施例提供了一种无指定病原体实验猪的培育方法，包括：
a)、妊娠母猪筛选：通过现场B超确认并结合实验室检测技术，筛选非洲猪瘟病毒、口蹄疫病毒、猪瘟病毒、猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪冠状病毒和猪肺炎支原体核酸阴性，且经B超仪现场确认怀孕状态良好的经产妊娠母猪为备用母猪。
b)、备用围产期母猪提前15天进入环境可控的洁净待产区进行隔离净化。
c)、仔猪不落地接生及脐血检测：母猪临产前做好产道、接生区域及设施设备的消毒灭菌工作，将已进入产道的仔猪人工取出，在仔猪脐带未脱离母体的状态下快速采集脐带血并送检，接生仔猪迅速进入通体消毒程序。
d)、仔猪无菌转移：实验仔猪完成通体消毒后放28℃恒温IVC无菌转运箱，并迅速转移至温度26℃且最大日温差小于4℃、相对湿度70％、换气次数16次/h、与相同房间最小静压差10Pa、空气洁净度7级、噪声小于60分贝、工作照度300勒克斯的屏障环境进行饲养。
e)、肠道益生：实验仔猪出生后及断奶前全程采食液体人工代乳粉。出生后1-7日，每顿所采食的乳粉中均按8％的比例加入配方益生菌溶液，益生菌溶液由OD值均大于600的干酪乳杆菌新鲜培养液、植物乳杆菌新鲜培养液、嗜酸乳杆菌新鲜培养液按1﹕2﹕1的比例混合而成。
f)、人工喂养：用47℃的温开水按代乳粉：温开水以质量体积比1：5的比例配置成人工乳液。出生后第1日每2.2小时饲喂1次，每次30-60ml/头；第2至3日白天每2.2小时饲喂1次，晚上每3.2小时饲喂1次，每次50-100ml/头；第4至7日白天每3.2小时饲喂1次，晚上每4.2小时饲喂1次，每次80-160ml/头；第7日后直至断奶，白天4.2小时饲喂1次，晚上每6.2小时饲喂1次，每次120-240ml/头；人工乳液中粗蛋白含量占比23-24％、粗脂肪含量为5-5.5％、钙含量大于等于1.1％、磷含量大于等于0.8％、赖氨酸含量大于等于1.5％。
g)、超前断奶：在人工喂养过程中，出生后第3日，代乳粉﹕开口料﹕温开水按质量﹕质量﹕体积比为1﹕0.08﹕6的比例在人工乳液中添加由天康生物股份有限公司生产的5500型乳猪开口料；第4日将比例调整至1﹕0.12﹕6；第5日调整至1﹕0.25﹕6；第6日调整至1﹕0.45﹕6；第7日调整至1﹕0.85﹕6；第8日调整至1﹕3﹕6；第9日调整至1﹕6﹕6；第10日调整至0﹕2.5﹕1；第11日调整至0﹕6﹕1；第12日调整至0﹕12﹕1；第13日调整至0﹕22﹕1；第14日调整至0﹕1﹕0，进行固体饲料诱导采食，出生后14日龄时完成断奶。
h)、全程监测：实验仔猪从采集脐带血开始，每隔7日采集静脉血及肛拭子进行相关疾病的核酸、抗体监测，对检测不合格的实验猪依检测情况及时淘汰。
对比例1
本对比例与实施例1的不同之处在于，采用剖腹产的方式将仔猪取出。
对比例2
本对比例与实施例1的不同之处在于，饲养不包括肠道益生。
对比例3
本对比例与实施例1的不同之处在于，所产仔猪由母猪喂养，全程采食母乳。
实验例1
将实施例1-3及对比例1-3得到的无指定病原体实验猪在出生后14日时进行成活率及平均增重统计。统计结果见表1和表2：
表1试验猪日增重统计
| 组别 | 平均初生重(kg) | 14日龄平均体重(kg) | 日增重(g) |
| 实施例1 | 1.58 | 3.37 | 128 |
| 实施例2 | 1.52 | 3.49 | 140 |
| 实施例3 | 1.66 | 3.69 | 145 |
| 对比例1 | 1.48 | 3.57 | 149 |
| 对比例2 | 1.63 | 2.92 | 92 |
| 对比例3 | 1.56 | 3.48 | 137 |
表2试验猪成活率统计结果
| 组别 | 产活仔数(头) | 14日龄活仔数(头) | 14日龄成活率 |
| 实施例1 | 12 | 12 | 100％ |
| 实施例2 | 10 | 10 | 100％ |
| 实施例3 | 13 | 13 | 100％ |
| 对比例1 | 11 | 11 | 100％ |
| 对比例2 | 9 | 3 | 33.3％ |
| 对比例3 | 13 | 12 | 92.3％ |
由以上结果可见，在出生后14日时实施例1-3组仔猪与对比例1和3组仔猪增重无明显差异。因对比例3组仔猪被母猪压死一头，使得其成活率低于试验组，而人工喂养可以从根本上杜绝因母猪母性差或误伤而造成仔猪被咬死、压死的现象发生。此外，对比例2中因未进行肠道益生，造成仔猪营养吸收能力较差，因此增重较低；且在生长过程中发生严重腹泻，导致死亡严重。
实验例2
将实施例1-3及对比例1-3得到的仔猪在出生当日采集脐带血，出生后第7日以及出生后第14日分别采集前腔静脉血进行猪圆环病毒2型核酸和抗体检测，结果统计如下：
表3试验仔猪猪圆环病毒2型核酸及抗体检测阳性率统计结果
由以上结果可见，实施例1-3组仔猪在出生后14日之前均未检测到猪圆环病毒2型核酸及抗体，说明本发明提供的培育方法可以从根本上杜绝仔猪经由母乳被感染病毒或获取母源抗体的风险。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (10)
1.一种无指定病原体实验猪的培育方法，其特征在于，包括：
使无指定病原妊娠母猪在屏障环境中经人为无菌操作干预下自然分娩，将分娩得到的仔猪经通体消毒后转移至与母猪分娩区完全独立的屏障环境中饲养至多14日后断奶，得到无指定病原体实验猪；
其中，所述饲养包括肠道益生、人工乳液喂养及固体饲料采食诱导。
2.根据权利要求1所述的培育方法，其特征在于，所述无指定病原妊娠母猪包括非洲猪瘟病毒核酸阴性、口蹄疫病毒核酸阴性、猪瘟病毒核酸阴性、猪圆环病毒2型核酸阴性、猪繁殖与呼吸综合征病毒核酸阴性、猪伪狂犬病毒核酸阴性和猪流行性腹泻病毒核酸阴性、猪传染性胃肠炎病毒核酸阴性、猪冠状病毒核酸阴性、猪肺炎支原体核酸阴性的妊娠母猪；
优选地，在生产前7-15天将所述无指定病原妊娠母猪置于具有屏障环境条件的待产区进行隔离饲养。
3.根据权利要求1所述的培育方法，其特征在于，所述屏障环境满足如下条件：温度24-30℃且最大日温差不大于4℃，相对湿度40-70％，换气次数不小于15次/h，与屏障环境外的最小静压差为10Pa，空气洁净度为7级，噪声为0-60分贝和照度为150-300勒克斯。
4.根据权利要求1所述的培育方法，其特征在于，所述肠道益生包括给所述仔猪喂食益生菌，优选喂食益生菌溶液；
优选地，所述益生菌包括干酪乳杆菌、植物乳杆菌或嗜酸乳杆菌中的一种或多种；
优选地，所述益生菌溶液包括干酪乳杆菌培养液、植物乳杆菌培养液或嗜酸乳杆菌培养液中的一种或多种；
优选地，干酪乳杆菌培养液、植物乳杆菌培养液或嗜酸乳杆菌培养液的OD值均独立地大于600；
优选地，益生菌溶液的饲喂量为人工乳液饲喂量的8-12％v/v；
优选地，干酪乳杆菌、植物乳杆菌和嗜酸乳杆菌的体积比为1:1-2:1-2；
优选地，在仔猪出生后第1-7日进行肠道益生。
5.根据权利要求1所述的培育方法，其特征在于，人工乳液为代乳粉的水溶液，优选为42-47℃的水，所述代乳粉与水的质量体积比优选为1:5-7；
优选地，所述人工乳液中粗蛋白的含量为23-24％w/w、粗脂肪的含量为5-5.5％w/w、钙的含量为1.1-1.5％w/w、磷的含量为0.8-1.0％w/w以及赖氨酸的含量为1.5-1.8％w/w；
优选地，所述代乳粉包括全脂牛奶粉、乳清蛋白、葡萄糖、鱼粉、氯化钠或磷酸钙中的一种或多种。
6.根据权利要求1所述的培育方法，其特征在于，所述人工乳液喂养包括：
仔猪出生后第1日，每1.8-2.2小时饲喂1次人工乳液，饲喂量优选为30-60ml/头；和/或，
仔猪出生后第2-3日，白天每1.8-2.2小时饲喂1次人工乳液，晚上每2.8-3.2小时饲喂1次人工乳液，饲喂量优选为50-100ml/头；和/或，
仔猪出生后第4-7日，白天每2.8-3.2小时饲喂1次人工乳液，晚上每3.8-4.2小时饲喂1次人工乳液，饲喂量优选为80-160ml/头；和/或，
仔猪出生后7日后至断奶前，白天每3.8-4.2小时饲喂1次人工乳液，晚上每5.8-6.2小时饲喂1次人工乳液，饲喂量优选为120-240ml/头。
7.根据权利要求1所述的培育方法，其特征在于，通过在人工乳液中添加开口料诱导固体饲料采食；
其中，代乳粉、开口料和水按质量：质量：体积的比为0-1:0.05-20:0-6。
8.根据权利要求7所述的培育方法，其特征在于，所述固体饲料采食诱导包括：
仔猪出生后第3日，代乳粉、开口料和水按质量：质量：体积的比为1:0.03-0.08:6；和/或，
仔猪出生后第4日，代乳粉、开口料和水按质量：质量：体积的比为1:0.09-0.12:6；和/或，
仔猪出生后第5日，代乳粉、开口料和水按质量：质量：体积的比为1:0.15-0.25:6；和/或，
仔猪出生后第6日，代乳粉、开口料和水按质量：质量：体积的比为1:0.35-0.45:6；和/或，
仔猪出生后第7日，代乳粉、开口料和水按质量：质量：体积的比为1:0.75-0.85:6；和/或，
仔猪出生后第8日，代乳粉、开口料和水按质量：质量：体积的比为1:1-3:6；和/或，
仔猪出生后第9日，代乳粉、开口料和水按质量：质量：体积的比为1:4-6:6；和/或，
仔猪出生后第10日，代乳粉、开口料和水按质量：质量：体积的比为0:1.5-2.5:1；和/或，
仔猪出生后第11日，代乳粉、开口料和水按质量：质量：体积的比为0:4-6:1；和/或，
仔猪出生后第12日，代乳粉、开口料和水按质量：质量：体积的比为0:8-12:1；和/或，
仔猪出生后第13日，代乳粉、开口料和水按质量：质量：体积的比为0:18-22:1；和/或，
仔猪出生后第14日，代乳粉、开口料和水按质量：质量：体积的比为0:1:0。
9.根据权利要求1-8任一项所述的培育方法，其特征在于，所述培育方法还包括对仔猪进行病原核酸的检测，淘汰感染病原的仔猪，得到无指定病原体实验猪；
优选地，所述病原包括非洲猪瘟病毒、口蹄疫病毒、猪瘟病毒、猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪冠状病毒和猪肺炎支原体。
10.如权利要求1-9任一项所述的无指定病原体实验猪的培育方法在培育无指定病原体实验猪中的应用。
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