JP3372952B2

JP3372952B2 - 家禽マイコプラズマ抗原、その遺伝子、その遺伝子を含む組み換えベクター、およびそれを利用したワクチン

Info

Publication number: JP3372952B2
Application number: JP50039694A
Authority: JP
Inventors: 修治斉藤; 節子大川; 歩藤沢; 好一入谷; 茂美青山
Original assignee: Zeon Corp
Current assignee: Zeon Corp
Priority date: 1992-05-29
Filing date: 1993-05-28
Publication date: 2003-02-04
Anticipated expiration: 2018-02-04
Also published as: EP0603406A4; KR100262208B1; EP0603406A1; WO1993024646A1; US5489430A; CA2113562A1; EP0603406B1; AU657859B2; CA2113562C; DE69330778T2; DE69330778D1; AU4090393A

Description

【発明の詳細な説明】

技術分野本発明は家禽に感染するマイコプラズマ・ガリセプテ
ィカムの抗原タンパク質、その遺伝子を組み込んだ組み
換えベクター、そのベクターによって形質転換された宿
主、および前記抗原タンパク質を利用する家禽用マイコ
プラズマ・ガリセプティカム感染症のワクチンに関す
る。背景技術世界で最も重要な鶏等家禽の感染症の一つであるマイ
コプラズマ・ガリセプティカム（Mycoplasmagallisepti
cum）感染症は、鶏に於いては気嚢炎を伴う慢性の呼吸
器障害を特徴とする疾病である。病原菌である、マイコ
プラズマ・ガリセプティカムに感染すると産卵率ならび
に感染鶏による産出卵の孵化率が著しく低下し、その結
果、鶏卵の出荷および産卵鶏が減少するという相当な経
済的損失をもたらす。また、マイコプラズマ・ガリセプ
ティカムの感染は免疫の低下を誘発し、他の感染症に感
染し易くなり重篤な感染症を併発する。さらに、マイコ
プラズマ・ガリセプティカムは七面鳥における伝染性副
鼻腔炎の病原菌であることが知られている。我々は既に、抗マイコプラズマ・ガリセプティカム家
禽血清と抗原抗体反応を呈するタンパク質を見出してい
る（特開平２−111795号公報）。これらのタンパク質
は、抗マイコプラズマ・ガリセプティカム感染症ワクチ
ンとして有用であると期待されるが、より強力なワクチ
ンを作製するために、より高い活性を有するタンパク質
が求められていた。発明の開示本発明者らは、有効性の高い抗マイコプラズマ・ガリ
セプティカム感染症ワクチンを得るべく鋭意研究した結
果、前記特開平２−111795号で開示されたタンパク質の
中でTMG−１を選択し、このタンパク質に約１キロダル
トンのタンパク質が付加するとマイコプラズマ・ガリセ
プティカムの抗原性が顕著に向上し、それを抗原として
誘導される抗血清がマイコプラズマ・ガリセプティカム
の生育を抑制すること、さらに上記タンパク質がマイコ
プラズマ・ガリセプティカムの感染を防御する家禽用ワ
クチンとして期待しうるものであること、かつ家禽用マ
イコプラズマ・ガリセプティカム感染症診断薬として有
用であることを見い出し、本発明を完成するに至った。図面の簡単な説明第１図は本発明において組み換え用に使用しうる−DN
A断片の制限酵素切断点地図を示す。第２図はTTM−1DNAのM13ファージへのクローニング手
順を示す模式図である。第３図は人工合成オリゴヌクレオチドをプライマーと
して使用して作製した位置特異的変異株の作製手順を示
す模式図である。第４図はTTM−１′がコードするタンパク質TTMG−１
を発現するプラスミドpMTTMIEの作製手順を示す模式図
である。発明を実施するための最良の形態かくして本発明によれば第１の側面として、抗マイコ
プラズマ・ガリセプティカム家禽血清と抗原反応を呈
し、第１図に示す制限酵素切断点地図を有するDNA配列
がコードする分子量約40キロダルトン（以下、Kdと略
す）のタンパク質が提供される。その第２の側面とし
て、そのアミノ酸配列をコードするDNA配列が提供され
る。その第３の側面として、そのDNAを含んだ組み換え
ベクターおよびそのベクターにより形質転換または形質
導入された宿主が提供される。第４の側面として、上記
タンパク質を有効成分とする家禽用マイコプラズマ・ガ
リセプティカム感染症ワクチンが提供される。すなわち、本発明の第１の側面であるタンパク質は、
マイコプラズマ・ガリセプティカム免疫血清またはマイ
コプラズマ・ガリセプティカム感染血清と抗原抗体反応
を呈し、マイコプラズマ・ガリセプティカムに由来する
第１図の制限酵素切断点地図を有するDNA配列がコード
する分子量約40Kdのタンパク質で、その具体例として
は、配列番号１に示すごときアミノ酸配列をもつタンパ
ク質や、そのアミノ酸配列をＣ末端とし、そのＮ末端側
にβ−ガラクトシダーゼ、β−ラクタマーゼなどの細菌
由来の酵素タンパク質を有する融合タンパク質などが例
示される。このタンパク質は、本発明の第３の側面である組み換
えベクターにより形質転換または形質導入された宿主を
用いることによって得ることができる。上記組み換えベ
クターは、本発明の第２の側面であるDNA断片を常法に
従って発現用ベクターに組み込むことによって得られ
る。 DNA断片の採取源はマイコプラズマ・ガリセプティカ
ムに属するものであればよく、その具体例としてS6株
（ATCC15302）、PG31（ATCC19610）などが例示される。
また組み換えに用いるDNA断片の具体例としては、第１
図に示される制限酵素切断点地図を有するDNA断片（例
えば第２図に示すもの）が挙げられる。配列番号１に示されるDNA配列を有する断片の第202番
目〜第988番目は、特開平２−111795号公報に記載され
たタンパク質TMG−１の塩基配列と同じである。このTMG
−１をコードする遺伝子の終止コドンに当たる第986番
目〜第988番目の塩基を宿主内で終止コドンとして翻訳
されないように改変し、さらに第999番目〜第1387番目
のDNA配列を付加したものである。そして第1048番目〜
第1050番目のTGAも同様に終止コドンとして翻訳されな
いように改変したものである。尚、DNA配列中のNNNは、発現に際して終止コドンとな
らないものであれば特に限定されないが、天然のマイコ
プラズマ・ガリセプティカムではTGAがトリプトファン
として翻訳されると予想されていることから（J.Bacter
iology、172（１）、504−506（1990））、宿主細胞内
でもトリプトファンとして翻訳される塩基、例えばTGG
などに改変することが好ましい。組み換えベクターを構築するためのベクターは格別制
限されるものではなく、例えば、pUC8、pUC9、pUC10、p
UC11、pUC18、pUC19、pBR322、pBR325、pBR327、pDR54
0、pDR720などのプラスミドやλgt11、λgt10、λEMBL
3、λEMBL4、Charon4Aなどのファージなどが例示され
る。これらのベクターに、上記DNA断片を挿入し組み換え
ベクターを生成させる為の方法は当業者に周知のもので
よく、例えばベクターを制限酵素で切断したのち適当な
発現制御配列の支配下に上記DNA断片を直接結合すれば
よい。用いられる発現制御配列は、例えば1acプロモー
ター・オペレーター、trpプロモーター、tacプロモータ
ー、1ppプロモーター、PLプロモーター、amyEプロモー
ター、Ga17プロモーター、PGKプロモーター、ADHプロモ
ーターなどが例示される。これらマイコプラズマ由来タンパク質を発現せしめる
為に組み換えベクターを作製する上で、上記DNA断片を
いったん適当なベクターに組み込んで組み換えベクター
を作製しサブクローニングする方法は当業者に於いては
周知の方法である。これらサブクローニングされたDNA
断片は適切な制限酵素により切り出され、上記の発現制
御配列に結合させタンパク質を産生せしめる組み換えベ
クターを作製させることができる。上記のサブクローニングに用いることができるベクタ
ーも、格別制限されるものではなく、pUC8、pUC9、pUC1
0、pUC11、pUC18、pUC19、pBR322、pBR325、pBR327、pD
R540、pDR720、pUB110、pIJ702、YEp13、YEp24、YCp1
9、YCp50、pAc373、pAcYM1などのプラスミドが例示され
る。次いで得られた組み換えベクターを使用して、種々の
適当な宿主を形質転換して抗原性を有するマイコプラズ
マ・ガリセプティカム由来のタンパク質、あるいはその
アミノ酸配列を含む融合たんぱく質の産生能を有する微
生物を得ることができる。ここで用いられ適当な宿主とは、発現ベクターに対す
る適性、生成物の安定性などを加味して選択することが
できる。具体的にはエシェリヒア属（例えばエシェリヒ
ア・コリ）、バチルス属（例えばバチルス・ズブチリ
ス、バチルス・スフェリカスなど）、放線菌、酵母、昆
虫細胞、カイコなどが例示される。適当な発現ベクター
の導入により形質転換された宿主は、当業者により周知
の培養條件下で培養、増殖させることができる。また、タンパク質の産生に当たっては、発現制御配列
の作用を誘導させる条件を選択することができ、その具
体例として、1acプロモーター・オペレーターを例にと
るとイソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシドを
適当量培養液に添加することにより達成される。このようにして得られた本発明の第４の側面である形
質転換された宿主を用いて家禽用マイコプラズマ・ガリ
セプティカム感染症ワクチンを製造するには、常法に準
じて行えばよい。この宿主の培養はこの種の微生物の培
養に通常用いられる条件で行う。大腸菌の場合では、例
えば、好気的条件下、37℃でLB培地を用いて培養する。培養後、当業者によく知られているクロマトグラフィ
ー、塩析による沈澱、密度勾配遠心等から任意に選択し
た方法により本発明の第１の側面であるタンパク質が精
製される。こうして得られたタンパク質は、ワクチンと
して用いることができる。または、形質転換された宿主
を不活化してワクチンとして用いることもできる。その
場合、宿主の培養終了後、常法に従い不活化を行う。不
活化は加熱により行っても良いが、培養液に不活化剤を
加える方法がより簡便である。不活化剤として、マーゾ
ニン、ベータープロピオラクトン、タイロシン、サリチ
ル酸、クリスタルバイオレット、安息香酸、塩化ベンゼ
トニウム、ポリミキシン、グラミジシン、ホリマリン、
石炭酸等が用いられる。不活化培養液は必要に応じて適
量のアジュバントを加えた後、サイホンまたは遠心分離
等の方法で不活化物を分割する。アジュバントとして、
水酸化アルミニウムゲル、リン酸アルミニウムゲル、リ
ン酸ガルシウムゲル、明ばん等が用いられる。分離され
た不活化物は、リン酸緩衝食塩液等を用いて適当な濃度
に調製する。また、必要に応じて、防腐剤を加える。使
用される防腐剤としては、マーゾニン、ベータープロピ
オラクトン、タイロシン、サリチル酸、クリスタルバイ
オレット、安息香酸、塩化ベンゼトニウム、ポリミキシ
ン、グラミシジン、ホルマリン、石炭酸等が挙げられ
る。得られたワクチンに、更に免疫活性を高めるためにア
ジュバントを添加することを考慮しても良い。アジュバ
ントは通常、ワクチン100容量に対し１〜99容量を加え
て用いる。ワクチンとしての使用に際しては、常法により、稀釈
剤、増量剤などと混合しても良い。ワクチンは体重1Kg
当り、抗原性タンパク質量１μｇ以上の投与で効果を示
し、急性毒性を示さない限り上限は特に限定されないの
で、常法により適宜定めれば良く、例えば抗体が中和抗
体価として1.0〜2.0（log₁₀）が得られる量を投与すれ
ば良い。急性毒性は、ニワトリに対し体重1Kg当り抗原
性タンパク質量5mgの投与では認められない。本発明で得られた家禽用マイコプラズマ・ガリセプテ
ィカム感染症ワクチンは筋肉内、皮下または皮内注射等
により、家禽に接種する。また、噴霧によって気道に免
疫することも可能である。かくして、本発明によれば従来の技術に比較して高い
抗原性を有するタンパク質を効率よく製造することがで
き、優れたタンパク質は家禽マイコプラズマ・ガリセプ
ティカム感染症ワクチンとして有用であると共に、マイ
コプラズマ・ガリセプティカム感染症診断薬としても有
用である。

【実施例】

〔実施例−１〕マイコプラズマ・ガリセプティカムが発現しているポリ
ペプチド遺伝子TTM−１の取得（１）マイコプラズマ・ガリセプティカム・ゲノムDN
Aの調製マイコプラズマ・ガリセプティカムS6株を100mlのPPL
Oブロス基礎培地に20％馬血清、５％酵母エキス、１％
グルコース、およびpH指示薬としてフェノールレッドを
微量加えて調製した液体培地で、37℃３〜５日培養し
た。マイコプラズマ・ガリセプティカムの増殖に従って
培養液のpHが下がり、培養液に含まれているpH指示薬の
呈色が赤から黄に変化した時点で、培養を終了し、培養
液を8000G、20分間遠心し、集菌した。さらに菌体を培
養液の1/10容量のPBSに懸濁し、再び10,000rpm、20分間
遠心し、集菌した。収集菌体を再び2.7mlのPBSに懸濁
し、１％になる様にSDSを、さらに10μｇのRNaseを加
え、37℃30分間インキュベートし溶菌した。溶菌液を等容量のフェノールで３回抽出しさらに、エ
チルエーテルで３回抽出を行なった後エタノール沈澱
し、マイコプラズマ・ガリセプティカム・ゲノムDNA200
μｇを得た。（２） TM−１遺伝子をプローブにしたマイコプラズマ
・ガリセプティカムのゲノミックサザンハイブリダイゼ
ーション（１）で取得したマイコプラズマ・ガリセプティカム
DNA1μｇをXba Iで消化し、0.6％低融点アガロースゲル
電気泳動に供した。泳動後ゲルをアルカリ変性液（0.5M
NaOH、1.5M NaCl）に10分間浸しDNAを変性させ、中
和液（3M酢酸ナトリウムpH5.5）に10分間浸して中和の
後６倍SSC液（0.7M NaCl、0.07Mクエン酸ナトリウム、
pH7.5）中でナイロンメンブレンに転写した。風乾の後8
0℃で２時間焼き付け、４倍SET（0.6M NaCl、0.08M T
ris−HCl、4mM EDTA、pH7.8）−10倍Denhardt−0.1％
SDS−0.1％Na₄P₂O₇−50μg/ml変性サケ精子DNAとpUM
−１インサートDNA（TM−１遺伝子：特開平２−111795
号参照）を常法に従い標識したものを加えて、68℃14時
間ハイブリダイゼーションをした。ナイロンメンブレン
とＸ線フィルムを重ね、オートラジオグラフィーで確認
したところ、約3.4kbpの断片にハイブリダイズしている
ことを確認した。（３） Xba I消化約3.4kpb断片のpUC−19へのクローニ
ング及びコロニーハイブリダイゼーション実施例１−（１）で取得したマイコプラズマ・ガリセ
プティカムDNA4μｇを制限酵素Xba Iで消化後、0.6％低
融点アガロースゲル電気泳動後、約3.4kpbの断片を回収
した。この断片を、Xba I消化によって開裂したpUC−19
とリガーゼによって連結し、コンピテントな大腸菌TG1
株を形質転換し、５−ブロモ−４−クロロ−３−インド
リル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド0.003％、イソプロ
ピルチオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド0.03mM、40μg/
mlアンピシリンを含むLB寒天培地で37℃、15時間培養し
た。この培地上に生育した白コロニーをナイロンメンブ
レンに転写し、（２）と同様の方法でハイブリダイゼー
ションを行ない、オートラジオグラフィーで確認したと
ころ、クローニングされていることが判明し、このプラ
スミドをpUTTM1と名付けた。（４） TTM−１全塩基配列の決定（３）で作製したpUTTM−１を用いてSangerらのDideo
xy法〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74 5463（1977）〕で
インサートDNAの配列を決定した。塩基配列を配列番号
１に示す（但し、同配列中のNNNは共にTGAである）。マ
イコプラズマ属では、TGAコドンが翻訳終結コドンでは
なく、トリプトファンとして読まれると云われているこ
とから、TGAコドン以外の終止コドンTAA、TAGでのみ翻
訳が終結すると考えた場合のTTM−１のアミノ酸配列
は、配列番号１に示すとうりであった。この配列からTT
M−１のコードするタンパク質の分子量は約40キロダル
トンであると推定された。〔実施例−２〕（１） TTM−１がコードするタンパクTTMG1を、TGAが
翻訳終結コドンとして読まれないように改変（TGA→TG
G）したTTM−１′の作製 ◎２−１ TTM−1DNAのM13ファージへのクローニング
（第２図）１−（３）のpUTTM−１を制限酵素Sac IとEcoR Iで消
化後0.8％低融点アガロースゲル電気泳動に供し、TTM−
１の５′端を含む1.1kbpの断片をフェノール−クロロホ
ルム処理後エタノール沈澱により回収し、M13mp11ファ
ージをSac IとEcoR Iで開裂させた断片とリガーゼによ
り連結した。この反応容器と、37℃で24時間培養した大
腸菌TG1に最終的に100mMとなるようにIPTGを加えてＸ−
galが２％となるようにさらに加えた溶液とm.o.i.が0.1
になるよう混合し軟寒天上に撒いて固化させ、37℃、24
時間インキュベートする。出現したファージプラークの
うち青変していないファージからTTM−１の1.1kbpDNAを
含む組み換えファージTTM−1Nを得た。同様に、pUTTM−１をEcoR IとEcoR Vで消化後、0.8％
低融点アガロースゲル電気泳動に供し、TTM−１の３′
末端側を含む0.4kbpの断片をゲルより回収し、フェノー
ル・クロロホルム処理後エタノール沈澱により回収し、
M13mp10ファージをEcoR IとEcoR Vで開裂させた断片と
リガーゼにより連結した。この反応溶液を1.1kbpDNAの
クローニングと同様の方法で、TTM−１の0.4kbpDNAを含
む組み換えファージTTM−1Cを得た。（２）各組み換えファージから一本鎖DNAの調製上記（１）で得られた二種類の組み換えファージにつ
いて、100mlの２×YT培地で37℃で増殖している大腸菌T
G1にm.o.i.＝0.1になるようにそれぞれ加え、37℃で５
時間振盪培養後5000gで30分遠心分離し、大腸菌菌体成
分を除いた上清を取得する。この上清に0.2倍量のポリ
エチレングリコール／塩化ナトリウム混合溶液（20％ポ
リエチレングリコール＃6000、2.5M NaCl）を加え４℃
で１時間静置後5000gで20分遠心分離し、沈澱を回収す
る。この沈澱を500μｌのTE緩衝液（10mMTris−HCl、1m
M EDTA、pH8.0）に溶かし、フェノール・クロロホルム
抽出後、エタノール沈澱で各組み換えファージの単鎖DN
Aを回収した。（３）人工合成オリゴヌクレオチドをプライマーとす
る位置特異的変異体の作製（第３図）このようにして得られたDNAをこのまま大腸菌に組み
込み発現させると、配列番号１中の塩基のNNNに相当す
る部分は共にTGAであるために、ここを終止コドンとし
て認識してしまい、これより後ろに付加している配列を
翻訳しなくなる。そこで、TGA部分をメチオニンとして
翻訳するようにコドンNNNの第３番目の塩基に当たる塩
基アデニンをグアニンに改変するために、次の２つのオ
リゴヌクレオチドを合成した。配列番号２のオリゴヌクレオチドはTTM−1Nの単鎖DNA
と、配列番号３のオリゴヌクレオチドは、TTM−1Cの単
鎖DNAとアニールさせFrits Ecksteinらの方法（Nuclei
c Acid Research 8749−8764、1985）によって、目
的の変異をおこさせた組み換えファージを各各TTM−1
N′、TTM−1C′と命名した。得られたTTM−1N′、TTM−
1C′ファージDNAをそれぞれ制限酵素Sac I−EcoR I、Ec
oR I−Bgl IIで切断し、0.8％低融点アガロース電気泳
動によって1.1kbp、0.4kbpの断片をアガロースゲルより
抽出し、エタノール沈澱で回収した。一方プラスミドpU
TTM−１もSac I−Bgl IIで切断し、4.8kbpのベクターを
含む断片を0.8％低融点アガロースゲル電気泳動から回
収し、エタノール沈澱で回収した。こうして得られた３
つの断片をリガーゼにより連結し、コンピテントな大腸
菌TG1株を形質転換し、目的の位置に変異がおきたTTM−
１′を持つプラスミドpUTTM−１′を得た。配列分析は
１−（４）と同様の方法で行ない、目的の位置が変異し
ていることを確認した。得られたマイコプラズマ・ガリセプティカム由来の遺
伝子の制限酵素切断点地図は、第１図に示すとおりであ
る。〔実施例−３〕 TTM−１′がコードするタンパク質TTMG−１の発現プラ
スミドpUTMIEの作製（第４図）プラスミドpBMG6T（特開平２−111795）を制限酵素Ba
mH Iで消化し、DNAポリメラーゼＩで処理後、制限酵素A
va IIIで消化し、0.8％低融点アガロース電気泳動後、
ゲルより約5000bpのDNAを回収し、フェノール・クロロ
ホルム処理後エタノール沈澱によりtacプロモーターを
含む断片を回収した。一方１−（３）で得たプラスミド
pUTTM1を制限酵素Ava IIIとEcoR Vで消化し、0.8％低融
点アガロース電気泳動後、約600bpのDNAを回収し、フェ
ノール・クロロホルム処理後エタノール沈澱により、TT
M−1DNAの一部を含む断片を回収した。この２つの断片をリガーゼにより連結し、コンピテン
トな大腸菌TG1株を形質転換し、アンピシリンを含むLB
培地で37℃、15時間培養し、ビルンボイムとドーリーの
方法〔ヌクレイック・アシッド・リサーチ７1513〜
（1979）〕でプラスミドを抽出し、tacプロモーターとT
TM−1DNAを含むプラスミドpTTM1Eを作製した。一方、pBMG6Tを制限酵素BamH Iで消化し、0.8％低融
点アガロースゲル電気泳動後転写終結配列を含む約700b
pの断片をエタノール沈澱で回収した。最後に、pTTM1Eを制限酵素Bgl IIで開裂させ、フェノ
ール・クロロホルム処理後エタノール沈澱により回収し
た断片と、転写終結配列を含む上記約700bpの断片をリ
ガーゼにより連結し、pTTM1Eと同様な方法で目的のプラ
スミドを選択し、pMTTM1Eと命名した。〔実施例−４〕 TTM1Eのコードするポリペプチドの発現 pMTTM1Eで形質転換した大腸菌TG1株をアンピシリン50
μg/mlを含むLB培地で37℃12時間培養した後、1mlを採
取して、同じくアンピシリン50μg/mlを含むLB培地100m
lに加え、37℃で培養した。２時間後にイソプロピルチ
オ−β−Ｄ−ガラクトピラノシドを1mMになるよう添加
し、さらに37℃12時間培養した。培養後大腸菌を6000
g、10分間遠心し、集菌した後、10％ SDS−PAGEに付
し、50mAで２時間泳動した。泳動後クーマジ−ブリリア
ントブルーＲ−250でゲルを染色したところ、約40キロ
ダルトンのバンドが新たに検出され、全菌体タンパク量
の約10％に及んでいた。この分子量が推定値と一致する
ことから、この約40キロダルトンのタンパク質はTTM−
１がコードしているものであることを確認し、これをTT
MG−１と名付けた。さらに、このようにSDS−PAGEに付したゲルを、ウエ
スタンブロット分析〔Towbin等、Proc.Natl.Acad.Sci.U
SA 76;4350（1979）〕のためニトロセロースに転写
し、一次抗体にマイコプラズマ・ガリセプティカム免疫
鶏血清を用いたところ、クーマジーブリリアントブルー
Ｒ−250で染色された約40kdのバンドが反応し、TTMG−
１がマイコプラズマ・ガリセプティカム由来であること
を確認した。〔実施例−５〕 TTMG−１の精製実施例−４で集菌した大腸医菌を10mlのPBSダルベッ
コリン酸緩衝液に懸濁したのち、フレンチプレス処理
（大岳製作所製:1500kgf/cm²）し、60000g、30分遠心分
離後沈澱を回収し、１％NP−40を含むKPB（10mMリン酸
カリウム緩衝液、pH7.0）で３回洗浄後、尿素を7.5M含
むPBSに懸濁し、60000g、30分遠心分離後、上清を回収
した。この上清を尿素を6M含みpH7.5に調製したKPBで平
衡化したQAE−トヨパールカラム（東ソー製）で、NaCl
濃度を0Mから1Mまでの直線的濃度勾配によって分画を試
み、NaCl濃度0MでTMG−１を含むフラクション（画分）
を回収した。この画分をさらにQAE−トヨパールカラム
と同じKPBで平衡化したRed−トヨパールカラム（東ソー
製）を用い、NaCl濃度を0Mから1Mまでの直線的勾配によ
って分画を試み、0.5Mから0.7M NaCl濃度でTMG−１
（約200μｇ）を含む画分を取得した。得られたTTMG−１を実施例４と同様にSDS−PAGEに供
し、ブリリアントブルーＲ−250で染色後、TLC−スキャ
ナー（TS−930:島津製作所）によって純度を測定したと
ころ、約90％であった。 TGlの培養液から約200μｇのTTMG−１が精製できた。〔実施例−６〕マイコプラズマ・ガリセプティカム生育阻止試験実施例−５で得られたTTMG−１をダルベッコPBS緩衝
液に200μg/mlになるように溶解した。この溶液1mlを、
等量の完全フロイント・アジュバント若しくは水酸化ア
ルミニウムゲルと混合し、８週齢以降の鶏（line−Ｍ、
SPF:日本生物科学研究所）右大腿部に注入した。さらに
２週間後、第２回目の免疫として上記TTMG−１ 1mlを
１回目の免疫と同様の方法で実施し、１週間後に鶏の心
臓より抗TTMG−１抗血清を採取した。一方、マイコプラズマ・ガリセプティカムS6株をPPLO
液体培地（変法Chanock培地）に10％植菌し37℃で３日
間培養したあと、0.45μｍのメンブレンフィルターを通
して凝集菌体を取り除いたろ液を、菌体数が10³CFU/ml
になるようにPPLO液体培地で希釈し、活性測定用菌液と
した。この菌液を滅菌したポリプロピレン製のチューブに40
0μｌ分注し、標準鶏血清、TMG−１免疫血清（特開平２
−111795号）、TTMG−１免疫血清をそれぞれ100μｌ加
えて、37℃で２〜５日間培養することにより生育阻止試
験を行なった。培養０、１、２、３、４日目に各マイコプラズマ・ガ
リセプティカム生育阻止試験培養液から各10μｌを採取
し、PPLO寒天培地に広げ37℃で７日間培養し、出現した
コロニー数で対応する培養液中の菌数を演えきした。そ
の３日目の菌数測定の結果を表１に示す。添加した試料が標準鶏血清、または馬血清を加えた培
地の培養液ではマイコプラズマ・ガリセプティカムの増
殖速度には差がなく、培養３日目で菌数は飽和に達し
た。抗TTMG−１免疫鶏血清マイコプラズマ・ガリセプテ
ィカム免疫鶏血清、またはマイコプラズマ・ガリセプテ
ィカム感染鶏血清を添加した培養液ではマイコプラズマ
・ガリセプティカムの増殖は３日目において明らかにお
さえられていた。これはTTMG−１タンパクがマイコプラ
ズマ・ガリセプティカムの生育を効果的に抑制する抗体
を誘導できる抗原であることを示している。〔実施例−７〕 TTMG−１免疫鶏のマイコプラズマ・ガリセプティカムに
対する感染防御効果測定マイコプラズマ・ガリセプティカムKP−13株をPPLO液
体培地中で培養し１×10⁶CFU/mlに調製し、実施例−６
で免疫した鶏に２回目免疫２週間後に、菌液を両鼻腔内
に0.5mlずつ点鼻接種した。４日後鶏を殺処分し、眼下
下洞、気のうを滅菌綿棒でそれぞれぬぐい、各々、PPLO
液体培地（１％ペニシリン、0.05％酢酸タリウムを含
む）に浸せきし、37℃で168時間静置培養し、さらに20
μｌを2ml PPLO培地（１％ペニシリン、0.05％酢酸タリ
ウムを含む）で168時間静置培養後、菌の存在の有無を
実施例−６と同様の方法で測定し、感染防御効果を判定
した。感染防御効果を表２に示す。本発明TTMG−１を接種し
た鶏は、未接種鶏に比較し、著しく感染防御効果を有
し、本発明TTMG−１に高いワクチン効果があることが示
された。配列リステング（１）一般情報（ｉ）出願人：米国斉藤修治大川節子藤沢歩入谷好一青山茂美米国以外の指定国日本ゼオン株式会社塩野義製薬株式会社（ii）発明の名称：家禽マイコプラズマ抗原、その遺
伝子、その遺伝子を含む組み換えベクター、およびそれ
を利用したワクチン（iii）配列の数:3 （２）配列番号１についての情報（ｉ）配列の特性（Ａ）配列の長さ:1387塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：二本鎖（Ｄ）トポロジー：円形状（Ｅ）配列の種類:DNA （xi）配列の表示：配列番号１（２）配列番号２についての情報（ｉ）配列の特性（Ａ）配列の長さ:32塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直線状（xi）配列の表示：配列番号２（３）配列番号３についての情報（ｉ）配列の特性（Ａ）配列の長さ:21塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直線状（xi）配列の表示：配列番号３

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩＣ１２Ｒ 1:19） (72)発明者入谷好一京都府京都市伏見区深草大亀谷万帖敷町 151 (72)発明者青山茂美滋賀県甲賀郡水口町貴生川370−13 (56)参考文献特開平２−111795（ＪＰ，Ａ) 国際公開91／15593（ＷＯ，Ａ１) ＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙａｎｄＩｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ（1989），21，ｐ．197− 206 ＡｖｉａｎＤｉｓｅａｓｅｓ（1990），34，ｐ．575−584 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＥＵＲＯＰＡＴ（ＱＵＥＳＴＥＬ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳｅｑＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】マイコプラズマ免疫血清またはマイコプラ
ズマ感染血清に抗原抗体反応しうる純粋なタンパク質で
あって、以下に示す制限酵素切断点地図を有するマイコ
プラズマ・ガリセプティカム由来のDNA配列がコードす
る分子量約40キロダルトンのタンパク質、またはその改
変体であって前記タンパク質と同等に前記抗原抗体反応
するタンパク質。
【請求項２】配列番号１に示されたアミノ酸配列を有す
る請求項１記載のタンパク質、またはそれと同等に抗原
抗体反応するタンパク質。
【請求項３】請求項２に記載するタンパク質をコードす
るDNA配列。
【請求項４】請求項３記載のDNA断片を組み込んだ組み
換えベクター。
【請求項５】請求項４記載の組み換えベクターにより形
質転換された宿主。
【請求項６】請求項１、または２記載のタンパク質を有
効成分とする家禽マイコプラズマ・ガリセプティカム感
染症ワクチン。