JPH07133295A - 新規な抗原タンパク質、その遺伝子、及び組み換えバキュロウイルスとその利用 - Google Patents
新規な抗原タンパク質、その遺伝子、及び組み換えバキュロウイルスとその利用Info
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- JPH07133295A JPH07133295A JP21310293A JP21310293A JPH07133295A JP H07133295 A JPH07133295 A JP H07133295A JP 21310293 A JP21310293 A JP 21310293A JP 21310293 A JP21310293 A JP 21310293A JP H07133295 A JPH07133295 A JP H07133295A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 鳥類に感染するマイコプラズマ・ガリセプテ
ィカム用ワクチンの提供。 【構成】 マイコプラズマ・ガリセプティカムの抗原蛋
白質の遺伝子をバキュロウイルスの非必須ＤＮＡ領域に
組み込んだ組み換えを生ワクチンとして使用するか又は
ウイルス同組み換えウイルスの産生する抗原タンパク質
をコンポネントワクチンとして利用する。
ィカム用ワクチンの提供。 【構成】 マイコプラズマ・ガリセプティカムの抗原蛋
白質の遺伝子をバキュロウイルスの非必須ＤＮＡ領域に
組み込んだ組み換えを生ワクチンとして使用するか又は
ウイルス同組み換えウイルスの産生する抗原タンパク質
をコンポネントワクチンとして利用する。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、新規なマイコプラズマ
・ガリセプティカムの抗原タンパク質、それをコードす
る遺伝子、該タンパク質を有効成分とするワクチン、お
よびマイコプラズマ・ガリセプティカムの抗原タンパク
質をコードする遺伝子を組み込んだ組み換えウイルス、
それを用いた組み換え生ワクチン、それを用いたマイコ
プラズマ・ガリセプティカムの抗原タンパク質の製造方
法に関する。
・ガリセプティカムの抗原タンパク質、それをコードす
る遺伝子、該タンパク質を有効成分とするワクチン、お
よびマイコプラズマ・ガリセプティカムの抗原タンパク
質をコードする遺伝子を組み込んだ組み換えウイルス、
それを用いた組み換え生ワクチン、それを用いたマイコ
プラズマ・ガリセプティカムの抗原タンパク質の製造方
法に関する。
【０００２】
【従来の技術】世界で最も重要な鶏などの家禽の感染症
のひとつであるマイコプラズマ・ガリセプティカム（Ｍ
ｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ）感
染症は、鶏においては、気嚢炎を伴う慢性の呼吸器障害
を特徴とする疾病である。マイコプラズマ・ガリセプテ
ィカムに感染すると、産卵率並びに孵化率の低下が長期
に渡り引き起こされ、養鶏業界に重大な経済的損失をも
たらす。また、マイコプラズマ・ガリセプティカム感染
症によって鶏の免疫能が低下して常圧菌や弱毒ワクチン
などの日和見感染も引き起こされる。これらの点から予
想できる経済的被害は計り知れない額となる。いくつか
のマイコプラズマ・ガリセプティカム抗原タンパク質が
特開平２−１１１７９５号公報で開示されている。しか
し、これらは天然のマイコプラズマ・ガリセプティカム
由来の抗原タンパク質ではなく高い抗原性は期待できな
い。このため、より高い抗原性を有するタンパク質が求
められている。また、前記公報など従来からマイコプラ
ズマ・ガリセプティカム由来の抗原タンパク質を遺伝子
工学的に製造する方法は、大腸菌や酵母を用いた系に限
られていた（特開平２−１１１７５９号公報など）。こ
のような系では、抗原発現量が少ない、発現したタンパ
ク質の抗原性が低下・欠損するなどの原因があるほか、
効果の高い生ワクチンとして利用できない、宿主由来の
発熱性物質が取り除けないなどの問題があり、実用に適
していなかった。
のひとつであるマイコプラズマ・ガリセプティカム（Ｍ
ｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ）感
染症は、鶏においては、気嚢炎を伴う慢性の呼吸器障害
を特徴とする疾病である。マイコプラズマ・ガリセプテ
ィカムに感染すると、産卵率並びに孵化率の低下が長期
に渡り引き起こされ、養鶏業界に重大な経済的損失をも
たらす。また、マイコプラズマ・ガリセプティカム感染
症によって鶏の免疫能が低下して常圧菌や弱毒ワクチン
などの日和見感染も引き起こされる。これらの点から予
想できる経済的被害は計り知れない額となる。いくつか
のマイコプラズマ・ガリセプティカム抗原タンパク質が
特開平２−１１１７９５号公報で開示されている。しか
し、これらは天然のマイコプラズマ・ガリセプティカム
由来の抗原タンパク質ではなく高い抗原性は期待できな
い。このため、より高い抗原性を有するタンパク質が求
められている。また、前記公報など従来からマイコプラ
ズマ・ガリセプティカム由来の抗原タンパク質を遺伝子
工学的に製造する方法は、大腸菌や酵母を用いた系に限
られていた（特開平２−１１１７５９号公報など）。こ
のような系では、抗原発現量が少ない、発現したタンパ
ク質の抗原性が低下・欠損するなどの原因があるほか、
効果の高い生ワクチンとして利用できない、宿主由来の
発熱性物質が取り除けないなどの問題があり、実用に適
していなかった。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、かかる
従来技術の中で、高い抗原性を示すマイコプラズマ由来
の抗原タンパク質を得、また、新たなマイコプラズマ・
ガリセプティカム由来の抗原タンパク質製造方法を開発
すべく鋭意検討を進めた結果、新規なマイコプラズマ・
ガリセプティカム由来の抗原タンパク質を見いだし、さ
らにマイコプラズマ・ガリセプティカム由来の抗原タン
パク質をコードする遺伝子を組み込んだ組み換えウイル
スを見いだし、本発明を完成するに至った。
従来技術の中で、高い抗原性を示すマイコプラズマ由来
の抗原タンパク質を得、また、新たなマイコプラズマ・
ガリセプティカム由来の抗原タンパク質製造方法を開発
すべく鋭意検討を進めた結果、新規なマイコプラズマ・
ガリセプティカム由来の抗原タンパク質を見いだし、さ
らにマイコプラズマ・ガリセプティカム由来の抗原タン
パク質をコードする遺伝子を組み込んだ組み換えウイル
スを見いだし、本発明を完成するに至った。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明の新規な抗原タン
パク質は、マイコプラズマ・ガリセプティカム免疫血清
またはマイコプラズマ・ガリセプティカム感染血清と抗
原抗体反応を呈し、マイコプラズマ・ガリセプティカム
に由来する図１の制限酵素切断点地図を有するＤＮＡ配
列がコードする抗原タンパク質、またはその修飾された
ものである。このような抗原タンパク質の具体例とし
て、３２キロダルトンの分子量を有する図２または図３
に示すごときアミノ酸配列をもつ抗原タンパク質が例示
される。また、ここでいう修飾された抗原タンパク質と
は、上述の抗原タンパク質と同等の免疫原性を示す程度
にアミノ酸配列が置換・脱落・欠損・挿入、付加された
ものであるが、好ましくは図２または図３のアミノ酸配
列を有する抗原タンパク質と同等の免疫原性を有し、か
つ該タンパク質のアミノ酸配列との相同性が７０％以
上、より好ましくは８０％以上、更に好ましくは９０％
以上のものである。本発明でいう相同性は、ＤＮＡシー
ケンス入力解析システム「ＤＮＡＳＩＳ」（発売元：宝
酒造（株））により測定されたものを指標とするもので
ある。この抗原タンパク質は、常法にしたがって製造さ
れる。例えば、後述する組み換えバキュロウイルスを用
いて製造することができる。
パク質は、マイコプラズマ・ガリセプティカム免疫血清
またはマイコプラズマ・ガリセプティカム感染血清と抗
原抗体反応を呈し、マイコプラズマ・ガリセプティカム
に由来する図１の制限酵素切断点地図を有するＤＮＡ配
列がコードする抗原タンパク質、またはその修飾された
ものである。このような抗原タンパク質の具体例とし
て、３２キロダルトンの分子量を有する図２または図３
に示すごときアミノ酸配列をもつ抗原タンパク質が例示
される。また、ここでいう修飾された抗原タンパク質と
は、上述の抗原タンパク質と同等の免疫原性を示す程度
にアミノ酸配列が置換・脱落・欠損・挿入、付加された
ものであるが、好ましくは図２または図３のアミノ酸配
列を有する抗原タンパク質と同等の免疫原性を有し、か
つ該タンパク質のアミノ酸配列との相同性が７０％以
上、より好ましくは８０％以上、更に好ましくは９０％
以上のものである。本発明でいう相同性は、ＤＮＡシー
ケンス入力解析システム「ＤＮＡＳＩＳ」（発売元：宝
酒造（株））により測定されたものを指標とするもので
ある。この抗原タンパク質は、常法にしたがって製造さ
れる。例えば、後述する組み換えバキュロウイルスを用
いて製造することができる。
【０００５】本発明の遺伝子は、前記抗原タンパク質を
コードするものであり、具体例としては、図２または図
３に示される塩基配列のものが挙げられるが、該配列中
の塩基が置換・脱落・欠損・挿入、付加等によって修飾
されたものであっても、修飾された遺伝子がコードする
タンパク質の抗原タンパク質が本発明のタンパク質と実
質的に同等の抗原性を示すかぎり使用できる。このよう
な遺伝子の採取源としては、マイコプラズマ・ガリセプ
ティカムに属するものであれば特に限定されないが、そ
の具体例としてＳ６株（ＡＴＣＣ１５３０２）、ＰＧ３
１（ＡＴＣＣ１９６１０）などが例示される。
コードするものであり、具体例としては、図２または図
３に示される塩基配列のものが挙げられるが、該配列中
の塩基が置換・脱落・欠損・挿入、付加等によって修飾
されたものであっても、修飾された遺伝子がコードする
タンパク質の抗原タンパク質が本発明のタンパク質と実
質的に同等の抗原性を示すかぎり使用できる。このよう
な遺伝子の採取源としては、マイコプラズマ・ガリセプ
ティカムに属するものであれば特に限定されないが、そ
の具体例としてＳ６株（ＡＴＣＣ１５３０２）、ＰＧ３
１（ＡＴＣＣ１９６１０）などが例示される。
【０００６】上記抗原タンパク質を有効成分とするコン
ポネントワクチンは、常法にしたがって調製され、希釈
剤、増量剤、アジュバンドなどと混合してもよい。ワク
チンは、体重１kg当り、抗原タンパク質量１μｇ以上の
量で投与すればよく、上限は、急性毒性を示さない限り
特に限定されず、例えば抗体が中和抗体価として１．０
〜２．０（ｌｏｇ10）が得られる量を投与すればよい。
急性毒性は、ニワトリに対し、体重１kg当たり抗原タン
パク質量５mgの投与では認められない。本発明で得られ
た家禽用マイコプラズマ・ガリセプティカム感染症ワク
チンは、筋肉内、皮下または皮内注射等により、家禽に
接種する。また、噴霧によって気道に免疫するか、ある
いは通常の経口投与することも可能である。
ポネントワクチンは、常法にしたがって調製され、希釈
剤、増量剤、アジュバンドなどと混合してもよい。ワク
チンは、体重１kg当り、抗原タンパク質量１μｇ以上の
量で投与すればよく、上限は、急性毒性を示さない限り
特に限定されず、例えば抗体が中和抗体価として１．０
〜２．０（ｌｏｇ10）が得られる量を投与すればよい。
急性毒性は、ニワトリに対し、体重１kg当たり抗原タン
パク質量５mgの投与では認められない。本発明で得られ
た家禽用マイコプラズマ・ガリセプティカム感染症ワク
チンは、筋肉内、皮下または皮内注射等により、家禽に
接種する。また、噴霧によって気道に免疫するか、ある
いは通常の経口投与することも可能である。
【０００７】本発明の組み換えウイルスは、マイコプラ
ズマ・ガリセプティカム由来の抗原タンパク質をコード
する遺伝子を有するウイルスであればよく、使用される
ウイルスは、通常遺伝子組み換え技術で用いるものであ
れば特に限定されないが、好ましくはアビポックスウイ
ルス、ワクチニアウイルス、バキュロウイルス、であ
り、特に好ましくはアビポックスウイルスおよびバキュ
ロウイルスである。
ズマ・ガリセプティカム由来の抗原タンパク質をコード
する遺伝子を有するウイルスであればよく、使用される
ウイルスは、通常遺伝子組み換え技術で用いるものであ
れば特に限定されないが、好ましくはアビポックスウイ
ルス、ワクチニアウイルス、バキュロウイルス、であ
り、特に好ましくはアビポックスウイルスおよびバキュ
ロウイルスである。
【０００８】組み換えアビポックスウイルスに供される
ウイルスとしては、アビポックスウイルスに分類される
限りいかなる株でもよいが、鶏、七面鳥、アヒルなどの
家禽類の細胞中で増殖可能なものが好ましく、その具体
例として、ＡＴＣＣ ＶＲ−２５１，ＡＴＣＣ ＶＲ２
５０，ＡＴＣＣ ＶＲ−２２９，ＡＴＣＣ ＶＲ−２４
９，ＡＴＣＣ ＶＲ−２８８，西が原株，泗水株，など
のごときファウルポックスウイルスやファウルポックス
ウイルスと近縁のウイルスであって、ＮＰ株（鶏胎化鳩
痘毒中野株）などのように鶏痘生ワクチン株として使用
されるウイルスなどが例示される。これらの株はいずれ
も市販されており、容易に入手することができる。ま
た、組み換えバキュロウイルスの作製に供されるウイル
スとしては、昆虫細胞に感染するものであれば如何なる
ものでも良く、天然のものであっても、人工的に作製さ
れたハイブリッドウイルスであっても良い。これらのウ
イルスの具体例として、オートグラファ・カリフォルニ
カ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃ
ａ）、トリコプルシア・ニ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ
ｎｉ）、ラキブルシア・オウ（Ｒａｃｈｉｐｌｕｓｉ
ａ ｏｕ）、ガレリア・メロネラ（Ｇａｌｌｅｒｉａ
ｍｅｌｌｏｎｅｌｌａ）、ボンビックス・モリ（Ｂｏｍ
ｂｙｘ ｍｏｒｉ）などの天然のバキュロウイルスや、
オートグラファ・カリフォルニカとボンビックス・モリ
とから作製した、アルファルファワムシにもカイコにも
感染する能力を有するハイブリッドウイルス（以下、Ａ
ｃＮＰＶ−ＢｍＮＰＶという；日本蚕糸学会第５９回学
術講演会講演要旨集、日本蚕糸学会編、第５９頁、１９
８９年、柴田ら、日本蚕糸学会第６０回講演会講演要旨
集、日本蚕糸学会、第７８頁、１９９０年、Ｋｏｎｄ
ｏ、Ｍａｅｄａら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、６５、３６
２５−３６３２（１９９１））のようなハイブリッドウ
イルスが例示される。なかでもＡｃＮＰＶ−ＢｍＮＰＶ
は、抗原タンパク質の製造に当たり、多種類の宿主を用
いることができることから、とりわけ好ましい。
ウイルスとしては、アビポックスウイルスに分類される
限りいかなる株でもよいが、鶏、七面鳥、アヒルなどの
家禽類の細胞中で増殖可能なものが好ましく、その具体
例として、ＡＴＣＣ ＶＲ−２５１，ＡＴＣＣ ＶＲ２
５０，ＡＴＣＣ ＶＲ−２２９，ＡＴＣＣ ＶＲ−２４
９，ＡＴＣＣ ＶＲ−２８８，西が原株，泗水株，など
のごときファウルポックスウイルスやファウルポックス
ウイルスと近縁のウイルスであって、ＮＰ株（鶏胎化鳩
痘毒中野株）などのように鶏痘生ワクチン株として使用
されるウイルスなどが例示される。これらの株はいずれ
も市販されており、容易に入手することができる。ま
た、組み換えバキュロウイルスの作製に供されるウイル
スとしては、昆虫細胞に感染するものであれば如何なる
ものでも良く、天然のものであっても、人工的に作製さ
れたハイブリッドウイルスであっても良い。これらのウ
イルスの具体例として、オートグラファ・カリフォルニ
カ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃ
ａ）、トリコプルシア・ニ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ
ｎｉ）、ラキブルシア・オウ（Ｒａｃｈｉｐｌｕｓｉ
ａ ｏｕ）、ガレリア・メロネラ（Ｇａｌｌｅｒｉａ
ｍｅｌｌｏｎｅｌｌａ）、ボンビックス・モリ（Ｂｏｍ
ｂｙｘ ｍｏｒｉ）などの天然のバキュロウイルスや、
オートグラファ・カリフォルニカとボンビックス・モリ
とから作製した、アルファルファワムシにもカイコにも
感染する能力を有するハイブリッドウイルス（以下、Ａ
ｃＮＰＶ−ＢｍＮＰＶという；日本蚕糸学会第５９回学
術講演会講演要旨集、日本蚕糸学会編、第５９頁、１９
８９年、柴田ら、日本蚕糸学会第６０回講演会講演要旨
集、日本蚕糸学会、第７８頁、１９９０年、Ｋｏｎｄ
ｏ、Ｍａｅｄａら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、６５、３６
２５−３６３２（１９９１））のようなハイブリッドウ
イルスが例示される。なかでもＡｃＮＰＶ−ＢｍＮＰＶ
は、抗原タンパク質の製造に当たり、多種類の宿主を用
いることができることから、とりわけ好ましい。
【０００９】また、マイコプラズマ・ガリセプティカム
の抗原タンパク質をコードする遺伝子としては、抗マイ
コプラズマ・ガリセプティカム血清と抗原抗体反応を呈
する抗原タンパク質をコードするものであれば特に限定
されず、後述する本発明の遺伝子のほか特開平２−１１
１７９５号公報に開示された抗原タンパク質をコードす
る遺伝子またはその一部、あるいはマイコプラズマ・ガ
リセプティカム由来の図４に示される制限酵素切断地図
を有する４０Ｋｄのタンパク質をコードする遺伝子（図
５及び図６）が挙げられる。図５および図６で示される
塩基配列の第９８６番目〜第９８８番目および第１０４
８番目〜１０５０番目の塩基は図中ではＮＮＮである。
これらの塩基は天然のマイコプラズマ・ガリセプティカ
ムの遺伝子ではＴＧＡであり、マイコプラズマ・ガリセ
プティカム内ではトリプトファンとして翻訳されている
と予想される（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、１７２
（１）、５０４−５０６（１９９０））。しかし、通常
はＴＧＡは終止コドンであり、アミノ酸をコードするも
のではない。従って、目的とするタンパク質を発現させ
るためには、天然のマイコプラズマ・ガリセプティカム
由来の遺伝子のＴＧＡをアミノ酸として翻訳されるよう
な塩基に改変する必要がある。改変の手法は常法に従え
ばよく、本発明の実施例ではこれらの塩基を共にＴＧＧ
に改変し、トリプトファンとして翻訳されるようにし
た。このような遺伝子の採取源も、前述と同様マイコプ
ラズマ・ガリセプティカムに属するものであれば特に限
定されないが、その具体例としてＳ６株（ＡＴＣＣ１５
３０２）、ＰＧ３１（ＡＴＣＣ１９６１０）などが例示
される。また、上記抗原タンパク質をコードする遺伝子
の５′上流にβ−ガラクトシダーゼをコードする遺伝
子、β−ラクタマーゼをコードする遺伝子などの細菌由
来の酵素タンパク質をコードする遺伝子を適当なリンカ
ーによって結合させた融合タンパク質遺伝子を用いれ
ば、組み換えウイルスの構築に際し、組み換え体の選択
などに便利である。
の抗原タンパク質をコードする遺伝子としては、抗マイ
コプラズマ・ガリセプティカム血清と抗原抗体反応を呈
する抗原タンパク質をコードするものであれば特に限定
されず、後述する本発明の遺伝子のほか特開平２−１１
１７９５号公報に開示された抗原タンパク質をコードす
る遺伝子またはその一部、あるいはマイコプラズマ・ガ
リセプティカム由来の図４に示される制限酵素切断地図
を有する４０Ｋｄのタンパク質をコードする遺伝子（図
５及び図６）が挙げられる。図５および図６で示される
塩基配列の第９８６番目〜第９８８番目および第１０４
８番目〜１０５０番目の塩基は図中ではＮＮＮである。
これらの塩基は天然のマイコプラズマ・ガリセプティカ
ムの遺伝子ではＴＧＡであり、マイコプラズマ・ガリセ
プティカム内ではトリプトファンとして翻訳されている
と予想される（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、１７２
（１）、５０４−５０６（１９９０））。しかし、通常
はＴＧＡは終止コドンであり、アミノ酸をコードするも
のではない。従って、目的とするタンパク質を発現させ
るためには、天然のマイコプラズマ・ガリセプティカム
由来の遺伝子のＴＧＡをアミノ酸として翻訳されるよう
な塩基に改変する必要がある。改変の手法は常法に従え
ばよく、本発明の実施例ではこれらの塩基を共にＴＧＧ
に改変し、トリプトファンとして翻訳されるようにし
た。このような遺伝子の採取源も、前述と同様マイコプ
ラズマ・ガリセプティカムに属するものであれば特に限
定されないが、その具体例としてＳ６株（ＡＴＣＣ１５
３０２）、ＰＧ３１（ＡＴＣＣ１９６１０）などが例示
される。また、上記抗原タンパク質をコードする遺伝子
の５′上流にβ−ガラクトシダーゼをコードする遺伝
子、β−ラクタマーゼをコードする遺伝子などの細菌由
来の酵素タンパク質をコードする遺伝子を適当なリンカ
ーによって結合させた融合タンパク質遺伝子を用いれ
ば、組み換えウイルスの構築に際し、組み換え体の選択
などに便利である。
【００１０】本発明の組み換えウイルスを構築する方法
は、常法にしたがって行えばよく、例えば次の手順にし
たがって行うことができる。まず、ウイルスの増殖に非
必須なＤＮＡ領域（以下、単に非必須領域という）にプ
ロモーターが挿入されたＤＮＡ断片を組み込んだ第一の
組み換えベクターを作製する。次に前記プロモーターの
下流に前述の抗原遺伝子を挿入して第二の組み換えベク
ターを作製する。第一および第二の組み換えベクターを
作製するに当たっては、大腸菌の系を用いればよく、使
用するベクターも目的に相応しいものであるかぎり、特
に限定されない。ここで使用されるベクターの具体例と
しては、例えばｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＢＲ３
２７、ｐＢＲ３２８、ｐＡＣＹＭ１（Ｖｉｒｏｌｏｇ
ｙ、１７３、６７４−６８２（１９８２））、ｐＡＣ３
７３（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ、８２、８４０４−８４０８（１９８５））、ｐＵＣ
７、ｐＵＣ８、ｐＵＣ９、ｐＵＣ１９などのプラスミ
ド、λ−ファージ、Ｍ１３ファージなどのごときファー
ジ、ｐＨＣ７９などのごときコスミドが例示され、中で
も、組み込むウイルスとしてアビポックスウイルスを使
用するときは、例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、
ｐＵＣ８、ｐＵＣ９、ｐＵＣ１８などのプラスミド、λ
ファージ、Ｍ１３ファージなどのファージ、ｐＨＣ７９
などのコスミドなどのベクターが好適に使用される。バ
キュロウイルスを用いるときは、ｐＡＣＹＭ１やｐＡＣ
３７３のようなバキュロウイルストランスファーベクタ
ーとして確立されたプラスミドを用いることが好まし
い。非必須領域とは、組み込むウイルスの増殖に非必須
であり、かつ相同組み換えなどにより組み込むウイルス
に挿入される領域であれば特に限定されず、アビポック
スウイルスの増殖に非必須な領域としては、例えば、Ｎ
Ｐ株ＤＮＡの約７．３ｋｂｐのＥｃｏＲＩ断片、約５．
２ｋｂｐのＨｉｎｄ III断片、約５．０ｋｂｐのＥｃｏ
ＲＩ−Ｈｉｎｄ III断片、約４．０ｋｂｐのＢａｍＨＩ
断片などと相同組み換えを起こす領域（特開平１−１６
８２７９号）が例示される。バキュロウイルスの増殖に
非必須な領域としては、ポリヘドリン遺伝子（サイエン
ス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２１９、７１５−７２１（１９
８３））などが例示される。
は、常法にしたがって行えばよく、例えば次の手順にし
たがって行うことができる。まず、ウイルスの増殖に非
必須なＤＮＡ領域（以下、単に非必須領域という）にプ
ロモーターが挿入されたＤＮＡ断片を組み込んだ第一の
組み換えベクターを作製する。次に前記プロモーターの
下流に前述の抗原遺伝子を挿入して第二の組み換えベク
ターを作製する。第一および第二の組み換えベクターを
作製するに当たっては、大腸菌の系を用いればよく、使
用するベクターも目的に相応しいものであるかぎり、特
に限定されない。ここで使用されるベクターの具体例と
しては、例えばｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＢＲ３
２７、ｐＢＲ３２８、ｐＡＣＹＭ１（Ｖｉｒｏｌｏｇ
ｙ、１７３、６７４−６８２（１９８２））、ｐＡＣ３
７３（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ、８２、８４０４−８４０８（１９８５））、ｐＵＣ
７、ｐＵＣ８、ｐＵＣ９、ｐＵＣ１９などのプラスミ
ド、λ−ファージ、Ｍ１３ファージなどのごときファー
ジ、ｐＨＣ７９などのごときコスミドが例示され、中で
も、組み込むウイルスとしてアビポックスウイルスを使
用するときは、例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、
ｐＵＣ８、ｐＵＣ９、ｐＵＣ１８などのプラスミド、λ
ファージ、Ｍ１３ファージなどのファージ、ｐＨＣ７９
などのコスミドなどのベクターが好適に使用される。バ
キュロウイルスを用いるときは、ｐＡＣＹＭ１やｐＡＣ
３７３のようなバキュロウイルストランスファーベクタ
ーとして確立されたプラスミドを用いることが好まし
い。非必須領域とは、組み込むウイルスの増殖に非必須
であり、かつ相同組み換えなどにより組み込むウイルス
に挿入される領域であれば特に限定されず、アビポック
スウイルスの増殖に非必須な領域としては、例えば、Ｎ
Ｐ株ＤＮＡの約７．３ｋｂｐのＥｃｏＲＩ断片、約５．
２ｋｂｐのＨｉｎｄ III断片、約５．０ｋｂｐのＥｃｏ
ＲＩ−Ｈｉｎｄ III断片、約４．０ｋｂｐのＢａｍＨＩ
断片などと相同組み換えを起こす領域（特開平１−１６
８２７９号）が例示される。バキュロウイルスの増殖に
非必須な領域としては、ポリヘドリン遺伝子（サイエン
ス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２１９、７１５−７２１（１９
８３））などが例示される。
【００１１】また、本発明で用いられるプロモーターと
は、合成・天然を問わず遺伝子を組み込むウイルスが保
有する転写の系でプロモーターとして有効に機能しうる
ものなら如何なる塩基配列のものでもよく、例えばアビ
ポックスウイルス内で機能するものとしては、例えば、
７．５Ｋポリペプチドをコードするワクチニアウイルス
遺伝子のプロモーター、１１Ｋポリペプチドをコードす
るワクチニアウイルス遺伝子のプロモーター、チミジン
キナーゼをコードするワクチニアウイルス遺伝子のプロ
モーターなどが例示される他、プロモーターとして機能
する限りにおいては、これらの一部を改変したものであ
っても、また、合成されたものであっても良い。このほ
か、初期プロモーターと後期プロモーターの両方の配列
を有する合成プロモーター（A. J. Davidson et. al.,
J. Mol. Biol., 215, 749-769 and 771-784, 1989 ）や
その一部をプロモーター活性が喪失しない範囲での削
除、変更などにより改変されたもの（たとえばＴＴＴＴ
ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＧＧＣＡＴＡＴＡＡＡＴＡＡＴＡＡ
ＴＡＡＡＴＡＣＡＡＴＡＡＴＴＡＡＴＴＡＣＧＣＧＴＡ
ＡＡＡＡＴＴＧＡＡＡＡＡＣＴＡＴＴＣＴＡＡＴＴＴＡ
ＴＴＧＣＡＣＴＣで例示されるもの）をもちいると、組
み換えアビポックスウイルスを接種した宿主が、効率よ
く抗体を産生し、好ましい。更に、バキュロウイルスの
ポリヘドリンをコードする遺伝子のプロモーター（以
下、ポリヘドリンプロモーターという）や１０Ｋポリペ
プチドをコードするバキュロウイルス遺伝子のプロモー
ターなどが例示される。
は、合成・天然を問わず遺伝子を組み込むウイルスが保
有する転写の系でプロモーターとして有効に機能しうる
ものなら如何なる塩基配列のものでもよく、例えばアビ
ポックスウイルス内で機能するものとしては、例えば、
７．５Ｋポリペプチドをコードするワクチニアウイルス
遺伝子のプロモーター、１１Ｋポリペプチドをコードす
るワクチニアウイルス遺伝子のプロモーター、チミジン
キナーゼをコードするワクチニアウイルス遺伝子のプロ
モーターなどが例示される他、プロモーターとして機能
する限りにおいては、これらの一部を改変したものであ
っても、また、合成されたものであっても良い。このほ
か、初期プロモーターと後期プロモーターの両方の配列
を有する合成プロモーター（A. J. Davidson et. al.,
J. Mol. Biol., 215, 749-769 and 771-784, 1989 ）や
その一部をプロモーター活性が喪失しない範囲での削
除、変更などにより改変されたもの（たとえばＴＴＴＴ
ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＧＧＣＡＴＡＴＡＡＡＴＡＡＴＡＡ
ＴＡＡＡＴＡＣＡＡＴＡＡＴＴＡＡＴＴＡＣＧＣＧＴＡ
ＡＡＡＡＴＴＧＡＡＡＡＡＣＴＡＴＴＣＴＡＡＴＴＴＡ
ＴＴＧＣＡＣＴＣで例示されるもの）をもちいると、組
み換えアビポックスウイルスを接種した宿主が、効率よ
く抗体を産生し、好ましい。更に、バキュロウイルスの
ポリヘドリンをコードする遺伝子のプロモーター（以
下、ポリヘドリンプロモーターという）や１０Ｋポリペ
プチドをコードするバキュロウイルス遺伝子のプロモー
ターなどが例示される。
【００１２】最終的に組み換えウイルスを作製するに
は、第二の組み換えベクターをウイルスと混合した後、
宿主として用いる培養細胞に移入し、あるいは第二の組
み換えベクターを予めウイルスで感染させた宿主として
用いる培養細胞に移入し、ベクターＤＮＡとウイルスゲ
ノムＤＮＡの間に相同組み換えを起こさせ、組み換えウ
イルスを構築する。ここで宿主として用いる培養細胞と
は、使用するウイルスが感染・増殖可能なものであれば
特に限定されず、例えば、アビポックスウイルスを用い
る場合、例えば鶏胎児繊維芽細胞（以下、ＣＥＦと称
す）などの鶏胎児繊維芽細胞由来培養細胞が挙げられ、
また、発育鶏卵しょう尿膜なども宿主の範疇に当然含ま
れる。また、バキュロウイルスを用いる場合には、通
常、昆虫培養細胞が使用され、このような細胞の具体例
としては、Ｓｆ９細胞やＢｍＮ細胞などが挙げられる。
培養条件は、予備実験によって容易に決定できるが、具
体的には、Ｓｆ９細胞を用いた場合は１０％ウシ胎児血
清を含む培地で、２８℃で培養することが望ましい。こ
のようにして構築された組み換えウイルスは、常法、例
えばプラークアッセイなどによって純化される。
は、第二の組み換えベクターをウイルスと混合した後、
宿主として用いる培養細胞に移入し、あるいは第二の組
み換えベクターを予めウイルスで感染させた宿主として
用いる培養細胞に移入し、ベクターＤＮＡとウイルスゲ
ノムＤＮＡの間に相同組み換えを起こさせ、組み換えウ
イルスを構築する。ここで宿主として用いる培養細胞と
は、使用するウイルスが感染・増殖可能なものであれば
特に限定されず、例えば、アビポックスウイルスを用い
る場合、例えば鶏胎児繊維芽細胞（以下、ＣＥＦと称
す）などの鶏胎児繊維芽細胞由来培養細胞が挙げられ、
また、発育鶏卵しょう尿膜なども宿主の範疇に当然含ま
れる。また、バキュロウイルスを用いる場合には、通
常、昆虫培養細胞が使用され、このような細胞の具体例
としては、Ｓｆ９細胞やＢｍＮ細胞などが挙げられる。
培養条件は、予備実験によって容易に決定できるが、具
体的には、Ｓｆ９細胞を用いた場合は１０％ウシ胎児血
清を含む培地で、２８℃で培養することが望ましい。こ
のようにして構築された組み換えウイルスは、常法、例
えばプラークアッセイなどによって純化される。
【００１３】本発明の組み換え生ワクチンは、上記のよ
うにして得られる組み換えアビポックスウイルスを有効
成分とするものである。例えば、本発明の組み換えアビ
ポックスウイルスが成育することのできる細胞を、本発
明の組み換えアビポックスウイルスに感染させ、組み換
えアビポックスウイルスが増殖するまで培養する。その
後、細胞を回収し破砕する。この細胞破砕物を遠心分離
機によって遠心分離チューブ中で沈澱物と組み換えアビ
ポックスウイルスを含んだ非細胞依存性の高力価遠心上
清とに分離する。実質的に宿主細胞を含まず、細胞培養
培地と組み換えウイルスを含んだこの遠心上清は、本発
明のワクチンとして使用できる。また、薬理学的に受け
入れられる生理食塩水等の様な物で再構成して使用す
る。遠心上清を凍結乾燥した凍結乾燥ワクチンとしても
使用できる。
うにして得られる組み換えアビポックスウイルスを有効
成分とするものである。例えば、本発明の組み換えアビ
ポックスウイルスが成育することのできる細胞を、本発
明の組み換えアビポックスウイルスに感染させ、組み換
えアビポックスウイルスが増殖するまで培養する。その
後、細胞を回収し破砕する。この細胞破砕物を遠心分離
機によって遠心分離チューブ中で沈澱物と組み換えアビ
ポックスウイルスを含んだ非細胞依存性の高力価遠心上
清とに分離する。実質的に宿主細胞を含まず、細胞培養
培地と組み換えウイルスを含んだこの遠心上清は、本発
明のワクチンとして使用できる。また、薬理学的に受け
入れられる生理食塩水等の様な物で再構成して使用す
る。遠心上清を凍結乾燥した凍結乾燥ワクチンとしても
使用できる。
【００１４】本発明の生ワクチンは、ワクチン中の組み
換えアビポックスウイルスが家禽に感染して防御免疫反
応を引き起こすような方法であれば、どのような方法で
家禽に投与してもよい。例えば、皮膚に引っかき傷をつ
けてワクチンを接種したり、注射針やその他の器具等に
よって、家禽の皮下にワクチン接種することができる。
また、ワクチンを家禽の飲み水に懸濁したり、飼料等の
固形物に混入して、経口接種させることも可能である。
さらに、エアロゾルやスプレーによるワクチンを吸入さ
せる方法、静脈内接種法、筋肉中接種法、腹腔内接種
法、翼膜接種法、発育卵接種法等を用いることもでき
る。
換えアビポックスウイルスが家禽に感染して防御免疫反
応を引き起こすような方法であれば、どのような方法で
家禽に投与してもよい。例えば、皮膚に引っかき傷をつ
けてワクチンを接種したり、注射針やその他の器具等に
よって、家禽の皮下にワクチン接種することができる。
また、ワクチンを家禽の飲み水に懸濁したり、飼料等の
固形物に混入して、経口接種させることも可能である。
さらに、エアロゾルやスプレーによるワクチンを吸入さ
せる方法、静脈内接種法、筋肉中接種法、腹腔内接種
法、翼膜接種法、発育卵接種法等を用いることもでき
る。
【００１５】接種量は、例えば鶏の場合、１羽あたり、
通常、１０2 〜１０7 ＰＦＵ（プラーク形成単位）であ
る。注射する場合には、この量を生理食塩水などの生理
学的に受け入れられる液体で希釈したりして０．０１〜
１ｍｌ程度にすればよい。
通常、１０2 〜１０7 ＰＦＵ（プラーク形成単位）であ
る。注射する場合には、この量を生理食塩水などの生理
学的に受け入れられる液体で希釈したりして０．０１〜
１ｍｌ程度にすればよい。
【００１６】本発明の抗原タンパク質の製造方法は、上
述の方法によって作製され、純化された組み換えバキュ
ロウイルスを宿主である昆虫または昆虫の樹立細胞に感
染させ、感染虫を飼育または感染細胞を培養して抗原タ
ンパク質を発現させることによって実現される。宿主と
して用いられる昆虫または昆虫の樹立細胞とは、通常、
バキュロウイルスベクターの系で宿主として使用される
ものであれば特に制限されるものではないが、例えば、
昆虫としてヨウトウガ、カイコガ、アワヨウトウガ、セ
ロクピア蚕、アルファルファワムシ（Ａｕｔｏｇｒａｐ
ｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒ
ａ ｅｘｉｇｕａ、Ｔｒｉｃｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ等の
幼虫、さなぎ、成虫等の虫体が、また、昆虫の樹立細胞
としてＳｆ細胞（例えばＩＰＬＢ−Ｓｆ−２１ＡＥ細
胞、Ｓｆ９細胞等）、ＴＮ細胞およびＢｍ細胞（例え
ば、ＢｍＮ細胞、ＳＥＳ−ＢｏＭｏ−１５Ａ細胞、ＥＳ
Ｅ−ＢｏＭｏ−１５ＡＩＩ細胞、ＥＩＳＥＳ−ＢｏＭｏ
−１５ＡＩＩｅ細胞、ＮＩＳＥＳ−ＢｏＭｏ−ＣａｍＩ
細胞等）が挙げられる。例えば、バキュロウイルスとし
てＡｃＮＰＶ−ＢｍＮＰＶを用いた場合、Ｓｆ細胞やＢ
ｍ細胞、およびカイコやヨトウガの虫体内（幼虫、成虫
あるいはさなぎ）等の昆虫または昆虫の樹立細胞で増殖
可能である。感染後の宿主の飼育または培養方法は、特
に制限はなく、通常の方法が用いられる。即ち、昆虫を
用いる場合であれば、虫体に本発明の組み換えバキュロ
ウイルスを適当な溶媒に懸濁させ、それを注射して２０
〜３０℃で飼育する方法、昆虫の樹立細胞を用いる場合
であれば、前記細胞へ適当な培地に懸濁した本発明の組
み換えバキュロウイルスを感染させ、２０〜３０℃で培
養する方法等が例示される。飼育または培養後、当業者
によく知られているクロマトグラフィー、塩析による沈
澱、密度勾配遠心等から任意に選択した方法により、目
的とする抗原タンパク質が精製される。こうして得られ
た抗原タンパク質は、コンポネントワクチンとして用い
ることができる。勿論、精製せずに虫体や培養細胞に含
まれた状態のタンパク質であっても本発明のコンポネン
トワクチンとして使用してもよい。
述の方法によって作製され、純化された組み換えバキュ
ロウイルスを宿主である昆虫または昆虫の樹立細胞に感
染させ、感染虫を飼育または感染細胞を培養して抗原タ
ンパク質を発現させることによって実現される。宿主と
して用いられる昆虫または昆虫の樹立細胞とは、通常、
バキュロウイルスベクターの系で宿主として使用される
ものであれば特に制限されるものではないが、例えば、
昆虫としてヨウトウガ、カイコガ、アワヨウトウガ、セ
ロクピア蚕、アルファルファワムシ（Ａｕｔｏｇｒａｐ
ｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒ
ａ ｅｘｉｇｕａ、Ｔｒｉｃｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ等の
幼虫、さなぎ、成虫等の虫体が、また、昆虫の樹立細胞
としてＳｆ細胞（例えばＩＰＬＢ−Ｓｆ−２１ＡＥ細
胞、Ｓｆ９細胞等）、ＴＮ細胞およびＢｍ細胞（例え
ば、ＢｍＮ細胞、ＳＥＳ−ＢｏＭｏ−１５Ａ細胞、ＥＳ
Ｅ−ＢｏＭｏ−１５ＡＩＩ細胞、ＥＩＳＥＳ−ＢｏＭｏ
−１５ＡＩＩｅ細胞、ＮＩＳＥＳ−ＢｏＭｏ−ＣａｍＩ
細胞等）が挙げられる。例えば、バキュロウイルスとし
てＡｃＮＰＶ−ＢｍＮＰＶを用いた場合、Ｓｆ細胞やＢ
ｍ細胞、およびカイコやヨトウガの虫体内（幼虫、成虫
あるいはさなぎ）等の昆虫または昆虫の樹立細胞で増殖
可能である。感染後の宿主の飼育または培養方法は、特
に制限はなく、通常の方法が用いられる。即ち、昆虫を
用いる場合であれば、虫体に本発明の組み換えバキュロ
ウイルスを適当な溶媒に懸濁させ、それを注射して２０
〜３０℃で飼育する方法、昆虫の樹立細胞を用いる場合
であれば、前記細胞へ適当な培地に懸濁した本発明の組
み換えバキュロウイルスを感染させ、２０〜３０℃で培
養する方法等が例示される。飼育または培養後、当業者
によく知られているクロマトグラフィー、塩析による沈
澱、密度勾配遠心等から任意に選択した方法により、目
的とする抗原タンパク質が精製される。こうして得られ
た抗原タンパク質は、コンポネントワクチンとして用い
ることができる。勿論、精製せずに虫体や培養細胞に含
まれた状態のタンパク質であっても本発明のコンポネン
トワクチンとして使用してもよい。
【００１７】
【発明の効果】かくして、本発明によればアビポックス
ウイルスの増殖に非必須なゲノム領域にマイコプラズマ
・ガリセプティカム由来の抗原をコードするＤＮＡがプ
ロモーター機能を有するＤＮＡと共に発現可能な形で組
み込まれた組み換えアビポックスウイルスが得られ、こ
のような組み換えアビポックスウイルスを生ワクチンと
して鶏に接種することでマイコプラズマ・ガリセプティ
カム由来抗原に対する抗体を得ることができる。更に、
本発明の組み換えバキュロウイルスを用いれば従来の技
術に比較して効率よくマイコプラズマ・ガリセプティカ
ム抗原タンパク質を製造することができる。また、本発
明の新規な抗原タンパク質は、家禽マイコプラズマ・ガ
リセプティカム感染症に対するワクチンとして有用であ
ると共に、マイコプラズマ・ガリセプティカム感染症診
断薬としても有用である。
ウイルスの増殖に非必須なゲノム領域にマイコプラズマ
・ガリセプティカム由来の抗原をコードするＤＮＡがプ
ロモーター機能を有するＤＮＡと共に発現可能な形で組
み込まれた組み換えアビポックスウイルスが得られ、こ
のような組み換えアビポックスウイルスを生ワクチンと
して鶏に接種することでマイコプラズマ・ガリセプティ
カム由来抗原に対する抗体を得ることができる。更に、
本発明の組み換えバキュロウイルスを用いれば従来の技
術に比較して効率よくマイコプラズマ・ガリセプティカ
ム抗原タンパク質を製造することができる。また、本発
明の新規な抗原タンパク質は、家禽マイコプラズマ・ガ
リセプティカム感染症に対するワクチンとして有用であ
ると共に、マイコプラズマ・ガリセプティカム感染症診
断薬としても有用である。
【００１８】以下本発明を実施例および参考例により説
明するが、本発明は勿論これらにより限定されるもので
はない。
明するが、本発明は勿論これらにより限定されるもので
はない。
【００１９】〔参考例−１〕マイコプラズマ・ガリセプ
ティカムが発現しているポリペプチド遺伝子ＴＴＭ−１
の取得 （１） マイコプラズマ・ガリセプティカム・ゲノムＤ
ＮＡの調製 マイコプラズマ・ガリセプティカムＳ６株を１００ｍｌ
のＰＰＬＯブロス基礎培地に２０％馬血清、５％酵母エ
キス、１％グルコース、およびｐＨ指示薬としてフェノ
ールレッドを微量加えて調製した液体培地で、３７℃３
〜５日培養した。マイコプラズマ・ガリセプティカムの
増殖に従って培養液のｐＨが下がり、培養液に含まれて
いるｐＨ指示薬の呈色が赤から黄に変化した時点で、培
養を終了し、培養液を８０００Ｇ、２０分間遠心し、集
菌した。さらに菌体を培養液の１／１０容量のＰＢＳに
懸濁し、再び１０，０００ｒｐｍ×Ｇ、２０分間遠心
し、集菌した。収集菌体を再び２．７ｍｌのＰＢＳに懸
濁し、１％になる様にＳＤＳを、さらに１０μｇのＲＮ
ａｓｅを加え、３７℃３０分間インキュベートし溶菌し
た。溶菌液を等容量のフェノールで３回抽出しさらに、
エチルエーテルで３回抽出を行なった後エタノール沈澱
し、マイコプラズマ・ガリセプティカム・ゲノムＤＮＡ
２００μｇを得た。
ティカムが発現しているポリペプチド遺伝子ＴＴＭ−１
の取得 （１） マイコプラズマ・ガリセプティカム・ゲノムＤ
ＮＡの調製 マイコプラズマ・ガリセプティカムＳ６株を１００ｍｌ
のＰＰＬＯブロス基礎培地に２０％馬血清、５％酵母エ
キス、１％グルコース、およびｐＨ指示薬としてフェノ
ールレッドを微量加えて調製した液体培地で、３７℃３
〜５日培養した。マイコプラズマ・ガリセプティカムの
増殖に従って培養液のｐＨが下がり、培養液に含まれて
いるｐＨ指示薬の呈色が赤から黄に変化した時点で、培
養を終了し、培養液を８０００Ｇ、２０分間遠心し、集
菌した。さらに菌体を培養液の１／１０容量のＰＢＳに
懸濁し、再び１０，０００ｒｐｍ×Ｇ、２０分間遠心
し、集菌した。収集菌体を再び２．７ｍｌのＰＢＳに懸
濁し、１％になる様にＳＤＳを、さらに１０μｇのＲＮ
ａｓｅを加え、３７℃３０分間インキュベートし溶菌し
た。溶菌液を等容量のフェノールで３回抽出しさらに、
エチルエーテルで３回抽出を行なった後エタノール沈澱
し、マイコプラズマ・ガリセプティカム・ゲノムＤＮＡ
２００μｇを得た。
【００２０】（２） ＴＭ−１遺伝子をプローブにした
マイコプラズマ・ガリセプティカムのゲノミックサザン
ハイブリダイゼーション 上記（１）で取得したマイコプラズマ・ガリセプティカ
ムＤＮＡ１μｇをＸｂａＩで消化し、０．６％低融点ア
ガロースゲル電気泳動に供した。泳動後ゲルをアルカリ
変性液（０．５Ｍ ＮａＯＨ、１．５Ｍ ＮａＣｌ）に
１０分間浸しＤＮＡを変性させ、中和液（３Ｍ酢酸ナト
リウムｐＨ５．５）に１０分間浸して中和の後６倍ＳＳ
Ｃ液（０．７Ｍ ＮａＣｌ、０．０７Ｍクエン酸ナトリ
ウム、ｐＨ７．５）中でナイロンメンブレンに転写し
た。風乾の後８０℃で２時間焼き付け、４倍ＳＥＴ
（０．６Ｍ ＮａＣｌ、０．０８Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ、４ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ７．８）−１０倍Ｄｅｎｈａ
ｒｄｔ−０．１％ ＳＤＳ−０．１％Ｎａ4 Ｐ2 Ｏ7 −
５０μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡとｐＵＭ−１（特開
平２−１１１７９５号参照）を常法に従い標識したもの
を加えて、６８℃１４時間ハイブリダイゼーションをし
た。ナイロンメンブレンとＸ線フィルムを重ね、オート
ラジオグラフィーで確認したところ、約３．４ｋｂｐの
断片にハイブリダイズしていることを確認した。
マイコプラズマ・ガリセプティカムのゲノミックサザン
ハイブリダイゼーション 上記（１）で取得したマイコプラズマ・ガリセプティカ
ムＤＮＡ１μｇをＸｂａＩで消化し、０．６％低融点ア
ガロースゲル電気泳動に供した。泳動後ゲルをアルカリ
変性液（０．５Ｍ ＮａＯＨ、１．５Ｍ ＮａＣｌ）に
１０分間浸しＤＮＡを変性させ、中和液（３Ｍ酢酸ナト
リウムｐＨ５．５）に１０分間浸して中和の後６倍ＳＳ
Ｃ液（０．７Ｍ ＮａＣｌ、０．０７Ｍクエン酸ナトリ
ウム、ｐＨ７．５）中でナイロンメンブレンに転写し
た。風乾の後８０℃で２時間焼き付け、４倍ＳＥＴ
（０．６Ｍ ＮａＣｌ、０．０８Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ、４ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ７．８）−１０倍Ｄｅｎｈａ
ｒｄｔ−０．１％ ＳＤＳ−０．１％Ｎａ4 Ｐ2 Ｏ7 −
５０μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡとｐＵＭ−１（特開
平２−１１１７９５号参照）を常法に従い標識したもの
を加えて、６８℃１４時間ハイブリダイゼーションをし
た。ナイロンメンブレンとＸ線フィルムを重ね、オート
ラジオグラフィーで確認したところ、約３．４ｋｂｐの
断片にハイブリダイズしていることを確認した。
【００２１】（３） ＸｂａＩ消化約３．４ｋｐｂ断片
のｐＵＣ−１９へのクローニング及びコロニーハイブリ
ダイゼーション 上記１−（１）で取得したマイコプラズマ・ガリセプテ
ィカムＤＮＡ４μｇを制限酵素ＸｂａＩで消化後、０．
６％低融点アガロースゲル電気泳動後、約３．４ｋｂｐ
の断片を回収した。この断片を、ＸｂａＩ消化によって
開裂したｐＵＣ−１９とリガーゼによって連結し、コン
ピテントな大腸菌ＴＧ１株を形質転換し、５−ブロモ−
４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノ
シド０．００３％、イソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラク
トピラノシド０．０３ｍＭ、４０μｇ／ｍｌアンピシリ
ンを含むＬＢ寒天培地で３７℃、１５時間培養した。こ
の培地上に生育した白コロニーをナイロンメンブレンに
転写し、上記（２）と同様の方法でハイブリダイゼーシ
ョンを行ない、オートラジオグラフィーで確認したとこ
ろ、クローニングされていることが判明し、このプラス
ミドをｐＵＴＴＭ１と名付けた。
のｐＵＣ−１９へのクローニング及びコロニーハイブリ
ダイゼーション 上記１−（１）で取得したマイコプラズマ・ガリセプテ
ィカムＤＮＡ４μｇを制限酵素ＸｂａＩで消化後、０．
６％低融点アガロースゲル電気泳動後、約３．４ｋｂｐ
の断片を回収した。この断片を、ＸｂａＩ消化によって
開裂したｐＵＣ−１９とリガーゼによって連結し、コン
ピテントな大腸菌ＴＧ１株を形質転換し、５−ブロモ−
４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノ
シド０．００３％、イソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラク
トピラノシド０．０３ｍＭ、４０μｇ／ｍｌアンピシリ
ンを含むＬＢ寒天培地で３７℃、１５時間培養した。こ
の培地上に生育した白コロニーをナイロンメンブレンに
転写し、上記（２）と同様の方法でハイブリダイゼーシ
ョンを行ない、オートラジオグラフィーで確認したとこ
ろ、クローニングされていることが判明し、このプラス
ミドをｐＵＴＴＭ１と名付けた。
【００２２】〔参考例−２〕 （１） ＴＴＭ−１がコードするタンパクＴＴＭＧ１
を、ＴＧＡが翻訳終結コドンとして読まれないように改
変（ＴＧＡ→ＴＧＧ）したＴＴＭ−１′の作製（図７参
照） 参考例１−（３）のｐＵＴＴＭ−１を制限酵素ＳａｃＩ
とＥｃｏＲＩで消化後０．８％低融点アガロースゲル電
気泳動に供し、ＴＴＭ−１の５′端を含む１．１ｋｂｐ
の断片をフェノール−クロロホルム処理後エタノール沈
澱により回収し、Ｍ１３ｍｐ１１ファージをＳａｃＩと
ＥｃｏＲＩで開裂させた断片とリガーゼにより連結し
た。この反応溶液と、３７℃で２４時間培養した大腸菌
ＴＧ１に最終的に１００ｍＭとなるようにＩＰＴＧを加
えてＸ−ｇａｌが２％となるようにさらに加えた溶液と
ｍ．ｏ．ｉ．が０．１になるよう混合し軟寒天上に撒い
て固化させ、３７℃、２４時間インキュベートする。出
現したファージプラークのうち青変していないファージ
からＴＴＭ−１の１．１ｋｂｐＤＮＡを含む組み換えフ
ァージＴＴＭ−１Ｎを得た。同様に、ｐＵＴＴＭ−１を
ＥｃｏＲＩとＥｃｏＲＶで消化後、０．８％低融点アガ
ロースゲル電気泳動に供し、ＴＴＭ−１の３′末端側を
含む０．４ｋｂｐの断片をゲルより回収し、フェノール
・クロロホルム処理後エタノール沈澱により回収し、Ｍ
１３ｍｐ１０ファージをＥｃｏＲＩとＥｃｏＲＶで開裂
させた断片とリガーゼにより連結した。この反応溶液を
１．１ｋｂｐＤＮＡのクローニングと同様の方法で、Ｔ
ＴＭ−１の０．４ｋｂｐＤＮＡを含む組み換えファージ
ＴＴＭ−１Ｃを得た。 （２）各組み換えファージから一本鎖ＤＮＡの調製 上記（１）で得られた二種類の組み換えファージについ
て、１００ｍｌの２×ＹＴ培地で３７℃で増殖している
大腸菌ＴＧ１にｍ．ｏ．ｉ．＝０．１になるようにそれ
ぞれ加え、３７℃で５時間振盪培養後５０００ｇで３０
分遠心分離し、大腸菌菌体成分を除いた上清を取得す
る。この上清に０．２倍量のポリエチレングリコール／
塩化ナトリウム混合溶液（２０％ポリエチレングリコー
ル＃６０００、２．５Ｍ ＮａＣｌ）を加え４℃で１時
間静置後５０００ｇで２０分遠心分離し、沈澱を回収す
る。この沈澱を５００μｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭＴｒ
ｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）に溶か
し、フェノール・クロロホルム抽出後、エタノール沈澱
で各組み換えファージの単鎖ＤＮＡを回収した。
を、ＴＧＡが翻訳終結コドンとして読まれないように改
変（ＴＧＡ→ＴＧＧ）したＴＴＭ−１′の作製（図７参
照） 参考例１−（３）のｐＵＴＴＭ−１を制限酵素ＳａｃＩ
とＥｃｏＲＩで消化後０．８％低融点アガロースゲル電
気泳動に供し、ＴＴＭ−１の５′端を含む１．１ｋｂｐ
の断片をフェノール−クロロホルム処理後エタノール沈
澱により回収し、Ｍ１３ｍｐ１１ファージをＳａｃＩと
ＥｃｏＲＩで開裂させた断片とリガーゼにより連結し
た。この反応溶液と、３７℃で２４時間培養した大腸菌
ＴＧ１に最終的に１００ｍＭとなるようにＩＰＴＧを加
えてＸ−ｇａｌが２％となるようにさらに加えた溶液と
ｍ．ｏ．ｉ．が０．１になるよう混合し軟寒天上に撒い
て固化させ、３７℃、２４時間インキュベートする。出
現したファージプラークのうち青変していないファージ
からＴＴＭ−１の１．１ｋｂｐＤＮＡを含む組み換えフ
ァージＴＴＭ−１Ｎを得た。同様に、ｐＵＴＴＭ−１を
ＥｃｏＲＩとＥｃｏＲＶで消化後、０．８％低融点アガ
ロースゲル電気泳動に供し、ＴＴＭ−１の３′末端側を
含む０．４ｋｂｐの断片をゲルより回収し、フェノール
・クロロホルム処理後エタノール沈澱により回収し、Ｍ
１３ｍｐ１０ファージをＥｃｏＲＩとＥｃｏＲＶで開裂
させた断片とリガーゼにより連結した。この反応溶液を
１．１ｋｂｐＤＮＡのクローニングと同様の方法で、Ｔ
ＴＭ−１の０．４ｋｂｐＤＮＡを含む組み換えファージ
ＴＴＭ−１Ｃを得た。 （２）各組み換えファージから一本鎖ＤＮＡの調製 上記（１）で得られた二種類の組み換えファージについ
て、１００ｍｌの２×ＹＴ培地で３７℃で増殖している
大腸菌ＴＧ１にｍ．ｏ．ｉ．＝０．１になるようにそれ
ぞれ加え、３７℃で５時間振盪培養後５０００ｇで３０
分遠心分離し、大腸菌菌体成分を除いた上清を取得す
る。この上清に０．２倍量のポリエチレングリコール／
塩化ナトリウム混合溶液（２０％ポリエチレングリコー
ル＃６０００、２．５Ｍ ＮａＣｌ）を加え４℃で１時
間静置後５０００ｇで２０分遠心分離し、沈澱を回収す
る。この沈澱を５００μｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭＴｒ
ｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）に溶か
し、フェノール・クロロホルム抽出後、エタノール沈澱
で各組み換えファージの単鎖ＤＮＡを回収した。
【００２３】（３） 人工合成オリゴヌクレオチドをプ
ライマーとする位置特異的変異体の作製 このようにして得られたＤＮＡには、配列の途中にＴＧ
Ａがある。このＴＧＡは、通常の細胞内では、終止コド
ンとして認識されてしまい、これより後ろに付加してい
る配列を翻訳しなくなる。そこで、ＴＧＡ部分をメチオ
ニンとして翻訳するようにコドンＮＮＮの第３番目の塩
基に当たる塩基アデニンをグアニンに改変するために、
次の２つのオリゴヌクレオチドを合成した。
ライマーとする位置特異的変異体の作製 このようにして得られたＤＮＡには、配列の途中にＴＧ
Ａがある。このＴＧＡは、通常の細胞内では、終止コド
ンとして認識されてしまい、これより後ろに付加してい
る配列を翻訳しなくなる。そこで、ＴＧＡ部分をメチオ
ニンとして翻訳するようにコドンＮＮＮの第３番目の塩
基に当たる塩基アデニンをグアニンに改変するために、
次の２つのオリゴヌクレオチドを合成した。
【００２４】
【化１】３′−ＴＡＣＧＴＴＣＴＴＣＣＴＧＧＣＡＡＡ
ＣＣＴＴＡＣＣＡＣＴＡＣＴＴ−５′
ＣＣＴＴＡＣＣＡＣＴＡＣＴＴ−５′
【００２５】
【化２】３′−ＣＴＡＣＡＡＡＧＡＡＣＣＴＡＡＡＴＡ
ＴＣＡ−５′
ＴＣＡ−５′
【００２６】化１のオリゴヌクレオチドはＴＴＭ−１Ｎ
の単鎖ＤＮＡと、化２のオリゴヌクレオチドはＴＴＭ−
１Ｃの単鎖ＤＮＡとをアニールさせ、Ｆｒｉｔｓ Ｅｃ
ｋｓｔｅｉｎらの方法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒ
ｅｓｅａｒｃｈ ８７４９−８７６４、１９８５）によ
って、目的の変異をおこさせて、得られた組み換えファ
ージを各々ＴＴＭ−１Ｎ′、ＴＴＭ−１Ｃ′と命名し
た。得られたＴＴＭ−１Ｎ′、ＴＴＭ−１Ｃ′ファージ
ＤＮＡをそれぞれ制限酵素ＳａｃＩ−ＥｃｏＲＩ、Ｅｃ
ｏＲＩ−ＢｇｌIIで切断し、０．８％低融点アガロース
電気泳動によって１．１ｋｂｐ、０．４ｋｂｐの断片を
アガロースゲルより抽出し、エタノール沈澱で回収し
た。一方プラスミドｐＵＴＴＭ−１もＳａｃＩ−Ｂｇｌ
IIで切断し、４．８ｋｂｐのベクターを含む断片を０．
８％低融点アガロースゲル電気泳動から回収し、エタノ
ール沈澱で回収した。こうして得られた３つの断片をリ
ガーゼにより連結し、コンピテントな大腸菌ＴＧ１株を
形質転換し、目的の位置に変異がおきたＴＴＭ−１′を
持つプラスミドｐＵＴＴＭ−１′を得た。ＴＴＭ−１′
の塩基配列は、SaugarらのDideoxy 法（Proc. Natl. Ac
od. Sci. USA、７４、５４６３（１９７７））によれば
図５および図６に示す通りであった。これは、天然のM.
gallisepticumの４０キロダルトンのＴＴＭ−１ポリペ
プチドと実質的に同一のものである。
の単鎖ＤＮＡと、化２のオリゴヌクレオチドはＴＴＭ−
１Ｃの単鎖ＤＮＡとをアニールさせ、Ｆｒｉｔｓ Ｅｃ
ｋｓｔｅｉｎらの方法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒ
ｅｓｅａｒｃｈ ８７４９−８７６４、１９８５）によ
って、目的の変異をおこさせて、得られた組み換えファ
ージを各々ＴＴＭ−１Ｎ′、ＴＴＭ−１Ｃ′と命名し
た。得られたＴＴＭ−１Ｎ′、ＴＴＭ−１Ｃ′ファージ
ＤＮＡをそれぞれ制限酵素ＳａｃＩ−ＥｃｏＲＩ、Ｅｃ
ｏＲＩ−ＢｇｌIIで切断し、０．８％低融点アガロース
電気泳動によって１．１ｋｂｐ、０．４ｋｂｐの断片を
アガロースゲルより抽出し、エタノール沈澱で回収し
た。一方プラスミドｐＵＴＴＭ−１もＳａｃＩ−Ｂｇｌ
IIで切断し、４．８ｋｂｐのベクターを含む断片を０．
８％低融点アガロースゲル電気泳動から回収し、エタノ
ール沈澱で回収した。こうして得られた３つの断片をリ
ガーゼにより連結し、コンピテントな大腸菌ＴＧ１株を
形質転換し、目的の位置に変異がおきたＴＴＭ−１′を
持つプラスミドｐＵＴＴＭ−１′を得た。ＴＴＭ−１′
の塩基配列は、SaugarらのDideoxy 法（Proc. Natl. Ac
od. Sci. USA、７４、５４６３（１９７７））によれば
図５および図６に示す通りであった。これは、天然のM.
gallisepticumの４０キロダルトンのＴＴＭ−１ポリペ
プチドと実質的に同一のものである。
【００２７】 参考例３ 挿入用ベクターｐＮＺ１７２９Ｒの構築 ＮＰ株のＥｃｏＲＩ断片（約７．３ｋｂｐ）をｐＵＣ１
８のＥｃｏＲＩ切断部位（マルチクローニング部位の末
端）に組み込んでプラスミドｐＮＺ１３３（約１０．０
ｋｂｐ）を得た。このプラスミドから、ＨｐａＩ−Ｓｐ
ｅＩ断片（約３．０ｋｂｐのＮＰ株由来断片）を切り出
し、クレノー（Ｋｌｅｎｏｗ）断片により平滑末端とし
た。またｐＵＣ１８からＲｃｏＲＩ−Ｈｉｎｄ III断片
（５２ｂｐのマルチクローニング部位）を除き、クレノ
ー断片で平滑末端とした。この２つの断片をつないで、
プラスミドとし、ＨｐａＩ−ＳｐｅＩ断片中のＥｃｏＲ
Ｖ部位を除いて、そこにｐＵＣ１８のＥｃｏＲＩ−Ｈｉ
ｎｄ III断片（５２ｂｐのマルチクローニング部位）を
Ｈｉｎｄ IIIリンカー（５′−ＣＡＡＧＣＴＴＧ−
３′）とＥｃｏＲＩリンカー（５′−ＧＧＡＡＴＴＣＣ
−３′）を用いて組み込み、プラスミドｐＮＺ１３３Ｓ
Ｒを構築した。
８のＥｃｏＲＩ切断部位（マルチクローニング部位の末
端）に組み込んでプラスミドｐＮＺ１３３（約１０．０
ｋｂｐ）を得た。このプラスミドから、ＨｐａＩ−Ｓｐ
ｅＩ断片（約３．０ｋｂｐのＮＰ株由来断片）を切り出
し、クレノー（Ｋｌｅｎｏｗ）断片により平滑末端とし
た。またｐＵＣ１８からＲｃｏＲＩ−Ｈｉｎｄ III断片
（５２ｂｐのマルチクローニング部位）を除き、クレノ
ー断片で平滑末端とした。この２つの断片をつないで、
プラスミドとし、ＨｐａＩ−ＳｐｅＩ断片中のＥｃｏＲ
Ｖ部位を除いて、そこにｐＵＣ１８のＥｃｏＲＩ−Ｈｉ
ｎｄ III断片（５２ｂｐのマルチクローニング部位）を
Ｈｉｎｄ IIIリンカー（５′−ＣＡＡＧＣＴＴＧ−
３′）とＥｃｏＲＩリンカー（５′−ＧＧＡＡＴＴＣＣ
−３′）を用いて組み込み、プラスミドｐＮＺ１３３Ｓ
Ｒを構築した。
【００２８】配列１（配列番号１）と配列２（配列番号
２）（１７ベースのＦＶＰプロモーターを含み、ｌａｃ
Ｚのための翻訳開始コドンが連なっている）をアニーリ
ングして２本鎖にし、ｌａｃＺ遺伝子（ｐＭＣ１８７１
及びｐＭＡ００１由来、Ｓｉｒａｋａｗａ ｅｔ．ａ
ｌ．，Ｇｅｎｅ，２８，１２７−１３２，１９８４）と
アニーリングした配列３（配列番号３）と配列４（配列
番号４）、配列５（配列番号５）と配列６（配列番号
６）、配列７（配列番号７）と配列８（配列番号８）、
配列９（配列番号９）と配列１０（配列番号１０）とを
結合させ（配列３の５′側末端のＡＧＣの次のＴから配
列５の３′側末端のＧの前のＣまでに塩基配列ＴＴＴＴ
ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＧＧＣＡＴＡＴＡＡ
ＡＴＡＡＴＡＡＡＴＡＣＡＡＴＡＡＴＴＡＡＴＴＡＣＧ
ＣＧＴＡＡＡＡＡＴＴＧＡＡＡＡＡＣＴＡＴＴＣＴＡＡ
ＴＴＴＡＴＴＧＣＡＣＴＣで示されるポックスウイルス
の合成プロモーターの改変物を含み、さらにマルチクロ
ーニング部位及び両方向のポックスウイルス初期転写終
結信号（配列番号１１）（Ｙｕｅｎ ｅｔ．ａｌ．，Ｐ
ＮＡＳ，８８，６４１７−６４２１，１９８９年）が連
なっている）、ＥｃｏＲＩ−Ｈｉｎｄ III断片（約３．
５ｋｂｐ、図１の中央に示す）を得た。そのＥｃｏＲＩ
−Ｈｉｎｄ III断片を、ｐＮＺ１３３ＳＲに挿入し、プ
ラスミドｐＮＺ１７２９Ｒを完成させた。
２）（１７ベースのＦＶＰプロモーターを含み、ｌａｃ
Ｚのための翻訳開始コドンが連なっている）をアニーリ
ングして２本鎖にし、ｌａｃＺ遺伝子（ｐＭＣ１８７１
及びｐＭＡ００１由来、Ｓｉｒａｋａｗａ ｅｔ．ａ
ｌ．，Ｇｅｎｅ，２８，１２７−１３２，１９８４）と
アニーリングした配列３（配列番号３）と配列４（配列
番号４）、配列５（配列番号５）と配列６（配列番号
６）、配列７（配列番号７）と配列８（配列番号８）、
配列９（配列番号９）と配列１０（配列番号１０）とを
結合させ（配列３の５′側末端のＡＧＣの次のＴから配
列５の３′側末端のＧの前のＣまでに塩基配列ＴＴＴＴ
ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＧＧＣＡＴＡＴＡＡ
ＡＴＡＡＴＡＡＡＴＡＣＡＡＴＡＡＴＴＡＡＴＴＡＣＧ
ＣＧＴＡＡＡＡＡＴＴＧＡＡＡＡＡＣＴＡＴＴＣＴＡＡ
ＴＴＴＡＴＴＧＣＡＣＴＣで示されるポックスウイルス
の合成プロモーターの改変物を含み、さらにマルチクロ
ーニング部位及び両方向のポックスウイルス初期転写終
結信号（配列番号１１）（Ｙｕｅｎ ｅｔ．ａｌ．，Ｐ
ＮＡＳ，８８，６４１７−６４２１，１９８９年）が連
なっている）、ＥｃｏＲＩ−Ｈｉｎｄ III断片（約３．
５ｋｂｐ、図１の中央に示す）を得た。そのＥｃｏＲＩ
−Ｈｉｎｄ III断片を、ｐＮＺ１３３ＳＲに挿入し、プ
ラスミドｐＮＺ１７２９Ｒを完成させた。
【００２９】
【実施例−１】 組み換え用プラスミドｐＮＺ７９２９−Ｒ１の構築（図
８参照）
８参照）
【００３０】１−１ 合成プロモーターとＴＴＭ−１遺
伝子を結合したプラスミドｐＵＴＴＭ１Ｐの構築 参考例２で得たＴＴＭ−１ ＤＮＡ全長を含むプラスミ
ドｐＵＴＴＭ１′（特許出願平成４年第１３８８１９
号）のうちＴＴＭ−１ポリペプチドの開始コドンにあた
るＡＴＧの上流に制限酵素ＤｒａＩ切断部位をつくるた
めに、まず次のオリゴヌクレオチドを合成した。 ３′−TATAGAATTAAATTTTACTTATTC−５′ つぎに、ｐＵＴＴＭ−１′を制限酵素ＳａｃＩとＥｃｏ
ＲＩで消化後約２３００ｂｐの断片を回収し、Ｍ１３ｍ
ｐ１０のＳａｃＩとＥｃｏＲＩで開裂させた断片と連結
し組み換えファージＴＴＭ−１′を得た。上記オリゴヌ
クレオチドと単鎖ＴＴＭ−１′とをアニールさせ、Frit
s Ecksteinらの方法（Nucleic Acid Research 8749-876
4, 1985 ）によって目的の変異をおこさせた。この変異
組み換えファージＤＮＡを制限酵素ＳａｃＩとＥｃｏＲ
Ｉで消化後約２３００ｂｐの断片を回収し、再びｐＵＴ
ＴＭ−１′をＳａｃＩとＥｃｏＲＩで消化したベクター
を含んだ断片にクローニングし、ｐＵＴＴＭ１Ｄを得
た。合成プロモーターは配列−１２と配列−１３のＤＮ
Ａを合成し、アニーリングして末端に制限酵素Ｈｉｎｄ
IIIとＨｉｎｃ II 切断部位ができるように作製した。
伝子を結合したプラスミドｐＵＴＴＭ１Ｐの構築 参考例２で得たＴＴＭ−１ ＤＮＡ全長を含むプラスミ
ドｐＵＴＴＭ１′（特許出願平成４年第１３８８１９
号）のうちＴＴＭ−１ポリペプチドの開始コドンにあた
るＡＴＧの上流に制限酵素ＤｒａＩ切断部位をつくるた
めに、まず次のオリゴヌクレオチドを合成した。 ３′−TATAGAATTAAATTTTACTTATTC−５′ つぎに、ｐＵＴＴＭ−１′を制限酵素ＳａｃＩとＥｃｏ
ＲＩで消化後約２３００ｂｐの断片を回収し、Ｍ１３ｍ
ｐ１０のＳａｃＩとＥｃｏＲＩで開裂させた断片と連結
し組み換えファージＴＴＭ−１′を得た。上記オリゴヌ
クレオチドと単鎖ＴＴＭ−１′とをアニールさせ、Frit
s Ecksteinらの方法（Nucleic Acid Research 8749-876
4, 1985 ）によって目的の変異をおこさせた。この変異
組み換えファージＤＮＡを制限酵素ＳａｃＩとＥｃｏＲ
Ｉで消化後約２３００ｂｐの断片を回収し、再びｐＵＴ
ＴＭ−１′をＳａｃＩとＥｃｏＲＩで消化したベクター
を含んだ断片にクローニングし、ｐＵＴＴＭ１Ｄを得
た。合成プロモーターは配列−１２と配列−１３のＤＮ
Ａを合成し、アニーリングして末端に制限酵素Ｈｉｎｄ
IIIとＨｉｎｃ II 切断部位ができるように作製した。
【００３１】
【００３２】最後に、ｐＵＴＴＭ１Ｄを制限酵素Ｄｒａ
ＩとＢａｌ II の消化回収断片１２００ｂｐと上記合成
プロモーターとｐＵＣ１８のＨｉｎｄ III，ＢａｍＨＩ
開裂断片を連結し、ｐＵＴＴＭ１Ｐを得た。
ＩとＢａｌ II の消化回収断片１２００ｂｐと上記合成
プロモーターとｐＵＣ１８のＨｉｎｄ III，ＢａｍＨＩ
開裂断片を連結し、ｐＵＴＴＭ１Ｐを得た。
【００３３】１−２ ｐＮＺ７９２９Ｒ１の構築 １−１によって得られたプラスミドｐＵＴＴＭ１Ｐを制
限酵素Ｈｉｎｄ IIIとＫｐｎＩで消化後、約１３００ｂ
ｐの断片を回収する。次に、参考例３で得たＦＰＶ組み
換え用ベクターｐＮＺ１７２９Ｒ（特許出願平成４年第
１６７４７８号）を制限酵素Ｈｉｎｄ IIIとＫｐｎＩで
開裂させた。この二つの断片を連結し、目的の組み換え
用ベクターｐＮＺ７９２９−Ｒ１を得た。
限酵素Ｈｉｎｄ IIIとＫｐｎＩで消化後、約１３００ｂ
ｐの断片を回収する。次に、参考例３で得たＦＰＶ組み
換え用ベクターｐＮＺ１７２９Ｒ（特許出願平成４年第
１６７４７８号）を制限酵素Ｈｉｎｄ IIIとＫｐｎＩで
開裂させた。この二つの断片を連結し、目的の組み換え
用ベクターｐＮＺ７９２９−Ｒ１を得た。
【００３４】
【実施例−２】 組み換えＦＰＶ ｆＮＺ７９２９−Ｒ１の作製と純化
【００３５】単層のＣＥＦに鶏痘生ワクチン株であるＮ
Ｐ株をm. o. i.＝０．１で感染した。３時間後、これら
の細胞をトリプシン処理で剥がし、細胞懸濁液とした。
この懸濁液の２×１０7 個の細胞と１０μｇの組み換え
用プラスミドｐＮＺ７９２９−Ｒ１を混合し、Ｓａｌｉ
ｎｅＧ（０．１４Ｍ ＮａＣｌ，０．５ｍＭ ＫＣｌ，
１．１ｍＭ Ｎａ2 ＨＰＯ4 ，１．５ｍＭ ＫＨ2 ＰＯ
4 ，０．５ｍＭ ＭｇＣｌ2 ６Ｈ2 Ｏ ０．０１１％グ
ルコース）に懸濁し、室温においてジーンパルサー（Ｂ
ｉｏ−Ｒａｄ社）を用いて３．０ｋＶｃｍ-1，０．４ms
ec，２５℃の条件下でエレクトロポレーションした。プ
ラスミドを導入した細胞を、その後３７℃，７２時間培
養し、３回の凍結融解によって細胞を溶解し、組み換え
ウイルスを含むウイルスを回収した。
Ｐ株をm. o. i.＝０．１で感染した。３時間後、これら
の細胞をトリプシン処理で剥がし、細胞懸濁液とした。
この懸濁液の２×１０7 個の細胞と１０μｇの組み換え
用プラスミドｐＮＺ７９２９−Ｒ１を混合し、Ｓａｌｉ
ｎｅＧ（０．１４Ｍ ＮａＣｌ，０．５ｍＭ ＫＣｌ，
１．１ｍＭ Ｎａ2 ＨＰＯ4 ，１．５ｍＭ ＫＨ2 ＰＯ
4 ，０．５ｍＭ ＭｇＣｌ2 ６Ｈ2 Ｏ ０．０１１％グ
ルコース）に懸濁し、室温においてジーンパルサー（Ｂ
ｉｏ−Ｒａｄ社）を用いて３．０ｋＶｃｍ-1，０．４ms
ec，２５℃の条件下でエレクトロポレーションした。プ
ラスミドを導入した細胞を、その後３７℃，７２時間培
養し、３回の凍結融解によって細胞を溶解し、組み換え
ウイルスを含むウイルスを回収した。
【００３６】回収した組み換えウイルスはつぎのように
して選択した。回収したウイルス液を単層のＣＥＦに感
染させ生育培地を含んだ１０ｍｌの寒天溶液を重層し
た。室温中で寒天を固めたのち、ＦＰＶのプラークが出
現するまで３７℃で培養後ブルオギャル（Bluo gal）を
２００μｇ／ｍｌの濃度でふくんだ寒天培地を重層し、
さらに４８時間３７℃で培養した。前プラークのうち約
１％のプラークが青く発色した。これらの青いプラーク
を単離・回収して、さらに同様の操作によって単離・回
収を繰り返し、すべてのプラークがブルオギャルで青く
染まるまでウイルスの純化を行った。通常この繰り返し
操作は３〜４回で終了する。この純化されたウイルスを
ｆＮＺ７９２９−Ｒ１と名付けた。ｆＮＺ７９２９−Ｒ
１はドットブロットハイブリダイゼーション，サザンブ
ロットハイブリダイゼーションによってＴＴＭ−１，ｌ
ａｃＺ遺伝子ともに予想通りの位置にあることを確認し
た。
して選択した。回収したウイルス液を単層のＣＥＦに感
染させ生育培地を含んだ１０ｍｌの寒天溶液を重層し
た。室温中で寒天を固めたのち、ＦＰＶのプラークが出
現するまで３７℃で培養後ブルオギャル（Bluo gal）を
２００μｇ／ｍｌの濃度でふくんだ寒天培地を重層し、
さらに４８時間３７℃で培養した。前プラークのうち約
１％のプラークが青く発色した。これらの青いプラーク
を単離・回収して、さらに同様の操作によって単離・回
収を繰り返し、すべてのプラークがブルオギャルで青く
染まるまでウイルスの純化を行った。通常この繰り返し
操作は３〜４回で終了する。この純化されたウイルスを
ｆＮＺ７９２９−Ｒ１と名付けた。ｆＮＺ７９２９−Ｒ
１はドットブロットハイブリダイゼーション，サザンブ
ロットハイブリダイゼーションによってＴＴＭ−１，ｌ
ａｃＺ遺伝子ともに予想通りの位置にあることを確認し
た。
【００３７】
【実施例−３】 ｆＮＺ７９２９−Ｒ１感染細胞におけるＴＴＭ−１ポリ
ペプチドの発現
ペプチドの発現
【００３８】ｆＮＺ７９２９−Ｒ１がＴＴＭ−１ポリペ
プチドを感染細胞中で発現することを調べるために抗マ
イコプラズマ・ガリセプティカムＳ６株血清を用いた免
疫蛍光抗体法を行った。ｆＮＺ７９２９−Ｒ１をＣＥＦ
に感染させ、３７℃でプラークが出現するまで培養後冷
アセトンで固定し、マイコプラズマ・ガリセプティカム
Ｓ６株で免疫した鶏血清（抗Ｓ６）またはマイコプラズ
マ・ガリセプティカムＳ６株感染鶏血清（感染Ｓ６）及
びＴＴＭ−１ポリペプチド免疫鶏血清（抗ＴＴＭ−１）
を一次抗体として１００〜１０００倍に希釈して反応さ
せた。これらの培養細胞をさらに、蛍光物質（ＦＩＴ
Ｃ）を結合した抗鶏イムノグロブリンと反応させ、非特
異反応部分を洗い流したのち蛍光励起波長光下で顕微鏡
観察した。対照ウイルスとしてＦＰＶ−ＮＰ株，ｆＮＺ
２３３７（特開平１−１５７３８１）を用い、対照一次
抗体としてニューカッスル病ウイルス免疫鶏血清（抗Ｎ
ＤＶ）とＳＰＦ鶏血清（ＳＰＦ）を１０００倍で用い
た。反応性は表１に示した。
プチドを感染細胞中で発現することを調べるために抗マ
イコプラズマ・ガリセプティカムＳ６株血清を用いた免
疫蛍光抗体法を行った。ｆＮＺ７９２９−Ｒ１をＣＥＦ
に感染させ、３７℃でプラークが出現するまで培養後冷
アセトンで固定し、マイコプラズマ・ガリセプティカム
Ｓ６株で免疫した鶏血清（抗Ｓ６）またはマイコプラズ
マ・ガリセプティカムＳ６株感染鶏血清（感染Ｓ６）及
びＴＴＭ−１ポリペプチド免疫鶏血清（抗ＴＴＭ−１）
を一次抗体として１００〜１０００倍に希釈して反応さ
せた。これらの培養細胞をさらに、蛍光物質（ＦＩＴ
Ｃ）を結合した抗鶏イムノグロブリンと反応させ、非特
異反応部分を洗い流したのち蛍光励起波長光下で顕微鏡
観察した。対照ウイルスとしてＦＰＶ−ＮＰ株，ｆＮＺ
２３３７（特開平１−１５７３８１）を用い、対照一次
抗体としてニューカッスル病ウイルス免疫鶏血清（抗Ｎ
ＤＶ）とＳＰＦ鶏血清（ＳＰＦ）を１０００倍で用い
た。反応性は表１に示した。
【００３９】
【表１】 表１ 組み換えウイルス感染ＣＥＦの各種血清に対する反応性 ──────────────────────────────────── 一次抗体に対する反応性 感染ウイルス ───────────────────────────── 抗Ｓ６ 感染Ｓ６ 抗TTM-1 抗NDV SPF ──────────────────────────────────── fNZ7929-R1 ＋ ＋ ＋ − − fNZ2337 − − − ＋ − NP − − − − − ── − − − − − ──────────────────────────────────── ＋：反応する −：反応しない
【００４０】ｆＮＺ７９２９−Ｒ１が感染した細胞は、
抗Ｓ６および感染Ｓ６抗ＴＴＭ−１とのみ反応し、その
他の抗体とは反応しなかった。この事実は、ｆＮＺ７９
２９−Ｒ１はＴＴＭ−１ポリペプチドを感染細胞中で発
現していることを示している。
抗Ｓ６および感染Ｓ６抗ＴＴＭ−１とのみ反応し、その
他の抗体とは反応しなかった。この事実は、ｆＮＺ７９
２９−Ｒ１はＴＴＭ−１ポリペプチドを感染細胞中で発
現していることを示している。
【００４１】
【実施例−４】 ｆＮＺ７９２９−Ｒ１接種鶏への抗ＴＴＭ−１ポリペプ
チド抗体誘導能
チド抗体誘導能
【００４２】ｆＮＺ７９２９−Ｒ１をＣＥＦで３７℃，
４８時間培養後、二回凍結融解を繰り返し、細胞浮遊液
を回収し、ウイルスタイターが１０6 ｐｆｕ／ｍｌとな
るように調製したのち生後７日のＳＰＦ鶏（Line Ｍ，
日本生物科学研究所）の右翼膜に穿刺用針で１０μｌ接
種した。接種後善感発痘を観察し、接種から２週後に血
清を採取した。採取した血清の抗体価はＥＬＩＳＡ法で
測定した。精製したＴＴＭ−１ポリペプチドを１μｇ／
wellとなるようにバイカーボネートバッファーに溶解
し、９６wellマイクロタイタープレートに吸着させた
後、スキムミルクでブロッキングを行ってその後の非特
異的吸着を防いだ。次に各ウェルに被検血清の希釈液を
のせたのちホースラディッシュパーオキシダーゼ結合抗
鶏イムノグロブリン抗体（ウサギ抗体）を二次抗体とし
てのせた。充分洗浄したのち、基質として２，２′−ア
ジノジエチル−ベンズチアゾリンスルフォネートを加
え、イムノリーダーで４０５ｎｍの波長光に対する吸光
度で抗体の相対希釈倍率を測定した（表２）。なお、対
照一次抗体には、抗ＴＴＭ−１ポリペプチド鶏血清を用
いた。
４８時間培養後、二回凍結融解を繰り返し、細胞浮遊液
を回収し、ウイルスタイターが１０6 ｐｆｕ／ｍｌとな
るように調製したのち生後７日のＳＰＦ鶏（Line Ｍ，
日本生物科学研究所）の右翼膜に穿刺用針で１０μｌ接
種した。接種後善感発痘を観察し、接種から２週後に血
清を採取した。採取した血清の抗体価はＥＬＩＳＡ法で
測定した。精製したＴＴＭ−１ポリペプチドを１μｇ／
wellとなるようにバイカーボネートバッファーに溶解
し、９６wellマイクロタイタープレートに吸着させた
後、スキムミルクでブロッキングを行ってその後の非特
異的吸着を防いだ。次に各ウェルに被検血清の希釈液を
のせたのちホースラディッシュパーオキシダーゼ結合抗
鶏イムノグロブリン抗体（ウサギ抗体）を二次抗体とし
てのせた。充分洗浄したのち、基質として２，２′−ア
ジノジエチル−ベンズチアゾリンスルフォネートを加
え、イムノリーダーで４０５ｎｍの波長光に対する吸光
度で抗体の相対希釈倍率を測定した（表２）。なお、対
照一次抗体には、抗ＴＴＭ−１ポリペプチド鶏血清を用
いた。
【００４３】
【表２】 表.2 ｆＮＺ７９２９−Ｒ１接種鶏のＴＴＭ−１免疫鶏血清ポリペプチドに対 する抗体価 ──────────────────────────────────── 接種ウイルス 抗ＴＴＭ−１ポリペプチド抗体価（希釈倍率）* ──────────────────────────────────── ｆＮＺ７９２９−Ｒ１ ３２ ＮＰ １ ─── １ 抗ＴＴＭ−１ ２５６ ──────────────────────────────────── ＊ＳＰＦ鶏血清の反応性を１としたときの希釈倍率
【００４４】この結果により、ｆＮＺ７９２９−Ｒ１は
接種鶏に効果的に抗ＴＴＭ−１抗体を誘導できる。この
ことからｆＮＺ７９２９−Ｒ１は、鶏痘とマイコプラズ
マ・ガリセプティカム感染症に効果的に感染を防御する
ワクチンとして使用することができる。
接種鶏に効果的に抗ＴＴＭ−１抗体を誘導できる。この
ことからｆＮＺ７９２９−Ｒ１は、鶏痘とマイコプラズ
マ・ガリセプティカム感染症に効果的に感染を防御する
ワクチンとして使用することができる。
【００４５】
【実施例−５】 マイコプラズマ・ガリセプティカムが発現しているポリ
ペプチド遺伝子ＴＭ−１６の取得 （１） マイコプラズマ・ガリセプティカム・ゲノムＤ
ＮＡの調製 マイコプラズマ・ガリセプティカムＳ６株を１００ｍｌ
のＰＰＬＯブロス基礎培地に２０％馬血清、５％酵母エ
キス、１％グルコース、およびｐＨ指示薬としてフェノ
ールレッドを微量加えて調製した液体培地で、３７℃３
〜５日培養した。マイコプラズマ・ガリセプティカムの
増殖に従って培養液のｐＨが下がり、培養液に含まれて
いるｐＨ指示薬の呈色が赤から黄に変化した時点で、培
養を終了し、培養液を８０００Ｇ、２０分間遠心し、集
菌した。さらに菌体を培養液の１／１０容量のＰＢＳに
懸濁し、再び１０，０００ｒｐｍ、２０分間遠心し、集
菌した。収集菌体を再び２．７ｍｌのＰＢＳに懸濁し、
１％になる様にＳＤＳを、さらに１０μｇのＲＮａｓｅ
を加え、３７℃３０分間インキュベートし溶菌した。溶
菌液を等容量のフェノールで３回抽出しさらに、エチル
エーテルで３回抽出を行なった後エタノール沈澱し、マ
イコプラズマ・ガリセプティカム・ゲノムＤＮＡ２００
μｇを得た。
ペプチド遺伝子ＴＭ−１６の取得 （１） マイコプラズマ・ガリセプティカム・ゲノムＤ
ＮＡの調製 マイコプラズマ・ガリセプティカムＳ６株を１００ｍｌ
のＰＰＬＯブロス基礎培地に２０％馬血清、５％酵母エ
キス、１％グルコース、およびｐＨ指示薬としてフェノ
ールレッドを微量加えて調製した液体培地で、３７℃３
〜５日培養した。マイコプラズマ・ガリセプティカムの
増殖に従って培養液のｐＨが下がり、培養液に含まれて
いるｐＨ指示薬の呈色が赤から黄に変化した時点で、培
養を終了し、培養液を８０００Ｇ、２０分間遠心し、集
菌した。さらに菌体を培養液の１／１０容量のＰＢＳに
懸濁し、再び１０，０００ｒｐｍ、２０分間遠心し、集
菌した。収集菌体を再び２．７ｍｌのＰＢＳに懸濁し、
１％になる様にＳＤＳを、さらに１０μｇのＲＮａｓｅ
を加え、３７℃３０分間インキュベートし溶菌した。溶
菌液を等容量のフェノールで３回抽出しさらに、エチル
エーテルで３回抽出を行なった後エタノール沈澱し、マ
イコプラズマ・ガリセプティカム・ゲノムＤＮＡ２００
μｇを得た。
【００４６】（２） Ｍ−１６遺伝子をプローブにした
マイコプラズマ・ガリセプティカムのゲノミックサザン
ハイブリダイゼーション 上記（１）で取得したマイコプラズマ・ガリセプティカ
ムＤＮＡ１μｇをＸｂａＩで消化し、０．６％低融点ア
ガロースゲル電気泳動に供した。泳動後ゲルをアルカリ
変性液（０．５Ｍ ＮａＯＨ、１．５Ｍ ＮａＣｌ）に
１０分間浸しＤＮＡを変性させ、中和液（３Ｍ酢酸ナト
リウムｐＨ５．５）に１０分間浸して中和の後６倍ＳＳ
Ｃ液（０．７Ｍ ＮａＣｌ、０．０７Ｍクエン酸ナトリ
ウム、ｐＨ７．５）中でナイロンメンブレンに転写し
た。風乾の後８０℃で２時間焼き付け、４倍ＳＥＴ
（０．６Ｍ ＮａＣｌ、０．０８Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ、４ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ７．８）−１０倍Ｄｅｎｈａ
ｒｄｔ−０．１％ ＳＤＳ−０．１％Ｎａ4 Ｐ2 Ｏ7 −
５０μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡとｐＵＭ−１６（こ
のプラスミド内にＭ−１６遺伝子が含まれている；特開
平２−１１１７９５号参照）を常法に従い標識したもの
を加えて、６８℃１４時間ハイブリダイゼーションをし
た。ナイロンメンブレンとＸ線フィルムを重ね、オート
ラジオグラフィーで確認したところ、約５．５ｋｂｐの
断片にハイブリダイズしていることを確認した。
マイコプラズマ・ガリセプティカムのゲノミックサザン
ハイブリダイゼーション 上記（１）で取得したマイコプラズマ・ガリセプティカ
ムＤＮＡ１μｇをＸｂａＩで消化し、０．６％低融点ア
ガロースゲル電気泳動に供した。泳動後ゲルをアルカリ
変性液（０．５Ｍ ＮａＯＨ、１．５Ｍ ＮａＣｌ）に
１０分間浸しＤＮＡを変性させ、中和液（３Ｍ酢酸ナト
リウムｐＨ５．５）に１０分間浸して中和の後６倍ＳＳ
Ｃ液（０．７Ｍ ＮａＣｌ、０．０７Ｍクエン酸ナトリ
ウム、ｐＨ７．５）中でナイロンメンブレンに転写し
た。風乾の後８０℃で２時間焼き付け、４倍ＳＥＴ
（０．６Ｍ ＮａＣｌ、０．０８Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ、４ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ７．８）−１０倍Ｄｅｎｈａ
ｒｄｔ−０．１％ ＳＤＳ−０．１％Ｎａ4 Ｐ2 Ｏ7 −
５０μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡとｐＵＭ−１６（こ
のプラスミド内にＭ−１６遺伝子が含まれている；特開
平２−１１１７９５号参照）を常法に従い標識したもの
を加えて、６８℃１４時間ハイブリダイゼーションをし
た。ナイロンメンブレンとＸ線フィルムを重ね、オート
ラジオグラフィーで確認したところ、約５．５ｋｂｐの
断片にハイブリダイズしていることを確認した。
【００４７】（３） ＸｂａＩ消化約５．５ｋｐｂ断片
のｐＵＣ−１９へのクローニング及びコロニーハイブリ
ダイゼーション 上記１−（１）で取得したマイコプラズマ・ガリセプテ
ィカムＤＮＡ４μｇを制限酵素ＸｂａＩで消化後、０．
６％低融点アガロースゲル電気泳動後、約５．５ｋｂｐ
の断片を回収した。この断片を、ＸｂａＩ消化によって
開裂したｐＵＣ−１９とリガーゼによって連結し、コン
ピテントな大腸菌ＴＧ１株を形質転換し、５−ブロモ−
４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノ
シド０．００３％、イソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラク
トピラノシド０．０３ｍＭ、４０μｇ／ｍｌアンピシリ
ンを含むＬＢ寒天培地で３７℃、１５時間培養した。こ
の培地上に生育した白コロニーをナイロンメンブレンに
転写し、上記（２）と同様の方法でハイブリダイゼーシ
ョンを行ない、オートラジオグラフィーで確認したとこ
ろ、クローニングされていることが判明し、このプラス
ミドをｐＵＭ１６と名付けた。
のｐＵＣ−１９へのクローニング及びコロニーハイブリ
ダイゼーション 上記１−（１）で取得したマイコプラズマ・ガリセプテ
ィカムＤＮＡ４μｇを制限酵素ＸｂａＩで消化後、０．
６％低融点アガロースゲル電気泳動後、約５．５ｋｂｐ
の断片を回収した。この断片を、ＸｂａＩ消化によって
開裂したｐＵＣ−１９とリガーゼによって連結し、コン
ピテントな大腸菌ＴＧ１株を形質転換し、５−ブロモ−
４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノ
シド０．００３％、イソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラク
トピラノシド０．０３ｍＭ、４０μｇ／ｍｌアンピシリ
ンを含むＬＢ寒天培地で３７℃、１５時間培養した。こ
の培地上に生育した白コロニーをナイロンメンブレンに
転写し、上記（２）と同様の方法でハイブリダイゼーシ
ョンを行ない、オートラジオグラフィーで確認したとこ
ろ、クローニングされていることが判明し、このプラス
ミドをｐＵＭ１６と名付けた。
【００４８】（４） ｐＵＭ−１６インサートＤＮＡの
配列分析 実施例５(3) で作製したｐＵＭ−１６内に挿入された約
５．５ｋｂｐの断片の配列をＳａｎｇｅｒらのＤｉｄｅ
ｏｘｙ法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ．、７４、５４６３（１９７７））によって解析し
た。この断片の制限酵素切断点地図を図４に示す。ま
た、この断片中に存在するオープンリーディングフレー
ム（以下ＯＲＦという）の制限酵素切断点地図を図１に
示し、このＯＲＦの塩基配列及びそれから推定されるア
ミノ酸配列を図２および３に示す。このＯＲＦから推定
されるポリペプチドをＴＭ−１６ポリペプチドと命名し
た。
配列分析 実施例５(3) で作製したｐＵＭ−１６内に挿入された約
５．５ｋｂｐの断片の配列をＳａｎｇｅｒらのＤｉｄｅ
ｏｘｙ法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ．、７４、５４６３（１９７７））によって解析し
た。この断片の制限酵素切断点地図を図４に示す。ま
た、この断片中に存在するオープンリーディングフレー
ム（以下ＯＲＦという）の制限酵素切断点地図を図１に
示し、このＯＲＦの塩基配列及びそれから推定されるア
ミノ酸配列を図２および３に示す。このＯＲＦから推定
されるポリペプチドをＴＭ−１６ポリペプチドと命名し
た。
【００４９】
【実施例−６】 ＴＭ−１６ポリペプチド発現リコンビナントウイルスの
作製 (1) ＴＭ−１６の開始コドン（ＡＴＧ）直前及び終止
コドン（ＴＡＡ）直後への制限酵素サイト挿入ＹｐＭＵ
ＴＡＢの構築（図１０参照） ｐＵＭ１６を、ＥｃｏＲＩとＰｓｔＩで消化後、０．８
％低融点アガロースゲル電気泳動に供し、ＴＭ−１６の
５′末端側を含む約１０００ｂｐの断片をゲルより回収
し、フェノール、クロロホルム処理後、エタノール沈澱
により回収した。次いで、この断片と、予めＭ１３ｍｐ
１０ファージをＥｃｏＲＩとＰｓｔＩで開裂させて得た
断片とをリガーゼにより連結した。この反応液を、３７
℃で２４時間培養した大腸菌ＴＧ１に最終的に１００mM
となるようにＩＰＴＧ（イソプロピルチオ−β−Ｄ−ガ
ラクトピラノシド）を加えてＸ−ｇａｌが２％となるよ
うにさらに加えた溶液と、ｍ．ｏ．ｉ．が０．１になる
ように混合し、軟寒天上に撒いて固化させ、３７℃、２
４時間インキュベートした。出現したファージプラーク
のうち、青変していない組み換えファージから、上記１
０００ｂｐ断片を含んでいるファージＴＭ−１６Ｌ′を
得た。次に、単鎖ＤＮＡ ５′−ＣＴＣＡＧＴＧＧＡＴＣＣＡＧＡＧＡＴＧ−３′ を合成し、ＴＭ−１６Ｌ′から常法によって得た一本鎖
ファージとアニールさせ、Ｆｒｉｔｓ Ｅｃｋｓｔｅｉ
ｎらの方法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒ
ｃｈ ８７４９−８７６４、１９８５）によって目的の
変異をおこさせて、得られた組み換えファージＴＭ−１
６Ｌを、ＸｂａＩ、ＮｈｅＩで切断し、約９８０ｂｐの
断片を０．８％アガロースゲル電気泳動によって回収
し、エタノール沈澱で回収した。また、ｐＵＭ−１６を
ＶｓｐＩで消化後、ＢａｍＨＩリンカーを常法に従い結
合させ、約７３０ｂｐの断片を回収した。この断片をｐ
ＵＣ１８をＢａｍＨＩで切断した部位に組み込んでプラ
スミドｐＵＭ−１６Ｒを得た。このプラスミドをＸｂａ
Ｉ、ＮｈｅＩで切断したベクター部を含む断片と、上記
９８０ｂｐ断片をリガーゼによって結合させ、目的のプ
ラスミドｐＭＵＴＡＢを得た。
作製 (1) ＴＭ−１６の開始コドン（ＡＴＧ）直前及び終止
コドン（ＴＡＡ）直後への制限酵素サイト挿入ＹｐＭＵ
ＴＡＢの構築（図１０参照） ｐＵＭ１６を、ＥｃｏＲＩとＰｓｔＩで消化後、０．８
％低融点アガロースゲル電気泳動に供し、ＴＭ−１６の
５′末端側を含む約１０００ｂｐの断片をゲルより回収
し、フェノール、クロロホルム処理後、エタノール沈澱
により回収した。次いで、この断片と、予めＭ１３ｍｐ
１０ファージをＥｃｏＲＩとＰｓｔＩで開裂させて得た
断片とをリガーゼにより連結した。この反応液を、３７
℃で２４時間培養した大腸菌ＴＧ１に最終的に１００mM
となるようにＩＰＴＧ（イソプロピルチオ−β−Ｄ−ガ
ラクトピラノシド）を加えてＸ−ｇａｌが２％となるよ
うにさらに加えた溶液と、ｍ．ｏ．ｉ．が０．１になる
ように混合し、軟寒天上に撒いて固化させ、３７℃、２
４時間インキュベートした。出現したファージプラーク
のうち、青変していない組み換えファージから、上記１
０００ｂｐ断片を含んでいるファージＴＭ−１６Ｌ′を
得た。次に、単鎖ＤＮＡ ５′−ＣＴＣＡＧＴＧＧＡＴＣＣＡＧＡＧＡＴＧ−３′ を合成し、ＴＭ−１６Ｌ′から常法によって得た一本鎖
ファージとアニールさせ、Ｆｒｉｔｓ Ｅｃｋｓｔｅｉ
ｎらの方法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒ
ｃｈ ８７４９−８７６４、１９８５）によって目的の
変異をおこさせて、得られた組み換えファージＴＭ−１
６Ｌを、ＸｂａＩ、ＮｈｅＩで切断し、約９８０ｂｐの
断片を０．８％アガロースゲル電気泳動によって回収
し、エタノール沈澱で回収した。また、ｐＵＭ−１６を
ＶｓｐＩで消化後、ＢａｍＨＩリンカーを常法に従い結
合させ、約７３０ｂｐの断片を回収した。この断片をｐ
ＵＣ１８をＢａｍＨＩで切断した部位に組み込んでプラ
スミドｐＵＭ−１６Ｒを得た。このプラスミドをＸｂａ
Ｉ、ＮｈｅＩで切断したベクター部を含む断片と、上記
９８０ｂｐ断片をリガーゼによって結合させ、目的のプ
ラスミドｐＭＵＴＡＢを得た。
【００５０】(2) ＴＭ−１６遺伝子を含有するトラン
スファーベクターｐＡｃＺＭ１６の構築 (1) で得たｐＭＵＴＡＢをＢａｍＨＩで消化後０．８％
アガロースゲル電気泳動し、ゲルより約１０５０ｂｐの
断片を回収した。一方バキュロウイルストランスファベ
クターｐＡＣＹＭ１〔Ｍａｔｓｕｕｖａ Ｓ．Ｖｉｒｏ
ｌｏｇｙ、１７３ ６７４−６８２（１９８９）〕をＢ
ａｍＨＩで開裂させ、さきほどの約１０５０ｂｐ断片
と、リガーゼにより連結することにより、目的のトラン
スファーベクターｐＡｃＺＭ１６を得た。このベクター
は、ポリヘドリン遺伝子内にポリヘトリンプロモーター
の支配下となる様にＴＭ−１６遺伝子が挿入されたもの
を有している。
スファーベクターｐＡｃＺＭ１６の構築 (1) で得たｐＭＵＴＡＢをＢａｍＨＩで消化後０．８％
アガロースゲル電気泳動し、ゲルより約１０５０ｂｐの
断片を回収した。一方バキュロウイルストランスファベ
クターｐＡＣＹＭ１〔Ｍａｔｓｕｕｖａ Ｓ．Ｖｉｒｏ
ｌｏｇｙ、１７３ ６７４−６８２（１９８９）〕をＢ
ａｍＨＩで開裂させ、さきほどの約１０５０ｂｐ断片
と、リガーゼにより連結することにより、目的のトラン
スファーベクターｐＡｃＺＭ１６を得た。このベクター
は、ポリヘドリン遺伝子内にポリヘトリンプロモーター
の支配下となる様にＴＭ−１６遺伝子が挿入されたもの
を有している。
【００５１】(3) 組み換えバキュロウイルスの作出 Ｆ．Ｌ．グラハムらの論文（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２巻
１９７３年 ４５６−４６７頁）に記載されている方法
に準じ、ＡｃＮＰＶ−ＢｍａＮＰＶハイブリッドウイル
スのゲノムＤＮＡ １μｇを上記(2) で得られたトラン
スファーベクターｐＡｃＡＺＭ１６ １〜１０μｇと混
合し、１５μｇ／mlの仔牛胸腺ＤＮＡを含む、１−ＨＥ
ＰＥＳ（Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ′−
２−エタンスルホン酸）緩衝液（pH７．０）で９５０μ
ｌにした。混合物をスターラで攪拌しながら５０mlの
２．５Ｍ ＣａＣｌ2 を滴下し、沈澱を室温で３０分間
形成させた。１mlの沈澱したＤＮＡをＳｆ細胞培養プレ
ートに添加した。４時間後、細胞を培地で洗浄し、１０
％ウシ胎児血清を含む２mlの培地を加えて、３日間イン
キュベートした。その後、組み換え及び非組み換えウイ
ルスが混じっている培地を集め、組み換えウイルスを単
離するため、適当に希釈し、単層培養したＳｆ細胞に感
染させ、プラークを形成させた。核多角体を形成しない
プラークを選び、そのプラークから組み換えバキュロウ
イルスを回収した。この組み換えバキュロウイルスをＴ
Ｍ−１６リコンビナントウイルスと命名した。
１９７３年 ４５６−４６７頁）に記載されている方法
に準じ、ＡｃＮＰＶ−ＢｍａＮＰＶハイブリッドウイル
スのゲノムＤＮＡ １μｇを上記(2) で得られたトラン
スファーベクターｐＡｃＡＺＭ１６ １〜１０μｇと混
合し、１５μｇ／mlの仔牛胸腺ＤＮＡを含む、１−ＨＥ
ＰＥＳ（Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ′−
２−エタンスルホン酸）緩衝液（pH７．０）で９５０μ
ｌにした。混合物をスターラで攪拌しながら５０mlの
２．５Ｍ ＣａＣｌ2 を滴下し、沈澱を室温で３０分間
形成させた。１mlの沈澱したＤＮＡをＳｆ細胞培養プレ
ートに添加した。４時間後、細胞を培地で洗浄し、１０
％ウシ胎児血清を含む２mlの培地を加えて、３日間イン
キュベートした。その後、組み換え及び非組み換えウイ
ルスが混じっている培地を集め、組み換えウイルスを単
離するため、適当に希釈し、単層培養したＳｆ細胞に感
染させ、プラークを形成させた。核多角体を形成しない
プラークを選び、そのプラークから組み換えバキュロウ
イルスを回収した。この組み換えバキュロウイルスをＴ
Ｍ−１６リコンビナントウイルスと命名した。
【００５２】
【実施例−７】 ３：カイコ虫体内での発現 カイコ蛹（蛹になってから、２５℃で２日間経過したも
の）実施例６(3) で得られたＴＭ−１６リコンビナント
ウイルス（５×１０5 ＰＦＵ）を体節間膜から注射し
た。ウイルス接種後、蛹は２５℃に保った。その後、感
染された蛹虫体を摩砕し、その摩砕液に緩衝液を加え、
ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて検出した。なお、ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥは、２０ｍＡの電流のもとで１２．５％ポリアク
リルアミドゲルを用いて、約２時間電気泳動を行い、得
られたゲルをクーマシーブリリアントで染色して検出を
行った。
の）実施例６(3) で得られたＴＭ−１６リコンビナント
ウイルス（５×１０5 ＰＦＵ）を体節間膜から注射し
た。ウイルス接種後、蛹は２５℃に保った。その後、感
染された蛹虫体を摩砕し、その摩砕液に緩衝液を加え、
ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて検出した。なお、ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥは、２０ｍＡの電流のもとで１２．５％ポリアク
リルアミドゲルを用いて、約２時間電気泳動を行い、得
られたゲルをクーマシーブリリアントで染色して検出を
行った。
【００５３】
【実施例−８】 カイコ蛹で産生されたＴＭ−１６ポリペプチドの鶏にお
ける免疫効果 カイコ中で発現したＴＭ−１６ポリペプチドの有効性を
確認するために実施例５により作製されたＴＭ−１６リ
コンビナントウイルス接種後４日目のカイコ幼虫１０頭
に１３mlのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を加え、バーチ
スホモゲナイザーで粉砕し、β−プロピオラクトンを加
えウイルスを不活化した。６，０００rpm ３０分間遠心
した上清１０mlにＰＢＳ１９ml、レオドールＡＯ−１５
（セスキオレイン酸ソルビタン 花王株式会社製）４．
５ml、レオドールＴＷ−０２０（モノオレイン酸ポリオ
キシエチレン（２０）ソルビタン 花王株式会社製）
０．５ml、カーネーション（流動パラフィン Ｗｉｔｃ
ｏ Ｃｏｒｐ．社製）６５mlおよび１０％ホルマリン
１．０mlを加え、オイルアジュバントワクチンを作製し
た。
ける免疫効果 カイコ中で発現したＴＭ−１６ポリペプチドの有効性を
確認するために実施例５により作製されたＴＭ−１６リ
コンビナントウイルス接種後４日目のカイコ幼虫１０頭
に１３mlのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を加え、バーチ
スホモゲナイザーで粉砕し、β−プロピオラクトンを加
えウイルスを不活化した。６，０００rpm ３０分間遠心
した上清１０mlにＰＢＳ１９ml、レオドールＡＯ−１５
（セスキオレイン酸ソルビタン 花王株式会社製）４．
５ml、レオドールＴＷ−０２０（モノオレイン酸ポリオ
キシエチレン（２０）ソルビタン 花王株式会社製）
０．５ml、カーネーション（流動パラフィン Ｗｉｔｃ
ｏ Ｃｏｒｐ．社製）６５mlおよび１０％ホルマリン
１．０mlを加え、オイルアジュバントワクチンを作製し
た。
【００５４】このオイルアジュバントワクチンを４９日
齢のＳＰＦ白色レグホンに１．０mlずつ接種し、接種
後、３週目に鶏から血清を採取し常法に従いＥＬＩＳＡ
で抗ＴＭ−１６抗体価を測定した（表３）。また、接種
後６週目にマイコプラズマ・ガリセプティカムＫＰ１３
株（Ｎａｔｌ．Ｉｎｓｔ．Ａｎｉｍ．Ｈｅａｌｔｈ．
Ｑ、４、６８−（１９６４）、１０6 ｃ．ｆ．ｕを鶏に
点鼻攻撃した。攻撃後４日目に鶏をと殺し、眼窩下洞を
綿棒を用いてぬぐい取り、ＰＴＬＯ培地で１６８時間培
養後、さらに同培地に継代して菌分離の有無で、感染防
御効果を判定した（表４）。
齢のＳＰＦ白色レグホンに１．０mlずつ接種し、接種
後、３週目に鶏から血清を採取し常法に従いＥＬＩＳＡ
で抗ＴＭ−１６抗体価を測定した（表３）。また、接種
後６週目にマイコプラズマ・ガリセプティカムＫＰ１３
株（Ｎａｔｌ．Ｉｎｓｔ．Ａｎｉｍ．Ｈｅａｌｔｈ．
Ｑ、４、６８−（１９６４）、１０6 ｃ．ｆ．ｕを鶏に
点鼻攻撃した。攻撃後４日目に鶏をと殺し、眼窩下洞を
綿棒を用いてぬぐい取り、ＰＴＬＯ培地で１６８時間培
養後、さらに同培地に継代して菌分離の有無で、感染防
御効果を判定した（表４）。
【００５５】
【表３】 表３．ＴＭ−１６リコンビナントウイルス感染虫体免疫鶏のＴＭ−１６ポリペプ チドに対する抗体価 ─────────────────────────────────── 抗 原 抗ＴＭ−１６ポリペプチド抗体価* ─────────────────────────────────── ＴＭ−１リコンビナント感染虫体 ４７．２ 親ウイルス感染虫体 １ カイコ虫体 １ 非免疫 １ ─────────────────────────────────── * 非免疫鶏血清の反応性を１としたときの希釈倍率
【００５６】
【表４】 表４．ＴＭ−１６リコンビナントウイルス感染虫体免疫鶏の攻撃試験結果 ────────────────────────────── 抗 原 感染防御率* ────────────────────────────── ＴＭ−１リコンビナント感染虫体 ０／６（１００％） 親ウイルス感染虫体 ４／４（ ０％） カイコ虫体 ４／４（ ０％） 非免疫 ３／３（ ０％） ────────────────────────────── *分母は攻撃羽数、分子は菌分離羽数、カッコ内は感染防御率
【００５７】この結果により、ＴＭ−１６リコンビナン
ト感染虫体は抗ＴＭ−１６ポリペプチド抗体を効果的に
誘導するだけでなく、マイコプラズマ・ガリセプティカ
ムの感染も防御し、マイコプラズマ・ガリセプティカム
感染症に有効なワクチンとして使用できる。
ト感染虫体は抗ＴＭ−１６ポリペプチド抗体を効果的に
誘導するだけでなく、マイコプラズマ・ガリセプティカ
ムの感染も防御し、マイコプラズマ・ガリセプティカム
感染症に有効なワクチンとして使用できる。
【００５８】
【実施例−９】 ＴＴＭ−１ポリペプチド発現リコンビナントウイルスの
作製 (1) ＴＴＭ−１遺伝子を含有するトランスファーベク
ターｐＡｃＺＭ−１の構築（図１１参照） 実施例１−１で作製したプラスミドｐＵＴＴＭＩＤを制
限酵素ＳｓｐＩで開裂させた後、フェノール・クロロホ
ルム処理し、エタノール沈澱により、開裂したｐＵＴＴ
ＭＩＤを回収した。この開裂したｐＵＴＴＭＩＤをＤＮ
Ａ−ポリメラーゼＩでＫｌｅｎｏｗ処理し、接着末端を
平滑末端にして、フェノール・クロロホルム処理、エタ
ノール沈澱によりＤＮＡを回収した。次にＢｇｌIIで切
断し、約１２００ｂｐのＴＴＭ−１ ＤＮＡを含む断片
（）を、０．８％アガロース電気泳動により回収し
た。一方、バキュロウイルストランスファーベクターｐ
ＡＣＹＭ１〔Ｍａｔｓｕｕｒａ、Ｓ．Ｖｉｒｏｌｏｇ
ｙ、１７３ ６７４−６８２（１９８９）〕を制限酵素
ＢａｍＨＩで開裂させた後、フェノールクロロホルム処
理、エタノール沈殿により、開裂したｐＡｃＹＭ１を回
収した。この開裂したｐＡｃＹＭ１をＤＮＡ−ポリメラ
ーゼＩでＫｌｅｎｏｗ処理し接着末端を平滑末端にして
フェノール・クロロホルム処理、エタノール沈殿により
ＤＮＡを回収した。平滑末端になった開裂ｐＡｃＹＭ１
を制限酵素ＸｈｏＩで切断し、約２１００ｂｐの断片
（）を、０．８％アガロース電気泳動により回収し
た。またｐＡｃＹＭ１をＸｈｏＩ、ＢａｍＨＩで切断し
た後約７１００ｂｐの断片も同様にして回収した。
の３断片を混合し、リガーゼによって連結し、目的
のトランスファーベクターｐＡｃＺＭ−１を得た。
作製 (1) ＴＴＭ−１遺伝子を含有するトランスファーベク
ターｐＡｃＺＭ−１の構築（図１１参照） 実施例１−１で作製したプラスミドｐＵＴＴＭＩＤを制
限酵素ＳｓｐＩで開裂させた後、フェノール・クロロホ
ルム処理し、エタノール沈澱により、開裂したｐＵＴＴ
ＭＩＤを回収した。この開裂したｐＵＴＴＭＩＤをＤＮ
Ａ−ポリメラーゼＩでＫｌｅｎｏｗ処理し、接着末端を
平滑末端にして、フェノール・クロロホルム処理、エタ
ノール沈澱によりＤＮＡを回収した。次にＢｇｌIIで切
断し、約１２００ｂｐのＴＴＭ−１ ＤＮＡを含む断片
（）を、０．８％アガロース電気泳動により回収し
た。一方、バキュロウイルストランスファーベクターｐ
ＡＣＹＭ１〔Ｍａｔｓｕｕｒａ、Ｓ．Ｖｉｒｏｌｏｇ
ｙ、１７３ ６７４−６８２（１９８９）〕を制限酵素
ＢａｍＨＩで開裂させた後、フェノールクロロホルム処
理、エタノール沈殿により、開裂したｐＡｃＹＭ１を回
収した。この開裂したｐＡｃＹＭ１をＤＮＡ−ポリメラ
ーゼＩでＫｌｅｎｏｗ処理し接着末端を平滑末端にして
フェノール・クロロホルム処理、エタノール沈殿により
ＤＮＡを回収した。平滑末端になった開裂ｐＡｃＹＭ１
を制限酵素ＸｈｏＩで切断し、約２１００ｂｐの断片
（）を、０．８％アガロース電気泳動により回収し
た。またｐＡｃＹＭ１をＸｈｏＩ、ＢａｍＨＩで切断し
た後約７１００ｂｐの断片も同様にして回収した。
の３断片を混合し、リガーゼによって連結し、目的
のトランスファーベクターｐＡｃＺＭ−１を得た。
【００５９】(2) ＴＴＭ−１遺伝子を含むリコンビナ
ントウイルス 実施例６(3) において、トランスファーベクターとして
ｐＡｃＺＭ１６のかわりにｐＡｃＺＭ−１を用いる以外
同様の操作によって得られた組み換えバキュロウイルス
をＴＴＭ−１リコンビナントと命名した。
ントウイルス 実施例６(3) において、トランスファーベクターとして
ｐＡｃＺＭ１６のかわりにｐＡｃＺＭ−１を用いる以外
同様の操作によって得られた組み換えバキュロウイルス
をＴＴＭ−１リコンビナントと命名した。
【００６０】以下に配列番号１から配列番号１１の配列
を示す。
を示す。
【００６１】
【配列表１】 配列番号：１ 配列の長さ：４８ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 AATTCGAGCT CGGATCGTTG AAAAAATAAT ATAGATCCTA AAATGGAA 48
【００６２】
【配列表２】 配列番号：２ 配列の長さ：４８ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GATCTTCCAT TTTAGGATCT ATATTATTTT TTCAACGATC CGAGCTCG 48
【００６３】
【配列表３】 配列番号：３ 配列の長さ：５５ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 AGCTTTTTTT TTTTTTTTTT TTTGGCATAT AAATAATAAA TACAATAATT AATTA 55
【００６４】
【配列表４】 配列番号：４ 配列の長さ：５５ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CGCGTAATTA ATTATTGTAT TTATTATTTA TATGCCAAAA AAAAAAAAAA AAAAA 55
【００６５】
【配列表５】 配列番号：５ 配列の長さ：４０ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CGCGTAAAAA TTGAAAAACT ATTCTAATTT ATTGCACTCG 40
【００６６】
【配列表６】 配列番号：６ 配列の長さ：４０ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GATCCGAGTG CAATAAATTA GAATAGTTTT TCAATTTTTA 40
【００６７】
【配列表７】 配列番号：７ 配列の長さ：４２ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GATCCCCGGG CGAGCTCGCT AGCGGGCCCG CATGCGGTAC CG 42
【００６８】
【配列表８】 配列番号：８ 配列の長さ：４２ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TCGACGGATC CGCATGCGGG CCCGCTAGCG AGCTCGCCCG GG 42
【００６９】
【配列表９】 配列番号：９ 配列の長さ：３９ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TCGACCCGGT ACATTTTTAT AAAAATGTAC CCGGGGATC 39
【００７０】
【配列表１０】 配列番号：１０ 配列の長さ：３５ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GATCCCCGGG TACATTTTTA TAAAAATGTA CCGGG 35
【００７１】
【配列表１１】 配列番号：１１ 配列の長さ：１４ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ATTTTTATAA AAAT 14
【図１】ＴＭ−１６ポリペプチド全長をコードする遺伝
子の制限酵素切断点地図。
子の制限酵素切断点地図。
【図２】ＴＭ−１６ポリペプチド全長をコードする遺伝
子を含むＤＮＡ配列及びアミノ酸配列の前半部。
子を含むＤＮＡ配列及びアミノ酸配列の前半部。
【図３】ＴＭ−１６ポリペプチド全長をコードする遺伝
子を含むＤＮＡ配列及びアミノ酸配列の後半部。
子を含むＤＮＡ配列及びアミノ酸配列の後半部。
【図４】ＴＴＭ−１ポリペプチド全長をコードする遺伝
子の制限酵素切断点地図。
子の制限酵素切断点地図。
【図５】ＴＴＭ−１ポリペプチド全長をコードする遺伝
子を含むＤＮＡ配列及びアミノ酸配列の前半部。
子を含むＤＮＡ配列及びアミノ酸配列の前半部。
【図６】ＴＴＭ−１ポリペプチド全長をコードする遺伝
子を含むＤＮＡ配列及びアミノ酸配列の後半部。
子を含むＤＮＡ配列及びアミノ酸配列の後半部。
【図７】ＴＴＭ−ＩＮ及びＴＴＭ−ＩＣの作製方法。
【図８】ｐＮＺ７９２９−Ｒ１の作製方法。
【図９】ＴＭ−１６ポリペプチドをコードする遺伝子近
傍を含む遺伝子の制限酵素切断点地図。
傍を含む遺伝子の制限酵素切断点地図。
【図１０】ｐＭＵＴＡＢの作製方法。
【図１１】ｐＡｃＺＭ１の作製方法。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成６年６月１日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正内容】
【書類名】 明細書
【発明の名称】 新規な抗原タンパク質、その遺伝子、
及び組み換えバキュロウイルスとその利用
及び組み換えバキュロウイルスとその利用
【特許請求の範囲】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、新規なマイコプラズマ
・ガリセプティカムに対して抗原性を示すポリペプチ
ド、それをコードするＤＮＡ、該ポリペプチドを有効成
分とするワクチン、およびマイコプラズマ・ガリセプテ
ィカムに対して抗原性を示すポリペプチドをコードする
ＤＮＡを組み込んだ組み換えウイルス、それを用いた組
み換え生ワクチン、それを用いたマイコプラズマ・ガリ
セプティカムに対して抗原性を示すポリペプチドの製造
方法に関する。
・ガリセプティカムに対して抗原性を示すポリペプチ
ド、それをコードするＤＮＡ、該ポリペプチドを有効成
分とするワクチン、およびマイコプラズマ・ガリセプテ
ィカムに対して抗原性を示すポリペプチドをコードする
ＤＮＡを組み込んだ組み換えウイルス、それを用いた組
み換え生ワクチン、それを用いたマイコプラズマ・ガリ
セプティカムに対して抗原性を示すポリペプチドの製造
方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】世界で最も重要な鶏などの家禽の感染症
のひとつであるマイコプラズマ・ガリセプティカム（Ｍ
ｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ）感
染症は、鶏においては、気嚢炎を伴う慢性の呼吸器障害
を特徴とする疾病である。マイコプラズマ・ガリセプテ
ィカムに感染すると、産卵率並びに孵化率の低下が長期
に渡り引き起こされ、養鶏業界に重大な経済的損失をも
たらす。また、マイコプラズマ・ガリセプティカム感染
症によって鶏の免疫能が低下して常圧菌や弱毒ワクチン
などの日和見感染も引き起こされる。これらの点から予
想できる経済的被害は計り知れない額となる。いくつか
のマイコプラズマ・ガリセプティカム抗原タンパク質が
特開平２−１１１７９５号公報で開示されている。しか
し、これらは天然のマイコプラズマ・ガリセプティカム
由来の抗原タンパク質ではなく高い抗原性は期待できな
い。このため、より高い抗原性を有するタンパク質が求
められている。また、前記公報など従来からマイコプラ
ズマ・ガリセプティカム由来の抗原タンパク質を遺伝子
工学的に製造する方法は、大腸菌や酵母を用いた系に限
られていた（特開平２−１１１７５９号公報など）。こ
のような系では、抗原発現量が少ない、発現したタンパ
ク質の抗原性が低下・欠損するなどの原因があるほか、
効果の高い生ワクチンとして利用できない、宿主由来の
発熱性物質が取り除けないなどの問題があり、実用に適
していなかった。
のひとつであるマイコプラズマ・ガリセプティカム（Ｍ
ｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ）感
染症は、鶏においては、気嚢炎を伴う慢性の呼吸器障害
を特徴とする疾病である。マイコプラズマ・ガリセプテ
ィカムに感染すると、産卵率並びに孵化率の低下が長期
に渡り引き起こされ、養鶏業界に重大な経済的損失をも
たらす。また、マイコプラズマ・ガリセプティカム感染
症によって鶏の免疫能が低下して常圧菌や弱毒ワクチン
などの日和見感染も引き起こされる。これらの点から予
想できる経済的被害は計り知れない額となる。いくつか
のマイコプラズマ・ガリセプティカム抗原タンパク質が
特開平２−１１１７９５号公報で開示されている。しか
し、これらは天然のマイコプラズマ・ガリセプティカム
由来の抗原タンパク質ではなく高い抗原性は期待できな
い。このため、より高い抗原性を有するタンパク質が求
められている。また、前記公報など従来からマイコプラ
ズマ・ガリセプティカム由来の抗原タンパク質を遺伝子
工学的に製造する方法は、大腸菌や酵母を用いた系に限
られていた（特開平２−１１１７５９号公報など）。こ
のような系では、抗原発現量が少ない、発現したタンパ
ク質の抗原性が低下・欠損するなどの原因があるほか、
効果の高い生ワクチンとして利用できない、宿主由来の
発熱性物質が取り除けないなどの問題があり、実用に適
していなかった。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、かかる
従来技術の中で、高い抗原性を示すマイコプラズマ由来
の抗原性を示すポリペプチドを得、また、新たなマイコ
プラズマ・ガリセプティカム由来の抗原性を示すポリペ
プチド製造方法を開発すべく鋭意検討を進めた結果、新
規なマイコプラズマ・ガリセプティカム由来の抗原性を
示すポリペプチドを見いだし、さらにマイコプラズマ・
ガリセプティカム由来の抗原性を示すポリペプチドをコ
ードするＤＮＡを組み込んだ組み換えウイルスを見いだ
し、本発明を完成するに至った。
従来技術の中で、高い抗原性を示すマイコプラズマ由来
の抗原性を示すポリペプチドを得、また、新たなマイコ
プラズマ・ガリセプティカム由来の抗原性を示すポリペ
プチド製造方法を開発すべく鋭意検討を進めた結果、新
規なマイコプラズマ・ガリセプティカム由来の抗原性を
示すポリペプチドを見いだし、さらにマイコプラズマ・
ガリセプティカム由来の抗原性を示すポリペプチドをコ
ードするＤＮＡを組み込んだ組み換えウイルスを見いだ
し、本発明を完成するに至った。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明の新規な抗原性を
示すポリペプチドは、マイコプラズマ・ガリセプティカ
ム免疫血清またはマイコプラズマ・ガリセプティカム感
染血清と抗原抗体反応を呈し、マイコプラズマ・ガリセ
プティカムに由来する図１の制限酵素切断点地図を有す
るＤＮＡ配列がコードする抗原性を示すポリペプチド、
またはその修飾されたものである。このような抗原性を
示すポリペプチドの具体例として、３２キロダルトンの
分子量を有する配列１（配列番号１）に示すごときアミ
ノ酸配列をもつ抗原性を示すポリペプチドが例示され
る。また、ここでいう修飾された抗原性を示すポリペプ
チドとは、上述の抗原性を示すポリペプチドと同等の免
疫原性を示す程度にアミノ酸配列が置換・脱落・欠損・
挿入、付加されたものであるが、好ましくは配列１（配
列番号１）のアミノ酸配列を有する抗原タンパク質と同
等の免疫原性を有し、かつ該タンパク質のアミノ酸配列
との相同性が７０％以上、より好ましくは８０％以上、
更に好ましくは９０％以上のものである。本発明でいう
相同性は、ＤＮＡシーケンス入力解析システム「ＤＮＡ
ＳＩＳ」（発売元：宝酒造（株））により測定されたも
のを指標とするものである。この抗原タンパク質は、常
法にしたがって製造される。例えば、後述する組み換え
バキュロウイルスを用いて製造することができる。
示すポリペプチドは、マイコプラズマ・ガリセプティカ
ム免疫血清またはマイコプラズマ・ガリセプティカム感
染血清と抗原抗体反応を呈し、マイコプラズマ・ガリセ
プティカムに由来する図１の制限酵素切断点地図を有す
るＤＮＡ配列がコードする抗原性を示すポリペプチド、
またはその修飾されたものである。このような抗原性を
示すポリペプチドの具体例として、３２キロダルトンの
分子量を有する配列１（配列番号１）に示すごときアミ
ノ酸配列をもつ抗原性を示すポリペプチドが例示され
る。また、ここでいう修飾された抗原性を示すポリペプ
チドとは、上述の抗原性を示すポリペプチドと同等の免
疫原性を示す程度にアミノ酸配列が置換・脱落・欠損・
挿入、付加されたものであるが、好ましくは配列１（配
列番号１）のアミノ酸配列を有する抗原タンパク質と同
等の免疫原性を有し、かつ該タンパク質のアミノ酸配列
との相同性が７０％以上、より好ましくは８０％以上、
更に好ましくは９０％以上のものである。本発明でいう
相同性は、ＤＮＡシーケンス入力解析システム「ＤＮＡ
ＳＩＳ」（発売元：宝酒造（株））により測定されたも
のを指標とするものである。この抗原タンパク質は、常
法にしたがって製造される。例えば、後述する組み換え
バキュロウイルスを用いて製造することができる。
【０００５】本発明のＤＮＡは、前記抗原性を示すポリ
ペプチドをコードするものであり、具体例としては、配
列１（配列番号１）に示される塩基配列即ち、ＴＭ−１
６ポリペプチドをコードするＤＮＡ、のものが挙げられ
るが、該配列中の塩基が置換・脱落・欠損・挿入、付加
等によって修飾されたものであっても、修飾された遺伝
子がコードする抗原性を示すポリペプチドが本発明のポ
リペプチドと実質的に同等の抗原性を示すかぎり使用で
きる。
ペプチドをコードするものであり、具体例としては、配
列１（配列番号１）に示される塩基配列即ち、ＴＭ−１
６ポリペプチドをコードするＤＮＡ、のものが挙げられ
るが、該配列中の塩基が置換・脱落・欠損・挿入、付加
等によって修飾されたものであっても、修飾された遺伝
子がコードする抗原性を示すポリペプチドが本発明のポ
リペプチドと実質的に同等の抗原性を示すかぎり使用で
きる。
【０００６】また、マイコプラズマ・ガリセプティカム
の抗原性を示すポリペプチドをコードするＤＮＡとして
は、抗マイコプラズマ・ガリセプティカム血清と抗原抗
体反応を呈する抗原性を示すポリペプチドをコードする
ものであれば特に限定されず、後述する本発明の遺伝子
のほか特開平２−１１１７９５号公報に開示された抗原
性を示すポリペプチドをコードするＤＮＡまたはその一
部、あるいはマイコプラズマ・ガリセプティカム由来の
図２に示される制限酵素切断地図を有する４０Ｋｄのポ
リペプチドをコードするＤＮＡ配列１３（配列番号１
３）が挙げられる。配列１３（配列番号１３）で示され
る塩基配列の第９８６番目〜第９８８番目および第１０
４８番目〜１０５０番目の塩基は配列中ではＮＮＮであ
る。これらの塩基は天然のマイコプラズマ・ガリセプテ
ィカムの遺伝子ではＴＧＡであり、マイコプラズマ・ガ
リセプティカム内ではトリプトファンとして翻訳されて
いると予想される（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、１
７２（１）、５０４−５０６（１９９０））。しかし、
通常はＴＧＡは終止コドンであり、アミノ酸をコードす
るものではない。従って、目的とするポリペプチドを発
現させるためには、天然のマイコプラズマ・ガリセプテ
ィカム由来のＤＮＡのＴＧＡをアミノ酸として翻訳され
るような塩基に改変する必要がある。改変の手法は常法
に従えばよく、本発明の実施例ではこれらの塩基を共に
ＴＧＧに改変し、トリプトファンとして翻訳されるよう
にした。このようなＤＮＡの採取源も、前述と同様マイ
コプラズマ・ガリセプティカムに属するものであれば特
に限定されないが、その具体例としてＳ６株（ＡＴＣＣ
１５３０２）、ＰＧ３１（ＡＴＣＣ１９６１０）などが
例示される。また、上記抗原性を示すポリペプチドをコ
ードするＤＮＡの５′上流にβ−ガラクトシダーゼをコ
ードするＤＮＡ、β−ラクタマーゼをコードするＤＮＡ
などの細菌由来の酵素タンパク質をコードするＤＮＡを
適当なリンカーによって結合させた融合ポリペプチドＤ
ＮＡを用いれば、組み換えウイルスの構築に際し、組み
換え体の選択などに便利である。
の抗原性を示すポリペプチドをコードするＤＮＡとして
は、抗マイコプラズマ・ガリセプティカム血清と抗原抗
体反応を呈する抗原性を示すポリペプチドをコードする
ものであれば特に限定されず、後述する本発明の遺伝子
のほか特開平２−１１１７９５号公報に開示された抗原
性を示すポリペプチドをコードするＤＮＡまたはその一
部、あるいはマイコプラズマ・ガリセプティカム由来の
図２に示される制限酵素切断地図を有する４０Ｋｄのポ
リペプチドをコードするＤＮＡ配列１３（配列番号１
３）が挙げられる。配列１３（配列番号１３）で示され
る塩基配列の第９８６番目〜第９８８番目および第１０
４８番目〜１０５０番目の塩基は配列中ではＮＮＮであ
る。これらの塩基は天然のマイコプラズマ・ガリセプテ
ィカムの遺伝子ではＴＧＡであり、マイコプラズマ・ガ
リセプティカム内ではトリプトファンとして翻訳されて
いると予想される（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、１
７２（１）、５０４−５０６（１９９０））。しかし、
通常はＴＧＡは終止コドンであり、アミノ酸をコードす
るものではない。従って、目的とするポリペプチドを発
現させるためには、天然のマイコプラズマ・ガリセプテ
ィカム由来のＤＮＡのＴＧＡをアミノ酸として翻訳され
るような塩基に改変する必要がある。改変の手法は常法
に従えばよく、本発明の実施例ではこれらの塩基を共に
ＴＧＧに改変し、トリプトファンとして翻訳されるよう
にした。このようなＤＮＡの採取源も、前述と同様マイ
コプラズマ・ガリセプティカムに属するものであれば特
に限定されないが、その具体例としてＳ６株（ＡＴＣＣ
１５３０２）、ＰＧ３１（ＡＴＣＣ１９６１０）などが
例示される。また、上記抗原性を示すポリペプチドをコ
ードするＤＮＡの５′上流にβ−ガラクトシダーゼをコ
ードするＤＮＡ、β−ラクタマーゼをコードするＤＮＡ
などの細菌由来の酵素タンパク質をコードするＤＮＡを
適当なリンカーによって結合させた融合ポリペプチドＤ
ＮＡを用いれば、組み換えウイルスの構築に際し、組み
換え体の選択などに便利である。
【０００７】上記抗原タンパク質を有効成分とするコン
ポネントワクチンは、常法にしたがって調製され、希釈
剤、増量剤、アジュバンドなどと混合してもよい。ワク
チンは、体重１ｋｇ当り、抗原タンパク質量１μｇ以上
の量で投与すればよく、上限は、急性毒性を示さない限
り特に限定されず、例えば抗体が中和抗体価として１．
０〜２．０（ｌｏｇ１０）が得られる量を投与すればよ
い。急性毒性は、ニワトリに対し、体重１ｋｇ当たり抗
原タンパク質量５ｍｇの投与では認められない。本発明
で得られた家禽用マイコプラズマ・ガリセプティカム感
染症ワクチンは、筋肉内、皮下または皮内注射等によ
り、家禽に接種する。また、噴霧によって気道に免疫す
るか、あるいは通常の経口投与することも可能である。
ポネントワクチンは、常法にしたがって調製され、希釈
剤、増量剤、アジュバンドなどと混合してもよい。ワク
チンは、体重１ｋｇ当り、抗原タンパク質量１μｇ以上
の量で投与すればよく、上限は、急性毒性を示さない限
り特に限定されず、例えば抗体が中和抗体価として１．
０〜２．０（ｌｏｇ１０）が得られる量を投与すればよ
い。急性毒性は、ニワトリに対し、体重１ｋｇ当たり抗
原タンパク質量５ｍｇの投与では認められない。本発明
で得られた家禽用マイコプラズマ・ガリセプティカム感
染症ワクチンは、筋肉内、皮下または皮内注射等によ
り、家禽に接種する。また、噴霧によって気道に免疫す
るか、あるいは通常の経口投与することも可能である。
【０００８】本発明の組み換えバキュロウイルスは、マ
イコプラズマ・ガリセプティカム由来の抗原性を示すポ
リペプチドをコードするＤＮＡを有するバキュロウイル
スであればよい。
イコプラズマ・ガリセプティカム由来の抗原性を示すポ
リペプチドをコードするＤＮＡを有するバキュロウイル
スであればよい。
【０００９】組み換えバキュロウイルスの作製に供され
るウイルスとしては、昆虫細胞に感染するものであれば
如何なるものでも良く、天然のものであっても、人工的
に作製されたハイブリッドウイルスであっても良い。こ
れらのウイルスの具体例として、オートグラファ・カリ
フォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎ
ｉｃａ）、トリコプルシア・ニ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓ
ｉａ ｎｉ）、ラキブルシア・オウ（Ｒａｃｈｉｐｌｕ
ｓｉａ ｏｕ）、ガレリア・メロネラ（Ｇａｌｌｅｒｉ
ａ ｍｅｌｌｏｎｅｌｌａ）、ボンビックス・モリ（Ｂ
ｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ）などの天然のバキュロウイルス
や、オートグラファ・カリフォルニカとボンビックス・
モリとから作製した、アルファルファワムシにもカイコ
にも感染する能力を有するハイブリッドウイルス（以
下、ＡｃＮＰＶ−ＢｍＮＰＶという；日本蚕糸学会第５
９回学術講演会講演要旨集、日本蚕糸学会編、第５９
頁、１９８９年、柴田ら、日本蚕糸学会第６０回講演会
講演要旨集、日本蚕糸学会、第７８頁、１９９０年、Ｋ
ｏｎｄｏ、Ｍａｅｄａら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、６
５、３６２５−３６３２（１９９１））のようなハイブ
リッドウイルスが例示される。なかでもＡｃＮＰＶ−Ｂ
ｍＮＰＶは、抗原タンパク質の製造に当たり、多種類の
宿主を用いることができることから、とりわけ好まし
い。
るウイルスとしては、昆虫細胞に感染するものであれば
如何なるものでも良く、天然のものであっても、人工的
に作製されたハイブリッドウイルスであっても良い。こ
れらのウイルスの具体例として、オートグラファ・カリ
フォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎ
ｉｃａ）、トリコプルシア・ニ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓ
ｉａ ｎｉ）、ラキブルシア・オウ（Ｒａｃｈｉｐｌｕ
ｓｉａ ｏｕ）、ガレリア・メロネラ（Ｇａｌｌｅｒｉ
ａ ｍｅｌｌｏｎｅｌｌａ）、ボンビックス・モリ（Ｂ
ｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ）などの天然のバキュロウイルス
や、オートグラファ・カリフォルニカとボンビックス・
モリとから作製した、アルファルファワムシにもカイコ
にも感染する能力を有するハイブリッドウイルス（以
下、ＡｃＮＰＶ−ＢｍＮＰＶという；日本蚕糸学会第５
９回学術講演会講演要旨集、日本蚕糸学会編、第５９
頁、１９８９年、柴田ら、日本蚕糸学会第６０回講演会
講演要旨集、日本蚕糸学会、第７８頁、１９９０年、Ｋ
ｏｎｄｏ、Ｍａｅｄａら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、６
５、３６２５−３６３２（１９９１））のようなハイブ
リッドウイルスが例示される。なかでもＡｃＮＰＶ−Ｂ
ｍＮＰＶは、抗原タンパク質の製造に当たり、多種類の
宿主を用いることができることから、とりわけ好まし
い。
【００１０】本発明の組み換えウイルスを構築する方法
は、常法にしたがって行えばよく、例えば次の手順にし
たがって行うことができる。まず、ウイルスの増殖に非
必須なＤＮＡ領域（以下、単に非必須領域という）にプ
ロモーターが挿入されたＤＮＡ断片を組み込んだ第一の
組み換えベクターを作製する。次に前記プロモーターの
下流に前述の抗原遺伝子を挿入して第二の組み換えベク
ターを作製する。第一および第二の組み換えベクターを
作製するに当たっては、大腸菌の系を用いればよく、使
用するベクターも目的に相応しいものであるかぎり、特
に限定されない。ここで使用されるベクターの具体例と
しては、例えばｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＢＲ３
２７、ｐＢＲ３２８、ｐＡｃＹＭ１（Ｖｉｒｏｌｏｇ
ｙ、１７３、６７４−６８２（１９８２））、ｐＡｃ３
７３（Ｐｒｏｃ・Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ、８２、８４０４−８４０８（１９８５））、ｐＵＣ
７、ｐＵＣ８、ｐＵＣ９、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９など
のプラスミド、λ−ファージ、Ｍ１３ファージなどのご
ときファージ、ｐＨＣ７９などのごときコスミドが例示
され、ｐＡｃＹＭ１やｐＡｃ３７３のようなバキュロウ
イルストランスファーベクターとして確立されたプラス
ミドを用いることが好ましい。非必須領域とは、組み込
むウイルスの増殖に非必須であり、かつ相同組み換えな
どにより組み込むウイルスに挿入される領域であれば特
に限定されず、バキュロウイルスの増殖に非必須な領域
としては、ポリヘドリンＤＮＡ（サイエンス（Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ）、２１９、７１５−７２１（１９８３））など
が例示される。
は、常法にしたがって行えばよく、例えば次の手順にし
たがって行うことができる。まず、ウイルスの増殖に非
必須なＤＮＡ領域（以下、単に非必須領域という）にプ
ロモーターが挿入されたＤＮＡ断片を組み込んだ第一の
組み換えベクターを作製する。次に前記プロモーターの
下流に前述の抗原遺伝子を挿入して第二の組み換えベク
ターを作製する。第一および第二の組み換えベクターを
作製するに当たっては、大腸菌の系を用いればよく、使
用するベクターも目的に相応しいものであるかぎり、特
に限定されない。ここで使用されるベクターの具体例と
しては、例えばｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＢＲ３
２７、ｐＢＲ３２８、ｐＡｃＹＭ１（Ｖｉｒｏｌｏｇ
ｙ、１７３、６７４−６８２（１９８２））、ｐＡｃ３
７３（Ｐｒｏｃ・Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ、８２、８４０４−８４０８（１９８５））、ｐＵＣ
７、ｐＵＣ８、ｐＵＣ９、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９など
のプラスミド、λ−ファージ、Ｍ１３ファージなどのご
ときファージ、ｐＨＣ７９などのごときコスミドが例示
され、ｐＡｃＹＭ１やｐＡｃ３７３のようなバキュロウ
イルストランスファーベクターとして確立されたプラス
ミドを用いることが好ましい。非必須領域とは、組み込
むウイルスの増殖に非必須であり、かつ相同組み換えな
どにより組み込むウイルスに挿入される領域であれば特
に限定されず、バキュロウイルスの増殖に非必須な領域
としては、ポリヘドリンＤＮＡ（サイエンス（Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ）、２１９、７１５−７２１（１９８３））など
が例示される。
【００１１】また、本発明で用いられるプロモーターと
は、合成・天然を問わずＤＮＡを組み込むウイルスが保
有する転写の系でプロモーターとして有効に機能しうる
ものなら如何なる塩基配列のものでもよく、バキュロウ
イルスのポリヘドリンをコードする遺伝子のプロモータ
ー（以下、ポリヘドリンプロモーターという）や１０Ｋ
ポリペプチドをコードするバキュロウイルスＤＮＡのプ
ロモーターなどが例示される。
は、合成・天然を問わずＤＮＡを組み込むウイルスが保
有する転写の系でプロモーターとして有効に機能しうる
ものなら如何なる塩基配列のものでもよく、バキュロウ
イルスのポリヘドリンをコードする遺伝子のプロモータ
ー（以下、ポリヘドリンプロモーターという）や１０Ｋ
ポリペプチドをコードするバキュロウイルスＤＮＡのプ
ロモーターなどが例示される。
【００１２】最終的に組み換えウイルスを作製するに
は、第二の組み換えベクターをウイルスと混合した後、
宿主として用いる培養細胞に移入し、あるいは第二の組
み換えベクターを予めウイルスで感染させた宿主として
用いる培養細胞に移入し、ベクターＤＮＡとウイルスゲ
ノムＤＮＡの間に相同組み換えを起こさせ、組み換えウ
イルスを構築する。ここで宿主として用いる培養細胞と
は、使用するウイルスが感染・増殖可能なものであれば
特に限定されず、バキュロウイルスを用いる場合には、
通常、昆虫培養細胞が使用され、このような細胞の具体
例としては、Ｓｆ９細胞やＢｍＮ細胞などが挙げられ
る。培養条件は、予備実験によって容易に決定できる
が、具体的には、Ｓｆ９細胞を用いた場合は１０％ウシ
胎児血清を含む培地で、２８℃で培養することが望まし
い。このようにして構築された組み換えウイルスは、常
法、例えばプラークアッセイなどによって純化される。
は、第二の組み換えベクターをウイルスと混合した後、
宿主として用いる培養細胞に移入し、あるいは第二の組
み換えベクターを予めウイルスで感染させた宿主として
用いる培養細胞に移入し、ベクターＤＮＡとウイルスゲ
ノムＤＮＡの間に相同組み換えを起こさせ、組み換えウ
イルスを構築する。ここで宿主として用いる培養細胞と
は、使用するウイルスが感染・増殖可能なものであれば
特に限定されず、バキュロウイルスを用いる場合には、
通常、昆虫培養細胞が使用され、このような細胞の具体
例としては、Ｓｆ９細胞やＢｍＮ細胞などが挙げられ
る。培養条件は、予備実験によって容易に決定できる
が、具体的には、Ｓｆ９細胞を用いた場合は１０％ウシ
胎児血清を含む培地で、２８℃で培養することが望まし
い。このようにして構築された組み換えウイルスは、常
法、例えばプラークアッセイなどによって純化される。
【００１３】本発明の組み換え生ワクチンは、上記のよ
うにして得られる組み換えウイルスを有効成分とするも
のである。例えば、本発明の組み換えウイルスが成育す
ることのできる細胞を、本発明の組み換えウイルスに感
染させ、組み換えウイルスが増殖するまで培養する。そ
の後、細胞を回収し破砕する。この細胞破砕物を遠心分
離機によって遠心分離チューブ中で沈澱物と組み換えウ
イルスを含んだ非細胞依存性の高力価遠心上清とに分離
する。実質的に宿主細胞を含まず、細胞培養培地と組み
換えウイルスを含んだこの遠心上清は、本発明のワクチ
ンとして使用できる。また、薬理学的に受け入れられる
生理食塩水等の様な物で再構成して使用する。遠心上清
を凍結乾燥した凍結乾燥ワクチンとしても使用できる。
うにして得られる組み換えウイルスを有効成分とするも
のである。例えば、本発明の組み換えウイルスが成育す
ることのできる細胞を、本発明の組み換えウイルスに感
染させ、組み換えウイルスが増殖するまで培養する。そ
の後、細胞を回収し破砕する。この細胞破砕物を遠心分
離機によって遠心分離チューブ中で沈澱物と組み換えウ
イルスを含んだ非細胞依存性の高力価遠心上清とに分離
する。実質的に宿主細胞を含まず、細胞培養培地と組み
換えウイルスを含んだこの遠心上清は、本発明のワクチ
ンとして使用できる。また、薬理学的に受け入れられる
生理食塩水等の様な物で再構成して使用する。遠心上清
を凍結乾燥した凍結乾燥ワクチンとしても使用できる。
【００１４】本発明の生ワクチンは、ワクチン中の組み
換えウイルスが家禽に感染して防御免疫反応を引き起こ
すような方法であれば、どのような方法で家禽に投与し
てもよい。例えば、皮膚に引っかき傷をつけてワクチン
を接種したり、注射針やその他の器具等によって、家禽
の皮下にワクチン接種することができる。また、ワクチ
ンを家禽の飲み水に懸濁したり、飼料等の固形物に混入
して、経口接種させることも可能である。さらに、エア
ロゾルやスプレーによるワクチンを吸入させる方法、静
脈内接種法、筋肉中接種法、腹腔内接種法、翼膜接種
法、発育卵接種法等を用いることもできる。
換えウイルスが家禽に感染して防御免疫反応を引き起こ
すような方法であれば、どのような方法で家禽に投与し
てもよい。例えば、皮膚に引っかき傷をつけてワクチン
を接種したり、注射針やその他の器具等によって、家禽
の皮下にワクチン接種することができる。また、ワクチ
ンを家禽の飲み水に懸濁したり、飼料等の固形物に混入
して、経口接種させることも可能である。さらに、エア
ロゾルやスプレーによるワクチンを吸入させる方法、静
脈内接種法、筋肉中接種法、腹腔内接種法、翼膜接種
法、発育卵接種法等を用いることもできる。
【００１５】接種量は、例えば鶏の場合、１羽あたり、
通常、１０２〜１０７ＰＦＵ（プラーク形成単位）であ
る。注射する場合には、この量を生理食塩水などの生理
学的に受け入れられる液体で希釈したりして０．０１〜
１ｍｌ程度にすればよい。
通常、１０２〜１０７ＰＦＵ（プラーク形成単位）であ
る。注射する場合には、この量を生理食塩水などの生理
学的に受け入れられる液体で希釈したりして０．０１〜
１ｍｌ程度にすればよい。
【００１６】本発明の抗原性を示すポリペプチドの製造
方法は、上述の方法によって作製され、純化された組み
換えバキュロウイルスを宿主である昆虫または昆虫の樹
立細胞に感染させ、感染虫を飼育または感染細胞を培養
して抗原性を示すポリペプチドを発現させることによっ
て実現される。宿主として用いられる昆虫または昆虫の
樹立細胞とは、通常、バキュロウイルスベクターの系で
宿主として使用されるものであれば特に制限されるもの
ではないが、例えば、昆虫としてヨウトウガ、カイコ
ガ、アワヨウトウガ、セロクピア蚕、アルファルファワ
ムシ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃ
ａ）、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｅｘｉｇｕａ、Ｔｒｉｃ
ｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ等の幼虫、さなぎ、成虫等の虫体
が、また、昆虫の樹立細胞としてＳｆ細胞（例えばＩＰ
ＬＢ−Ｓｆ−２１ＡＥ細胞、Ｓｆ９細胞等）、ＴＮ細胞
およびＢｍ細胞（例えば、ＢｍＮ細胞、ＳＥＳ−ＢｏＭ
ｏ−１５Ａ細胞、ＥＳＥ−ＢｏＭｏ−１５ＡＩＩ細胞、
ＥＩＳＥＳ−ＢｏＭｏ−１５ＡＩＩｅ細胞、ＮＩＳＥＳ
−ＢｏＭｏ−ＣａｍＩ細胞等）が挙げられる。例えば、
バキュロウイルスとしてＡｃＮＰＶ−ＢｍＮＰＶを用い
た場合、Ｓｆ細胞やＢｍ細胞、およびカイコやヨトウガ
の虫体内（幼虫、成虫あるいはさなぎ）等の昆虫または
昆虫の樹立細胞で増殖可能である。感染後の宿主の飼育
または培養方法は、特に制限はなく、通常の方法が用い
られる。即ち、昆虫を用いる場合であれば、虫体に本発
明の組み換えバキュロウイルスを適当な溶媒に懸濁さ
せ、それを注射して２０〜３０℃で飼育する方法、昆虫
の樹立細胞を用いる場合であれば、前記細胞へ適当な培
地に懸濁した本発明の組み換えバキュロウイルスを感染
させ、２０〜３０℃で培養する方法等が例示される。飼
育または培養後、当業者によく知られているクロマトグ
ラフィー、塩析による沈澱、密度勾配遠心等から任意に
選択した方法により、目的とする抗原タンパク質が精製
される。こうして得られた抗原性を示すポリペプチド
は、コンポネントワクチンとして用いることができる。
勿論、精製せずに虫体や培養細胞に含まれた状態のポリ
ペプチドであっても本発明のコンポネントワクチンとし
て使用してもよい。
方法は、上述の方法によって作製され、純化された組み
換えバキュロウイルスを宿主である昆虫または昆虫の樹
立細胞に感染させ、感染虫を飼育または感染細胞を培養
して抗原性を示すポリペプチドを発現させることによっ
て実現される。宿主として用いられる昆虫または昆虫の
樹立細胞とは、通常、バキュロウイルスベクターの系で
宿主として使用されるものであれば特に制限されるもの
ではないが、例えば、昆虫としてヨウトウガ、カイコ
ガ、アワヨウトウガ、セロクピア蚕、アルファルファワ
ムシ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃ
ａ）、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｅｘｉｇｕａ、Ｔｒｉｃ
ｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ等の幼虫、さなぎ、成虫等の虫体
が、また、昆虫の樹立細胞としてＳｆ細胞（例えばＩＰ
ＬＢ−Ｓｆ−２１ＡＥ細胞、Ｓｆ９細胞等）、ＴＮ細胞
およびＢｍ細胞（例えば、ＢｍＮ細胞、ＳＥＳ−ＢｏＭ
ｏ−１５Ａ細胞、ＥＳＥ−ＢｏＭｏ−１５ＡＩＩ細胞、
ＥＩＳＥＳ−ＢｏＭｏ−１５ＡＩＩｅ細胞、ＮＩＳＥＳ
−ＢｏＭｏ−ＣａｍＩ細胞等）が挙げられる。例えば、
バキュロウイルスとしてＡｃＮＰＶ−ＢｍＮＰＶを用い
た場合、Ｓｆ細胞やＢｍ細胞、およびカイコやヨトウガ
の虫体内（幼虫、成虫あるいはさなぎ）等の昆虫または
昆虫の樹立細胞で増殖可能である。感染後の宿主の飼育
または培養方法は、特に制限はなく、通常の方法が用い
られる。即ち、昆虫を用いる場合であれば、虫体に本発
明の組み換えバキュロウイルスを適当な溶媒に懸濁さ
せ、それを注射して２０〜３０℃で飼育する方法、昆虫
の樹立細胞を用いる場合であれば、前記細胞へ適当な培
地に懸濁した本発明の組み換えバキュロウイルスを感染
させ、２０〜３０℃で培養する方法等が例示される。飼
育または培養後、当業者によく知られているクロマトグ
ラフィー、塩析による沈澱、密度勾配遠心等から任意に
選択した方法により、目的とする抗原タンパク質が精製
される。こうして得られた抗原性を示すポリペプチド
は、コンポネントワクチンとして用いることができる。
勿論、精製せずに虫体や培養細胞に含まれた状態のポリ
ペプチドであっても本発明のコンポネントワクチンとし
て使用してもよい。
【００１７】
【発明の効果】本発明の組み換えバキュロウイルスを用
いれば従来の技術に比較して効率よくマイコプラズマ・
ガリセプティカムに抗原性を示すポリペプチドを製造す
ることができる。また、本発明の新規な抗原性を示すポ
リペプチドは、家禽マイコプラズマ・ガリセプティカム
感染症に対するワクチンとして有用であると共に、マイ
コプラズマ・ガリセプティカム感染症診断薬としても有
用である。
いれば従来の技術に比較して効率よくマイコプラズマ・
ガリセプティカムに抗原性を示すポリペプチドを製造す
ることができる。また、本発明の新規な抗原性を示すポ
リペプチドは、家禽マイコプラズマ・ガリセプティカム
感染症に対するワクチンとして有用であると共に、マイ
コプラズマ・ガリセプティカム感染症診断薬としても有
用である。
【００１８】以下本発明を実施例および参考例により説
明するが、本発明は勿論これらにより限定されるもので
はない。
明するが、本発明は勿論これらにより限定されるもので
はない。
【００１９】〔参考例−１〕 マイコプラズマ・ガリセプティカムが発現しているポリ
ペプチドＤＮＡＴＴＭ−１の取得 （１） マイコプラズマ・ガリセプティカム・ゲノムＤ
ＮＡの調製 マイコプラズマ・ガリセプティカムＳ６株を１００ｍｌ
のＰＰＬＯブロス基礎培地に２０％馬血清、５％酵母エ
キス、１％グルコース、およびｐＨ指示薬としてフェノ
ールレッドを微量加えて調製した液体培地で、３７℃３
〜５日培養した。マイコプラズマ・ガリセプティカムの
増殖に従って培養液のｐＨが下がり、培養液に含まれて
いるｐＨ指示薬の呈色が赤から黄に変化した時点で、培
養を終了し、培養液を８０００Ｇ、２０分間遠心し、集
菌した。さらに菌体を培養液の１／１０容量のＰＢＳに
懸濁し、再び１０，０００ｒｐｍ×Ｇ、２０分間遠心
し、集菌した。収集菌体を再び２．７ｍｌのＰＢＳに懸
濁し、１％になる様にＳＤＳを、さらに１０μｇのＲＮ
ａｓｅを加え、３７℃３０分間インキュベートし溶菌し
た。溶菌液を等容量のフェノールで３回抽出しさらに、
エチルエーテルで３回抽出を行なった後エタノール沈澱
し、マイコプラズマ・ガリセプティカム・ゲノムＤＮＡ
２００μｇを得た。
ペプチドＤＮＡＴＴＭ−１の取得 （１） マイコプラズマ・ガリセプティカム・ゲノムＤ
ＮＡの調製 マイコプラズマ・ガリセプティカムＳ６株を１００ｍｌ
のＰＰＬＯブロス基礎培地に２０％馬血清、５％酵母エ
キス、１％グルコース、およびｐＨ指示薬としてフェノ
ールレッドを微量加えて調製した液体培地で、３７℃３
〜５日培養した。マイコプラズマ・ガリセプティカムの
増殖に従って培養液のｐＨが下がり、培養液に含まれて
いるｐＨ指示薬の呈色が赤から黄に変化した時点で、培
養を終了し、培養液を８０００Ｇ、２０分間遠心し、集
菌した。さらに菌体を培養液の１／１０容量のＰＢＳに
懸濁し、再び１０，０００ｒｐｍ×Ｇ、２０分間遠心
し、集菌した。収集菌体を再び２．７ｍｌのＰＢＳに懸
濁し、１％になる様にＳＤＳを、さらに１０μｇのＲＮ
ａｓｅを加え、３７℃３０分間インキュベートし溶菌し
た。溶菌液を等容量のフェノールで３回抽出しさらに、
エチルエーテルで３回抽出を行なった後エタノール沈澱
し、マイコプラズマ・ガリセプティカム・ゲノムＤＮＡ
２００μｇを得た。
【００２０】（２） ＴＭ−１ＤＮＡをプローブにした
マイコプラズマ・ガリセプティカムのゲノミックサザン
ハイブリダイゼーション 上記（１）で取得したマイコプラズマ・ガリセプティカ
ムＤＮＡ１μｇをＸｂａＩで消化し、０．６％低融点ア
ガロースゲル電気泳動に供した。泳動後ゲルをアルカリ
変性液（０．５Ｍ ＮａＯＨ、１．５Ｍ ＮａＣｌ）に
１０分間浸しＤＮＡを変性させ、中和液（３Ｍ酢酸ナト
リウムｐＨ５．５）に１０分間浸して中和の後６倍ＳＳ
Ｃ液（０．７Ｍ ＮａＣｌ、０．０７Ｍクエン酸ナトリ
ウム、ｐＨ７．５）中でナイロンメンブレンに転写し
た。風乾の後８０℃で２時間焼き付け、４倍ＳＥＴ
（０．６Ｍ ＮａＣｌ、０．０８Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ、４ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ７．８）−１０倍Ｄｅｎｈａ
ｒｄｔ−０．１％ ＳＤＳ−０．１％Ｎａ４Ｐ２Ｏ７−
５０μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡとｐＵＭ−１（特開
平２−１１１７９５号参照）を常法に従い標識したもの
を加えて、６８℃１４時間ハイブリダイゼーションをし
た。ナイロンメンブレンとＸ線フィルムを重ね、オート
ラジオグラフィーで確認したところ、約３．４ｋｐｂの
断片にハイブリダイズしていることを確認した。
マイコプラズマ・ガリセプティカムのゲノミックサザン
ハイブリダイゼーション 上記（１）で取得したマイコプラズマ・ガリセプティカ
ムＤＮＡ１μｇをＸｂａＩで消化し、０．６％低融点ア
ガロースゲル電気泳動に供した。泳動後ゲルをアルカリ
変性液（０．５Ｍ ＮａＯＨ、１．５Ｍ ＮａＣｌ）に
１０分間浸しＤＮＡを変性させ、中和液（３Ｍ酢酸ナト
リウムｐＨ５．５）に１０分間浸して中和の後６倍ＳＳ
Ｃ液（０．７Ｍ ＮａＣｌ、０．０７Ｍクエン酸ナトリ
ウム、ｐＨ７．５）中でナイロンメンブレンに転写し
た。風乾の後８０℃で２時間焼き付け、４倍ＳＥＴ
（０．６Ｍ ＮａＣｌ、０．０８Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ、４ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ７．８）−１０倍Ｄｅｎｈａ
ｒｄｔ−０．１％ ＳＤＳ−０．１％Ｎａ４Ｐ２Ｏ７−
５０μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡとｐＵＭ−１（特開
平２−１１１７９５号参照）を常法に従い標識したもの
を加えて、６８℃１４時間ハイブリダイゼーションをし
た。ナイロンメンブレンとＸ線フィルムを重ね、オート
ラジオグラフィーで確認したところ、約３．４ｋｐｂの
断片にハイブリダイズしていることを確認した。
【００２１】（３） ＸｂａＩ消化約３．４ｋｂｐ断片
のｐＵＣ−１９へのクローニング及びコロニーハイブリ
ダイゼーション （１）で取得したマイコプラズマ・ガリセプティカムＤ
ＮＡ４μｇを制限酵素ＸｂａＩで消化後、０．６％低融
点アガロースゲル電気泳動後、約３．４ｋｂｐの断片を
回収した。この断片を、ＸｂａＩ消化によって開裂した
ｐＵＣ−１９とリガーゼによって連結し、コンピテント
な大腸菌ＴＧ１株を形質転換し、５−ブロモ−４−クロ
ロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド０．
００３％、イソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトピラノ
シド０．０３ｍＭ、４０μｇ／ｍｌアンピシリンを含む
ＬＢ寒天培地で３７℃、１５時間培養した。この培地上
に生育した白コロニーをナイロンメンブレンに転写し、
上記（２）と同様の方法でハイブリダイゼーションを行
ない、オートラジオグラフィーで確認したところ、クロ
ーニングされていることが判明し、このプラスミドをｐ
ＵＴＴＭ−１と名付けた。
のｐＵＣ−１９へのクローニング及びコロニーハイブリ
ダイゼーション （１）で取得したマイコプラズマ・ガリセプティカムＤ
ＮＡ４μｇを制限酵素ＸｂａＩで消化後、０．６％低融
点アガロースゲル電気泳動後、約３．４ｋｂｐの断片を
回収した。この断片を、ＸｂａＩ消化によって開裂した
ｐＵＣ−１９とリガーゼによって連結し、コンピテント
な大腸菌ＴＧ１株を形質転換し、５−ブロモ−４−クロ
ロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド０．
００３％、イソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトピラノ
シド０．０３ｍＭ、４０μｇ／ｍｌアンピシリンを含む
ＬＢ寒天培地で３７℃、１５時間培養した。この培地上
に生育した白コロニーをナイロンメンブレンに転写し、
上記（２）と同様の方法でハイブリダイゼーションを行
ない、オートラジオグラフィーで確認したところ、クロ
ーニングされていることが判明し、このプラスミドをｐ
ＵＴＴＭ−１と名付けた。
【００２２】〔参考例−２〕 （１） ＴＴＭ−１がコードするポリペプチドＴＴＭＧ
１を、ＴＧＡが翻訳終結コドンとして読まれないように
改変（ＴＧＡ→ＴＧＧ）したＴＴＭ−１′の作製（図３
参照） 上記１−（３）のｐＵＴＴＭ−１を制限酵素ＳａｃＩと
ＥｃｏＲＩで消化後０．８％低融点アガロースゲル電気
泳動に供し、ＴＴＭ−１の５′端を含む１．１ｋｂｐの
ＤＮＡ断片をフェノール−クロロホルム処理後エタノー
ル沈澱により回収し、この断片とＭ１３ｍｐ１１ファー
ジをＳａｃＩとＥｃｏＲＩで開裂させた断片とをリガー
ゼにより連結した。この反応溶液と、３７℃で２４時間
培養した大腸菌ＴＧ１に最終的に１００ｍＭとなるよう
にＩＰＴＧを加えてＸ−ｇａｌが２％となるようにさら
に加えた溶液とｍ．ｏ．ｉ．が０．１になるよう混合し
軟寒天上に撒いて固化させ、３７℃、２４時間インキュ
ベートする。出現したファージプラークのうち青変して
いないファージからＴＴＭ−１の１．１ｋｂｐＤＮＡを
含む組み換えファージＴＴＭ−１Ｎを得た。同様に、ｐ
ＵＴＴＭ−１をＥｃｏＲＩとＥｃｏＲＶで消化後、０．
８％低融点アガロースゲル電気泳動に供し、ＴＴＭ−１
の３′末端側を含む０．４ｋｂｐの断片をゲルより回収
し、フェノール・クロロホルム処理後エタノール沈澱に
より回収し、この断片をＭ１３ｍｐ１０ファージをＥｃ
ｏＲＩとＥｃｏＲＶで開裂させた断片とリガーゼにより
連結した。この反応溶液から１．１ｋｂｐＤＮＡのクロ
ーニングと同様の方法で、ＴＴＭ−１の０．４ｋｂｐＤ
ＮＡを含む組み換えファージＴＴＭ−１Ｃを得た。 （２）各組み換えファージから一本鎖ＤＮＡの調製 上記（１）で得られた二種類の組み換えファージについ
て、１００ｍｌの２×ＹＴ培地で３７℃で増殖している
大腸菌ＴＧ１にｍ．ｏ．ｉ．＝０．１になるようにそれ
ぞれ加え、３７℃で５時間振盪培養後５０００Ｇで３０
分遠心分離し、大腸菌菌体成分を除いた上清を取得す
る。この上清に０．２倍量のポリエチレングリコール／
塩化ナトリウム混合溶液（２０％ポリエチレングリコー
ル＃６０００、２．５Ｍ ＮａＣｌ）を加え４℃で１時
間静置後５０００Ｇで２０分遠心分離し、沈澱を回収す
る。この沈澱を５００μｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭＴｒ
ｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）に溶か
し、フェノール・クロロホルム抽出後、エタノール沈澱
で各組み換えファージの単鎖ＤＮＡを回収した。
１を、ＴＧＡが翻訳終結コドンとして読まれないように
改変（ＴＧＡ→ＴＧＧ）したＴＴＭ−１′の作製（図３
参照） 上記１−（３）のｐＵＴＴＭ−１を制限酵素ＳａｃＩと
ＥｃｏＲＩで消化後０．８％低融点アガロースゲル電気
泳動に供し、ＴＴＭ−１の５′端を含む１．１ｋｂｐの
ＤＮＡ断片をフェノール−クロロホルム処理後エタノー
ル沈澱により回収し、この断片とＭ１３ｍｐ１１ファー
ジをＳａｃＩとＥｃｏＲＩで開裂させた断片とをリガー
ゼにより連結した。この反応溶液と、３７℃で２４時間
培養した大腸菌ＴＧ１に最終的に１００ｍＭとなるよう
にＩＰＴＧを加えてＸ−ｇａｌが２％となるようにさら
に加えた溶液とｍ．ｏ．ｉ．が０．１になるよう混合し
軟寒天上に撒いて固化させ、３７℃、２４時間インキュ
ベートする。出現したファージプラークのうち青変して
いないファージからＴＴＭ−１の１．１ｋｂｐＤＮＡを
含む組み換えファージＴＴＭ−１Ｎを得た。同様に、ｐ
ＵＴＴＭ−１をＥｃｏＲＩとＥｃｏＲＶで消化後、０．
８％低融点アガロースゲル電気泳動に供し、ＴＴＭ−１
の３′末端側を含む０．４ｋｂｐの断片をゲルより回収
し、フェノール・クロロホルム処理後エタノール沈澱に
より回収し、この断片をＭ１３ｍｐ１０ファージをＥｃ
ｏＲＩとＥｃｏＲＶで開裂させた断片とリガーゼにより
連結した。この反応溶液から１．１ｋｂｐＤＮＡのクロ
ーニングと同様の方法で、ＴＴＭ−１の０．４ｋｂｐＤ
ＮＡを含む組み換えファージＴＴＭ−１Ｃを得た。 （２）各組み換えファージから一本鎖ＤＮＡの調製 上記（１）で得られた二種類の組み換えファージについ
て、１００ｍｌの２×ＹＴ培地で３７℃で増殖している
大腸菌ＴＧ１にｍ．ｏ．ｉ．＝０．１になるようにそれ
ぞれ加え、３７℃で５時間振盪培養後５０００Ｇで３０
分遠心分離し、大腸菌菌体成分を除いた上清を取得す
る。この上清に０．２倍量のポリエチレングリコール／
塩化ナトリウム混合溶液（２０％ポリエチレングリコー
ル＃６０００、２．５Ｍ ＮａＣｌ）を加え４℃で１時
間静置後５０００Ｇで２０分遠心分離し、沈澱を回収す
る。この沈澱を５００μｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭＴｒ
ｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）に溶か
し、フェノール・クロロホルム抽出後、エタノール沈澱
で各組み換えファージの単鎖ＤＮＡを回収した。
【００２３】（３） 人工合成オリゴヌクレオチドをプ
ライマーとする位置特異的変異体の作製 このようにして得られたＤＮＡには、配列の途中にＴＧ
Ａがある。このＴＧＡは、通常の細胞内では、終止コド
ンとして認識されてしまい、これより後ろに付加してい
る配列を翻訳しなくなる。そこで、ＴＧＡ部分をメチオ
ニンとして翻訳するようにコドンＮＮＮの第３番目の塩
基に当たる塩基アデニンをグアニンに改変するために、
次の２つのオリゴヌクレオチドを合成した。
ライマーとする位置特異的変異体の作製 このようにして得られたＤＮＡには、配列の途中にＴＧ
Ａがある。このＴＧＡは、通常の細胞内では、終止コド
ンとして認識されてしまい、これより後ろに付加してい
る配列を翻訳しなくなる。そこで、ＴＧＡ部分をメチオ
ニンとして翻訳するようにコドンＮＮＮの第３番目の塩
基に当たる塩基アデニンをグアニンに改変するために、
次の２つのオリゴヌクレオチドを合成した。
【００２４】
【化１】
【００２５】
【化２】
【００２６】化１のオリゴヌクレオチドはＴＴＭ−１Ｎ
の単鎖ＤＮＡと、化２のオリゴヌクレオチドはＴＴＭ−
１Ｃの単鎖ＤＮＡとアニールさせ、Ｆｒｉｔｓ Ｅｃｋ
ｓｔｅｉｎらの方法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅ
ｓｅａｒｃｈ ８７４９−８７６４、１９８５）によっ
て、目的の変異をおこさせて、得られた組み換えファー
ジを各々ＴＴＭ−１Ｎ′、ＴＴＭ−１Ｃ′と命名した。
得られたＴＴＭ−１Ｎ′、ＴＴＭ−１Ｃ′ファージＤＮ
Ａをそれぞれ制限酵素ＳａｃＩ−ＥｃｏＲＩ、ＥｃｏＲ
Ｉ−ＢｇｌＩＩで切断し、０．８％低融点アガロース電
気泳動によって１．１ｋｂｐ、０．４ｋｂｐの断片をア
ガロースゲルより抽出し、エタノール沈澱で回収した。
一方プラスミドｐＵＴＴＭ−１もＳａｃＩ−ＢｇｌＩＩ
で切断し、４．８ｋｂｐのベクターを含む断片を０．８
％低融点アガロースゲル電気泳動から回収し、エタノー
ル沈澱で回収した。こうして得られた３つの断片をリガ
ーゼにより連結し、この連結した３つの断片を用いてコ
ンピテントな大腸菌ＴＧ１株を形質転換し、目的の位置
に変異がおきたＴＴＭ−１′を持つプラスミドｐＵＴＴ
Ｍ−１′を得た。ＴＴＭ−１′の塩基配列は、Ｓａｎｇ
ａｒらのＤｉｄｅｏｘｙ法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７４、５４６３（１９７７））
によれば配列１３（配列番号１３）に示す通りであっ
た。これは、天然のＭ．ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍの
４０キロダルトンのＴＴＭ−１ポリペプチドと実質的に
同一のものである。
の単鎖ＤＮＡと、化２のオリゴヌクレオチドはＴＴＭ−
１Ｃの単鎖ＤＮＡとアニールさせ、Ｆｒｉｔｓ Ｅｃｋ
ｓｔｅｉｎらの方法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅ
ｓｅａｒｃｈ ８７４９−８７６４、１９８５）によっ
て、目的の変異をおこさせて、得られた組み換えファー
ジを各々ＴＴＭ−１Ｎ′、ＴＴＭ−１Ｃ′と命名した。
得られたＴＴＭ−１Ｎ′、ＴＴＭ−１Ｃ′ファージＤＮ
Ａをそれぞれ制限酵素ＳａｃＩ−ＥｃｏＲＩ、ＥｃｏＲ
Ｉ−ＢｇｌＩＩで切断し、０．８％低融点アガロース電
気泳動によって１．１ｋｂｐ、０．４ｋｂｐの断片をア
ガロースゲルより抽出し、エタノール沈澱で回収した。
一方プラスミドｐＵＴＴＭ−１もＳａｃＩ−ＢｇｌＩＩ
で切断し、４．８ｋｂｐのベクターを含む断片を０．８
％低融点アガロースゲル電気泳動から回収し、エタノー
ル沈澱で回収した。こうして得られた３つの断片をリガ
ーゼにより連結し、この連結した３つの断片を用いてコ
ンピテントな大腸菌ＴＧ１株を形質転換し、目的の位置
に変異がおきたＴＴＭ−１′を持つプラスミドｐＵＴＴ
Ｍ−１′を得た。ＴＴＭ−１′の塩基配列は、Ｓａｎｇ
ａｒらのＤｉｄｅｏｘｙ法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７４、５４６３（１９７７））
によれば配列１３（配列番号１３）に示す通りであっ
た。これは、天然のＭ．ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍの
４０キロダルトンのＴＴＭ−１ポリペプチドと実質的に
同一のものである。
【００２７】〔参考例３〕 挿入用ベクターｐＮＺ１７
２９Ｒの構築 ＮＰ株のＥｃｏＲＩ断片（約７．３ｋｂｐ）をｐＵＣ１
８のＥｃｏＲＩ切断部位（マルチクローニング部位の末
端）に組み込んでプラスミドｐＮＺ１３３（約１０．０
ｋｂｐ）を得た。このプラスミドから、ＨｐａＩ−Ｓｐ
ｅＩ断片（約３．０ｋｂｐのＮＰ株由来断片）を切り出
し、該断片をクレノー（Ｋｌｅｎｏｗ）断片により平滑
末端とした。またｐＵＣ１８からＲｃｏＲＩ−Ｈｉｎｄ
ＩＩＩ断片（５２ｂｐのマルチクローニング部位）を除
き、残りの断片をクレノー断片で平滑末端とした。かく
して得られたこの２つの断片をつないで、プラスミドと
し、ＨｐａＩ−ＳｐｅＩ断片中のＥｃｏＲＶ部位を除い
て、そこにｐＵＣ１８のＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断
片（５２ｂｐのマルチクローニング部位）をＨｉｎｄＩ
ＩＩリンカー（５′−ＣＡＡＧＣＴＴＧ−３′）とＥｃ
ｏＲＩリンカー（５′−ＧＧＡＡＴＴＣＣ−３′）を用
いて組み込み、プラスミドｐＮＺ１３３ＳＲを構築し
た。
２９Ｒの構築 ＮＰ株のＥｃｏＲＩ断片（約７．３ｋｂｐ）をｐＵＣ１
８のＥｃｏＲＩ切断部位（マルチクローニング部位の末
端）に組み込んでプラスミドｐＮＺ１３３（約１０．０
ｋｂｐ）を得た。このプラスミドから、ＨｐａＩ−Ｓｐ
ｅＩ断片（約３．０ｋｂｐのＮＰ株由来断片）を切り出
し、該断片をクレノー（Ｋｌｅｎｏｗ）断片により平滑
末端とした。またｐＵＣ１８からＲｃｏＲＩ−Ｈｉｎｄ
ＩＩＩ断片（５２ｂｐのマルチクローニング部位）を除
き、残りの断片をクレノー断片で平滑末端とした。かく
して得られたこの２つの断片をつないで、プラスミドと
し、ＨｐａＩ−ＳｐｅＩ断片中のＥｃｏＲＶ部位を除い
て、そこにｐＵＣ１８のＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断
片（５２ｂｐのマルチクローニング部位）をＨｉｎｄＩ
ＩＩリンカー（５′−ＣＡＡＧＣＴＴＧ−３′）とＥｃ
ｏＲＩリンカー（５′−ＧＧＡＡＴＴＣＣ−３′）を用
いて組み込み、プラスミドｐＮＺ１３３ＳＲを構築し
た。
【００２８】配列２（配列番号２）と配列３（配列番号
３）（１７ベースのＦＰＶプロモーターを含み、１ａｃ
Ｚのための翻訳開始コドンが連なっている）をアニーリ
ングして２本鎖にし、１ａｃＺ遺伝子（ｐＭＣ１８７１
及びｐＭＡ００１由来、Ｓｉｒａｋａｗａ ｅｔ．ａ
ｌ．，Ｇｅｎｅ，２８，１２７−１３２，１９８４）と
アニーリングした配列４（配列番号４）と配列５（配列
番号５）、配列６（配列番号６）、配列７（配列番号
７）と配列８（配列番号８）、配列９（配列番号９）と
配列１０（配列番号１０）と配列１１（配列番号１１）
とを結合させ（配列４の５′側末端のＡＧＣの次のＴか
ら配列６の３′側末端のＧの前のＣまでに塩基配列ＴＴ
ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＧＧＣＡＴＡＴ
ＡＡＡＴＡＡＴＡＡＡＴＡＣＡＡＴＡＡＴＴＡＡＴＴＡ
ＣＧＣＧＴＡＡＡＡＡＴＴＧＡＡＡＡＡＣＴＡＴＴＣＴ
ＡＡＴＴＴＡＴＴＧＣＡＣＴＣで示されるポックスウイ
ルスの合成プロモーターの改変物を含み、さらにマルチ
クローニング部位及び両方向のポックスウイルス初期転
写終結信号（配列番号１２）（Ｙｕｅｎ ｅｔ．ａ
ｌ．，ＰＮＡＳ，８８，６４１７−６４２１，１９８９
年）が連なっている）、ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断
片（約３．５ｋｂｐ、図１の中央に示す）を得た。その
ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を、ｐＮＺ１３３ＳＲ
に挿入し、プラスミドｐＮＺ１７２９Ｒを完成させた。
３）（１７ベースのＦＰＶプロモーターを含み、１ａｃ
Ｚのための翻訳開始コドンが連なっている）をアニーリ
ングして２本鎖にし、１ａｃＺ遺伝子（ｐＭＣ１８７１
及びｐＭＡ００１由来、Ｓｉｒａｋａｗａ ｅｔ．ａ
ｌ．，Ｇｅｎｅ，２８，１２７−１３２，１９８４）と
アニーリングした配列４（配列番号４）と配列５（配列
番号５）、配列６（配列番号６）、配列７（配列番号
７）と配列８（配列番号８）、配列９（配列番号９）と
配列１０（配列番号１０）と配列１１（配列番号１１）
とを結合させ（配列４の５′側末端のＡＧＣの次のＴか
ら配列６の３′側末端のＧの前のＣまでに塩基配列ＴＴ
ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＧＧＣＡＴＡＴ
ＡＡＡＴＡＡＴＡＡＡＴＡＣＡＡＴＡＡＴＴＡＡＴＴＡ
ＣＧＣＧＴＡＡＡＡＡＴＴＧＡＡＡＡＡＣＴＡＴＴＣＴ
ＡＡＴＴＴＡＴＴＧＣＡＣＴＣで示されるポックスウイ
ルスの合成プロモーターの改変物を含み、さらにマルチ
クローニング部位及び両方向のポックスウイルス初期転
写終結信号（配列番号１２）（Ｙｕｅｎ ｅｔ．ａ
ｌ．，ＰＮＡＳ，８８，６４１７−６４２１，１９８９
年）が連なっている）、ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断
片（約３．５ｋｂｐ、図１の中央に示す）を得た。その
ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を、ｐＮＺ１３３ＳＲ
に挿入し、プラスミドｐＮＺ１７２９Ｒを完成させた。
【００２９】
【実施例−１】 マイコプラズマ・ガリセプティカムが発現しているポリ
ペプチドＤＮＡ ＴＭ−１６の取得
ペプチドＤＮＡ ＴＭ−１６の取得
【００３０】（１） Ｍ−１６ＤＮＡをプロープにした
マイコプラズマ・ガリセプティカムのゲノミックサザン
ハイブリダイゼーション 上記参考例１−（１）で取得したマイコプラズマ・ガリ
セプティカムＤＮＡ１μｇをＸｂａＩで消化し、０．６
％低融点アガロースゲル電気泳動に供した。泳動後ゲル
をアルカリ変性液（０．５Ｍ ＮａＯＨ、１．５Ｍ Ｎ
ａＣｌ）に１０分間浸しＤＮＡを変性させ、中和液（３
Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ５．５）に１０分間浸して中和の
後６倍ＳＳＣ液（０．７Ｍ ＮａＣｌ、０．０７Ｍクエ
ン酸ナトリウム、ｐＨ７．５）中でナイロンメンブレン
に転写した。風乾の後８０℃で２時間焼き付け、４倍Ｓ
ＥＴ（０．６Ｍ ＮａＣｌ、０．０８Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ、４ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ７．８）−１０倍Ｄｅｎｈ
ａｒｄｔ−０．１％ ＳＤＳ−０．１％Ｎａ４Ｐ２Ｏ７
−５０μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡとｐＵＭ−１６
（このプラスミド内にＭ−１６ＤＮＡが含まれている；
特開平２−１１１７９５号参照）を常法に従い標識した
ものを加えて、６８℃１４時間ハイブリダイゼーション
をした。ナイロンメンブレンとＸ線フィルムを重ね、オ
ートラジオグラフィーで確認したところ、約５．５ｋｂ
ｐの断片にハイブリダイズしていることを確認した。
マイコプラズマ・ガリセプティカムのゲノミックサザン
ハイブリダイゼーション 上記参考例１−（１）で取得したマイコプラズマ・ガリ
セプティカムＤＮＡ１μｇをＸｂａＩで消化し、０．６
％低融点アガロースゲル電気泳動に供した。泳動後ゲル
をアルカリ変性液（０．５Ｍ ＮａＯＨ、１．５Ｍ Ｎ
ａＣｌ）に１０分間浸しＤＮＡを変性させ、中和液（３
Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ５．５）に１０分間浸して中和の
後６倍ＳＳＣ液（０．７Ｍ ＮａＣｌ、０．０７Ｍクエ
ン酸ナトリウム、ｐＨ７．５）中でナイロンメンブレン
に転写した。風乾の後８０℃で２時間焼き付け、４倍Ｓ
ＥＴ（０．６Ｍ ＮａＣｌ、０．０８Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ、４ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ７．８）−１０倍Ｄｅｎｈ
ａｒｄｔ−０．１％ ＳＤＳ−０．１％Ｎａ４Ｐ２Ｏ７
−５０μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡとｐＵＭ−１６
（このプラスミド内にＭ−１６ＤＮＡが含まれている；
特開平２−１１１７９５号参照）を常法に従い標識した
ものを加えて、６８℃１４時間ハイブリダイゼーション
をした。ナイロンメンブレンとＸ線フィルムを重ね、オ
ートラジオグラフィーで確認したところ、約５．５ｋｂ
ｐの断片にハイブリダイズしていることを確認した。
【００３１】（２） ＸｂａＩ消化約５．５ｋｂｐ断片
のｐＵＣ−１９へのクローニング及びコロニーハイブリ
ダイゼーション 上記参考例１−（１）で取得したマイコプラズマ・ガリ
セプティカムＤＮＡ４μｇを制限酵素ＸｂａＩで消化
後、０．６％低融点アガロースゲル電気泳動後、約５．
５ｋｂｐの断片を回収した。この断片を、ＸｂａＩ消化
によって開裂したｐＵＣ−１９とリガーゼによって連結
し、コンピテントな大腸菌ＴＧ１株を形質転換し、５−
ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラク
トピラノシド０．００３％、イソプロピルチオ−β−Ｄ
−ガラクトピラノシド０．０３ｍＭ、４０μｇ／ｍｌア
ンピシリンを含むＬＢ寒天培地で３７℃、１５時間培養
した。この培地上に生育した白コロニーをナイロンメン
ブレンに転写し、上記（２）と同様の方法でハイブリダ
イゼーションを行ない、オートラジオグラフィーで確認
したところ、クローニングされていることが判明し、こ
のプラスミドをｐＵＭ−１６と名付けた。
のｐＵＣ−１９へのクローニング及びコロニーハイブリ
ダイゼーション 上記参考例１−（１）で取得したマイコプラズマ・ガリ
セプティカムＤＮＡ４μｇを制限酵素ＸｂａＩで消化
後、０．６％低融点アガロースゲル電気泳動後、約５．
５ｋｂｐの断片を回収した。この断片を、ＸｂａＩ消化
によって開裂したｐＵＣ−１９とリガーゼによって連結
し、コンピテントな大腸菌ＴＧ１株を形質転換し、５−
ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラク
トピラノシド０．００３％、イソプロピルチオ−β−Ｄ
−ガラクトピラノシド０．０３ｍＭ、４０μｇ／ｍｌア
ンピシリンを含むＬＢ寒天培地で３７℃、１５時間培養
した。この培地上に生育した白コロニーをナイロンメン
ブレンに転写し、上記（２）と同様の方法でハイブリダ
イゼーションを行ない、オートラジオグラフィーで確認
したところ、クローニングされていることが判明し、こ
のプラスミドをｐＵＭ−１６と名付けた。
【００３２】（３） ｐＵＭ−１６インサートＤＮＡの
配列分析 上記（２）で作製したｐＵＭ−１６内に挿入された約
５．５ｋｂｐの断片の配列をＳａｎｇｅｒらのＤｉｄｅ
ｏｘｙ法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ．、７４、５４６３（１９７７））によって解析し
た。この断片の制限酵素切断点地図を図２に示す。ま
た、この断片中に存在するオープンリーディングフレー
ム（以下ＯＲＦという）の制限酵素切断点地図を図４に
示し、このＯＲＦの塩基配列及びそれから推定されるア
ミノ酸配列を配列１（配列番号１）に示す。このＯＲＦ
から推定されるポリペプチドをＴＭ−１６ポリペプチド
と命名した。
配列分析 上記（２）で作製したｐＵＭ−１６内に挿入された約
５．５ｋｂｐの断片の配列をＳａｎｇｅｒらのＤｉｄｅ
ｏｘｙ法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ．、７４、５４６３（１９７７））によって解析し
た。この断片の制限酵素切断点地図を図２に示す。ま
た、この断片中に存在するオープンリーディングフレー
ム（以下ＯＲＦという）の制限酵素切断点地図を図４に
示し、このＯＲＦの塩基配列及びそれから推定されるア
ミノ酸配列を配列１（配列番号１）に示す。このＯＲＦ
から推定されるポリペプチドをＴＭ−１６ポリペプチド
と命名した。
【００３３】
【実施例−２】 ＴＭ−１６ポリペプチド発現リコンビナントウイルスの
作製 （１） ＴＭ−１６の開始コドン（ＡＴＧ）直前及び終
止コドン（ＴＡＡ）直後への制限酵素サイト挿入したプ
ラスミドｐＭＵＴＡＢの構築（図５参照） ｐＵＭ−１６を、ＥｃｏＲＩとＰｓｔＩで消化後、０．
８％低融点アガロースゲル電気泳動に供し、ＴＭ−１６
の５′末端側を含む約１０００ｂｐの断片をゲルより回
収し、これをフェノール、クロロホルム処理した後、エ
タノール沈澱により再回収した。次いで、この断片と、
予めＭ１３ｍｐ１０ファージをＥｃｏＲＩとＰｓｔＩで
開裂させて得た断片とをリガーゼにより連結した。この
反応液を、３７℃で２４時間培養した大腸菌ＴＧ１に最
終的に１００ｍＭとなるようにＩＰＴＧ（イソプロピル
チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）を加えてＸ−ｇａ
ｌが２％となるようにさらに加えた溶液と、ｍ．ｏ．
ｉ．が０．１になるように混合し、軟寒天上に撒いて固
化させ、３７℃、２４時間インキュベートした。出現し
たファージプラークのうち、青変していない組み換えフ
ァージから、上記１０００ｂｐ断片を含んでいるファー
ジＴＭ−１６Ｌ′を得た。次に、単鎖ＤＮＡ ５′−ＣＴＣＡＧＴＧＧＡＴＣＣＡＧＡＧＡＴＧ−３′ を合成し、ＴＭ−１６Ｌ′から常法によって得た一本鎖
ファージとアニールさせ、Ｆｒｉｔｓ Ｅｃｋｓｔｅｉ
ｎらの方法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒ
ｃｈ ８７４９−８７６４、１９８５）によって目的の
変異をおこさせて、得られた組み換えファージＴＭ−１
６Ｌを、ＸｂａＩ、ＮｈｅＩで切断し、約９８０ｂｐの
断片を０．８％アガロースゲル電気泳動によって回収
し、エタノール沈澱で回収した。また、ｐＵＭ−１６を
ＶｓｐＩで消化後、ＢａｍＨＩリンカーを常法に従い結
合させ、約７３０ｂｐの断片を回収した。この断片をｐ
ＵＣ１８をＢａｍＨＩで切断した部位に組み込んでプラ
スミドｐＵＭ−１６Ｒを得た。このプラスミドとＸｂａ
Ｉ、ＮｈｅＩで切断したベクター部を含む断片と、上記
９８０ｂｐ断片の三断片をリガーゼによって結合させ、
目的のプラスミドｐＭＵＴＡＢを得た。
作製 （１） ＴＭ−１６の開始コドン（ＡＴＧ）直前及び終
止コドン（ＴＡＡ）直後への制限酵素サイト挿入したプ
ラスミドｐＭＵＴＡＢの構築（図５参照） ｐＵＭ−１６を、ＥｃｏＲＩとＰｓｔＩで消化後、０．
８％低融点アガロースゲル電気泳動に供し、ＴＭ−１６
の５′末端側を含む約１０００ｂｐの断片をゲルより回
収し、これをフェノール、クロロホルム処理した後、エ
タノール沈澱により再回収した。次いで、この断片と、
予めＭ１３ｍｐ１０ファージをＥｃｏＲＩとＰｓｔＩで
開裂させて得た断片とをリガーゼにより連結した。この
反応液を、３７℃で２４時間培養した大腸菌ＴＧ１に最
終的に１００ｍＭとなるようにＩＰＴＧ（イソプロピル
チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）を加えてＸ−ｇａ
ｌが２％となるようにさらに加えた溶液と、ｍ．ｏ．
ｉ．が０．１になるように混合し、軟寒天上に撒いて固
化させ、３７℃、２４時間インキュベートした。出現し
たファージプラークのうち、青変していない組み換えフ
ァージから、上記１０００ｂｐ断片を含んでいるファー
ジＴＭ−１６Ｌ′を得た。次に、単鎖ＤＮＡ ５′−ＣＴＣＡＧＴＧＧＡＴＣＣＡＧＡＧＡＴＧ−３′ を合成し、ＴＭ−１６Ｌ′から常法によって得た一本鎖
ファージとアニールさせ、Ｆｒｉｔｓ Ｅｃｋｓｔｅｉ
ｎらの方法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒ
ｃｈ ８７４９−８７６４、１９８５）によって目的の
変異をおこさせて、得られた組み換えファージＴＭ−１
６Ｌを、ＸｂａＩ、ＮｈｅＩで切断し、約９８０ｂｐの
断片を０．８％アガロースゲル電気泳動によって回収
し、エタノール沈澱で回収した。また、ｐＵＭ−１６を
ＶｓｐＩで消化後、ＢａｍＨＩリンカーを常法に従い結
合させ、約７３０ｂｐの断片を回収した。この断片をｐ
ＵＣ１８をＢａｍＨＩで切断した部位に組み込んでプラ
スミドｐＵＭ−１６Ｒを得た。このプラスミドとＸｂａ
Ｉ、ＮｈｅＩで切断したベクター部を含む断片と、上記
９８０ｂｐ断片の三断片をリガーゼによって結合させ、
目的のプラスミドｐＭＵＴＡＢを得た。
【００３４】（２） ＴＭ−１６ＤＮＡを含有するトラ
ンスファーベクターｐＡｃＺＭ１６の構築 （１）で得たｐＭＵＴＡＢをＢａｍＨＩで消化後０．８
％アガロースゲル電気泳動し、ゲルより約１０５０ｂｐ
の断片を回収した。一方バキュロウイルストランスファ
ーベクターｐＡＣＹＭ１〔Ｍａｔｓｕｕｖａ Ｓ．Ｖｉ
ｒｏｌｏｇｙ、１７３ ６７４−６８２（１９８９）〕
をＢａｍＨＩで開裂させ、得られた断片をさきほどの約
１０５０ｂｐ断片と、リガーゼにより連結することによ
り、目的のトランスファーベクターｐＡｃＺＭ１６を得
た。このベクターには、ポリヘドリンＤＮＡ内にポリヘ
ドリンプロモーターの支配下となる様にＴＭ−１６ＤＮ
Ａが挿入されているものである。
ンスファーベクターｐＡｃＺＭ１６の構築 （１）で得たｐＭＵＴＡＢをＢａｍＨＩで消化後０．８
％アガロースゲル電気泳動し、ゲルより約１０５０ｂｐ
の断片を回収した。一方バキュロウイルストランスファ
ーベクターｐＡＣＹＭ１〔Ｍａｔｓｕｕｖａ Ｓ．Ｖｉ
ｒｏｌｏｇｙ、１７３ ６７４−６８２（１９８９）〕
をＢａｍＨＩで開裂させ、得られた断片をさきほどの約
１０５０ｂｐ断片と、リガーゼにより連結することによ
り、目的のトランスファーベクターｐＡｃＺＭ１６を得
た。このベクターには、ポリヘドリンＤＮＡ内にポリヘ
ドリンプロモーターの支配下となる様にＴＭ−１６ＤＮ
Ａが挿入されているものである。
【００３５】（３） 組み換えバキュロウイルスの作出 Ｆ．Ｌ．グラハムらの論文（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２巻
１９７３年 ４５６−４６７頁）に記載されている方法
に準じ、ＡｃＮＰＶ−ＢｍＮＰＶハイブリッドウイルス
のゲノムＤＮＡ １μｇを上記（２）で得られたトラン
スファーベクターｐＡｃＡＺＭ１６ １〜１０μｇと混
合し、１５μｇ／ｍｌの仔牛胸腺ＤＮＡを含む、１−Ｈ
ＥＰＥＳ（Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ′
−２−エタンスルホン酸）緩衝液（ｐＨ７．０）で９５
０μｌにした。混合物をスターラで攪拌しながら５０ｍ
ｌの２．５Ｍ ＣａＣｌ２を滴下し、沈澱を室温で３０
分間形成させた。１ｍｌの沈澱したＤＮＡをＳｆ細胞培
養プレートに添加した。４時間後、細胞を培地で洗浄
し、１０％ウシ胎児血清を含む２ｍｌの培地を加えて、
３日間インキュベートした。その後、組み換え及び非組
み換えウイルスが混じっている培地を集め、組み換えウ
イルスを単離するため、適当に希釈し、単層培養したＳ
ｆ細胞に感染させ、プラークを形成させた。核多角体を
形成しないプラークを選び、そのプラークから組み換え
バキュロウイルスを回収した。この組み換えバキュロウ
イルスをＴＭ−１６リコンビナントウイルスと命名し
た。
１９７３年 ４５６−４６７頁）に記載されている方法
に準じ、ＡｃＮＰＶ−ＢｍＮＰＶハイブリッドウイルス
のゲノムＤＮＡ １μｇを上記（２）で得られたトラン
スファーベクターｐＡｃＡＺＭ１６ １〜１０μｇと混
合し、１５μｇ／ｍｌの仔牛胸腺ＤＮＡを含む、１−Ｈ
ＥＰＥＳ（Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ′
−２−エタンスルホン酸）緩衝液（ｐＨ７．０）で９５
０μｌにした。混合物をスターラで攪拌しながら５０ｍ
ｌの２．５Ｍ ＣａＣｌ２を滴下し、沈澱を室温で３０
分間形成させた。１ｍｌの沈澱したＤＮＡをＳｆ細胞培
養プレートに添加した。４時間後、細胞を培地で洗浄
し、１０％ウシ胎児血清を含む２ｍｌの培地を加えて、
３日間インキュベートした。その後、組み換え及び非組
み換えウイルスが混じっている培地を集め、組み換えウ
イルスを単離するため、適当に希釈し、単層培養したＳ
ｆ細胞に感染させ、プラークを形成させた。核多角体を
形成しないプラークを選び、そのプラークから組み換え
バキュロウイルスを回収した。この組み換えバキュロウ
イルスをＴＭ−１６リコンビナントウイルスと命名し
た。
【００３６】
【実施例−３】 ３：カイコ虫体内での発現 カイコ蛹（蛹になってから、２５℃で２日間経過したも
の）実施例２（３）で得られたＴＭ−１６リコンビナン
トウイルス（５×１０５ＰＦＵ）を体節間膜から注射し
た。ウイルス接種後、蛹は２５℃に保った。その後、感
染された蛹虫体を摩砕し、その摩砕液に緩衝液を加え、
ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて検出した。なお、ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥは、２０ｍＡの電流のもとで１２．５％ポリアク
リルアミドゲルを用いて、約２時間電気泳動を行い、得
られたゲルをクーマシーブリリアントブルーで染色して
検出を行った。
の）実施例２（３）で得られたＴＭ−１６リコンビナン
トウイルス（５×１０５ＰＦＵ）を体節間膜から注射し
た。ウイルス接種後、蛹は２５℃に保った。その後、感
染された蛹虫体を摩砕し、その摩砕液に緩衝液を加え、
ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて検出した。なお、ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥは、２０ｍＡの電流のもとで１２．５％ポリアク
リルアミドゲルを用いて、約２時間電気泳動を行い、得
られたゲルをクーマシーブリリアントブルーで染色して
検出を行った。
【００３７】
【実施例−４】 カイコ蛹で産生されたＴＭ−１６ポリペプチドの鶏にお
ける免疫効果 カイコ中で発現したＴＭ−１６ポリペプチドの有効性を
確認するために実施例１により作製されたＴＭ−１６リ
コンビナントウイルス接種後４日目のカイコ幼虫１０頭
に１３ｍｌのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を加え、バー
チスホモゲナイザーで粉砕し、β−プロピオラクトンを
加えウイルスを不活化した。６，０００ｒｐｍ３０分間
遠心した上清１０ｍｌにＰＢＳ１９ｍｌ、レオドールＡ
Ｏ−１５（セスキオレイン酸ソルビタン 花王株式会社
製）４．５ｍｌ、レオドールＴＷ−０２０（モノオレイ
ン酸ポリオキシエチレン（２０）ソルビタン 花王株式
会社製）０．５ｍｌ、カーネーション（流動パラフィン
Ｗｉｔｃｏ Ｃｏｒｐ．社製）６５ｍｌおよび１０％
ホルマリン１．０ｍｌを加え、オイルアジュバントワク
チンを作製した。
ける免疫効果 カイコ中で発現したＴＭ−１６ポリペプチドの有効性を
確認するために実施例１により作製されたＴＭ−１６リ
コンビナントウイルス接種後４日目のカイコ幼虫１０頭
に１３ｍｌのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を加え、バー
チスホモゲナイザーで粉砕し、β−プロピオラクトンを
加えウイルスを不活化した。６，０００ｒｐｍ３０分間
遠心した上清１０ｍｌにＰＢＳ１９ｍｌ、レオドールＡ
Ｏ−１５（セスキオレイン酸ソルビタン 花王株式会社
製）４．５ｍｌ、レオドールＴＷ−０２０（モノオレイ
ン酸ポリオキシエチレン（２０）ソルビタン 花王株式
会社製）０．５ｍｌ、カーネーション（流動パラフィン
Ｗｉｔｃｏ Ｃｏｒｐ．社製）６５ｍｌおよび１０％
ホルマリン１．０ｍｌを加え、オイルアジュバントワク
チンを作製した。
【００３８】このオイルアジュバントワクチンを４９日
齢のＳＰＦ白色レグホンに１．０ｍｌずつ接種し、接種
後、３週目に鶏から血清を採取し常法に従いＥＬＩＳＡ
で抗ＴＭ−１６抗体価を測定した（表１）。また、接種
後６週目にマイコプラズマ・ガリセプティカムＫＰ１３
株（Ｎａｔｌ．Ｉｎｓｔ．Ａｎｉｍ．Ｈｅａｌｔｈ．
Ｑ、４、６８−（１９６４））、１０６ｃ．ｆ．ｕを鶏
に点鼻攻撃した。攻撃後４日目に鶏をと殺し、眼窩下洞
を綿棒を用いてぬぐい取り、ＰＴＬＯ培地で１６８時間
培養後、さらに同培地に継代して菌分離の有無で、感染
防御効果を判定した（表２）。
齢のＳＰＦ白色レグホンに１．０ｍｌずつ接種し、接種
後、３週目に鶏から血清を採取し常法に従いＥＬＩＳＡ
で抗ＴＭ−１６抗体価を測定した（表１）。また、接種
後６週目にマイコプラズマ・ガリセプティカムＫＰ１３
株（Ｎａｔｌ．Ｉｎｓｔ．Ａｎｉｍ．Ｈｅａｌｔｈ．
Ｑ、４、６８−（１９６４））、１０６ｃ．ｆ．ｕを鶏
に点鼻攻撃した。攻撃後４日目に鶏をと殺し、眼窩下洞
を綿棒を用いてぬぐい取り、ＰＴＬＯ培地で１６８時間
培養後、さらに同培地に継代して菌分離の有無で、感染
防御効果を判定した（表２）。
【００３９】
【表１】
【００４０】
【表２】
【００４１】この結果により、ＴＭ−１６リコンビナン
ト感染虫体は抗ＴＭ−１６ポリペプチド抗体を効果的に
誘導するだけでなく、マイコプラズマ・ガリセプティカ
ムの感染も防御し、マイコプラズマ・ガリセプティカム
感染症に有効なワクチンとして使用できる。
ト感染虫体は抗ＴＭ−１６ポリペプチド抗体を効果的に
誘導するだけでなく、マイコプラズマ・ガリセプティカ
ムの感染も防御し、マイコプラズマ・ガリセプティカム
感染症に有効なワクチンとして使用できる。
【００４２】
【実施例−４】 ＴＴＭ−１ポリペプチド発現リコンビナントウイルスの
作製 （１） １−１ 合成プロモーターとＴＴＭ−１ＤＮＡ
を結合したプラスミドｐＵＴＴＭ１Ｄの構築 参考例２で得たＴＴＭ−１ ＤＮＡ全長を含むプラスミ
ドｐＵＴＴＭ１′（ＷＯ ９３／２４６４６公報参照）
のうちＴＴＭ−１ポリペプチドの開始コドンにあたるＡ
ＴＧの上流に制限酵素ＤｒａＩ切断部位をつくるため
に、まず次のオリゴヌクレオチドを合成した。 ３′−ＴＡＴＡＧＡＡＴＴＡＡＡＴＴＴＴＡＣＴＴＡＴ
ＴＣ−５′ つぎに、ｐＵＴＴＭ−１′を制限酵素ＳａｃＩとＥｃｏ
ＲＩで消化後約２３００ｂｐの断片を回収し、これをＭ
１３ｍｐ１０のＳａｃＩとＥｃｏＲＩで開裂させた断片
と連結し単鎖組み換えファージＴＴＭ−１′を得た。上
記オリゴヌクレオチドと単鎖ＴＴＭ−１′とをアニール
させ、Ｆｒｉｔｓ Ｅｃｋｓｔｅｉｎらの方法（Ｎｕｃ
ｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ８７４９−８
７６４，１９８５）によって目的の変異をおこさせた。
この変異組み換えファージＤＮＡを制限酵素ＳａｃＩと
ＥｃｏＲＩで消化後約２３００ｂｐの断片を回収し、再
びｐＵＴＴＭ−１′をＳａｃＩとＥｃｏＲＩで消化した
ベクターを含んだ断片にクローニングし、ｐＵＴＴＭ１
Ｄを得た。 （２） ＴＴＭ−１ＤＮＡを含有するトランスファーベ
クターｐＡｃＺＭ−１の構築（図６参照） （１）で作製したプラスミドｐＵＴＴＭＩＤを制限酵素
ＳｓｐＩで開裂させた後、フェノール・クロロホルム処
理し、エタノール沈澱により、開裂したｐＵＴＴＭＩＤ
を回収した。この開裂したｐＵＴＴＭＩＤをＤＮＡ−ポ
リメラーゼＩでＫｌｅｎｏｗ処理し、接着末端を平滑末
端にして、フェノール・クロロホルム処理、エタノール
沈澱によりＤＮＡを回収した。次にＢｇｌＩＩで切断
し、約１２００ｂｐのＴＴＭ−１ ＤＮＡを含む断片
（）を、０．８％アガロース電気泳動により回収し
た。一方、バキュロウイルストランスファーベクターｐ
ＡＣＹＭ１〔Ｍａｔｓｕｕｒａ、Ｓ．Ｖｉｒｏｌｏｇ
ｙ、１７３ ６７４−６８２（１９８９）〕を制限酵素
ＢａｍＨＩで開裂させた後、フェノールクロロホルム処
理、エタノール沈殿により、開裂したｐＡｃＹＭ１を回
収した。この開裂したｐＡｃＹＭ１をＤＮＡ−ポリメラ
ーゼＩでＫｌｅｎｏｗ処理し接着末端を平滑末端にして
フェノール・クロロホルム処理、エタノール沈殿により
ＤＮＡを回収した。平滑末端になった開裂ｐＡｃＹＭ１
を制限酵素ＸｈｏＩで切断し、約２１００ｂｐの断片
（）を、０．８％アガロース電気泳動により回収し
た。またｐＡｃＹＭ１をＸｈｏＩ、ＢａｍＨＩで切断し
た後約７１００ｂｐの断片も同様にして回収した。
の３断片を混合し、リガーゼによって連結し、目的
のトランスファーベクターｐＡｃＺＭ−１を得た。
作製 （１） １−１ 合成プロモーターとＴＴＭ−１ＤＮＡ
を結合したプラスミドｐＵＴＴＭ１Ｄの構築 参考例２で得たＴＴＭ−１ ＤＮＡ全長を含むプラスミ
ドｐＵＴＴＭ１′（ＷＯ ９３／２４６４６公報参照）
のうちＴＴＭ−１ポリペプチドの開始コドンにあたるＡ
ＴＧの上流に制限酵素ＤｒａＩ切断部位をつくるため
に、まず次のオリゴヌクレオチドを合成した。 ３′−ＴＡＴＡＧＡＡＴＴＡＡＡＴＴＴＴＡＣＴＴＡＴ
ＴＣ−５′ つぎに、ｐＵＴＴＭ−１′を制限酵素ＳａｃＩとＥｃｏ
ＲＩで消化後約２３００ｂｐの断片を回収し、これをＭ
１３ｍｐ１０のＳａｃＩとＥｃｏＲＩで開裂させた断片
と連結し単鎖組み換えファージＴＴＭ−１′を得た。上
記オリゴヌクレオチドと単鎖ＴＴＭ−１′とをアニール
させ、Ｆｒｉｔｓ Ｅｃｋｓｔｅｉｎらの方法（Ｎｕｃ
ｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ８７４９−８
７６４，１９８５）によって目的の変異をおこさせた。
この変異組み換えファージＤＮＡを制限酵素ＳａｃＩと
ＥｃｏＲＩで消化後約２３００ｂｐの断片を回収し、再
びｐＵＴＴＭ−１′をＳａｃＩとＥｃｏＲＩで消化した
ベクターを含んだ断片にクローニングし、ｐＵＴＴＭ１
Ｄを得た。 （２） ＴＴＭ−１ＤＮＡを含有するトランスファーベ
クターｐＡｃＺＭ−１の構築（図６参照） （１）で作製したプラスミドｐＵＴＴＭＩＤを制限酵素
ＳｓｐＩで開裂させた後、フェノール・クロロホルム処
理し、エタノール沈澱により、開裂したｐＵＴＴＭＩＤ
を回収した。この開裂したｐＵＴＴＭＩＤをＤＮＡ−ポ
リメラーゼＩでＫｌｅｎｏｗ処理し、接着末端を平滑末
端にして、フェノール・クロロホルム処理、エタノール
沈澱によりＤＮＡを回収した。次にＢｇｌＩＩで切断
し、約１２００ｂｐのＴＴＭ−１ ＤＮＡを含む断片
（）を、０．８％アガロース電気泳動により回収し
た。一方、バキュロウイルストランスファーベクターｐ
ＡＣＹＭ１〔Ｍａｔｓｕｕｒａ、Ｓ．Ｖｉｒｏｌｏｇ
ｙ、１７３ ６７４−６８２（１９８９）〕を制限酵素
ＢａｍＨＩで開裂させた後、フェノールクロロホルム処
理、エタノール沈殿により、開裂したｐＡｃＹＭ１を回
収した。この開裂したｐＡｃＹＭ１をＤＮＡ−ポリメラ
ーゼＩでＫｌｅｎｏｗ処理し接着末端を平滑末端にして
フェノール・クロロホルム処理、エタノール沈殿により
ＤＮＡを回収した。平滑末端になった開裂ｐＡｃＹＭ１
を制限酵素ＸｈｏＩで切断し、約２１００ｂｐの断片
（）を、０．８％アガロース電気泳動により回収し
た。またｐＡｃＹＭ１をＸｈｏＩ、ＢａｍＨＩで切断し
た後約７１００ｂｐの断片も同様にして回収した。
の３断片を混合し、リガーゼによって連結し、目的
のトランスファーベクターｐＡｃＺＭ−１を得た。
【００４３】（３） ＴＴＭ−１ＤＮＡを含むリコンビ
ナントウイルス 実施例２（３）において、トランスファーベクターとし
てｐＡｃＺＭ１６のかわりにｐＡｃＺＭ−１を用いる以
外同様の操作によって得られた組み換えバキュロウイル
スをＴＴＭ−１リコンビナントと命名した。以下に配列
番号１から配列番号１３の配列を示す。尚、配列番号２
から配列番号１２まではいずれも相補配列なので３′−
末端から表記している。
ナントウイルス 実施例２（３）において、トランスファーベクターとし
てｐＡｃＺＭ１６のかわりにｐＡｃＺＭ−１を用いる以
外同様の操作によって得られた組み換えバキュロウイル
スをＴＴＭ−１リコンビナントと命名した。以下に配列
番号１から配列番号１３の配列を示す。尚、配列番号２
から配列番号１２まではいずれも相補配列なので３′−
末端から表記している。
【配列１】
【００４４】
【配列２】
【００４５】
【配列３】
【００４６】
【配列４】
【００４７】
【配列５】
【００４８】
【配列６】
【００４９】
【配列７】
【００５０】
【配列８】
【００５１】
【配列９】
【００５２】
【配列１０】
【００５３】
【配列１１】
【００５４】
【配列１２】
【００５５】
【配列１３】
【図面の簡単な説明】
【図１】ＴＭ−１６ポリペプチド全長をコードするＤＮ
Ａの制限酵素切断点地図。
Ａの制限酵素切断点地図。
【図２】ＴＴＭ−１ポリペプチド全長をコードするＤＮ
Ａの制限酵素切断点地図。
Ａの制限酵素切断点地図。
【図３】ＴＴＭ−ＩＮ及びＴＴＭ−ＩＣの作製方法。
【図４】ＴＭ−１６ポリペプチドをコードするＤＮＡ近
傍のオープンリディングフレーム制限酵素切断点地図。
傍のオープンリディングフレーム制限酵素切断点地図。
【図５】ｐＭＵＴＡＢの作製方法。
【図６】ｐＡｃＺＭ１の作製方法。
─────────────────────────────────────────────────────
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成６年６月２日
【手続補正１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図６】
【図５】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 9282−4Ｂ //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:92） (72)発明者 船戸 洋乃 埼玉県草加市吉町３−３−７ (72)発明者 入谷 好一 京都府京都市伏見区深草大亀谷万帖敷町 151番地 (72)発明者 青山 茂美 滋賀県甲賀郡水口町貴生川370−13 (72)発明者 高橋 清人 滋賀県栗太郡栗東町小平井71−21
Claims (8)
- 【請求項１】 マイコプラズマ・ガリセプティカム免疫
血清またはマイコプラズマ・ガリセプティカム感染血清
に反応しうる実質的に純粋な抗原タンパク質であって、
図１に示される制限酵素切断点地図を有するマイコプラ
ズマ・ガリセプティカム由来の遺伝子がコードする分子
量約３２キロダルトンの抗原タンパク質、またはそれと
同等の免疫性を示す限りにおいて修飾されていてもよい
抗原タンパク質。 - 【請求項２】 請求項１記載の抗原タンパク質をコード
する遺伝子。 - 【請求項３】 請求項１記載の抗原タンパク質を有効成
分とするコンポネントワクチン。 - 【請求項４】 マイコプラズマ・ガリセプティカムの抗
原タンパク質をコードする遺伝子を組み込んだ組み換え
ウイルス。 - 【請求項５】 用いるウイルスがアビポックスウイルス
およびバキュロウイルスから選ばれるウイルスである請
求項４記載の組み換えウイルス。 - 【請求項６】 組み込む遺伝子が、分子量約４０キロダ
ルトンのマイコプラズマ・ガリセプティカムの抗原タン
パク質をコードする遺伝子であって図４に示す制限酵素
切断点地図を有する遺伝子および請求項２記載の遺伝子
から選ばれる遺伝子である請求項４または５記載の組み
換えウイルス。 - 【請求項７】 用いるウイルスがアビポックスウイルス
である請求項４または６記載の組み換えウイルスを有効
成分とした抗家禽マイコプラズマ・ガリセプティカム感
染症用組み換え生ワクチン。 - 【請求項８】 用いるウイルスがバキュロウイルスであ
る請求項４または６記載の組み換えウイルスを用いるこ
とを特徴とするマイコプラズマ・ガリセプティカムの抗
原タンパク質の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP21310293A JPH07133295A (ja) | 1993-08-27 | 1993-08-27 | 新規な抗原タンパク質、その遺伝子、及び組み換えバキュロウイルスとその利用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP21310293A JPH07133295A (ja) | 1993-08-27 | 1993-08-27 | 新規な抗原タンパク質、その遺伝子、及び組み換えバキュロウイルスとその利用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07133295A true JPH07133295A (ja) | 1995-05-23 |
Family
ID=16633610
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP21310293A Pending JPH07133295A (ja) | 1993-08-27 | 1993-08-27 | 新規な抗原タンパク質、その遺伝子、及び組み換えバキュロウイルスとその利用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH07133295A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1997024370A1 (fr) * | 1995-12-28 | 1997-07-10 | Nippon Zeon Co., Ltd. | Nouvelles proteines antigeniques de mycoplasmes, genes associes, vecteur recombinant et leur utilisation |
| EP1531861A2 (en) * | 2002-07-13 | 2005-05-25 | The University Of Georgia Research Foundation, Inc. | Mycoplasma gallisepticum formulation |
| JP2018529337A (ja) * | 2015-09-17 | 2018-10-11 | オルタナティブ ジーン エクスプレッション， エセ．エレ． | トリコプルシア・ニの蛹における組み換えタンパク質の発現 |
-
1993
- 1993-08-27 JP JP21310293A patent/JPH07133295A/ja active Pending
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1997024370A1 (fr) * | 1995-12-28 | 1997-07-10 | Nippon Zeon Co., Ltd. | Nouvelles proteines antigeniques de mycoplasmes, genes associes, vecteur recombinant et leur utilisation |
| EP1531861A2 (en) * | 2002-07-13 | 2005-05-25 | The University Of Georgia Research Foundation, Inc. | Mycoplasma gallisepticum formulation |
| EP1531861A4 (en) * | 2002-07-13 | 2006-10-11 | Univ Georgia Res Found | MYCOPLASMA GALLISEPTICUM FORMULATION |
| US7217420B2 (en) | 2002-07-13 | 2007-05-15 | The University Of Georgia Research Foundation, Inc. | Mycoplasma gallisepticum formulation |
| JP2018529337A (ja) * | 2015-09-17 | 2018-10-11 | オルタナティブ ジーン エクスプレッション， エセ．エレ． | トリコプルシア・ニの蛹における組み換えタンパク質の発現 |
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