JP3357071B2 - 新規な融合タンパク質、その遺伝子、組み換えベクター、及び組み換えウイルスとその利用 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は、マイコプラズマ・ガリセプティカム抗原性
ポリペプチドとヘルペスウイルス属外膜タンパク質由来
のポリペプチドとの融合タンパク質、当該融合タンパク
質をコードするハイブリッドDNA、及び当該ハイブリッ
ドDNAを含有する組み換えアビポックスウイルスと、そ
れを利用したワクチンに関する。

背景技術 マイコプラズマ・ガリセプティカム（Mycoplasma ga
llisepticum;以下、MGという）は鶏を含む家禽の産卵率
低下や孵化率低下の原因菌であり、全世界に広く蔓延し
ており、養鶏業界に多大なる被害を及ぼしている。現
在、その予防方法として不活化ワクチンや生ワクチンが
利用されているが、前者の場合は接種方法が煩雑であっ
たり、免疫持続期間が短く、高価であるなどの欠点があ
る。後者は、他の生ワクチンの併用によって予期せぬ疾
病が現れる欠点がある。また、不活化ワクチン、生ワク
チンともにMG感染の迅速な検出方法であるMG凝集反応を
使えないデメリットがある。

そこで、MGの感染防御抗原タンパク質などの、MG由来
のタンパク質を遺伝子工学的技術で生産させてワクチン
として利用することが期待されている。

MG抗原の遺伝子工学的製造は、大腸菌や酵母を用いた
系（特開平２−111795公報など）では、発現させるタン
パク質の種類によっては発現量が少ない他、宿主由来の
タンパク質の混入や発熱性物質の除去が難しいなどの問
題が指摘されている。このため、組み換えウイルスを用
いた抗原タンパク質の製造や組み換え生ワクチンの研究
が進められている。

組み換えウイルスによる異種遺伝子の発現例は、多く
の場合、真核生物の遺伝子もしくはウイルス遺伝子を発
現させているため、糖鎖の付加や発現様式などが感染細
胞のタンパク発現メカニズムと同じで、in vivoにおけ
る発現タンパク質に対する抗体価の誘導が比較的容易で
あった。しかし、原核生物遺伝子を組み換えウイルスで
発現させた例は少なく、真核生物との発現様式の違いか
ら効果的に特異抗体を誘導するとは言い難かった（Aust
enら、Protein Targeting and Selection Oxford
Univ.Press.（1991））。

また、MGに関しては、当該タンパク質をコードする遺
伝子を組み込んだ組み換えウイルスは、特開平５−8246
46号公報、特開平７−133295号公報、WO94/23019号公報
等で知られている。なかでも、WO94/23019号公報には、
ニューカッスル病ウイルス（以下、NDVという）のHN遺
伝子のシグナル膜アンカー部分の遺伝子とMG抗原遺伝子
を繋げてウイルス膜アンカー領域を持つMG抗原タンパク
質を発現する組み換えウイルスを、組み換え生ワクチン
として接種するとMG抗原遺伝子単独を発現する組み換え
ウイルスより効率よく抗体を誘導することが確認されて
いる。

しかしながら、この程度では十分なワクチン効果は必
ずしも期待できない。

従って、さらに抗原認識性を上げる方法を見出すこと
が、効果的な抗MG感染症用ワクチンの開発に急務であ
る。

ところで、外膜タンパク質は、前述したNDV以外に
も、ヘルペスウイルス属などにおいても、外膜タンパク
質が知られている。例えば、単純ヘルペスウイルスの糖
タンパク質Ｂ（gB）、Ｃ（gC）、Ｄ（gD）、Ｈ（gH）、
Ｉ（gI）やマレック病ウイルス（以下、MDVという）の
単純ヘルペスウイルス糖タンパク質gB、gC、gD、gH、gI
に相当するgBh、gCh、gDh、gHh、gIh、及び上記タンパ
ク質とホモロジーを有するヘルペスウイルス属のタンパ
ク質などは、その塩基配列やアミノ酸配列も知られてい
る。また、これらのタンパク質の一部は単純ヘルペスウ
イルスの中和抵抗を誘導する事が知られている（Deluca
ら、Virology、122、411−423（1982））。また、これ
らのタンパク質をコードする遺伝子をワクシニアウイル
スに組み込んで、発現させることにより中和抗体を誘導
する事も知られている（Blacklawsら、Virology、177、
727−736（1990））。

しかしながら、これらヘルペスウイルス属の外膜タン
パク質のシグナル配列を活用することは十分に検討され
ていなかった。

発明の開示 本発明者らは、かかる従来技術の下で、高い感染防御
活性を有するマイコプラズマ抗原タンパク質を大量に発
現し、宿主側に高度に抗原認識させることのできる組み
換えウイルスを得るべく鋭意努力した結果、ヘルペスウ
イルス属の外膜タンパク質DNAにマイコプラズマ抗原タ
ンパク質DNAを連結させたハイブリッドDNAを組み込んだ
組み換えアビポックスウイルスを、宿主に感染させるこ
とにより宿主側の抗原認識能を飛躍的に向上させ得るこ
とを見いだし、本発明を完成するに至った。

かくして本発明によれば、マイコプラズマ・ガリセプ
ティカムの抗原性を有するポリペプチド（以下、マイコ
プラズマ由来のポリペプチドということがある）とヘル
ペスウイルスの外膜タンパク質由来のポリペプチド（以
下、ヘルペスウイルス由来のポリペプチドということが
ある）とを含む融合タンパク質であって、外膜タンパク
質由来のポリペプチドがマイコプラズマ・ガリセプティ
カムの抗原性を有するポリペプチドのＮ末端側に連結し
ていることを特徴とする融合タンパク質、当該融合タン
パク質をコードするハイブリッドDNA、当該ハイブリッ
ドDNAを組み込んだ組み換えアビポックスウイルス、お
よび当該組み換えアビポックスウイルスを有効成分とす
る生ワクチンが提供される。

図面の簡単な説明 図１はpNZ40K−Ｓの構築手順を説明する図である。

図２はpNZ40K−Ｓの構築手順を説明する図である。

図３はpNZ40K−Ｓの構築手順を説明する図である。

図４はpNZ40K−Ｃの構築手順を説明する図である。

図５はpNZ40K−Ｃの構築手順を説明する図である。

図６はpNZ40K−Ｃの構築手順を説明する図である。

図７はTTM−１ポリペプチドの発現を確認した結果を
示すウエスタンブロットの図である。

図８は気管病変スコアを示す図である。

発明を実施するための最良の形態 （マイコプラズマ由来のポリペプチドとその遺伝子） ここで、マイコプラズマ由来のポリペプチドとは、MG
免疫血清またはMG感染血清と抗原抗体反応を呈し、MGに
由来する抗原タンパク質であるが、これらは天然のマイ
コプラズマ・ガリセプティカムが発現するタンパク質そ
のものである必要はなく、例えば１または２以上のアミ
ノ酸が自然に、または人工的に例えば位置特異的変異な
ど公知の手法（特公平６−16709号公報など）により欠
損・付加・挿入・脱落・置換などの修飾を受けているタ
ンパク質であってもよい。もちろんこのような変異によ
っても抗原性を示すエピトープが含まれていることは必
要である。尚、エピトープ領域の決定は、ペプスキャン
法に基づくGeysenらの方法（J.Immunol.Meth.、102、25
9−274（1987））、Hoppらの方法（Proc.Natl.Acad.US
A、78、3824−3828（1981））、Chouらの方法（Advance
s in Enzymology 47、145−148（1987））など公知
の方法を用いることができる。

このような抗原性を有するペプチドの具体例として特
開平２−111795号公報（米国特許出願シリアル番号359,
779号，米国特許出願シリアル番号07/888,320号，米国
特許出願シリアル番号08/299,662号）、特開平５−8246
46号公報（米国特許第5,489,430号公報）、WO94/23019
号公報（米国特許出願シリアル番号08/525,742号，特表
平６−521927号公報）に記載された抗原タンパク質やそ
のタンパク質のアミノ酸配列を含むマイコプラズマ・ガ
リセプティカムのタンパク質などが例示され、もちろ
ん、エピトープが含まれる限りこれらの一部であっても
よい。

これらのなかでも、特開平５−824646号公報に記載さ
れている約40キロダルトンのポリペプチド、特表平６−
521927号公報に記載されている約66キロダルトンのTM−
66遺伝子によってコードされたポリペプチド（当該公報
の配列番号16）や約67キロダルトンのTM−67遺伝子によ
ってコードされたポリペプチド（当該公報の配列番号2
7）などが好ましい。

本発明においてマイコプラズマ由来のポリペプチドの
遺伝子は、上述したマイコプラズマ・ガリセプティカム
の抗原性を有するポリペプチドをコードするDNA配列を
含むものであり、このようなDNAは、合成するか、また
は天然のマイコプラズマ・ガリセプティカムに属する細
菌（具体例としてはＲ株、S6株、KP−13株、PG31株な
ど）などから得ることができる。野外から分離されたMG
由来のDNAでもよい。もちろん、これらの遺伝子を公知
の手法（Methods in Enzymologyなど）により欠損・
付加・挿入・脱落・置換などの修飾をしてもよい。

ヘルペスウイルス由来のポリペプチドとその遺伝子） 本発明で言うヘルペスウイルス由来のポリペプチドと
は、ヘルペスウイルス属ウイルスのエンベロープを構成
するタンパク質由来のポリペプチドであるが、このタン
パク質の全長である必要はなく、融合タンパク質として
細胞膜に呈示させることのみを目的とする場合は、膜ア
ンカーとシグナル配列を含み、分泌を目的とする場合な
どはシグナル配列のみであってもよい。また、外膜タン
パク質はタイプＩ外膜タンパク質、タイプIIの外膜タン
パク質のどとらでもよく、そのシグナル配列、膜アンカ
ー配列はアミノ末端もしくはカルボキシル末端の疎水性
ペプチド領域のアミノ酸配列を解析する事により、容易
に見いだすことが可能である。

外膜タンパク質の具体例としては、例えば、単純ヘル
ペスウイルスの糖タンパク質gB、gC、gD、gH、gIやマレ
ック病ウイルス（以下、MDVという）の単純ヘルペスウ
イルス糖タンパク質gB、gC、gD、gH、gIに相当するgB
h、gCh、gDh、gHh、gIh、及び上記タンパク質とホモロ
ジーを有するヘルペスウイルス属のタンパク質等が挙げ
られる。

もちろん、外膜タンパク質のシグナル配列以外のエピ
トープを含むポリペプチドを前記抗原性を有するポリペ
プチドに連結させれば、このエピトープが生体内で生体
に免疫を付与することも期待できる。

本発明においてマイコプラズマ由来のポリペプチドの
遺伝子は、上述したヘルペスウイルス由来のポリペプチ
ドをコードするDNA配列を含むものであり、このようなD
NAは、合成するか、または天然のヘルペスウイルスから
得ることができる。もちろん、これらの遺伝子を公知の
手法（Methods in Enzymologyなど）により欠損・付
加・挿入・脱落・置換などの修飾をしてもよい。

（融合タンパク質とパイブリッドDNA） 本発明の融合タンパク質は、後述するハイブリッドDN
Aを組み込んだ組み換えアビポックスウイルスを鶏胎児
線維芽細胞（以下、CEF細胞という）や発育鶏卵しょう
尿膜細胞などにて培養し得ることができる。

得られた融合タンパク質は、コンポーネントワクチン
として用いることも可能である。

本発明のハイブリッドDNAは、上記該マイコプラズマ
由来のポリペプチドの遺伝子とヘルペスウイルス由来の
ポリペプチドの遺伝子とが直接、又は任意のDNA配列を
介して連結されたものである。

このハイブリッドDNAは、常法、例えばヘルペスウイ
ルスの外膜タンパク質をコードするDNAまたは外膜タン
パク質のシグナル配列をコードするDNAと、マイコプラ
ズマ・ガリセプティカムの抗原タンパク質をコードする
DNAとが結合可能な制限酵素切断断片となるようにし、
両者をリガーゼで連結する方法や適当なリンカーを挟ん
で両DNAをリガーゼで連結する方法などによって作製さ
れる。

本発明の融合タンパク質のアミノ酸配列の具体的な例
としては、配列番号２および４記載のものが例示され
る。マイコプラズマ・ガリセプティカム由来の40キロダ
ルトンの抗原タンパク質の配列は、配列番号２中、第64
〜456番目、配列番号４中、第693〜1086番目であり、配
列番号２中、第１〜63番目は、MDV由来の外膜タンパク
質gBのシグナル配列であり、配列番号４中、第１〜672
番目は、MDV由来の外膜タンパク質gBのほぼ全長であ
る。これらの融合タンパク質をコードするハイブリッド
DNAの塩基配列の具体例としては、配列番号１および３
記載のものが例示される。

もちろん、本発明において融合タンパク質及びハイブ
リッドDNAはこれに限定されるものではない。

（組み換えアビポックスウイルス） 本発明の組み換えアビポックスウイルスは、アビポッ
クスウイルスの非必須領域に上述のハイブリッドDNAを
組み込んだ組み換えアビポックスウイルスである。本発
明の組み換えアビポックスウイルスの構築方法は常法に
従えば良く、例えば特開平１−168279号公報に記載の方
法に従えばよい。すなわち、まずアビポックスウイルス
の非必須領域に組み込んだ第一の組み換えベクターが構
築される。

本発明で用いるアビポックスウイルスの非必須領域
は、クエイルポックスウイルスのTK領域、七面鳥ポック
スウイルスのTK遺伝子領域や特開平１−168279号公報に
記載されたDNA断片が挙げられ、好ましくは、前記公報
記載の約7.3KbのEcoR I断片、約5.2KbのHind III断片、
約5.0KbのEcoR I−Hind III断片、約4.0KbのBamH I断片
と相同組み換えをおこす領域である。

本発明で用いるベクターとしては、例えばpBR322、pB
R325、pBR327、pBR328、pUC7、pUC8、pUC9、pUC18、pUC
19などのプラスミド、λファージ、M13ファージなどの
ファージ、pHC79などのコスミドなどが挙げられる。

本発明で用いられるアビポックスウイルスは鳥類に感
染するウイルスであれば特に限定されない。このような
ウイルスの具体例としては、ピジョンポックスウイル
ス、フォウルポックスウイルス（以下、FPVという）、
カナリーポックスウイルス、七面鳥ポックスウイルスな
どが例示されるが、好ましくはピジョンポックスウイル
ス、FPV、七面鳥ポックスウイルス、より好ましくは、
ピジョンポックスウイルス、FPVである。とりわけ好ま
しいアビポックスウイルスの具体例としては、ATCC VR
−251、ATCC VR−249、ATCC VR−250、ATCC VR−22
9、ATCC VR−229、ATCC VR−288、西ヶ原株、泗水
株、CEVA株、CEVA株由来のウイルスのうち鶏胚線維芽細
胞に感染したときに大きいプラークを形成するウイルス
株などのごときFPVや、NP株（鶏胎化鳩痘毒中野株）な
どのように鶏痘生ワクチン株として使用されるFPVと近
縁のウイルスなどが例示される。これらの株はいずれも
市販されているなど、容易に入手することができる。

ついで、前記第一の組み換えベクターの非必須領域内
に本発明のハイブリッドDNAを組み込んだ第二の組み換
えベクターを構築する。通常、ハイブリッドDNAは、合
成天然を問わず、アビポックスウイルスが保有する転写
の系でプロモーターとして有効に機能するものであれば
いかなる塩基配列のものでもよく、チミジンキナーゼを
コードするアビポックスウイルス由来遺伝子のプロモー
ターなどのアビポックスウイルス固有のプロモーターは
もちろんのこと、アビポックスウイルス以外のウイルス
由来のDNAや真核生物、原核生物どちら由来のDNAであっ
ても、上記条件を満たす限りにおいては当然本発明に使
用可能である。このようなプロモーターの具体例として
は、例えばJournal of Virology、51、662−669頁（1
984年）に例示されるようなVVのプロモーター、具体的
には7.5KポリペプチドをコードするVV遺伝子のプロモー
ター、19KポリペプチドをコードするVV遺伝子のプロモ
ーター、42KポリペプチドをコードするVV遺伝子のプロ
モーター、チミジンキナーゼをコードするVV遺伝子のプ
ロモーター、28KポリペプチドをコードするVV遺伝子の
プロモーターなどが例示される。また、Mossらの文献J.
Mol.Biol.210、49−76頁、771−784頁（1989年）を参考
にした合成プロモーター、Davidsonの合成プロモーター
や、その一部をプロモーター活性が喪失しない範囲での
削除、変更などにより改変されたもの（例えば、TTTTTT
TTTTTTGGCATATAAATAATAATAAATACAATAATTAATTACGCGTAAAA
ATTGAAAAACTATTCTAATTTATTGCACTC、TTTTTTTTTTTTTTTTTT
TTGGCATATAAATAATAAATACAATAATTAATTACGCGTAAAAATTGAAA
AACTATTCTAATTTATTGCACTCなど）を用いることもでき
る。

また、組み換えウイルスの検出が容易であるという点
から、β−ガラクトシダーゼをコードするDNAなどマー
カー遺伝子も組み込むことができる。

組み換えアビポックスウイルスの作製は、予めアビポ
ックスウイルスを感染させた動物培養細胞に上記の第二
の組み換えベクターを移入し、ベクターDNAとウイルス
ゲノムDNAとの間で相同組み換えを起こさせればよい。
ここで用いられる動物培養細胞は、アビポックスウイル
スが増殖可能なものであればよく、その具体例としては
CEF細胞や発育鶏卵しょう尿膜細胞などが例示される。

宿主細胞に感染しているウイルスからプラークハイブ
リダイゼーションなどの方法により目的とする組み換え
アビポックスウイルスを単離する事ができる。

（生ワクチン） 上記の方法によって構築された本発明の組み換えウイ
ルスは抗マイコプラズマ・ガリセプティカム感染症生ワ
クチンとして鳥類に接種することができる。

本発明の生ワクチンの調製方法は特に限定されない
が、例えば、次の方法によって調製される。本発明の組
み換えウイルスを該ウイルスが生育することができる細
胞（以下、宿主細胞という）に感染させ、増殖させたの
ち、細胞を回収し、破砕する。この細胞破砕物を遠心分
離によって沈殿物と組み換えウイルスを含有する高力価
上清とに分離する。得られた上清は実質的に宿主細胞を
含まず、細胞培養培地と組み換えウイルスを含んでお
り、生ワクチンとして使用することができる。この上清
には薬理学的に問題のないキャリアー、例えば生理食塩
水などを添加し、希釈することもできる。また、この上
清は凍結乾燥しても生ワクチンとして使用できる。本発
明の生ワクチンの家禽への投与法は特に限定されず、例
えば皮膚に引っかき傷を付けて生ワクチンを接種する方
法、注射により接種する方法、飼料や水に混合し経口投
与する方法、エアロズルやスプレーなどにより吸入させ
る方法などが挙げられる。生ワクチンとして使用するに
は、通常の生ワクチンの使用方法と同等でよく、例えば
ニワトリ一羽あたり10²から10⁸プラークフォーミングユ
ニット（以下、PFUという）程度を接種する。注射によ
る場合、通常、0.1ml程度の生理食塩水などの等張溶媒
に本発明の組み換えウイルスを懸濁して用いることがで
きる。本発明の生ワクチンは、ふつうの条件下では凍結
乾燥すればよく、室温での保存が可能である。また、ウ
イルスの懸濁液を−20から−70℃下で凍結させ保存する
事も可能である。

特に、前記ヘルペスウイルスの外膜タンパク質由来の
ポリペプチドをコードする遺伝子が、ヘルペスウイルス
のエピトープが１以上、好ましくは天然の外膜タンパク
質との相同性が90％以上のポリペプチドをコードするも
のである場合、本発明の生ワクチンは、マイコプラズマ
・ガリセプティカム感染症とアビポックスウイルス感染
症に対するワクチンとして機能するほか、外膜タンパク
質の由来となるヘルペスウイルスの感染症に対しても有
効なワクチンとして機能する、いわゆる三価のワクチン
として用いることができる。

実施例 実施例１ マレック病ウイルスのgB遺伝子のシグナル直
後へTTM−１タンパク質DNAが連結したハイブリッドDNA
を有する組み換えpNZ40K−Ｓの構築（図１、２、３参
照） まず、特開平６−78764号公報に開示されている、マ
レック病ウイルスのgB遺伝子を含むプラスミドpUCgBを
制限酵素BamH IとSal Iで切断し、3.9kbの断片を回収し
た。

これとは別に、pUC8のHind III−Sal I部位にプラス
ミドpNZ1729R（Yanagidaら、J.Virol.、66、1402−1408
（1992））をHind IIIとSal Iとで消化して得られた約1
40dpのDNA断片を挿入し、さらにHind III−Pst I部位に
合成DNA（5'−AGCTGCCCCCCCGGCAAGCTTGCA−3'）を挿入
し、次にSal I−EcoR I部位に合成DNA（5'−TCGACATTTT
TATGTGTAC−3'）を挿入し、最後にSac I−EcoR I部位に
合成DNA（5'−AATCGGCCGGGGGGGCCAGCT−3'）を挿入し
て、プラスミトpGTPsを構築した。

得られたpGTPsを制限酵素Sal IとBamH Iで開裂させ、
リガーゼで前出の3.9kbの断片と連結し、pGTPsMDgBを取
得した。次に、WO94/23019号公報に開示のpNZ2929XM1を
EcoR Iで切断し、740pbの断片を回収したのちT4 DNA
ポリメラーゼで末端を平滑化した。pGTPsMDgBもXba Iで
開裂させた後、T4 DNA ポリメラーゼで末端を平滑化
し、末端平滑化した740bp断片とリガーゼによって連結
して、新たなプラスミドを構築した。この新たなプラス
ミドをBgl IIとSal Iで切断して3.0kbの断片を回収し、
pNZ2927XM1のBgl IIとSal Iで切断した1.1kbの断片とリ
ガーゼによって連結し、マレック病ウイルスのgB遺伝子
のシグナル配列部分のＣ末端にTTM−１遺伝子のＮ末端
が連結したプラスミドが得られた。

最後に、pGTPs40K−ＳをSal IとBamH Iで切断した1.4
kbを、Sal IとBamH Iで開裂させたプラスミドpNZ1829R
断片（9.3kb）とリガーゼによって連結し、目的の組み
換え用プラスミドpNZ40K−Ｓ（10.7kb）を取得した。

実施例２ マレック病ウイルスのgB遺伝子のＣ末端にTT
M−１タンパク質DNAが連結したハイブリッドDNAを有す
る組み換え用プラスミドpNZ40K−Ｃの構築（図４、５、
６参照） 実施例１のプラスミドpGTPsMDgBを制限酵素Mlu Iで切
断後、T4 DNA ポリメラーゼで末端を平滑化した。そ
のあとに制限酵素Xba Iで切断して、1.9kbの断片を回収
した。また、ファージミッドベクターpBluescript II
（東洋紡績株式会社製；以下、pBSKS IIという）を制限
酵素Xba IとSma Iで開裂後、先ほどの1.9kbの断片とリ
ガーゼによって連結したプラスミドを取得した。つぎに
このプラスミドを制限酵素EcoR IとSal Iで開裂後、pNZ
2929XM1を制限酵素EcoR IとSal Iで切断した550bp断片
および、EcoT22 IとSal Iで切断した615bpとリガーゼに
よって連結したプラスミドを取得した。このプラスミド
を制限酵素Xba IとSal Iで切断した2.7kbの断片と、pGT
PsMDgBを制限酵素Xba IとSal Iで切断した3.3kbの断片
とをリガーゼによって連結し、マレック病ウイルスのgB
遺伝子のＣ末端にTTM−１遺伝子のＮ末端が連結したプ
ラスミドpGTPs40K−Ｃが得られた。

最後に、pGTPs40K−ＣをSal IとXba Iで切断した2.7k
bを、Sal IとXba Iで開裂させたプラスミドpNZ1829R断
片（9.5kb）とリガーゼによって連結し、目的の組み換
え用プラスミドpNZ40K−Ｃ（12.2kb）を取得した。

実施例３ 組み換えFPV 40K−Ｃ、40K−Ｓの作製と純
化 単層のCEFに鶏痘生ワクチン株であるNP株をm.o.i.＝
0.1で感染させて、３時間後にこれらの細胞をトリプシ
ン処理で剥がし、細胞懸濁液とした。この懸濁液中の２
×10⁷個の細胞と10μｇの組み換え用プラスミドpNZ40K
−ＣまたはpNZ40K−Ｓと混合し、Saline Ｇ（0.14M塩
化ナトリウム、0.5mM塩化カリウム、1.1mMリン酸一水素
二ナトリウム、1.5mMリン酸二水素一カリウム、0.5mM塩
化マグネシウム・６水和物、0.011％グルコース）に懸
濁し、室温においてジーンパルサー（Bio−Rad社製）を
用いて3.0KVcm^-1、0.4msec、25℃の条件下でエレクトロ
ポレーションした。プラスミドを導入した細胞を、その
後37℃、72時間培養し、３回の凍結融解によって細胞を
溶解し、組み換えウイルスを含むウイルスを回収した。

回収した組み換えウイルスは、次のようにして選択し
た。回収したウイルス液を単層のCEFに感染させ、生育
培地を含んだ10mlの寒天溶液を重層した。室温中で寒天
を温めたのち、FPVのプラークが出現するまで37℃で培
養後ブルオギャル（Bluo−gal）を200μg/mlの濃度で含
んだ寒天溶液を重層し、さらに48時間37℃で培養した。
全プラークのうち約１％のプラークが青く発色した。こ
れらの青いプラークを単離回収して、さらに同様の操作
を繰り返して全てのプラークが青く染まるまでウイルス
の純化を行った。通常この繰り返しは３〜４日で終了す
る。この純化されたウイルスをそれぞれ40K−Ｃ、40K−
Ｓと名付けた。40K−Ｃ、40K−Ｓはドットブロットハイ
ブリダイゼーション、サザンブロットハイブリダイゼー
ションによって組み込んだ各DNAの位置を確認した。

実施例４ 40K−Ｃ、40K−Ｓ感染細胞におけるTTM−１
ポリペプチドの発現 40K−Ｃ及び40K−ＳがTTM−１ポリペプチドを感染細
胞中で発現することを調べるために、抗マイコプラズマ
・ガリセプティカムS6株血清を用いたウェスタンブロッ
ティング法を行った。40K−Ｃまたは40K−ＳをCEFに感
染させ、37℃でプラークが出現するまで培養後、セルス
クレーパーによって細胞をはがし取り培養上清とともに
8000G、20分間遠心し、細胞を含む沈さ（以下、ペレッ
トという）を回収した。さらに、ペレットをPBSで洗浄
後、8000G、20分間遠心し、洗浄した細胞を含むペレッ
トを回収した。このペレットを150μｌのPBSで懸濁し、
そのうちの50μｌに等量のレムリバッファー（10％メル
カプトエタノールを含む）を加え、３分間煮沸処理した
のち、Laemmliの方法（Nature、227、668−685（197
0））に従い、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動（以下、SDS−PAGEという）に付し
た。SDS−PAGEを終了したゲルで分離したポリペプチド
をBurnett等（A.Anal.Biochem.、112、195−203（197
0））やTowbin等の方法（Proc.Natl.Acad.Sci.、75、43
50−4354（1979）に従ってポリビニリデンジフルオロラ
イド膜（immobilon Transfer Membrane（ミリポア
社）；以下、メンブレンという）に電気泳動によって移
行させた。メンブレンは、３％のスキムミルクを含むPB
Sに１時間浸せきして、非特異結合が起きないようにブ
ロッキングし、次に鶏抗マイコプラズマ・ガリセプティ
カムS6株血清を1000倍に希釈したPBSに１時間浸せきし
た。

次に、PBSでメンブレンをすすいだ後、二次抗体とし
てアルカリフォスファターゼコンジュゲート抗鶏IgGを
含むPBSに１時間浸せきした。PBSでメンブレンをすすい
だ後、発色基質としてニトロブルーテトラゾリウム塩
（NBT）（GIBCO−BRL社製）と、５−ブロモ−４−クロ
ロ−３−インドールフォスフェイト−Ｐ−トルイジン塩
（BCIP）（GIBCO−BRL社製）を用い、反応液（100mMト
リス塩酸（pH7.5）、0.15M塩化ナトリウム、50mM塩化マ
グネシウム）10m中で発色反応を行った。

ウエスタンブロットの結果を図７に示す。

図７に示すとおり、40K−Ｓ、40K−Ｃ感染細胞とも
に、目的の位置に反応するタンパク質が確認でき、組み
換えFPV感染細胞で予想通りのタンパク質を発現してい
ることを確認できた。

実施例５ 組み換えFPV接種鶏の抗体誘導能 40K−Ｃ及び40K−ＳをCEFで37℃、48時間培養後、二
開凍結融解を繰り返し、細胞浮遊液を回収し、ウイルス
タイターが、10⁶pfu/mlとなるように調製したのち、生
後７日のSPF鶏（Line Ｍ、日本生物科学研究所）の右
翼膜に穿刺用針で10μｌ接種した。接種後善感発痘を観
察し、接種から二週後に血清を採取した。採取した血清
の抗体価はELISA法で測定した。精製したTTM−１ポリペ
プチドを１μg/wellとなるようにバイカーボネイトバッ
ファーに溶解し、96wellマイクロタイタープレートに吸
着させた後、スキムミルクでブロッキングを行ってその
後の非特異的吸着を防いだ。次に各ウェルに被検血清の
希釈液をのせた後ホースラディッシュパーオキシダーゼ
結合抗鶏イムノグロブリン抗体（ウサギ抗体）としての
せた。十分洗浄した後、基質として2,2'−アジノジエチ
ル−ベンズチアゾリンスルフォネートを加え、イムノリ
ーダーで405nmの波長光に対する吸光度で抗体の相対希
釈倍率を測定した。なお、対照一次抗体には、抗TTM−
１ポリペプチド鶏血清を用いた。

抗体価は非接種鶏群の抗体価を１とした場合の血清の
希釈倍率 表１に示すとおり、40K−Ｃまたは40K−Ｓを接種した
鶏の血清中の抗TTM−１抗体価は、TTM−１ポリペプチド
を免疫した鶏血清抗体価と同等以上に上昇した。このこ
とから、組み換えFPVは接種鶏に有意に抗体価を誘導す
ることが確かめられた。

実施例６ 組み換えFPV接種鶏へのマイコプラズマ攻撃
試験 攻撃試験は基本的に動物用生物学的製剤基準に従っ
た。以下、簡単にその方法を記述する。

試験用SPF鶏（Line Ｍ、日本生物科学研究所）が５
週齢のときに40K−Ｃ及び40K−Ｓを右翼膜に穿刺用針で
10μｌ接種した。接種後善感発痘を観察し、免疫が成立
したことを確認した。接種後２週目にマイコプラズマガ
リセプティカムＲ株を10⁴〜15⁵cfu/羽となるように気管
内に強制投与し、感染を成立させた。感染14日後にネン
ブタールで屠殺剖検し、気管の病理組織標本を作製し、
気管粘膜の厚さと、組織所見をもとに気管病変スコアを
測定した。スコアの基準も製剤基準に則り、群内の各鶏
の気管病変スコアの平均を各群のスコアとした。参考ま
でに、気管病変スコアの判定基準を表２に記す。

判定結果を表３および図８に示した。

この結果から明らかなように、40K−Ｃ及び40K−Ｓを
接種した鶏の病変スコアは非接種鶏に比べて明らかに低
く、マイコプラズマチャレンジに対して明らかな感染防
御能を鶏に付与していることがわかった。このことか
ら、40K−Ｃおよび40K−Ｓはマイコプラズマガリセプテ
ィカムに対する有効なワクチンとなりうることがわかっ
た。

産業上の利用可能性 本発明によれば、マイコプラズマ・ガリセプティカム
の抗原タンパク質由来のポリペプチドとヘルペスウイル
スの外膜タンパク質由来のポリペプチドとの融合タンパ
ク質が得られ、この融合タンパク質は抗マイコプラズマ
感染症、抗鶏痘、抗マレック病ワクチンとして有用であ
る。また、当該融合タンパク質をコードするハイブリッ
ドDNAを利用することにより、マイコプラズマ・ガリセ
プティカム抗原タンパク質を宿主細胞表面に効率よく提
示するばかりでなく、細胞外に分泌して宿主の抗原認識
担当細胞に効果的に認識されるアビポックスウイルスが
得られ、該組み換えアビポックスウイルスは強力な抗マ
イコプラズマ感染症ワクチンとして有用である。

配列表 配列番号:1 配列の長さ:1371 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 ハイブリッドDNA（40K−Ｓ） 配列 配列表 配列番号:2 配列の長さ:456 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 配列表 配列番号:3 配列の長さ:3261 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 ハイブリッドDNA（40K−Ｃ） 配列 配列表 配列番号:4 配列の長さ:1086 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ Ｃ０７Ｋ 19/00 Ｃ０７Ｋ 19/00 Ｃ１２Ｎ 7/00 Ｃ１２Ｎ 7/00 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ // Ｃ１２Ｐ 21/02 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:92 Ｃ１２Ｒ 1:92） Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (56)参考文献 国際公開94／23019（ＷＯ，Ａ１) Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，1994年，Ｖｏｌ. 200，Ｎｏ．２，ｐ．484−493 Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ｅａｒｃｈ，1986年，Ｖｏｌ．14，Ｎ ｏ．11，ｐ．4683−4692 Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，1992年 ７月，Ｖ ｏｌ．66，Ｎｏ．７，ｐ．4390−4398 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 C07K 14/00 - 14/825 ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＰｕｂＭｅｄ

Claims (8)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】マイコプラズマ・ガリセプティカムの抗原
   性を有するポリペプチドとヘルペスウイルスの外膜タン
   パク質由来のシグナル配列部分とを含む融合タンパク質
   であって、外膜タンパク質由来のシグナル配列部分がマ
   イコプラズマ・ガリセプティカムの抗原性を有するポリ
   ペプチドのＮ末端側に連結していることを特徴とする融
   合タンパク質。
2. 【請求項２】外膜タンパク質が、マレック病ウイルス由
   来gBタンパク質である請求項１記載の融合タンパク質。
3. 【請求項３】外膜タンパク質由来のシグナル配列部分
   が、マレック病ウイルス由来のgBタンパク質のシグナル
   配列部分である請求項１記載の融合タンパク質。
4. 【請求項４】請求項１記載の融合タンパク質をコードす
   るハイブリッドDNA。
5. 【請求項５】請求項１記載の融合タンパク質をコードす
   るDNAを組み込んだ組み換えベクター。
6. 【請求項６】請求項１記載の融合タンパク質をコードす
   るDNAを組み込んだ組み換えアビポックスウイルス。
7. 【請求項７】請求項１記載の融合タンパク質をコードす
   るDNAを組み込んだ組み換えアビポックスウイルスを有
   効成分とした抗家禽マイコプラズマガリセプティカム感
   染症用組み換え生ワクチン。
8. 【請求項８】請求項２記載の融合タンパク質をコードす
   るDNAを組み込んだ組み換えアビポックスウイルスを有
   効成分として抗家禽マイコプラズマ・ガリセプティカム
   感染症、および抗マレック病感染症用組み換え三価生ワ
   クチン。