KR970011149B1 - 재조합 아비폭스 바이러스 - Google Patents

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Abstract

내용없음.

Description

[발명의 명칭]
재조합 아비폭스 바이러스
[발명의 상세한 설명]
본 출원은 1987년 8월 28일자 출원된 출원번호 090,711의 부분계속 출원인 1987년 10월 20일자 출원의 출원번호 110,335의 부분계속 출원인 1988년 4월 25일자 출원의 출원번호 186,054의 부분계속 출원이다.
본 발명은 비-조류 척추동물을 포함한 척추동물에서 합성 재조합 아비폭스(avipox) 바이러스를 사용하여 면역학적 반응을 유도하는 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 척추동물, 특히 포유류에서, 척추동물 병원체의 항원 결정기를 코드화하고 발현하는 DNA를 함유하는 합성 재조합 아비폭스 바이러스로 척추동물을 접종함으로써 척추동물 병원체에 대한 면역학적 반응을 유도하는 방법 및 그러한 변형 아비폭스 바이러스를 포함하는 백신에 관한 것이다. 나아가, 본 발명은 변형 아비폭스 바이러스, 그것의 제조 및 이용방법, 및 변형 아비폭스 바이러스의 제조시에 중간체로서 제조 또는 포함되는 어떤 DNA 서열과 그러한 서열의 제조방법에 관한 것이다.
[발명의 배경]
아비폭스(Avipox) 또는 아비폭스 바이러스는 가금류를 감염시키는 두진 바이러스에 밀접하게 관련된 속(genus)이다. 아비폭스 속에는 파울폭스종, 카나리아폭스종, 정코폭스종, 피젼폭스종, 퀘일폭스종, 스패로우폭스종, 스타알링폭스종, 및 터어키 폭스종이 있다. 파울폭스종은 닭을 감염시키며, 수두라 불리우는 사람의 질병과 혼동되어서는 안된다. 아비폭스 속은 다른 폭스 바이러스와 많은 공통적인 특징이 있으며 척추동물의 폭스바이러스로, 백시니아와 같은, 동일한 아과의 일원이다. 백시니아와 아비폭스를 포함하여 폭스바이러스는 진핵 숙주 세포내에서 복제한다. 이들 바이러스는 그들의 큰 크기, 복합성에 의해, 그리고 복제의 원형질내 부위에 의해 구별된다. 그러나, 백시니아와 아비폭스는 상이한 속이고 그들의 각각의 분자량, 항원 결정기, 및 숙주 종에 있어서 유사하지 않다(Intervirology Vol. 17, Pages 42-44, Fourth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses(1982)).
아비폭스 바이러스는 사람을 포함하여 포유류와 같은 비-조류 척추동물을 증식적으로 감염시키지는 않는다. 나아가, 아비폭스는(사람을 포함하여) 포유류의 세포 배양액에 접종되는 경우 증식하지 않는다. 아비폭스로 접종된 그러한 포유류 세포 배양액에서, 세포는 세포독성 효과 때문에 죽을 것이지만, 증식적인 바이러스 감염의 증거를 나타내지는 않는다.
살아있는 아비폭스에 의한 포유류 같은 비-조류 척추동물의 접종은 백시니아 접종과 닮은 접종부위에서의 병변의 형성을 유발한다. 그러나, 증식적인 바이러스 감염은 일어나지 않는다. 그럼에도 불구하고, 그렇게 접종된 포유류가 아비폭스 바이러스에 면역학적으로 반응하는 것으로 발견되었다. 이것은 기대하지 않았던 결과이다.
죽은 병원체 또는 그러한 병원체의 정제된 항원성분으로 구성된 백신은 효과적인 면역반응을 나타내기 위해서는 살아있는 바이러스 백신보다 많은 양으로 주사되어야 한다. 왜냐하면 살아있는 바이러스 접종이 훨씬 더 효과적인 예방접종방법이기 때문이다. 관심의 항원이 바이러스에 복제 중에 증폭되므로 상대적으로 적은 접종물이 효과적인 면역반응을 유발할 수 있다. 의학적 견지에서, 살아있는 바이러스 백신이 죽은 병원체 또는 정제된 항원 백신으로 접종이 되었을 때보다 더 효과적이고 더 지속적인 면역성을 제공한다. 그러므로, 죽은 병원체 또는 그러한 병원체의 정제된 항원 성분으로 구성된 백신은 살아있는 바이러스를 이용하여 요구되는 것보다 더 많은 양의 백신물질의 제조를 필요로 한다.
전술한 논의로부터 살아있는 바이러스 백신을 이용하는 것이 의학적이고 경제적임이 분명하다. 한가지 그러한 살아있는 바이러스 백신은 백시니아 바이러스를 포함한다. 이 바이러스는 재조합 DNA방법에 의하여 포유류 병원체의 항원의 유전 서열을 나타내는 DNA를 삽입시키는데 유용한 것으로 선행 기술분야에서 알려져 있다.
그러므로, 선행 기술분야에서 병원체 유기체의 항원 결정기를 코드하는 DNA서열을 포함하여, 백시니아 게놈의 비필수 영역으로의 어떠한 공급원(예컨대 바이러스, 원핵세포, 진핵세포, 합성의)으로부터의 DNA의 삽입에 의하여 재조합 백시니아 바이러스의 창조를 허용하는 방법들이 개발되어 왔다. 이들 방법에 의하여 만들어진 어떤 재조합 백시니아 바이러스는 포유류에서 다양한 포유류 병원체에 대한 특이적 면역성을 유도하기 위하여 사용되어 왔고, 이들에 대해서는 본원에 참고로 삽입된 미국특허 제4,603,112호에 기재되어 있다.
미변형 백시니아 바이러스는 스몰폭스에 대한 접종에 대하여 상대적으로 안전하고 효과적인 이용의 긴 역사가 있다. 그러나, 스몰폭스의 박멸전에, 미변형 백시니아가 광범위하게 투여된 경우, 일반화된 백시니아 감염의 형태로, 특히 습진 또는 면역억제로 고생하는 사람들에 의해 작지만 진실로 위험한 합병증이 있게 된다. 백시니아 접종으로부터 유발될 수 있는 또다른 희귀하지만 가능한 합병증은 예방접종후 뇌염이다. 이들 반응의 대부분은 습진 같은 피부병에 걸린 개인 또는 면역 시스템이 손상된 개인, 또는 가족중에 습진에 걸렸거나 면역학적 반응이 손상된 사람이 있는 개인의 접종으로부터 유발된다. 백시니아는 살아있는 바이러스이며 정상적으로는 건강한 사람에게는 무해하다. 그러나, 접종 수주일 후까지도 개인간에 전파될 수 있다. 만약 정상 면역반응이 손상된 개인이 접종에 의해 또는 최근에 접종된 개인으로부터의 전염성 전파에 의해 감염된다면 그 결과는 증대할 수 있다.
그러므로, 기술상으로 살아있는 바이러스 접종의 장점을 제공하면서 앞서 논의되었던 문제점들을 감소 또는 제거하는 방법이 현상태의 기법을 능가하는 고도로 바람직한 진보된 것이 될 것임을 인정할 수 있다. 이것은 후천성 면역 결핍 증후군(AIDS)으로 알려진 질병의 출현으로 오늘날 더욱 중요하다. 이 질병의 희생자들은 심각한 면역학적 이상기능으로 고생하며 그들이 다른 안전한 살아있는 바이러스와 직접 접촉하거나 또는 그러한 살아있는 바이러스를 포함하는 백신으로 최근에 면역된 사람과 경유 접촉하는 경우 그러한 바이러스의 증식에 의해 쉽게 손상될 수 있다.
[발명의 목적]
본 발명의 목적은 병원체 유기체에 대하여 척추동물을 면역시킬 수 있는 백신을 제공하는 것으로, 그 백신은 살아있는 바이러스 백신의 이점을 가지며, 특히 비-조류 척추동물에 사용되는 경우에 상기 열거한 바와 같은 살아있는 바이러스 백신 또는 족은 바이러스 백신의 단점을 거의 또는 전혀 갖지 않는다.
본 발명의 추가의 목적은 그러한 백신에 사용하기 위한 합성 재조합 아비폭스 바이러스를 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 포유류같은 비-조류 척추동물의 경우에 감염성 바이러스의 생성으로 동물에서 증식적으로 증식할 수 없는 합성 재조합 아비폭스 바이러스로 척추동물을 접종함으로써 항원에 대한 면역학적 반응을 조류 및 비-조류 척추동물에서 유도하는 방법을 제공하는 것이다. 이 경우에, 바이러스는 자기-제한적이며 예방접종되지 않은 숙주로까지 확산되는 가능성이 감소된다.
본 발명의 또하나의 목적은 척추동물에서 항원에 대한 면역학적 반응을 유도하는 방법을 제공하는 것으로, 그 방법은 척추동물을 상기 척추동물에 대한 병원체의 항원 결정기를 포함하고 발현하는 합성 재조합 아비폭스를 포함하는 백신으로 접종하는 것을 포함한다.
본 발명의 또다른 목적은 척추동물에서의 바이러스의 증식적 복제없이 유전자 생성물을 코드화하고 발현하는 DNA를 함유하는 재조합 바이러스로 척추동물을 접종함으로써 척추동물에서 유전자 생성물을 발현시키는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또하나의 목적은 척추동물에서의 바이러스의 증식적 복제없이 항원을 코드화하고 발현하고 DNA를 함유하는 재조합 바이러스로 척추동물을 접종함으로써 척추동물에서 항원에 대한 면역학적 반응을 유도하는 방법을 제공하는 것이다.
[발명의 설명]
본 발명의 한 측면은 아비폭스 게놈의 비필수 영역에 존재하는 병원체의 항원을 코드화하고 발현하는 어떠한 공급원으로부터의 DNA에 의하여 변형된 합성 재조합 아비폭스 바이러스로 척추동물을 접종함으로써 병원체에 대한 면역학적 반응을 척추동물에서 유도하는 방법에 관한 것이다.
다른 측면으로, 본 발명은 척추동물의 세포에서 증식적으로 복제하지는 못하지만 그런 세포에서 유전자 생성물 또는 항원을 발현하는 재조합 바이러스로 척추동물에서 유전자 생성물을 발현하거나 항원에 대한 면역학적 반응을 유도하는 방법에 향해 있다.
또다른 측면으로, 본 발명은 어떠한 공급원으로부터의, 및 특히 비-조류 공급원으로부터의 DNA의 아비폭스 게놈의 비필수 영역으로의 삽입에 의하여 변형된 합성 재조합 아비폭스 바이러스에 관한 것이다. 항원을 코드화하고 발현하는 외인성(즉, 비-아비폭스) 유전자를 운반하고, 항원에 대한, 및 그러므로 외인성 병원체에 대한 면역학적 반응의 척추동물 숙주에 의한 생성을 유도하는 합성적으로 변형된 아비폭스 바이러스 재조합체는 발명에 따라 사용되어 특히 비-조류 척추동물 접종에 사용되는 경우, 죽은 또는 감퇴된 살아있는 유기체를 사용하는 종래 백신의 결점을 극복한 신규한 백신을 제조하게 된다.
다시 한번 아비폭스 바이러스는 조류중 또는 조류 셀라인에서만 증식적으로 복제할 수 있고 또는 계대된다는 것이 주지되어야 한다. 조류 숙주 세포에서 수득된 재조합 아비폭스 바이러스는 백시니아 바이러스에 의한 포유류의 접종에 유사한 방식으로 포유류 같은 비-조류 척추동물에 접종된 경우, 아비폭스 바이러스의 증식적 복제없이 접종 병변을 발생시킨다. 그렇게 접종된 비-조류 척추동물에서 아비폭스 바이러스가 증식적으로 복제하지 못함에도 불구하고, 바이러스의 충분한 발현이 일어나므로 접종된 동물은 재조합 아비폭스 바이러스의 항원 결정기 및 또한 그 안의 외인성 유전자에 코드화된 항원 결정기에 대해 면역학적으로 반응한다.
조류종을 접종하기 위해 사용되는 경우, 그러한 합성 재조합 아비폭스 바이러스는 그 안에 존재할 수 있는 어떠한 공급원으로부터의 외인성 DNA에 의해 코드화되는 항원에 대한 면역학적 반응을 생성할 뿐만 아니라, 아비폭스 벡터 자체에 대한 예견된 면역학적 반응의 환기와 함께 숙주에서의 바이러스의 증식적 복제를 유발한다.
여러 연구자들은 가금류 가축의 보호를 위하여 가축백신으로서 사용하기 위한 재조합 파울폭스, 특히 바이러스를 만드는 것을 제안하였었다. 보일과 쿠파, J. Gen Virol.
Figure kpo00001
, 1591-1600(1986), 및 빈스 등, Isr. J. Vet. Med.
Figure kpo00002
, 124-127(1986). 포유류에서 특이적 면역성을 유도하기 위한 방법으로서 재조합 아비폭스 바이러스를 사용하는 것에 관한 제안이나 실제 보고는 아직까지 없었다.
스티클과 메이어는 Fortschr. Med. 97(40), Pages 1781-1788(1979)에서 아비폭스, 특히 파울폭스 바이러스의 사람에게의 주사에 대해 기재하고 있다. 그러나, 이들 연구는 단지 암치료의 후유증으로 고생하는 환자에서 비특이적 면역성을 증진시키기 위한 통상의 파울폭스의 사용에 관련된 것에 불과하다. 어떠한 재조합 DNA기법도 사용되지 않았다. 거기에는 척추동물 병원체의 항원을 코드하는 DNA가 삽입되어 있는 아비폭스나, 또는 척추동물에서 특이적 면역성을 유도하는 방법은 나타나 있지 않다. 대신에, 선행기술은 사람 숙주에 미치는 일반적이고 비특이적인 강장효과에 좌우된다.
유전적 재조합의 기초에 대한 보다 완전한 논의는 어떻게 본 발명의 변형 재조합 바이러스가 만들어지는가를 이해하는데 도움을 줄 것이다.
유전적 재조합은 일반적으로 DNA의 2스트란드 사이의 데옥시리보핵산(DNA)의 상동부분의 교환이다(어떤 바이러스에서는 리보핵산[RNA]이 DNA를 대신하기도 한다). 핵산의 상동부분은 뉴클레오티드 염기서열이 동일한 핵산(RNA 또는 DNA)의 부분이다.
유전적 재조합은 감염된 숙주 세포내에서 새로운 바이러스 게놈의 복제 또는 조작중에 자연적으로 일어날 수 있다. 그러므로, 바이러스 유전자 사이의 유전적 재조합은 둘 또는 그 이상의 상이한 바이러스 또는 다른 유전적 구조로 공-감염되는 숙주 세포에서 일어나는 바이러스 복제 주기중에 일어날 수 있다. 제1게놈으로부터의 DNA부분은 DNA가 제1바이러스 게놈의 그것과 상동인 제2공-감염성 바이러스의 게놈의 부분을 제조할 때에 상호교환 가능하게 사용된다.
그러나, 완전히 상동이 아닌 상이한 게놈의 DNA부분 사이에서도 재조합은 일어날 수 있다. 만약 하나의 그런 부분이 예를 들어 유전적 마커 또는 상동 DNA의 일부에 삽입된 항원 결정기를 코드하는 유전자의 제1부분내의 존재를 제외한 또다른 게놈의 부분과 상동인 제1게놈으로부터라면, 재조합은 여전히 일어날 수 있고 그 재조합의 생성물은 그 유전적 마커 또는 유전자의 존재에 의하여 검출이 가능하다.
변형된 감염성 바이러스에 의한 삽입 DNA 유전 서열의 성공적인 발현은 2가지 조건을 필요로 한다.
첫째, 삽입은 변형된 바이러스가 생존가능하게 남아있을 수 있도록 바이러스의 비필수 영역으로 이루어져야 한다. 파울폭스나 다른 아비폭스 바이러스는 어떤것도 아직 백시니아 바이러스에 대해 설명되었던 것과 유사한 비필수 영역을 입증하지 못하였다. 따라서, 본 발명에 대해서 파울폭스의 비필수 영역이 파울폭스 게놈을 단편들로 절단함으로써 발견되었고 그런 다음에 크기에 의해 단편이 분리되고 증폭을 위해 플라스미드 구조로 이들 단편들이 삽입되었다(플라스미드는 대장균을 포함하여 많은 박테리아에서 염색체 외재성 요소로서 발견된 작은 원형 DNA분자이다. 항원 결정기 또는 다른 유전적 마커에 대한 유전자와 같은 DNA서열을 플라스미드 안으로 삽입하는 방법은 기술분야에 공지이며 매니아티스 등의
Figure kpo00003
Figure kpo00004
, Cold Spring Harbor Laboratory New York[1982]에 상세하게 설명되어 있다). 이것에 이어서 유전적 마커 및/또는 항원을 코드하는 유전자가 클론된 파울폭스 단편에 삽입되었다. 유전적 마커 또는 항원의 성공적인 발견에 의해 증명되는 바, 성공적인 재조합을 가리키는 그런 단편들은 파울폭스 게놈의 비필수 영역에 삽입된 DNA를 포함하는 것들이었다.
삽입된 DNA의 발현에 대한 제2조건은 삽입된 DNA와 적절한 관련이 있는 촉진유전자의 존재이다. 촉진유전자는 발현시키고자 하는 DNA서열의 위쪽에 위치하도록 놓여져야 한다. 아비폭스 바이러스가 잘 알려져 있지 않고 아비폭스 촉진유전자가 기술분야에서 사전에 확인되어 있지 않으므로, 다른 폭스 바이러스로부터의 공지 촉진유전자들이 DNA의 위쪽에 유용하게 삽입되어 본 발명의 일부로서 발현된다. 파울폭스 촉진유전자 또한 발명의 방법을 수행하고 생성물을 만들기 위해 성공적으로 사용될 수 있다. 본 발명에 따라서, 파울폭스 촉진유전자, 백시니아 촉진유전자 및 엔토모폭스 촉진유전자가 재조합 폭스 바이러스의 전사를 촉진시키는 것으로 밝혀졌다.
보일과 쿠파는 J. Gen. Virol.
Figure kpo00005
, 1591(1986)에서 백시니아 촉진유전자가 "(파울폭스) 바이러스에서 작동하는 것으로 강력하게 예견된다"는 견해를 발표하였다. 그들은 파울폭스 TK 유전자를 위치시켜 클론하였고(Boyle et al., Virology
Figure kpo00006
, 355-365[1987]) 그것을 백시니아 바이러스에 삽입하였다. 이 TK 유전자를, 아마도 백시니아 중합효소 기능에 의한 파울폭스 TK 촉진유전자의 인지 때문에 발현시켰다. 그러나, 그들의 견해에도 불구하고, 그들은 어떠한 백시니아 촉진유전자도 파울폭스 바이러스에 삽입시키지 않았고 또 파울폭스 게놈에 존재하는 외래 DNA서열의 어떠한 발현도 관찰하지 않았다. 본 발명 전에는 백시니아 촉진유전자 같은, 다른 폭스 바이러스로부터의 촉진유전자가 실제로 아비폭스 게놈에서 유전자를 촉진한다는 것이 미지였다.
[어떤 바람직한 구체예의 설명]
특별히 파울폭스와 카나리아폭스가 본 발명에 따라 그 안에 외인성 DNA를 통합시킬 때 재조합에 의하여 변형될 바람직한 아비폭스 종으로서 사용되었다.
파울폭스는 특히 닭을 감염시키지만, 포유류는 감염시키지 않는 아비폭스의 종이다. 본원에서 FP-5로 표시되는 파울폭스 균주는 미합중국 위스콘신, 매디슨 소재의 아메리칸 사이언티픽 래보레이토리스(Americ an Scientific Laboratories)(Divison of Schering Corp.)로부터 쉽게 구할 수 있는 닭의 배(embryo)기원의 상업용 파울폭스 바이러스 백신 균주로, 미합중국 수의학 라이센스 넘버 165, 일련번호 30321이다.
본원에 FP-1로 표시된 파울폭스 균주는 생후 1일된 병아리에서 백신으로서 사용될 변형된 듀베트 균주이다. 이 균주는 O DCEP 25/CEP 67/2309 옥토버 1980으로 표시된 상업용 파울폭스 바이러스 백신 균주이고 인스티튜트 메리에욱스 인코오퍼레이티드로부터 쉽게 구할 수 있다.
카나리아폭스는 아비폭스의 또다른 종이다. 파울폭스와 비슷하게 카나리아폭스는 특히 카나리아를 감염시키지만 포유류는 감염시키지 않는다. 본원에 CP로 표시된 카나리아폭스 균주는 LF2 CEP 524 24 10 75로 표시된 상업용 카나리아폭스 백신 균주이고 인스티튜트 메리에욱스 인코오퍼레이티드로부터 쉽게 구할 수 있다.
본 발명에 따라 유전적 재조합에 의해 이들 아비폭스 바이러스에 삽입된 DNA 유전 서열로는 원핵세포 기원의 Lac Z 유전자; 비-조류(특이적으로는 포유류의) 병원체의 항원인 광견병 당단백질(G) 유전자; 아비폭스 바이러스 이외의 병원성 조류 바이러스의 항원인 칠면조 인플루엔자 혈구 응집소 유전자; 포유류 바이러스인 소 백혈병 바이러스의 gp51,30 엔벨로프 유전자; 조류 바이러스인 뉴캐슬 질병 바이러스(텍사스 균주)의 융합 단백질 유전자; 포유류 바이러스인 고양이 백혈병 바이러스의 FeLV 엔벨로프 유전자; 조류 바이러스/가축 질병인 로우스 관련 바이러스의 RAV-1 env 유전자; 조류 바이러스인 닭/펜실바니아/1/83 인플루엔자 바이러스의 핵단백질(NP) 유전자; 조류 바이러스인 감염성 기관지염 바이러스(균주 Mass 41)의 매트릭스 유전자 및 페플로머 유전자; 포유류 바이러스인 단순포진 바이러스의 당단백질 D유전자(gD)가 있다.
Lac Z 유전자의 단리는 카사대반 등에 의해 Methods in Enzymology
Figure kpo00007
, 293-308(1983)에 기재되어 있다. 광견병 G 유전자의 구조는 예를 들면 아닐리오니스 등에 의해 Nature
Figure kpo00008
275-278(1981)에 개시되어 있다.
그것의 백시니아로의 통합과 이 벡터에서의 발현은 키에니등에 의해 Nature
Figure kpo00009
163-166(1984)에서 논의되고 있다. 칠면조 인플루엔자 혈구 응집소 유전자는 가와오까등에 의해 Virology
Figure kpo00010
218-227(1987)에 기재되어 있다. 소 백혈병 바이러스 gp51,30 env 유전자는 라이스등에 의해 Virology
Figure kpo00011
82-93(1984)에 기재되어 있다. 뉴캐슬 질병 바이러스(텍사스 균주)의 융합유전자는 인스티튜트 메리에욱스 인코오퍼레이티드로부터 플라스미드 pNDV 108로서 쉽게 구할 수 있다. 고양이 백혈병 바이러스 env 유전자는 길호트등에 의해 Virology
Figure kpo00012
, 252-258(1987)에 기재되어 있다. 로우스 관련 바이러스 타입 1은 두가지 클론, pen VRVIPT와 mp 19env(190)으로서, 인스티튜트 메리에욱스 인코오퍼레이티드로부터 쉽게 구할 수 있다. 닭 인플루엔자 NP유전자는 세인트 쥬드 아동연구병원의 가와오까 요시히로로부터 플라스미드 pNP33으로서 쉽게 구할 수 있다. IBV Mass 41 매트릭스 유전자와 페플로머 유전자의 감염성 기관지염 바이러스 cDNA 클론은 인스티튜트 메리에욱스 인코오퍼레이티드로부터 플라스미드 pIBVM 63으로서 쉽게 구할 수 있다. 단순 포진 바이러스 gD 유전자는 왓슨등에 의해 Science
Figure kpo00013
381-385(1982)에 기재되어 있다.
아래에서 더욱 상세히 기재되는 재조합 아비폭스 바이러스는 3 백시니아 촉진유전자중 하나를 통합한다. 백시니아의 Ava I H영역으로부터의 Pi 촉진유전자가 와치스맨등에 의해 J. of Inf. Dis
Figure kpo00014
1188-1197(1987)에 기재되어 있다. 보다 구체적으로, 이 촉진유전자는 L-변이 WR 백시니아 균주의 Ava I H(Xho I G) 단편으로부터 유도되고 그 단편내의 촉진유전자는 전사의 방향을 우측에서 좌측으로 정한다. 촉진유전자의 지도 위치는 Ava I H의 좌측 끝으로부터 대략 1.3Kbp(킬로염기쌍)이고 백시니아 게놈의 좌측 끝으로부터 대략 12.5Kbp이며, Hind Ⅲ C/N 접합의 좌측으로 약 8.5Kbp 위치이다. 촉진유전자의 서열은 : (GGATCCC)-ACTGTAAAAATAGAAACTATAATCATATAATAGTGTAGGTTGGTAGTAGGGTACTCGTGATTAATTTTATTGTTAAACTTG-(AATTC)이며 괄호안의 기호는 링커서열이다.
Hind Ⅲ H 촉진유전자(또한 본원에서 "HH"와 "H6")는 표준전사 지도 기법에 의해 확인되었다. 그의 서열은 다음과 같다 :
Figure kpo00015
그 서열은 로젤등에 의한 J. Virol. 60, 436-449(1986) 기재의 오픈 리딩 프레임 H6의 윗쪽 서열로 기재된 것과 동일하다.
11K 촉진유전자는 위텍크에 의해 J. Virol. 49, 371-378(1984)에 및 시. 베르톨레트등에 의해 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 2096-2100(1985)에 기재된 바와 같다.
본 발명의 재조합 아비폭스 바이러스는 기술분야에 공지된 두 단계로 제조되고 상기 언급한, 백시니아 바이러스의 합성 재조합체의 제조에 대한 미국특허 제4,603,112호에 개시된 것과 유사하다.
먼저, 바이러스에 삽입될 DNA유전자 서열은 아비폭스 바이러스의 비필수 DNA부분과 상동인 DNA가 이미 삽입되어 있는 대장균 플라스미드 구조안에 놓인다. 별도로, 삽입될 DNA유전자 서열이 촉진유전자에 연결된다. 그런 다음 촉진유전자-유전자 연쇄가 구조안에 삽입되어 촉진유전자-유전자 연쇄가 아비폭스 DNA의 비필수 영역에 상동인 DNA에 의하여 양쪽 끝에 플랭크된다. 그 결과 형성된 플라스미드 구조체는 그후 대장균 박테리아내에서의 성장에 의하여 증폭된다(플라스미드 DNA는 외인성 유전물질을 운반하고 증폭하기 위하여 사용되고, 이 방법은 기술분야에서 잘 알려져 있다. 예컨대, 이들 플라스미드 기법이 클레웰에 의한 J. Bacteriol. 110, 667-676(1972)에 기재되어 있다. 대장균 숙주로부터 증폭된 플라스미드를 단리하는 기법이 또한 기술분야에서 잘 알려져 있으며 예컨대 클레웰등에 의해 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 62, 1159-1166(1969)에 기재되어 있다).
대장균내에서의 성장후에 단리된 증폭된 플라스미드 물질은 그후 제2단계에 사용된다. 즉, 삽입될 DNA유전자 서열 함유 플라스미드는 세포 배양액, 예컨대 닭의 배 섬유아세포에, 아비폭스 바이러스(파울폭스 균주 FP-1 또는 FP-5와 같은)와 함께 형질전환된다. 플라스미드와 바이러스 게놈에서 상동 파울폭스 DNA간의 재조합은 각각 그의 게놈의 비필수 영역의, 비-파울폭스 DNA서열의 존재에 의하여 변형된 아비폭스 바이러스를 제공한다.
본 발명과 그의 많은 이점에 대한 보다 나은 이해를 예시로서 제공한 다음의 실시예로 설명하기로 한다.
[실시예 1]
파울폭스 RNA 전사 인자에 의한 백시니아 촉진유전자의 인지를 증명하는 과도 발현 측정
백시니아 바이러스 촉진유전자 서열에 연결된 간염 B형 바이러스 표면 항원(HBSAg)코딩 서열을 함유하는 많은 플라스미드 구조를 만들었다. 50㎍의 각 플라스미드를 파울폭스 바이러스 또는 백시니아 바이러스로 세포당 10pfu로 감염된 CEF세포상에 형질전환시켰다. 감염을 24시간 동안 진행시킨 후 세포를 동결 및 해빙을 3회 반복함으로써 융해시켰다.
융해물중의 HBSAg의 양을 애보트 래보레이토리스, 다이아그노스틱 디비젼으로부터 쉽게 구입할 수 있는 AUSRIA Ⅱ-125I 키트를 사용하여 측정하였다. HBSAg의 존재 또는 부재를 제조업자에 의해 미리 결정된 네가티브 컷오프 값에 대한 미지의 총 카운트(샘플에서 바탕값을 뺌)의 비율로서 표현한다. 이것이 P/N(양성/음성) 비율이다. 그 결과를 표 I에 나타낸다.
세가지 상이한 백시니아 촉진유전자 서열을 사용하였다 : DNA 복제전에 백시니아 감염에서 초기 인지된 Pi 촉진유전자; DNA 복제의 개시 후에 백시니아 감염에서 후기에 인지된 11K 촉진유전자; 및 백시니아 감염에서 초기와 후기에 모두 인지되는 Hind Ⅲ H(HH) 촉진유전자. 이들 촉진유전자에 대해서는 앞서 설명하였다. 데이터는 감염된 세포의 융해물 중에 생성된 HBSAg이 파울폭스 또는 백시니아 전사 인자에 의한 백시니아 촉진유전자의 인지의 결과임을 의미한다.
[표 Ⅰ]
Figure kpo00016
[실시예 2]
Lac Z 유전자 함유 재조합 파울폭스 바이러스 vFP-1의 제조
파울폭스 바이러스의 비필수 영역에 단편을 위치시켰고 다음과 같이 단리하였다.
뉴클레아제 Bal 31을 FP-5 DNA의 단일 스트란트 말단 헤어핀 루프를 제거하기 위하여 사용하였다. DNA 중합효소 I의 클레노우 (큰)단편을 블런트 끝을 만들기 위하여 사용하였다. 루프를 제거한 후 제한 엔도뉴클레아제 Bgl Ⅱ로 소화하여 단편을 생성시켰다. 이 소화로 아가로스 겔전기영동에 의해 분리되는 일련의 FP-5 단편을 제조하였다.
8.8Kbp Bgl Ⅱ 블런트 끝처리된 단편을 단리하고 BamH I과 Sma I으로 절단되어 있는, 쉽게 구입할 수 있는 플라스미드 pUC 9에 연결하였다. 그 결과 형성된 플라스미드를 pRW 698로 표시하였다.
파울폭스 단편의 크기를 감소시키기 위하여 이 플라스미드를 Hind Ⅲ로 절단하여 2개의 추가의 단편을 만들었다. 6.7Kbp 단편은 버리고 나머지 4.7Kbp 단편을 그 자체끼리 연결하여 새로운 플라스미드를 형성하고 pRW 699로 표시하였다.
11K 촉진유전자로 촉진된 Lac Z 유전자를 이 플라스미드에 통합시키기 위하여 단지 한곳에서만 플라스미드를 절단하는 EcoRV로 pRW 699를 절단하였다. 그런 다음 11K 촉진유전자로 촉진된 Lac Z 절편을 블런트 끝처리된 Pst I-Bam H I 단편으로서 삽입하여 새로운 플라스미드를 만들고 pRW 702로 표시하였다. Lac Z 클론은 카사대반등의 상기 인용문헌에 기재된 바와 같이 pMC 1871으로부터이다. 11K 촉진유전자를 Bam H I 링커를 경유하여 Lac Z 유전자의 8번째 코돈에 연결하였다.
미국특허 제4,603,112호에 백시니아에 대해 기재된 것과 같은 재조합 기법으로, pRW 702 플라스미드를 다음의 과정을 사용하여 닭의 배 섬유아세포(CEF) 상에서 성정하는 파울폭스 바이러스 FP-5와 재조합시켰다. 50㎍의 pRW 702 DNA를 0.5㎍의 전체 게놈 파울폭스 DNA와 최종 부피가 100μl가 되도록 하여 혼합하였다. 이것에 10μl의 2.5M CaCl2와 40mM HePes, 300mM Nacl, 1.4mM Na2HPO4, 10mM Kcl, 및 12mM 덱스트로스로부터 제조한 2×HEBS 완충액(pH7) 110μl를 첨가하였다. 실온에서 30분 경과후, 5pfu/세포로 희석된 200μl의 파울폭스 바이러스 푸울을 첨가하고 그 혼합물을 일차 CEF 단일층을 함유하고 있는 60mm 디쉬상에 접종하였다. 2% 우태아혈청(FBS) 함유 이글배지 0.7ml을 동시에 첨가하였다. 그 플레이트를 37℃에서 2시간 동안 배양하였다. 그런 다음 2% FBS 함유 이글 배지를 다시 3ml 첨가하고 플레이트를 3일동안 배양하였다. 세포를 동결과 해빙을 3회 반복함으로써 융해한 후 그 자손 바이러스를 재조합체의 존재에 대하여 측정하였다.
파울폭스 FP-5의 게놈으로의 11K-촉진 Lac Z 유전자의 재조합에 의한 성공적인 삽입의 증거를 Lac Z 유전자의 발현에 대한 시험으로써 얻었다. Lac Z 유전자는 효소 베타-갈락토시다제를 코드하며, 그 효소는 색원체 기질 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-베타-D-갈락토시드(X-gal)를 절단하여 푸른색의 인돌릴 유도체를 방출한다. 푸른색 플라크를 양성 재조합체로서 선택하였다.
파울폭스 FP-5의 게놈으로의 Lac Z의 성공적인 삽입과 그의 발현을 또한 상업적으로 쉽게 구할 수 있는 항혈청과 베타-갈락토시다제 단백질의 면역 침전과 vFP-1 감염된 CEF, BSC(원숭이 신장 셀라인-ATCC CCL26), VERO(원숭이 신장 셀라인-ATCC CCL81), 및 MRC-5(사람 이극성 폐 셀라인-ATCC CCL171)을 사용하는 표준기법에 의해 확인하였다.
재조합 바이러스 vFP-1에 의한 베타-갈락토시다제의 발현은 토끼와 마우스를 바이러스로 접종하고 접종된 동물의 혈청에서 베타-갈락토시다제 단백질에 대해 지시된 항체의 역가의 접종 후 상승을 성공적으로 측정함으로써 추가로 체내에서도 확인하였다.
특히, 재조합체 vFP-1을 숙주세포 오염물로부터 정제하였고 2마리 토끼의 양 옆에서 두곳에 피부내 접종하였다. 각 토끼에 총 108pfu를 주었다.
동물을 주간격으로 출혈시키고 쉽게 구입할 수 있는 정제된 베타-갈락토시다제의 제제를 사용하는 ELISA측정에서 혈청을 항원 공급원으로서 사용하였다.
재조합체 vFP-1으로 접종된 토끼와 마우스는 두가지 모두 ELISA 측정으로 검출된 바와 같이 베타-갈락토시다제에 대한 면역 반응을 나타냈다. 2가지 종에서 반응은 접종후 1주일에 검출가능하였다.
[실시예 3]
파울폭스 바이러스 FP-5로부터 광견병 G 유전자와 Lac Z 함유 재조합 바이러스 vFP-2의 제조
0.9Kbp Pvu Ⅱ 단편을 FP-5로부터 얻어서 표준기법에 의해 pUC 9의 2 Pvu Ⅱ 부위 사이에 삽입하였다. pRW 688.2로 표시한 그 결과의 구조는 Pvu Ⅱ 단편내에 비대칭으로 있는 대략 30bp 떨어져 있는 2개의 Hinc Ⅱ 부위를 가지며 그로써 단편의 긴 아암과 짧은 아암을 형성한다.
올리고뉴클레오티드 어댑터를 공지기법을 사용하여 이들 Hinc Ⅱ 부위 사이에 삽입하여 Pst I과 Bam H I 부위를 도입하고, 그로써 플라스미드 pRW 694를 만들었다.
이 플라스미드를 Pst I과 Bam H I으로 절단하고 앞서 기재한 연결된 11K 백시니아 촉진유전자를 가지는 Lac Z 유전자를 삽입하여 새로운 플라스미드 pRW 700을 만들었다.
Pi-촉진된 광견병 G 유전자를 만들기 위하여 광견병 유전자의 5'에 가까운 쪽의 Bgl Ⅱ 부위(키에니등의 상기 인용문헌과 비교)를 블런트 끝처리하여 상기한 Pi 촉진유전자의 끝이 채워진 Eco R I 부위에 연결하였다.
이 구조를 pRW 700의 Pst I 부위에 삽입하여 외래 유전자 서열 Pi-광견병 G-11K-Lac Z를 가지고 있는 플라스미드 pRW 735.1을 만들었다. 이 삽입은 플라스미드 안으로 방향이 되어 있어서 FP-5 도너(donor)서열의 긴 Pvu Ⅱ-Hinc Ⅱ 아암이 Lac Z 유전자에 대한 3'이다.
그 결과의 최종 구조를 재조합체 파울폭스 바이러스 vFP-2를 만들기 위해 앞서 기재하였던 방법에 의하여 닭의 배 섬유아세포의 감염/형질전환에 의하여 파울폭스 바이러스 FP-5와 재조합하였다. 이 재조합체 바이러스를 X-gal 염색으로 선택하였다.
두가지 Lac Z 마커 유전자와 광견병 G 유전자의 적절한 삽입 및 발현을 아래에 기재하는 많은 추가의 방법에 의하여 증명하였다.
특이적 항체에 의한 광견병 항원의 면역형광 정위는 vFP-2 바이러스로 감염된 조류 및 비-조류 세포의 표면상에서의 광견병 항원발현을 입증하였다.
보다 앞서 vFP-2 바이러스로 감염된 조류 및 비-조류 세포에 의한 광견병 항원과 베타-갈락토시다제의 발현을 면역 침전법에 의하여 확인하였다.
본 발명의 vFP-2 구체예가 광견병 G와 베타-갈락토시다제에 대한 유전자를 운반하는 성공적인 재조합체 바이러스라는 추가의 증거를 2마리 토끼를 vFP-2 바이러스로 접종시킴으로써 얻었다. 2마리 토끼를 마리당 1×108pfu의 vFP-2로 피부내 접종시켰다. 이들 토끼는 2마리 모두 전형적인 폭스 병변을 나타냈다. 토끼를 주 간격으로 출혈시켜서 혈청을 ELISA에 의해 시험하여 광견병 당단백질과 베타-갈락토시다제 단백질에 특이적인 항체의 존재를 검출하였다.
하기 표 Ⅱ에 나타나는 바와 같이, 토끼 205는 접종 1주일 후 ELISA 시험에 의하여 항-베타-갈락토시다제 항체의 검출가능 수준을 나타냈다.
4000분의 1의 역가까지의 2주일 후의 이 상승은 접종후 5주까지 유지되었다. 항원 캡춰 ELISA 측정을 사용하여 토끼 205로부터의 혈청은 접종후 3주 내지 10주 동안에 검출가능한 수준의 항-광견병 항체를 나타냈다.
[표 Ⅱ]
토끼 205에 의한 광견병 항원과 베타-갈락토시다제 단백질에 대한 항체 생성
Figure kpo00017
[실시예 4A]
파울폭스 바이러스 FP-1으로부터의 촉진된 광견병 G 유전자 함유 재조합 바이러스 vFP-3의 제조
이 구체예는 광견병 G 유전자가 FP-5 이외의 파울폭스 균주, 특이적으로 FP-1로 표시되는 파울폭스 바이러스의 다른 균주에 의하여 완전히 발현되는 것을 증명한다.
실시예 3에서와 같이, FP-5에서와 같이 단편이 비필수 영역을 함유할 것이라는 추측하에 0.9Kbp Pvu Ⅱ 단편을 FP-1으로부터 얻었다.
이 단편을 pUC 9의 2 Pvu Ⅱ 부위 사이에 삽입하여 pRW 731.15R로 표시되는 플라스미드를 생성하였다.
이 플라스미드는 Pvu Ⅱ 단편내에 비대칭으로 대략 30bp 떨어져 있는 2개의 Hinc Ⅱ 부위를 가지며, 그로써 단편의 긴 아암과 짧은 아암을 형성한다.
상업적으로 쉽게 구할 수 있는 Pst 링커 (5')-CCTGCAGG-(3')을 두개의 Hinc Ⅱ 부위 사이에 삽입하여 플라스미드 pRW 741을 만들었다.
HH-촉진된 광견병 G 유전자를 Pst I 부위에서 이 플라스미드에 삽입하여 새로운 플라스미드 pRW 742B를 생성하였다. CEF 세포의 감염/형질전환에 의하여 FP-1과의 이 플라스미드 재조합에 의하여 바이러스 vFP-3을 얻었다.
HH 촉진유전자에 의해 촉진되는 오픈 리딩 프레임의 ATG 번역 개시 코돈을 HH 촉진 유전자의 Eco RV 부위와 광견병 G 유전자의 Hind Ⅲ 부위를 회전하는 합성 올리고뉴클레오티드를 사용하여 광견병 G의 개시 코돈 위에 중첩시켰다.
이 HH-촉진 광견병 유전자의 5' 끝은 공지 기법에 의하여 변형시켜 Pst I 부위를 함유하도록 한 후 이 구조를 pRW 741의 Pst I 부위를 연결하여 pRW 742B를 만들었다. 이 플라스미드에서 구조의 방향은 앞서 실시예 3에서 논의된 pRW 735.1과 동일하다.
실시예 2에서 기재한 바와 같이 재조합을 수행하였다. 그 결과의 재조합체를 vFP-3이라 한다.
vFP-3 바이러스로 감염된 조류 및 비-조류 세포 두가지에 의한 광견병의 발현을 앞서 기재한 면역 침전과 면역형광 기법에 의하여 확인하였다.
본 발명의 vFP-3 구체예가 광견병 G에 대한 유전자를 발현하는 성공적인 재조합 바이러스라는 추가의 증거를 재조합 바이러스로 한 쌍의 토끼를 피부내 접종함으로써 얻었다. 2마리 토끼를 토끼당 1×108pfu의 vFP-3로 피부내 접종하였다. 이들 2마리 토끼는 모두 접종 후 5-6일에 최대 크기에 도달하는 전형적인 폭스 병변을 나타냈다. 토끼를 주 간격으로 출혈시키고 그 혈청을 ELISA로 시험하여 광견병 당단백질에 특이적인 항체의 존재를 검출하였다.
5마리 쥐의 각각을 또한 5×107pfu의 vFP-3로 피부내 접종하였다. 모든 동물에서 병변이 나타났다.
토끼와 쥐 두가지 모두 접종 2주일 후 광견병에 특이적인 항체를 검출가능한 수준으로 나타냈다. 원래의 FP-1 바이러스로 피부내 접종된 2마리의 대조 토끼는 검출 가능한 수준의 항-광견병 항체가 없었다.
항체 반응이 제공된 동물에서 재조합 바이러스에 의한 광견병 항원의 새로운 합성에 의한다기 보다는 접종물 바이러스와 함께 우연히 운반된 또는 재조합 파울폭스 바이러스의 막에 통합된 광견병 항원의 도입 때문이라는 가능성을 배제하기 위하여, vFP-3 바이러스를 화학적으로 비활성화시켜 토끼에게 접종하였다.
정제된 바이러스를 0.001%의 베타 프로피오락톤의 존재하에 4℃에서 밤새 비활성화시킨 후 원심분리에 의하여 펠릿화하였다. 펠릿화 바이러스를 10mM 트리스 완충 식염수 중에 수집하고 초음파 처리한 다음 적정하여 감염성 바이러스가 남아 있지 않음을 확실하게 하였다. 2마리 토끼를 비활성화 vFP-3로, 그리고 2마리는 동등량의 미처리 재조합체로 피부내 접종하였다. 병변의 크기를 모니터하였다.
미처리 vFP-3을 받은 두마리 토끼는 모두 접종 5일 후 4 내지 5+ 등급의 전형적인 폭스 병변을 발생하였다. 비활성화 바이러스로 접종된 토끼도 또한 병변을 발생하였지만, 이들의 등급은 접종 5일 후 2+였다.
토끼를 주 간격으로 출혈시키고 그 혈청을 ELISA로 광견병 특이적 항체 및 파울폭스 특이적 항체의 존재에 대하여 시험하였다. 그 결과를 아래의 표 Ⅲ에 나타낸다.
[표 Ⅲ]
Figure kpo00018
이 시험에서 역가 종점(혈청 희석의 역수로 표시함)을 모든 예비-도전 혈청의 흡광 가를 뺀후의 0.2에 임의로 고정하였다. 살아있는 바이러스를 받은 토끼 295와 318은 모두 광견병 당단백질과 파울폭스 바이러스 항원에 대한 면역 반응을 나타냈다. 토끼 303과 320도 또한 비록 역가는 낮았지만 파울폭스 바이러스 항원에 대한 면역 반응을 나타냈다. 이들 토끼는 어느 것도 광견병 당단백질에 대한 검출할 수 있는 반응을 나타내지 않았다.
이 발견은 토끼에서 생성된 면역 반응이 재조합 바이러스에 운반된 광견병 당단백질 유전자의 새로운 발현 때문이고 접종물 바이러스에 운반된 어떠한 우연한 당단백질에 대한 반응이 아니라는 것을 의미한다.
[실시예 4B]
파울폭스 바이러스 FP-1으로부터의 촉진되지 않은 광견병 G 유전자 함유 재조합 바이러스 vFP-5의 제조파울폭스 게놈에 재조합에 의하여 삽입된 외래 유전자의 발현은 촉진유전자의 존재를 필요로 한다. 이것을 HH 촉진유전자가 없는 것을 제외하고는 vFP-3와 동일한 또하나의 재조합체, vFP-5의 제조에 의하여 입증하였다.
이 재조합체에서 광견병 유전자의 존재를 핵산 혼성체 형성에 의하여 확인하였다.
그러나, 바이러스에 의해 감염된 CEF 세포 배양액에서 광견병 항원은 검출되지 않았다.
[실시예 5]
파울폭스 바이러스의 비-조류 세포에서의 복제 여부를 측정하기 위한 시험관내 계대 실험
세가지 세포 시스템, 조류 한마리와 비-조류 2마리가 원래의 FP-1 균주 또는 재조합 vFP-3으로 접종된 실험을 수행하였다. CEF, MRC-5, 및 VERO 각각의 2디쉬를 세포당 10pfu의 인풋 중복도로 FP-1 또는 vFP-3으로 접종하였다. 3일째에, 한 디쉬를 각각 수확하였다. 바이러스를 동결 및 해빙의 3회 반복으로 방출시키고 동일한 셀라인의 새로운 단일층상에 재접종하였다.
이것을 6회 연속 계대동안 반복하고, 실험의 마지막에 각 계대의 샘플을 CEF 단일층상에서 바이러스 감염도에 대하여 측정하였다.
그 결과를 표 Ⅳ A에 나타내며 그것은 FP-1과 vFP-3 두가지의 연속계대가 CEF 세포에서 가능하지만 두가지 비-조류 셀라인에서는 가능하지 않음을 가리킨다. 감염성 바이러스는 VERO 또는 MRC-5 세포에서 3 또는 4계대 후에 검출가능하지 않았다.
두번째 디쉬는 바이러스가 직접 적정에 의해 검출가능하지 않고 투과성 CEF 세포에서 증폭후에 검출될 수 있다면, 측정하기 위해 사용하였다. 3일째에, 제2디쉬상의 세포를 스크랩핑에 의해 수득하여 세포의 3분의 1을 융해한 후 새로운 CEF 단일층상에 접종하였다. 완전한 세포병원 효과(CPE)가 나타났거나 또는 감염후 7일째에 세포를 융해하여 바이러스 수율을 적정하였다. 그 결과를 표 Ⅳ B에 나타낸다. CEF 세포에서의 계대가 어떠한 바이러스 존재를 증폭하기 위해 사용된 경우, 바이러스는 4 또는 5계대 후에 검출할 수 없었다.
영구적으로 감염된 세포를 만들려는 시도는 실패하였다.
비-조류 세포에서 연속 바이러스 발현의 증거를 검출하기 위한 추가의 시도에서 상기 바이러스 적정에 사용한 샘플을 항-파울폭스 항체와 항-광견병 항체를 각각의 항원의 존재를 검출하기 위해 사용한 표준 면역돗트 측정에 사용하였다. 이들 측정의 결과는 적정 결과를 확증한다.
[표 ⅣA]
Figure kpo00019
a-ml당 log10pfu로서 나타낸 바이러스 역가.
b-검출되지 않음.
[표 ⅣB]
Figure kpo00020
a-ml당 log10pfu로서 나타낸 바이러스 역가.
b-검출되지 않음.
[실시예 6]
파울폭스 FP-1의 기타의 재조합체 : vFP-6, vFP-7 vFP-8 및 vFP-9
재조합 바이러스 vFP-6 및 vFP-7을 다음의 과정에 의하여 제조하였다.
FP-1의 5.5Kbp Pvu Ⅱ 단편을 pUC 9의 2 Pvu Ⅱ 부위 사이에 삽입하여 플라스미드 pRW 731.13을 만들었다. 그런 다음 이 플라스미드를 유일한 Hinc Ⅱ 부위에서 절단하고 블런트 끝의 HH-촉진된 광견병 G 유전자를 삽입하여 삽입의 방향이 반대인 플라스미드 pRW 748A와 B를 만들었다. 플라스미드 pRW 748A와 B를 그 다음에 별도로 FP-1 바이러스와 함께 CEF 세포를 형질전환하여 재조합에 의하여 각각 vFP-6과 vFP-7을 제조하는데 사용하였다. 이 유전자좌를 이제 유전자좌 f7로 표시한다.
FP-1의 10Kbp Pvu-Ⅱ 단면을 pUC 9의 2 Pvu Ⅱ 부위 사이에 삽입하여 pRW 731.15를 만들었다. 그런 다음 이 플라스미드를 유일한 Bam H I 부위에서 절단한 후 11K 촉진된 Lac Z 유전자 단편을 삽입하여 각각 반대방향의 삽입을 나타내는 pRW 749A와 B를 만들었다. 이들 도너 플라스미드의 FP-1으로의 재조합으로 각각 vFP-8과 vFP-9를 만들었다. 이 유전자좌를 이제 유전자좌 f8로 표시한다.
vFP-8과 vFP-9는 X-gal에 의해 검출된 바, Lac Z 유전자를 발현하였다. vFP-6과 vFP-7은 광견병 특이적 항혈청에 의해 검출된 바 광견병 G 유전자를 발현하였다.
[실시예 7]
살아있는 광견병 바이러스로의 도전에 대하여 동물을 보호하기 위한 vFP-3으로의 면역감작
4-6주된, 암컷 SPF 마우스 20마리 군을 50μl의 vFP-3로 마우스당 0.7 내지 6.7TCID50의 용량 범위로 풋패드에 접종하였다(TCID50 또는 조직 배양 감염성 용량은 조직 배양 세포의 50퍼센트가 세포 병원 효과로 고생하는 용량이다). 예방접종 후 14일째에 각 군의 10마리 마우스를 희생시켜 RFFI 시험의 측정을 위해 혈청 샘플을 수집하였다. 나머지 10마리 마우스에는 10LD50의 CVS 광견병 균주를 뇌내 경로로 접종 도전하고 도전 14일 후 생존한 마우스를 계수하였다.
그 결과를 아래의 표 ⅤA에 나타낸다.
[표 ⅤA]
Figure kpo00021
* RFFI(급속 형광 포커스 저해) 시험(Laboratory Techniques in Rabies, Third Ed., 354-357, WHO Geneva)으로 측정함.
실험을 12.5LD50의 도전 광견병 바이러스로 반복하였다. 그 결과를 아래의 표 ⅤB에 나타낸다.
[표 ⅤB]
Figure kpo00022
두마리 개와 두마리 고양이를 8log10TCID50의 재조합체 vFP-3으로 1회 피하 접종으로 면역시켰다. 또한, 동일한 년수와 체중의 두마리 개와 네마리 고양이를 예방접종하지 않은 대조표준으로 하였다. 모든 동물을 주간격으로 출혈시켰다. 94일째에 각 개에 인스티튜트 메리에욱스 인코오퍼레이티드로부터 쉽게 구할 수 있는 광견병 바이러스의 NY 균주의 타액 균등물 0.5ml을 측두근에 2회 접종 도전하였다. 총 용량은 뇌내 경로에 의한 10000마우스 LD50에 해당하였다. 6마리 고양이를 동일한 바이러스 현탁액 0.5ml로 2회 목근육을 접종함으로써 도전시켰다. 동물당 총 용량은 뇌내 경로에 의한 40000마우스 LD50에 해당하였다. 동물을 매일 관찰하였다. 표 Ⅵ에 표시된 날에 예방접종되지 않은 모든 동물은 광견병 증상으로 죽었다. 예방 접종한 동물은 도전에도 살아남았고 마지막 대조 동물의 사망후에도 3주 동안 관찰하였다. 그 결과를 아래 표 Ⅵ에 나타낸다.
[표 Ⅵ]
Figure kpo00023
a-vFP-3으로 예방접종된 고양이와 개는 모두 피하 경로로 8log10 TCID50을 받았다.
b-RFFI 시험에서 형광 웰의 수를 50% 이상 감소시키는 가장 높은 혈청 희석의 log10 값으로 나타낸 역가.
c-예방접종하지 않은 대조동물.
d-죽은 동물/도전후 사망일.
추가의 실험에서 재조합 바이러스 vFP-2와 vFP-3을 여러 상이한 경로에 의하여 소에 접종시켰다.
접종된 동물을 6, 14, 21, 28, 및 35일째에 항-광견병 항체에 대하여 시험하였다. 다음의 표 ⅦA에 나타나는 바와 같이, 모든 동물은 광견병 항원에 대하여 혈청학적 반응을 보였다.
[표 ⅦA]
vFP-3으로 접종된 동물의 항체 역가
Figure kpo00024
+ 유효하지 않음
모든 소를 접종후 55일째에 8log10 TCID50으로 재예방접종하였고 광견병 항원에 대하여 기왕성 반응을 보였다. 추가의 재예방접종에서 No. 1421을 제외한 모든 소를 피하접종하였고, No. 1421은 다시 근육내 접종하였다. RFFI 역가를 55, 57, 63, 70, 77 및 86일째에 측정하였다. 그 결과를 표 ⅦB에 나타낸다.
[표 ⅦB]
Figure kpo00025
모든 데이터는 vFP-2에 대한 1423 동물을 제외하고는 vFP-3에 대한 것이다.
소, 고양이, 및 토끼를 또한 공지량의 파울폭스 바이러스로 피부내 접종하였고 약 1주 후 동물로부터 가피(scab)를 수집하였다. 이들을 갈아서 식염액에 현탁하여 적정함으로써 바이러스 레벨을 측정하였다.
감염성 바이러스의 단지 잔여량만을 회수할 수 있었다. 이것은 체내에서 증식적 감염이 일어나지 않았음을 증명한다.
[실시예 8]
vFP-3으로의 닭의 접종
벡터의 증식적 복제를 허용하는 시스템에서 재조합 파울폭스 바이러스에 의한 외래 DNA의 발현을 증명하기 위하여 재조합체 파울폭스 바이러스 vFP-3을 닭에 접종하였다.
화이트 레그호온 닭을 9log10TCID50vFP-3 또는 3log10TCID50vFP-3으로 날개를 관통하여 근육내 접종하였다. 예방접종 21일 후 광견병 항체에 대한 RFFI 시험을 위하여 혈액 샘플을 취하였다. 접종된 닭에서 21일째의 역가는 대조표준에서 21일째의 역가보다 상당히 높았다. 즉, 비감염 대조표준의 평균역가는 0.6이었고 ; 근육내 접종된 조류에서 평균은 1.9였으며 ; 관통된 조류에서는 1.2였다.
[실시예 9]
칠면조 인플루엔자 H5 HA항원을 발현하는 재조합체 파울폭스 vFP-11
조류종을 발명의 재조합 아비폭스 바이러스를 이용하여 조류 병원체에 대하여 면역시킬 수 있다.
그러므로, 파울폭스 바이러스 FP-1로부터 유도되고, A/터어키/아일랜드/1378/83(TYHA)의 Hind Ⅲ H-촉진된 혈구응집소 유전자(H5)를 함유하고 있는 신규한 플라스미드 pRW 759(아래에 기재함)를 원래의 바이러스 FP-1으로 동시에 감염되는 CEF 세포를 형질전환하기 위하여 사용하였다. 재조합 파울폭스 바이러스 vFP-11을 본원에 앞서 기재한 기법에 의하여 얻었다.
vFP-11 감염 세포에 의한 혈구응집소 분자의 합성을 특이적 항 H5-항체와 표준기법을 사용하여 대사적으로 방사성 표지한 감염세포 융해물로부터 면역 침전법에 의하여 확인하였다. 분자량이 대략 63kd(킬로달톤)인 전구체 혈구응집소와 분자량이 44와 22kd인 두개의 절단 생성물과의 특이적 면역 침전이 입증되었다. 비감염 CEF 세포 또는 원래의 바이러스, 즉, FP-1 감염 세포의 융해물로부터는 침전되는 그러한 단백질은 없었다.
재조합 파울폭스 vFP-11로 감염된 세포에서 제조된 HA 분자가 세포 표면상에서 발현되었는지를 측정하기 위하여 면역형광 연구를 수행하였다. 재조합 파울폭스 바이러스 vFP-11로 감염된 CEF 세포는 강한 표면 형광 염색을 보였다. 어버이 바이러스 FP-1로 감염된 세포에서는 형광은 검출되지 않았다.
플라스미드 pRW 759를 다음과 같이 제조하였다 :
pRW 742 B(실시예 4 비교)를 Pst I으로 부분 소화하여 선형화하고 그 단편을 Eco RV로 재절단하여 광견병 G 유전자를 제거하여 약 3.4Kbp의 나머지 단편상에 HH 촉진유전자가 남아있게 하였다. 이것을 알칼리 포스파타제로 처리하고 HH 촉진유전자와 TYHA와의 결합을 위하여 합성 올리고뉴클레오티드를 ATG에 삽입하여 pRW 744를 만들었다.
이 플라스미드를 Dra I으로 부분 소화하여 선형화하고, 선형 단편을 Sal I으로 잘라 큰 단편을 재단리하여 알칼리 포스파타제로 처리-하였다.
마지막으로 pRW 744 벡터에 TYHA의 코딩 서열인 단리된 Sal I -Dra I를 삽입하여 pRW 759를 제조하였다(Kawaoka et al., Virology 158, 218-227(1987)).
[실시예 10]
살아있는 인플루엔자 바이러스로의 도전에 대하여 조류를 보호하기 위한 vFP-11로의 면역감작
재조합 파울폭스 바이러스 vFP-11의 면역원성을 평가하기 위하여 예방접종과 도전 실험을 닭과 칠면조에 대해 수행하였다.
생후 2일과 5주된, 특이적인 병원체가 없는 화이트 레그호온 닭을 가금류의 상용 예방접종에 사용하는 이중 바늘로 날개를 망상으로 구멍을 내어 파울폭스 바이러스로 예방접종하였다. 각 조류에 6×105pfu의 vFP-11을 함유한 대략 2μl을 제공하였다. 예방접종 전에 더 오래된 조류를 출혈시켰고, 모든 조류는 도전전에 및 2주 후에 출혈시켰다.
비교를 위하여, 닭의 제2군을 워터-인-오일(water-in-oil) 에멀젼 중의 비활성화 H5N2 균주로 이루어진 종래의 H5 백신으로 예방접종하였다.
비활성화 H5N2 백신은 수정후 11일된 계란에서 성장한 A/물오리/NY/189/92(H5N2) 인플루엔자 바이러스로부터 제조하였다 ; HA 역가가 800/0.1ml이고 감염성 역가가 108.5/0.1ml인 감염된 요막 유동액을 스톤등의 Avain Dis. 22, 666-674(1978)과 브루프등의 Proc. Second Inter. Sym. on Avain Influenza, 283-292(1986)에 기재된 바와 같이 0.1% 프로피오락톤으로 비활성화시켜서 워터-인-오일 에멀젼에 현탁하였다. 0.2ml 부피의 백신을 생후 2일과 5주된 SPF 화이트 레그호온 닭에 피하경로에 의하여 대퇴근육의 측면상의 피부밑에 투여하였다.
닭의 제3 및 제4군에는 각각 어버이 바이러스 FP-1을 투여하거나 또는 백신을 투여하지 않았다.
닭에 대략 103LD50의 매우 병원성이 큰 A/칠면조/아일랜드/1378/83(H5N8) 또는 A/닭/펜/1370/83(H5N2) 인플루엔자 바이러스로 각 닭의 비강에 0.1ml을 투여함으로써 도전시켰다. 2일된 닭에게는 예방접종 6주 후에 도전하였고 5주된 닭에게는 예방접종 5주 후에 도전하였다. 닭을 얼굴과 볏의 팽화 및 청색증과 다리의 출혈(그러한 닭은 자주 서있을 수 없었다)로 표시되는 질병신호, 마비 및 죽음에 대하여 매일 관찰하였다. 대부분의 사망은 감염후 4 내지 7일 사이에 일어났다. 기관과 총배출강의 면봉채취물을 감염 3일 후 살아있는 각각의 닭에서 취하여 수정란으로의 접종에 의하여 바이러스에 대하여 스크린하였다. 야생형 또는 재조합 파울폭스 바이러스의 어느 하나로 접종된 닭은 날개상에 전형적인 병변을 나타냈다. 각 바늘로 찌른 부위에 제3일째에 형성된 농포는 가피형성과 함께 세포 침윤되었고 7일째에 회복되었다. 형성된 2차 병변은 없었고 예방접종하지 않은 접촉 닭에까지 확산된 증거는 없었다. 도전 실험의 결과를 표 Ⅷ에 나타내고 관련된 혈청학적 발견을 표 Ⅸ에 나타낸다.
[표 Ⅷ]
파울폭스에서 발현된 H5에 의해 중재된 닭의 보호
Figure kpo00026
* 예방접종하지 않은 조류 네 마리를 우리에 넣고 파울폭스-H5의 확산에 대해 시험하기 위하여 10마리 조류의 파울폭스-H5 군으로 사육하였다.
[표 Ⅸ]
vFP-11 또는 비활성화 인플루엔자 바이러스 백신으로의 접종에 의해 유도된 혈청학적 반응
Figure kpo00027
(a) 5주된 조류를 예방접종 전에 출혈시켜서 HI 및 중화시험으로 시험하였다. 검출할만한 항체 수준을 함유한 것은 없었으며 그 결과는 제시하지 않는다. 2일된 닭을 예방접종후 6주째에 (후-1) 및 5주된 조류를 예방접종후 5주째에 (후-1) 출혈시켰다 ; 2가지 군을 도전 2주후에 (후-2) 출혈시켰다. 숫자는 표 I에 기재된 닭의 동일군으로부터의 평균 항체 역가이다.
(b) 괄호안의 숫자는 도전에 살아남은 것들이다.
<=10 이하
(c) 혈구응집 저해(HI)시험을 팔머등에 의한 Immun. Series No. 6, 51-52, U.S. Dept. Health, Education and Welfare(1975) 기재와 같이 수용체-파괴-효소-처리혈청, Ty/Ire 바이러스 4HA 유니트, 및 0.5% 닭 적혈구를 사용하여 마이크로타이터 플레이트에서 행하였다. 감염성의 중화 측정을 희석된 혈청과 함께 103EID50의 Ty/Ire 바이러스를 30분 동안 실온에서 배양하고, 이어서 수정란에 그 알리큇을 접종함으로써 행하였다. 바이러스 성장을 2일동안 33℃에서의 난 배양후 혈구응집 측정뼈에 의해 측정하였다.
파울폭스-H5 재조합체(vFP-11) 또는 보조제중의 비활성화 H5N2 인플루엔자 백신으로 접종된 닭은 상동 Ty/Ire(H5N8) 인플루엔자 바이러스와 관련은 있지만 구별가능한 Ck/펜(H5N2) 인플루엔자 바이러스로의 도전으로부터 보호되었다. 대조적으로 어버이 FPV로 접종되었거나 백신처리되지 않은 조류의 대부분은 얼굴과 볏의 팽화 및 청색증, 다리의 출혈 및 마비를 포함하여 매우 병원성이 높은 인플루엔자의 임상상의 표식을 나타냈다. 예방접종된 조류는 Ty/Ire는 검출 가능한 수준을 나타내지 않았지만 Ck/펜은 나타냈다.
비활성화 및 재조합체 백신 두가지는 모두 Ty/Ire에 대한 HI 및 중화 항체를 유도하였지만 파울폭스-H5 재조합체, vFP-11에 의해 유도된 항체의 수준은 도전에 앞서 HA를 저해하지 못했거나 또는 이종 Ck/펜 H5를 중화하지 못하였다. 그럼에도 불구하고, 닭은 Ty/Ire 및 Ck/펜 인플루엔자 바이러스 두가지로의 도전으로부터 보호되었다.
vFP-11 예방접종에 의해 유도된 H5 인플루엔자에 대한 면역성은 적어도 4-6주동안 지속되었고 교차반응적이었다. 반응의 기간과 특이성을 추가로 조사하기 위하여 4주된 닭의 군을 앞서 기재한 바와 같이 vFP-11로 날개에 접종하고 월 간격으로 교차반응성 Ck/펜 바이러스로 도전시켰다. 마찬가지로 도전에 앞서 검출가능한 HI 항체는 없었다. 그럼에도 불구하고, 닭들은 4달 이상 보호되었다.
vFP-11에 의해 발현된 H5는 또한 칠면조에서 보호 면역반응을 유도한다. 3일과 4주된 아웃브레드 화이트 칠면조를 앞서와 같이 날개에 접종하였다. 그 결과를 표 X에 나타낸다.
[표 X]
vFP-11에서 발현된 H5-HA에 의해 중재된 칠면조의 보호
Figure kpo00028
상동 Ty/Ire 바이러스로의 도전에 대해 상당수가 살아남았음을 두가지 군에서 관찰하였다. 예방접종하지 않은 접촉 대조표준을 예방접종한 조류와 함께 우리에 넣고 재조합체 바이러스의 확산에 대하여 시험하였다. 이들 조류는 도전에 살아남지 못하였다.
[실시예 11]
닭 인플루엔자 핵단백질(NP) 유전자를 발현하는 파울폭스 바이러스 FP-1 재조합체 vFP12의 제조
플라스미드 pNP33은 인플루엔자 바이러스 닭/펜실바니아/1/83 핵단백질 유전자(NP)의 cDNA 클론을 함유한다. 대략 1.6Kbp NP 유전자는 단지 5' 및 3' 끝만이 서열분석되어 있다. NP를 pNP33으로부터 제거하여 블런트 끝의 5' Cla I-Xho I 3 단편으로서, 3' 끝에 pUC 9 Eco R I 부위와 함께 Sma I 소화된 pUC 9에 넣어 pRW 714를 만들었다. NP의 번역개시 코돈(ATG)은 다음의 밑줄친 AhaⅡ 부위를 함유한다 : AT
Figure kpo00029
앞서 기재한 백시니아 H6 촉진유전자를 이중 스트란드의 합성 올리고뉴클레오티드로 NP에 연결하였다. 합성 올리고뉴클레오티드는 Eco R V 부위에서 그의 ATG 까지의 H6 서열을 함유하였고 Aha Ⅱ 부위에서 NP 코딩 서열에 넣었다. pRW 755를 생성하기 위하여 pUC 9에 삽입하기에 적당한 Bam H I 와 Eco R I 끝이 있는 올리고뉴클레오티드를 합성하였다. Bam H I 적합한 부위에서 출발하여 밑줄친 ATG가 있는 이중 스트란드의 합성 올리고뉴클레오티드의 서열은 :
Figure kpo00030
pRW 755의 Aha Ⅱ 선형 부분소화 생성물을 단리하여 Eco R I 으로 재절단하였다. ATG에서 절단하고 Eco R I 으로 재절단된 단일한 Aha Ⅱ 함유 pRW 755 단편을 단리하고 포스파타제로 처리하여 아래의 pRW 714 소화 생성물에 대한 벡터로서 사용하였다.
pRW 714의 단리된 Aha Ⅱ 선형 부분소화 생성물을 Eco R I 으로 재절단하였다. NP 코딩 서열을 함유하는 대략 1.6Kbp의 Aha Ⅱ-Eco R I 단리 단편을 상기 pRW 755 벡터에 삽입하여 pRW 757을 만들었다. 완전한 H6 프로모터를 Eco R V 부위의 위쪽(5')에 서열을 첨가함으로써 형성하였다. 플라스미드 pRW 742B(실시예 4 기재)는 pUC 9의 Nde I 부위를 지나는 서열과 함께 제거된 Eco R V 부위 아래쪽(3') H6 서열을 가지고 잇다. 포스파타제로 처리된, pRW 742B Eco R V-Nde I 단편을 아래의 pRW 757 단편에 대한 벡터로서 사용하였다. pRW 757의 단리된 선형 부분 Eco R V 소화 생성물을 Nde I 소화후에 재단리하였다 ; 이 단편은 Eco R V 부위로부터 NP를 지나 pUC 9 Nde I 부위까지의 H6 촉진유전자를 함유한다. pRW 757 단편을 pRW 742B 벡터에 삽입하여 pRW 758을 형성하였다. 완전한 H6 촉진 NP를 함유하는, pRW 758로부터의 Eco R I 단편을 DNA 중합효소 I의 클레노우 단편으로 블런트 끝으로 만들고 pRW 731.13 Hinc Ⅱ 부위에 삽입하여 pRW 760을 만들었다. pRW 731.13 Hinc Ⅱ 부위는 실시예6에서 vFP-6과 vFP-7의 제조에 사용된 FP-1 유전자좌이다.
보호 바이러스로서 파울폭스 FP-1을 사용하여 플라스미드 pRW 760을 시험관내 재조합 시험에 사용하였다. 자손 플라크를 측정하고 정제된 플라크를 제자리 혼성체 형성에 사용하였다. 유전자의 발현을 염소다중클론성 항-NP 항혈청을 사용하여 면역 침전연구로 확인하였다.
vFP-12 감염 CEF 세포의 융해물로부터 특이적으로 침전된 단백질의 크기는 대략 55KD이었고, 그것은 인플루엔자 바이러스 핵단백질의 공인된 크기 범위 내이다.
[실시예 12]
조류 인플루엔자 핵단백질(NP)과 혈구응집소(HA) 유전자를 발현하는 파울폭스 바이러스 이중 재조합체 vFP-15의 제조
A/Tyr/Ire/1378/83으로부터의 혈구응집소(HA) 유전자는 앞서 vFP-11의 제조(실시예 9)에서 기재한 바있다. 이중 재조합체의 제조시 먼저 HA 유전자를 vFP-8의 제조에서 앞서 규정된 유전자좌 f8에 플라tm미드 pRW 731.15를 사용하여 옮겼다.
vFP-11의 제조에 사용한 플라스미드는 pRW 759였다. 이 플라스미드로부터 H6 촉진유전자에 연결된 혈구응집소 유전자를 Pst I 부분소화에 의하여 제거하였다. 그런 다음 이 단편을 DNA 중합효소 I의 클레노우 단편으로 블런트 끝으로 만들어 pRW 731.15의 블런트 끝의 Bam H I 부위에 삽입하여 pRW 771을 만들었다.
그런 다음 플라스미드 pRW 771을 보호 바이러스로서 vFP-12를 사용하는 시험관내 재조합 시험에 사용하였다. vFP-12 재조합 바이러스는 플라스미드 pRW 731.13에서 규정된 유전자좌 f7에서 촉진유전자에 연결된 핵단백질 유전자를 함유한다. 두가지 삽입을 함유하는 재조합체 플라크를 선택하여 플라크를 제자리 혼성체 형성에 의해 정제하고 혈구응집소의 표면발현을 단백질-A-베타-갈락토시다제 결합 면역 측정법에 의하여 확인하였다. 두가지 유전자의 발현을 이중 재조합 바이러스인 vFP-15로 감염된 세포 융해물로부터의 면역 침전에 의하여 확인하였다.
[실시예 13]
재조합 카나리아폭스 바이러스의 제조
다음의 실시예는 카나리아폭스 바이러스에 삽입된 네가지 비필수 유전자좌의 확인과 네가지 재조합 카나리아폭스 바이러스 vCP-16, vCP-17, vCP-19 및 vCP-20의 제조를 보여준다.
재조합 카나리아폭스 vCP-16을 다음과 같이 제조하였다.
3.4Kbp의 Pvu Ⅱ 카나리아폭스 DNA 단편을 pUC 9에 클론하여 pRW 764.2를 제조하였다. 유일한 Eco R I 부위가 700bp의 짧은 아암과 2.7Kbp의 긴 아암이 있는 단편내에 비대칭적으로 위치하고 있음을 발견하였다. 플라스미드들 Eco R I 으로 소화하고 DNA 중합효소 I 의 클레노우 단편을 사용하여 블런트 끝으로 만들었다. 그런 다음 블런트 끝의 H6/라비에스 G 유전자를 이 부위에 연결하여 대장균을 형질전환하는데 사용하였다. 그 결과 형성된 플라스미드 pRW 775를 시험관내 재조합 시험에 사용하였다. 면역 스크린상에 양성인 자손 플라크를 선택하여 플라크를 정제하였다. 그 결과의 재조합체를 vCP-16으로 표시하고 삽입 유전자좌를 C3으로서 표시하였다.
상기 제조에 사용한 플라스미드 pRW 764.2는 또한 Eco R I 부위로부터 대략 2.4Kbp 떨어져 있는 유일한 Bgl Ⅱ 부위를 함유하였다. 동일한 클로닝 스트래티지를 사용하여 H6/광견병 G 유전자를 플라스미드 pRW 764.2에 이 부위에서 연결하여 pRW 774를 제조하였다. 이 플라스미드를 C4로 표시한 삽입 유전자좌를 포함하는 재조합체 vCP-117의 제조에 사용하였다.
플라스미드 pRW 764.5는 단편내에 한쪽 말단으로부터 400bp 떨어져 비대칭으로 있는 유일한 Bgl Ⅱ 부위가 있는 카나리아폭스 DNA의 850bp Pvu Ⅱ 단편을 함유한다. 앞서 기재한 동일한 클로닝 스트래티지를 사용하여 H6 촉진유전자에 연결된 광견병 G 유전자를 이 부위에서 삽입하여 pRW 777을 제조하였다. 제조된 안정한 재조합 바이러스를 vCP-19로 표시하고 삽입 유전자좌를 C5로 표시하였다.
플라스미드 pRW 764.7은 한쪽 말단으로부터 300 염기 떨어져 있는 유일한 Bgl Ⅱ 부위가 있는 1.2Kbp Pvu Ⅱ 단편을 함유한다. 플라스미드를 Bgl-Ⅱ로 소화하고 DNA 중합효소 I의 클레노우 단편으로 블런트 끝으로 하였다. 블런트 끝의 11K 촉진 Lac Z 유전자를 삽입하여 플라스미드 pRW 778을 제조하였다. 이 플라스미드를 사용하여 제조된 안정한 재조합 바이러스를 vCP-20으로 표시하고 삽입 유전자좌를 C6으로 표시하였다.
[실시예 14]
뉴캐슬 질병 바이러스의 융합 단백질을 발현하는 파울폭스 바이러스 재조합체 vFP-20의 제조
NDV 텍사스 균주의 융합 유전자의 cDNA 클론인 플라스미드 pNDV 108은 pBR 322의 Sca I 부위에 클론된 추가의 NDV 코딩 서열 뿐만 아니라 융합 단백질 코딩 서열을 함유하는 대략 3.3Kbp의 Hpa I cDNA 단편을 포함하였다. 삽입 플라스미드의 제조단계를 아래에 기재한다.
(1) 플라스미드 pCE11의 제조
FPV 삽입 벡터 pCE 11을 pRW 731.13(유전자좌 f7로 표시함)의 Hinc Ⅱ 부위에 폴리링커를 삽입함으로써 제조하였다. pRW 731.13은 FP-1 DNA의 5.5Kbp Pvu Ⅱ 단편을 함유한다. 비필수 유전자좌는 실시예 6에서 이미 기재한 안정한 재조합체 vFP-6의 제조에 의하여 Hinc Ⅱ 부위에서 이미 규정되었다. Hinc Ⅱ 부위에 삽입된 폴리링커는 다음의 제한 효소 부위를 함유한다 : Nru I, Eco R I, Sac I, Kpn I, Sma I, Bam H I, Xba I, Hinc Ⅱ, Sal I, Acc I, Pst I, Sph I, Hind Ⅲ 및 Hpa I.
(2) 플라스미드 pCE 19의 제조
이 플라스미드는 pCE 11을 추가로 변형시킨 것으로 백시니아 바이러스 전사 중지신호 ATTTTTNT(L. Yuen과 B. Moss, J. Virology 60, 320-323[1986])(이 경우 N은 A이다)는 pCE 11의 Sac I 와 Eco R I 부위 사이에 삽입되어 있어서 Eco R I 부위가 손실되어 있다.
(3) NDV 코딩 서열의 삽입
융합 단백질 유전자의 5' 끝으로부터의 22 뉴클레오티드를 제외한 전부를 함유한 1.8Kbp의 겔-정제 Bam H I 단편을 pUC 18의 Bam H I 부위에 삽입하여 pCE 13을 형성하였다. 이 플라스미드를 벡터에서 코딩 서열의 5' 끝에서 12 염기 위쪽을 절단하는 Sal I 으로 소화시켰다. 그 끝을 DNA 중합효소 I의 클레노우 단편으로 채우고 플라스미드를 Sal I 부위의 18 염기 위쪽을 절단하는 Hind Ⅲ로 소화하였다. 각 말단에 폴리링커 서열 뿐만 아니라 바람직한 구체예에서 앞서 기재한 백시니아 바이러스 H6 촉진유전자를 함유하는 겔-정제 146bp의 Sma I-Hind Ⅲ 단편을 벡터에 연결하고 대장균 세포에 형질전환시켰다. 그 결과의 플라스미드를 pCE 16으로 표시하였다.
NDV 융합 단백질 유전자의 개시 ATG 코돈과 H6 촉진유전자의 3' 끝을 배열하고 pCE 16의 NDV 5' 끝으로부터 빠진 22 뉴클레오티드를 대치시키기 위하여 Eco R V 와 Kpn I 부위에서 끝나는 상보 합성 올리고뉴클레오티드를 고안하였다. 올리고뉴클레오티드 서열은 5' ATC-CGT-TAA-GTT-TGT-ATC-GTA-ATG-GGC-TCC-AGA-TCT-TCT-ACC-AGG-ATC-CCG-GTA-C3'이었다.
그런 다음 구조 pCE 16을 Eco R V 와 Kpn I 으로 소화하였다. Eco R V 부위는 개시 ATG의 24염기 위쪽에 있는 H6 촉진유전자에 있다. Kpn I 부위는 ATG의 29염기 아래쪽에 있는 NDV 코딩 서열에 있다.
올리고뉴클레오티드를 아닐링하고 인산화하여 선형 플라스미드에 연결하여 그 결과 형성된 DNA를 대장균 세포를 형질전환하기 위하여 사용하였다. 이 플라스미드를 pCE 18로 표시하였다.
NDV 코딩 서열을 FPV 삽입 벡터에 삽입하기 위하여 pCE 18의 겔정제 1.9Kbp Sma I-HindⅢ 단편(폴리링커 영역에서 절단함)을 상기 기재한 pCE 19의 7.8Kbp Sma I-Hind Ⅲ 단편에 연결하였다. 전사 중지신호는 Sma I 부위의 16 염기 아래쪽에 있다. 그 결과의 플라스미드를 pCE 20으로 표시하였다.
보호 바이러스로서 파울폭스 바이러스 FP-1을 사용하여 시험관내 재조합 시험에 플라스미드 pCE 20을 사용하였다. 그 결과의 자손을 CEF 단일층 위에 놓고 다중클론성 항-NDV 닭 혈청을 사용하여 베타-갈락토시다제 연결 단백질-A 면역스크린을 플라크에 수행하였다. 양성으로 염색된 플라크를 선택하여 플라크의 정제를 4회 실시하여 동종 집단을 얻었다. 재조합체를 vFP-29로 표시하였다.
[실시예 15]
고양이 백혈병 바이러스(FeLV) 엔벨로프(ENV) 당단백질을 발현하는 아비폭스 바이러스 재조합체의 제조
FeLV env 유전자는 p70+p15E 다단백질을 코드화하는 서열을 함유한다. 이 유전자를 먼저 백시니아 H6 촉진유전자가 FeLV env 유전자의 5'와 나란히 놓여 있는 플라스미드 pSD467vC에 삽입하였다. 백시니아 혈구응집소(HA) 유전자를 함유하고 있는 1802bp의 Sal I/Hind Ⅲ 단편을 pUC 18 벡터에 먼저 삽입함으로써 플라스미드 pSD467vC를 유도하였다. HA 유전자의 위치는 앞서 규정되었다(Shida, Virology 150, 451-462[1988]). HA 유전자 생성물을 코드화하는 오픈 리딩 프레임의 대부분을 결실하였고(뉴클레오티드 443에서 뉴클레오티드 1311까지) Bgl Ⅱ, Sma I, Pst I, 및 Eag I 제한 엔도뉴클레아제 유전자 함유 다중 클로닝 부위를 삽입하였다. 그 결과의 pSD467vC 플라스미드는 다중 클로닝 부위의 442bp 위쪽과 이들 제한 부위의 491bp 아래쪽에 있는 백시니아 플랭킹 아암을 함유한다. 이들 플랭킹 아암은 다중 클로닝 영역에 삽입된 유전물질이 백시니아 바이러스의 코펜하겐 균주의 HA 영역에 재조합되는 것을 가능하게 한다. 그 결과의 재조합체 자손은 HA 음성이다.
바람직한 구체예에서 상기 기재한 완전한 서열을 함께 포함한 4개의 중첩 올리고뉴클레오티드를 아닐링함으로써 H6 촉진유전자를 합성하였다. 그 결과의 132bp 단편은 5' 끝에 Bgl Ⅱ 제한 부위와 3' 끝에 Sma I 부위를 함유하였다. 이것을 Bgl Ⅱ와 Sma I 제한 부위를 경유하여 pSD467vC에 삽입하였다. 그 결과 형성된 플라스미드를 pPT 15로 표시하였다. FeLV env 유전자를 H6 촉진유전자 바로 아래에 있는 pPT15의 유일한 Pst I 부위에 삽입하였다. 그 결과의 플라스미드를 pFeLV1A로 표시하였다.
FP-1 재조합체의 제조를 위하여 Bgl Ⅱ로의 소화 및 Pst I 으로의 부분소화에 의하여 2.4Kbp의 H6/FeLV env 서열을 pFeLV1A로부터 절출하였다. Bgl Ⅱ 부위는 H6 촉진유전자 서열의 5' 경계에 있다. Pst I 부위는 엔벨로프 당단백질 오픈 리딩 프레임에 대한 번역 종결 신호의 420bp 아래쪽에 위치한다.
2.4Kbp H6/FeLV env 서열을 Bam H I 과 Pst I 으로 소화된 pCE 11에 삽입하였다. FP-1 삽입 벡터 pCE 11을 다중 클로닝 부위를 비필수 Hinc Ⅱ 부위에 삽입함으로써 pRW 731.13으로부터 유도하였다. 이 삽입 벡터는 FP-1 게놈의 유전자좌 f7에서 외래 유전자를 은닉하는 FP-1 재조합체 생성을 허용한다. 재조합 FP-1/FeLV 삽입 플라스미드를 그런 다음 pFeLVFI로 표시하였다. 이 구조는 ATG 치환에 대한 완전한 ATG를 제공하지는 않는다.
완전한 ATG : ATG 제조를 이루기 위하여 대략 1.4Kbp의 Nru I/Sst Ⅱ 단편을 백시니아 바이러스 삽입 벡터, pFeLV1C로부터 유도하였다. Nru I 부위는 ATG로부터 24bp 위쪽에 위치한 H6 촉진유전자 내에 있다. Sst Ⅱ 부위는 ATG로부터 1.4Kbp 아래쪽에 및 번역 종결 신호로부터 1Kbp 위쪽에 위치한다. 이 Nru I/Sst Ⅱ 단편을 Sst Ⅱ 소화 및 Nru I 부분소화로 생성된 9.9Kbp 단편에 연결하였다. 이 9.9Kbp 단편은 5.5Kbp의 FP-1 플랭킹 아암, pUC 벡터 서열, env 유전자의 아래쪽 부분에 해당하는 1.4Kbp의 FeLV 서열, 및 H6 촉진유전자의 5'쪽 서열(대략 100bp)을 함유한다. 그 결과의 플라스미드를 pFeFLVF2로 표시하였다. ATG 제조를 위한 ATG를 뉴클레오티드 서열 분석에 의하여 확인하였다.
추가의 FP-1 삽입 벡터, pFeLVF3을 잠정적인 면역억제 영역에 해당하는 FeLV env 서열(Cianciolo et al., Science 230, 453-455[1985])(코딩 서열의 뉴클레오티드 1548에서 1628까지)을 제거함으로써 pFeLVF2로부터 유도하였다. 이것은 백시니아 바이러스 삽입 벡터 pFeLV1D로부터 대략 1Kbp의 Sst Ⅱ/Pst I 단편(상기 부위)를 단리함으로써 이루어졌다. 플라스미드 pFeLV1D는 면역억제 영역에 해당하는 env 서열(뉴클레오티드 1548에서 1628)이 올리고뉴클레오티드-특정 돌연변이 생성(Mandecki, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 7177-7181[1987])에 의하여 결실된 것 외에는 pFeLV1C와 유사하다. 뉴클레오티드 1548에서 1628이 없는 1Kbp의 Sst Ⅱ/Pst I 단편을 pFeLVF2로부터 유도된 나머지 H6 : FeLV env 유전자를 함유하고 있는 10.4Kbp의 Sst Ⅱ/Pst I 단편에 삽입하였다.
삽입 플라스미드, pFeLVF2와 pFeLVF3을 보호 바이러스로서 FP-1과 함께 시험관내 재조합 시험에 사용하였다. 재조합의 자손을 CEF 단일층위에 놓고 CEF 단일층 상에서의 플라크 혼성체 형성에 의하여 재조합체 바이러스를 선택하였다. 혼성체 형성 분석에 의하여 확인된 재조합체 자손을 선택하여 플라크 정제를 4회 수행하여 동종성 집단을 만들었다. 완전한 FeLV env 유전자를 은닉하고 있는 FP-1 재조합체를 vFP-25로 표시하였고 면역억제 영역이 부족한 완전한 유전자를 함유하고 있는 FP-1 재조합체를 vFP-32로 표시하였다. 두가지 재조합체는 모두 소 항-FeLV 다중 클론성 혈청(Antibodies, Inc., Davis, CA)을 사용한 면역 침전법에 의하여 적합한 유전자 생성물을 발현하는 것으로 나타났다. 구체적으로, 이들 FP-1 재조합체는 고양이과 기원의 CRFK 셀라인(ATCC #CCL94)에서 외래 FeLV env 유전자를 발현한다.
카나리아폭스(CP) 재조합체의 제조를 위하여 H6 : FeLV env 서열 함유 2.2Kbp 단편을 Sma I 와 Hpa I 소화에 의하여 pFeLVF2로부터 절출하였다. Sma I 부위는 H6 촉진유전자 서열의 5' 경계에 있다. Hpa I 부위는 엔벨로프 당단백질 오픈 리딩 프레임에 대한 번역 종결 신호로부터 180bp 아래에 있다.
2.2Kbp H6/FeLV env 서열을 Eco R I 부위를 블런트 끝으로 만들어 놓은 삽입 벡터 pRW 764.2의 비필수 Eco R I 부위에 삽입하였다. 이 삽입 벡터는 CP 게놈의 유전자좌 C4에서 외래 유전자를 은닉하는 CP 재조합체의 생성을 허용한다. 재조합체 CP 삽입 플라스미드를 pFeLVCP2로 표시하였다. 이 구조는 ATG 치환에 대한 완전한 ATG를 제공한다.
삽입 플라스미드 pFeLVCP2를 보호 바이러스로서 CP를 사용하는 시험관내 재조합 시험에 사용하였다. 재조합체의 자손을 CEF 단일층상에 놓고 소 항-FeLV 상업용 다중 클론성 혈청(Antibodies, Inc., Davis, CA.)을 사용한 베타갈락토시다제 결합 단백질-A 면역스크린에 의하여 재조합체 바이러스를 선택하였다. 양성 염색 플라크를 선택하여 플라크 정제를 4회 수행함으로써 동종성 집단을 얻었다. 완전한 FeLV env 유전자를 발현하는 재조합체 vCP-36으로 표시하였다.
[실시예 16]
로우스 관련 바이러스 타입 1(RAV-1) 엔벨로프(ENV) 유전자를 발현하는 파울폭스 바이러스 재조합체 vFP-22의 제조
RAV-1 엔벨로프 유전자의 클론 penvRVIPT는 M13mp18에 Kpn I-Sac I 단편으로서 클론된 1.1Kbp의 RAV-1 env DNA 코딩 서열을 함유한다. 이 단편은 5' 끝이 무상이지만 3' 서열의 일부가 없다. 이것을 다음의 조작에 사용하였다. penvRVIPT로부터 겔정제된 1.1Kbp의 Eco R I-Pst I 단편을 pUC 9의 Eco R I과 Pst I 부위에 삽입하여 pRW 756을 형성하였다. 그런 다음 이 플라스미드를 벡터에서 ATG의 위쪽 59 염기를 절단하는 Kpn I 과 Hind Ⅲ로 소화시켰다. 앞서 기재한 백시니아 H6 촉진유전자를 함유하는 146 염기쌍 Kpn I-Hind Ⅲ 단편을 삽입하여 플라스미드 pCE6을 제조하였다.
RAV env 유전자의 개시 ATG가 외부 서열이 결실되어 있는 H6 촉진유전자의 3' 끝에 인접하여 있는지를 확실히 하기 위하여 말단에 Eco R V 와 Ban Ⅱ 부위가 있는 두개의 상보 합성 올리고뉴클레오티드를 제조하였다. 올리고뉴클레오티드 서열을 5' ATC-CGT-TAA-GTT-TGT-ATC-GTA-ATG-AGG-CGA-GCC-3'이었다.
플라스미드 pCE6을 ATG의 24 염기 위쪽의 H6 촉진유전자에서 절단하고 Eco R V 와 ATG의 7 염기 아래쪽의 RAV env 코딩 서열에서 절단하는 Ban Ⅱ 로 소화시켰다. DNA 절편을 연결하여 대장균 세포의 형질전환에 사용하였다. 그 결과의 플라스미드 pCE7은 최종 구조에 대한 H6 촉진유전자와 정확한 5'서열을 제공하였다.
클론 mp19env(190)이 제한 지도에 의하여 완전한 RAV-1 env 유전자를 함유하는 것으로 밝혀졌다. 완전한 유전자를 함유하는 mp19env(190)의 1.9Kbp의 Kpn I-Sac I 단편을 pUC 18의 Kpn I 과 Sac I 부위에 삽입하여 pCE 3을 형성하였다. 이 플라스미드를 RAV-1 코딩 서열에서 개시 ATG로부터 132 염기 아래쪽을 절단하는 Hpa I 과 유전자의 3' 말단에서 절단하는 Sac I 으로 소화시켰다.
앞서 기재한 FPV 삽입 벡터 pCE 11을 폴리링커 영역에서 플라스미드를 절단하는 Sma I 와 Sac I 으로 소화시켰다. pCE 3의 Hpa I-Sac I 단편을 pCE 11로 연결시켜 pCE 14를 형성하였다.
그런 다음 플라스미드 pCE 7을 Xho I 과 Hind Ⅲ로 소화하여 H6 촉진유전자와 정확한 5' 서열을 함유한 332 염기쌍 단편을 얻었다. 플라스미드 pCE 14를 벡터의 폴리링커 영역에서 절단하는 Hind Ⅲ와 코딩 서열에서 절단하는 Xho I 으로 소화시켰다. 이 DNA를 pCE 7로부터 얻어진 Hind Ⅲ-Xho I 단편과 연결하여 최종 RAV-1 엔벨로프 유전자 구조인 pCE 15를 형성하였다.
이 플라스미드를 보호 바이러스로서 파울폭스 FP-1과 함께 시험관내 재조합 시험에 사용하였다. 재조합의 자손을 CEF 단일층 상에 놓고 항-RAV-1 다중 클론성 항체를 사용하여 베타-갈락토시다제 결합 단백질 A 면역측정법에 의하여 플라크를 스크린하였다. 양성으로 염색된 플라크를 선택하여 플라크 정제를 4회 수행함으로써 동종성 집단을 얻었다. 제조된 재조합체를 vFP-22로 표시하였다. vFP-22 감염 CEF 융해물을 사용한 면역 침전 실험으로 외관상 분자량 76.5Kd와 30Kd의 두가지 단백질이 엔벨로프 유전자의 2가지 유전자 생성물에 해당하는 것을 증명하였다. 전구체 유전자 생성물은 나타나지 않았다.
예비 실험에서 vFP-22로 접종된 닭에서 RAV-1 엔벨로프 유전자 생성물에 대한 면역 반응이 유도되었다.
[실시예 17]
소의 백혈병 바이러스(BLV)의 gp51, 30 엔벨로프(ENV) 유전자를 발현하는 아비폭스 바이러스 재조합체의 제조
(1) pBLVF1과 pBLVF2의 제조
플라스미드 pBLVF1과 pBLVF2는 BLV의 gp51, 30 env 유전자를 함유한다. 두가지 플라스미드에서 BLV env 유전자는 백시니아 바이러스 H6 촉진유전자의 전사 제어하에 있고 파울폭스 플랭킹 아암(유전자좌 f7)사이에 클론된다. 두 플라스미드의 뉴클레오티드 서열은 268과 269의 코돈 위치를 제외하고는 동일하다(pBLVF1은 이들 두 위치에서 아미노산 Arg-Ser를 함유하는 단백질을 코드화하고 pBLVF2는 아미노산 Gln-Thr을 함유하는 단백질을 코드화한다).
pBLVF1과 pBLVF2를 다음 과정에 의하여 제조하였다. 완전한 BLV env 유전자 함유 플라스미드인 플라스미드 pNS97-1을 Bam H I 으로 절단하고 Mst Ⅱ로 부분 절단하였다. 완전한 gp51, 30 유전자를 함유하는 2.3Kbp 단편을 아가로스 겔상에서 단리하고 대장균 DNA 중합효소 I (클레노우 단편)로 스티키 끝을 채웠다.
그런 다음 Pst I 링커를 Pst I 소화 후에 pTP 15(실시예 15)의 Pst I 부위에 연결되어 있는 단편의 끝에 연결하였다. 이것은 BLV 유전자를 백시니아 H6 촉진유전자 다음에 놓는다. pTP 15는 백시니아 게놈의 비필수 유전자좌에서 클론된 백시니아 H6 촉진유전자를 함유한다.
그런 다음 이 플라스미드를 Eco R V 로 절단하고 Ava Ⅱ로 부분 절단하였다. 5.2Kbp 단편을 단리하고 올리고뉴클레오티드 5'-ATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGCCCAAAGAACGACG-3'과 5'-GACCGTCGTTCTTTGGGCATTACGATACAAACTTAACGGAT-3'을 플라스미드의 재고리화에 사용하였다. 이것은 BLA 유전자와 H6 촉진유전자 사이의 비필수 염기를 제거한다.
그 결과의 플라스미드를 Pst I 으로 절단하고 Bgl Ⅱ로 부분절단하여 H6 촉진된 BLV 유전자를 함유한 1.7Kbp 단편을 앞서 기재한 파울폭스 바이러스 삽입 벡터인 pCE 11의 Bam H I-Pst I 부위에 유전자좌 f7을 사용하여 클론하였다. 이것은 파울폭스 플랭킹 아암 사이에 H6 촉진된 BLV 유전자를 놓는다. 이 플라스미드를 pBLVF1으로 표시하였다.
추가의 시험관내 돌연변이생성 단계를 H6 촉진된-BLV 유전자의 pCE 11로의 클로닝 전에 수행한 것을 제외하고는 동일한 과정을 pBLVF2의 제조에 사용하였다. 이 돌연변이 생성을 다음 과정에 의하여 수행하였다. 플라스미드 pNS 97-1을 Xma I 으로 절단하고 Stu I 으로 부분절단하였다. 5.2Kbp 단편을 분리하고 올리고뉴클레오티드 5'-CCGGGTCAGACAAACTCCCGTCGCAGCCCTGACCTTAGG-3'과 5'-CCTAAGGTCAGGGCTGCGACGGGAGTTTGTCTGAC-3'을 플라스미드를 재고리화하기 위해 사용하였다. 이것은 코돈 268과 269의 뉴클레오티드 서열을 CGC-AGT에서 CAA-ACT로 바꾼다.
(2) 재조합 바이러스의 제조
플라스미드 pBLVF1과 pBLVF2를 보호 바이러스로서 FP-1을 사용하여 시험관내 재조합 시험에 사용하였다. 재조합체 자손을 제자리 플라크 혼성체 형성에 의해 선택하고 집단이 이 범주 플라크에 의해 순수한 것으로 판명이 된 경우 BLVgp 특이적 단일 클론성 항체 제제를 이용하여 베타-갈락토시다제-단백질 A 면역측정법에 의해 스크린하였다. pBLVF1과 pBLVF2로부터 각각 제조된 두가지 재조합체 vFP23과 vFP24는 면역스크린에서 양성으로 염색되었고 이것은 면역학적으로 인지가능한 당단백질이 감염된 세포 표면상에서 발현되었음을 의미한다.
플라스미드, pBLVK4와 pBLVK6은 각각 BLV env gp51, 30 유전자와 BLV gp51, 30 절단 마이너스 유전자를 함유한다. 두가지 유전자는 pRW 764.2(유전자좌 C3)의 유일한 Eco R I 부위에 클론되어 있고(pRW 764.2는 실시예 13에 기재) 백시니아 H6 촉진유전자의 전사 제어하에 있다.
플라스미드를 다음의 과정에 의해 유도하였다 : pBLVF1과 pBLVF2를 제한 효소 Hind Ⅲ로 절단하였다. 올리고뉴클레오티드 BKL1(AGCTTGAATTCA)을 이 부위에 클론함으로써 BLV 유전자의 3'에 Eco R I 부위를 만들었다. BLV 유전자의 5'에도 또한 Eco R I 부위가 있으므로, 이들 플라스미드(pBLVK1과 pBLVK2)를 Eco R I 으로 절단하고 H6 촉진된 BLV 유전자 함유 단편을 pRW 764.2의 Eco R I 부위에 클론하였다. 그 결과의 플라스미드를 각각 pBLVK4와 pBLVK6으로 표시하였다. 이들 플라스미드를 보호 바이러스로서 카나리아폭스를 사용하여 시험관내 재조합 시험에 사용하였다. 재조합체를 선택하고 면역측정법으로 검출한 바와 같이 당단백질의 표면 발현을 토대로 정제하였다. 플라스미드 pBLVK4와 pBLVK6으로부터의 재조합체를 각각 vCP 27과 vCP 28로 표시하였다.
파울폭스 재조합체 vFP 23과 vFP 24를 각종 경로에 의하여 양과 소에 접종하였다. 첫번째 접종후 45일째에 동물을 2번째로 접종하였다. 혈청 샘플을 첫번째 접종 5주 후와 두번째 접종 2주 후에 취하였다. gp51에 대한 항체를 경합 ELISA 시험으로 측정하고 역가를 50%의 경합 감소를 나타내는 혈청 희석의 역수로서 표시하였다. 그 결과를 표 XI에 나타낸다.
시험한 어느 종도 일차 접종 후 검출가능한 면역 반응을 나타내지 못했다. 양과 소 두가지 모두 2차 접종후 상당한 항체 상승을 나타냈다.
[표 XI]
양과 소의 vFP 23과 vFP 24로의 접종
Figure kpo00031
a 피부내 주사를 2곳에 하였다.
b 역가를 50% 경합을 제공하는 희석의 역수로서 표시하였다.
[실시예 18]
감염성 기관지염 바이러스 매스 41 매트릭스 유전자를 발현하는 파울폭스 바이러스 FP-1 재조합체 vFP-26의 제조
플라스미드 pIBVM 63은 매스 41 균주 매트릭스 유전자의 감염성 기관지염 바이러스(IBV) cDNA 클론을 함유한다. pIBVM 63의 8Kbp Eco R I 단편은 매트릭스 유전자와 위쪽의 페플로머 유전자 및 더 위쪽의 Eco R V 부위를 함유한다. 플라스미드 pRW 715는 pUC 9의 2개의 Pvu Ⅱ 부위를 결합시키는 Eco R I 링커를 갖는다. pIBVM 63으로부터의 8Kbp Eco R I 단편을 pRW 715의 Eco R I 부위에 삽입하여 pRW 763을 생성하였다. 구조 pRW 776은 완전한 IBV 페플로머 및 매트릭스 유전자와 이어서 단일한 Eco R I 부위를 갖는다.
대략 0.9Kbp 매트릭스 유전자의 단지 5'과 3' 끝만이 서열분석되어 있다. 번역 개시 코돈(ATG)에서 출발하여 매트릭스 유전자의 5' 서열은 다음의 밑줄친 Rsa I 부위를 함유한다 :
Figure kpo00032
앞서 기재한 H6 촉진유전자를 합성 올리고뉴클레오티드로 매트릭스 유전자에 결합시켰다. 합성 올리고뉴클레오티드는 그의 Eco R V 부위에서 ATG 까지의 H6 서열을 함유하였고 첫번째 Rsa I 부위를 통하여 매트릭스 코딩 서열에 넣었다.
pRW 772 생성을 위해 pUC 9에 삽입하기에 접합한 Bam H I 과 Eco R I 끝이 있는 올리고뉴클레오티드를 합성하였다. Eco R I 끝은 Rsa I 부위의 3'이다. Bam H I 부합 끝에서 출발하여 밑줄친 ATG가 있는 이중 스트란드의 합성 올리고뉴클레오티드의 서열은 :
Figure kpo00033
pRW 772의 Rsa I 선형 부분소화 생성물을 단리하고 Eco R I 으로 재절단하였다. 상기 Rsa I 부위에서 1회 절단하고 Eco R I 으로 재절단한 것을 포함하는 pRW 772 단편을 단리하고 포스파타제로 처리하여 아래의 pRW 776 소화 생성물에 대한 벡터로서 사용하였다.
단리한 pRW 776의 Rsa I 선형 부분소화 생성물을 Eco R I 으로 재절단하였다. Eco R I 은 매트릭스 유전자의 3' 끝 바로 옆에 있다. 상기 Rsa I 부위로부터 매트릭스 코딩 서열을 함유하고 있는 대략 0.8Kbp의 Rsa I-Eco R I 단리 단편을 상기 pRW 772 벡터에 삽입하여 pRW 783을 만들었다. 완전한 H6 촉진유전자를 Eco R V 부위의 5' 서열을 첨가함으로써 형성하였다.
H6 촉진유전자 5' 끝은 pUC 9 Sal I 에 블런트 끝으로 들어 있는 Hin f I 부위에서 Eco R I 부위를 만든다; H6 촉진유전자의 5'는 pUC 9 Hind Ⅲ 부위이다. 5' H6 촉진유전자 함유 Hind Ⅲ-Eco R V 단편을 pRW 783 Hind Ⅲ와 Eco R V 부위 사이에 삽입하여 pRW 786을 제조하였다. 완전한 H6 촉진 매트릭스 유전자를 함유하는 pRW 786 Eco R I 단편을 DNA 중합효소 I 의 클레노우 단편으로 처리하고 pRW 731.15(유전자좌 f8)의 블런트 끝의 Bam H I 부위에 삽입하여 pRW 789를 제조하였다. pRW 731.15 Bam H I 부위는 vFP-8의 제조에 대하여 실시예6에서 사용한 FP-1 유전자좌이다.
플라스미드 pRW 789를 vFP-26의 제조에 사용하였다. 재조합체 플라크를 선택하여 제자리 플라크 혼성체 형성 반응을 진행하였다.
예비실험에서 vFP-26으로 접종된 닭에서 IBV 매트릭스 단백질에 대한 면역 반응이 유도되었다.
[실시예 19]
감염성 기관지염(IBV) 페플로머를 발현하는 파울폭스 바이러스 FP-1 재조합체 vFP-131의 제조
감염성 기관지염 바이러스(IBV) 매스 41 cDNA 클론 pIBVM 63과 그의 하위 클론 pRW 776에 대해서는 실시예 18에서 vFP-26 제조에 대하여 기재하였었다. 하위 클론 pRW 776은 41Kbp의 IBV 페플로머 유전자와 3' 끝에 유일한 Eco R I 부위를 가지고 있는 매트릭스 유전자를 함유한다. 대략 4Kbp의 IBV 페플로머의 단지 5'과 3' 끝만이 서열 분석되어 있다. 유일한 Xba I 부위로 2개의 유전자로 분리된다. 페플로머 유전자의 5' 끝은 번역 개시 코돈(ATG)에서 출발하여 다음의 밑줄친 Rsa I 부위를 함유한다 :
Figure kpo00034
Figure kpo00035
. 앞서 기재한 H6 촉진유전자를 합성 올리고뉴클레오티드로 페플로머 유전자에 결합시켰다. 합성 올리고뉴클레오티드는 그의 Nru I 부위부터 ATG까지의 H6 촉진유전자 서열을 함유하고 그의 처음 Rsa I 부위를 통하여 페플로머 코딩 서열에까지 연결된다. pRW 768을 생성하기 위해 pUC 9에 삽입하기에 적합한 Bam H I 과 Eco R I 끝을 가지는 올리고뉴클레오티드를 합성하였다. Eco R I 끝은 Rsa I 부위의 3'이다. Bam H I 부합끝에서 출발하여 밑줄친 ATG가 있는 이중 스트란드의 합성 올리고뉴클레오티드의 서열은 :
Figure kpo00036
pRW 768에서 단리된 선형부분 Rsa I 소화 생성물을 Eco R I 으로 재절단하였다. 상기 Rsa I 부위에서 1회 절단되고 Eco R I 으로 재절단된 것을 함유하는 pRW 768 단편을 단리하고 포스파타제로 처리하여 아래의 pRW 776 소화 생성물에 대한 벡터로서 사용하였다.
pRW 776 단리 선형부분 Rsa I 소화 생성물을 Eco R I 으로 재절단하였다. 상기 Rsa I 부위에서 Eco R I 부위까지 1회 절단한 것을 포함하는 5Kbp pRW 776 단편을 단리하였다 ; 단편은 상기 페플로머 Rsa I 부위에서 Eco R I 부위까지의 IBV 서열을 매트릭스 유전자의 3' 끝에 함유한다. 상기 pRW 768 벡터에 pRW 776 단편을 삽입함으로써 pRW 788을 제조하였다. 매트릭스 유전자를 상기 주지된 Xba I 부위에서 제거하였다. 5' H6 촉진유전자를 4Kbp의 pRW 788 Nru I-Xba I 블런트 끝처리 단편을 pRW 760 Nru I-Bam H I 블런트 끝처리 백터에 삽입함으로써 Nru I 부위에서 첨가하여 pRW 790을 제조하였다. 벡터 pRW 760은 실시예 11에 기재하였다 ; 간단히 말하면, 그것은 비필수 FP-1 유전자좌 f7에 의해 플랭크된 백시니아 H6 촉진된 인플루엔자 핵단백질이다. 3' H6 서열을 Nru I 부위로부터 Bam H I 에서의 핵단백질의 끝을 통해 제거함으로써 pRW 760 벡터를 만들었다. pRW 790은 pRW 731.13 Hinc Ⅱ 부위에서 H6 촉진된 IBV 페플로머이다. 도너 플라스미드인 pRW 790과 FP-1과의 재조합 결과 vFP-31이 형성되었다. vFP-31 감염 세포로부터 제조된 CEF 융해물을 사용한 면역 침전 실험으로 분자량이 대략 180Kd인 전구 단백질과 90Kd의 절단 생성물과의 적은 양의 특이적 침전이 일어남이 증명되었다.
[실시예 20]
단순 포진 바이러스 gD를 발현하는 파울폭스 바이러스 FP-1 재조합체 vFP-30의 제조
순 포진 바이러스(HSV) 타입 1균주 KOS 당단백질 D 유전자(gD)를 5' Bam H I 연결 Hpa Ⅱ로서 pUC 9 Bam H I 부위에 클론하여 3' Bam H I 연결된 Nru I 단편을 얻었다 ; 5' 끝은 pUC 9 Pst I 부위 옆이다. 번역 개시 코돈(ATG)에서 출발하는 HSV gD의 5' 서열은 다음의 밑줄친 Nco I 부위를 함유한다 :
Figure kpo00037
앞서 기재한 백시니아 H6 촉진유전자를 합성 올리고뉴클레오티드로 HSV gD 유전자에 결합시켰다. 합성 올리고뉴클레오티드는 Nco I 부위를 통해 gD 코딩 서열로 향하는 Nru I 부터 ATG까지의 H6 촉진유전자의 3' 부분을 함유한다. 5' Pst I 부합 끝을 가지는 올리고뉴클레오티드를 합성하였다. pUC 9 중의 gD 클론을 Pst I 과 Nco I 으로 절단하여 5' HSV 서열을 제거하고 합성 올리고뉴클레오티드로 대치하여 pRW 787을 제조하였다. 이중 스트란드 합성 올리고뉴클레오티드의 서열은 다음과 같다.
Figure kpo00038
pRW 787을 Nru I 과 Bam H I 으로 소화하면 Nru I 부위부터 HSV gD 코딩 서열을 통하여 Bam H I 부위까지의 3' H6 촉진유전자를 함유하는 대략 1.Kbp의 단편이 생성된다. Nru I 과 Bam H I 으로 절단한 pRW 760은 실시예 11에서 기재하였었다. pRW 760 벡터에 1.3Kbp 단편을 삽입하여 pRW 791을 제조하였다. pRW 791 벡터는 pRW 731.13(유전자좌 f7)의 비필수 FP-1 Hinc Ⅱ 부위에 완전한 백시니아 H6 촉진 HSV gD 유전자를 함유한다.
도너 플라스미드 pRW 791의 FP-1으로의 재조합으로 vFP-30을 제조하였다. 당단백질의 표면 발현을 단백질-A-베타-갈락토시다제 결합 면역측정법과 HSV-1 특이적 혈청을 사용하여 재조합체 플라크에서 검출하였다.
[실시예 21]
폭스 바이러스 벡터에서의 외래 유전자의 발현의 조절을 위한 엔토모폭스 촉진유전자의 이용
(a) 배경
곤충의 폭스 바이러스(엑토모폭스)는 각각 곤충목(order), 딱정벌레목, 나비목, 및 메뚜기목으로부터 단리된 엔토모폭스 바이러스에 해당하는 세가지 속(genus)(A, B, 및 C)으로 다시 하위 분할되는 아과(subfamily) 엔토모폭스 바이러스로 분류된다. 엔토모폭스 바이러스는 자연계에 좁은 숙주 범위를 가지고 있으며, 어떠한 척추동물종에서도 복제하는 것으로 알려져 있지 않다.
이들 연구에 사용한 엔토모폭스 바이러스는 원래 인도의 감염 암사크타 무레이(Amsacta moorei)(나비목 : arctildae) 유충으로부터 단리하였다(Roberts and Granandos, J. Invertebr. Pathol.
Figure kpo00039
141-143[1968]). AmEPV로 표시한 바이러스는 속 B에 대한 타입종이다.
야생형 AmEPV를 감염된 에스티그멘 아크레아(
Figure kpo00040
) 유충으로부터 감염성 혈임파로서 알. 그라나도스 박사(Boyce Thompson Institute, Cornell University)로부터 얻었다. 바이러스는 리만트리아 디스파(
Figure kpo00041
)(매미 나방)의 난소 조직으로부터 유도된 무척추 셀라인 IPLB-LD652Y에서 복제하는 것으로 알려졌다(Goodwin et al., In Vitro
Figure kpo00042
485-494[1978]). 세포를 4% 우태아 혈청 및 4% 닭 혈청이 첨가된 IPL-528 배지에서 28℃에서 성장시켰다.
야생형 바이러스를 LD652Y 세포상에서 플라스 측정하여 V1으로 표시한 한 플라크를 다음의 실험을 위해 선택하였다. 이 단리물은 감염주기 후기의 감염 세포의 원형질에서 수많은 교합체(OBs)를 형성한다.
(b) 촉진유전자 확인
AmEPV 촉진유전자의 확인 및 지도화를 다음과 같이 수행하였다. 후기 감염 LD652Y 세포(감염 48시간 후)로부터 총 RNA를 단리하여 32P-표지 제1스트란드 cDNA를 만들기 위해 사용하였다. 그런 다음 cDNA를 AmEPV 게놈의 제한 소화물을 함유하는 블롯을 프로브하기 위해 사용하였다. 이 서던블롯으로 2.6kb Cla I 단편에서 강력한 신호를 검출하였으며, 이것은 단편이 강력하게 발현된 유전자를 크드화하였음을 의미한다. 단편을 플라스미드 벡터에 클론하고 그의 DNA 서열을 측정하였다.
서열 데이터의 분석으로 오픈 리딩 프레임이 42kd 폴리펩티드를 코드화할 수 있는 것을 알았다. 감염 48시간 후의 총 RNA의 시험관내 번역과 SDS-PAGE에 의한 생성물의 분리로 폴리펩티드가 대략 42kd인 것을 알았다.
(c)엔토모폭스 촉진유전자의 제어하에 외래 유전자를 발현하는 재조합 백시니아 바이러스의 제조
엔토모폭스 촉진유전자가 척추동물 폭스 바이러스 시스템에서 기능할 수 있는지를 측정하기 위하여 다음의 플라스미드를 제조하였다. 5' 끝에 Bal Ⅱ 부위에 의해 플랭크된 42K 유전자 번역 출발신호의 5' 107 염기(이하 AmEPV 42K 촉진유전자로 언급함)와 3' 끝에 Eco R I 부위에서 종결되는 간염 B형 바이러스 pre-S2 코딩영역의 처음 14염기를 함유한 올리고뉴클레오티드를 화학적으로 합성하였다. AmEPV 42K 촉진유전자 서열을 아래에 기재한다.
Figure kpo00043
Figure kpo00044
AmEPV 42K 촉진유전자를 다음과 같이 간염 B형 바이러스 표면 항원(HBVsAg)에 연결하였다. 혈구응집소(HA)분자(HA 아암은 실시예 15에 기재하였고 ; HA 영역은 시다에 의해 Virology
Figure kpo00045
451-462[1986])에 기재되어 있다.)를 코드화하는 백시니아 바이러스 게놈의 비필수 영역에 백시니아 바이러스 아암에 의해 플랭크된 간염 B형 바이러스 표면 항원과 pre-S2 코딩 영역(갈리버트등에 의해 Nature
Figure kpo00046
646-650[1979])에 기재된 타입 ayw)을 함유하는 pUC 플라스미드를 제조하였다. 상기 기재한 올리고뉴클레오티드를 HBVsAg 코딩영역의 유일한 Eco R I 부위와 HA 백시니아 아암중의 유일한 Bgl Ⅱ 부위를 사용하여 이 플라스미드에 삽입하였다. 그 결과 형성된 재조합 백시니아 바이러스를 vP 547로 표시하였다.
엔토모폭스 42K 촉진유전자의 제어하의 삽입된 HBVsAg 코딩 서열의 발현을 면역측정법을 사용하여 확인하였다. 포유류 셀라인 BSC-40의 동등한 배양액을 원래의 백시니아 바이러스 또는 재조합 vP 547로 감염시켰다. 감염후 24시간이 지난 세포를 융해하고 그 융해물을 연속희석하여 니트로셀룰로스 막에 적용하였다. 막을 먼저 염소 항-HBV 혈청과 배양하고 다음에125I-단백질 A와 배양하였다. 세척후, 막을 X-선 필름에 노출시켰다. vP 547 감염 배양액에서는 양성신호를 검출하였지만 원래의 바이러스로 감염된 배양액에서는 나타나지 않았으며, 이것은 포유류 세포에서 백시니아 바이러스에 의한 AmEPV 42K 촉진유전자의 인지를 의미한다.
상기 결과를 감염된 포유류 세포에서 HBVsAg을 검출하기 위한 오스리아 측정법(상세한 것에 대해서는 실시예 1 참조)으로 증명하였다.
AmEPV 42K 또는 백시니아 바이러스 H6 촉진유전자에 커플된 HBVsAg 유전자를 함유하는 백시니아 바이러스 재조합체를 BSC-40 세포를 감염하는데 사용하였고 sAg의 발현 수준을 오스리아 시험으로 측정하였다. 표 XII에 나타난 바와 같이, 데이터는 42K 촉진유전자를 이용한 HBVsAg의 발현수준이 컸음을 나타낸다.
[표 XII]
재조합 백시니아 바이러스에서 HBVsAg의 발현
Figure kpo00047
척추동물 폭스 바이러스 바탕에서 AmEPV 42K 촉진유전자의 조절의 잠재성을 확실히 하기 위하여 추가의 실험을 수행하였다. BSC-40 세포의 동등한 배양액을 DNA 복제의 저해제, 따라서 후기 바이러스 전사를 차단하는 시토신 아라비노스의 40㎍/ml의 존재 또는 부재하에 vP547로 감염시켰다. 감염 24시간 후의 발현의 수준을 오스리아 시험으로 측정하였다. 그 결과는 42K 촉진유전자가 백시니아 바이러스 복제 시스템에서 초기 촉진유전자로서 인지되었음을 나타낸다.
포유류 시스템에서 외래 유전자의 발현에 대하여 AmEPV 42K 촉진유전자의 이용은 무척추 시스템에서의 유전자 발현에 대한 오토그라파 캘리포르니카(
Figure kpo00048
) NPV 폴리헤드린 촉진유전자의 이용과는 분명히 구별되는 것을 주의해야 한다(Luckow and Summers, Biotechnology 6, 47-55[1988]). 폴리헤드린 촉진유전자는 포유류 세포의 전사 장치에 의해 인지되지 않는다(Tjla
Figure kpo00049
Virology,
Figure kpo00050
107-117[1983]). 포유류 세포에서 AmEPV 42K 촉진유전자의 사용은 비-무척추 세포에서 비-곤충 바이러스 벡터의 외래 유전자의 발현에 대해 곤충 바이러스 촉진유전자가 먼저 활용되었음을 나타낸다.
아비폭스 바이러스가 또한 42K 엔토모폭스 촉진유전자를 인지하는가를 측정하기 위하여 다음의 실험을 수행하였다. CEF 세포의 동일한 배양액을 세포당 10pfu의 두가지 파울폭스 바이러스 카나리아폭스 바이러스 또는 백시니아 바이러스의 어느 하나로 접종하고 동시에 25㎍의 다음의 플라스미드 1) 42K 촉진유전자에 연결된 HBV pre-S2+sAg 코딩 서열을 함유하는 플라스미드 42K,17 또는 2) 앞서 기재한 백시니아 바이러스 H6 촉진유전자에 연결된 동일한 HBVsAg 코딩 서열을 함유하는 플라스미드 pMP15.spsP 중의 하나로 형질전환시켰다. 배양액을 동결시킨 후, 세포를 융해시키고 오스리아 시험을 이용하여 HBVsAg의 존재에 대하여 융해물을 분석하였다(실시예 1 참조).
표 XⅢ에 나타난 결과는 정상적인 의미에서 고찰되어야 한다. 그것들은 두가지 파울폭스와 카나리아폭스의 전사 장치가 42K 촉진유전자를 인지할 수 있고 연결된 HBVsAg 코딩 서열의 전사를 허용한다는 것을 의미한다. 발현수준이 백시니아 바이러스 H6 촉진유전자로 얻어진 것들보다 낮지만 그 수준은 음성대조표준으로 얻어진 바탕값 수준보다 훨씬 위이다.
[표 XⅢ]
아비폭스 바이러스에 의한 42K 엔토모폭스 촉진유전자의 인지
Figure kpo00051
[실시예 22]
살아있는 광견병 바이러스로의 도전에 대하여 마우스를 보호하기 위한 VCP-16으로의 면역감작
생후 4 내지 6주된 마우스 20마리씩의 각 군을 두가지 재조합체 : (a) 실시예 6에 기재한 파울폭스-광견병 재조합체인 vFP-6 및 (b) 실시예 13에 기재한 카나리아폭스-광견병 재조합체인 vCP-16의 어느 하나의 희석 범위의 50 내지 100μl로 다리에 접종하였다.
14일째에, 각 군으로부터 10마리를 희생시켜 혈청을 수집하였다. 혈청중의 항-광견병 역가를 앞서 실시예 7에 기재한 RFFI 시험을 사용하여 계산하였다. 각 군의 나머지 10마리에는 실시예 7에서 사용한 광견병 바이러스의 CVS 균주로 뇌내 접종에 의하여 도전시켰다. 각 마우스에 16마우스 LD50에 해당하는 30μl을 접종하였다. 28일째에 살아남은 마우스의 수를 세고 보호용량(PD50)을 계산하였다. 그 결과를 표 XⅣ에 나타낸다.
vFP-6의 접종에 의해 발견된 마우스의 보호 수준은 실시예 7에서 논의한 파울폭스 재조합체 vFP-3의 접종에 의해 발견된 결과를 확증한다. vCP-16의 접종에 의해 제공된 보호 수준은 상당히 더 높다. 계산된 PD50을 토대로 할 때 카나리아폭스-광견병 재조합체가 파울폭스-광견병 재조합체보다 광견병 도전에 대한 보호에 있어서 100배 더 효과적이다.
[표 XⅣ]
2가지 아비폭스-광견병 재조합체에 의해 유도된 광견병 바이러스 도전에 대한 보호 면역성
Figure kpo00052
a 바이러스 역가는 log10TCID50으로 표시하였다.
b RFFI 역가는 RFFI 시험에서 형광 웰의 수에 있어 50% 감소보다 더 큰 감소를 나타내는 가장 높은 혈청 희석의 log10으로 표시하였다.
[실시예 23]
외래 유전자를 발현하기 위한 파울폭스 촉진유전자 성분의 이용
I. 25.8킬로달톤(KD) 유전자 생성물을 코드화하는 파울폭스 유전자의 확인
SDS-폴리아크릴아미드 겔의 쿠마찌 형광 블루염색에 의한 파울폭스(FP-1) 감염 CEF 융해물에 존재하는 단백질 종의 육안화는 외관상 분자량이 25.8KD인 많은 종이 있음을 나타냈다. 이 단백질은 비감염 세포융해물에는 없었다. 감염후 특정 시간에35S-메티오닌을 사용하여 방사성표지 합성 단백질에 대해 행한 펄스-실험은 다시 한변 FP-1 유도 단백질의 풍부함을 입증하였고 그것이 감염후 6시간 내지 54시간 내에 합성되는 것을 보여주었다. 그의 피크 레벨에서 이 FP-1 25.8KD 단백질은 세포 융해물 중에 존재하는 총 단백질의 대략 5% 내지 10%에 해당한다.
FP-1 유도 25.8KD 단백질의 풍부성은 이 유전자 생성물을 코드화하는 유전자가 강력한 FP-1 촉진유전자 성분에 의해 조절되는 것을 시사해 주었다. 폭스 바이러스 재조합체에서의 외래 유전자의 발현에 계속 사용하기 위한 이 촉진유전자 성분을 정위하기 위하여 FP-1 감염 CEF 세포로부터 감염후 54시간째에 폴리좀 제제를 얻었다. RNA를 이 폴리좀 제제로부터 단리하였고 토끼의 망상 적혈구 시험관내 번역 시스템을 만들기 위해 사용했을 때 우선적으로 25.8KD FP-1 단백질을 생성하였다.
폴리좀 RNA를 또한 프라이머로서 올리고(dT) 12-18을 사용하는 제1스트란드 cDNA 합성에 대한 주형으로서 사용하였다. 제1스트란드 cDNA를 FP-1 게놈 소화물로 서던 블롯 분석할 때에 혼성체 형성 프로브로서 사용하였다. 이들 혼성체 형성 분석으로부터의 결과는 25.8KD 단백질을 코드화하는 유전자가 10.5Kbp Hind Ⅲ 단편에 포함되었음을 암시하였다. 이 게놈성 Hind Ⅲ 단편을 계속해서 단리하고 상업용 벡터 pBS(Stratagene, La Jolla, CA.)에 연결하여, 그 클론을 pFP23k-1로 표시하였다. pFP23k-1의 프로브 소화물에 대한 제1스트란드 cDNA를 사용한 추가의 혼성체 형성 분석으로 25.8KD 유전자가 3.2Kbp의 Eco R V 하위-단편에 위치하고 있음을 알아냈다. 그 단편을 pBS에 하위 클론하고 pFP23k-2로 표시하였다.
대략 2.4Kbp의 이 FP-1 Eco R V 단편을 상거 디데옥시 사슬 종결법(Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
Figure kpo00053
5463-5467[1977])에 의해 서열분석하였다. 서열분석은 분자량 25.8KD의 유전자 생성물을 코드화하는 오픈 리딩 프레임(ORF)을 드러낸다. pBS 벡터에서 박테리오파지 T7 중합효소(Stratagene, La Jolla, CA)에 의한 이 ORF의 시험관내 런-오프 전사는 토끼 망상적혈구 시험관내 번역 시스템(Promega Biotec, Madison, WI)을 만들기 위해 사용한 경우 외관상 분자량이 25.8KD인 폴리펩티드 종을 산출하는 RNA종을 만든다. 이 폴리펩티드는 SDS-폴리아크릴아미드 겔상에서 FP-1 감염 CEF로부터 융해물에서 관찰된 풍부한 25.8KD 단백질과 함께 이동한다. 이들 결과는 이것에 풍부한 FP-1-유도 25.8KD 유전자 생성물을 코드화하는 유전자임을 시사한다.
Ⅱ. FP-1과 백시니아 재조합체에서 고양이 백혈병 바이러스(FeLV) env 유전자를 발현하기 위한 FP-1 25.8KD 유전자의 위쪽 촉진 유전자 성분의 이용
FP-1 25.8KD 유전자 조절 영역(FP 25.8K 촉진유전자)과 25.8KD 유전자 코딩 서열의 21bp를 함유하는 270bp의 Eco R V/Eco R I 단편을 pFP23k-2로부터 단리하였다. pFeLV 25.8F1과 pFeLV 25.81A를 유도하기 위해 사용한 FP 25.8K 촉진유전자 영역의 뉴클레오티드 서열을 아래에 표시한다. 이 270 뉴클레오티드 서열은 25.8KD 유전자 생성물에 대한 개시 코돈(ATG) 위쪽 영역의 249 뉴클레오티드와 코딩 서열의 처음 21bp를 제공한다.
Figure kpo00054
이 단편을 블런트-끝처리한 후, FeLV env 서열을 함유하고 있는 Sam I 소하-FP-1 삽입 벡터(pFeLVF1 ; 실시예 15 참조)에 삽입하였다. 이 삽입 벡터는 FP-1 게놈의 f7 유전자좌와의 재조합을 가능하게 하였다. FP 25.8K 촉진유전자 위쪽 서열 5'의 FeLV env 유전자에의 및 적절한 방향으로의 삽입을 서열분석으로 확인하였다. 이 삽입은 완전한 ATG에 대한 ATG 치환을 제공하지 못하고 25.8KD 유전자에 의해 제공된 ATG는 FeLV env ATG가 있는 프레임 밖에 있어, 그로써 융합 단백질이 형성되지 않는다. FeLV env 유전자 위쪽의 FP 25.8KD 촉진유전자를 함유하는 FP-1 삽입 플라스미드를 pFeLV 25.8F1으로 표시하였다.
유사한 구조를, FeLV 유전자를 은닉하는 백시니아 바이러스 삽입 벡터 vFeLV1A(실시예 15 참조)를 사용하여 제조하였다. H6 촉진유전자를 pFeLV1A로부터 Bal Ⅱ와 Sma I 으로 pFeLV1A를 소화하여 절출하였다. Bgl Ⅱ 제한 부위를 블런트로 끝처리한 후 이어서 FP 25.8K 촉진유전자를 함유하는 블런트 끝 270bp Eco R V/Eco R I 단편을 FeLV env 유전자의 5'쪽에 나란히 삽입하였다. 이 구조를 서열분석으로 확인하였다. 이 구조에서 완전한 ATG 대 ATG 치환은 일어나지 않으며 25.8KD 유전자로부터의 ATG는 FeLV 유전자로부터의 ATG가 있는 프레임 밖에 있다. FeLV 유전자 5' 쪽에 나란히 있는 위쪽 영역에 25.8KD 유전자를 은닉하고 있는 백시니아(코펜하겐 균주) 삽입 벡터를 pFeLV 25.81A로 표시하였다.
삽입 플라스미드 pFeLV 25.8F1과 pFeLV 25.81A를 보호 바이러스로서 FP-1(pFeLV 25.8F1)과 백시니아 바이러스의 코펜하겐 균주(pFeLV 25.81A)를 사용하는 시험관내 재조합에 사용하였다. 재조합체의 자손을 적합한 세포단일층상에 놓고 베타-갈락토시다제 결합 단백질 A 면역 스크린법과 소 항-FeLV 혈청(Antibodies, Inc., Davis, CA.)에 의하여 재조합체 바이러스를 선택하였다. 예비 결과는 FP 25.8K 촉진유전자가 폭스 바이러스 재조합체에서 외래 유전자의 발현을 조절할 수 있음을 시시한다.
[실시예 24]
가금류에서 vFP-6과 vCP-16의 안정성 및 효력
2가지 아비폭스 재조합체 vFP-6과 vCP-16(실시예 6과 13에 기재)을 18일된 닭의 배, 1일된 닭, 28일된 닭에 각각 접종하고 세가지 범주 1) 부화능, 백신반응 및 사망률에 미치는 예방접종의 효과, 2) 광견병 당단백질에 대해 유도된 면역반응 및 3)파울폭스 항원에 대해 유도된 면역반응에 대해 조류의 반응을 평가하였다. 실험은 다음과 같이 수행한다.
A. 안전성 시험
18일된 배의 20씩의 군을 요낭강에 3.0 또는 4.0log10TCID50의 vFP-6 또는 vCP-16의 어느 하나로 접종하였다. 부화된 후 닭들을 개별적으로 사육했을 때 14일 동안 관찰하고 혈청을 수집하였다. 닭의 배에 접종된 2가지 재조합체는 알의 부화능에 영향을 미치지 않았고 닭은 관찰된 기간인 14일 동안 건강하게 유지되었다.
1일된 닭 SPF 10마리씩의 군을 3.0log10TCID50의 각 재조합체로 근육내 경로에 의하여 접종하였다. 닭을 28일동안 관찰하고 혈청 샘플을 접종후 14 및 28일에 수집하였다. 2가지 재조합체로의 접종 부위에서 백신반응은 나타나지 않았고 닭은 관찰기간 28일동안 건강하게 유지되었다.
28일된 닭 10마리씩의 군을 각 재조합체 바이러스로 3.0log10TCID50을 근육내 경로로 또는 3.0log10TCID50을 피부(날개) 경로로 접종하였다. 닭을 28일동안 관찰하고 혈청 샘플을 접종 후 14 및 28일에 수집하였다. 재조합체의 어느 것으로도 근육내 접종후에 반응은 볼 수 없었다. 피부 접종으로는 병변의 크기가 각기 다른 파울폭스에 대한 매우 작은 백신반응을 유발하였다. 카나리아폭스 접종은 접종 부위에서 정상적인 피부 병변의 생성을 유발하였다. 모든 병변은 실험의 마지막에 퇴행되었다.
B. 면역반응
앞서 실시예 7에서 기재한 RFFI 시험을 광견병 당단백질에 대한 항체 수준을 평가하기 위하여 사용하였다. 각 군에 대하여 23.4IU를 함유하는 표준 혈청에 따라 국제단위(IU)로 전환된 각 혈청의 기하 평균 역가로 그 결과를 표시하였다. 최소 양성 수준을 1 IU에 고정하여 양성 조류의 백분율 측정에 사용하였다. 아비폭스 바이러스에 대한 항체를 항원으로서 파울폭스 바이러스 균주를 사용하여 ELISA 방법으로 시험하였다. 각 혈청 샘플을 1/20 및 1/80으로 희석하였다. 표준 곡선을 양성 및 음성 혈청을 사용하여 구하였다. 최소 양성 수준을 2개의 표준 편차가 첨가된 음성 혈청의 상이한 값의 평균으로 계산하였다.
혈청학적 조사의 결과를 vFP-6에 대해서는 표 XⅤ에 그리고 vCP-16에 대해서는 표 XⅥ에 나타낸다.
제한된 혈청학적 반응을 광견병 및 파울폭스 항원 두가지에 대하여 vFP-6 또는 vCP-16의 어느 하나로 접종된 배에 대하여 관찰하였다. 파울폭스 벡터는 두가지 항원에 대한 혈청학적 반응을 카나리아폭스로 행했을 때보다 더 많은 수의 조류에서 유도하였지만 반응은 여전히 이질적이었다.
제1일에 vFP-6으로 접종된 닭은 접종 28일 후에 광견병 및 파울폭스 항원에 대해 모든 조류가 혈청 양성인 양호한 혈청학적 반응을 보였다. vCP-16 접종에 대한 반응은 훨씬 더 낮아서 28일째에 광견병 당단백질에 대해서 조류의 40%가 혈청 양성이었고 아비폭스 항원에 대해서는 10%가 혈청양이었다.
vFP-6으로 근육내 경로로 접종된 28일된 닭은 두가지 항원에 대하여 접종후 14일에 100% 혈청전환을 나타냈다. 조류의 대다수가 또한 피부접종 후에 혈청전환되었지만, 이루어진 역가는 광견병 및 아비폭스 항원 두가지에 대해 더 낮았다. 앞서와 같이, 근육내 및 피부 경로로 vCP-16으로 접종된 닭은 근육내 접종에 의한 광견병에 대해 최대 70% 혈청전환까지의 가변성 반응을 보였다. 카나리아폭스 접종후 아비폭스 항원에 대한 혈청전환의 낮은 수준은 바이러스간의 혈청학적 관련도를 반영할 것이다.
결과는 vFP-6 및 vCP-16 두가지가 다양한 일수의 닭의 접종에 대하여 안전할 것임을 나타낸다. 파울폭스 벡터 vFP-6은 닭에서의 면역반응을 유도하는데 더 효과적인 것으로 여겨진다. 그러나, 중대하게도, 두가지 재조합 아비폭스 바이러스, 파울폭스 및 카나리아폭스는 난내에서의
Figure kpo00055
면역감작에 유용할 것으로 나타난다.
[표 XⅤ]
상이한 일수의 닭에서의 파울폭스/광견병 당단백질(vFP-6)에 대한 면역학적 반응
Figure kpo00056
[표 XⅥ]
상이한 일수의 닭에서의 카나리아폭스/광견병 당단백질(vCP-16)에 대한 면역학적 반응
Figure kpo00057
[실시예 25]
피그렛트의 vFP-6 접종의 안전성 및 면역원성
세마리씩의 피그렛트의 2군을 재조합체 vFP-6으로 2가지 경로 : a) 3마리에게는 근육내 접종으로 81log10TCID50을 주고 b) 3마리에게는 경구접종에 의해 동일 용량을 주는 경우중 하나에 의해 접종하였다.
모든 동물을 주 간격으로 출혈시켰고 35일째에 동일한 경로에 의해 동일 용량의 추가 접종을 하였다. 임상 신호에 대하여 피그렛트를 매일 관찰하였다. 혈청을 ELISA 시험과 혈청 중화 시험에 의하여 항파울폭스 항체에 대하여 시험하였다. 광견병 항체를 RFFI 시험으로 측정하였다.
모든 피그렛트가 건강이 양호한 상태를 유지하였고 접종후 관찰되는 병변은 없었다. 온도 곡선은 정상이어서 접종 동물과 비접종동물간에 차이가 나타나지 않았다.
근육내 경로와 경구경로에 의해 접종된 피그렛트는 ELISA 및 혈청 중화에 의해 측정된 바 파울폭스 항원에 대한 혈청학적 반응을 나타냈다. 2차 반응이 추가 접종후에 분명하였다(결과는 제시하지 않음). 모든 피그렛트는 또한 RFFI 시험으로 측정된 바 광견병 당단백질에 대한 면역학적 반응을 나타냈고 추가의 효과가 두가지 경로에 의해 분명하다. 이들 결과를 표 XⅦ에 나타낸다.
결과를 파울폭스/광견병 재조합체의 접종이 피그렛트에서는 무해하고 재조합체가 경구 또는 근육내 접종에 의해 광견병 당단백질에 대한 유효한 면역반응을 생성할 수 있음을 가리킨다.
[표 XⅦ]
vFP-6으로 접종된 피그렛트에서 생성된 광견병 당단백질에 대한 항체
Figure kpo00058
a 역가는 RFFI 시험에서 형광 웰의 수를 50% 이상 감소시키는 가장 높은 혈청 희석의 log10으로서 표시하였다.
b 제35일에 동물에게 두번째 접종을 하였다.

Claims (33)

  1. 인간을 제외한 척추동물에서 원하는 유전자 생성물을 발현시키는 방법으로서, 인간을 제외한 척추동물에서 바이러스의 증식적인 복제없이 상기의 유전자 생성물을 코드화하고 발현하는 DNA를 포함하는 재조합 아비폭스 바이러스로 인간을 제외한 척추동물을 접종하는 것으로 이루어지는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 아비폭스 바이러스가 파울폭스 바이러스와 카나리아폭스 바이러스로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 인간을 제외한 척추동물에 피하로, 피부내로, 근육내로, 경구로 또는 난내로 바이러스를 도입함으로써 인간을 제외한 척추동물을 접종하는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 인간을 제외한 척추동물에서 원하는 항원에 대한 면역학적 반응을 유도하는 방법으로서, 인간을 제외한 척추동물에서 바이러스의 증식적 복제없이 상기의 항원을 코드화하고 발현하는 DNA를 포함하는 재조합 아비폭스 바이러스로 인간을 제외한 척추동물을 접종하는 것으로 이루어지는 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 아비폭스 바이러스가 파울폭스 바이러스와 카나리아폭스 바이러스로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제4항에 있어서, 인간을 제외한 척추동물에 피하로, 피부내로, 근육내로, 경구로 또는 난내로 바이러스를 도입함으로써 인간을 제외한 척추동물을 접종하는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 인간을 제외한 척추동물에서 인간을 제외한 척추동물 병원체에 대한 면역학적 반응을 유도하는 방법으로서, 인간을 제외한 척추동물에서 바이러스의 증식적 복제없이 상기 병원체의 항원을 코드화하고 발현하는 DNA를 포함하는 재조합 아비폭스 바이러스로 인간을 제외한 척추동물을 접종하는 것으로 이루어지는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 아비폭스 바이러스가 파울폭스 바이러스와 카나리아폭스 바이러스로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제7항에 있어서, 상기 인간을 제외한 척추동물이 인간을 제외한 포유류이고 상기 척추동물
    병원체가 포유류 병원체인 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 항원이 광견병 G 항원, 소 백혈병 바이러스의 gp51, 30 엔벨로프 항원, 고양이 백혈병 바이러스의 FeLV 엔벨로프 항원 및 단순 포진 바이러스의 당단백질 D 항원으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제9항에 있어서, 인간을 제외한 포유류가 개, 고양이, 마우스, 토끼, 소, 양 및 돼지로 이루
    어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제7항에 있어서, 인간을 제외한 척추동물에 피하로, 피부내로, 근육내로, 경구로 또는 난내로 바이러스를 도입함으로써 인간을 제외한 척추동물을 접종하는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 인간을 제외한 척추동물에서 인간을 제외한 척추동물 병원체에 대한 면역학적 반응의 유도방법으로서, 상기 병원체의 항원을 코드화하고 발현하는 DNA를 포함하는 재조합 아비폭스 바이러스로 인간을 제외한 척추동물을 접종하는 것으로 이루어지는 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 인간을 제외한 척추동물이 인간을 제외한 포유류이고 상기 척추동물 병원체가 포유류 병원체인 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제13항에 있어서, 항원이 광견병 G 항원, 소백혈병 바이러스의 gp51, 30 엔벨로프 항원, 고양이 백혈병 바이러스의 FeLV 엔벨로프 항원 및 단순 포진 바이러스의 당단백질 D 항원으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제13항에 있어서, 상기 인간을 제외한 척추동물이 조류이고 상기 인간을 제외한 척추동물 병원체가 조류 병원체인 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 항원이 조류 인플루엔자 혈구응집소 항원, 뉴캐슬 질병 바이러스의 융합 단백질 항원, 로우스 관련 바이러스의 RAV-1 엔벨로프 항원, 조류 인플루엔자 바이러스의 핵단백질 항원, 감염성 기관지염 바이러스의 매트릭스 항원 및 감염성 기관지염 바이러스의 페플로머 항원으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 아비폭스 바이러스 게놈의 비필수 영역(nonessential region)에 본래의 아비폭스 바이러스에는 존재하지 않는 DNA를 함유하도록 변형시킨 재조합 아비폭스 바이러스.
  19. 제18항에 있어서, 추가로 상기 DNA를 발현하기 위한 비-아비폭스 촉진유전자(promoter)를 함유하는 것을 특징으로 하는 바이러스.
  20. 제19항에 있어서, 비-아비폭스 촉진유전자가 백시니아 촉진유전자인 것을 특징으로 하는 바이러스.
  21. 제20항에 있어서, 상기 백시니아 촉진유전자가 HH, 11K, 및 Pi로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 바이러스.
  22. 제19항에 있어서, 비-아비폭스 촉진유전자가 엔토모폭스 촉진유전자인 것을 특징으로 하는 바이러스.
  23. 제18항에 있어서, 추가로 상기 DNA를 발현하기 위한 아비폭스 촉진유전자를 함유하는 것을 특징으로 하는 바이러스.
  24. 제18항에 있어서, 상기 DNA가 포유류 병원체의 항원을 코드하는 것을 특징으로 하는 바이러스.
  25. 제24항에 있어서, 항원이 광견병 항원, 광견병 G 항원, 소백혈병 바이러스의 gp51, 30 엔벨로프 항원, 고양이 백혈병 바이러스의 FeLV 엔벨로프 항원 및 단순 포진 바이러스의 당단백질 D 항원으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 바이러스.
  26. 제18항에 있어서, 상기 DNA가 조류 병원체의 항원을 코드하는 것을 특징으로 하는 바이러스.
  27. 제26항에 있어서, 상기 항원이 조류 인플루엔자 혈구응집소 항원, 뉴캐슬 질병 바이러스의 융합 단백질 항원, 로우스 관련 바이러스의 RAV-1 엔벨로프 항원, 조류 인플루엔자 바이러스의 핵단백질 항원, 감염성 기관지염 바이러스의 매트릭스 항원 및 감염성 기관지염 바이러스의 페플로머 항원으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 바이러스.
  28. 제18항에 있어서, 상기 아비폭스 바이러스가 파울폭스인 것을 특징으로 하는 바이러스.
  29. 제18항에 있어서, 상기 아비폭스 바이러스가 카나리아폭스인 것을 특징으로 하는 바이러스.
  30. 어떠한 공급원으로부터의 DNA와 상기 DNA를 발현하는 엔토모폭스 촉진유전자를 함유하도록 폭스 바이러스를 변형시켜서 얻어지는 재조합 폭스 바이러스.
  31. 제30항에 있어서, 상기 바이러스가 아비폭스 바이러스인 것을 특징으로 하는 바이러스.
  32. 제30항에 있어서, 상기 바이러스가 백시니아 바이러스인 것을 특징으로 하는 바이러스.
  33. 어떠한 공급원으로부터의 DNA와 상기 DNA를 발현하기 위한 아비폭스 촉진유전자를 함유하도록 백시니아 바이러스를 변형시켜서 얻어지는 재조합 백시니아 바이러스.
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