IT9020063A1 - Vaccino di poxvirus ricombinante di herpesvirus - Google Patents

Description

La presente domanda di brevetto é una continuazione-in-parte della domanda di brevetto Numero di serie 394,488, depositata il 16 agosto 1989, che, a sua volta, é una continuazione-in-parte della domanda di brevetto numero di serie 339,004, depositata il 17 aprile 1989. La presente invenzione riguarda un poxvirus modificato e riguarda metodi per la sua produzione e per il suo impiego. Più in particolare, l'invenzione riguarda un poxvirus ricombinante, detto virus esprimendo prodotti di geni d1 un gene herpesvirus e riguarda vaccini che forniscono immunità protettiva contro infezioni provocate da herpesvirus.In questa domanda di brevetto vengono riportate parecchie pubblicazioni indicate con numeri arabi tra parentesi. Una citazione completa di questi riferimenti bibliografici si trova alla fine della descrizione che precede immediatamente le rivendicazioni. Questi riferimenti descrivono lo stato della tecnica al quale questa invenzione si riferisce. Vaccinia virus e, più recentemente, altri poxvirus sono stati usati per l'inserimento e l'espressione di geni estranei. La tecnica fondamentale per inserire geni estranei in poxvirus infettivi viventi comporta una ricombinazione tra sequenze di DNA di poxvirus che fiancheggiano un elemento genetico estraneo in un plasmide donatore e sequenzé omologhe presenti nel poxvirus di recupero (28). Specificamente, i poxvirus ricombinanti vengono costruiti in due stadi noti nel settore e analoghi ai metodi adottati per creare ricombinanti sintetici dei vaccinia virus descritti nel brevetto U.S. N° 4,603,112, la cui descrizione viene qui inserita come riferimento. Innanzitutto, la sequenza di geni DNA da inserire nel virus, in particolare uno schema di lettura aperto da una sorgente non-pox, viene introdotta in una struttura di plasmide di E.Coli nel quale é stato inserito DNA omologo rispetto ad una sezione di DNA del poxvirus. Separatamente, la sequenza di geni -di DNA da inserire é collegata a un promotore. Il legame del gene-promotore é situato nella struttura del plasmide in modo che il legame del gene-promotore é affiancato su entrambe le estremità · da DNA omologo rispetto a una sequenza di DNA che fiancheggia una regione di pox DNA contenente un sito non essenziale. La struttura del plasmide così ottenuta viene quindi amplificata mediante crescita all'interno di batteri di E.coli (11) e viene isolata (12,20). In secondo luogo, il plasmide isolato contenente la sequenza di geni DNA da inserire viene trasferito in una coltura di cellule, per esempio fibroblasti di embrione di pollo, insieme con il poxvirus. Una ricombinazione tra pox DNA omologo nel plasmide ed il genoma virale, rispettivamente, fornisce un poxvirus modificato dalla presenza di sequenze di DNA estranee in una regione non essenziale del suo genoma. Il termine DNA "estraneo" indica DNA esogeno, in particolare DNA proveniente da una sorgente non-pox, che codifica per geni prodotti non usualmente prodotti dal genoma nel quale il DNA esogeno é introdotto. Una ricombinazione genetica, in generale, é lo scambio di sezioni omologhe di DNA tra due filamenti di DNA. In certi virus, il RNA può sostituire il DNA. Sezioni omologhe di acido nucleico sono sezioni di acido nucleico (DNA oppure RNA) che hanno la medesima sequenza di basi di nucleotidi. Una ricombinazione genetica può avvenire naturalmente durante la replicazione oppure la produzione di nuovi genomi virali all'interno della cellula ospite infettata. Così, una ricombinazione genetica tra geni virali può avvenire durante il ciclo di replicazione virale che avviene in una cellula ospite che viene co-infettata con due o più differenti virus o altre strutture genetiche. Si usa una sezione di DNA ottenuta da un primo genoma in modo intercambiabile nel costruire la sezione del genoma di un secondo virus co-infettante nel quale il DNA é omologo con quello del primo genoma virale.

Tuttavia, può avvenire anche una ricombinazione tra sezioni di DNA in differenti genomi che non sono perfettamente omologhi. Se una tale sezione proviene da un primo genoma omologo con una sezione di un altro genoma tranne che per la presenza all'interno della prima sezione, per esempio, di un marcante genetico o di un gene che codifica per un determinante antlgenico inserito in una porzione del DNA omologo, una ricombinazione può ancora avvenire e i prodotti di detta ricombinazione sono quindi rivelabili per la presenza di quel marcante genetico o gene nel genoma virale ricombinante. Un'espressione efficace della sequenza genetica d1 DNA inserita dal virus infettivo modificato richiede due condizioni. Prima condizione, l'inserimento deve essere * in una regione non essenziale del virus affinché il virus modificato rimanga vivo. La seconda condizione per l'espressione di DNA inserito é la presenza di un promotore nell'opportuna relazione verso il DNA inserito. Il promotore deve venire situato in modo che esso sia collocato a monte rispetto alla sequenza di DNA da esprimere. Esistono due sottotipi di herpesvirus equino che, sebbene contengano epitopi che neutralizzano in modo incrociato, possono venire distinti per mezzo dei loro profili antigenici, per mezzo di impronte digitali di endonucleasi di restrizione e per mezzo della loro patogenicità per i cavalli (1). L‘herpesvirus equino 1 (EHV-1) é associato con malattie dell'apparato respiratorio, disturbi del sistema nervoso centrale e aborti erpetici classici mentre l herpesvirus equino 4 (EHV-4) é associato prevalentemente con malattie dell'apparato respiratorio (1,48). G11 herpesvirus equini sono membri della sottofamiglia degli alfa-herpesvirus e presentano molte delle caratteristiche biologiche e biochimiche tipiche di herpesvirus umani, per esempio isomerizzazione genomica, regolazione della espressione di geni, lo stabilirsi di infezioni latenti, la formazione di particelle virali che interferiscono, con effetto di defezione, lo scatenamento ‘ di disturbi neorologici e la trasformazione oncogenica in vitro (1,4,23). Così, EHV può venire usato vantaggiosamente per studiare le diverse conseguenze biologiche delle infezioni provocate da herpesvirus.

Glicoproteine dell'herpesvirus mediano essenziali funzioni virali per esempio un attacco cellulare e una penetrazione cellulare, la propagazione del virus cellula a cellula e, fatto importante, determinano il profilo di patogenicità dell'infezione. Le glicoproteine di herpesvirus sono componenti critici nell'interazione con il sistema immunitario dell'ospite (36,37). Tra le glicoproteine ben caratterizzate del virus dell'herpes simplex sono comprese gB, gC, gD, gE, gG, gH e gl (36,37,49-55). Numerosi studi hanno indicato l'importanza delle glicoproteine del virus dell'herpes simplex nel provocare risposte immunitarie. Quindi, é stato indicato che gB e gD possono provocare notevoli risposte immunitarie (6,8,13,18,21,22,26,27,30,44,46,47). gC può stimolare linfociti citotossici limitati alla classe I (15-32) mentre gD può stimolare risposte di cellule T citotossiche della classe II (21, 22,44,46,47). Si é messo in evidenza che gG é un bersaglio per un anticorpo complemento-dipendente diretto verso una neutralizzazione di virus (38,39).* Inoltre si é messo in evidenza che numerose glicoproteine ottenute da altri herpesvirus provocano notevoli risposte immunitarie (5,10,36,56). Entrambi

i sottotipi di EHV esprimono sei glicoproteine abbondanti (1,3,43). Le porzioni genomiche delle sequenze d1 DNA che codificano gp2, gp!0,gpl3, gpl4, gpl7/18, e gp21/22a sono state determinate usando vettori di espressione gtll lambda e usando anticorpi monoclonali (3). Si sono collocate glicoproteine gpl3 e gp14 nelle medesime posizioni all'interno del componente L del genoma al quale gli omologhi gC e gB, rispettivamente, di virus di herpes simplex formano una mappa (3). EHV-1 appare unico tra gli alfa--herpesvirus i cui geni di glicoproteine sono stati compresi in una mappa in quanto cinque delle sue sei principali glicoproteine sono codificate da sequenze all'interno del componente L del genoma mentre soltanto una glicoproteina (gpl7/18) é Inserita in una mappa verso la regione υs. Analizzando questi dati, si é previsto che alcune delle glicoproteine di bassa abbondanza identidificate in virioni EHV-1 e anche glicoproteine EHV-1 non ancora Identificate formano mappa verso il componente S del genoma (3). Le glicoproteine di inviluppo sono i principali immunogeni di herpesvirus coinvolti nel provocare risposte immunitarie nell'ospite umorali e cellulari (5,8,73-75) e, cosi, sono del massimo interesse per coloro che si dedicano a sviluppare vaccini. Recentemente, é stata descritta (2) la sequenza d1 nucleotidi del ceppo Kentucky T431 dell'unità di trascrizione EHV-1 che codifica gp13. Uno schema di lettura aperto codifica un prodotto di traslazione primaria di 468 amminoacidi di 51k0a. La proteina ha le proprietà caratteristiche di una proteina che attraversa una membrana con nove siti di glicosilazione N-collegati potenziali (Asn-X-Ser/Thr) presenti nella zona superficiale tra il segnale putativo e le porzioni di ancoraggio di transmembrana della proteina (2). Si é messo in evidenza che la glicoproteina é omologa nei confronti dei virus dell'herpes simplex (HSV) gC-1 e gC-2, nei confronti del virus della pseudorabbia (PRV)glII e nei confronti del virus zoster della varicella (VZV) gpV (2). EHV-1 gp!3 é, così, l'omologo strutturale delle glicoproteine gC-simi1i del virus dell'herpes. Recentemente é stata descritta la sequenza di nucleotidi di EHV-1 gpl4 (71,72). L'analisi della sequenza di amminoacidi precedentemente indicata di glicoproteina gp14 ha messo in evidenza una notevole omologia nei confronti della corrispondente glicoproteina ‘ di HSV, gB. Anticorpi monoclonali diretti contro alcune glicoproteine EHVV-1 si sono rivelati neutralizzanti (76). Esperimenti di immunizzazione passiva hanno messo in evidenza che anticorpi monoclonali diretti contro gpl3 oppure gpl4 (77) oppure contro gp 13, gp14 oppure gp17/18 (78) potrebbero proteggere criceti contro un attacco letale. Anche altri analoghi di glicoproteine gB e gC sono coinvolti nella protezione contro malattie provocate da virus del alfa-herpes (8,10,73). La glicoproteina EHV-1 gpl7-/18 , sebbene caratterizzata come un altro immunogeno protettivo potenziale, fino ad ora non aveva una controparte strutturale nota tra le parecchie glicoproteine codificate dal componente S negli altri virus dell alfa-herpes (66,79,80). Sulla base della sua posizione genomica, si é pensato che gpl7/18 possa essere l'analogo HSV gE (2). Il virus della pseudorabbia (PRV), un virus del alfa-herpes, é l'agente che provoca il morbo di Aujesky. La malattia é molto infettiva e provoca notevoli danni economici nell'industria dell'allevamento dei maiali. La malattia é associata con un'elevata morbilità e con un'elevata mortalità tra i maialini e é caratterizzata da una grave insufficienza respiratoria, aborti, ridotte dimensioni delle cucciolate e velocità di crescita diminuite degli animali sopravvissuti. L'encefalite mortale é una conseguenza frequente di un'infezione. Si possono instaurare infezioni virali,latenti, una caratteristica dei virus herpes che fa sì che un maiale adulto recuperato serva come veicolo cronico del virus. Per una recente rassegna ampia vedi Wittmann e Rziha (81). Il genoma PRV é costituito da un DNA a doppia elica da 90 x 10<6 >dalton (82) separato da sequenze ricorrenti invertite in un unico segmento lungo (UΊ ) oppure un unico segmento corto (U ) (83,84). Il genoma PRV codifica circa 100 poiipeptidi la cui espressione è regolata in un modo del tipo a cascata simile ad altri herpesvirus (85-86). Attualmente, si é messo in evidenza che cinque glicoproteine gpl, gpll, gpIII, gp63 e gp5Q sono associate con l'involucro virale e sono associate con le diverse strutture di membrana di cellule infettate PRV (80,86-91). Una sesta glicoproteina codificata PRV (gX) viene liberata nel mezzo di coltura (92). La posizione fisica di queste glicoproteine sul genoma PRV e la loro sequenza DNA sono attualmente note (62,80,91-98). Come nel caso di glicoproteine di altri herpesvlrus le glicoproteine PRV mediano essenziali funzioni virali per esempio il collegamento cellulare e la penetrazione' nelle cellule oppure la liberazione dalle cellule. Le glicoproteine PRV sono critiche nel profilo di patogenicità della infezione PRV e sono componenti critici nella risoluzione di stati patologici e in stati immunitari. PRV gpl é non essenziale per la replicazione di virus in vitro e in vivo e é assente

dai ceppi PRV più attenuati (99). La natura attenuata di questi ceppi gI-cancel1ati indica anch‘essa

un possibile ruolo del gl nella virulenza (99,100).

Tuttavia, risulta che altre proteine PRV siano coinvolte in questa funzione, poiché l'espressione di gl

da solo non é sufficiente a provocare elevati livelli di virulenza (100). La funzione che gl esplica

nel provocare una risposta immunitaria contro PRV

non é chiara. Anticorpi monoclonali contro gl possono neutralizzare virus in vitro (101) e possono proteggere passivamente topi immunizzati contro un attacco PRV letale (81). Kost et al (98) hanno descritto recentemente l'espressione di PRV gpl in

ricombinanti di vaccinia virus o da soli oppure 1n

associazione con gp50 e con gp63. Una inoculazione

intracranica dei ricombinanti vaccinici nel topo ha

dato come risultato una aumentata virulenza 1n

particolare quando PRV gpl era associato con una

coespressione di gp50 e gp63. Tuttavia, nel maiale, ‘ non vengono prodotti anticorpi neutralizzanti nei

confronti di gl (5). Inoltre, un virus vaccinico ricombinante che esprime pollpeptldi codificati da PRV

gl (98) non protegge 11 topo nei confronti di un attacco di PRV letale (rispetto alla protezione realizzata dal controllo costituito da un virus vaccinico tipo selvatico). Questi dati, considerati nel loro insieme, suggeriscono che PRV gpl é più adatto come campione diagnostico piuttosto che come componente in un vaccino subunitario .

La glicoproteina PRV gp63 é situata adiacente a gp50 nella regione del genoma PRV (80). La sequenza codificante per PRV gp63 inizia con 3 codoni ATG consecutivi circa 20 nucleotidi a valle dal codone di arresto di gp50. Non vi é un motivo di segnale di trascrizione riconoscibile e la traslazione probabilmente avviene dal medesimo trascritto come gp50. PRV gp63 é non-essenziale in vitro (88). PRV gp63, come sequenza di DNA continua con PRV gp50 é stato espresso in vaccinia virus, come indicato da Kost et al (98). Il contributo di PRV gp63 alla protezione nel topo contro un attacco PRV é difficile da stabilire poiché quegli studi non analizzavano 1 contributi di PRV gp50 e di gp63.

La glicoproteina PRV gX é una glicoproteina non-strutturale il cui prodotto finale viene secreto nel fluido extracellulare (85,92). Non si é ottenuta alcuna neutralizzazione in vitro di PRV con sieri policlonali oppure monoclonali nei confronti di PRV gX (102,103) e vaccini gX di sotto-unità non erano protettivi nei confronti di un'infezione (104).

La glicoproteina PRV gp50 é gO-analoga del virus dell'herpes simplex tipo 1 (HSV-1) gD analogo (97). Lo schema di lettura aperto del DNA codifica 402 amminoacidi (95). La forma glicosilata matura (50-60 kDa) contiene un carboidrato 0-legato senza glicosi1azione N-legata (95). Il siero di maiale é molto reattivo con PRV gp50, e ciò mette in evidenza la sua importanza come immunogeno. Anticorpi monoclonali verso gp50 neutralizzano PRV 1n vitro con oppure senza complemento (97,105,106) e proteggono passivamente il topo (102,105,106) ed il maiale (102). Ricombinanti di vaccinia virus che esprimono PRV gp50 hanno provocato la formazione di anticorpi neutralizzanti nel siero e hanno protetto topi e maiali nei confronti di un'infezione PRV letale (98,107,108).11 gene PRV gpIII é situato nella regione U1 del genoma. Lo schema d1 lettura aperto 1437 bp codifica una proteina di 479 amminoacidi. Il prodotto di traslazione primario dedotto da 50,9 kDa ha otto siti di glicosilazione N-legati potenziali (96). PRV glll é l'analogo di gC HSV-1 (96). Non si é osservata alcuna sostituzione funzionale di PRV glll con HSV gc. Sebbene PRV gIII non sia essenziale per la replicazione in vitro (110-111),la

forma glicosilata matura (98 kDa) é un costituente abbondante dell'involucro di PRV. Anticorpi monoclonali anti-gpIII neutralizzano il virus in vitro con oppure senza complemento (86,106,110) e possono proteggere passivamente topi e maiali (102). La glicoproteina PRV gin può proteggere topi e maiali da un'infezione PRV letale dopo immunizzazione con una proteina di fusione Cro/glII espressa in E.Coli (Robbins, A., Watson, L. Enquist, domanda di brevetto europeo N 0162738A1) oppure quando viene epsressa in un ricombinante vaccinico (Panicali, 0., L. Gritz, G. Mazzera, domanda di brevetto europeo 0261940A2).

Uno dei costituenti principali dell'involucro PRV é un complesso legato con un disolfuro di tre glicoproteine (120 kDa, 67 kDa, e 58 kDa) denominate PRV gpll, secondo la nomenclatura d1 Hampl (86). La sequenza DNA che codifica PRV gpII é situata nell'estremità sinistra di . Lo schema di lettura aperto di 2976 nucleotidi codifica un prodotto di traslazione primaria di 913 amminoacidi oppure di 110 kDa. PRV gpll é l'omologo di HSV-1 gB (62). Si é messo in evidenza che anticorpi monoclonali diretti contro PRV gpll neutralizzano il virus in vitro (5) con oppure senza complemento (81). Inoltre, studi di immunizzazione passiva hanno messo in evidenza che anticorpi monoclonali neutralizzanti proteggevano parzialmente i maiali ma non proteggevano i topi da un'infezione virale virulenta (102). Fino ad ora, l'immunizzazione attiva di maiali con glicoproteina PRV gpll non é stata descritta.

Durante gli ultimi 20 anni, l'incidenza di infezioni genitali provocate da virus di herpes simplex tipo 2 (HSV 2) é aumentata notevolmente. Valutazioni recenti indicano che negli stati Uniti, 5-20 milioni di persone hanno herpes genitale (112). Sebbene si sia messo in evidenza che un trattamento orale con acyclovir faccia diminuire la gravità di infezioni primarie (113) e elimini episodi ricorrenti (114), il controllo e il trattamento di queste infezioni sono lungi dall'essere ideali. Pertanto, é necessario avere a disposizione un vaccino per prevenire infezioni primarie e infezioni ri correnti .

Il genoma del virus dell'herpes simplex tipo-1 (HSV-1) codifica almeno 8 glicoproteine distinte anti geni cernente gB, gC, gD, gE, gG, gH, gl e gJ (115). Risulta che omologhi per questi geni sono presenti in HSV2 (116-119). Poiché le glicoproteine sono presenti nell'inviluppo del virione e nella membrana del plasma cellulare infetto, esse possono provocare risposte immunitarie protettive umorali e cellule-mediate (37).

L'importanza relativa di una immunità umorale e cellulare nella protezione contro infezioni provocate da virus dell'herpes simplex non é stata completamente chiarita. Topi immunizzati con HSV1, gB, gC oppure gD purificati sono protetti contro un'infezione HSV1 letale (120). Si sono inoltre protetti topi contro una infenzione HSV1 letale oppure HSV2 letale mediante immunizzazione passiva con anticorpi verso virus di HSV1 totali (121) oppure virus di HSV2 totali (122) e con anticorpi nei confronti delle singole glicoproteine HSV2, gB,gC, gD oppure gE (123). Tuttavia, risulta che questa protezione dipende da una competente risposta di cellule-T poiché gli animali immunosoppressi mediante irradiazione, mediante l'uso di ciclofosfamide oppure mediante l'uso di siero anti-timociti non erano protetti (124).

Il contributo delle singole glicoproteine nel provocare una risposta immunitaria protettiva non é completamente chiaro. L'espressione di queste glicoproteine in un sistema eterologo come vaccini, ha laciato alcuni di questi parametri da analizzare.

Per esempio, si é dimostrato che i vettori di virus vaccinici che esprimono HSV1 gB (125) e HSV1 gC (32) inducono risposte citotossiche di cellule T. Inoltre, si é dimostrato che topi immunizzati con virus vaccinici ricombinanti che esprimono l'uno o l 'altro di HSV1 gb (8), HSV1 gC (126) o HSVI gD (26) sono protetti contro un attacco letale di HSV1. Un virus vaccinico ricombinante che esprime HSV1 gD é stato inoltre dimostrato che protegge contro HSV2 in un sistema di modello di cavia (44). Tuttavia, non é noto se l'espressione di antigeni HSV multipli dia come risultato un potenziamento di questa risposta protettiva.

Il virus herpes bovino 1 (BHV1) é responsabile di una grande varietà di malattie in bestiame, che comprendono la congiuntivite, la vulvovaginite e l'aborto (127). Esso é anche uno degli agenti più importanti di una malattia respiratoria dei bovini che agisce direttamente oppure come un fattore predisponente per una infezione batterica (128).

Il BHV1 presenta in modo specifico più di 30 polipeptidi strutturali, 11 dei quali sono glicosilati (129). Quattro di queste glicoproteine gl, gli, glll e gIV sono state caratterizzate e si é trovato che sono omologhe alle glicoproteine di virus herpes simplex (HSV) gB, gC, gD, e gE (130,131) .

Si é dimostrato che vaccini subunitari costituiti da gl, g11I e/σ gIV proteggono il bestiame da malattie (adottando un modello di infezione con aerosol BHV1/Pasteurel 1a emolitico) però non dall'infezione (132). Questi risultati indicano l'importanza di queste glicoproteine nel provocare una risposta immunitaria efficace contro 6HV1 .

I gl e glll sono stati anche clonati in virus vaccinici e bestiame immunizzato con questi ricombinanti hanno dimostrato di produrre anticorpi neutralizzanti verso BHV1 (56,133).

La rinotrachei te dei felini é una malattia comune e diffusa dei gatti che viene provocata da un alfa-virus herpes denominato virus herpes felino tipo 1 (FHV-1). Come altri virus herpes, il FHV-1 instaura una infezione latente che porta come risultato a una riattivazione periodica (134). Le infezioni da FHV-1 in colonie di allevamento sono caratterizzate da un elevato grado di mortalità in gattini. Infezioni secondarie del tratto respiratorio superiore sono molto delibitanti in adulti. Il controllo di questa malattia usualmente viene tentato impiegando vaccini vivi modificati oppure inattivati che possono sopprimere lo sviluppo di sintomi clinici ma che non prevengono l'infezione e ciò porta come risultato alla diffusione del virus. Così, gatti vaccinati in modo asintomatico possono diffondere virus virulenti e infezioni latenti non possono venire evitate dai vaccini esistenti (135) oppure da vaccini di subunità purificati più sicuri in via di sviluppo (136,137) .

Le glicoproteine di virus herpes mediano l'attacco del virione verso la cellula ospite e sono estremamente importanti nella infettività virale (138,139). Essi inoltre determinano la specificità di subtipo del virus (140). Gli antigeni di glicoproteine di virus herpes vengono riconosciuti sia dai sistemi immunitari umorali che dai sistemi immunitari cellulari e si é dimostrato che evocano risposte immunitarie protettive in ospiti vaccinati (44,107, 141, 142). Si é dimostrato che il FHV-1· contiene almeno 23 differenti proteine (143, 144). Di queste, almeno 5 sono glicosilate (144,145) con pesi molecolari riportati compresi tra 120 kDa e 60 kDa. Si é dimostrato che le glicoproteine di FHV-1 sono immunogeniche (143,145).

Come diversi altri alfa-virus herpes, sembra che il FHV-1 abbia un omologo di glicoproteina B (gB) di HSV-1, e una parziale sequenza del gene gB di FHV-1 é stata recentemente riportata (146). Il gB di HSV-1 é necessario perché il virus penetri e per la fusione delle cellule (147-149). Il gB di HSV-1 e i gB-analoghi di altri virus herpes si é dimostrato che provocano un importante anticorpo circolante come anche risposte immunitarie mediate da cellule (8,10,37,47,73,150). La glicoproteina di gB di FHV-1 é un complesso da 134 kDa che viene dissociato con B-mercaptoetanolo in due glicoproteine da 66 kDa e 60 kDa.

Il DNA-genomico di FHV-1 ha dimensioni di circa 134 Kb (153).

Il virus Epstein Barr (EBV), un virus herpes linfotropico B umano é un membro del genere linfocritpovivus che appartiene alla sottofamiglia dei gamma-virus herpes (115). Esso é l'agente che* provoca la mononuc1eosi infettiva (154) e linfomi delle cellule B (156). Il EBV é associato con due forme maligne umane: il linfoma endemico di Burkitt e il carcinoma nasofaringeo indifferenziato (156).

Poiché il genoma di EBV era completamente sequenziato (207) come i genomi di VZV (66) e HSV1 (158), sono state descritte numerose analogie tra questi differenti herpesvirus (159). In alcuni casi, queste analogie sono state usate per prevedere le funzioni potenziali di un certo schema di lettura aperta (ORFs) di EBV. I geni EBV omologhi ai geni HSV1 coinvolti nella immunità sono particolarmente interessanti. Così, il gene EBV BALF4 presenta analogie con HSV1 gB (68) e il gene EBV BXLF2 presenta analogie con HSV1 gH (161). Da ultimo, il gene EBV BBRF3 contiene analogie con una proteina di membrana CMV (162).

Tra le proteine EBV, le due principali glicoproteine di involucro gp340 e gp220 sono gli antigeni vaccinanti potenziali meglio caratterizzati. Essi derivano dal medesimo gene mediante collegamento senza che si abbia un cambiamento nello schema di lettura (163,164). Anticorpi monoclonali e sieri policlonali diretti contro gp340 neutralizzano EBV in vitro (165). I· "cottontop tamarinds", l'unico animale sensibile, possono venire protetti mediante una immunizzazione con gp340 purificato (166) e con un vacciniavirus EBV gp340 ricombinante (167). In questo caso, si é ottenuta la protezione con un ricombinante derivato dal ceppo vaccinico WR, ma non con un ricombinante derivato dal ceppo vaccinico Wyeth. Il ceppo Wyeth é stato ampiamente usato come ceppo vaccinico.

Anticorpi monoclonali diretti contro il gp85, l'omologo EBV verso HSV1 gH, sono stati descritti come anticorpi neutralizzanti in vitro (168,169).

Il citomegaiovi rus umano (HCMV) é un membro della sottofamiglia delle β-herpesvi rine (famiglia delle Herpesviri dae). HCMV può produrre un'infezione produttiva persistente sotto l'aspetto di un'immunità specifica sostanziale. Anche se HCMV possiede una bassa patogenicità in generale, un 'infezione intrauterina provoca danni al cervello oppure sordità in circa 0,15% di tutti i neonati e é la complicazione infettiva la più comune nel caso dì trapianti di organi (170). Sebbene l'efficacia di un vaccino HCMV (ceppo Towne) attenuato, vivo, sperimentale sia stata dimostrata (171), le preoccupazioni relative a ceppi di vaccini viventi hanno diretto gli sforzi verso l'identificazione di' proteine HCMV usabili come vaccino di sotto-unità. Sotto questo aspetto, l'identificazione di glicoproteine di virioni e la loro valutazione come agenti protettivi é uno stadio importante.

Sono state descritte tre famiglie immunologicamente distinte di glicoproteine associate con l'involucro HCMV (172): gCI (gp55 e gp93-l30) ; gCII (gp47-52); e gCIII (gp85-145).

Il gene che codifica gCI é omologo a HSVIgb. Le glicoproteine gCII sono codificate da una famiglia di cinque geni (HXLF) situati uno dopo l'altro e che hanno in comune una oppure due regioni di analogia. Più probabilmente, gCII é codificato soltanto da due di questi geni (172,173). Il gene che codifica per gCIII è omologo a HSVI gH (174).

Sono stati descritti anticorpi neutralizzanti in vitro diretti specificernente contro ciascuna di queste famiglie (174-176).

Mutanti di poxvirus opportunamente modificati che portano geni di herpesvirus equino esogeni che sono espressi in un ospite come un determinante antìgenico che provoca la produzione da parte dell'ospite di anticorpi verso antigeni di herpesvirus rappresentano nuovi vaccini che evitano di inconventi di vaccini tradizionali che impiegano* organismi uccisi oppure organismi vivi attenuati. Così, per esempio, la produzione di vaccini da organismi uccisi richiede la crescita di notevoli quantità degli organismi seguita da un trattamento che distruggerà selettivamente la loro infettività senza influire sulla loro antigenicità. D'altro canto, vaccini che contengono organismi vivi attenuati presentano sempre la possibilità di una reversione dell'organismo attenuato verso uno stato patogenico. Invece, quando si usa come vaccino un poxvirus ricombinante opportunamente modificato con un gene di un herpesvirus equino che codifica per un determinante antigenico di un herpesvirus che provoca malattie, si evita la possibilità di reversione verso un organismo patogeno, poiché il potvirus contiene soltanto il gene che codifica per il determinante antigenico dell'organismo che provoca la malattia e non contiene quelle porzioni genetiche dell'organismo che sono responsabili della replicazione del patogeno.

PRV inevitabilmente infetta molte specie di mammiferi (bestiame bovino, cani, ecc). Tuttavia, i maiali adulti, usualmente, sopravvivono ad una infezione e, pertanto rappresentano un importante serbatoio di virus. Poiché PRV provoca gravi perdite economiche, la vaccinazione di maiali con vaccini attenuati o con vaccini uccisi viene effettuata in molti paesi.

Si sono effettuati tentativi per controllare l'infezione PRV nel maiale e per ridurre le perdite economiche mediante immunizzazione attiva con vaccini vivi modificati oppure con vaccini inattivati. Vaccini attenuati che, in generale, conferiscono una immunità di lunga durata e sono di notevole costo, presentano il rischio di una insufficiente attenuazione oppure di una instabilità genetica. I vaccini inattivati sono meno efficaci, richiedono parecchie immunizzazioni e, usualmente, contengono potenti sostanze coadiuvanti. Queste ultime formulazioni possono provocare reazioni allergiche post-vaccinazione per esempio mancanza di appetito, ipertermia oppure aborto in scrofe gravide. Questi tipi di vaccini inoltre presentano certi inconvenienti per ciò che riguarda la prevenzione di infezioni latenti, il superamento degli effetti di anticorpi materni sull'efficacia della vaccinazione e l'eliminazione dell'uso potenziale di un saggio diagnostico sierologico per distinguere animali vaccinati da quelli precedentemente infettati con PRV.

Strategie di vaccinazioni alternative come l'impiego di poxvirus ricombinanti che esprimono in modo immunologico prodotti del gene PRV relativi avrebbero alcuni vantaggi: (a) eliminano i ceppi vaccinici PRV attenuati vivi dal settore e (b) consentono la distinzione di animali vaccinati in confronto a animali infetti oppure sieropositivi. Quest'ultimo fatto potrebbe venire realizzato mediante l'impiego di opportuni reagenti diagnostici che distinguerebbero in modo preciso gli animali vaccinati da quelli infettati naturalmente. Ciò é una considerazione importante a causa dell'esistenza di regolazioni che controllano il movimento di animali sieropositivi. Inoltre, una vaccinazione é più economica ed é più preferibile per esaminare ed eliminare dai gruppi animali infetti. Lo sviluppo di tali vaccini richiede una conoscenza dei contributi apportati dagli opportuni antigeni PRV alla induzione di una immunità protettiva. Nel caso di PRV come con altri membri della famiglia di virus herpes, le glicoproteine sono candidati importanti per antigeni che sono presenti in un vaccino ricombinante di subunità efficace.

La tecnologia di generare ricombinanti di virus vaccinici é stata recentemente estesa ad altri membri della famiglia dei poxvirus che hanno uno spettro di infettività più ristretto. In particolare, i poxvirus di uccelli che si replicano in specie avicole, sono stati costruiti in modo da esprimere immunologicamente prodotti di geni pertinenti. L'inoculazione di specie avicole (42, 177) e di specie non avicole (41) con ricombinanti di poxvirus di uccelli ha provocato risposte immunitarie protettive contro il corrispondente agente patogeno.

Vaccini vivi attenuati e vaccini inattivati verso BHV1 sono stati disponibili per oltre 30 anni e hanno fatto diminuire con successo l'incidenza di malattie in relazione a BHV1. Tuttavia questi vaccini non prevengono una infezione latente oppure una reinfezione con virus tipo selvaggio. Essi complicano inoltre la differenziazione tra animali infettati e vaccinati.

Entrambi i tipi di vaccini hanno altri inconvenienti significativi. La vaccinazione di vacche gravide con vaccini vivi attenuati può provocare la morte del feto e il successivo aborto (127).

Inoltre, si é dimostrato che gli animali vaccinati diffondono i virus (178). Pertanto, gli animali vaccinati tenuti insieme con mucche gravide potevano diffondere i virus infettivi all'animale gravido e provocare l'aborto del feto.

I vaccini inattivati non inducono aborti oppure non provocano escrezione virale. Tuttavia essi richiedono l'impiego di agenti coadiuvanti e possono provocare reazioni di ipersensibilità mortali (anafilassi) e infiammazione e febbre non mortali (179) .

Una delle questioni più importanti della vaccinazione é quella di superare oppure evitare l'immunità materna. A questo riguardo, se una madre é immune verso un particolare agente patogeno, "l'immunità" nella madre passerà al neonato tramite gli anticorpi presenti nel colostro e/o mediante altre vie. Tuttavia, il neonato non può venire vaccinato con successo fino a che il livello di immunità materna non é diminuito in modo sufficiente. Pertanto, vi é un periodo di tempo ristretto durante .il quale il neonato può venire vaccinato con successo in presenza di una immunità materna in fase decrescente.

Così si può capire che la realizzazione di un poxvirus ricombinante di un virus herpes e larealizzazione di vaccini che forniscono una immunità protettiva contro infezioni provocate da virus herpes, che nel settore comportano i vantaggi della inoculazione di virus vivi ma che fanno diminuire oppure eliminano i problemi discussi in precedenza sarebbe un progresso molto desiderabile rispetto allo stato attuale della tecnologia.

SCOPI DELL'INVENZIONE

Pertanto uno scopo di questa invenzione é quello di mettere a disposizione poxvirus ricombinanti, i quali virus esprimono prodotti di gene del virus herpes e di mettere a disposizione un procedimento di produzione di tali poxvirus ricombinanti.

Un ulteriore scopo di questa invenzione é quello di provvedere alla clonazione e alla espressione di virus herpes che codificano sequenze in un vettore di poxvirus, in particolare un vettore di virus vaccinico, di poxvirus di uccelli oppure di poxvirus di canarino.

Un altro scopo di questa invenzione é quello di mettere a disposizione un vaccino che sia in grado di provocare anticorpi che neutralizzano virus herpes e una immunità protettiva contro una infezione letale da virus herpes.

Questi e altri scopi e vantaggi della presente invenzione risulteranno più facilmente evidenti considerando quanto segue.

In un aspetto, la presente invenzione riguarda un poxvirus ricombinante che contiene una sequenza di DNA proveniente da virus herpes in una regione non essenziale del genoma del poxvirus. Vantaggiosamente, il virus herpes é un membro della sottofamiglia di virus alfa herpes, virus B herpes oppure virus gamma herpes. In particolare, la sequenza di DNA provente dal virus herpes codifica per una glicoproteina di virus herpes. Più in particolare, la glicoproteina di virus herpes viene scelta dal gruppo costituito da virus herpes equino gP13, virus herpes equino gp!4, virus herpes equino gD, virus herpes equino gp63, virus herpes equino gE, virus della psuedo rabbia gp50, virus della pseudorabbia gpll, virus della psuedorabbia gpIII, virus della pseudorabbia gpl, virus herpes simplex gB, virus herpes simplex gC, virus herpes simplex gD, virus herpes bovino gl, virus herpes felino gB, virus Epstein-Barr gp220, virus Epstein-Barr gp340, virus Epstein-Barr gB, virus Epstein-Barr gH e il citomegai ovirus umano gB.

Secondo la presente invenzione, il poxvirusricombinante esprime prodotti del gene del gene di virus herpes estraneo. In particolare, la sequenza di DNA estranea codifica per una glicoproteina di virus herpes e il DNA estraneo viene espresso in un ospite mediante la produzione della glicoproteina di virus herpes. Vantaggiosamente, una pluralità di glicoproteine di virus herpes vengono co espresse nell'ospite dal poxvirus ricombinante. Il poxvirus é vantaggiosamente un virus vaccinico oppure un avipox-virus come un poxvirus di uccelli oppure un poxvirus di canarino.

In un altro aspetto, la presente invenzione riguarda un vaccino per provocare una risposta immunologica in un animale ospite inoculato con il vaccino, detto vaccino comprendendo una sostanza-veicolo e un poxvirus ricombinante contenente, in una sua regione non essenziale, DNA proveniente da virus herpes. Più in particolare, il DNA codifica per una glicoproteina di virus herpes ed esprime una glicoproteina di virus herpes. Vantaggiosamente, una pluralità di glicoproteine di virus herpes vengono coespresse nell'ospite dal poxvirus. Il poxvirus usato nel vaccino secondo la presente invenzione é vantaggiosamente un virus vaccinico oppure un poxvirus avicolo come per· esempio poxvirus di uccelli oppure poxvirus di canarino.

In un altro aspetto, la presente invenzione riguarda meccanismi per superare il problema della immunità materna. Se la barriera é dovuta alla presenza di anticorpi verso un determinato antigene {determinati antigeni) la barriera dell'immunità materna può venire superata oppure evitata usando selettivamente vettori che esprimono sottogruppi definiti di antigeni. Per esempio, l'animale gravido può venire vaccinato con un virus vaccinico ricombinante che esprime una glicoproteina di virus della pseudorabbia gp50 e il figlio può venire vaccinato al momento della nascita oppure dopo poco tempo con ricombinanti vaccinici che esprimono altre glicoproteine del virus della pseudorabbia gp 11 oppure gp III oppure loro combinazioni. D'altra parte, se la barriera presentata dall'immunità materna é dovuta al vettore allora si può vaccinare in modo differente la madre con un vettore (vaccinia oppure avipox) e vaccinare il figlio con un altro vettore. Questo procedimento naturalmente tiene conto non soltanto dell'impiego di differenti vettori ma anche di vettori che esprimono una differente disposizione di glicoproteine. Così la <1 >presente invenzione riguarda un metodo per superare oppure evitare l'immunità materna che altrimenti impedirebbe una immunizzazione con successo in un figlio neonato. Per mezzo della presente invenzione, il neonato viene inoculato con un poxvirus ricombinante che contiene DNA proveniente da una sorgente non costituita da poxvirus, in una regione non essenziale del genoma del poxvirus, detto DNA codificando per un primo antigene di un agente patogeno del neonato e detto antigene essendo differente da un secondo antigene del medesimo agente patogeno usato per indurre una risposta immunologica verso il medesimo agente patogeno nella madre del neonato. Quindi per mezzo della presente invenzione, il figlio neonato viene inoculato con un primo poxvirus ricombinante contenente in esso DNA proveniente da una origine non costituita da poxvirus in una regione non essenziale del genoma del primo poxvirus, detto DNA codificando per un antigene di un agente patogeno del neonato e detto primo poxvirus essendo differente da un secondo poxvirus ricombinante usato per indurre una risposta immunologica verso il medesimo agente patogeno nella madre del figlio neonato.

BREVE DESCRIZIONE DEI DISEGNI

Si avrà una migliore comprensione della presente invenzione riferendosi ai disegni allegati nei quali:

la figura 1 mostra schematicamente un metodo per la costruzione del virus vaccinico ricombinante vP425; la figura 2 mostra la sequenza del DNA di un frammento da 1,88 Kb di EHV-1 contenente le sequenze codificanti gp13;

la figura 3 mostra schematicamente un metodo per la costruzione del virus vaccinico ricombinante vP483 contenente il gene EHV-1 gpì3;

la figura 4 mostra schematicamente un metodo per la costruzione del virus vaccinico ricombinante vP458; la figura 5 mostra schematicamente un metodo per la costruzione del virus vaccinico ricombinante vP577 contente il gene gpl4 di EHV-1;

la figura 5 mostra la sequenza di DNA di un frammento di 3,5 Kb di EHV-1 contenente la sequenza che codifica gp!4;

la figura 7 é un diagramma del carattere idrofilo relativo per la sequenze che codificano gpl4 di EHV-1;

la figura 8 mostra schematicamente un metodo per la costruzione del pox-virus di uccelli ricombinante vFP44 contenente il gene gp13 di EHV-1;

la figura 9 mostra schematicamenteu un metodo per la costruzione del pox-virus ricombinante di canarino vCP48 contenente il gene gp13 di EHV-1;

la figura 10 mostra schematicernente un metodo per la costruzione di plasmidi donatori pHES-MP63, pHES-MPl e pHES-MP34 contenenti versioni modificate del gene gpl 4 di EHV-1 ;

la figura 11 é una mappa dei siti di scissione BamHI del ceppo EHV-1 Kentucky D che indica le unità ripetute invertite del genoma mediante spazi delimitati ("boxes"), che mostra la posizione dei sei principali geni di glicoproteine EHV-1 e che mostra una espansione della regione del genoma che comprende i geni gD, g p 63 e gE.

La figura 12 mostra la sequenza di nucleotidi di un frammento di 6402 coppie di basi di EHV-1 contenente le sequenze codificanti gD, gp63 e gE;

La figura 13 é un grafico idroterapico " hydropathy" della sequenza di 402 amminoacidi che costituiscono EHV-1 gD;

la figura 14 é un grafico idroterapico "hydropathy" della sequenza di 413 amminoacidi che costituiscono EHV-1 gp63;

la figura 15 é un grafico idroterapico " hydrotatry <11 >della sequenza di 552 amminoacidi che costituiscono * EHV-1 gE;

la figura 16 mostra schematicamente un metodo per la costruzione di plasmidi donatori pJCA006, pJCA007 e pJCA008 contenenti rispettivamente il gene gD di EHV-1, il gene gE di EHV-1 e il gene g p 63 di EHV-1 e la generazione dei virus vaccinici ricombinanti contenenti questi geni.

La figura 17 mostra schemativamente un metodo per la costruzione di plasmidi donatori pJCAQ09 (contenente i geni gD e gp63 di EHV-1) e pJCAOlO (contenente i geni gD, gp63 e gE di EHV-1), e la generazione di virus vaccinici ricombinanti contenenti questi geni.

La figura 18 mostra schematicamente un metodo per la costruzione di un plasmide donatore PR18 contenente il gene PRV gpll e la generazione di virus vaccinici ricombinanti che esprimono il gene PRV gpll;

la figura 19 mostra la sequenza di DNA dello schema di lettura aperto PRV pg11;

la figura 20 mostra schematicamente un metodo per la costruzione di un plasmide donatore pPR24 contenente il gene PRV pglll e la generazione di virus vaccinici ricombinanti che esprimono il gene PRV gρ111; la figura 21 mostra la sequenza di DNA dello schema· di lettura aperto di PRV gpIII;

la figura 22 mostra schematicamente un metodo per la costruzione di un plasmide donatore pPR26 contenente il gene PRV gp50 e la generazione di un virus vaccinico ricombinante che esprime il gene PRV gp50; la figura 23 mostra la sequenza di DNA dello schema di lettura aperto del PRV gp50;

la figura 24 mostra schematicamente un metodo per la costruzione di plasmide pSD478VC, e pSD479VCBG e l'inserzione di beta-galattoside in virus vaccinico; la figura 25 mostra schematicamente un metodo per la costruzione di plasmide pMP13PP;

la figura 26 mostra schematicamente un metodo per la costruzione di un plasmide pFPPRVII contenente il gene PRV gpll;

la figura 27 mostra schematicamente un metodo per la produzione del poxvirus ricombinante di canarino vCP55 che esprime il gene PRV gpll;

la figura 28 mostra schematicamente un metodo per la costruzione del virus vaccinico ricombinante vP717 che esprime il gene PRV gl;

la figura 29 mostra schematicamente un metodo per la costruzione di virus vaccinici ricombinanti vP569 e vP734 che esprime il gene HSV-2 gB;

la figura 30 mostra schematicamente un metodo per la costruzione di virus vaccinici ricombinanti vP579, vP748 e vP776 che esprimono il gene HSV-2 gC;

la figura 31 mostra schematicamente un metodo per la costruzione di virus vaccinici ricombinanti vP570, vP761, vP775 e vP777 che esprimono il gene gD di HSV-2;

la figura 32 mostra schematicamente un metodo per la costruzione di virus vaccinici ricombinanti vP637 e vP724 che esprimono il gene gl di BHV-1;

la figura 33 mostra schematicamente un metodo per la costruzione di un plasmide donatore pJCAQOl contenente il gene gB di FHV-Ì e per la costruzione del virus vaccinico ricombinante vP713 che esprime i 1 gene gB di FHV-1;

la figura 34 mostra la sequenza di nucleotidi del segmento da 3400 bP del FHV-1 DNA che codifica la glicoproteina gB;

la figura 35 é un grafico idroterapico " "hydropathy" della sequenza dei 947 amminoacidi che costituiscono il gB di FHV-1;

la figura 36 mostra schematicamente un metodo per la costruzione di plasmidì donatori 409 gp220 contenente il gene gp220 di EBV e 409 gp340 contenente il gene gp340 di EBV;

La figura 37 mostra schematicamente un metodo per la costruzione di un plasmide donatore vaccinico 409 gB contenente il gene gB di EBV;

la figura 38 mostra schematicamente un metodo per la costruzione di un plasmide donatore vaccinico 486 gH contenente il gene gH di EBV;

la figura 39 mostra schematicamente la struttura del plasmide donatore vaccinico 5ì3gHgBgp340 contenente i geni di EBV gp340, gB e gH;

la figura 40 mostra schematicamente un metodo per la costruzione di un plasmide donatore vaccinico 4Q9CMVgB contenente il gene gB di CMV;

la figura 41 mostra le sequenze di nucleotidi e di amminoacidi del gene HXLF1 di HCMV (ceppo Towne); e la figura 42 mostra la sequenze di nucleotidi e di amminoacidi del gene HXLF2 di HCMV (ceppo Towne).

DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL'INVENZIONE

Si avrà una migliore comprensione della presente invenzione e dei suoi numerosi vantaggi dagli esempi che seguono che vengono dati a scopo illustrativo .

Esempio 1 -Costruzione di ricombinanti di virus vaccinici che esprimono la glicoproteina gp13 del virus herpes equino

Sostituzione del gene HA di vaccini con il gene della beta-gaiattosidasi di E.Coli. Il ceppo Copenhagen del virus vaccinico ottenuto da Rhone Merieux, Ine. (Athens, Georgia) é stato utilizzato in questo esempio. Il virus é stato fatto propagare da una placca purificata isolata o su cellule VERO (ATCC3⁄4tCCL81 ) o MRC-5 (ATCC# CCL171) in mezzo essenziale minimo di Eagle (MEM) più siero bovino fetale al 10% (FBS). Un derivato del virus di tipo selatico dal quale mediante metodi standard (25,28) si era cancellata l'intera sequenza codificante per il gene della timidina-chinasi, é stato isolato ed é stato designato con vP410. Questo mutante di delezione della timidina-chinasi é stato usato per ulteriori manipolazioni. I plasmidi sono stati costruiti, sono stati selezionati e sono stati fatti crescere mediante procedimenti standard (20,27,28).

Riferendosi ora alla figura 1, il frammento SaiI F da 13 Kb di virus vaccinico che circonda la giunzione del frammento Hindl11 A/B é stato sottoposto a legatura in pUC8 sottoposto a digestione con Sali che genera pSD419VC. Il "braccio destro" di pSD419VC corrispondente alla porzione Hindl11 B del frammento SaiI F é stato rimosso mediante digestione con Hind111 e mediante una nuova legatura che genera pS0456 VC. Il pSD456VC contiene così l'estremità destra del frammento Hind111 A* entro il quale vi é la completa regione codificante per il gene della emoagglutitina (HA) (35) fiancheggiato su ciascun lato da sequenze vacciniche addizionali da circa 0,4 Kb.

Per generare un vettore-plasmide praticamente privo delle sequenze codificanti HA, il pSD456VC BC é stato tagliato (digestione parziale) nel sito RsaI a monte del gene HA e in corrispondenza del sito Eag I 80 bp dalla estremità 3<l >del gene HA. Il frammento Rsal/Eagl da circa 3,5 Kb é stato isolato da un gel di agarosio.

Si sono preparati oligonucleotidi sintetici MPSYN59-62 per sostituire la regione dal sito Rsal attraverso la posizione 2 a monte della sequenza codificante HA, immediatamente seguita da siti di restrizione Bgl II, Smal e Ps_tl e da una estremità "appiccicosa" EagI. La sequenza di MPSYN59-62, con i siti di restrizione come indicati é la seguente:

La miscela di MPSYN59-62 ibridata é stata sottoposta a legatura nel frammento Rsal/Eagl da 3,5 Kb ottenuto da pSD456VC, che genera pSD466VC. Così, in pSD466VC il gene HA é stato sostituito con una regione "polylinker" .

Un frammento (parziale) BglII/BamHI da 3,2 Kb -contenente il gene della beta-gaiattosidasi di E.Coli ottenuto da pMC1871 (34) sotto il controllo di trascrizione del promotore vaccinico 11 kDa (7) é stato clonato in pSD466VC che era stato sottoposto a digestione con B_gJ 11. Un plasmide contenente la "cassetta" gene promotore/beta-galattosidasi da 11 kDa in un orientamento da sinistra verso destra rispetto alle braccia vacciniche fiancheggianti é stato denominato pSD466VCBGA ed é stato ricombinato in un mutante di delezione della timidina-chinasi, vP410, del ceppo copenhagen del virus vaccinico che genera il ricombinante vaccinico vP425 che esprime la beta-gaiattosidasi. 80 coppie di basi in corrispondenza del terminale carbossile del gene HA sono state conservate così da non rompere uno schema di lettura aperto potenziale breve trascritto da destra verso sinistra rispetto al genoma vaccinico.

Il virus vaccinico ricombinante, vP425 (184), é stato identificato sulla base della formazione di placche blu in presenza del substrato croniogeno, X-gal, come descritto da altri (9,24). La sostituzione del gene della beta-gaiattosidasi con un altro gene estraneo in successivi ricombinanti vaccinici potrebbe venire facilmente valutata isolando placche Incolori invece di placche blu.

Per facilitare le fasi di clonazione future, il sito Smal derivato dalla regione multiclonante pUC8 é stato eliminato mediante digestione di pSD466VC con BamHI/EcoRI. smussando le estremità con il frammento Klenow di E.Coli polimerasi e sottoponendo di nuovo a legatura. Così il singolo sito Smal che rimane nel plasmide risultante pSD467VC, si trova nella regione "polylinker" della delezione HA.

Identificazione delle sequenze di DNA che codificano per il gene gpΊ3 di EHV-1. La sequenza di DNA che codifica la glicoproteina gpl3 di EHV-1 risiede nel frammento BamHI-H da 7,3 Kb di EHV-1 (3). I dati della sequenza di nucleotidi per entrambi i filamenti sono stati ottenuti dalla regione pUC (BamHI-H) che utilizza subcloni omologhi usando l'enzima T7 modificato SEQUENASE (40) (U.S. Biochemicals, Cleveland, OH). Le reazioni di dideossi-terminazione delle catene standard (33) sono state effettuate su stampi di plasmidi a doppia elica che erano stati denaturati in alcali. Gli inneschi anteriori e inversi M13 sono stati usati per ottenere la sequenza iniziale di ciascun clone. Gli inneschi 16-17-mer usuali sintetizzati adottando procedimenti chimici standard (Biosearch 8700, San Rafael, CA; Applied Biosystem 380B, Foster City, CA), sono stati usati per proseguire lungo il rimanente frammento. Nell'analisi di tutti i dati di sequenza si é adottato il programma di analisi di sequenza IBI di Pustei (29).

L'analisi della sequenza di DNA ha rivelato uno schema di lettura aperto da 1404 bp che codifica 468 amminoacidi con un prodotto di trascrizione primario previsto da 50,9 KDa. Una significativa omologia degli amminoacidi nella metà carbossile dello schema di lettura aperto gp13 presunto é stata osservata in gC di virus di herpes simplex tipo 1 e tipo 2, glll di virus della pseudo rabbia e gpV di virus zoster della varicella il che suggerisce che il gp13 é un membro delle glicoproteine tipo gC di virus herpes. Una ulteriore analisi dettagliata dello schema di lettura aperto gpl3 di EHV-1 é stato presentato in una precedente pubblicazione (2). Per facilitare la descrizione della clonazione e dell'espressione del EHV-1 gpl3, i vettori di virus vaccinici, lo schema di lettura aperto g p13 più ulteriori sequenze 5' e 3' vengono mostrati nella figura 2. Nella figura 2 un presunto "box" TATA e amminoacidi che comprendono segnali presunti ed elementi di ancoraggio della membrana sono sottolineati. Il sito di scissione potenziale della sequenza di segnale viene notato con una freccia seguendo il segnale di scissione ASA (cerchi aperti). Potenzialmente, esistono nove siti di glicosi1azione N-collegati entro le sequenze di segnale e di ancoraggio come definito dall'unità ricorrente Asn-X-Ser/Thr (asterischi).

Clonazione del gene gp13 di EHV-1 in un plasmide donatore di virus vaccinico. Un promotore di virus vaccinico precoce/tardivo, H6, é stato usato per depressione di geni estranei in vettori di poxvirus di uccelli (41,42). Questo elemento promotore corrisponde alle sequenze di DNA immediatamente a monte dello schema di lettura aperto H6 nel frammento HindIII-H vaccinico (31).

Riferendosi ora alla figura 3, per mutare e per inserire il promotore H6 in pSD467VC, si sono sintetizzati oligonucleotidi H6SYN oligoA-D. La sequenza degli H6SYN oligo A-D, con una base· modificata come sottolineata e siti di restrizione come indicati é la seguente:

Le basi sottolineate stanno ad indicare una modificazione dalla sequenza di promotore H6 nativo.

Il DNA a doppio filamento, di lunghezza completa da 130 bp formato riassociando gli oligo A-D di H6SYN é stato purificato mediante elettroeluizione da un gel di agarosio ed é stato sottoposto legatura ai frammenti a Smal/Hindl11 da 0,5 Kb e Bql 11/Hindl11 da 3,1 Kb derivati da pSD467VC. Il plasmide ottenuto, pTP15 (184), ha il codone di inizio ATG modificato in CCC come parte del sito Smal che é immediatamente seguito da un sito Pstl. Un Nsil-lynker, 5'-TGCATGCATGCA-3', (New England Biolabs, Beverly MA) é stato inserito nel sito Smal di pTP15 per generare il plasmide pNSI.

Un frammento EcoRI/NarI di EHV-1 in cui il sito EcoRI é 120 bp a monte del codone di inizio ATG 1 e in cui il sito Nari é 23 bp a monte dal codone di terminazione TAG di EHV-1 gp13 é stato clonato nel fago MI3mp19 che genera il fago ricombinante M13EcoRNar. Usando una mutagenesi diretta di oligonucleotide (17) si é introdotto un sito NsiI cambiando la sequenza TTGCCT (le basi 130-135 in figura 2) nel gene gp!3 di EHV-1 in ATGCAT. Il frammento EcoRI/Narl ottenuto dal fago mutante M13EcoRNar é stato clonato in pUC8 in corrispondenza dei siti I/NarI che generano il plasmide pNSIEN.

Due oligonuc1eotidi da 42-mer sono stati sintetizzati e avevano la sequenza, con i siti di restrizione come indicati, come segue:

In questo ol igonuotide, il codone di terminazione (TAG) é seguito immediatamente da un terminatore di trascrizione precoce vaccinico (ATTTTTAT). Il frammento di DNA a doppio filamento ottenuto riassociando la coppia di 22-mer contiene una estremità adesiva Nari seguita dall'estremità 3' della sequenza codificante per il gene gpl3 di EHV-1 * come anche un segnale di terminazione di trascrizione precoce vaccinico (45), un sito PstI e una estremità adesiva AdeI. Questo frammento é stato inserito tra i siti Narl/I^fil di pNSIEN che genera pNSIENPN (figura 3).

Il frammento NsiI/PstI ottenuto da pNSIENPN é stato isolato ed é stato clonato nei siti NsiI/PstI del plasmide pNSI, che genera un plasmide pVHA6g13Nsii (fig 3). Il pVHA6gl3NsiI é stato tagliato in corrispondenza del sito EcoRV nel promotore H6 e nel sito NsiI che era stato introdotto in vicinanza dell'inizio del gene gp13 di EHV-1. Questo frammento vettore é stato smussato all'estremità con nucleasi di Mung Bean. Si sono sintetizzati due oligonucleotidi 32-mer complementari aventi la sequenza che segue, con il sito di restrizione come indicato:

H6 promotore estremità 5‘ di pg13

Questi oligonucleotidi sono stati riassociati e sono stati sottoposti a legatura nel frammento vettore pVHA6gl3NsiI producendo il plasmide pVHA 6g 13, che contiene un preciso collegamento in corri spondenza del codone di inizio ATG (sottolineato nella sequenza 32-mer) del promotore H6 e del gene gp13 di EHV-1 (figura 3).

Il pVHA6gl3 é stato transinfettato in cellule infettate con vP425 in modo da generare il ricombinante vaccinico vP483 contenente il gene gpl3 di EHV-1 (figura 3).

Costruzione di ricombinanti di virus vaccinico.

Procedimenti per la transinfezione di plasmidi donatori ricombinanti in cellule di colture di tessuti infettate con un virus vaccinico di recupero e identificazione di ricombinanti mediante ibridazione in situ su filtri di nitrocellulosa erano come descritto in precedenza (25,28). Per costruire il vP425 in cui il gene della beta-gai attosidasi di E.Coli sostuisce le sequenze che codificano HA vaccinico, il plasmide-DNA (25 ug di pSD466VCBGA in HeBS (16)) sono stati sottoposti a elettroforesi (BioRad Gene Pulser, capacitance 960, 200 volts) in cellule VERO. I monostrati subconfluenti di cellule sono stati infettati in corrispondenza di 10 pfu/cellula con vP410 un'ora prima dell'impiego. Le cellule infettate sono state' raccolte con tripsina e sono state lavate con HeBS prima della elettroporazi one. Le cellule sono state fatte incubare in MEM+siero di bovino fetale al 5% a 37°C per 24 ore, sono state raccolte e i virus discendenti sono stati seminati in piastre su monostrati VERO. Il virus ricombinante che esprime la beta-galattosidasi é stato messo in evidenza sotto forma di placche blu in presenza di un substrato X-gal (9,24). Per generare il virus vaccinico ricombinante in cui il gene gpì3 di EHV-1 sostituiva il gene della beta-galattosidasi in vP425, si é seguito un protocollo simile tranne che il plasmide donatore era pVHA6g13 e il virus di recupero era vP425. Il ricombinante vaccinico vP483, contenente il gp13 di EHV-1 é stato messo in evidenza sotto forma di una placca incolore in presenza di X-gal e si é confermato come ricombinante vero mediante ibridazione del DNA dopo 3 cicli di puficazione delle placche.

Espressione del gene gp13 di EHV-1 sulla superficie di cellule infettate con il virus vaccinico ricombinante vP483

Cellule di BSC-40 sono state seminate su vetrini coprioggetti da 22 mm in piastre da 35 mm in

5

5 x 10 cellule/piastra. In corrispondenza di circa· 80% di confluenza, le cellule sono state infettate con 2pfu/cellula. Dopo un periodo di assorbimento di un'ora l'inoculo di virus é stato rimosso e si é aggiunto MEM più 2 percento di siero bovino fetale. In corrispondenza di 20 ore dopo l'infenzione i vetrini sono stati lavati con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) contenente 0,2% di BSA e 0,1% di NaN3 (PBS+) e sono stati esposti a 0,1 mi di un anticorpo monoclonale anti-gpl3, 14H7 {3) diluito 1:1000 in PBS . Dopo un'ora in una camera umidificata a temperatura ambiente le cellule sono state lavate tre volte in PBS+. Questo procedimento é stato ripetuto con IgG anti-topo di capra coniugato con fluoresceina-isotiocianato. Alla fine, le cellule sono state fissate per 20 minuti in paraformaideide al 2% in PBS. I vetrini sono stati montati in glicerolo all'80% in PBS contenente 3% di n-propilgallato e con un microscopio si é osservata la fluorescenza.

La proteina prevista dalla sequenza di DMA ha le caratteristiche tipiche proprie di una glicoproteina che circonda una membrana (14). In una infezione produttiva da EHV-1 quella glicoproteina gpl3 viene incorporata nei diversi sistemi di membrana della cellula e viene trasportata nella membrana citoplasmatica ed è rivelabile sulla superficie esterna della cellula infettata. Il gpl3 da EHV-1 è inoltre un componente del virione di EHV-1. Pertanto si sono effettuati studi di immunofluorescenza per determinare se il gpl3 di EHV-1 espresso dal ricombinante di vaccinia-virus, vP483, si presentava in modo simile sulla membrana citoplasmatica dì cellule infettate.

Un anticorpo monoclonale specifico anti-gpl3 seguito da una IgG anti-topo di capra coniugata con fluoresceina ha messo in evidenza una forte imminofluorescenza in cellule infettate con vP483 ma non in cellule infettate con vP410 di vaccinia-virus. Ciò suggerisce che il gpl3 del EHV-1 espresso dal vaccinia-virus ricombinante vP483 si presenta sulla membrana citoplasmatica come è previsto per una sintesi autentica di una glicoproteina che circonda la membrana.

Immunoprecipitazione di prodotti di gp!3 di EHV-1 sintetizzati da cellule infettate con vP483 di vaccinia-vi rus ricombinante

Due milioni di cellule che formano un monostrato confluente in una piastra da 60 mm sono stati infettati con 10 pfu/cellula. L'inoculazione è stata effettuata in un mezzo privo di metionina. Dopo il periodo di assorbimento, l'inoculo è stato rimosso e si sono aggiunti 2 mi di mezzo privo di metionina contenen-

35

te 20 u Ci/ml di S-metionina. L'infezione è stata lasciata proseguire per 24 ore quando le cellule sono state lisate mediante aggiunta di 1 mi di 3 x tampone A contenente 3% di NP-40, 30 mM-Tris pH 7,4, 450 mli di NaCl, 3 mM di EDTA, 0,035·» di sodio-azide e 0,6 mg/ml di PMSF. Le cellule lisate e il liquido sovrastante sono stati raccolti, sono stati sottoposti ad agitazione vorticosa e sono stati chiarificati mediauite centrifugazione a 10.000 g per 15 minuti .

Si è preparata proteina A-sefarosio CL-4B (Pharmacia, Cat . No. 17.0780.01) sotto forma di una sospensione 1:1 in IX taunpone A. Un prodotto di coniugazione anti-topo di ratto (Boehringer Mannheim, Cat. N° 605500) è stato diluito 1:100 nella sospensione ed è stato collegato a perline a temperatura ambiente per 4 ore sotto sbattimento. Le perline sono state quindi lavate a fondo con 6 lavaggi da 1 mi in tampone A per rimuovere il prodotto di coniugazione non legato. Un anticorpo monoclonale specifico verso gpl3 è stato quindi legato alle perline a temperatura ambiente per 4 ore. L'anticorpo in eccesso è stato rimosso mediante lavaggio a fondo. 1 mi di lisato di cellule infettate purificato è stato "precleared" mediante incubazione con perline di

se farosio-proteina A alle quali si era aggiunto siero di topo normale. Queste perline sono state rimosse mediante centrifugazione. 1 mi del lisato "precleared" chiarificato è stato quindi mescolato con 100 microlitri delle perline alle quali era stato legato un anticorpo monoclonale specifico. Questa miscela è

stata sottoposta ad agitazione a temperatura ambiente per 4 ore. Le perline sono state quindi separate mediante centrifugazione e sono state lavate a fondo mediante 4 lavaggi in tampone A IX e mediante 2 lavaggi in Tris 10 mM pH 7,4 contenente 0,2M LìCl e 2M di urea. Il complesso antlgene-anticorpo è

stato quindi staccato dalle perline ed è stato dissociato mediante aggiunta di 50 microlitri di soluzione 2x Laemmli Distrupting (60,195). Il campione è stato quindi fatto bollire per 5 minuti prima della elettroforesi .

Vi sono due prodotti di circa 44 e 47 kDa rivelabili che sono alquanto più piccoli del prodotto di traduzione primario previsto (51 kDa) e un prodotto più grande di circa 90 kDa che è in accordo con una forma completamente glicosilata del prodotto costituito dal gene gpl3 di EHV-1. Polipeptidi equivalenti non erano precipitati da cellule infettate con vaccinia-virus di controllo.

Esempio 2 - Costruzione di ricombinanti di vaccinia-virus che esprimono la glicoproteina gpl4 di virus herpes equino

Sostituzione del gene M2L in vaccinia-virus con il gene della beta-galattosidasi di E. coli

Allo scopo di inserire le sequenze che codificano gpl4 di EHV-1 in un vettore di vaccinia-virus, si è costruito un vaccinia-virus ricombinante , vP458, che esprime il gene LacZ di E. coli. La sostituzione delle sequenze che codificano LacZ nel virus ricombinante, vP458, con le sequenze che codificano gpl4 di EHV-1 consente un sistema di selezione con placche blu rispetto a placche incolori per identificare gpl4 di EHV-1 contenente virus ricombinanti * (9,24) in presenza di X-gal, un substrato cromogeno di beta-galattosidasi. Inoltre, con lo scopo di costruire ricombinanti di vaccinia-virus che esprimono sia gpl4 di EHV-1 che gpl3 di EH-1, in corrispondenza del locus M2L di HindlII M si è preparato un locus di inserzione per gpl4 di EHV-1 unico dal locus cancellato della emoagglutinina usato per l'inserzione di gpl3 di EHV-1 nell'Esempio 1. L'intera sequenza codificante del gene M2L nel frammento di HindlII IIvaccinico è stata eliminata e sostituita con il gene E. coli LacZ che codifica la beta-galattosidasi. Gli stadi di clonazione per la costruzione di vP458 sono rappresentati schematicamente nella Figura 4.

Riferendosi ora alla Figura 4, uno schema di lettura aperto che legge da destra a sinistra rispetto al genoma vaccinico e che codifica una proteina putativa di 220 ammino acidi è situato interamente all<1>interno del frammento HindlII M dal ceppo Copenhagen di vaccinia virus verso la sinistra del sito BglII unico. Secondo la convenzione (31), questo gene, che è situato immediatamente alla destra di M1L (58) è stato denominato M2L. Studi di cancellazione riguardanti il genoma vaccinico (WR) che si estende verso sinistra dal sito unico BglII nel frammento HindlII M (57) indicano che sequenze che codificano vaccinia contenute in HindlII M verso la sinistra del sito

BgIII non sono essenziali per la replicazione del virus nella coltura di tessuti.

Per facilitare l'uso della regione M2L come luogo di inserimento per geni estranei, si è creato un vettore plasmide pMP409DVC nel quale l'intera sequenza che codifica M2L è stata sostituita, nel modo seguente con un sito BglII. Si è fatto digerire pSD409VC, che è costituito dal frammento HindiII M di vaccinia Copenhagen clonato nel sito Hindlll di pUC8, con Bamili/BglII e è stato auto-ligaco, rimuovendo così l'estremità destra di HindiII M e distruggendo il sito BglII. Il plasmide così ottenuto pMP409BVC è stato linearizzato con Sphl, che taglia all'internodello schema di lettura aperto M2L, e è stato sottoposto ad una digestione con esonucleasi Bal-31 per 2 minuti. Si è effettuata mutagenesi sul DNA ottenuto (19) usando un sito BglII sintetico da 49 mer.

Nel plasmide sottoposto a mutagenesi pMP409DVC, le sequenze che codificano M2L sono state cancellate dalla posizione 3 finp all'estremità dello schema di lettura aperto. Il G del codone di iniziazione ATG è stato cambiato verso un C per creare un sito BglII unico (AGATCT) in corrispondenza della giunzione di cancellazione.

Un frammento parziale BglII/BamHI da 3,2 Kb contenente 3,1 Kb del gene della beta-galattosidasi

E. coli tra i siti BamHI di pMC1871 (34) sotto il controllo di trascrizione del promotore tardivo

11 kDa vaccinico da 0,1 Kb (7) è stato clonato nell'unico sito BglII di pMP409DVC. Un plasmide ricombinante contenente la cassetta del gene-beta galattosidasi/ promotore 11 kDa in un orientamento destra verso sinistra rispetto alle braccia dei vaccini fiancheggianti e rispetto al genoma è stato denominato p?IP409DVCBG. Si è usato pMP409DVCBG come plasmide donatore per la ricombinazione con vaccinia virus

di recupero, vP410, descritto nell'Esempio 1. Il

nuovo ricombinante vaccinico, denominato vP458,

che esprime il gene della beta-galattosidasi inserito nel sito di cancellazione M2L, è stato rivelato

usando il substrato X-gal cromogenico (9,24) e è

stato purificato mediante clonazione su placche ripetuta.

Clonazione del gene EHV-1 gp!4. Riferendosi

ora alla Figura 5, la sequenza codificante EHV-1 gpl4 collega la giunzione tra i frammenti di restrizione BamHI a ed i (3). Si sono isolati i frammenti

di EHV-1 DKA, BamHI-a (21,3 Kb) e i (7,1 Kb) (59)

da gel di agarosio. Si è costruito il plasmide

pUC (BamHI-i) inserendo il frammento EHV-1 BamHI-i

in un plasmile pUC3 sul sito BamHI. Si è fatto digerire il frammento EHV-1 BamHI-a con EcoRI e lo si è legato in pUC8 digerito con EcoRI/BamHI . Il plasmide (pUC BamHI-a/EcoRI)contiene un inserto BamHI/EcoRI da 10 Kb di EHV-1.Sulla base delle determinazioni di dimensione dei frammenti indicate (59), le sequenze di

DNA in questo inserto sono contigue con quelle del frammento BamHI -1 nel genoma EHV-1.

Analisi delle sequenze di nucleotidi.

Si è effettuata una analisi di sequenze di nucleotidi impiegando differenti subcloni dai plasmidi pUC

(BamHI-a/EcoRI ) e pUC (BamHI-i). Si è fatta iniziare la sequenza delplasmide pU0(BamHI-a/EcoRI) in corrispondenza del sito BamHI, poiché il gene EHV-1

gp 14 circonda la giunzione BamHI-a/i (3). Si è determinato l'orientamento del plasmide pUC (BamHI-i) mediante digestione con un enzima di restrizione.

Poiché si è trovato che la porzione terminale EHV-1 BamHI più vicina al sito EcoRI in pUC EHV-1 BamHI

è il sito BamHI in corrispondenza della giunzione BamHI-a/ i, si è fatta iniziare la sequenza del frammento da questa estremità BamHI.

Si sono ottenuti i dati di sequenza per entrambi i filamenti come è descritto nell'Esempio 1.

La sequenza di nucleotidi del frammento 3«351 bp contenente la sequenza codificante r,HV-l gpl4 è indicata nella Figura 6. La numerazione nel margine di sinistra e la numerazione nel margine di destra riguardano rispettivamente la sequenza di animino acidi e la sequenza di acidi nucleici. Le "scatole" CAT e TATA putative sono sottolineate. Ammino acidi nella regione di collegamento del segnale e della membrana sono anch'essi sottolineati con la freccia che indica un sito di scissione di pepcidi con segnali potenziali. I tredici siti di glicosilazione potenziale che usano la sequenza di consenso

(Asn-X-Ser/Thr) sono indicati con un asterisco.

Un'analisi di sequenza di DNA ha messo in evidenza uno schema di lettura aperto che si estende da posizioni di nucleotidi 300 fino a 3239 leggendo da sinistra verso destra rispetto al genoma EHV-1, ossia, il codone di partenza ATG era contenuto nel frammento BamHI-a/EcoRI e il codone di arresto TAA era contenuto nel frammento BamHI-i (3,59).

Si sono trovati segnali di regolazione della trascrizione putativi nella regione 5' verso il codone di iniziazione ATG nella posizione 300. Si è collocata una "scatola" TATA avente la sequenza AAATATAT (nucleotidi da 148 a 155) in una posizione 70 nucleotidi a valle da una "scatola" CAT putativa in corrispondenza delle posizioni da 71 a 77 aventi la sequenza GGTCAAT. Un segnale di poliadenilazione AATAAA (nucleotidi 3251 fino a 3256) è stato situato 8 nucleotidi a valle dal codone terminale TAA (nucleotidi 3240 fino a 3242). Nove degli undici nucleotidi nella sequenza 5'-TCCTGCGCGCA-3<1 >(nucleotidi 218 fino a 228) sono complementari rispetto alla sequenza RNA ribosomale 18S 3'-AGGAAGGCGT-5' (61) e possono servire come sito di legame di ribosomi.

Analisi della struttura EHV-1 gp!4. Lo schema di lettura aperto EHV-1 gpl4 codifica 980 animino acidi con un peso molecolare calcolato di 109,8 kDa.

Un'analisi della sequenza di ammino acidi ha messo in evidenza numerose caratteristiche comuni a quelle di glicoproteine associate con membrana. Una regione che si estende dagli ammino acidi 58 fino a 99 aveva un profilo di proprietà idrofobe caratteristico e detta regione viene proposta come sequenza di segnali (Figura 6). Una caratteristica insolita del gene EHV-1 gpl4 prodotto è che la lunga sequenza di segnali idrofobi è preceduta da una lunga sequenza di segnali idrofili. Questa caratteristica è stata notata anche per il virus della pseudorabbia (PRV) gli (62) e per il gene gl (BHV-l) del virus dell'herpes bovino (63), entrambi essendo anche omologhi HSV

gB. E' previsto che una regione idrofoba costituita da 45 ammino acido (animino acido da 826 a 870 funzioni come dominio di ancoraggio della transmembrana. Il dominio citoplasmico idrofilo contiene 110 ammino acidi.

Esistono 11 siti Asn-X-Thr/Ser (in cui X può essere qualsiasi ammino acido tranne la prolina) per una glicosilazione N-legata potenziale (64). Una caratteristica insolita è costituita dal fatto che si hanno inoltre due siti di glicosilazione potenziali nel dominio citoplasmico (Figura 6).

Un diagramma di idrofilicità della sequenza che codifica EHV-1 gpl4 è indicato nella Figura 7.

Si calcola l'indice idropatico di EHV-1 gpl4 mediante il metodo di Kyte e Doolittle (65) con una apertura di sette ammino acidi e senza alcuna spianatura. I punti al disotto della linea orizzontale rappresentano aree di idrofobicità più elevata, indicando così regioni di segnale potenziale e/o di avvolgimento di membrane. Le caratteristiche di una glicoproteina di avvolgimento di membrana che comprendono elementi di segnale ed elementi di ancoraggio e la regione idrofila lunga che precede la sequenza di segnali vengono trovate per la sequenza che codifica EHV-1 gpl4.

Local izzazione del determinante antigenico riconosciuto dall anticorpo monoclonale antl-EHV-1 gp!4,

3F6 .

Vettori di espressione gtll Lambda e anticorpi monoclonali sono stati utili nella identificazione

delle sequenze EHV-1 DMA che codificano le principali glicoproteine EHV-1 (3). Si è messo in evidenza che

un ricombinante gtll lambda, 4al, esprime un epitopo gpl4 EHV-1 riconosciuto dallo specifico anticorpi monoclonale 3F6 (3). Allo scopo di determinare l’identità di questo epitopo, il DNA EHV-1 contenuto all'interno di 4al è stato sequenziato e paragonato

con la sequenza di DNA della sequenza che codifica

EHV-1 gpl4 (Figura 6). Per sequenziare il frammento

di DNA corrispondente all'epitopo EHV-1 gpl4 nel ricombinante gtll lambda 4al riconosciuto da 3F6 monoclonale anti-EHV-1 gpl4 (3) si è fatto digerire

4al con EcoRI, il frammento EHV-1 è stato isolato su gel di agarosio ed è stato legato nel sito EcoRI di pUC8. Si è sequenziato il DNA come è descritto sopra con gli

inneschi in avanti e inversi universali M13.

L'allineamento della sequenza di nucleotidi

ha indicato che questo epitopo era contenuto all'interno della regione di 66 ammino acidi corrispondente a 107 (Thr) fino a 172 (Val) del pro

dotto di traslazione primario dedotto. Pertanto, l'epitopo è situato all'interno della regione ammino-terminale del dominio di superficie EHV-1 gpl4 dedotto .

Confronto della sequenza di ammino acidi EHV-1 gp!4 rispetto ad altre glicoproteine del virus_ herpes .

Un confronto della composizione di ammino

acidi del gene EHV-1 gpl4 ha messo in evidenza

un'ampia analogia con glicoproteine di altri herpes virus. Così, il EHV-1 gpl4 è omologo con gli di FRV (62), con gl di BHV-1 (63), con gli di virus della varicella-zoster (VZV) (66), con gB del virus di herpes simplex (HSV) (67,71,72) e anche con glicoproteine

nel virus di Epstein-Barr (EBV) (68) e nel citomegalovirus umano (HCMV) (10).

Mutagenesi oligonucleotide-diretta della porzione terminale 5' della sequenza che codifica EHV-1 gp!4 Riferendosi ora ancora alla Figura 5, si è generato il plasmide Blue (KpnI/BamHI) inserendo un frammento KpnI/BamHI proveniènte da pUC(BamHI-a/EcoRI) in un plasmide Bluescript SK<+ >fatto digerire con

KpnI/BamHI . Si è effettuata una mutagenesi diretta

da oligonucleotidi mediante una modificazione del procedimento di Kunkel (17) usando stampi di DNA contenenti uracile ottenuti dal plasmide Blue (KpnI/BamHI) prodotto nel ceppo CJ236 di E. coli "dut ung host".

Nel plasmide che ha subito la mutagenesi, si è creato un sito Nsil in corrispondenza dei codoni 1 e 2 del gene EHV-1 gpl4, che cambia la sequenza ATG/TCC (Met/Ser) in ATG/CAT (Met/His). La sequenza mutata è stata verificata mediante analisi della sequenza di DNA. Il frammento Kpnl/BamHI proveniente dal mutante è stato trasferirò in pUC18 fatto digerire con XpnI/BamHI generando il plasmide pUC (Kpnl/BamHI).

Si è costruito un plasmide, pUCgl4, contenente il gene EHV-1 gpl4 completo con la mutazione nel sito Nsil inserendo il frammento EcoRI/BamHI da

pUC (Kpnl/BamHI ) in pUC fatto digerire con EcoRI/BamHI (BamHI/PstI ), un subclone da 3,9 Kb di pUC (BamHI-1).

Costruzione di un plasmide donatore chimerico pVM2LH6g!4. Si è tagliato pMP409DVC con BgIII e lo si è legato con DNA a doppia elica sintetico contenente il promotore (precoce /tardivo) di vaccinia H6 modificato, descritto nell'Esempio 1, fiancheggiato da siti di restrizione. Si sono creati siti di restrizione per Nsil , Sacl, PstI e EcoRI immediatamente a valle dal codone di inizio endogeno nel promotore H6.

In p?1Gll, la sequenza di polylinker a valle dal promotore H6 è ATG CAT GAG CTC TGC AGA ATT CGG ATC T.

L'unica sito Nsil contenente il codone di inizio

H6 (sottolineato) è immediatamente seguito da unici siti Sacl, PstI e EcoRI.

Si è sostituito il frammento EcoRI/Msil DMA ottenuto da pUCgl4 contenente la regione EHV-1 DMA a monte dal codone di inizio EHV-1 gpl4 con il frammento EcoRI/Nsil ottenuto dal plasmide pMGll, generando così il plasmide pMRHgl4 che contiene il braccio destro di vaccinia HindlII TI, il promotore

H6 e l'intera lunghezza del gene EHV-1 gpl4. Si è trasferito il frammento che contiene Hpal/PstI EHV-1 gpl4 dal plasmide pMRHgl4 al plasmide vettore pMGll tagliato con Hpal/PstI, che crea il plasmide pVl-52LH6gl4. Il plasmide pVM2LH6gl4 contiene l'intera sequenza codificante EHV-1 gpl4 (con il codone 2 cambiato da TCC (Ser) a CAT (His) come indicato, e circa 1,2 Kb di EHV-1 DMA a valle dal gene EHV-1 gp!4) sotto il controllo del promotore H6, inserito in un orientamento destra verso sinistra rispetto alle sequenze di vaccinia fiancheggianti relative al genoma vaccinia che bersaglia l'inserimento del gene EHV-1

gP14 verso il sito M2L.

Si è effettuata la ricombinazione usando vP458 come virus di recupero e usando pVM2LH6gl4 come plasmide donatore . Placche incolori sono state prelevate e analizzate per la presenza di sequenze che codificano EHV-1 gpl4 usando una sonda EHV-1 gpl4 specifica marcata con P. Dopo ripetuta clonazione

rii placche il ricombinante vaccinico è stato denominato vP577.

Troncamento delle sequenze "leader<11 >idrofile EHV-1 gp!4 Usando variazioni della mutagenesi e manipolazioni clonanti descritte sopra, si è costruito il plasmide donatore chimerico pVM2LH6gl4-l . Per creare pVM2LH6gl4-l , che contiene una cancellazione di codoni 2 fino a 34 di EHV-1 gpl4 con la sostituzione di 4 codoni, si è effettuata mutagenesi in vitro (17) su plasmide Blue (KpnI/BamHI ) , creando un sito Nsil in codoni 32 fino a 34 invece che in codoni 1 e 2. Il frammento Nsil/BamHI ottenuto dal plasmide Blue (KpnI/BamHI) che ha

subito una nuova mutagenesi è stato impiegato al

posto del frammento Nsil/BamHI in pVM2LH6gl4. Si

sono legati linkers Nsil multipli (New England BioLabs, Beverly, MA) nel sito Nsil per portare il ATG iniziale in schema con il rimanente della sequenza codificante EHV-1 gpl4. Il plasmide finale pVM2LH6gl4-l contiene la sequenza ATG/CAT/GCA/TGC/ATT/GCT . ...

che codifica Met/His/Ala/Cys/Ile/Ala. ... nella quale GCT (Ala) è il codone 35 di EHV-1 gpl4. Il rimanente di pVH2LH6gl4-l è identico a quello in pVM2LHSgl4.

Si è ottenuto il ricombinante vaccinico VP613 mediante ricombinazione con virus di recupero vP458 e con il plasmide donatore pVM2LH6gl4-l.

Esempio 3 - COSTRUZIONE DI RICOMBINANTI DI VACCINIA VIRUS VP633 e vP634 CHE ESPRIMONO CIASCUNA DELLE GLICOPROTEINE DI HERPES VIRUS EQUINO gP13 e gp!4

Allo scopo di costruire vaccini ricombinanti che esprimono entrambe le glicoproteine gpl3 e gpl4

EHV-1, si è effettuata una ricombinazione con vP577 oppure con vP613 come virus di recupero e con il plasmide donatore pVHA6gl3 (descritto nell'Esempio 1) che contiene il gene EHV-1 gpl3 sotto il controllo del promotore H6 vaccinia inserito in corrispondenza del sito di cancellazione HA dei vaccinia. L'inserimento delle sequenze EHV-1 gpl3 in virus ricombinanti è stato identificato mediante ibridazione di

DNA in situ (25,28). La ricombinazione di pVHA6gl3 con il ricombinante vaccinia virus vP577 (contenente la lunghezza totale EHV-1 gpl4) ha generato il ricombinante vaccinia virus doppio vP633; la ricombina— zione con vP613 (contenente EHV-1 gp!4 troncato) ha generato il ricombinante vaccinico doppio vP634.

I ricombinanti doppi di vaccinia virus vP633 e vP634 sono stati sottoposti a clonazione con placche e si è confermata la presenza di entrambe le sequenze codificanti EHV-1 gpl3 e gpl4 mediante analisi di ibridazione di DNA e effettuando saggi di espressione (vedi qui di seguito).

Immunoprecipitazione di glicoproteine EHV-1 gpl3 e gp!4 espresse in ricombinanti di vaccinia virus.

Allo scopo di valutare le glicoproteine EHV-1 gpl3 e gpl4 espresse da ricombinanti di vaccinia virus, si sono infettate cellule VERO con i ricombinanti e si sono marcate le proteine metabolicamente con

35

S-metionina e si è effettuata la immunoprecipitazione come è descritto nell'Esempio 1. Si sono legati l anticorpo monoclonale specifico verso EHV-1 gpl3 (14H7 )oppure verso EHV-1 gpl4 (3F6) (3) con una diluizione 1:1000 per 4 ore a temperatura ambiente. Si sono analizzati campioni mediante elettroforesi su gel di poliacrilammide SDS su un gel di polimero al 10% a 30mA (corrente costante) per circa 6 ore.

Si sono preparati autoradiogrammi.

Nessun prodotto significativo è stato immunoprecipitato dallo specifico 14H7 (3) monoclonale anti— EHV-1 gpl3 oppure dallo specifico 3F6 (3) monoclonale anti-EHV-1 gpl4 da cellule VERO non infettate oppure da cellule VERO infettate con l emoagglutinina di controllo meno vaccinia virus, vP452 (184). I prodotti radiomarcati EHV-1 gpl3 sono stati fatti precipitare con 14H7 monoclonale da cellule VERO infettate con vP483, un ricombinante vaccinico che

esprime soltanto il EHV-1 gpl3, oppure con i ricom¬

binanti doppi di vaccinia virus che esprimono EHV-1

gpl3 con gpl4 ,intatto vP633 oppure con gpl4, troncato vP634.

Esistono due prodotti di circa 44 kDa e

47 kDa rivelabili che sono un poco più piccoli ri¬

spetto al prodotto di traslazione primario previsto

(51 kDa) e un prodotto più grande di circa 90 kDa

che è in accordo con una forma completamente glicosi-

lata del prodotto del gpne EHV-1 gpl3. In modo signifi¬

cativo, la qualità e la quantità di espressione di

EHV-1 gpl3 non viene influenzata dalla co-espressio¬

ne di una o l'altra forma di EHV-1 gpl4 nei ricombi¬

nanti doppi vaccinici, vP633 e vP634.

Si sono infettate cellule VERO con, rispetti¬

vamente, vP633, vP634, vP613 e vP577, e si sono im-

munoprecipitate con il 3F6 (3) monoclonale specifico anti-EHV-1 gpl4. Con vP633 (contenente gpl4 di lunghezza completa più gpl3) e con vP577 (contenente una corrpleta -lunghezza gpl4), si sono osservate bande principa¬

li a circa 34, 47, 60-64 e 90 kDa; mentre con vP634 (contenente gpl4 troncato più gpl3) e con vP613 · (contenente gpl4 troncato), si sono osservate bande

principali a 34, 47, 57, 72-82 e 116 kDa. Anche in

questo caso, non si sono osservate differenze note¬

voli nella sintesi di EHV-1 gpl4 dell 'una o dell'al

tra forma durante la coespressione con EHV-1 gpl3.

Analisi di Immunofluorescenza di prodotti di EHV-1 gp13 e gp14, sintetizzati usando vaccinia virus ricombinanti

Si è effettuata una immunofluorescenza di cellule VERO infettate con vaccinia virus ricombinanti, come è descritto nell'Esempio 1, usando anticorpo monoclonale specifico EHV-1 gpl3 oppure gpl4.

Il EHV-1 gpl3 era facilmente rivelabile sulla superficie di cellule VERO infettate con ricombinanti vaccinici vP483, vP633 e vP634 e anche internamente, dopo fissaggio con acetone. Non si è messa in evidenza alcuna significativa,iirmunoreattività interna oppure superficiale verso anticorpo gpl3-specifico in cellule infettate vP410, vP577 e vP613.

L'espressione di EHV-1 gpl4 era facilmente rivelabilé in cellule VERO fissate con acetone infettate con ricombinanti vaccinici vP577, vP613, vP633 e vP634.

In cellule infettate ccn vP410 oppure vP483 non si è messa in evidenza alcuna notevole immunofluorescenza interna nei confronti di anticorpo gpl4-specif ico.

Usando l'anticorpo monoclonale gpl4-specifico , 3F6, si è osservata una debole immunofluorescenza superficiale in cellule infettate con vP613 oppure con vP634, che esprimono la forma troncata di EHV-1 gpl4 e non si è ottenuta alcuna risposta superficiale significativa al disopra dei virus di controllo vP410 e vP483 con vaccinia virus ricombinanti vP577 e vP633 che esprimono il gene EHV-1 gpl4 in completa lunghezza (vedi anche Esempio 3).

Esempio 4 - IMMUNIZZAZIONE DI PORCELLINI D'INDIA CON IL RICOMBIMANTE VACCINICO vP483

Allo scopo di determinare la immunogenicità del prodotto del gene del virus herpes equino gpl3 espresso dal ricombinante vaccinico vP483, si sono inoculati porcellini d'india con il virus e si è esaminata la presenza di anticorpi neutralizzanti

del siero contro vaccinia virus e contro virus di herpes equino.

Si sono suddivisi quindici porcellini d'india aventi un peso di circa 450 g in gruppi di cinque. A un gruppo è stato somministrato 1 mi del ricombinante vaccinico in corrispondenza del giorno O e quindi si è somministrato 1 mi in corrispondenza del giorno 21 mediante inoculazione sottocutanea. Al secondo gruppo sono state praticate inoculazioni simili, ma con vaccinia vP452 ). Il terzo gruppo è rimasto non vaccinato.A tutti i porcellini d'india si è fatto un prelievo di sangue prima della vaccinazione primaria e in corrispondenza del giorno 21 e del giorno 35. I sieri

sono stati preparati e esaminati per la presenza di anticorpi neutralizzanti nei confronti di vaccinia

e di EHV-1 (ceppo Kentucky), usando 50 di

virus esaminato su cellule di testicoli di maiali.

Come è indicato nella Tabella 1, il ricombinante v?483 vaccinico di EHV-1 gpl3 provoca una ovvia sierotrasformazione in porcellini d'india. I

titoli neutralizzanti del siero ottenuti con i

vaccinia virus sono indicati tra parentesi nella Tabella 1. ' Gli anticorpi del siero neutralizzanti sia vaccinia che EHV-1 sono rivelabili 21 giorni dopo l'inoculazione primaria e si ottiene un notevole aumento nel titolo di anticorpi neutralizzanti del

siero due settimane dopo una seconda inoculazione

di virus in corrispondenza del giorno 21. Si deve

notare che i titoli di neutralizzazione di vaccini

del siero ottenuti in porcellini d'india inoculati

con EHV-1 gpl3 che esprime il virus ricombinante

sono notevolmente più elevati (t=7,2), rispetto ai

titoli ottenuti da porcellini d'india inoculati ·

con il virus vP452 vaccinia.

Tabella 1. Anticorpi neutralizzanti del siero presenti in porcellini d'india inoculati con un vaccinia-ricom<'>oinariLe che esprime EHV-1 gpl3 oppure con

un virus vaccinico di controllo, vP452.

Esempio 5 - IMMUNIZZAZIONE DI CAVIE CON IL RICOMBI-NANTE VACCINICO VP577 e VP613

Cavie sono state immunizzate per valutare la loro risposta contro gpl4 di EHV-1 espresso mediante ricombinanti vaccinici vP577 e vP613. Cavie aventi un peso di circa 450 g hanno ricevuto

o di un ricombinante vaccinico vP577

oppure di un ricombinante vaccinico vP613 per via sottocutanea, uno mi al giorno in corrispondenza del giorno 0 e del giorno 21. Alle cavie si sono effettuate i prelievi nei giorni 0, 21 e 35, i sieri sono stati preparati e valutati per determinare gli anticorpi verso EHV-1. Si sono effettuate prove di neutralizzazione su cellule testicolari di maiale contro 50 TCID50 del virus EHV-1, certo Kentucky. Gli anticorpi vaccinici sono stati titolati mediante il metodo ELISA impiegando un prodotto di coniugazione perossidasi-anti IgG (H&L).

I risultati sono mostrati nella Tabella 2. Non si è ottenuta alcuna attività neutralizzante nel siero contro EHV-1 in cavie immunizzate con 11 vaccinia ricombinante, vP577, contenente il gene gpl4 di EHV-1 di lunghezza completa (dati non mostrati). D'altra parte, le cavie inoculate con il vaccinia-virus ricombinante, vP613, che esprime il gene gp14 di EHV-1 tagliato, hanno prodotto livelli simili di anticorpi neutralizzanti del siero verso EHV-1 (Tabella 2) come il ricombinante vaccinico vP483 che esprime gpl3 di EHV-1 (Tabella 1). Sebbene gli anticorpi neutralizzanti del siero contro EHV-1 siano rivelabili in corrispondenza di tre settimane dopo la vaccinazione primaria, si osserva un livello più significativo due settimane dopo l'immunizzazione secondaria (Tabella 2). In tutti gli animali immunizzati, si sono ottenute risposte quando gli anticorpi vaccinici sono state esaminati mediante il metodo ELISA.

Tabella 2. Anticorpi neutralizzanti del siero presenti in cavie inoculate con ricombinante vaccinico che esprime gp14 di EHV-1.

Esempio 6 -PROTEZIONE DI CRICETI VACCINATI DALL'INFE-

ZIONE CON EHV-1

Allo scopo di valutare l'efficacia del vaccinia ricombinante VP483 che esprime gpl3 di EHV-1, criceti hanno ricevuto o una vaccinazione primaria oppure una vaccinazione primaria più un rinforzo e insieme con un gruppo di controllo non inoculato oppure con un gruppo inoculato due volte con un virus vaccinico di controllo, vP452, sono stati infettati per via intraperitoneale con un ceppo Kentucky di EHV-1 adatto ai criceti.

Quaranta criceti siriani (di 40 giorni aventi un peso compreso tra 55 e 65 g) sono stati separati in quattro gruppi. Un gruppo A ha ricevuto una singola inoculazione sottocutanea (1 mi) di , oppure del ricombinante vaccinico vP483, cinque animali per dose. Il gruppo B è stato vaccinato con vP483 in corrispondenza del giorno 0 seguito da un rinforzo in corrispondenza del giorno 14. Le dosi dell’inoculazione primaria e di rinforzo (1 mi) sono state somministrate per via sottocutanea a gruppi di 5 animali impiegando . Il gruppo C era costitui-to da 5 criceti e ha ricevuto 2 iniezioni sottocutanee in corrispondenza dei giorni 0 e 14 di vaccinia vP452. Cinque criceti nel gruppo D sono rimasti non vaccinati come controlli. Tutti i criceti hanno ricevuto di un ceppo Kentucky adatto ai criceti di EHV-1 per via intraperitoneale 14 giorni dopo l'ultima immunizzazione. 7 giorni dopo l'infezione si sono contati i sopravissuti.

I risultati vengono mostrati nella Tabella 3. Tutti i criceti non vaccinati e vaccinati con il virus vP452 vaccinico sono morti entro 5 giorni dall infezione .

s Livelli significativi di protezione contro l'infezione da EHV-1 sono stati osservati in criceti vaccinati con vaccinia ricombinante vP483 che esprime gpl3 di EHV-1 . Non si sono osservate differenze significative nei livelli di protezione in criceti immunizzati o con una dose primaria oppure con una dose primaria più una dose di rinfor¬

Allo scopo di determinare l'efficacia protettiva di un ricombinante di vaccinia-virus che esprime gpl4 di EHV-1 da solo oppure in combinazione con gpl3 di EHV-1, si sono effettuati studi di infezione su criceti vaccinati. Criceti siriani di 20 giorni aventi un peso di circa 60 g ciascuno sono stati inoculati per via sottocutanea con 1 mi di un vaccinia-virus di controllo oppure con vaccinia-virus ricombinante vP483, vP577, vP613, vP633 e vP634 che esprimono gpl3 di EHV-1 e/o gpl4 di EHV-1. La vaccinazione primaria è stata seguita da una dose di vaccinazione identica in corrispondenza del giorno 14. Tutti i criceti, ivi compresi i controlli non inoculati sono stati infettati 14 giorni dopo l'ultima immunizzazione con una iniezione per via intramuscolare di 200-LD-50 di un ceppo Kentucky adattato ai criceti di EHV-1. I sopravissuti da gruppi di 5 animali sono stati calcolati 14 giorni dopo l'infezione e in corrispondenza di questo momento l'esperimento è stato interrotto. La dose di inoculo che dava una protezione del 50% dei criceti viene valutata come

inoculante.

Come viene mostrato nella Tabella 4, il ricombinante di vaccinia-virus ,vP577, che esprime il gene gpl4 di EHV-1 di lunghezza completa non è stato in grado di proteggere i criceti contro l'infezione con una

D'altra parte, il gene gpl4 di EHV-1 tagliato come viene espresso dal vaccinia-ricombinante , vP613, ha dato una buona protezione in seguito ad infezione (Tabella 4). Il valore PD^ calcolato è alquanto migliore (5,2) rispetto a quello ottenuto con il ricombinante vaccinico, vP483 che esprime gpl3 di EHV-1 (6,1). Sorprendentemente, la coespressione di gpl3 di EHV-1 e gpl4 di EHV-1, o il gene gpl4 di lunghezza completa oppure gp!4 tagliato in ricombinanti di vaccinia-virus vP633 e vP634, rispettivamente ha dato un'efficacia protettiva aumentata in modo significativo in confronto all'efficacia per le glicoproteine di EHV-1 espresse singolarmente. Quindi la quantità di inoculo di virus per ottenere una protezione del 50% dei criceti vaccinati è stata significativamente diminuita quando gpl3 e gpl4 di EHV-1 sono stati coespressi nel medesimo ricombìnante di vaccinia-virus.

ESEMPIO 7 - COSTRUZIONE DI RICOMBINANTI DI AVIPOXVIRUS CHE ESPRIMONO LA GLICOPROTEINA gp!3

DEL VIRUS ERPES EQUINO

Riferendosi ora alla Figura 8, si è utilizzato pVHA6gl3 con sorgente del gene gpl3 di EHV-1. Per isolare il segmento DNA contenente tutto il gene gpl3 di EHV-1, il pVHA6gl3 è stato sottoposto a digestione con NruI e HindIII . Mediante questa digestione si è generato un frammento di circa 1,8 Kb contenente 28 bp dell'estremità 3' del promotore H6 di vaccinia-virus , tutto il gene gpl3 di EHV-1 e circa 410 bp di sequenze di virus vaccinico. Il frammento NruI/HindIII da 1,8 Kb è stato isolato per l'inserimento in vettori di inserzione di avipoxvirus pFPCV2 e pCPCVl.

Il vettore di inserimento di pox virus di uccelli (FP) pFPCV2 fornisce un veicolo per generare ricombinanti che ospitano geni estranei in una regione non essenziale del genoma FP designato il locus F7. Il pFPCV2 è stato derivato da pRW731.!3. Il plasmide pRW731.13 contiene un frammento PvuII genomico di FP di circa 5,5 Kp inserito tra i due siti PvuII di pUC9. Inizialmente, una sequenza di clonazione multipla (MCS) è stata sottoposta a legatura nel sito di inserimento unico HinlI entro

IL plasmide che conteneva la MCS è stato designato come pCE11.

Il pFeLVIA è un derivato di un vettore di inserimento vaccinico pTP15 (184) (FIG.3) in cui il gene env del virus della leucemia felina (FeLV) (192)fè inserito nel sito PstI a valle dal promotore H6. Per trasferire la cassetta di espressione da 2,4 kb in un vettore FP, (FIG.8), le sequenze H6/FeLV env sono state tagliate da pFeLVIA mediante digestione con BgIII e mediante parziale digestione con PstI. Il sito BgIII è in corrispondenza del margine 5' della sequenza del promotore H6. Il sito PstI è situato 420 bp a valle dal segnale di terminazione della traduzione per lo schema di lettura aperto della glicoproteina che avvolge FeLv.

La sequenza H6/FeLv env da 2,4 Kb è stata inserita in pCEll sottoposto a digestione con BamHI e PstI . Questo plasmide è stato denominato

pFeLVFl . Il plasmide pFeLVFl è stato quindi sottoposto a digestione con PstI per rimuovere le sequenze env di FeLV. Il plasmide ottenuto che contiene il promotore H6 di vacc inia-virus entro pCEll è stato denominato pFPCVl. Le sequenze 5' verso il promotore sono state sottoposte a mutagenesi (19) per rimuovere sequenze estranee impiegando

Il frammento NruI/HindlII EHV-1 gpl3 da 1,8 Kb, definito sopra, è stato inserito nel frammento da 8,0 Kb derivato mediante digestione di pFPCV2. Questo frammento da 8,0 Kb conteneva la porzione 5* del promotpre H6 di vaccinia-virus (100 bp), le sequenze di fiancheggiamento FP (4,8 Kb a monte e 1,5 Kb a valle dal sito di inserzione) e 2,4 Kb di pUC (BRL, Bethesda, MD). La legatura di questi due frammenti ha dato come risultato la formazione di un plasmide da 9,8 Kb denominato pFPEHV13A.

Il plasmide pFPEHV13A è stato quindi sottoposto a digestione con Kpnl e HindlII per rimuovere un frammento da circa 600 bp . Questo frammento conteneva la massima parte della regione 3' del gene gpl3 di EHV-1 (200 bp) e il segmento di DNA di virus vaccinico da 410 bp. Il frammento Kpnl/HindlII da 600 bp è stato sostituito con un frammento da 200 bp derivato da pNSIENPN (FIG.3) nel modo seguente. Una digestione con PstI di pNSIENPN ha reso lineare il plasmide. I terminali PstI sono stati smussati all'estremità mediante la DNA-pol imerasi T4 (New England Biolabs, Beverly, Ma) in presenza di dNTPs (0,5 millimoli ciascuno). I HindlII linkers (BRL, Bethesda, MD) sono stati quindi sottoposti a legatura al frammento con l'estremità smussate. Dopo la digestione con HindlII il plasmide reso lineare è stato sottoposto a digestione con Kpnl per ottenere un frammento da 200 bp contenente la porzione 3* del gene gpl3 di EHV-1, la sequenza corrispondente al codone di terminazione (TAG), e l'unità ricorrente

della sequenza TTTTTNT nota per essere un segnale di terminazione della trascrizione precoce di vaccinia-virus (45). Il plasmide ricombinante è stato denominato pFPEHV13B ed è stato usato nella ricombinazione in vitro per l'inserzione del gene gpl3 di EHV attivato con H6 nel locus f7 del genoma FP. Il pox virus di uccelli ricombinante è stato denominato cFP44.

Riferendosi ora alla FIG. 9, il pFPEHV13B è stato anch'esso utilizzato per generare un frammento NruI/HindlII da 1,4 Kb per l'inserzione in pCPCVl. Il plasmide pCPCVl contiene il promotore H6 del virus vaccinico nel sito unico EcoRI all'interno del frammento genomico (CP) del pox virus di canarino PvuII da 3,3 Kb. Questo plasmide di inserzione consente l'inserzione di geni estranei nel locus C3 del genoma CP. Il pCPCVl è stato derivato da pRW764.2, che contiene un frammento genomico di CP PvuII da 3,3 Kb inserito in un vettore pUC. Il pRW764.2 è stato reso lineare mediante disgestione con EcoRI. Questo frammento è stato smussato all'estremità impiegando il frammento di Klenow della DNA-polimerasi di E. coll (Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, IN) in presenza di dNTPs (0,5 mM per ciascuno). Le sequenze del promotore H6 di vaccinia-virus e una regione di clonazione multipla situata 3' verso il promotore sono state tagliate da pFPCVl mediante digestione con KpnI/Hpal.

Questo frammento da 200 bp è stato smussato all'estre mità con DNA-polimerasi T4 in presenza di dNTP (0,5 mM ciascuno) ed è stato inserito nel plasmide smussato all'estremità reso lineare pRW764.2. Il plasmide ottenuto è stato denominato pCPCVl. Il plasmide pCPCVl è stato sottoposto a digestione con NruI e HindlII e il frammento da 5,8 Kb è stato isolato per la legatura al frammento contenente gpl3 di EHV da 1,4 Kb descritto sopra. Il plasmide ottenuto è stato denominato pCPEHV13A. Questo plasmide è stato usato in esperimenti di ricombinazione in vitro per l'inserzione del gene gpl3 di EHV attivato con H6 nel locus C3 del genoma di CP. Il pox virus di canarino ricombinante è stato denominato vCP48.

Dopo la ricombinazione in vitro, gli avipoxvirus ricombinanti contenenti il gene gpl3 di EHV-1 sono stati identificati mediante un saggio di ibridazione di placche standard. Le placche positive sono state purificate mediante 3 cicli di isolamento delle placche seguito da un'analisi di ibridazione. I ricombinanti sono stati denominati rispettivamente vFP44 e vCP48 per i ricombinanti FP e CP. Entrambi i ricombinanti sono stati analizzati impiegando un saggio di immunoselezione con fl-galattosidasi di proteina A con un antisiero monoclonale verso gpl3 di EHV-1 . I risultati hanno dimostrato che i monostrati di cellule CEF e VERO infettati o con vFP44 oppure con vCP48 esprimono il gpl3 di EHV-1 sulla superficie di cellule infettate del virus .

Esemplo 8 -VALUTAZIONE DI ULTERIORI RICOMBINANTI DI VACCINIA-VIRUS CHE ESPRIMONO VERSIONI NON MODIFICATE E MODIFICATE DEL GENE DA VIRUS ERPES-1 EQUINO CHE CODIFICA LA GLICOPROTEINA gp14

Costruzione e valutazione di ulteriori vaccinia -virus ricombinanti che esprimono gpl4 di EHV-1. Il gpl4 di EHV-1 contenente "constructs" (Esempio 2) sono stati modificati in 3 modi: (a) facendo variare la lunghezza della sequenza leader di gpl4 di EHV-1 ; (b) eliminando il DNA 3' di EHV-1 in eccesso dal gene; e (c) inserendo le versioni modificate del gene gpl4 di EHV-1 in un sistema di selezione dello spettro di infettività di vaccinia -virus vP293 (69) per la valutazione.

Il prodotto del gene gpl4 di EHV-1 contiene una sequenza leader insolitamente lunga. Viene proposto che la sequenza idrofoba lunga che si estende dagli amminoacidi 58 fino a 99 sia la sequenza di segnale. Questa regione è preceduta da una sequenza idrofila lunga. Una sequenza leader lunga simile è stata anche notata per due altri gB omologhi, gli di virus della psudorabbia (62) e di gl del virus erpes bovino 1 (63).

Modificazione dell'estremità 5* del gp!4 di EHV-1 . Per studiare l'effetto della lunghezza della sequenza leader del gpl4 di EHV-1 durante la lavorazione, la presentazione e l'efficacia immnologico del prodotto gpl4 espresso in vaccinia virus ricombinanti, si sono costruiti plasmidi contenenti il gene gpl4 di EHV-1 con tre differenti lunghezze della sequenza leader modificando il precedente gpl4 di EHV-1 contenente constructs nel modo seguente.

Riferendosi ora alla FIG.10, il plasmide pVM2LH6gl4 (Esempio 2) contiene l'intera sequenza codificante gpl4 di EHV-1 sotto il controllo del promotore H6 inserito nel locus di delezione M2L del vaccinia Copenhagen. In pVM2LH6gl4, l'animinoacido numero 2 del gene gpl4 di EHV-1 è presente come His piuttosto che come Ser naturale. Per cambiare l'amminoacido 2 in Ser, il pVM2LH6gl4 è stato tagliato con Nsil (sequenza di riconoscimento ATGCAT) in corrispondenza dei codoni 1-2 (Met/His).

Si è effettuata una mutagenesi (19) impiegando oligonucleotide sintetico

Il plasmide pVM2LH6gl4-l (Esempio 2) è identico a pVM2LH6gl4 tranne che per una scissione della sequenza leader e l<1>.introduzione di quattro codoni derivati da Nsil linkers. In pVM2LH6gl4-l, sintetici;

in cui GCT (Ala) è il codone 35 di gpl4 di EHV-1 Il pVM2LH6gl4-l è stato modificato mediante mutagene-

si (19) in due modi. Per produrre una versione del gene gpl4 tagliato circa nel medesimo grado come pVM2LH6g14-l ma più strettamente vicino alla sequenza naturale di gpl4, il pVM2LH6gl4-l è stato tagliato con Nsil in corrispondenza dei codoni 1 - 2. Si è effettuata una mutagenesi impiegando un oligonucleotide sintetico MPSYN241

Nel plasmide risultante, pMPl4M-34, la sequenza che codifica gpl4 di EHV-1 inizia con

in cui CCA (Pro) è un amminoacido 36 di gpl4 di EHV-1. Il gene gpl4 di EHV-1 contiene un sito Nael (GCCGGC) in corrispondenza dei codoni 61-63 (Lys/Pro/Ala) . Per produrre una versione più drasticamente tagliata del gene gpl4 di EHV-1, il pVM2LH6gl4-l è stato reso lineare con Nael seguito da una digestione con Nsil e isolamento del frammento vettore da un gel di agarosio. La mutagenesi è stata effettuata impiegando un oligonucleotide sintetico

Nel plasmide ottenuto, pMP14M-63, la sequenza che codifica gpl4 di EHV-1 inizia con ATG/GCA . . .

Me t/Ala. .. in cui GCA (Ala) è un animino acido 63 del gp14 di EHV-1 naturale.

Rimozione di DNA di EHV-1 estraneo. In tutti i plasmidi contenenti il gpl4 di EHV-1 descritti sopra, le sequenze codificanti gpl4-EHV sono seguite da circa 1200 bp di EHV-1 DNA. Il codone di terminazione (TAA)per il gene gpl4 si trova entro un sito Drai (TTTAAA). Per rimuovere il DNA di EHV-1 in eccesso, il pMP14M-63 è stato sottoposto ad una parziale digestione

con Dral seguita dall'isolamento del DNA lineare da un gel di agarosio e da una digestione con PstI che taglia in corrispondenza del collegamento di DNA di EHV-1 e del braccio fiancheggiante di vaccinia a valle. Una banda Dral/PstI DNA da 6,5 Kb è stata isolata da un gel di agarosio. Oligonicleotidi sintetici MPSYN247

sono stati riassociatì e sono stati sottoposti a legatura con il frammento da 6,5 Kb. Nel plasmide ottenuto, pMP14M-63P, le sequenze codificanti gpl4 di EHV-1 sono seguite immediatamente da una terminazione di specificazione della sequenza di trascrizione di vaccinia precoce (45) seguita da una regione di Polylinker (contenente i siti di restrizione Hpal, Xhol , PstI ) e il braccio fiancheggiante sinistro di vaccinia derivato da HindIII M.

Inserimento del promotore H6/gene gp14 EHV-1 in un sistema di selezione pHES/vP293. In tutti i plasmidi contenenti gp14 di EHV-1 descritti sopra, il gene gpl4 di EHV-1 é sotto il controllo del promotore H6 vaccinico inserito nel locus di delezione M2L del virus vaccinico del ceppo Copenhagen. Poiché il locus di inserimento di M2L é situato entro una regione più grande del genoma rispetto a quella che può venire cancellata (69) si é esaminata la ridisposizione della cassetta di espressione H6 promotore/EHV- 1 pgΊ4 in un sito di inserimento potenzialmente più stabile. Come fase preliminare, le parti costruite del gene gp!4 di EHV-1 contenenti differenti lunghezze della sequenza leader sono state spostate verso il sistema di selezione dello spettro di infettività basato su WR pHES/vP293 (69) in modo da consentire una rapida generazione di ricombinanti vaccinici per la valutazione comparativa.

Il plasmide pHES-4 contiene il promotore H6' vaccinico, seguito da una regione "poly1inker “ e dal gene dello spettro di infettività umano K1L (70), tutti inseriti tra le braccia vacciniche WR che fiancheggiano una delezione da 21,7 Kb (69). Il pHES-4 contiene due siti NruI, uno all'interno del promotore H6 e uno all'interno delle sequenze vacciniche a fianco. Il pHES-4 é stato reso lineare mediante parziale digestione con NruI e la banda contenente il DNA lineare di lunghezza completa é stata isolata da un gel di agarosio. Questo DNA lineare è stato tagliato in corrispondenza del sito Xhol nella regione polylinker. Il pMP14M-63P contiene due siti NruI uno all'interno del promotore H6 e l'altro all'interno delle sequenze codificanti gp14 di EHV-1, 0,2 Kb dalla estremità 3' del gene. IL pMP14M-63P é stato reso lineare con NruI, seguito da digestione con Xhol. Un frammento NruI (parziale)/XhoI da 2,8 Hb é stato isolato da un gel di agarosio. Questo frammento contiene parte del promotore H6, seguito dalla forma del gene gp!4 di EHV-1 modificato contenente la versione più corta della sequenza leader. Il frammento contenente gpl4 di EHV+l/promotore H6 da 2,8 Kb derivato da pMPl4-63P é stato sottoposto a legatura con il frammento vettore NruI (parziale)/XhoI derivato da pHES-4. Il plasmide risultante pHES-MP63 contiene la cassetta promotore H6/gene gpl4 di EHV-1 senza DNA estraneo di EHV-1. Per trasferire le estremità 5' di H6 promotore/EHV-1 gp!4 contenenti sequenze leader di lunghezza completa oppure moderatamente tagliate, i plasmidi pMP14M e pMP14M-34 sono stati tagliati con NruI e rispettivamente le bande da 2,8 Kb e da 2,7 Kb sono state isolate da gel di agarosio. Il pH£S-MP63 é stato sottoposto ad una digestione parziale con NruI e un frammento da 7,2 Kb é stato isolato da un gel di agarosio. Il frammento vettore da 7,2 Kb corrisponde al pHES-MP63 dal quale é stato rimosso il frammento NruI da 2,7 Kb contenente l'estremità 5' di H6 promotore/EHV-1-gpl4. Il frammento vettore NruI (parziale) da 7,2 Kb derivato da pHES-MP63 é stato sottoposto a legatura con il frammento Nru I da 2,8 Kb ottenuto da pMP14M, generando pHES-MPl. Il frammento vettore di NruI (parziale) da 7,2 Kb derivato da pHES-MP63 é stato sottoposto a legatura con il frammento NruI da 2,7 Kb ottenuto da pMP14M-35, generando pHES-MP34. Le fasi di clonazione che portano alla generazione di plasmidi pHES-MP63, pHES-MPl e pHES-MP34 vengono presentate schematicamente nella figura 10.

I plasmidi pHES-MPl, pHES-MP34 e pHES-MP63. sono stati usati come plasmidi donatori per la ricombinazione con vP293 (69), generando i virus vaccinici ricombinanti rispettivamente vP753, vP765 e vP721. La discendenza ricombinante é stata selezionata su cellule MRC-5 umane.

Valutazione dei ricombinanti di vaccinia-virus a base di vP293 che esprimono il gene pg!4 di EHV-1

Per determinare se le tre forme del gene gp!4 di EHV-1 espresse nel vacci nia-virus ricombinante vp753, vP765 e vP721 erano presenti sulla superficie di cellule infettate, monostrati di cellule VERO sono stati infettati con i tre vaccini a-virus ricombinanti contenenti gpl4 di EHV-1. I monostrati di cellule infettate sono stati analizzati per la immunof 1uorescenza superficiale impiegando l'anticorpo monoclonale 3F6 specifico per gpl4 di EHV-1. La immunofl uorescenza superficiale era positiva per cellule infettate con tutti e tre i ricombinanti virali vaccinici, vP753, vP765 e vP721. Ciò sta ad indicare che l'opportuno trasferimento del prodotto del gene gP 14 di EHV-1 in cellule infettate vacciniche non viene influenzato facendo variare la lunghezza della sequenza leader.

Per confrontare i prodotti dei geni EHV-1 gpl4 espressi dai tre ricombinanti di vaccina virus contenenti EHV-1 gpl4, si sono infettate cellule MRC-5 con vP753, vP765 e vP721 e si sono marcate metabolicamente le proteine con S- metionina. Si sono effettuate le immunoprecipitazi oni con i lisati di cellule radiomarcate usando un anticorpo 3F6 monoclonale EHV-1 gpl4-specifico.

Le proteine immunoprecipitate da cellule infettate con vP753, vP765 e vP721 non sono distinguibili l'una dall'altra e sono equivalenti alle proteine immunoprecipitate da vP613, il ricombinante vaccinico contenente EHV-1 gp14 prodotto dal pìasmide pVM2LH6gl4-l. Questi risultati indicano che le variazioni in lunghezza della sequenza "leader" EHV-1 gp14 esaminate in questi ricombinanti non aumentano, né interferiscono con il l'opportuno processo del prodotto gene.

Per valutare l'efficacia protettiva di vaccinia virus ricombinanti che esprimono le differenti forme di EHV-1 gp14 si sono inoculati criceti con dosi variabili di vP753, vP765 e vP721 e si sono infettati con ceppo Kentucky adatto ai criceti EHV-1. Tutti e tre i ricombinanti vaccinici contenenti EHV-1 gpl4 sono protettivi, con un 1°9-10 PD50 di 6,2 o migliore. Le differenze nella protezione tra i tre ricombinanti di virus vaccinici non sono statisticamente significative.

Invece, con vP577, un successivo ricombinante di vaccina virus che era stato anche generato mediante ricombinazione tra pVM2LH6gl4 e vP458 mostra uno schema di immunoprecipitazione EHV-1 gp14 identico a quello che si mette in evidenza con vP613, vP753, vP765, e vP721 e, come questi virus vaccinia ricombinanti che esprimono EHV-1 gpl4, ha espresso la proteina EHV-1 gp14 sulla superficie di cellule infettate .

I dati di cui sopra suggeriscono che il EHV-1 gp!4 espresso in vP577 ricombinante di vaccinia virus é difettoso e che il difetto probabilmente sorge durante la ricombinazione tra il plasmide donatore pVM2LH6gl4 e il vaccina virus vP458.

Esempio 9-SEQUENZA DI NUCLEOTIDI DI TRE NUOVI GENI DA HERPES VIRUS EQUINO TIPO 1 E ESPRESSIONE IN RICOMBINANTI DI VACCINIA VIRUS

Per identificare e isolare il gene EHV-1 che codifica il gp17/18 prima di esprimerlo in un virus ricombinante vaccinico, la massima parte della regione del genoma EHV-1 é stata sequenziata e i differenti schemi di lettura aperti trovati su questo frammento di DNA sono stati espressi. Tre nuovi geni EHV-1 codificati dal componente S sono* stati identificati ed analizzati: EHV-1 gD che, sequenziato, ha presentato analogia con i prodotti dei geni HSV gD e PRV gp50, HEV-1 gp63 che ha presentato analogia con i prodotti dei geni HSV US 7 e PRV gp63, e EHV-1 gE che ha presentato analogia con i prodotti dei geni HSV gE e PRV gl. Tutti e tre i geni, singolarmente oppure in associazione, sono stati clonati in un sistema di selezione dello spettro di infettività del ceppo vaccinico Copenhagen per studi di espressione rapidi. La immunof1uorescenza ottenuta con un siero di coniglio anti-EHV-ì ha messo in evidenza l'espressione di prodotti specifici EHV-1.

Clonazione dei frammento EHV-1 BamHI. Come il gene EHV-1 gp17/18 é stato collocato sul componente S del genoma EHV-1 (3), il frammento BamHI D che rappresenta la massima parte della regione (59) é stato isolato e clonato. Si é fatto digerire DNA genomico EHV-1 del ceppo Kentucky D con BamHI. Si é isolato il frammento BamHI D da 11,0 Kb da gel di agarosio (Geneclean, BiolOl, Ine., La Jolla, Ca) e lo si é clonato in plasmide pIBI 24 come plasmide pEHVBamHID. Si é ricavata una mappa di restrizione di questo frammento (figura 11).

Identificazione di sequenze DNA che codificano EHV-1 gD, gp63 e gE. Si sono ottenuti dati di sequenze di nucleotidi per entrambi i filamenti da parecchi subcloni del frammento BamHI D subclonato in pIBI 24, come descritto nell'esempio 1. Si sono esaminate sequenze delle giunzioni tra frammenti consecutivi sul clone iniziale pEHVBamHID. In tutte le analisi di dati di sequenza si é usato PC/GENE sfotware package ( Intelligenetics Ine., Mountain View, CA).

Analisi di sequenze di DNA dei geni EHV-1 gD, gp63 e gE . L'analisi della sequenza di DNA della regione da 6402 bp analizzata dal frammento BamHI D (che rappresenta la massima parte della regione breve unica) ha rivelato l'esistenza di almeno tre schemi di lettura aperti completi che leggono tutti dal medesimo filamento. Questa sequenza é presentata nella figura 12 come il filamento da 5‘ a 3' verso destra. La composizione delle basi é 50,44% G+C.

Il primo schema di lettura aperto (0RF1) s1 estendeva dalle posizioni dei nucleotidi da 971 fino a 2176. Si sono trovati segnali regolatori della trascrizione presunti nella regione 5' verso il codone di inizio ATG più probabile in corrispondenza della posizione 971. Uno spazio TATA avente la sequenza TATATTAA (nucleotidi da 871 a 878) é stato localizzato 60 nucleotidi a valle da uno spazio CAT presunto in corrispondenza delle posizioni da 811 a 817 aventi la sequenza TGACAAT. Non si é trovato alcun segnale di poiiadeni1azione (AATAAA) a valle del codone di terminazione (TAA) (nucleotidi da 2177 a 2179). Sette dei 10 nuleotidi nella sequenza 5 ' TCCCTTCGCC 3' (nucleotidi da 890 a 899) sono complementari alla sequenza di RNA ribosomale 18S 3'AGGAAGGCGT 5' (61) e possono servire come sito di legame del ribosoma. Si é proposto un modello di esplorazione mediante il quale i mRNA eucariotici iniziano la traduzione (151). La regola principale di questo modello è che i ribosomi si legano all 'estremità 5' del mRNA ed esplorano linearmente la molecola di mRNA. L’incarico all 'inizio della traduzione é usualmente in corrispondenza del primo codone ATG 5 ' -pross i mal e sebbene si siano notate eccezioni (152). Una purina in posizione -3 é essenziale per l'inizio della traduzione e la traduzione viene stimolata da C nelle posizioni-1 e -2 quando il resto della sequenza é subottimale (155). Il contesto della sequenza intorno al codone di inizio proposto AGCATGT (nucleotidi da 968 a 974) si qualifica come un contesto di sequenza funzionale per l 'inizio della traduzione di mRNA eucariotico. Vi sono due altri possibili codoni di inizio ATG situati rispettivamente nelle posizioni da 989 a 991 e da 992 a 994. Il contesto di questi due codoni CTTATGATGG non si qualifica come funzionale per l 'inizio della traduzione. Il EHV-1 0RF1 codifica 402 amminoacidi con un peso molecolare calcolato di l 45239 dalton.

Analisi della struttura proteica di 0RF1 di EHV-1

L'analisi della sequenza degli amminoacidi ha rivelato un certo numero di caratteristiche comuni alle glicoproteine associate alla membrana. Una regione che si estende dagli amminoacidi 1 fino a 26 aveva un profilo di caratteristica idrofoba e si pensa che sia la sequenza di segnale. Una regione idrofoba costituita da 24 amminoacidi (amminoacidi da 351 a 374) viene prevista nel senso che funzioni come settore di ancoraggio di trans-membrana. Vi sono 4 siti Asn-X-Thr/Ser (in cui X può essere un qualsiasi amminoacido tranne la prolina) per la glicosilazoine N-collegata potenziale (157). Il profilo del carattere idrofobo della sequenza di amminoacidi di 0RF1 di EHV-1 viene mostrato nella figura 13. Le caratteristiche di una glicoproteina che circonda la membrana ivi compresi elementi di segnali e di ancoraggio vengono chiaramente definite. Le due regioni più ibrofobe in corrispondenza del terminale N e in vicinanza del terminale C si prevede che rappresentino la sequenza di segnale e la regione di avvolgimento di trans-membrana rispettivamente della molecola di glicoproteina.

Confronto della sequenza di amminoacidi del 0RF1 di EHV-1 con altre glicoproteine di virus herpes

Il confronto della composizione degli amminoacidi della proteina 0RF1 di EHV-1 presunta ha rivelato una significativa omologia con glicoproteine di altri virus herpes. Così la proteina 0RF1 di EHV-1 é simile a PRV gp50 (95) e HSV-1 gD (79,160).

Il secondo schema di lettura aperto (QRF2) si estendeva dalle posizioni nucleotidiche 2287 fino a 3525. Non si sono trovati presunti segnali regolatori della trascrizione nella regione 5' al codone di inizio ATG in corrispondenza della posizione 2287. Non si é trovato alcun segnale di poiiadeni1azione AATAAA a valle del codone di terminazione TGA (nucleotidi da 3526 a 3528) però due potenziali segnali di poiiadenilazione YGTGTTYY (180) sono stati localizzati a valle di questo codone di terminazione in corrispondenza di circa 40 e 70 bp. Il contesto della sequenza intorno al codone di inizio proposto GCTATGG é in accordo con le regole di Kozak (151,155).

Vi sono almeno due altri possibili codoni di inizio ATG in corrispondenza delle posizioni 2305 fino a 2307 e 2332 fino a 2334 ma il contesto della sequenza di questi due codoni (GGGATGT e TCTATGG) non si qualifica come funzionale dell'inizio della traduzione. Il 0RF2 di EHV-1 codifica un polipeptide da 413 amminoacidi con un peso molecolare calcolato di 45431 dalton.

Analisi della struttura della proteina di 0RF2 di EHV-1

L'analisi della sequenza di amminoacidi ha messo in evidenza un certo numero di caratteristiche comuni alle glicoproteine associate alla membrana. Una regione che si estende dagli amminoacidi 1 fino a 22 aveva un profilo di proprietà idrofoba caratteristico e si pensa che sia la sequenza di segnale (sebbene la valutazione del computer per il presunto sito di scissione fosse bassa). La regione idrofoba costituita da 32 amminoacidi (posizioni da 315 a 346) si prevede che funzioni come un settore di ancoraggio di trans-membrana. Vi sono sette siti Asn-X-Thr/Ser per la glicosi1azione N-collegata potenziale. Un diagramma del carattere idrofobo della sequenza di amminoacidi di EHV-1 0RF2 viene mostrato nella figura 14. Le caratteristiche di una glicoproteina che circonda la membrana che comprende elementi di segnale e di ancoraggio sono chiaramente definite. Le due regioni più idrofobe in corrispondenza del terminale N e in vicinanza del terminale C si prevede che rappresentino la sequenza di segnale e rispettivamente la regione di che circonda la trans-membrana della molecola di glicoproteina.

Confronto della sequenza di amminoacido 0RF2 di EHV-1 rispetto ad altre glicoproteine di virus herpes .

Il confronto della composizione di amminoacidi del GRF2 di EHV-1 ha messo in evidenza una significativa omologia con glicoproteine di altri virus herpes. Così, la proteina di EHV-1 0RF2 é omologa alle PRV gp63 (80), VZV gpIV (181) e HSV-1 US7 (79).

Il terzo schema di lettura aperto (0RF3) s1 estendeva dalle posizioni nucleotidiche 3796 fino a 5451. Si sono trovati segnali regolatori della trascrizione presunti nella regione 5' rispetto al codone di inizio ATG in corrispondenza della posizione 3796. Uno spazio delimitato TATA avente la sequenza GTTTAAA (nucleotidi da 3705 a 3711) é stato localizzato 50 nucleotidi a valle di uno spazio CAT presunto in corrispondenza delle posizioni 3649 fino a 3654 aventi la sequenza GCAATG. Non si é trovato alcun segnale evidente di poliadenilazione a valle del codone di terminazione TGA (nucleotidi da 5452 a 5454). Il contesto della sequenza intorno al codone di inizio proposto ACAATGG é in accordo con le regole di Kozak (151,155). Il EHV-10RF3 codifica un polipeptide da 552 amminoacidi con un peso molecolare calcolato di 61493 dalton.

Analisi della struttura della proteina 0RF3 di EHV-1

L'analisi della sequenza degli amminoacidi ha messo in evidenza un certo numero di caratteristiche comuni alle glicoproteine associate alla membrana. Una regione che si estende dagli amminoacidi 1 fino a 23 aveva un andamento caratteristico di proprietà idrofoba e viene proposta come la sequenza di segnale. Si prevede che una regione idrofoba costituita da 38 amminoacidi (posizioni 404 fino a 437) funzioni come settore di ancoraggio di transmembrana. Vi sono cinque siti Asn-X-Thr-Ser per la glieosilezione N-collegata potenziale. Un grafico del carattere idrofobo della sequenza di amminoacidi 0RF3 di EHV-1 viene mostrato nella figura 15. Le caratteristiche di una glicoproteina che circonda la membrana che comprende elementi di segnale e di ancoraggio vengano chiaramente definite. Le due regioni più idrofobe in corrispondenza del terminale N e in vicinanza del terminale C si prevede che rappresentino la sequenza di segnale e la regione che circonda la transmembrana rispettivamente della molecola di glicoproteina.

Confronto della sequenza di amminoacidi di EHV-1 0RF3 con altre glicoproteine di virus herpes

Il confronto della composizione degli amminoacidi della proteina 0RF3 di EHV-1 ha messo in evidenza una omologia significativa con glicoproteine di altri virus herpes. Così la proteina 0RF3 di EHV-1 é omologa a PRV gl (80), VZV gE (181) e HSV-1 gE (79).

Costruzione di un virus vaccinia Copenhagen basato sul sistema di selezione dello spettro di infettivita

Si é costruito un vaccinia-virus copenhagen basato sul sistema di selezione dello spettro di infettività simile al sistema di selezione dello spettro di infettività pHES/vP293 WR (69).

Il mutante di delezione del vaccina-virus Copenhagen vP668 viene cancellato per 12 geni dallaregione Hindl11 C fino a Hindl11 K che comprende i geni di spettro di infettività umani KIL (70) e C7L, un gene che si dispone verso Hindl11 C. Il vP668 non é in grado di crescere su cellule umane MRC-5. Membri della serie di plasmidi COPCS contengono il gene C7L entro le braccia di vaccino a fianco,

consentendo la ricoinbinazione con vP668 e il

ripristino della capacità del virus a crescere su cellule MRC-5. La capacità della discendenza vaccinica ricombinante generata dalla ricombinazione con l'impiego del sistema di selezione dello spettro

di infettività vP668/C0PCS per formare placche su

cellule umane MRC-5 mette a disposizione un mezzo di

identificazione rapida di questi ricombi nanti. Il

plasmide pC0PCS657 contiene il promotore vaccinico

H6 sintetico seguito da una regione di clonazione

"polylinker" per l'inserzione di geni estranei. La

regione "polylinker" é seguita da codoni di arresto

e da un segnale di terminazione della trascrizione

vaccinica (45).

Clonazione del gene gD di EHV-1 in pCQPCS657

Riferendosi ora alla figura 16, il plasmide

pEHVBamHID é stato sottoposto a digestione con

Hindll I e un frammento Hindl 11 DNA da 1 240 bp

contenente gD di EHV-1 é stato isolato da un gel di * agarosio (Geneclean, BioìO Ine., La Jo1la, CA) ed é

stato ripristinato impiegando il frammento Klenow di

DNA-polimerasi. Il frammento ripristinato é stato

quindi sottoposto a legatura in un plasmide pCOPC-S657 sottoposto a digestione con Smal. Il plasmide ottenuto, pJCA0Q6, ha il codone di inizio ATG circa 10 pb dal promotore H6 (figura 16).

Clonazione del gene EHV-1 gp63 in pCOPCS657.

Il plasmide pEHVBamHID é stato sottoposto a digestione con Hind111, EcoRI e Pvu11 e il frammento Hind 111-Pvu11 DNA da 1300 bp contenente il gp63 di EHV-1 é stato isolato da un gel di agarosio ed é stato ripristinato con Kìenow. Il frammento ripristinato é stato quindi sottoposto a legatura nel plasmide pC0PCS657 sottoposto a digestione con Smal. Il plasmide ottenuto con il gp63 di EHV-1 nell'orientamento opportuno rispetto al promotore H6 é stato denominato pJCA 008 (figura 16).

Clonazione del gene gE di EHV-1 in pC0PCS657

Il plasmide pEHVBamHID é stato sottoposto a digestione con AatII e Apal e un frammento AatII-ApaI DNA da 2630 bp contenente gE di EHV-1 é stato isolato da un gel di agarosio ed é stato restaurato con Klenow. Il frammento ricostituito é stato quindi inserito nel plasmide pC0PCS657-sottoposto a digestione con Smal. Il plasmide ottenuto con il gene gE di EHV-1 nell'orientamento giusto rispetto al promotore H6 é stato denominato pJCA007 (figura 16).

Clonazione del frammento EHV-1 gD-gp63 in pC0PCS657. Riferendosi ora alla figura 17, il plasmide pEHVBamHID è stato sottoposto a digestione con EcoRI e Pvu11 e il frammento di DNA EcoRI-Pvu11 da 1832 bp (A) é stato isolato da un gel di agarosio. Il plasmide pJCA006 é stato sottoposto a digestione con C1aI e EcoRI e il frammento Clal-EcoRI DNA da 1450 bp (B) é stato isolato da un gel di agarosio. Il plasmide pC0PCS657 é stato sottoposto a digestione con CIa I e SmaI e il frammento ClaI-SmaI DNA da 3700 bp (C) é stato isolato da un gel di agarosio. I frammenti A,B e C sono quindi stati sottoposti a legatura insieme e il plasmide ottenuto é stato denominato pJCAQ09 (figura 17).

Clonazione del frammento EHV-1 gD-gp63-gE in PCQPCS657. Il plasmide pEHVBamHID é stato sottoposto a digestione con EcoRI e con Sac11 e il frammento DNA di EcoRI-SacII da 4240 bp (D) é stato isolato da un gel di agarosio. Il frammento D é stato quindi sottoposto a legatura con frammenti B e C (vedere sopra) con l'aggiunta di dNTP in modo da assicurare il restauro del collegamento Sac11-SmaI. Il plasmide ottenuto é stato denominato pYCAOlO (figura 17).

Costruzione di vaccinia-virus ricombinanti vP773, vP8Q3, vP809, vP81Q e vP822 che esprimono schemi di lettura aperti EHV-1 Us.

Allo scopo di controllare rapidamente l'espressione degli schemi di lettura aperti di EHV-1 descritti sopra, si é costruito un certo numero di virus ricombinanti vaccinici usando il sistema di selezione dello spettro di infettività COPCS. I tre schemi di lettura aperti identificati dall'analisi della sequenza sono stati clonati o singolarmente oppure in associazione ( doppia"e "tripla") nel plasmide pC0PCS657 (figure 16,17). I piasmi di ottenuti sono stati quindi usati per la ricombi nazione con ricombinante vaccinico vP668 come virus di recupero. 1 virus vaccinici ricombinanti differenti ottenuti da queste ricombinazioni vengono presentati nella tabella 5.

Il ricombinante vaccinico vP773 é stato ottenuto dalla ricombi nazione effettuata con plasmide donatore pJCA006 contenente il gene gD EHV-1. Il ricombinante vaccinico vP822 é stato ottenuto da una ricombi nazione effettuata con un* plasmide donatore pJCA008 contenente il gene gp63 di EHV-1. Il ricombinante vaccinico vP803 é stato ottenuto dalla ricombinazi one effettuata con il plasmide donatore pJCA007 contenente il gene gE EHV-1. Il ricombinante vaccinico vP809 é stato ottenuto dalla ricombinazione effettuata con un plasmide donatore pJCA009 contenente il frammento gD-gp63 di EHV-1 e il ricombinante vaccinico vP810 é stato ottenuto da una ricombinazione effettuata con plasmide donatore pYCAO10 contenente il frammento gO-gp63-gE di EHV-1 (tabella 5).

La immunof1uorescenza di cellule VERO e MRC-5 infettate con virus vaccinico ricombinante é stata effettuata come descritto nell'esempio 1 impiegando un siero di coniglio policlonale specifico anti-EHV-1, R5935 (1:200) (tabella 6).

Tabella 5 Designazione di ricombinanti virus vaccinici che esprimono i geni EHV-1 gD, gE e gp63.

Tabella 6. Immunofluorescenza di cellule infettate con virus vaccinico ricombinante effettuata impiegando siero di coniglio anti-EHV-1, R5935.

Esempio 10 - Valutazione immunologica in topi e maiali di glicoproteine di virus della pseudorabbia gpll, gpIII e gp50 espresse singolarmente oppure in combinazione di ricombinanti di vaccinia-virus .

Il ceppo Copenhagen di vaccinia-virus e i suoi derivati vP410, vP425, e vP458 (184) sono stati utilizzati in questo esempio.

La clonazione dei geni PRV che codificano qp11. gpIII e qp50. Il virus PRV NIA3 (182) é stato propagato su una coltura di cellule NIL2 (183). I residui cellulari sono stati separati dal liquido surnatante mediante centrifugazione a 3000 xg per 30 minuti. I virioni sono stati purificati mediante centri fugazione attraverso ad uno strato (cushion)· di saccarosio al 40% (peso/voiurne) a 40000 giri al minuto per 60 minuti in un rotore 45 Ti Beckman seguito da un gradiente di saccarosio discontinuo da 30 al 50% (peso/voi urne) (rotore SW25 Beckman) a 23000 giri al minuto per 5 ore. I virioni "Banded" sono stati raccolti, sono stati diluiti con tampone TNE (tris-HCl 50 mM, pH 7,8, NaCl 150 mM e EDTA 10 mM) e sono stati pellettizzati a 30 000 giri al minuto per 1 ora in un rotore SW40 Beckman. Il granulo virale é stato posto in sospensione di nuovo in tampone TE (50 mM Tris-HCl pH7,8 10 mM EDTA) ed é stato sottoposto a lisi mediante aggiunta di dodec i1solfato di sodio fino ad una concentrazione finale di 0,5% (peso/voiurne) e proteinasi K fino a 100 mg/ml . Dopo incubazione a 37°C per 2 ore il lisato é stato estratto una volta con fenolorcloroformio (1:1) e una volta con cloroformi o:alcol isoamilico (24:1). Il DNA é stato fatto precipitare con etanolo ed é stato sciolto di nuovo in acqua. Dopo digestione completa con BamHI i frammenti sono stati clonati nel sito BamHI di pBR322 precedentemente trattato con fosfatasi alcalina di intestino di vitello (CIAP). La miscela di legatura é stata usata per trasformare il ceppo NM522 di E.Coli competente (20).

Riferendosi ora alle figure 18 e 19, la sequenza di DNA che codifica il gene gpll risiede nel frammento 1 BamHI e nei subframmenti 1A e 1B SaiI del genoma di PRV (62,94). Il plasmide denominato pPR9.25 contenente il frammento PRV BamHI inserito nel sito BamH I di pBR322 é stato sottoposto a digestione con NcoI. Il prodotto di digestione di DNA ottenuto é stato sottoposto a frazionamento su un gel di agarosio allo 0,8% e un frammento NcoI DNA da 6,2 Kb é stato purificato adottando un procedimento Gene Clean (BiolOl, Ine. La Jolla, CA) e successivamente é stato inserito nel sito NcoI di pBR328 (Boehringer Mannheim Biochemi cals, Indianapolis, IN) trattato con CIAP. Il plasmide pPR2.15 ottenuto é stato sottoposto a digestione con Sph I ed é stato sottoposto a frazionamento su un gel di agarosio. I frammenti da 2,7 e 1,8 Kb sono stati purificati e sono stati inseriti nel sito SphI di pUC18 trattato con fosfatasi in modo da creare i plasmidi pPRl e pPR2 (figura 18) e nel fago M13. La sequenza di nucleotidi é stata determinata come descritto sopra. L'analisi della sequenza del DNA ha rivelato uno schema di lettura aperto da 2742 bp che codifica 913 amminoacidi. La omologia significativa degli amminoacidi rispetto a gB di HSV-1 é stata' osservata come previsto (62). Per facilitare la descrizione delle manipolazioni di clonazione per l'espressione di PRV gp 11 in vettori di vacci nia-virus , la sequenza di DNA dello schema di

lettura aperto PRV gpll più ulteriori sequenze non codificanti 5 e 3' viene mostrata nella figura 19. Riferendosi ora alle figure 20 e 21, la sequenza di DNA che codifica la glicoproteina di PRV, gpIII risiede nei frammenti BamHI 2 e 9 del genoma PRV (96). Il plasmide pPR9.9 contenente il frammento 2 BamHI inserito nel sito BamHI di pBR322 (figura 20) é stato sottoposto a digestione con BamHI e con SphI. Il plasmide pPR7.5 contenente il frammento BamHI 9 inserito nel s1toBamHI di pBR322 é stato sottoposto a digestione con NCoI e BamHI. Il DNA ottenuto da entrambe le digestioni é stato frazionato su un gel di agarosio. Il frammento SphI-BamHI da 2,35 Kb e il frammento Ncol-BamHI da 1,1 kb sono stati purificati e sono stati sottoposti a legatura nei siti EcoRI-Sphl di IBI25 trattato con fosfatasi (figura 20) usando un linker fosforilato NCoI-EcoRI

Si é isolato un plasmide denominato pPR17 che conteneva un frammento SphI-NcoI da 3450 bp che comprende il gene completo PRV gpIII (figura 20). La sequenza di nucleotidi é stata ottenuta dagli stampi di plasmidi a doppio filamento denaturati con alcali e da stampi a singolo filamento dopo clonazione nel fago Mi3. L'analisi della sequeneza di DNA ha messo in evidenza uno schema di lettura aperto di 1440 bp che codifica 479 amminoacidi (figura 21). La omologia significativa verso gC di HSV é stata osservata come riportato in precedenza (96).

Riferendosi ora alle figure 22 e 23, la sequenza di DNA che codifica la glicoproteina gp50 di PRV risiede nel frammento BamHÌ 7 del genoma PRV (95). Il plasmide pPR7.ì (figura 22) contenente il frammento PRV BamHI 7 inserito nel sito BamHI di pBR322 é stato sottoposto a digestione con StuI e NdeI ed é stato trattato con nucleasi di fagioli Mung. Il frammento da 1,7 Kb é stato purificato da un gel di agarosio, é stato inserito nel sito Hind i di IBI25 trattato con fosfatasi. Questo plasmide pPR22, (figura 22) contiene tutto il gene gp5Q di PRV. La determinazione della sequenza di nucleotidi ha messo in evidenza uno schema di lettura aperto da' 1215 bp che codifica 404 amminoacidi (figura 23). La omologia significativa rispetto a gD di HSV-1 é stata osservata come riportato in precedenza (95).

Clonazione dei geni PRV che codificano gpll, gplll e gp5Q in plasmidi donatori di inserimento di virus vaccinici

in modo da generare il plasmide pPR6 (figura 18A). Il pPR6 é stato sottoposto a digestione con HindIII e Apal ed é stato trattato con CIAP. Il sito Apal é localizzato 32 bp a valle dal codone di inizio ATG di PRV gpll (figura 19). Il frammento di DNA a doppio filamento é stato ottenuto mediante riassociazione della coppia di oligonuc1eotidi fosforilati sintetici MRSYN3/MRSYN4. Questo frammento contiene DNA che determina il promotore H6 vaccinico dal sito EcoRV attraverso il ATG (sottolineato), seguito immediatamente da sequenze codificanti gpll di PRV

Il DNA sintetico é stato sottoposto a legatura al frammento HindIII-ApaI da 3920 bp derivato da pPR6 in modo da generare un plasmide pPR9 (figura 18A) .

Il plasmide pPR9 é stato sottoposto a digestione con BamHI e Nhel, é stato trattato con CIAP ed é stato sottoposto a legatura impiegando un linker BamHI-Sphl fosforilato

ad un frammento Sphl-Nhel da 1640 bp ottenuto dal plasmide pPR12 che genera pPRl (figure 18A, 18B).

Il frammento HincII-SphI da 1030 bp ottenuto da pPR2 (figura Ί8A) é stato isolato da un gel di agarosio ed é stato inserito nei siti HinelI-SphI di pUC18 trattato con fosfatasi. Il plasmide pPRIO ottenuto é stato sottoposto a digestione con Hind111 e NaeI ed é stato trattato con CIAP. Il sito Nael ésituato 44 bp a monte del codone di terminazione TAG (figura 19). Un frammento di DNA a doppia elica ottenuto riassociando la coppia di o1igonuc1eotidi sintetici fosforilati

é stato sottoposto a legatura al frammento Nael-HindII1 da 3720 bp derivato da pPRIO in modo da generare il plasmide pPRll.

Le sequenze sottolineate corrispondono al codone di terminazione di gpll di PRV e ad un segnale della terminazione della trascrizione precoce vaccinico (45). Il frammento SphI-HincII da 770 bp ottenuto da pPR2 é stato purificato da un gel di agarosio ed é stato inserito impiegando un linker fosforilato BamHI-SphI (MRSYN7/MRSYN8) nei siti BamHI-HincII di pPRll trattato con CIAP in modo da generare pPRÌ3 (figure 18A, 18B). Il plasmide pPR12 sottoposto a digestione con EcoRI e SphI e trattato con CIAP é stato sottoposto a legatura

Impiegando un linker HindIII-EcoRI fosforilato

ad un frammento isolato HindIII-SphI da 990 bp derivato da pPR13 in modo da generare il plasmide pPRl 5 (figura 18B).

Il frammento da 2780 bp sottoposto a

digestione con HindIII-EcoRV ottenuto da pPR15 é stato trattato con nucleasi di fagioli Mung, é stato purificato da un gel di agarosio ed é stato inserito in plasmide pTP15 {184) (figura 3) che era stato sottoposto a digestione con Xmal II-EcoRV , con nucleasi di fagioli Mung e con CIAP in modo da generare un plasmide pPR18 (figura 18B). In pPR18, il PRV gpll é stato collegato con il promotore H6 vaccinico sintetico nel locus di delezione della emoaggl utini na vaccinica. Questo plasmide é stato transinfettato in cellule infettate con vaccinia virus, in modo da generare ricombinanti vaccinici vP534, vP644, v621 e vP629 contenenti il gene gpll di PRV (vedere di seguito).

Il gene gpIII di PRV é stato manipolato in modo che si esprimesse sotto il controllo del promotore di vaccinia virus precoce u (vedere di seguito) situato nel frammento Hindl II B vaccinico. Impiegando una mutagenesi sito-specifica, si é introdotto un sito NsiI cambiando la sequenza CCG* (basi 192-194) (figura 21) in PRV gp111 in ATG e un sito XbaI é stato introdotto cambiando la sequenza GTGACGT nella TTCTAGA (basi 1632-1638) (figura 21). Per fare ciò, si é generato un DNA a singolo filamento dal plasmide pPR 17 impiegando un fago

e mediante selezione su E.coli dut ung ceppo CJ236 (IBI, New Haven CT) (17,186).

Queste mutazioni hanno generato un plasmide pPR28. Il plasmide pPR28 é stato sottoposto a digestione con NsiI e XbaI ed é stato trattato con nucleasi di fagioli Mung. Un frammento da 1440 bp é stato purificato da un gel di agarosio ed é stato inserito nei siti 8g111-Hpal di pSD478VC (figure 20, 24) dopo trattamento con nucleasi di fagioli Mung e con CIAP. Il plasmide pPR24 é stato transinfettato in cellule infettate con vaccinia-virus in modo da generare ricombinanti di vaccinia-virus vP604, vP644, vP691 e vP692 contenenti il gene gpIII di PRV (vedere di seguito).

Il gp50 di PRV é stato manipolato in modo che si esprimesse sotto il controllo di un promotore di vaccinia-virus precoce/intermedio, 13L (187). Adottando una mutagenesi sito-specifica, si é introdotto un sito NsiI cambiando la sequenza CCTGCCAGCGC (basi 177-187) (figura 23) in gp50 nella sequenza ATGCATTTAAT e un sito Bg1I1 é stato introdotto cambiando la sequenza CCTCCGCAGTACCGG in corrispondenza delle basi 1404-1418 (figura 23) in una sequenza AATTTTTATAGATCT. I procedimenti descritti in precedenza (17,185,186) di mutagenesi sono stati adottati per generare il plasmide pPR29 da pPR22 impiegando o1igonuc1eotidi sintetici fosforilati purificati MRSYN12 e MRSYN13 (Fig. 22)

Il pPR29 é stato sottoposto a digestione con NsiI, é stato trattato con nucleasi di fagioli Mung ed é stato sottoposto a parziale digestione con -Bglll per generare un frammento da 1290 bp. IL plasmide pMP13PP (figure 22,25) é stato sottoposto a digestione con EcoRI, é stato trattato con nucleasi di fagioli di Mung e quindi con BamHI in modo da generare un frammento da 140 bp contenente il promotore vaccinico I3L. I frammenti da 1290 e 140 bp sono stati purificati da gel di agarosio e sono stati sottoposti a legatura nel sito Bg111 trattato con fosfatasi di pMP409DVC (figure 4, 22). Il plasmide pPR26 ottenuto é stato usato nella ricombinazione per produrre ricombinanti di vaccinia-virus vP591, vP621, vP691 e vP692 contenenti il gene gp50 (vedere di seguito).

costruzione di ricombinanti di vaccini che esprimono glicoproteine di PRV gp11, gpIII e gp50 singolarmente oppure in combinazioni

Allo scopo di valutare il carattere di immunogenicità e il contributo relativo delle tre glicoproteine di PRV (gpll, gp111 e gp50) nella protezione di animali immunizzati contro l'infezione con PRV virulenti, si é costruita una serie di ricombinanti vaccinici che esprimono le tre glicoproteine di PRV da soli oppure in combinazione.

Riferendosi ora alla figura 24 il vaccinia-virus ricombinante, vP533, che esprime il gene della beta-galattosidasi i stato costruito nel modo seguente: una regione da 1Kb all 'interno del frammento B Hind111 vaccinico che circonda la giunzione SaiI F/I del genoma copenhagen contiene una omologia di DNA con il gene emorragico (u) del poxvirus del vaiolo (188) come é stato determinato mediante analisi "blot di Southern" (189). Il gene u codifica un polipeptide con somiglianza verso gli inibitori di serina-proteasi e biologicamente é responsabile della formazione di sacche emorragiche da virus sulla membrana corioallantoidea. La sequenza di DNA del genoma Copenhagen ha messo in evidenza che il gene u equivalente conteneva mutazioni di alterazione dello schema di lettura multiple ed era biologicamente non funzionale. Il plasmide pSD419VC (184) (FIG 24) contiene la porzione sinistra della regione u. Il plasmide pSD422VC, che contiene il frammento Sali I Copenhagen clonato in pUC8, contiene il resto della regione u. Per rimuovere le sequenze vacciniche non desiderate verso sinistra, il pSD419VC é stato sottoposto a digestione con Ncol e SmaI ed é stato smussato alle estremità con il frammento Klenow di polimerasi di E.Coli ed é stato di nuovo sottoposto a legatura ottenendo come risultato il plasmide pSD476VC (figura 24). Il plasmide pSD422VC é stato sottoposto a digestione con HpaI e NruI e un frammento da circa 0,3 Kb situato immediatamente a destra della regione u é stato isolato da un gel di agarosio. Questo frammento é stato sottoposto a legatura in pSD476VC tagliato con Hinc1 1 (che riconosce i siti Sali) ottenendo come risultato il plasmide pSD477VC. Per esprimere la beta-ga 1attosidasi sotto il controllo della regione del promotore u del vaccino Copenaghen si sono preparati oligonucleotidi sintetici 22MER/20MER. La sequenza 22 tner/20 mer con siti di restrizione indicati e con il codone di inizio ATG sottolineato é la seguente:

La miscela 22mer/20mer riassociata é stata sottoposta a legatura in pSD477VC sottoposto a digestione con CIal e Hinel I ottenendo come risultato il nuovo plasmide pSD479VC (figura 24). Un frammento BamHI da 3,1 Kb contenente le sequenze che codificano la beta-gaiattosidasi di E.Coli ottenute da pMC187ì (34) privato del codone di inizio e del promotore é stato sottoposto a legatura in pSD479VC · tagliato con BamHI. Il plasmide ottenuto contenente il gene lacZ nell'orientamento opportuno sotto il controllo del promotore u Copenaghen è stato denominato pSD479VCBG. Questo plasmide donatore di inserimento stato ricombinato in vaccinia-virus vP410 (184). Un vaccinia-virus ricombinante é stato

identificato sulla base della formazione di placche

blu in presenza di un substrato croniogeno X-gal

(9,24), é stato clonato con placche ed é stato

denominato vP533 (figura 24).

Per costruire un plasmide vettore per

l'inserimento di geni estranei, si sono preparati

oligonucleotidi sintetici 42 mer/40 mer

La mi scel a 42 mer/40 mer ri associ ata é stata

sottoposta a legatura in pSD477VC tagliato con Clal

e Hind i ottenendo come risultato i l nuovo plasmide

pSD478VC (figura 24). Questo plasmide contiene circa

0, 3 Kb di sequenze vacciniche su ciascun lato della

regione di multiclonazione che sostituisce

completamente la regione codificante u del ceppo

Copenaghen di vaccinia. I l pSD478VC é stato usato

per generare il pPR 24 (figura 20) contenente ‘ sequenze codificanti gp111 di PRV e ricombinanti

vaccinici vP604, vP644, vP691 e vP692.

Riferendosi ora alla Figura 25, il plasmide pMP4 19 contiene un frammento BamHI da 850 bp ottenuto dal frammento HindIXI vaccinico I contenente il promotore I3L inserito nel sito BamHI di pUC8 (Figura 25). L'elemento promotore I3L corrisponde alle sequenze di DNA a monte dello schema di lettura aperto I3L nel frammento HindlII vaccinico I (187) ed è stato usato in precedenza per esprimere i geni estranei in ricombinanti di vaccinia-virus (27,190). Il pMP419 è stato reso lineare in corrispondenza dell’unico sito Clal all'interno delle sesequenze codificanti I3L ed è stato sottoposto a digestione con Bai 31 seguita da digestione con EcoRI ed è stato smussato all'estremità mediante il trattamento con il frammento di Klenow di polimerasi di E. coli. Il plasmide ottenuto pMP419-5, (Figura 25) contiene le sequenze del promotore I3L a monte del nucleotide 8 legato ad un sito EcoRI. L'elemento promotore è stato isolato sotto forma di un frammento EcoRI-MspI da pMP419-5 ed è stato inserito in pUC13C digerito con EcoRI-Clal , un derivato di pUC13 contenente un linker Clal in corrispondenza del sito Smal . Il plasmide ottenuto pMP13PP, (FIGURE 22,25) contiene le sequenze del promotore I3L dalla posizione -126 attraverso la posizione -8 seguito da un sito EcoRl in corrispondenza della posizione -8.

Il gp50 di PRV guidalo dal promotore I3L vaccinico è stato inserito nel vettore del plasmide di delezione di M2L pMP409DVC (Figura 4) ottenendo come risultato pPR26 (Figura 22). Il pPR26 è stato usato per generare i ricombinanti vaccinici vP591, vP621/e VP692.

Isolamento dei vaccinia-virus ricombinanti

I vaccinia-virus ricombinanti contenenti i

geni PRV sono stati identificati e purificati come è descritto sopra. I vaccinia-virus ricombinanti che esprimono le tre glicoproteine di PRV (gpll, gpIII, e gp50 da sole oppure in combinazione vengono elencati nella Tabella 7.

Tabella 7. Designazione di ricombinanti di vaccinia-virus che esprimono glicoproteine di PRV gpll, gpIII e gp50.

Valutazione in vitro delle glicoproteine PRV espresse da ricombinanti di vaccinla virus. Le glicoproteine PRV gplI, gpIII e gp50 sono glicoproteine tipiche associate con la struttura membranosa di cellule infettate PRV e sono inoltre componenti del virus. Anticorpi monoclonali specifici anti-gpll, anti-gpIII e anti-gp50 seguiti da IgG anti-topo di capra coniugato con fluoresceina ha dato una forte immunof luorescenza superficiale su cellule infettate con i vaccinia virus ricombinanti, ma non in cellule infettate con vaccinia virus selvatico.

Valutazione in vivo del potenziale immunogenico di glicoproteine PRV gpll, gpIII e gp50 espresse da ricombinantl di vaccinla virus nel topo e nel maiale. Allo scopo di valutare la immunogenicìtà relativa delle tre glicoproteine PRV espresse da ricombinanti di vaccinia virus, si sono inoculati topi nella zampa con 50-100 microlitri di differenti dosi dei virus ricombinanti. 14 giorni dopo l'immunizzazione, i topi sono stati infettati con 10 LD del cepDO di Kojnock virulento di PRV per via intraperitoneale .

In esperimenti preliminari, ciascuna delle glicoproteine PRV si è dimostrata efficace nel proteggere topi inoculati contro un'infezione di PRV virulento. In una serie più estesa di esperimenti nei quali si utilizzano oltre 500 topi, si è valutata l'efficacia di ricombinanti vaccinici che esprimono glicoproteine ΡΠν. Si è calcolata la dose di vaccinazione che è in grado di proteggere 50% dei topi infettati e i risultati di questi studi sono riportati nella Tabella 8. Virus di vaccini ricombinanti che esprimono individualmente glicoproteine di PRV gpll, gp50 e gpIII generano valori calcolati rispettivamente di Quando le glicoproteine vengono espresse in combinazione, si calcolano valori notevolmente migliori. Il ricombinante vaccinico che esprime PRV gpll più gp50 ha generato un valore di 3,3, mentre il ricombinante vaccinico che esprime PRV gp50 più gpIII dà come risultato un valore P sostanzialmente simile (3,6). Evidentemente, è più efficace il ricombinante che esprime glicoproteine di PRV gpll più gpIII in cui si ottiene un

La coespressione di tutte e tre le glicoproteine di PRV gpll, gpIII e gp50 in un virus vaccinico ricombinante non realizza un valore notevolmente inferiore a quello ottenuto con i virus ricombinanti che esprimono singolarmente le tre glicoproteine PRV. L'efficacia potenziata ottenuta con il ricombinante vaccinico che esprime gpll e gpIII in confronto con il virus ricombinance vaccinico che esprime i geni singolarmente è simile ai risultati riportati nell'Isempio 6 per la coespressione di glicoproteine ci herpes virus equino gpl3 e SP14.

Tabella 8. Potenza di ricombinanti di-virus vaccinici che esprimono glicoproteine del virus della pseudorabbia gp50, gpll e gpIII.

Sebbene il topo possa costituire un interessante sistema modello per la valutazione della immunogenicità di glicoproteine PRV, la principale specie bersaglio di un vaccino PRV è il maiale.

Pertanto, allo scopo di valutare la validità dell’approccio di vaccinia virus ricombinanti nel maiale, si è effettuato l'esperimento che segue. Maialini aventi un peso di circa 25 kg sono stati inoculati per via intramuscolare con 2 mi di ricombinanti vaccinici che esprimono combinazioni delle glicoproteine PRV gpll, gpIII e gp50. Si è diluito l'inoculo virus in PBS. Trenta giorni dopo questa inoculazione, i maialini sono stati infettati iniettando per via intranasale (1 mi) in ciascuna narice) una sospensione di NIA3 isolato di PRV virulento. Si è valutata l'efficacia della vaccinazione misurando l'aumento di peso comparativo di maialini vaccinati e di maialini di controllo per 7 giorni dopo l'infezione. Si calcola l'aumento di peso relativo come l'aumento di peso percentuale medio giornaliero osservato in maiali vaccinati meno l’aumento di peso percentuale medio giornaliero di maiali di controllo non vaccinati. L'aumento di peso normale di maiali in condizioni non perturbate è superiore a 1,1 kg. Come dimostrato dai dati nella Tabella 9, lo sviluppo del peso durante il periodo di 7 giorni dopo l'infezione con PRV è notevolmente aumentato nei maialini vaccinati rispetto al gruppo di maialini di controllo inoculati con virus di tipo selvatico. Una singola inoculazione con i ricombinanti di vaccinia virus realizza una notevole protezione contro una perdita di peso dopo una infezione con PRV virulento.

Tabella 9. Valutazione di ricombinanti vaccinici che esprimono combinazioni di glicoproteine-PRV gp50,

La disponibilità di ricombinanti di vaccinia virus che esprimono le tre glicoproteine PRV dominanti, singolarmente, oppure in combinazione, offre numerosi vantaggi per il controllo di infezioni PRV nel settore: (a) un vantaggio notevole è costituito dal fatto che i vaccinia virus ricombinanti , come agenti di vaccinazione, esprimono soltanto un numero limitato di geni PRV e, pertanto, non si ha alcun rischio di reversione di un ceppo di vaccino PRV attenuato verso una forma virulenta e, pertanto, non si ha alcuna immissione continuata di virus PRV nell'ambiente,· (b) poiché soltanto un numero limitato di antigeni PRV sono espressi dai candidati di vaccino PRV ricombinanti di vaccinia virus, ciò consente la discriminazione di animali vaccinati nei confronti di animali infettati naturalmente, poiché reagenti diagnostici costituiti da altri antigeni PRV possono venire assemblati per effettuare una discriminazione tra animali vaccinati ed animali infettati naturalmente; e (c) tali vaccini ricombinanti possono essere utili nell'interrompere la trasmissione verticale naturale di PRV da una scrofa al suo neonato. Si può realizzare ciò mediante la vaccinazione della scrofa gravida con un ricombinante di vaccinia virus che esprime un gruppo separato di glicoproteine PRV. L'immunità materna proteggerà il figlio da una infezione PRV. A sua volta, il figlio verrà quindi vaccinato con un ricombinante di vaccinia virus che esprime ancora una configurazione differente di antigeni PRV diversi da quelli usati per vaccinare la scrofa. Questo è un metodo potenziale per interrompere l'immunità materna. Un altro approccio per indirizzare il manifestarsi di una immunità materna sarà di esprimere le glicoproteine PRV in qualsiasi combinazione, in un vettore completamente eterologo.

Si realizza ciò mediante la costruzione di'poxvirus di'uccelli che esprimono glicoproteine PRV. L'utilità di'poxvirus di uccelli

il cui spettro di infettività naturale è ristretto alle specie di uccelli, nella vaccinazione di specie costituite da non uccelli, è stata dimostrata (41).

Così, sono disponibili due approcci per indirizzare il manifestarsi della barriera fornita dell'immunità materna: (l) i vettori e (2) la costellazione degli antigeni espressi da detti vettori.

Esempio 11 - VETTORI AVIPOX CHE ESPRIMONO LA GLICO-PROTEINA DEL VIRUS DELLA PSEUDORABBIA gpll

Si è fatto propagare poxvirus del canarino su fibroplasti di embrione di pollo primari (CEF) ottenuti da uova embrionate di 10-11 giorni ottenute da SPAFAS, Ine. (Norwich, CT) adottando le condizioni precedentemente descritte (41,42). Il virus è stato purificato da contaminanti di cellule-ospite mediante centrifugazione a gradiente di saccarosio adottando il metodo descritto da Joklik(l91). Si sono ottenute cellule di rene di maiale (PK-1) dalla American Type Culture Collection, Rockville, MD

(ATCC CL101).

Costruzione di un ricombinante di poxyirus di canarino che esprime la glicoproteina gpll del virus della pseudorabbia .

Riferendosi ora alla Figura 26, si è utilizzato il plasmidepPRl5 (Figura 18) come sorgente del gene PRVgpII. Per isolare il segmento di DNA che contiene l'intero gene PRVgpII, si è fatto digerire pPRl 5 con EcoRV e con HindlII. Per effetto di questa digestione si è formato un frammento da circa 2,8 Kb contenente 21 bp dell'estremità 3' del promotore H& di vaccinia virus (VV) e l’intero gene PRVgpll. Si è isolato il frammento EcoRV/HindlII da 2,8 Kb per l'inserimento in pFPCV2 (FIGURE 8,26).

Si è inserito il frammento di EcoRV/HindlII da 2,8 Kb (definito sopra) nel frammento pFPCV2 da

8,0 Kb ottenuto mediante digestione completa con HindlII e mediante digestione parziale con EcoRV.

Il legame di questi due frammenti ha dato come risultato la formazione di un plasmide da 10,8 Kb denominato pFPPRVII.

Riferendosi ora alla Figura 27, si è utilizzato il plasmide pFPPRVII per formare un frammento di NruI/HindlII da 2,8 Kb per l'inserimento in

pCPCVl (Figura 9). Il plasmide pCPCVl contiene il promotore W H6 nell'unico sito EcoRI all'interno del frammento genomico PvuII CP da 3,3 Kb. Questo plasmide di inserimento consente 1<1 >inserimento di geni estranei nel sito C3 del genoma CP. Si è fatto digerire il plasmide pCPCVl con MruI e con HindlII

e si è isolato il frammento da 5,8 Kb per il legame al frammento da 2,8 Kb definito sopra. Il plasmide così ottenuto è stato denominato pCPPRVII.

Si è inserito il marcatore selezionabile dominante E. coli xantina-guanina fosforibosil transferasi (Eco gpt) in pCPPRVII come mezzo di selezione di

crescita per ricombinanti CP/PRVgpII.

Pubblicazioni precedenti hanno descritto l'uso di Eco gpt come marcatore selezionabile nella generazione di ricombinanti poxvirus (193,194). Si é ottenuto il gene Eco gpt dal plasmide pSV2gpt (ATCC 37145). Il frammento 670 bp BglII/Dral, contenente il gene Eco gpt é stato isolato da questo plasmide ed é stato inserito nel sito BglII/Smal di pSD486VC. Il plasmide così ottenuto pGPT-1, contiene il gene Eco gpt tra le braccia che fiancheggiano il gene VV u e sotto di regolazione di trascrizione del promotore u. Il plasmide pSD486VC é stato derivato da pSD478VC (figura 4) nel modo che segue. Si é fatto digerire pSD478VC con EcoRI nel MRC, riempito in reazione standard con Klenow in presenza di dNTP(0,5 mM ciascuno) e é stato sottoposto nuovamente a legatura per produrre pSD478E VC. Questo plasmide é stato fatto digerire con HpaI e

La digestione di pGPT-1 con NcoI e EcoRI ha liberato un frammento da 1,0 Kb contenente il gene Eco gtp (670 bp) e il promotore VV u (330 bp). Le estremità Ncol e EcoRI sono state smussate impiegando il frammento Klenow ottenuto da ONA-pol imerasi di E.Coli in presenza di 0,5 mM dNTPs. I HindlII linkers (Bethesda Research Laboratories, Bethesda, MD) sono stati aggiunti al frammento smussato all'estremità. Il DNA é stato sottoposto a digestione con Hind111 e il frammento da 1,0 Kb é stato ricuperato da un gel di agarosio. Questo frammento HindIII da 1,0 Kb é stato quindi inserito nel sito HindlII di pCPPRVII. Il plasmide ottenuto contenente i geni Eco gpt e PRVgpII legati in una configurazione coda a coda é stato denominato pCPPRVII gpt. Questo plasmide é stato usato in esperimenti di ricombinazione in vitro per l'inserimento nel locus C3 del genomato CP. La selezione di ricombinanti contenenti il gene Eco gpt é stata effettuata in presenza di 100 ug/ml di acido mucofenolico e i ricombinanti Eco gpt-positivi sono stati successivamente selezionati per la presenza del gene PRVgpII mediante analisi di ibridazione di placche. Le placche Eco gpt e PRV gplI-positive sono state purificate mediante tre cicli di isolamentodelie placche e popolazioni pure sono cresciute fino ad un titolo elevato e sono state denominate pCP55. Le analisi "blot" di Southern hanno confermato che questi due geni erano in effetti geneticamente collegati in questi ricombinanti CP. Il ricombinante lP é stato denominato vCP55.

Immunof1uorescenza di cellule infettate con vCP55 Si sono effettuati studi di immunofluorescenza per dimostrare la localizzazione cellulare del gpll di PRV espresso in cellule infettate con vCP55. Le cellule CEF o PK-1 sono state seminate in vetrini coprioggetti da 22 mm in piastre da 35 min in 5 x 10 celi ule/piastra . Le cellule CEF e PK-1 sono state infettate o con vCP55 oppure con il virus originario CP. Infezioni e incubazioni per il saggio di immunofl uorescenza sono state effettuate come descritto nell'esempio 1 impiegando un anticorpo monoclonale 7 5N10, diluito 1:100 in PBS+.

Le cellule infettate sono state analizzate sia per l'espressione interna che per l'espressione superficiale. Non si é osservata alcuna espressione superficiale significativa di gpll nell'uno o nell'altro sistema di cellule Infettate con vCP55. L'espressione interna del prodotto del gene gpll tuttavia é stato dimostrato sia nelle cellule CEF che nelle cellule PK-1 infettate con vCP55. I segnali di fluorescenza interna in entrambi i tipi di cellule sono stati localizzati in granuli nella regione perinucleare delle cellule infettate. Questi risultati suggeriscono che il PRVgpII espresso da CP viene spostato verso il complesso golgi ma non verso la membrana del plasma. Questo risultato differisce dai risultati con gp11 espresso da vaccinia-virus che era stato messo in evidenza sulla superficie di celle infettate.

Immunoprecipitazione di PRVgpII da cellule infettate di CEF e PK-1.

L'espressione del prodotto del gene PRVgpII mediante vCP55 é stata analizzata mediante immunoprecipitazione da U sati di cellule infettate. Monostrati di cellule sono stati infettati con 5 PFU/cellula. Il saggio di immunoprecipitazione é stato effettuato come descritto nell'esempio 1 impiegando un anticorpo monoclonale 75N10.

La specie di polipeptide prevalente é precipitata con siero anti-PRV di coniglio da cellule infettate di CEF e di PK-1 migrate con pesi molecolari apparenti di circa 120 kDa, 67 kDa, e 58 kDa. Questi polipeptidi rappresentano le forme precursori e proteoliticamente trattate,' rispettivamente, del PRVgpII rivelato nelle cellule infettate PRV che sono complessate con legami di disolfuro (86,101,196). Si sono anche osservate specie minori con pesi molecolari apparenti di circa 26 kDa e esse possono riflettere ulteriori eventi di processo proteolitico di gp11 in queste cellule infettate di ricombinanti CP-PRV. Non sono precipitati polipeptidi equivalenti da lisati di cellule infettate con virus CP di controllo e da lisati di cellule non infettate.

Studi di protezione. Si é analizzata, nel sistema topo, la possibilità che vCP55 provochi una risposta immunitaria protettiva nei confronti di una infezione PRV vivente. I topi sono stati inoculati nella zampa con campioni di 50 ul fino a 100 ul contenenti diversi dosaggi di vCP55 indicati nella tabella 10. 14 giorni dopo l'immunizzazione, ai topi sono state somministrate 16 DL50 del ceppo Kojnock di PRV per via intraperitoneale. Si sono contati i topi sopravvissuti 14 giorni dopo l'infezione e a questo punto si é concluso l'esperimento. Come indicato nella tabella 10, una inoculazione dei topi con una singola dose di ha protetto otto dei dieci topi da un'infezione letale di PRV. Le dosi inferiori di VCP55 sperimentate non hanno' realizzato alcun livello di protezione. Un'infezione con PRV vivente ha ucciso sette degli otto topi non vaccinati. Dai risultati riportati nella tabella 10, si é calcolato un valore PD50 (dose protettiva 50%) di per il ricombinante vCP55.

Si é inoltre valutata l'efficacia di vCP55 come agente immunizzante nei confronti di una infezione di PRV vivo nella specie bersaglio, ossia nel maialino. Si sono separati in tre gruppi 15 maialini aventi un peso di circa 25 Kg. Il gruppo vCP55 e il gruppo di virus CP dal quale esso deriva hanno ricevuto, ciascuno due inoculazioni (2 mi pari in corrispondenza del giorno 0 e del giorno 28 per via intramuscoiare. Cinque maialini sono stati lasciati come controlli non vaccinati. A tutti i maialini é stato somministrato il ceppo NIA3 patogeno di PRV per via intranasale in corrispondenza del giorno 35. Si é controllata l 'efficacia confrontando l 'aumento di peso di maialini vaccinati con vCP55 e di maialini di controllo durante i 7 giorni dopo l'infezione. L'aumento di peso viene calcolato come valori Delta GMQR (in chilogrammi) = porcellini vaccinati GMQR per 100 medio- porcellini non vaccinati GMQR per 100 medio.

Nel gruppo non vaccinato, tutti i porcellini sono morti in seguito all 'infezione con virus PRV (2 porcellini corrispondenza del giorno 5, 2 porcellini in corrispondenza del giorno 6, e 1 porcellino in corrispondenza del giorno 7). Nei gruppi inoculati con virus tipo selvatico (CP), quattro dei cinque porcellini sono morti in seguito all'infezione (tre in corrispondenza del giorno sei, uno in corrispenza del giorno sette). Tutti i porcellini nel gruppo vaccinato vCP55 sono sopravvissuti all'infezione PRV e sono cresciuti bene.

Si sono osservati livelli notevoli di protezione per porcellini inoculati con vCP55 che esprimono la glicoproteina PRVgpII nei confronti di un'infezione da PRV vivo (tabella 11). Gli animali vaccinati con vCP55 avevano un aumento di peso netto notevole rispetto al periodo sperimentale, mentre i due gruppi di controllo avevano una notevole perdita di peso rispetto al periodo che segue l'infezione PRV. Inoltre, non si sono osservate morti nel gruppo vaccinato con vCP55, mentre si é notato un grado di mortalità da 80% a 100% nei gruppi di controllo dopo l'infezione con PRV vivo.

Esempio 12. RICOMBINANTI VACCINICI CHE ESPRIMONO GLICOPROTEINE PRVgl

In questo esempio si sono utilizzati il ceppo Copenhagen di vaccinia virus e ricombinanti derivati da esso.

Clonazione del gene PRVgl in un pox virus del canarino e plasmidi donatori del vaccinia virus Riferendosi ora alla figura 28, si é ottenuto un plasmide pGPI contenente il gene PRVgl (ceppo NIA3) da Rhone Merieux, Lyon Francia). Si é isolato il gene gl (riferimento di sequenza (80)) da questo plasmide e lo si é clonato a valle del promotore H6 sintetico vaccinico (69). Si é effettuato ciò sottoponendo a clonazione il frammento (parziale) XhoI-Nco I da 2330 bp di pGPI nel frammento 6,400 bp XhoI-Nco I di PGBC2. (Si é generato pGBC2 sottoponendo a clonazione il gene HSV2gb nel frammento 3,200 bp Bgl11 di pRW764.5. Si é costruito pRW764,5 sottoponendo a clonazione un frammento Pvu11 da 0,8

Kb ottenuto da DNA di poxvirus di canarino nel fram-mento 2.360 bp Pvuli di pUCl8). Il plasmide generato con questa manipolazione viene denominato pPG12.

Il codone di inizio del promotore H6 é stato quindi allineato con il codone di inizio del gene di gl. Si é effettuato ciò sottoponendo a clonazione gli ollgonuc1eotidi

manipolazione viene denominato pPGI6.

Il gene gl attivato da H6 é stato quindi sottoposto a clonazione in un plasmide donatore di vaccinia virus. Si é effettuato ciò sottoponendo a clonazione il frammento 1,750 bp NruI-BamHI di pPG16 nel frammento 5,000 bp NruI-BamHI di pBP14. (pBP14 contiene il gene "gag" del virus della leucemia bovina sotto il controllo del promotore H6 vaccinico sintetico in un plasmide vettore vaccinico pSD494VC. pSD494VC é un subclone del virus vaccinico Copenhagen, frammento Hind111 A nel quale la sequenza codificante del gene vaccinico contenente omologia rispetto al gene ATI di vaiolo bovino (210) é sostituito da una regione di "polylinker".) Ciò pone il gene gl attivato da H6 tra le sequenze di vaccinia virus Copenhagen che fiancheggiano il gene ATI. Il plasmide generato da questa manipolazione viene denominato pPGI7.

Il vaccinia virus ricombinante vP717 é stato generato transinfettando pPG17 in cellule infettate con vP410.

Costruzione di vP717. Il gene gl di PRV é stato sottoposto a clonazione in un vettore di vaccinia virus. La strategia usata per costuire questo ricombinante di vaccinia virus, vP717, é delineata nella figura 28. Il gene PRV gl contenuto in vP717 viene clonato tra le sequenze di vaccinia virus che fiancheggiano il gene ATI e utilizza il promotore "early-late”, di vaccina virus H6 (41,42,69).

Immunofluorescenza del polipeptide codificato-PRV su cellule infettate con vP717 . In cellule infettate di PRV, il gl viene espresso sulla membrana del plasma. Analisi di immunofluorescenza di cellule infettate con vP717 con l'anticorpo monoclonale PRV gl-specifico, 42M17, indicano il polipeptide codificato PRV prodotto in queste cellule é anch'esso espresso sulla membrana nel plasma.

Valutazione di vP7T7 nel topo. Una valutazione in vivo di vP 717 nel topo ha indicato una certa protezione nei confronti di una infezione PRV (tabella 12) adottando procedimenti standard.

sempio 13 ESPRESSIONE DI GLICOPROTEINE gB. gC e gD DEI. VIRUS DELL HERPES SIMPEX TIPO 2 IN S COMBINANTI

DI VACCINIA VIRUS, INDIVIDUALMENTE OPPURE IN COMBINAZIONI

Il HSV2 (ceppo G) (American Type Culture Colìection, Bethesda, MD) (ATCC VR734) utilizzato in questo esempio é stato propagato in cellule VERO (ATCC CCL81) e é stato purificato mediante centrifugazione su un gradiente di saccarosio (197).

Clonazione del gene HSV2 gB in plasmidi

donatori di vaccinia virus.

La sequenza di nucletodi del gene HSV2 gB é

stata pubblicata precedentemente (116). Riferendosi

ora alla figura 29, si é isolato un frammento BglII

da 12 Kb contenente il gene HSV2 gB da DNA genomico di HSV2 (ceppo 6) e lo si é inserito nel sito BamHI

di pUC19 che genera il plasmide pJ4.

Il gene gB é stato quindi clonato tra braccia

fiancheggianti di vacciniavirus (Copenhagen). Si é

effettuato ciò sottoponendo a clonazione il ' frammento (parziale) 2,700 bp SstlllSacI di pJ4 nel

frammento SstlI-Sacl di pMP409DVC3. (pMP409DVC3 é un

derivato di pMP409DVC (184) (FIG 4) nel quale il

sito Bg 111 é sostituito con una regione di

"polylinkers"). Ciò pone il gene gB tra le sequenze vacciniche che fiancheggiano il gene M2L. Il plasmide generato da questa manipolazione viene denominato pGB1 .

Un codone di terminazione in-schema é stato quindi aggiunto all'estremità3' del gene gB. Si é effettuato ciò sottoponendo a clonazione gli oligonucleotidi GBL3 5 1--CTAATAG-31 e GBL4 51-GATCCTATTAGAGCT-31 nel frammento (parziale) 6,300 bp BamHI-SacI di pGBl. Il plasmide generato da questa manipolazione viene denominato pGB2.

Il promotore H6 é stato quindi clonato a monte del gene gB. Si é effettuato ciò sottoponendo a clonazione il frammento Bgl1I da 370 bp di pBLVH14 contenente il promotore H6 nel sito Bgl11 di pGB2 (pBLVHH contiene il gene di inviluppo del virus della leucemia bovino attivato da H6 nel sito di cancellazione di HA vaccinico). Il plasmide generato da questa manipolazione viene denominato pGB3.

Il codone di inizio del promotore H6 é stato quindi allineato con il codone di inizio del genegB. Si é effettuato ciò sottoponendo a clonazione gli oligonucleotidi, GBL15'-

nel frammento (parziale) SstlI-EcoRV da 6300 bp di pGB3. Il plasmide generato con questa manipolazione viene denominato pGB5. Nel plasmide pGB5, il gene HSVgB é sotto il controllo del promotore H6 vaccinico inserito nel sito di cancellazione M2L del vaccino. Poiché il sito di inserimento di M2L é situato all'interno di una regione più ampia del genoma che può venire cancellato, il gene gB attivato da H6 é stato clonato in un sito di inserimento diverso, in un differente plasmide donatore di vaccinia virus. Si é effettuato ciò sottoponendo a clonazione il frammento 2,800 bp Bgl11-BamHI di pGB5 nel sito Bgl1 1 di pS0513VCVQ. (pS0513VCVQ é un subclone del frammento Hind111 di vaccinia virus Copenhagen nel quale la sequenza che codifica per il gene timidina chinasi (TK) é sostituito con una regione di "polylinker " ) . Ci ò pone i l gene gB atti vato da H6 tra le sequenze di vaccinia virus che fiancheggiano il gene TK. Il plasmide generato con questa manipolazione viene denominato pGB6.

clonazione del gene HSV2 gC in plasmidi donatori di vaccinia virus.

La sequenza di nucleotidi del gene HSV2gC é stata determinata precedentemente (117). Riferendosi ora alla figura 30, un frammento 2,900 bp SaiI contenente il gene HSV2 gC é stato isolato da DNA genomico (ceppo G) HSV2 e é stato inserito nel sito Sali di pIB125 generando il plasmide pGC3.

Il gene gC é stato quindi clonato tra braccia affiancanti di vaccinia virus (copenhagen). Si é effettuato ciò sottoponendo a clonazione il frammento 2,900 bp Xhol-BamHI di PGC3 nel sito Xhol-BAMHI di pGC2. pGC2 é stato generato sottoponendo a clonazione il frammento 370 bp BglI di pBLVH14, contenente il promotore H6 di vaccinia virus nel sito Bglll di pSD486VC. pSD486VC é un subclone del frammento HindlII B di vaccinia virus Copenhagen nel quale la sequenza codificante del gene u é sostituita da una regione di "polylinker". Ciò pone il gene gC tra la sequenza di vaccinia virus che fiancheggia il gene u. Il plasmide generato con questa manipolazione viene denominato

pGC5.

Il codone di inizio del promotore H6 è stato quindi allineato con il codone d'inizio del gene gC. Ciò è stato realizzato mediante clonazione degli oligonucleotidi ,

GCL1 5'-

nel frammento Nrul-Sfil da 5400 bp di pGC5. ILpiasmide generato mediante questa manipolazione viene denominato pGCIO.

Una sequenza 3'-non codificante estranea è stata quindi eliminata da pGCIO. Ciò viene realizzato riavvolgendo il frammento (parziale) Sall-Smal da 4900 bp di pGCIO trattato con DNA polimerasi I (frammento di Klenow) di E. coli. Il plasmide generato mediante questa manipolazione viene denominato pGCll.

Una ulteriore sequenza 3'-non codificante è stata quindi eliminata da pGCll. Ciò è stato realizzato sottoponendo a clonazione l'oligonucleotide, GCL3 5 -CTAGGGCC-3', nel frammento (parziale) Xbal-Apal da 4900 bp di pGCll. Il plasmide generato mediante questa manipolazione viene denominato pGC12. Nel plasmide pGC12 il gene. gC di HSX è sotto il controllo del promotore H6 inserito nel locus di delezione u di vaccinia. Poiché il locus di inserzione u è situato all'interno di una regione più grande del genoma che può venire cancellata, il gene gC attivato con H6 è stato quindi clonato nel sipo di inserzione ATI in un plasmide donatore di vaccinia-virus. Ciò è stato realizzato sottoponendo a clonazione il frammento NruI- BamHI da 1550 bp di pGC12 nel frammento NruI-BamHI da 5000 bp di pBP14. Questo pone il gene gC attivato con H6 tra le sequenze di vaccinia-virus (Copenhagen) che fiancheggiano il gene ATI. Il plasmide generato mediante questa manipolazione viene denominato pGC13.

Clonazione del gene gD di HSV2 in plasmidi donatori di vaccinia-virus. La sequenza di nucleotidi per il gene gD di HSV2 è stata precedentemente determinata (118). Riferendosi ora alla figura 31, un frammento XbaI da 7,5 kb contenente il gene gD di HSV2 è stato isolato dal DNA genomico di HSV2 (ceppo G) ed è stato inserito nel sito XbaI di pIBI25 generando il plasmide pGDl.

Il gene gD è stato quindi clonato a valle del promotore H6 e tra le braccia a fianco di vaccinia-virus (Copenhagen). Ciò viene realizzato sottoponendo a clonazione il frammento Dral-PstI da 1500 bp di pGDl nel sito Smal-PstI di pTP15 (184) (fig.3). Ciò pone il gene gD a valle del promotore H6 e tra le sequenze di vaccinia-virus che fiancheggiano il gene HA. Il plasmide generato mediante questa manipolazione viene denomianto pGD2.

Il codone d'inizio del promotore H6 è stato quindi allineato con il codone d'inizio del gene gD. Ciò è stato realizzato sottoponendo a clonazione gli ol igonucleotidi GDL1 5'-

nel frammento Nael-PstI da 4800 bp di pGD5. Il plasmide generato mediante questa manipolazione viene denominato pGD7.

Una ulteriore sequenza è stata quindi aggiunta in 5' al promotore H6. Ciò viene realizzato clonando il frammento BglII-EcoRV da 150 bp di pGB6 (fig. 30) nel frammento BglII-EcoRV da 4800 bp di pGD7. Il plasmide generato mediante questa manipolazione viene denominato pGD8.

Costruzione di vaccinia-virus ricombinaitl. La strategia usata per clonare i geni gB, gC e gD di HSV2 nel vaccinia-virus viene delineata nelle figure rispettivamente 29, 30 e 31. Tutte le costruzioni utilizzano il promotore precoce-tardivo di vaccinia-virus H6 (41,42,184). Tuttavia ciascun gene HSV2 viene clonato in un sito differente nel genoma del vaccinia-virus. Il gene gB attivato da H6 viene clonato tra la sequenza che fiancheggia il gene M2L (vP569) oppure la sequenza che fiancheggia il gene TK (vP734, vP775 e vP776). Il gene-gC-attivato ocnH5viereclorato tra la sequenza che fiancheggia il gene μ (vP579) oppure la sequenza che fiancheggia il gene ATI (vp748, vP776 e vP777). Il gene gD attivato con H6 viene clonato tra la sequenza che fiancheggia il gene HA (vP570, vP761, vP775, e vP777). Il vaccinia-virus ricombirentl. vP569 è stato generato transinfettando pGB5 in cellule infettate con vP458. Il vP734 è stato generato transinfettando pGB6 in cellule infettate con vP618. Il vP579 è stato generato transinfettando pGCll in cellule infettate con vP533. Il vP748 è stato generato transinfettando pGC13 in cellule infettate con vP618. Il vP570 è stato generato transinfettando pGD5 in cellule infettate con vP425. Il vP761 è stato generato transinfettando pGD8 in cellule infettate con vP618.

Il vP425 è una variante del vaccinia-virus di tipo selvatico (Copenhagen) dal quale è stato cancellato il gene TK e il gene HA è stato sostituito con β-galat tosidasi (esempio 1) (184). Il vP458 è una variante di vaccinia-virus di tipo selvatico dal quale è stato cancellato il gene TK ed è stato sostituito il gene M2L con . B-galat-tosidasi (esempio 2). Il vP533 è una variante del vaccinia-virus del tipo selvatico dal quale è stato cancellato il gene TK ed è stato sostituito il gene u con β-galactosidasi. Il vP618 è una variante di vaccinia-virus di tipo selvatico dal quale sono stati cancellati i geni TK, u e ATI.

Si sono quindi costruiti vaccinia-virus ricombinanti contenenti 2 geni di glicolproteine di HSV2. Il vP775 contiene i geni gB e gD, vP776 contiene i geni gB e gC e vP777 contiene i geni gC e gD. Il vP775 è stato generato transinfettando pGD8 in cellule infettate con vP734. Il vP776 è stato generato transinfettando pGC13 in cellule infettate con vP734. Il vP777 è stato generato transinfettando pGD8 in cellule infettate con vP748.

Si è anche costruito un vaccinia-virus ricombiraite contenente 3 geni di glicoproteine di HSV2. vP812 contiene i geni gB, gC e gD di HSV-2. vP812 è stato generato transinfettando pGD8 in cellule infettate con vP776.

Immunof luorescenza di glicoproteine di HSV2 in cellule infettate di vaccinia-virus ricombinante· In cellule infettate di HSV2 gB, gC e gD (come anche altri glicoproteine codificate di HSV2) vengono espresse sulla membrana del plasma. Studi di immunofluorescenza effettuati su cellule infettate con i vaccinia-virus ricombinanti contenenti geni HSV2 indicano che i polipeptidi HSV2 prodotti in cellule infettate con questi vaccinia-virus ricombinanti vengono anche espressi sulla membrana piasmatica.

Immunoprecipitazione di glicoproteine HSV2 in cellule infettate con vaccinia-virus rlcombinanti. La glicoproteina . gB di HSV2 prodotta in cellule infettate di HSV2 ha un peso molecolare di circa 117 kDa (198,199). Le cellule infettate con vaccinia-virus ricombinanti contenenti il gene gB HSV2 (vP569, vP734, vP775 e vP776), producono anche un polipeptide codificato da HSV2 con un peso molecolare di circa 117 kDa. Una immunoprecipitazione di cellule infettate con vP569 con antisieri verso il virus HSV2 intero fà precipitare 2 proteine principali con pesi molecolari di circa 117 kDa e 110 kDa e 3 proteine minori con pesi molecolari di 50 kDa, 45 kDa e 30 kDa. La immunoprecipitazione di cellule infettate con vP734, vP775 e vP776 fà precipitare 2 proteine principali con pesi molecolari di circa 110 kDa e 90 kDa e 5 proteine minori con pesi molecolari di circa 117 kDa, 100 kDa, 50 kDa, 45 kDa e 30 kDa.

La glicoproteina gC di HSV2 prodotta in cellule infettate di HSV2 ha un peso molecolare di circa 63 kDa (199, 200). Le cellule infettate con vaccinia-virus ricombinanti contenenti il gene gC di HSV2 (vP579, vP748, vP776 e vP777) producono anche es.se un polipeptide codificato da HSV2 con un peso molecolare di circa 63 kDa. Una immunoprecipitazione di cellule infettate con vP579, vP748, vP776 e vP777 con antisieri verso il virus intero HSV2 fà precipitare una proteina principale con un peso molecolare di circa 65 kDa e una proteina minore con un peso molecolare di circa 85 kDa. Antisieri di coniglio contro il virus intero HSV2 è stato ottenuto dalla DAKO Corporation (Santa Barbara, CA; codice n. B116 ) ed è stato usato con una diluizione di 1:100.

La glicoproteina gD di HSV2 prodotta in cellule infettate con HSV2 ha un peso molecolare di circa 51 kDa (198,199). Le cellule infettate con vaccinia-virus ricombinanti contenenti il gene gD di HSV2 (vP570, vP761, vP775 e vP777) producono anche esse un polipeptide codificato da HSV2 con un peso molecolare di circa 51 kDa. Una immunoprecipitazione di cellule infettate con VP570, vP761, vP775 e vP777 con antisieri verso il virus intero HSV2 fà precipitare una proteina principale con un peso molecolare di circa 48 kDa e 2 proteine minori con pesi molecolari di circa 40 kDa e 31 kDa.

Valutazione in vivo. Tutti i vaccinia-virus ricombinanti che esprimono le diverse strutture di glicoproteine di HSV2 hanno protetto topi immunizzati da una successiva infezione letale con HSV2 in esperimenti simili a quelli descritti da Paoletti et al. (26).

donatori di vacoinia-virus . La sequenza di nucleotidi del gene gl di BHV1 è stata precedentemente pubblicata (63). Riferendosi ora alla figura 32 un plasmide pIBRS6 contenente il gene gl di BHV1 (geppo Straub) è stato ottenuto da Rhone Merieux, Lyon, France. L'estremità 5' del gene gl è stata clonata a valle del promotore H6 (41,42, 69) e tra le braccia che fiancheggiano 1 vaccinia-virus (Copenhagen). Ciò è stato realizzato sottoponendo a clonazione il frammento Sall-PstI da 540 bp di pIBRS6 nel frammento Sall-PstI da 4400 bp di pGD5 ( il pGD5 è stato generato sottoponendo a clonazione il gene gD di HSV2 in pflP 15 (184) (Fig.3).Ciò pone il gene gl a valle del promotore H6 e tra le braccia che fiancheggiano HA di vaccinia-virus. Il plasmide generato mediante questa manipolazione viene denominato pIBR2.

Il codone d'inizio del promotore H6 è stato quindi allineato con il codone di inizio del gene gl. Ciò è stato realizzato sottoponendo a clonazione gli oligonucleotidi ,

plasmide generato mediante questa manipolazione viene denominato pIBR4.

Si è quindi generato un sito Ncol necessario per le future manipolazioni. Ciò è stato realizzato sottoponendo a clonazione gli oligonucleotidi IBRL3 5'-CCATGGTTTAATGCA-3' e IBRL4 5'- TTAAACCATGGTGCA-3 nel sito PstI di pIBR4. Il plasmide generato mediante questa manipolazione viene denominato pIBR5.

L'estrenLtà 3' del-gene- g(è stata quindi sottoposta a clonazione in pIBRS. Ciò è stato realizzato sottoponendo a clonazione il frammento Tthllll-Ncol da 1740 bp di pIBRS6 nel frammento Tthllll-Ncol da 3700 bp di pIBR5. Il plasmide generato mediante questa meuiipoiazione viene denominato pIBR7.

Si è quindi generato un sito BglII necessario per le future manipolazioni. Ciò è stato realizzato sottoponendo a clonazione gli oligonucleotidi IBRL5 5 '-CATGGTTTAAGATCTC-3' e IBRL65'-CATGGAGATCTTAAAC-31, nel sito Ncol di pIBR7. Il plasmide generato mediante questa manipolazione viene denominato pIBR8.

Una porzione della sequenza leader idrofila lunga del gene gl è stata quindi cancellata (63). Ciò è stato realizzato sottoponendo a clonazione gli oligonucleotidi IBRL7 5'

3', nel frammento (parziale) Nrul-Apal da 4400 bp di pIBR8. Ciò elimina 132 bp della sequenza lea3⁄4r idrofila. Il plasmide generato mediante questa manipolazione viene denominato pIBR9.

Il gene gl tagliato attivato con H6 è stato quindi clonato in un differente plasmide donatore di vaccinia-virus. Ciò è stato realizzato sottoponendo a clonazione il frammento NruI-BglII da 1700 bp di pIBR9 nel frammento NruI-BamHi da 4900 bp di pBP14 (211). Il plasmide generato mediante questa manipolazione viene denominato pIBRIO.

Costruzione di vaccinia-virus ricombinanti. La strategia usata per clonare il gene gl di BHV1 in vaccinia-virus viene delineata nella figura 32. Il vaccinia-virus ricombinante vP637 è stato generato transinfettando pIBR7 in cellule infettate con vP410. Il vP724 è stato generato transinfettando pIBRIO in cellule infettate con VP410. Il vP637 contiene il gene gl intero di BHV1. Il vP724 contiene un gene gl cancellato di 132 bp della sequenza di segnale 5'-(73). In entrambe le costruzioni si è utilizzato il promotore precoce-tardivo di vaccinia-virus, H6 (41,42,184). Il gene gl in vP637 viene clonato tra le sequenze che fiancheggiano il gene HA. Il-gene-in vP724 viene clonato tra le sequenze che fiancheggiano il gene ATI.

Immunofluorescenza e rivelazione di un polipeptide codificato da BHVl-in cellule infettate di vaccinia-virus ricombinanti

In cellule infettate di BHV1 gl viene espresso sulla membrana del plasma. Studi di immunofluorescenza di cellule infettate con vP637 oppure vP724 indicano che il polipeptide codificato da BHV1 prodotto in queste cellule viene espresso anche esso sulla membrana del plasma. La immunofluorescenza è stata effettuata come descritto nell'esempio 1. Si sono usati gli anticorpi monoclonali gl-specifici di BHV1, 4203 e 5106 (201).

Esempio 15 - Espressione di una glicoproteina_ di virus HERPES felino gB in un ricombinante di virus vaccinico

In questo esempio si è utilizzato il ceppo WR di vaccinia-virus (202). Il ceppo WR derivato da vaccinia-virus ricombinante vP293 è stato usato come virus di recupero (69).

Estrazione di DNA di FHV-1 e clonazione del frammento da 3,2 Kb Sacl-Sacl di FHV-1. Il DNA di FHV-1 è stato estratto ed è stato purificato dal ceppo C 0. Il DNA-genoma dì FHV-1 è stato sottoposto a digestione con EcoRI ed è stato sottoposto a legatura nel plasmide pBR322 adottando procedimenti standard (20). Questa raccolta di FHV-1 è stata selezionata con sonde di DNA derivate dai geni PRVglI (62) e BHV-1 gB (203). Successive io.ridazioni con subcloni derivati dai due cloni EcoRI trovati positivi mediante ibridazione hanno consentito una più accurata mappatura del gene gB di FHV-1. Un frammento Sacl-Sacl da 3,2 Kb contenente il gene gB di FHV-1 è stato clonato in pUC18, generando così un plasmide pFHVgBC.

Analisi della sequenza del frammento Sacl-Sacl che codifica gB di FHV-1. I dati della sequenza di nucleotidi per entrambi i filamenti sono stati ottenuti pFHVgBC e da subcloni derivati da pFHVgBC impiegando la T7 sequenasi modificata come descritto sopra.

Clonazione del gene gB di FHV-1 in un plasmide donatore di vaccinia-virus . Riferendosi ora alla figura 33, il gene gB di FHV-1 è stato clonato in pHES4, uno dei plasmidi destinato al sistema di selezione dello spettro di infettività nel ceppo di vaccinia-virus WR (69) (fig.10). Questo plasmide porta il gene dello spettro di infettività K1L che consente che il mutante di delezione vP293 si replichi in cellule umane. Il gene gB di FHV-1 è stato inserito immediatamente a valle dal promotore H6 sintetico di vaccinia (69). Il plasmide pFHVgBC è stato sottoposto a digestioneocn Kpnl e Sacl e il frammento di restrizione da 3150 bp contenente FHV-1 gB è stato isolato da un gel di agarosio ed è stato sottoposto a ligatura nel plasmide pHES4 precedentemente sottoposto a digestione con Kpnl e Sacl.Il plasmide ottenuto è stato denominato pJCAOOl (fig. 33).

Analisi della sequenza di DNA del gene gB di FHV-1.

Riferendosi ora alla figura 34, l'analisi della sequenza di DNA ha messo in evidenza uno schema di lettura aperto che si estende dalle posizioni di nucleotidi da 337 fino a 3177. I segnali regolatori della trascrizione presunti sono stati trovati nella regione 5* rispetto al codone di inizio ATG in corrispondenza della posizione 337. Una zona TATA avente la sequenza AAATATAT (nucleotidi da 184 a 191) è stata localizzata BO nucleotidi a valle da una zona CAT presunta avente la sequenza GGTGAGTA. Un segnale di poliadenilazione AATAAA (nucleotidi da 3251 a 3256) è stato localizzato 50 nucleotidi a valle dal codone di terminazione TAA (nucleotidi da 3178 a 3180). Otto degli undici nucleotidi nella sequenza 5' TCATTCTAGCA 3' (nucleotidi da 200 a 210) sono complementari alla sequenza di RNA ribosomale 18S 3' AGGAAGGCGT 5' (61) e possono servire come sito di legame del ribosoma. Si è proposto un modello di scansione mediante il quale gli mRNA eucariotici iniziar» la traduzione (151, 155). Il contesto di sequenza intorno al codone di inizio proposto ATCATGT (nucleotidi da 334 a 340)siqualifica come contest di sequenza funzionale per l'inizio della traduzione di mRNA eucariotico. Lo schema di lettura aperto gB di FHV-1 codifica 947 amminoacidi con un peso molecolare calcolato di 106,2 kDa. Il contenuto G C è 45,8%.

Analisi della struttura della proteina gB di FHV-1 L'analisi della sequenza di amminoacidi ha messo in evidenza un certo numero di caratteristiche comuni alle glicoproteine associate con le membrane. Una regione che si estende dagli amminoacidi 23 fino a 73 aveva un andamento di proprietà idrofoba particolare e viene proposto per essere la sequenza di segnale (fig. 34). Riferendosi ora alla figura 35, vi è una sequenza idrofila lunga di 22 amminoacidi che precede la sequenza di segnale idrofoba lunga. Questa caratteristica è stata notata anche per il gene gli (PRV) della pseudorabbia (62), per il gene gl (BHV-1) del herpes virus-1 bovino (63) e per i geni gpl4 di herpes virus-1 equino (EHV-l) (71) e del herpes virus-4 equino (EHV-4) (72), i quali sono tutti anche gB-omologhi di HSV. Una regione idrofoba costituita da 42 amminoacidi (amminoacidi da 789 a 831) viene prevista per funzionare come settore di ancoraggio della transmembrana. Il settore citoplasmatico idrofilo contiene 116 amminoacidi. Vi sono 10 siti Asn-X-Thr/Ser (in cui X può essere qualsiasi amminoacido eccettuato la prolina) per una glicolsilazione N-legata potenziale (64), un sito essendo situato nella sequenza di segnale. Vi sono due siti di scissione proteolitica potenziali consegutivi e vicini (Arg-Arg-Ser) (posizioni da 504 a 506 e 516 a 518) identici a quelli presenti in PRVglI (94), VZV gpll e HCMV gB (71) e EHV-l gpl4 (71,72). L'andamento del carattere idrofobo della sequenza di amminoacidi di gB di FHV-1 viene mostrato nella figura 35.

Confronto della sequenza di amminoacidi di FHV-1 gB rispetto ad altre glicoproteine di herpes virus.

Il confronto della composizione di amminoacidi del gene gB di FHV-1 ha messo in evidenza una estesa omologia con le glicoproteine di altri herpes virus. Così il gB di FHV-1 è omologo a PRVglI (62), BHV-1 gl (63), virus zoster della varicella (VZV) gli (66,204), HSV-1 gB (67), HSV-2 gB (205), EHV-1 gpl4 (71), e anche alle glicoproteine nel virus Epstein-Barr (EBV) (68,206) e al citomegalovirus-mano (HCMV) (10).

Costruzione del rlcombinante vaccinico vP713 che esprime la glicoproteina gB di FHV-1.

Le sequenze che codificano gB di FHV-1 sono state inserite in un vettore di vaccinia-virus impiegando il sistema di selezione dello spettro di infettività di vaccinia-virus WR pHES4/vP293 (69). La capacità della discendenza di vaccinia ricombinante generata mediante ricombinazione impiegando il sistema di selezione dello spettro di infettività vP293/pHES di vaccinia-virus WR per formare placche su cellule umane MRC-5 consente una rapida identificazionediqjesti ricombinanti (69). Il ricombinante di vaccinia-virus vP713 è stato ottenuto mediante ricombinazione effettuata con un plasmide pJCAOOl come plasmide donatore e vP293 come virus di ricupero (fig. 33).

Immunofluorescenza di una glicoproteina gB di FHV-1 sintetizzata con vP713. La immunofluorescenza di cellule VERO e MRC-5 infettate con vaccinia-virus ricombinante vP713 è stata effettuata come descritto nell'esempio 1, impiegando un siero di pecora specifico anti gB di FHV-1. Si è adottata una molteplicità di infezione di 2pfu per cellula. Come secondo anticorpo si è usato un IgG anti pecora di scimmia FITC.

Il FHV-1 gB era rivelabile sulla superficie delle cellule VERO infettate con vaccinia-ricombinante vP713 e anche internamente dopo fissaggio con acetone. Non si è vista alcuna immunoreattività interna oppure superficiale significativa verso FHV-1 gB in cellule di controllo infettate con vP410.

Immunoprecipitazione di una glicoproteina gB di FHV-1 sintetizzata con vP713.

Allo scopo di esaminare la glicoproteina gB di FHV-1 espressa da vP713, cellule VERO sono state infettate con vP713 e proteine sono state marcate in modo metabolico con S metionina. Si sono effettuate immunoprecipitazioni con i U sati di cellule radiomarcati impiegando un siero di capra specifico anti-gB di FHV-1 #2854.

Monostrati di cellule VERO seminati in una quantità di 2 x 10^ cellule per piastra da 60 mm sopo stati infettati in corrispondenza di una bassa molteplicità di infezione di 0,1 pfu per cellula con vaccinia-virus di controllo (vP410) oppure con vaccinia-virus ricombinante vP713. Si sono effettuate immunoprecipitazioni come descritto nell'esempio 1.

Non sono stati immunoprecipitati prodotti significativi con il siero specifico anti-gB di FHV-1 o dalle cellule VERO non infettate oppure dalle cellule VERO infettate con il vaccinia-virus di controllo vP410. I prodotti radiomarcati gB di FHV-1 sono stati fatti precipitare con il siero #2854 ottenuto da cellule VERO infettate con vP713. Sono precipitati in modo specifico 5 polipeptidi radiomarcati in modo metabolico dominanti. I due polipeptidi più grandi di pesi molecolari apparenti 115 kDa e 110 kDa, potevano corrispondere a proteine precursori immature non glicosilate ( dimensioni teoriche rispettivamente di 106 kDa e 98 kDa). Una banda larga in corrispondenza di 68 kDa potrebbe rappresentare le due subunità glicosilate (69 kDa 66 kDa) che risultano dalla scissione proteolitica di un precursore glicosilato (136 kDa) che qui è mancante. Tre prodotti precipitati più piccoli (59,53 e 48 kDa) non corrispondono a prodotti noti di gB di FHV-1 e possono rappresentare prodotti di degradazione.

esempio, si sono isolati i geni EBV dal ceppo B95-8 EBV (207), i geni gp340 e gp220 erano cloni di cDNA (rispettivamente, plasmide pMLPgp340 e plasmide pMLPgp220), e i geni gB, gH e BBRF3 sono stati isolati da una banca di geni BamHl. Referendosi ora alla FIG. 36, un frammento 2100 bp Xmal-Clal di plasmide pMLPgp220 è stato clonato in M13mpl8 fatto digerire con Xmal-AccI . Il fago ottenuto con questa manipolazione è stato denomianto mpl8gp220 (FIG. 36). Mediante mutagenesi in vitro (17) usando gli oligonucleotidi CM4

il gene gp220 è stato modificato in modo da venire espresso sotto il controllo del promotore H6 vaccinico. Il plasmide contenente il gene gp220 modificato è stato denominato mpl8gp220(5+4) (FJIG. 36).

Il gene gp220 modificato è stato clonato nel plasmide SP131NotI che contiene il promotore sintetico H6 completo (69). Si è effettuato ciò sottoponendo a clonazione il frammento 2300 bp Narl-EcoRV di mpl8gp220( 5+4) nel frammento 2940bp EcoRV-Narl del plasmide SP131NotI. Il plasmide ottenuto è stato denominato SP131gp220 (FIG.36).

Il gene gp340 sotto il controllo del promotore H6 è stato ottenuto sottoponendo a clonazione un frammento 2360 bp Scal-Xhol di pMLPgp340 nel plasmide SP131gp220 digerito (parziale) Xhol-Scal.

Il plasmide ottenuto è stato denominato SP131gp340 (FIG.36) .

I geni gp340 e gp 220 attivati da H6 sono stati clonati nel plasmide pMP409DVC del sito di inserimento M2L divaccinia virus (FIG.4; nelle FIGURE 36, 40 questo plasmide viene denominato MP409). Si è effettuato ciò sottoponendo a clonazione il frammento Noti trattato con nucleasi di Mung-Bean da 2800 bp del - plasmide SP131gp340 e il frammento Noti trattato con nucleasi di Mung-Bean da 2100 bp del plasmide SP131gp220 nel sito trattato con nucleasi BglII Mung-Bean del plasmide pMP409DVC.

I plasmidi così ottenuti sono stati denominati, rispettivamente, 409H6340 e 409H6220 (FIG.36).

Clonazione del gene EBV gB nel plasmide pMP409DVC donatore di vaccinia virus. Riferendosi ora alla FIG. 37, si è isolato un frammento 3500 bp EciRI-XmnI del frammento EBV DNA BamHI A (207), contenente il gene EBV gB dalla teca genomica EBV e lo si è sottoposto a clonazione ottenendo il frammento HincII-EcoRI da 2837 bp di pIBI25.

Il plasmide così ottenuto è stato denominato p25gB (FIG . 37).

Mediante mutagenesi in vitro (17,185) usando gli oligonucleotidi EBVBM5

il gene gB è stato adattato per venire espresso sotto il controllo del promotore H6 vaccinico. Il plasmide ottenuto è stato denominato p25gB(5+3).

Il frammento EcoRV-EcoRI da 2600 bp di p25gB(5+3) è stato clonato nel frammento 3300 bp EcoRV-EcoRI di SP131. Il plasmide ottenuto è stato denominato SP131gB (FIG.37).

Il gene gB promotore H6 è stato quindi clonato nel <' >plasmide pMP409DVC donatore di vaccinia virus. Si è effettuato ciò sottoponendo a clonazione il frammento trattato con nucleasi 2700 bp HindlII Mung-Bean di SP131gB nel sito trattato con nucleasi BglII Mung-Bean di pMP409DVC. Il plasmide ottenuto è stato denominato 409H6gB (FIG. 37).

Clonazione del gene EBV gH nel plasmide donatore vaccinico pSD486VC. Nella teca di frammenti di restrizione clonati EBV BamHI, lo schema di lettura aperto BXLF2 è contenuto nei frammenti BamHI X e

BamHI T (207. Come indicato nella FIG . 38, lo schema di lettura aperto BXLF2 completo è stato ricostituito sottoponendo a clonazione il frammento

830 bp Smal-BamHI di BamHI X nel frammento 2880 bp Smal-BamHI di pIBI <'>24; il plasmide così ottenuto è stato denominato 24gH5. Il frammento 1850 bp BamHI-HindlII di BamHI? è stato clonato nel frammento BamHI -Hindi II da 3660 bp di 24gH5. Il plasmide ottenuto contenente il gene gH completo è stato denominato 24gH (FIG. 38).

Mediante mutagenesi in vitro ( (17,185) usando gli oligonucleotidi

il gene gH è stato modificato per venire espresso sotto i controllo del promotore precoce (^u) emorragico vaccinico. L oligonucleotide HM4 è stato usato per rimuovere un segnale di arresto di trascrizione precoce vaccinico contenuto nel gene gH (45). Il plasmide contenente il gene gH modificato è stato denominato 24gH( 5+4+3).

Riferendosi ora alla FIG. 38, il promotore u vaccinico è contenuto nel plasmide pSD486 VC

(FIG. 30). (Nella FIG. 38, questo plasmide viene denominato SD486. Il frammento trattato con nucleasi 2130 bp BglII Mung Bean di 24gH(5+4+3) è stato clonato nel pSD486VC trattato con nucleasi di Mung-Bean BglH quest'ultimo stadio di clonazione ha posto il gene gH sotto il controllo del promotore u vaccinico. Il plasmide generato con questa manipolazione è stato denominato 486gH (FIG. 38).

Clonazione dello schema di lettura aperto BBRF3 . nel - __ plasmide pC0PSC-5H. Lo schema di lettura aperto BBRF3 completo è contenuto nel frammento BamHI B del EBV DNA. Questo frammento è stato fatto digerire con BspHI, trattato con la DNA polimerasi I . di E. Coli (frammento di Klenow) e è stato fatto digerire con BglIII. Il sito di BglII all'interno del frammento BamH33⁄4 è situato 10 basi prima del codone di arresto BB.RF3. Il frammento 1230 bp BspHI-BglII è stato isolato e clonato nel frammento 4200 bp Smal-BglII del plasmide pC0PSC5H. (Il plasmide pC0PCS-5H è identico al plasmide pC0PCS657 (FIG.16)). Il plasmide generato con questa manipolazione è stato denominato COPSCEBVX.

Clonazione dei geni EBV gp340, gB e gH

nel plasmide donatore di vaccinia virus pSD513VCV0.

Il plasmide donatore di vaccinia virus usato per generare il ricombinante EBV triplo era il plasmide pSD513VCV3⁄4 (FIG. 29). Questo plasmide contiene un subclone del frammento HindlII J di vaccinia virus Copenhagen nel quale la sequenza codificante per il gene timidina chinasi è sostituito da una regione di "polylinker.

In un primo stadio, il gene EBV gH attivato da ^u è stato clonato . in pSD513VCVQ. In particolare, il frammento 2300 bp SnaBI-BglII di 486gH è stato clonato nel frammento 4000 bp Smal-BglII di pSD513VCVQ. Il plasmide generato con questa manipolazione è stato denominato 513UgH.

Successivamente, il gene EBV gp340 attivato da H6 è stato clonato in 513gH .. In particolare il,frammento trattato con 2800 bp Noti Mung-Bean di SP131gp340 è stato clonato nel frammento di 513UgH trattato con nucleasi 6300 bp Xhol-PstI Mung-Bean. Il plasmide generato con questa manipolazione è stato denorrdnato 513UgH340H6.

Quindi, il gene EBV gB attivato da H6 è stato clonato in 513UgH340H6. In particolare, il frammento di SP131gp340 trattato con nucleasi HindlII Mung-bean da 2700 bp è stato clonato nel frammento di 513HgH340H6 trattato con nucelasi 9100 bp Bglll Mung-bean. Il plasmide ottenuto è stato denominato 513gHgBgp340 (FIG.39).

Costruzione di vaccinia virus ricombinante. Si sono ricombinati EBV gp340 (plasmide donatore 409H 6340), EBV gp220 (plasmide donatore 409H6220),e EBV gB (plasmide donatore 409H6gB) nel vaccinia virus vP458 (sito M2L): questi ricombinanti di vaccinia virus singoli vengono denominati, rispettivamente, vP474, vP480 e vP561. EBV gH (plasmide donatore 486gH) è stato ricombinato nei vaccinia virus vP533 (^u sito di inserimento): questo ricombinante di vaccinia virus singolo viene denominato vP611.

Da ultimo, si è ottenuto il ricombinante di vaccinia virus triplo contenente gp340, gB e gH ricombinando il plasmide donatore 513gHgBgp340 nel vaccinia virus vP617 in corrispondenza del sito di inserimento della timidina chinasi. Questo virus ricombinante viene denominato vP712. vP617 è un vaccinia virus Copenhagen cancellato per i geni TK, HA e ATI.

Immunofluorescenza di proteine EBV in cellule infettate con vaccinia virus ricombinante. Studi di immunofluorescenza effettuati su cellule infettate con vP474 (gp340) e vP480 (gp220) usando 1'anticorpo monoclonale F29-89 (165) hanno mostrato le proteine EBV gp340 e EBV gp220, espresse sulla membrana del plasma.

Cellule infettate con vP611 (gH), usando un siero umano, hanno presentato un segnale positivo debole sulla membrana del plasma.

Da ultimo, si è effettuato il medesimo esperimento con cellule infettate con vP712 (ricombinante vaccinico EBV triplo): si è ottenuto un segnale positivo sulla membrana del plasma con gli anticorpi monoclonali F29-89 e NEA 9247 (specificità gB ottenuta da DuPont).

Immunoprecipitazione di proteine EBV in cellule infettate con vaccinia virus ricombinante., La glicoproteina EBV gp340 prodotta in cellule infettate EBV ha un peso molecolare di circa 340 kDa (165). Cellule infettate con i vaccinia virus ricombinanti vP474 oppure vP712 hanno prodotto anch'esse una proteina codificata EBV di circa 340 kDa (immunoprecipitazione effettuata con 1*anticorpo monoclonale F29-89). La glicoproteina EBV gp220 ha un peso molecolare di 220 kDA (165). Le cellule infettate con il virus vaccinia ricombinante vP480 producono una proteina codificata EBV di circa 220 kDa.

La glicoproteina EBV gB prodotta in cellule infettate EBV ha un peso molecolare di 110 kDa fino a 125 kDa con una forma precursore di 93 kDa (206,208). Le cellule infettate con i vaccinia virus ricombinanti vP561 oppure vP712 producono una proteina principale EBV con un peso molecolare di circa 125 kDa e quattro proteine minori con pesi molecolari di circa 80 kDa, 60 kDa, 50 kDa e 45 kDa.

La glicoproteina EBV gH prodotta in cellule infettate EBV ha un peso molecolare di 85 kDa con una forma di precursore di 70 kDa (209). Cellule infettate con il virus ricombinante vP611 producono una proteina codificata EBV di circa 85 kDa.

Immunizzazione di conigli con ricombinanti vaccinici che esprimono glicoproteine EBV. Si sono immunizzati conigli con VP474 (gp340) oppure vP480 (gp220) oppure vP561 (gB) oppure vP611 (gH) oppure vP712 (triplo). Dopo un "boost" i sieri sono stati esaminati mediante immunofluorescenza su cellule B95-8 trattate con TPA. In ciascun caso, si sono ottenuti segnali positivi. Si è messa in evidenza l'attività neutralizzante in vitro usando i sieri stimolati contro vP474 (gp340).

Esempio 17 - CLONAZIONE ED ESPRESSIONE DI ANTIGENI DI GLICOPROTEINE DI CITOL GALOVIRUS

UMANO IN VETTTORI DI POXVIRUS

Clonazione del gene HCMV gB nel plasmide donatore vaccinico pMP409DVC. Referendosi ora alla FIG. 40, il frammento 4800 bp HindlII -BamHI del frammento HindlII D del HCMV DNA è stato clonato nel frammento Hindlll-BamHI da 2800 bp del plasmide pIBI24. Mediante mutagensei in vitro (17,185) usando gli oligonucleotidi ,

il gene HCMV gB è stato modificato per venire espresso sotto il controllo del promotore H6 vaccinico. IL plasmide contenente il gene HCMV gB modificato è stato denominato 24CMVgB(5+3) (FIG. 40).

Successivamente, il frammento EcoRV-BamHI da 290bp di 24CMVgB(5+3) è stato clonato nel frammento 3100 bp EcoRV-BglII di plasmide ;pSP131che contiene il promotore H6 sintetico (69). Questo stadio di clonazione ha posto il gene HCMV gB sotto il controllo del promotore H6 vaccinico. Il plasmide ottenuto è stato denominato SP131gB.

Da ultimo, il gene HCMV gB attivato da H6 è stato clonato nel plasmide donatore vaccinico pMP409DVC. Il frammento di SP131gB trattato con nucleasi 3000 bp HindlII Mung Bean è stato clonato nel sito di pMP409DVC trattato con nucleasi BglII Mung Bean. Il plasmide ottenuto è stato denominato 409CMVgB (FIG.40).

Costruzione di vaccinia virus ricombinante· Il gene CMV gB attivato da H6 nel plasmide 409CMVgB è stato inserito nel sito M2L del virus vP458 di recupero.Il vaccinia virus ricombinante è stato denominato vP525.

Immunofluorescenza_ di proteina CMV gB in cellule infettate con vaccinia virus ricombinante.

Studi di immunofluorescenza effettuati su cellule infettate con vP525 usando un anticorpo monoclonale oppure un siero policlonale di porcellino d'india hanno messo in evidenza HCMV gB espresso sulla membrana del plasma.

Immunoprecipitazione di CMV gB in cellule infettate con vaccino rlcombinante. La glicoproteina CMV gB prodotta in cellule infettate CMV ha ‘un peso molecolare 55 kDa con una forma precursore di 130 kDa (172). Cellule infettate con vP525 hanno prodotto due proteine codificate CMV gB di circa 130 kDa e 55 kDa.

Sequenze di nucleotidi di HXLF1 e HXLF2. La famiglia di geni HXLF è localizzata nel frammento Hindi II X del DNA genomico HCMV (172). Usando inneschi di oligonucleotidi specifici, si sono determinati le sequenze di nucleotidi di HXLF1 e di HXLF2 ( FIGURE 41,42). HXLF1 è lungo 648 nucleotidi e codifica per una proteina di 215 amminoacidi. HXLF2 è lungo 558 nucleotidi e codifica per una proteina di 185 amminoacidi. Le sequenze di nucleotidi dei medesimi geni (ceppo AD169 HCMV) sono state pubblicate (173) e studi di confronto presentano una omologia al 99% per HXLF1 e una omologia al 96% per HXLF2.

Immunizzazione di porcellini d'india con ricombinanti vaccinici che esprimono antigenl HCMV. Tre porcellini d'india sono stati immunizzati con vP525. Dopo un rinforzo ("boost"), gli animali hanno sviluppato anticorpi neutralizzanti HCMV (titolo medio 518). E' interessante notare che 50% fino a 87% dell'attività neutralizzante di sieri umani sieropositivi HCMV può venire assorbito da cellule infettate vP525. Questo risultato indica l'importanza potenziale di HCMV gB come un vaccino di sottounità.

Claims (52)

1. RIVENDICAZIONI 1. Poxvirus ricombinante contenente DNA da herpesvirus equino in una regione non essenziale del genoma del poxvirus.
2. 2. Poxivurs ricombinante come rivendicato nella rivendicazione 1, nel quale detto DNA codifica per una glicoproteina di herpesvirus equino.
3. 3. Poxvirus ricombinante come rivendicato nella rivendicazione 2 nel quale detta glicoproteina di herpesvirus equino é una glicoproteina di herpesvirus equino gpl3.
4. 4. Poxvirus ricombinante come rivendicato nella rivendicazione 2 nel quale detta glicoproteina di herpesvirus equino é una glicoproteina di herpesvirus equino gp14.
5. 5. Poxvirus ricombinante come rivendicato nella rivendicazione 1 nel quale detto DNA codifica per due glicoproteine di herpesvirus equino.
6. 6. Poxvirus ricombinante come rivendicato nella rivendicazione 5 nel quale dette glicoproteinedi herpesvirus equino sono glicoproteina di herpesvirus equino gp13 e glicoproteina di herpesvirus equino gp14.
7. 7. Poxvirus ricombinante come rivendicato nella rivendicazione 1 nel quale detto DNA é espresso in un ospite mediante la produzione di una glicoproteina di herpesvirus equino.
8. 8. Poxvirus ricombinante come rivendicato nella rivendicazione 7 nel quale detta glicoproteina di herpesvirus equino é glicoproteina di herpesvirus equino gp13.
9. 9. Poxvirus ricombinante come rivendicato nella rivendicazione 7 nel quale detta glicoproteina di herpesvirus equino é glicoproteina di herpesivurs equino gp14.
10. 10. Poxvirus ricombinante come rivendicato nella rivendicazione 1 nel quale detto DNA é espresso in un ospite mediante la produzione di due glicoproteine di herpesvirus equino.
11. 11. Poxvirus ricombinante come rivendicato nella rivendicazione 10 nel quale dette glicoproteine di herpesvirus equino sono glicoproteina di herpesvirus equino gpl3 e glicoproteina di herpesvirus equino gp14.
12. 12. poxvirus ricombinante come rivendicato * nella rivendicazione 1 nel quale il poxvirus é un vaccinia virus.
13. 13. Poxvirus ricombinante come rivendicato nella rivendicazione 1 nel quale il poxvirus é un poxvirus degli uccelli.
14. 14. Poxvirus ricombinante come rivendicato nella rivendicazione 13 nel quale il poxvirus degli uccelli é scelto dal gruppo costituito da poxvirus dei polli e da poxvirus dei canarini.
15. 15. Poxvirus ricombi nante come rivendicato nella rivendicazione 1 nel quale detto DNA viene introdotto in detto poxvirus mediante ricombi nazione .
16. 16. Poxvirus ricombi nante contenente DNA proveniente da herpesvirus equino e da un promotore per esprimere detto DNA.
17. 17. Vaccino per provocare una risposta immunologica in un animale ospite inoculato con detto vaccino, detto vaccino comprendendo una sostanza-veicol o e un poxvirus ricombinante contenente, in una sua regione non essenziale, DNA derivato da herpesvirus equino.
18. 18. Vaccino come rivendicato nella rivendicazione 17 nel quale detto DNA codifica e esprime una glicoproteina di herpesvirus equino.
19. 19. Vaccino come rivendicato nella rivendicazione 18 nel quale detta glicoproteina di herpesvirus equino é glicoproteina di herpesvirus equino gpl3.
20. 20. Vacci no come rivendicato nella rivendicazione 18 nel quale detta glicoproteina di herpesvirus equino é glicoproteina di herpesvirus equino gp14.
21. 21. Vaccino come rivendicato nella rivendicazione 17 nel quale detto DNA codifica ed esprime due glicoproteine di herpesvirus equino.
22. 22. Vaccino come rivendicato nella rivendicazione 21 nel quale dette glicoproteine di herpesvirus equino sono glicoproteina di herpesvirus equino g p13 e glicoproteina di herpesvirus equino gp14 .
23. 23 Vacci no come rivendicato nella rivendicazione 17 nel quale il poxvirus é un vaccim a virus.
24. 24. Vaccino come rivendicato nella rivendicazione 17 nel quale il poxvirus é un poxvirus degli uccelli.
25. 25. Vaccino come rivendicato nella rivendicazione 24 nel quale il poxvirus degli uccelli é scelto dal gruppo costituito da poxvirus dei polli e da poxvirus dei canarini.
26. 26. Vaccino come rivendicato nella rivendicazione 17 nel quale detto DNA viene introdotto in detto poxvirus medi ante ricombi nazione
27. 27. Poxvirus ricombinante contenente DNA proveniente da herpesvirus in una regione non essenziale del genoma di poxvirus.
28. 28. Poxvirus ricombinante come rivendicato nella rivendicazione 27 nel quale detto herpesvirus é un membro di una sottofamiglia di herpesvirus scelto dal gruppo costituito da alfa-herpesvirus, beta-herpesvirus e gamma-herpesvirus.
29. 29. Poxvirus ricombinante come rivendicato nella rivendicazione 28 nel quale detto herpesvirus é scelto dal gruppo costituito da herpesvirus equino, virus della pseudorabbia, herpesvirus simplex, herpesvirus bovino, herpesvirus dei gatti, virus di Epstein-Barr e citomegaiovirus umano.
30. 30. Poxvirus ricombinante come rivendicato nella rivendicazione 27 nel quale detto DNA codifica per una glicoproteina di herpesvirus.
31. 31. Poxvirus ricombinante come rivendicato nella rivendicazione 30 nel quale detta glicoproteina di herpesvirus é scelta dal gruppo costituito da herpesvirus equino gpl3, herpesvirus equino gpl4, herpesvirus equino gD, herpesvirus equino gp63, herpesvirus equino gE, virus della pseudorabbia gpBO, virus della pseudorabbia gpll, virus della pseudorabbia gpIII, virus della pseudorabbia gpl, herpesvirus simplex gB, herpesvirus simplex gC, herpesvirus simplex gD, herpesvirus bovino gl, herpesvirus felino gB, virus di Epstein-Barr gp220, virus di Epstein-Barr gp340, virus di Epstein-Barr gB, virus di Epstein-Barr gH e ci tomegai ovi rus umano gB;
32. 32. Poxvirus ricombinante come rivendicato nella rivendicazione 27 nel quale detto DNA codifica per almeno due glicoproteine di herpesvirus.
33. 33. Poxvirus ricombinante come rivendicato nella rivendicazione 27 nel quale detto DNA é espresso in un ospite mediante la produzione di una glicoproteina di herpesvirus.
34. 34. Poxvirus r i combi nante come rivendicato nella rivendicazione 33 nel quale detta glicoproteina di herpesvirus equino é scelta dal gruppo costituito da herpesvirus equino g p 13 , herpesvirus equino gpl4, herpesvirus equino gD, herpesvirus equino g p 63 , herpesvirus equino gE, virus della pseudorabbia gp50, virus della pseudorabbia gpll, virus della pseudorabbia gplll, virus della pdeudorabbia gpl, herpesvirus simplex gB, herpesvirus simplex gC, herpesvirus simplex gD, herpesvirus bovino gl, herpesvirus felino gB, virus di Epstain-Barr g p 220 , virus di Epstein-Barr gp340, virus di Epstain-Barr gB, virus di Epstein-Barr gH e citomegaiovirus umano gB.
35. 35. Poxvirus ricombinante come rivendicato nella rivendicazione 27 nel quale detto DNA viene espresso in un ospite mediante la produzione di almeno due glicoproteine di herpesvirus.
36. 36. Poxvirus ricombinante come rivendicato nella rivendicazione 27 nel quale il poxvirus é un vacciniavirus.
37. 37. Poxvirus ricombinante come rivendicato nella rivendicazione 27 nel quale il poxvirus é un poxvirus degli uccelli.
38. 38. Poxvirus ricombinante come rivendicato nella rivendicazione 37 nel quale il poxvirus degli uccelli é scelto dal gruppo costituito da poxvirus dei polli e dal poxvirus dei canarini.
39. 39. Poxvirus ricombinante come rivendicato nella rivendicazione 27 nel quale detto DNA viene introdotto in detto poxvirus mediante ricombinazione.
40. 40. Poxvirus ricombinante contenente DNA da herpesvirus e un promotore per esprimere detto DNA.
41. 41. Vaccino per produrre una risposta immunologica in un animale ospite inoculato con detto vaccino, detto vaccino comprendendo una sostanza-veicolo ed un poxvirus ricombinante che contiene, in una sua regione non essenziale, DNA ottenuto da herpesvirus.
42. 42. Vaccino come rivendicato nella rivendicazione 41 nel quale detto herpesvirus é un membro di una sottofamiglia di herpesvirus scelto dal gruppo costituito da alf a-herpevirus, beta-herpesvirus , e gamma-herpesvirus.
43. 43. Vaccino come rivendicato nella rivendicazione 42 nel quale detto herpesvirus é scelto dal gruppo costituito da herpesvirus equino, virus della pseudorabbia, herpesvirus simplex, herpesvirus bovino, herpesvirus felino, virus di Epstein-Barr e citomegaiovirus umano.
44. 44. Vaccino come rivendicato nella rivendicazione 41 nel quale detto DNA codifica ed esprime una glicoproteina di herpesvirus.
45. 45. Vaccino come rivendicato nella rivendicazione 44 nel quale detta glicoproteina di herpesvirus é scelta dal gruppo costituito daherpesvirus equino gp13, herpesvirus equino gp14, herpesvirus equino gD, herpesvirus equino gp63, herpesvirus equino gE, virus della pseudorabbia gp50, virus della pseudorabbia gpll, virus della pseudorabbia gpIII, virus della pseudorabbia gpl, herpesvirus simplex gB, herpesvirus simplex gC, herpesvirus simplex gD, herpesvirus bovino gl, herpesvirus felino gB, virus di Epstein-Barr gp220, virus di Epstein-Barr gp340, virus di Epstein-Barr gB, virus di Epstein-Barr gH e citomegaiovirus umano gB.
46. 46 Vaccino come rivendicato nella rivendicazione 41 nel quale detto DNA codifica ed esprime almeno due glicoproteine di herpesvirus.
47. 47. Vaccino come rivendicato nella rivendicazione 41 nel quale il poxvirus é un vaccimavirus.
48. 48 Vaccino come rivendicato nella rivendicazione 41 nel quale il poxvirus é un poxvirus degli uccelli.
49. 49. Vaccino come rivendicato nella rivendicazione 48 nel quale il poxvirus degli uccelli é scelto dal gruppo costituito da poxvirus di polli e da poxvirus dei canarini.
50. 50. Vaccino come rivendicato nella rivendicazione 41, nel quale detto DNA viene introdotto in detto poxvirus mediante ricombinazione.
51. 51. Metodo per evitare una immunità materna in un figlio neonato, detto metodo consistendo nello inoculare il figlio neonato con un poxvirus ricombinante contenente DNA da una sorgente non-pox in una regione non essenziale del genoma di poxvirus, detto DNA codificando un primo antigene di un patogeno del figlio neonato, detto antigene essendo diverso da un secondo antigene del medesimo patogeno usato per provocare una risposta immunologica nei confronti del medesimo patogeno nella madre del figlio neonato.
52. 52. Metodo per evitare un'immunità materna in un figlio neonato, detto metodo consistendo nel inoculare il figlio neonato con un primo poxvirus ricombinante contenente DNA da una sorgente non-pox in una regione non essenziale del genoma del primo poxvirus, detto DNA codificando un antigene di un patogeno del figlio neonato, detto primo poxvirus essendo diverso da un secondo poxvirus ricombinante usato per provocare una risposta immunologica verso il medesimo patogeno nella madre del figlio neonato.