MXPA03002513A - Variante modificada de virus vaccinia ankara. - Google Patents

Variante modificada de virus vaccinia ankara.

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Abstract

La presente invencion proporciona un virus atenuado, el cual es derivado del Virus Modificado de Vaccinia Ankara y el cual esta caracterizado por la perdida de su capacidad para replicarse reproductivamente en lineas celulares humanas. Describe ademas virus recombinantes derivados de este virus y el uso del virus o sus recombinantes como medicamento o vacuna. Adicionalmente, se proporciona un metodo para inducir una respuesta inmune incluso en pacientes inmunocomprometidos, pacientes con inmunidad preexistente al virus de la vacuna o pacientes sometidos a terapias antivirales.

Description

VARIANTE MODIFICADA DE VIRUS VACCINIA ANKARA La presente invención proporciona un virus atenuado, que se deriva del virus Modificado de Vaccinia Ankara y que está caracterizado por la pérdida de su capacidad para replicarse reproductivamente en lineas celulares humanas. Ésta además describe virus recombinantes derivados de este virus y el uso del virus o sus recombinantes como medicamento o vacuna. Adicionalmente , se proporciona un método para inducir una respuesta inmune incluso en pacientes inmunocompromet idos , pacientes con inmunidad preexistente al virus vaccinia o pacientes sometidos a terapia antiviral.
ANTECEDENTES DE LA INVENCION El virus modificado de Vaccinia Ankara (MVA) está relacionado al virus de Vaccinia, un miembro del género Orthopoxvirus en la familia de Poxviridae. MVA se ha generado por 516 pasos en serie sobre fibroblastos embrionarios de la cepa Ankara del virus vaccinia (CVA) (para revisión ver Mayr, A., et al. Infection 3, 6-14
[1975]) . Como una consecuencia de estos pasos a largo plazo, el virus MVA resultante suprime aproximadamente 31 kilobases de su secuencia genómica y, por lo tanto, fue descrito como altamente restrictivo de células huésped para las células aviares (Meyer, H. et al., J. Gen. Virol. 72, 1031-1038
[1991]) . Se mostró, en una variedad de modelos animales que el MVA resultante fue significativamente avirulento (Mayr, A. & Danner, K.
[1978] Dev. Biol. Stand. 41: 225-34) . Adicionalmente , esta cepa MVA ha sido probada en exámenes clínicos como vacuna para inmunizar contra la enfermedad de la viruela humana (Mayr et al., Zbl. Bakt. Hyg . 1, Abt . Org. B 167 , 375-390
[1987], Stickl et al., Dtsch, med. Wschr. 99, 2386-2392
[1974]) . Estos estudios involucraron alrededor de 120,000 humanos, incluyendo pacientes de alto riesgo, y probaron que, en comparación a las vacunas basadas en Vaccinia, MVA tuvo virulencia disminuida o sin infección, mientras que mantuvo buena inmunogenicidad . En las siguientes décadas MVA ha sido manipulado mediante ingeniería genética para utilizarse como vector viral para la expresión recombinante en genes o como vacuna recombinante (Sutter, G. et al.
[1994], Vaccine 12: 1032-40) . A este respecto más sorprendente es que aún cuando Mayr et al. demostraron durante los 1970' s que MVA es altamente atenuado y virulento en humanos y mamíferos, algunas observaciones recientemente reportadas (Blanchard et al., 1998, J Gen Virol 79, 1159-1167; Carroll & Moss, 1997, Virology 238, 198-211; Alternberger , US Patent 5,185,146; Ambrosini et al, 1998, J Neurosci Res 55(5), 569) han mostrado que MVA no es completamente atenuado en líneas celulares de mamífero y de humano, ya que la replicación residual podría ocurrir en estas células. Se asumió que los resultados reportados en estas publicaciones han sido obtenidos con diversas cepas de MVA, ya que los virus utilizados difieren esencialmente en sus propiedades, particularmente en su comportamiento de desarrollo en diversas líneas celulares. El comportamiento de desarrollo es reconocido como un indicador para la atenuación del virus. Generalmente, una cepa viral es considerada como atenuada si ésta ha perdido su capacidad o únicamente ha reducido la capacidad para replicarse reproductivamente en células huésped. La observación anteriormente mencionada, de que MVA es completamente incompetente a la replicación de células de humano y de mamífero, compromete la cuestión de la seguridad absoluta de MVA como una vacuna humana o un vector para vacunas recombinantes .
Particularmente, para una vacuna así como para una vacuna recombinante , el balance entre la eficacia y la seguridad del virus vector de vacuna . es extremadamente importante.
OBJETIVO DE LA INVENCION De este modo, un objetivo de la invención es proporcionar nuevas cepas virales que tienen seguridad mejorada para el desarrollo de productos más seguros tales como vacunas o productos farmacéuticos. Además, un objetivo adicional es proporcionar medios para mejorar un régimen de vacunación existente.
DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION Para lograr los objetivos anteriores, de acuerdo a una modalidad preferida de la presente invención, se proporcionan nuevos virus de vaccinia, los cuales son capaces de replicación reproductiva en células no humanas y líneas celulares, especialmente en fibroblastos de embrión de pollo (CEF) y en la línea celular de riñón de hámster bebé BHK (ECACC 85011433), pero no son capaces de replicación reproductiva en líneas celulares humanas.
Las cepas conocidas de vaccinia se replican reproductivamente en al menos algunas lineas celulares humanas, en particular en la linea celular HaCaT_ de querat inoci tos humanos (Boukamp et al, 1988, J Cell Biol 106(3) : 761-71) . La replicación en la linea celular HaCaT es predictiva para la reproducción in vivo, en particular para replicación in vivo en humanos. Por supuesto, se muestra en la sección de ejemplos que todas las cepas conocidas de vaccinia probadas que muestran una ' replicación residual productiva en HaCaT también se replican in vivo. De este modo, la invención se refiere preferentemente a virus de vaccinia que no se replican reproductivamente en la linea celular humana HaCaT. Más preferentemente, la invención se refiere a cepas de virus de vaccinia que no son capaces de replicación reproductiva en ninguna de las líneas celulares humanas siguientes: la línea celular HeLa de adenoca cinoma de cervix humano (ATCC N° CCL-2) , la línea celular de riñon embrionario humano 293 (ECACC N° 85120602) , la línea celular 143B de osteosarcoma óseo humano (ECACC N° 91112502) y la línea celular HaCaT. El comportamiento de desarrollo o la amplí fícación/replicación de un virus, normalmente es expresado por la relación de los virus producidos a partir de una célula infectada (Output) a la cantidad originalmente utilizada para infectar las células en el primer lugar (Input) ("proporción de amplificación") . Una proporción de "1" entre Output e Input define un estado de amplificación en donde la cantidad de virus producidos a partir de las células infectadas es la misma que la cantidad inicialmente utilizada para infectar las células. Este estado alude al hecho, de que las células infectadas son permisivas para infección viral y reproducción viral. Una proporción de amplificación menor de 1, por ejemplo una disminución de la amplificación por debajo del nivel de input es un indicador para una falta de replicación reproductiva y, de este modo, un indicador para la atenuación del virus. Por lo tanto, fue de interés particular para los inventores identificar y finalmente aislar una cepa, que muestra una proporción de amplificación menor de 1 en varias líneas celulares humanas, en particular en todas las líneas celulares humanas 143B, HeLa, 293 y HaCaT . De este modo, el término "incapaz de replicación reproductiva" significa que el virus de acuerdo a la invención muestra una proporción de amplificación menor de 1 en líneas celulares humanas, tales como las líneas celulares 293 (ECñCC N° 85120602), 143B (ECACC N° 91112502), HeLa (ATCC N° CCL-2) y HaCaT (Boukamp et al . 1988 , J Cell Biol 106(3) : 761-71), bajo las condiciones como se señalan en el ejemplo 1 de la presente especi icación para algunas cepas especificas de MVA. Preferentemente, la proporción de amplificación del virus de acuerdo a la invención es 0,8 o menor en cada una de las lineas celulares humanas anteriores HeLa, HaCaT y 143B. Se muestra con detalle en el ejemplo 1 y en la tabla 1 que los virus de acuerdo a la presente invención no se replican reproducti amente en ninguna de las líneas celulares 143B, HeLa y HaCaT. La- cepa particular de acuerdo a la presente invención que ha sido utilizada en los ejemplos, ha sido colocada en la colección europea de cultivos celulares bajo el número V00083008. Esta cepa es denominada como "MVA-BN" a todo lo largo de la especificación. Las cepas MVA conocidas muestran replicación residual en al menos una de las líneas celulares humanas probadas (figura 1, ejemplo 1) . Todas las cepas de vaccinia conocidas muestran al menos algo de reproducción en la línea celular HaCaT, mientras que las cepas MVA de acuerdo a la presente invención, en particular MVA-BN, no se replican productivamente en células HaCaT. Con mayor detalle MVA-BN muestra una proporción de amplificación de 0.05 hasta 0.2 en la linea celular de riñón embrionario humano 293 (ECACC N° 85120602) . En la linea celular 143B de osteosarcoma óseo humano (ECACC N° 91112502) la proporción está en el intervalo de 0.0 hasta 0.6. Para la linea celular HeLa de adenocarcinoma de cervix humano (ATCC N° CCL-2) y la linea celular de queratinocitos humanos HaCaT (Boukamp et al. 1988, J Cell Biol 106(3) : 761-71) la proporción de amplificación está en el intervalo desde 0.04 hasta 0.8 y desde 0.02 hasta 0.8, respectivamente. MVA-BN tiene una proporción de amplificación desde 0.01 hasta 0.06 en células de riñón de mono verde africano (CV1: ATCC N° CCL-70) . De este modo, MVA-BN que es una cepa prototipo de acuerdo a la presente invención no se replica productivamente en ninguna de las lineas celulares probadas. La proporción de amplificación de MVA-BN es claramente superior a 1 en fibroblastos de embrión de pollo (CEF; cultivos primarios) o la linea celular BH de riñón de hámster bebé (ATCC N° CRL-1632) . Como se describió ante iormente, una proporción mayor de "1" indica replicación reproductiva, ya que la cantidad de virus producida a partir de las células infectadas se incrementa en comparación a la cantidad de virus, el cual se utilizó para infectar las células. Por lo tanto, el virus puede ser fácilmente propagado y amplificado en cultivos primarios de CEF con una proporción superior a 500 o en células BH con una proporción superior a 50. En una modalidad particular de la presente invención, la invención se refiere a derivados del virus como se depositaron bajo ECACC V0083008. "Derivados" del virus como se depositaron bajo ECACC V00083008 se refieren a virus que muestran esencialmente las mismas características de replicación que la cepa depositada pero que muestran diferencias en una o más partes de su genoma. Los virus que tienen las mismas "características de replicación" que el virus depositado son virus que se replican con proporciones similares de amplificación a la cepa depositada en células CEF y las líneas celulares BHK, HeLa, HaCaT y 143B y que muestran una replicación similar in vivo como se determina en el modelo de ratón transgénico AGR129 (ver más adelante) . En una modalidad preferida, las cepas del virus vaccinia de acuerdo a la presente invención, en particular MVA-BN y sus derivados, están caracterizadas por una falla para replicarse in vivo. En el contexto de la presente invención, "falla para replicarse in vivo" se refiere a virus que no se replican en humanos y en el modelo de ratón explicado más adelante. La "falla para replicarse in vivo" puede preferentemente determinarse en ratones que son incapaces de producir células B y T maduras. Un ejemplo para tal modelo de ratón es el modelo de ratón transgénico AGR129 (obtenido de ark Sutter, Institute of Virology, University of Zurich, Zurich, Suiza) . Esta cepa de ratón tiene interrupciones genéticas dirigidas en el tipo I del receptor IFN (IFN-a/ß) y los genes del tipo II (IFN-?) y en RAG . Debido a estas interrupciones, los ratones no tienen sistema IFN y son incapaces de producir células B y T maduras y como tales se ven severamente inmunocomprometidos y altamente susceptibles a un virus de replicación. En vez del ratón AGR129, cualquier otra cepa de ratón puede ser utilizada, que sea incapaz de reproducir células B y T maduras como tal que sea severamente inmunocomprometida y altamente susceptible a un virus de replicación. En particular, los virus de acuerdo a la presente invención no matan ratones AGR129 dentro de un periodo de tiempo de al menos 45 días, más preferentemente dentro de al menos 60 días, más preferentemente dentro de 90 días después de la infección del ratón con 107 ufp de virus administrado intraperitonealmente. Preferentemente, los virus que muestran "falla para replicarse in vivo" están adicionalmente caracterizados porque ningún virus puede ser recuperado a partir de órganos o tejidos del ratón AGR129 45 dias, preferentemente 60 dias y más preferentemente 90 días después de la infección del ratón con 107 ufp de virus administrado int raper tonealraente . La información detallada respecto a los ensayos de infección con ratones AGR19 y los ensayos que se utilizan para determinar si el virus puede ser recuperado de órganos y tejidos infectados., puede ser encontrada en la sección de ejemplos. En una modalidad preferida, las cepas del virus de vaccinia de acuerdo a la presente invención, en particular MVA-BN y sus derivados, están caracterizadas por una inmunogenicidad mayor en comparación a la cepa conocida MVA 575 como se determina en un modelo de ratón de reto letal. Los detalles de este ejemplo se describen en el ejemplo 2, mostrado más adelante. En resumen, en tal modelo, un ratón no vacunado murió después de la infección con cepas de vaccinia competentes a replicación tales como la cepa de reserva Western L929 TK+ o IHD-J. La infección con virus de vaccinia competentes para replicación se denomina como "reto" en el contexto de la descripción del modelo de reto letal. Cuatro días después del reto, los ratones usualmente son sacrificados y el titulo viral en los ovarios se determina mediante ensayos estándares en placa utilizando células VERO (para mayores detalles ver sección de ejemplos) . El titulo viral es determinado para ratones no vacunados y para ratones vacunados con virus de vaccinia de acuerdo a la presente invención. Más específicamente, los virus de acuerdo a la presente invención están caracterizados porque en esta prueba después de la vacunación con 102 TCIso/ml de virus de acuerdo a la presente invención, los títulos de virus en ovario se reducen en al menos 70%, preferentemente por al menos 80%, más preferentemente por al menos 90% en comparación a ratones no vacunados. En una modalidad preferida, los virus de vaccinia de acuerdo a la presente invención, en particular MVA-BN y sus derivados son útiles para la inmunización con administración de cebador /refuer zo de la vacuna. Existen numerosos reportes que sugieren que los regímenes de cebador/refuerzo utilizando MVA como un vector de distribución inducen respuestas inmunes pobres y son inferiores a los regímenes de cebador de ADN-cebador/MVA-refue zo de (Schneider et al., 1998, Nat. Med. 4; 397-402) . En todos estos estudios, las cepas MVA que han sido utilizadas son diferentes de los virus de vaccinia de acuerdo a la presente invención. Para explicar la respuesta inmune pobre, si se utilizó MVA para la administración de cebador y refuerzo, se ha lanzado la hipótesis de que los anticuerpos generados para MVA durante la administración con cebador neutralizan el MVA dado en la segunda inmunización, previniendo un refuerzo efectivo de la respuesta inmune. En contraste, los regímenes de ADN-cebador/MVA-refuerzo son reportados por ser superiores a la generación de respuestas con gran avidez, debido a que este régimen combina la habilidad del ADN para cebar efecti amente la respuesta inmune con las propiedades de MVA para reforzar esta respuesta en ausencia de una inmunidad preexistente a MVA. Claramente, si una inmunidad preexistente a MVA y/o vaccinia previenen el refuerzo de la respuesta inmune, entonces el uso de MVA como una vacuna o material terapéutico tendría eficacia limitada, particularmente en los individuos que han sido vacunados contra viruela. Además, de acuerdo a una modalidad adicional, el virus de vaccinia de acuerdo a la presente invención, en particular MVA-BN y sus derivados así como virus recombinantes correspondientes que albergan secuencias heterólogas, pueden ser utilizados para cebar primero eficientemente y posteriormente reforzar las respuestas inmunes en animales nativos asi como en animales con una inmunidad preexistente a los poxvirus. Por lo tanto, el virus de vaccinia de acuerdo a_ la presente invención induce al menos sustancialmente el mismo nivel de inmunidad en regímenes de cebador de virus de vaccinia/refuerzo de virus de vaccinia en comparación a regímenes ADN-cebador/refuerzo de virus de vaccinia. Un virus de vaccinia es considerado como que induce al menos sust ncialmente el mismo nivel de inmunidad en regímenes de cebador de virus de vaccinia/refue zo de virus de vaccinia cuando se compara con regímenes de ADN-cebador/ref erzo de virus de vaccinia en la respuesta de CTL como se mide en uno de los siguientes 2 ensayos ("ensayo 1" y "ensayo 2") , preferentemente en ambos ensayos, es al menos sustancialmente el mismo en regímenes de cebador de virus de vaccinia/refuerzo de virus de vaccinia en comparación a regímenes de ADN-cebador/refuerzo de virus de vaccinia. Más preferentemente, la respuesta de CTL después de la administración de cebador de virus de vaccinia/refuerzo de virus de vaccinia es mayor en al menos uno de los ensayos, cuando se compara a regímenes de ADN-cebador/refuerzo de virus de vaccinia.
Más preferentemente, la respuesta de CTL es más elevada en ambos de los siguientes ensayos.
Ensayo 1; Para las administraciones de cebador de virus de vaccinia/refuerzo de virus de vaccinia, ratones BALB/c de 6-8 semanas de edad (H-2d) son inmunizados con cebador mediante administración intravenosa con 107 TCID50 virus de vaccinia de acuerdo a la presente invención que expresan el politope murino como se describe en Thomson et al., 1988, J. Immunol. 160, 1717 e inmunizados con refuerzo con la misma cantidad del mismo virus, administrado de la misma manera 3 semanas después. Para este fin es necesario construir un virus de vaccinia recombinante que exprese dicho politope. Los métodos para construir dichos virus recombinantes son conocidos para la persona experta en la técnica y se describen con más detalle posteriormente. En los regímenes de ADN-cebador/ refuerzo de virus de vaccinia, la vacunación de cebador es realizada mediante inyección intramuscular del ratón con 50 \iq de ADN que expresa el mismo antigeno que el virus de vaccinia; la administración de refuerzo con el virus de vaccinia se realiza exactamente de la misma manera que para la administ ación de cebador de virus de vaccinia/refuerzo de virus de vaccinia. El plásmido de ADN que expresa el politope también se describe en la publicación anteriormente referenciada por Thomson et al. En ambos regímenes, el desarrollo de una respuesta de CTL contra los epitopes SYIPSAEKI, RPQASGVYM y/o YPHFMPTNL se determina dos semanas después de la administración de refuerzo. La determinación de la respuesta de CTL preferentemente se realiza utilizando análisis de ELISPOT como se describe por Schneider et al., 1998 , Nat . Med. 4, 397-402 y como se señala en la sección siguiente de ejemplos, para un virus específico de acuerdo a la presente invención. El virus de acuerdo a la presente invención está caracterizado en este experimento porque la respuesta inmune de CTL contra los epitopes mencionados anteriormente, la cual es inducida por la administración de cebador de virus de vaccinia/refuerzo de virus de vaccinia, es sustancialmente la misma, prefe entemente al menos la misma como se induce por la administración de ADN-cebador/refue zo de virus de vaccinia como se evaluó por el número de IFN-? que produce células/106 células esplénicas (ver también sección experimental) .
Ensayo 2 : Este ensayo básicamente corresponde al ensayo 1. Sin embargo, en vez de utilizar 107 TCID50 de virus de vaccinia administrado intravenosamente como en el ensayo 1, en este ensayo 10B TCID50 de acuerdo a la presente, invención se administraron subcut neamente para la inmunización de cebador y para la inmunización de refuerzo. El virus de acuerdo a la presente invención está caracterizado en este experimento porque la respuesta inmune de CTL contra los epitopes mencionados anteriormente, que es inducida por la administración de cebador de virus de vaccinia/refuerzo de virus de vaccinia, es sustancialmente la misma, preferentemente al menos la misma como se induce por la administración de ADN-cebador/refuerzo de virus de vaccinia como se evaluó por el número de IFN-? que produce células/106 células esplénicas (ver también sección experimental) . La resistencia de una respuesta de CTL como se mide en uno de los ensayos mostrados anteriormente corresponde al nivel de protección. De este modo, los virus de acuerdo a la presente invención son particularmente adecuados para fines de vacunación. En resumen, el virus de vaccinia de acuerdo a la presente invención está caracterizado porque tiene al menos una de las siguientes propiedades: (i) capacidad de replicación reproductiva en fibroblastos de embrión de pollo (CEF) y en la linea celular BHK, pero incapacidad de replicación reproductiva en la linea celular humana HaCaT, (ii) falla para replicarse in vivo, (iii) inducción de una inmunogenicidad mayor comparada a la cepa conocida MVA 575 (ECACC V00120707) en un modelo de reto letal y/o (iv) inducción de al menos sustancialmente el mismo nivel de inmunidad e ¦ regímenes de cebador de virus de vacci ia/refuerzo de virus de vaccinia cuando se compara a regímenes de ADN- cebador/refuerzo de virus de vaccinia. Preferentemente, el virus de vaccinia de acuerdo a la presente invención tiene al menos dos de las propiedades anteriores, más preferentemente al menos tres de las propiedades anteriores . Más preferidos son los virus de vaccinia que tienen todas las propiedades anteriores. En una modalidad adicional, la invención se refiere a un equipo de vacunación que comprende un virus de acuerdo a la presente invención para la primera vacunación ("cebadura") en un primer frasco/recipiente y para una segunda vacunación ("refuerzo") en un segundo frasco/recipiente. El virus puede ser un virus de vaccinia no recombinante , por ejemplo un virus de vaccinia que no contiene secuencias nucleotídicas heterólogas. Un ejemplo para tal virus de vaccinia es MVA-BN y sus derivados. Alternativamente, el virus puede ser un virus de vaccinia recombinante que contiene secuencias nucleotidicas adicionales que son heterólogas para el virus de vaccinia. Como se señaló en otras secciones de la descripción, las secuencias heterólogas pueden codificar para epitopes que inducen una respuesta por el sistema inmune. Es posible utilizar el virus de vaccinia recombinante para vacunar contra las proteínas o agentes que comprenden dicho epítope. Los virus pueden ser formulados como se muestra más adelante con mayor detalle. La cantidad de virus que puede ser utilizada para cada vacunación ha sido definida ante iormente . Es conocido para una persona experta en la técnica, como puede obtenerse virus de vaccinia que tienen al menos una de las siguientes propiedades: capacidad de replicación reproductiva en fibroblastos de embrión de pollo (CEF) y en la linea celular de riñón de hámster bebé BHK, pero incapacidad de replicación reproductiva en la linea celular de querat inocitos humanos HaCaT, falla para replicarse in vivo, inducción de una inmunogenicidad mayor en comparación a la cepa conocida MVA 575 en un modelo de reto letal y/o inducción de al menos sustancialment e el mismo nivel de inmunidad en regímenes de cebador de virus de vaccinia/ refuerzo de virus de vaccinia cuando se comparan a regímenes de ADN- cebador/refuer zo de virus de vaccinia. Un proceso para obtener al virus puede comprender los siguientes pasos: (i) introducir una cepa de virus de vaccinia conocida, preferentemente MVA 574 o MVA 575 (ECACC V00120707) en células no humanas en las cuales el virus es capaz de replicarse reproductivamente, en donde las células no humanas preferentemente son seleccionadas de células CEF y de la línea celular BHK, (ii) aislamiento/enriquecimiento de partículas virales a partir de estas células y (iii) analizar si el virus obtenido tiene al menos una de las propiedades biológicas deseadas como se definieron anteriormente, en donde los pasos anteriores opcionalmente pueden ser repetidos hasta que se obtenga un virus con las características de replicación deseadas. La invención se refiere además a los virus obtenidos mediante este método de acuerdo a la presente invención. Cómo pueden ser determinadas las propiedades biológicas deseadas por los métodos, se explica en otras partes de esta descripción. Al aplicar este método, los inventores identificaron y aislaron en varias rondas de purificación clonal, una cepa de acuerdo a la presente invención que inicia a partir del pasaje 575 de aislado de MVA (MVA 575) . Esta nueva cepa corresponde a la cepa con el número de acceso ECACC V0083008, mencionada anteriormente. El comportamiento de desarrollo de los virus de vaccinia de acuerdo a la presente invención, en particular el comportamiento de desarrollo de MVA-BN, indica que las cepas de acuerdo a la presente invención son muy superiores a cualquier otra en cuanto al aislado de MVA caracterizado, respecto a la atenuación en lineas celulares humanas y a la falla de la replicación in vivo. Las cepas de acuerdo a la presente invención por lo tanto son candidatos ideales para el desarrollo de productos más seguros tales como vacunas o productos farmacéuticos como se describirá más adelante. En una modalidad, el virus de acuerdo a la presente invención, en particular MVA-BN y sus derivados, es utilizado como una vacuna contra enfermedades producidas por poxvirus humanos tales como viruela. En una modalidad adicional, el virus de acuerdo a la presente invención puede ser recombinante, por ejemplo puede expresar genes heterólogos como, por ejemplo, antigenos o epitopes heterólogos para el virus y puede ser útil de este modo como una vacuna para inducir una respuesta inmune contra antigenos o epitopes heterólogos. El término "respuesta inmune" significa la reacción del sistema inmune, cuando una sustancia extraña o microorganismo entra al organismo. Por definición, la respuesta inmune está dividida en una reacción especifica y una no especifica, aunque ambas están ligadas estrechamente. La respuesta inmune no específica es la defensa inmediata contra una amplia variedad de sustancias extrañas y agentes infecciosos. La respuesta inmune específica es la defensa surgida después de una fase de retardo, cuando el organismo es retado con una sustancia en la primera ocasión.
La respuesta inmune específica es grandemente eficiente y es responsable por el hecho de que un individuo que se recupera de una infección específica está protegido contra esta infección específica. Por lo tanto, una segunda infección con el mismo o un agente infeccioso muy similar provoca síntomas mucho más leves o ningún síntoma después de todo, puesto que ya existe una "inmunidad preexistente" para este agente. Tal inmunidad y la memoria inmunológica , respectivamente, persisten por algún tiempo prolongado, en algunos casos incluso por toda la vida. En consecuencia, la inducción de una memoria inmunológica puede ser utilizada para la vacunación. El "sistema inmune" significa un órgano complejo involucrado en la defensa del organismo contra sustancias extrañas y microorganismos. El sistema inmune comprende una parte celular que comprende diversos tipos celulares, tales como, por ejemplo, linfocitos y otras células derivadas de células sanguíneas blancas, y una parte humoral que comprende péptidos pequeños y factores complementarios . "Vacunación" significa que un organismo es retado con un agente infeccioso, por ejemplo, en una forma atenuada o inactivada del agente infeccioso, para inducir una inmunidad específica. El término vacunación también cubre el reto de un organismo con virus recombinantes de vaccinia de acuerdo a la presente invención, en particular MVA-BN recombinante y sus derivados, que expresa antigenos o epitopes que son heterólogos al virus. Los ejemplos para tales epitopes se dan en otras partes de la descripción y cubren, por ejemplo epitopes provenientes de proteínas derivadas de otros virus tales como el virus del dengue, el virus de la hepatitis C, VIH, o epitopes derivados de proteínas que están asociados con el desarrollo de tumores y cáncer. Después de la administración del virus recombinante de vaccinia en el cuerpo, los epitopes son expresados y son presentados al sistema inmune y puede ser inducida una respuesta inmune específica contra estos epitopes. El organismo, por lo tanto, es inmunizado contra el agente/proteína que contiene el epítope que es codificado por el virus recombinante de vaccinia . "Inmunidad" significa protección parcial o completa de un organismo contra enfermedades provocadas por un agente infeccioso, debido a una eliminación exitosa de una infección precedente con el agente infeccioso en una parte característica del mismo. La inmunidad está basada en la existencia, la inducción y la activación de células especializadas del sistema inmune . Como se anotó anteriormente, en una modalidad de la invención, los virus recombinantes de acuerdo a la presente invención, en particular MVA-BN recombinante y sus derivados, contienen al menos una secuencia de ácido nucleico heterólogo. El término "heterólogo" se utiliza de aqui en adelante para cualquier combinación de secuencias de ácido nucleico que no se encuentren normalmente intimamente asociadas con el virus por naturaleza, tal virus también es denominado "virus recombinante". De acuerdo a una modalidad adicional de la presente invención, las secuencias heterólogas son preferentemente epítopes antigénicos, los cuales son seleccionados a partir de cualquier fuente que no sea vaccinia. Más preferentemente, tal virus recombinante expresa uno o más epitopes antigénicos a partir de Plasmodium falciparum, Mycobacteria , Virus de Influenza , provenientes de virus seleccionados de la familia de Flavivirus , Paramyxovi rus , Virus de Hepatitis , Virus de inmunodeficiencia humana o de virus que provocan fiebre hemorrágica tales como Hantavirus o Fi lovirus , por ejemplo, virus Ebola o Marburg .
De acuerdo a una modalidad adicional, pero también además de la selección anteriormente mencionada de epitopes antigénicos, las secuencias heterólogas pueden ser seleccionadas de otra fuente poxviral o una fuente de vaccinia. Estas secuencias virales pueden ser utilizadas para modificar el espectro del huésped o la inmunogenicidad del virus. En una modalidad adicional, el virus de acuerdo a la invención puede codificar para un gen het erólogo/ácido nucleico que expresa un compuesto terapéutico. Un "compuesto terapéutico" codificado por el ácido nucleico heterólogo en el virus puede ser, por ejemplo, un ácido nucleico terapéutico tal como un ácido nucleico antisentido o un péptido o proteina con actividad biológica deseada. De acuerdo a una modalidad preferida adicional, la expresión de la secuencia heteróloga de ácido nucleico está preferentemente, pero no exclusivamente, bajo el control t anscripcional de un promotor de poxvirus, más referentemente de un promotor de virus de vaccinia. De acuerdo a una modalidad adicional, la inserción de la secuencia heteróloga de ácido nucleico está preferentemente en una región no esencial del genoma del virus. En otra modalidad preferida de la invención, la secuencia heteróloga de ácido nucleico es insertada en un sitio de supresión de origen natural del genoma de MVA (descrito en la publicación PCT/EP96/02926) . Los métodos para insertar secuencias heterólogas en el genoma poxviral son conocidos para una persona experta en la técnica. De acuerdo a una modalidad preferida adicional, la invención incluye también el genoma del virus, sus recombinantes o partes funcionales del mismo. Tales secuencias virales pueden ser utilizadas para identificar o aislar el virus o sus recombinantes, por ejemplo, mediante el uso de PCR, tecnologías de hibridación o mediante el establecimiento de ensayos de ELISA. Además, tales secuencias virales pueden ser expresadas a través de un vector de expresión para producir la proteína o el péptido codificados que entonces pueden suplementar mutantes de supresión de un virus que carece de la secuencia viral contenida en el vector de expresión. "Parte funcional" del genoma viral significa una parte de la secuencia genómica completa, la cual codifica para una entidad física, tal como una proteína, dominio de proteína, epítope de una proteína. La parte funcional del genoma viral también describe partes de la secuencia genómica completa, que codifican para elementos o partes regulatorios de tales elementos con actividad individualizable, tales como promotor, aumentador, elementos de actuación cis o trans. El virus recombinante de acuerdo a la presente invención puede ser utilizado para la introducción de la secuencia heteróloga de ácido nucleico en una célula objetivo, dicha secuencia es homóloga o bien heteróloga para la célula objetivo. La introducción de una secuencia heteróloga de ácido nucleico en una célula objetivo puede ser utilizada para producir in vitro péptidos o polipéptidos heterólogos y/o virus completos codificados por tal secuencia. Este método comprende la infección de una célula huésped con el MVA recombinante, el cultivo de la célula huésped infectada bajo condiciones adecuadas, y el aislamiento y/o enriquecimiento del péptido, proteina y/o virus producidos por tal célula huésped. Además, el método para introducción de una secuencia homóloga o de una secuencia heteróloga a las células, puede ser aplicado para la terapia in vitro y preferentemente in vivo. Para la terapia in vitro, las células aisladas que han sido previamente infectadas (ex vivo) con el virus, son administradas al cuerpo animal viviente para inducir una respuesta inmune. Para la terapia in vivo, el virus o sus recombinantes son directamente administrados al cuerpo animal viviente para inducir una respuesta inmune. En este caso, las células que rodean el sitio de inoculación son directamente infectadas por el virus o sus recombinantes de acuerdo a la invención. Ya que el virus de acuerdo a la invención es restringido en su desarrollo grandemente en células humanas y de mono y, de este modo, altamente atenuado, es ideal para tratar un amplio intervalo de mamiferos incluyendo humanos. Por lo tanto, la presente invención también proporciona una composición farmacéutica y una vacuna, por ejemplo, para inducir una respuesta inmune en un cuerpo animal viviente, incluyendo un humano. El virus de la invención es además seguro en cualesquiera otros protocolos de terapia génica. La composición farmacéutica puede incluir generalmente uno o más portadores, aditivos, antibióticos, conservadores, adyuvantes, diluyentes y/o estabilizadores, aprobados y/o farmacéuticamente aceptados. Tales sustancias auxiliares pueden ser agua, solución salina, glicerol, etanol, agentes humectantes o emulsificantes , sustancias amortiguadoras del pH, o similares. Los portadores adecuados son típicamente moléculas grandes, lentamente metabolizadas tales como proteínas, polisacáridos , ácidos poliláct icos , ácidos poliglicólicos , aminoácidos poliméricos, copolimeros de aminoácido, agregados lipidíeos, o similares. Para la preparación de vacunas, el virus o sus recombinantes de acuerdo a la invención, es convertido en una forma fisiológicamente aceptable. Esto se puede realizar con base en la experiencia en la preparación de vacunas de poxvirus utilizadas para vacunación contra viruela (como se describe por Stickl, H. et al.
[1974] Dtsch. Med. schr. 99, 2386-2392) . Por ejemplo, el virus purificado es almacenado a -80°C con un título de 5xl08 TCID5o/ml formulado en Tris aproximadamente 10 mM, NaCl 140 m , pH 7.4. Para la preparación de inyecciones de vacuna, por ejemplo 102-108 partículas del virus son liofilizadas en 100 mi de solución salina amortiguada con fosfato (PBS) en presencia de 2% de peptona y 1% de albúmina humana en una ampolleta, preferentemente en una ampolleta de vidrio. Alternativamente, las inyecciones de vacuna pueden ser producidas mediante liofili zación gradual del virus en una formulación. Esta formulación puede contener aditivos adicionales tales como manitol, dextrano, azúcar, glicina, lactosa o polivinilpirrolidona u otros aditivos tales como antí oxidantes o gas inerte, estabilizadores o proteínas recombinantes (por ejemplo albúmina sérica humana) adecuados para la administración in vivo. La ampolleta de vidrio es posteriormente sellada y puede ser almacenada entre 4°C y la temperatura ambiente por varios meses. Sin embargo, mientras no exista la necesidad, la ampolleta es almacenada preferentemente a temperaturas inferiores a -20°C. Para la vacunación o terapia, el liofilizado puede ser disuelto en 0.1 a 0.5 mi de una solución acuosa, preferentemente solución salina fisiológica o amortiguador Tris, y administrada ya sea sistémicamente o localmente, por ejemplo parenteralmente , int ramuscularmente o por cualquier otra vía de administración conocida para la persona experta en la materia. El modo de administración, la dosis y el número de administraciones pueden ser optimizados por aquellos expertos en la técnica de una manera conocida. Adicionalmente, de acuerdo a una modalidad adicional, el virus de acuerdo ? La presente invención es particularmente útil para inducir respuestas inmunes en animales no comprometidos, por ejemplo, monos (CD4 < 400/µ1 de sangre) infectados con VIS, o en humanos inmunocompromet idos . El término " i nmunocomprometido" describe el estado del sistema inmune de un individuo, que muestra únicamente respuestas inmunes incompletas o que tiene una eficiencia reducida en la defensa contra aqentes infecciosos . Aún más interesante y de acuerdo a una modalidad adicional, el virus de acuerdo a la presente invención puede disparar respuestas inmunes en animales o humanos inmunocomprometidos , incluso en presencia de una inmunidad preexistente a poxvirus en estos animales o humanos. Particularmente fue interesante que el virus de acuerdo a la presente invención, pueda reforzar respuestas inmunes también en animales o humanos sometidos a un antiviral, por ejemplo terapia antirretroviral . "Terapia antiviral" incluye conceptos terapéuticos con el fin de eliminar o suprimir la infección viral incluyendo, por ejemplo (i) la aplicación de análogos nucleotidicos , (ii) la aplicación de inhibidores para actividad enzimática viral o ensamblaje viral, o (iii) aplicación de citocinas para influir en las respuestas inmunes del huésped. De acuerdo a una modalidad adicional, la vacuna es especialmente, pero no exclusivamente aplicable en el campo veterinario, por ejemplo para la inmunización contra infección de viruela en animales. En animales pequeños, la inoculación para inmunización se realiza de manera parenteral o nasalmente, mientras que en animales grandes o humanos se prefiere una inoculación subcutánea, intramuscular u oral. Se ha encontrado por los inventores que ya una inyección de vacuna que contiene una dosis efectiva de únicamente 102 TCIDso/ml (dosis infecciosa de cultivo de tejido) del virus de acuerdo a la presente invención, es suficiente para inducir inmunidad completa contra un reto por virus de vaccinia tipo silvestre en ratones. Esto es particularmente sorprendente, ya que tal grado alto de atenuación del virus' de acuerdo a la presente invención podria esperarse que influya negativamente y, por lo tanto, reduzca su inmunogenicidad . Tal expectativa se basa en la creencia de que para la inducción de una respuesta inmune, los epitopes antigénicos necesitan ser presentados al sistema inmune en cantidad suficiente. Un virus que es grandemente atenuado y, de este modo, no se replica, puede únicamente presentar una cantidad muy pequeña de epitopes antigénicos, es decir tanto como lo que él mismo incorpora. Esta cantidad de antigeno, llevada por las partículas virales, no se consideró suficiente para la inducción de una respuesta inmune potente. Sin embargo, el virus de acuerdo a la invención estimula incluso con una dosis efectiva muy pequeña de únicamente 103 TCID50 una respuesta inmune potente y protectora en un modelo de reto de ratón/vaccini . El virus de acuerdo a la presente invención muestra por lo tanto una inmunogenicidad inesperada e incluso incrementada en comparación a otros en cuanto a las cepas de MVA caracterizadas. Esta alta inmunogenicidad hace al virus de acuerdo a la presente invención y a cualquier vacuna derivada del mismo, especialmente útiles para la aplicación en animales o humanos inmunocomprometidos . De acuerdo a otra modalidad adicional de la invención, el virus es utilizado como un adyuvante. Un ""adyuvante" en el contexto de la presente descripción se refiere a un aumentador de la respuesta inmune especifica en vacunas. "Utilizar el virus como adyuvante" significa que incluye el virus en una vacuna preexistente para estimular adicionalmente al sistema inmune del paciente que recibe la vacuna. El efecto inmunizante de un epitope antigénico en la mayoría de las vacunas es recuentemente aumentado mediante la adición de un denominado adyuvante. Un adyuvante coestimula al sistema inmune al provocar una reacción inmune específica más fuerte contra un epitope antigénico de una vacuna. Esta estimulación puede ser regulada por factores del sistema inmune no específico, tal como interferón e interleucina .
Por lo tanto, en una modalidad adicional de la invención, el virus es utilizado en mamíferos incluyendo humanos para activar, sustentar o suprimir al sistema inmune, y preferentemente para activar la respuesta inmune contra un determinante antigénico. El virus también puede ser utilizado para sustentar al sistema inmune en una situación de susceptibilidad incrementada contra infecciones tal como en el caso de estrés . El virus utilizado como un adyuvante puede ser un virus no recombinant e , por ejemplo un virus que no contenga ADN heterólogo en su genoma. Un ejemplo para este tipo de virus es MVA-BN. Alternativamente, el virus que es utilizado como un adyuvante es un virus recombinante que contiene en su genoma secuencias heterólogas de ADN que no están naturalmente presentes en el genoma viral. Para utilizarse como un adyuvante, el ADN viral recombinante del virus preferentemente contiene y expresa genes que codifican para péptidos o proteínas estimuladores tales como interleucinas . De acuerdo a una modalidad adicional, se prefiere que el virus esté inactivado, cuando se utilice como un adyuvante o agregado a otra vacuna. La inactivación del virus se puede realizar, por ejemplo, por calor o productos químicos, como es conocido en la técnica. Preferentemente, el virus es inactivado por ß-propriolactona . De acuerdo a esta modalidad de la invención, el virus inactivado puede ser agregado a vacunas contra numerosas enfermedades infecciosas o proliferat ivas para incrementar la respuesta inmune del paciente a esta enfermedad.
BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION La invención comprende entre otros, lo siguiente, solo o en combinación: Virus de vaccinia que tiene al menos una de las siguientes propiedades: capacidad de replicación reproductiva en fibroblastos de embrión de pollo (CEF) y en la linea celular BHK de riñon de hámster bebé, pero incapacidad de replicación reproductiva en la linea celular HaCaT de queratinocitos humanos, falla para replicarse in vivo, inducción de una inmunogen icidad mayor en comparación a la cepa conocida MVA 575 en un modelo de reto letal y/o inducción de al menos sus tancialmente el mismo nivel de inmunidad en regímenes de cebador de virus de vaccinia/refuerzo de virus de vaccinia cuando se comparan a regímenes de ADN- cebador /re uerzo de virus de vaccínia. El virus como se mencionó anteriormente, en donde el virus no es capaz de replicarse reproductivamente en cualquiera de las líneas celulares humanas siguientes: la línea celular 293 de riñón de embrión humano, la línea celular 143B de os teosarcoma óseo humano y la línea celular HeLa de adenocarcinoma de cervix humano. El virus como se dijo anteriormente, .está depositado en la colección europea de cultivos celulares (ECACC), Salisbury (UK) bajo el número de V00083003 y los derivados del mismo. El virus como se mencionó anteriormente comprende al menos una secuencia heteróloga de ácido nucleico . El virus como se dijo anteriormente, en donde la secuencia heteróloga de ácido nucleico se selecciona de una secuencia que codifica para al menos un antígeno, epítope antigénico, y/o un compuesto terapéutico . El genoma o partes funcionales del mismo, derivados del virus como se define anteriormente. La composición farmacéutica que comprende el virus como se dijo anteriormente y/o el genoma y/o parte funcional del mismo como se define anteriormente y un portador, diluyente y/o aditivo, farmacéuticamente aceptables . La vacuna que comprende el virus como se dijo anteriormente y/o el genoma y/o parte funcional del mismo como se definió anteriormente. El virus como se mencionó, el genoma y/o parte funcional del mismo como se definió anteriormente, la composición como se definió anteriormente o la vacuna como se definió anteriormente, como fármaco para efectuar, preferentemente inducir, una respuesta inmunológica en un animal vivo, incluyendo un humano. El virus como se dijo anteriormente, la composición farmacéutica como se definió anteriormente, la vacuna como se definió anteriormente o el virus como se definió anteriormente, en donde el virus, la composición o la vacuna es administrada en cantidades terapéuticamente efectivas en una primera inoculación ("inoculación de cebador") y en una segunda inoculación ("inoculación de refuerzo") . El uso del virus como se dijo anteriormente, y/o el genoma como se definió anteriormente, para la preparación de un medicamento o una vacuna. El método para introducir secuencias homólogas y/o heterólogas de ácido nucleico en células objetivo, que comprende la infección de las células objetivo con el virus que comprende secuencias heterólogas como se definieron anteriormente o la transfección de la célula objetivo con el genoma como se definió anteriormente. El método para producir un péptido, proteína y/o virus que comprende la infección de una célula huésped con el virus como se dijo anteriormente, el cultivo de la célula huésped infectada bajo condiciones adecuadas, y el aislamiento y/o enriquecimiento del péptido y/o proteina y/o virus producidos por la célula huésped . El método para efectuar, preferentemente inducir una respuesta inmunológica en un cuerpo animal viviente incluyendo humano, que comprende administrar el virus como se dijo ante iormente, el genoma y/o parte funcional del mismo como se definió anteriormente, la composición como se definió anteriormente o la vacuna como se definió anteriormente al animal o humano a ser tratado. El método como se dijo anteriormente comprende la administración de al menos 102 TCID50 (dosis infecciosa de cultivo de tejido) del virus.
El método como se dijo anteriormente, en donde el virus, la composición o la vacuna es administrada en cantidades terapéuticamente efectivas en una primera inoculación ("inoculación de cebador") y en una segunda inoculación ("inoculación de refuerzo") . El método como se dijo anteriormente, en donde el animal se encuentra inmunocomprometido . El método como se dijo anteriormente, en donde el animal tiene una inmunidad preexistente a poxvirus . El método como se dijo anteriormente, en donde el animal se somete a una terapia antiviral. El método en donde el animal es sometido a una terapia antiviral, caracterizado porque la terapia antiviral es una terapia antirretroviral . El uso del virus como se dijo anteriormente, el genoma y/o parte funcional del mismo como se definió anteriormente como adyuvante. Un método para aumentar una respuesta inmune especifica contra un antigeno y/o un epitope antigénico incluido en una vacuna que comprende la administ ación del virus como se mencionó anteriormente o el genoma como se definió anteriormente, como un adyuvante a un cuerpo animal viviente incluyendo un humano a ser tratado con la vacuna.
El virus como se dijo anteriormente o el genoma como se definió anteriormente, como adyuvante. Una célula, preferentemente una célula humana que contiene el virus como se dijo anteriormente o el genoma o parte funcional del mismo como se definió anteriormente . Método para obtener el virus de vaccinia como se dijo anteriormente, que comprende los siguientes pasos : introducir una . cepa del virus de vaccinia comúnmente disponible, preferentemente MVA 575 en células no humanas en las cuales el virus es capaz de replicarse reproductivamente, en donde las células no humanas se seleccionan preferentemente de células CEF y la linea celular BHK, el aislamiento/enriquecimiento de partículas virales provenientes de estas células y analizar si el virus obtenido tiene al menos una de las propiedades biológicas como se definieron ante iormente , en donde los pasos anteriores se pueden repetir opcionalmente hasta que se obtenga un virus con las características deseadas de replicación.
El equipo para inmunización de cebador /refuerzo que comprende un virus como se dijo anteriormente, una vacuna como se mencionó anteriormente o el virus como fármaco como se definió anteriormente para una primera inoculación ("inoculación de cebador") en un primer f asco/recipiente y para una segunda inoculación ("inoculación de refuerzo") en un segundo frasco/recipiente. El uso del virus como se dijo anteriormente, la composición como se definió anteriormente y/o la vacuna como se definió anteriormente para la preparación de una vacuna, en donde el virus, la composición o la vacuna se administra en una inoculación de cebador y en donde el mismo virus o vacuna se administra en una inoculación de refuerzo.
BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS Figura 1: Cinética de desarrollo de diferentes cepas de MVA en lineas celulares diferentes. En la parte A) los resultados se agrupan de acuerdo a las cepas MVA probadas mientras que en la parte B) los resultados se agrupan de acuerdo a las lineas celulares probadas. B) la cantidad de virus recuperada de una línea celular después de 4 días (D4) de cultivo se determinó por ensayo de placa y se expresó como la proporción de virus recuperado después de 4 días al ínóculo inicial en el día 1 (DI) . Figura 2: Protección proporcionada contra un reto letal de vaccinia después de vacunaciones ya sea con MVA-BN o MVA 575. La protección se mide mediante la reducción en títulos de ovario determinados 4 días después del reto por ensayo estándar en placa. Figura 3: Inducción de CTL y protección proporcionada contra un reto de influenza, utilizando diferentes regímenes de cebador-refuerzo. 3A: Inducción de respuestas de CTL a 4 diferentes epítopes restringidos H-2d después de las vacunaciones con combinaciones diferentes de ADN o vacunas de MVA-BN que codifican para un polítope murino. Ratones BALB/c (5 por grupo) fueron vacunados ya sea con ADN ( int ramuscularmente ) o MVA-BN (subcutáneamente) y recibieron inmunizaciones de refuerzo 3 semanas después. Las respuestas de CTL a 4 diferentes epítopes codificados por las vacunas (TYQRTRALV, influenza; SYIPSAE I, P. Berghei; YPHFMPTNL, Citomegalovirus ; RPQASGVYM, LCV) se determinaron utilizando un ensayo ELISPOT 2 semanas después de las inmunizaciones de refuerzo. 3B: Inducción de respuestas de CTL a 4 diferentes epitopes después de vacunaciones con combinaciones diferentes de ADN o vacunas de MVA-BN .que codifican para un politope murino. Ratones BALB/c (5 por grupo) se vacunaron ya sea con ADN ( ntraruscularmente ) o MVA-BN (intravenosamente) y recibieron inmunizaciones de refuerzo 3 semanas después. Las respuestas de CTL a 4 diferentes epitopes codificados por las vacunas (TYQRTRALV, influenza; SYIPSAEKI, P. Berghei; YPHF PTNL, Citomegalovirus; RPQASGVYM, LCV) se determinaron utilizando un ensayo ELISPOT 2 semanas después de las inmunizaciones de refuerzo . 3C: Frecuencia de péptido y células T especificas de MVA, después refuerzo con cebador homólogo utilizando una dosis óptima (1 x 108 TCID50) de MVA-BN recombinante, administrado subcutáneamente. Grupos de 8 ratones fueron vacunados con 2 inyecciones de las combinaciones como se indican en la figura. 2 semanas después de la vacunación final, el número de esplenocitos específicos de péptido se midió utilizando un ensayo ELISPOT IFN-gamma. Las barras representan el número promedio de manchas especificas más/menos la desviación estándar de la media.
Figura 4: Carga de VIS de monos vacunados con MVA-BN nef o MVA-BN. Figura 5: Supervivencia de monos vacunados después de infección con VIS. Figura 6: Títulos de anticuerpo sérico de mono para MVA-BN. Los títulos de anticuerpo para cada animal se muestran como formas diferentes, mientras que el título medio se ilustra como un rectángulo sólido. Figura 7: Niveles de VIS en monos inmunocompromet idos (CD4<400 ml/sangre) después de vacunaciones con MVA-BN que codifica para tat . Los monos recibieron previamente 3 vacunaciones ya sea con MVA-BN o MVA-BN nef (semana 0, 8, 16) y habían sido infectados con un aislado patógeno de VIS (semana 22) . En la semana 100, 102 y 106 (indicada por flecha) los monos se vacunaron con MVA-BN tat. Figura 8: Niveles de VIS en monos sometidos a terapia antirretroviral y vacunaciones terapéuticas utilizando MVA-BN. 3 grupos de monos (n=6) se infectaron con VIS y se trataron diariamente con PMPA (indicado por línea negra) . En la semana 10 y 16 los animales se vacunaron (indicado por flechas) ya sea con mezclas de MVA recombinante o solución salina. Figura 9: Respuesta humoral generada a VIS después de infección y vacunaciones con MVA recombinante . 3 grupos (n=6) se infectaron con un aislado patógeno de VIS (semana 0) y luego se trataron con la terapia ant irretroviral (P PA; indicado por línea negrita) . Los monos se vacunaron con mezclas de MVA recombinante o solución salina en la semana 10 y en la 16. Los anticuerpos a VIS se determinaron utilizando lisados de células T como antigeno en un ensayo de ELISA estándar. Figura 10: Respuesta humoral generada para MVA en monos infectados con VIS sometidos a terapia ant irretroviral . 3 grupos (n=6) se infectaron con un aislado patógeno de VIS (semana 0) y luego se trataron con la terapia antirretroviral (PMPA; indicado por línea negrita) . Los monos se vacunaron con mezclas de MVA recombinante en solución salina en la semana 10 y en la 16. Los anticuerpos para MVA se determinaron utilizando un ensayo de ELISA de captura estándar de MVA. Figura 11: Inducción de anticuerpos para MVA después de vacunación de ratones con diferentes vacunas de viruela. Los niveles de anticuerpos generados para MVA después de vacunaciones con MVA-BN (semana 0 y 4) , se compararon a las cepas convencionales de vaccinia, Elstree y Wyeth, administ adas vía escarificación en la cola (semana 0) , MVA 572 (semana 0 y 4) y MVA-BN 572 administrado como una vacuna pre-Elstree. MVA 572 ha sido depositado en la colección europea de cultivos celulares animales como ECACC V94012707. Los títulos se determinaron utilizando un ensayo de ELISA de captura y se calcularon mediante regresión lineal, utilizando la parte lineal de la gráfica y definidos como la dilución que resultó en una densidad óptica de 0.3. *MVA-BN : MVA-BN es significativamente (p>0.05) diferente a MVA 572.-MVA 572.
E emplos Los siguientes ejemplos ilustrarán adicionalmente la presente invención. Se debe comprender perfectamente por una persona experta en la técnica que los ejemplos proporcionados no pueden ser interpretados de ninguna manera en una forma que limiten la aplicabilidad de la tecnología proporcionada por la presente invención para estos ejemplos.
Ejemplo 1 Cinética de desarrollo de una cepa nueva de MVA en líneas celulares seleccionadas y replicación in vivo (i) Cinética de desarrollo en líneas celulares : Para caracterizar una cepa aislada de acuerdo a la presente invención (posteriormente denominada como MVA-BN) la cinética de desarrollo de esta cepa nueva se comparó a aquellas de otras cepas de MVA, las cuales ya habían estado caracterizadas. El experimento se realizó comparando la cinética de desarrollo de los siguientes virus en las células primarias y líneas celulares subsecuentemente listadas : MVA-BN (reserva de virus # 23, 18. 02. 99 crudo, titulado a 2.0 x 107 TCID50/ml) ; MVA como se caracterizó por Altenburger (patente norteamericana 5,185,146) y denominada de aquí en adelante como MVA-HLR; MVA (paso 575) como se caracterizó por Antón Mayr (Mayr, A., et al.
[1975] Infection 3; 6-14) y de aquí en adelante denominada como MVA 575 (ECACC V00120707); y MVA-Vero como se caracterizó en la Solicitud de Patente Internacional PCT/EP01 / 02 03 (WO 01/68820) (reserva de virus, pasaje 49, # 20, 22. 03. 99 crudo, titulado "a 4.2 x 107 TCIDso/ml) . Las células primarias y las lineas celulares utilizadas fueron: CEF Fibroblastos de embrión de pollo (recientemente preparados de huevos de SPF) ; HeLa Adenocarcinoma de cervix humano (epitelial, ATCC N° CCL-2 : 143B Osteosarcoma óseo humano TK-, ECACC N° 91112502 ; HaCaT Linea celular de queratinocitos humanos, Boulamp et al. 1988 , J Cell Biol 106(3) : 761- 71; BHK Riñon de hámster bebé, ECACC 85011433; Vero Fibroblastos de riñón de mono verde africano, ECACC 85020299; CV1 Fibroblastos de riñón de mono verde africano, ECACC 87032605. Para la infección, las diferentes células se sembraron en placas de 6 pozos a una concentración de 5 x 105 células/pozo y se incubaron toda la noche a 37°C, con C02 al 5% en DMEM (Gibco, Cat. N° 61965-026) más 2% de FCS. El medio de cultivo natural se retiró y las células se infectaron aproximadamente a 0.05 moi por una hora a 37°C, en C0¿ al 5% (para la infección se asumió que los números celulares se duplicaron toda la noche) . La cantidad de virus utilizada para cada infección de los diferentes tipos celulares fue de 5 x 104 TCID50 y ésta será denominada como Input. Las células fueron posteriormente lavadas 3 veces con DMEM y finalmente 1 mi de DMEM, se agregó 2% de FCS y las placas se dejaron incubar por 96 horas (4 días) a 37°C, en 5% de CO2. Estas infecciones se detuvieron al congelar las placas a -80°C listas para el análisis de titulación.
Análisis de titulación ( inmunoteñido con un anticuerpo especifico de virus de vaccinia) Para la titulación de la cantidad de virus, se sembraron células de prueba (CEF) sobre placas de 96 pozos en RPMI (Gibco, Cat . N° 61870-010), 7% de FCS, 1% de antibiótico/antimicótico (Gibco, Cat. N° 15240-062) a una concentración de 1 x 104 células/pozo y se incubaron toda la noche a 37°C, con CO2 al 5%. Las placas de 6 pozos que contenían los experimentos de infección se congelaron/descongelaron 3 veces y se prepararon diluciones de 10"1 a 10~12 utilizando medio de desarrollo RPMI. Las diluciones de virus se distribuyeron sobre las células probadas y se incubaron por 5 dias a 37°C, en C02 al 5% para permitir el desarrollo de CPE (efecto citopático) . Las células se probaron (acetona/metanol 1:1) por 10 minutos, se lavaron con PBS y se incubaron con anticuerpo especifico de virus de vaccinia policlonal (Quartett Berlin, Cat . N° 9503-2057) a dilución de 1:1000 en amortiguador de incubación por una hora a temperatura ambiente. Después de lavar 2 veces con PBS (Gibco, Cat. N° 20012-019) el . anticuerpo anti-conejo acoplado a HPR (Promega Mannheim, Cat. N° W411) se agregó a una dilución de 1:1000 en amortiguador de incubación (PBS que contenia FCS al 3%) por una hora a temperatura ambiente. Las células se lavaron nuevamente 2 veces con PBS y se incubaron con solución de tinción (10 mi de PBS + 200 µ? de solución saturada de o-dianisidina en 100% de etanol + 15 µ? de H202 recién preparada) hasta que fueron visibles manchas cafés (2 horas) . La solución de tinción se retiró y se agregó PBS para detener la reacción de tinción. Se mostró perfectamente una mancha café, se marcó como positiva para CPE y el titulo se calculó utilizando la fórmula de aerber (basado en TCID50) (Kaerber, G. 1931. Arch. Exp. Pathol. Pharmakol. 162, 480) .
Los virus se utilizaron para infectar grupos por duplicado de CEF y BHK por un lado, los cuales se esperaba eran permisivos para MVA, y por otro lado CV-1, Vero, HeLa, 143B y HaCaT que se esperaba eran no permisivos para MVA, a una baja multiplicidad de infección, por ejemplo, 0.05 unidades infecciosas por célula (5 x 104 TCID50) - Después de esto, el inoculo viral se retiró y las células se lavaron 3 veces para eliminar cualesquiera virus remanentes no absorbidos. Las infecciones se dejaron por un total de 4 día-s, en donde los extractos virales se prepararon y luego se titularon sobre células CEF. La tabla 1 y la figura 1 muestran los resultados de los ensayos de titulación, en donde los valores se dan como cantidad total de virus producida después de 4 dias de infección. Se mostró que todos los virus amplificaron perfectamente bien en células CEF (fibroblastos de embrión de pollo) como se esperaba, ya que esta es una línea celular permisiva para todos los MVAs . Adicionalment e se mostró que todos los virus se amplificaron perfectamente en BHK (linea celular de riñón de hámster) . MVA-Vero se desempeñaron mejor, ya que BHK es una línea celular permisiva. Respecto a la replicación en células Vero (línea celular de riñón de mono) MVA-Vero se amplificó perfectamente como se esperaba, específicamente 1000 veces por arriba de Input. MVA-HLR y también MVA-575 se amplificaron perfectamente con 33 veces y 10 veces se incrementaron por arriba de Input, respectivamente. Se encontró que únicamente MVA-BN no se amplificó también en estas células en comparación a las otras, específicamente únicamente un incremento de 2 veces superior a Input. También se encontró que respecto a la replicación en células CV1 (línea celular de riñón de mono) , MVA-BN es grandemente atenuado en esta línea celular. Se mostró una disminución de 200 veces por debajo de Input. También MVA 575 no se amplificó por arriba del nivel de Input, también mostró una amplificación ligeramente negativa, a saber disminución de 16 veces por debajo de Input. MVA-HLR amplificó lo mejor con incremento de 30 veces por arriba de Input, seguida por MVA-Vero con incremento de 5 veces por arriba de Input. Lo más interesante es comparar la cinética de desarrollo de varios virus en las líneas celulares humanas. Respecto a la replicación reproductiva en células 143B (línea celular de cáncer óseo humano) se mostró que MVA-Vero fue la única para mostrar amplificación superior a Input (incremento de 3 veces) .
Todos los otros virus no se amplificaron por arriba de Input, sino que tuvieron una gran diferencia entre MVA-HLR y MVA-BN y MVA-575 conjuntamente. MVA-HLR fue el "limite" (disminución de una vez por debajo de Input) , como MVA-BN muestra la mayor atenuación (disminución de 300 veces por debajo de Input) seguida por MVA-575 (disminución de 50 veces por debajo de Input) . Para resumir, MVA-BN es superior respecto a la atenuación en células 143B humanas. Además, respecto a la replicación en células HeLa (células de cáncer de cervix humano) se ha mostrado que MVA-HLR amplificó perfectamente en esta linea celular, e incluso mejor que lo hizo en las células BHK permisivas (HeLa = incremento de 125 veces por arriba de Input; BHK incremento de 88 veces por arriba de Input) MVA-Vero también se amplificó en esta linea celular (incremento de 27 veces por arriba de Input) . Sin embargo, MVA-BN y también a un grado menor MVA-575 se atenuaron en estas líneas celulares (MVA-BN = disminución de 29 veces por debajo de Input y MVA-57 = disminución de 6 veces por debajo de Input) . Respecto a la replicación en células HaCaT (linea celular de queratinocitos humanos) se mostró que MVA-HLR se amplificó perfectamente en esta línea celular (incremento de 55 veces superior a Input) .
Tanto MVA-Vero adaptada y MVA-575 mostraron amplificación en esta línea celular (incremento de 1.2 y 1.1 veces superior a Input) . Sin embargo, MVA-BN fue la única en demostrar atenuación (disminución de 5 veces inferior a Input) . En conclusión, se puede establecer que MVA-BN es la cepa viral más atenuada en este grupo de virus: MVA-BN demuestra ser extremadamente atenuada en líneas celulares humanas al mostrar una proporción de amplificación de 0.05 a 0.2 en células de riñón embrionario humano (293: ECACC N° 85120602) (datos no incorporados en la tabla 1) , muestra además una proporción de amplificación de aproximadamente 0.0 en células 143B una proporción de ampli icación de aproximadamente 0.04 en células HeLa; una proporción de amplificación de aproximadamente 0.22 en células HaCaT . Adicionalmente, MVA-BN mostró una proporción de amplificación de aproximadamente de 0.0 en células CV1. Únicamente en células Vero la amplificación pudo ser observada (proporción de 2.33) , sin embargo, no al mismo grado que en las líneas celulares permisivas tales como BHK y CEF (comparar con la tabla 1) . Por lo tanto MVA-BN es la única cepa de MVA conocida que muestra una proporción de amplificación menor a 1 en todas las lineas celulares humanas 143B, HeLa, HaCaT y 293. MVA-575 muestra un perfil similar a MVA-BN pero no tan atenuado como MVA-BN. MVA-HLR amplificada perfectamente en todas las líneas probadas (excepto por la célula 143B) , de este modo puede ser considerada como replicación competente en todas las líneas celulares probadas con excepción de las células 143B. En un caso incluso se amplificó mejor en una línea celular humana (HeLa) que en una línea celular permisiva (BHK) . MVA-Vero mostró amplificaciones en todas las líneas celulares pero a un grado menor que lo demostrado por MVA-HLR (ignorando el resultado de 143B) . Sin embargo, no se puede considerar como que es de la misma "clase", con respecto a la atenuación, como MVA-BN o MVA-575. 2. Replicación in vivo Dado que algunas cepas de MVA se replican claramente in vitro, la habilidad de cepas MVA diferentes se examinó para replicarse in vivo utilizando un modelo de ratón transgénico AGR129. Esta cepa de ratón tiene interrupciones objetivo genéticas en el tipo I del receptor de IFN (IFN-a/ß) y genes del tipo II (IFN-?) y en RAG. Debido a estas interrupciones, los ratones no tienen sistema IFN y son incapaces de producir células maduras B y T y como tales se encuentran severamente inmunocompromet idos y altamente susceptibles a un virus de replicación. Grupos de 6 ratones fueron inmunizados ( int raper i t onea lmente ) con 107 ufp ya sea de MVA-BN,. MVA-HLR o MVA-572 (utilizada en 120,000 personas en Alemania) y monitoreada diariamente para los signos clínicos. Todos los ratones vacunados con MVA-HLR o MVA-572 murieron dentro de 28 y 60 días, respectivamente. En la necropsia existieron signos generales de una infección viral severa en la mayoría de los organismos y mediante un ensayo de placa estándar MVA (108 ufp) se recuperaron de los ovarios. En contraste, ratones vacunados con la misma dosis de MVA-BN (correspondiente a la cepa depositada ECACC V00083008) sobrevivieron por más de 90 días y ningún MVA pudo ser recuperado de los órganos o tejidos. Cuando se toman conjuntamente los datos de los estudios in vitro e in vivo, se demuestra claramente que MVA-BN es más grandemente atenuado que la cepa MVA-HLR progenitora y comercial.
Ejemplo 2 Datos inmunológicos e in vivo Estos experimentos se establecieron para comparar diferentes regímenes de dosis y de vacunación de MVA-BN en comparación a otros MVAs . 2.1. Cepas diferentes de MVA que difieren en su habilidad para estimular la respuesta inmune.
Cepas competentes de replicación de vaccinia inducen respuestas inmunes potentes en ratones y a altas dosis son letales. Aunque MVA son grandemente atenuados y tienen una habilidad reducida para replicarse en células de mamífero, existen diferencias en la atenuación entre cepas di ferentes de MVA. Por supuesto, MVA-BN parece ser ñas atenuada que otras cepas de MVA, incluso la c p i :.. rogenitora 575. Para determinar si esta diferenci i la atenuación afecta en la eficacia de MVA i inducir respuestas protectoras inmunes, dosis di tironees de MVA-BN y MVA 575 se compararon en un modelo de reto de vaccinia letal. Los niveles de protección se midieron mediante una reducción en títulos eváricos de vaccinia determinados 4 días después del reto, ya que esto permitió una evaluación cuantitativa de dosis y cepas diferentes de MVA.
Modelo de reto letal Ratones BALB/c hembras de 6 a 8 semanas de edad, libres de patógenos, específicos (H-2d) (n=5) se inmunizaron int raper itonealmente con dosis diferentes (102, 10" o 106 TCIDso/ml) ya sea de MVA-BN o MVA 575. MVA-BN y MVA 575 se propagaron en células CEF, .y se habían purificado con sucrosa y formulado en Tris a pH 7.4. Tres semanas después, los ratones recibieron un refuerzo de la misma dosis y cepa de MVA, lo cual siguió 2 semanas después por un reto letal (intraperitoneal) con una cepa de replicación competente de vaccinia. Como el virus de vaccinia competente de replicación (abreviado como "rVV") se utilizaron ya sea la cepa WR-L929 TK+ o bien la cepa IHD-J. Los ratones control recibieron una vacuna de placebo. La protección se midió por la reducción en títulos ováricos determinados 4 días después del reto por ensayo estándar en placa. Para esto, los ratones se sacrificaron en el día 4 después del reto y los ovarios se retiraron, se homogeneizaron en PBS (1 mi) y los títulos virales se determinaron mediante ensayo estándar en placa utilizando células Vero (Thomson et al., 1998, J. Immunol. 160: 1717) . Los ratones vacunados con 2 inmunizaciones ya sea de 104 o 106 TCID50/ml de MVA-BN o VA 575 se protegieron completamente como se juzgó por una reducción del 100% en títulos ováricos de rVV 4 días después del reto (figura 2) . El virus de reto se aclaró- Sin embargo, las diferencias en los niveles de protección proporcionados por MVA-BN o MVA-575 se observaron a dosis inferiores. Los ratones que recibieron 2 inmunizaciones de 102 TCIDso/ml de MVA 575 fallaron para ser protegidos como se juzgó por los títulos altos de rVV en ovario (media 3.7 x 107 ufp +/-2.11 x 107) . En contraste, los ratones vacunados con la misma dosis de MVA-BN indujeron una reducción significativa (96%) en títulos de rVV en ovarios (media 0.21 x 107 ufp +/- 0.287 x 107) . Los ratones control que recibieron una vacuna de placebo tuvieron un título viral medio de 5.11 x 107 ufp (+/- 3.59 x 107) (figura 2) . Ambas cepas de MVA inducen respuestas inmunes protectoras en ratones contra un reto de rVV letal. Aunque ambas cepas de MVA son igualmente eficientes a dosis más altas, las diferencias en su eficacia son claramente diferentes a dosis sub-óptimas. MVA-BN es más potente que su cepa progenitora MVA 575 al inducir una respuesta inmune protectora contra un reto de rVV letal lo cual puede ser relacionado a la atenuación incrementada de MVA-BN en comparación a MVA-575. 2.2. MVA-BN en regímenes de vacunación de cebador-refuerzo . 2.2.1. : Inducción de anticuerpos para MVA después de la vacunación de ratones con vacunas diferentes de viruela .
La eficacia de MVA-BN se comparó a otras cepas de MVA y vaccinia previamente utilizadas en la erradicación de viruela. Éstas incluyeron inmunizaciones simples utilizando las cepas de vaccinia Elstree y yeth producidas en células CEF y administrando vía escarificación en la cola e inmunizaciones utilizando MVA 572 que se usó previamente en el programa de erradicación de viruela en Alemania. Además, MVA-BN y MVA 572 se compararon como una prevacuna seguida por Elstree vía escarificación. Para cada grupo, 8 ratones BALB/c se utilizaron y todas las vacunaciones de MVA (1 X 107 TCID50) se administraron subcutáneamente en la semana 0 y en la semana 3. 2 semanas después de la inmunización de refuerzo, los ratones se retaron con vaccinia (IHD-J) y los títulos en los ovarios se determinaron 4 días después del reto. Todas las vacunas y los regímenes indujeron protección de 100%. Las respuestas inmunes inducidas que utilizaron estas diferentes vacunas o regímenes se midieron en animales antes del reto. Fueron utilizados los ensayos para medir los niveles de anticuerpos de neutralización, proliferación de células T, producción de citocina (IFN-? vs . IL-4) y producción de IFN-? por células T. El nivel de las respuestas de células T inducidas por MVA-BN, como se midió por ELISPOT, fue generalmente equivalente a otro MVA y virus de vaccinia demostrando bio-equivalenci . Un análisis semanal de los títulos de anticuerpo para MVA después de los diferentes regímenes de vacunación reveló que las vacunaciones con MVA-BN aumentaron significativamente la velocidad y magnitud de la respuesta de anticuerpos en comparación a los otros regímenes de vacunación (figura 11) . Por supuesto, los títulos de anticuerpo para MVA fueron significativamente mayores (p>0.05) en las semanas 2, 4 y 5 (1 semana después del refuerzo en la semana 4) cuando se vacunaron con MVA-BN en comparación a ratones vacunados con MVA 572. Después de la vacunación de refuerzo en la semana 4, los títulos de anticuerpo fueron también significativamente más altos en el grupo de MVA-BN en comparación a los ratones que recibieron una vacunación simple ya sea de las cepas de vaccinia Elstree o Wyeth. Estos resultados demuestran claramente que dos vacunaciones con MVA-BN indujeron una respuesta de anticuerpo superior en comparación a la vacunación simple clásica con cepas de vaccinia tradicionales (Elstree y Wyeth) y confirman los hallazgos de la sección 1.5 de que MVA-BN es más inmunogénica que otras cepas de MVA. 2.2.2. : Regímenes de MVA-cebador y refuerzo generan el mismo nivel de protección que regímenes de ADN-cebador/refuerzo en un modelo de reto de influenza.
La eficacia de r>:.::^nes de MVA cebador-refuerzo para generar respuestas de CTL de gran avidez, se evaluó y se comparó a e- de ADN-cebador /MVA-refuerzo que habían sido : -'uorLadas que eran superiores. Los regímenes i r-? rentes se evaluaron utilizando una construcción de polítope murino codificado ya sea por un vector de ADN o de MVA-BN y los niveles de inducción de CTL se compararon por ELISPOT, al tiempo que la avidez de la respuesta se midió como el grado de protección proporcionada después de un reto con influenza.
Construcciones El plásmido de ADN que codifica para el politope murino (epitopes 10 CTL incluyendo influenza, ovalbúmina) se describió previamente (Thomson et al. , 1998, J. Immunol. 160: 1717) . Este politope murino se insertó en el sitio de supresión II de VA-BN, se propagó sobre células CEF, se purificó con sucrosa y se formuló en Tris a pH 7.4.
Protocolos de vacunación En el patógeno especifico del estudio actual se utilizaron ratones BALB/c (H-2d) hembras de 6 a 8 semanas de edad, libres de patógenos, específicos. Grupos de 5 ratones se utilizaron para análisis de ELISPOT mientras que 6 ratones por grupo se utilizaron para los expe imentos de reto con influenza. Los ratones se vacunaron con regímenes diferentes de cebador-refuerzo utilizando MVA o ADN que codifica para el politope murino como se detalla en los resultados. Para las inmunizaciones con ADN, los ratones se anestesiaron y se les administró una inyección simple de 50 µq de ADN plasmidico libre de endotoxina (en 50 µ? de ???) en el músculo cuadríceps bajo anestesia. Las inmunizaciones primarias utilizando MVA se realizaron ya sea por administración intravenosa de 107 ufp de VA-BN por ratón o mediante administración subcutánea de 107 ufp o 108 ufp de MVA-BN por ratón. Las inmunizaciones de refuerzo se administraron 3 semanas después de las inmuni aciones primarias. El refuerzo con ADN plasmidico se realizó de la misma manera que la inmunización primaria con ADN (ver anteriormente) . Con el fin de establecer respuestas de CTL se realizaron ensayos de ELISPOT estándares (Schneider et al., 1998 , Nat. Med. 4; 397-402) sobre esplenocitos 2 semanas después de la última inmunización de refuerzo utilizando el péptido de epítope de CTL de influenza (TYQRTRALV) , el péptido de epítope de P. Berghei (SYIPSAEKI) , el epítope del péptido de Citomegalovirus (YPHFMPTNL) y/o el epítope del péptido LCV (RPQASGVYM) . Para los experimentos de reto, los ratones se anestesiaron y se infectaron i.n. con una dosis sub-letal del virus de influenza recurrente, Mem71 (4.5 x 105 ufp en 50 mi de PBS) . En el día 5 después de la infección, se retiraron los pulmones y los títulos virales se determinaron por duplicado en la línea celular de riñón canino Madin-Darby utilizando un ensayo de placa de influenza e s tánda r .
Resultados: Utilizando la vacuna de ADN sola, la inducción de CTL para los epitopes 4 H-2d codificados por el politope murino fue pobre y únicamente pudieron ser detectadas respuestas débiles de 2 de los epitopes para P. Berghei (SYIPSAEKI) y el virus de coriomeningi t i s linfocítica (RPQASGVYM) . En contraste, utilizando un régimen de cebador de ADN-refuerzo de MVA (107 ufp MVA-BN administrada subcutáneamente) fueron significativamente más CTL inducidos a SLY (incremento de 8 veces) y RPQ (incremento de 3 veces) y también se observaron respuestas para un tercer epitope para Citomegalovirus murino (YPHFMPTNL) (figura 3A) . Sin embargo, utilizando 107 ufp de MVA-BN administrada subcutáneamente en un régimen de cebador-refuerzo homólogo indujo el mismo nivel de respuestas que ADN seguida por MVA-BN (figura 3A) . Sorprendentemente, no existió diferencia significativa en los números de CTLs inducidos para los 3 epitopes cuando se utilizó una inmunización de MVA-BN (10; TCID¾o) indicando que una inmunización secundaria con MVA-BN no produjo respuestas signif cativas de CTL de refuerzo. La administración subcutánea de 10' ufp de MVA había mostrado previamente ser la ruta y la concen ración viral más ineficientes para la vacunación utilizando otras cepas de MVA, particularmente en comparación a inmunizaciones intravenosas (Schneider et al 1998) . Con el fin de definir regímenes óptimos de inmunización, el experimento anterior se repitió medíante el cambio ya sea de la cantidad de virus o medíante el cambio del modo de administ ación. En un experimento, se administraron intravenosamente vacunaciones de 107 ufp de MVA-BN (figura 3B) . En un experimento adicional se administraron subcutáneamente 108 ufp de MVA-BN (figura 3C) . En estos experimentos, las inmunizaciones de cebador-refuerzo de MVA-BN indujeron números de CTL en promedio más altos a todos los 3 epítopes de CTL en comparación a los regímenes de ADN-cebador /MVA-refuerzo . También, de manera diferente se administraron subcutáneamente 107 ufp de MVA-BN, la inmunización con 107 ufp de MVA-BN administrada subcutáneamente y la inmunización con 10s ufp administrada subcutáneamente significati amente reforzó las respuestas de CTL, indicando claramente que MVA-BN puede ser utilizada para respuestas de CTL de refuerzo en presencia de una inmunidad preexistente para el vecto r . 2.2.3. : Eficacia de una vacuna de MVA-BN nef en monos R esus infectados con VIS.
Para determinar la eficacia de una vacuna MVA-BN nef mediante la evaluación de la carga viral y el retraso de la enfermedad después de un reto con un aislado primario virulento de VIS. Además, el estudio determinará si MVA-BN puede ser utilizado para reforzar de manera segura respuestas inmunes en monos inmunocomprometidos con una inmunidad preexistente a MVA.
Protocolos de vacunación Do s grupo s ( n= 6 ) monos Rhesus {Macaca mulalta) se vacunaron con i;:, ::.vección intramuscular de bolo ya sea con MVA-BN sol. ? MVA-BN recombinante nef en la semana 0, 8 y 16. r la semana 22, todos los monos se retaron con 50 MID de una reserva de VIS asociada a célula patogénica (1XC) de PBMC de mono Rhesus no cultivado, primario or la ruta intravenosa, El estado clínico de los animales se verificó frecuentemente y las muestras sanguíneas regulares se recogieron para la medición de viremia, parámetros de inmunidad, y un intervalo completo de parámetros de química clínica sanguínea y hematológica . Se sacrificaron los animales que desarrollaron enfermedad similar al SIDA y los monos sobrevi ientes se revisaron periódicamente por 9 semanas después de la vacunación. En la semana 100, los monos sobrevivientes se inmunizaron todos i. . con MVA-BN tat y recibieron inmunizaciones adicionales con el mismo MVA-BN tat en las semanas 102 y 106. No se observaron efectos adversos después de cualquiera de las vacunaciones ya sea de MVA-BN o de MVA-BN nef. Después de la infección de los monos con VIS, se mostraron los niveles de erisipela y viremia marcadamente y con picos dos semanas después de la infección (figura 4) . Debido a las grandes desviaciones estándares dentro de los grupos, no existió diferencia significativa en los niveles medios de VIS entre los grupos vacunados con MVA-BN o MVA-BN. Sin embargo, existió una carga de VIS inferior a 10 veces general en el grupo vacunado con MVA-BN nef en comparación al grupo control (MVA-BN) . Además, después de 35 semanas posteriores a la infección (el periodo de observación inicial) únicamente una salida de los 6 monos vacunados con MVA-BN nef tuvo que ser sacrificado debido a la severidad de la enfermedad, en comparación a 4 salidas de los 6 animales en el grupo control (figura 5) . El desarrollo de enfermedad claramente se correlacionó con una carga de virus más alta y como tal, los animales se observaron por un periodo adicional de 29 semanas después de la infección. La vacuna de MVA-BN nef pareció retrasar la aparición de la enfermedad, en comparación al grupo control e incluso en la semana 46 después de la infección, 5 salidas de los 6 animales con MVA-BN sobrevivieron (figura 5) . Sin embargo, por la infección posterior a la semana 59, 2 animales adicionales en el grupo vacunado con nef se sacrificaron, dejando 5 animales sobrevivientes (3 del grupo MVA-BN nef y 2 vacunados con MVA-BN) . Un examen de los títulos de anticuerpo generados para MVA-BN en estos 12 monos demostró claramente que MVA-BN pudo reforzar la respuesta inmune aún en presencia de una inmunidad preexistente a MVA (figura 6) . Después de la inmunización primaria ya sea con MVA-BN o MVA-BN nef, todos los monos generaron una respuesta de anticuerpo a MVA con un titulo medio de 1000. Esta respuesta de anticuerpos fue significativamente reforzada después de la inmunización secundaria, demostrando claramente que MVA puede ser utilizada para respuesta inmune de cebador-refuerzo en monos saludables. Estos títulos de anticuerpos gradualmente disminuyeron, aunque por la semana 49 después de la inmunización, los títulos se nivelaron, tales como los títulos medios para MVA en la semana 99 que fueron de 2000. Los 5 monos sobrevivientes se infectaron con VIS y se inmunocomprometieron con cuentas de CD4 inferiores a 400/µ1 en sangre. Para investigar el impacto de la utilización de MVA-BN en monos inmunocompromet idos , los 5 animales tuvieron vacunación 3 veces con MVA-BN tat en la semana 100, 102 y 106 después de la vacunación inicial. La primera inmunización con MVA-BN tat reforzó significativamente la respuesta de anticuerpos a MVA en estos monos inmunocomprometidos , lo que fue adicionalmente reforzado con la tercera inmunización 6 semanas después (figura 6) . Estos resultados muestran además que MVA-BN puede reforzar respuestas inmunes en presencia de una inmunidad preexistente significativa para MVA, incluso en monos inmunocomprometidos. Aunque la respuesta inmune de los monos fue reforzada después de las inmunizaciones con MVA-BN tat, los niveles de VIS permanecieron estables, indicando que las inmunizaciones con MVA-BN son seguras y no afectan los niveles de VIS en monos inmunocompromet idos (figura 7) . Este estudio demostró que MVA-BN puede cebar-reforzar respuestas inmunes en monos rhesus inmunocomprometidos y que las inmu izaciones de MVA-BN son seguras y no afectan los niveles de viremia en animales infectados con VIS. El retraso en la progresión del VIS de la enfermedad similar al SIDA en los animales vacunados con la vacuna MVA-BN nef, indica que una respuesta inmune se generó exitosamente para nef . 2.2.4. : Vacunación terapéutica de monos infectados con VIS sometidos a tratamiento antirretroviral Es probable que una vacuna de HIV terapéutica basada en MVA-BN sea utilizada en individuos sometidos a terapia antirretroviral . Por lo tanto, este estudio investigó la seguridad (efectos sobre los niveles de VIS) y la eficacia de MVAs recombinantes que codifican para una variedad de antigenos de VIS (gag, pol, env, rev, tat, y nef) en monos infectados con VIS tratados con PMPA. PMPA es un análogo de nucleósidos y es efectivo contra VIH y VIS (Rosenwirth, B. et al., 2000, J Virol 74, 1704-11) .
Construcciones Todas las construcciones de MVA recombínantes se propagaron en células CE F , se purificaron con sucrosa y se formularon en Tris a pH 7.4.
Protocolo de vacunación Se infectaron 3 grupos (n=6) de monos rhesus {Macaca muía Ita) con 50 MID 0 con un VIS aislado patógeno (1XC) y luego se trataron diariamente con PMPA (60 mg/kg administrado subcutáneamente) por 19 semanas. En la semana 10, los animales se vacunaron con MVA-BN recombinante ( intramuscuia rmen e ) , o solución salina y recibieron vacunaciones idénticas 6 semanas después. El grupo 1 recibió una mezcla dn MVA y gat-pol MVA-env, el grupo 2 recibió MVA-tat, M'.'A-rev y MVA-nef, mientras gue el grupo 3 recibió so L ..n salina. El estado clínico de los animales se r ¦¦¦.·-..- - frecuentemente y las muestras sanguíneas regularas -; recogieron para la medición de viremia, parámetros Lnrnunes, y un intervalo total de parámetros de hematología y química clínica sanguínea . Todos los animales es ablecie on altas cargas de VIS que alcanzaron picos dos semanas después de la infección (figura 8) . Después de tratamiento diario con PMPA, los niveles de VIS disminuyeron y se estabilizaron a niveles bajos en la semana 9. Como en las vacunaciones de estudio previas con MVA, en la semana 10 y 6 no hubo efecto sobre los niveles de VIS, indicando que VA-BN es un vector de vacuna seguro para animales inmunocomprometidos . Una vez que los animales salieron del tratamiento con PMPA (semana 21) los niveles de VTS se incrementaron. Aunque 3 animales en el grupo 1 tuvieron niveles reducidos de VIS en comparación al grupo control 3, no existió diferencia signi icativa en la carga de VIS media entre cualquiera de los grupos después del final del tratamiento con PMPA (figura 8) . Utilizando un ensayo de ELISA para VIS, se infectaron animales con Usados de células T en todos los grupos, que generaron una respuesta de anticuerpos para VIS por la semana 4 después de la infección (figura 9) . El titulo de anticuerpos de VIS en el grupo control (solución salina) cayó durante el tratamiento con PMPA y aumentó rápidamente cuando se detuvo el tratamiento con PMPA, reflejando la caída y el incremento subsecuente en los niveles de VIS durante la terapia antirretroviral (figura 9) . Se observó un patrón similar en el título de anticuerpos por VIS en el grupo 2 que recibió MVA-tat, MVA-rev y MVA-nef, posiblemente reflejando su expresión de estas proteínas reguladoras en los lisados de células T infectados con VIS utilizados en el ensayo de ELISA. En contraste, sin embargo, los títulos de anticuerpos anti-VIS en el grupo 1 se incrementaron después de las vacunaciones con MVA gag-pol y MVA-env en la semana 10, indicando que MVA-BN recombinante puede reforzar la respuesta inmune para VIS en animales infectados (VIS) sometidos a terapia ant irretroviral . De manera importante, los títulos de anticuerpo anti-VIS se reforzaron después de la segunda inmunización en la semana 16, demostrando nuevamente que MVA puede reforzar respuestas inmunes en animales inmunocomprometidos , aún en presencia de una inmunidad preexistente a MVA (figura 8) . Los títulos de anticuerpo anti-MVA en el grupo 1 también reflejaron este patrón con la generación de una respuesta de anticuerpo después de la inmunización primaria y ésta se reforzó significativamente después de la vacunación secundaria (figura 10) .
Referencias Schneider, J., Gilbert, SC, Blanchard, TJ., Hanke, T., Robson, J., Hannan, CM . , Becker, M . , Sinden, R., Smith, GL., y Hill, AVS . 1998. Enhanced immunogenícity for CD8+ T cell in luction and complete efficacy of malaria DNA vaccination by boostin with raodified vaccinia virus Ankara. Nat. Med. 4; 397-402. Thomson, SA . , Sherritt, MA . , Medveczky, J., Elliott, SL., Moss, DJ. , Fernando, GJP., Bro n, LE., y Suhrbier, A. 1998. Delivery of múltiple CD8 cytotoxic T cell epitopes by DNA vaccination. J. Immunol. 160:1717.
Tabla 1: Amplificación viral superior al nivel de Input después de 4 días de infección. Proporción de amplificación = TCID50 de Output - TCID50 de Input. Los valores están en TCID5o.

Claims (27)

REIVINDICACIONES
1. Virus de vaccinia que tiene al menos una de las siguientes propiedades: (i) capacidad de replicación reproductiva en fibroblastos de embrión de pollo (CEF) y en la linea celular BHK de riñon de hámster bebé, pero incapacidad de replicación reproductiva en la linea celular humana HaCaT de queratinocitos ; (ü) falla para replicarse in vivo; (iü) inducción de una inmunogenicidad mayor comparada a la cepa conocida MVA 575 en un modelo de reto letal y/o (iv) inducción de al menos sustancialmente el mismo nivel de inmunidad en regímenes de cebador de virus de vaccinia/refuerzo de virus de vaccinia cuando se compara a regímenes de ADN-cebador/refuerzo de virus de vaccinia .
2. Virus de conformidad con la reivindicación 1, en donde el virus no es capaz de replicarse reproductivamente en ninguna de las siguientes líneas celulares humanas: la línea celular 293 de riñón embrionario humano, la línea celular 143B de osteosarcoma óseo humano y la línea celular HeLa de adenocarcinoma de cervix humano.
3. El virus de conformidad con la reivindicación 1 ó 2 que está depositado en la colección europea de cultivos celulares (ECACC) , Salisbury (Reino Unido) bajo el número V00083008 y los derivados del mismo.
4. El virus de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende al menos una secuencia heteróloga de ácido nucleico.
5. El virus de conformidad con la reivindicación 4, en donde la secuencia heteróloga de ácido nucleico se selecciona de una secuencia que codifica para al menos un antíqeno, epitope antigénico, y/o un compuesto terapéutico.
6. Genoma o part r'uncionales del mismo, derivados del virus de con:, ir: dad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.
7. Composición farmi '-v.;t :ca que comprende el virus de conformiaad c y. cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 y/o el genoma y/o parte funcional del mismo de conformidad con la reivindicación 6 y un portador, diluyente y/o aditivo, farmacéuticamente aceptables.
8. Vacuna que comprende el virus de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 y/o el genoma y/o parte funcional del mismo de conformidad con la reivindicación 6.
9. El virus de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, el genoma y/o .parte funcional del mismo de conformidad con la reivindicación 6, la composición de conformidad con la reivindicación 7 o la vacuna de conformidad con la reivindicación 8 como fármaco para efectuar, preferentemente inducir, una respuesta inmunológica en un animal viviente, incluyendo un humano.
10. El virus de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, la composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 7, la vacuna de conformidad con la reivindicación 8 o el virus de conformidad con la reivindicación 9, en donde el virus, la composición o la vacuna se administra en cantidades terapéuticamente efectivas en una primera inoculación ("inoculación de cebador") y en una segunda inoculación ("inoculación de refuerzo") .
11. El uso del virus de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, y/o el genoma de conformidad con la reivindicación 6, para la preparación de un medicamento o una vacuna.
12. Método para introducir una secuencia homóloga y/o heteróloga de ácido nucleico en células objetivo, que comprende la infección de las células objetivo con el virus de conformidad con la reivindicación 4 ó 5 o la transfección de la célula objetivo con el genoma de conformidad con la reivindicación 6.
13. Método para producir un péptido, proteina y/o virus que comprende: a) infección de una célula huésped con el virus de conformidad con las reivindicaciones 1 o 5; b) culLivo de la célula huésped infectada bajo condiciones adecuadas, y c) aislamiento y/o enriquecimiento del péptido y/o proteina y/o virus producidos por la célula huésped.
14. Método para efectuar, preferentemente inducir una respuesta inmunológica en un cuerpo animal viviente incluyendo un humano, que comprende administrar el virus de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, el genoma, y/o parte funcional del mismo de conformidad con la reivindicación 6, la composición de conformidad con la rei indicación 7 o la vacuna de conformidad con la reivindicación 8, al animal o humano a ser tratado.
15. El método de conformidad con la rei indicación 14, que comprende la administración de al menos 102 TCIDS0 (dosis infecciosa de cultivo de tejido) del virus.
16. Método de conformidad con la reivindicación 14 ó 15, en donde el virus, la composición o la vacuna se administra en cantidades terapéuticamente efectivas en una primera inoculación ("inoculación de cebador") y en una segunda inoculación ("inoculación de refuerzo") .
17. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16, en donde el animal se encuentra inmunocomprome t ido .
18. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 14 a 17, en donde el animal tiene una inmunidad preexistente a los poxvirus.
19. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 14 a 18, en donde el animal es sometido a una terapia antiviral.
20. El método de conformidad con la reivindicación 19, en donde la terapia antiviral es una terapia antirretroviral .
21. El uso del virus de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, el genoma y/o parte funcional del mismo de conformidad con la reivindicación 6, como adyuvante.
22. Un método para aumentar una respuesta inmune especifica contra un antigeno y/o un epitope antigénico incluido en una vacuna, que comprende la administración del virus de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 o el genoma de conformidad con la reivindicación 6 como un adyuvante a un cuerpo animal viviente, incluyendo un humano, a ser tratado con la vacuna.
23. El virus de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 o el genoma de conformidad con la reivindicación 6 como adyuvante.
24. Una célula, preferentemente una célula humana, que contiene el virus de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 o el genoma o parte funcional del mismo de la reivindicación 6.
25. Método para obtener el virus de vaccinia de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende los siguientes pasos: introducir una cepa de virus de vaccinia comúnmente disponible, preferentemente MVA 574 en células no humanas en las cuales el virus es capaz de replicarse reproductivamente, en donde las células no humanas preferentemente son selecc i oriad s de células CEF y de la línea celular BHK; a i i de partículas virales a partir ;·¦ --seas células y analizar si el virus obtenido ti--:.-- > .' menos una de las propiedades biológicas deso ? como se definieron en la reivindicación 1, en dc-r. ie Los pasos anteriores opcionalmente pueden ser repetidos hasta que se obtenga un virus con las caract s icas deseadas de replicación .
26. Equipo para inmunización de cebador/refuerzo que comprende un virus de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, una composición de conformidad con la reivindicación 7, una vacuna de conformidad con la reivindicación 8 o un virus de conformidad con la rei indicación 9 para una primera inoculación ("inoculación de cebador") en primer f a s co / ec ipi ent e y para una segunda inoculación ("inoculación de refuerzo") en un segundo frasco/recipiente.
27. El uso del virus de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, la composición de conformidad con la reivindicación 7, la vacuna de conformidad con la reivindicación 8 o el virus de conformidad con la reivindicación 9, para la preparación de una vacuna, en donde el virus, la composición o la vacuna se administra en cantidades terapéuticamente efectivas en una primera inoculación y en una segunda inoculación.
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