KR20090057335A - 변형된 백시니아 앙카라 바이러스 변형체 - Google Patents

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폴 하울리
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Abstract

본 발명은 변형된 백시니아 앙카라 바이러스로부터 유래되고, 인간 세포주 내에서 재생산적으로 복제하는 능력이 상실된 것을 특징으로 하는 약독화된 바이러스를 제공하는 것이다. 또한, 상기 바이러스로부터 유래되는 재조합 바이러스, 및 의약품 혹은 백신으로서의 상기 바이러스 혹은 그의 재조합체의 용도에 대해서도 기재된다. 또한, 면역 저하 환자, 백신 바이러스에 대한 기존 면역성을 가지는 환자 혹은 항바이러스 치료를 받고 있는 환자에서도 면역반응을 유도하기 위한 방법도 제공한다.
백시니아, Ankara, 변이체, 백신, 폭스

Description

변형된 백시니아 앙카라 바이러스 변형체{MODIFIED VACCINIA ANKARA VIRUS VARIANT}
본 발명은 변형된 백시니아 앙카라 바이러스로부터 유래되고 인간 세포주 내에서 재생산적으로 복제하는 능력이 상실된 것을 특징으로 하는 약독화(attenuated) 바이러스를 제공한다. 또한, 상기 바이러스로부터 유래되는 재조합 바이러스 및 의약품 혹은 백신으로서의 상기 바이러스 혹은 그의 재조합체의 용도에 대해서도 기재한다. 또한, 면역저하(immuno-compromised) 환자, 백신 바이러스에 대한 기존 면역성(pre-existing immunity)을 지니는 환자 혹은 항바이러스 치료를 받고 있는 환자에서도 면역반응을 유도하기 위한 방법도 제공한다.
변형된 백시니아 앙카라(MVA) 바이러스는 폭스비리대(Poxviridae)과 오르토폭스바이러스(Orthopoxvirus)속의 일원인 백시니아 바이러스에 관련된 것이다. MVA 는 백시니아 바이러스의 앙카라 균주의 닭의 태아 섬유아세포(CVA) 상에서 516회 연속 계대에 의해 생성되었다(Mayr, A., et al. Infection 3, 6-14 [1975] 참조). 이러한 장기 계대의 결과로 획득된 MVA 바이러스는 그 게놈 서열에서 약 31킬로베이스가 결실되었으며 따라서, 조류(avian) 세포에 한정되는 매우 높은 숙주 세포 제한성을 갖는 것으로 기재되었다(Meyer, H. et al., J.Gen.Virol. 72, 1031-1038 [1991]). 각종 동물모델에서 생성된 MVA는 매우 무독화된 것으로 공지되었다(Mayr, A.& Danner, K. [1978] Dev. Biol. Stand. 41:225-34). 또한, 이 MVA 균주는 인체 천연두 질환에 대해 면역화시키는 백신으로서 임상실험에서 검사되었다(Mayr et al., Zbl.Bakt.Hyg.I, Abt. Org.B 167, 375-390 [1987], Stickl et al., Dtsch. med. Wschr. 99, 2386-2392 [1974]). 이 연구에는 위험도가 큰 환자를 포함해 120,000명이 동원되었으며, 백시니아계 백신과 비교했을 때 MVA는 독성 혹은 감염성이 감소되면서도 우수한 면역원성을 유지하는 것으로 증명되었다.
그 뒤 수십년간 MVA는 재조합 유전자 발현을 위한 바이러스 벡터 혹은 혹은 재조합 백신으로 사용하기 위해 가공처리해왔다(Sutter, G. et al. [1994], Vaccine 12:1032-40).
이러한 측면에서, Mayr 등이 1970년대에 MVA가 인간 및 포유류에서 크게 약독화 및 부독화된 것임을 발표하였음에도 불구하고, 최근의 일부 보고에 따르면(Blanchard et al., 1998, J Gen Virol 79, 1159-1167; Carroll & Moss, 1977, Virology 238, 198-211; Altenberger, US 특허 5,185,146호; Ambrosini et al., 1999, J Neurosci Res 55(5), 569), MVA는 포유류 및 인간의 세포주 내에서 잔류 복제가 발생할 수 있으므로 이들 세포에서 완전히 약독화되지 않은 것으로 입증되었다. 사용된 바이러스들은 본래 이들의 성질, 특히 다양한 세포주 내에서의 성장 형태가 상이하므로, 상기 논문에서 수득한 결과는 다양한 MVA 균주에 대해 얻어진 것으로 추정된다.
성장 형태는 바이러스 약독화를 가리키는 지표로 알려져있다. 일반적으로, 바이러스 균주는 숙주세포 내에서 재생산적으로 복제하는 능력을 잃거나 감소되기만 해도 약독화된 것으로 본다. 상술한 관찰결과, MVA가 인간 및 포유류의 세포 내에서 전혀 복제하지 않는 것은 아니므로 인간 백신 혹은 재조합 백신용 벡터로서 MVA의 절대적 안전성에 대해 의문이 제기된다.
특히, 백신 및 재조합 백신에 있어서 백신 벡터 바이러스의 효능과 안전성 간의 균형이 극히 중요하다.
따라서, 본 발명의 한가지 목적은 백신 혹은 약제 같은 더 안전한 제품의 개발을 위해 안전성이 증강된 신규 바이러스 균주를 제공하는 것이다. 또한 본 발명의 또 다른 목적은 기존의 백신접종 방식을 개선하는 방법을 제공하는 것이다.
상술한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면 비-인간 세포 및 세포주, 특히 닭 태아 섬유아세포(CEF) 및 베이비 햄스터의 신장 세포주 BHK(ECACC 85011433) 내에서의 재생산적 복제는 가능하나 인간 세포주 내에서는 재생산적 복제가 불가능한 새로운 백시니아 바이러스가 제공된다.
공지의 백시니아 균주는 적어도 일부 인간 세포주, 특히 인간 각질 세포주 HaCat 내에서 재생산적으로 복제한다(Boukamp et al., 1988, J Cell Biol 106(3): 761-71). 세포주 HaCat 내의 복제는 생체 내 복제, 특히 인간에서의 생체 내 복제의 전조이다. 실제로, 실시예 부문에서는 HaCat 내의 잔류 생산적 복제를 보여주는 모든 공지의 백시니아 균주가 역시 생체 내에서도 복제함을 나타낸다. 따라서, 본 발명은 바람직하게는 인간 세포주 HaCat 내에서 재생산적으로 복제하지 않는 백시니아 바이러스에 관한 것이다. 더 바람직하게는, 본 발명은 다음의 인간 세포주 중 어느 것에서도 재생산적 복제가 불가능한 백시니아 바이러스 균주에 관한 것이다: 인간 자궁경부 선암종 세포주 HeLa(ATCC No. CCL-2), 인간 태아 신장 세포주 293(ECACC No. 85120602), 인간 골육종 세포주 143B(ECACC No. 91112502) 및 인간 각질세포주 HaCat.
바이러스의 성장 형태 혹은 증폭/복제는 통상 감염된 세포에서 생성된 바이 러스(아웃풋) 대 최초로 세포 감염에 사용된 원래 양(인풋)의 비("증폭비")로 표현된다. 아웃풋과 인풋 사이의 비 "1"은 감염세포로부터 생성된 바이러스의 양이 세포 감염에 초기 사용된 양과 동일한 증폭상태로 규정된다. 이 상태는 감염세포가 바이러스 감염 및 바이러스 재생산을 허용한다는 사실을 시사하는 것이다.
1 미만의 증폭비 즉, 인풋 레벨 미만의 증폭감소는 재생산적 복제가 모자란다는 지표, 따라서 바이러스의 약독화에 대한 지표이다. 따라서, 여러 인간 세포주, 특히 인간 세포주 143B, HeLa, 293 및 HaCat 전체에서 1 미만의 증폭비를 나타내는 균주를 동정하고 최종적으로 분리하는 것이 특별히 요구되었다.
따라서, "재생산적으로 복제가 불가능한"이라는 문장은, 일부 특이 MVA 균주에 있어서 본 발명에 따른 바이러스가 본 명세서의 실시예 1에서 개략적으로 설명한 조건하에서 세포주 293(ECACC No. 85120602), 143B(ECACC No. 91112502), HeLa(ATCC No. CCL-2) 및 HaCat(Boukamp et al. 1988, J Cell Biol 106(3): 761-71) 등의 인간 세포주에서 1 미만의 증폭비를 나타낸다는 사실을 의미한다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 바이러스의 증폭비는 상술한 인간 세포주 HeLa, HaCat 및 143B 각각에서 0.8 이하이다.
실시예 1 및 표 1에서는 본 발명에 따른 바이러스가 세포주 143B, HeLa 및 HaCat 중의 어느 것에서도 재생산적으로 복제하지 않음을 상세히 보여준다. 실시예에서 사용된 본 발명에 따른 특정 균주는 기탁번호 V00083008로 유럽 세포 배양물 기탁기관에 기탁되었다. 이 균주를 본 명세서에서는 "MVA-BN"이라고 한다.
공지의 MVA 균주는 시험된 적어도 하나의 인간 세포주 내에서 잔류 복제를 보여준다(도 1, 실시예 1). 모든 공지의 백시니아 균주는 세포주 HaCat 내에서 적어도 일부의 복제를 보여주나, 본 발명에 따른 MVA 균주, 특히 MVA-BN은 HaCat 세포 내에서 재생산적으로 복제하지 않는다. 더 상세히는, MVA-BN은 인간의 태아 신장 세포주 293(ECACC No. 85120602) 내에서 0.05 내지 0.2의 증폭비를 보여준다. 인간의 골육종 세포주 143B(ECACC No. 91112502)에서, 상기 비는 0.0 내지 0.6의 범위이다. 인간의 자궁경부 선암종 세포주 HeLa(ATCC No. CCL-2) 및 인간 각질세포주 HaCat(Boukamp et al. 1988, J Cell Biol 106(3):761-71)에 있어서, 상기 증폭비는 각각 0.04 내지 0.8 및 0.02 내지 0.8의 범위이다. MVA-BN은 아프리칸 녹색 원숭이의 신장 세포(CV1: ATCC No. CCL-70) 내에서 0.01 내지 0.06의 증폭비를 갖는다. 따라서, 본 발명에 따른 프로토타입 균주인 MVA-BN 는 시험된 인간 세포주 중 어느 것에서도 재생산적으로 복제하지 않는다.
MVA-BN 의 증폭비는 닭의 태아 섬유아세포(CEF: 1차 배양물) 혹은 베이비 햄스터 신장 세포주 BHK(ATCC No. CRL-1632)에서 확실히 1을 초과한다. 상술한 바와 같이, "1" 초과의 증폭비는 감염세포로부터 생성된 바이러스양이 세포 감염에 사용된 바이러스의 양보다 증가한 것이므로 재생산적 복제를 시사한다. 따라서, 바이러스는 CEF 1차 배양물 내에서 500 초과의 증폭비 혹은 BHK 세포 내에서 50 초과의 증폭비로 쉽게 증식 및 증폭될 수 있다.
본 발명의 특정 구현예에서, 본 발명은 ECACC V00083008로 기탁된 바이러스의 유도체에 관한 것이다. ECACC V00083008로 기탁된 바이러스의 "유도체"란 본질적으로, 기탁된 균주와 같은 복제 특성을 나타내지만 그것의 게놈의 일부 혹은 여 러 부분이 차이를 나타내는 바이러스를 말한다. 기탁된 바이러스와 동일한 "복제 특성"을 갖는 바이러스는 CEF 세포 및 세포주 BHK, HeLa, HaCat 및 143B에서 기탁 균주와 유사한 증폭비로 복제하고 또한 AGR129형 형질전환(transgenic) 생쥐 모델 내에서 측정된 것과 유사한 생체 내 복제를 보여주는 바이러스이다(하기 참조).
바람직한 구현예에서, 본 발명의 백시니아 바이러스 균주, 특히 MVA-BN 및 그의 유도체는 생체 내 복제가 불가능한 것이 특징이다. 본 명세서에서 "생체 내 복제가 불가능한" 이란 인간 및 하기 기술되는 생쥐 모델 내에서 복제하지 않는 바이러스를 말한다. "생체 내 복제가 불가능한" 은 바람직하게는 성숙 B 및 T 세포를 생성할 수 없는 생쥐에게서 결정할 수 있다. 이러한 생쥐의 예는 형질전환 생쥐 모델 AGR129(Mark Sutter, Institute of Virology, University of Zurich, Zurich, Switzerland에서 구할 수 있음)이다. 이 생쥐 균주는 IFN 수용체 I형(IFN-α/β) 및 II형(IFN-γ) 유전자 및 RAG에서 유전자 표적화된 손상을 갖는다. 이러한 손상 때문에, 생쥐는 IFN 체계를 갖지 않고, 성숙 B 및 T 세포를 생산할 수 없으며 따라서 심각하게 면역 저하되어 있고 복제 바이러스의 영향을 받기 쉽다. AGR129 생쥐 대신, 성숙 B 및 T 세포를 생산할 수 없고 따라서 심각하게 면역 저하되어 있고 복제 바이러스의 영향을 받기 쉬운 기타 다른 생쥐 균주를 사용할 수 있다. 특히, 본 발명에 따른 바이러스는 생쥐에 107 pfu 바이러스를 복강내 투여하여 감염시킨 후 적어도 45일의 시간 내에, 바람직하게는 적어도 60일 내에, 가장 바람직하게는 90일 내에 AGR129 생쥐를 죽이지 않는다. 바람직하게는, "생체 내 복제가 불가능한" 것을 나타내는 바이러스는 생쥐에 107 pfu 바이러스를 복강내 투여하여 감염시킨 후 45일, 바람직하게는 60일, 가장 바람직하게는 90일째에 ARG129 생쥐의 기관 혹은 조직으로부터 바이러스를 회수할 수 없는 것이 추가 특징이다. AGR129 생쥐에 관한 감염 분석 및 바이러스가 감염 생쥐의 기관 및 조직으로부터 회수될 수 있는지 여부를 판단하는데 이용하는 분석법에 관한 상세한 내용은 실시예 부문에서 소개한다.
바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 백시니아 바이러스 균주, 특히 MVA-BN 및 그의 유도체는 치사량 챌린지 생쥐 모델에서 측정된 바와 같이 공지의 균주 MVA 575에 비교하여 더 큰 면역원성을 특징으로 한다. 이 실험의 세부내용은 하기의 실시예 2에서 기술하였다. 요약하면, 상기 모델에서 백신접종되지 않은 생쥐는 웨스턴 리저브 균주 L929 TK+ 혹은 IHD-J 같은 복제 능력을 가진 백시니아 바이러스로 감염된 후 죽는다. 상기 치사량 챌린지 모델에 관한 설명에서 복제 가능 백시니아 바이러스로 감염시키는 것을 "챌린지"라고 한다. 챌린지 4일후, 생쥐는 보통 죽게되며 난소 내의 바이러스 역가는 VERO 세포를 이용하는 표준 플라크 분석(상세 내용은 실시예 부문을 참조)에 의해 결정된다. 바이러스 역가는 백신접종되지 않은 생쥐 및 본 발명에 따른 백시니아 바이러스로 백신접종된 생쥐에 대해 측정한다. 더 구체적으로, 본 발명에 따른 바이러스는 이 시험에서 본 발명에 따른 102 TCID50/ml 바이러스로 백신접종한 후의 난소 바이러스 역가가, 백신접종되지 않은 생쥐와 비교하여 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 더욱 더 바람직하게는 적 어도 90% 감소하는 것을 특징으로 한다.
바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 백시니아 바이러스, 특히 MVA-BN 및 그의 유도체는 백신의 감작(prime)/촉진(boost) 투여로 면역화하는데 유용하다. MVA를 전달 벡터로 사용하는 감작/촉진 방식(regime)은 낮은 면역반응을 유도하며 DNA-감작 MVA-촉진 방식보다 열등한 것으로 여러 연구에서 제시되었다(Schneider et al., 1998, Nat. Med. 4; 397-402). 이들 모든 연구에서, 사용되어온 MVA 균주는 본 발명에 따른 백시니아 바이러스와는 다르다. 상기 낮은 면역반응을 설명하면, MVA를 감작 및 촉진 투여에 사용했을 경우 감작-투여 과정에서 MVA에 대해 생성된 항체가 2차 면역화 과정에서 제공된 MVA를 중화시키고 이에 따라, 면역 반응의 효과적 촉진이 방해되는 것으로 추정된다. 이와 대조적으로, DNA-감작/MVA-촉진 방식은 고결합성(avidity) 반응을 일으키는데 더 탁월한 것으로 보고되는데, 이는 상기 방식이 면역 반응을 효과적으로 감작하는 DNA의 능력과 또한 MVA에 대한 기존의 면역성이 결핍된 상태에서 상기 면역 반응을 촉진하는 MVA의 성질이 조합되기 때문이다. 분명히, MVA 및/또는 백시니아에 대한 기존 면역성은 면역 반응의 촉진를 방해하며 따라서 백신으로 혹은 치료제로서 MVA를 사용하는 것은 특히 천연두 예방접종을 한 개인에 있어서 효능을 제한할 것이다. 그러나, 또 다른 구현예에 따르면, 본 발명에 따른 백시니아 바이러스, 특히 MVA-BN 및 그의 유도체 또한 이종성 서열을 갖는 대응 재조합 바이러스는 처리하지 않은 동물들 및 폭스바이러스에 대한 기존 면역성을 갖는 동물들에 있어서 1차로 효과적으로 감작한 다음 다음 면역반응을 촉진하는데 사용될 수 있다. 그러므로, 본 발명에 따른 백시니아 바이러스는 DNA-감작/백시니아 바이러스-촉진 방식과 비교하여, 백시니아 바이러스-감작/백시니아 바이러스-촉진 방식과 적어도 실질적으로 동일한 면역성 레벨을 유도한다.
만일, 다음의 두가지 분석법( "분석 1" 및 "분석 2") 중 어느 하나, 바람직하게는 두 분석 모두로 측정했을 때, CTL 반응이 DNA-감작/백시니아 바이러스-촉진 방식과 비교하여 백시니아 바이러스-감작/백시니아 바이러스-촉진 방식과 적어도 실질적으로 동일하다면, 백시니아 바이러스는 DNA-감작/백시니아 바이러스-촉진 방식과 비교하여 백시니아 바이러스-감작/백시니아 바이러스-촉진 방식과 적어도 실질적으로 동일한 면역성 레벨을 유도하는 것으로 판단된다. 더 바람직하게는, DNA-감작/백시니아 바이러스-촉진 방식과 비교하여 백시니아 바이러스-감작/백시니아 바이러스-촉진 투여 후의 CTL 반응이 상기 분석 중 적어도 하나에서 더 높다. 가장 바람직하게는, CTL 반응이 다음 분석 둘 모두에서 더 높다.
분석 1: 백시니아 바이러스-감작/백시니아 바이러스-촉진 투여에 있어서, 6-8주령 BALB/c(H-2d) 생쥐는 톰슨 등(1988, J. Immunol. 160, 1717)이 기술한 바와 같은 뮤린(murine) 폴리토프를 발현하는 본 발명에 따른 107 TCID50 백시니아 바이러스를 정맥내 투여하여 감작-면역화하고 3주 후에 동일한 방식으로 투여한 동일량의 동일한 바이러스로 촉진-면역화한다. 이 과정을 위해서 상기 폴리토프를 발현하는 재조합 백시니아 바이러스를 구축해야 한다. 상기 재조합 바이러스의 구축 방법은 당해 분야에서 공지된 바와 같으며 하기에 보다 상세히 기술한다. DNA-감 작/백시니아 바이러스-촉진 방식에서, 감작 백신접종은 생쥐에게 백시니아 바이러스와 동일한 항원을 발현하는 DNA 50㎍ 를 근육내 주사하여 실행하고; 백시니아 바이러스를 이용한 촉진 투여는 백시니아 바이러스-감작/백시니아 바이러스-촉진 투여와 똑같은 방법으로 실행한다. 폴리토프를 발현하는 DNA 플라스미드 역시 톰슨 등의 상기 참고문헌에 기술되어 있다. 양쪽 방식에서,에피토프 SYIPSAEKI, RPQASGVYM 및/또는 YPHFMPTNL에 대한 CTL 반응의 진행은 촉진 투여 뒤 2주 후에 결정한다. CTL 반응의 결정은 바람직하게는 Schneider 등(1998, Nat. Med. 4, 397-402)이 설명하고 본 발명에 따른 하나의 특정 바이러스에 대해 하기의 실시예 부문에서 개시된 ELISPOT 분석법을 이용하여 실행한다. 본 발명에 따른 바이러스는 상기 실험에서 'IFNγ 생성 세포의 수/106 비장세포'로 평가되는 바와 같이 백시니아 바이러스-감작/백시니아 바이러스-촉진 투여에 의해 유도되는 상술한에피토프에 대한 CTL 면역 반응이 실질적으로 동일하고, 바람직하게는 DNA-감작/백시니아 바이러스-촉진 투여에 의해 유도되는 것과 적어도 동일한 것을 특징으로 한다(실험 부문 참조).
분석 2: 이 분석은 기본적으로 분석 1에 상응한다. 그러나, 분석 1에서와 같이 정맥내 투여된 107 TCID50 백시니아 바이러스를 사용하는 대신에 본 분석에서는 본 발명에 따른 108 TCID50 백시니아 바이러스를 감작 면역화 및 촉진 면역화 용도로 피하투여한다. 본 발명에 따른 바이러스는 이 실험에서, 'IFNγ 생성 세포의 수/106 비장세포'로 평가되는 바와 같이 백시니아 바이러스-감작/백시니아 바이러스-촉진 투여에 의해 유도되는 상술한 에피토프에 대한 CTL 면역 반응이 실질적으로 동일하고, 바람직하게는 DNA-감작/백시니아 바이러스-촉진 투여에 의해 유도되는 것과 적어도 동일한 것을 특징으로 한다.
상기에서 보여준 분석 중 하나에서 측정된 CTL 반응의 강도가 보호 레벨에 상응한다.
따라서, 본 발명에 따른 바이러스는 특히 백신 접종 목적에 적합하다.
요약하면, 본 발명에 따른 백시니아 바이러스는 다음의 특성들 중 적어도 하나를 가지는 것을 특징으로 한다:
(ⅰ) 닭 태아 섬유아세포(CEF) 및 세포주 BHK 내에서는 재생산적 복제능력을 가지나 인간 세포주 HaCat 내에서는 재생산적 복제능력을 갖지 않고,
(ⅱ) 생체 내 복제가 불가능하고;
(ⅲ) 치사 챌린지 모델 내에서 공지의 균주 MVA 575(ECACC V00120707)와 비교하여 더 큰 면역원성을 유도하고; 및/또는
(ⅳ) DNA-감작/백시니아 바이러스-촉진 방식과 비교하여, 백시니아 바이러스-감작/백시니아 바이러스-촉진 방식과 적어도 실질적으로 동일한 면역성 레벨을 유도한다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 백시니아 바이러스는 상술한 특성 중 적어도 2가지, 더 바람직하게는 적어도 3가지를 가진다. 상술한 특성을 모두 가지는 백시 니아 바이러스가 가장 바람직하다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 제1 유리병/용기 내에 1차 백신접종("감작 접종")을 위한, 및 제2 유리병/용기 내에서 2차 백신접종("촉진 접종")을 위한 본 발명에 따른 바이러스를 포함하는 백신접종용 키트에 관한 것이다. 이 바이러스는 비-재조합 백시니아 바이러스 즉, 이종성 뉴클레오티드 서열을 함유하지 않는 백시니아 바이러스일 수 있다. 이러한 백시니아 바이러스의 예로는 MVA-BN 및 그의 유도체가 있다. 대안적으로, 이 바이러스는 백시니아 바이러스에 대해 이종성인 추가 뉴클레오티드 서열을 함유하는 재조합 백시니아 바이러스일 수도 있다. 본 명세서의 다른 부문에서 개시한 바와 같이, 이종성 서열은 면역계에 의해 반응을 유도하는에피토프를 코딩할 수 있다. 따라서, 상기에피토프를 포함하는 단백질 혹은 물질에 대해 백신접종하기 위하여 재조합 백시니아 바이러스를 사용할 수 있다. 바이러스는 다음의 상세한 기술과 같이 제형화될 수 있다. 각 백신접종에 사용될 수 있는 바이러스의 양은 상기에서 정의되었다.
당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 다음의 특성 중 적어도 하나를 지닌 백시니아 바이러스를 수득하는 방법을 알 수 있다:
- 닭 태아 섬유아세포(CEF) 및 베이비 햄스터 신장 세포주 BHK 내에서 재생산적 복제능력을 가지나 인간 각질세포주 HaCat 내에서는 재생산적 복제능력을 갖지 않고,
- 생체 내 복제가 불가능하고;
- 치사 챌린지 모델 내에서 공지의 균주 MVA 575와 비교하여 더 큰 면역원성 을 유도하고; 및/또는
- DNA-감작/백시니아 바이러스-촉진 방식과 비교하여, 백시니아 바이러스-감작/백시니아 바이러스-촉진 방식과 적어도 실질적으로 동일한 면역성을 유도한다.
이러한 바이러스를 수득하는 방법은
(ⅰ) 공지된 백시니아 바이러스 균주, 바람직하게는 MVA 572 또는 MVA 575(ECACC V00120707)를 바이러스가 재생산적으로 복제할 수 있는 비인간 세포에 도입하고, 이때의 비인간 세포는 바람직하게는 CEF 세포 및 세포주 BHK로부터 선택되는 단계;
(ⅱ) 이들 세포로부터 바이러스 입자를 분리/농축하는 단계; 및
(ⅲ) 수득된 바이러스가 상술한 목적 생물학적 성질 중 적어도 하나를 갖는지 여부를 분석하는 단계를 포함할 수 있고,
상기 단계들은 원하는 복제 특성을 갖는 바이러스가 수득될 때까지 임의로 반복될 수 있다. 또한 본 발명은 본 발명에 따른 이 방법에 의해 수득되는 바이러스에도 관계한다. 원하는 생물학적 특성을 결정하는 방법은 본 명세서의 다른 부문에서 기술한다.
이 방법을 적용함에 있어서, 본 발명자들은 MVA 분리물 계대 575(MVA 575)로부터 출발하여 본 발명에 따른 균주를 수회 클론 정제함으로써 동정하여 분리하였다. 상기 신규한 균주는 상술한 바와 같이 수탁번호 ECACC V00083008의 균주에 해당한다.
본 발명에 따른 백시니아 바이러스의 성장 형태, 특히 MVA-BN의 성장 형태는 본 발명에 따른 균주가 인간 세포주 내에서의 약독화 및 생체 내 복제 불가능에 대해 지금까지 분석된 어떠한 다른 MVA 분리물보다 훨씬 우수함을 시사한다. 따라서 본 발명에 따른 균주는 하기에서 설명하는 백신 혹은 약제물 같은 더 안전한 제품의 개발에 이상적인 후보이다.
한 구현예에서, 본 발명에 따른 바이러스, 특히 MVA-BN 및 그의 유도체는 천연두 같은 인간의 폭스바이러스 질환에 대한 백신으로 사용된다. 또 다른 구현예에서, 본 발명에 따른 바이러스는 재조합 가능할 수 있다, 예컨대 항원 혹은 바이러스에 대해 이종성을 갖는 에피토프 등의 이종성 유전자를 발현할 수 있고 따라서 이종성 항원 혹은에피토프에 대한 면역반응을 유도하기 위한 백신으로 유용할 수 있다.
"면역 반응"이란 용어는 외부 물질 혹은 미생물이 생물체 내에 들어올 때의 면역계의 반응을 말한다. 정의에 따르면, 면역 반응은 특이적 및 비특이적 반응으로 구분되나 이들은 서로 밀접한 관계가 있다. 비특이적 면역 반응은 광범위한 외부 물질 및 감염 물질에 대한 즉각적인 방어이다. 특이적 면역 반응은 생물체에 최초로 물질이 챌린지된지 일정 기간 뒤에 생기는 방어이다. 특이적 면역 반응은 매우 효율적이며 특이적 감염으로부터 회복되는 개체가 이 특이적 감염에 대해 보호되는 것에 관여한다. 따라서, 동일한 혹은 매우 유사한 감염 물질에 의한 2차 감염은 이미 이 물질에 대해 "기존 면역성" 이 있으므로 훨씬 약한 증세를 야기하거나 혹은 전혀 증세를 야기하지 않는다. 이러한 면역성 및 면역학적 기억은 각각 장기간, 일부 경우에는 일생동안 존재한다. 따라서, 면역학적 기억의 유도는 백신 접종에 이용될 수 있다.
"면역계"는 외부 물질 및 미생물에 대한 생물체의 방어에 관여하는 복합기관을 의미한다. 면역계는 여러 세포 유형, 예컨대 임파구 및 백혈구로부터 유래되는 다른 세포들을 포함하는 세포성 부분과, 또한 소형 펩티드 및 보체(complement) 인자를 포함하는 체액성 부분을 포함한다.
"백신접종"이란 생물체가, 예컨대 상기 감염 물질의 약독화 혹은 비활성화된 형태로 감염 물질에 의해 챌린지되어 특이적 면역성을 유도하는 것을 의미한다. 백신접종이라는 용어는 또한 본 발명에 따른 재조합 백시니아 바이러스, 특히 바이러스에 대해 이종성인 항원 혹은에피토프를 발현하는 재조합 MVA-BN 및 그의 유도체를 이용하는 생물체의 챌린지를 포함한다. 이러한 에피토프의 예는 본 명세서의 다른 부문에 나와 있으며 또한 뎅기열(Dengue) 바이러스, C형 간염 바이러스, HIV 등의 다른 바이러스에서 유래되는 단백질로부터 나온에피토프, 또는 종양 및 암의 발생에 관련되는 단백질로부터 유래되는 에피토프를 포함한다. 몸에 재조합 백시니아 바이러스를 투여한 후 에피토프가 발현되고 면역계에 제시되어, 이들에피토프에 대한 특이적 면역반응을 유도할 수 있다. 따라서, 생물체는 재조합 백시니아 바이러스에 의해 코딩되는에피토프를 함유하는 물질/단백질에 대해 면역화된다.
"면역성"은 감염 물질 혹은 그 특징적인 일부로 선행 감염을 완전히 제거함으로써 감염 물질에 의해 유발되는 질환으로부터 생물체를 부분적 혹은 완전히 보호하는 것을 의미한다. 면역성은 면역계의 특화 세포들의 존재, 유도 및 활성화에 근거한다.
본 발명의 한 구현예에서 상기 지적한 바와 같이, 본 발명에 따른 재조합 바이러스, 특히 재조합 MVA-BN 및 그의 유도체는 적어도 하나의 이종성 핵산 서열을 함유한다. "이종성"이란 용어는, 이후 통상적으로 자연 상태에서 바이러스와 밀접한 관계가 없는 핵산 서열의 임의 조합을 말하며 이러한 바이러스를 소위 "재조합 바이러스"라고 한다.
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면 이종성 서열은 바람직하게는 비-백시니아 원천으로부터 선택되는 항원성 에피토프이다. 가장 바람직하게는, 상기 재조합 바이러스는 플라스모디움 팔시파룸(Plasmodium falciparum), 미코박테리아, 인플루엔자 바이러스; 플라비바이러스(Flaviviruse), 파라믹소바이러스(Paramyxoviruse), 간염 바이러스, 인간 면역결핍 바이러스로부터 선택된 바이러스; 혹은 한타바이러스나 필로바이러스 예컨대,에볼라나 마르버그 바이러스 같은 출혈열을 일으키는 바이러스로부터 나온 하나 이상의 항원성 에피토프를 발현한다.
또한 상술한 항원성 에피토프 이외에도 본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 이종성 서열은 또 다른 폭스바이러스 혹은 백시니아 원천으로부터 선택될 수 있다. 이들 바이러스 서열은 숙주 스펙트럼 혹은 바이러스의 면역원성을 변형시키는데 사용될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 본 발명에 따른 바이러스는 치료 화합물을 발현하는 이종성 유전자/핵산을 코딩할 수 있다. 바이러스 내의 이종성 핵산에 의해 코딩되는 "치료 화합물"은 예컨대, 안티센스(antisense) 핵산 같은 치료적 핵산 혹은 원하는 생물학적 활성을 갖는 펩티드나 단백질일 수 있다.
또 다른 바람직한 구현예에 따르면, 이종성 핵산 서열의 발현은 바람직하게, 그러나 비제한적으로 폭스바이러스 프로모터, 더 바람직하게는 백시니아 바이러스 프로모터의 전사적 제어를 받는다.
그 밖에 본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 이종성 핵산 서열은 바람직하게는 바이러스 게놈의 비필수적인 지역에 삽입된다. 본 발명의 또 다른 바람직한 구현예에 따르면, 이종성 핵산 서열은 MVA 게놈의 천연 생성 결실 위치(PCT/EP96/02926에 소개되어 있음)에 삽입된다. 이종성 서열을 폭스바이러스 게놈에 삽입하는 방법은 당해 분야에서 공지되어 있다.
또 다른 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명은 또한 바이러스의 게놈, 이의 재조합체 혹은 기능부를 포함한다. 이러한 바이러스형 서열은 예컨대, PCR, 하이브리드법을 이용하거나 또는 ELISA 분석법을 실시하여 바이러스 혹은 그의 재조합체를 동정 혹은 분리하는데 사용할 수 있다. 또한, 이러한 바이러스 서열은 발현 벡터로부터 발현되어 코딩된 단백질 혹은 펩티드를 생성할 수 있고, 이후 발현벡터 내에 존재하는 바이러스 서열이 결핍된 바이러스의 결실 돌연변이체를 보충할 수 있다.
바이러스성 게놈의 "기능부"란 완전한 게놈 서열의 일부를 의미하며, 단백질, 단백질 도메인, 단백질의에피토프 같은 물리적 실체를 코딩한다. 바이러스 게놈의 기능부는 또한 프로모터, 인핸서, 시스- 또는 트랜스-작용 요소 등과 같이, 조절요소들 또는 개별화가능한 활성을 갖는 상기 요소의 일부를 코딩하는 완전 게놈 서열의 일부를 말한다.
본 발명에 따른 재조합 바이러스는 이종성 핵산 서열을 타겟 세포에 도입하는데 사용될 수 있으며, 상기 서열은 타겟 세포에 대해 동종성 혹은 이종성이다. 이종성 핵산 서열의 타겟 세포 내의 도입은 이종성 펩티드 혹은 폴리펩티드 및/또는 상기 서열에 의해 코딩되는 전체 바이러스를 시험관 내 생성하는데 사용될 수 있다. 이 방법은 재조합 MVA에 의한 숙주세포의 감염, 감염된 숙주세포의 적절한 조건하의 배양, 또한 상기 숙주세포에 의해 생성된 펩티드, 단백질 및/또는 바이러스의 분리 및/또는 농축을 포함한다.
더욱이, 세포에 대한 동종성 혹은 이종성 서열의 도입 방법은 시험관 내, 바람직하게는 생체 내 치료에 적용할 수 있다. 시험관 내 치료에서, 이미 바이러스에 의해(생체 외) 감염된 분리 세포를 면역 반응을 유도할 살아있는 동물 체내에 투여한다. 생체 내 치료의 경우, 바이러스 혹은 그의 재조합체를 면역 반응을 유도할 살아있는 동물 체내에 직접 투여한다. 이 경우, 접종 범위를 둘러싸는 세포들은 본 발명에 따른 바이러스 혹은 그의 재조합체에 의해 직접 생체 내 감염된다.
본 발명에 따른 바이러스는 인간 및 원숭이 세포에서 성장이 크게 제한되고, 이에 따라 크게 약독화되기 때문에, 인간을 포함하여 광범위한 포유류를 치료하는데 이상적이다. 따라서, 본 발명은, 예를 들면 인간을 포함하여 살아있는 동물 체내에서 면역 반응을 유도하기 위한 약제학적 조성물 및 백신을 제공한다. 본 발명의 바이러스는 또한 다른 유전자 치료 프로토콜에서 안전하다.
약제학적 조성물은 일반적으로 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 및/또는 허가된 담체, 첨가제, 항생제, 보존제, 항원보강제(adjuvant), 희석제 및/또는 안정화제를 포함할 수 있다. 이러한 보조물질은 물, 염산, 글리세롤,에탄올, 습윤제 혹은 유화제, pH 완충물질 등일 수 있다. 적절한 담체는 단백질, 다당류, 폴리락트산, 폴리글리콜릴산, 중합체성 아미노산, 아미노산 공중합체, 지질 응집체 등과 같이 전형적으로 크기가 크고, 느리게 대사되는 분자들이다.
백신 제조에 있어서, 본 발명에 따른 바이러스 혹은 그 재조합체는 생리학적으로 허용가능한 형태로 전환된다. 이것은 천연두 백신접종에 사용된 폭스바이러스 백신의 제조에서 얻은 경험에 근거하여 실행할 수 있다(Stickl, H. et al. [1974] Dtsch. med. Wschr. 99, 2386-2392). 예를 들어, 정제된 바이러스를 약 10mM 트리스, 140mM NaCl pH7.4 내에 제형화된 역가 5x108 TCID50/ml 로서 -80℃에서 보관한다. 백신 접종물(shots) 제조시, 예컨대 102-108 바이러스 입자를 앰플, 바람직하게는 유리앰플 1개당 2% 펩톤 및 1% 인간 알부민의 존재하에서 100ml의 인산완충염수(PBS)에서 감압동결건조시킨다. 대안적으로, 백신 접종물은 제형내 바이러스의 단계적 동결건조로 제조할 수도 있다. 이 제형은 만니톨, 덱스트란, 설탕, 글리신, 락토오스 혹은 폴리비닐 피롤리돈 같은 또 다른 첨가제나 혹은 항산화제나 불활성 기체, 안정화제 혹은 생체 내 투여에 적절한 재조합 단백질(예, 인간 혈청 알부민) 같은 다른 첨가제를 함유할 수 있다. 그 뒤, 유리앰플을 밀봉하고 4℃ 내지 실온 범위에서 수개월간 보관할 수 있다. 그러나, 필요한 경우가 아니라면 앰플은 -20℃ 미만의 온도에서 보관하는 것이 바람직하다.
백신접종 혹은 치료시, 감압동결건조물을 0.1 내지 0.5ml의 수용액, 바람직 하게는 생리 식염수나 트리스 완충액에 용해하여 전신적 혹은 국소적으로, 즉, 비경구적, 근육내 혹은 의사들이 알고있는 기타 다른 투여경로를 통하여 투여할 수 있다. 투여 방식, 약량, 및 투여횟수는 당업자에게 공지된 방식으로 최적화할 수 있다.
또한, 또 다른 구현예에 있어서 본 발명에 따른 바이러스는 특히 면역-저하 동물들, 예컨대 SIV 감염된 원숭이(CD4 < 400/혈액 ㎕) 혹은 면역-저하 인간에게서 면역 반응을 유도하는데 유용하다. "면역-저하" 란 용어는 불완전한 면역 반응을 보이거나 혹은 감염 물질에 대한 방어 효능이 떨어지는 개인의 면역계 상태를 말한다. 또 다른 관심대상인 구현예에서, 본 발명에 따른 바이러스는 면역-저하 동물 혹은 인간의 폭스바이러스에 대한 기존 면역성의 존재하에서도 이들 동물 혹은 인간에게서 면역 반응을 촉진할 수 있다. 특히 관심을 끄는 것은 본 발명의 바이러스가 항-바이러스 치료, 예컨대 항-레트로바이러스 치료를 받는 동물이나 인간에서도 면역 반응을 촉진할 수 있다는 점이다. "항-바이러스 치료" 란 예컨대, (ⅰ) 뉴클레오티드 유사체의 적용, (ⅱ) 바이러스 효소활성 혹은 바이러스 어셈블리에 대한 저해제의 적용, 혹은 (ⅲ) 숙주의 면역 반응에 영향을 미칠 사이토킨의 적용을 포함하는, 바이러스 감염을 제거 혹은 억제하기 위한 치료개념을 포함한다.
그 외의 또 다른 구현예에 따르면 백신은 특히 그러나 비제한적으로, 예컨대 동물 폭스 감염에 대한 면역화 등의 수의학 분야에 적용할 수 있다. 작은 동물들에서 면역화를 위한 접종은 바람직하게는 비경구적 혹은 비강을 통해 시행되는 반면 큰 동물들 혹은 인간의 경우 피하, 근육내 혹은 경구 접종이 바람직하다.
본 발명자들은 이미 유효량으로 단지 102 TCID50(조직 배양 감염량)의 본 발명에 따른 바이러스를 함유하는 백신 접종물이 생쥐의 야생형 백시니아 바이러스 챌린지에 대한 완전 면역성을 유도하기에 충분함을 알아내었다. 이는 본 발명에 따른 바이러스의 약독화도가 매우 높아 영향이 없고, 따라서 면역원성을 감소시킬 것으로 예상되므로, 특히 놀라운 발견이다. 이러한 예상은 면역 반응 유도에서 항원성 에피토프가 면역계 내에 충분한 양으로 존재하여야 한다고 믿어온 사실에 근거한 것이다. 크게 약독화되고 따라서 복제하지 않는 바이러스는 극소량의 항원에피토프만, 즉 스스로 통합할 수 있는 만큼만 제시할 수 있다. 바이러스 입자들에 의해 운반되는 이러한 항원의 양은 강력한 면역 반응의 유도에 충분한 것으로 여겨지지 않았다. 그러나, 본 발명에 따른 바이러스는 단 102 TCID50의 극히 적은 약량만으로도 생쥐/백시니아 챌린지 모델 내에서 강력한 보호성 면역 반응을 자극한다. 따라서 본 발명에 따른 바이러스는 지금까지 특징이 분석된 다른 MVA 균주와 비교하여 예상치못한 증가된 면역원성을 보여준다. 이 높은 면역원성 때문에 본 발명에 따른 바이러스 및 이로부터 유래된 모든 백신은 면역-저하 동물 혹은 인간에게 적용하기에 특히 유리해진다.
그 외에 본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 바이러스는 항원보강제로서 사용된다. 여기서의 "항원보강제(adjuvant)"는 백신에서 특이 면역 반응의 증강제(enhancer)를 말한다. "바이러스를 항원보강제로 사용"하는 것은 백신 수용 환 자의 면역계를 추가로 자극하기 위해 기존 백신에 바이러스를 포함시키는 것을 말한다. 대부분의 백신에서 항원성 에피토프의 면역화 효과는 소위 항원보강제를 첨가함으로써 증강되는 경우가 자주 있다. 항원보강제는 백신의 항원성 에피토프에 대한 더 강한 특이적 면역 반응을 일으켜 면역계를 공동-자극시킨다. 이러한 자극은 인터페론 및 인터루킨 같은 비특이적 면역계의 인자들에 의해 조절될 수 있다. 그러므로 본 발명의 또 다른 구현예에서, 바이러스는 인간을 포함한 포유류에서 면역계를 활성화, 지지 혹은 억제하기 위해, 바람직하게는 항원성 결정기(determinant)에 대한 면역 반응을 활성화시키는데 사용된다. 바이러스는 또한 스트레스 같은 경우, 감염되기 쉬운 조건에서 면역계를 지지하는데 사용될 수 있다.
항원보강제로 사용되는 바이러스는 비-재조합 바이러스, 즉 그 게놈 내에 이종성 DNA를 함유하지 않는 바이러스일 수 있다. 이러한 바이러스 종류의 예는 MVA-BN이다. 대안적으로, 항원보강제로 사용되는 바이러스는 바이러스 게놈에 자연적으로는 존재하지 않는 이종성 DNA 서열을 그 게놈 내에 함유하는 재조합 바이러스이다. 항원보강제로 사용함에 있어서, 바이러스의 재조합 바이러스 DNA는 바람직하게는 인터루킨 같은 면역 자극성 펩티드 혹은 단백질을 코딩하는 유전자를 함유하고 발현한다.
또 다른 구현예에 다르면, 바이러스는 항원보강제로 사용되거나 또 다른 백신에 첨가되는 경우 비활성화되는 것이 바람직하다. 바이러스의 비활성화는 예를 들어, 당해 분야에서 공지된 바와 같이 열이나 화학물질에 의해 수행될 수 있다. 바람직하게는, 바이러스는 β-프로프리오락톤에 의해 비활성화된다. 본 발명의 이 구현예에 따르면, 비활성화된 바이러스는 다수 감염성 혹은 증식성 질환에 대한 백신에 첨가되어, 이 질환을 가진 환자의 면역 반응을 증가시킬 수 있다.
발명의 개요
본 발명은 특히, 다음을 단독으로 혹은 조합하여 포함한다:
ㆍ다음 특성 중 적어도 하나를 갖는 백시니아 바이러스:
- 닭 태아 섬유아세포(CEF) 및 베이비 햄스터 신장 세포주 BHK 내에서 재생산적 복제능력을 가지나 인간 각질세포주 HaCat 내에서는 재생산적 복제능력을 갖지 않고,
- 생체 내 복제가 불가능하고;
- 치사 챌린지 모델 내에서 공지의 균주 MVA 575와 비교하여 더 큰 면역원성을 유도하고; 및/또는
- DNA-감작/백시니아 바이러스-촉진 방식과 비교하여, 백시니아 바이러스-감작/백시니아 바이러스-촉진 방식과 적어도 실질적으로 동일한 면역성 레벨을 유도한다.
ㆍ다음의 인간 세포주의 어느 것에서도 재생산적인 복제능력을 갖지 않는 상술한 바이러스: 인간 태아 신장세포주 293, 인간 골육종 세포주 143B 및 인간 자궁경부 선암종 세포주 HeLa.
ㆍ유럽 세포 배양물 기탁기관(ECACC)(Salisbury, UK)에 V00083008로 기탁된 것과 그의 유도체인 상술한 바이러스.
ㆍ적어도 하나의 이종성 핵산 서열을 포함하는 상술한 바이러스.
ㆍ상기 이종성 핵산 서열은 적어도 하나의 항원, 항원성 에피토프 및/또는 치료 화합물을 코딩하는 서열로부터 선택되는 상술한 바이러스.
ㆍ상기 정의된 바이러스로부터 유래된 게놈 혹은 기능부.
ㆍ상술한 바이러스 및/또는 상기 정의된 게놈 및/또는 그 기능부, 또한 약제학적으로 허용가능한 담체, 희석제 및/또는 첨가제를 포함하는 약제학적 조성물.
ㆍ상술한 바이러스 및/또는 상기 정의된 게놈 및/또는 기능부를 포함하는 백신.
ㆍ인간을 포함하여 살아있는 동물에게서 면역학적 반응에 영향을 미치고, 바람직하게는 이를 유도하는 약물로서의 상술한 바이러스, 상기 정의된 게놈 및/또는 기능부, 상기 정의된 조성물 혹은 상기 정의된 백신.
ㆍ상기 바이러스, 조성물 혹은 백신은 1차 접종("감작 접종") 및 2차 접종("촉진 접종")에서 치료학적 유효량으로 투여되는 상술한 바이러스, 상기 정의된 약제학적 조성물, 상기 정의된 백신 혹은 상기 정의된 바이러스.
ㆍ상술한 바이러스, 및/또는 상기 정의된 게놈의 의약품 혹은 백신의 제조를 위한 용도.
ㆍ타겟 세포를 상기 정의된 이종성 서열을 포함하는 바이러스로 감염시키거나 타겟 세포를 상기 정의된 게놈으로 트랜스펙션하는 것을 포함하는 동종성 및/또는 이종성 핵산 서열을 타겟 세포에 도입하는 방법.
ㆍ펩티드, 단백질 및/또는 바이러스를 생성하는 방법으로서,
- 숙주세포를 상술한 바이러스로 감염시키고,
- 감염된 숙주 세포를 적절한 조건하에서 배양하고, 및
- 상기 숙주세포로부터 생산된 펩티드 및/또는 단백질 및/또는 바이러스를 분리 및/또는 농축하는 단계들을 포함하는 방법.
ㆍ상술한 바이러스, 상기 정의된 게놈 및/또는 기능부, 상기 정의된 조성물 혹은 상기 정의된 백신을 치료할 동물 혹은 인간에게 투여하는 것을 포함하는 인간을 포함하여 살아있는 동물의 체내에서 면역학적 반응에 영향을 미치고, 바람직하게는 이를 유도하는 방법.
ㆍ적어도 102 TCID50(조직 배양 감염량)의 바이러스를 투여하는 것을 포함하는 상술한 방법.
ㆍ상기 바이러스, 조성물 혹은 백신은 1차 접종("감작 접종") 및 2차 접종("촉진 접종")에서 치료학적 유효량으로 투여되는 상술한 방법.
ㆍ동물은 면역-저하된 상술한 방법.
ㆍ동물은 폭스바이러스에 대한 기존의 면역성을 갖는 상술한 방법.
ㆍ동물은 항-바이러스 치료 중인 상술한 방법.
ㆍ동물은 항-바이러스 치료 중이며, 항-바이러스 치료는 항-레트로바이러스 치료인 것을 특징으로 하는 상술한 방법.
ㆍ상술한 바이러스, 상기 정의된 게놈 및/또는 기능부의 항원보강제로서의 용도.
ㆍ상술한 바이러스 혹은 상기 정의된 게놈을 백신치료 대상인 인간을 포함하는 살아있는 동물의 몸에 항원보강제로서 투여하는 것을 포함하는, 백신 내에 포함된 항원 및/또는 항원성 에피토프에 대한 특이적 면역 반응을 증강시키는 방법.
ㆍ항원보강제로서의 상술한 바이러스 혹은 상기 정의된 게놈.
ㆍ상술한 바이러스 또는 상기 정의된 게놈이나 기능부를 함유하는 세포, 바람직하게는 인간의 세포.
ㆍ상술한 백시니아 바이러스를 수득하는 방법으로서,
- 시판하는 백시니아 바이러스 균주, 바람직하게는 MVA 575를 바이러스가 재생산적으로 복제할 수 있는 비인간 세포에 도입하고 이때의 비인간 세포는 바람직하게는 CEF 세포 및 세포주 BHK 로부터 선택되는 단계;
- 이들 세포로부터 바이러스 입자를 분리/농축하는 단계; 및
- 수득된 바이러스가 상술한 생물학적 성질 중 적어도 하나를 갖는지 여부를 분석하는 단계를 포함하고,
원하는 복제 특성을 갖는 바이러스가 수득될때까지 상기 단계들이 임의 반복될 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
ㆍ상술한 바이러스, 상술한 백신 혹은 바이러스를 제1 유리병/용기 내에서 1차 접종("감작 접종") 를 위해, 및 제2 유리병/용기 내에서 2차 접종("촉진 접종")을 위해 상기 정의된 약물로서 포함하는 감작/촉진 면역화용 키트.
ㆍ상기 바이러스, 조성물 혹은 백신은 감작 접종에서 투여되며 동일한 바이 러스 혹은 백신이 촉진 접종에서 투여되는 상술한 바이러스, 상기 정의된 조성물 및/또는 상기 정의된 백신의 백신 제조용 용도.
다음의 실시예에서 본 발명을 상세히 기술한다. 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 여기에 제시된 실시예가 본 발명의 기술의 응용분야를 한정하지 않음을 이해할 것이다.
실시예 1
선별된 세포주 내의 신규한 MVA 균주의 성장 속도 및 생체 내 복제
(ⅰ) 세포주 내의 성장 속도:
신규하게 분리된 본 발명에 따른 균주를 특징분석하기 위하여(이하 MVA-BN 이라고 함), 이 신규한 균주의 성장 속도를 이미 특징분석된 다른 MVA 균주의 것과 비교했다.
실험은 다음에 열거된 1차 세포 및 세포주 내의 바이러스들의 성장 속도를 서로 비교하여 실행했다:
MVA-BN(바이러스 스톡 # 23, 18, 02, 99 조정제물(crude), 2.0 x 107 TCID50/ml에서 적정함);
알텐버거(미국 특허 5,185,146호)에 의해 특징분석되었으며 이하 MVA-HLR 로 불리는 MVA;
안톤 메이어(Mayr, A., et al. [1975] Infection 3;6-14)에 의해 특징분석 되었으며, 이하 MVA-575(ECACC V00120707)로 불리는 MVA(계대 575); 및
국제 특허출원 PCT/EP01/02703(W0 01/68820)에서 특징분석된 MVA-Vero(바이러스 스톡, 계대 49, #20, 22, 03, 99 조정제물, 4.2 x 107 TCID50/ml에서 적정함).
사용된 1차 세포 및 세포주는 다음과 같다:
CEF 닭 태아 섬유아세포(SPF 달걀로부터 새로 제조함);
HeLa 인간 자궁경부 선암종(상피), ATCC No. CCL-2;
143B 인간 골육종 TK-, ECACC No. 91112502;
HaCaT 인간 각질세포주, Boukamp et al. 1988, J Cell Biol 106(3):761-771;
BHK 베이비 햄스터 신장, ECACC 85011433;
Vero 아프리칸 녹색 원숭이 신장 섬유아세포, ECACC 85020299;
CV1 아프리칸 녹색 원숭이 신장 섬유아세포, ECACC 87032605
감염과 관련하여, 상이한 세포들을 6-웰 플레이트에 5 x 105 세포/웰의 농도로 접종하고 37℃, 5% CO2로 DMEM 내(Gibco, Cat.No. 61965-026) 및 2% FCS 의 조건에서 하룻밤 배양했다. 세포 배양 배지를 제거하고 세포를 약 moi 0.05에서 1시간 동안 37℃, 5% CO2에서 감염시켰다(감염시 세포수가 하룻밤 사이에 2배로 증가할 것으로 예측함). 상이한 세포 종류 각각의 감염에 사용된 바이러스의 양은 5.0 x 104 TCID50이었고 이것을 앞으로 인풋(input)이라고 한다. 다시, 세포를 3회 DMEM으로 세척하고 마지막으로는 1ml DMEM, 2% FCS를 첨가하고 플레이트를 그대로 두어 37℃, 5% CO2에서 96시간(4일) 동안 배양했다. 적정분석을 위해 플레이트를 -80℃로 동결하여 이 감염을 중지시켰다.
적정 분석(백시니아 바이러스 특이적 항체에 의한 면역염색)
바이러스 양의 적정을 위해 시험 세포(CEF)를 RPMI(Gibco, Cat. No. 61870-010), 7% FCS, 1% 항생제/항진균제(Gibco, Cat. No 15240-062) 중 96-웰 플레이트상에 1 x 104세포/웰의 농도로 접종하고 37℃, 5% CO2에서 하룻밤동안 배양했다. 감염 시험물을 함유하는 6-웰 플레이트는 3회 냉동/해동을 반복했고 RPMI 성장 배지를 사용하여 10-1 내지 10-12의 희석물을 제조했다. 바이러스 희석물을 시험세포 상에 분배하고 37℃, 5% CO2에서 5일간 배양하여 CPE(세포변성(cytopathic) 효과)를 전개시켰다. 시험세포는 10분간 고정시키고(아세톤/메탄올 1:1) PBS로 세척하여, 배양 완충액 내의 1:1000 희석농도에서 폴리클로날 백시니아 바이러스 특이적 항체(Quartett Berlin, Cat. No. 9503-2057) 와 RT에서 1시간 동안 배양했다. PBS(Gibco, Cat.No. 20012-019)로 2회 세척한 후 HPR-결합 항-토끼 항체(Promega Mannheim, Cat. No. W4011)를 배양 완충액(3% FCS 함유 PBS) 내의 1:1000 희석농도로 실온(RT)에서 1시간 동안 첨가했다. 세포를 다시 PBS로 2회 세척하고 갈색 스폿이 가시화될 때까지(2시간) 염색용액(10ml PBS + 100%에탄올 중 200㎕ o-디아 니시딘의 포화 용액 + 새로 제조된 15㎕ H2O2) 과 인큐베이션했다. 염색용액을 제거하고 PBS를 첨가하여 염색반응을 중지시켰다. 갈색 스폿이 나타난 모든 웰을 CPE 양성으로 표시했고 Kaerber식(TCID50 기초 분석)을 이용하여 역가를 계산했다(Kaerber, G. 1931. Arch. Exp. Pathol. Pharmakol. 162, 480).
바이러스를 낮은 감염다중도, 즉 0.05 감염유닛/세포(5 x 104 TCID50)로, 한편으로는 MVA에 대한 허용성이 있는 것으로 예상된 CEF 및 BHK, 또 다른 한편으로는 MVA에 대한 허용성이 없는 것으로 예상된 CV-1, Vero, Hela, 143B 및 HaCat의 2중 세트를 감염시키는데 사용했다. 그 뒤, 바이러스 접종물을 제거했고 세포를 3회 세척하여 잔류하는 미흡수된 바이러스를 제거했다. 바이러스 추출물이 제조되고 그 뒤 CEF 세포 상에서 적정하는 총 4일간 계속 감염상태로 두었다. 표 1 및 도 1은 4일간 감염 후 생성된 바이러의 총량으로 값을 표시한 적정 분석의 결과를 도시한다.
예상대로 CEF 세포(닭 태아 섬유아세포) 내에서는 모든 MVA에 대한 허용성이 있는 세포주이므로 모든 바이러스가 증폭된 것으로 나타났다. 또한, BHK(햄스터 신장 세포주) 내에서도 모든 바이러스가 잘 증폭된 것으로 나타났다. MVA-Vero는 BHK가 허용성 세포주이므로 가장 양호하게 증폭되었다.
Vero 세포(원숭이 신장 세포주)에서의 복제에 관련하여, MVA-Vero는 예상대로 잘, 즉 인풋보다 1000배 증폭했다. MVA-HLR 및 MVA-575 는 각각 인풋보다 33배와 10배 증가하며 잘 증폭했다. 다른 것들과 비교할 때 MVA-BN 만은 이들 세포에 서 잘 증폭하지 않아, 인풋보다 2배 증가했다.
또한, CV1 세포(원숭이 신장 세포주)에서의 복제에 관련하여, MVA-BN은 이 세포주 내에서 크게 약독화되는 것으로 나타났다. 인풋 보다 200배 감소하였다. 또한, MVA-575는 인풋 레벨 보다 증폭하지 않아 다소 음성적인 증폭을 보여, 인풋보다 16배 감소했다. MVA-HLR은 인풋보다 30배 증가함으로써 가장 잘 증폭하였고, 그 다음으로 MVA-Vero는 인풋보다 5배 증가하였다.
가장 관심을 끄는 것은 인간 세포주 내의 다양한 바이러스의 성장 속도를 비교하는 것이다. 143 세포(인간 골암 세포주)의 재생산적 복제에 관련하여, MVA-Vero는 인풋보다 증폭되는 현상을 보인 유일한 것이었다(3배 증가). 모든 다른 바이러스들은 인풋보다 증폭되지 않고 MVA-HLR 및 MVA-BN 와 MVA-575 간에는 큰 차이가 있었다. MVA-HLR 는 "경계선"(인풋보다 1배 감소)이었고, MVA-BN이 가장 큰 약독화(인풋보다 300배 감소)를 나타냈으며, 그 뒤가 MVA-575(인풋보다 59배 감소)이었다. 요약하면, MVA-BN은 인간 143B 세포에서의 약독화 현상에 관련하여 탁월하다.
더욱더, HeLa 세포(인간 자궁경부암 세포)에서의 복제에 있어서는 MVA-HLR이 이 세포주 내에서 잘 증폭하여, 허용성 BHK 세포에서보다도 우수했고(Hela = 인풋보다 125배 증가; BHK = 인풋보다 88배 증가) MVA-Vero 역시 이 세포주 내에서 증폭했다(인풋보다 27배 증가). 그러나, MVA-BN 및 이것 보다는 덜하지만 MVA-575도 상기 세포주에서 약독화되었다(MVA-BN = 인풋보다 29배 감소 및 MVA-575 = 인풋보다 6배 감소).
HaCat 세포(인간 각질세포주)에서의 복제에 관련하여, MVA-HLR는 이 세포주 내에서 잘 증폭하였다(인풋보다 55배 증가). 순응된(adapted) MVA-Vero 및 MVA-575도 상기 세포주 내에서 증폭하였다(인풋보다 각각 1.2배 및 1.1배 증가). 그러나, MVA-BN은 유일하게 약독화된 것으로 나타났다(인풋보다 5배 감소).
결론적으로, MVA-BN이 상기 바이러스 그룹에서 가장 크게 약독화된 바이러스라고 언급할 수 있다; MVA-BN은 인간 태아 신장세포(293: ECACC No. 85120602)(표 1에서 데이타는 수록되지 않음)에서 0.05 내지 0.2의 증폭비를 나타냄으로써 인간 세포주 내에서 매우 약독화된 모습을 보이며, 또한 143B 세포에서 약 0.0의 증폭비를 나타낸다; HeLa 세포에서는 약 0.04의 증폭비를; 또한 HaCat 세포에서는 약 0.22의 증폭비를 나타낸다. 또한, MVA-BN은 CV1 세포에서 약 0.0의 증폭비를 나타낸다. Vero 세포에서만 BHK 및 CEF 같은 허용성 세포주에서와는 동일하지 않은 증폭비(2.33)를 관찰할 수 있었다(표 1 비교). 따라서, MVA-BN은 모든 인간 세포주 143B, Hela, HaCat 및 293에서 1보다 낮은 증폭비를 보이는 유일한 공지의 MVA 균주이다.
MVA-575는 MVA-BN과 유사한 프로파일을 나타내나 MVA-BN 처럼 약독화되지는 않는다.
MVA-HLR은 시험 세포주 모두에서 잘 증폭되었고(143B 세포만 제외), 따라서 143B 세포를 제외한 모든 시험 세포주에서 복제능을 갖는 것으로 간주할 수 있다. 어떤 경우, 이것은 허용성 세포주(BHK)보다 인간 세포주(HeLa)에서 더 크게 증폭되기도 한다.
MVA-Vero는 모든 세포주에서 증폭현상을 보이나 MVA-HLR(143B의 결과는 무시하고)에서 나타난 것보다는 강도가 약하다. 그럼에도, 약독화 측면에서 MVA-BN 혹은 MVA-575에서와 동일한 "종류"에 속하는 것으로 간주할 수는 없다.
2. 생체내 복제
일부 MVA 균주가 시험관 내 복제를 뚜렷히 보이는 것에 대해, 상이한 MVA 균주의 능력을 형질전환 생쥐 모델 AGR 129를 이용하여 생체 내 복제에 대해 시험했다. 이 생쥐 균주는 IFN 수용체 I 형(IFN-α/β) 및 II 형(IFN-γ) 유전자 및 RAG에 유전자 표적화된 손상을 갖는다. 이들 손상 때문에 생쥐는 IFN 시스템을 갖지 않으며 성숙 B 및 T 세포를 생성할 수 없어 심각한 면역 저하 현상을 보이고 또한 복제 바이러스의 영향을 받기 쉽다. 6마리로 이루어진 그룹을 MVA-BN, MVA-HLR 혹은 MVA 572(독일에서 120,000명에 사용됨) 107 pfu로 면역화하고(복강내 투여), 매일 임상징후를 관찰했다. MVA HLR 혹은 MVA 572를 백신접종한 모든 생쥐가 각각 28 및 60일 이내에 죽었다. 해부시, 다수 기관 내에 심각한 바이러스 감염의 일반적 징후가 있었으며 표준 플라크 분석으로 MVA(108pfu)가 난소로부터 회수되었다. 대조적으로, 동일한 약량의 MVA-BN(기탁된 균주 ECACC V00083008에 상응)으로 백신접종한 생쥐는 90일 초과 생존했으나 MVA는 기관 혹은 조직으로부터 회수할 수 없었다.
시험관 내 및 생체내 연구에서 얻은 데이타를 함께 고찰할 때 MVA-BN 이 모계(parental) 및 시판 MVA-HLR 균주보다 훨씬 크게 약독화된 것이 뚜렷이 나타난 다.
실시예 2
면역학적 및 생체내 데이타
이 실험은 다른 MVA와 비교하여 MVA-BN의 상이한 약량 및 백신접종 방식을 비교하기 위하여 실시했다.
2.1. 상이한 MVA 균주들은 면역 반응을 자극하는 능력이 상이하다.
백시니아의 복제능 균주는 생쥐에게서 강력한 면역 반응을 유도하고 고용량에서는 치명적이다. MVA가 크게 약독화되고 포유류 세포 상에서의 복제능력이 감소되어도, 상이한 MVA 균주들 간 약독화에는 차이가 있다. 실제로, MVA BN은 다른 MVA 균주, 심지어는 모계 균주 MVA 575 보다 더 약독화되는 것으로 나타난다. 이 약독화의 차이가 보호 면역 반응을 유도하는 MVA의 효능에 영향을 미치는지 여부를 결정하기 위해서, 상이한 약량의 MVA BN 및 MVA 575를 치사 백시니아 챌린지 모델에서 비교했다. 보호 레벨은 챌린지 뒤 4일후 결정된 난소 백시니아 역가의 감소에 의해 측정되었고, 이는 상이한 약량 및 MVA 균주들의 정량적 평가를 가능하게 한다.
치사 챌린지 모델
특이 병원체가 없는 6-8주령 암컷 BALB/c(H-2d) 생쥐(n=5)를 상이한 약량(102, 104 혹은 106 TCID50/ml)의 MVA BN 혹은 MVA 575로 면역화했다(복강내 투여). MVA-BN 및 MVA-575는 CEF 세포 상에서 증식하였고 슈크로스 정제되어 트리스 pH 7.4에서 제형화되었다. 3주후 생쥐에 동일한 투여량 및 MVA 균주를 촉진(boost)한 2 주 후, 백시니아의 복제능 균주로 치사 챌린지(복강내) 했다. 복제능 백시니아 바이러스("rVV"로 약칭함)로서, 균주 WR-L929 TK+ 혹은 균주 IHD-J를 사용했다. 대조부 생쥐에는 위약 백신을 투여했다. 표준 플라크 분석에 의해 챌린지 뒤 4일후 결정된 난소 역가의 감소로서 보호력을 측정했다. 이를 위하여, 챌린지 뒤 4일후 생쥐를 희생시키고 난소를 제거하여 PBS(1ml)에서 균질화한 후 VERO 세포를 이용하는 표준 플라크 분석에 의해 바이러스 역가를 결정했다(Thomson et al., 1998, J. Immuno. 160:1717).
104 혹은 106 TCID50/ml의 MVA-BN 혹은 MVA-575로 2회 면역화하여 백신접종한 생쥐는 챌린지 뒤 4일후의 난소 rVV 역가가 100% 감소한 것으로 판단되어 완전히 보호되었다(도 2). 챌린지 바이러스는 제거되었다. 그러나, MVA-BN 혹은 MVA-575에 의해 제공된 보호 레벨의 차이를 더 낮은 용량에서 관찰하였다. 102 TCID50/ml 의 MVA-575로 2회 면역화한 생쥐는 높은 난소 rVV 역가(평균 3.7 x 107pfu +/- 2.11 x 107)로 판단되듯이 보호되는데 실패하였다. 이와 대조적으로, 동일한 약량의 MVA-BN으로 백신접종한 생쥐는 난소 rVV 역가(평균 0.21 x 107pfu +/- 0.287 x 107)의 현저한 감소(96%)를 유도하였다. 위약 백신을 수용한 대조부 생쥐는 평균 바이러스 역가 5.11 x 107pfu(+/- 3.59 x 107)를 나타내었다(도 2 참조).
두 MVA 균주 모두 치사 rVV 챌린지에 대해 생쥐에게서 보호성 면역 반응을 유도한다. 두 MVA 균주 모두 고용량에서는 동등한 효과를 나타내지만 최적량 미만에서는 이들의 효능의 차이가 현저하다. MVA-BN은 치사 rVV 챌린지에 대한 보호성 면역 반응을 유도함에 있어서 모계 균주 MVA-575 보다 훨씬 강력하며, 이것은 MVA-575와 비교할 때 MVA-BN의 약독화 증대에 관련될 수 있다.
2.2 감작-촉진 백신접종 방식에서의 MVA-BN
2.2.1.: 상이한 천연두 백신을 이용한 생쥐의 백신접종에 따른 MVA에 대한 항체 유도
MVA-BN의 효능을 다른 MVA 및 과거 천연두 박멸에 사용했던 백시니아 균주와 비교했다. 이것에는 CEF 세포 내에 생성되고 또한 꼬리 방혈로 제공되는 Elstree 및 Wyeth 백시니아 균주를 이용하는 단일 면역화 및 과거에 독일의 천연두 박멸 프로그램에서 사용했던 MVA 572를 이용한 면역화가 포함되었다. 또한, MVA-BN 및 MVA-572 모두 먼저 프리-백신으로 비교한 뒤 방혈을 통한 Elstree를 실시했다. 각 그룹에서 8마리의 BALB/c 생쥐를 사용했고 MVA 백신접종(1 x 107 TCID50)은 모두 0주 및 3주째에 피하투여했다. 촉진 면역화 뒤 2주후, 생쥐를 백시니아(IHD-J)로 챌린지했고 난소내의 역가를 챌린지 뒤 4일후에 결정했다. 모든 백신 및 방식은 100% 예방을 유도했다.
이들 상이한 백신 혹은 방식을 이용하여 유도한 면역 반응을 챌린지에 앞서서 동물로부터 측정했다. 중화용 항체의 레벨, T 세포 증식, 사이토킨 생성(IFN- γ 대 IL-4) 및 T 세포에 의한 IFN-γ 생성을 측정하는 분석법을 이용했다. MVA-BN에 의해 유도된 T 세포 반응의 레벨은 ELIspot 분석으로 측정시 생물학적 동등성을 나타내는 다른 MVA 및 백시니아 바이러스와 대체로 동등했다. 상이한 백신접종 방식에 뒤이은 MVA에 대한 항체 역가의 주간 분석에서, MVA-BN을 이용한 백신접종은 다른 백신접종 방식과 비교할 대 항체 반응의 속도 및 강도를 크게 증강시킨 것으로 나타났다(도 11). 사실상, MVA 572로 백신접종한 생쥐와 비교하여 MVA-BN 으로 백신접종되었을 때, MVA에 대한 항체 역가는 2주, 4주 및 5주(4주째의 촉진 뒤 1주후)에 현저히 더 높았다(p>0.05). 4주째 촉진 백신접종한 뒤, 항체 역가는 또한 백시니아 균주 Elstree 혹은 Wyeth 어느 것의 단일 백신접종한 생쥐와 비교할 때 MVA-BN 그룹에서 훨씬 더 높은 것으로 나타났다. 이들 결과는 MVA-BN을 이용한 2회의 백신접종이 기존 백시니아 균주(Elstree 및 Wyeth)에 의한 전통적인 단일 백신접종보다 더 우수한 항체반응을 유도했다는 것을 뚜렷이 나타내며 또한 앞의 단락 1.5에서의 발견 즉, MVA-BN이 다른 MVA 균주보다 더욱 면역원성이 크다는 사실을 확인시켜 주는 것이다.
2.2.2.: MVA-감작 및 촉진 방식은 인플루엔자 챌린지 모델에서 DNA-감작 MVA-촉진 방식과 동일한 보호 레벨을 생성한다.
고결합성 CTL 반응을 일으키는 MVA 감작-촉진 방식의 효능을 평가하고 이를 이미 우수한 효과를 갖는 것으로 공지된 DNA-감작/MVA-촉진 방식과 비교했다. 상이한 방식들을 DNA 벡터 혹은 MVA-BN에 의해 코딩되는 뮤린 폴리토프 컨스트럭트(construct)를 사용하여 평가했고, CTL 유도 레벨을 ELISPOT 으로 비교하는 한 편, 반응 결합성은 인플루엔자 챌린지 뒤에 얻어지는 보호 정도로 측정하였다.
컨스트럭트
뮤린 폴리토프(인플루엔자, 오발부민 함유 10 CTL에피토프) 를 코딩하는 DNA 플라스미드는 이미 소개되었다(Thomson et al., 1998, J. Immunol. 160:1717). 이 뮤린 폴리토프는 MVA-BN의 결실부위 II 속으로 삽입하고, CEF 세포상에서 증식하여 슈크로스 정제되고 Tris pH 7.4에서 제형화되었다.
백신접종 프로토콜
최근의 연구에서, 특이적 병원체가 없는 6-8주령 암컷 BALB/c(H-2d) 생쥐를 사용했다. 5마리로 된 생쥐 그룹을 ELISPOT 분석에 사용한 반면, 인플루엔자 챌린지 시험에서는 그룹당 6마리 생쥐를 사용했다. 생쥐를, 결과에서 상세히 기술하는 바와 같이, 뮤린 폴리토프를 코딩하는 DNA 혹은 MVA 를 이용하는 상이한 감작-촉진 방식으로 백신접종했다. DNA에 의한 면역화에서, 생쥐를 마취시킨 후 마취상태에서 사두근(quadriceps muscle) 내에 50㎍의 엔도톡신 무함유 플라스미드 DNA(50㎕의 PBS 중)를 생쥐에 1회 주사하였다. MVA를 이용하는 1차 면역화는 생쥐 1마리당 107 pfu MVA-BN을 정맥내 투여하거나 혹은, 생쥐 1마리당 107 pfu 또는 108 pfu MVA-BN을 피하투여함으로써 실시하였다. 촉진 면역화는 1차 면역화 뒤 3주후에 실시했다. DNA를 이용한 1차 면역화와 동일한 방식으로 플라스미드 DNA를 이용한 촉진을 실시했다(상기 참조). CTL 반응을 달성하기 위해, 표준 ELISPOT 분석(Schneider et al., 1998 Nat. Med. 4; 397-402)를 인플루엔자 CTL 펩티드 에피 토프(TYQRTRALV), P. Berghei 펩티드 에피토프(SYIPSAEKI), 사이토메갈로바이러스 펩티드 에피토프(YPHFMPTNL) 및/또는 LCV 펩티드 에피토프(RPQASGVYM)을 사용하여 최종 부스터 면역화 뒤 2주후에 비장세포 상에서 실행하였다.
챌린지 시험에서, 생쥐를 마취시킨후 휴지상태의 인플루엔자 바이러스 Mem71를 치사량 미만 투여량(50ml PBS 내에 용해된 4.5 x 105pfu)으로 비강내 투여하여 감염시켰다. 감염 5일후, 폐를 제거하고 바이러스 역가를 표준 인플루엔자 플라크 분석을 이용하여 Madin-Darby 개의 신장 세포주 상에서 2 개씩 측정하였다.
결과:
DNA 백신만을 단독 사용하면 뮤린 폴리토프에 의해 코딩되는 4H-2d 에피토프에 대한 CTL 유도 효과가 낮고 P. Berghei(SYIPSAEKI) 및 임파구 맥락수막염 바이러스(RPQASGVYM)를 위한 2개의에피토프에 대해 약한 반응만 검출될 수 있었다. 대조적으로, DNA-감작 MVA-촉진 방식(피하주사된 107 pfu MVA-BN)을 이용하면 SLY(8배 증가) 및 RPQ(3배 증가)에 대한 CTL 유도가 훨씬 더 컸으며 또한 뮤린 사이토메갈로바이러스(YPHFMPTNL)에 대한 제3 에피토프에 대한 반응도 관찰되었다(도 3A). 그러나, 동종성 감작 촉진 방식에서 피하주사된 107 pfu MVA-BN을 사용하면 DNA에 뒤이어 MVA-BN을 이용한 것과 동일한 반응 레벨을 유도하였다(도 3A). 놀라운 것은, MVA-BN(107 TCID50)을 이용한 1회 면역화 수행시 3개의에피토프에 대하여 유도된 CTL 숫자는 크게 차이가 없었다는 사실로서, 이는 MVA-BN을 이용한 2차 면역화 가 CTL 반응을 현저히 촉진하지 않는다는 것을 시사한다.
107pfu MVA의 피하투여는 특히, 정맥경로를 통한 면역화와 비교할 때, 과거에 다른 MVA 균주들을 사용한 백신접종을 위해 가장 비효율적인 경로 및 바이러스 농도인 것으로 나타났었다(Schneider et al 1998). 최적의 면역화 방식을 규정하기 위해, 바이러스의 양 혹은 투여 방식을 변경하면서 상술한 실험을 반복했다. 한가지 실험에서, 107pfu MVA-BN 백신접종은 정맥내 경로로 수행되었다(도 3B). 또 다른 실험에서는 108pfu MVA-BN을 피하투여하였다(도 3C). 이들 실험에서 MVA-BN 감작-촉진 면역화는 DNA-감작 MVA-촉진 방식과 비교할 때, 모든 3가지에피토프에 대해 높은 평균 CTL수치를 유도했다. 또한 피하투여된 107pfu MVA-BN과 달리 정맥내 투여한 107pfu MVA-BN으로의 면역화 및 피하투여한 108pfu MVA-BN으로의 면역화는 CTL 반응을 크게 촉진하였는데, 이러한 결과는 MVA-BN을 벡터에 대한 기존 면역성의 존재 하에 CTL 반응을 촉진하는데 사용할 수 있음을 시사한다.
2.2.3: SIV 감염된 레수스(Rhesus) 원숭이에서의 MVA-BN nef 백신의 효능
NVA-BN nef 백신의 효능을 결정하기 위하여, SIV의 병원성 1차 분리물을 이용한 챌린지 뒤 바이러스 부하 및 질병의 소실을 평가하였다. 또한 이 연구는 MVA에 대한 기존 면역성을 가진 면역-저하 원숭이에 대하여 면역 반응을 안전하게 촉진하는데 MVA-BN을 사용할 수 있는지 여부를 결정하게 된다.
백신접종 프로토콜
2개 그룹(n=6)의 레수스 원숭이(Macaca mulalta)를 MVA-BN 단독 혹은 재조합 MVA-BN nef을 이용하여 0주, 8주 및 16주에 환약형(bolus) 근육내 주사함으로써 백신접종하였다. 22주에 모든 원숭이에게 무배양된 일차 레수스 원숭이 PBMC로부터 얻은 50 MID50 의 병원성 세포 관련 SIV 스톡(1XC)을 정맥내 경로로 챌린지하였다. 동물의 임상적 상태를 자주 관찰하고 바이러스혈증, 면역 파라미터, 및 전체 혈액학 및 혈액 임상적 화학 파라미터의 측정을 위해 규칙적으로 시료를 채혈하였다. AIDS 유사 질환이 발병한 동물을 희생시켰고 살아남은 원숭이들은 백신접종 뒤 99주 동안 관찰하였다. 100주에, 생존한 원숭이를 모두 MVA-BN tat를 근육내 투여하여 면역화시켰고 또한 102주 및 106주에 동일한 MVA-BN tat으로 추가로 면역화시켰다.
MVA-BN 혹은 MVA-BN nef을 이용한 어떠한 백신접종 뒤에도 부작용은 관찰되지 않았다. SIV로 원숭이를 감염시킨 뒤 바이러스혈증 레벨은 현저히 증가했으며 감염 2주후에 피크점에 도달했다(도 4). 그룹 내에서에도 표준 편차가 컸기 때문에 MVA-BN nef 혹은 MVA-BN 으로 백신접종한 그룹간에 SIV의 평균레벨은 큰 차이를 보이지 않았다. 그러나, 대체로 NVA-BN nef로 백신접종한 그룹에서의 SIV 부하가 대조부 그룹(MVA-BN)보다 10배 정도 더 낮았다. 또한, 감염 뒤 35주 후(초기 관찰기간), MVA-BN nef로 백신접종한 6마리 중 1마리의 원숭이만 질환이 심각해져 안락사시켰으며 이는 대조부의 경우 6마리 중 4마리를 안락사시킨 것과 대조된다(도 5). 질병의 진행은 더 높은 바이러스 부하와 상관관계가 있음이 명백하며 이는 감 염뒤 또다시 29주 후에 동물을 관찰한 바에서도 확인되었다. 대조부와 비교하여, MVA-BN nef 백신은 질병의 진행을 지연시키는 것으로 나타났으며 또한 감염 46주 후에도 6마리의 NVA-BN nef 동물 중 5마리가 살아남았다(도 5). 그러나, 감염뒤 59주 후에는, nef 백신접종된 그룹 중 2마리가 더 안락사되어 5마리만 생존하였다(MVA-BN nef 그룹 중 3마리 및 MVA-BN 백신접종 그룹 중 2마리). 이들 12마리의 원숭이에게서 MVA-BN에 대하여 발생한 항체 역가의 시험결과, MVA-BN은 MVA에 대한 기존 면역성의 존재하에서도 면역 반응을 촉진할 수 있음이 확실히 나타났다(도 6). MVA-BN 혹은 MVA-BN nef을 이용한 1차 면역화 후, 모든 원숭이에게서 평균 1000의 역가로 MVA에 대한 항체 반응이 발생하였다. 이 항체 반응은 2차 면역화 처리후에는 현저히 촉진되었으며 따라서, MVA가 건강한 원숭이의 감작-촉진 면역 반응에 사용될 수 있음을 확실히 나타낸다. 이들 항체 역가는 점차 감소하나 면역화 처리뒤 49주 후에는 역치가 일정하게 되고 99주째에는 MVA에 대한 평균 역가가 2000이었다.
5마리의 생존 원숭이는 SIV에 감염되어 400/혈액 ㎕ 미만의 CD4 수를 나타내며 면역-저하되었다. 면역-저하 원숭이에서 MVA-BN이 미치는 영향을 조사하기 위하여, 5마리 동물에게 초기 백신접종 뒤 100주, 102주 및 106주째에 MVA-BN tat를 3회 백신접종했다. MVA-BN tat을 이용한 1차 면역화는 이들 면역-저하 원숭이에게서 MVA에 대한 항체반응을 크게 촉진했으며 다시 또 6주후에 3차 면역화로 더욱 더 촉진되었다(도 6). 이 결과는 MVA-BN이 MVA에 대한 현저한 기존 면역성의 존재하에서, 면역-저하 원숭이에서도 면역 반응을 촉진할 수 있음을 또한 나타낸다. 원 숭이 면역 반응은 MVA-BN tat을 이용한 면역화 후에 촉진되었으나 SIV 레벨은 여전히 안정한 상태로 남아있어, MVA-BN을 이용한 면역화가 안전하며 또한 면역-저하 원숭이의 SIV 레벨에 아무런 영향을 미치지 않는다는 것을 시사한다(도 7).
이 연구에서는, MVA-BN이 면역-저하 레수스 원숭이에서 면역 반응을 감작-촉진할 수 있고 또한 MVA-BN 면역화가 안전하며 SIV 감염 동물의 바이러스혈증 레벨에 영향을 미치지 않는다는 사실을 나타낸다. MVA-BN nef 백신으로 백신접종한 동물에게서 AIDS 유사 질환의 진행이 지연되는 사실은 면역 반응이 nef에 대하여 성공적으로 발생하였음을 시사한다.
2.2.4: 항-레트로바이러스 치료중인 SIV-감염 원숭이의 치료적 백신접종.
MVA-BN계 치료적 HIV 백신은 항-레트로바이러스 치료중인 대상에 사용되기 쉽다. 따라서 본 연구는 PMPA로 치료하는 SIV 감염 원숭이에서 각종 SIV 항원(gag, pol, env, rev, tat 및 nef)을 코딩하는 재조합 MVA의 안전성(SIV 레벨에 대한 영향) 및 효능을 조사했다. PMPA 는 뉴클레오시드 유사체이고 HIV 및 SIV에 대하여 효과가 있다(Rosenwirth, et al. B. 2000, J Virol 74, 1704-11)
컨스트럭트
모든 재조합 MVA 컨스트럭트는 CEF 세포 상에서 증식되고 슈크로스 정제되어, 트리스 pH 7.4에서 제형화되었다.
백신접종 프로토콜
3개 그룹(n=6)의 레수스 원숭이(Macaca mulatta)를 병원성 일차 SIV 분리 물(1XC) 50 MID50로 감염시켰고 그 후 19주 동안 PMPA(60mg/kg 피하투여)으로 매일 치료하였다. 10주째, 동물에 대해 재조합 MVA-BN(근육내 투여) 또는 식염수를 백신접종했고 6주 후 다시 동일한 백신접종을 수행했다. 그룹 1에는 MVA gag-pol 및 MVA-env의 혼합물을, 그룹 2에는 MVA-tat, MVA-rev 및 MVA-nef를 각각 투여했고 그룹 3에는 염수를 제공했다. 동물들의 임상 상태를 자주 관찰하고 바이러스혈증, 면역 파라미터 및 전체 혈액학 및 혈액 임상적 화학 파라미터를 측정하기 위해 규칙적으로 시료를 채혈했다.
모든 동물이 감염 2주 후 피크점에 달하는 높은 SIV 부하를 형성하였다(도 8). PMPA로 매일 치료한 뒤, 9주째에 SIV 레벨이 감소하여 낮은 레벨에서 안정화되었다. 앞서의 연구에서와 같이 MVA로 백신접종후 10주 및 16주째에는 SIV 레벨에 대한 아무런 영향도 나타내지 않았으며 이는 MVA-BN이 면역-저하 동물에 대해 안전한 백신 벡터임을 시사한다. 동물에서 PMPA 치료(21주째)를 중단했을 때, SIV레벨이 증가했다. 그룹 1 내의 3마리는 대조부 그룹 3과 비교하여 감소된 SIV 레벨을 나타내었으나, PMPA 치료 종결뒤 그룹간 평균 SIV 부하는 큰 차이가 없었다(도 8). SIV 감염된 T세포 용해물에 대한 ELISA를 이용하면, 모든 그룹의 동물에서 감염뒤 4주째에 SIV에 대한 항체 반응이 발생하였다(도 9). 대조부 그룹(식염수) 내의 SIV 항체 역가는 PMPA 처리 과정에서 감소했고 PMPA 처리 중단시 빠르게 증가했으며, 이는 항-레트로바이러스 치료 과정에서 SIV 레벨의 감소 및 후속 증가를 반영한다(도 9). SIV 항체 역가와 유사한 패턴이 MVA-tat, MVA-rev 및 MVA-nef 를 투여한 그룹 2에서도 관찰되었으며, 이는 ELISA에서 사용된 SIV 감염 T 세포 용해물 내의 이들 조절 단백질의 발현 저하를 반영하는 것일 수 있다. 이와 대조적으로, 그룹 1에서의 항-SIV 항체 역가는 10주째에 MVA gag-pol 및 MVA-env로 백신접종 후 증가하였으며, 이는 재조합 MVA-BN이 항-레트로바이러스 치료를 받는 SIV 감염 동물에 있어서 SIV에 대한 면역 반응을 촉진할 수 있음을 시사한다. 중요한 것은, 항-SIV 항체 역가가 16주째의 2차 면역화 처리 후에 촉진되었으며, 이는 다시 MVA가 심지어 MVA에 대한 기존 면역성이 있는 경우에도 면역-저하 동물의 면역 반응을 촉진할 수 있다는 사실을 나타낸다(도 8). 그룹 1의 항-MVA 항체 역가는 또한 1차 면역화 후 항체 반응이 발생하는 상기 패턴이 반영되며, 이것은 2차 백신접종 후 크게 촉진된다(도 10).
참고문헌
Figure 112009030616919-PAT00001
CEF Hela HaCat 143B BHK Vero CV-1
MVA-BN 579.73 0.04 0.22 0.00 65.88 2.33 0.00
MVA-575 796.53 0.15 1.17 0.02 131.22 10.66 0.06
MVA-HLR 86.68 124.97 59.09 0.83 87.86 34.97 29.70
MVA-Vero 251.89 27.41 1.28 2.91 702.77 1416.46 4.48
감염 4일후 인풋 레벨보다 큰 바이러스 증폭 증폭비 = 아웃풋 TCID50 ㆍ인풋 TCID50 모든 수치는 TCID50 임
출원인 참조번호: BN 35 PCT 국제출원번호 PCT/EP01/13628
PCT 규칙 13조에 따른
[기탁미생물에 관한 통지사항]
A.하기 내용은 명세서 5페이지의 24행에 기술된 미생물에 관한 것임.
B. 기탁사항 기탁기관 ECACC 유럽 세포배양물 기탁기관
기탁기관의 주소 영국, 윌트셔 SP4 OJG, 살스버리, 응용미생물학 & 연구소 센터
기탁일 2000년 8월 30일 액서션 번호 00083008
C. 추가사항
당 절차가 가능한 모든 지정국 및 해당 지정국의 법률하에 정당히 허용되는 범위 내에서, 기탁된 미생물 시료는 관련 특허법, 예, EPC 규칙 28조(4), 영국 특허법령 1995, 2조 3항; 오스트레일리아 법률 3.25(3); 덴마크 특허법령 22조 및 33조(3) 및 기타 지정국의 유사조항에 의거하여, 독립전문기관에 배포함으로써만 사용할 수 있다.
D. 통지대상 국가
E. 기타사항 하기 통지서를 추후 국제사무국에 제출할 것("수탁번호" 등의 통지사항을 명시)
본 통지서는 국제출원서와 함께 수령됨 담당자: R.M.맨담메이커 본 통지서는 2002년 3월 8일 국제사무국에 수령됨.
PCT/RO/134 서식
출원인 참조번호: BN 35 PCT 국제출원번호 PCT/EP01/13628
PCT 규칙 13조에 따른
[기탁미생물에 관한 통지사항]
A.하기 내용은 명세서 13페이지의 13행에 기술된 미생물에 관한 것임.
B. 기탁사항 기탁기관 ECACC 유럽 세포배양물 기탁기관
기탁기관의 주소 영국, 윌트셔, SP4 OJG, 살스버리, 응용미생물학 & 연구소 센터
기탁일 2000년 12월 7일 액서션 번호 00120707
C. 추가사항
당 절차가 가능한 모든 지정국 및 해당 지정국의 법률하에 정당히 허용되는 범위 내에서, 기탁된 미생물 시료는 관련 특허법, 예, EPC 규칙 28조(4), 영국 특허법령 1995, 2조 3항; 오스트레일리아 법률 3.25(3); 덴마크 특허법령 22조 및 33조(3) 및 기타 지정국의 유사조항에 의거하여, 독립전문기관에 배포함으로써만 사용할 수 있다.
D. 통지대상 국가
E. 기타사항 하기 통지서를 추후 국제사무국에 제출할 것("수탁번호" 등의 통지사항을 명시)
본 통지서는 국제출원서와 함께 수령됨 담당자: R.M.맨담메이커 본 통지서는 2002년 3월 8일 국제사무국에 수령됨.
PCT/RO/134 서식
출원인 참조번호: BN 35 PCT 국제출원번호 PCT/EP01/13628
PCT 규칙 13조에 따른
[기탁미생물에 관한 통지사항]
A.하기 내용은 명세서 35페이지의 16행에 기술된 미생물에 관한 것임.
B. 기탁사항 기탁기관 ECACC 응용미생물학 연구 유럽 세포배양물 기탁기관, CAMR
기탁기관의 주소 영국, SP4 OJG, 살스버리, 포턴 다운 ECACC 유럽 세포배양물 기탁기관, CAMR
기탁일 1994년 1월 27일 액서션 번호 V94012707
C. 추가사항
D. 통지대상 국가
E. 기타사항
본 통지서는 국제출원서와 함께 수령됨 담당자: R.M.맨담메이커 본 통지서는 2002년 3월 8일 국제사무국에 수령됨.
PCT/RO/134 서식
본 발명에 의하여 닭 태아 섬유아세포(CEF) 및 베이비 햄스터의 신장 세포주 BHK 내에서는 재생산적 복제가 가능하나 인간 세포주 내에서는 재생산적 복제가 불가능한 새로운 백시니아 바이러스가 제공된다.
도 1은 상이한 세포주 내의 상이한 MVA 균주의 성장 속도를 도시한다. (A)에서는 결과를 시험된 MVA 균주에 따라 그룹화한 반면 (B)에서는 결과를 시험 세포주에 따라 그룹화한다. (B) 배양 4일(D4) 후의 세포주로부터 회수된 바이러스의 양은 플라크 분석으로 측정했고 이를 1일(D1)의 초기 접종에 대해 4일후 회수된 바이러스의 비로서 표현하였다.
도 2는 MVA-BN 혹은 MVA 575로 백신접종한 뒤의 백시니아의 치사 챌린지에 대한 보호를 도시한다. 이 보호는 표준 플라크 분석에 의해 챌린지 4일 후에 결정된 난소 역가의 감소로 측정한다.
도 3은 상이한 감작-촉진 방식을 이용한 인플루엔자 챌린지에 대한 CTL 유도 및 보호를 도시한다.
3A: 뮤린 폴리토프를 코딩하는 DNA 혹은 MVA-BN 백신의 여러 조합물로 백신접종한 뒤의 4개의 상이한 H-2d 제한에피토프에 대한 CTL 반응의 유도를 도시한다. BALB/c 생쥐(5마리/군)를 DNA(근육내) 혹은 MVA-BN(피하)로 백신접종하고 3주후 부스터 면역화하였다. 백신에 의해 코딩된 4개의 상이한 에피토프(TYQRTRALV, 인플루엔자; SYIPSAEKI, P. Berghei; YPHFMPTNL, 사이토메갈로바이러스; RPQASGVYM, LCV)에 대한 CTL 반응을 부스터 면역화 2주후에 ELISPOT 분석으로 측정했다.
3B: 뮤린 폴리토프를 코딩하는 DNA 혹은 MVA-BN 백신의 여러 조합물로 백신접종한 뒤의 4개의 상이한에피토프에 대한 CTL 반응의 유도를 도시한다. BALB/c 생쥐(5마리/군)를 DNA(근육내) 혹은 MVA-BN(피하)로 백신접종하고 3주후 부스터 면역화하였다. 백신에 의해 코딩된 4개의 상이한 에피토프(TYQRTRALV, 인플루엔자; SYIPSAEKI, P. Berghei; YPHFMPTNL, 사이토메갈로바이러스; RPQASGVYM, LCV)에 대한 CTL 반응을 부스터 면역화 2주후에 ELISPOT 분석으로 측정했다.
3C: 피하투여한 최적 약량(1 x 108 TCID50)의 재조합 MVA-BN을 이용한 동종성 감작 촉진 후 펩티드 및 MVA 특이적 T 세포의 빈도수를 도시한다. 각각 8마리 생쥐로 이루어진 그룹을 도면에서 나타낸 바와 같은 조합물로 2회 백신접종하였다. 최종 백신접종한 뒤 2주후, 펩티드 특이적 비장세포의 수를 IFN-감마 ELISPOT 분석으로 측정했다. 막대는 특이적 스폿수의 평균치 +/- 평균치로부터의 표준편차를 나타낸다.
도 4는 MVA-BN nef 혹은 MVA-BN 으로 백신접종된 원숭이의 SIV 부하(load)를 도시한다.
도 5는 백신접종된 원숭이의 SIV 감염 후 생존율을 도시한다.
도 6은 MVA-BA에 대한 원숭이 혈청 항체 역가를 도시한다. 각 동물의 항체 역가는 상이한 모양으로 나타내며, 평균 역가는 검은 직사각형으로 도시된다.
도 7은 면역-저하 원숭이의 tat를 코딩하는 MVA-BN으로 백신접종한 뒤 SIV 레벨(CD4 < 400/혈액 ml)을 도시한다. 원숭이는 미리 MVA-BN 혹은 MVA-BN nef로 3차례(0주, 8주, 16주) 백신접종했고 SIV의 병원성 분리물에 의해 감염되었다(22주). 100주, 102주 및 106주(화살표로 표시됨)에 원숭이들은 MVA-BN tat 으로 백신 접종되었다.
도 8은 항-레트로바이러스 치료 및 MVA-BN을 이용한 치료적 백신접종을 받은 원숭이의 SIV 레벨을 도시한다. 3개 그룹의 원숭이들(n=6)이 SIV로 감염되었고 매일 PMPA(검정색 선으로 표시)으로 치료했다. 10주 및 16주째에 동물들을 재조합 MVA 혼합물 혹은 식염수로 백신접종했다(화살표로 표시).
도 9는 감염 및 재조합 MVA로 백신접종 뒤 SIV에 대하여 일어난 체액성 반응을 도시한다. 3개 그룹의 원숭이들(n=6)이 SIV의 병원성 분리물에 의해 감염되었고(0주) 그 뒤 이들을 항-레트로바이러스 치료로 처치했다(PMPA; 굵은 선으로 표시). 10주 및 16주째에 원숭이를 재조합 MVA 혼합물 혹은 식염수로 백신접종했다. 표준 ELISA에서 항원으로 감염된 T세포 용해액을 이용하여 SIV에 대한 항체를 측정했다.
도 10은 항-레트로바이러스 치료를 받는 SIV 감염된 원숭이에서 MVA에 대하여 일어난 체액성 반응을 도시한다. 3개 그룹의 원숭이들(n=6)이 SIV의 병원성 분리물에 의해 감염되었고(0주) 그 뒤 이들을 항-레트로바이러스 치료로 처치했다(PMPA; 굵은 선으로 표시). 10주 및 16주째에 원숭이를 재조합 MVA 혼합물 혹은 식염수로 백신접종했다. MVA에 대한 표준 캡쳐 ELISA를 이용하여 MVA에 대한 항체를 측정했다.
도 11은 상이한 천연두 백신으로 생쥐를 백신접종한 뒤 MVA에 대한 항체의 유도를 도시한다. MVA-BN 으로 백신접종(0주 및 4주)한 뒤 MVA에 대해 일어난 항체의 레벨은 꼬리 방혈로 제공된 종래의 백시니아 균주, Elstree 및 Wyeth(0주), 프리-Elstree 백신으로 제공된 MVA-BN 및 MVA 572(0 주 및 4 주) 와 비교했다. MVA 572는 유럽 세포 배양물 기탁기관에 ECACC V94012707로 기탁되었다. 역가는 캡쳐 ELISA를 이용하여 결정했고 그래프의 선형부를 이용하여 선형회귀법으로 계산하고 흡광도 0.3을 나타내는 희석도로 정의하였다(*MVA-BN : MVA-BN은 MVA 572 : MVA 572 와 크게 다르다(p > 0.05)).

Claims (29)

  1. 변형된 백시니아 바이러스 앙카라(Modified Vaccinia viurs Ankara, MVA)의 변형체로서,
    a) 변형된 백시니아 바이러스 앙카라를 닭 태아 섬유아세포(Chicken Embryo Fibroblast; CEF) 숙주 세포에 도입하는 단계;
    b) 상기 감염된 CEF 숙주 세포에서 생산된 바이러스를 분리(isolation), 농축(enrichment), 또는 분리 및 농축하는 단계;
    c) 단계 b)로부터 수득된 바이러스가 인간 골육종 세포주 143B, 인간 자궁경부 선암종 세포주 HeLa, 인간 태아 신장 세포주 293 및 인간 각질세포주 HaCat으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 인간 세포주에서 1 미만의 증폭비(amplification ratio)를 나타내는지 여부를 분석하는 단계(여기서 상기 증폭비는 처음 세포 감염에 사용된 최초 바이러스 양(인풋)에 대한 감염된 세포에서 생성된 바이러스 양(아웃풋)의 비로 정의됨); 및
    d) 상기 증폭비를 나타내는 상기 바이러스 변형체가 수득될 때까지 상기 단계 a) 내지 c)를 반복하는 단계를 포함하는 공정에 의해 생산되며,
    야생형 MVA와 비교하여 하기 특성을 갖는 MVA 변형체:
    (ⅰ) 인간 골육종 세포주 143B, 인간 자궁경부 선암종 세포주 HeLa, 인간 태아 신장 세포주 293 및 인간 각질세포주 HaCat으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 인간 세포주에서 재생산적 복제(reproductive replication) 불가능; 및
    (ⅱ) 성숙 B 및 T 세포를 생산할 수 없는 면역 저하된 생쥐 모델의 생체내 조건에서(in vivo) 복제 불가능.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 생쥐 모델이 AGR129 형질전환 생쥐(transgenic mouse)임을 특징으로 하는 MVA 변형체.
  3. 제 1항에 있어서, 유럽 세포 배양물 기탁기관(ECACC)에 기탁번호 V00083008로 기탁된 MVA임을 특징으로 하는 MVA 변형체.
  4. 제 1항에 있어서, 게놈 내에 하나 이상의 이종성(heterogenous) 핵산 서열을 추가로 포함하는 MVA 변형체로서, 상기 이종성 핵산 서열이 플라스모디움 팔시파룸(Plasmodium falciparum); 미코박테리아; 인플루엔자 바이러스; 플라비바이러스과(Flavivirus family), 파라믹소바이러스과(Paramyxovirus family), 간염바이러스과(Hepatitis virus family) 또는 인간면역결핍바이러스과(HIV family)에서 선택된 바이러스; 또는 출혈열을 일으키는 바이러스에서 유래된, 항원성 에피토프를 엔코딩하는 유전자들 또는 폴리뉴클레오티드 서열들인 것을 특징으로 하는 MVA 변형체.
  5. 제 1항에 있어서, 상기 도입되는 변형된 백시니아 바이러스 앙카라가 MVA 572(유럽 세포 배양물 기탁기관에 기탁번호 V94012707로 기탁됨), MVA 575(유럽 세포 배양물 기탁기관에 기탁번호 V00120707로 기탁됨) 또는 상기 기탁된 MVA들로부 터 수득되거나 생산된 MVA 바이러스를 포함함을 특징으로 하는 MVA 변형체.
  6. 제 4항에 있어서, 상기 출혈열을 일으키는 바이러스가 한타바이러스 또는 필로바이러스임을 특징으로 하는 MVA 변형체.
  7. 제 6항에 있어서, 상기 핵산 서열이 Nef 유전자임을 특징으로 하는 MVA 변형체.
  8. 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 따른 MVA 변형체의 게놈.
  9. 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 따른 MVA 변형체 또는 이의 게놈 및 약제학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 첨가제(additive)를 포함하는, 인간을 포함한 동물 생체 내의 면역 반응을 증강(enhancing)시키거나, 이를 유도하거나, 상기 둘 모두를 위한 약제학적 조성물.
  10. 제 9항에 있어서, 인플루엔자 바이러스, 플라비바이러스, 파라믹소바이러스, 폭스바이러스, 간염바이러스, 인간면역결핍바이러스, 또는 출혈열 유발 바이러스로 분류되는 바이러스의 감염으로 인한 바이러스성 질환에 대하여 인간을 포함한 살아 있는 동물을 면역화하기 위한 것임을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  11. 제 9항에 있어서, 102 TCID50(조직 배양 감염량) 이상의 MVA 변형체를 포함함을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  12. 제 10항에 있어서, 인간 폭스 바이러스 질환에 대하여 인간을 포함한 살아있는 동물을 면역화시키기 위한 약제학적 조성물.
  13. 제 12항에 있어서, 상기 인간 폭스 바이러스 질환이 천연두임을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  14. 제 12항에 있어서, 상기 살아 있는 동물이 폭스바이러스에 대한 기존 면역(pre-existing immunity)을 지님을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  15. 제 10항에 있어서, 상기 살아 있는 동물이 항-바이러스 치료를 받고 있는 중임을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  16. 제 15항에 있어서, 상기 항-바이러스 치료가 항-레트로바이러스 치료임을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  17. 제 10항에 있어서, 1차 접종("감작 접종") 및 2차 접종("촉진 접종")에서 치 료학적 유효량으로 투여됨을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  18. 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 따른 MVA 변형체를 포함하는, 인플루엔자 바이러스, 플라비바이러스, 파라믹소바이러스, 폭스바이러스, 간염바이러스, 인간면역결핍바이러스, 또는 출혈열 유발 바이러스로 분류되는 바이러스의 감염으로 유발되는 바이러스성 질환을 예방 또는 치료하기 위한 백신.
  19. 제 18항에 있어서, 102 TCID50(조직 배양 감염량) 이상의 MVA 변형체를 포함함을 특징으로 하는 백신.
  20. 제 18항에 있어서, 1차 접종("감작 접종") 및 2차 접종("촉진 접종")에서 치료학적 유효량으로 투여됨을 특징으로 하는 백신.
  21. 1차 접종("감작 접종")을 위한 제1 유리병 또는 용기 및 2차 접종("촉진 접종")을 위한 제2 유리병 또는 용기 내에, 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 따른 MVA 변형체, 제 9항의 약제학적 조성물, 또는 제 18항의 백신을 포함하는, 감작 및 촉진 면역화용 키트.
  22. 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 따른 MVA 변형체, 제 9항의 약제학적 조성물, 또는 제 18항의 백신을 치료학적으로 유효한 양으로 투여하는 단계를 포함하는, 치료가 요구되는 인간을 제외한 동물의 생체를 면역화시키는 방법.
  23. 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 따른 MVA 변형체 또는 이의 게놈을 유효 성분으로 포함하는 항원보강제(adjuvant).
  24. 유럽 세포 배양물 기탁기관(ECACC)에 기탁번호 V00083008로 기탁된 MVA 변형체.
  25. 제 1항에 있어서, 상기 인간 골육종 세포주 143B, 인간 자궁경부 선암종 세포주 HeLa, 인간 태아 신장 세포주 293 및 인간 각질세포주 HaCat 중에서 선택된 인간 세포주 각각에서 0.0 내지 0.8의 증폭비를 나타냄을 특징으로 하는 MVA 변형체.
  26. 제 25항에 있어서, 상기 인간 골육종 세포주 143B에서 0.0 내지 0.6의 증폭비를 나타냄을 특징으로 하는 MVA 변형체.
  27. 제 25항에 있어서, 상기 인간 자궁경부 선암종 세포주 HeLa에서 0.04 내지 0.8의 증폭비를 나타냄을 특징으로 하는 MVA 변형체.
  28. 제 25항에 있어서, 상기 인간 태아 신장 세포주 293에서 0.05 내지 0.2의 증폭비를 나타냄을 특징으로 하는 MVA 변형체.
  29. 제 25항에 있어서, 상기 인간 각질세포주 HaCat에서 0.02 내지 0.8의 증폭비를 나타냄을 특징으로 하는 MVA 변형체.
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